RU2846219C1 - Тест-система и способ выявления геномной нестабильности локусов 9р24.1 и 16р13.13 при первичной медиастинальной B-клеточной крупноклеточной лимфоме - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описана тест-система для определения геномной нестабильности в регионах генов PD-L1/PD-L2 локус 9р24.1 и CIITA локус 16р13.13 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающая пул олигонуклеотидных пар разработанных праймеров. Также описан способ выявления неблагоприятного течения первичной медиастинальной В-клеточной крупноклеточной лимфомы с применением указанной тест-системы. Технический результат заключается в определении прогноза ПМВКЛ в дебюте заболевания путем выявления прогностически неблагоприятных генетических аномалий в опухолевой ткани и идентифицировании значимых маркеров эффективности/резистентности к иммунотерапии. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к молекулярно-генетическим методам диагностики и может применяться для выявления геномной нестабильности в локусах, важных для патогенеза первичной медиастинальной В-клеточной крупноклеточной лимфомы (ПМВКЛ).

Для ПМВКЛ характерен фенотип уклонения от иммунного ответа, который достигается за счет множественных конвергентных генетических механизмов, включая структурные изменения в 9p24.1, приводящие к экспрессии PD-L (CD274 [PD-L1- лиганд белка запрограммированной гибели клеток-1] и, в частности, PDCD1LG12 [PD-L2]), а также снижение иммуногенности опухолевых клеток при снижении экспрессии MHC-II (Major Histocompatibility Complex, главный комплекс гистосовместимости 2 класса), которая может быть следствием транслокаций и делеций с участием гена CIITA (Class II Major Histocompatibility Complex Transactivator, трансактиватор главного комплекса гистосовместимости II класса) (Mottok A. et al. Molecular classification of primary mediastinal large B-cell lymphoma using routinely available tissue specimens. Blood, 2018; 132(22), p. 2401–5, DOI: 10.1182/blood-2018-05-851154; Кузнецова С.А. и др. Характеристика цитогенетических и молекулярно-генетических нарушений гена CIITA у пациентов с первичной медиастинальной (тимической) В-крупноклеточной лимфомой. Клиническая онкогематология, 2021, 14(2), с. 173–8, DOI: 10.21320/2500-2139-2021-14-2-173-178).

Для ПМВКЛ на сегодняшний день отсутствуют стандартизированные системы прогноза. Отдельные клинические параметры, такие как плохое общее состояние по шкале ECOG, высокая концентрация ЛДГ, вовлечение мягких тканей и/или молочных желез, наличие экстрамедиастинального поражения согласно противоречивым сообщениям связаны с неудачей лечения (Hang H et al. Prognostic factors and clinical survival outcome in patients with primary mediastinal diffuse large B-cell lymphoma in rituximab era: A population-based study. Medicine (Baltimore), 2024, 103(8), p. e37238, DOI: 10.1097/MD.0000000000037238; Shih H.J. et al. Major impact of prognosis by age and sex in patients with primary mediastinal large B cell lymphoma. Oncol Lett., 2023, 27(2), p. 57, DOI: 10.3892/ol.2023.14190). Но клинические данные остаются ненадежным предиктором, так как результаты различных крупных исследований противоречат друг другу. В отличие от других неходжкинских лимфом, прогностическое значение аберраций TP53, MYC/8q24, BCL2/18q21, BCL6/3q27, del17p13 при ПМВКЛ не доказано (Noerenberg D. et al. Genetic Characterization of Primary Mediastinal B-Cell Lymphoma: Pathogenesis and Patient Outcomes. Journal of Clinical Oncology, 2024, 42 (4), p. 452–466, DOI: 10.1200/JCO.23.01053).

Несмотря на идентифицированные важные генетические события в патогенезе ПМВКЛ, в настоящее время надежные биомаркеры, позволяющие стратифицировать пациентов на группы риска, не определены, часть биомаркеров продемонстрировали предиктивную ценность только при низкоинтенсивной химиотерапии, программа R-DA-EPOCH нивелировала прогностическую роль многих описанных молекулярных нарушений (NOERENBERG D. et al. Genetic Characterization of Primary Mediastinal B-Cell Lymphoma: Pathogenesis and Patient Outcomes. Journal of Clinical Oncology, 2024, 42 (4), p. 452–466, DOI: 10.1200/JCO.23.01053).

