RU2825231C1 - Method for producing grape exosomes - Google Patents
Method for producing grape exosomes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2825231C1 RU2825231C1 RU2023131471A RU2023131471A RU2825231C1 RU 2825231 C1 RU2825231 C1 RU 2825231C1 RU 2023131471 A RU2023131471 A RU 2023131471A RU 2023131471 A RU2023131471 A RU 2023131471A RU 2825231 C1 RU2825231 C1 RU 2825231C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- exosomes
- grape
- minutes
- phosphate buffer
- biomass
- Prior art date
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 88
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 title claims abstract description 68
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 title claims abstract description 68
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 title claims abstract description 68
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 6
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 title description 58
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims abstract description 29
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 28
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000000822 sequential centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 241000219095 Vitis Species 0.000 claims abstract 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 7
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 6
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 4
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 4
- 229920003045 dextran sodium sulfate Polymers 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 4
- 210000004966 intestinal stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001606 7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-[(2S,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one Substances 0.000 description 3
- 240000000560 Citrus x paradisi Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- DFPMSGMNTNDNHN-ZPHOTFPESA-N naringin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC=2C=C3O[C@@H](CC(=O)C3=C(O)C=2)C=2C=CC(O)=CC=2)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O DFPMSGMNTNDNHN-ZPHOTFPESA-N 0.000 description 3
- 229930019673 naringin Natural products 0.000 description 3
- 229940052490 naringin Drugs 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- FTVWIRXFELQLPI-ZDUSSCGKSA-N (S)-naringenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 FTVWIRXFELQLPI-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 101000588302 Homo sapiens Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 102100031701 Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 240000004371 Panax ginseng Species 0.000 description 2
- 244000273928 Zingiber officinale Species 0.000 description 2
- 235000006886 Zingiber officinale Nutrition 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000008397 ginger Nutrition 0.000 description 2
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 2
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 210000002487 multivesicular body Anatomy 0.000 description 2
- WGEYAGZBLYNDFV-UHFFFAOYSA-N naringenin Natural products C1(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2OC(C1)C1=CC=C(CC1)O WGEYAGZBLYNDFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000007625 naringenin Nutrition 0.000 description 2
- 229940117954 naringenin Drugs 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014156 AMP-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010011376 AMP-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000219317 Amaranthaceae Species 0.000 description 1
- 101100425386 Arabidopsis thaliana TIFY7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000125121 Aspergillus carbonarius Species 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 102000005853 Clathrin Human genes 0.000 description 1
- 108010019874 Clathrin Proteins 0.000 description 1
- 208000018458 Colitis-Associated Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 101000737786 Daucus carota Calcium-dependent protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- 244000307700 Fragaria vesca Species 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101000737787 Glycine max Calcium-dependent protein kinase SK5 Proteins 0.000 description 1
- 101000872170 Homo sapiens Polycomb complex protein BMI-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101150017554 LGR5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- VYLQGYLYRQKMFU-UHFFFAOYSA-N Ochratoxin A Natural products CC1Cc2c(Cl)cc(CNC(Cc3ccccc3)C(=O)O)cc2C(=O)O1 VYLQGYLYRQKMFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002789 Panax ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N Resveratrol Natural products OC1=CC=CC(C=CC=2C=C(O)C(O)=CC=2)=C1 QNVSXXGDAPORNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZONYXWQDUYMKFB-UHFFFAOYSA-N SJ000286395 Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)CC1C1=CC=CC=C1 ZONYXWQDUYMKFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 101150021300 TIFY11A gene Proteins 0.000 description 1
- LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N Trans-resveratrol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1\C=C\C1=CC(O)=CC(O)=C1 LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229930193282 clathrin Natural products 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 125000000332 coumarinyl group Chemical class O1C(=O)C(=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 235000018927 edible plant Nutrition 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229930003949 flavanone Natural products 0.000 description 1
- 150000002208 flavanones Chemical class 0.000 description 1
- 235000011981 flavanones Nutrition 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002443 hepatoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 231100000110 immunotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002625 immunotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000006859 interspecies communication Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 230000034778 micropinocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 1
- 108010001078 naringinase Proteins 0.000 description 1
- 230000003589 nefrotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000031990 negative regulation of inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 231100000381 nephrotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- RWQKHEORZBHNRI-BMIGLBTASA-N ochratoxin A Chemical compound C([C@H](NC(=O)C1=CC(Cl)=C2C[C@H](OC(=O)C2=C1O)C)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 RWQKHEORZBHNRI-BMIGLBTASA-N 0.000 description 1
- DAEYIVCTQUFNTM-UHFFFAOYSA-N ochratoxin B Natural products OC1=C2C(=O)OC(C)CC2=CC=C1C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 DAEYIVCTQUFNTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 235000021283 resveratrol Nutrition 0.000 description 1
- 229940016667 resveratrol Drugs 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000024053 secondary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001629 stilbenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000021286 stilbenes Nutrition 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и позволяет получать экзосомальные везикулы (экзосомы) растений, в частности винограда, которые могут быть использованы в медицинской и косметической промышленности.The invention relates to biotechnology and makes it possible to obtain exosomal vesicles (exosomes) of plants, in particular grapes, which can be used in the medical and cosmetic industries.
Экзосомы представляют собой биогенные мембранные образования с характерным размером от 30 до 200 нм, которые высвобождаются из клетки путем слияния мультивезикулярного тельца (МВТ) с плазматической мембраной [Yang M, Liu X, Luo Q, Xu L, Chen F. An efficient method to isolate lemon derived extracellular vesicles for gastric cancer therapy. J Nanobiotechnology 2020; 18: 100]. Состав экзосом варьируется в зависимости от объекта, из которого их получают. Однако все из них содержат специфические белки, матричную РНК (мРНК), микроРНК и другие некодирующие РНК, а также липиды и никзомолекулярные соединения [Rutter BD, Innes RW. Extracellular Vesicles Isolated from the Leaf Apoplast Carry Stress-Response Proteins. Plant Physiol 2017; 173:728-741].Exosomes are biogenic membrane entities with a characteristic size from 30 to 200 nm, which are released from the cell by the fusion of a multivesicular body (MVB) with the plasma membrane [Yang M, Liu X, Luo Q, Xu L, Chen F. An efficient method to isolate lemon derived extracellular vesicles for gastric cancer therapy. J Nanobiotechnology 2020; 18: 100]. The composition of exosomes varies depending on the object from which they are obtained. However, all of them contain specific proteins, messenger RNA (mRNA), microRNA and other non-coding RNAs, as well as lipids and non-molecular compounds [Rutter BD, Innes RW. Extracellular Vesicles Isolated from the Leaf Apoplast Carry Stress-Response Proteins. Plant Physiol 2017; 173:728-741].
