RU86455U1

RU86455U1 - BIO ENGINEERING DESIGN

Info

Publication number: RU86455U1
Application number: RU2008115257/22U
Authority: RU
Inventors: Валерий Иванович Чиссов; Наталия Сергеевна Сергеева; Ирина Константиновна Свиридова; Валентина Александровна Кирсанова; Сурая Абдулла кызы Ахмедова; Георгий Авраамович Франк; Валерий Вячеславович Тепляков; Джахангир Салимович Агзамов
Priority date: 2008-04-22
Filing date: 2008-04-22
Publication date: 2009-09-10

Abstract

1. Биоинженерная конструкция, представляющая собой имплантат для замещения костного дефекта, изготовленная из очищенного скелета коралла и содержащая терапевтически активную субстанцию, отличающаяся тем, что в качестве коралловой составляющей используют фрагмент коралла, очищенный от коралловой пыли и микроорганизмов путем грубой механической обработки поверхности, промывки в холодной проточной воде, чередования циклов замачивания/высушивания с кипячением, и последующей стерилизации, смоделированный в соответствии с формой и величиной замещаемого дефекта, и содержащий в качестве терапевтически активной субстанции иммобилизованные на поверхности коралла аутологичные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки. ! 2. Биоинженерная конструкция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве коралловой составляющей выбрана структура типа Acropora cervicornes.1. Bioengineering design, which is an implant for replacing a bone defect made of a purified coral skeleton and containing a therapeutically active substance, characterized in that a coral fragment is used as a coral component, purified from coral dust and microorganisms by rough mechanical surface treatment, washing in cold running water, alternating soaking / drying cycles with boiling, and subsequent sterilization, modeled in accordance with the shape and size another replaceable defect, and containing autologous multipotent mesenchymal stromal cells immobilized on the coral surface as a therapeutically active substance. ! 2. The bioengineered construction according to claim 1, characterized in that a structure of the type Acropora cervicornes is selected as the coral component.

Description

Группа изобретений относится к медицине, в частности к материалам, используемым в качестве имплантируемых протезов костей, и представляет собой биоинженерную конструкцию (далее - БИК) на основе коралловой структуры типа Acropora cervicomes, предназначенную для замещения костных дефектов (далее - КД), и способ замещения КД с ее помощью.The group of inventions relates to medicine, in particular to materials used as implantable bone prostheses, and is a bioengineered structure (hereinafter - BIC) based on a coral structure of the type Acropora cervicomes, designed to replace bone defects (hereinafter - CD), and a method of replacement CD with her help.

Материал скелета морских кораллов представляет собой уникальную пористую кальций-карбонатную структуру. Микроструктурное сходство скелетных материалов этих беспозвоночных с костью делает их потенциально применяемыми в качестве заместителя кости.The material of the skeleton of marine corals is a unique porous calcium-carbonate structure. The microstructural similarity of the skeletal materials of these invertebrates with bone makes them potentially useful as a bone substitute.

По объекту «Биоинженерная конструкция» известна Передняя перекрестная связка, сделанная с помощью биоинженерии (WO 00/69355). Известное изобретение представляет способ получения передней перекрестной связки ex vivo. Способ включает посев стволовых клеток в трехмерном матриксе, размещение засеянного матрикса путем прикрепления в двух местах, культивирование клеток внутри матрикса при условиях, предназначенных для роста клеток. При этом в качестве клеток-предшественников были использованы стромальные клетки костного мозга, а материалом для их фиксации в числе других был использован коралл Goniopora. В известной сложной биоинженерной композиции коралловый фрагмент выполняет ограниченную функцию материала для фиксации клеток, другими словами, носителя клеток, и не служит материалом для замещения КД.The Bioengineering Anterior Cross Ligament, made using bioengineering (WO 00/69355), is known for the Bioengineering Design. The known invention is a method for producing anterior cross ligament ex vivo. The method includes sowing stem cells in a three-dimensional matrix, placing the seeded matrix by attachment in two places, culturing the cells inside the matrix under conditions intended for cell growth. In this case, stromal cells of the bone marrow were used as precursor cells, and Goniopora coral was used among other materials as their material for fixation. In the well-known complex bioengineering composition, the coral fragment performs the limited function of a material for fixing cells, in other words, a cell carrier, and does not serve as a material for replacing CDs.