Принимая во внимание особенности патогенеза ПМВКЛ, иммунологическую толерантность, а также тот факт, что иммунотерапия больных первично-рефрактерными формами ПМВКЛ эффективна только у половины пациентов, остро стоял вопрос о разработке эффективного и доступного диагностического метода определения маркеров высокого риска и в дальнейшем использование этих маркеров как предикторов эффективности/резистентности к иммунотерапии (Zinzani P.L. et al. Pembrolizumab in Relapsed or Refractory Primary Mediastinal Large B-Cell Lymphoma: Final Analysis of KEYNOTE-170. Blood Journal, 2023, 142(2), p. 141–145, DOI: 10.1182/blood.2022019340).

Цель настоящего изобретения заключается в обеспечении эффективного, доступного и простого способа выявления геномной нестабильности в локусах 9р24.1 и 16р13.13 опухолевой ДНК у больных ПМВКЛ.

При проведении исследований нами были выбраны два ключевых локуса, играющих роль в патогенезе и уклонении от иммунного ответа ПМВКЛ. Также был разработан набор праймеров для олигонуклеотидных микросателлитов, обеспечивающих специфическую амплификацию микросателлитных повторов локусов 9p24.1 и 16p13.13. Этот набор может быть использован в тест-системе для выявления изменения копийности исследуемых локусов в опухолевом геноме методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР). На рисунке 1 продемонстрирована хромосомная локализация исследуемых молекулярных маркеров.

Заявленный способ основан на сравнении интенсивности флуоресценции ПЦР-продуктов микросателлитных маркеров опухолевой ДНК с контрольным образцом геномной ДНК этого же пациента, выделенной из пула клеток без специфического поражения (мононуклеары периферической крови). Различные количественные изменения микросателлитных повторов в опухоли в сравнении с контрольным образцом могут проявляться аллельным дисбалансом (АД) и в подавляющем большинстве случаев являются следствием хромосомных нарушений (делеция, дупликация и т. д.). Сравнение проводят путем сопоставления интенсивности флуоресценции ПЦР-продуктов (высот пиков флуоресценции на электрофореграмме) амплифицированных фрагментов ДНК, соответствующих разным аллелям в парных образцах при разделении и визуализации ПЦР-продукта методами горизонтального электрофореза или капиллярного электрофореза.

Для повышения точности анализа, подтверждения и верификации выявленных изменений, результаты анализа микросателлитных повторов 15 больных ПМВКЛ сопоставили с результатами хромосомного микроматричного анализа (ХМА), выполненного независимой лабораторией (лаборатория молекулярной патологии «Геномед», Россия). Во всех случаях АД были выявлены хромосомные нарушения (амплификация, делеция, cnLOH), а образцы без АД были без аберраций анализируемых локусов по результатам ХМА.

Идентификация геномной нестабильности 9р24.1 и 16р13.13 представляется актуальной задачей как в практическом отношении диагностики прогностически неблагоприятных вариантов ПМВКЛ, так и с позиций поиска предикторов эффективности иммунотерапии.

Данная задача может быть решена при использовании следующих вариантов лабораторного анализа:

1) стандартное цитогенетическое исследование (СЦИ);

2) флуоресцентная гибридизация in situ (FISH);

3) хромосомный микроматричный анализ (ХМА);

4) полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Метод 1 наряду с известными преимуществами и широким распространением в рутинной практике для исследования многих гемобластозов имеет ряд недостатков:

- метод позволяет обнаруживать только крупные хромосомные аномалии. Мелкие делеции, дупликации, а также сбалансированные хромосомные нарушения, например, количественно-нейтральная потеря гетерозиготности (cnLOH), не обнаруживаются;

- СЦИ требует значительного времени для культивирования клеток и подготовки метафазных пластинок;

- для успешного анализа необходимы нативные образцы с высокой митотической активностью. Это ограничивает использование образцов с низкой клеточностью и архивных материалов, в том числе замороженных и заключенных в парафин образцов. Из-за низкой митотической активности опухолевых клеток всех типов лимфом стандартное цитогенетическое исследование затруднено.

