RU2852282C1 - Лекарственное средство, содержащее пептид морского гриба, для лечения ран - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к средству лечения ран. Лекарственное средство для лечения ран, содержащее (3S,6R)-6-бензил-1-(циннамоил-L-пролил)-3-изопропилпиперазин-2,5-дион (астеррипептид С) из морского гриба Aspergillus terreus в концентрации 0,5 мг/г в гидрогеле карбоксиметилцеллюлозы. Вышеописанное изобретение расширяет арсенал лекарственных средств для местного лечения инфицированных ран за счёт применения астеррипептида С, трипептидного производного с фрагментом коричной кислоты, из морского гриба Aspergillus terreus (LM.5.2/КММ5900). Лекарственное средство, содержащее астеррипептид С, проявляет антибактериальную активность путём подавления роста S. aureus и образования биоплёнок на поверхности раны, а также противовоспалительную (цитопротекторную) активность путём активации внутриклеточных защитных систем человека и снижения выработки противовоспалительных цитокинов, что обеспечивает повышение жизнеспособности, пролиферации и миграции кератиноцитов HaCaT, в том числе инфицированных S. aureus. Астеррипептид C защищает клетки от воспаления, в связи с чем заявляемое лекарственное средство значительно ускоряет заживление ран, нормализует уровень цитокинов, гемоглобина и лейкоцитов в образцах периферической крови, а также снижает заражение S. aureus ран и крови. 7 ил., 2 табл.

Description

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно к средству лечения ран, в том числе инфицированных, пептидами природного происхождения, а именно выделенным из морского гриба Aspergillus terreus трипептидом с фрагментом коричной кислоты (астеррипептид С), обладающим антибактериальной и цитопротекторной активностью.

Интактные кожные покровы человека являются естественным барьером для патогенных бактерий. Однако бактерицидная функция кожи снижается в результате различных повреждающих воздействий, а широкое и подчас нерациональное применение антибиотиков приводит к развитию антибиотикорезистентности у патогенных бактерий. Эти два фактора благоприятствуют развитию клинически выраженных инфекций даже на фоне незначительных микротравм кожных покровов и значительно осложняют заживление ран, в том числе после хирургических вмешательств. Основными возбудителями инфекций кожи являются Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogene и другие условно-патогенные микроорганизмы. Эти микроорганизмы способны продуцировать ряд факторов вирулентности (прежде всего токсинов и гидролитических ферментов), обеспечивающих инвазию в ткани и их некротические поражения. Инфекционный процесс приводит к дополнительному повреждению клеток и тканей и существенно тормозит репарацию, кроме того, возникает риск распространения инфекции в кровеносное русло и по всему организму. Staphylococcus aureus представляет собой серьёзную проблему, поскольку этот микроорганизм - один из наиболее распространённых возбудителей инфекций кожи и мягких тканей. В настоящее время наблюдается широкое распространение штаммов S. aureus с множественной устойчивостью к антибиотикам (MRSA). Ранее MRSA традиционно рассматривались как исключительно нозокомиальные патогены, однако в последние годы стали выделяться у пациентов с внебольничными инфекциями, главным образом, тяжёлыми и рецидивирующими инфекциями кожи и мягких тканей. Инфекции кожи и мягких тканей, вызванные внебольничными MRSA, обычно ассоциируются с неэффективностью лечения бета-лактамными антибиотиками, рецидивирующим течением, тяжёлым течением с формированием абсцессов, флегмон, глубоких некрозов при отсутствии предрасполагающих факторов (травмы, иммуносупрессия).

Современная стратегия поиска антибиотиков предполагает поиск веществ, направленных не только на подавление роста бактерий путём ингибирования рибосомального синтеза белка или синтеза нуклеиновых кислот, как это делают «традиционные» антибиотики, но и на подавление вирулентности и образования биоплёнок, а также на задействование защитных клеточных систем самого пациента для борьбы с инфекциями.

Интерес для использования в качестве антибактериальных средств пептидов связан с тем, что бактериям гораздо сложнее выработать устойчивость к белкам с противомикробной активностью, поскольку для этого требуется перестроить или изменить липидный состав их мембраны, что является сложно реализуемым процессом для всех видов микроорганизмов (Zasloff M., Nature, 2002 415:389-395).

Так, из з. WO №2016124143 A1 (опубл. 11.08.2016) известен антибактериальный пептид WY-21 для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, в том числе синегнойной палочкой Pseudomonas aeruginosa, с иммуномодулирующим эффектом для уменьшения воспаления. Пептид WY-21 имеет следующую аминокислотную последовательность: Val-пропилгомосерин-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val-пропилгомосерин-Glu-Lys-Ile-Gly-Lys-Glu-Phe-Lys-Arg и представляет собой катионный полипептид, состоящий из 21 аминокислотного остатка, с молекулярной массой 2624,2 Да, изоэлектрической точкой 10,79, суммарным зарядом +8.