В последнее десятилетие внимание исследователей привлекает возможность использования экзосом растений в качестве системы доставки лекарственных соединений. Растительное происхождение и высокая биосовместимость, а также универсальный терапевтический потенциал экзосом дает им преимущество перед синтетическими липосомами, используемыми в качестве наноносителей.In the last decade, the attention of researchers has been attracted by the possibility of using plant exosomes as a system for delivering medicinal compounds. The plant origin and high biocompatibility, as well as the universal therapeutic potential of exosomes, give them an advantage over synthetic liposomes used as nanocarriers.
Было обнаружено, что экзосомы растений обладают выраженным противовоспалительным действием, участвуя в регуляции иммунного ответа. Благодаря способности экзосом к межвидовой транслокализации, содержащиеся в них молекулы регулируют взаимодействие между кишечной микробиотой и иммунной системой хозяина, что приводит к гомеостатическому балансу [Deng Z, Rong Y, Teng Y, Mu J. Broccoli-derived nanoparticle inhibits mouse colitis by activating dendritic cell amp-activated protein kinase. Mol Ther 2017; 25: 1641-1654]. Кроме того, экзосомы осуществляют доставку нарингина, ключевого флаванона грейпфрута. При высвобождении нарингин гидролизуется кишечной микробиотой в его активный метаболит нарингенин. Было показано, что обе формы проявили противоопухолевое действие на модели колита у мышей, вызванного декстраном сульфата натрия [Ines Amaro M, Rocha J, Vila-Real H. Anti-inflammatory activity of naringin and the biosynthesised naringenin by naringinase immobilized in microstructured materials in a model of DSS-induced colitis in mice. Food Res Int 2009; 42: 1010-1017]. При загрузке экзосом из имбиря доксорубицином с целью его адресной доставки, они эффективно внедрялись в клетки опухолевой модели толстой кишки и подавляли их рост. Предположительно экзосомы высвобождают доксорубицин при кислом рН внеклеточной микросреды опухолей и уменьшают побочные эффекты доксорубицина [Zhuang X, Deng ZB, Mu J, Zhang L. Ginger-derived nanoparticles protect against alcohol-induced liver damage. J Extracell Vesicles 2015; 4: 28713]. Экзосомы из винограда также проявляют противоопухолевое действие. Эффект достигался за счет увеличения экспрессии генов Lgr5, BMI1, служащих маркерами стволовых клеток кишечника и генов, регулирующих рост и пролиферацию стволовых клеток [Ju S, Mu J, Dokland T, Zhuang X. Grape exosome-like nanoparticles induce intestinal stem cells and protect mice from DSS-induced colitis. Mol Ther 2013; 21: 1345-1357].Plant exosomes have been found to have a pronounced anti-inflammatory effect, participating in the regulation of the immune response. Due to the ability of exosomes to interspecies translocalization, the molecules contained in them regulate the interaction between the intestinal microbiota and the host immune system, which leads to homeostatic balance [Deng Z, Rong Y, Teng Y, Mu J. Broccoli-derived nanoparticle inhibits mouse colitis by activating dendritic cell amp-activated protein kinase. Mol Ther 2017; 25: 1641-1654]. In addition, exosomes deliver naringin, a key flavanone of grapefruit. Upon release, naringin is hydrolyzed by the intestinal microbiota into its active metabolite naringenin. Both forms were shown to exhibit antitumor activity in a mouse model of dextran sodium sulfate-induced colitis [Ines Amaro M, Rocha J, Vila-Real H. Anti-inflammatory activity of naringin and the biosynthesised naringenin by naringinase immobilized in microstructured materials in a model of DSS-induced colitis in mice. Food Res Int 2009; 42: 1010-1017]. When ginger exosomes were loaded with doxorubicin for targeted delivery, they were effectively introduced into cells of a colon tumor model and suppressed their growth. Presumably, exosomes release doxorubicin at the acidic pH of the extracellular microenvironment of tumors and reduce the side effects of doxorubicin [Zhuang X, Deng ZB, Mu J, Zhang L. Ginger-derived nanoparticles protect against alcohol-induced liver damage. J Extracell Vesicles 2015; 4: 28713]. Grape exosomes also exhibit antitumor activity. The effect was achieved by increasing the expression of the Lgr5, BMI1 genes, which serve as markers of intestinal stem cells and genes regulating the growth and proliferation of stem cells [Ju S, Mu J, Dokland T, Zhuang X. Grape exosome-like nanoparticles induce intestinal stem cells and protect mice from DSS-induced colitis. Mol Ther 2013; 21: 1345-1357].
Помимо противоопухолевого действия, известно об использовании экзосом растений в регенеративной медицине. Было показано, что экзосомы винограда способны проникать в стволовые клетки кишечника, индуцировать их пролиферацию и тем самым регенерировать эпителиальную ткань посредством регуляции экспрессии генов SOX2, Oct4 и Klf4, ответственных за плюрипотентность [Cho EG, Choi SY, Kim H. Panax ginseng-derived extracellular vesicles facilitate anti-senescence effects in human skin cells: an eco-friendly and sustainable way to use ginseng substances. Cells 2021; 10: 1-25]. В то же время экзосомы имбиря проявляли гепатопротекторную активность за счет снижения генерации активных форм кислорода в поврежденной алкоголем печени мышей. Благодаря биоактивным компонентам они могут повлиять на активацию ядерного фактора NRF2. Как известно, стимуляция NRF2 приводит к экспрессии генов детоксикации печени и антиоксидантов, что в совокупности способствует гепатопротекции [Zhuang X, Deng ZB, Mu J, Zhang L. Ginger-derived nanoparticles protect against alcohol-induced liver damage. J Extracell Vesicles 2015; 4: 28713].In addition to antitumor activity, plant exosomes are known to be used in regenerative medicine. It has been shown that grape exosomes are able to penetrate intestinal stem cells, induce their proliferation, and thereby regenerate epithelial tissue by regulating gene expression.SOX2,Oct4 And Klf4, responsible for pluripotency [Cho EG, Choi SY, Kim H. Panax ginseng-derived extracellular vesicles facilitate anti-senescence effects in human skin cells: an eco-friendly and sustainable way to use ginseng substances. Cells 2021; 10: 1-25]. At the same time, ginger exosomes exhibited hepatoprotective activity by reducing the generation of reactive oxygen species in the liver of mice damaged by alcohol. Due to their bioactive components, they can affect the activation of the nuclear factor NRF2. As is known, stimulation of NRF2 leads to the expression of liver detoxification and antioxidant genes, which together contribute to hepatoprotection [Zhuang X, Deng ZB, Mu J, Zhang L. Ginger-derived nanoparticles protect against alcohol-induced liver damage. J Extracell Vesicles 2015; 4: 28713].