Метод 2. Несмотря на наличие коммерчески доступных флуоресцентных зондов для регионов 9p24.1 (PD-L1 (CD274) FISH Probe производства компании Empire Genomics (США) и Cytocell PD-L1 (CD274) Probe производства компании Cytocell (Oxford Gene Technology, Великобритания)) и 16p13.13 (CIITA Break Apart FISH Probe производства компании Empire Genomics (США)), их применение в методе FISH для диагностики геномной нестабильности при ПМВКЛ ограничено рядом существенных недостатков:

- метод требует приобретения флуоресцентно меченных ДНК-зондов, специфичных для интересующих генов или хромосомных регионов. Это увеличивает стоимость и сложность подготовки к исследованию;

- для исследования нескольких локусов требуется проведение множественных экспериментов, что увеличивает время и расходы;

- метод чувствителен к качеству и сохранности тканей. Архивные образцы, такие как парафиновые блоки с деградированной ДНК, могут быть непригодны для FISH-анализа;

- FISH может не выявить генетические изменения, если они присутствуют в небольшом проценте клеток. Это затрудняет обнаружение мозаичных и субклональных популяций опухолевых клеток;

- FISH позволяет выявлять только те генетические изменения, для которых разработаны специфические зонды. Неизвестные или редкие аномалии остаются невыявленными;

- метод эффективен для обнаружения крупных хромосомных перестроек, но не может детектировать мелкие делеции или точечные мутации.

Метод 3 позволяет максимально полно оценить количественные изменения в геноме, но пока не доступен в рутинной практике:

- анализ одного образца с помощью ХМА является дорогостоящим из-за стоимости микроматричных чипов, оборудования и программного обеспечения для анализа данных;

- метод требует значительного количества высококачественной ДНК, что может быть проблематично при работе с малоклеточными или деградированными образцами, такими как парафиновые блоки;

- результаты ХМА генерируют большой объем данных, требующий специализированного программного обеспечения и экспертизы для корректной интерпретации, что может привести к длительному времени анализа.

Метод 4, заключающийся в амплификации методом ПЦР коротких высокополиморфных последовательностей ДНК, расположенных на 9р24.1 и 16р13.13, имеет ряд преимуществ в идентификации геномной нестабильности интересуемых локусов:

- значительно снижает стоимость исследования за счет отсутствия необходимости в дорогостоящих зондах, реактивах и оборудовании;

- методика отличается относительной простотой выполнения и возможностью воспроизведения в большинстве молекулярно-генетических лабораторий;

- разработанный метод основан на использовании праймеров к коротким ДНК-мишеням, что позволяет проводить амплификацию даже на деградированной ДНК из архивных материалов (например, парафиновых блоков);

- мультиплексная ПЦР позволяет одновременно исследовать несколько генетических маркеров, что сокращает время исследования.

Таким образом, данный вариант решения поставленной задачи максимально соответствует требованиям высокой чувствительности анализа, экономической доступности и простоты технической реализации и воспроизводимости лабораторного исследования.

Использование в клинической практике заявляемого способа позволяет в том числе достичь следующих технических результатов:

1. определить прогноз ПМВКЛ в дебюте заболевания путем выявления прогностически неблагоприятных генетических аномалий в опухолевой ткани;

2. идентифицировать значимые маркеры эффективности/резистентности к иммунотерапии.

Сущность группы изобретений заключается в следующем.