Известен материал для костного протеза, включающий карбонат кальция, частично диспергированный в биорезорбирующем полимерном матриксе (US 5433751). Рассматриваемый материал содержит в качестве карбоната кальция измельченный скелет коралла. При использовании известного материала для костного протеза невозможно достичь указанных ниже лечебных результатов в силу того, что измельчение скелета коралла лишает его прочностных характеристик, что исключает возможность его использования для замещения крупных, в том числе критических, дефектов костной ткани в переходный период - до образования собственной зрелой костной ткани. Кроме того, измельчение скелета коралла снижает присущую ему пористость, необходимую для неоваскуляризации имплантата.Known material for a bone prosthesis, including calcium carbonate, partially dispersed in a bioresorbable polymer matrix (US 5433751). The material under consideration contains a crushed coral skeleton as calcium carbonate. When using the known material for a bone prosthesis, it is impossible to achieve the following medical results due to the fact that grinding the coral skeleton deprives it of strength characteristics, which excludes the possibility of its use to replace large, including critical, bone defects in the transition period - until the formation of its own mature bone tissue. In addition, grinding the coral skeleton reduces its inherent porosity necessary for neovascularization of the implant.

Весьма важное значение в процессе изготовления материала для замещения КД имеет методика подготовки природного коралла, в частности процесс очистки. Известен Способ очистки кораллов и кораллы, полученные этим способом (WO 2005/055885 Coral purification method and coral thus obtained), включающий экстракцию органических субстанций из кораллов, путем обработки кораллов жидкостью или смесью жидкостей при температуре меньше 270°С и давлении много большем, чем критическое давление жидкости или смеси жидкостей. В качестве экстрагентов авторы известного способа используют ацетон и/или этанол, которые сами по себе не являются биосовместимыми. Следствием этого является необходимость отмывки кораллов от ацетона и контроль за полнотой данной стадии.Very important in the process of manufacturing the material to replace the CD is the methodology for preparing natural coral, in particular the cleaning process. Known Method for cleaning corals and corals obtained by this method (WO 2005/055885 Coral purification method and coral thus obtained), including the extraction of organic substances from corals, by treating corals with a liquid or mixture of liquids at a temperature of less than 270 ° C and a pressure much higher than critical pressure of a liquid or mixture of liquids. As extractants, the authors of the known method use acetone and / or ethanol, which in themselves are not biocompatible. The consequence of this is the need to wash coral from acetone and control the completeness of this stage.

Наиболее близкими к заявляемой БИК по совокупности признаков являются Продукты или структуры, сформированные для медицинских или аналогичных целей (WO 1999/002200 Shaped products or structures for medical or related purposes). Известные структуры сформированы из кораллов, в частности из кораллов относящихся к семейству Acropora (Acropora grandis), являются твердыми изделиями, могут быть использованы в качестве имплантатов, при этом в коралл адсорбирована терапевтически активная субстанция, в частности представляющая собой фактор, помогающий или содействующий росту кости.The closest to the claimed BIC in terms of features are Products or structures formed for medical or similar purposes (WO 1999/002200 Shaped products or structures for medical or related purposes). Known structures are formed from corals, in particular from corals belonging to the family Acropora (Acropora grandis), are solid products, can be used as implants, and therapeutically active substance is adsorbed into the coral, in particular, it is a factor that helps or promotes bone growth .

Известные продукты или структуры, принятые в качестве прототипа, обладают рядом недостатков, препятствующих достижению указанных ниже лечебных результатов.Known products or structures adopted as a prototype have several disadvantages that impede the achievement of the following therapeutic results.

1. Процесс очистки природных кораллов состоит из промывки под гидростатическим давлением для уменьшения количества коралловой пыли и кратковременном размещении рабочего фрагмента коралла в жидком азоте. Однако в результате обработки жидким азотом в коралловой структуре могут произойти необратимые отрицательные изменения:1. The process of cleaning natural corals consists of washing under hydrostatic pressure to reduce the amount of coral dust and briefly placing the working fragment of coral in liquid nitrogen. However, as a result of treatment with liquid nitrogen in the coral structure, irreversible negative changes can occur:

- возникновение трещин за счет разной скорости охлаждения поверхности и внутренних частей коралла;- the occurrence of cracks due to different cooling rates of the surface and internal parts of the coral;

- фиксация сохранившихся во внутренних частях коралла чужеродных органических структур.- fixation of alien organic structures preserved in the interior of the coral.

