RU2862425C2 - Аналоги птг для лечения гипопаратиреоза - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены конъюгаты, содержащие пептид паратиреоидного гормона, фармацевтические композиции на основе конъюгатов и их применение. Конъюгаты имеют увеличенное время действия по сравнению с известными нативными пептидами-агонистами паратиреоидного гормона, одновременно минимизируя избыточное действие вскоре после введения. Композиции, содержащие новые конъюгаты паратиреоидного гормона, можно использовать для лечения гипопаратиреоза и остеопороза. 8 н. и 16 з.п. ф-лы, 26 ил., 20 табл., 17 пр.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка заявляет приоритет следующих заявок: предварительной заявки на патент США №63/030004, поданной 26 мая 2020 г., и предварительной заявки на патент США №63/033586, поданной 2 июня 2020 г., раскрытие которых непосредственно включено в настоящий документ посредством ссылки.

Список последовательностей

Посредством ссылки в полном объеме включен машиночитаемый список нуклеотидных/аминокислотных последовательностей, представленный одновременно с настоящим документом и идентифицированный следующим образом: файл acii (текст) размером 80 килобайт с названием «338101Final_ST25.txt», созданный 24 мая 2021 г.

Уровень техники

В результате секреции паратиреоидного гормона (ПТГ) паращитовидная железа контролирует содержание кальция в крови в очень узком диапазоне (8-10 мг/дл у взрослых). Кальций, в большом количестве находящийся в костях, высвобождается в ответ на ПТГ, поддерживая функционирование центральной нервной системы, сокращение кровеносных сосудов и мышц, секрецию ферментов и гормонов и свертывание крови. Механистически ПТГ повышает концентрацию кальция, стимулируя выработку биологически активных форм витамина D в почках, одновременно мобилизуя кальций и фосфат для высвобождения из костей, «подавая сигнал» почкам об элиминации избытка фосфата и максимизируя реабсорбцию кальция в канальцах почек.

Гипопаратиреоз (гипо-ПТ) представляет собой редкое заболевание, при котором наблюдается недостаточная продукция ПТГ. У пациентов с гипо-ПТ имеет место повышенное выделение кальция с мочой, очень высокий уровень фосфата в крови и аномально низкое ремоделирование костной ткани. До официального разрешения к применению препарата Natpara^® (rhPTH) компании NPS/Shire Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов в январе 2015 г. гипопаратиреоз был одним из очень немногих классических эндокринных заболеваний, которые не подвергались лечению заместительной гормональной терапией. Препарат Natpara^® обеспечивает лишь умеренную эффективность по сравнению со стандартным лечением, состоящим из высоких доз кальция и добавок витамина D. Несмотря на это, препарат был хорошо принят с момента его коммерческого запуска в 2015 г., что свидетельствует о значительной неудовлетворенной потребности в лечении гипо-ПТ.

Поскольку гипо-ПТ является редким заболеванием, то лекарственные препараты, разрабатываемые для лечения гипо-ПТ, получают статус орфанных препаратов от FDA и Европейского агентства по лекарственным средствам (ЕМА). Каждый появляющийся конкурент направлен на восстановление ПТГ более физиологическим образом, чем препарат Natpara®, чтобы в первую очередь нормализовать уровень кальция в сыворотке и ослабить отдаленные последствия недостаточно контролируемого заболевания. Конкуренты отличаются своим подходом к нормализации ПТГ со значительными различиями в характеристиках продукта, которые включают пути введения, активность, частоту введения и терапевтический индекс.Композиции, раскрытые в настоящем документе, обеспечивают еженедельное лечение пациентов с гипо-ПВ, которое будет безопасно восстанавливать и поддерживать физиологические уровни ПТГ в течение недели, тем самым обеспечивая уникальный фармакологический эффект и значительное удобство для пациентов.

Гипо-ПТ можно разделить на первичное и вторичное заболевание. Первичное заболевание возникает при наличии внутренних дефектов паращитовидных желез по генетическим причинам. Наследственный гипо-ПТ встречается особенно редко, и полагается, что он составляет менее 10% от общего числа случаев. Вторичное или приобретенное заболевание возникает при нарушении, разрушении или удалении ранее функционирующей паращитовидной железы. На сегодняшний день вторичное заболевание является наиболее распространенным, составляя примерно 90% от общего числа случаев.

По меньшей мере, 75% случаев приобретенного гипо-ПТ вызваны хирургическим вмешательством в передней области шеи (т.е. тотальной тиреоидэктомии или радикальной диссекции шеи при злокачественных опухолях головы и шеи) в результате непреднамеренного или неизбежного удаления или повреждения паращитовидных желез и/или их кровоснабжения. Транзиторный гипо-ПВ после операции на щитовидной железе встречается относительно часто, примерно в 7-46% операций на щитовидной железе. Транзиторный гипо-ПВ разрешается в течение нескольких недель или месяцев после операции. Хронический гипо-ПТ встречается редко, с частотой 0,9-1,6% в хирургических центрах с опытными хирургами-эндокринологами и большим объемом случаев. Тем не менее, сообщалось о таких высоких показателях, на уровне 6,6%, после операции на щитовидной железе, что подчеркивает важность знаний и опыта во избежание необратимого повреждения, приводящего к развитию гипо-ПВ.

После операции в передней области шеи следующей наиболее частой причиной приобретенного гипо-ПВ у взрослых считается аутоиммунное заболевание. Оно может поражать либо только паращитовидные железы, либо многие железы внутренней секреции. По оценкам, аутоиммунное опосредованное заболевание вызывает менее 10% случаев приобретенного гипо-ПТ. Другие вторичные причины включают редкие инфильтративные нарушения в результате метастатического заболевания или перегрузки железом/медью, воздействия ионизирующего излучения, или заболевание может быть неизвестного происхождения (идиопатические).

Показатели распространенности гипо-ПТ в США колеблются от 60000 до 115000 пациентов. Эксперты предполагают, что наилучшая оценка, основанная на административной базе данных страхового медицинского обслуживания, составляет 77000 пациентов, из которых 58793 были застрахованы. Данные по другим регионам являются очень ограниченными, и задокументированные оценки варьируются от 70000 до 267000 для Европы, 20000 для Японии и 30000 для остального мира.

Хронический гипо-ПТ является все более распространенным заболеванием, что обусловленно болезнями щитовидной железы, включая рак и его лечение, в первую очередь хирургическим вмешательством. Например, в период с 1996 по 2006 г. общее количество тиреоидэктомий, выполненных в США, увеличилось на 39%, с 66864 до 92931. Установлено, что количество тиреоидэктомий, выполняемых в США каждый год, в настоящее время достигло 150000. Число людей, потенциально страдающих гипо-ПТ, растет. Поскольку заболевание щитовидной железы поражает женщин в большей степени, чем мужчин, то более 70% пациентов с гипо-ПТ составляют женщины.

Большинство людей, у которых уровень кальция находится за пределами нормального физиологического диапазона, чувствуют себя больными. За счет критической роли кальция в функционировании нервов и мышц пациенты с гипокальциемией могут испытывать покалывание или жжение в конечностях (парестезии), мышечные подергивания, мышечные боли, непроизвольные мышечные сокращения (тетания), сухость/шероховатость кожи, неспособность сконцентрироваться или сосредоточиться, тревогу и/или депрессию. Очень низкий уровень кальция в крови может вызвать опасный для жизни ларингоспазм, судороги или сердечные аритмии, требующие неотложной терапии внутривенным введением кальция. Серьезные отдаленные последствия гипо-ПТ могут включать нефрокальциноз, нарушение функции почек/хроническое заболевание почек, отложения кальция в мягких тканях и чрезмерную минерализацию костей.

Гипо-ПТ обычно диагностируется на основании клинического анамнеза и результатов лабораторных анализов. Диагноз обычно основывается на низких/неопределяемых уровнях ПТГ в сыворотке крови и гипокальциемии, определяемой как общий кальций в сыворотке ниже нижнего предела нормы, и гиперфосфатемии. Уровни активированного витамина D и маркеров ремоделирования костной ткани также обычно находятся в нижней части нормального или явно низкого диапазона, а экскреция кальция является повышенной. Такие результаты лабораторных анализов в контексте недавней операции на шее могут привести к однозначной постановке диагноза гипо-ПВ. Однако случаи гипо-ПТ могут очень трудно диагностироваться, особенно когда отсутствуют известные повреждения паращитовидной железы.

Отсутствуют четкие рекомендации по лечению гипо-РТ, поэтому лечение основано на опыте и клинической оценке. Общепринятыми первичными целями лечения хронических заболеваний является поддержание в допустимых пределах общего содержания кальция в сыворотке (от низкого до низкого нормального уровня), фосфора в сыворотке (высокий нормальный диапазон), 24-ч экскреции кальция с мочой (<7,5 ммоль/сутки) и продукта фосфата кальция (ниже 4,4 ммоль/л).

Стандартное лечение включает применение кальция, метаболитов витамина D и иногда тиазидных диуретиков. Рекомендуемыми добавками кальция являются карбонат кальция и цитрат кальция, и необходимое количество существенно различается (в 9 раз) среди пациентов. 1,25 (OH)₂D₃ (кальцитриол) является активным метаболитом витамина D и помогает поддерживать уровень кальция в сыворотке за счет повышения эффективности всасывания кальция в кишечнике. Кальцитриол также вводят в широком (8-кратном) диапазоне доз. Повышая реабсорбцию кальция в дистальных почечных канальцах, тиазидные диуретики (препараты группы бензотиадиазинов) также могут быть полезны в лечении гипо-ПТ.

Хотя восполнение дефицита кальция с помощью добавок с кальцием и витамином D может показаться простым, реальность такова, что добиться хорошего контроля чрезвычайно сложно. Большинство пациентов испытывают «американские горки» при дозировании, которое чередуется между слишком высокими и слишком низкими дозами. Кроме того, добавки кальция и витамина D не восстанавливают основной дефицит ПТГ, что имеет терапевтические последствия.

Пациенты с гипо-ПТ испытывают тяжелое бремя болезни, что оказывает существенное негативное влияние на качество их повседневной жизни, а также на жизнь их попечителей, семей и друзей. NFS Pharmaceuticals провела эпидемиологическое исследование PARADOX с участием 374 пациентов для оценки клинических, социальных и экономических последствий гипо-РТ. Данные были собраны с использованием 30-минутного веб-инструмента, который был разработан при участии клинических экспертов, Ассоциации гипопаратиреоза и пациентов. Данный инструмент в основном был распространен по электронной почте среди членов Ассоциации гипопаратиреоза, включая взрослых в США, которые имели гипо-ПТ в течение шести или более месяцев. Результаты были опубликованы Hadker et al. в Endocrine Practice со следующими ключевыми положениями:

72% испытывали более 10 симптомов в сутки, из которых наиболее часто сообщалось:

физические симптомы: утомляемость (82%), мышечные боли/спазмы (78%), парестезии (76%), тетания (70%), боль в суставах или костях (67%), боль или слабость в конечностях (53%);

эмоциональные симптомы: тревога (59%) и депрессия (53%);

когнитивные симптомы: помутнение сознания/умственная летаргия (72%), неспособность сконцентрироваться (65%), потеря памяти (61,5%) и нарушения сна (57%);

для 7 9% требовались госпитализация или посещения отделений неотложной помощи;

45% сообщили о значительном негативном влиянии на их жизнь;

85% сообщили о неспособности выполнять домашние дела, и

20% испытали связанные с болезнью (негативные) изменения в служебном положении.

Другие публикации также подтвердили нагрузку от болезни гипо-ПТ. В поперечном исследовании, результаты которого были опубликованы Arlt et al. в Европейском журнале эндокринологии, сравнивали благополучие и настроение с использованием валидированных опросников у 25 женщин с послеоперационным гипо-ПТ, которые стабильно лечились с использованием терапии кальцием и витамином D, с 25 женщинами с интактной функцией паращитовидной железы после операции на щитовидной железе. Пациентки с гипо-ПТ имели значительно более высокие общие баллы жалоб в Гиссенском опроснике, списке симптомов по шкале депрессии фон Церссена и контрольном списке симптомов-90 с увеличением баллов по подшкалам в отношении тревоги, тревожно-фобических расстройств и их физических эквивалентов. Важно отметить, что имеющийся в настоящее время общепринятый стандарт терапии гипо-ПТ не восстанавливал самочувствие у этих пациенток.

Часто желательно увеличить время высвобождения инъекционного препарата, чтобы увеличить продолжительность его действия или уменьшить его токсическое действие. Препаративные формы, которые легко растворяются в жидкостях организма, обычно быстро всасываются и обеспечивают внезапный «выброс» доступного лекарственного средства в отличие от более желательного и постепенного высвобождения фармакологически активного продукта.

Предпринимались разнообразные попытки для обеспечения контролируемого и длительного высвобождения фармацевтических соединений, но ранее описанные методики не имели успеха в преодолении всех проблем, связанных с технологией, таких как достижение оптимального продленного времени высвобождения, максимизации устойчивости и эффективности, снижения токсичности, максимизации воспроизводимости при получении и устранение нежелательных физических, биохимических или токсикологических эффектов, вызываемых нежелательными матричными материалами Следовательно, существует потребность в препаратах, которые безопасно и эффективно продлевают период полувыведения существующих фармацевтических средств и улучшают их терапевтический индекс от дозы к дозе и от пациента к пациенту. Это чрезвычайно важно для препаратов с узким терапевтическим индексом, чтобы отделить дозу, обеспечивающую эффективность, от дозы, вызывающей токсические эффекты. ПТГ, подобно инсулину или гормону щитовидной железы, считается таким лекарственным препаратом, при котором незначительное превышение уровня кальция за пределами физиологического диапазона имеет острые и хронические неблагоприятные последствия.

Механизмы обеспечения пролонгированного высвобождения и повышенного терапевтического индекса включают секвестрацию молекул в месте инъекции или использование форм пролекарственных производных фармацевтического препарата, где пролекарственное производное предназначено для задержки начала действия и пролонгации периода полувыведения лекарственного средства. Отсроченное начало действия выгодно тем, что оно обеспечивает системное распределение пролекарства до его перехода в активную форму. Соответственно, введение пролекарств может устранить осложнения, вызванные пиковой активностью при введении, и повысить терапевтический индекс исходного лекарственного средства.

Кроме того, распознавание рецепторов и последующий процессинг пептидных и белковых агонистов является основным путем деградации многих препаратов на основе пептидов и белков. Таким образом, связывание пептидного лекарственного средства с его рецептором будет приводить к биологической стимуляции, но также будет инициировать последующую деактивацию пептида/белка, индуцированную фармакологическим действием, в результате ферментативного расщепления пептида или белка. Следовательно, использование пролекарств может также отсрочить время действия вводимых лекарственных средств для обеспечения их равномерного распределения по всему организму до активации. Настоящее изобретение относится к композициям и способам для безопасной пролонгации биологического действия ПТГ с одновременной минимизацией избыточного действия вскоре после введения.

Сущность изобретения

В соответствии с настоящим изобретением ПТГ пептиды можно модифицировать для предупреждения их взаимодействия с соответствующим рецептором. Более конкретно, как раскрыто в настоящем документе, пептиды ПТГ можно обратимо модифицировать посредством связывания саморасщепляющегося неферментативным путем дипептида с лекарственным средством с образованием комплекса, который функционирует или в качестве депо-композиции, для локализации лекарственного средства в месте инъекции для высвобождения контролируемым образом и/или в качестве пролекарства, которое распределяется по всему организму, но не способно взаимодействовать со своим рецептором. Кроме того, такие пролекарственные производные ПТГ пептидов могут быть дополнительно модифицированы посредством ковалентного связывания с ацильной группой жирной кислоты или двухосновной кислоты с ПТГ пептидом для увеличения времени удерживания и пролонгации удерживания пролекарства и продолжительности действия пептида при расщеплении группы пролекарства.

Преимущественно, ПТГ конъюгаты по настоящему изобретению безопасно продлевают биологическое действие ПТГ, сводя к минимуму чрезмерное действие вскоре после введения. Таким образом, композиции, раскрытые здесь, обеспечивают для пациента возможность безопасно нормализовать кальций в сыворотке без опасности чрезмерного повышения уровня кальция, которое может иметь изменяющие жизнь последствия. Технология повышает удобство введения препарата для пациентов, что должно привести к повышению комплаентности к лечению. Как раскрыто в настоящем документе, аналоги ПТГ по настоящему изобретению демонстрируют увеличенную продолжительность действия, что позволяет вводить их пациентам один раз в неделю. Однако ежедневное введение пациентам также рассматривается в качестве метода, позволяющего еще более точно контролировать уровни кальция в сыворотке крови пациентов.

Композиции по настоящему изобретению можно вводить обычными путями, такими как подкожное введение. В одном варианте осуществления композиция формулирована для перорального введения путем совместной формуляции конъюгатов ПТГ по настоящему изобретению с усилителем всасывания, который может в достаточной степени повысить всасывание конъюгата ПТГ. N-[8-(2-гидроксибензоил)амино]каприлат натрия (SNAC) представляет собой средство для доставки, которое, как сообщается, повышает проницаемость для широкого спектра молекул, включая пептиды, такие как инсулин, GLP-1, кальцитонин и другие макромолекулы, такие как гепарин. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям для перорального введения, где композиция содержит конъюгат ПТГ по настоящему изобретению и SNAC, необязательно, где фармацевтическая композиция формулирована в виде таблетки.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к ацилированному конъюгированному производному паратиреоидного гормона, где производное имеет улучшенный терапевтический индекс и увеличенное время действия in vivo при введении теплокровным млекопитающим, включая, например, человека. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к ацилированному ПТГ пептиду из 31 аминокислоты, дополнительно модифицированному ковалентным связыванием с саморасщепляющимся дипептидом через амидную связь. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к ацилированному ПТГ пептиду из 32 аминокислот, дополнительно модифицированному ковалентным связыванием с саморасщепляющимся дипептидом через амидную связь. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к ацилированному ПТГ пептиду из 33 аминокислот, дополнительно модифицированному ковалентным связыванием с саморасщепляющимся дипептидом через амидную связь. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к ацилированному ПТГ пептиду из 34 аминокислот, дополнительно модифицированному ковалентным связыванием с саморасщепляющимся дипептидом через амидную связь. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к ацилированному ПТГ пептиду из 38 аминокислот, дополнительно модифицированному ковалентным

связыванием с саморасщепляющимся дипептидом через амидную связь. Более конкретно, в одном варианте осуществления модифицированный паратиреоидный гормон (ПТГ) представляет собой пептид из 33, 34 или 35 аминокислот с последовательностями SEQ ID NO: 2, 3 или 30 соответственно, где ПТГ пептид дополнительно модифицирован ковалентным связыванием с саморасщепляющимся дипептидом через амидную связь, необязательно по N-концевому альфа-амину ПТГ пептида.

В одном варианте осуществления ПТГ пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SVSEIQLMHX₁₀LGX₁₃HLX₁₆SX₁₈ERVEWLRX₂₆X₂₇LQDX₃₁H-Z, (SEQ ID NO: 133);

SVSEIQLMHX₁₀LX₁₂KHLX₁₆X₁₇X₁₈ERVEWLDRKKDLQDVH-Z; (SEQ ID NO: 134);

SVSEIQLMHX₁₀LGKHLX₁₆SX₁₈ERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 135) and

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKDQDVH-Z (SEQ ID NO: 7);

где Z представляет собой X₃₃, X₃₃F, X₃₃FX₃₅, X₃₃FVX₃₅, X₃₃FVAX₃₅, X₃₃FVADX₃₅, X₃₃FVADGX₃₅, X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₅₃FVAX₃₅, X₅₃FVALX₃₅, or X₅₃FVADGX₃₅, где необязательно Z представляет собой X₃₃, X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₅₃FVAX₃₅, X₅₃FVALX₃₅ или X₅₃FVADGX₃₅;

Х₁₀ и Х₁₆ независимо представляют собой Asp, Gln или Asn;

Х₁₂ представляет собой Gly или Aib;

Х₁₇ представляет собй аминоизомасляную кислоту (Aib) или Ser;

Х₁₈ представляет собой Met, Met(О), Leu или Nleu;

X₁₃, Х₂₆ и Х₂₇ независимо выбраны из группы, состоящей из Arg, Glu, Asp и Lys;

Х₃₁ представляет собой Gly или Val;

Х₃₃ и Х₃₅ каждый содержит ацилированную аминокислоту, содержащую С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер, где необязательно ацилированная аминокислота выбрана из группы, состоящей из Lys, dLys, орнитин, Cys и гомоцистеин;

Х₅₃ представляет собой Gln или Asn, необязательно при условии, что не более чем один из X₁₂, X₁₆ и X₁₇ представляет собой Aib, и где необязательно С-концевая аминокислота модифицирована для замещения карбоксиконца амидом. В некоторых вариантах осуществления ПТГ пептид дополнительно содержит саморасщепляющийся дипептид, ковалентно связанный с указанным ПТГ пептидом через амидную связь, где саморасщепляющийся дипептид необязательно ковалентно связан с N-концевым альфа-амином ПТГ пептида. В одном варианте осуществления саморасщепляющийся дипептид имеет структуру А-В, где:

А представляет собой аминокислоту, необязательно ацилированную аминокислоту, содержащую С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер; и

В представляет собой N-алкилированную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления ПТГ пептид содержит эпсилон-ацилированный Lys, эпсилон-ацилированный dLys, орнитин, эпсилон-ацилированный орнитин, цистеин, S-ацилированный цистеин, гомоцистеин или S-ацилированный гомоцистеин, где необязательно ацилированная аминокислота представляет собой С-концевую аминокислоту ПТГ пептида.

В некоторых вариантах осуществления ПТГ пептид дополнительно содержит неприродную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления ПТГ пептид содержит 1, 2 или 3 аминокислотные замены. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой консервативные замены.

В некоторых вариантах осуществления замены сделаны неконсервативными аминокислотами. В некоторых вариантах осуществления ПТГ пептиды по настоящему изобретению включают одну или более неприродных аминокислот. Неограничивающие примеры неприродных аминокислот для использования в ПТГ пептиде по настоящему изобретению включают производные фенилаланина, содержащие бензофеноновые, кетоновые, йодидные или азидные заместители; O-пропаргилтирозин; α-аминокапроновую кислоту, O-метилтирозин, О-нитробензилцистеин; 3-(нафталин-2-иламино)-2-аминопропановую кислоту; пара-замещенные производные фенилаланина, такие как n-аминофенилаланин и n-метоксифенилаланин; метазамещенные производные тирозина, такие как 3-аминотирозин, 3-нитротирозин, 3,4-дигидроксифенилаланин и 3-йодтирозин; фенилселеноцистеин; n-боронофенилаланин; о-нитробензилтирозин; амид- и карбаматзамещенные лизины, такие как 2-амино-6-((R)-тетрагидрофуран-2-карбоксамидо)гексановая кислота, N-ε-D-пролил-L-лизин и N-ε-циклопентилоксикарбонил-L-лизин; N-ε-акрилоил-L-лизин; N-ε-[(1-(6-нитробензо[d][1,3]диоксол-5-ил)этокси)карбонил]-L-лизин; азидоаланин; 2-(4'-пентенил)аланин; аланиналь; и N-ε-(1-метилциклопро-2-енкарбоксамидо)лизин.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату ПТГ, содержащему любой из ПТГ пептидов, раскрытых в настоящем документе, и саморасщепляющийся дипептид, ковалентно связанный с указанным ПТГ пептидом через амидную связь, необязательно с N-концевым альфа-амином ПТГ пептида. В одном варианте осуществления конъюгат содержит ПТГ пептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SVSEIQLMHNLX₁₂X₁₃HLX₁₆X₁₇MERVEWLRX₂₆X₂₇LQDX₃₁H-Z (SEQ ID NO: 4),

SVSEIQLMHNLGX₁₃HLNSMERVEWLRX₂₆X₂₇LQDX₃₁H-Z (SEQ ID NO: 5),

SVSEIQLMHNLX₁₂KHLX₅₆X₁₇MERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 6);

SVSEIQLMHX₁₀LGKHLX₁₆SX₁₈ERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 135); и

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7) где:

Z представляет собой X₃₃F, X₅₃FX₃₅, X₃₃FX₃₅ или X₃₃, необязательно Z представляет собой X₅₃FX₃₅ или X₃₃;

X₁₀ и X₁₆ независимо представляют собой Asp, Gln или Asn;

X₁₂ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Gly;

X₅₆ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Asn;

Х₁₇ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Ser;

Х₁₈ представляет собой Met, Met(О) или Nleu;

X₁₃, Х₂₆ и Х₂₇ независимо выбраны из группы, состоящей из Arg, Glu, Asp и Lys, где необязательно Х₁₃, Х₂₆ и Х₂₇ независимо выбраны из Glu и Lys;

Х₃₁ представляет собой Gly или Val;

Х₃₃ и Х₃₅ каждый содержит ацитилированную аминокислоту;

Х₅₃ представляет собой Gln, Asp, Glu или Asn, где необязательно Х₅₃ представляет собой Asn,

необязательно при условии, что только один из X₁₂, X₁₆ и X₁₇, представляет собой Aib; где:

саморасщепляющийся дипептид конъюгата имеет общую структуру А-В-;

где:

А представляет собой ацилированную аминокислоту; и

В представляет собой N-алкилированную аминокислоту; где указанная ацилированная аминокислота каждого Х₃₃, Х₃₅ и А представляет собой аминокислоту, содержащую С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер, и где саморасщепляющийся дипептид связан с указанным ПТГ пептидом посредством образования амидной связи между В и первичным амином ПТГ пептида, где необязательно первичный амин расположен на боковой цепи замещенного лизина, находящегося в положении 13, 16, 19, 22 или 26, или N-концевой альфа-амин ПТГ пептида. В еще одном варианте осуществления аминокислота «А» саморасщепляющегося дипептида представляет собой остаток лизина, ацилированного С16-С30 жирной кислотой или С16-С30 двухосновной кислотой. В одном варианте осуществления А и В выбраны так, чтобы обеспечить полупериод (t1/2) химического отщепления А-В от указанного ПТГ пептида, составляющий по меньшей мере примерно от 24 ч до примерно 240 ч, примерно от 48 ч до примерно 168 ч, примерно от 48 ч до примерно 120 ч или примерно от 70 до примерно 120 ч, примерно от 80 до примерно 120 ч, примерно от 90 до примерно 120 ч или примерно от 100 до примерно 120 ч в стандартном растворе PBS в физиологических условиях. В одном варианте осуществления С-концевая аминокислота любого из конъюгатов ПТГ, раскрытых здесь, может быть модифицирована для замещения нативной карбоксильной группы на амид.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к конъюгированному производному ПТГ, где саморасщепляющийся дипептид ковалентно связан с N-концевым альфа-амином указанного ПТГ пептида через амидную связь, где ПТГ пептид содержит последовательность

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHX33-Z (SEQ ID NO: 2),

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHFNX35 SEQ ID NO: 15) или SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHX33 SEQ ID NO: 2), где:

X₃₃ и X₃₅ каждый независимо представляют собой аминокислоту, где боковая цепь аминокислоты ацилирована С16-С20 жирной кислотой или С16-С20 двухосновной кислотой, где необязательно Х₃₃ и Х₃₅ независимо выбраны из С16-С20 ацилированного лизина, С16-С20 ацилированного орнитина, С16-С20 ацилированного цистеина и С16-С20 ацилированного гомоцистеина, где необязательно оба Х₃₃ и Х₃₅ представляют собой С16-С20 ацилированный Lys; Z выбран из группы, состоящей из F-R, FV-R, FVA-R, FVAL-R, FVALG-R и FVALGA-R, где R представляет собой СООН или CONH₂, и указанный саморасщепляющийся дипептид представляет собой дипептид со структурой:

R₁ представляет собой боковую цепь, выбранную из группы, состоящей из C₁-C₁₈ алкила, (C₁-C₄ алкил)OH, (C₁-C₄ алкил)SH, (C₁-С₄ алкил)СООН, and (C₁-C₄ алкил)NH₂, где необязательно С16-С20 жирная кислота или С16-С20 двухосновная кислота ковалентно связана с указанной боковой цепью;

R₂, R₄ и R₈ независимо представляют собой Н или С₁-С₄ алкил;

R₃ представляет собой С₁-С₄ алкил или R₄ и R₃, взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, включая, например, пирролидиновое кольцо; и

R₅ представляет собой NH₂, при условии, что, когда R₄ и R³, взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют 5-или 6-членное гетероциклическое кольцо, включая, например, пирролидиновое кольцо, то R₂ не представляет собой Н. В одном варианте осуществления ацилированная аминокислота А, Х₃₃ и Х₃₅ независимо выбрана из аминокислоты, имеющей общую структуру:

где n представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4, и R₅₀ выбран из группы, состоящей из NH-CO (СН₂)_14-20СООН, NH-[спейсер]-СО(СН₂)_14-20СООН, S(СН₂)_14-20СООН, S- [спейсер]-СО (СН₂)_14-20СООН, N=N=N-[спейсер]-СО(СН₂)₁₄-₂₀СОО, НС≡С - [спейсер]-СО(СН₂)_14-20СОО, и СНО-[спейсер]-СО(СН₂)_14-20СОО. В одном варианте осуществления ацилированная аминокислота А, Х₃₃ и Х₃₅ независимо выбрана из лизина, d-лизина, орнитина, цистеина, гомоцистеина, азидоаланина, 2-(4'-пентенил)аланина или аланиналя, где боковая цепь указанной ацилированной аминокислоты ковалентно связана с С16-С22 жирной кислотой или С16-С22 двухосновной кислотой, необязательно через спейсер, содержащий аминокислоту или дипептид. В одном варианте осуществления спейсер содержит гамма-глутаминовую кислоту. В одном варианте осуществления необязательный спейсер содержит две гамма-глутаминовые кислоты, где необязательно две гамма-глутаминовые кислоты соединены друг с другом через промежуточный функционализированный ПЭГ-полимер, [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_кHN_]q, где к и q представляют собой целые числа, независимо выбранные из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8. В одном варианте осуществления спейсер представляет собой -{гамма-глутаминовая кислота- [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)₂NH-COCH₂ (ОСН₂СН₂)₂]NH-гамма-глутаминовая кислота}-. В еще одном варианте осуществления саморасщепляющийся дипептид имеет структуру формулы I, где R₁ представляет собой (С₁-С₄ алкил)NH-CO (СН₂)₁₄-₂₀СООН или (C₁-C₄ алкил)NH-[спейсер]-СО (СН₂)_14-20СООН; R₂ и R₈ каждый представляет собой Н; R₄ представляет собой Н или СН₃; R₃ представляет собой СН₃, и R₅ представляет собой NH₂, где необязательно первая аминокислота саморасщепляющегося дипептида представляет собой аминокислоту в D-стереохимической конфигурации, и спейсер выбран из группы, состоящей из гамма-глутаминовой кислоты, дипептида гамма-глутаминовая кислота-гамма-глутаминовая кислота и гамма-глутаминовая кислота - [СОСН₂(ОСН₂СН₂)_кHN_]q-гамма-глутаминовой кислоты, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8 или 2-4, и q равно 1, 2, 4 или 8. В одном варианте осуществления к равно 2 или 4, и q равно 1 или 2.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей любой из новых конъюгатов ПТГ, описанных в настоящем документе, предпочтительно с уровнем чистоты, по меньшей мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент. Такие композиции могут содержать конъюгат ПТГ, описанный здесь в концентрации, по меньшей мере, 0,1-10 мг/мл или выше. В одном варианте осуществления фармацевтические композиции содержат водные растворы, которые стерилизованы и необязательно хранятся в различных упаковочных контейнерах. В еще одних вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат лиофилизированный порошок. Фармацевтические композиции могут быть дополнительно упакованы в виде части набора, который включает одноразовое устройство для введения композиции пациенту. Контейнеры или наборы могут быть маркированы для хранения при комнатной температуре или в холодильнике.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу лечения гипопаратиреоза у пациентов, нуждающихся в этом. Способ включает стадии введения конъюгата ПТГ по настоящему изобретению в количестве, терапевтически эффективном для контроля гипопаратиреоза. В одном варианте осуществления ПТГ пептид ацилирован группой жирной кислоты или двухосновной кислоты достаточного размера для связывания с сывороточным альбумином с высокой аффинностью, и, кроме того, ПТГ пептид связан с саморасщепляющимся дипептидом, где аминокислота дипептида необязательно ацилирована группой жирной кислоты или двухосновной кислоты достаточного размера для связывания с сывороточным альбумином с высокой аффинностью.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к усовершенствованному способу лечения остеопороза или остеопении у пациентов, нуждающихся в этом. Способ включает стадии введения конъюгата ПТГ по настоящему изобретению в количестве, терапевтически эффективном для контроля уровней кальция в сыворотке. В одном варианте осуществления ПТГ пептид ацилирован группой жирной кислоты или двухосновной кислоты достаточного размера для связывания с сывороточным альбумином с высокой аффинностью, и, кроме того, ПТГ пептид связан с саморасщепляющимся дипептидом, где аминокислота дипептида необязательно ацилирована группой жирной кислоты или двухосновной кислоты достаточного размера для связывания с сывороточным альбумином с высокой аффинностью. Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлен график, показывающий эффект препарата Natpara® (SEQ ID NO: 1) на уровень экскреции кальция с мочой у людей. Уровни ПТГ в плазме крови и уровень экскреции кальция с мочой во времени показаны после подкожного введения препарата Natpara® в дозе 100 мкг.Несмотря на то, что препарат Natpara® эффективен в восстановлении потери кальция, данное соединение имеет недостаточную продолжительность действия, в результате чего адекватный контроль уровня кальция в сыворотке ограничивается только 1/3 суток с избыточными максимумами и минимумами в течение оставшегося времени.