На примере экзосом из грейпфрута, нагруженных метотрексатом, исследованы иммунологические реакции организма. Было показано, что при пероральном введении таких экзосом они эффективно таргетируют мышиные макрофаги F4/80, локализованные в кишечнике, посредством микропиноцитоза и клатрин-зависимых клеточных путей поглощения. После введения экзосом приостановилось уменьшение веса и сокращение длины толстой кишки. Наряду с очевидной противовоспалительной реакцией также снизилась продукция провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-1β и IL-6. Побочные эффекты при применении метотрексата в составе экзосом значительно уменьшались [Wang B, Zhuang X, Deng ZB, Jiang H. Targeted drug delivery to intestinal macrophages by bioactive nanovesicles released from grapefruit. Mol Ther 2014; 22: 522-534]. Также известны аналогичные исследования с использованием экзосом из брокколи, винограда и моркови, что подтверждает значительный потенциал экзосом в модуляции иммунологических реакций [Mu J, Zhuang X, Wang Q, Jiang H. Interspecies communication between plant and mouse gut host cells through edible plant derived exosome-like nanoparticles. Mol Nutr Food Res 2014; 58: 1561-1573].Using methotrexate-loaded grapefruit exosomes as an example, immunological responses of the body were studied. It was shown that when such exosomes were administered orally, they effectively targeted murine F4/80 macrophages localized in the intestine via micropinocytosis and clathrin-dependent cellular uptake pathways. After exosome administration, weight loss and reduction in colon length were halted. Along with an obvious anti-inflammatory response, the production of proinflammatory cytokines TNF-α, IL-1β was also reduced. And IL-6. Side effects when using methotrexate in exosomes were significantly reduced [Wang B, Zhuang X, Deng ZB, Jiang H. Targeted drug delivery to intestinal macrophages by bioactive nanovesicles released from grapefruit. Mol Ther 2014; 22: 522-534]. Similar studies using exosomes from broccoli, grapes and carrots are also known, which confirms the significant potential of exosomes in modulating immunological responses [Mu J, Zhuang X, Wang Q, Jiang H. Interspecies communication between plant and mouse gut host cells through edible plant derived exosome-like nanoparticles. Mol Nutr Food Res 2014; 58: 1561-1573].
Растительные экзосомы имеют ряд преимуществ в доставке веществ в сравнении с существующими аналогами. Во-первых, небольшой размер, отрицательный заряд, сродство с плазматической мембраной, выраженная физико-химическая стабильность при различных значениях рН и температурах позволяют экзосомам эффективно проникать целевые клетки. При этом фосфолипидный бислой защищает содержимое экзосомы от ферментативного разложения протеиназами и нуклеазами. Во-вторых, экзосомы имеют высокий потенциал для адресной доставки терапевтических агентов, что уменьшает потенциальную опасность нежелательной реакции при клиническом использовании. В-третьих, экзосомы успешно диффундируют через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что позволяет избежать воспалительной реакции, в отличие от искусственно изготовленных липосом и животных экзосом [Basu A, Nguyen A, Betts NM. Strawberry as a functional food: an evidence-based review. Crit Rev Food Sci Nutr 2014; 54: 790-806].Plant exosomes have a number of advantages in substance delivery compared to existing analogues. Firstly, small size, negative charge, affinity for the plasma membrane, pronounced physicochemical stability at various pH values and temperatures allow exosomes to effectively penetrate target cells. At the same time, the phospholipid bilayer protects the contents of the exosome from enzymatic degradation by proteinases and nucleases. Secondly, exosomes have a high potential for targeted delivery of therapeutic agents, which reduces the potential danger of an adverse reaction during clinical use. Thirdly, exosomes successfully diffuse through the blood-brain barrier (BBB), which avoids an inflammatory reaction, unlike artificially produced liposomes and animal exosomes [Basu A, Nguyen A, Betts NM. Strawberry as a functional food: an evidence-based review. Crit Rev Food Sci Nutr 2014; 54: 790-806].
В настоящее время наибольшее число исследований посвящено использованию нативных экзосом, содержащих присущие данному виду растения биомолекулы: белки, микроРНК, вторичные метаболиты и др. При этом терапевтический потенциал нативных экзосом определяется главным образом видом растения, используемым для выделения [Dad HA, Gu TW, Zhu AQ, Huang LQ. Plant exosome-like nanovesicles: emerging therapeutics and drug delivery nanoplatforms. Mol Ther 2021; 29: 13-31]. Стоит отметить, что состав молекул в нативных экзосомах и, как следствие, биологические свойства нестабильны. Кроме того, для некоторых редких или прихотливых растений остается актуальной проблема наработки достаточного количества биомассы для выделения экзосом в промышленных масштабах.Currently, the largest number of studies are devoted to the use of native exosomes containing biomolecules inherent to a given plant species: proteins, microRNA, secondary metabolites, etc. At the same time, the therapeutic potential of native exosomes is determined mainly by the plant species used for isolation [Dad HA, Gu TW, Zhu AQ, Huang LQ. Plant exosome-like nanovesicles: emerging therapeutics and drug delivery nanoplatforms. Mol Ther 2021; 29: 13-31]. It is worth noting that the composition of molecules in native exosomes and, as a consequence, their biological properties are unstable. In addition, for some rare or capricious plants, the problem of producing a sufficient amount of biomass for the isolation of exosomes on an industrial scale remains relevant.
Таким образом, несмотря на большой потенциал использования экзосом, остается значительный пробел в разработке современных способов получения возобновляемого сырья. По мнению авторов в этом отношении наибольшей перспективностью обладают выращиваемые in vitro на искусственных питательных средах клетки растений, т.н. каллусные культуры. Культура каллусных клеток является более простой системой по сравнению с целым растением, а параметры культивирования легко поддаются регулированию и являются стабильными.Thus, despite the great potential of using exosomes, there remains a significant gap in the development of modern methods for obtaining renewable raw materials. According to the authors, in this regard, the most promising are plant cells grown in vitro on artificial nutrient media, the so-called callus cultures. The culture of callus cells is a simpler system compared to the whole plant, and the cultivation parameters are easily regulated and are stable.
Известен способ получения экзосом винограда, в котором ягоды винограда очищают от кожуры, добавляют буферный раствор и готовят гомогенат, который центрифугируют в градиенте сахарозы [Ju S, Mu J, Dokland T, Zhuang X. Grape exosome-like nanoparticles induce intestinal stem cells and protect mice from DSS-induced colitis. Mol Ther 2013; 21:1345-1357].A method for obtaining grape exosomes is known, in which grape berries are peeled, a buffer solution is added, and a homogenate is prepared, which is centrifuged in a sucrose gradient [Ju S, Mu J, Dokland T, Zhuang X. Grape exosome-like nanoparticles induce intestinal stem cells and protect mice from DSS-induced colitis. Mol Ther 2013; 21:1345-1357].