В публикации з. US №20240360177 A1 (опубл. 31.10.2024) раскрыты синтетические пептиды, обладающие противомикробными свойствами с формулой (I): S1-[блок-1]_m-x-[блок-2]_n-y-[блок-3]_o-z-[блок-4]_p-S2, где m, n, o и p независимо друг от друга равны 0 или 1, где 0 означает отсутствие, а 1 - наличие, при этом хотя бы два из m, n, o и p равны 1; блок-1, блок-2, блок-3 и блок-4 независимо друг от друга содержат от 2 до 7 аминокислот, каждая из которых независимо выбрана из L-аргинина (R), D-аргинина (r) и гомоаргинина (Har); S1 и S2 независимо друг от друга представляют собой аминокислоты или аминокислоты, отличные от L-аргинина (R), D-аргинина (r) или гомоаргинина (Har), и независимо друг от друга присутствуют или отсутствуют; x, y и z - это линкеры, и каждый линкер независимо друг от друга присутствует или отсутствует и состоит из одной аминокислоты или аминокислоты, выбранной из: пролин (P), глицин (G), 3-аминопропионовая кислота (β-аланин, Apr), 4-аминомасляная кислота (Aba), 5-аминовалериановая кислота (Ava), 6-аминогексановая кислота (Ahx), 7-аминогептановая кислота (Ahp), 8-аминооктановая кислота (Aoa), 9-аминононановая кислота (Ana), 10-аминодекановая кислота (Ada), 11 -аминоундекановая кислота (Aun), 12-аминододекановая кислота (Ado), 13-аминотридекановая кислота (Atr), 14-аминотетрадекановая кислота (Ata), 15-аминопентадекановая кислота (Apn), 16-аминогексадекановая кислота (Ahd), N-(3-аминопропил) глицин (Apg), (S) -индолин-2-карбоновая кислота (Ica), L -α-метиллейцин (Leu(Me)) и L-2-инданилглицин (Igl), 5-амино-3-оксапентановая кислота (Aea), N-(2-аминоэтил) глицин (Aeg или Aeg2), изонипекотовая кислота (Inp), 2-циклогексилглицин, N-бутилглицин (ButylGly), N-(4-пиперидинил) глицин (PipGly), 2 -амино-3-гуанидинопропионовая кислота (Agp), (4'-пиридил) аланин (4-ПирАла), (S)-N-(1-фенилэтил) глицин (Feg), N-бензилглицин (Bng), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота (Tic), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-1-карбоновая кислота (Tiq), и 4-гуанидинофенилаланин (Phe(4-Ngu)); необязательно, пептид содержит модифицированную N-концевую аминокислоту, в которой N-концевой -NH₂ заменён на -N(X₁)(X₂), где (X₁) и (X₂) независимо выбраны из H, R₁, R₂C(O), R₃SO₂ и R₄, R₅NC(O), где R₁, R₂ и R₃ независимо представляют собой алкильную группу или арильную группу, и R₄ и R₅ независимо представляют собой H, алкильную группу или арильную группу, и при этом алкильная группа и арильная группа независимо дополнительно необязательно замещены галогенными, алкильными, аминогруппами и/или кислородными фрагментами; и при необходимости пептид может содержать модифицированную С-концевую аминокислоту, в которой С-концевая -COOH заменяется на -CONH₂.

Однако следует отметить, что многие пептиды, обладающие доказанной антибактериальной активностью in vitro, при тестировании в других питательных средах in vitro или in vivo теряют такую антибактериальную активность или большую её часть. Это явление объясняется тем, что высокие концентрации солей, например, в различных частях человеческого тела или в некоторых питательных средах, а также действие пептидаз сыворотки и тканей инактивируют пептиды. Таким образом, было бы полезно иметь группы или подгруппы пептидов, которые, помимо полезной базовой противомикробной активности, сохраняли бы её и в присутствии высоких концентраций соли, а также были бы устойчивы к протеазам и пептидазам, чтобы обеспечить стабильный антибактериальный эффект in vivo во всех физиологических средах. Присоединение липофильного фрагмента, в частности жирной кислоты, к неактивному или слабоактивному противомикробному пептиду неожиданно наделяет пептид высокой противомикробной активностью.

Так, источник информации пат. EP №3434287 B1 (опубл. 27.01.2021) раскрывает липопептиды со структурой FA-A-B-A'-NH₂, где FA - это жирная кислота, выбранная из капроновой (гексановой), каприловой (октановой), каприновой (декановой), лауриновой (додекановой), миристиновой (тетрадекановой), пентадекановой и пальмитиновой (гексадекановой) кислот; единицы A и A' независимо друг от друга состоят из 1, 2 или 3 аминокислот, выбранных из группы основных аминокислот или гидрофобных аминокислот; единица B состоит из 1, 2 или 3 аминокислот, выбранных из группы (а) гидрофобных аминокислот и (б) группы аминокислот, образующих водородные связи; при этом: (i) указанные гидрофобные аминокислоты выбираются из: аланина, фенилаланина, лейцина, пролина, тирозина, триптофана, валина, метионина, цистеина; (ii) указанные основные аминокислоты выбираются из: Lys, His, Arg; (iii) аминокислоты, образующие водородные связи, выбираются из Asn, Gin, Ser, Thr; -NH₂ представляет собой амидирование С-конца. Помимо этого, в изобретении указан способ профилактики или лечения микробной инфекции кожи или слизистой оболочки у млекопитающих, который включает введение в инфицированную область указанного млекопитающего терапевтически эффективного количества композиции в концентрации от 1 мкг/мл до примерно 12,5 масс. %.

Плесневые грибы являются известным источником антибиотиков, например, пенициллин был выделен из гриба Penicillium rubens, а цефалоспорин С - из морского гриба Acremonium chrysogenum. Виды плесневых грибов Aspergillus, обитающих в морской среде, также оказались интересными продуцентами биологически активных вторичных метаболитов и сыграли значительную роль в разработке лекарств. Конкурентные взаимодействия между грибами и бактериями играют важную роль в микробных сообществах, что побуждает микроорганизмы вырабатывать экзолиты, контролирующие рост и развитие своих конкурентов. При этом адаптация к экстремальным условиям морских микроорганизмов, благодаря уникальным метаболическим путям, приводит к тому, что морские грибы способны синтезировать различные по структуре противомикробные соединения, в том числе с необычными структурными фрагментами. Известно около 131 пептида из 17 родов морских грибов с подтверждённой цитотоксической, противомикробной и противовирусной активностью. Описано 366 нерибосомальных (NRP) и рибосомно синтезированных и посттрансляционно модифицированных (RiPP) пептидов морских грибов, принадлежащих к линейным, циклическим и депсипептидным классам, пятая часть которых обладает противомикробными и противобиоплёночными свойствами.

