RU2823325C1 - Composition for reducing hair graying, stimulating hair growth and/or preventing or reducing hair loss, containing double-stranded mcrna as active ingredient - Google Patents

Composition for reducing hair graying, stimulating hair growth and/or preventing or reducing hair loss, containing double-stranded mcrna as active ingredient Download PDF

Info

Publication number
RU2823325C1
RU2823325C1 RU2023121817A RU2023121817A RU2823325C1 RU 2823325 C1 RU2823325 C1 RU 2823325C1 RU 2023121817 A RU2023121817 A RU 2023121817A RU 2023121817 A RU2023121817 A RU 2023121817A RU 2823325 C1 RU2823325 C1 RU 2823325C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
mir
hsa
hair
seq
bond
Prior art date
Application number
RU2023121817A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Хан-О ПАК
Сан-Кён ЛИ
О Сон КВОН
Ын-А ГО
Original Assignee
Байонир Корпорейшн
Сирнаджен Терапьютикс Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байонир Корпорейшн, Сирнаджен Терапьютикс Корпорейшн filed Critical Байонир Корпорейшн
Application granted granted Critical
Publication of RU2823325C1 publication Critical patent/RU2823325C1/en

Links

Abstract

FIELD: cosmetic industry.
SUBSTANCE: group of inventions relates to compositions for reducing hair graying, stimulating hair growth and/or preventing or reducing hair loss. Compositions contain as an active ingredient a double-stranded oligonucleotide hsa-miR-3139, hsa-miR-3189, hsa-miR-3199 or hsa-miR-8485, double-stranded oligonucleotide structure containing it, or nanoparticles containing the above structure.
EFFECT: compositions prevent hair graying and reduce the rate of its progression by melanocyte activation and melanogenesis stimulation, and also provide improvement of condition of hair already affected by graying to condition preceding graying; in addition, the compositions promote activation of melanocytes and proliferation of dermal papilla and keratinocytes, which are present in hair follicles, and induce development of external root sheath and hair growth.
20 cl, 12 dwg, 7 tbl, 8 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates

Настоящее изобретение относится к композиции для уменьшения поседения волос, стимулирования роста волос и/или предотвращения или уменьшения выпадения волос, содержащей двухцепочечную мкрРНК в качестве активного ингредиента, и, более конкретно, к фармацевтической или косметической композиции для уменьшения поседения волос, стимулирования роста волос и/или предотвращения или уменьшения выпадения волос, содержащей в качестве активного ингредиента двухцепочечную мкрРНК, такую как miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485, двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию, включающую ее, или наночастицы, включающие указанную конструкцию.The present invention relates to a composition for reducing graying of hair, promoting hair growth and/or preventing or reducing hair loss, containing double-stranded miRNA as an active ingredient, and more particularly, to a pharmaceutical or cosmetic composition for reducing graying of hair, promoting hair growth and/ or preventing or reducing hair loss, containing as an active ingredient a double-stranded miRNA such as miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-8485, a double-stranded oligonucleotide construct including it, or nanoparticles including the said construct.

Сведения о предшествующем уровне техникиInformation about the prior art

Поседение волос у человека является явлением физиологического старения и, как известно, вызвано уменьшением пигмента меланина вследствие функционального ухудшения и истощения меланоцитов или стволовых клеток меланоцитов в волосяных фолликулах. Пигмент меланин является важным фактором, определяющим цвет волос, и меланин синтезируется в меланосомах и секретируется из меланосом, присутствующих в меланоцитах, переносится на близлежащие кератиноциты, фибробласты и т.д., а затем перемещается по мере роста волос и поддерживает цвет волос. В настоящее время в качестве решения проблемы поседения волос используется простая процедура окрашивания, но окрашивание является временным способом, и повторное окрашивание необходимо из-за роста седых волос, а ингредиенты, содержащиеся в красках для волос, имеют различные побочные эффекты, такие как раздражение кожи головы и волосяных фолликулов или вызывание аллергии или дерматита. Текущие исследования, связанные с контролем выработки пигмента меланина, ограничиваются разработкой материалов, обладающих эффектами отбеливания кожи, и идентификацией механизмов их действия путем подавления симптомов, таких как пигментация и т.д., из-за чрезмерной выработки меланина в коже, вызванной различными факторами, такими как генетические факторы, старение, гормоны, факторы роста, ультрафиолетовое излучение и т.п. Напротив, было проведено мало исследований, касающихся механизма действия и разработки материалов, связанных со стимулированием меланогенеза для преодоления поседения волос или пониженного синтеза меланина. Более того, меланогенез регулируется взаимодействиями различных сигналов (сигнальный путь SCF-KIT-RAS-ERK, сигнальный путь MC1R-cAMP-PKA, сигнальный путь Wnt-бета-катенин). Из-за такого сложного механизма действия непросто идентифицировать механизм действия и разработать новые материалы для предотвращения или уменьшения поседения волос.Graying of hair in humans is a phenomenon of physiological aging and is known to be caused by a decrease in melanin pigment due to the functional decline and depletion of melanocytes or melanocyte stem cells in hair follicles. The pigment melanin is an important determinant of hair color and melanin is synthesized in melanosomes and secreted from melanosomes present in melanocytes, transferred to nearby keratinocytes, fibroblasts, etc. and then moves as hair grows and maintains hair color. Nowadays, a simple dyeing procedure is used as a solution to the problem of graying hair, but dyeing is a temporary method and re-dying is necessary due to the growth of gray hair, and the ingredients contained in hair dyes have various side effects such as scalp irritation and hair follicles or causing allergies or dermatitis. Current research related to the control of melanin pigment production is limited to developing materials that have skin whitening effects and identifying the mechanisms of their action by suppressing symptoms such as pigmentation, etc., due to excessive melanin production in the skin caused by various factors, such as genetic factors, aging, hormones, growth factors, ultraviolet radiation, etc. In contrast, little research has been conducted regarding the mechanism of action and development of materials related to stimulating melanogenesis to overcome hair graying or decreased melanin synthesis. Moreover, melanogenesis is regulated by interactions of various signals (SCF-KIT-RAS-ERK signaling pathway, MC1R-cAMP-PKA signaling pathway, Wnt-beta-catenin signaling pathway). Due to this complex mechanism of action, it is not easy to identify the mechanism of action and develop new materials to prevent or reduce hair graying.

В последнее время андрогенетическая алопеция (AGA), которая в основном встречается у мужчин среднего возраста и считается генетическим заболеванием мужчин, часто встречается у женщин, а также у молодых мужчин из-за сильного загрязнения окружающей среды, стресса, диетических изменений и быстрого старения населения. Поскольку интерес к выпадению волос возрастает, быстро растет рынок, связанный с проблемой выпадения волос. Известно, что выпадение волос вызывается различными факторами, такими как генетические факторы, мужские гормоны, старение, нарушения кровообращения и т.п. В настоящее время одобренные лекарственные средства включают только финастерид, который ингибирует выработку дигидротестостерона (DHT), который является мужским гормоном (андрогеном), и миноксидил, который улучшает расширение кровеносных сосудов и кровообращение. Однако эти лекарственные средства обладают временной и ограниченной эффективностью в зависимости от дозы и способа введения, и сопровождаются различными побочными эффектами. Следовательно, требуется разработка новых материалов, которые индуцируют активацию клеток волосяных фолликулов и пролиферацию клеток, чтобы стимулировать рост волос без побочных эффектов.Recently, androgenetic alopecia (AGA), which mainly occurs in middle-aged men and is considered a genetic disease of men, is common in women as well as young men due to severe environmental pollution, stress, dietary changes and rapid aging of the population. As interest in hair loss increases, the market related to hair loss is growing rapidly. Hair loss is known to be caused by various factors such as genetic factors, male hormones, aging, circulatory disorders, etc. Currently approved drugs include only finasteride, which inhibits the production of dihydrotestosterone (DHT), which is a male hormone (androgen), and minoxidil, which improves blood vessel dilation and circulation. However, these drugs have temporary and limited effectiveness depending on the dose and route of administration, and are accompanied by various side effects. Therefore, the development of new materials that induce hair follicle cell activation and cell proliferation is required to stimulate hair growth without side effects.

Цикл роста волос включает три стадии: фазу анагена, в которой волосы растут наиболее активно, фазу катагена, в которой рост волос прекращается и начинается дегенерация волос, и фазу телогена, в которой активность волосяных фолликулов приостанавливается, и выпадение волос относится к естественному выпадению волос, которые перестали расти в соответствии с циклом роста, и известно, что выпадение волос вызывают различные факторы. Хотя разработка лекарственных средств для уменьшения симптомов выпадения волос проводилась в течение длительного времени, существуют только финастерид, который является пероральным терапевтическим средством от выпадения волос, и миноксидил, который является местным терапевтическим средством от выпадения волос. Однако, поскольку эти лекарственные средства вызывают облегчение симптомов выпадения волос за счет механизма ингибирования выработки мужских гормонов, они имеют побочные эффекты и ограничения в эффективности. Следовательно, необходимо разработать материалы с новыми механизмами и стратегиями, которые демонстрируют эффективность без побочных эффектов. Важной стратегией разработки терапевтических агентов для лечения выпадения волос является индукция быстрого перехода волос из фазы телогена в фазу анагена путем стимулирования активации и пролиферации клеток волосяных фолликулов. Соответственно, необходимо разработать новые материалы, которые вызывают активацию клеток волосяных фолликулов и пролиферацию клеток для стимулирования роста волос.The hair growth cycle includes three stages: the anagen phase, in which hair grows most actively, the catagen phase, in which hair growth stops and hair degeneration begins, and the telogen phase, in which the activity of hair follicles stops and hair loss refers to natural hair loss. which have stopped growing according to the growth cycle and various factors are known to cause hair loss. Although the development of medications to reduce the symptoms of hair loss has been underway for a long time, there are only finasteride, which is an oral therapeutic treatment for hair loss, and minoxidil, which is a topical therapeutic treatment for hair loss. However, because these medications provide relief from hair loss symptoms by inhibiting the production of male hormones, they have side effects and limitations in effectiveness. Therefore, there is a need to develop materials with new mechanisms and strategies that demonstrate efficacy without side effects. An important strategy for developing therapeutic agents for the treatment of hair loss is to induce a rapid transition of hair from the telogen phase to the anagen phase by stimulating the activation and proliferation of hair follicle cells. Accordingly, it is necessary to develop new materials that cause hair follicle cell activation and cell proliferation to promote hair growth.

Технология подавления экспрессии генов считается важным инструментом в разработке терапевтических агентов и проверки мишеней для лечения заболеваний, и разработку осуществляли различными способами, чтобы преодолеть ограничения, связанные со способами лечения традиционными лекарственными средствами, при этом одним из способов является использование РНК-интерференции (далее именуется как «РНКи») (Iorns, E., Lord, C.J., Turner, N. & Ashworth, A., Nat. Rev. Drug Discov. 6, 556-68. 2007). РНКи является способом, используемым для подавления экспрессии генов, и область его применения разнообразна, так как он просто и четко демонстрирует эффекты подавления генов с низкими затратами. миРНК представляет собой одноцепочечную РНК, состоящую из 16-27 нуклеотидов, и действует в клетках в качестве компонента рибонуклеопротеина, известного как РИСК (РНК-индуцированный комплекс сайленсинга). РИСК функционирует в качестве ферментных ножниц РНК и расщепляет информационную РНК (далее именуемую как «мРНК») для ингибирования выработки белка из мРНК. миРНК, включенная в РИСК, связывается с мРНК, имеющей последовательность, комплементарную последовательности миРНК, с образованием двухцепочечной РНК, и РИСК, служащий в качестве ферментных ножниц РНК, расщепляет мРНК-мишень, так что мРНК больше не может функционировать в качестве матрицы для выработки белка.Gene silencing technology is considered an important tool in the development of therapeutic agents and screening targets for the treatment of diseases, and development has been carried out in various ways to overcome the limitations associated with traditional drug treatment methods, with one of the methods being the use of RNA interference (hereinafter referred to as “RNAi”) (Iorns, E., Lord, C.J., Turner, N. & Ashworth, A., Nat. Rev. Drug Discov. 6, 556-68. 2007). RNAi is a technique used to suppress gene expression, and its applications are diverse as it simply and clearly demonstrates the effects of gene silencing at a low cost. miRNA is a single-stranded RNA consisting of 16-27 nucleotides and functions in cells as a component of a ribonucleoprotein known as RISK (RNA-induced silencing complex). RISK functions as an RNA scissor enzyme and cleaves messenger RNA (hereinafter referred to as “mRNA”) to inhibit protein production from mRNA. The siRNA included in the RISK binds to an mRNA having a sequence complementary to that of the miRNA to form double-stranded RNA, and the RISK, serving as an enzymatic RNA scissor, cleaves the target mRNA so that the mRNA can no longer function as a template for protein production .

Таким образом, терапевтические средства на основе РНКи оцениваются как более совершенные, чем одномолекулярные терапевтические средства, поскольку они блокируют мРНК до стадии выработки белка и используют РНК и клеточную внутреннюю систему РИСК, но вызывают побочные эффекты, которые не могут быть устранены даже с помощью технологии на основе миРНК, что представляет собой явление, называемое нецелевым эффектом. Как описано выше, терапевтические средства на основе РНКи разрушают мРНК, которая комплементарно связывается с последовательностью миРНК, но связываются с мРНК, которая комплементарна только части последовательности миРНК, а не всей последовательности миРНК, вызывая деградацию, которую называют «нецелевым эффектом», поскольку индуцируется деградация нецелевой мРНК.Thus, RNAi-based therapeutics are considered superior to single-molecule therapeutics because they block mRNA prior to protein production and utilize RNA and the cell's internal RISK system, but cause side effects that cannot be eliminated even with advanced technology. based on miRNA, which is a phenomenon called off-target effect. As described above, RNAi therapeutics degrade mRNA that is complementary to the miRNA sequence, but bind to mRNA that is complementary to only part of the miRNA sequence rather than the entire miRNA sequence, causing degradation, which is called an “off-target effect” because degradation is induced non-target mRNA.

С целью преодоления описанных выше технических трудностей терапевтических средств на основе РНКи проводится тщательное исследование по применению микроРНК (далее именуемой как «мкрРНК») в качестве терапевтического агента (Agostini, M. & Knight, R.A., Oncotarget 5, 872-81, 2014; Dangwal, S. & Thum, T., Annu. Rev. PharmacolToxicol. 54, 185-203, 2014). мкрРНК представляет собой РНК, состоящую из 16-27 нуклеотидов, и классифицируется как белок-некодирующая РНК при получении мРНК, которая транслируется в белок (Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009; MacFarlane, L.-A. & Murphy, P.R., Current Genomics 11, 537-561, 2010; Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009). мкрРНК обнаружена в геномах высших животных и клетках растений и, как известно, играет важную роль в регулировании клеточного метаболизма и функций, включая продуцирование, рост, дифференцировку и гибель клеток. На сегодняшний день известно около 2000 типов мкрРНК в геноме человека, и среди них до сих пор неизвестны функции значительного числа мкрРНК.In order to overcome the technical difficulties of RNAi-based therapeutics described above, extensive research is being conducted on the use of microRNA (hereinafter referred to as miRNA) as a therapeutic agent (Agostini, M. & Knight, R.A., Oncotarget 5, 872-81, 2014; Dangwal , S. & Thum, T., Annu Rev. Pharmacol Toxicol. 54, 185-203, 2014). miRNA is an RNA consisting of 16-27 nucleotides and is classified as a protein non-coding RNA when producing mRNA that is translated into protein (Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009; MacFarlane, L.- A. & Murphy, P.R., Current Genomics 11, 537-561, 2010; Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009). miRNAs are found in the genomes of higher animals and plant cells and are known to play important roles in regulating cellular metabolism and functions, including cell production, growth, differentiation, and death. To date, about 2000 types of miRNAs are known in the human genome, and among them, the functions of a significant number of miRNAs are still unknown.

мкрРНК транскрибируется в РНК РНК-полимеразой, называемой Pol II, из генома, и ее начальная длина не указана и варьируется (Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009; Brodersen, P. & Voinnet, O., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 141-148, 2009). Это обусловлено разнообразием положений, в которых мкрРНК включена в геном, в частности, из-за различных путей продукции мкрРНК, например, в интроне, который является частью мРНК, не участвующей в выработке белка и транскрибируется одновременно с выработкой мРНК, или в межгенной области генома и транскрибируется независимо (Malone, C.D. & Hannon, G.J., Cell 136, 656-68, 2009). Матрица мкрРНК, первоначально созданная таким образом, называется первичной miR (первичной микроРНК), и первичная мкрРНК редактируется в предшественник мкрРНК (далее именуемый как «пре-miR») с помощью РНКазы, называемой Дроша, в ядре (Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009). Pre-miR образует шпилечную структуру РНК и состоит примерно из 70-80 нуклеотидов. Pre-miR внутри клеточного ядра перемещается из ядра в цитоплазму с помощью белков-экспортинов и т.д. и вторично процессируется другой РНКазой, называемой Дисер, в цитоплазме с образованием двухцепочечной зрелой мкрРНК, состоящей из 16-27 нуклеотидов (зрелая микроРНК, далее именуемая miR, описанная без других модификаторов, означает зрелую miR). В двухцепочечной miR выбирается одноцепочечная РНК, которая связывается с РИСК, являющимся рибонуклеопротеином, и, таким образом, становится активной, и связывается с мРНК-мишенью, используя последовательность miR.miRNA is transcribed into RNA by an RNA polymerase called Pol II from the genome, and its initial length is unspecified and variable (Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009; Brodersen, P. & Voinnet, O. , Nat. Rev. Cell Biol. 10, 141-148. This is due to the variety of positions in which miRNA is included in the genome, in particular due to different pathways of miRNA production, for example, in the intron, which is part of the mRNA that is not involved in protein production and is transcribed simultaneously with the production of mRNA, or in the intergenic region of the genome and is transcribed independently (Malone, C.D. & Hannon, G.J., Cell 136, 656-68, 2009). The miRNA template initially created in this way is called the primary miR (primary miRNA), and the primary miRNA is edited into a miRNA precursor (hereinafter referred to as “pre-miR”) by an RNase called Drosha in the nucleus (Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009). Pre-miR forms a hairpin RNA structure and consists of approximately 70-80 nucleotides. Pre-miR inside the cell nucleus moves from the nucleus to the cytoplasm with the help of exportin proteins, etc. and is secondarily processed by another RNase called Diser in the cytoplasm to form a double-stranded mature miRNA consisting of 16-27 nucleotides (mature miRNA, hereafter referred to as miR, described without other modifiers, means mature miR). In double-stranded miR, single-stranded RNA is selected, which binds to RISK, which is a ribonucleoprotein, and thus becomes active, and binds to the target mRNA using the miR sequence.

Как правило, мРНК в основном подразделяется на три области в зависимости от их участия в выработке белка: кодирующая область, которая несет информацию о трансляции белка, а также 5'-UTR (нетранслируемая область) и 3'-UTR, которые не несут информацию о трансляции белка, в качестве соответствующих 5'- и 3'-концов кодирующей области. миРНК, которая индуцирует деградацию мРНК-мишени с применением комплементарных мРНК последовательностей, действует независимо от 5'- и 3'-UTR и кодирующей области мРНК, тогда как miR в основном связывается с 3'-UTR (Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009; Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009). Уникальной особенностью миРНК и мкрРНК, помимо различия в положении связывания с мРНК, является то, что миРНК связывается в основном с мРНК, включая последовательность, комплементарную всей последовательности миРНК, тогда как мкрРНК устроена так, что для распознавания мРНК-мишени в основном используется последовательность затравочной области ограниченного размера, расположенная в 2-8 нуклеотидах от 5'-конца мкрРНК, и, таким образом, даже когда вся последовательность мкрРНК не имеет полностью комплементарной последовательности гену-мишени и включает определенную часть некомплементарной последовательности, активность мкрРНК не затрагивается (Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009). Поскольку последовательность затравочной области имеет длину 6-8 нуклеотидов, существуют различные типы мРНК, имеющие комплементарные ей последовательности в 3'-UTR, и, следовательно, один тип мкрРНК способен одновременно контролировать несколько типов мРНК. Такая мкрРНК функционирует в качестве эффективного регулятора, участвующего в контроле многих аспектов клеточной физиологии, включая клеточное деление, рост, дифференцировку и гибель. Кроме того, функция мкрРНК в качестве регулятора имеет то преимущество, что ее можно эффективно применять при различных заболеваниях. В отличие от миРНК, которая нацелена на подавление экспрессии одного гена, мкрРНК способна одновременно ингибировать экспрессию нескольких генов, участвующих в различных сигнальных путях. Большое количество мРНК содержат область в 3'-UTR, в которой вероятно связывается по меньшей мере одна мкрРНК, и на основе биоинформатических расчетов известно, что выработка белка из примерно 30% всех мРНК регулируется мкрРНК.Typically, mRNA is mainly divided into three regions based on their involvement in protein production: the coding region, which carries information about protein translation, and the 5'-UTR (untranslated region) and 3'-UTR, which do not carry information about protein translation. protein translation, as the corresponding 5' and 3' ends of the coding region. miRNA, which induces degradation of target mRNA using complementary sequences to the mRNA, acts independently of the 5' and 3' UTR and coding region of the mRNA, whereas miR primarily binds to the 3' UTR (Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009; Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009). A unique feature of miRNA and miRNA, in addition to the difference in the position of binding to mRNA, is that miRNA binds mainly to mRNA, including a sequence complementary to the entire miRNA sequence, while miRNA is designed in such a way that the seed sequence is mainly used to recognize the target mRNA a region of limited size located 2-8 nucleotides from the 5' end of the miRNA, and thus, even when the entire miRNA sequence does not have a completely complementary sequence to the target gene and includes a certain part of the non-complementary sequence, the activity of the miRNA is not affected (Bartel, D.P. , Cell 136, 215-33, 2009). Since the seed region sequence is 6-8 nucleotides in length, there are different types of mRNA that have complementary sequences in the 3'UTR, and therefore one type of miRNA is capable of simultaneously controlling multiple types of mRNA. This miRNA functions as an effective regulator involved in the control of many aspects of cellular physiology, including cell division, growth, differentiation and death. In addition, the function of miRNAs as a regulator has the advantage that it can be effectively applied in various diseases. Unlike miRNA, which targets the suppression of the expression of a single gene, miRNA is capable of simultaneously inhibiting the expression of several genes involved in different signaling pathways. A large number of mRNAs contain a region in the 3'-UTR in which at least one miRNA is likely to bind, and protein production from approximately 30% of all mRNAs is known to be regulated by miRNAs based on bioinformatics calculations.

Несмотря на превосходные эффекты и широкий спектр применения мкрРНК или миРНК, для разработки мкрРНК/миРНК в качестве терапевтического агента мкрРНК/миРНК должна быть эффективно доставлена в клетки-мишени за счет улучшения стабильности мкрРНК/миРНК в организме и повышения эффективности доставки в клетки (FY Xie., Drug Discov. Today. 2006 Jan; 11(1-2):67-73). Для повышения стабильности в организме и решения проблемы, связанной со стимуляцией мкрРНК/миРНК неспецифического врожденного иммунитета, продолжаются тщательные исследования в отношении модификации некоторых нуклеотидов или остовов мкрРНК/миРНК для придания им устойчивости к нуклеазам или в отношении применения носителей, таких как вирусные векторы, липосомы, наночастицы и т.д. Система доставки с применением вирусного вектора, такого как аденовирус или ретровирус, обладает высокой эффективностью трансфекции, но высокой иммуногенностью и онкогенностью. С другой стороны, невирусная система доставки, включающая наночастицы, имеет низкую эффективность доставки в клетки по сравнению с вирусной системой доставки, но она имеет преимущество из-за высокой стабильности in vivo, возможности мишень-специфической доставки, поглощения и интернализации содержащихся олигонуклеотидов РНКи в клетки или ткани, а также почти отсутствия цитотоксичности или стимуляции врожденного иммунитета, так что в настоящее время она считается более мощным методом доставки, чем вирусная система доставки (Akhtar S, J. Clin. Invest. 2007 December 3; 117(12): 3623-3632).Despite the excellent effects and wide range of applications of miRNA or siRNA, to develop miRNA/siRNA as a therapeutic agent, miRNA/siRNA must be efficiently delivered to target cells by improving the stability of miRNA/miRNA in the body and enhancing the efficiency of delivery to cells (FY Xie ., Drug Disco. Today. 2006 Jan; 11(1-2):67-73. To improve stability in the body and address the problem associated with miRNA/miRNA stimulation of non-specific innate immunity, extensive research continues on the modification of certain nucleotides or miRNA/miRNA backbones to make them nuclease-resistant or in relation to the use of carriers such as viral vectors, liposomes , nanoparticles, etc. A delivery system using a viral vector, such as an adenovirus or retrovirus, has high transfection efficiency but is highly immunogenic and tumorigenic. On the other hand, the non-viral delivery system including nanoparticles has low efficiency of delivery into cells compared to the viral delivery system, but it has the advantage of high stability in vivo, the possibility of target-specific delivery, uptake and internalization of the contained RNAi oligonucleotides into cells or tissue, and almost no cytotoxicity or innate immune stimulation, so it is now considered a more potent delivery method than the viral delivery system (Akhtar S, J. Clin. Invest. 2007 December 3; 117(12): 3623- 3632).

