RU2829335C2 - Blood mineral homeostasis disorder screening test system - Google Patents
Blood mineral homeostasis disorder screening test system Download PDFInfo
- Publication number
- RU2829335C2 RU2829335C2 RU2023102489A RU2023102489A RU2829335C2 RU 2829335 C2 RU2829335 C2 RU 2829335C2 RU 2023102489 A RU2023102489 A RU 2023102489A RU 2023102489 A RU2023102489 A RU 2023102489A RU 2829335 C2 RU2829335 C2 RU 2829335C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blood
- calcium
- cpk
- serum
- minutes
- Prior art date
Links
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 46
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 46
- 230000004079 mineral homeostasis Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title abstract description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 23
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical class [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims abstract description 17
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims abstract description 6
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 3
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims abstract 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 23
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 claims description 17
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 11
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 238000011166 aliquoting Methods 0.000 claims 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 claims 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 abstract description 12
- 239000011734 sodium Substances 0.000 abstract description 9
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 abstract description 7
- 239000011707 mineral Substances 0.000 abstract description 7
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 abstract description 6
- 229960001714 calcium phosphate Drugs 0.000 abstract description 6
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 abstract 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 38
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 35
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 35
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 18
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 16
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 12
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 12
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 11
- -1 phosphate anions Chemical class 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 102000012005 alpha-2-HS-Glycoprotein Human genes 0.000 description 10
- 108010075843 alpha-2-HS-Glycoprotein Proteins 0.000 description 10
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 9
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 9
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 9
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 8
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 7
- 208000004434 Calcinosis Diseases 0.000 description 6
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 6
- 208000037998 chronic venous disease Diseases 0.000 description 6
- 230000034994 death Effects 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 4
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 4
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 4
- 230000007211 cardiovascular event Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 4
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GMRQFYUYWCNGIN-ZVUFCXRFSA-N 1,25-dihydroxy vitamin D3 Chemical compound C1([C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=CC=C1C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-ZVUFCXRFSA-N 0.000 description 3
- 229940122361 Bisphosphonate Drugs 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000002980 Hyperparathyroidism Diseases 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000004663 bisphosphonates Chemical class 0.000 description 3
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 3
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003211 Arteriosclerosis coronary artery Diseases 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 2
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 2
- 102100035650 Extracellular calcium-sensing receptor Human genes 0.000 description 2
- 108090000569 Fibroblast Growth Factor-23 Proteins 0.000 description 2
- 102100024802 Fibroblast growth factor 23 Human genes 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000556204 Huso dauricus Species 0.000 description 2
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 2
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- ZQBZAOZWBKABNC-UHFFFAOYSA-N [P].[Ca] Chemical compound [P].[Ca] ZQBZAOZWBKABNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 2
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 2
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 230000003317 calciotropic effect Effects 0.000 description 2
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 2
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 2
- 208000021779 congenital erosive and vesicular dermatosis Diseases 0.000 description 2
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 150000003017 phosphorus Chemical class 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- CPBJMKMKNCRKQB-UHFFFAOYSA-N 3,3-bis(4-hydroxy-3-methylphenyl)-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C(O)C(C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3C(=O)O2)C=2C=C(C)C(O)=CC=2)=C1 CPBJMKMKNCRKQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- 102100038520 Calcitonin receptor Human genes 0.000 description 1
- 206010007558 Cardiac failure chronic Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014882 Carotid artery disease Diseases 0.000 description 1
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 101710159793 Extracellular calcium-sensing receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000741435 Homo sapiens Calcitonin receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001135738 Homo sapiens Parathyroid hormone-related protein Proteins 0.000 description 1
- 101000589873 Homo sapiens Parathyroid hormone/parathyroid hormone-related peptide receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 102100036899 Parathyroid hormone-related protein Human genes 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 208000005764 Peripheral Arterial Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030831 Peripheral arterial occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930003316 Vitamin D Natural products 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 1
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- YVBOZGOAVJZITM-UHFFFAOYSA-P ammonium phosphomolybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]P([O-])=O.[O-][Mo]([O-])(=O)=O YVBOZGOAVJZITM-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000582 anti-calcifiying effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 230000002092 calcimimetic effect Effects 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 1
- 208000037876 carotid Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000013172 carotid endarterectomy Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000002655 chelation therapy Methods 0.000 description 1
- 229910052729 chemical element Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012916 chromogenic reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- VDHAWDNDOKGFTD-MRXNPFEDSA-N cinacalcet Chemical compound N([C@H](C)C=1C2=CC=CC=C2C=CC=1)CCCC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 VDHAWDNDOKGFTD-MRXNPFEDSA-N 0.000 description 1
- 229960003315 cinacalcet Drugs 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 208000026758 coronary atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000007822 cytometric assay Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- UOGVAJDTQJTBQQ-UHFFFAOYSA-H dicalcium;magnesium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [Mg+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O UOGVAJDTQJTBQQ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 1
- 239000000004 hemodialysis solution Substances 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010859 live-cell imaging Methods 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000010060 microvascular dysfunction Effects 0.000 description 1
- MEFBJEMVZONFCJ-UHFFFAOYSA-N molybdate Chemical compound [O-][Mo]([O-])(=O)=O MEFBJEMVZONFCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical group [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 238000013146 percutaneous coronary intervention Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000000291 postprandial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000009103 reabsorption Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 1
- 229940021384 salt irrigating solution Drugs 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000002037 soft tissue calcification Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 235000019166 vitamin D Nutrition 0.000 description 1
- 239000011710 vitamin D Substances 0.000 description 1
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046008 vitamin d Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к медицинской биотехнологии, медицинским и биологическим реактивам, а именно к реактивам для определения способности организма: 1) к компенсации нарушений минерального гомеостаза путем прямой детекции кальций-фосфатных комплексов (КФК) в сыворотке крови и 2) к декомпенсации нарушений минерального гомеостаза крови на основании оценки склонности сыворотки крови к формированию КФК при ее перенасыщении ионами кальция и фосфат-анионами.The present invention relates to medical biotechnology, medical and biological reagents, namely to reagents for determining the body's ability: 1) to compensate for disturbances in mineral homeostasis by direct detection of calcium phosphate complexes (CPC) in blood serum and 2) to decompensate disturbances in mineral homeostasis of the blood based on an assessment of the tendency of blood serum to form CPC when it is oversaturated with calcium ions and phosphate anions.
Поддержание фосфорнокальциевого гомеостаза является необходимым условием для обеспечения функционирования ряда клеточно-тканевых процессов (возбуждение нейронов, мышечное сокращение и свертывание крови, за которые ответственен кальций) и внутриклеточных метаболических процессов (синтез фосфолипидных мембран и репликация ДНК, для которых требуется фосфор). Основные этапы метаболизма кальция и фосфора включают в себя абсорбцию данных химических элементов в кишечнике, их отложение в костной ткани параллельно с ее резорбцией, а также реабсорбцию и выведение почками, при этом каждый из этих процессов жестко регулируется кальциотропными (паратиреоидный гормон, кальцитонин, 1,25-дигидроксивитамин D, ионизированный кальций) и фосфотропными (паратиреоидный гормон, 1,25-дигидроксивитамин D, FGF-23) факторами и их рецепторами (PTHR - рецептор к паратиреоидному гормону, CALCR - рецептор к кальцитонину, VDR - рецептор к 1,25-дигидроксивитамину D, CaSR - рецептор ионизированного кальция, Klotho - рецептор к FGF-23). Нарушения минерального гомеостаза в зависимости от своей тяжести могут привести к повышению уровней ионизированного кальция и фосфора до «высоких нормальных» значений или даже к превышению их физиологической нормы, что, в свою очередь, связано с развитием внескелетной кальцификации и ассоциировано с высоким риском острых сердечно-сосудистых событий, хронической сердечной недостаточности и смерти от болезней системы.Maintaining calcium-phosphorus homeostasis is a necessary condition for ensuring the functioning of a number of cellular and tissue processes (excitation of neurons, muscle contraction and blood clotting, for which calcium is responsible) and intracellular metabolic processes (synthesis of phospholipid membranes and DNA replication, for which phosphorus is required). The main stages of calcium and phosphorus metabolism include the absorption of these chemical elements in the intestine, their deposition in bone tissue in parallel with its resorption, as well as reabsorption and excretion by the kidneys, with each of these processes being tightly regulated by calciotropic (parathyroid hormone, calcitonin, 1,25-dihydroxyvitamin D, ionized calcium) and phosphotropic (parathyroid hormone, 1,25-dihydroxyvitamin D, FGF-23) factors and their receptors (PTHR - receptor for parathyroid hormone, CALCR - receptor for calcitonin, VDR - receptor for 1,25-dihydroxyvitamin D, CaSR - receptor for ionized calcium, Klotho - receptor for FGF-23). Depending on their severity, disturbances in mineral homeostasis can lead to an increase in the levels of ionized calcium and phosphorus to “high normal” values or even to exceeding their physiological norm, which, in turn, is associated with the development of extraskeletal calcification and is associated with a high risk of acute cardiovascular events, chronic heart failure and death from diseases of the system.
Особой важностью в этом отношении характеризуется ионизированный кальций, который не связан с белками крови и в силу этого является физиологически активной фракцией циркулирующего кальция, также будучи ассоциированным с высоким риском инфаркта миокарда и ишемического инсульта. Интересно, что «высокий нормальный» уровень фосфора также ассоциирован с развитием не только инфаркта миокарда и ишемического инсульта, но и микрососудистой дисфункции, которая, в свою очередь, ассоциирована с указанными сердечно-сосудистыми событиями. При этом «низкий нормальный» уровень ионов магния, являющегося физиологическим антагонистом кальция, также ассоциирован с повышенным риском неблагоприятных сердечно-сосудистых исходов и смерти от сердечнососудистых заболеваний. Назначение пациентам с хронической болезнью почек кальцимиметика цинакальцета (препарата, выступающего как альтернативный лиганд кальций-чувствительного рецептора CaSR и. снижающего выработку паратиреоидного гормона, а вследствие этого и уровень кальция и фосфора в крови) приводило к снижению частоты острых сердечно-сосудистых событий. Кроме того, последние мета-анализы показали, что системные фармакологические вмешательства, направленные на повышение уровня кальция и витамина D - одного из основных биоактивных факторов, увеличивающих поступление кальция из кишечника и его выделение из костной ткани в кровь - не снижают риск развития инфаркта миокарда, инсульта и сердечно-сосудистой смерти.Of particular importance in this regard is ionized calcium, which is not bound to blood proteins and is therefore a physiologically active fraction of circulating calcium, also being associated with a high risk of myocardial infarction and ischemic stroke. Interestingly, “high normal” phosphorus levels are also associated with the development of not only myocardial infarction and ischemic stroke, but also microvascular dysfunction, which in turn is associated with the aforementioned cardiovascular events. At the same time, “low normal” levels of magnesium ions, which are a physiological antagonist of calcium, are also associated with an increased risk of adverse cardiovascular outcomes and death from cardiovascular diseases. Administration of the calcimimetic cinacalcet (a drug that acts as an alternative ligand for the calcium-sensing receptor CaSR and reduces parathyroid hormone production, and therefore blood calcium and phosphorus levels) to patients with chronic kidney disease resulted in a reduction in the incidence of acute cardiovascular events. In addition, recent meta-analyses have shown that systemic pharmacological interventions aimed at increasing calcium and vitamin D levels, one of the main bioactive factors that increases calcium intake from the intestine and its release from bone tissue into the blood, do not reduce the risk of myocardial infarction, stroke, and cardiovascular death.