На фиг. 2А-2 В показано использование дипептида для образования пролекарства ПТГ. На фиг. 2А приведено схематичное представление реакции, в результате которой отщепляется связанный амидом дипептид от конъюгата ПТГ с образованием биологически активного ПТГ пептида и дикетопиперазина (DKP). На фиг. 2 В показано, что химическое отщепление является линейной реакцией нулевого порядка, не зависящей от концентрации и не требующей дополнительных компонентов (ферментов или

катализаторов). Скорость реакции при определенном рН и температуре зависит от конкретного дипептида и может регулироваться в пределах от менее чем 30 мин до более чем 500 ч.

На фиг. ЗА и ЗВ показана способность аналогов ПТГ стимулировать рецептор ПТГ в клетках, стабильно

трансфектированных рецептором-1 ПТГ, с использованием люциферазы в качестве репортера продукции цАМФ. На фиг. ЗА представлены данные для SEQ ID NO: 9, 10, 11 и 12, и на фиг. ЗВ представлены данные для SEQ ID NO: 9, 12, 13 и 14. Аминокислотные последовательности аналогов ПТГ представлены ниже. Данные демонстрируют, что аналоги ПТГ, в которых ПТГ пептид из 35 аминокислот ковалентно модифицирован добавлением ацилированного лизина (имеющего цепь С18 двухосновной жирной кислоты, связанную с его боковой цепью) в положении 35, сохраняют высокую активность в отношении рецептора ПТГ (SEQ ID NO: 12), в то время как присоединение ацилированного дипептида (SEQ ID No: 10, 11 и 14) к ПТГ (1-34) снижает активность, и комбинация присоединения ацилированного дипептида к N-концу и ацилирования по карбоксильной группе концевой аминокислоты также приводит к низкой активности (SEQ ID NO: 13).

На фиг. 4 показана способность аналогов ПТГ из 33 аминокислот (содержащих последовательность ПТГ SEQ ID NO: 2) стимулировать рецептор ПТГ в клетках, стабильно трансфектированных рецептором-1 ПТГ, с использованием люциферазы в качестве репортера продукции цАМФ. SEQ ID NO: 18 представляет собой аналог ПТГ, содержащий аланиновую замену в положении 8, которая снижает активность ПТГ на рецепторе ПТГ. Данные демонстрируют, что, подобно аналогам ПТГ из 34 аминокислот, добавление цепи жирной кислоты к С-концу аналога ПТГ из 33 аминокислот сохраняет высокую активность исходного соединения (SEQ ID NO: 16), но комбинация дипептида с ацилированием жирной кислотой на карбоксиконце снижает активность (SEQ ID NO: 17):

На фиг. 5А-5С представлены графики, демонстрирующие in vivo эффективность на мышах аналогов ПТГ, содержащих ацилированную аминокислоту на С-конце ПТГ пептида, для повышения уровня кальция в сыворотке крови (фиг. 5А) и снижения уровня фосфата в сыворотке крови (фиг. 5В) дозозависимым образом в течение длительного периода времени 72 ч.

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHK (γЕ-COC₁₆H₃₂CO₂H) F-OH (SEQ ID NO: 102). На фиг. 5С представлен график, демонстрирующий in vivo эффективность дополнительных ацилированных аналогов ПТГ на мышах (РТН(1-34), K33 (γЕ-двухосновная кислотаС18) (SEQ ID NO: 102); РТН(1-33), K33 (γЕ-двухосновная кислотаС18) (SEQ ID NO: 74) и РТН(1-33), K33 (γЕ-(миниПЭГ)2-γЕ-двухосновная кислотаС18) (SEQ ID NO: 77) для повышения уровня кальция в сыворотке крови.

На фиг. 6А и 6В представлены результаты фармакокинетических (ФК) исследований для определения времени появления и исчезновения у мышей с использованием аналогов ПТГ, предназначенных для длительного действия, но не способных превращаться в активное лекарственное средство. Каждое соединение вводили мышам подкожно в дозе 100 нмоль/кг. На фиг. 6А приведены данные для (dK) GSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHK (γЕ-(миниPEG)₂-γЕ-COC₁₆H₃₂CO₂H)-ОН (SEQ ID NO: 78); (dK) GSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHK (yE-(mini PEG)₂-γE-COC₁₈H₃₂CO₂H)-OH (SEQ ID NO: 84); и (dK)(γE-(mini PEG)₂-γE-COC₁₆H₃₂CO₂H) GSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHK (γE-(mini PEG)₂-γE-COC₁₆H₃₂CO₂H)-OH (SEQ ID NO: 79). На фиг. 6B приведены те же данные, что и на фиг. 6А, для SEQ ID No: 78, 84 и 79, но выраженные в логарифмической форме. На фиг. 6А и 6В показано значение длины ацильной группы жирной кислоты и различие между ацилированными и диацилированными аналогами ПТГ по настоящему изобретению.

На фиг. 7А и 7В представлены результаты фармакокинетических (ФК) исследований для определения времени удерживания у обезьян, которым вводили пролекарство ПТГ-аналога однократно подкожно в дозе 25 нмоль/кг, где ПТГ пептид был модифицирован аланиновой заменой в положении 8 для создания ПТГ-аналога с низкой активностью. На фиг. 7А представлен график, демонстрирующий детектированные уровни пролекарства ПТГ-аналога SEQ ID NO: 94: ПТГ(1-33), А8, K33(γЕ-2хОЕС-γЕ-двухосновная кислотаС18) dK_₁, N(Me)G₀; и его активированной формы SEQ ID NO: 93: РТН(1-33), А8, K33(γЕ-2хОЕ6-γЕ-двухосновная кислотаС18) во времени после введения однократной дозы пролекарства (SEQ ID NO: 94). На фиг. 7В представлен график, демонстрирующий детектированные уровни пролекарства ПТГ-аналога SEQ ID NO: 95: ПТГ(1-33), А8, K33(γЕ-2хОЕ6-γЕ-двухосновная кислотаС18) dK-1(γE-2xOEG)-γЕ-двухосновная кислотаС18), N(Me)G0 и его активированной формы: SEQ ID NO: 93: РТН(1-33), А8, K33(γЕ-2хОЕС-γЕ-двухосновная кислотаС18) во времени после введения однократной дозы пролекарства (SEQ ID NO: 95). Данные демонстрируют накопление активной формы во времени, которое совпадает с уменьшением пролекарственной формы, что приводит к относительно постоянному количеству активной формы в течение длительного периода времени. Пролекарство с двойным ацилированием жирными кислотами (SEQ ID: 95) достигает более высокой концентрации, которая поддерживается в течение более длительного периода, чем пролекарство с одним ацилированием жирной кислотой (SEQ ID: 94).

На фиг. 7С представлены те же результаты по концентрации лекарственного средства, что и на фиг. 7А, но выраженные по логарифмической шкале.

На фиг. 7D представлены те же результаты концентрации лекарственного средства, что и на фиг. 7 В, но выраженные по логарифмической шкале.

На фиг. 8А-8С показана функциональная ответная реакция продукции циклического АМФ в клетках CHO-K1 PTHR1, использованных в биоанализе cAMPHunter Teriparitide, описанном в примере 11, в ответ на обработку, на фиг. 8А, РТН(1-34), агонистом РТН по настоящему изобретению SEQ ID NO: 77; на фиг. 8В, нерасщепляемым пролекарством SEQ ID NO: 79; на фиг. 8С, РТН(1-34) и расщепляемым пролекарством SEQ ID NO: 87.

На фиг. 9A-9F приведены результаты ЖХ-МС для пролекарства ПТГ по настоящему изобретению, SEQ ID NO: 87, с его активной лекарственной формой, SEQ ID NO: 77, в буфере PBS в течение 8 суток. Пик со временем удерживания 7,3 мин соответствует пролекарству, и на фиг. 9А на сутки 0 это единственный пик. На фиг. 9В на сутки 1 наблюдается начало появления пика активного лекарственного средства на 6,5 мин. На фиг. 9С и 9D, 2 суток и 3 суток соответственно, активного лекарственного средства все еще меньше, чем пролекарства. На фиг. 9Е и 9F, 5 и 8 суток соответственно, больше активного лекарственного средства, чем пролекарства.

На фиг. 10 представлен график с данными анализа ЖХ-МС из примера 11, адаптированный к кинетике реакции нулевого порядка. Анализ ЖХ-МС показывает превращение пролекарства SEQ ID NO: 87 в активное лекарственной средство SEQ ID NO: 77 в течение 192 ч и показывает период полувыведения, равный 112 ч, с высокой линейной корреляцией (R>0,99).

На фиг. 11 показана функциональная ответная реакция продукции циклического АМФ в клетках СНО-К1 PTHR1 по данным биоанализа cAMPHunter Teriparitide после различной продолжительности инкубации, от 0 до 8 суток обработки, как показано на фиг. 9A-9F, пептидами по настоящему изобретению с SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 77 или с РТН(1-34).

На фиг. 12 показана функциональная ответная реакция продукции циклического АМФ в клетках СНО-K1 PTHR1 по данным биоанализа cAMPHunter Teriparitide после обработки пептидами с SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 109 и SEQ ID NO: 110.

На фиг. 13A и 13В показана функциональная ответная реакция продукции циклического АМФ в клетках СНО-К1 PTHR1 по данным биоанализа cAMPHunter Teriparitide после обработки пептидами, на фиг. 13А: SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 118 и SEQ ID NO: 120; и на фиг. 13B: SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 122 и SEQ ID NO: 124.

На фиг. 14A и 14В представлены графики абсолютных уровней кальция в сыворотке крови (фиг. 14А) и относительных изменений уровней кальция (фиг. 14В) у мышей после обработки носителем, 20 или 40 нмоль/кг аналога ПТГ с SEQ ID NO: 77 в течение периода времени 48 ч.

На фиг. 15 показана концентрация в сыворотке крысы в течение одной недели после введения пролекарства SEQ ID NO: 87 и активного лекарственного средства SEQ ID NO: 77. Вводили подкожно однократную дозу либо пролекарства, либо активного лекарственного средства и концентрации в сыворотке определяли в течение недели. Также измеряли количество активного лекарственного средства, образовавшегося из пролекарства (черная пунктирная линия, отмечено квадратами).

На фиг. 16А и 16В показана абсолютная концентрация кальция в сыворотке крови и ее изменение у крыс в течение недели после подкожного введения пролекарства SEQ ID NO: 87 в дозе 30 или 60 нмоль/кг.

На фиг. 17А и 17В показаны абсолютная концентрация фосфата в сыворотке и ее изменение у крысы в течение недели после подкожного введения пролекарства SEQ ID NO: 87 в дозе 30 или 60 нмоль/кг.

На фиг. 18А и 18В представлены графики изменения уровней кальция в сыворотке крови (фиг. 18А) и уровней фосфата в сыворотке крови (фиг. 18В) у крыс Sprague-Dawley после ежедневных подкожных инъекций носителя, 20 нмоль/кг активного лекарственного средства с SEQ ID NO: 77, 20 нмоль/кг или 40 нмоль/кг пролекарства с SEQ ID NO: 87.

На фиг. 19А и 19В представлены графики концентрации в сыворотке крови пролекарства с SEQ ID NO: 87 (фиг.19А) и активного лекарственного средства с SEQ ID NO: 77 (фиг. 19В) у крыс после семи ежедневных подкожных инъекций, начиная с суток 0, с измерениями на разные временные точки в течение более 144 ч. Имеет место 4-кратная разница в общей концентрации пролекарства в сравнении с лекарственным средством.

На фиг. 20А и 20В представлены графики, показывающие уровни кальция у грызунов, обработанных в течение 28 суток повторными ежедневными дозами носителя, начиная с суток 0; 4, 8, и 12 нмоль/кг пролекарства SEQ ID NO: 87 в течение 28 суток (фиг. 20А), и вымывания уровней кальция после последней дозы на сутки 28 (фиг. 20В).

На фиг. 21 представлены результаты фармакокинетического анализа с использованием ЖХ-МС превращения пролекарства в лекарственное средство при различных начальных дозах (4, 8 или 12 нмоль/кг) пролекарства SEQ ID NO: 87 у крыс с повторным введением дозы в течение 28 суток, как подробно описано в примере 5. Сплошные линии показывают концентрацию пролекарства в нМ в плазме крови, тогда как соответствующая пунктирная линия представляет собой концентрацию в плазме активного лекарственного средства с SEQ ID NO: 77.

На фиг. 22 представлены результаты фармакокинетического анализа с использованием ЖХ-МС меньшей временной части фиг. 21, и он показывает уровни концентрации в плазме активного лекарственного средства (нештрихованные столбцы) и пролекарства (белые штрихованные столбцы) после прекращения повторного введения дозы из примера 15 и изменение концентрации в плазме крови через несколько часов (2, 7 и 24) после введения последней дозы.

На фиг. 23 представлен график концентрации кальция в плазме крови у крыс, представляющих собой модель заболевания, с контрольной крысой, подвергшейся хирургическому вмешательству (имитация), и другими крысами с хирургической паратиреоидэктомией, где затем им вводили либо носитель, либо 10, 25 или 40 нмоль/кг пролекарства с SEQ ID NO: 87. Дозы вводили до времени каждого измерения, проводимого на временные точки 0, 24, 48, 72 ч, которое было последней дозой, и дополнительным измерением, проводимым через 144 ч, через 72 ч после введения последней дозы.

На фиг. 24 представлен график, показывающий уровни кальция в сыворотке у крыс, представляющих собой модель заболевания, с плацебо-контролем, как описано в примере 5. Крысам вводили носитель или различные дозы соединения, 10, 25 и 40 нмоль/кг пролекарства SEQ ID NO: 87, которые вводили ежедневно в течение 10 суток и анализ проводили в течение 25 суток.

На фиг. 25 представлен график, показывающий уровни фосфата в сыворотке крови у крыс, представляющих собой модель заболевания, с ложным контролем, как описано в примере 5. Крысам вводили носитель или различные дозы соединения, 10, 25 и 40 нмоль/кг пролекарства SEQ ID NO: 87, которые вводили ежедневно в течение 10 суток и анализ проводили в течение 25 суток.

На фиг. 26А и 26В представлены графики концентрации в сыворотке крови пролекарства SEQ ID NO: 87 (фиг. 26А) и активного лекарственного средства SEQ ID NO: 77 (фиг. 26В) у обезьян после подкожного введения различных доз пролекарства SEQ ID NO: 87 (2,5, 3, 75 и 5,0 нмоль/кг). Имеет место примерно 4-кратная разница между пролекарством и лекарством.

Подробное описание изобретения

Определения

В описании и формуле изобретения будет использоваться следующая терминология в соответствии с определениями, приведенными ниже.

В рамках настоящего изобретения, термин «ПТГ пептид» включает любой пептид, содержащий либо аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, либо любой аналог аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, включающий аминокислотные замены, добавления, делеции или посттрансляционные модификации (например, метилирование, ацилирование, алкилирование, пэгилирование и т.п.) пептида, где аналог стимулирует повышенное содержание кальция в крови при введении пациенту.

В рамках настоящего изобретения, термин «примерно» означает больше или меньше чем указанная величина или диапазон величин, на 10%, но предназначен для ограничения любой величины или диапазона величин только этому более широкому определению. Каждая величина или диапазон величин, которым предшествует термин «примерно», также предназначен для включения варианта осуществления указанной абсолютной величины или диапазона величин.

В рамках настоящего изобретения, термины «нативный» или «природный» определяют состояние, встречающееся в природе. «Нативная аминокислота» представляет собой находящуюся в природе аминокислоту, которая продуцировалась естественным путем.

В рамках настоящего изобретения, термин «аминокислота» охватывает любую молекулу, содержащую как аминогруппу, так и карбоксильные функциональные группы, где аминогруппа и карбоксильная группа присоединены к одному и тому же углероду (альфа-углероду). Альфа-углерод необязательно может иметь один или два дополнительных органических заместителя. Аминокислота может быть обозначена ее трехбуквенным кодом, однобуквенным кодом или, в некоторых случаях, по названию ее боковой цепи. Например, неканоническая аминокислота, содержащая циклогексановую группу, присоединенную к альфа-углероду, называется «циклогексан» или «циклогексил». Для целей настоящего описания обозначение аминокислоты без указания ее стереохимии предназначено для охвата либо L-, либо D-формы аминокислоты, либо рацемической смеси. Однако в случае, когда аминокислота обозначается своим трехбуквенным кодом (например, Lys) или одной буквой (например, K), то такое обозначение предназначено для указания нативной L-формы аминокислоты, тогда как D-форма будет указана путем включения строчной буквы d перед трехбуквенным кодом или одиночным кодом (т.е. dLys или dK). Используемое здесь обозначение конкретной аминокислоты предназначено для охвата нативной аминокислоты, а также любого ее изотопно-обогащенного производного, которое отличается по молекулярной массе от нативной аминокислоты, но имеет физические и биологические свойства, эквивалентные нативной аминокислоте.

В рамках настоящего изобретения, термин «гидроксильная кислота» относится к аминокислотам, которые были модифицированы для замещения альфа-углеродной аминогруппы гидроксильной группой.

В рамках настоящего изобретения, термин «некодируемая (неканоническая) аминокислота» охватывает любую аминокислоту, которая не является L-изомером любой из следующих 20 аминокислот: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr.

«Дипептид» является результатом соединения альфа-аминокислоты или альфа-гидроксильной кислоты с другой аминокислотой через пептидную связь.

В рамках настоящего изобретения, термин «химическое расщепление» без какого-либо дополнительного обозначения охватывает неферментативную реакцию, которая приводит к разрушению ковалентной химической связи.

«Биоактивный пептид» относится к пептидам, которые могут оказывать биологическое действие in vitro и/или in vivo. Используемая в настоящем описании общая ссылка на пептид предназначена для охвата пептидов, которые имеют модифицированные амино- или карбоксиконцы. Например, аминокислотная последовательность, обозначающая стандартные аминокислоты, предназначена для включения стандартных аминокислот на N- и С-конце, а также соответствующей гидроксильной кислоты на N-конце и/или соответствующей С-концевой аминокислоты, модифицированной для включения амидной группы вместо концевой карбоновой кислоты.

В рамках настоящего изобретения термин «ацилированная» аминокислота представляет аминокислоту, содержащую ацильную группу, которая не является нативной для естественно встречающейся аминокислоты, независимо от способа ее получения. Иллюстративные способы получения ацилированных аминокислот и ацилированных пептидов известны в данной области и включают ацилирование аминокислоты перед включением в пептид или пептидным синтезом с последующим химическим ацилированием пептида. В некоторых вариантах осуществления ацильная группа приводит к наличию у пептида одного или более из: (i) длительного периода полувыведения из кровотока, (ii) отсроченного начала действия, (iii) увеличенной продолжительности действия, (iv) повышенной устойчивости к протеазам, таким как DPP-IV, и (v) измененной активности на рецепторе ПТГ.

В рамках настоящего изобретения, термин «алкилированная» аминокислота представляет собой аминокислоту, содержащую алкильную группу, которая не является нативной для встречающейся в природе аминокислоты, независимо от способа ее получения. Иллюстративные способы получения алкилированных аминокислот и алкилированных пептидов известны в данной области и включают алкилирование аминокислоты перед включением в пептид или пептидным синтезом с последующим химическим алкилированием пептида.

В рамках настоящего изобретения, термин «пролекарство» определяется как любое соединение, которое подвергается химической модификации перед проявлением его фармакологических эффектов.

В рамках настоящего изобретения, термин «рецептор» представляет собой молекулу, которая распознает и связывается со специфическими молекулами в высокоаффинном взаимодействии, генерируя определенный биологический эффект (прямо или опосредованно) в клетке или на клетках и/или тканях организма-хозяина. «Клеточный рецептор» представляет собой молекулу на поверхности или внутри клетки, которая распознает и связывается со специфическими молекулами, производя некоторый эффект (прямой или косвенный) в клетке.

В рамках настоящего изобретения, термин «идентичность» относится к сходству между двумя или более последовательностями. Идентичность измеряется делением количества идентичных аминокислотных остатков на общее количество остатков и умножением произведения на 100 с получением процента. Таким образом, две копии одной и той же последовательности имеют 100% идентичность, в то время как две последовательности, имеющие аминокислотные делеции, добавления или замены относительно друг друга, имеют более низкую степень идентичности. Специалистам в данной области известно, что несколько компьютерных программ, таких как те, которые используют алгоритмы, такие как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:4 03-410), доступны для определения идентичности последовательности.

Термин «ПТГ пептид» относится к таким пептидам, которые обладают биологической активностью (в качестве агонистов или антагонистов) в отношении рецептора нативного ПТГ и содержат аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности (например, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%) с пептидной последовательностью (SEQ ID NO: 7) в выровненной части.

В рамках настоящего изобретения, термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любой из стандартных фармацевтических носителей, таких как забуференный фосфатом физиологический раствор, вода, эмульсии, такие как эмульсия масло/вода или вода/масло, и различные типы смачивающих агентов. Термин также охватывает любые агенты, одобренные регулирующим органом Федерального правительства США или приведенные в Фармакопее США для применения у животных, включая людей.

В рамках настоящего изобретения, термин «забуференный фосфатом физиологический раствор» или «PBS» относится к водному раствору, содержащему хлорид натрия и фосфат натрия. Специалистам в данной области техники известны различные составы PBS, но для целей настоящего раскрытия выражение «стандартный PBS» относится к раствору, имеющему конечную концентрацию 137 мМ NaCl, 10 мМ фосфата, 2,7 мМ KCl и рН 7,2-7,4.

В рамках настоящего изобретения, термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к солям соединений, которые сохраняют биологическую активность исходного соединения и которые не являются биологически или иным образом нежелательными. Многие из раскрытых здесь соединений могут образовывать соли с кислотами и/или основаниями благодаря присутствию амино- и/или карбоксильных групп или групп, подобных им.

В рамках настоящего изобретения, термин «лечение» включает профилактику конкретного расстройства или патологического состояния или облегчение симптомов, ассоциированных с конкретным расстройством или состоянием, и/или предупреждение или устранение указанных симптомов.

В рамках настоящего изобретения, термин «эффективное» количество или «терапевтически эффективное количество» лекарственного средства относится к нетоксичному количеству, но достаточному для обеспечения желаемого эффекта. Количество, которое является «эффективным», будет варьироваться от субъекта к субъекту или даже для одного субъекта в течение продолжительного периода времени, в зависимости от возраста и общего состояния субъекта, способа введения и т.п. Таким образом, не всегда возможно указать точное «эффективное количество». Однако подходящее «эффективное» количество в каждом отдельном случае может определить специалист обычной квалификации в данной области с использованием обычного экспериментирования.

Термин «парентеральное» означает введение не через пищеварительный тракт, а каким-либо другим путем, таким как подкожный, внутримышечный, интраспинальный или внутривенный.

В рамках настоящего изобретения, термин «замещение» аминокислоты относится к замещению одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком.

В рамках настоящего изобретения, термин «консервативная аминокислотная замена» определяется в настоящем документе как замены в пределах одной из следующих пяти групп:

I. Небольшие алифатические, неполярные или слабополярные остатки:

Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

II. Полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды: Asp, Asn, Glu, Gln;

III. Полярные, положительно заряженные остатки: His, Arg, Lys; орнитин (Orn)

IV. Крупные, алифатические, неполярные остатки:

Met, Leu, lie, Val, Cys, норлейцин (Nle), гомоцистеин (hCys)

V. Крупные ароматические остатки:

Phe, Tyr, Тгр, ацетилфенилаланин, нафтилаланин (Nal).

В рамках настоящего изобретения, общий термин «полиэтиленгликолевая цепь» или «ПЭГ цепь» относится к смесям конденсационных полимеров этиленоксида и воды с разветвленной или прямой цепью, представленной общей формулой Н(ОСН₂СН₂)_кOН, где к равно, по меньшей мере, 2. В рамках настоящего изобретения, термин «miniPEG» или «OEG» означает функционализированное полиэтиленовое соединение, имеющее структуру:

В рамках настоящего изобретения, термин «пэгилированный» и подобные термины относятся к соединению, которое было модифицировано из его нативного состояния путем связывания цепи полиэтиленгликоля с соединением. «Пегилированный полипептид» представляет собой полипептид, который имеет цепь ПЭГ, ковалентно связанную с полипептидом.

В рамках настоящего изобретения, термин «линкер» или «спейсер» представляет собой связь, молекулу или группу молекул, которые связывают два отдельных структурных элементов друг с другом. Линкеры могут обеспечивать оптимальное расстояние между двумя структурными элементами или могут дополнительно обеспечивать лабильную связь, которая позволяет отделить два структурных элемента друг от друга. Лабильные связи включают фоторасщепляемые группы, кислотно-лабильные группы, основно-лабильные группы и расщепляемые ферментами группы.

В рамках настоящего изобретения, термин «димер» представляет собой комплекс, содержащий две субъединицы, ковалентно связанные друг с другом через линкер. Термин «димер», используемый в отсутствие какого-либо конкретного определения, включает гомодимеры и гетеродимеры. Гомодимер содержит две идентичные субъединицы, тогда как гетеродимер содержит две отличающиеся субъединицы, хотя эти две субъединицы по существу сходны друг с другом.

Термин «C₁-C_n алкил», где n может иметь значения от 1 до 6, используемый здесь, представляет собой разветвленную или линейную алкильную группу, содержащую от одного до указанного количества атомов углерода. Типичные C₁-C₆ алкильные группы включают, не ограничиваясь этим, метил, этил, н-пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, гексил и т.п.

В рамках настоящего изобретения, термин С16-С20 жирная кислота обозначает структуру:

-СО (СН₂)_15-18СН₃, и термин С16-С20 двухосновная кислота обозначает структуру: -СО(СН₂)_14-18COOH, где приставка «С16-С20» обозначает переменное общее число атомов углерода в соединениях, охватываемых этим термином. Например, С18 двухосновная кислота представляет собой структуру: -СО(СН₂)₁₆СООН. В рамках настоящего изобретения, общий термин «ацилированная аминокислота» охватывает как аминокислоту, боковая цепь которой ацилирована жирной кислотой, так и аминокислоту, боковая цепь которой ацилирована двухосновной кислотой.

Полагается, что физиологические условия, описанные в настоящем документе, включают температуру от примерно 35°С до 40°С и рН от примерно 7,0 до примерно 7,4, и более типично включают рН от 7,2 до 7,4 и температуру от 36°С до 38°С. Поскольку физиологические значения рН и температуры у людей четко регулируются в строго определенном диапазоне, то скорость превращения комплекса дипептид/лекарственное средство (пролекарство) в лекарственное средство будет демонстрировать высокую воспроизводимость внутри популяции и между популяциями пациентой. Используемый в настоящем документе термин «пациент» без дальнейшего обозначения предназначен для охвата любого теплокровного позвоночного домашнего животного (включая, например, домашний скот, лошадей, кошек, собак и других домашних животных, не ограничиваясь этим) и людей, а также включает субъектов, не находящихся под непосредственным наблюдением врача.