Что касается способа применения наноносителя в невирусной системе доставки, то наночастицы формируются с применением различных полимеров, таких как липосомы, комплексы катионных полимеров и т.п., и мкрРНК/миРНК нагружают на такую наночастицу, а именно наноноситель, и доставляют в клетки. Среди способов применения наноносителя в основном можно использовать полимерную наночастицу, полимерную мицеллу, липоплекс и т.д., и, в частности, липоплекс состоит из катионных липидов и взаимодействует с анионными липидами эндосом клеток, тем самым вызывая эффект дестабилизации эндосом, чтобы обеспечить внутриклеточную доставку. Кроме того, известно, что высокая эффективность in vivo достигается путем связывания химического материала с концом смысловой (пассажирской) цепи мкрРНК/миРНК, чтобы обеспечить улучшенные фармакокинетические характеристики (J. Soutschek, Nature 11; 432(7014):173-8, 2004). Таким образом, стабильность мкрРНК/миРНК может варьироваться в зависимости от свойств химического материала, связанного с концом смысловой или антисмысловой (направляющей) цепи мкрРНК/миРНК.As for the method of using a nanocarrier in a non-viral delivery system, nanoparticles are formed using various polymers such as liposomes, cationic polymer complexes, etc., and miRNA/siRNA is loaded onto such a nanoparticle, namely the nanocarrier, and delivered into cells. Among the applications of nanocarrier, polymer nanoparticle, polymer micelle, lipoplex, etc. can mainly be used, and in particular, lipoplex is composed of cationic lipids and interacts with the anionic lipids of cell endosomes, thereby causing the endosome destabilization effect to ensure intracellular delivery . In addition, it is known that high potency in vivo is achieved by binding a chemical material to the sense (passenger) strand end of miRNA/miRNA to provide improved pharmacokinetic properties (J. Soutschek, Nature 11; 432(7014):173-8, 2004) . Thus, the stability of miRNA/miRNA may vary depending on the properties of the chemical material associated with the end of the sense or antisense (guide) strand of the miRNA/siRNA.

Например, миРНК, содержащая связанное с ней полимерное соединение, такое как полиэтиленгликоль (PEG), взаимодействует с анионной фосфатной группой мкрРНК/миРНК в присутствии катионных веществ с образованием комплекса, тем самым становясь носителем мкрРНК/миРНК, обладающим повышенной стабильностью (S.H. Kim, J. Control Release 129(2):107-16, 2008). В частности, мицеллы, состоящие из полимерных комплексов, имеют чрезвычайно малый размер по сравнению с другими системами, используемыми в качестве средств доставки лекарственных средств, такими как микросферы или наночастицы, но характеризуются очень однородным распределением по размеру и образуются спонтанно, тем самым облегчая управление качеством смеси и обеспечивая воспроизводимость составов. Для повышения эффективности внутриклеточной доставки мкрРНК/миРНК была разработана технология достижения стабильности мкрРНК/миРНК и эффективной проницаемости через клеточные мембраны с применением конъюгата мкрРНК/миРНК, в котором гидрофильный материал (например, полиэтиленгликоль (PEG)) в качестве биосовместимого полимера конъюгирован с мкрРНК/миРНК посредством простой ковалентной связи или ковалентной связи, опосредованной линкером (корейский патент № 883471).For example, siRNA containing an associated polymeric compound such as polyethylene glycol (PEG) interacts with the anionic phosphate group of miRNA/siRNA in the presence of cationic substances to form a complex, thereby becoming a miRNA/miRNA carrier with increased stability (S.H. Kim, J Control Release 129(2):107-16, 2008). In particular, micelles composed of polymer complexes are extremely small in size compared to other systems used as drug delivery vehicles, such as microspheres or nanoparticles, but have a very uniform size distribution and form spontaneously, thereby facilitating quality control mixtures and ensuring reproducibility of compositions. To increase the efficiency of intracellular delivery of miRNA/siRNA, a technology has been developed to achieve miRNA/miRNA stability and effective permeability through cell membranes using a miRNA/siRNA conjugate, in which a hydrophilic material (for example, polyethylene glycol (PEG)) as a biocompatible polymer is conjugated to miRNA/siRNA through a simple covalent bond or a linker-mediated covalent bond (Korean Patent No. 883471).

Однако химическая модификация мкрРНК/миРНК и конъюгирование с полиэтиленгликолем (PEG) (ПЭГилирование) по-прежнему имеют недостатки, такие как низкая стабильность in vivo и неэффективная доставка в целевые органы. Для устранения этих недостатков была разработана конструкция с двухцепочечным олигонуклеотидом, в которой гидрофильные и гидрофобные материалы связаны с двухцепочечным олигонуклеотидом, в частности, двухцепочечной олиго РНК, например, мкрРНК/миРНК, причем конструкция образует самособирающиеся наночастицы, названные SAMiRNA™ SAMiRNA (самособирающиеся мицеллы с ингибирующей РНК), самособирающиеся за счет гидрофорбного взаимодействия гидрофобного материала (корейский патент 1224828). Преимущество технологии SAMiRNA™ заключается в возможности получения однородных, но очень маленьких по размеру наночастиц по сравнению с традиционными технологиями доставки.However, chemical modification of miRNA/miRNA and polyethylene glycol (PEG) conjugation (PEGylation) still have disadvantages such as poor in vivo stability and ineffective delivery to target organs. To overcome these shortcomings, a double-stranded oligonucleotide design has been developed in which hydrophilic and hydrophobic materials are associated with a double-stranded oligonucleotide, in particular a double-stranded RNA oligo, such as miRNA/siRNA, and the design forms self-assembled nanoparticles called SAMiRNA™ SAMiRNA (self-assembled micelles with inhibitory RNA), self-assembling due to hydrophobic interaction of hydrophobic material (Korean patent 1224828). The advantage of SAMiRNA™ technology is the ability to produce homogeneous but very small nanoparticles compared to traditional delivery technologies.

В качестве конкретного примера технологии SAMiRNA™, используется PEG (полиэтиленгликоль) или HEG (гексаэтиленгликоль) в качестве гидрофильного материала, а PEG является синтетическим полимером и часто применяется для повышения растворимости фармацевтических препаратов, особенно белков, и для контроля фармакокинетики. PEG представляет собой полидисперсный материал, и партия полимера состоит из общей суммы различного количества мономеров и имеет гауссово распределение молекулярной массы, а степень однородности материала выражается в виде индекса полидисперсности (Mw/Mn). В частности, когда PEG имеет низкую молекулярную массу (3-5 кДа), он демонстрирует индекс полидисперсности около 1,01, а в случае высокой молекулярной массы (20 кДа) он проявляет высокий индекс полидисперсности около 1,2, поэтому чем больше молекулярная масса, тем ниже однородность материала. Таким образом, случай, когда PEG связан с фармацевтическим препаратом, является невыгодным, так как нелегко проверить отдельный материал, поскольку характерная полидисперсность PEG отражается в конъюгате. Поэтому существует тенденция к получению материалов с низким индексом полидисперсности путем улучшения процессов синтеза и очистки PEG. В частности, в случае, когда PEG связан с материалом, имеющим низкую молекулярную массу, возникают проблемы из-за характеристик полидисперсности материала, что неудобно с той точки зрения, что сложно проверить произошло ли связывание (Francesco M. VDRUG DISCOVERY TODAY(2005) 10(21):1451-1458). Соответственно, в последние годы в качестве усовершенствованной формы существующих самособирающихся наночастиц SAMiRNA™ из гидрофильного материала двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции, составляющей SAMiRNA™, формируются блоки из базовых единиц, включающих от 1 до 15 однородных мономеров определенной молекулярной массы, а при необходимости и линкер, и при применении соответствующего количества блоков в зависимости от потребности была разработана новая форма технологии носителя для доставки меньших размеров, чем у существующих SAMiRNA™, и со значительно лучшей полидисперсностью.As a specific example of SAMiRNA™ technology, PEG (polyethylene glycol) or HEG (hexaethylene glycol) is used as a hydrophilic material, and PEG is a synthetic polymer and is often used to increase the solubility of pharmaceuticals, especially proteins, and to control pharmacokinetics. PEG is a polydisperse material, and a batch of polymer consists of a total sum of varying amounts of monomers and has a Gaussian molecular weight distribution, and the degree of uniformity of the material is expressed as a polydispersity index (Mw/Mn). Specifically, when PEG has a low molecular weight (3-5 kDa), it exhibits a polydispersity index of about 1.01, and in the case of a high molecular weight (20 kDa), it exhibits a high polydispersity index of about 1.2, so the higher the molecular weight , the lower the homogeneity of the material. Thus, the case where PEG is associated with a pharmaceutical is disadvantageous since it is not easy to test the individual material since the characteristic polydispersity of PEG is reflected in the conjugate. Therefore, there is a trend towards obtaining materials with a low polydispersity index by improving PEG synthesis and purification processes. In particular, in the case where PEG is bound to a material having a low molecular weight, problems arise due to the polydispersity characteristics of the material, which is inconvenient from the point of view that it is difficult to verify whether binding has occurred (Francesco M. VDRUG DISCOVERY TODAY (2005) 10 (21):1451-1458). Accordingly, in recent years, as an improved form of existing self-assembled SAMiRNA™ nanoparticles, blocks of basic units, including from 1 to 15 homogeneous monomers of a certain molecular weight, and, if necessary, a linker, and By applying the appropriate number of blocks depending on the need, a new form of carrier technology was developed to deliver smaller sizes than existing SAMiRNA™ and with significantly better polydispersity.

Соответственно, авторы настоящего изобретения приложили большие усилия для обнаружения мкрРНК, способной уменьшать поседение волос, и установили, что miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485 могут активировать меланоциты и стимулировать меланогенез, тем самым уменьшая поседение волос, а также что пролиферация клеток дермальной папиллы волосяных фолликулов, кератиноцитов и т.д. стимулируется дополнительно к активации меланоцитов, и наружная корневая оболочка (ORS) волосяных фолликулов и длина волос увеличиваются, таким образом завершая настоящее изобретение.Accordingly, the present inventors have made great efforts to discover miRNAs capable of reducing hair graying and have found that miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-8485 can activate melanocytes and promote melanogenesis, thereby reducing hair graying, and also that proliferation of dermal papilla cells of hair follicles, keratinocytes, etc. is stimulated further to activate melanocytes, and the outer root sheath (ORS) of hair follicles and hair length are increased, thereby completing the present invention.

Патентная литератураPatent literature

(Патентный документ 1) Корейский патент № 883471(Patent Document 1) Korean Patent No. 883471

(Патентный документ 2) Корейский патент № 1224828(Patent Document 2) Korean Patent No. 1224828

(Патентный документ 3) Корейский патент № 1862349(Patent Document 3) Korean Patent No. 1862349

Непатентная литератураNon-patent literature

(Непатентный документ 1) Iorns, E., Lord, C.J., Turner, N. & Ashworth, A., Nat. Rev. Drug Discov. 6, 556-68. 2007(Non-Patent Document 1) Iorns, E., Lord, C.J., Turner, N. & Ashworth, A., Nat. Rev. Drug Discov. 6, 556-68. 2007

(Непатентный документ 2) Agostini, M. & Knight, R.A., Oncotarget 5, 872-81, 2014(Non-Patent Document 2) Agostini, M. & Knight, R.A., Oncotarget 5, 872-81, 2014

(Непатентный документ 3) Dangwal, S. & Thum, T., Annu. Rev. PharmacolToxicol. 54, 185-203, 2014(Non-Patent Document 3) Dangwal, S. & Thum, T., Annu. Rev. PharmacolToxicol. 54, 185-203, 2014

(Непатентный документ 4) Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009(Non-Patent Document 4) Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009

(Непатентный документ 5) MacFarlane, L.-A. & Murphy, P.R., Current Genomics 11, 537-561, 2010(Non-Patent Document 5) MacFarlane, L.-A. & Murphy, P.R., Current Genomics 11, 537-561, 2010

(Непатентный документ 6) Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009(Non-Patent Document 6) Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009

(Непатентный документ 7) Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009(Non-Patent Document 7) Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009

(Непатентный документ 8) Brodersen, P. & Voinnet, O., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 141-148, 2009(Non-Patent Document 8) Brodersen, P. & Voinnet, O., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 141-148, 2009

(Непатентный документ 9) Malone, C.D. & Hannon, G.J., Cell 136, 656-68, 2009(Non-Patent Document 9) Malone, C.D. & Hannon, G.J., Cell 136, 656-68, 2009

(Непатентный документ 10) Akhtar S, J. Clin Invest. 2007 December 3; 117(12): 3623-3632, 2007(Non-Patent Document 10) Akhtar S, J. Clin Invest. 2007 December 3; 117(12): 3623-3632, 2007

(Непатентный документ 11) S.H. Kim, J. Control Release 129(2):107-16, 2008(Non-Patent Document 11) S.H. Kim, J. Control Release 129(2):107-16, 2008

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Целью настоящего изобретения является обеспечение новой композиции, способной уменьшать поседение волос за счет активации меланоцитов волосяных фолликулов и стимуляции меланогенеза, а также предотвращать или уменьшать выпадение волос и стимулировать рост волос за счет индукции пролиферации клеток волосяных фолликулов.The object of the present invention is to provide a new composition capable of reducing hair graying by activating hair follicle melanocytes and stimulating melanogenesis, as well as preventing or reducing hair loss and stimulating hair growth by inducing proliferation of hair follicle cells.

Для достижения вышеуказанной цели в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция для уменьшения поседения волос, стимулирования роста волос и/или предотвращения или уменьшения выпадения волос, включающая в качестве активного ингредиента (i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485;To achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for reducing graying of hair, promoting hair growth and/or preventing or reducing hair loss, comprising as an active ingredient (i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-8485 ;

(ii) двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию, имеющую структуру приведенной ниже структурной формулы (1):(ii) a double-stranded oligonucleotide construct having the structure of the following structural formula (1):

A-X-R-Y-B … структурная формула (1),A-X-R-Y-B...structural formula (1),

в структурной формуле (1) A представляет собой гидрофильный материал, B представляет собой гидрофобный материал, X и Y, каждый, независимо представляют собой простую ковалентную связь или опосредованную линкером ковалентную связь, и R представляет собой miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485; илиin structural formula (1), A represents a hydrophilic material, B represents a hydrophobic material, X and Y each independently represent a single covalent bond or a linker-mediated covalent bond, and R represents miR-3139, miR-3189, miR- 3199 or miR-8485; or

(iii) наночастицы, включающие такую двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию.(iii) nanoparticles comprising such a double-stranded oligonucleotide construct.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается косметическая композиция для уменьшения поседения волос, стимулирования роста волос и/или предотвращения или уменьшения выпадения волос, включающая в качестве активного ингредиента (i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485; (ii) двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию, имеющую структуру приведенной ниже структурной формулы (1):In addition, the present invention provides a cosmetic composition for reducing graying of hair, promoting hair growth and/or preventing or reducing hair loss, comprising as an active ingredient (i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-8485; (ii) a double-stranded oligonucleotide construct having the structure of the following structural formula (1):

A-X-R-Y-B … структурная формула (1),A-X-R-Y-B...structural formula (1),

в структурной формуле (1) A представляет собой гидрофильный материал, B представляет собой гидрофобный материал, X и Y, каждый, независимо представляют собой простую ковалентную связь или опосредованную линкером ковалентную связь, и R представляет miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485; илиin structural formula (1), A represents a hydrophilic material, B represents a hydrophobic material, X and Y each independently represent a single covalent bond or a linker-mediated covalent bond, and R represents miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-8485; or

(iii) наночастицы, включающие такую двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию.(iii) nanoparticles comprising such a double-stranded oligonucleotide construct.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается способ уменьшения поседения волос, стимулирования роста волос и/или предотвращения или уменьшения выпадения волос, включающий введение субъекту, нуждающемуся в уменьшении поседения волос, стимулировании роста волос и/или предотвращении или уменьшении выпадения волос,In addition, the present invention provides a method of reducing graying of hair, promoting hair growth and/or preventing or reducing hair loss, comprising administering to a subject in need of reducing graying of hair, promoting hair growth and/or preventing or reducing hair loss,

(i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485;(i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-8485;

(ii) двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции, имеющей структуру представленной ниже структурной формулы (1):(ii) a double-stranded oligonucleotide construct having the structure of the following structural formula (1):

A-X-R-Y-B … структурная формула (1),A-X-R-Y-B...structural formula (1),

в структурной формуле (1) A представляет собой гидрофильный материал, B представляет собой гидрофобный материал, X и Y, каждый, независимо представляют собой простую ковалентную связь или опосредованную линкером ковалентную связь, и R представляет собой miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485; илиin structural formula (1), A represents a hydrophilic material, B represents a hydrophobic material, X and Y each independently represent a single covalent bond or a linker-mediated covalent bond, and R represents miR-3139, miR-3189, miR- 3199 or miR-8485; or

(iii) наночастиц, включающих такую двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию.(iii) nanoparticles comprising such a double-stranded oligonucleotide construct.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается применение для уменьшения поседения волос, стимулирования роста волос и/или предотвращения или уменьшения выпадения волос,In addition, the present invention provides use for reducing graying of hair, stimulating hair growth and/or preventing or reducing hair loss,

(i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485;(i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-8485;

(ii) двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции, имеющей структуру структурной формулы (1):(ii) a double-stranded oligonucleotide construct having the structure of structural formula (1):

A-X-R-Y-B … структурная формула (1),A-X-R-Y-B...structural formula (1),

в структурной формуле (1) A представляет собой гидрофильный материал, B представляет собой гидрофобный материал, X и Y, каждый, независимо представляют собой простую ковалентную связь или опосредованную линкером ковалентную связь, и R представляет собой miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485; или (iii) наночастиц, включающих такую двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию.in structural formula (1), A represents a hydrophilic material, B represents a hydrophobic material, X and Y each independently represent a single covalent bond or a linker-mediated covalent bond, and R represents miR-3139, miR-3189, miR- 3199 or miR-8485; or (iii) nanoparticles comprising such a double-stranded oligonucleotide construct.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается применение для изготовления лекарственных средств или косметических средств для уменьшения поседения волос, стимулирования роста волос и/или предотвращения или уменьшения выпадения волос,In addition, the present invention proposes use for the manufacture of medicinal products or cosmetics for reducing graying of hair, stimulating hair growth and/or preventing or reducing hair loss,

(i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485;(i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-8485;

(ii) двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции, имеющей структуру представленной ниже структурной формулы (1):(ii) a double-stranded oligonucleotide construct having the structure of the following structural formula (1):

A-X-R-Y-B … структурная формула (1),A-X-R-Y-B...structural formula (1),

в структурной формуле (1) A представляет собой гидрофильный материал, B представляет собой гидрофобный материал, X и Y, каждый, независимо представляют собой простую ковалентную связь или опосредованную линкером ковалентную связь, и R представляет собой miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485; или (iii) наночастиц, включающих такую двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию.in structural formula (1), A represents a hydrophilic material, B represents a hydrophobic material, X and Y each independently represent a single covalent bond or a linker-mediated covalent bond, and R represents miR-3139, miR-3189, miR- 3199 or miR-8485; or (iii) nanoparticles comprising such a double-stranded oligonucleotide construct.

Описание чертежейDescription of drawings

На фиг. 1 показаны результаты первичного скрининга 1728 мкрРНК человека, нагруженных на SAMiRNA™, путем измерения количества меланина, вырабатываемого в клеточной линии рака кожи человека (М21);In fig. Figure 1 shows the results of an initial screen of 1728 human miRNAs loaded on SAMiRNA™ by measuring the amount of melanin produced in a human skin cancer cell line (M21);

на фиг. 2 показаны результаты вторичного скрининга 18 мкрРНК с высоким количеством вырабатываемого меланина, отобранных посредством скрининга в клеточной линии рака кожи человека (М21);in fig. Figure 2 shows the results of a secondary screen of 18 miRNAs with high amounts of melanin production selected by screening in a human skin cancer cell line (M21);

на фиг. 3 показаны результаты оценки воспроизводимости количества вырабатываемого меланина и эффективности изменения цвета в клеточной линии рака кожи человека (SK-MEL-28) с применением 9 мкрРНК с наибольшим количеством вырабатываемого меланина, отобранных посредством первичного и вторичного скрининга;in fig. Figure 3 shows the results of assessing the reproducibility of the amount of melanin produced and the efficiency of color change in a human skin cancer cell line (SK-MEL-28) using the 9 miRNAs with the highest amount of melanin produced, selected through primary and secondary screening;

на фиг. 4 показаны результаты анализа изменений в передаче сигналов меланогенеза посредством кПЦР-РВ (кПЦР-РВ) для анализа механизма действия 9 мкрРНК, включающих miR-8485, miR-7978, miR-6074, miR-3132, miR-4644, miR-3139, miR-3189, miR-3199 и miR-933 с наибольшим количеством меланина, вырабатываемого в клеточной линии SK-MEL-28;in fig. Figure 4 shows the results of analysis of changes in melanogenesis signaling using qRT-PCR (qRT-PCR) to analyze the mechanism of action of 9 miRNAs, including miR-8485, miR-7978, miR-6074, miR-3132, miR-4644, miR-3139, miR-3189, miR-3199 and miR-933 with the highest amount of melanin produced in the SK-MEL-28 cell line;

на фиг. 5 показаны результаты анализа изменений в передаче сигналов меланогенеза посредством кПЦР-РВ с применением 9 выбранных мкрРНК, включающих miR-8485, miR-7978, miR-6074, miR-3132, miR-4644, miR-3139, miR-3189, miR-3199 и miR-933, в клеточной линии эпидермальных меланоцитов человека;in fig. Figure 5 shows the results of analysis of changes in melanogenesis signaling using qRT-PCR using 9 selected miRNAs, including miR-8485, miR-7978, miR-6074, miR-3132, miR-4644, miR-3139, miR-3189, miR- 3199 and miR-933, in a human epidermal melanocyte cell line;

на фиг. 6 показаны результаты, подтверждающие изменения в передаче сигналов меланогенеза посредством Вестерн-блоттинга для анализа механизма действия 9 выбранных мкрРНК, включающих miR-8485, miR-7978, miR-6074, miR-3132, miR-4644, miR-3139, miR-3189, miR-3199 и miR-933, в клеточной линии SK-MEL-28;in fig. Figure 6 shows results confirming changes in melanogenesis signaling using Western blotting to analyze the mechanism of action of 9 selected miRNAs, including miR-8485, miR-7978, miR-6074, miR-3132, miR-4644, miR-3139, miR-3189 , miR-3199 and miR-933, in the SK-MEL-28 cell line;

на фиг. 7 показаны результаты наблюдения за стимулированием пролиферации клеток наружной корневой оболочки (ORS) и волосяных фолликулов в выщипанных седых волосах человека с применением окончательно отобранных 4 мкрРНК, включающих miR-3139, miR-3189, miR-3199 и miR-8485;in fig. 7 shows the results of the observation of stimulation of proliferation of outer root sheath (ORS) cells and hair follicles in plucked gray human hair using the final selected 4 miRNAs, including miR-3139, miR-3189, miR-3199 and miR-8485;

на фиг. 8 показаны результаты наблюдения за эффективностью (изменением цвета) в выщипанных седых волосах человека с помощью окончательно отобранных 4 мкрРНК, включающих miR-3139, miR-3189, miR-3199 и miR-8485;in fig. 8 shows the results of monitoring the effectiveness (color change) in plucked gray human hair by the finally selected 4 miRNAs, including miR-3139, miR-3189, miR-3199 and miR-8485;

на фиг. 9а показаны результаты анализа изменения цвета клеток и количества меланина, вырабатываемого при обработке клеточной линии SK-MEL-28 с применением SAMiRNA-miR-3199;in fig. 9a shows the results of the analysis of changes in cell color and the amount of melanin produced when the SK-MEL-28 cell line is treated with SAMiRNA-miR-3199;

на фиг. 9b показаны результаты, подтверждающие изменения в передаче сигналов меланогенеза посредством кПЦР-РВ при обработке клеточной линии SK-MEL-28 с применением SAMiRNA-miR-3199;in fig. 9b shows results confirming changes in melanogenesis signaling by qRT-PCR when the SK-MEL-28 cell line was treated with SAMiRNA-miR-3199;

на фиг. 9c показаны результаты, подтверждающие изменения в передаче сигналов меланогенеза иммуноблоттингом с обработкой SAMiRNA-miR-3199 клеточной линии SK-MEL-28;in fig. 9c shows results confirming changes in melanogenesis signaling by immunoblotting with SAMiRNA-miR-3199 treatment of the SK-MEL-28 cell line;

на фиг. 9d показаны результаты, подтверждающие эффективность изменений в передаче сигналов меланогенеза иммуноцитохимическим анализом с обработкой SAMiRNA-miR-3199 клеточной линии SK-MEL-28;in fig. 9d shows the results confirming the effectiveness of changes in melanogenesis signaling by immunocytochemical analysis with SAMiRNA-miR-3199 treatment of the SK-MEL-28 cell line;

на фиг. 10а показаны результаты выбора GSK3бета в качестве гена-мишени miR-3199;in fig. 10a shows the results of selecting GSK3beta as the target gene of miR-3199;

на фиг. 10b показаны результаты, подтверждающие эффективность в отношении ингибирования GSK3бета посредством кПЦР-РВ при обработке SAMiRNA-miR-3199 клеточной линии SK-MEL-28;in fig. 10b shows the results confirming the effectiveness of GSK3beta inhibition by qRT-PCR on SAMiRNA-miR-3199 treatment of SK-MEL-28 cell line;

на фиг. 10c показаны результаты, подтверждающие эффективность в отношении ингибирования GSK3бета иммуноблоттингом с обработкой SAMiRNA-miR-3199 клеточной линии SK-MEL-28;in fig. 10c shows results confirming the effectiveness of GSK3beta inhibition by immunoblotting with SAMiRNA-miR-3199 treatment of the SK-MEL-28 cell line;

на фиг. 10d показаны результаты, подтверждающие эффективность в отношении ингибирования GSK3бета иммуноцитохимическим анализом с обработкой SAMiRNA-miR-3199 клеточной линии SK-MEL-28;in fig. 10d shows the results confirming the effectiveness of GSK3beta inhibition by immunocytochemical analysis with SAMiRNA-miR-3199 treatment of SK-MEL-28 cell line;

на фиг. 10е показаны результаты, подтверждающие действие miR-3199 путем прямого связывания с 3'-UTR мРНК GSK3бета посредством анализа репортерного гена люциферазы;in fig. Figure 10f shows results confirming the action of miR-3199 by directly binding to the 3'-UTR of GSK3beta mRNA through a luciferase reporter gene assay;

на фиг. 11а показаны результаты анализа изменения цвета клеток и количества меланина, вырабатываемого при обработке SAMiRNA-miR-3199 эпидермальных меланоцитов человека;in fig. 11a shows the results of the analysis of changes in cell color and the amount of melanin produced when human epidermal melanocytes are treated with SAMiRNA-miR-3199;

на фиг. 11b показаны результаты, подтверждающие изменения в передаче сигналов меланогенеза посредством кПЦР-РВ при обработке SAMiRNA-miR-3199 эпидермальных меланоцитов человека;in fig. 11b shows results confirming changes in melanogenesis signaling by qRT-PCR upon treatment of human epidermal melanocytes with SAMiRNA-miR-3199;

на фиг. 11c показаны результаты, подтверждающие изменения в передаче сигналов меланогенеза иммуноблоттингом с обработкой SAMiRNA-miR-3199 эпидермальных меланоцитов человека;in fig. 11c shows results confirming changes in melanogenesis signaling by immunoblotting with SAMiRNA-miR-3199 treatment of human epidermal melanocytes;

на фиг. 12а показаны результаты оценки цитотоксичности SAMiRNA-miR-3199 в клетках дермальной папиллы фолликула человека, кератиноцитах и меланоцитах человека; иin fig. 12a shows the results of assessing the cytotoxicity of SAMiRNA-miR-3199 in human dermal papillary follicle cells, human keratinocytes and melanocytes; And

на фиг. 12b показаны результаты оценки врожденной иммунотоксичности SAMiRNA-miR-3199 путем подтверждения увеличения содержания воспалительных цитокинов в мононуклеарных клетках периферической крови человека (РВМС).in fig. 12b shows the results of evaluating the innate immunotoxicity of SAMiRNA-miR-3199 by confirming the increase in inflammatory cytokines in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs).