Помимо системы кальциотропных и фосфотропных гормонов и их рецепторов, уровень ионизированного кальция в крови также контролируется циркулирующими белками-скевенджерами кальция. Видным представителем таких белков является альбумин, который связывает циркулирующие в крови положительно заряженные ионы кальция посредством большого количества отрицательно заряженных аминокислот, распределенных по всей его третичной структуре. Хотя связывание ионов кальция по такому механизму и осуществляется с низкой аффинностью, многократно более высокая концентрация альбумина в крови по сравнению с любым другим белком обусловливает его ведущую роль в поддержании минерального гомеостаза крови. Другим важным белком с точки зрения ингибирования внескелетной минерализации является фетуин-А, который стабилизирует зарождающиеся кластеры фосфата кальция в мономерной форме, образуя так называемые кальципротеиновые мономеры. Считается, что при перенасыщении крови ионами кальция и фосфат-анионами в кальципротеиновых мономерах содержится до 50% от всех данных ионов (выше порога перенасыщения) и до 95% всего фетуина-А крови. Вторая половина превышающих порог перенасыщения ионов кальция и фосфат-анионов крови, а также остаточные 5% фетуина-А находится в составе кальципротеиновых частиц, которые с позиции патобиохимии также справедливо называть кальций-фосфатными комплексами (КФК). В отличие от субнаноразмерных кальципротеиновых мономеров, КФК представляют собой частицы карбонат-гидроксиапатита от 50 до 500 нм в диаметре, которые способны адсорбировать белки крови. Стабильное состояние КФК обеспечивается за счет покрывающего их слоя фетуина-А, хотя в их состав также входят альбумин и прочие «кислые» белки сыворотки, получившие название минеральных шаперонов.In addition to the system of calciotropic and phosphotropic hormones and their receptors, the level of ionized calcium in the blood is also controlled by circulating calcium scavenger proteins. A prominent representative of such proteins is albumin, which binds positively charged calcium ions circulating in the blood via a large number of negatively charged amino acids distributed throughout its tertiary structure. Although calcium ions are bound by this mechanism with low affinity, the many times higher concentration of albumin in the blood compared to any other protein determines its leading role in maintaining mineral homeostasis in the blood. Another important protein in terms of inhibition of extraskeletal mineralization is fetuin-A, which stabilizes nascent calcium phosphate clusters in monomeric form, forming the so-called calciprotein monomers. It is believed that when blood is supersaturated with calcium ions and phosphate anions, calciprotein monomers contain up to 50% of all these ions (above the supersaturation threshold) and up to 95% of all fetuin-A in the blood. The second half of the calcium ions and phosphate anions in the blood that exceed the supersaturation threshold, as well as the remaining 5% of fetuin-A, are contained in calciprotein particles, which from the standpoint of pathobiochemistry are also rightly called calcium-phosphate complexes (CPC). Unlike subnanosized calciprotein monomers, CPCs are carbonate-hydroxyapatite particles from 50 to 500 nm in diameter, which are capable of adsorbing blood proteins. The stable state of CPCs is ensured by the fetuin-A layer covering them, although they also contain albumin and other "acidic" serum proteins, called mineral chaperones.
Последние крупные эпидемиологические исследования и мета-анализы достаточно убедительно продемонстрировали, что, по аналогии с «высоким нормальным» уровнем кальция и фосфора, «низкий нормальный» уровень фетуина-А и альбумина ассоциирован с повышенным риском развития инфаркта миокарда, ишемического инсульта и сердечно-сосудистой смерти. Таким образом, для клинической медицины является достаточно важной связь «высокого нормального» уровня кальция (в том числе ионизированного кальция) и фосфора, а также «низкого нормального» уровня альбумина и фетуина-А с повышенным риском инфаркта миокарда, ишемического инсульта и смерти от сердечно-сосудистых заболеваний.Recent large epidemiological studies and meta-analyses have demonstrated quite convincingly that, similar to “high normal” levels of calcium and phosphorus, “low normal” levels of fetuin-A and albumin are associated with an increased risk of myocardial infarction, ischemic stroke, and cardiovascular death. Thus, the association of “high normal” levels of calcium (including ionized calcium) and phosphorus, as well as “low normal” levels of albumin and fetuin-A with an increased risk of myocardial infarction, ischemic stroke, and cardiovascular death is quite important for clinical medicine.
Фундаментальные исследования последствий нарушений минерального гомеостаза крови (особенно характерных для пациентов с остеопорозом и гиперпаратиреозом) показали, что они приводят к формированию КФК, которые повреждают эндотелий и вследствие этого запускают развитие атеросклероза, таким образом приводя к ишемической болезни сердца и повышая риск ишемического инсульта. Клиническая значимость циркуляции КФК в крови отмечена по результатам клинического испытания Trial to Assess Chelation Therapy (TACT, NCT00044213), которое включало 1708 пациентов (50 лет и старше) с инфарктом миокарда в анамнезе, получавших (839 больных) или не получавших (869 больных) в течение 30 недель 40 внутривенных инфузий объемом 500 мл, включавших 3 г динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na2-ЭДТА, 1,5 г/л) как хелатирующего агента в сочетании с витаминной и электролитной смесью. У получавших указанную терапию пациентов в 1,22 раза реже регистрировалась первичная комбинированная конечная точка (в которую входили летальный исход независимо от причины, повторный инфаркт миокарда, острое нарушение мозгового кровообращения, коронарная реваскуляризация или госпитализация по поводу стенокардии). Данный эффект был особенно выражен в когорте пациентов с сахарным диабетом, первичная комбинированная конечная точка у которых отмечалась в 1,69 раза реже, и в субкогорте пациентов с сахарным диабетом и заболеваниями периферических артерий, являющихся клиническим проявлением мультифокального атеросклероза, у которых снижение частоты первичной комбинированной конечной точки достигло 1,92 раза. Эти результаты приобретают особый интерес в свете того, что пик формирования КФК в крови приходится на первые 2 часа после приема пищи; таким образом, существует ассоциативная связь между постпрандиальной гликемией и образованием КФК. Положительным эффектом протестированного в исследовании TACT режима терапии также является его безопасность. В то же время низкая биодоступность Na2-ЭДТА при пероральном употреблении (около 5%) существенно ограничивает ее клиническое применение, а внутривенный путь введения лекарственных средств в регулярной терапевтической практике в настоящее время считается сопряженным с достаточно высоким риском осложнений. В настоящее время проводятся клинические испытания ТАСТ2 (NCT02733185) и ТАСТ3а (NCT03982693) которые сфокусированы на эффективности терапии Na2-ЭДТА у пациентов с перенесенным инфарктом миокарда и сахарным диабетом (ТАСТ2) и у пациентов с данными патологиями и критической ишемией нижних конечностей (ТАСТ3а).Fundamental studies of the consequences of disturbances in blood mineral homeostasis (especially characteristic of patients with osteoporosis and hyperparathyroidism) have shown that they lead to the formation of CPK, which damages the endothelium and, as a result, triggers the development of atherosclerosis, thus leading to ischemic heart disease and increasing the risk of ischemic stroke. The clinical significance of CPK circulation in the blood was noted by the results of the Trial to Assess Chelation Therapy (TACT, NCT00044213) clinical trial, which included 1708 patients (50 years and older) with a history of myocardial infarction who received (839 patients) or did not receive (869 patients) 40 intravenous infusions of 500 ml for 30 weeks, including 3 g of disodium ethylenediaminetetraacetic acid (Na2-EDTA, 1.5 g/l) as a chelating agent in combination with a vitamin and electrolyte mixture. The primary composite endpoint (which included death from any cause, recurrent myocardial infarction, acute cerebrovascular accident, coronary revascularization, or hospitalization for angina) was 1.22 times less likely to be observed in patients receiving the indicated therapy. This effect was particularly pronounced in the cohort of patients with diabetes mellitus, in whom the primary composite endpoint was observed 1.69 times less frequently, and in the subcohort of patients with diabetes mellitus and peripheral arterial disease, which is a clinical manifestation of multifocal atherosclerosis, in whom the reduction in the incidence of the primary composite endpoint reached 1.92 times. These results are of particular interest in light of the fact that the peak formation of CPK in the blood occurs in the first 2 hours after a meal; thus, there is an association between postprandial glycemia and CPK formation. Another positive effect of the therapy regimen tested in the TACT study is its safety. At the same time, the low bioavailability of Na2-EDTA when taken orally (about 5%) significantly limits its clinical use, and the intravenous route of drug administration in regular therapeutic practice is currently considered to be associated with a fairly high risk of complications. Currently, clinical trials TACT2 (NCT02733185) and TACT3a (NCT03982693) are being conducted, which are focused on the effectiveness of Na2-EDTA therapy in patients with myocardial infarction and diabetes mellitus (TACT2) and in patients with these pathologies and critical lower limb ischemia (TACT3a).
Помимо терапии Na2-ЭДТА, в клинических испытаниях (NCT03565913) показала положительные результаты пероральная форма (растворимый порошок) цитрата кальция и магния (7,5 ммоль Са2+, 5 ммоль Mg2+, 20 моль-экв. Н+и 15 ммоль цитрата, прием 3 раза в сутки в течение 1 недели), которая замедляла формирование КФК у пациентов с ХБП5. Вполне вероятно, что именно за такой формой препаратов с хелатирующим действием стоит будущее терапии, направленной на элиминацию КФК из организма человека. Также относительно успешно в этом отношении прошли клинические испытания (NCT02216877) перорального приема доноров ионов магния (360 мг гидроксида магния, эквивалентные 15 ммоль Mg2+, 1 или 2 раза в сутки в течение 8 недель), которые ингибировали формирование КФК у пациентов с хронической болезнью почек 3 и 4 стадий. Подтверждение эффективности ионов магния для ингибирования формирования КФК было получено чуть позже в клиническом испытании (NCT02977117) повышенной концентрации ионов магния (2 моль-экв./л вместо 1 моль-экв./л) в растворе для гемодиализа, который проводился в течение 4 недель. Тем не менее, адекватное проведение клинических испытаний способов элиминации КФК из кровотока после выполнения ими своей гомеостатической функции прежде всего требует методов объективной оценки содержания КФК в крови.In addition to Na2-EDTA therapy, an oral form (soluble powder) of calcium magnesium citrate (7.5 mmol Ca2 + , 5 mmol Mg2 + , 20 mol-eq. H + and 15 mmol citrate, taken 3 times a day for 1 week) showed positive results in clinical trials (NCT03565913), which slowed the formation of CPK in patients with CKD5. It is likely that this form of drugs with chelating action is the future of therapy aimed at eliminating CPK from the human body. Also relatively successful in this regard were clinical trials (NCT02216877) of oral administration of magnesium ion donors (360 mg magnesium hydroxide, equivalent to 15 mmol Mg 2+ , 1 or 2 times a day for 8 weeks), which inhibited the formation of CPK in patients with chronic kidney disease stages 3 and 4. Confirmation of the effectiveness of magnesium ions for inhibiting the formation of CPK was obtained a little later in a clinical trial (NCT02977117) of an increased concentration of magnesium ions (2 mol-eq./L instead of 1 mol-eq./L) in a hemodialysis solution, which was carried out for 4 weeks. Nevertheless, adequate conduct of clinical trials of methods for eliminating CPK from the bloodstream after they have performed their homeostatic function primarily requires methods for objectively assessing the content of CPK in the blood.
Природная организация КФК такова, что, с одной стороны, они являются необходимым звеном минерального гомеостаза (по сути, выступая в роли вторичного депо ионов кальция и фосфат-анионов, в том числе агрегирующего избыточные ионы кальция и фосфат-анионы и выводящего их из кровотока), а с другой - патогенным циркулирующим в крови субстратом в силу своей химической природы (покрытый белками крови карбонат-гидроксиапатит). Широко известные биохимические показатели крови не позволяют определить способность сыворотки крови к компенсации и декомпенсации нарушений минерального гомеостаза, поскольку выраженные изменения этих маркеров встречаются при тяжелой хронической почечной недостаточности или тяжелом гиперпаратиреозе, а незначительные изменения неспецифичны, и терапии не подвергаются.The natural organization of CPK is such that, on the one hand, they are a necessary link in mineral homeostasis (in fact, acting as a secondary depot of calcium ions and phosphate anions, including aggregating excess calcium ions and phosphate anions and removing them from the bloodstream), and on the other hand, they are a pathogenic substrate circulating in the blood due to their chemical nature (carbonate-hydroxyapatite covered with blood proteins). Widely known biochemical blood parameters do not allow determining the ability of blood serum to compensate and decompensate mineral homeostasis disorders, since pronounced changes in these markers occur in severe chronic renal failure or severe hyperparathyroidism, and minor changes are nonspecific and are not subject to therapy.