Сокращенные обозначения:

Нижний регистр к=d-изомер лизина

γЕ=1-изомер гамма-глутаминовой кислоты

(mini PEG)₂-COCH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂NH

COC₁₆H₃₂CO₂H=(С18 двухосновная слота)

(N-Me)6=саркозин

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH (SEQ ID NO: 7)=PTH

Верхний регистр K=1-изомер лизина

Варианты осуществления изобретения

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к улучшенным аналогам паратиреоидного гормона (ПТГ) и способу лечения гипотиреоза и остеопороза. Более конкретно, аналоги ПТГ, описанные здесь обладают улучшенным терапевтическим индексом и увеличенным временем действия по сравнению с нативным ПТГ и его известными активными фрагментами.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к конъюгированным производным паратиреоидного гормона и конъюгированным производным пептида, родственного ПТГ (РТНгр), где производное имеет пролонгированное время действия in vivo и улучшенный терапевтический индекс по сравнению с немодифицированным исходным пептидом при введении теплокровным млекопитающим, включая человека. В одном варианте осуществления конъюгированные производные содержат саморасщепляющийся дипептид, необязательно ацилированный, связанный с N-концевым альфа-амином и ацилированный по С-концевой аминокислоте. Более конкретно, в одном варианте осуществления модифицированный паратиреоидный гормон (ПТГ) представляет собой пептид из 33, 34 или 35 аминокислот, содержащий последовательность SEQ ID NO: 2, 3 или 30, соответственно, или содержащий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 85%, 90%, 95% или 97% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2, 3, 7 или 30 в выровненной части сравниваемых последовательностей, которая имеет группу жирной кислоты или двухосновной кислоты (включая, например, С16-С20 жирную кислоту или С16-С20 двухосновную кислоту), ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, выбранной из положений 13, 16, 19, 22, 26 и 33 (относительно SEQ ID NO: 7), или С-концевой аминокислоты, и необязательно дополнительно модифицируется ковалентным связыванием с саморасщепляющимося дипептидом. Саморасщепляющийся дипептид может быть связан через амидную связь с любым первичным амином ПТГ пептида, включая N-концевой альфа-амин или любую боковую цепь, несущую первичный амин, пептида, включая, например, аминокислоту в положении, выбранном из 13, 16, 19, 22, 26 и 33 (относительно SEQ ID NO: 7). Боковые цепи аминокислот, входящих в состав саморасщепляющегося дипептида, могут быть необязательно связаны с группой жирной кислоты или двухосновной кислоты или другим полимером для более эффективного блокирования активности ПТГ пептида до удаления саморасщепляющегося дипептида посредством механизм неферментативного саморасщепления. В одном варианте осуществления боковая цепь первой аминокислоты дипептида ацилирована С16-С20 жирной кислотой или С16-С20 двухосновной кислотой.

В одном варианте осуществления саморасщепляющийся дипептид ковалентно связан амидной связью с аминоконцом ПТГ пептида, необязательно на N-концевом альфа-амине, и дополнительно содержит ацилированную аминокислоту в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 13, 16, 19, 22, 26 и 33 (относительно SEQ ID NO: 7), или С-концевую аминокислоту. В одном варианте осуществления модифицированный ПТГ пептид раскрытых конъюгатов ПТГ содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH (SEQ ID NO: 7),

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHN (SEQ ID NO: 31),

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF (SEQ ID NO: 32),

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFV (SEQ ID NO: 33),

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVA (SEQ ID NO: 34),

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVAL (SEQ ID NO: 35),

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALG (SEQ ID NO: 36) и

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGA (SEQ ID NO: 37),

где ПТГ пептид модифицирован ковалентным связыванием саморасщепляющегося дипептида, необязательно на N-концевом альфа-амине ПТГ пептида, и связыванием ацильной группы достаточного размера (например, С14-С22 жирной кислоты или С14-С22 двухосновной кислоты) для связывания с сывороточным альбумином, с боковой цепью аминокислоты в положениях 13, 16, 19, 22, 26, 33 или С-концевым участком пептида с любой из SEQ ID No: 7, 31-37 или соответствующее положение любых его аналогов, где необязательно пептиды SEQ ID No: 7, 31-37 содержат замещение ацилированного остатка лизина в одном или двух положениях, выбранных из 13, 16, 19, 22, 26, 33, и С-концевой аминокислоты. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату ПТГ, где ПТГ пептид с любой из SEQ ID No: 7, 31-37 модифицирован замещением нативной аминокислоты ацилированный лизином в положении 33 и/или нативной аминокислоты в С-концевой аминокислоте пептида ПТГ или соответствующее положение любых его аналогов, и саморасщепляющийся дипептид ковалентно связан через амидную связь с N-концевой аминокислотой ПТГ пептида, где необязательно первая аминокислота указанного саморасщепляющегося дипептида является ацилированной, где необязательно ацилированная аминокислота содержит С14-С20 жирную кислоту, С14-С20 двухосновную кислоту, С16-С18 жирную кислоту или С16-С18 двухосновную кислоту.

В соответствии с настоящим изобретением саморасщепляющийся дипептид содержит комбинацию двух аминокислот, которые связаны с первичным амином ПТГ пептида, так что в физиологических условиях дипептид будет самопроизвольно расщепляться посредством механизма неферментативного расщепления, высвобождая дипептид из ПТГ пептида. В одном варианте осуществления одну из аминокислот саморасщепляющегося дипептида, необязательно первую аминокислоту, ацилируют С14-С20 жирной кислотой или С14-С20 двухосновной кислотой для дополнительного ингибирования активности ПТГ, с которым он ковалентно связан. В одном варианте осуществления саморасщепляющийся дипептид связан с первичным амином, расположенным в боковой цепи аминокислоты в положениях 13, 16, 19, 22 или 26 ПТГ пептида (относительно SEQ ID NO: 7) или в положении N-концевого первичного амина. Таким образом, наличие саморасщепляющегося дипептида задерживает способность формы конъюгата взаимодействовать с рецептором-мишенью до тех пор, пока в результате химического расщепления не высвобождается ПТГ в активной форме. В соответствии с настоящим изобретением одним из вариантов конъюгата ПТГ по настоящему изобретению является ПТГ (1-33), dK^-1 (кЕ- (miniPEG) 2-γЕ-COC₁₆H₃₂CO₂H), N (Me) GO, К³³(γЕ-2х0Е6-γЕ-двухосновная кислотаС18), полная структура которого представляет собой: к (X) (N-Ме)GSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHK(X)-ОН (SEQ ID NO: 87),

где к представляет собой d-Lys;

X представляет собой γЕ- (miniPEG)₂-γЕ-COC₁₆H₃₂CO₂H;

γЕ представляет собой 1-изомер of гамма-глутаминовой кислоты;

(miniPEG) ₂ представляет собой COCH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂NH;

COC₁₆H₃₂CO₂H представляет собой С18 двухосновную кислоту;

(N-Me)G представляет собой саркозин;

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHK представляет собой ПТГ (1-32; SEQ ID NO: 7) + K33;

К представляет собой 1-Lys; и

-ОН обозначает С-концевую аминокислоту, которая содержит концевую карбоксильную группу.

В некоторых вариантах осуществления молекулярная масса конъюгата ПТГ по настоящему изобретению составляет 5873,9 дальтон.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к конъюгатам ПТГ, где для одного или нескольких миниПЭГ в конъюгате используется альтернативная группа. Неограничивающие примеры включают:

и

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к ПТГ пептиду, где ПТГ пептид содержит одно или более из:

Преимущественно, скорость расщепления саморасщепляющегося дипептида зависит от структуры и стереохимии дипептидного элемента, а также от силы нуклеофила, присутствующего на дипептиде, который индуцирует расщепление до дикетопиперазина или родственного дикетоморфолину соединения. В одном варианте осуществления, исходя из выбранной структуры дипептида, время неферментативного полураспада (t1/2) комплекса дипептид/лекарственное средство может быть выбрано в пределах 1-720 ч в физиологических условиях. Предполагается, что физиологические условия, описанные в настоящем документе, включают температуру примерно от 35°С до 40°С и рН примерно от 7,0 до примерно 7,4, и более типично включают рН от 7,2 до 7,4 и температуру от 36°С до 38°С. Поскольку физиологические значения рН и температура четко регулируются в строго определенном диапазоне, то скорость превращения комплекса дипептид/лекарственное средство в лекарственное средство будет демонстрировать высокую воспроизводимость внутри популяции и между популяциями пациентов. Скорость химического превращения будет определять время начала и продолжительность биологического действия in vivo. Соответственно, активация вводимого аналога ПТГ по настоящему изобретению зависит от внутримолекулярной химической реакции, которая не зависит от дополнительных химических добавок или ферментов, и где скорость превращения контролируется присущей химической природой дипептидных заместителей.

В одном варианте саморасщепляющийся дипептидный элемент ковалентно связан с ПТГ пептидом через амидную связь, и дипептид дополнительно содержит полимер-депо, связанный с боковой цепью аминокислоты саморасщепляющегося дипептида. В одном варианте осуществления два или более полимера-депо связаны с одним саморасщепляющимся дипептидным элементом. В одном варианте осуществления полимер-депо выбран таким образом, чтобы он был биосовместимым и имел достаточный размер, чтобы ПТГ пептид с ковалентно присоединенным дипептидом оставался секвестрированным в месте инъекции и/или был неспособен взаимодействовать с соответствующим рецептором при введении пациенту. Последующее расщепление дипептида высвобождает ПТГ пептид для взаимодействия с предназначенной мишенью. Выбор различных комбинаций заместителей в дипептидном элементе позволит получить композиции для инъекций, которые содержат смесь дипептидов/пептидов паратиреоидного гормона, которые высвобождают лекарственное средство в течение желаемого периода времени. Подходящие полимеры-депо включают, не ограничиваясь этим, декстраны, полилактиды, полигликолиды, полимеры на основе капролактона, поли(капролактон), полиангидриды, полиамины, полиэфирамиды, полиортоэфиры, полидиоксаноны, полиацетали, поликетали, поликарбонаты, полифосфоэфиры, полиэфиры, полибутилентерефталат, полиортокарбонаты, полифосфазены, сукцинаты, поли(яблочную кислоту), поли(аминокислоты), поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль, полигидроксицеллюлозу, полисахариды, хитин, хитозан, гиалуроновую кислоту и сополимеры, терполимеры и их смеси, биоразлагаемые полимеры и их сополимеры, в том числе на основе капролактона полимеры, поликапролактоны и сополимеры, которые включают полибутилентерефталат. В одном варианте осуществления полимер-депо выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, декстрана, полимолочной кислоты, полигликолевой кислоты и сополимера молочной и гликолевой кислот, и в одном конкретном варианте осуществления полимер-депо представляет собой полиэтиленгликоль. В одном варианте осуществления полимер-депо содержит одну или несколько цепей полиэтиленгликоля, связанных с саморасщепляющимся дипептидным элементом, где общая молекулярная масса полимера-депо составляет от 40000 до 80000 дальтон.

В соответствии с одним вариантом осуществления саморасщепляющийся дипептидный элемент ковалентно связан с ПТГ пептидом через амидную связь в активном центре ПТГ с образованием пролекарственного производного лекарственного средства. В одном варианте осуществления первая аминокислота саморасщепляющегося дипептида имеет D-стереохимическую конфигурацию. В одном варианте осуществления боковая цепь первой аминокислоты саморасщепляющегося дипептида ковалентно связана с фрагментом, который усиливает удерживание аналога ПТГ в кровотоке пациента. В одном варианте осуществления фрагмент, усиливающий удержание, связанный с первой аминокислотой саморасщепляющегося дипептида, содержит алкильную цепь достаточного размера для связывания с сывороточным альбумином при введении пациенту. В одном варианте осуществления боковая цепь первой аминокислоты саморасщепляющегося дипептида ковалентно связана с алкильной цепью, содержащей 14-30, 14-22, 16-20, 16, 18, 20 или 22 атома углерода. В одном варианте осуществления первая аминокислота саморасщепляющегося дипептида представляет собой алкилированную или ацилированную аминокислоту в D-стереохимической конфигурации. В одном варианте осуществления первая аминокислота саморасщепляющегося дипептида ковалентно связана с жирной кислотой или жирной двухосновной кислотой, имеющей длину 14-30, 14-22, 16-20, 16, 18, 20 или 22 атома углерода.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату ПТГ пептида, где ПТГ пептид ковалентно связан с саморасщепляющимся дипептидом. В одном варианте осуществления конъюгат имеет общую структуру A-B-Q, где

А представляет собой аминокислоту или гидроксильную кислоту, необязательно где боковая цепь аминокислоты или гидроксильной кислоты ковалентно связана с депо-полимером или алкильной или ацильной цепью;

В представляет собой N-алкилированную аминокислоту;

Q представляет собой ацилированный или алкилированный ПТГ пептид по настоящему изобретению, при условии, что, когда А представляет собой неацилированную аминокислоту, то тогда А представляет собой аминокислоту в D-стереохимической конфигурации. В дополнительном варианте осуществления для любого ПТГ конъюгата, раскрытого здесь, один из А или В указанного дипептида А-В может представлять собой некодированную аминокислоту, включая, например, аминокислоту в D-стереохимической конфигурации.

В соответствии с одним вариантом осуществления саморасщепляющийся дипептидный элемент (А-В) содержит структуру:

где:

R₁ содержит боковую цепь, выбранную из группы, состоящей из Н, С₁-С₁₈ алкила, С₂-С₁₈ алкенила, (С₁-С₈ алкил) ОН, (С₁-С₈ алкил) SH, (С₂-С₃ алкил)SCH₃, (С₁-С₄ алкил) CONH₂, (С₁-С₄ алкил) СООН, (С₁-С₄ алкил)NH₂, (С₁-С₄ алкил) NHC (NH₂ ⁺) NH₂, (С₀-С₄ алкил) (С₅-С₆ циклоалкила),

необязательно дополнительно содержащий С16-С30 углеродную цепь, ковалентно связанную с указанной боковой цепью;

R₂ и R₈ независимо представляют собой Н или С₁-С₆ алкил;

R₄ выбран из группы, состоящей из Н, С₁-С₁₈ алкила, С₂-С₁₈ алкенила, (С₁-С₈ алкил) ОН, (С₁-С₄ алкил) SH, (С₂-С₃ алкил) SCH₃, (С₁-С₄ алкил) C0NH₂, (С₁-С₄ алкил) СООН, (C₁-C₄ алкил) NH₂, (С₁-С₄ алкил) NHC (NH₂ ⁺)NH₂, (С₀-С₄ алкил) (С₅-С₆ циклоалкила),

R₃ выбран из группы, состоящей из C₁-C₈ алкила, или R₄ и R₃, взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют пирролидиновое или пиперидиновое кольцо;

R₅ представляет собой NH₂ или ОН; и

R₁₀ представляет собой Н, ОН или NH₂, при условии, что когда R₄ и R₃, взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют пирролидиновое кольцо, то тогда R₁ и R₂ не являются Н.

В соответствии с одним вариантом осуществления саморасщепляющийся дипептидный элемент (А-В) содержит структуру:

где:

R₁ содержит боковую цепь, выбранную из группы, состоящей из C₁-C₁₈ алкила, (C₁-C₈ алкил) ОН, (C₁-C₈ алкил) SH и (C₁-C₄ алкил)СООН, (С₁-С₄ алкил)NH₂, необязательно дополнительно содержащую С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с указанной боковой цепью;

R₂ и R₈ независимо представляют собой Н или C₁-C₆ алкил;

R₄ выбран их группы, состоящей из Н, C₁-C₁₈ алкила, С₂-С₈ алкенила, (С₁-С₈ алкил) ОН, (С₁-С₈ алкил) SH, (С₂-С₃ алкил) SCH₃, (С₁-С₄ алкил) CONH₂, (С₁-С₄ алкил) СООН, (С₁-С₄ алкил) NH₂, (С₁-С₄ алкил) NHC (NH₂ ⁺) NH₂, (С₀-С₄ алкил) (С₅-С₆ циклоалкила),

R₃ выбран из группы, состоящей из С₁-С₈ алкила;

R₅ представляет собой NH₂; и

R₁₀ представляет собой Н, ОН или NH₂.

В соответствии с одним вариантом осуществления саморасщепляющийся дипептидный элемент (А-В) содержит структуру:

где:

R₁ содержит боковую цепь, выбранную из группы, состоящей из C₁-C₁₈ алкила, (C₁-C₈ алкил) ОН, (C₁-C₈ алкил) SH и (С₁-С₄ алкил)СООН, (С₁-С₄ алкил)NH₂, содержащую С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 дикислоту, ковалентно связанную с указанной боковой цепью, необязательно через спейсер;

R₂ и R₈ каждый представляет собой Н;

R₄ выбран из группы, состоящей из Н и C₁-C₈ алкила;

R₃ представляет собой C₁-C₆ алкил; и

R₅ представляет собой NH₂, где указанный спейсер выбран из группы, состоящей из гамма-глутаминовой кислоты, дипептида гамма-глутаминовая кислота-гамма-глутаминовая кислота, гамма-глутаминовая кислота - [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_к-NH]_q-гамма-глутаминовой кислоты, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8 или 2-4, и q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4. В одном варианте осуществления к равно 2 или 4, и q равно 1 или 2.

В соответствии с одним вариантом осуществления саморасщепляющийся дипептидный элемент (А-В) содержит структуру:

где:

R₁ содержит боковую цепь (С₁-С₄ алкил) NH₂, где необязательно С16-С30 жирная кислота или С16-С30 двухосновная кислота ковалентно связана с указанной боковой цепью, необязательно через спейсер;

R₂, R₄ и R₈ независимо представляют собой Н или C₁-C₄ алкил;

R₃ представляет собой C₁-C₆ алкил; и

R₅ представляет собой NH₂, где указанный спейсер выбран из группы, состоящей из гамма-глутаминовой кислоты, дипептида гамма-глутаминовая кислота-гамма-глутаминовая кислота и гамма-глутаминовая кислота- [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_к-NH]_q-гамма-глутаминовой кислоты, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8 или 2-4, и q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4, где необязательно, когда R₁ состоит из (С₁-С₄ алкил) NH₂, то тогда первая аминокислота саморасщепляющегося дипептида находится в D-стереохимической конфигурации. В одном варианте осуществления к равно 2 или 4, и q равно 1 или 2.

В соответствии с одним вариантом осуществления саморасщепляющийся дипептидный элемент (А-В) содержит структуру:

где:

R₁ выбран из группы, состоящей из (C₁-C₈ алкил)-СО (СН₂)₁₄-₂₀СН₃, (C₁-C₈ алкил) S-CO (СН₂)_14-20СН₃, (C₁-C₄ алкил) NH-CO (СН₂)₁₄-₂₀ СН₃, (C₁-C₈ алкил)-СО(СН₂)_14-20COOH (С₁-С₈ алкил) S-CO (СН₂)₁₄-₂₀COOH, and (С₁-С₄ алкил) NH-CO (СН₂)₁₄-₂₀COOH;

R₂ и R₈ каждый представляет собой Н;

R₄ выбран из группы, состоящей из Н, С₁-С₈ алкила, (C₁-C₄ алкил) ОН, (С₁-С₄ алкил) SH, (С₂-С₃ алкил) SCH₃, (C₁-C₄ алкил) CONH₂, (C₁-C₄ алкил) СООН, (С₁-С₄ алкил) NH₂, (C₁-C₄ алкил) NHC (NH₂ ⁺) NH₂, (C₁-C₄ алкил) (C₅-C₆ циклоалкила),

R₃ выбран из группы, состоящей из C₁-C₆ алкила, или R₄ и R₃, взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют пирролидин или пиперидин;

R₅ представляет собой NH₂; и

Rio представляет собой Н, ОН или NH₂, при условии, что когда R₄ и R₃, взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют пирролидиновое кольцо, то тогда R₂ не является Н, где необязательно полупериод химического отщепления (t1/2) А-В от указанного ПТГ пептида составляет, по меньшей мере, примерно от 20 до 240 ч в стандартном растворе PBS в физиологических условиях.

В соответствии с одним вариантом осуществления саморасщепляющийся дипептидный элемент (А-В) содержит структуру:

где:

R₁ выбран из группы, состоящей из (С₁-С₄ алкил) S-CO (СН₂)₁₄-₂₀СН₃, (С₁-С₄ алкил) NH-CO (СН₂)_14-20СН₃, (С₁-С₄ алкил) S-CO (СН₂)_14-20СООН и (С₁-С₄ алкил) NH-CO (СН₂)₁₄-₂₀COOH;

R₂ и R₈ каждый представляет собой Н;

R₄ выбран из группы, состоящей из Н и С₁-С₉ алкила;

R₃ выбран из группы, состоящей из C₁-C₆ алкила; и

R₅ представляет собой NH₂, где необязательно полупериод химического отщепления (t1/2) А-В от указанного ПТГ пептида составляет, по меньшей мере, примерно от 48 до 168 ч в стандартном растворе PBS в физиологических условиях. В еще одном варианте осуществления R₁ представляет собой (С₁-С₄ алкил) NH-CO (СН₂)_14-20СН₃ или (C₁-C₄ алкил) NH-CO (СН₂)₁₄-₂₀СООН; R₂ и R₈ каждый представляет собой Н; R₄ представляет собой Н или СН₃; R₃ представляет собой C₁-C₆ алкил; и R₅ представляет собой NH₂.

В соответствии с одним вариантом осуществления саморасщепляющийся дипептидный элемент (А-В) содержит структуру:

где:

R₁ выбран из группы, состоящей из (С₁-С₄ алкил)NH-CO(СН₂)₁₄-₂₀СН₃, (С₁-С₄ алкил) NH-CO (СН₂)_14-20COOH, (С₁-С₄ алкил)NH- [спейсер] -СО (СН₂)_14-20CH₃ и (С₁-С₄ алкил) NH-[спейсер]-СО (СН₂)₁₄_₂₀СООН;

R₂ и R₈ каждый представляет собой Н или С₄-С₄ алкил;

R₄ и R₃, взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют пиперидиновое кольцо; и

R₅ представляет собой NH₂, где необязательно полупериод химического отщепления (t1/2) А-В от указанного ПТГ пептида составляет, по меньшей мере, примерно от 72 до 144 ч в стандартном растворе PBS в физиологических условиях, где указанный спейсер содержит одну или более групп, выбранных из гамма-глутаминовой кислоты и - [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_к-NH]_q, где необязательно указанный спейсер выбран из группы, состоящей из гамма-глутаминовой кислоты, дипептида гамма-глутаминовой кислоты-гамма-глутаминовой кислоты и гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂(ОСН₂СН₂)_r-NH_]q-гамма-глутаминовой кислоты, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8 или 2-4, и q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4, где необязательно к равно 2 или 4, и q равно 1 или 2. В еще одном варианте осуществления R₁ представляет собой (С₁-С₄ алкил) NH-CO(СН₂)_14-20CH₃, (C₁-C₄ алкил) NH-CO (СН₂)_14-20COOH, (С₁-С₄ алкил)NH-[спейсер]-СО (СН₂)_14-20CH₃ или (C₁-C₄ алкил) NH-[спейсер]-СО (СН₂)₁₄-₂₀СООН; R₂ и R₈ каждый представляет собой Н; R₄ представляет собой Н или СН₃; R₃ представляет собой С₁-С₆ алкил; и R₅ представляет собой NH₂.

В соответствии с одним вариантом осуществления саморасщепляющийся дипептидный элемент (А-В) содержит структуру:

где:

R₁ представляет собой (С₁-С₄ алкил) NH-CO (СН₂)₁₆COOH или (С₁-С₄ алкил) NH-CO (СН₂)₁₈СООН;

R₂ и R₈ каждый представляет собой Н;

R₄ представляет собой Н или СН₃;

R₃ представляет собой СН₃ и

R₅ представляет собой NH₂, где необязательно R₁ представляет собой (С₃-С₄ алкил) NH-СО (СН₂)₁₆СООН, и R₄ представляет собой СН₃.

В соответствии с одним вариантом осуществления саморасщепляющийся дипептидный элемент (А-В) содержит структуру:

где:

R₁ представляет собой (C₁-C₄ алкил) NH-[спейсер]-СО (СН₂)₁₆COOH или (C₁-C₄ алкил) NH-[спейсер]-СО (СН₂)₁₈COOH;

R₂ и R₈ каждый представляет собой Н;

R₄ представляет собой Н или СН₃;

R₃ представляет собой СН₃ и

R₅ представляет собой NH₂, где необязательно R₁ представляет собой (С₃-С₄ алкил) NH-[спейсер]-СО (СН₂)₁₆COOH, и R₄ представляет собой СН₃, где указанный спейсер представляет собой гамма-глутаминовая кислота- [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_к-NH]_q-гамма-глутаминовую кислоту, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8 или 2-4, и q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4, где необязательно к равно 2 или 4, и q равно 1 или 2, где необязательно к и q оба равны 2.

В одном варианте осуществления ПТГ пептид конъюгатов ПТГ по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKEDNVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKAKSQX₃₅ (SEQ ID NO: 20);

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEIRAX₃₅ (SEQ ID NO: 96);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALX₃₅ (SEQ ID NO: 21);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFX₃₅ (SEQ ID NO: 12);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHQFX₃₅ (SEQ ID NO: 14);

SVSEIQLMHNLX₁₂X₁₃HLX₁₆X₁₇MERVEWLRX₂₆X₂₇LQDX₃₁H-Z (SEQ ID NO: 4);

SVSEIQLMHNLGX₁₃HLNSMERVEWLRX₂₆X₂₇LQDX₃₁H-Z (SEQ ID NO: 5);

SVSEIQLMHNLX₁₂KHLX₅₆X₁₇MERVEWLRKKLQDVH - Z (SEQ ID NO: 6);

SVSEIQLMHX₁₀LGX₁3HLX₁₆SX₁₈ERVEWLRX2₆X27LQDX₃₁H-Z, (SEQ ID NO: 133);

SVSEIQLMHX₁₀LX₁₂KHLX₁₆X₁₇X₁₈ERVEWLRKKLQDVH-Z; (SEQ ID NO: 134);

SVS EIQLMHX₁₀LGKHLX₁₆SX₁₈E RVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 135);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDGH-Z (SEQ ID NO: 22);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7);

SVSEIQLMHNLGEHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 23);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLREKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 24); или

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKELQDVH-Z (SEQ ID NO: 25);

где:

Z представляет собой X₃₃, X₃₃F, X₃₃FX₃₅, X₃₃FVX₃₅, X₃₃FVAX₃₅, X₃₃FVALX₃₅, X₃₃FVALGX₃₅, X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₅₃FVAX₃₅, X₅₃FVALX₃₅, or X₅₃FVALGX₃₅, где необязательно Z представляет собой X₃₃, X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₅₃FVAX₃₅, X₅₃FVALX₃₅ или X₅₃FVALGX₃₅ где необязательно Z представляет собой X₃₃F, X₅₃FX₃₅ или X₃₃;

X₁₀ и X₁₆ независимо представляют собой Asp, Gln или Asn;

X₁₂ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Gly;

Х₅₆ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Asn;

Х₁₇ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Ser;

Х₁₈ представляет собой Met, Met(О) или Nleu;

X₁₃, Х₂₆ и Х₂₇ независимо выбраны из группы, состоящей Arg, Glu, Asp и Lys;

Х₃₁ представляет собой Gly или Val;

Х₃₃ и Х₃₅ каждый содержит ацилированную или алкилированную аминокислоту;

Х₅₃ представляет собой Gln, Asp, Glu или Asn, где необязательно Х₅₃ представляет собой Gln или Asn или Х₅₃ представляет собой Asn, и необязательно при условии, что только один из Х₁₂, Х₁₆ и Х₁₇ представляет собой Aib, где необязательно С-концевая аминокислота модифицирована с заменой карбоксиконца на амид.

В одном варианте осуществления ПТГ пептид конъюгатов ПТГ по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SVS EIQLMHNLGKHLNSME RVEWLRKKLQDVHN FX₃₅ (SEQ ID NO: 12);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHQFX₃₅ (SEQ ID NO: 14);

SVSEIQLMHNLGX₁₃HLNSMERVEWLRX₂₆X27LQDX₃₁H-Z (SEQ ID NO: 5);

SVSEIQLMHX₁₀LGKHLX₁₆SX₁₈E RVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 135);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDGH-Z (SEQ ID NO: 22); или

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7);

где:

Z представляет собой X₃₃F, X₅₃FX₃₅ или X₃₃;

X₁₀ и X₁₆ независимо представляют собой Asp, Gln или Asn;

X₁₈ представляет собой Met, Met(О) или Nleu;

X₁₃, X₂₆ и X₂₇ независимо выбраны из группы, состоящей из Arg, Glu, Asp и Lys;

Х₃₁ представляет собой Gly или Val;

Х₃₃ и Х₃₅ каждый содержит ацилированную или алкилированную аминокислоту, где необязательно Х₃₃ представляет собой ацилированный Lys, и Х₃₅ представляет собой ацилированный Cys;

Х₅₃ представляет собой Gln, Asp, Glu или Asn.