Так, ранее из питательной среды мангрового гриба Aspergillus terreus LM5.2 были выделены циклические нерибосомальные пептиды, содержащие в своей структуре фрагмент коричной кислоты - астеррипептиды A-C [Elena V. Girich, et al. «New Tripeptide Derivatives Asterripeptides A-C from Vietnamese Mangrove-Derived Fungus Aspergillus terreus LM.5.2 // Mar. Drugs 2022, 20, 77. https://doi.org/10.3390/md20010077]. Штамм был выделен из листьев мангрового дерева Kandelia candel (побережье провинции Кханьхоа, Вьетнам, Южно-Китайское море) на агаре с солодовым экстрактом и идентифицирован на основе морфологических и молекулярных признаков. Для выделения ДНК культуру выращивали на агаре с солодовым экстрактом при температуре 28°C в течение 7 дней. Выделение ДНК проводили с помощью набора HiPurATM Plant DNA Isolation kit (CTAB Method) (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., Индия) в соответствии с инструкциями производителя. Фрагменты, содержащие области ITS, амплифицировали с использованием праймеров ITS1 и ITS4. Новые полученные последовательности проверяли визуально и сравнивали с доступными последовательностями в базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank, дата обращения 16 декабря 2021 г. ). Согласно анализу BLAST последовательности ITS1-5.8S-ITS2, штамм LM.5.2 имел 98,06% сходства с Aspergillus terreus DTO 403-C9 (номер последовательности в базе данных GenBank - MT316343.1). Последовательности были депонированы в базе данных нуклеотидных последовательностей GenBank под номером MN788658.1. Штамм хранится в Коллекции морских микроорганизмов Института технологических исследований и разработок VAST (Нячанг, Вьетнам) под номером LM.5.2 и в Коллекции морских микроорганизмов Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова (Владивосток, Россия) под номером КММ 5900. Биологически активный трипептид - астеррипептид С имеет следующее систематическое название: (3S,6R)-6-бензил-1-(циннамоил-L-пролил)-3-изопропилпиперазин-2,5-дион и описывается следующей структурной формулой:

Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение арсенала лекарственных средств для местного лечения инфицированных ран за счёт применения астеррипептида С, трипептидного производного с фрагментом коричной кислоты, из морского гриба Aspergillus terreus (LM.5.2/КММ5900). Лекарственное средство, содержащее астеррипептид С, проявляет антибактериальную активность путём подавления роста S. aureus и образования биоплёнок на поверхности раны, а также противовоспалительную (цитопротекторную) активность путём активации внутриклеточных защитных систем человека и снижения выработки провоспалительных цитокинов, что обеспечивает повышение жизнеспособности, пролиферации и миграции кератиноцитов HaCaT, в том числе инфицированных S. aureus. Астеррипептид C защищает клетки от воспаления, в связи с чем заявляемое лекарственное средство значительно ускоряет заживление ран, нормализует уровень цитокинов, гемоглобина и лейкоцитов в образцах периферической крови, а также снижает заражение S. aureus ран и крови.

Подтверждение двойной антибактериальной и противовоспалительной активности заявляемого лекарственного средства, включающего в качестве активной фармакологической субстанции астеррипептид C, в экспериментах in vitro и in vivo проводили следующим образом.

Перед началом экспериментов астеррипептид С хранили в сухом виде при температуре -20°C. После растворения в ДМСО (10 мМ) соединение сразу же использовали в диапазоне концентраций 1-100 мкМ. Концентрация используемого ДМСО составляла 1 об.% или менее. Культуру золотистого стафилококка Staphylococcus aureus ATCC 21027 выращивали в чашке Петри при температуре 37°C в течение 24 часов на твёрдой питательной среде Мюллера-Хинтона с агаром (16,0 г/л).

Антимикробная активность in vitro астеррипептида С была протестирована при концентрациях от 0 до 100 мкМ. В качестве положительного контроля использовали гентамицин в концентрации 1 мг/мл, а в качестве отрицательного контроля - 1 об.% раствор ДМСО в фосфатно-солевом буфере (PBS). Оптическую плотность бактериальной суспензии через 18 часов измеряли при длине волны 620 нм. Влияние астеррипептида С на образование биоплёнок S. aureus в течение 18 часов проверяли с помощью реагента MTT (Sigma-Aldrich, США). Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре MultiskanFS (Thermo Scientific Inc., США) при длине волны 570 нм. Результаты выражали в процентах от контрольных данных. Все эксперименты проводились в трёхкратной повторности.

Кератиноциты человека HaCaT, инфицированные S. aureus, использовали для изучения in vitro различных аспектов влияния астеррипептида C с помощью люмино- и флуоресцентной спектрометрии, иммуноферментного анализа, проточной цитометрии, вестерн-блоттинга и микроскопии. Клетки HaCaT культивировали в среде DMEM (BioloT, Россия), содержащей 10 об.% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1 масс. % пенициллина/стрептомицина (BioloT, Россия), при 37°C и 5% (об./об.) влажности CO₂. В качестве отрицательного контроля использовали раствор диметилсульфоксида (ДМСО) в PBS, концентрация ДМСО составляла не более 1 об.%.

Заражение клеток HaCaT золотистым стафилококком проводили следующим образом. Клетки HaCaT (1,2×10⁴ клеток/лунка) были посеяны в 96-луночные планшеты и инкубированы в течение 24 часов. Затем питательную среду отбирали, и вместо питательной среды в каждую лунку добавляли суспензию S. aureus (10² КОЕ/мл) в полной среде DMEM. В контрольные лунки добавляли среду DMEM без суспензии S. aureus. Через 1 час в лунки добавляли 10 мкМ астеррипептида С и клетки HaCaT, инфицированные S. aureus, культивировали в течение 48 часов. Жизнеспособность клеток определяли посредством теста на высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Для измерения высвобождения ЛДГ из клеток использовали набор реактивов «LDH Cytotoxicity Assay Kit» (Abcam, Великобритания). Оптическую плотность реакционной смеси измеряли при длине волны 450 нм с помощью микропланшетного фотометра Multiskan FC (Thermo Scientific Inc., США) и выражали в оптических единицах. Для обнаружения активных форм кислорода (АФК) инфицированные клетки обрабатывали 10 мкМ астеррипептида С в течение 3 ч и затем окрашивали специфическим флуоресцентным красителем 2,7-дихлорфлуоресцеиндиацетатом (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 10 мкМ. Флуоресценцию 2,7-дихлорфлуоресцеина регистрировали при λ_ex=485 и λ_em=520 нм. Для обнаружения оксида азота (NO) использовался специфический флуоресцентный краситель диаминофлуоресцеин-FM диацетат (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 10 мкМ после обработки инфицированных клеток 10 мкМ астеррипептида С в течение 3 ч. Интенсивность флуоресценции диаминофлуоресцеина-FM измеряли при λ_ex=485 и λ_em=520 нм. Для всех экспериментов использовали планшетный ридер PHERAstar FS (BMG Германия). Данные обрабатывали с помощью MARS Data Analysis v. 3.01R2 (BMG Германия).

