RU2834909C1

RU2834909C1 - Способ выявления РНК вируса Mammarenavirus guanaritoense методом рекомбиназной полимеразной амплификации

Info

Publication number: RU2834909C1
Application number: RU2024114589A
Authority: RU
Inventors: Марина Анатольевна Капитонова; Анна Вячеславовна Шабалина; Владимир Георгиевич Дедков; Анна Сергеевна Долгова
Filing date: 2024-05-28
Publication date: 2025-02-17

Abstract

Изобретение относится к медицинской биотехнологии. Предложен способ выявления вируса Mammarenavirus guanaritoense методом изотермической рекомбиназной полимеразной амплификацией с обратной транскрипцией в реальном времени. Способ включает экстракцию PHК из биологических образцов, проведение анализа с использованием обратной транскриптазы M-MuLV, специфических праймеров RPA_GTOV_F5'-AAAAGCTTGAAGCCCTCTGTTAAGACCATCGG-3', RPA_GTOV_R5'-CGAAATTTGACAATGGATGAAAAAGTTGTAGTT-3', и флуоресцентно-меченного ДНК-зонда Exo_GTOV5'-GCAATGCCTCCTTCTGATAAGACAGTTCAGG[FAM-dT]A[dSpacer]A[BHQ1-dT]CAGGTACTTGCCTTC[3'-C3-спейсер]-3'. В качестве модификации [dSpacer] применяют соединение dSpacer СЕ фосфорамидит=5'-O-диметокситритил-1',2'-дидезоксирибоза-3'-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит. Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия отличия кривой флуоресценции пробы от отрицательного контрольного образца, не содержащего РНК Mammarenavirus guanaritoense. Результат считается положительным, если значение флуоресцентного сигнала возрастает со временем и конечное значение к 30 минуте анализа превышает значение в образце отрицательного контроля. Способ позволяет быстро и достоверно идентифицировать генетический материал вируса Mammarenavirus guanaritoense в биологических образцах и других вируссодержащих пробах. 1 ил., 2 табл.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к диагностике инфекционных заболеваний, в частности к проблеме выявления генетических маркеров вируса Mammarenavirus guanaritoense (GTOV).

РНК-содержащий вирус Mammarenavirus guanaritoense принадлежит роду Mammarenavirus, семейству Arenaviridae, относится к I группе патогенности (BSL-4), является возбудителем Венесуэльской геморрагической лихорадки (ВГЛ). Естественным резервуаром данного вируса являются грызуны Zygodontomys brevicauda, распространенные в восточной части Центральной Америки и в северной части Южной Америки. Изоляты GTOV также были обнаружены в Oligoryzomys delicatus и Sigmodon alstoni.

В период с 1989 года до 2006 известно о 618 случаях заражения GTOV. Из-за политического и экономического кризиса в Венесуэле в 2006-2021 годах эпидемиологические исследования практически не проводились. С 2021 года по настоящее время в штатах Венесуэлы Баринас и Португеса зарегистрировано 36 подтвержденных и 118 предположительных случаев заражения GTOV. Группой риска заражения являются рабочие фермерских хозяйств в областях распространенности данных грызунов.

Инкубационный период составляет 3-12 дней, летальность ВГЛ оценена в 33,3%. Наиболее распространенными симптомами ВГЛ являются лихорадка, головная боль, кашель, боль в горле, тошнота, рвота, диарея, носовое кровотечение, кровоточивость десен, меноррагия и мелена. Смерть происходит чаще всего вследствие диффузного отека легких и развития геморрагических симптомов. На данный момент не существует вакцинации против GTOV, а также эффективного лечения ВГЛ.

Симптоматически ВГЛ не отличается от других геморрагических лихорадок Южной Америки, анализы на общие показатели крови также не позволяют определить болезнь. Идентификация вируса возможна только при помощи лабораторных методов.