В одном варианте осуществления ПТГ пептид конъюгатов ПТГ по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SVSEIQLMHNLGX₁₃HLNSMERVEWLRX₂₆X₂₇LQDX₃₁H-Z (SEQ ID NO: 5);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDGH-Z (SEQ ID NO: 22); или

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7),

где:

Z представляет собой X₃₃F, X₅₃FX₃₅ или X₃₃;

X₁₃, X₂₆ и X₂₇ независимо выбраны из группы, состоящей из Arg, Glu, Asp и Lys;

Х₃₁ представляет собой Gly или Val;

Х₃₃ и Х₃₅ каждый независимо представляет собой аминокислоту, имеющую боковую цепь (С₁-С₄ алкил) NH-CO (СН₂)_14-20СООН, (С₄ алкил)NH-СО(СН₂)_14-20СН₃, (С₁-С₄ алкил) S-CO (СН₂)_14-20СООН, (С₁-С₄ алкил) S-CO (СН₂)_14-20СН₃, (С₁-С₄ алкил) NH- [спейсер] -СО (СН₂)_14-20COOH, (С₁-С₄ алкил) NH-[спейсер]-СО (СН₂)_{14_20}СН₃, (С₁-С₄ алкил) S-[спейсер] -СО (СН₂) ₁₄-₂₀СООН или (С₁-С₄ алкил) S-[спейсер]-СО (СН₂) ₁₄-₂₀СН₃; и

Х₅₃ представляет собой Gln, Asp, Glu или Asn, где необязательно Х₃₃ и Х₃₅ представляют собой аминокислоту, имеющую боковую цепь, выбранную из группы, состоящей из (С₁-С₄ алкил)NH-CO(CH₂)_14-20COOH, (C₁-C₄ алкил) NH-CO (CH₂)_14-20CH₃, (C₁-C₄ алкил)ИН-[спейсер] -CO (CH₂) ₁₄-₂₀COOH и (С₁-С₄ алкил) NH- [спейсер] -СО (СН₂)₁₄-₂₀СН₃, где спейсер выбран из группы, состоящей из гамма-глутаминовой кислоты, дипептида гамма-глутаминовая кислота-гамма-глутаминовая кислота и гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂(ОСН₂СН₂)_к-NH]_q-гамма-глутаминовой кислоты, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8 или 2-4, и q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4, где необязательно к равно 2 или 4, и q равно 1 или 2, где необязательно к и q оба значения 2.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату ПТГ пептида, демонстрирующему улучшенный терапевтический индекс и улучшенное время удерживания in vivo, где конъюгат содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFVALGAPLAPRDAGSQRPRKKEDNVLVESHEKSLGEADKADVNVLTKAKSQX₃₅ (SEQ ID NO: 20);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHN FVALX₃₅ (SEQ ID NO: 21);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFX₃₅ (SEQ ID NO: 12);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHQFX₃₅ (SEQ ID NO: 14);

SVSEIQLMHNLX₁₂X₁₃HLX₁₆X₁₇MERVEWLRX₂₆X₂₇LQDX₃₁H-Z (SEQ ID NO: 4);

SVSEIQLMHNLGX₁₃HLNSMERVEWLRX₂₆X₂₇LQDX₃₁H-Z (SEQ ID NO: 5);

SVSEIQLMHNLX₁₂KHLX₅₆X₁₇ME RVEWLRKKLQDVH - Z (SEQ ID NO: 6);

SVSEIQLMHX₁₀LGKHLX₁₆SX₁₈ERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 135);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDGH-Z (SEQ ID NO: 22);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7);

SVSEIQLMHNLGEHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 23);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLREKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 24); или

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKELQDVH-Z (SEQ ID NO: 25);

где:

Z представляет собой X₃₃, X₃₃F, X₃₃FX₃₅, X₃₃FVX₃₅, X₃₃FVAX₃₅, X₃₃FVALX₃₅, X₃₃FVALGX₃₅, X₃₃X₃₅, X₃₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₃₃FVAX₃₅, X₃₃FVALX₃₅, или X₅₃FVALGX₃₅, где необязательно Z представляет собой X₃₃, X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₅₃FVAX₃₅, X₅₃FVALX₃₅ или X₅₃FVALGX₃₅, где необязательно Z представляет собой X₃₃F, X₅₃FX₃₅ или X₃₃;

X₁₀ и X₁₆ независимо представляют собой Asp, Gln или Asn;

X₁₂ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Gly;

Х₅₆ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Asn;

Х₁₇ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Ser;

Х₁₈ представляет собой Met, Met(О) или Nleu;

X₁₃X₂₆ и Х₂₇ независимо выбраны из группы, состоящей из Arg, Glu, Asp и Lys;

Х₃₁ представляет собой Gly или Val;

Х₃₃ и Х₃₅ где каждый содержит ацилированную или алкилированную аминокислоту;

Х₅₃ представляет собой Gln, Asp, Glu или Asn, необязательно при условии, что только один Х₁₂, Х₁₆ и Х₁₇ представляет собой Aib; и

указанный саморасщепляющийся дипептид имеет общую структуру А-В-;

где:

А представляет собой ацилированную или алкилированную аминокислоту;

В представляет собой N-алкилированную аминокислоту;

где указанная ацилированная или алкилированная аминокислота каждого Х₃₃, Х₃₅ и А представляет собой аминокислоту, содержащую С16-С30 углеродную цепь, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер, и указанный саморасщепляющийся дипептид связан с указанным ПТГ пептидом посредством образования амидной связи между В и N-концевым альфа-амином указанного ПТГ пептида. В одном варианте осуществления А и В выбраны таким образом, чтобы обеспечить полупериод (t1/2) химического отщепления А-В от указанного пептида ПТГ, составляющий, по меньшей мере, примерно от 24 ч до примерно 96 ч, или примерно от 48 до примерно 96 ч, или примерно от 72 до примерно 120 ч в стандартном растворе PBS в физиологических условиях.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату, который содержит пептид ПТГ/ПТГрП и саморасщепляющийся дипептид, где дипептид ковалентно связан с указанным пептидом ПТГ/ПТГр через амидную связь, необязательно на N-концевом альфа-амине пептида ПТГ, где пептид ПТГ/ПТГр содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SRRLKRAVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRFFLHHLIAEIHTAEIRATSEVSPNSKPSPNTKN HPVRFGSDDEGRYLTQETNKVETYKEQPLKTPGKKKKGKPGKRKEQEKKKRRTRSAWLDSG VTGSGLEGDHLSDTSTTSLELDSRRH-X₃₃ (SEQ ID NO: 39);

SVSEIQLMHNLGX₁₃HLNSMERVEWLRX₂₆X₂₇LQDX₃iH-Z (SEQ ID NO: 5);

SVSEIQLMHNLX₁₂KHLX₅₆X₁₇MERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 6); и

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7); где:

Z представляет собой X₃₃, X₃₃F, X₃₃FX₃₅, X₃₃FVX₃₅, X₃₃FVAX₃₅, X₃₃FVALX₃₅, X₃₃FVALGX₃₅, X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₅₃FVAX₃₅, X₅₃FVALX₃₅ или X₅₃FVALGX₃₅, где необязательно Z представляет собой X₃₃, X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₅₃FVAX₃₅, X₅₃FVALX₃₅ или X₅₃FVALGX₃₅;

X₁₂ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Gly;

Х₅₆ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Asn;

Х₁₇ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Ser;

Х₁₃, Х₂₆ и Х₂₇ независимо выбраны из группы, состоящей из Arg, Glu, Asp и Lys;

Х₃₁ представляет собой Gly или Val;

Х₃₃ и Х₃₅ каждый содержит ацилированную аминокислоту, где необязательно Х₃₃ и Х₃₅ независимо выбраны из аминокислоты, имеющей общую структуру:

где т представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4, и R₅₀ представляет собой NH₂, СООН или SH, где необязательно ацилированная аминокислота Х₃₃ и Х₃₅ независимо выбрана из лизина, орнитина, цистеина или гомоцистеина, где боковая цепь указанной ацилированной аминокислоты ковалентно связана с С16-С22 жирной кислотой или С16-С22 двухосновной кислотой, необязательно через спейсер; и

Х₅₃ представляет собой Gln или Asn, необязательно при условии, что только один из Х₁₂, Х₁₆ и X¹⁷ представляет собой Aib; и

указанный саморасщепляющийся дипептид имеет общую структуру А-В-;

где:

А представляет собой аминокислоту или ацилированную аминокислоту, где необязательно указанная аминокислота выбрана из цистеина или лизина, где боковая цепь указанного цистеина или лизина необязательно ковалентно связана с С16-С22 жирной кислотой или С16-С22 двухосновной кислотой, необязательно через спейсер, соединяющий С16-С22 жирную кислоту или С16-С22 двухосновную кислоту с боковой цепью аминокислоты;

В представляет собой N-алкилированную аминокислоту, где необязательно В представляет собой N-метилглицин или N-метилаланин.

В одном варианте осуществления ацилированная аминокислота каждого Х₃₃, Х₃₅ и А представляет собой аминокислоту, содержащую С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер, и указанный саморасщепляющийся дипептид связан с указанным ПТГ пептидом посредством образования амидной связи между В и N-концевым альфа-амином указанного ПТГ пептида. Необязательно А имеет D-стереохимическую конфигурацию. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату, который содержит ПТГ пептид и саморасщепляющийся дипептид, где дипептид ковалентно связан с указанным ПТГ пептидом через амидную связь, необязательно на N-концевом альфа-амине ПТГ пептида, где:

ПТГ пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SVSEIQLMHNLGX13HLNSMERVEWLRX26X27LQDX31H-Z (SEQ ID NO: 5);

SVSEIQLMHNLX₁₂ KHLX₅₆X₁₇MERVEWLRKKLQDVH - Z (SEQ ID NO: 6);

SVSEIQLMHX₁₀LGKHLX₁₆SX₁₈ERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 135); и

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7);

где:

Z представляет собой X₃₃, X₃₃F, X₅₃FX₃₅ или;

X₁₀ и X₁₆ независимо представляют собой Asp, Gln или Asn;

X₁₂ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Gly;

Х₅₆ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Asn;

Х₁₇ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Ser;

Х₁₈ представляет собой Met, Met(О) или Nleu;

X_13, Х₂₆ и Х₂₇ независимо выбраны из группы, состоящей из Arg, Glu, Asp и Lys;

X₃₁ представляет собой Gly или Val;

X₃₃ и X₃₅ каждый содержит ацилированную аминокислоту, где необязательно Х₃₃ и Х₃₅ независимо выбраны из цистеина, гомоцистеина, орнитина или лизина, где боковая цепь указанного цистеина, гомоцистеина, орнитина или лизина ковалентно связана с С16-С22 жирной кислотой или С16-С22 двухосновной кислотой необязательно через спейсер;

Х₅₃ представляет собой Gln или Asn, необязательно при условии, что только один из Х₁₂, Х₁₆ и Х₁₇ представляет собой Aib; и

указанный саморасщепляющийся дипептид имеет общую структуру А-В-;

где:

А представляет собой ацилированную аминокислоту, необязательно выбранную из цистеина или лизина, где боковая цепь указанного цистеина или лизина ковалентно связана с С16-С22жирной кислотой или С16-С22 двухосновной кислотой, необязательно через спейсер;

В представляет собой N-алкилированную аминокислоту, где необязательно В представляет собой N-метилглицин или N-метилаланин;

где указанная ацилированная аминокислота каждого Х₃₃, Х₃₅ и А представляет собой аминокислоту, содержащую С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер, и указанный саморасщепляющийся дипептид связан с указанным ПТГ пептидом посредством образования амидной связи между В и N-концевым альфа-амином указанного ПТГ пептида. Необязательно А находится в D-стереохимической конфигурации.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему ПТГ пептид и

саморасщепляющийся дипептид, где дипептид ковалентно связан с указанным ПТГ пептидом через амидную связь, необязательно на N-концевом альфа-амине ПТГ пептида, где:

ПТГ пептид включает последовательность

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7) или пептид, который отличается от SEQ ID NO: 71 или 2 аминокислотными заменами,

где:

Z представляет собой X₃₃F, NFX₃₅ или X₃₃;

X₃₃ и X₃₅ каждый независимо представляет собой аминокислоту, содержащую С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер, где необязательно Х₃₃ и Х₃₅ независимо выбраны из цистеина или лизина где боковая цепь указанного цистеина или лизина ковалентно связана с С16-С22 жирной кислотой или С16-С22 двухосновной кислотой, необязательно через спейсер; и

Х₅₃ представляет собой Gln или Asn, и саморасщепляющийся дипептид имеет структуру:

где:

R₁ содержит боковую цепь, выбранную из группы, состоящей из С₁-С_в алкила, (С₁-С₄ алкил)ОН, (С₁-С₄ алкил)SH, (С₁-С₄ алкил)СООН и (C₁-C₄ алкил)NH₂, и необязательно С16-С30 углеродную цепь, где указанная С16-С30 углеродная цепь, если она присутствует, ковалентно связана с указанной боковой цепью, необязательно через спейсер;

R₂, R₄ и R₈ независимо представляют собой Н или С₁-С₄ алкил;

R₃ представляет собой С₁-С₆ алкил, или R₃ и R₄, взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют пиперидиновое кольцо; и

R₅ представляет собой NH₂.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему ПТГ пептид и любой из саморасщепляющихся дипептидов, описанных в настоящем документе, где дипептид ковалентно связан с указанным ПТГ пептидом посредством амидной связи, необязательно на N-концевом альфа-амине пептида ПТГ, где:

ПТГ пептид включает последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7) или пептид, который отличается от SEQ ID NO: 7 1, 2 или 3 аминокислотными заменами,

где:

Z представляет собой Х₃₃, X₃₃ F, X₃₃FX₃₅, X₃₃FVX₃₅, X₃₃FVAX₃₅, X₃₃FVALX₃₅, X₃₃FVALGX₃₅, X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₅₃FVAX₃₅, X₅₃FVALX₃₅, или X₅₃FVALGX₃₅, где необязательно Z представляет собой X₃₃, X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₅₃FVAX₃₅, X₅₃FVALX₃₅ или X₅₃FVALGX₃₅, где необязательно Z представляет собой X₃₃, X₅₃X₃₅ или X₅₃FX₃₅;

X₃₃ и X₃₅ каждый независимо представляет собой аминокислоту, содержащую С16-С30 углеродную цепь, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер, где необязательно Х₃₃ и Х₃₅ независимо выбраны из цистеина или лизина, где боковая цепь указанного цистеина или лизина ковалентно связана с С16-С22 жирной кислотой или С16-С22 двухосновной кислотой, необязательно через спейсер; и

Х₅₃ представляет собой Gln или Asn. В одном варианте осуществления саморасщепляющийся дипептид содержит структуру:

где:

R₁ содержит боковую цепь, выбранную из группы, состоящей из (С₁-С₄ алкил)NH₂, и, необязательно С16-С30 углеродной цепи, где указанная С16-С30 углеродная цепь, если она присутствует, ковалентно связана с указанной боковой цепью, необязательно через спейсер;

R₂, R₄ и R₈ независимо представляют собой Н или С₁-С₄ алкил;

R₃ представляет собой C₁-C₆ алкил, или R₃ и R₄, взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют пиперидиновое кольцо; и

R₅ представляет собой NH2.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему ПТГ пептид и саморасщепляющийся дипептид, где дипептид ковалентно связан с указанным ПТГ пептидом через амидную связь, необязательно на N-концевом альфа-амине ПТГ пептида, где:

ПТГ пептид включает последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7) или пептид, который отличается от SEQ ID NO: 7 1, 2 или 3 аминокислотными заменами,

где:

Z представляет собой Х₃₃, X₃₃ F, X₃₃FX₃₅, X₃₃FVX₃₅, X₃₃FVAX₃₅, X₃₃FVALX₃₅, X₃₃FVALGX₃₅, X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₅₃FVAX₃₅, X₅₃FVALX₃₅, или X₅₃FVALGX₃₅, где необязательно Z представляет собой X₃₃, X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₅₃FVAX₃₅, X₅₃FVALX₃₅ или X₅₃FVALGX₃₅, где необязательно Z представляет собой X₃₃, X₅₃X₃₅ или X₅₃FX₃₅;

X₃₃ и X₃₅ каждый независимо представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, выбранную из группы, состоящей из {С₁-С₄ алкил) NH-[спейсер]-СО (СН₂)₁₄-₂₀СООН, {С₁-С₄ алкил) NH-[спейсер] СО (СН₂) ₁₄-₂₀СН₃, (С₁-С₄ алкил) NH-CO (СН₂) ₁₄-₂₀СООН или (С₁-С₄ алкил) NH-CO (СН₂) ₁₄-₂₀СН₃;

Х₅₃ представляет собой Asn, и саморасщепляющийся дипептид имеет структуру:

где:

R₁ выбран из группы, состоящей из (C₁-C₄ алкил)NH-[спейсер]-СО (СН₂)_14-20COOH, (C₁-C₄ алкил) NH-[спейсер]-СО (СН₂) ₁₄-₂₀СН₃, (C₁-C₄ алкил) NH-CO (СН₂) _14-20СООН и (C₁-C₄ алкил) NH-CO (СН₂) ₁₄-₂₀СН₃;

R₂, R₄ и R₈ независимо представляют собой Н или C₁-C₄ алкил;

R₃ представляет собой C₁-C₆ алкил, или R₃ и R₄, взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют пиперидиновое кольцо; и

R₅ представляет собой NH₂, где необязательно первая аминокислота имеет D-стереохимическую конфигурацию. В еще одном варианте осуществления R₂ и R₈ оба представляют собой Н, и R₃ и R₄ независимо представляют собой C₁-C₄ алкил.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату ПТГ, где конъюгат содержит ПТГ пептид и саморасщепляющийся дипептид, где дипептид ковалентно связан с указанным ПТГ пептидом через амидную связь на N-концевом альфа-амине ПТГ пептида, где ПТГ пептид содержит последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7), где

Z представляет собой Х₃₃, X₃₃F, X₃₃FV, NX₃₅ или NFX₃₅;

Х₃₃ и Х₃₅ каждый независимо представляет собой аминокислоту (необязательно лизин или орнитин), содержащую С16-С20 углеродную цепь, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер, где необязательно Х₃₃ и Х₃₅ независимо представляют собой лизин, содержащий С16-С20 жирную кислоту или С16-С20 двухосновную кислоту, ковалентно связанные с боковой цепью лизина, где необязательно Х₃₃ и Х₃₅ независимо представляют собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, имеющую структуру (С₁-С₄ алкил)NH- [спейсер] СО (СН₂)₁₄-₂₀СООН;

Х₅₃ представляет собой Gln или Asn, и саморасщепляющийся дипептид имеет структуру:

где:

R₁ содержит боковую цепь (С₁-С₄ алкил)NH₂ и, необязательно, С16-С20 углеродную цепь, где указанная С16-С20 углеродная цепь, если она присутствует, ковалентно связана с указанной боковой цепью, необязательно через спейсер, где необязательно боковая цепь ацилирована С16-С20 жирной кислотой или С16-С20 двухосновной кислотой, необязательно через спейсер;

R₂, R₄ и R₈ независимо представляют собой Н или C₁-C₄ алкил;

R₃ представляет собой C₁-C₆ алкил; и

R₅ представляет собой NH₂, необязательно при условии, что, когда в R₁ отсутствует указанная С16-С20 углеродная цепь, то первая аминокислота дипептида формулы I находится в D-стереохимической конфигурации.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату ПТГ, где конъюгат содержит ПТГ пептид и саморасщепляющийся дипептид, где дипептид ковалентно связан с указанным ПТГ пептидом через амидную связь на N-концевом альфа-амине ПТГ пептида, где ПТГ пептид содержит последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7), где Z представляет собой Х₃₅, NX₃₅ или NFX₃₅; где Х₃₅ представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, имеющую структуру (C₁-C₄ алкил) NH-[спейсер] СО (СН₂)_14-20COOH, необязательно (С4 алкил) NH-[спейсер]СО(СН₂)_14-20COOH, и указанный дипептид имеет структуру А-В, где А представляет собой Lys, эпсилон-ацилированный Lys, эпсилон-ацилированный dLys или dLys, и В представляет собой N-метилглицин (саркозин), где необязательно ацилированный Lys или ацилированный dLys в А содержит боковую цепь, имеющую структуру (С4 алкил) NH-[спейсер]СО(СН₂)_14-20COOH, где указанный спейсер выбран из группы, состоящей из гамма-глутаминовой кислоты, димера гамма-глутаминовой кислоты или гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_кNH]_q-гамма-глутаминовой кислоты, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8 или 2-4, и q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4, где необязательно к равно 2 или 4, и q равно 2, где необязательно спейсер представляет собой гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂(ОСН₂СН₂)₂-NH-COCH₂(ОСН₂СН₂)₂-NHгамма-глутаминовую кислоту, имеющую структуру:

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату ПТГ, где конъюгат содержит ПТГ пептид и саморасщепляющийся дипептид, где дипептид ковалентно связан с указанным ПТГ пептидом через амидную связь на N-концевом альфа-амине ПТГ пептида, где ПТГ пептид содержит последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7), где Z представляет собой Х₃₅, NX₃₅ или NFX₃₅; где Х₃₅ представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, имеющую структуру (С₁-С₄ алкил) NH-[спейсер]СО(СН₂)_14-20СООН, необязательно (С₄ алкил) NH-[спейсер]СО(СН₂)_14-20СООН, и указанный дипептид имеет структуру А-В, где А представляет собой аминокислоту в L- или D-стереохимической конфигурации и содержит структуру боковой цепи (С₁-С₄ алкил) NH-[спейсер]СО(СН₂)₁₄-₂₀СООН, необязательно (С₄ алкил) NH-[спейсер]СО(СН₂)₁₄-₂₀СООН, и В представляет собой N-метилглицин (саркозин), где указанный спейсер выбран из группы, состоящей из гамма-глутаминовой кислоты, димера гамма-глутаминовой кислоты или гамма-глутаминовая кислота-[COCH₂ (ОСН₂СН₂)_к-NH]_q-гамма-глутаминовой кислоты, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8 или 2-4, и q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4, где необязательно к равно 2 или 4, и q равно 2, где спейсер необязательно представляет собой гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂(ОСН₂СН₂)₂NH]₂-гамма-глутаминовую кислоту.

В соответствии с любым из вариантов осуществления конъюгатов, раскрытых в настоящем документе, спейсер конъюгатов, если он присутствует, содержит аминокислоту или дипептид. В одном варианте осуществления аминокислота спейсера представляет собой гамма-глутаминовую кислоту. В одном варианте осуществления спейсер содержит две аминокислоты, разделенные полимером полиэтиленгликолем. В соответствии с любым из вариантов осуществления конъюгата, раскрытых в настоящем документе, спейсер может содержать структуру: гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂(ОСН₂СН₂)_к-NH]_q-гамма-глутаминовая кислота, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8 или 2-4, и q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4. В одном варианте осуществления к равно 2 или 4, и q равно 1 или 2. В одном варианте осуществления к равно 2, и q равно 2 или 4. В одном варианте осуществления к равно 2, и q равно 2. В одном варианте осуществления к равно 2, и q равно 4. В одном варианте осуществления к равно 2, и q равно 8. В одном варианте осуществления к равно 2 или 4, и q равно 1. В одном варианте осуществления к равно 2, и q равно 1. В одном варианте осуществления к равно 4, и q равно 1. В одном варианте осуществления к равно 8, и q равно 1. В одном варианте осуществления к равно 1, и q представляет собой целое число, выбранное из ряда от 2 до 8 или от 2 до 4. В одном варианте осуществления к равно 2, и q представляет собой целое число, выбранное из ряда от 2 до 8 или от 2 до 4. В одном варианте осуществления к равно 2, и q равно 1.

В одном варианте осуществления ПТГ пептид конъюгата содержит последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHX₃₃ (SEQ ID NO: 2) или SVSEI QLMHNLGKHLNSME RVEWLRKKLQDVHN FX₃₅ (SEQ ID NO: 26),

где X₃₃ и X₃₅ каждый независимо представляет собой аминокислоту, содержащую С16-С30 углеродную цепь, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер, где необязательно Х₃₃ и Х₃₅, каждый независимо представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, ацилированную С16-С20 жирной кислотой или С16-С20 двухосновной кислотой, необязательно через спейсер, и саморасщепляющийся дипептид имеет структуру:

где:

R₁ представляет собой (С₁-С₄ алкил) NH-CO(СН₂)₁₄-₂₀СООН, (С₁-С₄ алкил) NH-CO(СН₂)₁₄-₂₀СН₃, (С₁-С₄ алкил) NH-[спейсер]СО(СН₂)₁₄-₂₀СООН или (C₁-C₄ алкил) NH-[спейсер]СО СН₂)_14-20CH₃;

R₂, R₄ и R₈ независимо представляют собой Н или C₁-C₄ алкил;

R₃ представляет собой C₁-C₆ алкил; и

R₅ представляет собой NH₂, где необязательно R₂ и R₈ оба представляют собой Н, и R₄ представляет собой Н или СН₃.

В одном варианте осуществления конъюгат ПТГ содержит саморасщепляющийся дипептид, ковалентно связанный с N-концевым альфа-амином ПТГ пептида, где ПТГ пептид содержит последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHX₃₃ (SEQ ID NO: 2) или SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFX₃₅ (SEQ ID NO: 26),

где:

X₃₃ и X₃₅ каждый представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, имеющую структуру, выбранную из группы, состоящей из (С₁-С₄ алкил) NH-CO (СН₂)_14-20COOH, (С₁-С₄ алкил) NH-CO (СН₂)₁₄-₂₀СН₃, (C₁-C₄ алкил)NH-[спейсер]-СО (СН₂)₁₄-₂₀СООН или (C₁-C₄ алкил)NH-[спейсер]-СО (СН₂)₁₄-₂₀СН₃, где спейсер выбран из группы, состоящей из гамма-глутаминовой кислоты, димера гамма-глутаминовой кислоты или гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_к-NH]_q-гамма-глутаминовой кислоты, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8 или 2-4, и q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4, где необязательно к равно 2, и q равно 2;

и саморасщепляющийся дипептид имеет структуру:

где:

R₁ представляет собой структуру, выбранную из группы, состоящей из (С₁-С₄ алкил) NH-CO (СН₂)_14-20COOH, (С₁-С₄ алкил) NH-CO (СН₂)_14-20СН₃, (С₁-С₄ алкил) NH-[спейсер]-СО (СН₂)_14-20COOH или (С₁-С₄ алкил) NH- [спейсер]-СО(СН₂)₁₄-₂₀СН₃, где спейсер выбран из группы, состоящей из гамма-глутаминовой кислоты, димера гамма-глутаминовой кислоты или гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_к-NH_]q-гамма-глутаминовой кислоты, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8 или 2-4, и q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4;

R₂, R₄ и R₈ независимо представляют собой Н или С₁-С₄ алкил;

R₃ представляет собой C₁-C₆ алкил; и

R₅ представляет собой NH₂, где необязательно R₂ и R₈ оба представляют собой Н, и R₄ представляет собой Н или СН₃.

В одном варианте осуществления конъюгат ПТГ содержит саморасщепляющийся дипептид, ковалентно связанный с N-концевым альфа-амином ПТГ пептида, где ПТГ пептид содержит последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHX₃₃ (SEQ ID NO: 2),

где:

X₃₃ представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь, имеющую структуру, выбранную из группы, состоящей из {С₁-С₄ алкил)NH-[спейсер]-СО (СН₂)_14-20COOH или (С₁-С₄ алкил) NH-[спейсер]-СО(СН₂)_14-20СН₃, где спейсер представляет собой гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_кNH]-гамма-глутаминовую кислоту, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 2-4, и q равно 1 или 2, где необязательно к и q оба равны 2;

и саморасщепляющийся дипептид имеет структуру:

где:

R₁ представляет собой структуру, выбранную из группы, состоящей из (С₁-С₄ алкил)NH-[спейсер]-СО (СН₂)_14-20СООН или (С₁-С₄ алкил) NH-[спейсер]-СО(СН₂)₁₄-₂₀СН₃, где спейсер представляет собой гамма-глутаминовая кислота- [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_кNH]_q-гамма- глутаминовую кислоту, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 2-4, и q равно 1 или 2, где необязательно к и q оба представляют собой 2;

R₂, R₄ и R₈ независимо представляют собой Н или С₁-С₄ алкил; R₃ представляет собой С_г-С₆ алкил; и

R₅ представляет собой NH₂, где необязательно R₂ и R₈ оба представляют собой Н, R₃ представляет собой С₁-С₃ алкил, и R₄ представляет собой Н или СН₃.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему ПТГ пептид и саморасщепляющийся дипептид, ковалентно связанный с N-концевым альфа-амином ПТГ пептида посредством амидной связи, где ПТГ пептид содержит аминокислотную последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z,

где:

Z представляет собой X₃₃F, X₅₃FX₃₅ или Х₃₃;

Х₃₃ и Х₃₅ каждый независимо содержат цистеин, гомоцистеин, орнитин, d-лизин или лизин, где боковая цепь остатка цистеина, гомоцистеина, орнитина, d-лизина или лизина ацилирована или алкилирована С14-С30 углеродной цепью;

Х₅₃ представляет собой Gln или Asn; и

указанный саморасщепляющийся дипептид имеет общую структуру:

где:

R₁ представляет собой полимерную цепь, включающую боковую цепь, выбранную из группы, состоящей из (С₁-С₄ алкил)SH или (С₁-С₄ алкил)NH₂, и С16-С30 углеродную цепь, ковалентно связанную с указанной боковой цепью;

R₂, R₄ и R₈ независимо представляют собой Н или C₁-C₄ алкил;

R₃ представляет собой C₁-C₆ алкил; и

R₅ представляет собой NH₂, где необязательно R₁ представляет собой (C₁-C₄ алкил) NH-CO(СН₂)_14-20COOH;

R₂ и R₈ каждый представляет собой Н;

R₄ представляет собой Н;

R₃ представляет собой СН₃, и R₅ представляет собой NH₂.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему ПТГ пептид и саморасщепляющийся дипептид, где дипептид ковалентно связан с N-концевым альфа-амином указанного ПТГ пептида через амидную связь, где:

ПТГ пептид содержит аминокислотную последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHX33 или SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFX₃₅, где:

Х₃₃ и Х₃₅ каждый представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь (С₁-С₄ алкил)NH-гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂(ОСН₂СН₂)_k-NH_]q-гамма-глутаминовая кислота-СО(СН₂)₁₄-₂₀СООН; и

указанный саморасщепляющийся дипептид имеет общую структуру:

где:

R₁ представляет собой (С₁-С₄ алкил)NH-гамма-глутаминовая кислота- [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_кNH]_q-гамма-глутаминовая кислота-СО(СН₂)₁₄-₂₀ СООН;

R₂ и R₈ каждый представляет собой Н;

R₄ представляет собой Н или СН₃;

R₃ представляет собой С₁-С₃ алкил;

R₅ представляет собой NH₂;

к представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8; и

q представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 3, 4, 5 и 6, где необязательно R₄ представляет собой Н, и к равно 2 или 4, и q равно 1 или 2, где необязательно к равно 2, и q равно 2.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему ПТГ пептид и саморасщепляющийся дипептид, где дипептид ковалентно связан с N-концевым альфа-амином указанного ПТГ пептида посредством амидной связи, где ПТГ пептид содержит аминокислотную последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFX₃₅, где:

Х₃₅ представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь (С₁-С₄ алкил) NH-гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂(ОСН₂СН₂)_кNH_]q-гамма-глутаминовая кислота-СО (СН₂)_14-20COOH; и

указанный саморасщепляющийся дипептид имеет общую структуру:

где:

R₁ представляет собой (С₄ алкил)NH-гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂(ОСН₂СН₂)_к-NH]_q-гамма-глутаминовая кислота-СО (СН₂)_14-20СООН;

R₂, R₄ и R₈ каждый представляет собой Н;

R₃ представляет собой СН₃;

R₅ представляет собой NH₂;

к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4; и

q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4, где необязательно к равно 1 или 2, и q равно 1, 2 или 4, где необязательно к, и q оба равны 2.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему ПТГ пептид и саморасщепляющийся дипептид, где дипептид ковалентно связан с N-концевым альфа-амином указанного ПТГ пептида посредством амидной связи, где ПТГ пептид содержит аминокислотную последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHX33, где:

Х₃₃ представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь (С₁-С₄ алкил) NH-гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂(ОСН₂СН₂)_кNH_]q-гамма-глутаминовая кислота-СО (СН₂)_14-20COOH; и

указанный саморасщепляющийся дипептид имеет общую структуру:

где:

R₁ представляет собой (С₄-алкил)NH-гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_кNH]^q-гамма-глутаминовая кислота-СО (СН₂)₁₄-₂₀СООН;

R₂, R₄ и R₈ каждый представляет собой Н;

R₃ представляет собой СН₃; и

R₅ представляет собой NH₂;

к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4; и

q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4, где необязательно к равно 1 или 2, и q равно 1, 2 или 4, где необязательно к, и q оба равны 2.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к ПТГ пептиду, выбранному из группы, включающей SEQ ID NO: 77, 78, 79, 84, 87, 95, 102, 108, 110, 127 или 128. В некоторых вариантах осуществления ПТГ пептид выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 87, 95, 108, 127 или 128. В некоторых вариантах осуществления ПТГ пептид по настоящему изобретению выбран из SEQ ID NO: 77 или 87. В одном варианте осуществления ПТГ пептид представляет собой SEQ ID NO: 77. В другом варианте осуществления ПТГ пептид представляет собой SEQ ID NO: 87. В одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает ПТГ пептид, представленный в таблице 2. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает ПТГ пептид из таблицы 2 с орнитиновой заменой, сделанной для одного лизина в последовательности. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к ПТГ пептидам из таблицы 2 с более чем одним орнитином, замещенным более чем одним лизином.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее изобретение относится к пролекарству пептида паратиреоидного гормона, которое при введении пациенту, нуждающемуся в этом, обеспечивает половину или менее активного лекарственного средства по сравнению с пролекарством через одну неделю. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее изобретение относится к пролекарству пептида паратгормона, которое при введении пациенту, нуждающемуся в этом, обеспечивает одну треть или менее активного лекарственного средства в пролекарстве через одну неделю. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее изобретение относится к пролекарству пептида паратиреоидного гормона, которое при введении пациенту, нуждающемуся в этом, обеспечивает одну четверть или менее активного лекарственного средства к пролекарству через одну неделю.