- 2. В качестве активной субстанции, представляющей собой фактор, помогающий или содействующий росту кости используются в частности морфогенетические протеины, введение которых в организм может вызвать неконтролируемый рост костной ткани.- 2. In particular, morphogenetic proteins, the introduction of which into the body can cause uncontrolled bone growth, are used as an active substance, which is a factor that helps or promotes bone growth.

По объекту «Способ замещения костного дефекта» известна «Культура клеток, содержащая клетки-предшественники остеогенеза, имплантат на ее основе и его использование для восстановления целостности кости», в соответствии с которым восстановление целостности кости осуществляют путем заполнения дефекта имплантатом, выполненным в форме аллогенного костного матрикса в виде соломки (хвороста) из деминерализованной кости, содержащего культивированные на нем клетки стромального и лимфомакрофагального ряда аутологичного костного мозга млекопитающих (п-т РФ №2240135). Однако в описании известного изобретения не содержится сведений о способе получения, структуре и иных физических свойствах костного матрикса, используемого в качестве основы для костного имплантата. Можно предположить, что указанный костный матрикс, выполненный в виде соломки (хвороста) изготовлен из аллогенной деминерализованной кости (трупный материал), то есть чужеродной субстанции органического состава. Следствием этого может быть перенос в организм реципиента инфекционных агентов, отторжение имплантата, аллергические реакции.According to the object “Method for replacing a bone defect,” the “Cell culture containing osteogenesis precursor cells, an implant based on it and its use for restoring bone integrity” is known, according to which restoration of bone integrity is carried out by filling the defect with an implant made in the form of allogeneic bone matrix in the form of straws (brushwood) from demineralized bone containing cells of the stromal and lymphomacrophagic row of an autologous bone marrow cultured on it those who feed (p-t RF №2240135). However, the description of the known invention does not contain information about the preparation method, structure and other physical properties of the bone matrix used as the basis for the bone implant. It can be assumed that the specified bone matrix made in the form of straws (brushwood) is made of allogeneic demineralized bone (cadaveric material), that is, a foreign substance of organic composition. The consequence of this may be the transfer of infectious agents into the recipient's body, implant rejection, and allergic reactions.

Наиболее близким к заявляемому способу замещения КД по совокупности признаков является «Продукт остеогенеза и процесс» (US №5563124), включающий имплантацию в тело продукта, содержащего карбонат кальция и фактор роста кости. При этом карбонат кальция используют в форме арагонита, полученного из натурального коралла. Факторы роста кости выбирают из группы, включающей: коллаген, фибрин, альгинат, или их смесь, а также смесь аминокислот, способствующих остеогенезу. Процесс замещения КД, включает:Closest to the claimed method of substitution of CD in terms of features is the "Product of osteogenesis and process" (US No. 5563124), including implantation in the body of a product containing calcium carbonate and bone growth factor. In this case, calcium carbonate is used in the form of aragonite obtained from natural coral. Bone growth factors are selected from the group including: collagen, fibrin, alginate, or a mixture thereof, as well as a mixture of amino acids that contribute to osteogenesis. The substitution process of CD includes:

- изготовление из куска коралла дисков, имеющих диаметр около 5-8 мм и толщину около 3 мм;- the manufacture of a piece of coral disks having a diameter of about 5-8 mm and a thickness of about 3 mm;

- пропитывание каждого кораллового диска раствором, содержащим один из выбранных факторов роста кости;- impregnation of each coral disk with a solution containing one of the selected bone growth factors;

- изготовление имплантата замещаемого дефекта кости в соответствии с его размерами и формой;- the manufacture of an implant of a replaceable bone defect in accordance with its size and shape;

- хирургическое размещение изготовленного имплантата в дефекте кости в форме единого блока.- surgical placement of the manufactured implant in a bone defect in the form of a single unit.