Заявленная тест-система предназначена для определения геномной нестабильности в регионах генов PD-L1/PD-L2 (локус 9р24.1) и CIITA (локус 16р13.13) методом ПЦР и состоит из:

− пула олигонуклеотидных пар праймеров:

TTAT9-F: 5'- GGCATCTGCTTTGACCATGA -3',

TTAT9-R: 5'-FAM-AGTAGTGAGCCGAGATCTTG -3',

GT9-F: 5'- TCCATGTTGCCACAAATGACA -3',

GT9-R: 5'- FAM-GAGGCTGTGGGTGGGACGAT -3',

CA16-F: 5'- FAM-TGCATTGTTGCATCCAGCCT -3',

CA16-R: 5'- СATAACCACGCACGCACCCT -3',

GT16-F: 5'- FAM-CCAGCCCAGCACTGTGACCT -3',

GT16-R: 5'- CCTGGTCAAAAAACATGCCA-3',

разделенного на 4 смеси пар праймеров: 1 смесь – TTAT9, 2 смесь- GT9, 3 смесь – CA16, 4 смесь – GT16;

− реактивов для проведения ПЦР: 10х ПЦР-Буфер, смесь dNTP, раствор MgCl₂, Taq-полимераза, деионизированная вода.

Заявленный способ предназначен для выявления неблагоприятного течения ПМВКЛ у пациента по наличию геномной нестабильности в регионах генов PD-L1/PD-L2 и CIITA с помощью заявленной тест-системы и включает следующие этапы:

− сбор и подготовку парных образцов опухоли и контрольной ткани;

− выделение ДНК;

− проведение мультиплексной ПЦР с помощью указанной тест-системы для каждого образца при условиях, исключающих вероятность взаимного отжига и образования димеров и с учетом лучшей визуализации отдельных ПЦР-продуктов:

первичная денатурация 95°С 2 минуты,

28 циклов денатурации при 96°С 10 секунд, отжига при 58°С 30 секунд,

элонгации при 72°С 30 секунд,

заключительная элонгация при 68°С 10 минут;

- смешивание продуктов амплификации в разведении 1:60-100 с формамидом в соотношении 1:3 и денатурирование при 95°С в течение 3 минут;

- фрагментный анализ на основе капиллярного электрофореза на генетическом анализаторе;

− анализ полученных данных: наличие геномной нестабильности в регионах генов PD-L1/PD-L2 и CIITA в случае гетерозиготного наследования на основании отсутствия пиков одного из аллелей или уменьшения интенсивности его флуоресценции по отношению к пику второго аллеля соответствующего микросателлитного локуса в опухолевой ткани при сравнении с контрольным образцом выявляет неблагоприятное течение ПМВКЛ у пациента.

В качестве образца опухолевой ткани допустимо использование фрагментов опухолевого биоптата, срезов с парафиновых блоков с последующей депарафинизацией, а также клеток периферической крови или аспирата костного мозга в случае вовлечения их в опухолевый процесс. В качестве парного нормального образца используют клетки периферической крови того же пациента, а в случае лейкемизации - клетки буккального эпителия.

К локусам 9р24.1 (TTAT9 и GT9) и 16р13.13 (CA16 и GT16) были подобраны оригинальные специфичные пары олигонуклеотидов, ранее не описанные в литературе. В таблице 1 представлены данные о праймерах и анализируемых STR.

Таблица 1. Состав и характеристика праймеров к локусам 9р24.1 (GT9 и TTAT9) и 16р13.13 (CA16 и GT16), включенных в исследование.

Набор праймеров	Прямой (5’-3’)	Обратный (5’-3’)	Гетерозиготность, %	Длина ПЦР-продукта, п.н.
TTAT9	GGCATCTGCTTTGACCATGA (SEQ ID NO: 1)	FAM-AGTAGTGAGCCGAGATCTTG (SEQ ID NO: 2)	73,6	222-226
GT9	TCCATGTTGCCACAAATGACA (SEQ ID NO: 3)	FAM-GAGGCTGTGGGTGGGACGAT (SEQ ID NO: 4)	60,5	230-240
CA16	FAM-TGCATTGTTGCATCCAGCCT (SEQ ID NO: 5)	СATAACCACGCACGCACCCT (SEQ ID NO: 6)	81,6	171-181
GT16	FAM-CCAGCCCAGCACTGTGACCT (SEQ ID NO: 7)	CCTGGTCAAAAAACATGCCA (SEQ ID NO: 8)	68,4	490-500