Настоящее раскрытие также охватывает другие конъюгаты, в которых конъюгаты ПТГ по настоящему изобретению связаны, необязательно посредством ковалентной связи и необязательно через линкер, с дополнительной группой конъюгата. Связь может осуществляться ковалентными химическими связями, физическими силами, такими как электростатические, водородные, ионные, ван-дер-ваальсовы или гидрофобными или гидрофильными взаимодействиями. Могут быть использованы различные системы нековалентного связывания, включая биотин-авидин, лиганд/рецептор, фермент/субстрат, белок, нуклеиновая кислота/связывающий нуклеиновую кислоту белок, липид/связывающий липид белок, молекулы-партнеры клеточной адгезии; или любые партнеры по связыванию или их фрагменты, обладающие сродством друг к другу.

Полагается, что раскрытые конъюгаты ПТГ пептида подходят для любого применения, которое ранее было описано для соответствующего исходного ПТГ. Следовательно, конъюгаты ПТГ можно вводить пациентам для лечения любого заболевания или патологических состояний, ассоциированных с недостаточным уровнем ПТГ (гипопаратиреоз), или заболевания, поддающегося лечению ПТГ, такого как остеопороз. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения гипопаратиреоза, где пациенту, нуждающемуся в таком лечении, вводят композицию или конъюгат в соответствии с любым из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе в количестве, эффективном для лечения или профилактики гипопаратиреоза или облегчения патологического состояния, ассоциированного с гипопаратиреозом. В одном варианте осуществления путес введения является парентеральный, включая подкожный. В другом варианте осуществления путь введения представляет собой пероральный путь. В еще одном варианте осуществления путь введения является легочным. В некоторых вариантах осуществления ПТГ пептиды по настоящему изобретению вдыхают в виде аэрозоля, тумана или порошкообразного состава. Ингаляционные фармацевтические композиции, описанные здесь, могут быть доставлены в форме аэрозольного спрея из упаковок под давлением или распылителя с использованием подходящего пропеллента, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. Такие способы включают способы, описанные в патенте США №6468798, полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления стандартная дозировка ПТГ пептида определяется посредством обеспечения клапана для доставки отмеренного количества.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения описан способ лечения остеопороза. Способ включает введение любого из конъюгатов ПТГ по настоящему изобретению пациенту, нуждающемуся в этом, где необязательно конъюгат ПТГ вводят в сочетании с агонистом ПТГ короткого действия (например, ПТГ пептидом с SEQ ID N0; 7 или любым из SEQ ID No: 31-37). В одном варианте осуществления пациенту вводят композицию, содержащую конъюгат ПТГ по настоящему изобретению и второй компонент, выбранный из группы, состоящей из терипаратида (Forteo®), SEQ ID NO: 7, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 и кальцитонина. В одном варианте осуществления способ лечения остеопороза или остеопении включает введение композиции, содержащей конъюгат ПТГ по настоящему изобретению, посредством ежедневной подкожной инъекции или ежедневного перорального введения субъекту, нуждающемуся в этом.

В некоторых вариантах осуществления субъект, нуждающийся в лечении, страдает остеопорозом. В некоторых вариантах осуществления субъект, нуждающийся в лечении, страдает остеопенией. В некоторых вариантах осуществления субъектом, нуждающимся в лечении, представляет собой женщину в периоде постменопаузы. В некоторых вариантах осуществления субъект, нуждающийся в лечении, страдает остеопорозом, индуцированным глюкокортикоидами. В некоторых вариантах осуществления у субъекта, нуждающегося в лечении, имеется остеопения, вызванная глюкокортикоидами. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения остеопороза, включающему лечение субъекта, нуждающегося в этом, путем ежедневной подкожной инъекции конъюгата ПТГ по настоящему изобретению. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения остеопороза, включающему лечение субъекта, нуждающегося в этом, путем подкожной инъекции через день конъюгата ПТГ по настоящему изобретению. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения остеопороза, включающему лечение субъекта, нуждающегося в этом, еженедельной или ежемесячной подкожной инъекцией конъюгата ПТГ по настоящему изобретению.

Фармацевтические композиции, содержащие конъюгаты, описанные здесь, можно формулировать и вводить пациентам с использованием стандартных фармацевтически приемлемых носителей и путей введения, известных специалистам в данной области. Следовательно, настоящее раскрытие также охватывает фармацевтические композиции, содержащие один или несколько конъюгатов, раскрытых в настоящем документе, или их фармацевтически приемлемую соль в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей любой из новых комплексов дипептид / ПТГ пептид, раскрытых в настоящем документе, предпочтительно стерильных и предпочтительно с уровнем чистоты, по меньшей мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент. Такие композиции могут содержать конъюгат дипептид/пептид ПТГ, раскрытый в настоящем документе, где образовавшийся в результате активный агент находится в концентрации, по меньшей мере, 0,1-10 мг/мл или выше. В одном варианте осуществления фармацевтические композиции содержат водные растворы, которые стерилизованы и необязательно хранятся в различных контейнерах. Соединения, раскрытые здесь, можно использовать в соответствии с одним вариантом осуществления для приготовления предварительно формулированных растворов, готовых для инъекций. В других вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат лиофилизированный порошок. Фармацевтические композиции могут быть дополнительно упакованы в виде части набора, который включает одноразовое устройство для введения композиции пациенту. Контейнеры или наборы могут быть маркированы для хранения при комнатной температуре или в холодильнике.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, где раскрытые пролекарственные формы конъюгатов ПТГ выбраны для обеспечения оптимизированного уровня активного ПТГ в крови/сыворотке/плазме пациента. В некоторых вариантах осуществления после первого введения пролекарственной формы одного из конъюгатов ПТГ пептида по настоящему изобретению пациенту, нуждающемуся в этом, концентрация пролекарства в плазме остается выше, чем концентрация высвобожденного лекарственного средства в течение, по меньшей мере, 48-96 ч. В некоторых вариантах осуществления после начального введения пролекарственной формы одного из конъюгатов ПТГ пептида по настоящему изобретению концентрация пролекарства в плазме выше, чем концентрация активного лекарственного средства в плазме крови в течение, по меньшей мере, 120 ч. В некоторых вариантах осуществления пептиды по настоящему изобретению вводят пациенту, нуждающемуся в этом, и концентрация активного пептида в плазме достигает пика через 48-120 ч после начальной дозы. В некоторых вариантах осуществления пролекарственную форму одного из конъюгатов ПТГ пептида по настоящему изобретению вводят пациенту, нуждающемуся в этом, и концентрация активного пептида в плазме остается выше 75% от его Cmax через одну неделю после введения. В некоторых вариантах осуществления пролекарственную форму одного из конъюгатов ПТГ пептида по настоящему изобретению вводят пациенту, нуждающемуся в этом, и концентрация полученного активного пептида в плазме остается выше 50% от его Cmax через десять суток после введения. В некоторых вариантах осуществления пролекарственную форму одного из конъюгатов ПТГ пептида по настоящему изобретению вводят пациенту, нуждающемуся в этом, и концентрация полученного активного пептида в плазме остается выше 25% от его Cmax через две недели после введения.

Конъюгаты ПТГ по настоящему изобретению можно вводить пациентам любым из известных стандартных путей, самостоятельно или в комбинации с другими подходящими компонентами.

Препараты, подходящие для парентерального введения, включают водные и неводные изотонические стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, которые делают препарат изотоническим с кровью предполагаемого реципиента, и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. Термин «парентеральный» означает путь введения не через пищеварительный канал, а каким-то другим путем, таким как подкожный, внутримышечный, интраспинальный или внутривенный. Аналог по настоящему изобретению можно вводить с физиологически приемлемым разбавителем в фармацевтическом носителе, таком как стерильная жидкость или смесь жидкостей, включая воду, физиологический раствор, водный раствор декстрозы и растворы близких Сахаров, спирт, такой как этанол или гексадециловый спирт, гликоль, такой как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, диметилсульфоксид, глицерин, кетали, такие как 2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-метанол, простые эфиры, поли(этиленгликоль) 400, масла, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот или глицериды, или ацетилированные глицериды жирных кислот с добавлением или без добавления фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества, такого как мыло или детергент, суспендирующего агента, такого как пектин, карбомеры, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или карбоксиметилцеллюлоза, или эмульгаторов и других фармацевтических адъювантов.

Введение соединения по настоящему изобретению может осуществляться в комбинации с ПТГ более короткого действия или аналогами ПТГ. Пептиды по настоящему изобретению можно вводить пациенту, нуждающемуся в этом, последовательно или совместно с производными паратиреоидного гормона с относительно коротким биологическим периодом полураспада.

В еще одних вариантах осуществления соединение по настоящему изобретению можно вводить самостоятельно или в комбинации с другими агентами, например, антирезорбтивными агентами для костей, включая кальцитонин, бисфосфонаты, SERM (например, ралоксифен), заместительной гормональной терапией (ЗГТ), кальцием, витамином D1, витамином D2, витамином D3, витамином D4 и эстрогеном. Соединение по данному изобретению можно вводить совместно с другим агентом. Альтернативно, соединение по настоящему изобретению можно вводить последовательно с другим агентом; например, соединение по данному изобретению вводят одно в течение периода от одной недели до одного года с последующим введением другого агента либо вместе с указанным соединением, либо в отсутствие указанного соединения.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат ПТГ по настоящему изобретению и один или более антирезорбтивных агентов для костей, включая кальцитонин, бисфосфонаты, SERM (например, ралоксифен), заместительную гормональную терапию (ЗГТ), кальций, витамин D1, витамин D2, витамин D3, витамин D4 и эстроген. В одном варианте осуществления такую композицию вводят пациентам для лечения остеопении или остеопороза, где фармацевтическая композиция необязательно формулирована для перорального введения.

Составы, подходящие для перорального введения, могут состоять из (а) жидких растворов, содержащих эффективное количество аналога по настоящему изобретению, растворенного в растворителях, таких как вода, физиологический раствор или апельсиновый сок; (b) капсул, саше, таблеток, пастилок и лепешек, каждая из которых содержит заранее определенное количество активного ингредиента в виде твердых веществ или гранул; (с) порошков; (d) суспензий в соответствующей жидкости; и подходящих эмульсий. В соответствии с одним вариантом осуществления составы, подходящие для перорального введения, содержат конъюгат ПТГ по настоящему изобретению и усилитель абсорбции, такой как N-[8-(2-гидроксибензоил)амино]каприлат натрия (SNAC). N-[8-(2-гидроксибензоил)амино]каприлат натрия (SNAC) представляет собой средство для доставки, которое, как сообщается, повышает проницаемость для широкого спектра молекул, включая белки, такие как инсулин, кальцитонин и другие макромолекулы, такие как гепарин. В соответствии с одним вариантом осуществления обеспечиваются фармацевтические композиции для перорального введения, где композиция содержит конъюгат ПТГ по настоящему изобретению и SNAC, где оптимально фармацевтическая композиция формулирована в виде таблетки.

Все терапевтические способы, фармацевтические композиции, наборы и другие подобные варианты осуществления, описанные в настоящем документе, предполагают, что комплексы дипептид/ПТГ пептид включают все его фармацевтически приемлемые соли.

В одном варианте осуществления набор снабжен устройством для введения пациенту композиции комплекса дипептид/ПТГ пептид. Набор может дополнительно включать различные контейнеры, например, флаконы, пробирки, бутыли и т.п. Предпочтительно, чтобы наборы также включали инструкции по применению. В соответствии с одним вариантом осуществления устройство в наборе представляет собой устройство для дозирования аэрозоля, где композиция предварительно упакована в аэрозольное устройство. В другом варианте осуществления набор содержит шприц и иглу, и в одном варианте осуществления композиция пролекарства предварительно упакована в шприц или шприц-ручку с использованием иглы малого диаметра, например, размером 29-31.

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к модифицированному ПТГ пептиду, содержащему последовательность SEQ ID NO: 31, 32 или 33 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 31, 32 или 33 заменой лизина в одном или двух положениях, выбранных из положений 13, 16, 19, 22, 26 и 33, где указанный модифицированный ПТГ пептид содержит ацилированную аминокислоту в одном или двух положениях, выбранных из 13, 16, 19, 22, 26 и 33, где необязательно ацилированная аминокислота имеет С16-С20 жирную кислоту или С16-С20 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер, и ПТГ пептид дополнительно содержит дипептид А-В, ковалентно связанный через амидную связь с N-концом ПТГ пептида, где А представляет собой аминокислоту (например, Lys, орнитин, цистеин или гомоцистеин), где необязательно аминокислота находится в D-стереохимической конфигурации, и где необязательно представляет собой ацилированную аминокислоту; и В представляет собой N-алкилированную аминокислоту, необязательно N-метилглицин или N-метилаланин.

В соответствии с вариантом осуществления 1 настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему ПТГ пептид и саморасщепляющийся дипептид, ковалентно связанный с указанным ПТГ пептидом посредством амидной связи, где необязательно саморасщепляющийся дипептид связан посредством амидной связи с N-концевым альфа-амином ПТГ пептида, где:

указанный ПТГ пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SVSEIQLMHX₁₀LGX₁₃HLX₁₆SX₁₈ERVEWLRX₂₆X₂₇LQDX₃₁H-Z, (SEQ ID NO: 133);

SVSEIQLMHX₁₀LX₁₂KHLX₅₆X₁₇X₁₈ERVEWLRKKLQDVH-Z; (SEQ ID NO: 134);

SVSEIQLMHX₁oLGKHLX₁₆SX₁₈ERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 135) и

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7);

где Z представляет собой X₃₃, X₃₃F, X₃₃FX₃₅, X₃₃FVX₃₅, X₃₃FVAX₃₅, X₃₃FVALX₃₅, X₃₃FVALGX₃₅, X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₅₃FVAX₃₅, X₅₃FVALX₃₅, or X₅₃FVALGX₃₅; где необязательно Z представляет собой X₃₃ X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₅₃FVAX₃₅, X₅₃FVALX₃₅ или X₅₃FVALGX₃₅;

X₁₀ и X₁₆ независимо представляют собой Asp, Gln или Asn;

X₁₂ представляет собой Gly или Aib;

X₅₆ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Asn;

Х₁₇ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Ser;

Х₁₈ представляет собой Met, Met(О), Leu или Nleu; X₁₃, Х₂₆ и Х₂₇ независимо выбраны из группы, состоящей из Arg, Glu, Asp и Lys;

Х₃₁ представляет собой Gly или Val;

Х₃з и Х₃₅ каждый содержит ацилированную аминокислоту, содержащую С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер; где необязательно ацилированная аминокислота выбрана из группы, состоящей из Lys, dLys, орнитина, Cys и гомоцистеина;

Х₅₃ представляет собой Gln или Asn, необязательно при условии, что только один из Х₁₂, Х₁₆ и Х₁₇ представляет собой Aib, и где необязательно С-концевая аминокислота модифицирована для замены карбоксиконца амидом; и

указанный саморасщепляющийся дипептид имеет структуру А-В, где:

А представляет собой аминокислоту, необязательно ацилированную аминокислоту, содержащую С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер; и

В представляет собой N-алкилированную аминокислоту.

В соответствии с вариантом осуществления 2 настоящее изобретение относится к конъюгату по варианту осуществления 1, где А выбран из группы, состоящей из Lys, dLys, эпсилон-ацилированного Lys, эпсилон-ацилированного dLys, орнитина, эпсилон-ацилированного орнитина, цистеина, S-ацилированного цистеина, гомоцистеина и S-ацилированного гомоцистеина, где необязательно А выбран из группы, состоящей из Lys, dLys, ацилированного Lys и ацилированного dLys. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату по варианту осуществления 1, где А представляет собой dLys. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату по варианту осуществления 1, где А представляет собой эпсилон-ацилированный dLys. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату по варианту осуществления 1, где А выбран из 1-Lys или эпсилон-ацилированного 1-Lys.

В соответствии с вариантом осуществления 3 настоящее изобретение относится к конъюгату по варианту осуществления 1 или 2, где Z представляет собой Lys; Х₁₀ и Х₁₆ представляют собой Asn; Х₁₃, Х₂₆ и Х₂₇ представляют собой Lys; Х₁₇ представляет собой Ser; Х₁₈ представляет собой Met; Х₃₁ представляет собой Val; Х₃₃ представляет собой Lys; А представляет собой dLys, где боковая цепь ацилирована COC₁₆H₃₂CO₂H через спейсер гамма-Glu-СОСН₂ (ОСН₂СН₂)2NН-гамма Glu; и В представляет собой н-метилглицин.

В соответствии с вариантом осуществления 4 настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему ПТГ пептид и саморасщепляющийся дипептид, ковалентно связанный с указанным ПТГ пептидом посредством амидной связи, необязательно на N-концевом альфа-амине белка ПТГ, где указанный ПТГ пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

I)

SVSEIQLMHNLGX₁₃HLNSMERVEWLRX₂₆X₂₇LQDX₃₁H-Z, (SEQ ID NO: 5);

SVSEIQLMHNLX₁₂KHLX₅₆X₁₇MERVEWLRKKLQDVH - Z; (SEQ ID NO: 6); и

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7); где:

Z представляет собой X₃₃, X₃₃F, X₃₃FX₃₅, X₃₃FVX₃₅, X₃₃FVAX₃₅, X₃₃FVALX₃₅, X₃₃FVALGX₃₅, X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₅₃FVAX₃₅, X₅₃FVALX₃₅, или X₅₃FVALGX₃₅; где необязательно Z представляет собой X₃₃ X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅, X₅₃FVX₃₅, X₅₃FVAX₃₅, X₅₃FVALX₃₅ или X₅₃FVALGX₃₅;

X₁₂ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Gly;

Х₅₆ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Asn;

Х₁₇ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Ser;

Х₁₃, X₂₆, and X₂₇ независимо выбраны из группы, состоящей из Arg, Glu, Asp и Lys, где необязательно X₁₃, Х₂₆ и Х₂₇ независимо выбраны из Glu и Lys;

Х₃₁ представляет собой Gly или Val;

Х₃₃ и Х₃₅ каждый содержит ацилированную аминокислоту, содержащую С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер;

Х₅₃ представляет собой Gln или Asn, необязательно при условии, что только один из Х₁₂, Х₁₆ и Х₁₇ представляет собой Aib, и необязательно где С-концевая аминокислота модифицирована для замены карбоксиконца амидом; или

II)

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHX₃₅ (SEQ ID NO: 2);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHN FX₃₅ (SEQ ID NO: 12);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHQFX₃₅ (SEQ ID NO: 14);

SVSEIQLMHNLX₁₂X₁₃HLX₁₆X₁₇MERVEWLRX₂₆X₂₇LQDX₃₁HN (SEQ ID NO: 103);

SVSEIQLMHNLGX₁₃HLNSMERVEWLRX₂₆X₂₇LQDX₃₁HN (SEQ ID NO:104);

SVSEIQLMHNLX₁₂KHLX₁₆X₁₇MERVEWLRKKLQDVHN (SEQ ID NO: 105);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHN (SEQ ID NO: 106); где:

X₁₂ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Gly;

Х₁₆ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Asn;

Х₁₇ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Ser;

Х₁₃, Х₂₆ и Х₂₇ независимо выбраны из группы, состоящей из Arg, Glu, Asp и Lys;

X₃₁ представляет собой Gly или Val; и

Х₃₅ представляет собой ацилированную аминокислоту, содержащую С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер.

где ПТГ пептид с SEQ ID NO: 2, 12, 14, 103, 104, 105, 106 или 107 модифицирован заменой в любом из положений 13, 16, 19, 22, 26, 33 или на С-концевой аминокислоте пептида с SEQ ID NO: 103, 104, 105, 106 или 107 лизином, ацилированной С14-С20 жирной кислотой или С14-С20 двухосновной кислотой, необязательно через спейсер; и

указанный саморасщепляющийся дипептид имеет структуру А-В, где:

А представляет собой аминокислоту, необязательно аминокислоту в D-стереохимической конфигурации, и где необязательно боковая цепь аминокислоты «А» ацилирована С16-С30 жирной кислотой или С16-С30 двухосновной кислотой, необязательно через спейсер; и

В представляет собой N-алкилированную аминокислоту, необязательно N-(C₁-C₄) алкилированный глицин, N-метилглицин или N-метилаланин; необязательно при условии, что ацилированная аминокислота Х₃₃, Х₃₅ и аминокислота «А» дипептида формулы I являются одинаковыми или разными, где необязательно аминокислота Х₃₃, Х₃₅ и аминокислота «А» дипептида формулы I оба представляют собой лизин, но различаются спейсером, стереохимией или ацилирующей группой, присоединенной к боковой цепи лизина, где необязательно «А» представляет собой эпсилон-ацилированный dLys, и Х₃₃ и Х₃₅ каждый представляет собой эпсилон-ацилированный Lys, где необязательно ацилирующая группа представляет собой С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, необязательно связанную через спейсер.

В соответствии с вариантом осуществления 5 настоящее изобретение относится к конъюгату по любому из вариантов осуществления 1-2 или 4, где каждая из ацилированных аминокислот конъюгата содержит С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, связанные спейсером, где спейсер содержит одну или более линкерных групп, независимо выбранных из группы, состоящей из гамма-глутаминовой кислоты и СОСН₂(ОСН₂СН₂)_кNH, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8, с необязательным условием, что, когда А представляет собой неацилированную аминокислоту, то А представляет собой аминокислоту в D-стереохимической конфигурации.

В соответствии с вариантом осуществления 6 настоящее изобретение относится к конъюгату по варианту осуществления 1, где А выбран из группы, состоящей из Lys, dLys, ацилированного Lys, ацилированного dLys, орнитина, ацилированного орнитина, цистеина, ацилированного цистеина, гомоцистеина и ацилированного гомоцистеина, где необязательно А выбран из группы, состоящей из Lys, dLys, ацилированного-Lys и ацилированного-dLys.

В соответствии с вариантом осуществления 7 настоящее изобретение относится к конъюгату по любому из вариантов осуществления 1-6, где Z представляет собой Х₃₃, Х₅₃Х₃₅ или X₅₃FX₃₅.

В соответствии с вариантом осуществления 8 настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему ПТГ пептид и саморасщепляющийся дипептид, ковалентно связанный с указанным ПТГ пептидом через амидную связь, необязательно на N-концевом альфа-амине белка ПТГ, где:

указанный ПТГ пептид включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SVSEIQLMHNLGX₁₃HLNSMERVEWLRX₂₆X₂₇LQDX₃₁H-Z, (SEQ ID NO: 5);

SVS EIQLMHNLX₁₂KHLX₅₆X₁₇MERVEWLRKKLQDVH - Z; (SEQ ID NO: 6);

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7), и

пептид, который отличается от пептида SEQ ID NO: 7 1, 2 или 3 аминокислотными заменами;

где

Z представляет собой X₃₃F, Х₅₃Х₃₅, X₅₃ FX₃₅ или Х₃₃;

Х₁₂ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Gly;

Х₅₆ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Asn;

Х₁₇ представляет собой аминоизомасляную кислоту (Aib) или Ser;

X₁₃, Х₂₆ и Х₂₇ независимо выбраны из группы, состоящей из Arg, Glu, Asp и Lys;

Х₃₁ представляет собой Gly или Val;

Х₃₃ и Х₃₅ каждый содержит ацилированную аминокислоту;

Х₅₃ представляет собой Gln или Asn; и

указанный саморасщепляющийся дипептид имеет общую структуру А-В-;

где:

А представляет собой аминокислоту или ацилированную аминокислоту, где необязательно аминокислота или ацилированная аминокислота имеет D-стереохимическую конфигурацию;

В представляет собой N-алкилированную аминокислоту;

где указанная ацилированная аминокислота каждого Х₃₃, Х₃₅ и А независимо выбрана из аминокислоты, содержащей С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер, и указанный саморасщепляющийся дипептид связан с указанным ПТГ пептидом посредством образования амидной связи между В и N-концевым альфа-амином указанного ПТГ пептида или в любом из положений 13, 16, 19, 22, 26 и 33, где указанный необязательный спейсер ацилированных аминокислот Х₃₃, Х₃₅ и А независимо выбран из группы, состоящей из гамма-глутаминовой кислоты, дипептида гамма-глутаминовая кислота-гамма-глутаминовая кислота и гамма-глутаминовая кислота - [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_кNH_]q-гамма-глутаминовой кислоты, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8, и q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-4; и

при условии, что когда А представляет собой неацилированную аминокислоту, то А представляет собой аминокислоту в D-стереохимической конфигурации.

В соответствии с вариантом осуществления 9 настоящее изобретение относится к конъюгату по варианту осуществления 8, где указанный ПТГ пептид содержит последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7),

где:

Z представляет собой X₃₃F, Х₅₃Х₃₅, X₅₃FX₃₅ или Х₃₃;

Х₃₃ и Х₃₅ каждый независимо представляет собой аминокислоту, содержащую С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с кислотной боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер; и

Х₅₃ представляет собой Asn при необязательном условии, что ацилированная аминокислота Х₃₃, Х₃₅ и аминокислота «А» дипептида формулы I являются одинаковыми или разными, где необязательно аминокислота Х₃₃, Х₃₅ и аминокислота «А» каждая в дипептиде формулы I представляет собой лизин, но различается спейсером или ацилирующей группой, присоединенной к боковой цепи лизина, где необязательно ацилированная аминокислота Х₃₃, Х₃₅ и аминокислота «А» дипептида формулы I являются идентичными.

В соответствии с вариантом осуществления 10 настоящее изобретение относится к конъюгату по любому из вариантов осуществления 4-9, где указанный ПТГ пептид содержит последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHX₃₃ (SEQ ID NO: 16) или SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFX₃₅ (SEQ ID NO: 12),

где X₃₃ и X₃₅ каждый независимо представляет собой аминокислоту, содержащую С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с кислотной боковой цепью аминокислоты, необязательно через спейсер.

В соответствии с вариантом осуществления 11 настоящее изобретение относится к конъюгату по любому из вариантов осуществления 1-10, где ацилированная аминокислота А, Х₃₃ и Х₃₅ независимо выбрана из цистеина, гомоцистеина, орнитина и лизина, где боковая цепь указанного цистеина, гомоцистеина, орнитина или лизина ковалентно связана с С16-С22 жирной кислотой или С16-С22 двухосновной кислотой, необязательно через спейсер, содержащий связь через гамма-глутаминовую кислоту.

В соответствии с вариантом осуществления 12 настоящее изобретение относится к конъюгату по любому из вариантов осуществления 1-11, где каждая ацилированная аминокислота А, Х₃₃ и Х₃₅ представляет собой лизин или d-лизин, где боковая цепь указанного лизина или d-лизина ковалентно связана с С16-С30 жирной кислотой или С16-С30 двухосновной кислотой, необязательно через спейсер, содержащий связь через гамма-глутаминовую кислоту.

В соответствии с вариантом осуществления 13 настоящее изобретение относится к конъюгату по любому из вариантов осуществления 1-12, где А выбран из группы, состоящей из Lys, dLys, эпсилон-ацилированного Lys и эпсилон-ацилированного dLys, где указанный саморасщепляющийся дипептид ковалентно связан с N-концевым альфа-амином ПТГ пептида через карбоксиконец В-аминокислоты.

В соответствии с вариантом осуществления 14 настоящее изобретение относится к конъюгату по любому из вариантов осуществления 1-13, где указанная ацилированная аминокислота каждого Х₃₃, Х₃₅ и А содержит С16-С30 жирную кислоту или С16-С30 двухосновную кислоту, ковалентно связанную с боковой цепью аминокислоты через спейсер, где спейсер каждого из Х₃₃, Х₃₅ и А независимо выбран из дипептида гамма-глутаминовая кислота-гамма-глутаминовая кислота, (Хаа) - [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_кNH]_q-гамма-глутаминовой кислоты, гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_кNH_]q-гамма-глутаминовой кислоты, где:

Хаа выбран из Arg, Тук(OPO₃H₂) и hCys(SO₃H);

к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8; а также

q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8, где необязательно к равно 2, и q выбрано из ряда 1-4, где необязательно спейсер представляет собой -{гамма-глутаминовая кислота- [СОСН₂(ОСН₂СН₂)₂NH-COCH₂ (ОСН₂СН₂)₂]NH-гамма-глутаминовую кислоту}-.