Для измерения уровня цитокинов инфицированные клетки S. aureus обрабатывали 10 мкМ астеррипептида С в течение 48 часов, а затем готовили образцы. Уровни TNF-α в смеси супернатантов и клеточных лизатов сразу же анализировали с помощью набора для ИФА TNF-α человека (SEA133Hu), а уровни IL-18 анализировали с помощью набора для ИФА IL-18 человека (SEA064Hu) от Cloud-Clone (Хьюстон, США).

Профиль пролиферации клеток кератиноцитов HaCaT, инфицированных S. aureus, был изучен с помощью флуоресцентного красителя карбоксифлуоресцеиндиацетата сукцинимидилового эфира (CFDA SE) и проточной цитометрии. Астеррипептид С использовали в концентрации 10 мкМ. Клетки HaCaT в концентрации 1,2×10⁴ были посеяны в 12-луночный планшет на 24 часа. После адгезии клетки были окрашены (5,6)-карбоксифлуоресцеин-сукцинимидиловым эфиром (CFDA SE) (набор LumiTrace CFDA SE; Россия). В лунки добавляли суспензию S. aureus (10² КОЕ/мл) в полной среде DMEM, а через 1 час в лунки добавляли астеррипептид С (10 мкМ). В контрольные лунки добавляли среду без бактериальной суспензии. После 48-часовой инкубации клетки дважды промывали PBS, центрифугировали и собирали. Интенсивность флуоресценции CFDA анализировали с помощью проточного цитометра NovoCyte (Agilent, США).

Влияние астеррипептида С на клеточный цикл инфицированных S. aureus кератиноцитов HaCaT было исследовано с помощью проточной цитометрии. Клетки подвергали трипсинизации, собирали, фиксировали 70 об.% этанолом на льду и хранили при температуре -20°C в течение ночи. Затем клетки промывали PBS и инкубировали с 200 мкг/мл РНКазы (PanReac, Германия) и 20 мкг/мл йодида пропидия (Sigma-Aldrich, США) в течение 30 мин при 37°C. Содержание ДНК анализировали с помощью анализатора Cell Muse (Luminex, США). Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения Muse 1.5 (Luminex, США). Количество клеток на каждой стадии клеточного цикла выражали в процентах.

Влияние астеррипептида С на миграцию кератиноцитов HaCaT в модели инфицированной золотистым стафилококком раны in vitro было исследовано с помощью анализа зарастания свободной зоны. Определение способности клеток HaCaT, инфицированных золотистым стафилококком, к миграции проводили следующим образом. Для создания бесклеточных зон в монослое клеток HaCaT использовали силиконовые 2-луночные вставки в планшеты (Ibidi, Германия), в которые вносили клетки. После удаления вставок клетки были помечены красителем (5,6)-карбоксифлуоресцеин-сукцинимидиловым эфиром (CFDA SE) (набор LumiTrace CFDA SE; Россия). Затем в соответствующие лунки добавляли суспензию S. aureus (10² КОЕ/мл) в полной среде DMEM. В контрольные лунки добавляли среду без бактерий. Астеррипептид С в концентрации 10 мкм добавляли в лунки через 1 ч, и клетки HaCaT и S. aureus культивировали при 37°C в увлажнённой атмосфере с 5% (об./об.) CO₂. Миграцию клеток HaCaT наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа MBF-10 (Ломо Микросистемс, Россия). Для расчёта заполнения бесклеточной зоны клетками HaCaT использовалось программное обеспечение ImageJ 1.53t (Расбанд У.С., США). Все эксперименты проводили в трёхкратной повторности. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (SEM).

Противовоспалительную активность астеррипептида С определяли путём оценки влияния на транскрипционную активность NF-κB в клетках JB6 Cl41, стабильно экспрессирующих репортерный ген люциферазы, контролируемый NF-κB. Клетки мышиной эпидермальной клеточной линии JB6 P+ Cl41 и её стабильные трансфектанты JB6-Luc NF-κB культивировали в среде MEM с 5% FBS, 2 мМ L-глутамина и 1 масс. % пенициллина/стрептомицина при 37°C и 5% (об./об.) CO₂. Трансформированные клетки отбирали с помощью антибиотика генецитина G-418 (Sigma-Aldrich, США). Для люциферазной оценки транскрипционной активности NF-κB жизнеспособные клетки JB6 Cl41 NF-κB (8×10³ клеток/лунка) высевались в каждую лунку 96-луночного планшета на ночь, а затем добавлялись соединения в концентрации 1 мМ на 3, 6 или 24 часа. Затем клетки разрушали в течение 1 ч при RT с использованием лизирующего буфера (0,1 М калий-фосфатного буфера при рН 7,8, 1% Тритон Х-100, 1 мМ DTT, 2 мМ EDTA) и по 30 мкл лизата из каждой лунки переносили в планшет для люминесцентного анализа, и активность люциферазы измеряли с использованием буфера для люциферазного анализа (100 мкл/лунка), содержащего 0,47 мМ D-люциферина, 20 мм Трицин, 1,07 мМ (MgCO₃)₄×Mg(OH)₂×5H₂O, 2,67 мМ MgSO₄×7H₂O, 33,3 мМ DTT, 0,53 мМ ATP, 0,27 мМ CoA и 0,1 мМ EDTA, рН 7,8. Измерение проводили с помощью планшетного фотометра Luminoscan Ascent Type 392 (Финляндия). Результаты выражали в виде интенсивности люминесценции. Все эксперименты проводили в трёхкратной повторности, и данные представлены как среднее значение ± SEM.