Осуществление изобретенияCarrying out the invention

Если не указано иное, все используемые в настоящем документе технические и научные термины имеют такие же значения, которые обычно понимаются специалистами в той области, к которой относится настоящее изобретение. В общем, используемая в настоящем документе номенклатура хорошо известна в данной области и является типичной.Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used herein have the same meanings as commonly understood by those skilled in the art to which this invention relates. In general, the nomenclature used herein is well known in the art and is typical.

В настоящем изобретении, в связи с необходимостью предотвращения или уменьшения поседения и выпадения волос, синтезировали скрининговую библиотеку на 1728 мкрРНК человека (таблица 2) и использовали для обработки клеточных линий рака кожи человека и эпидермальных меланоцитов человека, а также измеряли количество вырабатываемого меланина и анализировали изменение окрашивания клеток, в результате чего было выявлено четыре эффективные мкрРНК, включающие miR-3139, miR-3189, miR-3199 и miR-8485. Кроме того, было подтверждено, что мкрРНК способна уменьшать поседение волос за счет активации меланоцитов и стимулирования меланогенеза в выщипанных седых волосах человека, и был идентифицирован механизм действия стимулирования меланогенеза, а также посредством оценки цитотоксичности и врожденной иммунотоксичности было подтверждено, что мкрРНК способна стимулировать меланогенез в волосах без побочных эффектов. Кроме того, было подтверждено стимулирование пролиферации клеток, таких как клетки дермальной папиллы волосяного фолликула и кератиноциты, наряду с активацией меланоцитов, а также развивалась наружная корневая оболочка и увеличилась длина волос.In the present invention, in response to the need to prevent or reduce graying and hair loss, a screening library of 1728 human miRNAs was synthesized (Table 2) and used to treat human skin cancer cell lines and human epidermal melanocytes, and measure the amount of melanin produced and analyze the change cell staining, which resulted in the identification of four effective miRNAs, including miR-3139, miR-3189, miR-3199 and miR-8485. In addition, it was confirmed that miRNA is able to reduce hair graying by activating melanocytes and promoting melanogenesis in human plucked gray hair, and the mechanism of action of promoting melanogenesis was identified, and through the evaluation of cytotoxicity and innate immunotoxicity, it was confirmed that miRNA is capable of promoting melanogenesis in hair without side effects. In addition, it was confirmed that the proliferation of cells such as hair follicle dermal papilla cells and keratinocytes was stimulated, along with the activation of melanocytes, as well as the development of the outer root sheath and increased hair length.

Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для уменьшения поседения волос, стимулирования роста волос и/или предотвращения или уменьшения выпадения волос, включающей в качестве активного ингредиента:Accordingly, one aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition for reducing graying of hair, promoting hair growth and/or preventing or reducing hair loss, comprising as an active ingredient:

(i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485;(i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-8485;

(ii) двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию, имеющую структуру представленной ниже структурной формулы (1):(ii) a double-stranded oligonucleotide construct having the structure of the following structural formula (1):

A-X-R-Y-B … структурная формула (1),A-X-R-Y-B...structural formula (1),

в структурной формуле (1) A представляет собой гидрофильный материал, B представляет собой гидрофобный материал, X и Y, каждый, независимо представляют собой простую ковалентную связь или опосредованную линкером ковалентную связь, и R представляет собой miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485; илиin structural formula (1), A represents a hydrophilic material, B represents a hydrophobic material, X and Y each independently represent a single covalent bond or a linker-mediated covalent bond, and R represents miR-3139, miR-3189, miR- 3199 or miR-8485; or

(iii) наночастицы, включающие такую двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию.(iii) nanoparticles comprising such a double-stranded oligonucleotide construct.

Другой аспект настоящего изобретения относится к косметической композиции для уменьшения поседения волос, стимулирования роста волос и/или предотвращения или уменьшения выпадения волос, включающей в качестве активного ингредиента:Another aspect of the present invention relates to a cosmetic composition for reducing graying of hair, stimulating hair growth and/or preventing or reducing hair loss, comprising as an active ingredient:

(i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485;(i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-8485;

(ii) двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию, имеющую структуру представленной ниже структурной формулы (1):(ii) a double-stranded oligonucleotide construct having the structure of the following structural formula (1):

A-X-R-Y-B … структурная формула (1),A-X-R-Y-B...structural formula (1),

в структурной формуле (1) A представляет собой гидрофильный материал, B представляет собой гидрофобный материал, X и Y, каждый, независимо представляют собой простую ковалентную связь или опосредованную линкером ковалентную связь, и R представляет собой miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485; илиin structural formula (1), A represents a hydrophilic material, B represents a hydrophobic material, X and Y each independently represent a single covalent bond or a linker-mediated covalent bond, and R represents miR-3139, miR-3189, miR- 3199 or miR-8485; or

(iii) наночастицы, включающие такую двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию.(iii) nanoparticles comprising such a double-stranded oligonucleotide construct.

В настоящем изобретении композиция способна уменьшать поседение волос, стимулировать рост волос и/или предотвращать или уменьшать выпадение волос путем активации меланоцитов и пролиферации клеток волосяных фолликулов, но настоящее изобретение не ограничивается этим.In the present invention, the composition is capable of reducing graying of hair, stimulating hair growth and/or preventing or reducing hair loss by activating melanocytes and proliferation of hair follicle cells, but the present invention is not limited to this.

В настоящем изобретении miR-3139 может включать нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10, и предпочтительно представляет собой ДНК/ДНК, РНК/РНК или гибрид ДНК/РНК, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 9, и нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10.In the present invention, miR-3139 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10, and preferably is DNA/DNA, RNA/RNA, or a DNA/RNA hybrid consisting of a nucleotide sequence , represented by SEQ ID NO: 9, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10.

miR-3139miR-3139

5’-CAGGCAUCUGUUGAGCUCCUAUU-3’ (SEQ ID NO: 9)5'-CAGGCAUCUGUUGAGCUCCUAUU-3' (SEQ ID NO: 9)

5’-UAGGAGCUCAACAGAUGCCUGUU-3’ (SEQ ID NO: 10)5'-UAGGAGCUCAACAGAUGCCUGUU-3' (SEQ ID NO: 10)

В настоящем изобретении miR-3189 может включать нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5, и нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6, и предпочтительно представляет собой ДНК/ДНК, РНК/РНК или гибрид ДНК/РНК, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, и нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.In the present invention, miR-3189 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, and is preferably DNA/DNA, RNA/RNA, or a DNA/RNA hybrid consisting of the nucleotide sequence , represented by SEQ ID NO: 5, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6.

miR-3189miR-3189

5’-UGCCCCAUCUGUGCCCUGGGUAGGA-3’ (SEQ ID NO: 5)5'-UGCCCCAUCUGUGCCCUGGGUAGGA-3' (SEQ ID NO: 5)

5’-CCCUUGGGUCUGAUGGGGUAG-3’ (SEQ ID NO: 6)5'-CCCUUGGGUCUGAUGGGGUAG-3' (SEQ ID NO: 6)

В настоящем изобретении miR-3199 может включать нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, и нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 16, и предпочтительно представляет собой ДНК/ДНК, РНК/РНК или гибрид ДНК/РНК, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 15, и нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16.In the present invention, miR-3199 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16, and preferably is DNA/DNA, RNA/RNA, or a DNA/RNA hybrid consisting of a nucleotide sequence , represented by SEQ ID NO: 15, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16.

miR-3199miR-3199

5’-CUUUCUCCUAAGGCAGUCCCUUU-3’ (SEQ ID NO: 15)5’-CUUUCUCCUAAGGCAGUCCCUUU-3’ (SEQ ID NO: 15)

5’-AGGGACUGCCUUAGGAGAAAGUU-3’ (SEQ ID NO: 16)5'-AGGGACUGCCUUAGGAGAAAGUU-3' (SEQ ID NO: 16)

В настоящем изобретении miR-8485 может включать нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, и нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2, и предпочтительно представляет собой ДНК/ДНК, РНК/РНК или гибрид ДНК/РНК, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, и нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2.In the present invention, miR-8485 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, and preferably is DNA/DNA, RNA/RNA, or a DNA/RNA hybrid consisting of a nucleotide sequence , represented by SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.

miR-8485miR-8485

5’-ACGUGUGUGUGUGUGUGUGUU-3’ (SEQ ID NO: 1)5'-ACGUGUGUGUGUGUGUGUGUU-3' (SEQ ID NO: 1)

5’-CACACACACACACACACGUAU-3’ (SEQ ID NO: 2)5'-CACACACACACACACACGUAU-3' (SEQ ID NO: 2)

В настоящем изобретении было подтверждено, что miR-3189, miR-3199 и miR-8485 повышают экспрессию фактора транскрипции, ассоциированного с микрофтальмом (MITF), тирозиназы (TYR), родственного тирозиназе белка 1 (TYRP1) и родственного тирозиназе белка 2 (TYRP2), а miR-3139 повышает экспрессию TYR и TYRP2.In the present invention, miR-3189, miR-3199 and miR-8485 were confirmed to increase the expression of microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase (TYR), tyrosinase-related protein 1 (TYRP1) and tyrosinase-related protein 2 (TYRP2) , and miR-3139 increases the expression of TYR and TYRP2.

Известно, что гены, экспрессия которых повышается с помощью мкрРНК по настоящему изобретению, выполняют следующие функции.The genes that are upregulated by the miRNAs of the present invention are known to perform the following functions.

MITF, являющийся фактором транскрипции, регулирует экспрессию генов TYR, TYRP1 и TYRP2, которые являются ферментами, непосредственно участвующими в синтезе пигмента меланина, и известен как основной фактор транскрипции для развития и дифференцировки меланоцитов (D’Mello, S. A., Finlay, G. J., Baguley, B. C. & Askarian-Amiri, M. E. Signaling Pathways in Melanogenesis. Int. J. Mol. Sci. 17 (2016); Kawakami A, Fisher DE. The master role of microphthalmia-associated transcription factor in melanocyte and melanoma biology. Lab. Investig. (2017)).MITF, which is a transcription factor, regulates the expression of the TYR, TYRP1 and TYRP2 genes, which are enzymes directly involved in the synthesis of melanin pigment, and is known as a major transcription factor for the development and differentiation of melanocytes (D'Mello, S. A., Finlay, G. J., Baguley, B. C. & Askarian-Amiri, M. E. Signaling Pathways in Melanogenesis. J. Mol. Sci. 17 (2016); Kawakami A., The master role of microphthalmia-associated transcription factor in melanocyte and melanoma biology. (2017)).

TYR, TYRP1 и TYRP2 в основном участвуют в превращении тирозина в пигмент меланин и, в частности, известно, что TYR и TYRP2 являются важными ферментами, влияющими на количество и качество меланина (NIU, C., AISA, H.A., 2017: Upregulation of melanogenesis and tyrosinase activity: potential agents for vitiligo. Molecules 22, E1303. (2017); D’Mello, S. A., Finlay, G. J., Baguley, B. C. & Askarian-Amiri, M. E. Signaling Pathways in Melanogenesis. Int. J. Mol. Sci. 17 (2016)).TYR, TYRP1 and TYRP2 are mainly involved in the conversion of tyrosine to the pigment melanin and, in particular, TYR and TYRP2 are known to be important enzymes affecting the quantity and quality of melanin (NIU, C., AISA, H.A., 2017: Upregulation of melanogenesis and tyrosinase activity: potential agents for vitiligo. Molecules 22, E1303. (2017); 17 (2016)).

Как описано в предшествующем уровне техники, затравочная область в диапазоне от 2-го основания до 8-го-9-го оснований в активной последовательности мкрРНК является основным фактором активности. При получении двухцепочечного олигонуклеотида можно сконструировать и использовать длинный двухцепочечный олигонуклеотид, включающий ее. As described in the prior art, the seed region ranging from base 2 to base 8-9 in the active miRNA sequence is the major driver of activity. When preparing a double-stranded oligonucleotide, a long double-stranded oligonucleotide incorporating it can be designed and used.

Кроме того, мкрРНК может быть двухцепочечной и в другом варианте осуществления может включать одномолекулярный полинуклеотид. Например, это может быть антисмысловой олигонуклеотид или мкрРНК, но не ограничивается ими.In addition, the miRNA may be double-stranded and, in another embodiment, may comprise a single molecule polynucleotide. For example, this may be, but is not limited to, an antisense oligonucleotide or miRNA.

Между тем, miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485 могут включать последовательность, в которой по меньшей мере одно основание заменено, удалено или вставлено в смысловую цепь, которая составляет ту же самую или комплементарную ей антисмысловую цепь.Meanwhile, miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-8485 may include a sequence in which at least one base is replaced, deleted or inserted into a sense strand that constitutes the same or complementary antisense strand.

Двухцепочечный олигонуклеотид в соответствии с настоящим изобретением может включать липкий конец, представляющий собой структуру, включающую один или несколько неспаренных нуклеотидов на 3’-конце одной или обеих цепей. Кроме того, смысловая цепь или антисмысловая цепь предпочтительно состоит из 19-31 нуклеотида, но не ограничивается этим.A double-stranded oligonucleotide in accordance with the present invention may include an overhang, which is a structure including one or more unpaired nucleotides at the 3' end of one or both strands. In addition, the sense strand or antisense strand preferably consists of 19-31 nucleotides, but is not limited to this.

В настоящем изобретении для олигоконъюгата, в котором гидрофильный материал и гидрофобный материал связываются с олигонуклеотидом РНК или ДНК, олигонуклеотид может быть эффективно доставлен in vivo, и его стабильность может быть повышена за счет конъюгата, в котором гидрофильный материал и гидрофобный материал конъюгированы с обоими концами олигонуклеотида РНК или ДНК.In the present invention, for an oligoconjugate in which a hydrophilic material and a hydrophobic material are bound to an RNA or DNA oligonucleotide, the oligonucleotide can be efficiently delivered in vivo and its stability can be improved by a conjugate in which a hydrophilic material and a hydrophobic material are conjugated to both ends of the oligonucleotide RNA or DNA.

Кроме того, самособирающиеся наночастицы образуются в результате гидрофобного взаимодействия гидрофобных материалов, и такие наночастицы обладают значительно более высокой эффективностью и стабильностью доставки in vivo, а также имеют очень однородный размер частиц благодаря структурным улучшениям, так что процесс изготовления лекарственного средства является простым, потому что QC (контроль качества) не составляет труда.In addition, self-assembled nanoparticles are formed by the hydrophobic interaction of hydrophobic materials, and such nanoparticles have significantly higher in vivo delivery efficiency and stability, and also have a very uniform particle size due to structural improvements, so that the drug manufacturing process is simple because QC (quality control) is not difficult.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения гидрофильный материал представлен (P)n, (Pm-J)n или (J-Pm)n, где P представляет собой мономер гидрофильного материала, n равно от 1 до 200, m равно от 1 до 15, и J представляет собой линкер, соединяющий m мономеров гидрофильного материала друг с другом или соединяющий m мономеров гидрофильного материала и олигонуклеотиды друг с другом.In one embodiment of the present invention, the hydrophilic material is (P) n , ( Pm -J) n , or ( JPm ) n , where P is a monomer of the hydrophilic material, n is from 1 to 200, m is from 1 to 15, and J is a linker connecting m hydrophilic material monomers to each other or connecting m hydrophilic material monomers and oligonucleotides to each other.

В настоящем изобретении гидрофильный материал может иметь молекулярную массу от 200 до 10000.In the present invention, the hydrophilic material may have a molecular weight from 200 to 10,000.

В настоящем изобретении гидрофильный материал может быть любым материалом, выбранным из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона и полиоксазолина, но не ограничивается ими.In the present invention, the hydrophilic material may be any material selected from the group consisting of, but not limited to, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone and polyoxazoline.

В настоящем изобретении мономер гидрофильного материала Р может иметь представленную ниже структуру соединения (1):In the present invention, the hydrophilic material monomer P may have the following structure of compound (1):

… соединение (1). ... connection (1).

В соединении (1) G выбран из группы, состоящей из CH2, O, S и NH.In compound (1), G is selected from the group consisting of CH 2 , O, S and NH.

В настоящем изобретении линкер J может быть выбран из группы, состоящей из PO3 -, SO3 и CO2.In the present invention, linker J may be selected from the group consisting of PO 3 - , SO 3 and CO 2 .

В настоящем изобретении гидрофобный материал может иметь молекулярную массу от 250 до 1000, и гидрофобный материал может быть выбран из группы, состоящей из производного стероида, производного глицерида, эфира глицерола, полипропиленгликоля, ненасыщенного или насыщенного C12-С50 углеводорода, диацилфосфатидилхолина, жирной кислоты, фосфолипида и липополиамина, но не ограничивается ими.In the present invention, the hydrophobic material may have a molecular weight of from 250 to 1000, and the hydrophobic material may be selected from the group consisting of a steroid derivative, a glyceride derivative, a glycerol ether, a polypropylene glycol, an unsaturated or saturated C 12 -C 50 hydrocarbon, a diacylphosphatidylcholine, a fatty acid , phospholipid and lipopolyamine, but is not limited to them.

В настоящем изобретении производное стероида может быть выбрано из группы, состоящей из холестерола, холестанола, холевой кислоты, холестерилформиата, холестанилформиата и холестериламина, но не ограничивается ими.In the present invention, the steroid derivative may be selected from the group consisting of, but not limited to, cholesterol, cholestanol, cholic acid, cholesteryl formate, cholestanyl formate and cholesterol.

В настоящем изобретении производное глицерида может быть выбрано из группы, состоящей из моно-, ди- и триглицеридов, но не ограничивается ими.In the present invention, the glyceride derivative may be selected from the group consisting of, but is not limited to, mono-, di- and triglycerides.

В настоящем изобретении ковалентная связь, представленная X и Y, может быть либо нерасщепляемой связью, либо расщепляемой связью. В настоящем документе нерасщепляемой связью может быть амидная связь или фосфатная связь, и расщепляемой связью может быть дисульфидная связь, разлагаемая кислотой связь, сложноэфирная связь, ангидридная связь, биоразлагаемая связь или разлагаемая ферментами связь, но настоящее изобретение не ограничивается ими.In the present invention, the covalent bond represented by X and Y may be either a non-cleavable bond or a cleavable bond. As used herein, the non-cleavable bond may be an amide bond or a phosphate bond, and the cleavable bond may be a disulfide bond, an acid-degradable bond, an ester bond, an anhydride bond, a biodegradable bond or an enzyme-degradable bond, but the present invention is not limited to them.

Когда гидрофильным материалом является А, двухцепочечная олигонуклеотидная конструкция по настоящему изобретению может иметь структуру представленной ниже структурной формулы (1’).When the hydrophilic material is A, the double-stranded oligonucleotide construct of the present invention may have the structure of the following structural formula (1').

… структурная формула (1’). ...structural formula (1').

В структурной формуле (1’) A, B, X и Y имеют значения, определенные в структурной формуле (1), S представляет собой смысловую цепь мкрРНК, и AS представляет собой антисмысловую цепь мкрРНК.In structural formula (1'), A, B, X and Y have the meanings defined in structural formula (1), S represents the sense strand of miRNA, and AS represents the antisense strand of miRNA.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения двухцепочечная олигонуклеотидная конструкция, включающая мкрРНК, в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию, имеющую структуру представленной ниже структурной формулы (2).In one embodiment of the present invention, the double-stranded oligonucleotide construct comprising miRNA according to the present invention may be a double-stranded oligonucleotide construct having the structure of structural formula (2) below.

A-X-5’ R 3’ Y-B … структурная формула (2).A-X-5’ R 3’ Y-B ... structural formula (2).

В структурной формуле (2) A, B, X, Y и R являются такими, как определено в структурной формуле 1.In structural formula (2), A, B, X, Y and R are as defined in structural formula 1.

Более предпочтительно двухцепочечная олигонуклеотидная конструкция имеет структуру представленной ниже структурной формулы (2’).More preferably, the double-stranded oligonucleotide construct has the structure of structural formula (2') below.

… структурная формула (2’) …structural formula (2')

В одном варианте осуществления настоящего изобретения гидрофильный материал может представлять собой катионный или неионогенный полимерный материал с молекулярной массой от 200 до 10000, предпочтительно неионогенный полимерный материал с молекулярной массой от 1000 до 2000. Гидрофильный материал может представлять собой неионогенное гидрофильное полимерное соединение и может быть любым соединением, выбранным из группы, состоящей, например, из полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона и полиоксазолина, но не ограничивается ими.In one embodiment of the present invention, the hydrophilic material may be a cationic or nonionic polymeric material with a molecular weight of 200 to 10,000, preferably a nonionic polymeric material with a molecular weight of 1000 to 2000. The hydrophilic material may be a nonionic hydrophilic polymeric compound and may be any compound selected from the group consisting of, for example, but not limited to polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone and polyoxazoline.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, когда гидрофильным материалом является (Pm-J)n или (J-Pm)n, двухцепочечная олигонуклеотидная конструкция в соответствии с настоящим изобретением имеет структуру представленной ниже структурной формулы (3) или структурной формулы (4).In another embodiment of the present invention, when the hydrophilic material is (P m -J) n or (JP m ) n , the double-stranded oligonucleotide construct according to the present invention has the structure of structural formula (3) or structural formula (4) below.

(Pm-J)n-X-R-Y-B … структурная формула (3),(P m -J) n -XRYB ... structural formula (3),

(J-Pm)n-X-R-Y-B … структурная формула (4).(JP m ) n -XRYB ... structural formula (4).

В структурной формуле (3) и структурной формуле (4) P представляет собой мономер гидрофильного материала, n равно от 1 до 200, m равно от 1 до 15, J представляет собой линкер, соединяющий m мономеров гидрофильного материала друг с другом или соединяющий m мономеров гидрофильного материала и олигонуклеотиды друг с другом, X и Y, каждый, независимо представляют собой простую ковалентную связь или опосредованную линкером ковалентную связь, и R представляет собой специфическую мкрРНК по настоящему изобретению. Более предпочтительно двухцепочечная олигонуклеотидная конструкция, включающая мкрРНК в соответствии с настоящим изобретением имеет структуру представленной ниже структурной формулы (3’).In structural formula (3) and structural formula (4), P represents a monomer of a hydrophilic material, n is from 1 to 200, m is from 1 to 15, J is a linker connecting m monomers of a hydrophilic material to each other or connecting m monomers hydrophilic material and oligonucleotides with each other, X and Y each independently represent a single covalent bond or a linker-mediated covalent bond, and R represents a specific miRNA of the present invention. More preferably, the double-stranded oligonucleotide construct comprising miRNA according to the present invention has the structure of the following structural formula (3').

… структурная формула (3’). ...structural formula (3').

В структурной формуле (3') P, B, J, m, n, X и Y имеют значения, указанные в структурной формуле (3), S представляет собой смысловую цепь мкрРНК, и AS представляет собой антисмысловую цепь мкрРНК.In structural formula (3'), P, B, J, m, n, X and Y have the meanings indicated in structural formula (3), S represents the sense strand of miRNA, and AS represents the antisense strand of miRNA.

Более предпочтительно двухцепочечная олигонуклеотидная конструкция, включающая мкрРНК в соответствии с настоящим изобретением имеет структуру представленной ниже структурной формулы (4’).More preferably, the double-stranded oligonucleotide construct comprising miRNA according to the present invention has the structure of the following structural formula (4').

… структурная формула (4’). ...structural formula (4').

В структурной формуле (4') P, B, J, m, n, X и Y имеют значения, определенные в структурной формуле (4), S представляет собой смысловую цепь мкрРНК, и AS представляет собой антисмысловую цепь мкрРНК.In structural formula (4'), P, B, J, m, n, X and Y have the meanings defined in structural formula (4), S represents the sense strand of miRNA, and AS represents the antisense strand of miRNA.