В соответствии с вариантом осуществления 15 настоящее изобретение относится к конъюгату по любому из вариантов осуществления 1-14, где указанный спейсер содержит структуру: гамма-глутаминовая кислота - [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_кNH_]q-гамма- глутаминовая кислота, где

к представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8; и q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8, где необязательно к равно 2, 4, 6 или 8, и q равно 1, где необязательно к равно 2 или 4, и q равно 2 или 4, где необязательно к равно 2 или 4, и q равно 1, где необязательно к равно 2, и q выбрано из ряда 1-8, где необязательно к равно 2, и q равно 2.

В соответствии с вариантом осуществления 16 настоящее изобретение относится к конъюгату по любому из вариантов осуществления 1-15, где А-В содержит структуру:

где:

R₁ содержит боковую цепь, выбранную из группы, состоящей из C₁-C₈ алкила, (C₁-C₄ алкил)ОН, (С₁-С₄ алкил)SH, (С₁-С₄ алкил)СООН и (C₁-C₄ алкил)NH₂, где необязательно С16-С30 жирная кислота или С16-С30 двухосновная кислота ковалентно связана с указанной боковой цепью, необязательно через указанный спейсер;

R₂, R₄ и R₈ независимо представляют собой Н или С₁-С₄ алкил;

R₃ представляет собой C₁-C₆ алкил; и

R₅ представляет собой NH₂, где указанный спейсер содержит аминокислоту или дипептид.

В соответствии с вариантом осуществления 17 настоящее изобретение относится к конъюгату по любому из вариантов осуществления 1-16, где указанный спейсер выбран из группы, состоящей из гамма-глутаминовой кислоты, дипептида гамма-глутаминовая кислота-гамма-глутаминовая кислота и гамма-глутаминовая кислота- [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_кNH]_q-гамма-глутаминовой кислоты, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 2-4, и q равно 1 или 2, где необязательно спейсер представляет собой -{гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂ (ОСН₂СН₂)₂NH-СОСН₂ (ОСН₂СН₂)₂]NH-гамма-глутаминовая кислота}-.

В соответствии с вариантом осуществления 18 настоящее изобретение относится к конъюгату по любому из вариантов осуществления 1-17, где полупериод (t1/2) химического отщепления А-В от указанного ПТГ пептида составляет, по меньшей мере, примерно от 48 до 168 ч в стандартном растворе PBS в физиологических условиях.

В соответствии с вариантом осуществления 19 настоящее изобретение относится к конъюгату по любому из вариантов осуществления 1-17, где полупериод (tl/2) химического отщепления А-В от указанного ПТГ пептида составляет, по меньшей мере, примерно от 70 до 140 ч в стандартном растворе PBS в физиологических условиях.

В соответствии с вариантом осуществления 20 настоящее изобретение относится к конъюгату по любому из вариантов осуществления 1-17, где полупериод (t1/2) химического отщепления А-В от указанного ПТГ пептида составляет, по меньшей мере, примерно от 90 до 120 ч в стандартном растворе PBS в физиологических условиях.

В соответствии с вариантом осуществления 21 настоящее изобретение относится к конъюгату по варианту осуществления 16, где:

R₁ представляет собой (С₁-С₄ алкил)NH;

R₂ и R₈ каждый представляет собой Н;

R₄ представляет собой Н или СН₃;

R₃ представляет собой СН₃ и R₅ представляет собой NH₂.

В соответствии с вариантом осуществления 22 настоящее изобретение относится к конъюгату по варианту осуществления 16, где:

R₁ представляет собой (С₁-С₄ алкил) NH-[спейсер]-СО(СН₂)_14-20СООН, (С₁-С₄ алкил)NH-[спейсер]-СО(СН₂)_14-20CH₃, (С₁-С₄ алкил)NH-CO(CH₂)₁₄-₂₀COOH или (С₁-С₄ алкил)NH-CO(CH₂)₁₄-₂₀CH₃;

R₂ и R₈ каждый представляет собой Н;

R₄ представляет собой Н или СН₃;

R₃ представляет собой СН₃ и

R₅ представляет собой NH₂, где указанный [спейсер] представляет собой линкерную группу, выбранную из группы, состоящей из гамма-глутаминовой кислоты, дипептида гамма-глутаминовая кислота-гамма-глутаминовая кислота и гамма-глутаминовая кислота - [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_кNH_]q-гамма-глутаминовой кислоты, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 2-4, и q представляет собой целое число, выбранное из ряда 1-8.

В соответствии с вариантом осуществления 23 настоящее изобретение относится к конъюгату по варианту осуществления 22, где R_x представляет собой (С₁-С₄ алкил) NH-[спейсер]-СО(СН₂)₁₄-₂₀СООН, где к равно 2 или 4, и q равно 1, 2 или 4, где необязательно к и q оба равны 2.

В соответствии с вариантом осуществления 24 настоящее изобретение относится к конъюгату по варианту осуществления 22, где:

R₁ представляет собой (С₄-алкил)NH-[гамма-глутаминовая кислота - [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_кNH_]q-гамма-глутаминовая кислота] -СО(СН₂)₁₄-₂₀СООН, где к равно 2-4, и q равно 1 или 2.

В соответствии с вариантом осуществления 25 настоящее изобретение относится к конъюгату по любому из вариантов осуществления 1-2 4, где первая аминокислота расщепляемого дипептида представляет собой аминокислоту в D-стереохимической конфигурации.

В соответствии с вариантом осуществления 2 6 настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему ПТГ пептид и саморасщепляющийся дипептид, ковалентно связанный с N-концевым альфа-амином указанного ПТГ пептида через амидную связь, где:

указанный ПТГ пептид включает аминокислотную последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHX₃₃ (SEQ ID NO: 16), SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFX₃₅ (SEQ ID NO: 12), или пептид, который отличается от пептида SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 12 1 или 2 аминокислотными заменами, где:

Х₃₃ и Х₃₅ каждый представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь (С₁-С₄ алкил) NH-CO(СН₂)₁₄-₂₀СООН, (С₁-С₄ алкил)NH-[спейсер]-СО (СН₂)₁₄-₂₀СООН, (С₁-С₄ алкил) NH-CO(СН₂)₁₄-₂₀СН₃ или (С₁-С₄ алкил)NH-[спейсер]-СО(СН₂)_14-20CH₃; и

указанный саморасщепляющийся дипептид имеет общую структуру:

где:

R₁ представляет собой (C₁-C₄ алкил)NH, (C₁-C₄ алкил)NH-CO(СН₂)_14-20COOH, (C₁-C₄ алкил)NH-[спейсер]-СО(СН₂)_14-20COOH, (C₁-С₄-алкил)NH-CO (СН₂)_14-20CH₃ или (С₁-С₄-алкил) NH- [спейсер]-СО (СН₂)_14-20СН₃;

R₂ и R₈ каждый представляет собой Н;

R₄ представляет собой Н или СН₃;

R₃ представляет собой C₁-C₃ алкил и

R₅ представляет собой NH₂, где указанный спейсер выбран из группы, состоящей из гамма-глутаминовой кислоты, дипептида гамма-глутаминовая кислота-гамма-глутаминовая кислота и гамма-глутаминовая кислота-[С0СН₂ (ОСН₂СН₂)_кNH_]q-гамма глутаминовой кислоты, где к представляет собой целое число, выбранное из ряда 2-4, и q равно 1 или 2, где необязательно С-концевая аминокислота модифицирована для замены карбоксиконца на амид.

В соответствии с вариантом осуществления 2 7 настоящее изобретение относится к конъюгату по варианту осуществления 2 6, где указанный ПТГ пептид содержит аминокислотную последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFX₃₅ (SEQ ID NO: 12), где:

X₃₅ представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь (C₁-C₄ алкил) NH- [гамма-глутаминовая кислота- [СОСН₂(ОСН₂СН₂)_кNH_]q-гамма-глутаминовая кислота]-СО (СН₂)_14-20COOH, где необязательно Х₃₅ представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь (С₄ алкил) NH- {гамма-глутаминовая кислота- [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)₂NH-СОСН₂ (ОСН₂СН₂)₂]NH-гамма-глутаминовая кислота} -СО (СН₂)₁₄-₂₀СООН; и

указанный саморасщепляющийся дипептид имеет общую структуру:

где:

R₁ представляет собой (С₁-С₄ алкил)NH-[гамма-глутаминовая кислота- [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_к-NH]_q-гамма-глутаминовая кислота] -СО(СН₂)₁₄-₂₀СООН;

R₂, R₄ и R₈ каждый представляет собой Н;

R₃ представляет собой СН₃;

R₅ представляет собой NH₂;

q равно 2 или 4, и

к равно 2, где необязательно q равно 2, где необязательно R₁ представляет собой (С₄ алкил)NH-{гамма-глутаминовая кислота-[СОСН₂ (ОСН₂СН₂)₂NH-COCH₂(ОСН₂СН₂)₂NH-гамма-глутаминовая кислота} -СО (СН₂)_14-20COOH с необязательным условием, что ацилированная аминокислота Х₃₅ и аминокислота «А» дипептида формулы I представляют собой, где необязательно аминокислота в положении Х₃₅ и аминокислота «А» дипептида формулы I обе представляют собой лизин, но различаются спейсером, стереохимией или ацилирующей группой, присоединенной к боковой цепи лизина, где необязательно А представляет собой эпсилон-ацилированный dLys, и Х35 представляет собой эпсилон-ацилированный Lys, где необязательно С-концевая аминокислота модифицирована для замены карбоксиконца амидом.

В соответствии с вариантом осуществления 28 настоящее изобретение относится к конъюгату по варианту осуществления 26, где указанный ПТГ пептид содержит аминокислотную последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHX₃₃ (SEQ ID NO: 16),

где:

X₃₃ представляет собой аминокислоту, содержащую боковую цепь {С₁-С₄ алкил) NH-[гамма-глутаминовая кислота- [СОСН₂(ОСН₂СН₂)_к-NH_]q-гамма-глутаминовая кислота]-СО (СН₂)₁₄-₂₀СООН, где необязательно аминокислота, содержит боковую цепь (С₄-алкил)NH-{гамма-глутаминовая кислота- [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)₂NH-COCH₂(ОСН₂СН₂)₂]NH-гамма-глутаминовая кислота}-СО (СН₂)₁₆-₁₈СООН; и

указанный саморасщепляющийся дипептид имеет общую структуру:

где:

R₁ представляет собой (С₁-С₄ алкил)NH-[гамма-глутаминовая кислота- [СОСН₂ (ОСН₂СН₂)_к ^_NH]_q-гамма-глутаминовая кислота] -

СО (СН₂)_14-20COOH, необязательно (С₄-алкил) NH-{гамма-глутаминовая кислота кислота- [СОСН₂ (ОСН₂СН₂) ₂NH-COCH₂ (ОСН₂СН₂) ₂] NH-гамма-глутаминовая кислота}-СО (СН₂)₁₆-₁₈СООН;

R₂, R₄ и R₈ каждый представляет собой Н;

R₃ представляет собой СН₃;

R₅ представляет собой NH₂;

q равно 2 и

к равно 2 или 4.

В соответствии с вариантом осуществления 29 настоящее изобретение относится к конъюгату по любому из вариантов осуществления 1-28, где первая аминокислота саморасщепляющегося дипептида имеет D-стереохимическую конфигурацию, и указанный спейсер, если он присутствует, необязательно представляет собой -{гамма-глутаминовая кислота- [СОСН₂(ОСН₂СН₂)₂NH-COCH₂(ОСН₂СН₂)₂]NH-гамма-глутаминовую кислоту}-.

В соответствии с вариантом осуществления 30 настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат по любому из вариантов осуществления 1-2 9 или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель.

В соответствии с вариантом осуществления 31 настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции по варианту осуществления 30, формулированной для перорального введения, где указанная композиция дополнительно содержит N[8-(2-гидроксибеноил)аминокаприлат натрия], где необязательно композиция формулирована в форме таблетки.

В соответствии с вариантом осуществления 32 настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции по варианту осуществления 30 или 31, дополнительно содержащей пептид с SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 32 и необязательно кальцитонин.

В соответствии с вариантом осуществления 33 настоящее изобретение относится к способу лечения гипопаратиреоза, где указанный способ включает введение эффективного количества фармацевтической композиции по любому из вариантов осуществления 30, 31 или 32 пациенту, нуждающемуся в лечении.

В соответствии с вариантом осуществления 34 настоящее изобретение относится к жидкой фармацевтической композиции по варианту осуществления 30, формулированной для внутривенной, подкожной или внутримышечной доставки.

В соответствии с вариантом осуществления 35 настоящее изобретение относится к способу лечения остеопороза или остеопении, где указанный способ включает введение эффективного количества фармацевтической композиции по любому из вариантов осуществления 30, 31 или 32 пациенту, нуждающемуся в лечении.

В соответствии с вариантом осуществления 36 настоящее изобретение относится к способу по любому из вариантов осуществления 33-35, где композицию вводят один раз в день, через день, один раз в неделю или один раз в две недели.

В соответствии с вариантом осуществления 37 настоящее изобретение относится к способу по любому из вариантов осуществления 33, 35-36, где композицию вводят перорально.

В соответствии с вариантом осуществления 38 настоящее изобретение относится к способу по любому из вариантов осуществления 33, 35-36, где композицию вводят пульмонарным путем.

В соответствии с вариантом осуществления 37 настоящее изобретение относится к применению любого из конъюгатов по вариантам осуществления 1-29 для лечения гипопаратиреоза или облегчения симптомов, ассоциированных с гипопаратиреозом.

Пример 1: определение скорости расщепления модельного дипептида (в PBS)

Конкретный гексапептид (HSRGT F-NH2; SEQ ID NO: 28) использовали в качестве модельного пептида для определения периода полураспада различных дипептидов, связанных с гексапептидом амидной связью. Гексапептид был собран на пептидном синтезаторе и к связанной с модельным пептидом смоле последовательно добавляли Вос-защищенный саркозин и лизин с получением пептида А (Lys-Sar-HSRGTF-NH₂; SEQ ID NO: 29). Пептид А расщепляли HF и очищали препаративной ВЭЖХ.

Препаративная очистка с использованием ВЭЖХ:

Очистку проводили с использованием ВЭЖХ-анализа на колонке Vydac С18 1×x25 см на основе диоксида кремния (размер частиц 5 мкм, размер пор 300 А). Используемые приборы представляли собой следующее: насос Waters Associates модель 600, инжектор модели 717 и УФ детектор модели 486. Для всех образцов использовали длину волн 230 нм. Растворитель А содержал 10% CH₃CN/0,1% ТФУК в дистиллированной воде, и растворитель В содержал 0,1% ТФУК в CH₃CN. Использовали линейный градиент (от 0 до 100% В за 2 ч). Скорость потока составляла 10 мл/мин, и размер фракции составлял 4 мл. Примерно из 150 мг неочищенного пептида было получено 30 мг чистого пептида.

Пептид А растворяли в концентрации 1 мг/мл в буфере PBS. Раствор инкубировали при 37°С. Образцы отбирали для анализа через 5 ч; 8 ч; 24 ч; 31 ч и 47 ч. Расщепление дипептида гасили снижением рН равным объемом 0,1% ТФУК. Скорость расщепления качественно контролировали с использованием ЖХ-МС и количественно изучали с использованием ВЭЖХ. Время удерживания и относительную площадь пика для пролекарства и исходного модельного пептида количественно определяли с использованием программного обеспечения Peak Simple Chromatography.

Анализ с использованием масс-спектрометрии

Масс-спектры получали с использованием

электрораспылительного квадрупольного масс-спектрометра Sciex API-III со стандартным источником ионов ESI (электрораспылительная ионизация). Использовали следующие условия ионизации: ESI в режиме положительных ионов; напряжение ионного распыления 3,9 кВ; потенциал отверстия 60 В. В качестве распыляющего и защитного газа использовали азот со скоростью потока 0,9 л/мин. Масс-спектры регистрировали от 600 до 1800 единиц Томпсона при 0,5 Th на шаг и времени пребывания 2 мс. Образец (примерно 1 мг/мл) растворяли в 50% водном ацетонитриле с 1% уксусной кислотой и вводили с помощью внешнего шприцевого насоса со скоростью 5 мкл/мин. Пептиды, солюбилизированные в PBS, перед анализом обессоливали с использованием твердофазного экстракционного наконечника ZipTip, содержащего 0,6 мкл смолы С4, в соответствии с инструкциями производителя (Millipore Corporation, Billerica, MA).

Анализ с использованием ВЭЖХ

Анализы ВЭЖХ выполняли с использованием хроматографической системы Beckman System Gold, оснащенной УФ-детектором при 214 нм и колонкой С8 Vydac 150 мм × 4,6 мм. Скорость потока составляла 1 мл/мин. Растворитель А содержал 0,1% ТФУ в дистиллированной воде, и растворитель В содержал 0,1% ТФУ в 90% CH₃CN. Использовали линейный градиент (от 0% до 30% В за 10 мин). Данные регистрировали и анализировали с использованием программного обеспечения Peak Simple Chromatography.

Начальные скорости расщепления использовали для измерения констант скорости диссоциации дипептидов из соответствующих пролекарств. Концентрации пролекарств и модельного исходного пептида определяли по их соответствующим площадям пиков «а» и «Ь» для каждого из различных периодов времени сбора данных. Константы скорости диссоциации нулевого порядка пролекарств определяли построения графика логарифма концентрации

пролекарства в различные интервалы времени. Наклон этой кривой дает константу скорости «к». Полупериоды расщепления различных пролекарств рассчитывали по формуле t1/2=0,693/k. Результаты, полученные в этих экспериментах, представлены в таблице 1.

Пример 2: синтез конъюгатов ПТГ

Аналоги ПТГ пептида собирали на смоле Fmoc-Lys(Mtt)-Wang в концентрации 0,1 ммоль, используя пептидный синтезатор ABI-433A и протоколы связывания Fmoc/Охута/DIC. Fmoc-Sar-OH и Boc-D-Lys(Boc)-OH последовательно присоединяли к N-концу нативной первой аминокислоты (Serl). С боковой цепи Mtt Lys³³ снимали защиту, и полученный свободный амин использовали для дополнительного удлинения. Данный амин последовательно сочетали с Fmoc-Glu-OtBu и дважды добавляли Fmoc-NH-PEG₂-CH₂COOH, затем Fmoc-Glu-OtBu и, наконец, моно-трет-бутиловый эфир октадекановой кислоты. Пептид химически удаляли с синтетической смолы обработкой раствором ТФУ, содержащим 2,5% TIS, 2,5% 2-меркаптоэтанола, 2,5% анизола и 2,5% H₂O, при комнатной температуре при осторожном перемешивании в течение 2 ч. Смолу удаляли фильтрованием, и пептид осаждали добавлением холодного эфира (50 мл). Пептидный осадок собирали центрифугированием и промывали холодным эфиром (3 × 50 мл).

Неочищенный пептид подвергали очистке на колонке для препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (Kinetex® 5 мкм С8, колонка 100 A LC 250 × 21,2 мм, 10-50% водный раствор ACN (0,1% ТФУК), при скорости потока 15 мл/мин). Чистый пептид анализировали с использованием аналитической ЖХ-МС, и объединенные фракции лиофилизировали с получением конечного продукта в виде белого пушистого твердого вещества.

В тех случаях, когда применяли ацилирование жирными кислотами с двумя различными структурами, то боковую цепь пролекарства дипептида в последнем лизине связывали в виде Вос-D-Lys(Fmoc)-ОН. С боковой цепи лизина снимали Fmoc-защиту стандартной обработкой основанием. Сборка боковой цепи с жирной кислотой имела место, как описано для Lys³³. Для введения второй, но отличающейся жирной кислоты в Lys³³, дополнительно использовали смолу с защищенным пептидом, как описано выше для аналогов моноацилированных жирной кислотой пептидов, где затем снимали защиту с боковой цепи Mtt Lys³³, и боковую цепь лизина использовали для дополнительного химического удлинения.

Для аналогов пептидов, в которых использовали двойное ацилирование жирной кислотой одинаковой структуры по N- и С-концевым остаткам лизина, последнюю аминокислоту добавляли в виде Boc-D-Lys(Fmoc)-ОН. После полной сборки смолы Fmoc- и Mtt-защитные группы удаляли, и при этом боковые цепи одновременно удлиняли с использованием обычной процедуры связывания, описанной выше.

ПЭГилирование

Пептид [Cys³⁵]-РТН(1-35) собирали на смоле Rink Amide 0,1 ммоль с использованием пептидного синтезатора ABI-433A и протоколов связывания Fmoc/Охута/DIC. Расщепление ТФУК и осаждение эфиром, как описано ранее для получения пептидов, используемых при ацилировании жирными кислотами, давали неочищенный Суз³⁵-пептид, который очищали препаративной ВЭЖХ. Конъюгацию тиола проводили в 100 мМ буфере на основе цитрата натрия, рН 4,0, содержащем 1 мМ ЭДТА и 10 мМ ТСЕР. Добавляли избыток 4 0к малеимидо, метокси ПЭГ и реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Непрореагировавший реагент ПЭГ удаляли катионообменной хроматографией с использованием смолы SP-сефарозы и линейного солевого градиента с 20 мМ ацетатом натрия, рН 4,0, в качестве буфера А, и тем же буфером, содержащим 1 М NaCl, в качестве буфера В. Объединенные фракции обессоливали с использованием картриджа С2 SPE и лиофилизировали с получением желаемого пегилированного ПТГ. Список соединений, полученных в соответствии с настоящим изобретением, представлен в таблице 2.

Пример 3: оценка полупериода расщепления

Пролекарства ПТГ растворяли в буфере PBS и доводили до рН 7,4. Полученный раствор инкубировали при 37°С. Аликвоты отбирали на определенные временные точки и анализировали с использованием ЖХ-МС.Анализ проводили с использованием прибора Agilent 1260 Infinity с колонкой Phenomenex Kinetex С8 2,6 мкм 100 А (75×4,6 мм). Скорость потока 1 мл/мин и градиент 10-80% ацетонитрила в воде с 0,1% трифторуксусной кислоты в течение 10 мин. Данные собирали, используя поглощение при длине волны 214 нм. Данные МС в положительном режиме были получены с использованием прибора Agilent 6120 Quadrupole LC/MS. Концентрацию пролекарства и лекарственного средства определяли по их относительным площадям пиков. Константу скорости диссоциации нулевого порядка пролекарства определяли построением графика логарифма концентрации пролекарства на различные временные точки. Наклон данной кривой дает константу скорости «к». Полупериод расщепления рассчитывали по формуле t1/2=0,б 93/к. В таблице 3 представлены полупериоды расщепления различных вариантов конъюгатов ПТГ по настоящему изобретению.

Пример 4: экспериментальный дизайн биоанализа: анализ репортерного анализа на основе гена люциферазы для детектирования цАМФ

Способность каждого аналога или пролекарства ПТГ индуцировать цАМФ измеряли с помощью репортерного анализа на основе люциферазы светлячка. Индуцируемая продукция цАМФ прямо пропорциональна связыванию ПТГ с его рецептором. Для биоанализа использовали клетки HEK293, котрансфектированные рецептором РТН1 и геном люциферазы, связанным с цАМФ-чувствительным элементом. Результаты представлены на фиг. 3А, 3В, 4 и в таблице 4.

Клетки культивировали в бессывороточных условиях в течение 16 ч в минимальной эссенциальной среде Дульбекко (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY) с добавлением 0,3% FetalClone III (HyClone, Logan, UT), и затем инкубировали с серийными разведениями аналогов или пролекарств ПТГ в течение 5 ч при 37°С, 5% CO₂ в 96-луночных планшетах для анализа «Costar 3610» (Corning, Kennebunk, ME). В конце инкубации в каждую лунку добавляли 50 мкл Steady-Lite Plus (PerkinElmer, Waltham, MA). Планшет быстро встряхивали, инкубировали в течение 4 мин и измеряли световой поток с использованием многорежимного планшетного ридера EnSpire Alpha (PerkinElmer, Waltham, MA). 50% эффективные концентрации (EC50) рассчитывали с использованием программного обеспечения Origin 2019b (OriginLab, Northapton, MA).

Пример 5: исследование фармакологического действия на нормальных крысах

Носитель и соединение с SEQ ID NO: 102 (в дозах 20, 40 и 80 нмоль/кг) вводили подкожно четырем группам крыс из шести животных в каждой (пол: самки; линия: Sprague Dawley; средняя масса тела: 267,3 г; возраст: 20-22 недели; рацион: стандартный сухой корм). У крыс каждой группы отбирали образцы крови непосредственно перед инъекцией и через 6, 24, 48 и 72 ч после. Кровь центрифугировали, отбирали сыворотку и хранили при -20°С. Концентрацию кальция и фосфора определяли с использованием имеющихся в продаже аналитических наборов в соответствии с инструкциями производителя. Результаты представлены на фиг. 5А и 5В.

Пример 6: исследование фармакологического действия на нормальных мышах

Носитель и соединения с SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 74 и SEQ ID NO: 7 7 (каждое в дозах 20 или 40 нмоль/кг) вводили подкожно семи группам мышей из восьми животных в каждой (пол: самцы; линия: C57B16/J; средняя масса тела: 24,8 г; возраст: 8-10 недель; рацион: стандартный сухой корм). У мышей каждой группы отбирали образцы крови непосредственно перед инъекцией и через 24 и 48 ч после. Кровь центрифугировали, отбирали сыворотку и хранили при -20°С. Концентрацию кальция определяли с использованием коммерчески доступных аналитических наборов в соответствии с инструкциями производителя. Результаты представлены на фиг. 5С, на которой показана эффективность in vivo на мышах аналогов ПТГ, содержащих ацилированную аминокислоту на С-конце ПТГ пептида, предназначенных для снижения уровня кальция в сыворотке крови.

Пример 7: исследование фармакокинетики на нормальных мышах - измерение концентрации пептидов в плазме с использованием ЖХ-МС

Соединения с SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 84 вводили подкожно в дозе 100 нмоль/кг мышам (пол: самцы; линия: C57B16/J; средняя масса тела: 34,8 г; возраст: 42-44 недели; рацион: стандартный сухой корм). Каждое соединение вводили 20 мышам, и кровь собирали в пробирки, покрытые ЭДТА, у 4 мышей после каждой обработки на временные точки: 1, 4, 8, 24 и 48 ч. Плазму отделяли после центрифугирования и хранили при -20°С.

Образцы для построения стандартной кривой готовили серийным раведением плазмой мыши cd-1 в день анализа. Аликвоты (40 мкл) для построений стандартной кривой и исследуемых образцов переносили в 96-луночный планшет и смешивали со 160 мкл раствора внутреннего стандарта в смеси метанол:ацетонитрил (ACN) (1:1, об./об.). После 10-мин центрифугирования надосадочную жидкость разбавляли в 2 раза подкисленной (0,1% муравьиной кислоты) смесью ACN:вода (3:1, об./об.) и анализировали с использованием ЖХ-МС/МС.

Система UPLC Shimadzu СВМ-20А Nexera и автоматический пробоотборник СТС PAL составляли переднюю часть системы для ЖХ-МС/МС. Хроматографию проводили на колонке Accurcore С8, 2,6 мкм, 2,1 мм х 30 мм (Thermo 17226-032130) и с использованием бинарной градиентной программы с 0,1% муравьиной кислотой (водн.) и 0,1% муравьиной кислотой в ACN. Растворитель подвижной фазы А состоял из смеси микрофильтрованная вода:муравьиная кислота (1000:1 по объему), и растворитель В состоял из смеси ацетонитрил:муравьиная кислота (1000:1). Скорость потока равнялась 0,8 мл/мин, температура колонки была равна температуре окружающей среды, и вводимый объем составлял 5 мкл. Промывка с двумя иглами представляла собой ACN:вода (25:75, об./об.) и ACN:изопропанол:ацетон в 0,1% муравьиной кислоте (5:4:1, об. / об. / об.). Градиентный цикл начинался при 15% В (концентрация) с линейным увеличением до 65% В за 0,75 мин. Колонку очищали 98% В в течение 0,25 мин и возврашали к исходному % В в течение времени сбора данных 1,2 0 мин. Общее время цикла для каждой инъекции, включая повторное уравновешивание исходного % В, составляло примерно 3 мин. Первую элюентную фракцию, полученную в течение 0,3 мин каждого цикла, отбрасывали.

Масс-спектрометрические данные получали с использованием программного обеспечения Analyst, управляющего тройным квадрупольным масс-спектрометром Sciex API 6500 plus (модель 5060743-J) в режиме положительной ионизации. Настройки мониторинга множественных реакций (MRM), энергии столкновения, потенциала декластеризации и потенциал выхода из столкновения для каждого тестируемого соединения и внутреннего стандарта (IS) представлены в таблице 5. Концентрации каждого аналога во времени показаны на фиг. 6А и 6В.

Пример 8: аналоги ПТГ: сравнительная фармакокинетика на яванских макаках после подкожного введения однократной дозы

Исследовали фармакокинетический профиль аналогов ПТГ после подкожного введения однократной дозы яванским макакам и проводили оценку фармакодинамического ответа в отношении уровня кальция и фосфора в сыворотке. В данном тесте использовали шесть обезьян, 2 самца и 4 самки в возрасте от 2 до 4 лет в начале исследования и массой тела не менее 2,5 кг.

Экспериментальный дизайн: путь, частота и продолжительность введения

Животных распределяли по группам, как указано в таблице 6 ниже. Животным проводили подкожную инъекцию. Введение дозы было ступенчатым.

Самцам группы 1 вводили дозу однократно, и оставшимся двум самкам группы 1 и всем животным группы 2 вводили дозу однократно, примерно через четыре дня. Первый день введения дозы обозначали как день исследования 1 (SD) для каждого животного. Объем дозы составлял 0,3 мл/кг. Объемы индивидуальных доз рассчитывали на основе самой последней зарегистрированной массы тела животных. Проводили наблюдение за животными и регистрировали данные, как указано в таблице 7.

У всех животных перед введением дозы и через 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 и 192 ч после введения дозы отбирали образец крови объемом не менее 0,5 мл. Перед отбором крови животные не голодали. Кровь отбирали из бедренной вены (или другого подходящего места). Образцы крови хранили при 5±3°С (влажный лед или эквивалент) и центрифугировали при 5±3°С в течение 1 ч после взятия каждого образца крови. Полученную плазму переносили в пробирку и затем хранили в условиях, установленных для поддержания температуры -75±15°С до проведения анализа.

Фармакокинетический анализ

Фармакокинетические данные по средней концентрации в зависимости от времени анализировали с использованием некомпартментных методов (Phoenix® WinNonlin® версия 7.0 или выше) в зависимости от пути введения. Следующие параметры рассчитывали, когда это было возможно, и насколько позволяли данные: Стах, Ттах и AUC. Описательная статистика была получена с использованием Phoenix WinNonlin.