Для обнаружения вируса М. guanaritoense методами вирусной изоляции и культивирования и реакцией нейтрализации необходим наивысший уровень биобезопасности лаборатории BSL-4, утвержденный только в ограниченном количестве лабораторий в мире (https://doi.org/10.1007/s00705-022-05453-3), что является значительным препятствием для их применения.

Согласно Центру по контролю и профилактике заболеваний США (https://ndc.services.cdc.gov/case-definitions/viral-hemorrhagic-fever-2022/) вирусные геморрагические лихорадки обычно диагностируются методами иммуноферментного анализа (ИФА), вирусной изоляцией в клетках культуры из крови или тканей, иммуногистохимией и детектирование специфической РНК вируса методом ПЦР с обратной транскрипцией из крови или тканей.

Недостатком тестирование крови на иммуноглобулины М (IgM) является возможная неспецифичность реакции относительно геморрагических лихорадок, вызываемых другими аренавирусами (doi: 10.1007/s00705-022-05453-3).

Примером теста ИФА на GTOV является https://cnphi.canada.ca/gts/reference-diagnostic-test/4607?labId=1021, рекомендуемый системой здравоохранения Канады. Среди его недостатков можно выделить длительное время анализа - 14 дней.

Кроме того известным недостатком любого метода, основанного на выявлении антител IgM и IgG, является сам принцип работы метода, а именно выявление иммунной реакции организма на возбудитель заболевания, а не самого возбудителя (Основы иммуноанализа: учебное пособие / Н.Е. Максимова, Н.Н. Мочульская, В.В. Емельянов; под общ. ред. Н.Н. Мочульской; Министерство науки и высшего образования Российской Федерации, Уральский федеральный университет. - Екатеринбург: Изд-во Урал, ун-та, 2021. - 148 с.: ил. - Библиогр.: с. 147. - 30 экз. - ISBN 978-5-7996-3295-3).

Примером анализа на основе ПЦР может служить система, применяемая в Викторианской референс-лаборатории по диагностике инфекционных заболеваний в Австралии (Victorian Infectious Diseases Reference Laboratory) (https://www.vidrl.org.au/resources/test-handbook/tests/guanarito-virus-pcr/). Преимуществом анализа ПЦР является прямое специфическое выявление генетических маркеров вируса. Известным недостатком данного метода анализа является потребность в специальном оборудовании - амплификаторов и длительном времени анализа, занимаемого обычно более 1 часа, например, в системе мультиплексной ПЦР реального времени с обратной транскрипцией (https://doi.org/10.4269/ajtmh.2010.09-0636).

В России на данный момент не существует зарегистрированных тест-систем на основе ИФА или ПЦР для достоверной диагностики вируса М. guanaritoense.

Изобретение направлено на расширение арсенала средств, используемых для диагностики, контроля и профилактики возможных будущих эпидемий.

Технический результат - разработка быстрого и достоверного способа идентификации генетического материала вируса Mammarenavirus guanaritoense в биологических образцах и других вируссодержащих пробах.

Поставленная задача решалась следующим путем:

1) конструирование диагностических праймеров и специфического флуоресцентно-меченного зонда на консервативный участок гена L-сегмента РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса;

2) конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК и получение транскрибированной РНК, несущий специфический участок РНК-матрицы;

3) оптимизация компонентов реакционной смеси и условий проведения анализа рекомбиназной полимеразной амплификации с обратной транскрипцией в реальном времени.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на ФИГ. 1 представлены кривые флуоресценции, полученные в программе прибора CFX96 Touch (Bio-Rad, США) для случаев образцов с разведением РНК К+.

Отрицательный контрольный образец, не содержащий РНК вируса GTOV, изображен красным цветом. В нем нет существенного роста флуоресцентного сигнала. Образцы, содержащие К+ в различных разведениях изображены следующими цветами: 100 копий/мкл - зеленый, 1000 копий/мкл - синий, 10000 копий/мкл - черный. В случаях более концентрированных образцов наблюдается значительный рост сигнала. Конечная точка значения флуоресценции на 30 минуте анализа превышает значение отрицательного контроля. Поэтому результаты анализа образцов, содержащих РНК К+ в указанных концентрациях, интерпретируются как положительные.