Таким образом, для выявления нарушений в системе минерального гомеостаза, которые могут приводить к эктопической минерализации (кальцификации мягких тканей), необходимо учитывать все факторы, ингибирующие или запускающие этот процесс в сыворотке крови. Создание высокоточного и быстрого скринингового метода диагностики сыворотки или плазмы крови к компенсации (прямая детекция КФК) и декомпенсации (оценка склонности сыворотки крови к формированию КФК) нарушений минерального гомеостаза крови будет способствовать получению ранней информации о предрасположенности организма к наступлению сердечно-сосудистых событий или о риске развития кальцификации у пациентов.Thus, to identify disturbances in the mineral homeostasis system that can lead to ectopic mineralization (soft tissue calcification), it is necessary to take into account all factors that inhibit or trigger this process in the blood serum. The development of a highly accurate and rapid screening method for diagnosing serum or plasma compensation (direct detection of CPK) and decompensation (assessment of the tendency of blood serum to form CPK) of disturbances in the mineral homeostasis of the blood will facilitate obtaining early information about the predisposition of the body to the occurrence of cardiovascular events or the risk of calcification in patients.
Известен способ (Koeppert S, Ghallab A, Peglow S, Winkler CF, Graeber S, Biischer A, Hengstler JG, Jahnen-Dechent W. Live Imaging of Calciprotein Particle Clearance and Receptor Mediated Uptake: Role of Calciprotein Monomers. Front Cell Dev Biol. 2021;9:633925. doi: 10.3389/fcell.2021.633925), где к исследуемому образцу и имеющимся стандартам для построения калибровочной кривой добавляют реагент, способный формировать хромогенный комплекс с ионами кальция и с ионами фосфора. Ионизированный кальций, присутствующий в образце, реагирует с комплексоном орто-крезолфталеином, образуя окрашенный комплекс, который можно количественно определить с помощью спектрофотометрического анализа при 570 нм. Ионизированный фосфор реагирует с молибдатом в кислой среде с образованием фосфомолибдата аммония, оптическая плотность которого максимальна при 340 нм.A known method (Koeppert S, Ghallab A, Peglow S, Winkler CF, Graeber S, Biischer A, Hengstler JG, Jahnen-Dechent W. Live Imaging of Calciprotein Particle Clearance and Receptor Mediated Uptake: Role of Calciprotein Monomers. Front Cell Dev Biol. 2021;9:633925. doi: 10.3389/fcell.2021.633925) involves adding a reagent capable of forming a chromogenic complex with calcium ions and phosphorus ions to the test sample and available standards to construct a calibration curve. Ionized calcium present in the sample reacts with the complexone ortho-cresolphthalein, forming a colored complex that can be quantified by spectrophotometric analysis at 570 nm. Ionized phosphorus reacts with molybdate in an acidic medium to form ammonium phosphomolybdate, the optical density of which is maximum at 340 nm.
Недостатками данного способа является количественное измерение ионизированных кальция и фосфора (представленных в свободной форме и не связанных с белками) в сыворотке крови, а не измерение склонности сыворотки крови к формированию КФК посредством повышения оптической плотности.The disadvantages of this method are that it quantitatively measures ionized calcium and phosphorus (present in free form and not bound to proteins) in the blood serum, rather than measuring the tendency of the blood serum to form CPK by increasing the optical density.
Известен способ (Uedono Н, Mori К, Ochi A, Nakatani S, Miki Y, Tsuda A, Morioka T, Nagata Y, Imanishi Y, Shoji T, Inaba M, Emoto M. Effects of fetuin-A-containing calciprotein particles on posttranslational modifications of fetuin-A in HepG2 cells. Sci Rep.2021;11(1):7486. doi: 10.1038/s41598-021-86881-0), в котором измеряли содержание ионизированного кальция в составе КФК путем добавления хромогенного реагента с дальнейшей детекцией результата при 575 нм.A known method (Uedono H, Mori K, Ochi A, Nakatani S, Miki Y, Tsuda A, Morioka T, Nagata Y, Imanishi Y, Shoji T, Inaba M, Emoto M. Effects of fetuin-A-containing calciprotein particles on posttranslational modifications of fetuin-A in HepG2 cells. Sci Rep. 2021; 11(1):7486. doi: 10.1038/s41598-021-86881-0) measures the content of ionized calcium in CPK by adding a chromogenic reagent followed by detection of the result at 575 nm.
Недостатками данного способа является количественное измерение ионизированного кальция только в составе КФК, а не во всей биологической жидкости, где эти комплексы формируются. Кроме того, данный способ не позволяет оценить склонность сыворотки к формированию КФК и не дает представления об актуальной концентрации данных частиц в циркулирующей крови.The disadvantages of this method are the quantitative measurement of ionized calcium only in the composition of CPK, and not in the entire biological fluid where these complexes are formed. In addition, this method does not allow one to assess the tendency of serum to form CPK and does not provide an idea of the current concentration of these particles in the circulating blood.
Известен способ (How to determine the tendency of calcification, JP 6104265 B2, https://patents.google.com/patent/JP6104265B2 и Method for determining the propensity for calcification, US 10054601 B2, https://patents.google.com/patent/US10054601B2) измерения времени полуперехода низкокристаллических менее патогенных сферических КФК в высококристаллические патогенные игольчатые КФК (так называемый тест Т50). Тест Т50 применяется в качестве прогностического биомаркера в большинстве когортных исследований (в качестве примера можно привести два недавних исследования: Bundy JD, Cai X, Scialla Л, Dobre MA, Chen J, Hsu CY, Leonard MB, Go AS, Rao PS, Lash JP, Townsend RR, Feldman HI, de Boer IH, Block GA, Wolf M, Smith ER, Pasch A, Isakova T; CRIC Study Investigators. Serum Calcification Propensity and Coronary Artery Calcification Among Patients With CKD: The CRIC (Chronic Renal Insufficiency Cohort) Study. Am J Kidney Dis. 2019;73(6):806-814. doi: 10.1053/j.ajkd.2019.01.024. и Eelderink С, Те Velde-Keyzer CA, Frenay AS, Vermeulen EA, Bachtler M, Aghagolzadeh P, van Dijk PR, Gansevoort RT, Vervloet MG, Hillebrands JL, Bakker SJL, van Goor H, Pasch A, de Borst MH; NIGRAM2+ consortium. Serum Calcification Propensity and the Risk of Cardiovascular and All-Cause Mortality in the General Population: The PREVEND Study. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2020;40(8): 1942-1951. doi: 10.1161/ATVBAHA.120.314187). Измерение проводится в 96-луночном планшете, в каждую лунку которого последовательно добавляют 20 мкл хлорида натрия (140 ммоль/л NaCl), 80 мкл исследуемой сыворотки, 50 мкл фосфата (исходными солями для приготовления раствора могут быть 24 ммоль/л Na2HPO4 или 24 ммоль/л NaH2PO4) и 50 мкл раствора хлорида кальция (40 ммоль/л CaCl2). Растворы фосфата и кальция готовятся на 140 ммоль/л NaCl и 100 ммоль/л HEPES с выравниванием рН до 7,4 при 37°С с помощью 10 ммоль/л NaOH. Конечные концентрации солей в лунке 96-луночного планшета составляют: NaCl - 140 ммоль/л, фосфата - 6 ммоль/л, кальция - 10 ммоль/л, HEPES - 50 ммоль/л. Инкубация исследуемых проб и измерение результатов занимает от 2 до 14 часов при помощи нефелометрии. Значения определяются по графику зависимости светорассеяния раствора от времени. Увеличение показателей происходит из-за повышения мутности исследуемого образца при образовании сферических и игольчатых КФК.A method is known (How to determine the tendency of calcification, JP 6104265 B2, https://patents.google.com/patent/JP6104265B2 and Method for determining the propensity for calcification, US 10054601 B2, https://patents.google.com/patent/US10054601B2) for measuring the half-life of low-crystalline, less pathogenic spherical CPK into highly crystalline pathogenic needle-shaped CPK (the so-called T 50 test). The T 50 test is used as a prognostic biomarker in most cohort studies (two recent studies are exemplified by Bundy JD, Cai X, Scialla L, Dobre MA, Chen J, Hsu CY, Leonard MB, Go AS, Rao PS, Lash JP, Townsend RR, Feldman HI, de Boer IH, Block GA, Wolf M, Smith ER, Pasch A, Isakova T; CRIC Study Investigators. Serum Calcification Propensity and Coronary Artery Calcification Among Patients With CKD: The CRIC (Chronic Renal Insufficiency Cohort) Study. Am J Kidney Dis. 2019;73(6):806-814. doi: 10.1053/j.ajkd.2019.01.024. and Eelderink C, Te Velde-Keyzer CA, Frenay AS, Vermeulen EA, Bachtler M, Aghagolzadeh P, van Dijk PR, Gansevoort RT, Vervloet MG, Hillebrands JL, Bakker SJL, van Goor H, Pasch A, de Borst MH; NIGRAM2+ consortium. Serum Calcification Propensity and the Risk of Cardiovascular and All-Cause Mortality in the General Population: The PREVEND Study. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2020;40(8): 1942-1951. doi: 10.1161/ATVBAHA.120.314187). The measurement is carried out in a 96-well plate, to each well of which 20 μl of sodium chloride (140 mmol/l NaCl), 80 μl of the serum being tested, 50 μl of phosphate (the initial salts for preparing the solution can be 24 mmol/l Na 2 HPO 4 or 24 mmol/l NaH 2 PO 4 ) and 50 μl of calcium chloride solution (40 mmol/l CaCl 2 ) are successively added. Phosphate and calcium solutions are prepared with 140 mmol/l NaCl and 100 mmol/l HEPES with pH adjustment to 7.4 at 37°C using 10 mmol/l NaOH. The final concentrations of salts in a well of a 96-well plate are: NaCl - 140 mmol/l, phosphate - 6 mmol/l, calcium - 10 mmol/l, HEPES - 50 mmol/l. Incubation of the samples and measurement of the results takes from 2 to 14 hours using nephelometry. The values are determined from the graph of the dependence of light scattering of the solution on time. The increase in indicators occurs due to an increase in the turbidity of the sample under study during the formation of spherical and needle-shaped CFC.
Недостатком данного способа являются высокие конечные концентрации солей в исследуемой лунке, что может повлиять на итоговый результат, поскольку чем выше перенасыщение исследуемого образца ионами кальция и фосфора, тем ниже значение Т50. Кроме того, интерпретация результатов теста кажется весьма времязатратной, поскольку необходимо отдельно рассчитывать светорассеяние для сферических КФК и игольчатых КФК и затем определять среднее арифметическое между светорассеяниями, по значению которого определяется момент времени Т50. Еще одним сомнительным моментом может быть отсутствие физиологической релевантности такого физико-химического перехода между сферическими и игольчатыми КФК, поскольку продолжительность теста Т50 составляет от 2 до 14 часов, в то время как интернализация КФК моноцитами, макрофагами и эндотелиальными клетками происходит в течение 1 часа. Поэтому представляется все же более правильным оценивать общую склонность сыворотки или плазмы крови к преципитации КФК по увеличению оптической плотности после ее перенасыщения ионами кальция и фосфора.The disadvantage of this method is the high final concentrations of salts in the test well, which may affect the final result, since the higher the supersaturation of the test sample with calcium and phosphorus ions, the lower the T 50 value. In addition, the interpretation of the test results seems to be very time-consuming, since it is necessary to separately calculate the light scattering for spherical CPK and needle CPK and then determine the arithmetic mean between the light scatterings, the value of which determines the T 50 time point. Another questionable point may be the lack of physiological relevance of such a physicochemical transition between spherical and needle CPK, since the duration of the T 50 test is from 2 to 14 hours, while the internalization of CPK by monocytes, macrophages and endothelial cells occurs within 1 hour. Therefore, it seems more correct to evaluate the general tendency of blood serum or plasma to precipitate CPK by the increase in optical density after its supersaturation with calcium and phosphorus ions.