В качестве мономера гидрофильного материала P в структурной формуле (3) и структурной формуле (4) можно использовать любой мономер неионогенных гидрофильных полимеров без ограничений при условии, что он соответствует цели настоящего изобретения. Предпочтительно используют мономер, выбранный из соединения (1) - соединения (3), показанных в таблице 1 ниже, более предпочтительно используют мономер соединения (1), и G в соединении (1) предпочтительно выбирают из СН2, О, S и NH.As the hydrophilic material monomer P in structural formula (3) and structural formula (4), any monomer of nonionic hydrophilic polymers can be used without limitation, provided that it meets the purpose of the present invention. Preferably, a monomer selected from compound (1) to compound (3) shown in Table 1 below is used, more preferably a monomer of compound (1) is used, and G in compound (1) is preferably selected from CH 2 , O, S and NH.

В частности, среди мономеров гидрофильных материалов мономер, представленный соединением (1), может включать различные введенные в него функциональные группы, может иметь превосходную биосовместимость, такую как хорошее сродство in vivo и низкий иммунный ответ, и может повышать стабильность in vivo олигонуклеотида, содержащегося в конструкции в соответствии со структурной формулой (3) и структурной формулой (4), а также эффективность его доставки, поэтому он очень подходит для изготовления конструкции в соответствии с настоящим изобретением.Particularly, among the monomers of hydrophilic materials, the monomer represented by compound (1) can include various functional groups introduced therein, can have excellent biocompatibility such as good in vivo affinity and low immune response, and can improve the in vivo stability of the oligonucleotide contained in structures according to structural formula (3) and structural formula (4), as well as its delivery efficiency, so it is very suitable for manufacturing the structure according to the present invention.

Таблица 1. Предпочтительная структура мономера гидрофильного материала в настоящем изобретенииTable 1. Preferred monomer structure of hydrophilic material in the present invention Соединение (1)Connection (1) Соединение (2)Connection (2) Соединение (3)Connection (3)
G представляет собой CH2, O, S или NH
G is CH2 , O, S or NH

Предпочтительно, чтобы гидрофильный материал по структурной формуле (3) и структурной формуле (4) имел общую молекулярную массу в пределах от 1000 до 2000. Поэтому, например, при применении гексаэтиленгликоля в качестве соединения (1) в структурной формуле (3) и структурной формуле (4), то есть материала, в котором G означает О, а m равно 6, молекулярная масса гексаэтиленгликолевого спейсера равна 344, а число повторений n предпочтительно составляет от 3 до 5. Настоящее изобретение отличается тем, что повторяющееся звено гидрофильной группы, представленное в виде (Pm-J) или (J-Pm) в структурной формуле (3) и структурной формуле (4), то есть блок гидрофильного материала, может использоваться в соответствующем количестве, представленном n, по необходимости. Мономер P гидрофильного материала и линкер J, входящие в каждый из блоков гидрофильного материала, могут независимо быть одинаковыми или разными в блоках гидрофильного материала. В частности, при применении трех блоков гидрофильного материала (n=3), первый блок может включать мономер гидрофильного материала в соответствии с соединением (1), второй блок может включать мономер гидрофильного материала в соответствии с соединением (2), а третий блок может включать мономер гидрофильного материала в соответствии с соединением (3). Таким образом, можно использовать различные мономеры гидрофильного материала для всех блоков гидрофильного материала или же использовать какой-либо мономер гидрофильного материала, выбранный из мономеров гидрофильного материала в соответствии с соединением (1) - соединением (3), одинаковый для всех блоков гидрофильного материала. Точно также же в качестве линкера, который опосредует связывание мономеров гидрофильного материала, можно использовать один и тот же линкер для блоков гидрофильного материала или же разные линкеры для блоков гидрофильного материала. Кроме того, m, то есть количество мономеров гидрофильного материала, может быть одинаковым или различным в блоках гидрофильного материала. В частности, в первом блоке гидрофильного материала могут соединяться три мономера гидрофильного материала (m=3), во втором блоке гидрофильного материала могут соединяться пять мономеров гидрофильного материала (m=5) и в третьем блоке гидрофильного материала могут соединяться четыре мономера гидрофильного материала (m=4). Таким образом, можно использовать различные количества мономеров гидрофильного материала или же использовать одинаковое количество мономеров гидрофильного материала во всех блоках гидрофильного материала.It is preferable that the hydrophilic material of structural formula (3) and structural formula (4) has a total molecular weight ranging from 1000 to 2000. Therefore, for example, when using hexaethylene glycol as the compound (1) in structural formula (3) and structural formula (4), that is, a material in which G is O and m is 6, the molecular weight of the hexaethylene glycol spacer is 344, and the number of repeats n is preferably from 3 to 5. The present invention is characterized in that the repeating unit of the hydrophilic group represented in form (P m -J) or (JP m ) in structural formula (3) and structural formula (4), that is, a block of hydrophilic material can be used in an appropriate amount represented by n as needed. The hydrophilic material monomer P and the linker J included in each of the hydrophilic material blocks may independently be the same or different in the hydrophilic material blocks. Specifically, when using three blocks of hydrophilic material (n=3), the first block may include a hydrophilic material monomer according to compound (1), the second block may include a hydrophilic material monomer according to compound (2), and the third block may include a hydrophilic material monomer according to compound (3). Thus, it is possible to use different hydrophilic material monomers for all hydrophilic material blocks, or to use any hydrophilic material monomer selected from hydrophilic material monomers according to Compound (1) to Compound (3) that is the same for all hydrophilic material blocks. Likewise, the linker that mediates the binding of the hydrophilic material monomers can be the same linker for the hydrophilic material blocks or different linkers for the hydrophilic material blocks. In addition, m, that is, the number of monomers of the hydrophilic material, may be the same or different in the blocks of hydrophilic material. Specifically, in the first block of hydrophilic material, three monomers of hydrophilic material can be combined (m=3), in the second block of hydrophilic material, five monomers of hydrophilic material can be combined (m=5), and in the third block of hydrophilic material, four monomers of hydrophilic material can be combined (m =4). Thus, different amounts of hydrophilic material monomers can be used, or the same amount of hydrophilic material monomers can be used in all blocks of hydrophilic material.

В настоящем изобретении линкер J предпочтительно выбирают из группы, состоящей из PO3 -, SO3 и CO2, но не ограничиваются этим. Можно использовать любой линкер, если только он соответствует цели настоящего изобретения, в зависимости от используемого мономера гидрофильного материала, как это должно быть очевидно специалистам в данной области.In the present invention, linker J is preferably selected from the group consisting of, but is not limited to, PO 3 - , SO 3 and CO 2 . Any linker can be used as long as it meets the purpose of the present invention, depending on the hydrophilic material monomer used, as will be apparent to those skilled in the art.

Все или часть мономеров гидрофильного материала могут быть модифицированы, чтобы иметь функциональную группу, необходимую для связывания с другими материалами, такими как мишень-специфический лиганд, по необходимости.All or part of the monomers of the hydrophilic material can be modified to have the functional group necessary for binding to other materials, such as a target-specific ligand, as needed.

В некоторых случаях от одной до трех фосфатных групп могут связываться с 5'-концом антисмысловой цепи двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции, включая ген-специфическую мкрРНК.In some cases, one to three phosphate groups may bind to the 5' end of the antisense strand of a double-stranded oligonucleotide construct, including a gene-specific miRNA.

Например, двухцепочечная олигонуклеотидная конструкция, включающая мкрРНК, имеет структуру представленной ниже структурной формулы (3”) или структурной формулы (4”).For example, a double-stranded oligonucleotide construct comprising miRNA has the structure of the following structural formula (3”) or structural formula (4”).

… структурная формула (3”) …structural formula (3”)

… структурная формула (4”) …structural formula (4”)

Гидрофобный материал В служит для формирования наночастиц, состоящих из олигонуклеотидной конструкции согласно структурной формуле (1), посредством гидрофобного взаимодействия.Hydrophobic material B serves to form nanoparticles consisting of an oligonucleotide construct according to structural formula (1) through hydrophobic interaction.

Гидрофобный материал предпочтительно имеет молекулярную массу от 250 до 1000, и его примеры могут включать, но без ограничения, производное стероида, производное глицерида, эфир глицерина, полипропиленгликоль, ненасыщенный или насыщенный C12-C50 углеводород, диацилфосфатидилхолин, жирную кислоту, фосфолипид, липополиамин и т.п., а также любой гидрофобный материал может быть применен при условии, что он соответствует цели настоящего изобретения, как это будет очевидно для специалистов в области, к которой относится настоящее изобретение.The hydrophobic material preferably has a molecular weight of from 250 to 1000, and examples thereof may include, but are not limited to, a steroid derivative, a glyceride derivative, a glycerol ether, a polypropylene glycol, an unsaturated or saturated C 12 -C 50 hydrocarbon, a diacylphosphatidylcholine, a fatty acid, a phospholipid, a lipopolyamine etc., as well as any hydrophobic material can be used provided that it meets the purpose of the present invention, as will be obvious to those skilled in the field to which the present invention relates.

Производное стероидов может быть выбрано из группы, состоящей из холестерина, холестанола, холевой кислоты, холестерилформиата, холестанилформиата и холестериламина, а производное глицерида может быть выбрано из группы, состоящей из моно-, ди- и триглицерида. При этом жирная кислота глицерида предпочтительно представляет собой ненасыщенную или насыщенную C12-C50 жирную кислоту.The steroid derivative may be selected from the group consisting of cholesterol, cholestanol, cholic acid, cholesteryl formate, cholestanyl formate and cholesterol amine, and the glyceride derivative may be selected from the group consisting of mono-, di- and triglyceride. In this case, the glyceride fatty acid is preferably an unsaturated or saturated C 12 -C 50 fatty acid.

В частности, среди гидрофобных материалов предпочтительными являются насыщенные или ненасыщенные углеводороды или холестерин, так как они обладают тем преимуществом, что они способны легко связываться во время синтеза олигонуклеотидной конструкции по настоящему изобретению.In particular, among hydrophobic materials, saturated or unsaturated hydrocarbons or cholesterol are preferred since they have the advantage that they are easily bound during the synthesis of the oligonucleotide construct of the present invention.

Гидрофобный материал может связываться с дистальным концом гидрофильного материала и может связываться с любым положением на смысловой или антисмысловой цепи мкрРНК.The hydrophobic material can bind to the distal end of the hydrophilic material and can bind to any position on the sense or antisense strand of the miRNA.

В настоящем изобретении гидрофильный материал, блок гидрофильного материала или гидрофобный материал и олигонуклеотид связаны простой ковалентной связью или ковалентной связью, опосредованной линкером (X или Y). Ковалентная связь может быть нерасщепляемой связью или расщепляемой связью. При этом нерасщепляемой связью может быть амидная связь или фосфатная связь, а расщепляемой связью может быть дисульфидная связь, расщепляемая кислотой связь, сложноэфирная связь, ангидридная связь, биоразлагаемая связь или расщепляемая ферментами связь, но настоящее изобретение этим не ограничивается.In the present invention, a hydrophilic material, a block of hydrophilic material, or a hydrophobic material and an oligonucleotide are linked by a single covalent bond or a linker-mediated covalent bond (X or Y). A covalent bond can be a non-cleavable bond or a cleavable bond. The non-cleavable bond may be an amide bond or a phosphate bond, and the cleavable bond may be a disulfide bond, an acid-cleavable bond, an ester bond, an anhydride bond, a biodegradable bond or an enzyme-cleavable bond, but the present invention is not limited to these.

Последовательность мкрРНК, которую можно использовать в качестве активного ингредиента композиции для уменьшения поседения волос, предотвращения или уменьшения выпадения волос, стимулирования пролиферации клеток волосяных фолликулов и/или стимулирования роста волос путем активации меланоцитов и стимулирования меланогенеза, в соответствии с настоящим изобретением, может включать последовательности, происходящие из генома человека, или геном, из которого происходят мкрРНК, не ограничивается геномом человека, и также могут быть применены последовательности мкрРНК, происходящие из геномов других животных.The miRNA sequence that can be used as an active ingredient of a composition for reducing graying of hair, preventing or reducing hair loss, promoting proliferation of hair follicle cells and/or promoting hair growth by activating melanocytes and promoting melanogenesis, in accordance with the present invention, may include sequences originating from the human genome, or the genome from which miRNAs originate, is not limited to the human genome, and miRNA sequences originating from the genomes of other animals can also be used.

мкрРНК можно использовать в любой имитирующей мкрРНК форме, которая обеспечивает биоэквивалентную эффективность мкрРНК, и можно использовать модифицированную мкрРНК, включающую последовательность мкрРНК, содержащую ту же затравочную область. При этом длина смысловой и антисмысловой последовательностей мкрРНК может быть уменьшена, а также может быть применен короткий миметик длиной 15 нуклеотидов.The miRNA can be used in any miRNA-mimicking form that provides bioequivalent potency to the miRNA, and a modified miRNA including an miRNA sequence containing the same seed region can be used. In this case, the length of the sense and antisense miRNA sequences can be reduced, and a short mimetic with a length of 15 nucleotides can also be used.

Миметик мкрРНК для мкрРНК может частично включать фосфоротиоатную структуру, которая представляет собой форму, в которой структура фосфатного остова РНК замещена другим элементом, таким как сера, и может быть применена в форме, в которой РНК является полностью или частично замещенной молекулами ДНК, PNA (пептидонуклеиновая кислота) или LNA (запертая нуклеиновая кислота). Более того, его можно использовать в форме, в которой 2’-гидроксильная группа РНК-сахара замещена различными функциональными структурами, которые включают, но без ограничения, метилирование, метоксилирование, фторирование и т.д.The miRNA mimetic for miRNA may partially include a phosphorothioate structure, which is a form in which the structure of the RNA phosphate backbone is replaced by another element, such as sulfur, and can be used in a form in which the RNA is completely or partially replaced by DNA molecules, PNA (peptide nucleic acid acid) or LNA (locked nucleic acid). Moreover, it can be used in a form in which the 2'-hydroxyl group of the RNA sugar is replaced by various functional structures, which include, but are not limited to, methylation, methoxylation, fluorination, etc.

мкрРНК не ограничивается двухцепочечной РНК зрелой мкрРНК и полученным из нее миметиком мкрРНК, и может использоваться в форме предшественника мкрРНК. Предшественник мкрРНК также может включать описанную выше структуру фосфатного остова РНК, частичную или полную замену РНК ДНК, PNA, LNA и т.д., модификацию 2’-гидроксильной группы молекулы РНК-сахара и т.п.miRNA is not limited to double-stranded RNA, mature miRNA and miRNA mimic derived from it, and can be used in the form of miRNA precursor. The miRNA precursor may also include the RNA phosphate backbone structure described above, partial or complete replacement of RNA with DNA, PNA, LNA, etc., modification of the 2'-hydroxyl group of an RNA sugar molecule, etc.

мкрРНК можно использовать в форме предшественника мкрРНК или первичной мкрРНК (пре-мкрРНК), которая может быть химически синтезирована или доставлена в клетки в форме плазмиды и, таким образом, экспрессирована.miRNA can be used in the form of a miRNA precursor or primary miRNA (pre-miRNA), which can be chemically synthesized or delivered into cells in the form of a plasmid and thereby expressed.

В настоящем изобретении мкрРНК может быть доставлена в клетки, культивированные в чашке для культивирования, с помощью способов применения смеси с катионными липидами, путем электрической стимуляции или применения вируса. Различные способы, известные в данной области для доставки мкрРНК, могут быть легко осуществлены специалистами в данной области, и настоящее изобретение ими не ограничивается.In the present invention, miRNA can be delivered to cells cultured in a culture dish through cationic lipid mixture methods, electrical stimulation, or virus application. Various methods known in the art for miRNA delivery can be easily performed by those skilled in the art, and the present invention is not limited to them.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции, включающей мкрРНК, такую как miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485, и к наночастицам, включающим ее.Another aspect of the present invention relates to a double-stranded oligonucleotide construct comprising miRNA, such as miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-8485, and nanoparticles comprising the same.

Как описано выше, двухцепочечная олигонуклеотидная конструкция, включающая мкрРНК, является амфифильной, содержащей как гидрофобные, так и гидрофильные материалы, и гидрофильная часть направлена наружу из-за сродства посредством взаимодействий, таких как водородные связи и т.д., с молекулами воды, присутствующими в организме, и гидрофобные материалы направлены внутрь за счет гидрофобного взаимодействия между ними с образованием термодинамически стабильных наночастиц. В частности, обеспечены наночастицы для защиты последовательности мкрРНК путем размещения гидрофобного материала в центре наночастиц и гидрофильного материала снаружи двухцепочечного олигонуклеотида, включающего мкрРНК.As described above, the double-stranded oligonucleotide construct comprising miRNA is amphiphilic, containing both hydrophobic and hydrophilic materials, and the hydrophilic portion is directed outward due to affinity through interactions such as hydrogen bonds, etc., with water molecules present in the body, and hydrophobic materials are directed inward due to hydrophobic interactions between them to form thermodynamically stable nanoparticles. In particular, nanoparticles are provided for protecting an miRNA sequence by placing a hydrophobic material at the center of the nanoparticles and a hydrophilic material on the outside of a double-stranded oligonucleotide comprising the miRNA.

Наночастицы в соответствии с настоящим изобретением могут быть составлены только с двухцепочечной олигонуклеотидной конструкцией, содержащей олигонуклеотиды с одинаковой последовательностью, или же они могут состоять из двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции, содержащей олигонуклеотиды с разными последовательностями, и двухцепочечные олигонуклеотидные конструкции, включающие различные мкрРНК, нацеленные на гены, стимулирующие меланогенез и стимулирующие пролиферацию клеток волосяных фолликулов, могут быть включены в наночастицы в соответствии с настоящим изобретением. Например, наночастицы могут быть образованы путем смешивания двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции, включающей miR-3139, и двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции, включающей miR-8485.Nanoparticles in accordance with the present invention can be formulated with only a double-stranded oligonucleotide construct containing oligonucleotides with the same sequence, or they can consist of a double-stranded oligonucleotide construct containing oligonucleotides with different sequences, and double-stranded oligonucleotide constructs including different miRNAs targeting genes, stimulating melanogenesis and stimulating the proliferation of hair follicle cells can be included in the nanoparticles in accordance with the present invention. For example, nanoparticles can be formed by mixing a double-stranded oligonucleotide construct including miR-3139 and a double-stranded oligonucleotide construct including miR-8485.

Кроме того, композиция в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно включать, в дополнение к двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции, включающей мкрРНК, двухцепочечный олигонуклеотид, включающий мкрРНК, который активирует меланоциты и способствует меланогенезу и пролиферации клеток волосяных фолликулов, или двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию, включающую то же самое.Moreover, the composition in accordance with the present invention may further include, in addition to a double-stranded oligonucleotide construct comprising miRNA, a double-stranded oligonucleotide construct comprising miRNA that activates melanocytes and promotes melanogenesis and proliferation of hair follicle cells, or a double-stranded oligonucleotide construct comprising the same .

В настоящем изобретении было подтверждено, что двухцепочечная олигонуклеотидная конструкция (SAMiRNA™), включающая мкрРНК и наночастицы, эффективно активирует меланоциты и способствует меланогенезу, тем самым уменьшая поседение волос. Кроме того, в дополнение к активации меланоцитов был подтвержден эффект стимуляции пролиферации клеток дермальной папиллы волосяного фолликула и кератиноцитов.The present invention has confirmed that a double-stranded oligonucleotide construct (SAMiRNA™) comprising miRNA and nanoparticles effectively activates melanocytes and promotes melanogenesis, thereby reducing hair graying. In addition, in addition to the activation of melanocytes, the effect of stimulating the proliferation of hair follicle dermal papilla cells and keratinocytes was confirmed.

Таким образом, настоящее изобретение позволяет использовать композицию для фармацевтического и косметического применения, при этом фармацевтическая композиция может быть применена в любом составе, выбранном из таких составов, как мази, пасты, гели, желе, сыворотки, аэрозольные спреи, неаэрозольные спреи, пены, кремы, лосьоны, растворы и суспензии, но не ограничиваются этим.Thus, the present invention allows the composition to be used for pharmaceutical and cosmetic use, and the pharmaceutical composition can be used in any formulation selected from ointments, pastes, gels, jellies, serums, aerosol sprays, non-aerosol sprays, foams, creams , lotions, solutions and suspensions, but are not limited to these.

Когда композицию применяют в качестве косметического средства, ее можно использовать в любом составе, выбранном из составов, таких как тоники для волос, кондиционеры для волос, эссенции для волос, лосьоны для волос, питательные лосьоны для волос, шампуни для волос, ополаскиватели для волос, лечебные средства для волос, крема для волос, питательные крема для волос, крема для увлажнения волос, крема для массажа волос, воски для волос, аэрозоли для волос, маски для волос, питательные маски для волос, мыла для волос, очищающие пены для волос, масла для волос, средства для сушки волос, защитного средства для волос, краски для волос, средства для завивки волос, средства для обесцвечивания волос, гели для волос, блески для волос, средства для укладки волос, лаки для волос, увлажняющие средства для волос, муссы для волос и распылители для волос, но не ограничиваются ими.When the composition is used as a cosmetic, it can be used in any formulation selected from hair tonics, hair conditioners, hair essences, hair lotions, hair nourishing lotions, hair shampoos, hair rinses, hair medicinal products, hair creams, nourishing hair creams, hair moisturizing creams, hair massage creams, hair waxes, hair aerosols, hair masks, nourishing hair masks, hair soaps, hair cleansing foams, hair oils, hair drying products, hair protectants, hair dyes, hair curling products, hair bleaching products, hair gels, hair glosses, hair styling products, hair sprays, hair moisturizers, hair mousses and hair sprays, but not limited to.

Композиция по настоящему изобретению может быть получена путем включения по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого носителя в дополнение к указанному выше активному ингредиенту. Такой фармацевтически приемлемый носитель должен быть совместим с активным ингредиентом по настоящему изобретению и может включать физиологический раствор, стерильную воду, раствор Рингера, забуференный физиологический раствор, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин и этанол, которые можно использовать отдельно или в комбинации двух или более из них, и, при необходимости, могут быть добавлены другие типичные добавки, такие как антиоксиданты, буферы и бактериостатические агенты. Кроме того, могут быть дополнительно добавлены разбавители, диспергирующие, поверхностно-активные, связующие и смазывающие вещества для получения инъекционного состава, такого как водный раствор, суспензия, эмульсия и т.п. В частности, предпочтительно получение составов в лиофилизированной форме. Для приготовления лиофилизированного состава можно использовать способ, широко известный в той области, к которой относится настоящее изобретение, а также можно добавлять стабилизатор для лиофилизации. Кроме того, композицию предпочтительно составляют в зависимости от каждого заболевания или ингредиента подходящим методом из данной области или методом, описанным в Remington’s Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA).The composition of the present invention can be prepared by including at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the above active ingredient. Such a pharmaceutically acceptable carrier must be compatible with the active ingredient of the present invention and may include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol and ethanol, which may be used alone or in combination of two or more of them, and, if necessary, other typical additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents can be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be further added to form an injectable composition such as an aqueous solution, suspension, emulsion and the like. In particular, it is preferable to obtain the compositions in lyophilized form. To prepare the lyophilized composition, a method widely known in the field to which the present invention relates can be used, and a stabilizer for lyophilization can also be added. In addition, the composition is preferably formulated depending on each disease or ingredient by a suitable method in the art or the method described in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA).

Количество и способ введения активного ингредиента и пр., включенных в композицию по настоящему изобретению, могут быть определены специалистами в данной области на основании количества меланоцитов, степени функционального ухудшения, симптомов поседения и тяжести седеющего участка обычного индивидуума. Кроме того, композиция может быть составлена в различных формах, таких как порошки, таблетки, инъекции, мази и функциональные косметические средства, и может поставляться в контейнерах для однократных или многократных доз, таких как запечатанные ампулы и флаконы.The amount and mode of administration of the active ingredient, etc., included in the composition of the present invention can be determined by those skilled in the art based on the number of melanocytes, the degree of functional impairment, symptoms of graying and the severity of the graying area of a normal individual. In addition, the composition may be formulated in various forms such as powders, tablets, injections, ointments and functional cosmetics, and may be supplied in single or multiple dose containers such as sealed ampoules and vials.