Данный метод основан на определении наличия РНК вируса М. guanaritoense, выделенной из биологических образцов, по флуоресцентному сигналу при помощи реакции рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA) с обратной транскрипцией в режиме «реального времени» с использованием специфических праймеров и флуоресцентно-меченного зонда. Результатом применения данного метода является изменение зависимости флуоресцентного сигнала от времени. Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора, способного считывать флуоресцентный сигнал от красителя FAM в изотермических условиях при +39°С в режиме «реального времени». Примером такого прибора является амплификатор CFX96 Touch (Bio-Rad, США). Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия отличия кривой флуоресценции пробы от отрицательного контрольного образца, не содержащего РНК GTOV. Причем результат считается положительным, если значение флуоресцентного сигнала возрастает со временем и конечное значение к 30 минуте анализа превышает значение в образце отрицательного контроля. При большой концентрации РНК GTOV в образце флуоресцентный сигнал может иметь характерный вид резкого возрастания с достижением насыщения.

Преимуществом представленного метода обнаружения РНК вируса М. guanaritoense методом рекомбиназной полимеразной амплификацией с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-RPA ехо) над ПЦР с обратной транскрипцией является отсутствие необходимости в термоциклерах или амплификаторах "реального времени", поскольку все реакции протекают при одной температуре +39°С. Кроме того время анализа RT-RPA ехо составляет 30 минут, в то время как ПЦР реального времени с обратной транскрипцией обычно занимает больше часа.

На начальном этапе были подобраны и синтезированы пара специфических олигонуклеотидных праймеров и специфический флуоресцентно-меченный зонд с модификациями. Для этого в базе данных NCBI Mega BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) на основе анализа всех последовательностей был выбран наиболее уникальный и консервативный участок генома вируса М. guanaritoense - фрагмент гена, кодирующего L-сегмент РНК-зависимой РНК-полимеразы, длиной 149 пар нуклеотидов. Подбор олигонуклеотидных праймеров и зонда проводился согласно рекомендациям TwistAmp® DNA Amplification Kits, Assay Design Manual и анализировался с использованием программного обеспечения Multiple Primer Analyzer (Thermo Fisher Scientific) и SnapGene. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда представлены в Таблице 1.

Обозначение модификаций:

• [FAM-dT]=флуоресцеин-dT фосфорамидит=5'-Диметокситритилокси-5-[N-((3',6'-дипивалоилфлуоресцеинил)-аминогексил)-3-акрилимидо]-2'-дезоксиуридин-3'-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит / Fluorescein-dT Phosphoramidite=5'-Dimethoxytrityloxy-5-[N-((3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-aminohexyl)-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite;

• [dSpacer]=dSpacer СЕ фосфорамидит=5'-O-диметокситритил-1',2'-дидезоксирибоза-3'-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит / dSpacer СЕ Phosphoramidite=5'-O-Dimethoxytrityl-1',2'-Dideoxyribose-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite;

• [BHQ1-dT]=BHQ1-dT фосфорамидит=5'-диметокситритилокси-5-[(N-4''-карбоксиэтил-4''-(N-этил)-4'-(2-нитро-4-толуилдиазо)-2'-метокси-5'-метил-азобензол)-аминогексил-3-акрилимидо]-2'-дезоксиуридин-3'-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит / BHQ1-dT Phosphoramidite=5'-Dimethoxytrityloxy-5-[(N-4''-carboxyethyl-4''-(N-ethyl)-4'-(2-Nitro-4-toluyldiazo)-2'-methoxy-5'-methyl-azobenzene)-aminohexyl-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite.

• [3'-С3-спейсер]=Спейсер фосфорамидит С3=3-(4,4'-диметокситритилокси)пропил-1-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит / Spacer Phosphoramidite С3=3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite.