Недостатком этого способа является использование нестандартизированного исходного растительного материала, биохимический состав которого варьируется в зависимости от сезона сбора и внешних факторов [Ali K, Maltese F, Fortes AM, Pais MS, Choi YH, Verpoorte R. Monitoring biochemical changes during grape berry development in Portuguese cultivars by NMR spectroscopy. Food Chem 2011; 124: 1760-1769; Miras-Avalos JM, Intrigliolo DS. Grape Composition under Abiotic Constrains: Water Stress and Salinity. Front Plant Sci 2017; 8], а также может быть контаминирован нежелательной микрофлорой, в т.ч. небезопасной для человека [Habib W. Fungal pathogens associated with harvested table grapes in Lebanon, and characterization of the mycotoxigenic genera. Phytopathol Mediterr 2021; 60: 427-439].The disadvantage of this method is the use of non-standardized source plant material, the biochemical composition of which varies depending on the season of collection and external factors [Ali K, Maltese F, Fortes AM, Pais MS, Choi YH, Verpoorte R. Monitoring biochemical changes during grape berry development in Portuguese cultivars by NMR spectroscopy. Food Chem 2011; 124: 1760-1769; Miras-Avalos JM, Intrigliolo DS. Grape Composition under Abiotic Constrains: Water Stress and Salinity. Front Plant Sci 2017; 8], and can also be contaminated with unwanted microflora, including those unsafe for humans [Habib W. Fungal pathogens associated with harvested table grapes in Lebanon, and characterization of the mycotoxigenic genera. Phytopathol Mediterr 2021; 60: 427-439].
Особую опасность представляет заражение ягод винограда грибами рода Aspergillus spp., которые продуцируют охратоксин А – иммунотоксичное, нефротоксичное и карценогенное производное кумарина [Giannoukos K, Giannoukos S, Lagogianni C, Tsitsigiannis DI, Taylor S. Analysis of volatile emissions from grape berries infected with Aspergillus carbonarius using hyphenated and portable mass spectrometry. Sci Rep 2020; 10: 21179]. К тому же авторы работы используют центрифугирование в градиенте сахарозы для очищения выделенных экзосом, что является весьма трудозатратной и дорогостоящей процедурой.Of particular danger is the contamination of grape berries with fungi of the genus Aspergillus spp., which produce ochratoxin A, an immunotoxic, nephrotoxic and carcinogenic derivative of coumarin [Giannoukos K, Giannoukos S, Lagogianni C, Tsitsigiannis DI, Taylor S. Analysis of volatile emissions from grape berries infected with Aspergillus carbonarius using hyphenated and portable mass spectrometry. Sci Rep 2020; 10: 21179]. In addition, the authors of the work use sucrose gradient centrifugation to purify the isolated exosomes, which is a very labor-intensive and expensive procedure.
Кроме того, дзета-потенциал раствора растительных экзосом лежит в очень широком диапазоне от −69,6 до +2,52 мВ.In addition, the zeta potential of the plant exosome solution lies in a very wide range from −69.6 to +2.52 mV.
В качестве ближайшего аналога (прототипа) принят способ выделения микровезикул из растений семейства амарантовых, включающий подготовку исходного материала и его гомогенизацию, последовательное центрифугирование в два этапа, отбор жидкой фазы и ее ультрацентрифугирование, суспендирование полученного осадка растительных экзосом в буфере и повторное ультрацентрифугирование при тех же условиях [патент РФ № 2771096, МПК A61K 36/21, B01D 21/26, B01D 61/14, дата публикации 26.04.2022 г.].The closest analogue (prototype) adopted is a method for isolating microvesicles from plants of the amaranth family, including the preparation of the starting material and its homogenization, sequential centrifugation in two stages, collection of the liquid phase and its ultracentrifugation, suspension of the resulting sediment of plant exosomes in a buffer and repeated ultracentrifugation under the same conditions [RU Patent No. 2771096, IPC A61K 36/21, B01D 21/26, B01D 61/14, publication date 04/26/2022].
Недостатком прототипа является большой размер получаемых внеклеточных везикул, диаметр которых достигает 50-1200 нм.The disadvantage of the prototype is the large size of the resulting extracellular vesicles, the diameter of which reaches 50-1200 nm.
Проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа получения экзосом винограда, в котором были бы сглажены вышеуказанные недостатки.The problem that the claimed invention is aimed at solving is the development of a method for obtaining grape exosomes in which the above-mentioned shortcomings would be smoothed out.
Технический результат, проявляющийся при решении поставленной проблемы, выражается в следующем:The technical result that emerges when solving the problem is expressed as follows:
1. расширение ассортимента используемого исходного материала, обладающего более стандартизированными свойствами, за счет:1. expansion of the range of used source materials with more standardized properties, due to:
- использования независимого от внешних факторов и самовоспроизводимого биотехнологического источника экзосом винограда;- the use of a biotechnological source of grape exosomes that is independent of external factors and self-reproducing;
- культивирования в стандартных условиях, что позволяет получать большое количество экзосом, биологически равноценных выделенным из растений;- cultivation under standard conditions, which allows obtaining a large number of exosomes that are biologically equivalent to those isolated from plants;
- накопления биомассы в асептических условиях, что позволяет избежать заражения каллусной культуры опасными для человека патогенами или их производными;- accumulation of biomass under aseptic conditions, which avoids contamination of the callus culture with pathogens dangerous to humans or their derivatives;
2. обеспечение возможности получения экзосом винограда:2. Providing the possibility of obtaining grape exosomes:
- со средним размером 200-350 нм;- with an average size of 200-350 nm;
- с более узким диапазоном значений поверхностного заряда (дзета-потенциала), что способствует повышению однородности;- with a narrower range of surface charge values (zeta potential), which contributes to increased homogeneity;
- с выходом не менее 4,4 мг на 1 г использованной сырой биомассы клеток.- with a yield of at least 4.4 mg per 1 g of used crude cell biomass.
Поставленная проблема решается тем, что способ получения экзосом винограда, включающий подготовку исходного материала и его гомогенизацию, последовательное центрифугирование в два этапа, отбор жидкой фазы и ее ультрацентрифугирование, суспендирование полученного осадка растительных экзосом в буфере и повторное ультрацентрифугирование при тех же условиях, отличается тем, что в качестве исходного материала используют биомассу каллусной культуры клеток винограда, которую гомогенизируют с фосфатным буфером при их соотношении 1 г : 5 мл – 1 г : 15 мл, полученную гомогенизированную смесь центрифугируют в течение 19-21 минут при 9 000-11 000g, далее повторно центрифугируют супернатант в течение 19-21 минут при 19 000-21 000g, жидкую фазу пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и ультрацентрифугируют ее в течение 59-61 минут при 90 000-110 000g, полученный осадок экзосом винограда суспендируют в фосфатном буфере, причем на 1 г биомассы каллусной культуры клеток винограда берут 0,9-1,1 мл фосфатного буфера, и повторно ультрацентрифугируют в течение 59-61 минут при 90 000-110 000g.The problem posed is solved in that the method for obtaining grape exosomes, including the preparation of the starting material and its homogenization, sequential centrifugation in two stages, collection of the liquid phase and its ultracentrifugation, suspension of the obtained sediment of plant exosomes in a buffer and repeated ultracentrifugation under the same conditions, differs in that the starting material used is the biomass of the callus culture of grape cells, which is homogenized with a phosphate buffer at a ratio of 1 g: 5 ml - 1 g: 15 ml, the resulting homogenized mixture is centrifuged for 19-21 minutes at 9,000-11,000 g, then the supernatant is centrifuged again for 19-21 minutes at 19,000-21,000 g, the liquid phase is passed through a membrane filter with a pore diameter of 0.45 μm and ultracentrifuged for 59-61 minutes at 90,000-110,000g, the resulting sediment of grape exosomes is suspended in a phosphate buffer, with 0.9-1.1 ml of phosphate buffer taken per 1 g of grape cell callus culture biomass, and ultracentrifuged again for 59-61 minutes at 90,000-110,000g.