Для оценки влияния астеррипептида С на уровень воспаления, вызванного TNF-α в клетках HaCaT, клетки HaCaT (1,2×10⁴ клеток/лунка) высевали в 96-луночные планшеты на 24 часа. Рекомбинантный человеческий фактор некроза опухоли α (TNF-α) (Sci-Store, Россия) добавляли в культуру клеток HaCaT в концентрации 10 пг/мл, а соединение астеррипептид С в концентрации 10 мкМ добавляли через 1 час. Уровень NO измеряли через 3 часа, а жизнеспособность клеток через 24 часа. Анализ продукции формазана (MTT тест) для оценки жизнеспособности клеток проводили с использованием реактива MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида) от Sigma-Aldrich (США). Оптическую плотность образовавшегося формазана измеряли при длине волны 570 нм с помощью микропланшетного фотометра Multiskan FC (Thermo Scientific Inc., США) и выражали в оптических единицах (о.е.).

Влияние астеррипептида С на уровни фосфорилированного Nrf2 и GSS в клетках HaCaT было измерено с помощью специфических антител и вестерн-блоттинга. После обработки астеррипептидом С клетки промывали фосфатно-солевым буфером (BioloT, Россия) и лизировали с помощью буфера для радиоиммунопреципитации (Sigma-Aldrich, США). Для измерения концентрации белка использовали метод Брэдфорда. SDS-PAGE на 12 масс. % полиакриламидном геле проводили для разделения белков, которые переносили на мембрану из поливинилидендифторида Immobilon^®-P (PVDF) с использованием полусухой ячейки для переноса (Bio-Rad, США). Для обнаружения белковых зон использовались специфические первичные кроличьи антитела к глутатион-синтетазе (кат. №: A11557, Abclonal, США) и фосфо-NRF2-S40 (кат. AP1133, Abclonal, США), а для обнаружения белковых зон β-актина в качестве контроля загрузки использовались специфические моноклональные антитела к β-актину. Антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), были приобретены у Sigma-Aldrich (Луис, Миссури, США) и использовались вторичные антитела. Белковые зоны на мембране визуализировали с помощью набора PierceTM ECL (Thermo Fisher Scientific, США) и системы визуализации Versa Doc (Bio-Rad, США). Денситометрический анализ белковых зон проводили с использованием программного обеспечения Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad, США). В качестве фона использовался β-актин. Уровни белков измеряли через 24 часа. Астеррипептид С использовали в концентрации 10 мкМ. Все эксперименты проводили в трёхкратной повторности, и данные представлены как среднее значение ± SEM.

В экспериментах in vivo изучено влияние лекарственного средства, содержащего астеррипептид С, на заживление ожоговых ран и инфицированных S. aureus резаных ран у мышей, показатели периферической крови и уровень цитокинов в крови. Для этого использовали половозрелых белых самцов мышей линии BALB/C весом 20±1,5 г. Животные содержались в условиях контролируемой окружающей среды с оптимальными параметрами: температурой 23±3°C, влажностью 50% и 12-часовым световым циклом. У мышей был постоянный доступ к сбалансированному корму для лабораторных животных и фильтрованной воде. Все экспериментальные работы с животными проводились в соответствии с Европейской директивой 2010/63/EC «О защите животных, используемых в научных целях» и правилами ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики».

Мышей разделили на пять групп по шесть особей в каждой: группа I - интактные мыши для контроля крови; группа II - интактные мыши без лечения; группа III - мыши, получавшие лекарственное средство, содержащее астеррипептид C; группа IV - мыши, получавшие референтный препарат левомеколь; группа V - мыши, получавшие гидрогель КМЦ без активного вещества. Перед манипуляциями животных анестезировали смесью золетила и ксилазина в дозировке 20-40 мг/кг + 5-10 мг/кг внутривенно. Эксперимент был прекращён после полного заживления ран в экспериментальных группах, и мышей эвтаназировали.

Для приготовления лекарственного средства 5 мг астеррипептида C растворяли в небольшом количестве диметилсульфоксида (ДМСО) (100 мкл), а затем растворяли в гидрогеле из карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) 10 г, концентрация фармакологически активного вещества составляла 0,5 мг на 1 г гидрогеля. Гидрогель КМЦ с ДМСО без соединения использовали в качестве контроля. Тонкие слои гидрогеля наносили на каждую рану с помощью стерильной лопатки. В качестве препарата сравнения использовали мазь для наружного применения Левомеколь (Нижфарм, Россия) с активными ингредиентами 40 мг/г диоксометилтетрагидропиримидина (метилурацила) и 7,5 мг/г хлорамфеникола. Эта мазь рекомендована для лечения инфицированных кожных ран в качестве антибактериального и регенерирующего средства.

Чтобы получить модель ожоговой раны, термическую ожоговую рану наносили с помощью медного стержня с плоской торцевой поверхностью и диаметром 0,6 см. Стержень нагревали в кипящей воде и прижимали к выбритому участку кожи в межлопаточной области в течение 6 секунд. У каждой мыши образовывалось по два ожога. Лечение начинали через день после нанесения ожога.

Для создания модели операционной раны использовали устройство для биопсии кожи и хирургические ножницы. На каждой мыши создавалось по две раны. Через 2 часа раны инфицировались суспензией S. aureus в концентрации 0,5×10⁹ КОЕ/мл (10 мкл суспензии на каждую рану) в стерильном фосфатно-солевом буфере. Лечение начиналось через день после нанесения ожога.

Для определения действия лекарственного средства, содержащего астеррипептид C, на ожоговые раны, площадь раны измеряли на следующий день после нанесения ожога, а затем через 3-4 дня. Площадь резаной раны измеряли до заражения S. aureus, а затем каждые 3-4 дня. Через четыре дня и после завершения эксперимента мышей эвтаназировали, взяли образцы периферической крови для проведения клинического анализа крови и исследования уровня цитокинов TNF-α и IL-18 в крови животных. Уровни TNF-α были проанализированы с помощью набора Mouse TNF-α ELISA (SEA133Mi), а уровни IL-18 - с помощью набора Mouse IL-18 ELISA (SEA064Mu) от Cloud-Clone (США) в соответствии с инструкциями производителя. Клинические анализы крови проводились с помощью гематологического анализатора (Mindray BC-5000 Vet, Китай).