Для контроля качества прохождения диагностики в состав методики был введен положительный контрольный образец K+. Матрицу для создания рекомбинантного положительного контрольного образца получали синтетическим методом на основе ампликона, включающего в себя диагностическую область-мишень и фланкирующие последовательности нуклеотидов. Ампликон получали методом ПЦР в один шаг. Конечный ПЦР-продукт лигировали в плазмидный вектор рЕТ под контролем промотора Т7 РНК полимеразы и трансформировали им Escherichia coli (штамм Turbo, New England BioLabs, США). Рекомбинантные плазмиды из индивидуальных клонов проверяли на правильность ориентации целевой последовательности и отсутствие мутаций в области посадки праймеров и специфического зонда. Проверку осуществляли методом секвенирования по Сэнгеру с помощью прибора для автоматического капиллярного секвенирования ABI PRISM 3500x1 (Applied Biosystems, США). Соответствующие заданным критериям рекомбинантные плазмиды использовали для приготовления положительного контрольного образца К+, который представляет собой транскрибированную РНК, содержащую вставку выбранного участка L-сегмента РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса М. guanaritoense.

Для реализации изобретения использовался набор для рекомбиназной изотермической амплификации TwistAmp® ехо kit (TwistDx™, UK). В пробирки с сухим веществом TwistAmp® ехо reaction (TwistDx™, UK) вносится смесь из 2,1 мкл 10 мкМ RPA_GTOV_F (ДНК-Синтез, Россия), 2,1 мкл 10 мкМ RPA_GTOV_R (ДНК-Синтез, Россия), 0,6 мкл 10 мкМ флуоресцентно-меченного зонда Exo_GTOV (ДНК-Синтез, Россия), 29,5 мкл Primer Free Rehydration buffer (TwistDx™, UK), 11,7 мкл ультрачистой воды Milli-Q, 0,5 мкл обратной транскриптазы M-MuLV в концентрации 200,000 U/ml (New England Biolabs, США). Смесь аккуратно пипетируют до полного растворения лиофилизированного осадка. В холодном штативе в пробирки вносят по 2,5 мкл 280 мМ Magnesium Acetate (MgOAc) (TwistDx™, UK) и 1 мкл РНК образца. Раствор в пробирках перемешивают, капли осаждают на центрифуге микроспин (BioSan FV-2400). Пробы переносят в прибор для регистрации флуоресцентного сигнала. На амплификаторе CFX96 Touch (Bio-Rad, США) или приборе с аналогичными возможностями выставляют программу анализа RT-RPA ехо (Таблица 2) со считыванием сигнала от флуоресцентного красителя FAM через каждые 60 секунд в течение 30 минут при постоянной температуре +39°С.

Тестирование способа выявления РНК вируса GTOV методом рекомбиназной полимеразной амплификации с обратной транскрипцией в реальном времени проведено на К+. Для получения РНК К+ использовался набор для транскрипции Т7 RiboMAX™ Express Large Scale RNA Production System (Promega, США). Продукты транскрипции очищены при помощи AMPure ХР Bead-Based Reagent (Beckman Coulter, США). Концентрация РНК К+ определена при помощи Nanodrop One (Thermo Fisher Scientific, США) и она разбавлена в РНК-буфере (из комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (АмплиСенс®, ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия)) до рабочей концентрации 1*10⁴ копий/мкл, что соответствует 1*10⁷ копий/мл или ≈16,6 фМ.

Оценку предела обнаружения производили на разведениях К+ и определяли как минимальную концентрацию РНК, содержащую вставку вируса GTOV и детектируемую данным методом как положительный результат в 100% случаев. Лимит детекции составил 100 копий/мкл РНК К+, содержащей вставку вируса М. guanaritoense. Таким образом, достоверная диагностика данного вируса осуществляется за 30 минут.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence

Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Способ выявления РНК вируса Mammarenavirus

guanaritoense

методом рекомбиназной полимеразной амплификации.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2024-04-27">

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное

учреждение

науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по

надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия

человека»</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Department of Epidemiology, Pasteur Institute,