Сопоставительный анализ признаков заявляемого изобретения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявляемого решения критерию «новизна».A comparative analysis of the features of the claimed invention with the features of the prototype and analogues indicates that the claimed solution meets the criterion of “novelty”.
При этом отличительные признаки формулы изобретения обеспечивают решение следующих функциональных задач.At the same time, the distinctive features of the invention formula provide a solution to the following functional problems.
Признак, указывающий что «в качестве исходного материала используют биомассу каллусной культуры клеток винограда» описывает используемый исходный материал, обладающий более стандартизированными свойствами, за счет:The attribute indicating that “the biomass of grape cell callus culture is used as the starting material” describes the starting material used, which has more standardized properties, due to:
- использования независимого от внешних факторов и самовоспроизводимого биотехнологического источника растительных экзосом;- the use of a biotechnological source of plant exosomes that is independent of external factors and self-reproducing;
- культивирования в стандартных условиях, что позволяет получать большое количество экзосом, биологически равноценных выделенным из растений;- cultivation under standard conditions, which allows obtaining a large number of exosomes that are biologically equivalent to those isolated from plants;
- накопления биомассы в асептических условиях, что позволяет избежать заражения каллусной культуры опасными для человека патогенами или их производными.- accumulation of biomass under aseptic conditions, which avoids contamination of the callus culture with pathogens dangerous to humans or their derivatives.
Признак, указывающий что «биомассу каллусной культуры клеток винограда гомогенизируют с фосфатным буфером при их соотношении 1 г : 5 мл – 1 г : 15 мл» способствует выделению экзосом винограда из исходного материала.The feature indicating that “the biomass of grape cell callus culture is homogenized with phosphate buffer at a ratio of 1 g: 5 ml – 1 g: 15 ml” facilitates the isolation of grape exosomes from the source material.
Признак, указывающий что «полученную гомогенизированную смесь центрифугируют в течение 19-21 минут при 9 000-11 000g» обеспечивает осаждение клеточного дебриса.The feature indicating that “the resulting homogenized mixture is centrifuged for 19-21 minutes at 9,000-11,000g” ensures sedimentation of cellular debris.
Признак, указывающий что «повторно центрифугируют супернатант в течение 19-21 минут при 19 000-21 000 g» обеспечивает осаждение мелкой взвеси, содержащей субклеточные органеллы.The feature that states "re-centrifuge the supernatant for 19-21 minutes at 19,000-21,000 g" ensures sedimentation of the fine suspension containing subcellular organelles.
Признак, указывающий что «жидкую фазу пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм», позволяет ограничить размер получаемых экзосом винограда.The feature indicating that “the liquid phase is passed through a membrane filter with a pore diameter of 0.45 µm” allows us to limit the size of the grape exosomes obtained.
Признак, указывающий, что жидкую фазу «ультрацентрифугируют в течение 59-61 минут при 90 000-110 000g», обеспечивает осаждение экзосом винограда.The feature indicating that the liquid phase is “ultracentrifuged for 59-61 minutes at 90,000-110,000g” ensures the sedimentation of grape exosomes.
Признак, указывающий что «осадок экзосом винограда суспендируют в фосфатном буфере… и повторно ультрацентрифугируют в течение 59-61 минут при 90 000-110 000g» позволяет очистить экзосомы винограда от возможных примесей.The feature indicating that “the grape exosome pellet is suspended in phosphate buffer… and re-ultracentrifuged for 59-61 minutes at 90,000-110,000g” allows the grape exosomes to be purified from possible impurities.
Признак, указывающий что «на 1 г биомассы каллусной культуры клеток винограда берут 0,9-1,1 мл фосфатного буфера» описывает количество фосфатного буфера, необходимое для промывки осадка экзосом винограда.The sign indicating that “0.9-1.1 ml of phosphate buffer is taken per 1 g of grape cell callus culture biomass” describes the amount of phosphate buffer required to wash the grape exosome sediment.
Другие отличительные признаки и преимущества изобретения ясно вытекают из описания, приведенного ниже для иллюстрации и не являющегося ограничительным, со ссылками на прилагаемые чертежи:Other distinctive features and advantages of the invention are clearly evident from the description given below for illustration and not limitation, with reference to the accompanying drawings:
на фиг.1 показано распределение размеров экзосом из каллусной культуры винограда;Fig. 1 shows the size distribution of exosomes from grape callus culture;
на фиг.2 изображен поверхностный заряд экзосом из каллусной культуры винограда;Fig. 2 shows the surface charge of exosomes from grape callus culture;
на фиг.3 представлен внешний вид осадка экзосом из каллусной культуры винограда.Fig. 3 shows the appearance of the exosome sediment from grape callus culture.
Заявляемый способ осуществляют на стандартном оборудовании в несколько этапов.The claimed method is carried out on standard equipment in several stages.
Подготовка исходного материала включает получение каллусной культуры и ее выращиваниеPreparation of the source material includes obtaining a callus culture and growing it
Каллусную культуру получают стандартным методом [Bonner J. Plant Tissue Cultures from a Hormone Point of View. Proc Natl Acad Sci 1936; 22: 426-430].Callus culture is obtained by the standard method [Bonner J. Plant Tissue Cultures from a Hormone Point of View. Proc Natl Acad Sci 1936; 22: 426-430].
Каллусная культура винограда характеризуется следующими признаками:Callus culture of grapes is characterized by the following features:
1) культурально-морфологические признаки: рыхлая, быстро растущая биомасса клеток, индекс роста в экспоненциальной фазе составляет 16±0,4, имеют беловато-желтоватый цвет;1) cultural and morphological characteristics: loose, rapidly growing cell biomass, growth index in the exponential phase is 16±0.4, have a whitish-yellowish color;
2) биохимические признаки: каллус характеризуется способностью к продукции стильбенов [Makhazen DS, Veremeichik GN, Shkryl YN, Grigorchuk VP, Tchernoded GK, Degtyarenko AI, Bulgakov VP. RNA inhibition of the JAZ9 gene increases the production of resveratrol in grape cell cultures. Plant Cell. Tissue Organ Cult 2021; 147: 611-618].2) biochemical characteristics: callus is characterized by the ability to produce stilbenes [Makhazen DS, Veremeichik GN, Shkryl YN, Grigorchuk VP, Tchernoded GK, Degtyarenko AI, Bulgakov VP. RNA inhibition of the JAZ9 gene increases the production of resveratrol in grape cell cultures. Plant Cell. Tissue Organ Cult 2021; 147: 611-618].