Когда двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию, включающую мкрРНК в соответствии с настоящим изобретением, и композиции или наночастицы, включающие ее, применяют для изготовления функциональных косметических средств или препаратов для местного нанесения на кожу, состав функциональных косметических средств или препаратов для местного нанесения на кожу может быть выбран из группы, состоящей из кремов, лосьонов, гелей, водорастворимых жидкостей и эссенций, но не ограничивается этим.When a double-stranded oligonucleotide construct comprising miRNA according to the present invention and compositions or nanoparticles thereof are used for the manufacture of functional cosmetics or topical preparations for the skin, the composition of the functional cosmetics or topical preparations for the skin can be selected from group consisting of, but not limited to, creams, lotions, gels, water-soluble liquids and essences.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу уменьшения поседения волос, стимулированию роста волос и/или предотвращению или уменьшению выпадения волос, включающему введение субъекту, нуждающемуся в уменьшении поседения волос, стимулировании роста волос и/или предотвращении или уменьшении выпадения волос,Another aspect of the present invention relates to a method of reducing graying of hair, promoting hair growth and/or preventing or reducing hair loss, comprising administering to a subject in need of reducing graying of hair, promoting hair growth and/or preventing or reducing hair loss,

(i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485;(i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-8485;

(ii) двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции, имеющий структуру представленной ниже структурной формулы (1):(ii) a double-stranded oligonucleotide construct having the structure of the following structural formula (1):

A-X-R-Y-B … структурная формула (1),A-X-R-Y-B...structural formula (1),

в структурной формуле (1) A представляет собой гидрофильный материал, B представляет собой гидрофобный материал, X и Y, каждый, независимо представляют собой простую ковалентную связь или опосредованную линкером ковалентную связь, и R представляет собой miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485; илиin structural formula (1), A represents a hydrophilic material, B represents a hydrophobic material, X and Y each independently represent a single covalent bond or a linker-mediated covalent bond, and R represents miR-3139, miR-3189, miR- 3199 or miR-8485; or

(iii) наночастиц, включающих такую двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию.(iii) nanoparticles comprising such a double-stranded oligonucleotide construct.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению для уменьшения поседения волос, стимулирования роста волос и/или предотвращения или уменьшения выпадения волос,Another aspect of the present invention relates to use for reducing graying of hair, stimulating hair growth and/or preventing or reducing hair loss,

(i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485;(i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-8485;

(ii) двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции, имеющей структуру представленной ниже структурной формулы (1):(ii) a double-stranded oligonucleotide construct having the structure of the following structural formula (1):

A-X-R-Y-B … структурная формула (1),A-X-R-Y-B...structural formula (1),

в структурной формуле (1) A представляет собой гидрофильный материал, B представляет собой гидрофобный материал, X и Y, каждый, независимо представляют собой простую ковалентную связь или опосредованную линкером ковалентную связь, и R представляет собой miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485; или (iii) наночастиц, включающих такую двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию.in structural formula (1), A represents a hydrophilic material, B represents a hydrophobic material, X and Y each independently represent a single covalent bond or a linker-mediated covalent bond, and R represents miR-3139, miR-3189, miR- 3199 or miR-8485; or (iii) nanoparticles comprising such a double-stranded oligonucleotide construct.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению (i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485;Another aspect of the present invention relates to the use of (i) miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-8485;

(ii) двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции, имеющей структуру приведенной ниже структурной формулы (1):(ii) a double-stranded oligonucleotide construct having the structure of the following structural formula (1):

A-X-R-Y-B … структурная формула (1),A-X-R-Y-B...structural formula (1),

в структурной формуле (1) A представляет собой гидрофильный материал, B представляет собой гидрофобный материал, X и Y, каждый, независимо представляют собой простую ковалентную связь или опосредованную линкером ковалентную связь, и R представляет собой miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485; или (iii) наночастиц, включающих такую двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию, для изготовления лекарственных средств или косметических средств для уменьшения поседения волос, стимулирования роста волос и/или предотвращения или уменьшения выпадения волос.in structural formula (1), A represents a hydrophilic material, B represents a hydrophobic material, X and Y each independently represent a single covalent bond or a linker-mediated covalent bond, and R represents miR-3139, miR-3189, miR- 3199 or miR-8485; or (iii) nanoparticles comprising such double-stranded oligonucleotide construct for the manufacture of medicinal products or cosmetics for reducing graying of hair, promoting hair growth and/or preventing or reducing hair loss.

ПримерыExamples

Лучше понять настоящего изобретения можно при помощи следующих примеров. Эти примеры приводятся просто для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения, что должно быть ясно специалистам в данной области. The present invention can be better understood with the help of the following examples. These examples are provided merely to illustrate the present invention and should not be construed as limiting the scope of the present invention, as will be apparent to those skilled in the art.

Пример 1. Скрининг для отбора мкрРНК, способствующих меланогенезуExample 1: Screening to select miRNAs that promote melanogenesis

1-1. Кандидаты в мкрРНК человека, способствующие меланогенезу1-1. Candidate human miRNAs promoting melanogenesis

В качестве 21 версии последовательностей мкрРНК человека, предоставленных miRBase (www.mirbase.org), которая представляет собой базу данных мкрРНК, было синтезировано 1728 мкрРНК на основе структуры «стебель-петля» в форме, нагруженной на двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию (SAMiRNA™) (таблица 2). Для синтеза предполагаемой последовательности все синтезированные цепи мкрРНК были идентифицированы и подтверждены с применением масс-спектрометрии MALDI-TOF. Был проведен скрининг для обнаружения мкрРНК с самым высоким количеством меланина, вырабатываемого с применением 1728 мкрРНК в клеточных линиях рака кожи человека. Последовательности антисмысловых цепей 1728 человеческих мкрРНК, протестированных в настоящем изобретении, известны по miRbase (http://www.mirbase.org), и когда исходная область была предоставлена только на одной цепи, была синтезирована комплементарная ей последовательность для доставки к клеткам в двухцепочечной форме.As 21 versions of human miRNA sequences provided by miRBase (www.mirbase.org), which is an miRNA database, 1728 miRNAs were synthesized based on the stem-loop structure in the form loaded with a double-stranded oligonucleotide construct (SAMiRNA™) ( table 2). To synthesize the putative sequence, all synthesized miRNA strands were identified and confirmed using MALDI-TOF mass spectrometry. A screen was conducted to find the miRNAs with the highest amount of melanin produced using 1728 miRNAs in human skin cancer cell lines. The antisense strand sequences of the 1728 human miRNAs tested in the present invention are known from miRbase (http://www.mirbase.org), and when the parent region was provided on only one strand, its complementary sequence was synthesized for delivery to cells in double-stranded form .

Например, мкрРНК miR-3139 получали следующим образом.For example, miR-3139 miRNA was prepared as follows.

SEQ ID NO: 9: 5’-CAGGCAUCUGUUGAGCUCCUAUU-3’SEQ ID NO: 9: 5'-CAGGCAUCUGUUGAGCUCCUAUU-3'

SEQ ID NO: 10: 5’-UAGGAGCUCAACAGAUGCCUGUU-3’SEQ ID NO: 10: 5’-UAGGAGCUCAACAGAUGCCUGUU-3’

Кроме того, когда затравочная последовательность обеспечена на обеих цепях, соответствующие цепи были синтезированы как смысловые и антисмысловые цепи. Например, мкрРНК miR-3189 получали следующим образом.In addition, when a seed sequence was provided on both strands, the corresponding strands were synthesized as sense and antisense strands. For example, miR-3189 miRNA was prepared as follows.

SEQ ID NO: 5: 5’-UGCCCCAUCUGUGCCCUGGGUAGGA-3’ (смысловая)SEQ ID NO: 5: 5’-UGCCCCAUCUGUGCCCUGGGUAGGA-3’ (semantic)

SEQ ID NO: 6: 5’-CCCUUGGGUCUGAUGGGGUAG-3’ (антисмысловая)SEQ ID NO: 6: 5’-CCCUUGGGUCUGAUGGGGUAG-3’ (antisense)