Для оценки динамики раневой инфекции были проведены посевы 10-кратных разведений гнойного отделяемого на селективной среде (панкреатический гидролизат рыбной муки (5,0 г/л), пептон (5,0 г/л), панкреатический гидролизат казеина (20,0 г/л), дрожжевой экстракт (2,0 г/л), NaCl (68,0 г/л), маннит (10,0 г/л), фенол красного (0,025 г/л) и агара (10,0±3,0 г/л), рН 7,2±0,2) из Научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск, Россия), после чего проводили подсчёт выросших колоний (КОЕ, количество на рану). Также на селективную среду наносили образец крови (10 мкл) для оценки заражённости крови S. aureus.

Возможность реализации заявляемого изобретения подтверждена на следующих графических материалах.

Фиг. 1. Влияние астеррипептида C в концентрации 10 мкМ на рост суспензии S. aureus в течение 18 часов в сравнении с контрольной суспензией S. aureus (отрицательный контроль). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM.

Фиг. 2. Влияние астеррипептида С (аст. С) на высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (А), уровень оксида азота (NO) (Б) и активных форм кислорода (АФК) (В) в инфицированных S. aureus клетках HaCaT. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Звёздочка указывает на значимость различия при значении p<0,05.

Фиг. 3. Влияние астеррипептида C на пролиферацию клеток HaCaT, инфицированных S. aureus: (А) - неинфицированные клетки HaCaT; (Б) - неинфицированные клетки HaCaT, обработанные астеррипептидом С; (В) - инфицированные S. aureus клетки HaCaT; (Г) - инфицированные S. aureus клетки, обработанные астеррипептидом С; (Д) - процентное содержание клеток в каждой фазе клеточного цикла.

Фиг. 4. Влияние астеррипептида C в концентрации 10 мкМ на клеточный цикл инфицированных S. aureus клеток HaCaT: (А) - неинфицированные клетки HaCaT; (Б) - инфицированные S. aureus клетки; (В) - инфицированные S. aureus клетки, обработанные астеррипептидом С, (Г) процент клеток в каждой фазе клеточного цикла.

Фиг 5. Влияние лекарственного средства, содержащего астеррипептид C, на заживление ожоговых ран (А) и инфицированных S. aureus ран (Б). Показана площадь ран во время заживления. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. Звёздочкой отмечены значимые различия (значение p<0,05) у мышей, получавших лекарственное средство, содержащее астеррипептид C, по сравнению с мышами, не получавшими лечения.

Фиг 6. Влияние лекарственного средства, содержащего астеррипептид C, на уровни TNF-α (А) и IL-18 (Б) в периферической крови мышей с инфицированными S. aureus резанными ранами.

Фиг 7. Влияние лекарственного средства, содержащего астеррипептид C (аст.С) в сравнении с Левомеколем (лев.), на заражение S. aureus резаных ран на 3-й (А), 5-й (Б), 9-й (В) и 12-й (Г) дни; и на заражение S. aureus образцов крови (Д). Репрезентативные изображения колоний S. aureus на чашках Петри с образцами из необработанных ран мышей (Е) и ран, обработанных лекарственным средством, содержащим астеррипептид C (Ж).

Достижение технического результата подтверждается следующими примерами.

Астеррипептид С проявлял противомикробную активность и значительно снижал образование биоплёнок S. aureus. В концентрации 100 мкМ ингибировал рост S. aureus на 35,3%, при концентрации 25 мкМ соединение подавляло рост S. aureus всего на 13,56%. Снижение плотности бактериальной суспензии наблюдалось через 4-5 часов после обработки соединениями в концентрации 50 мкМ, а некоторое бактериостатическое воздействие было выявлено через 14 часов (Фиг. 1). Астеррипептид С в концентрациях 10-100 мкМ ингибировал образование биопленок на 53,8-61,9%.

Астеррипептид С в концентрации до 100 мкМ не оказывал токсического воздействия на клетки HaCaT. Инкубация клеток HaCaT с S. aureus привела к значительному снижению жизнеспособности кератиноцитов и увеличению высвобождения фермента ЛДГ во внеклеточную среду на 53,4%, однако астеррипептид С в концентрации 10 мкМ снижал высвобождение ЛДГ на 22,3%. S. aureus увеличил уровень NO в клетках HaCaT на 23,5% через 3 часа, а астеррипептид С снижал этот показатель на 14,3%. Уровень АФК в клетках HaCaT, инфицированных S. aureus, увеличился на 42,1%, в то время как астеррипептид С снижал уровень АФК на 15,7% (Фиг. 2). S. aureus вызывал повышение уровня как TNF-α, так и IL-18, в то время как астеррипептид С снижал это повышение. Так, инфекция, вызванная S. aureus, приводила к высвобождению TNF-α на 42,5%, а астеррипептид С снижал его на 56,3%. Уровень IL-18 повысился на 35,7%, а астеррипептид С снизил его на 63,9%. Таким образом, астеррипептид C защищает клетки HaCaT от повреждений, вызванных S. aureus, окислительного стресса и воспаления.

В неинфицированных клетках HaCaT процент клеток с делением 0 составил 8,1%, с делением 1 - 43,7%, с делением 2 - 43,9%, с делением 3 - 4,1%. Астеррипептид С не оказал существенного влияния на профиль пролиферации HaCaT. Инфекция S. aureus значительно замедлила пролиферацию HaCaT: процент клеток в делении 0 и 1 увеличился до 13,9% и 55,1% соответственно, а процент клеток в делении 2 снизился до 22,4%. Астеррипептид С снизил процент клеток в делении 2, повысив процент клеток в делении 3. Эти результаты указывают на восстановление пролиферации в клетках HaCaT, инфицированных S. aureus, в результате воздействия астеррипептида С (Фиг. 3).

Заражение S. aureus останавливает клеточный цикл HaCaT на стадии G1 (Фиг. 4). Процент инфицированных S. aureus клеток на стадии G1 составлял 54,2±1,6%, а процент неинфицированных клеток на стадии G1 был равен 45,8±2,8%. Процент инфицированных S. aureus клеток в фазе G2/M составил 8,7±1,1%, а процент неинфицированных клеток в фазе G2/M составил 15,2±1,4%. Астеррипептид С вызывал нормализацию клеточного цикла HaCaT: процент клеток в фазе G1 составил 45,2% при обработке S. aureus-инфицированных клеток астеррипептидом С, процент клеток в фазе S составил 41,1%, а в фазе G2/M - 13,7%, соответственно. Таким образом, астеррипептид C способен восстанавливать клеточный цикл и пролиферацию кератиноцитов, инфицированных S. aureus.