Каллусная культура винограда не токсична, а при ее получении и культивировании используют безопасные для здоровья человека компоненты.The grape callus culture is not toxic, and its production and cultivation uses components that are safe for human health.
Полученную каллусную культуру клеток винограда массой 1 г помещают в колбу (объем 250 мл) с 60 мл питательной среды «WB/A» [Bulgakov VP, Gorpenchenko TY, Shkryl YN, Veremeichik GN, Mischenko NP, Avramenko TV, Fedoreyev SA, Zhuravlev YN. CDPK-driven changes in the intracellular ROS level and plant secondary metabolism. Bioeng Bugs 2011; 2: 327-30] с добавлением растительных гормонов 6-бензилоаминопурин (0,5 мг/л) и α-нафтилуксусной кислоты (2 мг/л), после чего культивируют в темноте при температуре 25 °С и относительной влажности воздуха 70 % в течение 30 суток.The resulting callus culture of grape cells weighing 1 g is placed in a flask (volume 250 ml) with 60 ml of the nutrient medium "W B/A " [Bulgakov VP, Gorpenchenko TY, Shkryl YN, Veremeichik GN, Mischenko NP, Avramenko TV, Fedoreyev SA, Zhuravlev YN. CDPK-driven changes in the intracellular ROS level and plant secondary metabolism. Bioeng Bugs 2011; 2: 327-30] with the addition of plant hormones 6-benzyloaminopurine (0.5 mg/l) and α-naphthylacetic acid (2 mg/l), after which it is cultivated in the dark at a temperature of 25 °C and a relative air humidity of 70% for 30 days.
Получают 10-20 г сырой каллусной культуры винограда с одной колбы. По истечении периода культивирования каллусную культуру винограда извлекают из культуральных сосудов, взвешивают и используют для выделения экзосом.10-20 g of raw grape callus culture is obtained from one flask. After the cultivation period, the grape callus culture is removed from the culture vessels, weighed and used for exosome isolation.
При этом выращивание каллусной культуры винограда производится в строго асептических условиях, а ее биохимический состав стабилен в течение длительного культивирования благодаря использованию стандартных питательных сред.Moreover, the cultivation of grape callus culture is carried out in strictly aseptic conditions, and its biochemical composition is stable during long-term cultivation due to the use of standard nutrient media.
Приготовление основыPreparing the base
Готовят гомогенизированную смесь, для чего биомассу каллусной культуры клеток винограда растирают с фосфатным буфером (0,01 М натрий фосфорнокислый однозамещенный, 0,0018 М натрий фосфорнокислый двузамещенный, 0,0027 М хлорид калия, 0,137 М хлорид натрия, pH 7.4) при их соотношении 1 г : 5 мл – 1 г : 15 мл.A homogenized mixture is prepared by grinding the biomass of grape cell callus culture with a phosphate buffer (0.01 M sodium phosphate monobasic, 0.0018 M sodium phosphate dibasic, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride, pH 7.4) in a ratio of 1 g: 5 ml – 1 g: 15 ml.
Полученную гомогенизированную смесь центрифугируют в течение 19-21 минут при 9 000-11 000g и температуре 3-5 °С.The resulting homogenized mixture is centrifuged for 19-21 minutes at 9,000-11,000g and a temperature of 3-5 °C.
Далее повторно центрифугируют супернатант в течение 19-21 минут при 19 000-21 000g и температуре 3-5 °С.The supernatant is then centrifuged again for 19–21 minutes at 19,000–21,000 g and a temperature of 3–5 °C.
Жидкую фазу пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.The liquid phase is passed through a membrane filter with a pore diameter of 0.45 µm.
Выделение экзосом винограда из основы и их очисткаIsolation of grape exosomes from the base and their purification
Отобранную жидкую фазу ультрацентрифугируют в течение 59-61 минут при 90 000-110 000g и температуре 3-5 °С.The collected liquid phase is ultracentrifuged for 59-61 minutes at 90,000-110,000g and a temperature of 3-5 °C.
Полученный осадок экзосом винограда промывают в фосфатном буфере (0,01 М натрий фосфорнокислый однозамещенный, 0,0018 М натрий фосфорнокислый двузамещенный, 0,0027 М хлорид калия, 0,137 М хлорид натрия, pH 7.4), причем на 1 г биомассы каллусной культуры клеток винограда берут 0,9-1,1 мл фосфатного буфера, и повторно ультрацентрифугируют в течение 59-61 минут при 90 000-110 000g и температуре 3-5 °С.The obtained sediment of grape exosomes is washed in a phosphate buffer (0.01 M sodium phosphate monobasic, 0.0018 M sodium phosphate dibasic, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride, pH 7.4), with 0.9-1.1 ml of phosphate buffer taken per 1 g of grape cell callus culture biomass, and ultracentrifuged again for 59-61 minutes at 90,000-110,000g and a temperature of 3-5 °C.
Подготовка целевого продукта к хранениюPreparing the target product for storage
Полученный очищенный осадок экзосом винограда имеет характерную слабую желтую или желто-оранжевую окраску.The resulting purified sediment of grape exosomes has a characteristic weak yellow or yellow-orange color.
Целевой продукт, т.е. очищенные экзосомы винограда, суспендируют в фосфатном буфере (0,01 М натрий фосфорнокислый однозамещенный, 0,0018 М натрий фосфорнокислый двузамещенный, 0,0027 М хлорид калия, 0,137 М хлорид натрия, pH 7.4) объемом 200-400 мкл и хранят при температуре 4 °С в течение нескольких суток или замораживают при температуре -86 °С для долговременного хранения.The target product, i.e. purified grape exosomes, is suspended in a phosphate buffer (0.01 M sodium phosphate, 0.0018 M sodium phosphate, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride, pH 7.4) in a volume of 200-400 μl and stored at 4 °C for several days or frozen at -86 °C for long-term storage.
Точный размер и содержание экзосом винограда определяют на основе анализа траекторий наночастиц с помощью прибора NS500 (Malvern Panalytical, Великобритания) (см. фиг. 1). Проведенные исследования показали, что каллусная культура винограда позволяет получить экзосомы с преобладающим размером 200-350 нм.The exact size and content of grape exosomes are determined based on the analysis of nanoparticle trajectories using the NS500 device (Malvern Panalytical, UK) (see Fig. 1). The studies conducted have shown that grape callus culture allows one to obtain exosomes with a predominant size of 200-350 nm.
Поверхностный заряд (дзета-потенциал) экзосом винограда определяют тем же методом (фиг. 2).The surface charge (zeta potential) of grape exosomes was determined by the same method (Fig. 2).