Как следует из описания известного изобретения, продукт и процесс успешно опробован в эксперименте на крысах и кроликах. Авторы предполагают возможность использования продукта и процесса в операциях замещения бедра, колена, позвоночника, лечения остеопороза, возмещения опухолевых процессов, костных переломов.As follows from the description of the known invention, the product and process has been successfully tested in an experiment on rats and rabbits. The authors suggest the possibility of using the product and process in operations to replace the thigh, knee, spine, treat osteoporosis, compensate for tumor processes, bone fractures.

Однако, известный способ, принятый в качестве прототипа, обладает рядом недостатков, препятствующих достижению указанных ниже лечебных результатов.However, the known method, adopted as a prototype, has several disadvantages that impede the achievement of the following therapeutic results.

1. Изготовление имплантата путем построения единого блока из нескольких отдельных коралловых дисков влечет за собой прерывистость во взаимосвязанной системе пор, следствием чего является неравномерность насыщения указанных пор терапевтически активной субстанцией, в частности раствором, содержащим один из выбранных факторов роста кости, и неравномерность в последующем процессе остеогенеза и резорбции коралловой составляющей имплантата. Кроме того, использование данной технологии построения единого блока из нескольких отдельных коралловых дисков возможно только для замещения незначительных по размерам дефектов кости, поскольку блок, составленный из дисков, не обладает требуемыми прочностными характеристиками.1. The manufacture of the implant by building a single block of several separate coral disks entails discontinuity in the interconnected pore system, resulting in uneven saturation of these pores with a therapeutically active substance, in particular, a solution containing one of the selected bone growth factors, and unevenness in the subsequent process osteogenesis and resorption of the coral component of the implant. In addition, the use of this technology to build a single block of several separate coral disks is possible only to replace minor bone defects, since a block made up of disks does not have the required strength characteristics.

2. Включение в состав имплантата чужеродного коллагена может вызвать реакцию отторжения.2. The inclusion of foreign collagen in the implant may cause a rejection reaction.

3. Включение в состав имплантата сложных фармацевтических композиций, содержащих факторы роста кости может привести к неконтролируемому неоостеогенезу.3. The inclusion of complex pharmaceutical compositions containing bone growth factors in the implant may lead to uncontrolled neo-osteogenesis.

Заявляемая группа изобретений направлена на решение единой задачи создания БИК, предназначенной для эффективного замещения КД с образованием собственной зрелой костной ткани и разработки методики имплантации указанной конструкции в КД.The claimed group of inventions is aimed at solving the unified task of creating a NIR, designed to effectively replace CD with the formation of their own mature bone tissue and to develop a technique for implanting this design in CD.

Использование в клинической практике заявляемой БИК и способа замещения КД с ее помощью позволяет достичь следующих технических (лечебных) результатов:The use in clinical practice of the claimed NIR and the method of replacing CD with its help allows you to achieve the following technical (medical) results:

- возможность замещения КД, имеющих размер критический или более критического, в том числе не закрывающихся самостоятельно;- the possibility of replacing CDs having a critical size or more than critical, including those that do not close independently;

- возможность замещения КД в костях различных видов - плоских и трубчатых в соответствии с естественными морфогенетическими потенциями.- the possibility of replacing CD in bones of various types - flat and tubular in accordance with natural morphogenetic potencies.

Указанные единые лечебные результаты при осуществлении группы изобретений по объекту БИК достигаются за счет того, что заявляемая конструкция, также как известная представляет собой имплантат для замещения КД, изготовленный из очищенного скелета коралла и содержащий терапевтически активную субстанцию.These uniform therapeutic results in the implementation of the group of inventions on the object of NIR are achieved due to the fact that the claimed design, as well as the known one, is an implant for replacing CD made from a purified coral skeleton and containing a therapeutically active substance.

Особенность заявляемой конструкции заключается в том, что в качестве коралловой составляющей используют фрагмент коралла, очищенный от коралловой пыли и микроорганизмов путем грубой механической обработки поверхности, промывки в холодной проточной воде, чередования циклов замачивания /высушивания с кипячением, и последующей стерилизации, смоделированный в соответствии с формой и величиной замещаемого дефекта, и содержащий в качестве терапевтически активной субстанции иммобилизованные на поверхности коралла аутологичные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (далее - ММСК).A feature of the claimed design is that as a coral component, a coral fragment is used, purified from coral dust and microorganisms by rough mechanical surface treatment, washing in cold running water, alternating soaking / drying cycles with boiling, and subsequent sterilization, modeled in accordance with the shape and size of the defect being replaced, and containing autologous multipots immobilized on the coral surface as a therapeutically active substance ent mesenchymal stromal cells (hereinafter - MMSC).