Таблица 2. Список 1728 мкрРНК человека, протестированных в рамках настоящего изобретенияTable 2. List of 1728 human miRNAs tested within the framework of the present invention мкрРНКmiRNA hsa-let-7a-1hsa-let-7a-1 hsa-miR-1197hsa-miR-1197 hsa-miR-1249hsa-miR-1249 hsa-let-7a-2hsa-let-7a-2 hsa-miR-1199hsa-miR-1199 hsa-miR-1250hsa-miR-1250 hsa-let-7bhsa-let-7b hsa-miR-1200hsa-miR-1200 hsa-miR-1251hsa-miR-1251 hsa-let-7chsa-let-7c hsa-miR-1202hsa-miR-1202 hsa-miR-1252hsa-miR-1252 hsa-let-7dhsa-let-7d hsa-miR-1203hsa-miR-1203 hsa-miR-1253hsa-miR-1253 hsa-let-7ehsa-let-7e hsa-miR-1204hsa-miR-1204 hsa-miR-1254hsa-miR-1254 hsa-let-7f-1hsa-let-7f-1 hsa-miR-1205hsa-miR-1205 hsa-miR-1255ahsa-miR-1255a hsa-let-7f-2hsa-let-7f-2 hsa-miR-1206hsa-miR-1206 hsa-miR-1255bhsa-miR-1255b hsa-let-7ghsa-let-7g hsa-miR-1207hsa-miR-1207 hsa-miR-1256hsa-miR-1256 hsa-let-7ihsa-let-7i hsa-miR-1208hsa-miR-1208 hsa-miR-1257hsa-miR-1257 hsa-miR-1hsa-miR-1 hsa-miR-122hsa-miR-122 hsa-miR-1258hsa-miR-1258 hsa-miR-100hsa-miR-100 hsa-miR-1224hsa-miR-1224 hsa-miR-125ahsa-miR-125a hsa-miR-101hsa-miR-101 hsa-miR-1225hsa-miR-1225 hsa-miR-125b-1hsa-miR-125b-1 hsa-miR-103ahsa-miR-103a hsa-miR-1226hsa-miR-1226 hsa-miR-125b-2hsa-miR-125b-2 hsa-miR-103bhsa-miR-103b hsa-miR-1227hsa-miR-1227 hsa-miR-126hsa-miR-126 hsa-miR-105hsa-miR-105 hsa-miR-1228hsa-miR-1228 hsa-miR-1260ahsa-miR-1260a hsa-miR-106ahsa-miR-106a hsa-miR-1229hsa-miR-1229 hsa-miR-1260bhsa-miR-1260b hsa-miR-106bhsa-miR-106b hsa-miR-1231hsa-miR-1231 hsa-miR-1261hsa-miR-1261 hsa-miR-107hsa-miR-107 hsa-miR-1233hsa-miR-1233 hsa-miR-1262hsa-miR-1262 hsa-miR-10ahsa-miR-10a hsa-miR-1234hsa-miR-1234 hsa-miR-1263hsa-miR-1263 hsa-miR-10bhsa-miR-10b hsa-miR-1236hsa-miR-1236 hsa-miR-1264hsa-miR-1264 hsa-miR-1178hsa-miR-1178 hsa-miR-1237hsa-miR-1237 hsa-miR-1265hsa-miR-1265 hsa-miR-1179hsa-miR-1179 hsa-miR-1238hsa-miR-1238 hsa-miR-1266hsa-miR-1266 hsa-miR-1180hsa-miR-1180 hsa-miR-124hsa-miR-124 hsa-miR-1267hsa-miR-1267 hsa-miR-1181hsa-miR-1181 hsa-miR-1243hsa-miR-1243 hsa-miR-1268ahsa-miR-1268a hsa-miR-1182hsa-miR-1182 hsa-miR-1244hsa-miR-1244 hsa-miR-1268bhsa-miR-1268b hsa-miR-1183hsa-miR-1183 hsa-miR-1245ahsa-miR-1245a hsa-miR-1269ahsa-miR-1269a hsa-miR-1184hsa-miR-1184 hsa-miR-1245bhsa-miR-1245b hsa-miR-1269bhsa-miR-1269b hsa-miR-1185-1hsa-miR-1185-1 hsa-miR-1246hsa-miR-1246 hsa-miR-127hsa-miR-127 hsa-miR-1185-2hsa-miR-1185-2 hsa-miR-1247hsa-miR-1247 hsa-miR-1270hsa-miR-1270 hsa-miR-1193hsa-miR-1193 hsa-miR-1248hsa-miR-1248 hsa-miR-1271hsa-miR-1271 hsa-miR-1272hsa-miR-1272 hsa-miR-1295bhsa-miR-1295b hsa-miR-142hsa-miR-142 hsa-miR-1273ahsa-miR-1273a hsa-miR-1296hsa-miR-1296 hsa-miR-143hsa-miR-143 hsa-miR-1273chsa-miR-1273c hsa-miR-1297hsa-miR-1297 hsa-miR-144hsa-miR-144 hsa-miR-1273dhsa-miR-1273d hsa-miR-1298hsa-miR-1298 hsa-miR-145hsa-miR-145 hsa-miR-1273ehsa-miR-1273e hsa-miR-1299hsa-miR-1299 hsa-miR-1468hsa-miR-1468 hsa-miR-1273fhsa-miR-1273f hsa-miR-1301hsa-miR-1301 hsa-miR-1469hsa-miR-1469 hsa-miR-1273ghsa-miR-1273g hsa-miR-1302hsa-miR-1302 hsa-miR-146ahsa-miR-146a hsa-miR-1273hhsa-miR-1273h hsa-miR-1303hsa-miR-1303 hsa-miR-146bhsa-miR-146b hsa-miR-1275hsa-miR-1275 hsa-miR-1304hsa-miR-1304 hsa-miR-1470hsa-miR-1470 hsa-miR-1276hsa-miR-1276 hsa-miR-1305hsa-miR-1305 hsa-miR-1471hsa-miR-1471 hsa-miR-1277hsa-miR-1277 hsa-miR-1306hsa-miR-1306 hsa-miR-147ahsa-miR-147a hsa-miR-1278hsa-miR-1278 hsa-miR-1307hsa-miR-1307 hsa-miR-147bhsa-miR-147b hsa-miR-1279hsa-miR-1279 hsa-miR-130ahsa-miR-130a hsa-miR-148ahsa-miR-148a hsa-miR-128-1hsa-miR-128-1 hsa-miR-130bhsa-miR-130b hsa-miR-148bhsa-miR-148b hsa-miR-128-2hsa-miR-128-2 hsa-miR-132hsa-miR-132 hsa-miR-149hsa-miR-149 hsa-miR-1281hsa-miR-1281 hsa-miR-1321hsa-miR-1321 hsa-miR-150hsa-miR-150 hsa-miR-1282hsa-miR-1282 hsa-miR-1322hsa-miR-1322 hsa-miR-151ahsa-miR-151a hsa-miR-1283hsa-miR-1283 hsa-miR-1323hsa-miR-1323 hsa-miR-151bhsa-miR-151b hsa-miR-1284hsa-miR-1284 hsa-miR-1324hsa-miR-1324 hsa-miR-152hsa-miR-152 hsa-miR-1285hsa-miR-1285 hsa-miR-133ahsa-miR-133a hsa-miR-153hsa-miR-153 hsa-miR-1286hsa-miR-1286 hsa-miR-133bhsa-miR-133b hsa-miR-1537hsa-miR-1537 hsa-miR-1287hsa-miR-1287 hsa-miR-134hsa-miR-134 hsa-miR-1538hsa-miR-1538 hsa-miR-1288hsa-miR-1288 hsa-miR-1343hsa-miR-1343 hsa-miR-1539hsa-miR-1539 hsa-miR-1289hsa-miR-1289 hsa-miR-135ahsa-miR-135a hsa-miR-154hsa-miR-154 hsa-miR-129-1hsa-miR-129-1 hsa-miR-135bhsa-miR-135b hsa-miR-155hsa-miR-155 hsa-miR-129-2hsa-miR-129-2 hsa-miR-136hsa-miR-136 hsa-miR-1587hsa-miR-1587 hsa-miR-1290hsa-miR-1290 hsa-miR-137hsa-miR-137 hsa-miR-15ahsa-miR-15a hsa-miR-1291hsa-miR-1291 hsa-miR-138-1hsa-miR-138-1 hsa-miR-15bhsa-miR-15b hsa-miR-1292hsa-miR-1292 hsa-miR-138-2hsa-miR-138-2 hsa-miR-16-1hsa-miR-16-1 hsa-miR-1293hsa-miR-1293 hsa-miR-139hsa-miR-139 hsa-miR-16-2hsa-miR-16-2 hsa-miR-1294hsa-miR-1294 hsa-miR-140hsa-miR-140 hsa-miR-17hsa-miR-17 hsa-miR-1295ahsa-miR-1295a hsa-miR-141hsa-miR-141 hsa-miR-181a-1hsa-miR-181a-1 hsa-miR-181a-2hsa-miR-181a-2 hsa-miR-196ahsa-miR-196a hsa-miR-2113hsa-miR-2113 hsa-miR-181b-1hsa-miR-181b-1 hsa-miR-196bhsa-miR-196b hsa-miR-2114hsa-miR-2114 hsa-miR-181b-2hsa-miR-181b-2 hsa-miR-197hsa-miR-197 hsa-miR-2115hsa-miR-2115 hsa-miR-181chsa-miR-181c hsa-miR-1972hsa-miR-1972 hsa-miR-2116hsa-miR-2116 hsa-miR-181dhsa-miR-181d hsa-miR-1973hsa-miR-1973 hsa-miR-2117hsa-miR-2117 hsa-miR-182hsa-miR-182 hsa-miR-1976hsa-miR-1976 hsa-miR-212hsa-miR-212 hsa-miR-1825hsa-miR-1825 hsa-miR-198hsa-miR-198 hsa-miR-214hsa-miR-214 hsa-miR-1827hsa-miR-1827 hsa-miR-199ahsa-miR-199a hsa-miR-215hsa-miR-215 hsa-miR-183hsa-miR-183 hsa-miR-199bhsa-miR-199b hsa-miR-216ahsa-miR-216a hsa-miR-184hsa-miR-184 hsa-miR-19ahsa-miR-19a hsa-miR-216bhsa-miR-216b hsa-miR-185hsa-miR-185 hsa-miR-19b-1hsa-miR-19b-1 hsa-miR-217hsa-miR-217 hsa-miR-186hsa-miR-186 hsa-miR-19b-2hsa-miR-19b-2 hsa-miR-218-1hsa-miR-218-1 hsa-miR-187hsa-miR-187 hsa-miR-200ahsa-miR-200a hsa-miR-218-2hsa-miR-218-2 hsa-miR-188hsa-miR-188 hsa-miR-200bhsa-miR-200b hsa-miR-219a-1hsa-miR-219a-1 hsa-miR-18ahsa-miR-18a hsa-miR-200chsa-miR-200c hsa-miR-219a-2hsa-miR-219a-2 hsa-miR-18bhsa-miR-18b hsa-miR-202hsa-miR-202 hsa-miR-219bhsa-miR-219b hsa-miR-1908hsa-miR-1908 hsa-miR-203ahsa-miR-203a hsa-miR-22hsa-miR-22 hsa-miR-1909hsa-miR-1909 hsa-miR-203bhsa-miR-203b hsa-miR-221hsa-miR-221 hsa-miR-190ahsa-miR-190a hsa-miR-204hsa-miR-204 hsa-miR-222hsa-miR-222 hsa-miR-190bhsa-miR-190b hsa-miR-205hsa-miR-205 hsa-miR-223hsa-miR-223 hsa-miR-191hsa-miR-191 hsa-miR-2052hsa-miR-2052 hsa-miR-224hsa-miR-224 hsa-miR-1910hsa-miR-1910 hsa-miR-2053hsa-miR-2053 hsa-miR-2276hsa-miR-2276 hsa-miR-1911hsa-miR-1911 hsa-miR-2054hsa-miR-2054 hsa-miR-2277hsa-miR-2277 hsa-miR-1912hsa-miR-1912 hsa-miR-206hsa-miR-206 hsa-miR-2278hsa-miR-2278 hsa-miR-1913hsa-miR-1913 hsa-miR-208ahsa-miR-208a hsa-miR-2355hsa-miR-2355 hsa-miR-1914hsa-miR-1914 hsa-miR-208bhsa-miR-208b hsa-miR-2392hsa-miR-2392 hsa-miR-1915hsa-miR-1915 hsa-miR-20ahsa-miR-20a hsa-miR-23ahsa-miR-23a hsa-miR-192hsa-miR-192 hsa-miR-20bhsa-miR-20b hsa-miR-23bhsa-miR-23b hsa-miR-193ahsa-miR-193a hsa-miR-21hsa-miR-21 hsa-miR-23chsa-miR-23c hsa-miR-193bhsa-miR-193b hsa-miR-210hsa-miR-210 hsa-miR-24-1hsa-miR-24-1 hsa-miR-194hsa-miR-194 hsa-miR-211hsa-miR-211 hsa-miR-24-2hsa-miR-24-2 hsa-miR-195hsa-miR-195 hsa-miR-2110hsa-miR-2110 hsa-miR-2467hsa-miR-2467 hsa-miR-25hsa-miR-25 hsa-miR-30bhsa-miR-30b hsa-miR-3140hsa-miR-3140 hsa-miR-2681hsa-miR-2681 hsa-miR-30c-1hsa-miR-30c-1 hsa-miR-3141hsa-miR-3141 hsa-miR-2682hsa-miR-2682 hsa-miR-30c-2hsa-miR-30c-2 hsa-miR-3142hsa-miR-3142 hsa-miR-26a-1hsa-miR-26a-1 hsa-miR-30dhsa-miR-30d hsa-miR-3143hsa-miR-3143 hsa-miR-26a-2hsa-miR-26a-2 hsa-miR-30ehsa-miR-30e hsa-miR-3144hsa-miR-3144 hsa-miR-26bhsa-miR-26b hsa-miR-31hsa-miR-31 hsa-miR-3145hsa-miR-3145 hsa-miR-27ahsa-miR-27a hsa-miR-3115hsa-miR-3115 hsa-miR-3146hsa-miR-3146 hsa-miR-27bhsa-miR-27b hsa-miR-3116hsa-miR-3116 hsa-miR-3147hsa-miR-3147 hsa-miR-28hsa-miR-28 hsa-miR-3117hsa-miR-3117 hsa-miR-3148hsa-miR-3148 hsa-miR-2861hsa-miR-2861 hsa-miR-3118hsa-miR-3118 hsa-miR-3149hsa-miR-3149 hsa-miR-2909hsa-miR-2909 hsa-miR-3119hsa-miR-3119 hsa-miR-3150ahsa-miR-3150a hsa-miR-296hsa-miR-296 hsa-miR-3120hsa-miR-3120 hsa-miR-3150bhsa-miR-3150b hsa-miR-297hsa-miR-297 hsa-miR-3121hsa-miR-3121 hsa-miR-3151hsa-miR-3151 hsa-miR-298hsa-miR-298 hsa-miR-3122hsa-miR-3122 hsa-miR-3152hsa-miR-3152 hsa-miR-299hsa-miR-299 hsa-miR-3123hsa-miR-3123 hsa-miR-3153hsa-miR-3153 hsa-miR-29ahsa-miR-29a hsa-miR-3124hsa-miR-3124 hsa-miR-3154hsa-miR-3154 hsa-miR-29b-1hsa-miR-29b-1 hsa-miR-3125hsa-miR-3125 hsa-miR-3155ahsa-miR-3155a hsa-miR-29b-2hsa-miR-29b-2 hsa-miR-3126hsa-miR-3126 hsa-miR-3155bhsa-miR-3155b hsa-miR-29chsa-miR-29c hsa-miR-3127hsa-miR-3127 hsa-miR-3156hsa-miR-3156 hsa-miR-300hsa-miR-300 hsa-miR-3128hsa-miR-3128 hsa-miR-3157hsa-miR-3157 hsa-miR-301ahsa-miR-301a hsa-miR-3129hsa-miR-3129 hsa-miR-3158hsa-miR-3158 hsa-miR-301bhsa-miR-301b hsa-miR-3130hsa-miR-3130 hsa-miR-3159hsa-miR-3159 hsa-miR-302ahsa-miR-302a hsa-miR-3131hsa-miR-3131 hsa-miR-3160hsa-miR-3160 hsa-miR-302bhsa-miR-302b hsa-miR-3132hsa-miR-3132 hsa-miR-3161hsa-miR-3161 hsa-miR-302chsa-miR-302c hsa-miR-3133hsa-miR-3133 hsa-miR-3162hsa-miR-3162 hsa-miR-302dhsa-miR-302d hsa-miR-3134hsa-miR-3134 hsa-miR-3163hsa-miR-3163 hsa-miR-302ehsa-miR-302e hsa-miR-3135ahsa-miR-3135a hsa-miR-3164hsa-miR-3164 hsa-miR-302fhsa-miR-302f hsa-miR-3135bhsa-miR-3135b hsa-miR-3165hsa-miR-3165 hsa-miR-3064hsa-miR-3064 hsa-miR-3136hsa-miR-3136 hsa-miR-3166hsa-miR-3166 hsa-miR-3065hsa-miR-3065 hsa-miR-3137hsa-miR-3137 hsa-miR-3167hsa-miR-3167 hsa-miR-3074hsa-miR-3074 hsa-miR-3138hsa-miR-3138 hsa-miR-3168hsa-miR-3168 hsa-miR-30ahsa-miR-30a hsa-miR-3139hsa-miR-3139 hsa-miR-3169hsa-miR-3169 hsa-miR-3170hsa-miR-3170 hsa-miR-3202hsa-miR-3202 hsa-miR-3607hsa-miR-3607 hsa-miR-3171hsa-miR-3171 hsa-miR-320ahsa-miR-320a hsa-miR-3609hsa-miR-3609 hsa-miR-3173hsa-miR-3173 hsa-miR-320bhsa-miR-320b hsa-miR-361hsa-miR-361 hsa-miR-3174hsa-miR-3174 hsa-miR-320chsa-miR-320c hsa-miR-3610hsa-miR-3610 hsa-miR-3175hsa-miR-3175 hsa-miR-320dhsa-miR-320d hsa-miR-3611hsa-miR-3611 hsa-miR-3176hsa-miR-3176 hsa-miR-320ehsa-miR-320e hsa-miR-3612hsa-miR-3612 hsa-miR-3177hsa-miR-3177 hsa-miR-323ahsa-miR-323a hsa-miR-3613hsa-miR-3613 hsa-miR-3178hsa-miR-3178 hsa-miR-323bhsa-miR-323b hsa-miR-3614hsa-miR-3614 hsa-miR-3179hsa-miR-3179 hsa-miR-324hsa-miR-324 hsa-miR-3615hsa-miR-3615 hsa-miR-3180hsa-miR-3180 hsa-miR-325hsa-miR-325 hsa-miR-3616hsa-miR-3616 hsa-miR-3181hsa-miR-3181 hsa-miR-326hsa-miR-326 hsa-miR-3617hsa-miR-3617 hsa-miR-3182hsa-miR-3182 hsa-miR-328hsa-miR-328 hsa-miR-3618hsa-miR-3618 hsa-miR-3183hsa-miR-3183 hsa-miR-329hsa-miR-329 hsa-miR-3619hsa-miR-3619 hsa-miR-3184hsa-miR-3184 hsa-miR-330hsa-miR-330 hsa-miR-362hsa-miR-362 hsa-miR-3185hsa-miR-3185 hsa-miR-331hsa-miR-331 hsa-miR-3620hsa-miR-3620 hsa-miR-3186hsa-miR-3186 hsa-miR-335hsa-miR-335 hsa-miR-3621hsa-miR-3621 hsa-miR-3187hsa-miR-3187 hsa-miR-337hsa-miR-337 hsa-miR-3622ahsa-miR-3622a hsa-miR-3188hsa-miR-3188 hsa-miR-338hsa-miR-338 hsa-miR-3622bhsa-miR-3622b hsa-miR-3189hsa-miR-3189 hsa-miR-339hsa-miR-339 hsa-miR-363hsa-miR-363 hsa-miR-3190hsa-miR-3190 hsa-miR-33ahsa-miR-33a hsa-miR-3646hsa-miR-3646 hsa-miR-3191hsa-miR-3191 hsa-miR-33bhsa-miR-33b hsa-miR-3648hsa-miR-3648 hsa-miR-3192hsa-miR-3192 hsa-miR-340hsa-miR-340 hsa-miR-3649hsa-miR-3649 hsa-miR-3193hsa-miR-3193 hsa-miR-342hsa-miR-342 hsa-miR-3650hsa-miR-3650 hsa-miR-3194hsa-miR-3194 hsa-miR-345hsa-miR-345 hsa-miR-3651hsa-miR-3651 hsa-miR-3195hsa-miR-3195 hsa-miR-346hsa-miR-346 hsa-miR-3652hsa-miR-3652 hsa-miR-3196hsa-miR-3196 hsa-miR-34ahsa-miR-34a hsa-miR-3653hsa-miR-3653 hsa-miR-3197hsa-miR-3197 hsa-miR-34bhsa-miR-34b hsa-miR-3654hsa-miR-3654 hsa-miR-3198hsa-miR-3198 hsa-miR-34chsa-miR-34c hsa-miR-3655hsa-miR-3655 hsa-miR-3199hsa-miR-3199 hsa-miR-3529hsa-miR-3529 hsa-miR-3656hsa-miR-3656 hsa-miR-32hsa-miR-32 hsa-miR-3591hsa-miR-3591 hsa-miR-3657hsa-miR-3657 hsa-miR-3200hsa-miR-3200 hsa-miR-3605hsa-miR-3605 hsa-miR-3658hsa-miR-3658 hsa-miR-3201hsa-miR-3201 hsa-miR-3606hsa-miR-3606 hsa-miR-3659hsa-miR-3659 hsa-miR-365ahsa-miR-365a hsa-miR-3689dhsa-miR-3689d hsa-miR-378jhsa-miR-378j hsa-miR-365bhsa-miR-365b hsa-miR-3689ehsa-miR-3689e hsa-miR-379hsa-miR-379 hsa-miR-3660hsa-miR-3660 hsa-miR-3689fhsa-miR-3689f hsa-miR-380hsa-miR-380 hsa-miR-3661hsa-miR-3661 hsa-miR-369hsa-miR-369 hsa-miR-381hsa-miR-381 hsa-miR-3662hsa-miR-3662 hsa-miR-3690hsa-miR-3690 hsa-miR-382hsa-miR-382 hsa-miR-3663hsa-miR-3663 hsa-miR-3691hsa-miR-3691 hsa-miR-383hsa-miR-383 hsa-miR-3664hsa-miR-3664 hsa-miR-3692hsa-miR-3692 hsa-miR-384hsa-miR-384 hsa-miR-3665hsa-miR-3665 hsa-miR-370hsa-miR-370 hsa-miR-3907hsa-miR-3907 hsa-miR-3666hsa-miR-3666 hsa-miR-3713hsa-miR-3713 hsa-miR-3908hsa-miR-3908 hsa-miR-3667hsa-miR-3667 hsa-miR-3714hsa-miR-3714 hsa-miR-3909hsa-miR-3909 hsa-miR-3668hsa-miR-3668 hsa-miR-371ahsa-miR-371a hsa-miR-3910hsa-miR-3910 hsa-miR-367hsa-miR-367 hsa-miR-371bhsa-miR-371b hsa-miR-3911hsa-miR-3911 hsa-miR-3670hsa-miR-3670 hsa-miR-372hsa-miR-372 hsa-miR-3912hsa-miR-3912 hsa-miR-3671hsa-miR-3671 hsa-miR-373hsa-miR-373 hsa-miR-3913hsa-miR-3913 hsa-miR-3672hsa-miR-3672 hsa-miR-374ahsa-miR-374a hsa-miR-3914hsa-miR-3914 hsa-miR-3674hsa-miR-3674 hsa-miR-374bhsa-miR-374b hsa-miR-3915hsa-miR-3915 hsa-miR-3675hsa-miR-3675 hsa-miR-374chsa-miR-374c hsa-miR-3916hsa-miR-3916 hsa-miR-3677hsa-miR-3677 hsa-miR-375hsa-miR-375 hsa-miR-3917hsa-miR-3917 hsa-miR-3678hsa-miR-3678 hsa-miR-376a-1hsa-miR-376a-1 hsa-miR-3918hsa-miR-3918 hsa-miR-3679hsa-miR-3679 hsa-miR-376a-2hsa-miR-376a-2 hsa-miR-3919hsa-miR-3919 hsa-miR-3680hsa-miR-3680 hsa-miR-376bhsa-miR-376b hsa-miR-3920hsa-miR-3920 hsa-miR-3681hsa-miR-3681 hsa-miR-376chsa-miR-376c hsa-miR-3921hsa-miR-3921 hsa-miR-3682hsa-miR-3682 hsa-miR-377hsa-miR-377 hsa-miR-3922hsa-miR-3922 hsa-miR-3683hsa-miR-3683 hsa-miR-378ahsa-miR-378a hsa-miR-3923hsa-miR-3923 hsa-miR-3684hsa-miR-3684 hsa-miR-378bhsa-miR-378b hsa-miR-3924hsa-miR-3924 hsa-miR-3685hsa-miR-3685 hsa-miR-378chsa-miR-378c hsa-miR-3925hsa-miR-3925 hsa-miR-3686hsa-miR-3686 hsa-miR-378dhsa-miR-378d hsa-miR-3926hsa-miR-3926 hsa-miR-3687hsa-miR-3687 hsa-miR-378ehsa-miR-378e hsa-miR-3927hsa-miR-3927 hsa-miR-3688hsa-miR-3688 hsa-miR-378fhsa-miR-378f hsa-miR-3928hsa-miR-3928 hsa-miR-3689ahsa-miR-3689a hsa-miR-378ghsa-miR-378g hsa-miR-3929hsa-miR-3929 hsa-miR-3689bhsa-miR-3689b hsa-miR-378hhsa-miR-378h hsa-miR-3934hsa-miR-3934 hsa-miR-3689chsa-miR-3689c hsa-miR-378ihsa-miR-378i hsa-miR-3935hsa-miR-3935 hsa-miR-3936hsa-miR-3936 hsa-miR-4256hsa-miR-4256 hsa-miR-4288hsa-miR-4288 hsa-miR-3937hsa-miR-3937 hsa-miR-4257hsa-miR-4257 hsa-miR-4289hsa-miR-4289 hsa-miR-3938hsa-miR-3938 hsa-miR-4258hsa-miR-4258 hsa-miR-429hsa-miR-429 hsa-miR-3939hsa-miR-3939 hsa-miR-4259hsa-miR-4259 hsa-miR-4290hsa-miR-4290 hsa-miR-3940hsa-miR-3940 hsa-miR-4260hsa-miR-4260 hsa-miR-4291hsa-miR-4291 hsa-miR-3941hsa-miR-3941 hsa-miR-4261hsa-miR-4261 hsa-miR-4292hsa-miR-4292 hsa-miR-3942hsa-miR-3942 hsa-miR-4262hsa-miR-4262 hsa-miR-4293hsa-miR-4293 hsa-miR-3943hsa-miR-3943 hsa-miR-4263hsa-miR-4263 hsa-miR-4294hsa-miR-4294 hsa-miR-3944hsa-miR-3944 hsa-miR-4264hsa-miR-4264 hsa-miR-4295hsa-miR-4295 hsa-miR-3945hsa-miR-3945 hsa-miR-4265hsa-miR-4265 hsa-miR-4296hsa-miR-4296 hsa-miR-3960hsa-miR-3960 hsa-miR-4266hsa-miR-4266 hsa-miR-4297hsa-miR-4297 hsa-miR-3972hsa-miR-3972 hsa-miR-4267hsa-miR-4267 hsa-miR-4298hsa-miR-4298 hsa-miR-3973hsa-miR-3973 hsa-miR-4268hsa-miR-4268 hsa-miR-4299hsa-miR-4299 hsa-miR-3974hsa-miR-3974 hsa-miR-4269hsa-miR-4269 hsa-miR-4300hsa-miR-4300 hsa-miR-3975hsa-miR-3975 hsa-miR-4270hsa-miR-4270 hsa-miR-4301hsa-miR-4301 hsa-miR-3976hsa-miR-3976 hsa-miR-4271hsa-miR-4271 hsa-miR-4302hsa-miR-4302 hsa-miR-3977hsa-miR-3977 hsa-miR-4272hsa-miR-4272 hsa-miR-4303hsa-miR-4303 hsa-miR-3978hsa-miR-3978 hsa-miR-4273hsa-miR-4273 hsa-miR-4304hsa-miR-4304 hsa-miR-409hsa-miR-409 hsa-miR-4274hsa-miR-4274 hsa-miR-4305hsa-miR-4305 hsa-miR-410hsa-miR-410 hsa-miR-4275hsa-miR-4275 hsa-miR-4306hsa-miR-4306 hsa-miR-411hsa-miR-411 hsa-miR-4276hsa-miR-4276 hsa-miR-4307hsa-miR-4307 hsa-miR-412hsa-miR-412 hsa-miR-4277hsa-miR-4277 hsa-miR-4308hsa-miR-4308 hsa-miR-421hsa-miR-421 hsa-miR-4278hsa-miR-4278 hsa-miR-4309hsa-miR-4309 hsa-miR-422ahsa-miR-422a hsa-miR-4279hsa-miR-4279 hsa-miR-431hsa-miR-431 hsa-miR-423hsa-miR-423 hsa-miR-4280hsa-miR-4280 hsa-miR-4310hsa-miR-4310 hsa-miR-424hsa-miR-424 hsa-miR-4281hsa-miR-4281 hsa-miR-4311hsa-miR-4311 hsa-miR-425hsa-miR-425 hsa-miR-4282hsa-miR-4282 hsa-miR-4312hsa-miR-4312 hsa-miR-4251hsa-miR-4251 hsa-miR-4283hsa-miR-4283 hsa-miR-4313hsa-miR-4313 hsa-miR-4252hsa-miR-4252 hsa-miR-4284hsa-miR-4284 hsa-miR-4314hsa-miR-4314 hsa-miR-4253hsa-miR-4253 hsa-miR-4285hsa-miR-4285 hsa-miR-4315hsa-miR-4315 hsa-miR-4254hsa-miR-4254 hsa-miR-4286hsa-miR-4286 hsa-miR-4316hsa-miR-4316 hsa-miR-4255hsa-miR-4255 hsa-miR-4287hsa-miR-4287 hsa-miR-4317hsa-miR-4317 hsa-miR-4318hsa-miR-4318 hsa-miR-4433ahsa-miR-4433a hsa-miR-4463hsa-miR-4463 hsa-miR-4319hsa-miR-4319 hsa-miR-4433bhsa-miR-4433b hsa-miR-4464hsa-miR-4464 hsa-miR-432hsa-miR-432 hsa-miR-4434hsa-miR-4434 hsa-miR-4465hsa-miR-4465 hsa-miR-4320hsa-miR-4320 hsa-miR-4435hsa-miR-4435 hsa-miR-4466hsa-miR-4466 hsa-miR-4321hsa-miR-4321 hsa-miR-4436ahsa-miR-4436a hsa-miR-4467hsa-miR-4467 hsa-miR-4322hsa-miR-4322 hsa-miR-4436bhsa-miR-4436b hsa-miR-4468hsa-miR-4468 hsa-miR-4323hsa-miR-4323 hsa-miR-4437hsa-miR-4437 hsa-miR-4469hsa-miR-4469 hsa-miR-4324hsa-miR-4324 hsa-miR-4438hsa-miR-4438 hsa-miR-4470hsa-miR-4470 hsa-miR-4325hsa-miR-4325 hsa-miR-4439hsa-miR-4439 hsa-miR-4471hsa-miR-4471 hsa-miR-4326hsa-miR-4326 hsa-miR-4440hsa-miR-4440 hsa-miR-4472hsa-miR-4472 hsa-miR-4327hsa-miR-4327 hsa-miR-4441hsa-miR-4441 hsa-miR-4473hsa-miR-4473 hsa-miR-4328hsa-miR-4328 hsa-miR-4442hsa-miR-4442 hsa-miR-4474hsa-miR-4474 hsa-miR-4329hsa-miR-4329 hsa-miR-4443hsa-miR-4443 hsa-miR-4475hsa-miR-4475 hsa-miR-433hsa-miR-433 hsa-miR-4444hsa-miR-4444 hsa-miR-4476hsa-miR-4476 hsa-miR-4330hsa-miR-4330 hsa-miR-4445hsa-miR-4445 hsa-miR-4477ahsa-miR-4477a hsa-miR-4417hsa-miR-4417 hsa-miR-4446hsa-miR-4446 hsa-miR-4477bhsa-miR-4477b hsa-miR-4418hsa-miR-4418 hsa-miR-4447hsa-miR-4447 hsa-miR-4478hsa-miR-4478 hsa-miR-4419ahsa-miR-4419a hsa-miR-4448hsa-miR-4448 hsa-miR-4479hsa-miR-4479 hsa-miR-4419bhsa-miR-4419b hsa-miR-4449hsa-miR-4449 hsa-miR-448hsa-miR-448 hsa-miR-4420hsa-miR-4420 hsa-miR-4450hsa-miR-4450 hsa-miR-4480hsa-miR-4480 hsa-miR-4421hsa-miR-4421 hsa-miR-4451hsa-miR-4451 hsa-miR-4481hsa-miR-4481 hsa-miR-4422hsa-miR-4422 hsa-miR-4452hsa-miR-4452 hsa-miR-4482hsa-miR-4482 hsa-miR-4423hsa-miR-4423 hsa-miR-4453hsa-miR-4453 hsa-miR-4483hsa-miR-4483 hsa-miR-4424hsa-miR-4424 hsa-miR-4454hsa-miR-4454 hsa-miR-4484hsa-miR-4484 hsa-miR-4425hsa-miR-4425 hsa-miR-4455hsa-miR-4455 hsa-miR-4485hsa-miR-4485 hsa-miR-4426hsa-miR-4426 hsa-miR-4456hsa-miR-4456 hsa-miR-4486hsa-miR-4486 hsa-miR-4427hsa-miR-4427 hsa-miR-4457hsa-miR-4457 hsa-miR-4487hsa-miR-4487 hsa-miR-4428hsa-miR-4428 hsa-miR-4458hsa-miR-4458 hsa-miR-4488hsa-miR-4488 hsa-miR-4429hsa-miR-4429 hsa-miR-4459hsa-miR-4459 hsa-miR-4489hsa-miR-4489 hsa-miR-4430hsa-miR-4430 hsa-miR-4460hsa-miR-4460 hsa-miR-4490hsa-miR-4490 hsa-miR-4431hsa-miR-4431 hsa-miR-4461hsa-miR-4461 hsa-miR-4491hsa-miR-4491 hsa-miR-4432hsa-miR-4432 hsa-miR-4462hsa-miR-4462 hsa-miR-4492hsa-miR-4492 hsa-miR-4493hsa-miR-4493 hsa-miR-4519hsa-miR-4519 hsa-miR-4635hsa-miR-4635 hsa-miR-4494hsa-miR-4494 hsa-miR-451ahsa-miR-451a hsa-miR-4636hsa-miR-4636 hsa-miR-4495hsa-miR-4495 hsa-miR-451bhsa-miR-451b hsa-miR-4637hsa-miR-4637 hsa-miR-4496hsa-miR-4496 hsa-miR-452hsa-miR-452 hsa-miR-4638hsa-miR-4638 hsa-miR-4497hsa-miR-4497 hsa-miR-4520-1hsa-miR-4520-1 hsa-miR-4639hsa-miR-4639 hsa-miR-4498hsa-miR-4498 hsa-miR-4520-2hsa-miR-4520-2 hsa-miR-4640hsa-miR-4640 hsa-miR-4499hsa-miR-4499 hsa-miR-4521hsa-miR-4521 hsa-miR-4641hsa-miR-4641 hsa-miR-449ahsa-miR-449a hsa-miR-4522hsa-miR-4522 hsa-miR-4642hsa-miR-4642 hsa-miR-449bhsa-miR-449b hsa-miR-4523hsa-miR-4523 hsa-miR-4643hsa-miR-4643 hsa-miR-449chsa-miR-449c hsa-miR-4524ahsa-miR-4524a hsa-miR-4644hsa-miR-4644 hsa-miR-4500hsa-miR-4500 hsa-miR-4524bhsa-miR-4524b hsa-miR-4645hsa-miR-4645 hsa-miR-4501hsa-miR-4501 hsa-miR-4525hsa-miR-4525 hsa-miR-4646hsa-miR-4646 hsa-miR-4502hsa-miR-4502 hsa-miR-4526hsa-miR-4526 hsa-miR-4647hsa-miR-4647 hsa-miR-4503hsa-miR-4503 hsa-miR-4527hsa-miR-4527 hsa-miR-4648hsa-miR-4648 hsa-miR-4504hsa-miR-4504 hsa-miR-4528hsa-miR-4528 hsa-miR-4649hsa-miR-4649 hsa-miR-4505hsa-miR-4505 hsa-miR-4529hsa-miR-4529 hsa-miR-4650hsa-miR-4650 hsa-miR-4506hsa-miR-4506 hsa-miR-4530hsa-miR-4530 hsa-miR-4651hsa-miR-4651 hsa-miR-4507hsa-miR-4507 hsa-miR-4531hsa-miR-4531 hsa-miR-4652hsa-miR-4652 hsa-miR-4508hsa-miR-4508 hsa-miR-4532hsa-miR-4532 hsa-miR-4653hsa-miR-4653 hsa-miR-4509hsa-miR-4509 hsa-miR-4533hsa-miR-4533 hsa-miR-4654hsa-miR-4654 hsa-miR-450a-1hsa-miR-450a-1 hsa-miR-4534hsa-miR-4534 hsa-miR-4655hsa-miR-4655 hsa-miR-450a-2hsa-miR-450a-2 hsa-miR-4535hsa-miR-4535 hsa-miR-4656hsa-miR-4656 hsa-miR-450bhsa-miR-450b hsa-miR-4536hsa-miR-4536 hsa-miR-4657hsa-miR-4657 hsa-miR-4510hsa-miR-4510 hsa-miR-4537hsa-miR-4537 hsa-miR-4658hsa-miR-4658 hsa-miR-4511hsa-miR-4511 hsa-miR-4538hsa-miR-4538 hsa-miR-4659ahsa-miR-4659a hsa-miR-4512hsa-miR-4512 hsa-miR-4539hsa-miR-4539 hsa-miR-4659bhsa-miR-4659b hsa-miR-4513hsa-miR-4513 hsa-miR-454hsa-miR-454 hsa-miR-466hsa-miR-466 hsa-miR-4514hsa-miR-4514 hsa-miR-4540hsa-miR-4540 hsa-miR-4660hsa-miR-4660 hsa-miR-4515hsa-miR-4515 hsa-miR-455hsa-miR-455 hsa-miR-4661hsa-miR-4661 hsa-miR-4516hsa-miR-4516 hsa-miR-4632hsa-miR-4632 hsa-miR-4662ahsa-miR-4662a hsa-miR-4517hsa-miR-4517 hsa-miR-4633hsa-miR-4633 