Отрицательный заряд необходим для обеспечения коллоидной стабильности раствора экзосом, а также способствует их адсорбции в очаге воспаления [Cai, Y.; Zhang, L.; Zhang, Y.; Lu, R. Plant-derived exosomes as a drug-delivery approach for the treatment of inflammatory bowel disease and colitis-associated cancer. Pharmaceutics, 2022, 14, 822; DOI: 10.3390/pharmaceutics14040822].The negative charge is necessary to ensure the colloidal stability of the exosome solution and also promotes their adsorption at the site of inflammation [Cai, Y.; Zhang, L.; Zhang, Y.; Lu, R. Plant-derived exosomes as a drug-delivery approach for the treatment of inflammatory bowel disease and colitis-associated cancer. Pharmaceutics, 2022, 14, 822; DOI: 10.3390/pharmaceutics14040822].
Заявляемый способ иллюстрируется следующими примерами.The claimed method is illustrated by the following examples.
Пример 1.Example 1.
Биомассу каллусной культуры клеток винограда (5 г) растирают с фосфатным буфером в соотношении 1 г : 5 мл.The biomass of grape cell callus culture (5 g) is ground with phosphate buffer in a ratio of 1 g: 5 ml.
Полученную гомогенизированную смесь центрифугируют в течение 19 минут при 9 000g и температуре 4 °С.The resulting homogenized mixture is centrifuged for 19 minutes at 9000g and 4°C.
Далее повторно центрифугируют супернатант в течение 19 минут при 19 000g и температуре 4 °С.The supernatant is then centrifuged again for 19 minutes at 19,000 g and 4 °C.
Жидкую фазу фильтруют через мембранный фильтр Millipore с диаметром пор 0,45 мкм.The liquid phase is filtered through a Millipore membrane filter with a pore diameter of 0.45 µm.
Отобранную жидкую фазу (20 мл) ультрацентрифугируют в течение 59 минут при 90 000g и температуре 4 °С.The collected liquid phase (20 ml) is ultracentrifuged for 59 minutes at 90,000g and 4°C.
Промывают полученный осадок экзосом винограда, для чего его суспендируют в фосфатном буфере, причем на 1 г биомассы каллусной культуры клеток винограда берут 0,9 мл фосфатного буфера, и ультрацентрифугируют в течение 59 минут при 90 000g и температуре 4 °С. Процедуру промывки повторяют.The resulting sediment of grape exosomes is washed, for which it is suspended in a phosphate buffer, with 0.9 ml of phosphate buffer taken per 1 g of grape cell callus culture biomass, and ultracentrifuged for 59 minutes at 90,000 g and a temperature of 4 °C. The washing procedure is repeated.
Осадок очищенных экзосом винограда суспендируют в 400 мкл фосфатного буфера и получают коллоидную суспензию, готовую к использованию.The sediment of purified grape exosomes is suspended in 400 µl of phosphate buffer to obtain a colloidal suspension ready for use.
Целевой продукт в виде коллоидной суспензии экзосом винограда имеет концентрацию 4.5х1010 частиц/мл, средний размер 233 нм и дзета-потенциал -23 мВ. Таким образом, общий выход экзосом составляет 5 мг на 1 г использованной сырой биомассы клеток.The target product in the form of a colloidal suspension of grape exosomes has a concentration of 4.5x10 10 particles/ml, an average size of 233 nm and a zeta potential of -23 mV. Thus, the total yield of exosomes is 5 mg per 1 g of used crude cell biomass.
Получившуюся суспензию экзосом хранят при +4 °С в течение 1-2 суток или замораживают при -86 °С для долговременного хранения.The resulting exosome suspension is stored at +4 °C for 1-2 days or frozen at -86 °C for long-term storage.
Пример 2.Example 2.
Биомассу каллусной культуры клеток винограда (5 г) растирают с фосфатным буфером в соотношении 1 г : 10 мл.The biomass of grape cell callus culture (5 g) is ground with phosphate buffer in a ratio of 1 g: 10 ml.
Полученную гомогенизированную смесь центрифугируют в течение 20 минут при 10 000g и температуре 3 °С.The resulting homogenized mixture is centrifuged for 20 minutes at 10,000g and a temperature of 3 °C.
Далее повторно центрифугируют супернатант в течение 20 минут при 20 000g и температуре 3 °С.The supernatant is then centrifuged again for 20 minutes at 20,000g and 3°C.
Жидкую фазу фильтруют через мембранный фильтр Millipore с диаметром пор 0,45 мкм.The liquid phase is filtered through a Millipore membrane filter with a pore diameter of 0.45 µm.
Отобранную жидкую фазу (20 мл) ультрацентрифугируют в течение 60 минут при 100 000g и температуре 3 °С.The collected liquid phase (20 ml) is ultracentrifuged for 60 minutes at 100,000 g and 3 °C.
Промывают полученный осадок экзосом винограда, для чего его суспендируют в фосфатном буфере, причем на 1 г биомассы каллусной культуры клеток винограда берут 1 мл фосфатного буфера и ультрацентрифугируют в течение 60 минут при 100 000g и температуре 3 °С. Процедуру промывки повторяют.The resulting sediment of grape exosomes is washed by suspending it in a phosphate buffer, with 1 ml of phosphate buffer taken per 1 g of grape cell callus culture biomass and ultracentrifuged for 60 minutes at 100,000 g and a temperature of 3 °C. The washing procedure is repeated.
Осадок очищенных экзосом винограда суспендируют в 200 мкл фосфатного буфера и получают коллоидную суспензию, готовую к использованию.The sediment of purified grape exosomes is suspended in 200 µl of phosphate buffer to obtain a colloidal suspension ready for use.
Целевой продукт в виде коллоидной суспензии экзосом имеет концентрацию 9,2×1010 частиц/мл, средний размер 241 нм и дзета-потенциал -28 мВ. Таким образом, общий выход экзосом составляет 4,4 мг на 1 г использованной сырой биомассы клеток.The target product in the form of a colloidal suspension of exosomes has a concentration of 9.2×10 10 particles/ml, an average size of 241 nm and a zeta potential of -28 mV. Thus, the total yield of exosomes is 4.4 mg per 1 g of used crude cell biomass.
Получившуюся суспензию экзосом хранят при +4 °С в течение 1-2 суток или замораживают при -86 °С для долговременного хранения.The resulting exosome suspension is stored at +4 °C for 1-2 days or frozen at -86 °C for long-term storage.
Пример 3.Example 3.
Биомассу каллусной культуры клеток винограда (5 г) растирают с фосфатным буфером в соотношении 1 г : 15 мл.The biomass of grape cell callus culture (5 g) is ground with phosphate buffer in a ratio of 1 g: 15 ml.
Полученную гомогенизированную смесь центрифугируют в течение 21 минут при 11 000g и температуре 5 °С.The resulting homogenized mixture is centrifuged for 21 minutes at 11,000 g and a temperature of 5 °C.
Далее повторно центрифугируют супернатант в течение 21 минут при 21 000g и температуре 5 °С.The supernatant is then centrifuged again for 21 minutes at 21,000 g and 5 °C.