Результаты

Для сведения к минимуму смертности в опыте на обезьянах при исследовании фармакокинетики аналогов ПТГ, низкоэффективный аланин-замещенный агонист ПТГ SEQ ID NO: 93 РТН(1-33), А8, K33(γЕ-2хОЕС-γЕ-диацидС18) в двух его пролекарственных формах вводили обезьнам: SEQ ID NO: 94 РТН(1-33), А8, K33 (γE-2xOEG-γE-двухосновная кислотаС18) с dK-1, N(Me)GO и SEQ ID NO: 95 PTH(1- 33), А8, K33(γЕ-2хОЕ6-γЕ-двухосновная кислотаС18) с dK-1(γE-2хОЕС-γЕ-диацидС18), N(Me)GO. Аланиновое замещение в положении 8 снижает активность in vitro почти в 100 раз.

Результаты проведенных фармакокинетических (ФК) исследований представлены на фиг. 7А и 7В, где концентрацию вводимой пролекарственной формы и его активированной лекарственной формы (полученной после неферментативного отщепления in vivo дипептидного элемента пролекарства) измеряли во времени. Обезьянам вводили подкожно однократную дозу аналога пролекарства ПТГ в дозе 25 нмоль/кг (SEQ ID NO: 94 на фиг. 7А и пептид 19 на фиг. 7В) и концентрации пролекарств SEQ ID NO: 94 и SEQ ID NO: 95 вместе с их соответствующим продуктом расщепления, SEQ ID NO: 93 («лекарственное средство») измеряли в течение следующих 192 ч после введения.

В частности, на фиг. 7А представлен график, демонстрирующий детектированные уровни пролекарства аналога ПТГ и его активированной формы SEQ ID NO: 94 РТН(1-33), А8, K33(γE-2xOEG-γЕ-диацидС18) во времени после введения однократной дозы пролекарства (SEQ ID NO: 94). На фиг. 7 В представлен график, демонстрирующий детектированные уровни пролекарства аналога ПТГ SEQ ID NO: 95 РТН(1-33), А8, K33(γЕ-2хОЕС-γЕ-двухосновная кислотаС18) уЕ-двухосновная кислотаС18), N(Me)G0 и его активированной формы: SEQ ID NO: 93 РТН(1-33), А8, K33(γE-2xOEG-γЕ-двухосновная кислотаС18) во времени после введения однократной дозы пролекарства (SEQ ID NO: 95). Данные демонстрируют накопление активной формы во времени, совпадающее с уменьшением уровня пролекарственной формы, что приводит к относительно постоянному количеству активной формы в течение длительного периода времени.

Пример 9: уровни кальция в сыворотке мышей C57BL/6J, измеренные через 24 и 48 ч после подкожного введения SEQ ID NO: 77 в дозе 20 или 40 нМ/кг

Самок мышей C57BL/6J произвольно распределяли на три группы (n=8 в группе) и однократно вводили подкожно либо носитель (стерильный раствор PBS), либо SEQ ID NO: 77 в PBS (20 или 40 нмоль/кг). SEQ ID NO:77 получали в концентрации 150 мкМ в PBS, рН 7,4. Образцы крови отбирали у каждой мыши надрезанием хвоста для определения кальция в сыворотке непосредственно перед введением (0 ч) и после введения (24 и 48 ч).

Концентрации Са в сыворотке определяли с использованием коммерческого набора для колориметрического анализа в соответствии с рекомендациями производителя (Calcium LiquiColor #10155, лаборатория Stanbio). Аналитический набор для определения кальция содержит цветной реагент (номер по каталогу 0156) и стандарт кальция (10 мг/дл; номер по каталогу 0157). Поглощение (Ab) измеряли при длине волны 650 нм. Производитель обеспечивает линейность до 15 мг/дл. Результаты рассчитывали следующим образом: Ab(неизвестно)/Ab(стандарт) × 10.

Уровни кальция в сыворотке крови регистрировали для контрольной группы и опытной группы на нулевое время, через 24 и 48 ч, и данные обобщены в таблицах 8-10. У мышей, получавших подкожно однократную дозу SEQ ID NO: 77 40 нмоль/кг, наблюдали достоверное повышение уровня кальция в сыворотке через 24 и 48 ч после обработки по сравнению с контрольной группой или с мышами, получавшими SEQ ID NO: 77 в дозе 20 нмоль/кг (фиг. 14А). Эта разница была статистически значимой через 24 ч с учетом начальных исходных уровней (фиг. 14В). Через 24 ч после введения дозы 40 нмоль/кг наблюдали увеличение содержания кальция в сыворотке крови. Это увеличение на 0,631 нмоль/мкл (2,524 мг/дл) по сравнению с исходным уровнем 2,4105 нмоль/мкл (9,6421 мг/дл) представляет собой повышение концентрации на 26,2%.

Данные по процентному изменению уровней кальция в сыворотке для каждой опытной группы обобщены в таблице 11. Повышение уровня кальция в сыворотке крови в группе с дозой 40 нмоль/кг было почти вдвое больше, чем увеличение (13,8%) при более низкой дозе 20 нмоль/кг SEQ ID NO: 77. При введении в этой дозе наблюдали увеличение на 0,3131 нмоль/мкл (1,252 мг/дл), начиная с исходного уровня 2,2704 нмоль/мкл (9,0816 мг/дл). Увеличение содержания Са в сыворотке после обработки носителем было меньше, чем в любой группе, обработанной SEQ ID NO: 77. Повышение содержания Са в сыворотке для животных группы, получавших носитель, на 9,7% представляет собой значение 0,2174 нмоль/мкл (0,898 мг/дл), начиная с уровень 2,2512 нмоль/мкл (9,0049 мг/дл). Во всех случаях уровень кальция в сыворотке возвращался к почти исходному уровню через 4 8 ч после обработки.

Пример 10: кальций, неорганический фосфат в сыворотке крови, масса тела, потребление корма и уровни лекарственного средства у крыс Sprague Dawley после однократного индивидуального подкожного введения SEQ ID NO: 77 или SEQ ID NO: 87

В данном эксперименте оценивали профиль кальция и неорганического фосфора в сыворотке крови после подкожной инъекции 30 или 60 нмоль/кг пролекарства аналога паратиреоидного гормона с SEQ ID NO: 87 самкам крыс Sprague-Dawley. Кроме того, исследовали фармакокинетику (ФК) пролекарства SEQ ID NO: 87 и его превращение в активную форму с SEQ ID NO: 77 в группе, получавшей 30 нмоль/кг SEQ ID NO: 87, и сравнивали с группой крыс, получавших 30 нмоль/кг SEQ ID NO: 77.

Самок крыс Sprague-Dawley произвольно распределяли на четыре группы по пять или шесть крыс в каждой. Составы готовили из лиофилизированных порошков SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 77 и разбавителя PBS, для получения 50 мкМ раствора SEQ ID NO: 77 в PBS и 100 мкМ и 50 мкМ растворов SEQ ID NO: 87 в PBS и их хранили на влажном льду во время введения. Объем дозы основывался на массе тела и регистрировался до введения. Каждому животному однократно подкожно вводили носитель (стерильный раствор PBS; n=6), SEQ ID NO: 77 (30 нмоль/кг; n=5) или SEQ ID NO: 87 (30 или 60 нмоль/кг; n=5 и 6 соответственно). Образцы крови отбирали у каждой крысы надрезанием хвоста непосредственно перед введением (0 ч) и после введения (24, 48, 72, 96, 120 и 168 ч). Полученные образцы использовали для определения содержания кальция и неорганического фосфора в сыворотке крови после введения носителя и у всех животных, получавших SEQ ID NO: 87. Отдельные образцы крови отбирали для исследования ФК в группах с введением SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 77 в дозе 30 нмоль/кг, и дополнительные образцы крови отбирали через 2 и 7 ч у животных этих двух групп, предназначенных для исследования ФК. Данные обобщены на фиг. 15, 16А, 16В, 17А и 17В и в таблицах 12 и 13.

Измерение уровня SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 77 в сыворотке проводили с использованием ЖХ-МС. Результаты фармакокинетического анализа обобщены на фиг. 15. Наблюдали увеличение концентрации SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 87 в плазме после введения однократной дозы 30 нмоль/кг. Пролекарственная форма агониста ПТГ (SEQ ID NO: 87) демонстрировала Cmax через 24 ч, которая снижалась в относительной концентрации на 1/3 через 48 ч и на 2/3 через 72 ч, возвращаясь к исходному значению через одну неделю. SEQ ID NO: 77 детектировали после введения SEQ ID NO: 87 в результате превращения in vivo и высвобождения N-концевого дипептида. Соединение достигает пика через 24 ч при концентрации немного ниже 20% от уровня SEQ ID NO: 87. Соединение сохраняется почти на том же уровне через 48 ч и в концентрации, сравнимой с SEQ ID NO: 87, через 72 ч, возвращаясь к исходному уровню через одну неделю. Сходный фармакокинетический профиль для концентрации SEQ ID NO: 77 в сыворотке после ее введения в той же дозе 30 нмоль/кг, что и для SEQ ID NO: 87, выявил более быстрое появление при концентрации более 100 нМ через 2 ч после введения дозы с пиком через 7 ч и сохранялась в течение 24 ч, но снижалась примерно до 1/3 Стах через 48 ч и до исходного уровня через 96 ч. Соотношение пика и минимума при сравнении концентрации SEQ ID NO: 77 в течение первого дня по сравнению с 96 ч продемонстрировало различие, зависящее от того, было ли оно достигнуто путем прямого введения пептида или в результате его превращения из SEQ ID NO: 87.

Результаты показывают, что SEQ ID NO: 87 превращается in vivo в SEQ ID NO: 77 со скоростью, которая согласуется с определениями in vitro, и что пептид сохраняется в течение почти недели у крыс, где клиренс жирных ацилированных пептидов ускоряется у приматов. При дозах, в которых пролекарство и лекарственное средство можно было измерить с использованием ЖХ-МС, изменения содержания кальция и фосфора в сыворотке находились в пределах физиологического диапазона и не оказывали неблагоприятного воздействия на крыс.

Анализ кальция и неорганического фосфора в сыворотке Образцы крови, отобранные надрезанием хвоста, использовали для определения общего кальция (Са) и неорганического фосфора (Pi) в сыворотке с использованием коммерческих аналитических наборов в соответствии с рекомендациями производителя (лаборатория Stanbio: Calcium LiquiColor #10155; Phosphorous Liqui-UV, номер по каталогу 0830). Для анализа использовали 96-луночный планшетный спектрофотометр (SpectraMax М5, Molecular Devices). Са и Pi в сыворотке определяли на сутки 0, 1, 2, 4, 5 и 7.

Поглощение (Ab) измеряли при длине волны 650 нм для Са и 34 0 нм для Pi. Линейность анализа обеспечивается до 15 мг/дл для Са и 10 мг/дл для Pi. Результаты рассчитывали следующим образом: Ab(неизвестно)/Ab(стандарт) × 10

Наблюдали достоверное увеличение содержания кальция в сыворотке по сравнению с обработкой носителем во временном интервале от 48 до 96 ч, с возвращением к уровням, сравнимым с контрольными значениями, через 120 и 240 ч (фиг. 16А, 16В и таблица 12). Измерение уровня кальция в сыворотке после введения SEQ ID NO: 87 показало увеличение в пределах физиологического диапазона, с достижением пика через 3 суток. Самая низкая доза пептида обеспечивала незначительное повышение, которое не было статистически значимым по сравнению с более высокой дозой.

Наблюдали менее выраженное повышение уровня фосфата в сыворотке, которое было статистически значимым только при оценке по сравнению с обработкой носителем. Это различие было связано с более низкой исходной концентрацией у крыс, получавших носитель (фиг. 17А, 17В и таблица 13).

Пример 11: анализ пролекарства и его превращение в лекарственное средство с использованием ЖХ-МС и анализа in vitro

Оценка биологической активности пролекарства по сравнению с его лекарственной формой была проведена по контракту с Eurofins-Discover Rx Corporation, с использованием запатентованного коммерческого набора для биоанализа cAMP Hunter® Teriparatide (95-0118Y2). Для каждого отдельного пептида или условий инкубации была построена 11-точечная кривая доза-эффект в режиме агониста. Каждый образец анализировали при каждой дозе в трех повторностях. Результаты, приведенные в таблице 14, представлены на фиг. 8А-8С, и они подтверждают вывод о том, что SEQ ID NO: 87 является полным агонистом ПТГ с высокой активностью на уровне нМ (фиг. 8А), и что удлинение SEQ ID NO: 87 нерасщепляемым дипептидом, представленным в виде SEQ ID NO: 79 (фиг. 8В), или дипептидом, представленным в виде SEQ ID NO: 77 (фиг.8С), инактивирует агонизм ПТГ.

Оценку превращения пролекарства в лекарственный препарат определяли анализом ЖХ-МС, методология которого была описана в примере 3. Площади пиков и расчет процентного содержания пролекарства приведены в таблице 15. Отдельные хроматографические спектры показаны на фиг. 9A-9F. Расчет скорости реакции выполняли подгонкой экспериментальных данных к уравнению нулевого порядка, которое демонстрирует высокую корреляцию со значением R2, равным 0,9988 (фиг. 10).

Оценка биологической активности пролекарства по сравнению с его лекарственной формой была проведена по контракту с Eurofins-Discover Rx Corporation, с использованием запатентованного коммерческого набора для биоанализа cAMP Hunter® Teriparatide (95-0118Y2). Для каждого отдельного пептида или условий инкубации была построена 11-точечная кривая доза-эффект в режиме агониста. Каждый образец анализировали при каждой дозе в трех повторностях. Анализ тех же инкубационных образцов, которые оценивали на относительную концентрацию

пролекарства/лекарственного препарата с использованием ЖХ-МС (фиг. 9A-9F и фиг. 10), проводили с помощью биоанализа сАМР Hunter® Teriparatide. Результаты, приведенные в таблице 16, представлены на фиг. 11, и они подтверждают вывод, сделанный выше с использованием ЖХ-МС.

Пример 12: определение Met(О) и дезамидированных аналогов с использованием анализа in vitro

Оценку биологической активности аналогов ПТГ, которые сайт-специфически модифицировали окислением до сульфоксида метионина (SEQ ID NO: 109 и 110) или дезаминировали нативный Asn или Gln до соответствующей карбоновой кислоты Asp или Glu (SEQ ID NO: 1118, 120, 122 и 124) проводили по контракту с Eurofins-Discover Rx Corporation, с использованием запатентованного коммерческого набора для биоанализа cAMP Hunter® Teriparatide (95-0118Y2). Для каждого отдельного пептида в каждой концентрации строили 11-точечную кривую доза-эффект в режиме агониста. Каждый образец анализировали при каждой дозе в трех повторностях. Результаты представлены в таблицах 17, 18 и 19, а также на фиг. 12, 13А и 13В.

Пример 13: уровень кальция, фосфата в сыворотке, масса тела, потребление корма и уровень лекарственного средства у крыс Sprague Dawley после повторного подкожного введения SEQ ID NO: 77 в дозе 20 нмоль/кг, SEQ ID NO: 87 в дозе 20 или 40 нмоль/кг

В данном эксперименте оценивали влияние повторного ежедневного введения SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 87 на уровень кальция и фосфата в сыворотке крыс Sprague-Dawley. Самок крыс Sprague-Dawley помещали в клетки с одним или двумя животными и произвольно распределяли на четыре группы (n=5-6 на группу), как показано в таблице 20, и затем взвешивали.

Крысам вводили подкожно один раз в сутки в течение 7 суток либо носитель (стерильный 0,9% раствор NaCl; n=5), SEQ ID NO: 77 (20 нмоль/кг; n=6) или SEQ ID NO: 87 (20 или 40 нмоль/кг); n=5 и 6 соответственно). После прекращения обработки за животными наблюдали на сутки 9 и 11 (период вымывания).

Образцы крови отбирали надрезанием хвоста у всех животных для анализа кальция и фосфата в сыворотке крови до введения носителя, SEQ ID NO: 77 или SEQ ID NO: 87 (0 ч) и после введения (1, 2, 3, 4, 7 суток) для определения общего кальция (Са) и неорганического фосфора (Pi) в сыворотке с использованием коммерческих наборов для колориметрического анализа. Массу тела и потребление корма измеряли на сутки 0, 1, 3, 5 и 7. Концентрацию Са определяли на сутки 0, 1, 2, 3, 4, 7, 9 и 11. Pi определяли на тех же образцах, за исключением суток 9 и 11. Определение SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 77 в сыворотке проводили с использованием ЖХ-МС, и данные приведены на фиг. 18А и 18В.

Уровни Са в сыворотке постепенно возрастали у крыс всех трех опытных групп в течение периода обработки и возвращались к исходным значениям в конце периода вымывания (фиг. 18А). Уровни Pi в сыворотке достоверно не отличались, за исключением суток 3, когда уровень в группе с введением SEQ ID NO: 77 достоверно отличался от такового у крыс, получавших носитель и SEQ ID NO: 87 в дозе 40 нмоль/кг (фиг. 18В).

Значения концентрации SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 87 в плазме показали пропорциональное дозе увеличение после введения (фиг.19А и 19В). Каждый пептид достиг равновесного уровня после четырех ежедневных введений. Относительная концентрация SEQ ID NO: 77 составляла примерно одну четвертую от уровня SEQ ID NO: 87. Относительная концентрация SEQ ID NO: 77 в стационарном состоянии при введении пролекарства SEQ ID NO: 87 составляла примерно 7 0% от показателя, достигнутого при прямом введении SEQ ID NO: 77.

Пример 14: измерение уровня кальция в сыворотке, массы тела и потребления корма у крыс Sprague Dawley после подкожного введения SEQ ID NO: 87 в дозах 4, 8 или 12 нмоль/кг

В данном эксперименте оценивали влияние повторных ежедневных введений SEQ ID NO: 87 в дозах 4, 8 и 12 нмоль/кг в течение 28 суток у самок крыс Sprague-Dawley. Также определяли изменения массы тела и потребления корма.

Крыс произвольно распределяли на четыре группы (n=10) и вводили подкожно один раз в день в течение 21 суток либо носитель, либо SEQ ID NO: 87 (4, 8, 12 нмоль/кг). Массу тела и потребление корма определяли на сутки 0 (непосредственно перед введением пептида), на сутки 1; 3; 7; 10; 14; 17; 21; 24; 28; 31 и 35 эксперимента и на сутки 7; 14; 21; 28; 29; 30; 31; 32 и 34. Образцы крови отбирали надрезанием хвоста для определения общего Са в сыворотке с использованием коммерчески доступных наборов для колометрического анализа. Образцы сыворотки собирали для фармакокинетического измерения SEQ ID NO: 87 и образовавшегося лекарственного средства SEQ ID NO: 77.

У всех крыс в исследовании, включая животных, получавших носитель, наблюдали небольшое увеличение общей массы тела, которое составляло не более 2%, исходя из исходной массы тела 272,6 г. Кумулятивное потребление корма увеличивалось пропорционально дозе на величину, соответствующую относительному увеличению массы тела по сравнению с крысами, получавшими носитель.

У всех обработанных крыс, включая контрольных крыс, получавших носитель, в ходе исследования отмечали увеличение содержания Са в сыворотке (фиг. 20А). Абсолютное увеличение составило 0,636; 1,356; 1,452 и 2,072 мг/дл для крыс, получавших носитель, 4, 8 и 12 нмоль/кг, соответственно. Все концентрации кальция в сыворотке оставались в пределах нормы, и процентное увеличение у крыс, получавших носитель, составило 6,6%. Увеличение на 14,7%, 16,7% и 23% было отмечено для возрастающих доз SEQ ID NO: 87 (4, 8, 12 нмоль/кг соответственно). Относительное увеличение Са в этом диапазоне доз было менее чем пропорционально увеличению дозы, поскольку трехкратное увеличение дозы с 4 до 12 нмоль/кг продемонстрировало менее чем двукратное относительное увеличение Са в сыворотке (увеличение на 56%). На сутки 34 концентрация кальция в сыворотке у всех крыс SEQ ID NO: 87 снизилась (фиг. 20В). Животные, получавшие носитель, не изменились, при этом уровни Са увеличились на 6,9% по сравнению с началом исследования. Крысы, получавшие низкие дозы, показали увеличение уровня Са в сыворотке на 6,9% по сравнению с началом исследования. У крыс, получавших средние и высокие дозы, было повышено содержание Са в сыворотке на 11,7% и 12,2% соответственно. Все животные выглядели здоровыми.

При еженедельном определении SEQ ID NO: 87 и образовавшегося SEQ ID NO: 77, концентрации в плазме начинали детектироваться на сутки 7 после того, как при ежедневном введении были достигнуты устойчивые уровни. Наблюдали пропорциональное дозе увеличение концентрации обоих пептидов с пролекарством (SEQ ID NO: 87) при любой из трех введенных доз, которое в четыре раза превышало дозу образовавшегося лекарственного средства (SEQ ID NO: 77). Абсолютная и относительная концентрация двух пептидов в трех дозах поддерживалась в течение 7-2 8 суток при повторных ежедневных введениях. В течение последующих 7 суток исчезновение этих двух пептидов отслеживали с помощью ЖХ-МС. В течение первых 2 4 ч после введения последней дозы концентрацию каждого пептида в плазме измеряли через 2; 7 и 24 ч после введения дозы. Результаты показали, что после достижения устойчивых концентраций суточная экспозиция препарата при приеме каждой последующей дозы практически не менялась. Полученные результаты показаны на фиг. 21 и 22.

Пример 15: измерение уровней кальция в сыворотке у крыс линии Sprague-Dawley, подвергшихся паратиреоидэктомии, после повторных подкожных введений SEQ ID NO: 87 в дозах 15, 25 или 40 нмоль/кг

В данном эксперименте анализировали профиль кальция в сыворотке крови после повторных подкожных введений пролекарства аналога паратиреоидного гормона, SEQ ID NO: 87, в отношении кальция в сыворотке и моче у самок крыс линии Sprague-Dawley, у которых паращитовидная железа была удалена хирургическим путем. Крыс произвольно распределяли на 5 групп и четыре дня подряд вводили подкожно либо носитель (стерильный 0,9% раствор NaCl; n=6), либо SEQ ID NO; 87 (10, 25, 40 нмоль/кг; n=8). В опыте были две отдельные группы крыс, получавших носитель. Первая группа представляла собой контрольных крыс, которым проводили хирургическую операцию, как и остальным контрольным крысам, но паращитовидную железу не удаляли (имитационный контроль). Вторая контрольная группа с носителем представляла собой крыс, которым проводили хирургическую операцию таким же образом, как крысам, получавшим SEQ ID NO: 87. После операции и за одну неделю до тестирования всех крыс помещали на определенный рацион с определенной концентрацией кальция.

Образцы крови отбирали перед введением носителя или SEQ ID NO: 87 (0 ч) и после введения (24, 48, 72, 96, 144 ч) надрезанием хвоста для определения общего кальция (Са) в сыворотке с использованием коммерчески доступного набора для колориметрического анализа в соответствии с рекомендациями производителя (Stanbio Laboratory: Calcium LiquiColor номер по каталогу 0155). Для анализа использовали 96-луночный планшетный спектрофотометр (SpectraMax М5, Molecular Devices). Набор для анализа кальция содержал цветной реагент (номер по каталогу 0156) и стандарт кальция (10 мг/дл; номер по каталогу 0157). Поглощение (АЬ) измеряли при длине волны 650 нм. Производитель обеспечивает линейность до 15 мг/дл. Уровень кальция в сыворотке измеряли непосредственно перед инъекцией (время 0 ч), и затем через 24, 48, 72 и 96 ч. Результаты (мг/дл) рассчитывали следующим образом: Ab(неизвестно)/Ab(стандарт) × 10.

У крыс, представляющих собой имитационный контроль, исходный уровень кальция в сыворотке был заметно повышен по сравнению с крысами РТх, получавшими носитель. Начальный уровень кальция составлял 1,495 нмоль/мкл по сравнению с 1,085 нмоль/мкл в контрольной группе крыс РТх, получавших носитель. Это представляет собой относительно более высокую концентрацию 37,8%. Разница между двумя контрольными группами в значительной степени сохранялась на протяжении всего эксперимента, хотя в обеих контрольных группах наблюдали увеличение почти на 0,3 нмоль/мкл. Для крыс, получавших SEQ ID NO: 87, обработка начиналась при концентрациях кальция в сыворотке, которые были промежуточными по отношению к двум контрольным группам, получавшим носитель, и показатели составляли 1,185; 1,354 и 1,251 нмоль/мкл для опытных групп с дозами 10, 25, 40 нмоль/кг. Это было на 9,2%, 24,8% и 15,3% выше, чем у сопоставимых контрольных крыс РТх, которые составляли группу, получавшую носитель. Через 48 ч и непосредственно перед введением третьей дозы у крыс, получавших РТх, наблюдалась четкая дозозависимая реакция, при этом максимальная доза 40 нмоль/кг несколько превышала таковую у контрольных крыс. Такая взаимосвязь сохранялась через 72 ч, когда промежуточная доза 25 нмоль/кг незначительно отличалась от таковой у контрольных крыс.Через 144 ч, то есть через 72 ч после введения последней дозы, у крыс РТх по-прежнему наблюдалась пропорциональная дозе разница в содержании кальция в сыворотке. Разница между начальным уровнем у крыс РТх, получавших носитель, и группами, получавшими средние дозы, удвоилась в течение периода обработки, и для группы с самой высокой дозой она увеличилась более чем в три раза до точки, где она превышала данный показатель у имитационного контроля более чем на 0,2 нмоль/мл, и результаты приведены на фиг. 23.

Пример 16: измерение уровней кальция в сыворотке и моче у крыс линии Sprague-Dawley, подвергнутых паратиреоидэктомии, после повторных подкожных введений SEQ ID NO: 87 в дозах 15, 25 или 40 нмоль/кг

В данном эксперименте анализировали профиль кальция в сыворотке крови после повторных подкожных введений пролекарства аналога паратиреоидного гормона, SEQ ID NO: 87, в отношении кальция в сыворотке и моче у самок крыс линии Sprague-Dawley, у которых паращитовидная железа была удалена хирургическим путем. Крыс произвольно распределяли на 5 групп и десять дней подряд вводили подкожно либо носитель, либо SEQ ID NO; 87 (10, 25, 40 нмоль/кг; n=8). В опыте были две отдельные группы крыс, получавших носитель. Первая группа представляла собой контрольных крыс, которым проводили хирургическую операцию, как и остальным контрольным крысам, но паращитовидную железу не удаляли (имитационный контроль). Вторая контрольная группа с носителем представляла собой крыс, которым проводили хирургическую операцию таким же образом, как крысам, получавшим SEQ ID NO: 87. После операции и за одну неделю до тестирования всех крыс помещали на определенный рацион с определенной концентрацией кальция.

Образцы крови отбирали надрезанием хвоста для определения общего содержания кальция (Са) в сыворотке с использованием имеющихся в коммерческом доступе набора для колориметрического анализа в соответствии с рекомендациями производителя (лаборатория Stanbio: Calcium LiquiColor #0155). Для анализа использовали 96-луночный планшетный спектрофотометр (SpectraMax М5, Molecular Devices). Набор для анализа кальция содержал цветной реагент (номер по каталогу 0156) и стандарт кальция (10 мг/дл; номер по каталогу 0157). Поглощение (АЬ) измеряли при длине волны 650 нм. Производитель обеспечивает линейность до 15 мг/дл. Уровень кальция в сыворотке измеряли непосредственно перед инъекцией (время 0 ч), и затем через 24, 48, 72 и 96 ч. Результаты (мг/дл) рассчитывали следующим образом: Ab(неизвестно)/Ab(стандарт) × 10.

У крыс, представляющих собой имитационный контроль, исходный уровень кальция в сыворотке был заметно повышен по сравнению с крысами РТх, получавшими носитель. Начальный уровень кальция составлял 5,896 нмоль/мкл по сравнению с 4,66 нмоль/мкл в контрольной группе крыс РТх, получавших носитель. Это представляет собой относительно более высокую концентрацию 26,5%. Разница между двумя контрольными группами в значительной степени сохранялась на протяжении всего эксперимента. Для крыс, получавших SEQ ID NO: 87, обработка начиналась при концентрациях кальция в сыворотке, которые были промежуточными по отношению к двум контрольным группам, получавшим носитель, и показатели составляли 4,5; 5,028 и 5,108 нмоль/мкл для опытных групп с дозами 10, 25, 40 нмоль/кг (фиг. 24). Это был соответственно пониженный уровень на 3,4%, чем в группе с самой низкой дозой и повышенный уровень на 7,9% и 9,6% в группах со средней и высокой дозой. Через 2 суток и непосредственно перед введением третьей дозы у всех крыс, получавших SEQ ID NO: 87, уровни кальция в сыворотке, были практически идентичны таковым у крыс, представляющих собой имитационный контроль. Через 4 и 7 суток у крыс РТх, получавших средние и высокие дозы, уровни кальция в сыворотке соответствовали или превышали уровни, наблюдаемые у контрольных крыс. Наблюдали пропорциональную дозе разницу у крыс, получавших SEQ ID NO: 87, при этом крысы с самой высокой дозой имели наибольшую величину, и крысы с самой низкой дозой имели самое низкое содержание кальция в сыворотке. У крыс, обработанных РТх, сохранялся повышенный уровень кальция в сыворотке, который был аналогичен таковому у крыс, представляющих собой имитационный контроль, в течение 10 и 11 суток. На сутки 14 и затем в течение 21 суток уровни кальция в сыворотке РТх крыс соответствовали друг другу, в том числе у крыс, обработанных носителем. Эти значения концентрации кальция были одинаково снижены в уровне кальции на сутки 21 по сравнению с крысами, представляющими собой имитационный контроль, в виде разницы, которая имела на сутки 0 в начале исследования.