Известен способ (Smith ER, Hewitson TD, Cai MMX, Aghagolzadeh P, Bachtler M, Pasch A, Holt SG. A novel fluorescent probe-based flow cytometric assay for mineral-containing nanoparticles in serum. Sci Rep.2017;7(1):5686. doi: 10.1038/s41598-017-05474-y) прямой детекции (определении исходной концентрации) КФК в сыворотке или плазме крови при помощи связывания КФК флюоресцентно меченым бисфосфонатом (OsteoSense 680ЕХ, Perkin Elmer) в сочетании с окрашиванием имеющих сходную размерность внеклеточных везикул липофильным мембранным красителем (PKH67, MIDI67-1KT, Sigma). Сочетание этих флюоресцентных зондов позволяет отличить КФК (OsteoSense- положительные РКН-отрицательные события) от внеклеточных везикул (OsteoSense-отрицательные РКН-положительные события, при этом кальцифицирующиеся внеклеточные везикулы детектируются как OsteoSense- и РКН-положительные события) при проточной цитометрии и анализировать концентрацию КФК в сыворотке/плазме крови. Для калибровки проточного цитометра в данном способе использовали коммерческие наборы ApogeeMix (1493, Apogee Flow Systems) и Nano Blank Polystyrene Size Standard Kit (NPPS-4K, Spherotech), а так же флюоресцентно-меченые OsteoSense 680EX стандарты сферических КФК и игольчатых КФК для установки компенсации сигналов флюоресценции. Первый набор способствует калибровке частиц крупного диаметра и состоит из водной смеси силикагелевых сфер диаметром 180, 240, 300, 590, 880 и 1300 нм. Второй набор применяется для калибровки наноразмерных частиц с диаметром от 0,1 до 1,9 мкм. Флюоресцентно-меченые OsteoSense 680ЕХ стандарты сферических и игольчатых КФК приготовлены путем использования предварительно очищенной сыворотки человека от естественных КФК методом ступенчатого центрифугирования: 1) для осаждения крупных частиц применялось центрифугирование при 10000 х g в течение 30 минут при 4°С, 2) для осаждения частиц всего спектра размерности применялось центрифугирование при 100000 х g в течение 120 минут при 4°С. Далее к 4 мл предварительно очищенной человеческой сыворотки добавляли 1 мл раствора хлорида натрия (140 ммоль/л NaCl), 2,5 мл раствора фосфата с рН 7,4 и 2,5 мл раствора кальция с рН 7,4. Раствор фосфата содержит 19,44 ммоль/л Na2HPO4, 4,56 ммоль/л NaH2PO4, 140 ммоль/л NaCl, 25 ммоль/л Tris. Раствор кальция содержит 40 ммоль/л CaCl2, 140 ммоль/л NaCl, 25 ммоль/л Tris. Оба раствора доводили до значения рН 7,4 при помощи NaOH с концентрацией 10 моль/л при 37°С. Полученные 10 мл суспензии, содержащей смесь КФК (как сферических КФК, так и игольчатых КФК), инкубировали при 37°С с постоянным помешиванием и дальнейшим выделением сферических КФК через один час инкубации, а игольчатых КФК через 12 часов при помощи высокоскоростного центрифугирования (30000 х g в течение 120 минут при 4°С). Полученный осадок трижды отмывали холодным TBS (Tris Buffered Saline) и получали заново при помощи центрифугирования. Далее отмытый образец сферических и игольчатых КФК растворяли в 500 мкл предварительно нагретого TBS. Следующим этапом было аликвотирование 25 мкл сферических или игольчатых КФК с последующим добавлением 75 мкл OsteoSense 680ЕХ (24 мкмоль/л) с дальнейшей инкубацией образцов в темноте в течение двух часов при 4°С. По завершении инкубации окрашенные сферические и игольчатые КФК осаждали центрифугированием при 30000 х g в течение 120 минут при 4°С. Концентрация и размерность полученных частиц измерялась при помощи автоматического анализатора Nanosight NS500, способного детектировать частицы диаметром от 10 до 2000 нм. Для пробоподготовки образцов сыворотки необходимо аликвотировать 50 мкл чистой сыворотки и развести ее в соотношении 1:5 в дважды отфильтрованном через поры с диаметром 220 нм Tris-буферном растворе (TBS, рН 7,4) с дальнейшим центрифугированием при 10,000 × g в течение 15 минут при 4°С для осаждения нецелевого крупного дебриса. Затем необходимо аликвотировать 200 мкл надосадка и смешать с 250 мкл флюоресцентного красителя OsteoSense 680ЕХ (предварительно разведенного в соотношении 1:50 в вышеуказанном Tris-буферном растворе). Далее образцы инкубируют в течение 50 минут в темноте при 4°С и добавляют 25 мкл флюоресцентного красителя РKН67, предварительно растворенного в соотношении 1:100 в растворителе С из прилагаемого набора, с дальнейшим ресуспендированием и инкубацией в темноте в течение 10 минут при 4°С. Скорость потока (flow rate) для измерения образца составляет 50 мкл/мин в течение 1 минуты или до сбора 30000 событий.A method is known (Smith ER, Hewitson TD, Cai MMX, Aghagolzadeh P, Bachtler M, Pasch A, Holt SG. A novel fluorescent probe-based flow cytometric assay for mineral-containing nanoparticles in serum. Sci Rep. 2017; 7 (1): 5686. doi: 10.1038 / s41598-017-05474-y) for direct detection (determination of the initial concentration) of CPK in serum or blood plasma using CPK binding with a fluorescently labeled bisphosphonate (OsteoSense 680EX, Perkin Elmer) in combination with staining of extracellular vesicles of similar size with a lipophilic membrane dye (PKH67, MIDI67-1KT, Sigma). The combination of these fluorescent probes allows distinguishing CPK (OsteoSense-positive RKN-negative events) from extracellular vesicles (OsteoSense-negative RKN-positive events, with calcifying extracellular vesicles being detected as OsteoSense- and RKN-positive events) in flow cytometry and analyzing the concentration of CPK in blood serum/plasma. For calibration of the flow cytometer in this method, commercial kits ApogeeMix (1493, Apogee Flow Systems) and Nano Blank Polystyrene Size Standard Kit (NPPS-4K, Spherotech) were used, as well as fluorescently labeled OsteoSense 680EX spherical CPK and needle CPK standards for setting fluorescence signal compensation. The first set facilitates calibration of large diameter particles and consists of an aqueous mixture of silica gel spheres with diameters of 180, 240, 300, 590, 880 and 1300 nm. The second set is used to calibrate nanosized particles with diameters from 0.1 to 1.9 μm. Fluorescently labeled OsteoSense 680EX spherical and needle CPK standards were prepared using pre-purified human serum from natural CPK by the step centrifugation method: 1) to sediment large particles, centrifugation at 10,000 x g for 30 minutes at 4°C was used, 2) to sediment particles of the entire size spectrum, centrifugation at 100,000 x g for 120 minutes at 4°C was used. Next, 1 ml of sodium chloride solution (140 mmol/l NaCl), 2.5 ml of phosphate solution with pH 7.4 and 2.5 ml of calcium solution with pH 7.4 were added to 4 ml of pre-cleared human serum. The phosphate solution contains 19.44 mmol/l Na 2 HPO 4 , 4.56 mmol/l NaH 2 PO 4 , 140 mmol/l NaCl, 25 mmol/l Tris. The calcium solution contains 40 mmol/l CaCl 2 , 140 mmol/l NaCl, 25 mmol/l Tris. Both solutions were adjusted to pH 7.4 with 10 mol/l NaOH at 37°C. The resulting 10 ml of suspension containing a mixture of CPK (both spherical CPK and needle-shaped CPK) was incubated at 37°C with constant stirring and then spherical CPK were isolated after one hour of incubation and needle-shaped CPK after 12 hours using high-speed centrifugation (30,000 x g for 120 minutes at 4°C). The resulting precipitate was washed three times with cold TBS (Tris Buffered Saline) and obtained again by centrifugation. Then, the washed sample of spherical and needle-shaped CPK was dissolved in 500 μl of pre-warmed TBS. The next step was to aliquot 25 μl of spherical or needle-shaped CPKs followed by the addition of 75 μl of OsteoSense 680EX (24 μmol/l) and incubate the samples in the dark for two hours at 4°C. After incubation, the stained spherical and needle-shaped CPKs were pelleted by centrifugation at 30,000 x g for 120 minutes at 4°C. The concentration and size of the resulting particles were measured using a Nanosight NS500 automated analyzer capable of detecting particles with diameters from 10 to 2000 nm. For sample preparation of serum samples, 50 μl of pure serum should be aliquoted and diluted 1:5 in double-filtered 220 nm pore size Tris-buffered saline (TBS, pH 7.4) followed by centrifugation at 10,000 × g for 15 min at 4°C to pellet non-target large debris. Then, 200 μl of the supernatant should be aliquoted and mixed with 250 μl of OsteoSense 680EX fluorescent dye (previously diluted 1:50 in the above Tris-buffered saline). The samples are then incubated for 50 minutes in the dark at 4°C and 25 µl of the fluorescent dye PKH67, previously dissolved at a ratio of 1:100 in solvent C from the supplied kit, are added, followed by resuspension and incubation in the dark for 10 minutes at 4°C. The flow rate for sample measurement is 50 µl/min for 1 minute or until 30,000 events are collected.
Недостатком данного способа является высокая скорость потока (flow rate) большинства проточных цитометров, которая влияет на точность измерения концентрации КФК. Скорость потока должна быть как можно ниже (не более 10 мкл/мин), поскольку это позволяет минимизировать детекцию ложноположительных «засвеченных частиц». Кроме того, использование наноразмерных силикагелевых сфер, не конъюгированных с флюоресцентной меткой, не позволяет проводить калибровку содержания кальций-фосфатных частиц с формой, отличной от сферической. Следует отметить, что использование коммерческих наборов для калибровки проточного цитометра основывается на теории рассеяния света частицами сферической формы, предполагая наличие однородных сфер в среде (теория Ми). Использование предварительно очищенной сыворотки человека от естественных КФК всего спектра размерности методом ступенчатого центрифугирования для синтезирования флюоресцентно-меченых OsteoSense 680ЕХ стандартов сферических КФК и игольчатых КФК не позволяет синтезировать КФК в нужном количестве и разного диапазона размерности, поскольку предварительно очищенная сыворотка будет лишена части альбумина и фетуина-А, связавшегося с утилизированными КФК в процессе ступенчатого центрифугирования. Это сдвигает синтез в сторону большего формирования игольчатых КФК, имеющих большую размерность. Кроме того, использование в данном способе перенасыщение сыворотки крови ионами кальция и фосфат-анионами не позволяют оценить способность организма к декомпенсации нарушений минерального гомеостаза крови на основании оценки склонности сыворотки крови к формированию КФК.The disadvantage of this method is the high flow rate of most flow cytometers, which affects the accuracy of measuring the concentration of CPK. The flow rate should be as low as possible (no more than 10 μl/min), since this minimizes the detection of false-positive "illuminated particles". In addition, the use of nanosized silica spheres not conjugated with a fluorescent label does not allow calibration of the content of calcium phosphate particles with a shape different from spherical. It should be noted that the use of commercial kits for calibrating a flow cytometer is based on the theory of light scattering by spherical particles, assuming the presence of homogeneous spheres in the medium (Mie theory). The use of pre-purified human serum from natural CPK of the entire size range by the method of step centrifugation for the synthesis of fluorescently labeled OsteoSense 680EX standards of spherical CPK and needle CPK does not allow the synthesis of CPK in the required quantity and of different size ranges, since the pre-purified serum will be deprived of some albumin and fetuin-A bound to the utilized CPK during the step centrifugation. This shifts the synthesis towards greater formation of needle CPK of greater size. In addition, the use of supersaturation of blood serum with calcium ions and phosphate anions in this method does not allow the assessment of the body's ability to decompensate for disorders of blood mineral homeostasis based on the assessment of the tendency of blood serum to form CPK.