Зона без клеток в необработанном монослое клеток HaCaT заполнилась на 15% через 8 часов, на 40% через 24 часа и на 83% через 30 часов. Астеррипептид С не повлиял на миграцию необработанных клеток HaCaT. S. aureus вызвал резкое замедление миграции кератиноцитов в зоне без клеток, поскольку через 30 часов зона без клеток была заполнена всего на 13%. Эффект от астеррипептида С наблюдался после первых 8 часов эксперимента. После 30 часов наблюдения зоны без клеток уменьшилась на 53%.

Таким образом, астеррипептид C способен защищать кератиноциты от повреждений, вызванных S. aureus, окислительного стресса и воспаления, а также восстанавливать интенсивность пролиферации и миграции в экспериментах in vitro.

Чтобы выяснить противовоспалительное и антиоксидантное действие астеррипептида С, исследовали его влияние на транскрипционную активность NF-κB в клетках JB6 Cl41, а также на выработку NO и жизнеспособность клеток HaCaT, обработанных TNF-α. В клетках HaCaT были измерены уровни ядерного фактора, связанного с эритроидным фактором 2 (Nrf2), и глутатион-синтетазы (GSS). Астеррипептид С через 1 час снизил активность люциферазы в клетках JB6-Luc NF-κB на 10,1%, через 3 часа на 4,3%, при этом p-значения составили 0,102 и 0,108, соответственно.

Обработка клеток HaCaT TNF-α в течение 3 часов увеличила выработку NO на 51,2%. Астеррипептид С снизил уровень NO в клетках HaCaT, обработанных TNF-α, на 27,8%. Кроме того, обработка клеток HaCaT TNF-α снизила выработку формазана, т.е. жизнеспособность клеток, на 44,3%, в то время как астеррипептид С повысил жизнеспособность клеток HaCaT, обработанных TNF-α, на 37,7%. Уровень GSS увеличился на 61% при обработке клеток HaCaT астеррипептидом C в течение 24 часов.

Таким образом, астеррипептид С способен снижать транскрипционную активность NF-κB и уменьшать воспаление, опосредованное TNF-α. Более того, астеррипептид C оказывал выраженное цитопротекторное действие на клетки HaCaT, инфицированные S. aureus. Таким образом, астеррипептид С в экспериментах in vitro показал значительное ингибирование роста и образования биоплёнок S. aureus, цитопротекторную активность и выраженное влияние на внутриклеточный антиоксидантный механизм.

В исследованиях in vivo показано, что гидрогель карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) без активного компонента не ускорял заживление ожоговых ран. Применение лекарственного средства, содержащего астеррипептид C в концентрации 0,5 мг/г, для лечения ожоговых ран ускоряет заживление. На 5-й день площадь необработанной раны уменьшилась на 7,3%, а площадь раны, обработанной астеррипептидом С, уменьшилась на 25,4%. На 10-й день площадь необработанной раны уменьшилась на 58,8%, а площадь раны, обработанной астеррипептидом С, уменьшилась на 70%, и это значительное улучшение заживления ран. В последний день наблюдения рана, обработанная лекарственным средством, полностью зажила, в то время как площадь необработанной раны составила 14,6% от первоначальной площади (Фиг. 5).

Влияние астеррипептида C на состав периферической крови мышей с ожоговыми ранами в конце эксперимента (18 день) сопровождалось двукратным увеличением содержания нейтрофилов в образцах периферической крови, поскольку концентрация нейтрофилов составляла 1,703×10⁹/л у здоровых мышей и 3,615×10⁹/л у мышей с ожоговыми ранами, не получавших лечения лекарственным средством, содержащим астеррипептид C (p=0,049). Применение лекарственного средства, содержащего астеррипептид C, при ожоговых ранах нормализовало лейкоцитарный профиль в образцах крови и снизило уровень нейтрофилов до 1,377×10⁹/л (p=0,034). Кроме того, в образцах крови мышей с ожоговыми ранами, не получавших лечения, было обнаружено заметное повышение концентрации тромбоцитов на 46%, хотя это изменение не было значительным (p=0,162), а применение астеррипептида С снизило его до исходного уровня (p=0,043). Примечательно, что гидрогель КМЦ и препарат сравнения Левомеколь не повлияли на показатели периферической крови мышей с ожоговыми ранами.

Таблица 1. Состав периферической крови мышей с ожоговыми ранами, получавших лекарственное средство, содержащее астеррипептид C

Показатель	Здоровые	Нелеченные	Астеррипептид С	КМЦ	Левомеколь
WBC, 109/л	6,447±1,526	6,813±1,985	4,750±1,208	4,983±0,818	6,397±1,970
Neu, 109/л	1,703±0,418	3,615±0,526*	1,377±0,471**	1,483±0,301	2,167±0,669
Lym, 109/л	4,167±0,708	3,597±0,230	3,073±0,681	3,150±0,630	3,847±1,217
Mon, 109/л	0,347±0,121	0,197±0,087	0,147±0,047	0,150±0,044	0,197±0,072
Eos, 109/л	0,230±0,070	0,190±0,075	0,150±0,026	0,197±0,072	0,187±0,042
Bas, 109/л	0,000±0,000	0,013±0,006	0,003±0,006	0,003±0,006	0,000±0,000
RBC, 1012/л	9,307±0,341	8,653±1,286	9,620±0,310	9,620±0,495	9,253±0,146
HGB, г/л	148,00±9,54	134,00±28,00	152,33±4,04	152,00±7,00	140,00±2,00
PLT, 109/л	376,00±69,60	549,33±73,71*	328,00±16,97**	524,00±73,54	468,00±167,1