Указанные единые лечебные результаты при осуществлении группы изобретений по объекту способ замещения КД достигаются за счет того, что также как в известном способе замещение КД, осуществляют путем изготовления имплантата на основе коралла, насыщения коралловой составляющей имплантата терапевтически активной субстанцией, хирургического размещения изготовленного имплантата в дефекте кости.These uniform therapeutic results when implementing the group of inventions on the subject of CD replacement are achieved due to the fact that, as in the known method, CD replacement is carried out by manufacturing an implant based on coral, saturating the coral component of the implant with a therapeutically active substance, and surgical placement of the manufactured implant in a bone defect .

Особенность заявляемого способа заключается в том, что имплантат изготавливают путем моделирования по результатам рентгенологического исследования в соответствии с формой и величиной замещаемого дефекта из предварительно очищенного цельного фрагмента коралла с последующей иммобилизацией на поверхности коралла аутологичных ММСК, размещают готовый имплантат в дефекте и фиксируют его.A feature of the proposed method is that the implant is made by modeling according to the results of x-ray examination in accordance with the shape and size of the replaced defect from a pre-cleaned whole coral fragment with subsequent immobilization of autologous MMSCs on the coral surface, the finished implant is placed in the defect and fixed.

Сущность изобретения заключается в следующем.The invention consists in the following.

Всем натуральным кораллам свойственна пористая кальций-карбонатная структура, однако различные виды кораллов отличаются в основном прочностью скелета и степенью его пористости. Эти параметры являются определяющими при выборе материала для замещения кости в переходный период до образования собственной зрелой костной ткани.All natural corals are characterized by a porous calcium-carbonate structure, however, various types of corals differ mainly in the strength of the skeleton and in the degree of its porosity. These parameters are decisive when choosing material for bone replacement in the transition period until the formation of its own mature bone tissue.

Для проведения описываемых ниже экспериментов авторами была выбрана коралловая структура типа Acropora cervicomes, которая обладает достаточной прочностью при оптимальной пористости и архитектонике поверхности, а именно плотность - 2,7 г/см³., пористость 10-12%, средний размер пор 500 (am. Меньшая пористость не позволяет клеткам достаточно быстро заселить коралловую структуру, что снижает скорость остеогенеза. Большая пористость значительно снижает прочностные характеристики имплантата, что не допустимо при замещении КД, имеющих размер критический или более критического.To conduct the experiments described below, the authors chose a coral structure of the type Acropora cervicomes, which has sufficient strength with optimal porosity and architectonics of the surface, namely, density - 2.7 g / cm ^3. , Porosity 10-12%, average pore size 500 (am The lower porosity does not allow the cells to populate the coral structure quickly enough, which reduces the rate of osteogenesis. whether more critical.

Существенными признаками заявляемой БИК, непосредственно влияющими на лечебные результаты, являются разработанные авторами наиболее физиологичный способ очистки и подготовки исходного коралла, способ предкультивирования ММСК, а также моделирование имплантата в соответствии с формой и величиной замещаемого дефекта по результатам предварительного рентгенологического исследования.The essential features of the claimed NIR that directly affect the therapeutic results are the most physiological method of cleaning and preparing the original coral, the method of precultivation of MMSCs, as well as the implant modeling in accordance with the shape and size of the replaced defect according to the results of a preliminary x-ray study developed by the authors.

Признаком заявляемого способ замещения КД, имеющим наибольшее влияние на лечебные результаты является размещение в дефекте готовой БИК. Как показали результаты эксперимента, при размещении в сформированном дефекте предварительно изготовленной БИК имеет место совпадение скоростей биорезорбции коралла и неоостеогенеза. При этом процесс образования костной ткани наблюдается по всему объему коралла одновременно.A sign of the claimed method for replacing CDs having the greatest influence on therapeutic results is the placement of a finished NIR in a defect. As shown by the experimental results, when a prefabricated NIR is placed in a defect formed, the rates of coral bioresorption and neosteogenesis coincide. Moreover, the process of bone formation is observed throughout the entire coral volume at the same time.