Состав тест-системы:

1) пары прямого и обратного праймеров к 4 микросателлитным маркерам cоответственно 4 реакционным смесям

1 пара - локус TTAT9 (прямой праймер SEQ ID NO: 1, 10 пмоль/мкл; обратный праймер SEQ ID NO: 2, меченный FAM, 10 пмоль/л);

2 пара - локус GT9 (прямой праймер SEQ ID NO: 3, 10 пмоль/мкл; обратный праймер SEQ ID NO: 4, меченный FAM, 10 пмоль/л).

3 пара - локус СA16 (прямой праймер SEQ ID NO: 5, меченный FAM, 10 пмоль/мкл; обратный праймер SEQ ID NO: 6, 10 пмоль/л);

4 пара - локус GT16 (прямой праймер SEQ ID NO: 7, меченный FAM, 10 пмоль/мкл; обратный праймер SEQ ID NO: 8, 10 пмоль/л).

Каждой паре соответствует одна пробирка со смесью праймеров, которую подготавливают путем смешивания стоков синтезированных олигонуклеотидов в приведенных концентрациях, обеспечивающих наиболее благоприятные условия проведения ПЦР. Объем каждой готовой смеси пар праймеров, необходимой для анализа одного образца, - 2 мкл.

2) Реактивы для проведения мультиплексной ПЦР:

- 10х ПЦР-Буфер в пробирках по 500 мкл из расчета 1 пробирка на 200 реакций;

- смесь dNTP (концентрация каждого дезоксинуклеотидтрифосфата 25 мМ) в пробирках по 500 мкл из расчета 1 пробирка на 200 реакций;

- 25 мМ раствор MgCl₂ в пробирках по 500 мкл из расчета 1 пробирка на 300 реакций;

- Taq-полимераза 5 ед./мкл в пробирках по 1000 мкл из расчета 1 пробирка на 4000 реакций;

- деионизированная вода во флаконах по 50 мл из расчета 1 флакон на 3400 реакций.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что определяют изменения совокупности 4 микросателлитных маркеров тест-системы.

При реализации способа осуществляют анализ изменений микросателлитных локусов ДНК в образце опухолевой ткани при сравнении с контрольным образцом методом ПЦР на основании последующего анализа длин ПЦР-продуктов.

Амплификация исследуемых локусов производится в 4 реакционных смесях методом ПЦР.

Заявляемый способ осуществляется согласно описанной далее методике.

1. Подготовка материалов и компонентов

Исследуемый материал представлен образцом опухолевой ткани, в качестве которого допустимо использование следующих источников:

- фрагмент опухолевого биоптата (объемом не менее 0,5 мм³);

- срезы с парафиновых блоков (в количестве от 2 до 10 при толщине среза 10 мкм в зависимости от объема заключенного материала) с последующей депарафинизацией согласно стандартным методикам;

- клетки периферической крови или аспирата костного мозга при доказанном иными методами наличия лейкемизации или вовлечения в опухолевый процесс костного мозга (10 мл в пробирке с раствором ЭДТА).

Доля опухолевых клеток от общей клеточности образца должна быть не менее 30%, что определено чувствительностью молекулярного исследования.

В качестве отрицательного контроля используют внесение в состав реакционной смеси ПЦР деионизированный воды вместо матрицы ДНК.

В качестве парного нормального образца в параллельном исследовании целесообразно использовать клетки периферической крови того же пациента, а в случае лейкемизации - клетки буккального эпителия, что обеспечивает наличие контроля и достоверность анализа.

Фрагменты опухолевых биоптатов могут быть взяты в работу непосредственно после выполнения биопсии или после замораживания при температуре не выше минус 30°С без использования криоконсерванта.