Определение уровня фосфата проводили с отбором проб в те же сроки, что и для определения кальция, и отличались только последними днями периода вымывания. Ответная реакция на SEQ ID NO: 87 была аналогичной реакции, описанной ранее для кальция в сыворотке, но с уменьшением содержания фосфата с каждой дозой по сравнению с крысами РТх, получавшими носитель (фиг.25). С увеличением времени обработки уровни фосфата у крыс, получавших SEQ ID NO: 87, совпадали с таковыми у крыс, представляющих собой имитационный контроль. У крыс, представляющих собой имитационный контроль, начальный уровень фосфата в сыворотке был заметно снижен по сравнению с крысами РТх, получавшими носитель. Исходный уровень фосфата составлял 7,003 мг/дл по сравнению с 11,317 мг/дл в контрольной группе крыс РТх, получавших носитель. Это представляет собой относительно более низкую концентрацию 38,1%. Разница между двумя контрольными группами сохранялась на протяжении всего эксперимента. Для крыс, получавших SEQ ID NO: 87, обработка начиналась при концентрациях фосфата в сыворотке, которые были промежуточными по отношению к двум контрольным группам, получавшим носитель, и показатели составляли 11,412; 10,67 3 и 8,152 нмоль/мкл для опытных групп с дозами 10, 25, 4 0 нмоль/кг. Это представляло, соответственно, увеличение на 1,0% при низких дозах и снижение уровня на 5,7% и 28% при средних и высоких дозах. Через 7 суток у всех крыс, обработанных РТх, соответствующих SEQ ID NO: 87, уровни фосфата в сыворотке были сопоставимы с таковыми у контрольных крыс. Эффективность полностью сохранялась при наблюдении на сутки 10, через день после последней введенной дозы. Через две недели у крыс, получавших среднюю и высокую дозы, наблюдали относительное снижение уровня фосфата, в то время как у крыс, получавших самую низкую дозу, уровень фосфата был повышен относительно их контроля через 10 суток. Через 25 суток после начала исследования все РТх-крысы были объединены в группу с повышенным содержанием фосфата по сравнению с контрольными крысами.

Пример 17: сравнительная фармакокинетика у яванских макак после подкожного введения однократной дозы SEQ ID NO: 87

Фармакокинетический профиль аналога ПТГ SEQ ID NO: 87 исследовали после подкожного введения однократной дозы яванским макакам по методологии, подробно описанной в примере 8. На каждую тестируемую дозу использовали всего три обезьяны. Обезьяны были в возрасте от 2 до 4 лет в начале исследования и имели массу тела не ниже 2,5 кг. Объем дозы составлял 0,3 мл/кг. Объемы индивидуальных доз рассчитывали на основе самой последней зарегистрированной массы тела животных.

У всех животных перед введением дозы и через 6, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 336 ч отбирали не менее 0,5 мл крови после введения. Перед сбором животных не голодали. Кровь отбирали из бедренной вены (или другого подходящего места). Образцы крови хранили при 5±3°С (влажный лед или эквивалент) и центрифугировали при 5±3°С в течение 1 ч после взятия каждого образца крови. Полученную плазму переносили в пробирку и затем хранили в условиях, установленных для поддержания температуры -75±15°С до проведения анализа.

Фармакокинетический анализ

Фармакокинетические данные о средней концентрации в зависимости от времени анализировали с использованием некомпартментных методов (Phoenix® WinNonlin® версии 7.0 или выше) в зависимости от пути введения. Рассчитывали следующие параметры, когда это было возможно, и насколько позволяли данные: Cmax, Tmax и AUC. Описательная статистика была сгенерирована с помощью Phoenix WinNonlin.

Результаты

Результаты этих фармакокинетических (ФК) исследований представлены на фиг. 26А и 26В, где концентрацию вводимой пролекарственной формы и его активной лекарственной формы (образующейся после неферментативного расщепления in vivo дипептидного элемента пролекарства) измеряли во времени. Обезьянам вводили подкожно однократную дозу аналога пролекарства ПТГ SEQ ID NO: 87 в дозе 2,5; 3,75 и 5 нмоль/кг и определяли концентрацию пролекарства (SEQ ID NO: 87, фиг. 26А) вместе с соответствующим продуктом расщепления, SEQ ID NO: 77 («лекарственный препарат») в течение следующих 336 ч после введения. Наблюдалось пропорциональное дозе увеличение концентрации SEQ ID NO: 87, которое достигало максимума через 24 ч и не возвращалось к исходным концентрациям до одной недели (фиг. 26А). Пептид SEQ ID NO: 77, образовавшийся в результате преобразования из SEQ ID NO: 87, достигал пика через 48-72 ч, и его концентрация оставалась примерно на уровне 2/3 от концентрации Стах при оценке через одну неделю. Концентрация SEQ ID NO: 77 оставалась повышенной по сравнению с начальной концентрацией даже через две недели после введения дозы (фиг. 26В).

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ИНДИАНА ЮНИВЕРСИТИ РИСЕРЧ ЭНД ТЕКНОЛОДЖИ КОРПОРЕЙШН

<120> АНАЛОГИ ПТГ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГИПОПАРАТИРЕОЗА

<130> 32993-338101

<150> 63/030,004

<151> 2020-05-26

<150> 63/033,586

<151> 2020-06-15

<160> 135

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 84

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser

35 40 45

Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu

50 55 60

Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys

65 70 75 80

Ala Lys Ser Gln

<210> 2

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой любую ацилированную

аминокислоту

<400> 2

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 3

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (34)..(34)

<223> Xaa в положении 34 представляет собой любую ацилированную

аминокислоту

<400> 3

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Xaa

<210> 4

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой изомасляную кислоту (Aib)

или Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> Xaa в положении 13 is Arg, Glu, Asp или Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Xaa в положении 16 представляет собой аминоизомасляную кислоту

(Aib) или Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> Xaa в положении 17 представляет собой аминоизомасляную кислоту

(Aib) или Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (26)..(26)

<223> Xaa в положении 26 представляет собой Arg, Glu, Asp или Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (27)..(27)

<223> Xaa в положении 27 представляет собой Arg, Glu, Asp или Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31)..(31)

<223> Xaa в положении 31 представляет собой Gly или Val

<400> 4

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Xaa Xaa His Leu Xaa

1 5 10 15

Xaa Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Xaa Xaa Leu Gln Asp Xaa His

20 25 30

<210> 5

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> Xaa в положении 13 представляет собой Arg, Glu, Asp или Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (26)..(26)

<223> Xaa в положении 26 представляет собой Arg, Glu, Asp или Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (27)..(27)

<223> Xaa в положении 27 представляет собой Arg, Glu, Asp или Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31)..(31)

<223> Xaa в положении 31 представляет собой Gly или Val

<400> 5

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Xaa His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Xaa Xaa Leu Gln Asp Xaa His

20 25 30

<210> 6

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой изомасляную кислоту

(Aib) или Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Xaa в положении 16 представляет собой изомасляную кислоту

(Aib) или Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> Xaa в положении 17 представляет собой аминоизомасляную

кислоту (Aib) или Ser

<400> 6

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Xaa Lys His Leu Xaa

1 5 10 15

Xaa Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

<210> 7

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 7

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

<210> 8

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой любую ацилированную

аминокислоту

<400> 8

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa Phe

<210> 9

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 9

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210> 10

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой ацилированный dLys

<400> 10

Xaa Gly Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe

35

<210> 11

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой ацилированный dLys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой N-метил Gly

<400> 11

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe

35

<210> 12

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой ацилированный Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> C-концевая карбоксильная группа замещена амидом

<400> 12

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Xaa

35

<210> 13

<211> 37

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой ацилированный dLys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой N-метил Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (37)..(37)

<223> Xaa в положении 37 представляет собой ацилированный Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (37)..(37)

<223> C-концевая карбоксильная группа замещена амидом

<400> 13

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe Xaa

35

<210> 14

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой ацилированный dLys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой N-метил Gly

<400> 14

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Gln Phe

35

<210> 15

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой любую ацилированную

аминокислоту

<400> 15

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Xaa

35

<210> 16

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой ацилированный Lys

<400> 16

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 17

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой ацилированный dLys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой N-метил Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой ацилированный Lys

<400> 17

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 18

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой ацилированный Lys

<400> 18

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Ala His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 19

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой ацилированный dLys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой ацилированный Lys

<400> 19

Xaa Gly Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 20

<211> 85

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (85)..(85)

<223> Xaa в положении 85 представляет собой ацилированную аминокислоту

<400> 20

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser

35 40 45

Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu

50 55 60

Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys

65 70 75 80

Ala Lys Ser Gln Xaa

85

<210> 21

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (38)..(38)

<223> Xaa в положении 38 представляет собой ацилированную аминокислоту

<400> 21

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Val Ala Leu Xaa

35

<210> 22

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 22

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Gly His

20 25 30

<210> 23

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 23

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Glu His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

<210> 24

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 24

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Glu Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

<210> 25

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 25

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Glu Leu Gln Asp Val His

20 25 30

<210> 26

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой любую ацилированную

аминокислоту

<400> 26

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Xaa

35

<210> 27

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой ацилированный dLys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой ацилированный Lys

<400> 27

Xaa Gly Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 28

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> модельный гексапептид для исследований с пролекарством

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой His, d-His или N-метил-His

<400> 28

Xaa Ser Arg Gly Thr Phe

1 5

<210> 29

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> модельный гексапептид для исследований с пролекарством

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой саркозин

<400> 29

Lys Xaa His Ser Arg Gly Thr Phe

1 5

<210> 30

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой любую ацилированную

аминокислоту

<400> 30

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Xaa

35

<210> 31

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 31

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn

<210> 32

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 32

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210> 33

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 33

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Val

35

<210> 34

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 34

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Val Ala

35

<210> 35

<211> 37

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 35

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Val Ala Leu

35

<210> 36

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 36

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Val Ala Leu Gly

35

<210> 37

<211> 39

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 37

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala

35

<210> 38

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (34)..(34)

<223> Xaa в положении 34 представляет собой K(гамма-glu-COC16H32CO2H)F-OH

<400> 38

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Xaa

<210> 39

<211> 147

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 39

Ser Arg Arg Leu Lys Arg Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp

1 5 10 15

Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His

20 25 30

Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala Glu Ile Arg Ala Thr Ser Glu Val

35 40 45

Ser Pro Asn Ser Lys Pro Ser Pro Asn Thr Lys Asn His Pro Val Arg

50 55 60

Phe Gly Ser Asp Asp Glu Gly Arg Tyr Leu Thr Gln Glu Thr Asn Lys

65 70 75 80

Val Glu Thr Tyr Lys Glu Gln Pro Leu Lys Thr Pro Gly Lys Lys Lys

85 90 95

Lys Gly Lys Pro Gly Lys Arg Lys Glu Gln Glu Lys Lys Lys Arg Arg

100 105 110

Thr Arg Ser Ala Trp Leu Asp Ser Gly Val Thr Gly Ser Gly Leu Glu

115 120 125

Gly Asp His Leu Ser Asp Thr Ser Thr Thr Ser Leu Glu Leu Asp Ser

130 135 140

Arg Arg His

145

<210> 40

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой dAla, который имеет

нативную карбоксильную группу, замещенную амидом

<400> 40

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Xaa

35

<210> 41

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 41

Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser

1 5 10 15

Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn

20 25 30

Phe

<210> 42

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 42

Gly Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210> 43

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 43

Ala Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210> 44

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, имеющий его боковую

цепь, ацилированную COC16H32CO2H) через гамма Glu спейсер

<400> 44

Xaa Gly Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe

35

<210> 45

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, имеющий боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H) через гамма Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой саркозин (n-метилглицин)

<400> 45

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe

35

<210> 46

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, имеющий боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H) через гамма Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-изопропилглицин

<400> 46

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe

35

<210> 47

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys

<400> 47

Xaa Gly Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe

35

<210> 48

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Lys, имеющий боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H) через гамма Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-изопропилглицин

<400> 48

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe

35

<210> 49

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, имеющий боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H) через гамма Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-изопропилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa в положении 3 представляет собой dSer

<400> 49

Xaa Xaa Xaa Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe

35

<210> 50

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, имеющий боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 50

Xaa Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe

35

<210> 51

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Lys, имеющий боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 51

Xaa Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe

35

<210> 52

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Lys, имеющий боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой саркозин (n-метилглицин)

<400> 52

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe

35

<210> 53

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Lys, имеющий боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилаланин

<400> 53

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe

35

<210> 54

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Lys, имеющий боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилаланин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой пипеколиновую кислоту

(пиперидин-2-карбоновую кислоту)

<400> 54

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe

35

<210> 55

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 55

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Gln Phe

<210> 56

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, который имеет нативную

карбоксильную группу, замещенную амидом, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 56

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Xaa

35

<210> 57

<211> 37

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой саркозин (n-метилглицин)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (37)..(37)

<223> Xaa в положении 37 представляет собой Lys, который имеет нативную

карбоксильную группу, замещенную амидом, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 57

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe Xaa

35

<210> 58

<211> 37

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, имеющий его боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H) через гамма Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой саркозин (n-метилглицин)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (37)..(37)

<223> Xaa в положении 37 представляет собой Lys, который имеет нативную

карбоксильную группу, замещенную амидом, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 58

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe Xaa

35

<210> 59

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 59

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn

<210> 60

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой аспарагиновую кислоту,

где карбоксиконец замещен амидом

<400> 60

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 61

<211> 36

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, имеющий его боковую

цепь, ацилированную COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой саркозин (n-метилглицин)

<400> 61

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Gln Phe

35

<210> 62

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 62

Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val

1 5 10 15

Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Gly His Asn Phe

20 25

<210> 63

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (38)..(38)

<223> Xaa в положении 38 представляет собой Lys, который имеет нативную

карбоксильную группу, замещенную амидом, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 63

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Val Ala Leu Xaa

35

<210> 64

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Lys, имеющий его боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 64

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Arg Arg Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 65

<211> 37

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, имеющий боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (37)..(37)

<223> Xaa в положении 37 представляет собой Lys, который имеет нативную

карбоксильную группу, замещенную амидом, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 65

Xaa Gly Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Asn Phe Xaa

35

<210> 66

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, который имеет нативную

карбоксильную группу, замещенную амидом, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 66

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Glu Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Xaa

35

<210> 67

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, который имеет нативную

карбоксильную группу, замещенную амидом, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 67

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Glu Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Xaa

35

<210> 68

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, который имеет нативную

карбоксильную группу, замещенную амидом, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 68

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Glu His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Xaa

35

<210> 69

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(20)

<223> Xaa в положении 20 представляет собой Aib

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, который имеет нативную

карбоксильную группу, замещенную амидом, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 69

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Xaa Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Xaa

35

<210> 70

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> Xaa в положении 17 представляет собой Aib

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, который имеет нативную

карбоксильную группу, замещенную амидом, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 70

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Xaa Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg His Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Xaa

35

<210> 71

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Xaa в положении 16 представляет собой Aib

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, который имеет нативную

карбоксильную группу, замещенную амидом, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 71

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Xaa

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Xaa

35

<210> 72

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой Aib

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, который имеет нативную

карбоксильную группу, замещенную амидом, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 72

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Xaa Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe Xaa

35

<210> 73

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой dLys, имеющий боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 73

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Glu His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Glu Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa Phe

<210> 74

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой Lys, имеющий боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 74

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Glu His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Glu Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 75

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (26)..(26)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой Lys, имеющий боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 75

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Xaa Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Gln

<210> 76

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой Lys, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через (гамма Glu)3x спейсер

<400> 76

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Glu His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Glu Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 77

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H черех гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 77

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 78

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, имеющий боковую цепь,

ацилированную COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 78

Xaa Gly Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 79

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu spacer

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой dLys, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма Glu spacer

<400> 79

Xaa Gly Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 80

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении2 представляет собой саркозин (n-метилглицин)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 80

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 81

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-изопропилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 81

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 82

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Aib

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 82

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 83

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой Lys, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через лизин-гамма Glu-(MINIPEG)2-gamma

Glu спейсер

<400> 83

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 84

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 84

Xaa Gly Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 85

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COCH3

<400> 85

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 86

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, у которого боковая

цепь ацилирована COC15CH31, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu

<400> 86

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 87

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 87

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 88

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 88

Ser Val Ser Glu Ile Gln Ala Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Lys

<210> 89

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 89

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Ala His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Lys

<210> 90

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 90

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Ala Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn

<210> 91

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 91

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Ala Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Lys

<210> 92

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 92

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Ala Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Lys

<210> 93

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 93

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Ala His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 94

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 94

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Ala His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 95

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 95

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Ala His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 96

<211> 38

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (38)..(38)

<223> Xaa в положении 38 представляет собой ацилированную аминокислоту

<400> 96

Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp

1 5 10 15

Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr

20 25 30

Ala Glu Ile Arg Ala Xaa

35

<210> 97

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 97

Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met

1 5 10 15

Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe

20 25 30

<210> 98

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 98

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210> 99

<211> 29

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 99

Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val

1 5 10 15

Glu Trp Leu Arg Glu Lys Leu Gln Asp Val His Asn Phe

20 25

<210> 100

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 100

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Glu Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210> 101

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 101

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Glu Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210> 102

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu спейсер

<400> 102

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa Phe

<210> 103

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой аминоизомасляную кислоту

(Aib) или Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> Xaa в положении 13 представляет собой Arg, Glu, Asp или Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Xaa в положении 16 представляет собой аминоизомасляную кислоту

(Aib) или Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> Xaa в положении 16 представляет собой аминоизомасляную кислоту

(Aib) или Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (26)..(26)

<223> Xaa в положении 26 представляет собой Arg, Glu, Asp или Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (27)..(27)

<223> Xaa в положении 27 представляет собой Arg, Glu, Asp или Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31)..(31)

<223> Xaa в положении 31 представляет собой Gly или Val

<400> 103

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Xaa Xaa His Leu Xaa

1 5 10 15

Xaa Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Xaa Xaa Leu Gln Asp Xaa His

20 25 30

Asn

<210> 104

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> Xaa в положении 13 представляет собой Arg, Glu, Asp или Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (26)..(26)

<223> Xaa в положении 26 представляет собой Arg, Glu, Asp или Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (27)..(27)

<223> Xaa в положении 27 представляет собой Arg, Glu, Asp или Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31)..(31)

<223> Xaa в положении 31 представляет собой is Gly или Val

<400> 104

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Xaa His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Xaa Xaa Leu Gln Asp Xaa His

20 25 30

Asn

<210> 105

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa a position 16 представляет собой аминоизомасляную кислоту

(Aib) или Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Xaa a position 16 представляет собой аминоизомасляную кислоту

(Aib) или Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> Xaa a position 17 представляет собой аминоизомасляную кислоту

(Aib) или Ser

<400> 105

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Xaa Lys His Leu Xaa

1 5 10 15

Xaa Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn

<210> 106

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 106

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn

<210> 107

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 is n-methyl glycine

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 107

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Ala His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 108

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 108

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 109

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa в положении 8 представляет собой Met, у которого боковая

цепь окислена до сульфоксида

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 109

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 110

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> Xaa в положении 18 представляет собой Met, у которого боковая

цепь окислена до сульфоксида

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 110

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Xaa Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 111

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через Tyr(OPO3H2)-(miniPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 111

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 112

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гомоCysr(SO3H)-(miniPEG)

2-гамма Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(miniPEG)

2-гамма Glu спейсер

<400> 112

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 113

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через Arg-(miniPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(miniPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 113

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 114

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через

Arg-(miniPEG)2-Tyr(OPO3H2)-(miniPEG)2-гамма Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(miniPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 114

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 115

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H через

Tyr(OPO3H2)-(miniPEG)2-Tyr(OPO3H2)-(miniPEG)2-гамма Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(miniPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 115

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 116

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через Tyr(OPO3H2)-(miniPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через Tyr(OPO3H2)-(miniPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 116

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 117

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 117

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Glu Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 118

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 118

Ser Val Ser Glu Ile Glu Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 119

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая цепь

ацилирована

COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма Glu спейсер

<400> 119

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asp Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 120

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 120

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asp Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 121

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 121

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asp Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 122

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 122

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asp

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 123

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 123

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Glu Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 124

<211> 33

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (33)..(33)

<223> Xaa в положении 33 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 124

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Glu Asp Val His

20 25 30

Xaa

<210> 125

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> Xaa в положении 18 представляет собой изоаспарагиновую кислоту

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 125

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Xaa Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 126

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метлглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой изоаспарагиновую кислоты

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 126

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Xaa Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 127

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa в положении 10 представляет собой Met, у которого боковая

цепь окислена до сульфоксида

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 127

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 128

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(20)

<223> Xaa в положении 20 представляет собой Met, у которого боковая

цепь оксилена до сульфоксида chain

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая цепь

ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 128

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Xaa Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 129

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 129

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Ala Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210> 130

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 130

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Phe Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210> 131

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 131

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Trp Leu Gly Lys His Leu Asn

1 5 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

Asn Phe

<210> 132

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa в положении 1 представляет собой dLys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa в положении 2 представляет собой n-метилглицин

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (20)..(20)

<223> Xaa в положении 20 представляет собой Met, у которого боковая

цепь оксилена до сульфоксида

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (35)..(35)

<223> Xaa в положении 35 представляет собой Lys, у которого боковая

цепь ацилирована COC16H32CO2H, через гамма Glu-(MINIPEG)2-гамма

Glu спейсер

<400> 132

Xaa Xaa Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Val Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp

20 25 30

Val His Xaa

35

<210> 133

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa в положении 10 представляет собой Asp, Gln или Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> Xaa в положении 13 представляет собой Arg, Glu, Asp или Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Xaa в положении 16 представляет собой Asp, Gln или Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> Xaa в положении 18 представляет собой Met, Met(O), Leu или Nleu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (26)..(26)

<223> Xaa в положении 26 представляет собой Arg, Glu, Asp или Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (27)..(27)

<223> Xaa в положении 27 представляет собой Arg, Glu, Asp или Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31)..(31)

<223> Xaa в положении 31 представляет собой Gly или Val

<400> 133

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Xaa Leu Gly Xaa His Leu Xaa

1 5 10 15

Ser Xaa Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Xaa Xaa Leu Gln Asp Xaa His

20 25 30

<210> 134

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa в положении 10 представляет собой Asp, Gln или Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Xaa в положении 12 представляет собой изомасляную кислоту

(Aib) или Gly

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Xaa в положении 16 представляет собой изомасляную кислоту

(Aib) или Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> Xaa в положении 17 представляет собой аминоизомасляную

кислоту (Aib) или Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> Xaa в положении 18 представляет собой Met, Met(O), Leu или Nleu

<400> 134

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Xaa Leu Xaa Lys His Leu Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

<210> 135

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa в положении 10 представляет собой Asp, Gln или Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (16)..(16)

<223> Xaa в положении 16 представляет собой Asp, Gln или Asn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (18)..(18)

<223> Xaa в положении 18 представляет собой Met, Met(O), Leu или Nleu

<400> 135

Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Xaa Leu Gly Lys His Leu Xaa

1 5 10 15

Ser Xaa Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His

20 25 30

<---

Claims (24)

1. Конъюгат, имеющий активность паратиреоидного гормона (ПТГ), содержащий пептид паратиреоидного гормона (ПТГ) и неферментативно саморасщепляющийся дипептид, ковалентно связанный с указанным пептидом ПТГ через амидную связь с N-концевым альфа-амидом пептида ПТГ,

где указанный пептид ПТГ содержит аминокислотную последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7);

где Z представляет собой X₃₃, X₃₃F, X₅₃X₃₅ или X₅₃FX₃₅;

X₃₃ и X₃₅ независимо друг от друга представляют собой лизин, где боковая цепь указанного лизина ковалентно связана с двухосновной кислотой -CO(CH₂)₁₆COOH через спейсер, содержащий гамма-глутаминовую кислоту или гамма-глутаминовую кислоту-[COCH₂(OCH₂CH₂)_kNH]_q-гамма-глутаминовую кислоту, где k представляет собой целое число, выбранное из 2, 4 или 8, и q представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 4 или 8;

X₅₃ представляет собой Gln или Asn, где С-концевая аминокислота имеет карбоксильный конец или модифицирована для замещения карбоксиконца амидом;

где указанный неферментативно саморасщепляющийся дипептид состоит из первой аминокислоты (A) и второй аминокислоты (B), где А представляет собой Lys, dLys или ацилированный Lys или ацилированный dLys, где указанные ацилированный Lys и ацилированный dLys содержат двухосновную кислоту -CO(CH₂)₁₆COOH, связанную с боковой цепью указанного ацилированного-Lys или ацилированного-dLys через спейсер, содержащий гамма-глутаминовую кислоту или гамма-глутаминовую кислоту-[COCH₂(OCH₂CH₂)_kNH]_q-гамма-глутаминовую кислоту, где k представляет собой целое число, выбранное из 2, 4 или 8, и q представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 4 или 8; и

B представляет собой N-алкилированный глицин,

или фармацевтически приемлемая соль конъюгата.

2. Конъюгат по п. 1, где Z представляет собой X₃₃ или X₃₃F, где X₃₃ и X₃₅ представляют собой лизин, причем боковая цепь указанного лизина ковалентно связана с двухосновной кислотой -CO(CH₂)₁₆COOH через указанный спейсер; X₅₃ представляет собой Gln или Asn, а B представляет собой саркозин.

3. Конъюгат, имеющий активность паратиреоидного гормона (ПТГ), содержащий пептид ПТГ и неферментативно саморасщепляющийся дипептид, ковалентно связанный с указанным пептидом ПТГ через амидную связь с N-концевым альфа-амином белка ПТГ,

где указанный пептид ПТГ включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из

SVSEIQLMHNLGX₁₃HLNSMERVEWLRX₂₆X₂₇LQDX₃₁H-Z, (SEQ ID NO: 5);

SVSEIQLMHX₁₀LGKHLX₁₆SX₁₈ERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 135); и

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7);

где Z представляет собой X₃₃F, X₅₃X₃₅, X₅₃FX₃₅ или X₃₃;

X₁₀ и X₁₆ независимо представляют собой Asp, Gln или Asn;

X₁₈ представляет собой Met, Met(O), Leu или Nleu;

X₁₃, X₂₆ и X₂₇ независимо выбраны из группы, состоящей из Arg, Glu, Asp и Lys;

X₃₁ представляет собой Gly или Val;

Х₃₃ и Х₃₅ каждый содержит лизин или d-лизин, где боковая цепь указанного лизина или d-лизина ковалентно связана с двухосновной кислотой -CO(CH₂)₁₆COOH через спейсер, содержащий гамма-глутаминовую кислоту или гамма-глутаминовую кислоту-[COCH₂(OCH₂CH₂)_kNH]_q-гамма-глутаминовую кислоту, где k – целое число, выбранное из 2, 4 или 8, и q – целое число, выбранное из 1, 2, 4 или 8;

X₅₃ представляет собой Gln или Asn; и

где указанный неферментативно саморасщепляющийся дипептид имеет общую структуру A-B-;

где A-B- содержат структуру

R₁ представляет собой (C₁-C₄ алкил)NH;

каждый R₂ и R₈ представляют собой H;

R₄ представляет собой H или CH₃;

R₃ представляет собой C₁-C₆ алкил; и

R₅ представляет собой NH₂,

или фармацевтически приемлемая соль конъюгата.

4. Конъюгат по п. 3, где указанный пептид ПТГ содержит последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVH-Z (SEQ ID NO: 7); и

X₅₃ представляет собой Asn.

5. Конъюгат по любому из пп. 1-3, где указанный пептид ПТГ содержит последовательность SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHX₃₃ (SEQ ID NO: 16) или SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFX₃₅ (SEQ ID NO: 12),

где X₃₃ и X₃₅ каждый представляет собой лизин, содержащую двухосновную кислоту -CO(CH₂)₁₆COOH, ковалентно связанную с боковой цепью указанного лизина через спейсер, содержащий гамма-глутаминовую кислоту или гамма-глутаминовую кислоту-[COCH₂(OCH₂CH₂)_kNH]_q-гамма-глутаминовую кислоту, где k представляет собой целое число, выбранное из 2, 4 или 8, и q представляет собой целое число, выбранное из 1, 2, 4 или 8.

6. Конъюгат по любому из пп. 1-5, где A, X₃₃ и X₃₅ представляют собой лизин или d-лизин, где боковая цепь указанного лизина или d-лизина ковалентно связана с двухосновной кислотой -CO(CH₂)₁₆COOH через спейсер, независимо выбранный из гамма-глутаминовой кислоты или гамма-глутаминовой кислоты-[COCH₂(OCH₂CH₂)_k NH]_q-гамма-глутаминовой кислоты,

где Xaa выбран из Arg, Tyr(OPO₃H₂) и hCys(SO₃H); и

k представляет собой 2 и q выбрано из ряда 1, 2 и 4.

7. Конъюгат по п. 6, где k равно 2 и q равно 2 или 4.

8. Конъюгат по п. 6 или 7, где каждый указанный спейсер A, X₃₃ и X₃₅ независимо выбран из соединений, содержащих структуру: гамма-глутаминовая кислота-[COCH₂(OCH₂CH₂)_kNH]_q-гамма-глутаминовая кислота, где k равно 2 и q равно 2.

9. Конъюгат по п. 8, где

R₁ представляет собой (C₄-алкил)NH-{гамма-глутаминовая кислота-[COCH₂(OCH₂CH₂)₂NH-COCH₂(OCH₂CH₂)₂]NH-гамма-глутаминовая кислота}-CO(CH₂)₁₆COOH.

10. Конъюгат по любому из пп. 1-9, где первая аминокислота (A) расщепляемого дипептида (A-B) представляет собой аминокислоту в D-стереохимической конфигурации.

11. Конъюгат по п. 1, содержащий структуру

k(X)(N-Me)GSVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHK(X)-OH (SEQ ID NO: 87);

где k представляет собой d-Lys;

X представляет собой γE-(COCH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂NH)-γECOC₁₆H₃₂CO₂H;

γE представляет собой L-изомер гамма-глутаминовой кислоты; и

(N-Me)G представляет собой саркозин.

12. Фармацевтическая композиция для лечения гипопаратиреоза, содержащая конъюгат по любому из пп. 1-11 или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель.

13. Фармацевтическая композиция для лечения остеопороза или остеопении, содержащая конъюгат по любому из пп. 1-11 или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель.

14. Фармацевтическая композиция по п. 12 или 13, составленная для перорального введения, где указанная композиция дополнительно содержит N[8-(2-гидроксибеноил)аминокаприлат натрия].

15. Фармацевтическая композиция по п. 14, где композиция составлена в форме таблетки.

16. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 12-15, дополнительно содержащая пептид SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 32.

17. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 12-16, дополнительно содержащая кальцитонин.

18. Способ лечения гипопаратиреоза, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп. 12, 14-17 пациенту, нуждающемуся в лечении.

19. Способ лечения остеопороза или остеопении, включающий введение эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп. 13-17 пациенту, нуждающемуся в лечении.

20. Способ по п. 18 или 19, где композицию вводят один раз в неделю.

21. Способ по п. 18 или 19, где композицию вводят ежедневно.

22. Способ по любому из пп. 18-21, где композицию вводят перорально.

23. Применение композиции по любому из пп. 12, 14-17 для лечения гипопаратиреоза.

24. Применение композиции по любому из пп. 13-17 для лечения остеопороза или остеопении.