Период времени от иммобилизации клеток на поверхности БИК до момента размещения готовой в дефекте составляет от 2 до 10 суток. При увеличении продолжительности указанного временного интервала в дальнейшем может возникнуть эффект избыточного образования костной ткани. Способ осуществляют следующим образом.The period of time from immobilization of cells on the surface of the NIR until the placement of the finished in the defect is from 2 to 10 days. With an increase in the duration of the indicated time interval, the effect of excessive bone formation may occur in the future. The method is as follows.

На первом этапе с помощью рентгенологического исследования определяют толщину кортикальных слоев, размеры костномозгового канала и предполагаемого сегментарного дефекта этой кости. Далее из цельного куска коралла Acropora cervicomes выпиливают имплантат, по своим форме и размеру соответствующий предполагаемому дефекту костной ткани, выявленным рентгенологическим методом. При изготовлении имплантата могут быть использованы инструменты, традиционно применяемые в травматологии и ортопедии.At the first stage, using the X-ray examination, the thickness of the cortical layers, the size of the bone marrow canal and the alleged segmental defect of this bone are determined. Then, an implant is cut out from a whole piece of Acropora cervicomes coral, which, in its shape and size, corresponds to the alleged bone defect detected by the X-ray method. In the manufacture of the implant, instruments traditionally used in traumatology and orthopedics can be used.

На втором этапе сформированный коралловый имплантат (далее - КИ) подвергают очистке от коралловой пыли и мелких органических остатков. Очистку от коралловой пыли осуществляют путем грубой механической обработки поверхности с помощью щетки подходящего размера с жесткой синтетической щетиной под струей проточной воды. Далее КИ промывают в течение 3-4 часов в холодной проточной воде. Затем КИ замачивают в дистиллированной воде в соотношении (по объему) имплантат/Н₂О-1/10, при комнатной температуре в течение 8 часов, каждые 2 часа, перенося КИ в свежую порцию дистиллированной воды. Далее КИ высушивают в сухожаровом шкафу при температуре 50-60°С в течение 8 часов. Эти манипуляции с кораллом повторяют трижды. На последнем этапе КИ стерилизуют в стеклянном флаконе с соответствующей крышкой в стерилизационном пакете 2 часа при 160°С.At the second stage, the formed coral implant (hereinafter - KI) is subjected to purification from coral dust and small organic residues. Purification of coral dust is carried out by rough mechanical processing of the surface with a suitable brush with a hard synthetic bristle under running water. Further, KI is washed for 3-4 hours in cold running water. Then KI is soaked in distilled water in the ratio (by volume) of the implant / Н ₂ О-1/10, at room temperature for 8 hours, every 2 hours, transferring KI to a fresh portion of distilled water. Further, KI is dried in a dry oven at a temperature of 50-60 ° C for 8 hours. These coral manipulations are repeated three times. At the last stage, KI is sterilized in a glass bottle with an appropriate lid in a sterilization bag for 2 hours at 160 ° C.

Для насыщения очищенного КИ ММСК осуществляют их выделение из образцов костного мозга, полученных во время операции или биопсии крыла подвздошной кости, культивирование и наращивание.To saturate the purified CI, MMSCs isolate them from bone marrow samples obtained during an operation or biopsy of the ilium wing, culturing and building.