hsa-miR-4662bhsa-miR-4662b hsa-miR-4518hsa-miR-4518 hsa-miR-4634hsa-miR-4634 hsa-miR-4663hsa-miR-4663 hsa-miR-4664hsa-miR-4664 hsa-miR-4695hsa-miR-4695 hsa-miR-4728hsa-miR-4728 hsa-miR-4665hsa-miR-4665 hsa-miR-4696hsa-miR-4696 hsa-miR-4729hsa-miR-4729 hsa-miR-4666ahsa-miR-4666a hsa-miR-4697hsa-miR-4697 hsa-miR-4730hsa-miR-4730 hsa-miR-4666bhsa-miR-4666b hsa-miR-4698hsa-miR-4698 hsa-miR-4731hsa-miR-4731 hsa-miR-4667hsa-miR-4667 hsa-miR-4699hsa-miR-4699 hsa-miR-4732hsa-miR-4732 hsa-miR-4668hsa-miR-4668 hsa-miR-4700hsa-miR-4700 hsa-miR-4733hsa-miR-4733 hsa-miR-4669hsa-miR-4669 hsa-miR-4701hsa-miR-4701 hsa-miR-4734hsa-miR-4734 hsa-miR-4670hsa-miR-4670 hsa-miR-4703hsa-miR-4703 hsa-miR-4735hsa-miR-4735 hsa-miR-4671hsa-miR-4671 hsa-miR-4704hsa-miR-4704 hsa-miR-4736hsa-miR-4736 hsa-miR-4672hsa-miR-4672 hsa-miR-4705hsa-miR-4705 hsa-miR-4737hsa-miR-4737 hsa-miR-4673hsa-miR-4673 hsa-miR-4706hsa-miR-4706 hsa-miR-4738hsa-miR-4738 hsa-miR-4674hsa-miR-4674 hsa-miR-4707hsa-miR-4707 hsa-miR-4739hsa-miR-4739 hsa-miR-4675hsa-miR-4675 hsa-miR-4708hsa-miR-4708 hsa-miR-4740hsa-miR-4740 hsa-miR-4676hsa-miR-4676 hsa-miR-4709hsa-miR-4709 hsa-miR-4741hsa-miR-4741 hsa-miR-4677hsa-miR-4677 hsa-miR-4710hsa-miR-4710 hsa-miR-4742hsa-miR-4742 hsa-miR-4678hsa-miR-4678 hsa-miR-4711hsa-miR-4711 hsa-miR-4743hsa-miR-4743 hsa-miR-4679hsa-miR-4679 hsa-miR-4712hsa-miR-4712 hsa-miR-4744hsa-miR-4744 hsa-miR-4680hsa-miR-4680 hsa-miR-4713hsa-miR-4713 hsa-miR-4745hsa-miR-4745 hsa-miR-4681hsa-miR-4681 hsa-miR-4714hsa-miR-4714 hsa-miR-4746hsa-miR-4746 hsa-miR-4682hsa-miR-4682 hsa-miR-4715hsa-miR-4715 hsa-miR-4747hsa-miR-4747 hsa-miR-4683hsa-miR-4683 hsa-miR-4716hsa-miR-4716 hsa-miR-4748hsa-miR-4748 hsa-miR-4684hsa-miR-4684 hsa-miR-4717hsa-miR-4717 hsa-miR-4749hsa-miR-4749 hsa-miR-4685hsa-miR-4685 hsa-miR-4718hsa-miR-4718 hsa-miR-4750hsa-miR-4750 hsa-miR-4686hsa-miR-4686 hsa-miR-4719hsa-miR-4719 hsa-miR-4751hsa-miR-4751 hsa-miR-4687hsa-miR-4687 hsa-miR-4720hsa-miR-4720 hsa-miR-4752hsa-miR-4752 hsa-miR-4688hsa-miR-4688 hsa-miR-4721hsa-miR-4721 hsa-miR-4753hsa-miR-4753 hsa-miR-4689hsa-miR-4689 hsa-miR-4722hsa-miR-4722 hsa-miR-4754hsa-miR-4754 hsa-miR-4690hsa-miR-4690 hsa-miR-4723hsa-miR-4723 hsa-miR-4755hsa-miR-4755 hsa-miR-4691hsa-miR-4691 hsa-miR-4724hsa-miR-4724 hsa-miR-4756hsa-miR-4756 hsa-miR-4692hsa-miR-4692 hsa-miR-4725hsa-miR-4725 hsa-miR-4757hsa-miR-4757 hsa-miR-4693hsa-miR-4693 hsa-miR-4726hsa-miR-4726 hsa-miR-4758hsa-miR-4758 hsa-miR-4694hsa-miR-4694 hsa-miR-4727hsa-miR-4727 hsa-miR-4759hsa-miR-4759 hsa-miR-4760hsa-miR-4760 hsa-miR-4792hsa-miR-4792 hsa-miR-499bhsa-miR-499b hsa-miR-4761hsa-miR-4761 hsa-miR-4793hsa-miR-4793 hsa-miR-5000hsa-miR-5000 hsa-miR-4762hsa-miR-4762 hsa-miR-4794hsa-miR-4794 hsa-miR-5001hsa-miR-5001 hsa-miR-4763hsa-miR-4763 hsa-miR-4795hsa-miR-4795 hsa-miR-5002hsa-miR-5002 hsa-miR-4764hsa-miR-4764 hsa-miR-4796hsa-miR-4796 hsa-miR-5003hsa-miR-5003 hsa-miR-4765hsa-miR-4765 hsa-miR-4797hsa-miR-4797 hsa-miR-5004hsa-miR-5004 hsa-miR-4766hsa-miR-4766 hsa-miR-4798hsa-miR-4798 hsa-miR-5006hsa-miR-5006 hsa-miR-4767hsa-miR-4767 hsa-miR-4799hsa-miR-4799 hsa-miR-5007hsa-miR-5007 hsa-miR-4768hsa-miR-4768 hsa-miR-4800hsa-miR-4800 hsa-miR-5008hsa-miR-5008 hsa-miR-4769hsa-miR-4769 hsa-miR-4801hsa-miR-4801 hsa-miR-5009hsa-miR-5009 hsa-miR-4770hsa-miR-4770 hsa-miR-4802hsa-miR-4802 hsa-miR-500ahsa-miR-500a hsa-miR-4771hsa-miR-4771 hsa-miR-4803hsa-miR-4803 hsa-miR-500bhsa-miR-500b hsa-miR-4772hsa-miR-4772 hsa-miR-4804hsa-miR-4804 hsa-miR-501hsa-miR-501 hsa-miR-4773hsa-miR-4773 hsa-miR-483hsa-miR-483 hsa-miR-5010hsa-miR-5010 hsa-miR-4774hsa-miR-4774 hsa-miR-484hsa-miR-484 hsa-miR-5011hsa-miR-5011 hsa-miR-4775hsa-miR-4775 hsa-miR-485hsa-miR-485 hsa-miR-502hsa-miR-502 hsa-miR-4776hsa-miR-4776 hsa-miR-486hsa-miR-486 hsa-miR-503hsa-miR-503 hsa-miR-4777hsa-miR-4777 hsa-miR-487ahsa-miR-487a hsa-miR-504hsa-miR-504 hsa-miR-4778hsa-miR-4778 hsa-miR-487bhsa-miR-487b hsa-miR-5047hsa-miR-5047 hsa-miR-4779hsa-miR-4779 hsa-miR-488hsa-miR-488 hsa-miR-505hsa-miR-505 hsa-miR-4780hsa-miR-4780 hsa-miR-489hsa-miR-489 hsa-miR-506hsa-miR-506 hsa-miR-4781hsa-miR-4781 hsa-miR-490hsa-miR-490 hsa-miR-507hsa-miR-507 hsa-miR-4782hsa-miR-4782 hsa-miR-491hsa-miR-491 hsa-miR-508hsa-miR-508 hsa-miR-4783hsa-miR-4783 hsa-miR-492hsa-miR-492 hsa-miR-5087hsa-miR-5087 hsa-miR-4784hsa-miR-4784 hsa-miR-493hsa-miR-493 hsa-miR-5088hsa-miR-5088 hsa-miR-4785hsa-miR-4785 hsa-miR-494hsa-miR-494 hsa-miR-5089hsa-miR-5089 hsa-miR-4786hsa-miR-4786 hsa-miR-495hsa-miR-495 hsa-miR-509-1hsa-miR-509-1 hsa-miR-4787hsa-miR-4787 hsa-miR-496hsa-miR-496 hsa-miR-509-3hsa-miR-509-3 hsa-miR-4788hsa-miR-4788 hsa-miR-497hsa-miR-497 hsa-miR-5090hsa-miR-5090 hsa-miR-4789hsa-miR-4789 hsa-miR-498hsa-miR-498 hsa-miR-5091hsa-miR-5091 hsa-miR-4790hsa-miR-4790 hsa-miR-4999hsa-miR-4999 hsa-miR-5092hsa-miR-5092 hsa-miR-4791hsa-miR-4791 hsa-miR-499ahsa-miR-499a hsa-miR-5093hsa-miR-5093 hsa-miR-5094hsa-miR-5094 hsa-miR-5194hsa-miR-5194 hsa-miR-545hsa-miR-545 hsa-miR-5095hsa-miR-5095 hsa-miR-5195hsa-miR-5195 hsa-miR-548ahsa-miR-548a hsa-miR-5096hsa-miR-5096 hsa-miR-5196hsa-miR-5196 hsa-miR-548aahsa-miR-548aa hsa-miR-510hsa-miR-510 hsa-miR-5197hsa-miR-5197 hsa-miR-548abhsa-miR-548ab hsa-miR-5100hsa-miR-5100 hsa-miR-519ahsa-miR-519a hsa-miR-548achsa-miR-548ac hsa-miR-511hsa-miR-511 hsa-miR-519bhsa-miR-519b hsa-miR-548adhsa-miR-548ad hsa-miR-512hsa-miR-512 hsa-miR-519chsa-miR-519c hsa-miR-548aehsa-miR-548ae hsa-miR-513ahsa-miR-513a hsa-miR-519dhsa-miR-519d hsa-miR-548aghsa-miR-548ag hsa-miR-513bhsa-miR-513b hsa-miR-519ehsa-miR-519e hsa-miR-548ahhsa-miR-548ah hsa-miR-513chsa-miR-513c hsa-miR-520ahsa-miR-520a hsa-miR-548aihsa-miR-548ai hsa-miR-514ahsa-miR-514a hsa-miR-520bhsa-miR-520b hsa-miR-548ajhsa-miR-548aj hsa-miR-514bhsa-miR-514b hsa-miR-520chsa-miR-520c hsa-miR-548akhsa-miR-548ak hsa-miR-515hsa-miR-515 hsa-miR-520dhsa-miR-520d hsa-miR-548alhsa-miR-548al hsa-miR-516ahsa-miR-516a hsa-miR-520ehsa-miR-520e hsa-miR-548amhsa-miR-548am hsa-miR-516bhsa-miR-516b hsa-miR-520fhsa-miR-520f hsa-miR-548anhsa-miR-548an hsa-miR-517ahsa-miR-517a hsa-miR-520ghsa-miR-520g hsa-miR-548aohsa-miR-548ao hsa-miR-517bhsa-miR-517b hsa-miR-520hhsa-miR-520h hsa-miR-548aphsa-miR-548ap hsa-miR-517chsa-miR-517c hsa-miR-521hsa-miR-521 hsa-miR-548aqhsa-miR-548aq hsa-miR-5186hsa-miR-5186 hsa-miR-522hsa-miR-522 hsa-miR-548arhsa-miR-548ar hsa-miR-5187hsa-miR-5187 hsa-miR-523hsa-miR-523 hsa-miR-548ashsa-miR-548as hsa-miR-5188hsa-miR-5188 hsa-miR-524hsa-miR-524 hsa-miR-548athsa-miR-548at hsa-miR-5189hsa-miR-5189 hsa-miR-525hsa-miR-525 hsa-miR-548auhsa-miR-548au hsa-miR-518ahsa-miR-518a hsa-miR-526ahsa-miR-526a hsa-miR-548avhsa-miR-548av hsa-miR-518bhsa-miR-518b hsa-miR-526bhsa-miR-526b hsa-miR-548awhsa-miR-548aw hsa-miR-518chsa-miR-518c hsa-miR-527hsa-miR-527 hsa-miR-548axhsa-miR-548ax hsa-miR-518dhsa-miR-518d hsa-miR-532hsa-miR-532 hsa-miR-548ayhsa-miR-548ay hsa-miR-518ehsa-miR-518e hsa-miR-539hsa-miR-539 hsa-miR-548azhsa-miR-548az hsa-miR-518fhsa-miR-518f hsa-miR-541hsa-miR-541 hsa-miR-548bhsa-miR-548b hsa-miR-5190hsa-miR-5190 hsa-miR-542hsa-miR-542 hsa-miR-548bahsa-miR-548ba hsa-miR-5191hsa-miR-5191 hsa-miR-543hsa-miR-543 hsa-miR-548bbhsa-miR-548bb hsa-miR-5192hsa-miR-5192 hsa-miR-544ahsa-miR-544a hsa-miR-548chsa-miR-548c hsa-miR-5193hsa-miR-5193 hsa-miR-544bhsa-miR-544b hsa-miR-548dhsa-miR-548d hsa-miR-548ehsa-miR-548e hsa-miR-557hsa-miR-557 hsa-miR-5687hsa-miR-5687 hsa-miR-548fhsa-miR-548f hsa-miR-5571hsa-miR-5571 hsa-miR-5688hsa-miR-5688 hsa-miR-548ghsa-miR-548g hsa-miR-5572hsa-miR-5572 hsa-miR-5689hsa-miR-5689 hsa-miR-548hhsa-miR-548h hsa-miR-5579hsa-miR-5579 hsa-miR-569hsa-miR-569 hsa-miR-548ihsa-miR-548i hsa-miR-558hsa-miR-558 hsa-miR-5690hsa-miR-5690 hsa-miR-548jhsa-miR-548j hsa-miR-5580hsa-miR-5580 hsa-miR-5691hsa-miR-5691 hsa-miR-548khsa-miR-548k hsa-miR-5581hsa-miR-5581 hsa-miR-5692ahsa-miR-5692a hsa-miR-548lhsa-miR-548l hsa-miR-5582hsa-miR-5582 hsa-miR-5692bhsa-miR-5692b hsa-miR-548mhsa-miR-548m hsa-miR-5583hsa-miR-5583 hsa-miR-5692chsa-miR-5692c hsa-miR-548nhsa-miR-548n hsa-miR-5584hsa-miR-5584 hsa-miR-5693hsa-miR-5693 hsa-miR-548ohsa-miR-548o hsa-miR-5585hsa-miR-5585 hsa-miR-5694hsa-miR-5694 hsa-miR-548phsa-miR-548p hsa-miR-5586hsa-miR-5586 hsa-miR-5695hsa-miR-5695 hsa-miR-548qhsa-miR-548q hsa-miR-5587hsa-miR-5587 hsa-miR-5696hsa-miR-5696 hsa-miR-548shsa-miR-548s hsa-miR-5588hsa-miR-5588 hsa-miR-5697hsa-miR-5697 hsa-miR-548thsa-miR-548t hsa-miR-5589hsa-miR-5589 hsa-miR-5698hsa-miR-5698 hsa-miR-548uhsa-miR-548u hsa-miR-559hsa-miR-559 hsa-miR-5699hsa-miR-5699 hsa-miR-548vhsa-miR-548v hsa-miR-5590hsa-miR-5590 hsa-miR-570hsa-miR-570 hsa-miR-548whsa-miR-548w hsa-miR-5591hsa-miR-5591 hsa-miR-5700hsa-miR-5700 hsa-miR-548xhsa-miR-548x hsa-miR-561hsa-miR-561 hsa-miR-5701hsa-miR-5701 hsa-miR-548yhsa-miR-548y hsa-miR-562hsa-miR-562 hsa-miR-5702hsa-miR-5702 hsa-miR-548zhsa-miR-548z hsa-miR-563hsa-miR-563 hsa-miR-5703hsa-miR-5703 hsa-miR-549ahsa-miR-549a hsa-miR-564hsa-miR-564 hsa-miR-5704hsa-miR-5704 hsa-miR-550a-1hsa-miR-550a-1 hsa-miR-566hsa-miR-566 hsa-miR-5705hsa-miR-5705 hsa-miR-550a-3hsa-miR-550a-3 hsa-miR-567hsa-miR-567 hsa-miR-5706hsa-miR-5706 hsa-miR-550bhsa-miR-550b hsa-miR-568hsa-miR-568 hsa-miR-5707hsa-miR-5707 hsa-miR-551ahsa-miR-551a hsa-miR-5680hsa-miR-5680 hsa-miR-5708hsa-miR-5708 hsa-miR-551bhsa-miR-551b hsa-miR-5681ahsa-miR-5681a hsa-miR-571hsa-miR-571 hsa-miR-552hsa-miR-552 hsa-miR-5681bhsa-miR-5681b hsa-miR-572hsa-miR-572 hsa-miR-553hsa-miR-553 hsa-miR-5682hsa-miR-5682 hsa-miR-573hsa-miR-573 hsa-miR-554hsa-miR-554 hsa-miR-5683hsa-miR-5683 hsa-miR-5739hsa-miR-5739 hsa-miR-555hsa-miR-555 hsa-miR-5684hsa-miR-5684 hsa-miR-574hsa-miR-574 hsa-miR-556hsa-miR-556 hsa-miR-5685hsa-miR-5685 hsa-miR-575hsa-miR-575 hsa-miR-576hsa-miR-576 hsa-miR-6069hsa-miR-6069 hsa-miR-6128hsa-miR-6128 hsa-miR-577hsa-miR-577 hsa-miR-607hsa-miR-607 hsa-miR-6129hsa-miR-6129 hsa-miR-578hsa-miR-578 hsa-miR-6070hsa-miR-6070 hsa-miR-613hsa-miR-613 hsa-miR-5787hsa-miR-5787 hsa-miR-6071hsa-miR-6071 hsa-miR-6130hsa-miR-6130 hsa-miR-579hsa-miR-579 hsa-miR-6072hsa-miR-6072 hsa-miR-6131hsa-miR-6131 hsa-miR-580hsa-miR-580 hsa-miR-6073hsa-miR-6073 hsa-miR-6132hsa-miR-6132 hsa-miR-581hsa-miR-581 hsa-miR-6074hsa-miR-6074 hsa-miR-6133hsa-miR-6133 hsa-miR-582hsa-miR-582 hsa-miR-6075hsa-miR-6075 hsa-miR-6134hsa-miR-6134 hsa-miR-583hsa-miR-583 hsa-miR-6076hsa-miR-6076 hsa-miR-614hsa-miR-614 hsa-miR-584hsa-miR-584 hsa-miR-6077hsa-miR-6077 hsa-miR-615hsa-miR-615 hsa-miR-585hsa-miR-585 hsa-miR-6078hsa-miR-6078 hsa-miR-616hsa-miR-616 hsa-miR-586hsa-miR-586 hsa-miR-6079hsa-miR-6079 hsa-miR-6165hsa-miR-6165 hsa-miR-587hsa-miR-587 hsa-miR-608hsa-miR-608 hsa-miR-617hsa-miR-617 hsa-miR-588hsa-miR-588 hsa-miR-6080hsa-miR-6080 hsa-miR-618hsa-miR-618 hsa-miR-589hsa-miR-589 hsa-miR-6081hsa-miR-6081 hsa-miR-619hsa-miR-619 hsa-miR-590hsa-miR-590 hsa-miR-6082hsa-miR-6082 hsa-miR-620hsa-miR-620 hsa-miR-591hsa-miR-591 hsa-miR-6083hsa-miR-6083 hsa-miR-621hsa-miR-621 hsa-miR-592hsa-miR-592 hsa-miR-6084hsa-miR-6084 hsa-miR-622hsa-miR-622 hsa-miR-593hsa-miR-593 hsa-miR-6085hsa-miR-6085 hsa-miR-623hsa-miR-623 hsa-miR-595hsa-miR-595 hsa-miR-6086hsa-miR-6086 hsa-miR-624hsa-miR-624 hsa-miR-596hsa-miR-596 hsa-miR-6087hsa-miR-6087 hsa-miR-625hsa-miR-625 hsa-miR-597hsa-miR-597 hsa-miR-6088hsa-miR-6088 hsa-miR-626hsa-miR-626 hsa-miR-598hsa-miR-598 hsa-miR-6089hsa-miR-6089 hsa-miR-627hsa-miR-627 hsa-miR-599hsa-miR-599 hsa-miR-609hsa-miR-609 hsa-miR-628hsa-miR-628 hsa-miR-600hsa-miR-600 hsa-miR-6090hsa-miR-6090 hsa-miR-629hsa-miR-629 hsa-miR-601hsa-miR-601 hsa-miR-610hsa-miR-610 hsa-miR-630hsa-miR-630 hsa-miR-602hsa-miR-602 hsa-miR-611hsa-miR-611 hsa-miR-631hsa-miR-631 hsa-miR-603hsa-miR-603 hsa-miR-612hsa-miR-612 hsa-miR-632hsa-miR-632 hsa-miR-604hsa-miR-604 hsa-miR-6124hsa-miR-6124 hsa-miR-633hsa-miR-633 hsa-miR-605hsa-miR-605 hsa-miR-6125hsa-miR-6125 hsa-miR-634hsa-miR-634 hsa-miR-606hsa-miR-606 hsa-miR-6126hsa-miR-6126 hsa-miR-635hsa-miR-635 hsa-miR-6068hsa-miR-6068 hsa-miR-6127hsa-miR-6127 hsa-miR-636hsa-miR-636 hsa-miR-637hsa-miR-637 hsa-miR-6514hsa-miR-6514 hsa-miR-6724hsa-miR-6724 hsa-miR-638hsa-miR-638 hsa-miR-6515hsa-miR-6515 hsa-miR-6726hsa-miR-6726 hsa-miR-639hsa-miR-639 hsa-miR-6516hsa-miR-6516 hsa-miR-6727hsa-miR-6727 hsa-miR-640hsa-miR-640 hsa-miR-652hsa-miR-652 hsa-miR-6728hsa-miR-6728 hsa-miR-641hsa-miR-641 hsa-miR-653hsa-miR-653 hsa-miR-6729hsa-miR-6729 hsa-miR-642ahsa-miR-642a hsa-miR-654hsa-miR-654 hsa-miR-6730hsa-miR-6730 hsa-miR-642bhsa-miR-642b hsa-miR-655hsa-miR-655 hsa-miR-6731hsa-miR-6731 hsa-miR-643hsa-miR-643 hsa-miR-656hsa-miR-656 hsa-miR-6732hsa-miR-6732 hsa-miR-644ahsa-miR-644a hsa-miR-657hsa-miR-657 hsa-miR-6733hsa-miR-6733 hsa-miR-645hsa-miR-645 hsa-miR-658hsa-miR-658 hsa-miR-6734hsa-miR-6734 hsa-miR-646hsa-miR-646 hsa-miR-659hsa-miR-659 hsa-miR-6735hsa-miR-6735 hsa-miR-647hsa-miR-647 hsa-miR-660hsa-miR-660 hsa-miR-6736hsa-miR-6736 hsa-miR-648hsa-miR-648 hsa-miR-661hsa-miR-661 hsa-miR-6737hsa-miR-6737 hsa-miR-649hsa-miR-649 hsa-miR-662hsa-miR-662 hsa-miR-6738hsa-miR-6738 hsa-miR-6499hsa-miR-6499 hsa-miR-663ahsa-miR-663a hsa-miR-6739hsa-miR-6739 hsa-miR-650hsa-miR-650 hsa-miR-663bhsa-miR-663b hsa-miR-6740hsa-miR-6740 hsa-miR-6500hsa-miR-6500 hsa-miR-664ahsa-miR-664a hsa-miR-6741hsa-miR-6741 hsa-miR-6501hsa-miR-6501 hsa-miR-664bhsa-miR-664b hsa-miR-6742hsa-miR-6742 hsa-miR-6502hsa-miR-6502 hsa-miR-665hsa-miR-665 hsa-miR-6743hsa-miR-6743 hsa-miR-6503hsa-miR-6503 hsa-miR-668hsa-miR-668 hsa-miR-6744hsa-miR-6744 hsa-miR-6504hsa-miR-6504 hsa-miR-670hsa-miR-670 hsa-miR-6745hsa-miR-6745 hsa-miR-6505hsa-miR-6505 hsa-miR-671hsa-miR-671 hsa-miR-6746hsa-miR-6746 hsa-miR-6506hsa-miR-6506 hsa-miR-6715ahsa-miR-6715a hsa-miR-6747hsa-miR-6747 hsa-miR-6507hsa-miR-6507 hsa-miR-6715bhsa-miR-6715b hsa-miR-6748hsa-miR-6748 hsa-miR-6508hsa-miR-6508 hsa-miR-6716hsa-miR-6716 hsa-miR-6749hsa-miR-6749 hsa-miR-6509hsa-miR-6509 hsa-miR-6717hsa-miR-6717 hsa-miR-675hsa-miR-675 hsa-miR-651hsa-miR-651 hsa-miR-6718hsa-miR-6718 hsa-miR-6750hsa-miR-6750 hsa-miR-6510hsa-miR-6510 hsa-miR-6719hsa-miR-6719 hsa-miR-6751hsa-miR-6751 hsa-miR-6511ahsa-miR-6511a hsa-miR-6720hsa-miR-6720 hsa-miR-6752hsa-miR-6752 hsa-miR-6511bhsa-miR-6511b hsa-miR-6721hsa-miR-6721 hsa-miR-6753hsa-miR-6753 hsa-miR-6512hsa-miR-6512 hsa-miR-6722hsa-miR-6722 hsa-miR-6754hsa-miR-6754 hsa-miR-6513hsa-miR-6513 hsa-miR-6723hsa-miR-6723 hsa-miR-6755hsa-miR-6755 hsa-miR-6756hsa-miR-6756 hsa-miR-6785hsa-miR-6785 hsa-miR-6817hsa-miR-6817 hsa-miR-6757hsa-miR-6757 hsa-miR-6786hsa-miR-6786 hsa-miR-6818hsa-miR-6818 hsa-miR-6758hsa-miR-6758 hsa-miR-6787hsa-miR-6787 hsa-miR-6819hsa-miR-6819 hsa-miR-6759hsa-miR-6759 hsa-miR-6788hsa-miR-6788 hsa-miR-6820hsa-miR-6820 hsa-miR-676hsa-miR-676 hsa-miR-6789hsa-miR-6789 hsa-miR-6821hsa-miR-6821 hsa-miR-6760hsa-miR-6760 hsa-miR-6790hsa-miR-6790 hsa-miR-6822hsa-miR-6822 hsa-miR-6761hsa-miR-6761 hsa-miR-6791hsa-miR-6791 hsa-miR-6823hsa-miR-6823 hsa-miR-6762hsa-miR-6762 hsa-miR-6792hsa-miR-6792 hsa-miR-6824hsa-miR-6824 hsa-miR-6763hsa-miR-6763 hsa-miR-6793hsa-miR-6793 hsa-miR-6825hsa-miR-6825 hsa-miR-6764hsa-miR-6764 hsa-miR-6794hsa-miR-6794 hsa-miR-6826hsa-miR-6826 hsa-miR-6765hsa-miR-6765 hsa-miR-6795hsa-miR-6795 hsa-miR-6827hsa-miR-6827 hsa-miR-6766hsa-miR-6766 hsa-miR-6796hsa-miR-6796 hsa-miR-6828hsa-miR-6828 hsa-miR-6767hsa-miR-6767 hsa-miR-6797hsa-miR-6797 hsa-miR-6829hsa-miR-6829 hsa-miR-6768hsa-miR-6768 hsa-miR-6798hsa-miR-6798 hsa-miR-6830hsa-miR-6830 hsa-miR-6769ahsa-miR-6769a hsa-miR-6799hsa-miR-6799 hsa-miR-6831hsa-miR-6831 hsa-miR-6769bhsa-miR-6769b hsa-miR-6800hsa-miR-6800 hsa-miR-6832hsa-miR-6832 hsa-miR-6770hsa-miR-6770 hsa-miR-6801hsa-miR-6801 hsa-miR-6833hsa-miR-6833 hsa-miR-6771hsa-miR-6771 hsa-miR-6802hsa-miR-6802 hsa-miR-6834hsa-miR-6834 hsa-miR-6772hsa-miR-6772 hsa-miR-6803hsa-miR-6803 hsa-miR-6835hsa-miR-6835 hsa-miR-6773hsa-miR-6773 hsa-miR-6804hsa-miR-6804 hsa-miR-6836hsa-miR-6836 hsa-miR-6774hsa-miR-6774 hsa-miR-6805hsa-miR-6805 hsa-miR-6837hsa-miR-6837 hsa-miR-6775hsa-miR-6775 hsa-miR-6806hsa-miR-6806 hsa-miR-6838hsa-miR-6838 hsa-miR-6776hsa-miR-6776 hsa-miR-6807hsa-miR-6807 hsa-miR-6839hsa-miR-6839 hsa-miR-6777hsa-miR-6777 hsa-miR-6808hsa-miR-6808 hsa-miR-6840hsa-miR-6840 hsa-miR-6778hsa-miR-6778 hsa-miR-6809hsa-miR-6809 hsa-miR-6841hsa-miR-6841 hsa-miR-6779hsa-miR-6779 hsa-miR-6810hsa-miR-6810 hsa-miR-6842hsa-miR-6842 hsa-miR-6780ahsa-miR-6780a hsa-miR-6811hsa-miR-6811 hsa-miR-6843hsa-miR-6843 hsa-miR-6780bhsa-miR-6780b hsa-miR-6812hsa-miR-6812 hsa-miR-6844hsa-miR-6844 hsa-miR-6781hsa-miR-6781 hsa-miR-6813hsa-miR-6813 hsa-miR-6845hsa-miR-6845 hsa-miR-6782hsa-miR-6782 hsa-miR-6814hsa-miR-6814 hsa-miR-6846hsa-miR-6846 hsa-miR-6783hsa-miR-6783 hsa-miR-6815hsa-miR-6815 hsa-miR-6847hsa-miR-6847 hsa-miR-6784hsa-miR-6784 hsa-miR-6816hsa-miR-6816 hsa-miR-6848hsa-miR-6848 hsa-miR-6849hsa-miR-6849 hsa-miR-6881hsa-miR-6881 hsa-miR-7154hsa-miR-7154 hsa-miR-6850hsa-miR-6850 hsa-miR-6882hsa-miR-6882 hsa-miR-7155hsa-miR-7155 hsa-miR-6851hsa-miR-6851 hsa-miR-6883hsa-miR-6883 hsa-miR-7156hsa-miR-7156 hsa-miR-6852hsa-miR-6852 hsa-miR-6884hsa-miR-6884 hsa-miR-7157hsa-miR-7157 hsa-miR-6853hsa-miR-6853 hsa-miR-6885hsa-miR-6885 hsa-miR-7158hsa-miR-7158 hsa-miR-6854hsa-miR-6854 hsa-miR-6886hsa-miR-6886 hsa-miR-7159hsa-miR-7159 hsa-miR-6855hsa-miR-6855 hsa-miR-6887hsa-miR-6887 hsa-miR-7160hsa-miR-7160 hsa-miR-6856hsa-miR-6856 hsa-miR-6888hsa-miR-6888 hsa-miR-7161hsa-miR-7161 hsa-miR-6857hsa-miR-6857 hsa-miR-6889hsa-miR-6889 hsa-miR-7162hsa-miR-7162 hsa-miR-6858hsa-miR-6858 hsa-miR-6890hsa-miR-6890 hsa-miR-718hsa-miR-718 hsa-miR-6859hsa-miR-6859 hsa-miR-6891hsa-miR-6891 hsa-miR-744hsa-miR-744 hsa-miR-6860hsa-miR-6860 hsa-miR-6892hsa-miR-6892 hsa-miR-7515hsa-miR-7515 hsa-miR-6861hsa-miR-6861 hsa-miR-6893hsa-miR-6893 hsa-miR-758hsa-miR-758 hsa-miR-6862hsa-miR-6862 hsa-miR-6894hsa-miR-6894 hsa-miR-759hsa-miR-759 hsa-miR-6863hsa-miR-6863 hsa-miR-6895hsa-miR-6895 hsa-miR-760hsa-miR-760 hsa-miR-6864hsa-miR-6864 hsa-miR-7-1hsa-miR-7-1 hsa-miR-761hsa-miR-761 hsa-miR-6865hsa-miR-6865 hsa-miR-7-2hsa-miR-7-2 hsa-miR-762hsa-miR-762 hsa-miR-6866hsa-miR-6866 hsa-miR-708hsa-miR-708 hsa-miR-764hsa-miR-764 hsa-miR-6867hsa-miR-6867 hsa-miR-7106hsa-miR-7106 hsa-miR-7641hsa-miR-7641 hsa-miR-6868hsa-miR-6868 hsa-miR-7107hsa-miR-7107 hsa-miR-765hsa-miR-765 hsa-miR-6869hsa-miR-6869 hsa-miR-7108hsa-miR-7108 hsa-miR-766hsa-miR-766 hsa-miR-6870hsa-miR-6870 hsa-miR-7109hsa-miR-7109 hsa-miR-767hsa-miR-767 hsa-miR-6871hsa-miR-6871 hsa-miR-711hsa-miR-711 hsa-miR-769hsa-miR-769 hsa-miR-6872hsa-miR-6872 hsa-miR-7110hsa-miR-7110 hsa-miR-770hsa-miR-770 hsa-miR-6873hsa-miR-6873 hsa-miR-7111hsa-miR-7111 hsa-miR-7702hsa-miR-7702 hsa-miR-6874hsa-miR-6874 hsa-miR-7112hsa-miR-7112 hsa-miR-7703hsa-miR-7703 hsa-miR-6875hsa-miR-6875 hsa-miR-7113hsa-miR-7113 hsa-miR-7704hsa-miR-7704 hsa-miR-6876hsa-miR-6876 hsa-miR-7114hsa-miR-7114 hsa-miR-7705hsa-miR-7705 hsa-miR-6877hsa-miR-6877 hsa-miR-7150hsa-miR-7150 hsa-miR-7706hsa-miR-7706 hsa-miR-6878hsa-miR-6878 hsa-miR-7151hsa-miR-7151 hsa-miR-7843hsa-miR-7843 hsa-miR-6879hsa-miR-6879 hsa-miR-7152hsa-miR-7152 hsa-miR-7844hsa-miR-7844 hsa-miR-6880hsa-miR-6880 hsa-miR-7153hsa-miR-7153 hsa-miR-7845hsa-miR-7845 hsa-miR-7846hsa-miR-7846 hsa-miR-8066hsa-miR-8066 hsa-miR-888hsa-miR-888 hsa-miR-7847hsa-miR-7847 hsa-miR-8067hsa-miR-8067 hsa-miR-889hsa-miR-889 hsa-miR-7848hsa-miR-7848 hsa-miR-8068hsa-miR-8068 hsa-miR-890hsa-miR-890 hsa-miR-7849hsa-miR-7849 hsa-miR-8069hsa-miR-8069 hsa-miR-891ahsa-miR-891a hsa-miR-7850hsa-miR-7850 hsa-miR-8070hsa-miR-8070 hsa-miR-891bhsa-miR-891b hsa-miR-7851hsa-miR-7851 hsa-miR-8071hsa-miR-8071 hsa-miR-892ahsa-miR-892a hsa-miR-7852hsa-miR-7852 hsa-miR-8072hsa-miR-8072 hsa-miR-892bhsa-miR-892b hsa-miR-7853hsa-miR-7853 hsa-miR-8073hsa-miR-8073 hsa-miR-892chsa-miR-892c hsa-miR-7854hsa-miR-7854 hsa-miR-8074hsa-miR-8074 hsa-miR-9hsa-miR-9 hsa-miR-7855hsa-miR-7855 hsa-miR-8075hsa-miR-8075 hsa-miR-920hsa-miR-920 hsa-miR-7856hsa-miR-7856 hsa-miR-8076hsa-miR-8076 hsa-miR-921hsa-miR-921 hsa-miR-7973hsa-miR-7973 hsa-miR-8077hsa-miR-8077 hsa-miR-922hsa-miR-922 hsa-miR-7974hsa-miR-7974 hsa-miR-8078hsa-miR-8078 hsa-miR-924hsa-miR-924 hsa-miR-7975hsa-miR-7975 hsa-miR-8079hsa-miR-8079 hsa-miR-92a-1hsa-miR-92a-1 hsa-miR-7976hsa-miR-7976 hsa-miR-8080hsa-miR-8080 hsa-miR-92a-2hsa-miR-92a-2 hsa-miR-7977hsa-miR-7977 hsa-miR-8081hsa-miR-8081 hsa-miR-92bhsa-miR-92b hsa-miR-7978hsa-miR-7978 hsa-miR-8082hsa-miR-8082 hsa-miR-93hsa-miR-93 hsa-miR-802hsa-miR-802 hsa-miR-8083hsa-miR-8083 hsa-miR-933hsa-miR-933 hsa-miR-8052hsa-miR-8052 hsa-miR-8084hsa-miR-8084 hsa-miR-934hsa-miR-934 hsa-miR-8053hsa-miR-8053 hsa-miR-8085hsa-miR-8085 hsa-miR-935hsa-miR-935 hsa-miR-8054hsa-miR-8054 hsa-miR-8086hsa-miR-8086 hsa-miR-936hsa-miR-936 hsa-miR-8055hsa-miR-8055 hsa-miR-8087hsa-miR-8087 hsa-miR-937hsa-miR-937 hsa-miR-8056hsa-miR-8056 hsa-miR-8088hsa-miR-8088 hsa-miR-938hsa-miR-938 hsa-miR-8057hsa-miR-8057 hsa-miR-8089hsa-miR-8089 hsa-miR-939hsa-miR-939 hsa-miR-8058hsa-miR-8058 hsa-miR-8485hsa-miR-8485 hsa-miR-940hsa-miR-940 hsa-miR-8059hsa-miR-8059 hsa-miR-873hsa-miR-873 hsa-miR-941hsa-miR-941 hsa-miR-8060hsa-miR-8060 hsa-miR-874hsa-miR-874 hsa-miR-942hsa-miR-942 hsa-miR-8061hsa-miR-8061 hsa-miR-875hsa-miR-875 hsa-miR-943hsa-miR-943 hsa-miR-8062hsa-miR-8062 hsa-miR-876hsa-miR-876 hsa-miR-944hsa-miR-944 hsa-miR-8063hsa-miR-8063 hsa-miR-877hsa-miR-877 hsa-miR-95hsa-miR-95 hsa-miR-8064hsa-miR-8064 hsa-miR-885hsa-miR-885 hsa-miR-9500hsa-miR-9500 hsa-miR-8065hsa-miR-8065 hsa-miR-887hsa-miR-887 hsa-miR-96hsa-miR-96 hsa-miR-98hsa-miR-98 hsa-miR-99ahsa-miR-99a hsa-miR-99bhsa-miR-99b