Известен способ (Novel calciprotein particle (СРР) measurement method using fluorescent probe, JP 6566697 B2, https: //patents.google.com/patent/JP6566697B2), который был апробирован в качестве диагностического маркера хронической болезни почек и показывает увеличение количества КФК при снижении функции почек. Пробоподготовка к измерению общей фракции КФК проводится путем добавления 5 мкл сыворотки крови пациента (объем исследуемой сыворотки может быть от 0,5 до 5 мкл) к 45 мкл 50 мкмоль/л флюоресцентного красителя OsteoSense 680ЕХ (объем флюоресцентного красителя может быть от 10 до 100 мкл и с концентрацией от 5 до 50 мкмоль/л) с инкубацией исследуемого образца при комнатной температуре в течение часа (время инкубации может быть увеличено до двух часов). Затем образец при помощи спин-колонки для гель-фильтрации очищают от несвязавшегося флюоресцентного красителя и собирают элюат центрифугированием при 1000 g в течение 2 минут. Нерастворимые флюоресцентно меченные КФК, содержащиеся в 40 мкл собранного элюата, ресуспендируют путем последовательного добавления 10 мкл раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, концентрация 250-500 ммоль/л) и 10 мкл додецилсульфата натрия (в концентрации 5-10%) с инкубацией при комнатной температуре в течение 5 минут (время экспозиции может быть увеличено до 10 минут). Интенсивность флюоресцентного красителя считывается сканером ближнего инфракрасного диапазона (к примеру, LI-COR Odyssey CLx). Концентрацию КФК в крови или сыворотке определяют по интенсивности считываемой флюоресценции зонда, связавшегося с гидроксиапатитом в составе КФК. Кроме того, данным способом пробоподготовки возможно анализировать низкокристаллические КФК, которые получают из цельной сыворотки путем ее центрифугирования при 16,000 g в течение 2 часов. В пробоподготовку берется 5 мкл полученного надосадка с последующим соблюдением шагов, описанных выше. Высококристаллические КФК определяются путем вычитания значений низкокристаллических КФК из значений общей фракции КФК. В качестве проб для построения калибровочной кривой используются серийные разведения коммерчески доступных стандартов кристаллов фосфата кальция в концентрации 1000, 500, 150, 125, 62,5 мкг/мл.A known method (Novel calciprotein particle (CPP) measurement method using fluorescent probe, JP 6566697 B2, https: //patents.google.com/patent/JP6566697B2) was tested as a diagnostic marker of chronic kidney disease and shows an increase in the amount of CPK with a decrease in kidney function. Sample preparation for measuring the total CPK fraction is carried out by adding 5 μl of the patient's blood serum (the volume of the serum to be tested can be from 0.5 to 5 μl) to 45 μl of 50 μmol/l fluorescent dye OsteoSense 680EX (the volume of the fluorescent dye can be from 10 to 100 μl and with a concentration of 5 to 50 μmol/l) with incubation of the test sample at room temperature for an hour (the incubation time can be increased to two hours). The sample is then purified from unbound fluorescent dye using a gel filtration spin column and the eluate is collected by centrifugation at 1000 g for 2 minutes. Insoluble fluorescently labeled CPK contained in 40 μl of the collected eluate are resuspended by successive addition of 10 μl of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, concentration 250-500 mmol/l) and 10 μl of sodium dodecyl sulfate (at a concentration of 5-10%) with incubation at room temperature for 5 minutes (the exposure time can be increased to 10 minutes). The intensity of the fluorescent dye is read using a near infrared scanner (e.g., LI-COR Odyssey CLx). The concentration of CPK in blood or serum is determined by the intensity of the read fluorescence of the probe bound to hydroxyapatite in the CPK. In addition, this method of sample preparation can analyze low-crystalline CPK, which is obtained from whole serum by centrifugation at 16,000 g for 2 hours. 5 μl of the obtained supernatant is taken for sample preparation, followed by the steps described above. Highly crystalline CPK is determined by subtracting the values of low-crystalline CPK from the values of the total CPK fraction. Serial dilutions of commercially available calcium phosphate crystal standards at a concentration of 1000, 500, 150, 125, 62.5 μg/ml are used as samples for constructing the calibration curve.
Недостатком данного способа является отсутствие показателей границ физиологической нормы для КФК у условно здоровых субъектов. Несмотря на то, что цифровое изображение позволяет дать качественную и количественную оценку (измерение плотности лунок планшета в программе Fiji, National Institutes of Health) кратности изменения интенсивности флюоресценции, остается неясным количество КФК, которое позволяло стабильно бы поддерживать минеральный гомеостаз крови путем связывания избыточных ионов кальция, количество которых оценить также не представляется возможным. Кроме того, данный способ не позволяет оценить склонность сыворотки к формированию КФК. Еще одним из недостатков данного способа является использование сканера ближнего инфракрасного диапазона, который не распространен в клинико-диагностических лабораториях.The disadvantage of this method is the lack of indicators of the physiological norm boundaries for CPK in conditionally healthy subjects. Despite the fact that the digital image allows for a qualitative and quantitative assessment (measuring the density of the wells of the plate in the Fiji program, National Institutes of Health) of the multiplicity of changes in fluorescence intensity, the amount of CPK that would allow stable maintenance of mineral homeostasis of the blood by binding excess calcium ions, the amount of which is also impossible to assess, remains unclear. In addition, this method does not allow assessing the tendency of serum to form CPK. Another disadvantage of this method is the use of a near infrared scanner, which is not common in clinical diagnostic laboratories.
Известен способ оценки отдельных параметров минерального гомеостаза (к примеру, на современных автоматизированных биохимических анализаторах с использованием коммерчески доступных реагентов). Спектр данных параметров при оценке в рутинной клинико-лабораторной диагностике достаточно узок и ограничивается измерением общего белка (границы нормы 64-83 г/л), альбумина (границы нормы 35-50 г/л), общего кальция (границы нормы 2,2-2,55 ммоль/л) и фосфора (границы нормы 0,78-1,42 ммоль/л).A method for assessing individual parameters of mineral homeostasis is known (for example, on modern automated biochemical analyzers using commercially available reagents). The range of these parameters during assessment in routine clinical laboratory diagnostics is quite narrow and is limited to measuring total protein (normal limits 64-83 g/l), albumin (normal limits 35-50 g/l), total calcium (normal limits 2.2-2.55 mmol/l) and phosphorus (normal limits 0.78-1.42 mmol/l).
Недостатком данного способа является широкий диапазон границ нормы, выраженные нарушения которых встречаются лишь при тяжелой хронической почечной недостаточности или декомпенсированном гиперпаратиреозе, а незначительные изменения в пределах границ норм считаются незначимыми и терапии не подвергаются.The disadvantage of this method is the wide range of normal limits, pronounced violations of which occur only in severe chronic renal failure or decompensated hyperparathyroidism, and minor changes within the normal limits are considered insignificant and are not treated.
Ввиду описанных обстоятельств целью настоящего изобретения является создание тест-системы для скрининга нарушений минерального гомеостаза крови, позволяющей непосредственно и высокоточно измерять концентрацию КФК в крови с параллельной оценкой склонности сыворотки крови к формированию КФК.In view of the described circumstances, the aim of the present invention is to create a test system for screening disorders of blood mineral homeostasis, allowing direct and highly accurate measurement of the concentration of CPK in the blood with a parallel assessment of the tendency of the blood serum to form CPK.
Техническим результатом изобретения является набор реактивов тест-системы, позволяющих определить нарушения минерального гомеостаза крови с разработанными протоколами их использования и установленными значениями референсных границ (границ нормы) концентрации КФК.The technical result of the invention is a set of reagents for a test system that allows for the determination of disturbances in blood mineral homeostasis with developed protocols for their use and established values of reference limits (normal limits) for the concentration of CPK.
Предложенная тест-система для скрининга нарушений минерального гомеостаза крови включает в себя способ оценки исходной компенсации нарушений минерального гомеостаза (определение исходной концентрации КФК в сыворотке) и выраженности его декомпенсации при минеральном стресс-тесте.The proposed test system for screening disorders of blood mineral homeostasis includes a method for assessing the initial compensation of disorders of mineral homeostasis (determination of the initial concentration of CPK in the serum) and the severity of its decompensation during a mineral stress test.
Основным отличием данного изобретения от аналогов является быстрота проведения исследования (результат определения исходной компенсации нарушений минерального гомеостаза выдается через 2 часа от начала работы, результат выраженности декомпенсации при минеральном стресс-тесте - через 24 часа) и высокоточное измерение концентрации КФК с показателем склонности сыворотки к формированию КФК всего спектра размерности. Предложенный способ позволяет создать условия in vitro для непосредственного быстрого скрининга работы антикальцифицирующих кислых белков (минеральных шаперонов, прежде всего альбумина и фетуина-А) в исследуемой сыворотке.The main difference of this invention from its analogues is the speed of the study (the result of determining the initial compensation of mineral homeostasis disorders is issued within 2 hours from the start of the work, the result of the severity of decompensation during the mineral stress test - after 24 hours) and highly accurate measurement of the concentration of CPK with an indicator of the tendency of serum to form CPK of the entire spectrum of dimensions. The proposed method allows creating in vitro conditions for direct rapid screening of the work of anticalcifying acidic proteins (mineral chaperones, primarily albumin and fetuin-A) in the serum being studied.
Протокол специфичной оценки способности организма к компенсации нарушений минерального гомеостаза крови путем прямой детекции КФК в сыворотке крови.Protocol for specific assessment of the body's ability to compensate for disturbances in blood mineral homeostasis by direct detection of CPK in blood serum.
В протоколе представлен способ специфичной оценки способности организма к компенсации нарушений минерального гомеостаза крови при помощи прямой детекции кальций-фосфатных комплексов в сыворотке крови посредством специфично связывающего фосфат кальция флюоресцентно меченного бисфосфоната (OsteoSense 680ЕХ, NEV10020EX, Perkin-Elmer) и проточной цитометрии (CytoFlex, Beckman Coulter). Для дифференцировки КФК от имеющих схожий спектр диаметров (200-1000 нм) внеклеточных мембранных везикул используется краситель липидных мембран PKH67 (MIDI67-1KT, Sigma). Спектр данных красителей не перекрывается, что позволяет избавиться от настройки компенсации на проточном цитометре и достичь максимальной точности результатов. После окрашивания КФК детектируются на проточном цитометре как OsteoSense 680ЕХ-положительные PKH67-отрицательные события.The protocol presents a method for specific assessment of the body's ability to compensate for blood mineral homeostasis disorders using direct detection of calcium-phosphate complexes in blood serum using a fluorescently labeled bisphosphonate that specifically binds calcium phosphate (OsteoSense 680EX, NEV10020EX, Perkin-Elmer) and flow cytometry (CytoFlex, Beckman Coulter). To differentiate CPK from extracellular membrane vesicles with a similar diameter spectrum (200-1000 nm), the lipid membrane dye PKH67 (MIDI67-1KT, Sigma) is used. The spectrum of these dyes does not overlap, which eliminates the need to adjust compensation on the flow cytometer and achieves maximum accuracy of results. After staining, CPK are detected on the flow cytometer as OsteoSense 680EX-positive PKH67-negative events.
Необходимые растворы:Necessary solutions:
1. Раствор TBS (Tris Buffered Saline), рН 7,4.1. TBS (Tris Buffered Saline) solution, pH 7.4.
a. Для приготовления 1 л раствора необходимо: 6,05 г Tris + 8,76 г NaCl + 800 мл ddH2O.a. To prepare 1 liter of solution you need: 6.05 g Tris + 8.76 g NaCl + 800 ml ddH 2 O.
b. Измерить рН. Если рН>7,4, то довести рН до 7,4 при помощи 1М НС1.b. Measure pH. If pH>7.4, adjust pH to 7.4 with 1M HCl.