Federal Service on Consumers' Rights Protection and Human

Well-Being Surveillance</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Капитонова Марина

Анатольевна</InventorName>

<InventorNameLatin>Kapitonova Marina

Anatol'evna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ выявления РНК вируса

Mammarenavirus guanaritoense методом рекомбиназной полимеразной

амплификации</InventionTitle>

<INSDSeq_length>32</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..32</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaaagcttgaagccctctgttaagaccatcgg</INSDSeq_sequenc

e>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>33</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..33</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgaaatttgacaatggatgaaaaagttgtagtt</INSDSeq_sequen

ce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>50</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..50</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>32</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Fluorescein-dT Phosphoramidite

(5'-Dimethoxytrityloxy-5-[N-((3'

6'-dipivaloylfluoresceinyl)-aminohexyl)-3-acrylimido]-2'-deo

xyUridine-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-

phosphoramidite)</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Флуоресцеин-dT фосфорамидит

(5'-Диметокситритилокси-5-[N-((3',6'-

дипивалоилфлуоресцеинил)-аминогексил)-3-акрилимидо]-2'-дезоксиури

дин-3'-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит)</NonEnglis

hQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>33^34</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>dSpacer CE Phosphoramidite

(5'-O-Dimethoxytrityl-1'

2'-Dideoxyribose-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosp

horamidite)</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>dSpacer CE фосфорамидит (5'-O-

диметокситритил-1',2'-дидезоксирибоза-3'-[(2-цианоэтил)

-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>35</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>BHQ1-dT Phosphoramidite

(5'-Dimethoxytrityloxy-5-[(N-4''-carboxyethyl-4'&a

pos;-(N-ethyl)-4'-(2-Nitro-4-

toluyldiazo)-2'-methoxy-5'-methyl-azobenzene)-aminohexyl-3-a

crylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyanoethyl)-

(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>BHQ1-dT фосфорамидит

(5'-диметокситритилокси-5-[(N-4''-

карбоксиэтил-4''-(N-этил)-4'-(2-нитро-4-толуилдиазо)-2&

apos;-метокси-5'-метил-азобензол)-аминогексил-3-

акрилимидо]-2'-дезоксиуридин-3'-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопро

пил)]-фосфорамидит)</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>>50</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Spacer Phosphoramidite C3 =

3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopro

pyl)]-phosphoramidite</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Спейсер фосфорамидит C3 =

3-(4,4'-диметокситритилокси)пропил-1-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопро

пил)]-фосфорамидит </NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcaatgcctccttctgataagacagttcaggtaatcaggtacttgcctt

c</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

Способ выявления вируса Mammarenavirus guanaritoense методом изотермической рекомбиназной полимеразной амплификацией с обратной транскрипцией, включающий экстракцию PHК из биологических образцов, с последующим проведением детекции целевых фрагментов РНК генома вируса, отличающийся тем, что анализ проводят в реальном времени с использованием обратной транскриптазы M-MuLV, специфических праймеров
RPA_GTOV_F5'-AAAAGCTTGAAGCCCTCTGTTAAGACCATCGG-3', RPA_GTOV_R5'-CGAAATTTGACAATGGATGAAAAAGTTGTAGTT-3',
и флуоресцентно-меченного ДНК-зонда
Exo_GTOV5'-GCAATGCCTCCTTCTGATAAGACAGTTCAGG[FAM-dT]A[dSpacer]A[BHQ1-dT]CAGGTACTTGCCTTC[3'-C3-спейсер]-3', где в качестве модификации [dSpacer] применяют соединение dSpacer СЕ фосфорамидит=5'-O-диметокситритил-1',2'-дидезоксирибоза-3'-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит,
где результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия отличия кривой флуоресценции пробы от отрицательного контрольного образца, не содержащего РНК Mammarenavirus guanaritoense, причем результат считается положительным, если значение флуоресцентного сигнала возрастает со временем и конечное значение к 30 минуте анализа превышает значение в образце отрицательного контроля.