Гидрогель на основе карбоксиметилцеллюлозы без активного вещества не ускорял заживление резанных ран, инфицированных S. aureus. Лекарственное средство, содержащее астеррипептид C, обеспечивало полное заживление через 11 дней, в то время как площадь необработанных ран составляла 19% от площади исходных ран. На 4-й день площадь необработанных ран уменьшилась на 41,4%, в то время как применение лекарственного средства, содержащего астеррипептид C в концентрации 0,5 мг/г, уменьшило площадь ран на 55,6%. На 7-й день площадь необработанных ран уменьшилась на 60,8%, а площадь ран, обработанных лекарственным средством, содержащим астеррипептид C, уменьшилась на 79,9%. Анализ периферической крови у мышей с инфицированными S. aureus резанными ранами проводился на 4-й и 12-й день. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Состав периферической крови мышей с ранами, инфицированными S. aureus, получавших лекарственное средство, содержащее астеррипептид C

Показатель	Здоровые	Нелеченные	Астеррипептид С	КМЦ	Левомеколь
4 день
WBC,109/л	4,463±1,042	5,820±2,260	4,820±1,000	5,680±0,612	4,557±1,330
Neu, 109/л	1,290±0,365	2,798±0,391*	1,953±0,534	2,057±0,283	1,870±0,678
Lym, 109/л	2,773±0,391	2,647±0,615	2,610±0,548	3,243±0,344	2,447±0,621
Mon, 109/л	0,197±0,115	0,277±0,096	0,133±0,029	0,227±0,091	0,130±0,010
Eos, 109/л	0,200±0,176	0,117±0,012	0,120±0,036	0,153±0,012	0,110±0,044
Bas, 109/л	0,003±0,006	0,000±0,000	0,003±0,006	0,000±0,000	0,000±0,000
RBC,1012/л	9,363±0,317	10,143±0,151	9,857±0,446	9,787±0,147	9,363±0,887
HGB, г/л	145,333±7,506	152,667±3,215	155,000±6,083	155,667±1,528	156,000±10,440
PLT, 109/л	377,333±47,606	587,667±34,686*	495,333±58,398	554,667±71,699	563,000±136,451
18 день
WBC,109/л	6,177±1,236	2,520±1,942*	4,535±0,932	4,497±0,391	4,397±0,569
Neu, 109/л	2,047±0,684	0,665±0,148*	1,370±0,303	1,687±0,505	1,857±0,559
Lym, 109/л	3,697±0,529	1,137±1,078	2,880±0,690	2,477±0,110	2,25±0,335
Mon, 109/л	0,243±0,049	0,170±0,069	0,155±0,029	0,163±0,035	0,137±0,035
Eos, 109/л	0,190±0,010	0,113±0,064	0,130±0,107	0,170±0,050	0,153±0,101
Bas, 109/л	0,000±0,000	0,000±0,000	0,000±0,005	0,000±0,000	0±0
RBC,1012/л	9,060±0,565	5,263±3,846	9,210±1,740	9,227±0,220	8,737±1,154
HGB, г/л	142,667±9,018	86,333±6,517*	155,000±24,069	147,333±3,055	137,333±16,773
PLT, 109/л	536,667±104,026	338,667±322,274	563,000±9,899	207,500±19,092	940,333±264,462

На 4-й день наблюдали значительное увеличение концентрации нейтрофилов в образцах периферической крови мышей с инфицированными S. aureus резанными ранами до 2,798×10⁹/л по сравнению с мышами без ран, у которых концентрация нейтрофилов составляла 1,290×10⁹ на литр (p=0,048). Лечение астеррипептидом С незначительно снизило концентрацию нейтрофилов до 1,953×10⁹/л (p=0,095) в образцах крови. Кроме того, в образцах крови мышей с инфицированными S. aureus резанными ранами было обнаружено значительное повышение концентрации тромбоцитов (p=0,023). Астеррипептид C вызвал незначительное снижение концентрации тромбоцитов (p=0,111). На 12-й день состав крови у мышей, не получавших лечения, с инфицированными S. aureus резанными ранами резко изменился. Концентрация лейкоцитов (WBC) снизилась вдвое (p=0,187), нейтрофилов (Neu) - на 67,5% (p=0,120), а лимфоцитов (Lym) - на 69,2% (p=0,305) по сравнению с неповреждёнными животными. Концентрация гемоглобина (Hb) в крови мышей с инфицированными ранами значительно снизилась до 86,333 г/л, в то время как в крови здоровых мышей она составляла 142,667 г/л (p=0,007). Применение астеррипептида C позволило приблизить показатели крови к уровню здоровых мышей. Уровень гемоглобина в крови у обработанных мышей составил 155,00 г/л (p=0,051), а лейкоцитарная формула была близка к норме. Несмотря на то, что большинство изменений в профилях крови не были значимыми (p>0,05), важно отметить негативное влияние инфекции S. aureus на периферическую кровь мышей и положительное влияние лекарственного средства, содержащего астеррипептид C.

Уровни цитокинов значительно повысились у мышей с ранами, заражёнными S. aureus (Фиг. 6). Инфекция S. aureus повысила уровень TNF-α на 16,3% (p=0,727) и 94,7% (p=0,0611) на 4-й и 12-й дни, соответственно. Астеррипептид C снизил уровень TNF-α на 36,4% (p=0,384) на 4-й день и на 41,0% (p=0,111) на 12-й день. S. aureus инфекция повысила уровень IL-18 на 187,1% (p=0,0846) и 69,4% (p=0,187) на 5-й и 12-й дни соответственно. Астеррипептид C снизил уровень IL-18 на 84,4% (p=0,0169) на 4-й день и на 71,9% (p=0,0542) на 12-й день.

Также была изучена бактериальная контаминация резных ран, инфицированных S. aureus. Данные представлены на Фиг. 7. Во всех экспериментах из необработанных резанных ран, инфицированных S. aureus, было выделено большое количество бактериальных колоний. Кроме того, в конце эксперимента некоторое количество колоний S. aureus (1-11 на образец) было выделено из образцов крови мышей, не получавших лечение. Лекарственное средство, содержащее астеррипептид C, быстро снизило заражение ран, и только одна колония S. aureus была выделена из всех образцов крови (n=6), полученных от мышей.

Claims (1)

1. Лекарственное средство для лечения ран, содержащее (3S,6R)-6-бензил-1-(циннамоил-L-пролил)-3-изопропилпиперазин-2,5-дион (астеррипептид С) из морского гриба Aspergillus terreus в концентрации 0,5 мг/г в гидрогеле карбоксиметилцеллюлозы.