с. Готовый раствор необходимо отфильтровать через поры диаметром 220 нм.c. The finished solution must be filtered through pores with a diameter of 220 nm.
2. OsteoSense 680 EX, NEV10020EX, Perkin-Elmer.2. OsteoSense 680 EX, NEV10020EX, Perkin-Elmer.
a. OsteoSense 680ЕХ изначально поставляется в лиофилизированном виде в концентрации 24 нмоль. Порошок нужно растворить в 1,2 мл TBS (рН 7,4) в пластмассовой пробирке типа Eppendorf на 1,5 мл. После растворения концентрация OsteoSense 680 EX составит 24 мкмоль/л.a. OsteoSense 680EX is initially supplied lyophilized at a concentration of 24 nmol. The powder should be dissolved in 1.2 ml TBS (pH 7.4) in a 1.5 ml Eppendorf plastic tube. After dissolution, the concentration of OsteoSense 680 EX will be 24 μmol/L.
b. Разведенный OsteoSense 680ЕХ (24 мкмоль/л) центрифугировать при 13000 х g в течение 30 минут для осаждения крупных частиц красителя. Приготовленный раствор имеет ярко-синий цвет.b. Centrifuge the diluted OsteoSense 680EX (24 μmol/L) at 13,000 x g for 30 minutes to precipitate large dye particles. The resulting solution is bright blue.
c. После центрифугирования 0,2 мл 24 мкмоль/л OsteoSense 680ЕХ аликвотировать в чистый эппендорф (резервный объем), а 1 мл OsteoSense 680ЕХ растворить в 74 мл TBS (рН 7,4, предварительно отфильтрованном). Итоговое разведение должно быть 1:75.c. After centrifugation, 0.2 ml of 24 μmol/l OsteoSense 680EX is aliquoted into a clean Eppendorf (reserve volume), and 1 ml of OsteoSense 680EX is dissolved in 74 ml of TBS (pH 7.4, pre-filtered). The final dilution should be 1:75.
d. Рабочий раствор OsteoSense (бледно-голубой цвет) объемом 75 мл необходимо повторно отфильтровать через поры диаметром 220 нм (для удаления крупных частиц красителя, способных создать шум при анализе методом проточной цитометрии).d. The 75 ml OsteoSense working solution (pale blue) must be refiltered through 220 nm pores (to remove large dye particles that may create noise during flow cytometry analysis).
Протокол работы с исследуемой сывороткойProtocol for working with the serum under study
1. Образцы сыворотки крови после разморозки необходимо центрифугировать в течение 5 минут при 3500 × g (Microfuge 20R, Beckman Coulter) для осаждения криопреципитата. Чистый надосадок необходимо перенести в новую пробирку с соответствующей маркировкой.1. After thawing, serum samples should be centrifuged for 5 minutes at 3500 × g (Microfuge 20R, Beckman Coulter) to precipitate the cryoprecipitate. The clear supernatant should be transferred to a new, appropriately labeled tube.
2. Аликвотировать 15 мкл чистой сыворотки и развести ее в соотношении 1:5 в дважды отфильтрованном через поры диаметром 220 нм Tris-буферном растворе (TBS, рН 7,4).2. Aliquot 15 µl of pure serum and dilute it 1:5 in double-filtered 220 nm pore-sized Tris-buffered saline (TBS, pH 7.4).
3. Разведенные в TBS образцы необходимо центрифугировать для осаждения нецелевого крупного дебриса при 10,000 × g в течение 15 минут при 4°С (Microfuge 20R, Beckman Coulter).3. TBS-diluted samples should be centrifuged to pellet non-target large debris at 10,000 × g for 15 minutes at 4°C (Microfuge 20R, Beckman Coulter).
4. Для дальнейшего окрашивания необходимо аликвотировать 66,8 мкл надосадка и смешать с 83,5 мкл флюоресцентного красителя OsteoSense 680ЕХ, тропного к фосфату кальция (предварительно разведенного в соотношении 1:74 в вышеуказанном Tris-буферном растворе).4. For further staining, it is necessary to aliquot 66.8 µl of the supernatant and mix it with 83.5 µl of the fluorescent dye OsteoSense 680EX, tropic to calcium phosphate (previously diluted in a ratio of 1:74 in the above-mentioned Tris-buffer solution).
5. Образцы инкубировать в течение 50 минут в темноте при 4°С.5. Incubate samples for 50 minutes in the dark at 4°C.
6. По истечении времени инкубации в пробирку добавить 8,3 мкл флюоресцентного красителя PKH67 (липофильный краситель, тропный к внеклеточным везикулам, имеющим аналогичную с КФК размерность), растворенного в вышеуказанном Tris-буферном растворе в соотношении 1:100, с дальнейшим ресуспендированием и инкубацией в течение 10 минут при 4°С. Количественный анализ КФК на проточном цитометре6. After the incubation time has elapsed, add 8.3 µl of the fluorescent dye PKH67 (a lipophilic dye tropic to extracellular vesicles that have a size similar to that of CPK) dissolved in the above-mentioned Tris-buffer solution in a ratio of 1:100 to the test tube, followed by resuspension and incubation for 10 minutes at 4°C. Quantitative analysis of CPK on a flow cytometer
Проточный цитометр должен быть оснащен двумя лазерами (488, 638) и позволять детектировать частицы диаметром до 200 нм. В качестве отмывочной жидкости необходимо использовать отфильтрованную через поры диаметром 220 нм бидистиллированную воду либо рекомендованную к прибору проточную жидкость (Sheath Fluid).The flow cytometer must be equipped with two lasers (488, 638) and be able to detect particles up to 200 nm in diameter. The wash liquid must be bidistilled water filtered through pores with a diameter of 220 nm or the flow liquid (Sheath Fluid) recommended for the device.
Для детекции флюоресцентного красителя OsteoSense 680ЕХ используется лазер с длиной волны 638 нм (фильтр 712/25 BP), для детекции PKH67 - лазер с длиной волны 488 нм (фильтр 525/40 BP).A laser with a wavelength of 638 nm (filter 712/25 BP) is used to detect the fluorescent dye OsteoSense 680EX, and a laser with a wavelength of 488 nm (filter 525/40 BP) is used to detect PKH67.
В качестве контроля (холостые пробы) для установки напряжения каналов флюоресценции и ежедневной проверки сходимости показаний прибора необходимо использовать рабочие растворы обоих указанных флюоресцентных красителей и чистый TBS без внесения сыворотки пациентов, а также разведенную в TBS и отцентрифугированную сыворотку без добавления флюоресцентных красителей.As a control (blank samples) for setting the voltage of the fluorescence channels and daily checking of the convergence of the instrument readings, it is necessary to use working solutions of both of the specified fluorescent dyes and pure TBS without adding patient serum, as well as serum diluted in TBS and centrifuged without adding fluorescent dyes.
Настройка прибораSetting up the device
1. Целевой гейт событий установить по логарифмической шкале гистограммы FSC-H/SSC-H.1. Set the target event gate according to the logarithmic scale of the FSC-H/SSC-H histogram.
2. Гейт перенести на гистограммы PKH67/SSC-H, OsteoSense 680EX/SSC-H и PKH67/OsteoSense 680ЕХ.2. Transfer the gate to the histograms of PKH67/SSC-H, OsteoSense 680EX/SSC-H and PKH67/OsteoSense 680EX.
3. По холостой пробе PKH67/OsteoSense 680ЕХ установить отсекающие гейты и дискриминирующую сетку для разделения положительных и отрицательных событий.3. Using the PKH67/OsteoSense 680EX blank sample, set up cut-off gates and a discriminatory grid to separate positive and negative events.
4. Для сбора событий установить минимальную скорость 10 мкл/мин. Длительность регистрации событий в каждой пробе установить 2 минуты, что позволит собрать достаточное количество (не менее 10000) событий и достоверно измерить концентрацию КФК в образце.4. To collect events, set the minimum flow rate to 10 µl/min. Set the event recording duration for each sample to 2 minutes, which will allow collecting a sufficient number (at least 10,000) of events and reliably measuring the concentration of CPK in the sample.
5. Начало записи событий осуществлять через 20-30 секунд после запуска пробы (для стабилизации сигнала).5. Start recording events 20-30 seconds after the start of the sample (to stabilize the signal).
6. Все измерения рекомендуется проводить трижды для повышения точности анализа.6. It is recommended to perform all measurements three times to increase the accuracy of the analysis.
7. Стабильность измерений оценивать с помощью графика зависимости SSC-Н от времени.7. The stability of measurements is assessed using a graph of the dependence of SSC-H on time.
8. После каждого измеренного образца дважды проводить функцию Backflush (короткая промывка) для исключения кросс-контаминации между различными образцами.8. After each measured sample, perform the Backflush function twice to prevent cross-contamination between different samples.
9. Подсчет результатов проводить путем деления полученного значения на 3 (количество технических повторов) и 20 (объем проанализированного образца) с последующим умножением полученного значения на 14,4 (фактор разведения сыворотки).9. Calculate the results by dividing the obtained value by 3 (the number of technical repetitions) and 20 (the volume of the analyzed sample), then multiplying the obtained value by 14.4 (the serum dilution factor).
Референсное значение концентрации КФК в сыворотке крови условно здоровых доноров должно быть не менее 378 КФК/мкл (межквартильный интервал: 245-495 КФБ/мкл).The reference value of CPK concentration in the blood serum of conditionally healthy donors should be at least 378 CPK/μl (interquartile range: 245-495 CPK/μl).
Протокол определения декомпенсации нарушений минерального гомеостаза крови путем оценки склонности сыворотки крови к формированию КФК при ее перенасыщении ионами Са2+и РО4 3- Protocol for determining decompensation of blood mineral homeostasis disorders by assessing the tendency of blood serum to form CPK when it is oversaturated with Ca 2+ and PO 4 3- ions
Необходимые растворыNecessary solutions
1. Отфильтрованная через поры диаметром 220 нм стерильная бидистиллированная вода.1. Sterile bidistilled water filtered through pores with a diameter of 220 nm.
2. Отфильтрованный через поры диаметром 220 нм раствор солей кальция (0,1M CaCl2, донор ионов кальция).2. A solution of calcium salts (0.1 M CaCl 2 , a calcium ion donor) filtered through pores with a diameter of 220 nm.
3. Отфильтрованный через поры диаметром 220 нм раствор солей фосфора (0,1M Na2HPO4, донор фосфат-анионов).3. A solution of phosphorus salts (0.1 M Na 2 HPO 4 , a donor of phosphate anions) filtered through pores with a diameter of 220 nm.
Протокол работы с исследуемой сывороткойProtocol for working with the serum under study
1. В исследовании необходимо использовать 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты. Сыворотку пациента необходимо аликвотировать в дублях по 100 мкл на лунку с последующим выделением контрольной лунки и экспериментальной лунки.1. The study must use 96-well flat-bottomed culture plates. The patient serum must be aliquoted in duplicate at 100 µl per well, with a control well and an experimental well separated.
2. Во все выделенные контрольные лунки добавить 4 мкл предварительно отфильтрованной через поры диаметром 220 нм стерильной бидистиллированной воды. Во все выделенные экспериментальные лунки добавить 2 мкл 0,1М CaCl2 и + 2 мкл 0,1М Na2HPO4 (предварительно отфильтрованных через поры диаметром 220 нм). Конечная концентрация добавляемых растворов кальция и фосфора составляет 2 ммоль/л.2. Add 4 µl of sterile bidistilled water pre-filtered through 220 nm pores to all selected control wells. Add 2 µl of 0.1 M CaCl 2 and + 2 µl of 0.1 M Na 2 HPO 4 (pre-filtered through 220 nm pores) to all selected experimental wells. The final concentration of the added calcium and phosphorus solutions is 2 mmol/l.
3. Планшет инкубировать в течение 24 часов в физиологических условиях (37°С, соотношение воздуха и углекислого газа 95%:5% и высокая влажность для предотвращения высыхания содержимого лунок).3. Incubate the plate for 24 hours under physiological conditions (37°C, air to carbon dioxide ratio 95%:5% and high humidity to prevent drying of the well contents).