2. Выделение ДНК из опухолевой ткани биоптатов и депарафинизированных срезов. Подготовку проводят по изложенной ранее методике (Sidorova J.V. et al. A simple and efficient method for DNA extraction from skin and paraffin-embedded tissues applicable to T-cell clonality assays. Exp Dermatol., 2012, 21(1), p. 57–60, DOI: 10.1111/j.1600-0625.2011.01375). Забор клеток аспирата костного мозга или периферической крови осуществляют в 10 мл пробирку с раствором ЭДТА. Выделение ДНК проводят по любой из стандартных методик.

ПЦР проводят в составе реакционной смеси путем смешивания следующих компонентов в 0,2 мл микропробирках:

− 2,5 мкл 10х буфера (ПЦР-Буфер);

− 2,5 мкл смеси dNTP (концентрация каждого дезоксинуклеотидтрифосфата 25 мМ);

− 1,5 мкл 25 мМ раствора MgCl₂;

− не менее 20 нг геномной ДНК (в среднем в объеме водного раствора от 2 мкл до 5 мкл);

− 2 мкл одной из 4 смеси пар праймеров;

− 2,5 ед. Taq-полимеразы;

− деионизированная вода до общего объема реакционной смеси 25 мкл.

3. Постановка реакции

ПЦР проводят при следующих условиях:

− первичная денатурация 95°С 2 минуты;

− 28 циклов денатурации при 96°С 10 секунд, отжига при 58°С 30 секунд,

− элонгации при 72°С 30 секунд;

− заключительная элонгация при 68°С 10 минут.

4. Учет результатов

Продукты амплификации в разведении 1:60-100 смешивают с формамидом в соотношении 1:3 и денатурируют при 95°С в течение 3 минут, после чего проводят фрагментный анализ на основе капиллярного электрофореза на генетическом анализаторе. Авторами заявленного изобретения был использован генетический анализатор Нанофор-05 (ООО "СИНТОЛ", Россия), при этом можно использовать любой аналогичный анализатор.

5. Интерпретация результатов

Наличие геномной нестабильности в локусах 9р24.1 и 16р13.13 определяют в случае гетерозиготного наследования на основании отсутствия пиков одного из аллелей или уменьшения интенсивности его флуоресценции по отношению к пику второго аллеля соответствующего микросателлитного локуса в опухолевой ткани при сравнении с контрольным образцом.

На рисунках 2-7 отображены электрофореграммы, полученные при анализе исследуемых маркеров. Наличие геномной нестабильности в регионах генов PD-L1/PD-L2 (9р24.1) и CIITA (16р13.13) у пациента с ПМВКЛ подтверждает иммунопривилегированный статус и, потенциально, свидетельствует о неблагоприятном прогнозе ПМВКЛ.

Сущность группы изобретений пояснена клиническими примерами:

Клинический пример 1. Пациентка В. Диагноз: ПМВКЛ, 6 курсов химиотерапии 1 линии (R-DA-EPOCH), прогрессия, химиотерапия 2 линии с включением иммунотерапии (Nivo-Dexa-Beam №2), полная ремиссия более 7 месяцев. СЦИ в дебюте заболевания не было выполнено в связи с отсутствием достаточного количества опухолевых клеток. На Рис. 2 и 5 представлены результаты исследования панели микросателлитных локусов 9р24.1 и 16р13.13 в контрольном и опухолевом образцах пациентки В., а также примеры электрофореграмм отдельных локусов. По двум микросателлитным локусам (TTAT9, GT16) в опухолевой ткани отмечена утрата одного из аллелей, что свидетельствует о наличии геномной нестабильности. По данным СЦИ биоптата опухоли, взятого при прогрессии: анализ затруднен в связи с единичными митозами низкого качества, был выявлен клон гипердиплоидным набором хромосом и комплексными перестройками кариотипа: дополнительными хромосомами 12,18,9,4, дериватами хромосом 9,16, маркерными хромосомами (47-50, ХХ,?+4,+9, der(9), ?+12, der(16)x2,?+18,+1-2mar, inc[cp5]/46,XX[3]). Мутация в гене TP53 не была обнаружена ни в дебюте заболевания, ни в прогрессии. В рассмотренном примере молекулярное исследование выявило геномную нестабильность по всем анализируемым маркерам, указывающим на иммунологическую толерантность, в дальнейшем у пациентки достигнута полная ремиссия после иммунотерапии. Проведенный анализ микросателлитного профиля подтвердил неблагоприятный прогноз течения заболевания.