Для формирования БИК стерильный КИ, подготовленный как указано выше, переносят в культуральный флакон с вентилируемой крышкой, заполненный полной ростовой средой (ПРС) и выдерживают в течение 4 часов в СО₂ -инкубаторе (37°С, 5% CO₂). ММСК 2-4 пассажей (160-400 тыс.кл./см²) помещают в посуду для роллерной установки подходящего объема с герметичной крышкой и переносят в эту посуду КИ из ПРС. Далее посуду с ММСК и КИ помещают в СО₂ - инкубатор (37°С, 5% СО₂) на роллерную установку на 18-20 часов (скорость вращения - 4 об/мин), что обеспечивает равномерное прикрепление ММСК к КИ.To form a NIR, a sterile CI prepared as described above is transferred to a culture bottle with a vented lid filled with a complete growth medium (ORS) and incubated for 4 hours in a CO ₂ incubator (37 ° C, 5% CO ₂ ). MMSK 2-4 passages (160-400 thousand cells / cm ² ) are placed in a pan for a roller installation of a suitable volume with a sealed lid and transferred to this dish KI from PRS. Next, the dishes with MMSC and CI are placed in a CO ₂ incubator (37 ° C, 5% CO ₂ ) on a roller unit for 18-20 hours (rotation speed - 4 rpm), which ensures uniform attachment of MMSC to CI.

Далее за 2-10 дней до планируемого оперативного вмешательства БИК культивируют в ПРС в стационарных условиях в CO₂ - инкубаторе (37°С, 5% СО₂) каждые 2-3 дня производя замену ПРС. На протяжении культивирования производят микроскопический контроль БИК (инвертированный микроскоп) и контроль ее стерильности по стандартным методикам.Then, 2-10 days before the planned surgical intervention, NIRs are cultivated in ORS under stationary conditions in a CO ₂ incubator (37 ° C, 5% CO ₂ ) every 2-3 days, replacing ORS. Throughout the cultivation, a NIR microscope is monitored (inverted microscope) and its sterility is monitored using standard techniques.

На Фиг.1А представлен общий вид БИК (КИ с иммобилизованными на нем ММСК после 3-х недель культивирования). Фиг.1Б представляет собой фото фрагмента нативного коралла, Фиг.1В, Г, и Д - фото того же фрагмента коралла, заселенного ММСК in vitro с различной степенью увеличения (окраска клеток гематоксилин-эозином или 2-,4-,5-дифенилтетразолитбромистым). Результаты контрольных исследований показывают, что культивированные стволовые клетки заселили всю толщу объема коралла по порам и их количество увеличилось в несколько раз.On figa presents a General view of the NIR (CI with immobilized MMSC on it after 3 weeks of cultivation). Figv is a photo of a fragment of native coral, Figv, D, and D is a photo of the same fragment of a coral populated by MMSC in vitro with various degrees of increase (staining of cells with hematoxylin-eosin or 2-, 4-, 5-diphenyltetrazolite bromide) . The results of control studies show that cultured stem cells have populated the entire thickness of the coral volume in the pores and their number has increased several times.

Оперативное вмешательство, направленное на замещение КД с помощью БИК, изготовленной на основе КИ и ММСК, осуществляют по правилам, принятым в травматологии и ортопедии при использовании имплантатов.Surgery aimed at replacing CD using BIC, made on the basis of KI and MMSK, is carried out according to the rules adopted in traumatology and orthopedics when using implants.

БИК в культуральной посуде доставляют в операционную из лаборатории непосредственно к этапу ее размещения в дефекте. Транспортировку осуществляют в герметичном термостатируемом контейнере. Промежуток времени между извлечением емкости с БИК из С02 - инкубатора и ее имплантации не должен превышать 3 часов.BIC in a culture dish is delivered to the operating room from the laboratory directly to the stage of its placement in the defect. Transportation is carried out in a sealed thermostatic container. The time interval between removing the container with NIR from the CO2-incubator and its implantation should not exceed 3 hours.

В процессе операции на этапе размещения БИК в дефекте кости ее извлекают пинцетом/зажимом из культуральной посуды и имплантируют в дефект.During the operation, at the stage of placing the NIR in the bone defect, it is removed with tweezers / clamp from the culture dishes and implanted into the defect.

Все последующие этапы операции осуществляют по принятым в клинике стандартам.All subsequent stages of the operation are carried out according to the standards accepted in the clinic.