4. Измерить величину оптической плотности растворов в лунках стрипов на спектрофотометре вертикального сканирования на длине волны 650 нм.4. Measure the optical density of the solutions in the wells of the strips using a vertical scanning spectrophotometer at a wavelength of 650 nm.
5. Подсчет результатов проводить путем вычитания значений контрольной сыворотки из значений экспериментальной.5. Calculate the results by subtracting the values of the control serum from the values of the experimental serum.
А-В=С, гдеA-B=C, where
А - значение экспериментальной сыворотки, усл.ед.A - value of experimental serum, conventional units.
В - значение контрольной сыворотки, усл.ед.B - value of control serum, conventional units.
С - склонность сыворотки крови к формированию КФК, усл.ед.C - the tendency of blood serum to form CPK, conventional units.
Степень увеличения оптической плотности при данном подходе отражает склонность сыворотки к преципитации КФК в условиях минерального стресса, которая может быть обусловлена как «низким нормальным» уровнем общего белка, так и «высоким нормальным» уровнем ионизированного кальция в исследуемом образце.The degree of increase in optical density with this approach reflects the tendency of serum to precipitate CPK under conditions of mineral stress, which can be due to either a “low normal” level of total protein or a “high normal” level of ionized calcium in the sample being tested.
Склонность сыворотки к формированию КФК не должна превышать +0,009 усл.ед. ОП650.The tendency of serum to form CPK should not exceed +0.009 conventional units of OP 650 .
Пример осуществления и использования изобретения.An example of the implementation and use of the invention.
В исследование было включено 308 субъектов: 1) 88 участников эпидемиологического исследования PURE (Prospective Urban Rural Epidemiology Study), обследованных на базе НИИ КПССЗ и не имеющих гемодинамически значимого (стеноз >50% просвета сосуда) каротидного атеросклероза по данным ультразвуковой допплерографии и симптоматического коронарного атеросклероза в анамнезе; 2) 88 пациентов, поступивших в нейрохирургическое отделение ГБУЗ КО «КОККД им. акад. Л.С. Барбараша» с цереброваскулярной болезнью (ЦВБ, включающей в себя хроническую ишемию головного мозга или ишемический инсульт, требующие проведения каротидной эндартерэктомии); 3) 88 пациентов, поступивших в кардиохирургическое отделение НИИ КПССЗ или кардиологическое отделение ГБУЗ КО «КОККД им. акад. Л.С. Барбараша» с ишемической болезнью сердца (ИБС), потребовавшей чрескожного коронарного вмешательства (инфаркт миокарда) или коронарного шунтирования (хронический коронарный синдром); 4) 44 пациента с хронической болезнью почек 5 стадии (ХБП5, определяемой как скорость клубочковой фильтрации (СКФ) <15 мл/мин/1,73 м2 по формуле CKD-EPI), поступивших в Центр нефрологии и гемодиализа ГАУЗ «КОКБ им. С,В. Беляева» с целью проведения гемодиализа. Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской Декларации. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом НИИ КПССЗ (протокол №80/2018, утвержден 10.09.2018). До включения в исследование от всех пациентов было получено письменное информированное согласие. Гендерно-возрастные характеристики, коморбидные патологии и лекарственный анамнез включенных в исследование субъектов приведены в Таблице 1.The study included 308 subjects: 1) 88 participants in the Prospective Urban Rural Epidemiology Study (PURE) examined at the Research Institute of Cardiovascular Diseases and Health and who did not have hemodynamically significant (stenosis >50% of the vessel lumen) carotid atherosclerosis according to Doppler ultrasound data and a history of symptomatic coronary atherosclerosis; 2) 88 patients admitted to the neurosurgical department of the State Budgetary Healthcare Institution of the Kaluga Region "Karabakh Regional Clinical Hospital named after academician L.S. Barbarash" with cerebrovascular disease (CVD, including chronic cerebral ischemia or ischemic stroke requiring carotid endarterectomy); 3) 88 patients admitted to the cardiac surgery department of the Research Institute of Cardiovascular Diseases and Health or the cardiology department of the State Budgetary Healthcare Institution of the Kaluga Region "Karabakh Regional Clinical Hospital named after academician L.S. Barbarash" L.S. Barbarash" with ischemic heart disease (IHD), requiring percutaneous coronary intervention (myocardial infarction) or coronary artery bypass grafting (chronic coronary syndrome); 4) 44 patients with chronic kidney disease stage 5 (CKD5, defined as glomerular filtration rate (SFR) <15 ml/min/1.73 m2 according to the CKD-EPI formula), admitted to the Nephrology and Hemodialysis Center of the S.V. Belyaev Kyiv Regional Clinical Hospital for hemodialysis. The study was performed in accordance with the standards of good clinical practice and the principles of the Declaration of Helsinki. The study protocol was approved by the local ethics committee of the Research Institute of Nephrology and Hemodialysis (protocol No. 80/2018, approved on September 10, 2018). Written informed consent was obtained from all patients prior to inclusion in the study. Gender and age characteristics, comorbid pathologies, and drug history of the subjects included in the study are presented in Table 1.
У включенных в исследование пациентов оценивалась способность организма к компенсации (путем прямой детекции КФК в сыворотке крови) и декомпенсации (путем оценки склонности сыворотки крови к формированию КФК при ее перенасыщении ионами Са2+и РО4 3-) нарушений минерального гомеостаза крови.In patients included in the study, the body's ability to compensate (by direct detection of CPK in the blood serum) and decompensate (by assessing the tendency of the blood serum to form CPK when it is oversaturated with Ca 2+ and PO 4 3- ions) disturbances of blood mineral homeostasis was assessed.
Компенсаторная способность организма к нарушениям минерального гомеостаза оценивается путем добавления к исследуемой сыворотке флюоресцентных красителей OsteoSense 680ЕХ (бисфосфонат, тропный к фосфату кальция) и PKH67 (липофильный краситель, тропный к имеющим схожую с КФК размерность внеклеточным везикулам), сочетание которых позволило детектировать КФК при проточной цитометрии как OsteoSense 680ЕХ-положительные PKH67-отрицательные события. В результате проточно-цитометрических измерений было выявлено, что медианная концентрация КФК в сыворотке крови условно здоровых доноров составляет 378 (МКИ: 245-495 КФК/мкл), у пациентов с ЦВБ - 258 (МКИ: 178-323), у пациентов с ИБС - 210 (МКИ: 156-280), у пациентов с ХБП5 до гемодиализа - 308 (253-371), у пациентов с ХБП5 после гемодиализа - 292 (234-419) (фиг. 1). Примеры репрезентативных гейтов (графиков прибора) приведены на фиг. 2-6. Техническая верификация разработанной тест-системы на положительном контроле (искусственно синтезированные КФК) и отрицательных контролях (рабочие растворы обоих указанных флюоресцентных красителей, смешанные с чистым Tris-буферным раствором без внесения сыворотки пациентов, а также сыворотка пациентов без внесения флюоресцентных красителей) приведена на рис. 7-9. На основании этих экспериментов был сделан вывод о том, что сыворотка условно здоровых доноров крови обладает сохранной способностью к компенсации нарушений минерального гомеостаза путем агрегации избыточного кальция и фосфора с белками (биохимический процесс, лежащий в основе формирования КФК). Сниженное формирование КФК у пациентов с ССЗ и у больных с ХБП5 свидетельствует о нарушенной способности крови агрегировать избыточный кальций и фосфор (вероятно, вследствие сниженного уровня общего белка и альбумина), что приводит в том числе и к повышению концентрации ионизированного (не связанного с белками) кальция в крови.The compensatory capacity of the body to disturbances in mineral homeostasis is assessed by adding fluorescent dyes OsteoSense 680EX (bisphosphonate, tropic to calcium phosphate) and PKH67 (lipophilic dye, tropic to extracellular vesicles with dimensions similar to CPK) to the test serum, the combination of which made it possible to detect CPK in flow cytometry as OsteoSense 680EX-positive PKH67-negative events. As a result of flow cytometric measurements, it was revealed that the median concentration of CK in the blood serum of conditionally healthy donors is 378 (IQR: 245-495 CK/μl), in patients with CVD - 258 (IQR: 178-323), in patients with ischemic heart disease - 210 (IQR: 156-280), in patients with CKD5 before hemodialysis - 308 (253-371), in patients with CKD5 after hemodialysis - 292 (234-419) (Fig. 1). Examples of representative gates (device graphs) are shown in Figs. 2-6. Technical verification of the developed test system on the positive control (artificially synthesized CPK) and negative controls (working solutions of both fluorescent dyes mixed with pure Tris-buffered solution without adding patients' serum, as well as patients' serum without adding fluorescent dyes) is shown in Figs. 7-9. Based on these experiments, it was concluded that the serum of conditionally healthy blood donors has an intact ability to compensate for mineral homeostasis disorders by aggregating excess calcium and phosphorus with proteins (a biochemical process underlying the formation of CPK). Reduced formation of CPK in patients with CVD and in patients with CKD5 indicates an impaired ability of the blood to aggregate excess calcium and phosphorus (probably due to a reduced level of total protein and albumin), which leads, among other things, to an increase in the concentration of ionized (not bound to proteins) calcium in the blood.
Когда компенсаторный механизм подержания минерального гомеостаза в виде формирования КФК полностью исчерпывает свои возможности по связыванию избыточных ионов кальция с белками, оценивается способность организма к декомпенсации нарушений минерального гомеостаза. В 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты было аликвотировано по 100 мкл сыворотки пациента на лунку с последующим выделением контрольной лунки (с добавлением ультрафильтрованной стерильной бидистиллированной воды) и экспериментальной лунки с предварительно ультрафильтрованными растворами солей кальция и фосфора (+2 ммоль/л CaCl2 и Na2HPO4) (фиг. 10). Данная молярная концентрация указанных солевых растворов была выбрана на основании кривой формирования КФК, показывающей, что именно она индуцирует преципитацию КФК вследствие искусственной декомпенсации минерального гомеостаза у всех без исключения пациентов (фиг. 11). Далее планшеты были инкубированы в течение 24 часов при 37°С, поддержании атмосферы 95% воздуха: 5% CO2 для поддержания рН и высокой влажности для предотвращения высыхания содержимого лунок (фиг. 10). После этого во всех лунках была измерена оптическая плотность на длине волны 650 нм на спектрофотометре Multiskan Sky (Thermo Scientific) с последующим вычитанием фонового шума путем вычитания значений контрольной сыворотки из значений экспериментальной.When the compensatory mechanism for maintaining mineral homeostasis in the form of CPK formation completely exhausts its capacity to bind excess calcium ions with proteins, the body's ability to decompensate for mineral homeostasis disorders is assessed. 100 μl of patient serum per well were aliquoted into 96-well flat-bottomed culture plates, followed by the isolation of a control well (with the addition of ultrafiltered sterile bidistilled water) and an experimental well with pre-ultrafiltered solutions of calcium and phosphorus salts (+2 mmol/l CaCl 2 and Na 2 HPO 4 ) (Fig. 10). This molar concentration of the indicated salt solutions was selected based on the CPK formation curve, showing that it is precisely this concentration that induces CPK precipitation due to artificial decompensation of mineral homeostasis in all patients without exception (Fig. 11). The plates were then incubated for 24 hours at 37°C, maintaining an atmosphere of 95% air: 5% CO2 to maintain pH and high humidity to prevent well content from drying out (Fig. 10). Afterwards, the optical density of all wells was measured at 650 nm using a Multiskan Sky spectrophotometer (Thermo Scientific), followed by background noise subtraction by subtracting the control serum values from the experimental serum values.