Клинический пример 2. Пациент Е. ПМВКЛ, 4 курса высокодозной химиотерапии 1 линии (Rm-NHL-BFM-90), прогрессия заболевания, химиотерапия 2 линии (R-GIDOX№1), смерть в результате рефрактерного течения заболевания. На Рис. 3 и 7 представлены результаты исследования панели микросателлитных локусов в контрольном и опухолевом образцах пациента Е. По двум микросателлитным локусам (GT9, CA16) в опухолевой ткани отмечена утрата одного из аллелей, что свидетельствует о наличии геномной нестабильности.

В связи с отсутствием митозов в биоптате опухоли СЦИ не было выполнено. В практическом отношении у данного пациента с геномной нестабильностью в локусах, указывающих на иммунологическую толерантность, опухолевый клон оказался не чувствительным к проводимой высокодозной химиотерапии. Проведенный анализ микросателлитного профиля подтвердил неблагоприятный прогноз течения ПМВКЛ.

Клинический пример 3. Пациентка Б. ПМВКЛ, 6 курсов химиотерапии 1 линии (R-DA-EPOCH), полная ремиссия более 24 месяцев. На Рис. 4 и 6 представлены результаты исследования панели микросателлитных локусов в контрольном и опухолевом образцах пациентки Б. У данной пациентки при исследовании микросателлитного профиля не были выявлены аберрации микросателлитных повторов локусов 9р24.1 и 16р13.13, что предполагает благоприятный прогноз заболевания. Данная пациентка находится в длительной полной ремиссии.

Таким образом, проведенные авторами исследования позволили определить набор олигонуклеотидных праймеров, разработать диагностическую тест-систему для выявления геномной нестабильности в локусах 9р24.1 и 16р13.13 опухолевой ДНК и способ выявления пациентов с возможным риском неблагоприятного течения ПМВКЛ, что реализуется путем выполнения мультиплексной ПЦР с набором пар олигонуклеотидных праймеров для амплификации локусов 9р24.1 и 16р13.13 и последующего фрагментного анализа ПЦР-продуктов. Требуется расширение исследования для уточнения неблагоприятного прогноза ПМВКЛ, выполнение исследования в группе больных ПМВКЛ, получивших иммунотерапию в первой линии и оценки эффективности иммунотерапии у больных с геномной нестабильностью в анализируемых локусах.

Перечень последовательностей:

1. SEQ ID NO: 1 последовательность нуклеотидов ДНК Homo sapiens, прямой праймер к локусу TTAT9:

GGCATCTGCTTTGACCATGA

2. SEQ ID NO: 2 последовательность нуклеотидов ДНК Homo sapiens, обратный праймер к локусу TTAT9

FAM-AGTAGTGAGCCGAGATCTTG

3. SEQ ID NO: 3 последовательность нуклеотидов ДНК Homo sapiens, прямой праймер к локусу GT9

TCCATGTTGCCACAAATGACA

4. SEQ ID NO: 4 последовательность нуклеотидов ДНК Homo sapiens, обратный праймер к локусу GT9

FAM-GAGGCTGTGGGTGGGACGAT

5. SEQ ID NO: 5 последовательность нуклеотидов ДНК Homo sapiens, прямой праймер к локусу CA16

FAM-TGCATTGTTGCATCCAGCCT

6. SEQ ID NO: 6 последовательность нуклеотидов ДНК Homo sapiens, обратный праймер к локусу CA16

СATAACCACGCACGCACCCT

7. SEQ ID NO: 7 последовательность нуклеотидов ДНК Homo sapiens, прямой праймер к локусу GT16

FAM-CCAGCCCAGCACTGTGACCT

8. SEQ ID NO: 8 последовательность нуклеотидов ДНК Homo sapiens, обратный праймер к локусу GT16

CCTGGTCAAAAAACATGCCA

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2025-01-21"

softwareVersion="2.3.0" softwareName="WIPO Sequence"

fileName="Перечень последовательностей.xml" dtdVersion="V1_3"

originalFreeTextLanguageCode="ru">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText/>