В модельном эксперименте по замещению дефекта бедренной кости барана на первом этапе был сформирован циркулярный дефект бедренной кости и сделан рентгеновский снимок бедра с дефектом. Далее из цельного куска коралла Асгорога cervicomes был выпилен имплантат, по своим форме и размеру соответствующий образованному дефекту костной ткани, выявленному рентгенологическим методом. Сформированный имплантат соответствовал толщине кортикальных слоев, размерам костномозгового канала и предполагаемого сегментарного дефекта этой кости. При изготовлении имплантата были использованы инструменты, традиционно применяемые в травматологии и ортопедии.In a model experiment for the replacement of a ram femoral defect, at the first stage, a circular femoral defect was formed and an x-ray of the thigh with the defect was taken. Then, an implant was cut out of a whole piece of Asgorog's coral cervicomes, which, in its shape and size, corresponds to the formed bone defect detected by the X-ray method. The formed implant corresponded to the thickness of the cortical layers, the size of the bone marrow canal and the alleged segmental defect of this bone. In the manufacture of the implant, instruments traditionally used in traumatology and orthopedics were used.

В соответствии с описанной выше методикой сформированный КИ был очищен от коралловой пыли и мелких органических остатков, была изготовлена и размещена в дефекте БИК. Рентгеновский снимок размещения БИК в дефекте кости представлен на Фиг.2, на котором показана интактная конечность (А) и конечность с БИК, размещенной в дефекте через сутки после операции (Б). На Фиг.3 представлена схема размещения и укрепления БИК в дефекте бедренной кости барана. Каждый месяц после оперативного вмешательства животному осуществляли рентгенологическое исследование оперированной конечности.In accordance with the method described above, the formed KI was cleaned of coral dust and small organic residues, was made and placed in the NIR defect. An X-ray image of the placement of the NIR in the bone defect is presented in Figure 2, which shows the intact limb (A) and the limb with NIR placed in the defect one day after surgery (B). Figure 3 presents the layout and strengthening of the NIR in the defect of the femur of the ram. Each month after surgery, the animal was performed x-ray examination of the operated limb.

Через 4 месяца животное вывели из эксперимента. Из тканей в области оперативного вмешательства были изготовлены парафиновые блоки и срезы. Путем микроскопии препаратов установлена полная резорбция вещества коралла и его замещение правильно организованной костной тканью разной степенью зрелости с формированием остеонов, костных балок, очагов костно-мозгового кроветворения. На Фиг.4 представлены фотографии, иллюстрирующие процесс остеогенеза на месте имплантата, размещенного в дефекте бедренной кости барана по истечении четырех месяцев после операции:After 4 months, the animal was removed from the experiment. Paraffin blocks and sections were made from tissues in the area of surgical intervention. Microscopy of the preparations established the complete resorption of the coral substance and its replacement with properly organized bone tissue of varying degrees of maturity with the formation of osteons, bone beams, foci of bone marrow hematopoiesis. Figure 4 presents photographs illustrating the process of osteogenesis at the site of an implant placed in a sheep femoral defect after four months after surgery:

- Фиг.4а - участок незрелой костной ткани;- Figa - plot immature bone tissue;

- Фиг.4в - формирующийся остеон;- Figv - forming osteon;

- Фиг.4с - формирующиеся костно-мозговые лакуны.- Figs - forming bone marrow lacunae.

На Фиг 5 представлено фото макропрепарата задней конечности барана в области КД через 4 месяца после имплантации БИК. Фиг.5 А - вид костной мозоли на месте дефекта. Фиг.5 Б - костная ткань в распиле на месте дефекта, замещенного БИК.Figure 5 presents a photo of a macrodrug of the hind limb of the ram in the CD area 4 months after implantation of the BIC. Fig. 5 A is a view of the callus at the site of the defect. Figure 5 B - bone tissue in the cut at the site of the defect, replaced by NIR.

Таким образом, заявляемая группа изобретений обладает значительными преимуществами и отвечает критериям патентоспособности.Thus, the claimed group of inventions has significant advantages and meets the criteria of patentability.

Claims

1. Bioengineering design, which is an implant for replacing a bone defect made of a purified coral skeleton and containing a therapeutically active substance, characterized in that a coral fragment is used as a coral component, purified from coral dust and microorganisms by rough mechanical surface treatment, washing in cold running water, alternating soaking / drying cycles with boiling, and subsequent sterilization, modeled in accordance with the shape and size another replaceable defect, and containing autologous multipotent mesenchymal stromal cells immobilized on the coral surface as a therapeutically active substance.

2. The bioengineered construction according to claim 1, characterized in that a structure of the type Acropora cervicornes is selected as the coral component.