В результате апробации данного метода было выявлено, что пациенты с ЦВБ, ИБС, а также ХБП5 до и после гемодиализа характеризуются повышенной склонностью крови к преципитации КФК в сравнении с условно здоровыми донорами (вероятно, вследствие повышенной молярной концентрации ионизированного кальция), что отражает декомпенсацию нарушений минерального гомеостаза крови в условиях искусственного фосфорнокальциевого стресса. Медианное повышение оптической плотности на длине волны 650 нм у условно здоровых доноров крови составило +0,009 усл.ед. (МКИ: 0,003-0,024), у пациентов с ЦВБ - +0,026 усл.ед. (МКИ: 0,015-0,046), у пациентов с ИБС - +0,014 усл.ед. (МКИ: 0,010-0,021), у пациентов с ХБП5 до гемодиализа - +0,018 усл.ед. (МКИ: 0,009-0,028), у пациентов с ХБП5 после гемодиализа - +0,023 усл.ед. (МКИ: 0,015-0,033) (фиг. 12).As a result of testing this method, it was revealed that patients with CVD, IHD, and CKD5 before and after hemodialysis are characterized by an increased tendency of blood to precipitate CPK in comparison with conditionally healthy donors (probably due to an increased molar concentration of ionized calcium), which reflects decompensation of disorders of blood mineral homeostasis under conditions of artificial phosphorus-calcium stress. The median increase in optical density at a wavelength of 650 nm in conditionally healthy blood donors was +0.009 conventional units (IQR: 0.003-0.024), in patients with CVD - +0.026 conventional units (IQR: 0.015-0.046), in patients with IHD - +0.014 conventional units. (IQR: 0.010–0.021), in patients with CKD5 before hemodialysis – +0.018 conventional units (IQR: 0.009–0.028), in patients with CKD5 after hemodialysis – +0.023 conventional units (IQR: 0.015–0.033) (Fig. 12).
Описание чертежейDescription of drawings
Фиг. 1. Концентрация КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительные PKH67-отрицательные события) в сыворотке крови исследованных субъектов. PURE - условно здоровые лица, ЦВБ - цереброваскулярная болезнь, ИБС - ишемическая болезнь сердца, ХБП5 - хроническая болезнь почек 5 стадии. Критерий Краскела-Уоллиса с FDR-поправкой на множественные сравнения. Значения Р указаны над графиками. Каждая точка на графике отражает анализ по одному пациенту. График типа «коробка с усами», центральная линия отражает медиану, границы «коробок» - 25-й и 75-й процентиль, границы «усов» - минимальное и максимальное значения.Fig. 1. Concentration of CK (OsteoSense 680EX-positive PKH67-negative events) in the blood serum of the studied subjects. PURE - conditionally healthy individuals, CEVD - cerebrovascular disease, CAD - ischemic heart disease, CKD5 - chronic kidney disease stage 5. Kruskal-Wallis test with FDR-correction for multiple comparisons. P-values are indicated above the graphs. Each point on the graph reflects the analysis of one patient. Box-and-whisker plot, the central line reflects the median, the borders of the boxes are the 25th and 75th percentiles, the borders of the whiskers are the minimum and maximum values.
Фиг. 2. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (в центре) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Условно здоровые доноры крови.Fig. 2. Representative gates (flow cytometric maps) showing the percentage of CPK (OsteoSense 680EX-positive PKH67-negative events, left), the distribution of event sizes (center), and the stability of CPK detection between samples of the same group (right). Conditionally healthy blood donors.
Фиг. 3. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (в центре) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Пациенты с ЦВБ.Fig. 3. Representative gates (flow cytometric maps) showing the percentage of CPK (OsteoSense 680EX-positive PKH67-negative events, left), the distribution of event sizes (middle) and the stability of CPK detection between samples of the same group (right). Patients with CVD.
Фиг. 4. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (в центре) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Пациенты с ИБС.Fig. 4. Representative gates (flow cytometric maps) showing the percentage of CK (OsteoSense 680EX-positive PKH67-negative events, left), the distribution of event sizes (middle) and the stability of CK detection between samples of the same group (right). Patients with coronary artery disease.
Фиг. 5. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (в центре) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Пациенты с ХБП5 до гемодиализа.Fig. 5. Representative gates (flow cytometric maps) showing the percentage of CK (OsteoSense 680EX-positive PKH67-negative events, left), the distribution of event sizes (middle) and the stability of CK detection between samples of the same group (right). Patients with CKD5 before hemodialysis.
Фиг. 6. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (в центре) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Пациенты с ХБП5 после гемодиализа.Fig. 6. Representative gates (flow cytometric maps) showing the percentage of CK (OsteoSense 680EX-positive PKH67-negative events, left), the distribution of event sizes (middle) and the stability of CK detection between samples of the same group (right). Patients with CKD5 after hemodialysis.
Фиг. 7. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (в центре) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Искусственно синтезированные КФК (положительный контроль).Fig. 7. Representative gates (flow cytometric maps) showing the percentage of CPK (OsteoSense 680EX-positive PKH67-negative events, left), the distribution of event sizes (middle) and the stability of CPK detection between samples of the same group (right). Artificially synthesized CPK (positive control).
Фиг. 8. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (в центре) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Контрольный образец без внесения сыворотки крови (отрицательный контроль).Fig. 8. Representative gates (flow cytometric maps) showing the percentage of CPK (OsteoSense 680EX-positive PKH67-negative events, left), the distribution of event sizes (middle) and the stability of CPK detection between samples of the same group (right). Control sample without addition of blood serum (negative control).
Фиг. 9. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (слева) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Сыворотка крови без внесения флюоресцентных красителей (отрицательный контроль).Fig. 9. Representative gates (flow cytometric maps) showing the percentage of CPK (OsteoSense 680EX-positive PKH67-negative events, left), the distribution of event sizes (left) and the stability of CPK detection between samples of the same group (right). Blood serum without the addition of fluorescent dyes (negative control).
Фиг. 10. Схема определения декомпенсации нарушений минерального гомеостаза крови путем оценки склонности сыворотки крови к формированию КФК при ее перенасыщении ионами Са2+и РО4 3-. Донором ионов кальция является CaCl2, фосфора - Na2HPO4. Выполнение анализа занимает 24 часа в физиологических условиях культивирования клеток с дальнейшим измерением оптической плотности на длине волны 650 нм (ОП650) и последующим вычитанием фоновых значений (ОП650 образца сыворотки, культивируемого в аналогичных условиях, но без добавления CaCl2 и Na2HPO4) из значений экспериментальных.Fig. 10. Scheme for determining decompensation of blood mineral homeostasis disorders by assessing the tendency of blood serum to form CPK when it is supersaturated with Ca 2+ and PO 4 3- ions. The donor of calcium ions is CaCl 2 , and of phosphorus - Na 2 HPO 4 . The analysis takes 24 hours under physiological conditions of cell cultivation with subsequent measurement of optical density at a wavelength of 650 nm (OD 650 ) and subsequent subtraction of background values (OD 650 of a serum sample cultivated under similar conditions, but without the addition of CaCl 2 and Na 2 HPO 4 ) from the experimental values.
Фиг. 11. Тест-кривая формирования КФК при различных добавляемых в сыворотку крови молярных концентрациях CaCl2 и Na2HPO4.Fig. 11. Test curve of CPK formation with different molar concentrations of CaCl 2 and Na 2 HPO 4 added to blood serum.
Фиг. 12. Преципитация КФК (увеличение оптической плотности на длине волны 650 нм при искусственном перенасыщении солями кальция и фосфора) в сыворотке крови исследованных субъектов. PURE - условно здоровые лица, ЦВБ - цереброваскулярная болезнь, ИБС - ишемическая болезнь сердца, ХБП5 - терминальная хроническая почечная недостаточность. Критерий Краскела-Уоллиса с FDR-поправкой на множественные сравнения. Значения Р указаны над графиками. Каждая точка на графике отражает анализ по одному пациенту. График типа «коробка с усами», центральная линия отражает медиану, границы «коробок» - 25-й и 75-й процентиль, границы «усов» - минимальное и максимальное значения.Fig. 12. Precipitation of CPK (increase in optical density at 650 nm wavelength with artificial supersaturation with calcium and phosphorus salts) in the blood serum of the subjects studied. PURE - conditionally healthy individuals, CEVD - cerebrovascular disease, CAD - ischemic heart disease, CKD5 - terminal chronic renal failure. Kruskal-Wallis test with FDR correction for multiple comparisons. P values are indicated above the graphs. Each point on the graph reflects the analysis of one patient. Box-and-whisker plot, the central line reflects the median, the box boundaries are the 25th and 75th percentiles, the whisker boundaries are the minimum and maximum values.
Claims (3)
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2023102489A RU2023102489A (en) | 2024-08-05 |
| RU2829335C2 true RU2829335C2 (en) | 2024-10-30 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170292962A1 (en) * | 2011-11-07 | 2017-10-12 | Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen | Method for Determining the Propensity for Calcification |
| JP6566697B2 (en) * | 2015-04-08 | 2019-08-28 | 学校法人自治医科大学 | Novel calciprotein particle (CPP) measurement method using fluorescent probe |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170292962A1 (en) * | 2011-11-07 | 2017-10-12 | Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen | Method for Determining the Propensity for Calcification |
| JP6566697B2 (en) * | 2015-04-08 | 2019-08-28 | 学校法人自治医科大学 | Novel calciprotein particle (CPP) measurement method using fluorescent probe |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KUTIKHIN A.G. et al. Calciprotein particles. Balancing mineral homeostasis and vascular pathology // Arterioscler Thromb Vasc Biol., 2021, V.41, pp.1607-1624. * |
| SMITH E.R. et al. A novel fluorescent probe-based flow cytometric assay for mineralcontaining nanoparticles in serum // Scientific Reports, 2017, V.7(5686), pp.1-17. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DUDA JR et al. | Concurrent assays of circulating bone Gla-protein and bone alkaline phosphatase: effects of sex, age, and metabolic bone disease | |
| CN111094978B (en) | Immunoturbidimetric method for determining members of calcium binding protein S100 family | |
| CN102105794B (en) | A marker for graft failure and mortality | |
| JP5903270B2 (en) | Immunoassay for galectin-3 | |
| CN106370856B (en) | The urine protein marker of pulmonary fibrosis and its purposes in diagnosis and prognosis | |
| Kumar et al. | Dietary oxalate induces urinary nanocrystals in humans | |
| Asir et al. | Placental vimentin expression in preeclampsia and gestational diabetes mellitus | |
| Bissinger et al. | GFR is a key determinant of red blood cell survival in anemia associated with progressive CKD | |
| RU2829335C2 (en) | Blood mineral homeostasis disorder screening test system | |
| JP2023521339A (en) | Prediction and early diagnosis of acute kidney injury | |
| JP6012108B2 (en) | Prognosis for renal failure | |
| JP2001503863A (en) | Protein extraction method | |
| CN115097138B (en) | Application of a buffer in PGP 9.5 detection kit | |
| Delmas et al. | Bone histomorphometry and serum bone gla‐protein in the diagnosis of primary hyperparathyroidism | |
| RU2504786C1 (en) | Diagnostic technique for urolithiasis | |
| Upmanyu et al. | Co-localization of different Neurotransmitter Transporters on the same Synaptic Vesicle is Bona-fide yet Sparse | |
| JP2003508059A (en) | For identifying persons at risk for vascular disease and cancer | |
| WO2025262039A1 (en) | Method, kit and computer program product for the diagnosis of arthritis and/or prognostic assessment of disease progression in arthritis | |
| JP2000180447A (en) | Judgment method and reagent for judging acute myocardial infarction | |
| JP2002543430A (en) | Method for identifying individuals at risk for irreversible neurological damage comprising the step of quantitatively measuring pepsinogen I (PGI) and vitamin B12 concentrations - Patent Application 20070223333 | |
| HK40072995A (en) | Galectin-3 immunoassay | |
| JPH10170516A (en) | Dilute preservation liquid for lactoferrin | |
| Lau | Identification Of Biomarker And Development Of Screening Method For Kidney Stone Disease [R853. B54 L366 2007 f rb]. | |
| Bleyer et al. | Medullary cystic disease | |
| CN120490481A (en) | Method for detecting collagenase content in biological matrix by electrochemical luminescence immunoassay |