Жидкую фазу фильтруют через мембранный фильтр Millipore с диаметром пор 0,45 мкм.The liquid phase is filtered through a Millipore membrane filter with a pore diameter of 0.45 µm.
Отобранную жидкую фазу (20 мл) ультрацентрифугируют в течение 61 минут при 110 000g и температуре 5 °С.The collected liquid phase (20 ml) is ultracentrifuged for 61 minutes at 110,000 g and 5 °C.
Промывают полученный осадок экзосом винограда, для чего его суспендируют в фосфатном буфере, причем на 1 г биомассы каллусной культуры клеток винограда берут 1,1 мл фосфатного буфера, и ультрацентрифугируют в течение 61 минут при 110 000g и температуре 5 °С. Процедуру промывки повторяют.The resulting sediment of grape exosomes is washed by suspending it in a phosphate buffer, with 1.1 ml of phosphate buffer taken per 1 g of grape cell callus culture biomass, and ultracentrifuged for 61 minutes at 110,000 g and a temperature of 5 °C. The washing procedure is repeated.
Осадок очищенных экзосом винограда суспендируют в 300 мкл фосфатного буфера и получают коллоидную суспензию, готовую к использованию.The sediment of purified grape exosomes is suspended in 300 µl of phosphate buffer to obtain a colloidal suspension ready for use.
Целевой продукт в виде коллоидной суспензии экзосом винограда имеет концентрацию 5.8×1010 частиц/мл, средний размер 217 нм и дзета-потенциал -29 мВ. Таким образом, общий выход экзосом составляет 5,3 мг на 1 г использованной сырой биомассы клеток.The target product in the form of a colloidal suspension of grape exosomes has a concentration of 5.8×10 10 particles/ml, an average size of 217 nm and a zeta potential of -29 mV. Thus, the total yield of exosomes is 5.3 mg per 1 g of used crude cell biomass.
Получившуюся суспензию экзосом хранят при +4 °С в течение 1-2 суток или замораживают при -86 °С для долговременного хранения.The resulting exosome suspension is stored at +4 °C for 1-2 days or frozen at -86 °C for long-term storage.
Заявляемое изобретение позволяет с помощью каллусной культуры винограда, культивируемой in vitro на питательных средах, получать большое количество растительных экзосом, что может быть использовано для медицинской и косметической промышленности.The claimed invention makes it possible to obtain a large number of plant exosomes using a grape callus culture cultivated in vitro on nutrient media, which can be used for the medical and cosmetic industries.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2825231C1 true RU2825231C1 (en) | 2024-08-22 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2771096C1 (en) * | 2021-02-04 | 2022-04-26 | Гордейчук Владимир Евгеньевич | Method for isolating microvesicles from plants of the amaranth family |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2771096C1 (en) * | 2021-02-04 | 2022-04-26 | Гордейчук Владимир Евгеньевич | Method for isolating microvesicles from plants of the amaranth family |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TENG Y et al. Grape exosome-like nanoparticles: A potential therapeutic strategy for vascular calcification //Front. Pharmacol. 21.10.2022, 13:1025768. doi: 10.3389/fphar.2022.1025768. SHTAM T.A. et al. Isolation of Extracellular Microvesicles from Cell Culture Medium: Comparative Evaluation of Methods //Biochemistry (Moscow) Supplement Series B Biomedical Chemistry, 2018, 12(2): 167-175. Будущее биомедицины 2023 = Future of Biomedicine: Young 2023: IV форум молодых учёных, 19-21 апреля 2023 г., Владивосток, о. Русский: материалы конференции / Дальневосточный федеральный университет. - Владивосток: Издательство Дальневосточного федерального университета, 2023. - ISBN 978-5-7444-5488-3. - DOI https://doi.org/10.24866/7444-5488-3. - URL: https://www.dvfu.ru/science/publishing-activities/catalogue-of-books-fefu/. - Дата публикации: 27.04.2023, стр.24. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1292320B1 (en) | Use of extracts from spermatophyte plants with immunomodulating activity | |
| Tang et al. | Polyhydroxylated fullerenols regulate macrophage for cancer adoptive immunotherapy and greatly inhibit the tumor metastasis | |
| CN107812197B (en) | A kind of inflammation targeted neutrophil leucocyte delivery system and its application | |
| JPH11512439A (en) | Composition having anti-apoptotic activity comprising a mixture of phospholipids | |
| CN104586775B (en) | Astragalus polysaccharide sustained release microsphere for treating radiation pneumonitis and preparation method of astragalus polysaccharide sustained release microsphere | |
| ES2741599T3 (en) | Cellular therapy with polarized macrophages for tissue regeneration | |
| CN113679670B (en) | Vesicle nano-drug carrying chloroquine compound, and preparation method and application thereof | |
| KR20190003383A (en) | A composition comprising an exosome derived from adipose-derived stem cell as an active ingredient and its application for improving dermatitis | |
| CN101020715B (en) | Process of extracting and preparing deer nerve growth factor (DEER NGF) | |
| Sajjadiyan et al. | Preparation of silibinin loaded pegylatedniosomal nanoparticles and investigation of its effect on MCF-10A human breast cancer cell line | |
| US11931458B2 (en) | Exosome systems, products and methods | |
| Shao et al. | Plant-derived extracellular vesicles-a novel clinical anti-inflammatory drug carrier worthy of investigation | |
| Han et al. | Engineered plant extracellular vesicles for autoimmune diseases therapy | |
| RU2825231C1 (en) | Method for producing grape exosomes | |
| RU2822745C1 (en) | Method of producing exosomes of thale cress | |
| Bai et al. | Research status and challenges of plant-derived exosome-like nanoparticles | |
| Zhang et al. | Regulating the surface topography of CpG nanoadjuvants via coordination-driven self-assembly for enhanced tumor immunotherapy | |
| Wang et al. | The Remarkable Anti-Breast Cancer Efficacy and Anti-Metastasis by Multifunctional Nanoparticles Co-Loading Squamocin, R848 and IR 780 | |
| CN102366408A (en) | Monosialotetrahexosyl ganglioside sodium liposome injection | |
| ES2678023T3 (en) | Factors extracted from fish embryos and use of mixtures thereof in the control of multiplication and differentiation of stem cells | |
| WO2017071379A1 (en) | Tumor vaccine for use in treating gastric cancer and preparation method for vaccine | |
| Perminaite et al. | Formulation of liposomes containing royal jelly and their quality assessment | |
| CN116059158A (en) | Exosome composite nano hydrogel for targeted treatment of psoriasis and preparation method thereof | |
| Ukwubile et al. | Application of Melastomastrum capitatum Fern.(Melastomataceae) loaded-exosome as analgesic drug carrier in acetic acid-induced Swiss albino mice | |
| KR102260713B1 (en) | Composition for preventing of hair loss or promoting hair growth comprising loliolide or Scenedesmus sp. HS4 |