<FilingDate/>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский

центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации,

RU</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Institution "National

Medical Rasearch Center of Hematology" of the Ministry of Healthcare

of the Russion Federation</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Тест-система и способ выявления

геномной нестабильности локусов 9р24.1 и 16р13.13 при первичной

медиастинальной В-клеточной крупноклеточной лимфоме</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q17">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggcatctgctttgaccatga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agtagtgagccgagatcttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tccatgttgccacaaatgaca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaggctgtgggtgggacgat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgcattgttgcatccagcct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q19">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cataaccacgcacgcaccct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccagcccagcactgtgacct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cctggtcaaaaaacatgcca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims (25)

1. Тест-система для определения геномной нестабильности в регионах генов PD-L1/PD-L2 локус 9р24.1 и CIITA локус 16р13.13 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), состоящая из:

пула олигонуклеотидных пар праймеров

TTAT9-F: 5'- GGCATCTGCTTTGACCATGA -3',

TTAT9-R: 5'- FAM-AGTAGTGAGCCGAGATCTTG -3',

GT9-F: 5'- TCCATGTTGCCACAAATGACA -3',

GT9-R: 5'- FAM-GAGGCTGTGGGTGGGACGAT -3',

CA16-F: 5'- FAM-TGCATTGTTGCATCCAGCCT -3',

CA16-R: 5'- СATAACCACGCACGCACCCT -3',

GT16-F: 5'- FAM-CCAGCCCAGCACTGTGACCT -3',

GT16-R: 5'- CCTGGTCAAAAAACATGCCA -3',

разделенного на 4 смеси пар праймеров: 1 смесь - TTAT9, 2 смесь - GT9, 3 смесь - CA16, 4 смесь - GT16;

реактивов для проведения ПЦР: 10х ПЦР-буфер, смесь dNTP, раствор MgCl₂, Taq-полимераза, деионизированная вода.

2. Способ выявления неблагоприятного течения первичной медиастинальной В-клеточной крупноклеточной лимфомы (ПМВКЛ) у пациента по наличию геномной нестабильности в регионах генов PD-L1/PD-L2 и CIITA с помощью тест-системы по п. 1, включающий следующие этапы:

сбор и подготовку парных образцов опухоли и контрольной ткани;

выделение ДНК;

проведение мультиплексной ПЦР с помощью тест-системы по п. 1 для каждого образца при условиях, исключающих вероятность взаимного отжига и образования димеров, и с учетом лучшей визуализации отдельных ПЦР-продуктов:

первичная денатурация 95°С 2 минуты,

28 циклов денатурации при 96°С 10 секунд, отжига при 58°С 30 секунд,

элонгации при 72°С 30 секунд,

заключительная элонгация при 68°С 10 минут;

смешивание продуктов амплификации в разведении 1:60-100 с формамидом в соотношении 1:3 и денатурирование при 95°С в течение 3 минут;

фрагментный анализ на основе капиллярного электрофореза на генетическом анализаторе;

анализ полученных данных: наличие геномной нестабильности в регионах генов PD-L1/PD-L и CIITA в случае гетерозиготного наследования на основании отсутствия пиков одного из аллелей или уменьшения интенсивности его флуоресценции по отношению к пику второго аллеля соответствующего микросателлитного локуса в опухолевой ткани при сравнении с контрольным образцом выявляет неблагоприятное течение ПМВКЛ у пациента.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве образца опухолевой ткани допустимо использование фрагментов опухолевого биоптата, срезов с парафиновых блоков с последующей депарафинизацией, а также клеток периферической крови или аспирата костного мозга в случае вовлечения их в опухолевый процесс.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве парного нормального образца используют клетки периферической крови того же пациента, а в случае лейкемизации - клетки буккального эпителия.