1-2. Клеточная культура и трансфекция мкрРНК1-2. Cell culture and miRNA transfection

Для обнаружения мкрРНК, которые индуцируют выработку меланина, использовали меланому человека M21 (Корейский банк клеточных линий, KR), которая представляет собой клеточную линию рака кожи, полученную от человека. Клетки М21 культивировали при 37°C/5% CO2 в среде DMEM (Hyclone, США) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, Hyclone, США) и 1% пенициллина-стрептомицина (Hyclone, США). Клетки М21 распределяли по 4×104 клеток/лунку в 12-луночный планшет (Falcon, США) и на следующий день трансфицировали мкрРНК при концентрации 40 нМ с применением Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом изготовителя.To detect miRNAs that induce melanin production, human melanoma M21 (Korea Cell Line Bank, KR), which is a human-derived skin cancer cell line, was used. M21 cells were cultured at 37°C/5% CO 2 in DMEM (Hyclone, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone, USA) and 1% penicillin-streptomycin (Hyclone, USA). M21 cells were distributed at 4 × 10 4 cells/well in a 12-well plate (Falcon, USA) and the next day transfected with sRNA at a concentration of 40 nM using Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, USA) according to the manufacturer's protocol.

1-3. Скрининг 1728 мкрРНК путем измерения количества вырабатываемого меланина1-3. Screening 1,728 miRNAs by measuring the amount of melanin produced

Клетки М21 трижды трансфицировали 1728 мкрРНК с помощью способа по примеру 1-2. После культивирования в течение 72 часов все клетки собирали и оставляли реагировать в 1 М растворе NaOH (Bioneer, KR) в течение 2 часов при 37°C в соответствии с протоколом экстракции меланина, после чего измеряли поглощение при длине волны 405 нм для сравнения изменения окрашивания и количества вырабатываемого меланина. После культивирования в течение 72 часов все клетки собирали и оставляли реагировать в 1 М растворе NaOH (Bioneer, KR) в течение 2 часов при 37°C в соответствии с протоколом экстракции меланина, после чего измеряли поглощение при длине волны 405 нм и, таким образом, анализировали количество вырабатываемого меланина. Для оценки воспроизводимости 9 лучших мкрРНК использовали для обработки клеток М21 с помощью способа по примеру 1-2. После культивирования в течение 72 часов все клетки собирали и оставляли реагировать в 1 М растворе NaOH (Bioneer, KR) в течение 2 часов при 37°C в соответствии с протоколом экстракции меланина, после чего измеряли поглощение при длине волны 405 нм и, таким образом, анализировали количество вырабатываемого меланина.M21 cells were transfected three times with 1728 miRNAs using the method according to example 1-2. After culture for 72 hours, all cells were collected and allowed to react in 1 M NaOH (Bioneer, KR) for 2 hours at 37°C according to the melanin extraction protocol, after which absorbance was measured at 405 nm to compare color changes and the amount of melanin produced. After culture for 72 hours, all cells were collected and allowed to react in 1 M NaOH solution (Bioneer, KR) for 2 hours at 37°C according to the melanin extraction protocol, after which the absorbance was measured at a wavelength of 405 nm and thus , analyzed the amount of melanin produced. To assess reproducibility, the top 9 miRNAs were used to treat M21 cells using the method in Example 1-2. After culture for 72 hours, all cells were collected and allowed to react in 1 M NaOH solution (Bioneer, KR) for 2 hours at 37°C according to the melanin extraction protocol, after which the absorbance was measured at a wavelength of 405 nm and thus , analyzed the amount of melanin produced.

Таким образом, в клетках M21, обработанных в общей сложности 1728 мкрРНК, было отобрано 9 мкрРНК, демонстрирующих выработку меланина в количестве 13,0 мкг/мл или более (в 1,88 или более раз больше по сравнению с отрицательным контролем) и количество выработанного меланина, сходное с группой, обработанной положительным контролем IBMX (Sigma, США)/CuSO4 (Sigma, США) (фиг. 1). В повторных экспериментах для оценки воспроизводимости изменение окрашивания и меланогенез подтверждали в клеточной линии М21 с помощью выбранных 9 лучших мкрРНК по сравнению с группой отрицательного контроля (фиг. 2, таблица 3).In summary, in M21 cells treated with a total of 1728 miRNAs, 9 miRNAs were selected to exhibit melanin production of 13.0 μg/ml or more (1.88 or more times greater than the negative control) and the amount of melanin produced melanin, similar to the group treated with the positive control IBMX (Sigma, USA)/CuSO 4 (Sigma, USA) (Fig. 1). In replicate experiments to evaluate reproducibility, color change and melanogenesis were confirmed in the M21 cell line using the selected top 9 miRNAs compared to the negative control group (Fig. 2, Table 3).

Таблица 3. Последовательности лучших 9 мкрРНК для меланогенезаTable 3. Sequences of the top 9 miRNAs for melanogenesis SEQ ID NO: 1SEQ ID NO: 1 hsa-miR-8485hsa-miR-8485 Цепь 1Chain 1 ACGUGUGUGUGUGUGUGUGUUACGUGUGUGUGUGUGUGUGUU SEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 2 hsa-miR-8485hsa-miR-8485 Цепь 2Chain 2 CACACACACACACACACGUAUCACACACACACACACACGUAU SEQ ID NO: 3SEQ ID NO: 3 hsa-miR-3132hsa-miR-3132 Цепь 1Chain 1 CUCUGAGCUCCUUCUCUACCCAUUCUCUGAGCUCCUUCUCUACCCAUU SEQ ID NO: 4SEQ ID NO: 4 hsa-miR-3132hsa-miR-3132 Цепь 2Chain 2 UGGGUAGAGAAGGAGCUCAGAGGAUGGGUAGAGAAGGAGCUCAGAGGA SEQ ID NO: 5SEQ ID NO: 5 hsa-miR-3189hsa-miR-3189 Цепь 1Chain 1 UGCCCCAUCUGUGCCCUGGGUAGGAUGCCCCAUCUGUGCCCUGGGUAGGA SEQ ID NO: 6SEQ ID NO: 6 hsa-miR-3189hsa-miR-3189 Цепь 2Chain 2 CCCUUGGGUCUGAUGGGGUAGCCCUUGGGUCUGAUGGGGUAG SEQ ID NO: 7SEQ ID NO: 7 hsa-miR-6074hsa-miR-6074 Цепь 1Chain 1 ACCUAGCCUCUGAAUAUCUUACCUAGCCUCUGAAUAUCUU SEQ ID NO: 8SEQ ID NO: 8 hsa-miR-6074hsa-miR-6074 Цепь 2Chain 2 GAUAUUCAGAGGCUAGGUGGGAUAUUCAGAGGGCUAGGUGG SEQ ID NO: 9SEQ ID NO: 9 hsa-miR-3139hsa-miR-3139 Цепь 1Chain 1 CAGGCAUCUGUUGAGCUCCUAUUCAGGCAUCUGUUGAGCUCCUAUU SEQ ID NO: 10SEQ ID NO: 10 hsa-miR-3139hsa-miR-3139 Цепь 2Chain 2 UAGGAGCUCAACAGAUGCCUGUUUAGGAGCUCAACAGAUGCCUGUU SEQ ID NO: 11SEQ ID NO: 11 hsa-miR-933hsa-miR-933 Цепь 1Chain 1 GAGAGGUCUCCCUGCGCACAUUGAGAGGUCUCCCUGCGCACAUU SEQ ID NO: 12SEQ ID NO: 12 hsa-miR-933hsa-miR-933 Цепь 2Chain 2 UGUGCGCAGGGAGACCUCUCCCUGUGCGCCAGGGAGACCUCUCCC SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 13 hsa-miR-7978hsa-miR-7978 Цепь 1Chain 1 AGCAACGCUAUACACCAGAUUAGCAACGCUAUACACCAGAUU SEQ ID NO: 14SEQ ID NO: 14 hsa-miR-7978hsa-miR-7978 Цепь 2Chain 2 UCUGGUGUAUAGCGUUGCUCAUCUGGUGUAUAGCGUUGCUCA SEQ ID NO: 15SEQ ID NO: 15 hsa-miR-3199hsa-miR-3199 Цепь 1Chain 1 CUUUCUCCUAAGGCAGUCCCUUUCUUUCUCCUAAGGCAGUCCCUUU SEQ ID NO: 16SEQ ID NO: 16 hsa-miR-3199hsa-miR-3199 Цепь 2Chain 2 AGGGACUGCCUUAGGAGAAAGUUAGGGACUGCCUUAGGAGAAAGUU SEQ ID NO: 17SEQ ID NO: 17 hsa-miR-4644hsa-miR-4644 Цепь 1Chain 1 UCUGUCUCUUUUCUCUCUCCAUUUCUGUCUCUUUUCUCUCCCAUU SEQ ID NO: 18SEQ ID NO: 18 hsa-miR-4644hsa-miR-4644 Цепь 2Chain 2 UGGAGAGAGAAAAGAGACAGAAGUGGAGAGAGAAAAGAGACAGAAG

Пример 2. Окончательный отбор индуцирующих меланин мкрРНК путем оценки воспроизводимости 9 отобранных мкрРНК и анализа механизма меланогенезаExample 2. Final selection of melanin-inducing miRNAs by assessing the reproducibility of the 9 selected miRNAs and analyzing the mechanism of melanogenesis

2-1. Клеточная культура и трансфекция мкрРНК2-1. Cell culture and miRNA transfection

SK-MEL-28 (Корейский банк клеточных линий, KR), представляющая собой клеточную линию рака кожи, полученную от человека, использовали для оценки воспроизводимости 9 основных мкрРНК для меланогенеза. Клетки SK-MEL-28 культивировали при 37°C/5% CO2 в МЕМ (Hyclone, США) с добавлением 10% ФБС (Hyclone, США) и 1% пенициллина-стрептомицина (Hyclone, США). Клетки SK-MEL-28 распределяли по 4×104 клеток/лунку в 12-луночный планшет (Falcon, США) и на следующий день трансфицировали мкрРНК при концентрации 40 нМ с применением Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом изготовителя.SK-MEL-28 (Korea Cell Line Bank, KR), which is a human-derived skin cancer cell line, was used to evaluate the reproducibility of 9 major miRNAs for melanogenesis. SK-MEL-28 cells were cultured at 37°C/5% CO 2 in MEM (Hyclone, USA) supplemented with 10% FBS (Hyclone, USA) and 1% penicillin-streptomycin (Hyclone, USA). SK-MEL-28 cells were distributed at 4 × 10 4 cells/well in a 12-well plate (Falcon, USA) and the next day transfected with sRNA at a concentration of 40 nM using Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, USA) according to the manufacturer's protocol.

2-2. Оценка воспроизводимости лучших 9 мкрРНК посредством анализа количества вырабатываемого меланина2-2. Assessing the reproducibility of the top 9 miRNAs by analyzing the amount of melanin produced

Чтобы оценить воспроизводимость отобранных 9 лучших мкрРНК, изменение окрашивания и количество вырабатываемого меланина измеряли в клетках SK-MEL-28. Клетки SK-MEL-28 трижды трансфицировали каждой из miR-8485, miR-7978, miR-6074, miR-3132, miR-4644, miR-3139, miR-3189, miR-3199 и miR-933 с помощью способа по примеру 2-1. После культивирования в течение 72 часов все клетки собирали и наблюдали изменение окрашивания. Для измерения количества вырабатываемого меланина реакцию проводили в 1 М растворе NaOH (Bioneer, KR) в течение 2 часов при 37°C в соответствии с протоколом экстракции меланина, после чего измеряли поглощение при длине волны 405 нм и, таким образом, анализировали количество вырабатываемого меланина.To evaluate the reproducibility of the selected top 9 miRNAs, staining changes and the amount of melanin produced were measured in SK-MEL-28 cells. SK-MEL-28 cells were transfected three times with each of miR-8485, miR-7978, miR-6074, miR-3132, miR-4644, miR-3139, miR-3189, miR-3199 and miR-933 using the method according to example 2-1. After culture for 72 hours, all cells were harvested and color changes were observed. To measure the amount of melanin produced, the reaction was carried out in 1 M NaOH solution (Bioneer, KR) for 2 hours at 37°C according to the melanin extraction protocol, after which the absorbance was measured at a wavelength of 405 nm and thus the amount of melanin produced was analyzed .

Таким образом, в группе, обработанной miR-8485, miR-7978, miR-6074, miR-3132, miR-4644, miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-933, наблюдалось отчетливое изменение окрашивания и увеличение количества вырабатываемого меланина по сравнению с группой отрицательного контроля. Значительное изменение окрашивания и увеличение количества вырабатываемого меланина подтверждались при сравнении с положительным контрольным индуктором меланина (фиг. 3).Thus, in the group treated with miR-8485, miR-7978, miR-6074, miR-3132, miR-4644, miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-933, there was a clear change in staining and an increase in the number melanin produced compared to the negative control group. A significant change in staining and an increase in the amount of melanin produced were confirmed when compared with a positive control melanin inducer (Fig. 3).

2-3. Анализ путей передачи сигналов, которые опосредуют меланогенез, с помощью кПЦР-РВ в клетках SK-MEL-28.2-3. Analysis of signal transduction pathways that mediate melanogenesis using qRT-PCR in SK-MEL-28 cells.

Чтобы проанализировать механизм действия выбранных лучших 9 мкрРНК для стимулирования меланогенеза, проводили кПЦР-РВ для анализа генов MITF, TYR, TYRP1 и TYRP2, которые являются ключевыми факторами меланогенеза. Клетки SK-MEL-28 распределяли по 4×104 клеток/лунку в 12-луночный планшет (Falcon, США) и затем культивировали при 37°C/5% CO2. На следующий день с помощью способа по примеру 2-1 клетки SK-MEL-28 трижды трансфицировали каждой из miR-8485, miR-7978, miR-6074, miR-3132, miR-4644, miR-3139, miR-3189, miR-3199 и miR-933. После культивирования в течение 96 часов общую РНК экстрагировали из клеточного лизата с применением набора Universal RNA extraction kit (Bioneer, KR) и, используя эту РНК в качестве матрицы, оценивали уровни экспрессии мРНК генов (набор Human qPCR panel kit, Bioneer, KR) и RPL13A (набор праймеров Human reference qPCR primer set, Bioneer, KR) с помощью количественной кПЦР-РВ с применением AccuPower GreenStar™ qRT-PCR Master Mix (Bioneer, KR) в соответствии с протоколом изготовителя. Значения Ct двух генов, полученные массовой кПЦР, подвергали относительной количественной оценке с помощью метода типа «два дельта Ct» [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec;25(4):4 02-8], в результате чего рассчитывали относительное количество (кратное изменение) мРНК каждого гена в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой. Последовательности праймеров для отдельных генов показаны ниже (таблица 4).To analyze the mechanism of action of the selected top 9 miRNAs to promote melanogenesis, qRT-PCR was performed to analyze the genes MITF, TYR, TYRP1 and TYRP2, which are key factors in melanogenesis. SK-MEL-28 cells were distributed at 4×10 4 cells/well in a 12-well plate (Falcon, USA) and then cultured at 37°C/5% CO 2 . The next day, using the method in Example 2-1, SK-MEL-28 cells were transfected three times with each of miR-8485, miR-7978, miR-6074, miR-3132, miR-4644, miR-3139, miR-3189, miR -3199 and miR-933. After culturing for 96 hours, total RNA was extracted from the cell lysate using a Universal RNA extraction kit (Bioneer, KR) and, using this RNA as a template, gene mRNA expression levels were assessed (Human qPCR panel kit, Bioneer, KR) and RPL13A (Human reference qPCR primer set, Bioneer, KR) by qRT-PCR using AccuPower GreenStar™ qRT-PCR Master Mix (Bioneer, KR) according to the manufacturer's protocol. The Ct values of the two genes obtained by bulk qPCR were subjected to relative quantification using the two-delta Ct method [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec;25(4):4 02-8], as a result of which the relative amount (fold change) of mRNA of each gene in the experimental group compared to the control group was calculated. Primer sequences for individual genes are shown below (Table 4).

Таблица 4. Последовательности праймеров человеческих MITF, TYR, TYRP1/2, RPL13A (внутренний контроль)Table 4. Primer sequences of human MITF, TYR, TYRP1/2, RPL13A (internal control) SEQ ID NO: 19SEQ ID NO: 19 hMITF-прямойhMITF-direct 5’- CGTCTCTCACTGGATTGGTG -3’5’- CGTCTCTCACTGGATTGTG -3’ SEQ ID NO: 20SEQ ID NO: 20 hMITF-обратныйhMITF-reverse 5’- CTTATAAAATCCCTGCTGCCGT -3’5’- CTTATAAAATCCCTGCTGCCGT -3’ SEQ ID NO: 21SEQ ID NO: 21 hTYR-прямойhTYR-straight 5’- GGATAGCGGATGCCTCTCAA -3’5’- GGATAGCGGATGCCCTCTCAA -3’ SEQ ID NO: 22SEQ ID NO: 22 hTYR-обратныйhTYR-reverse 5’- GGAGCCACTGCTCAAAAATAC -3’5’- GGAGCCACTGCTCAAAAATAC -3’ SEQ ID NO: 23SEQ ID NO: 23 hTYRP1-прямойhTYRP1-direct 5’- CCACAGCCCTCAGTATCCC -3’5’- CCACAGCCCTCAGTATCCC -3’ SEQ ID NO: 24SEQ ID NO: 24 hTYRP1-обратныйhTYRP1-reverse 5’- CAGCTCCTCTCCAGCCAG -3’5’- CAGCTCCTCTCCAGCCAG -3’ SEQ ID NO: 25SEQ ID NO: 25 hTYRP2-прямойhTYRP2-direct 5’- TCGGATGTACAACATGGTTCC -3’5’- TCGGATGTACAACATGGTTCC -3’ SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 26 hTYRP2-обратныйhTYRP2-reverse 5’- CCAACCTGGAGTTTCTTCAAC -3’5’- CCAACCTGGAGTTTCTTCAAC -3’ SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 27 hRPL13A-прямойhRPL13A-straight 5’- CCAGCAATCAAGTTTGCCTA -3’5’- CCAGCAATCAAGTTTGCCTA -3’ SEQ ID NO: 28SEQ ID NO: 28 hRPL13A-обратныйhRPL13A-reverse 5’- GTGGTGGTGGTGGTAATTCA -3’5’- GTGGTGGTGGTGGTAATTCA -3’

Таким образом, было подтверждено, что экспрессия генов TYR, TYRP1 и TYRP2, которые представляют собой ферменты, непосредственно участвующие в синтезе меланина в меланосомах, увеличилась с помощью 9 мкрРНК (фиг. 4). В случае MITF, который является фактором транскрипции, наблюдалось слабое увеличение или отсутствие изменения экспрессии гена. Полагают, что это связано с наличием механизма регуляции MITF, влияющего не только на экспрессию генов, но также на стабильность и активность белка.Thus, it was confirmed that the expression of TYR, TYRP1 and TYRP2 genes, which are enzymes directly involved in melanin synthesis in melanosomes, was increased by 9 miRNAs (Fig. 4). In the case of MITF, which is a transcription factor, little or no increase in gene expression was observed. This is believed to be due to the presence of a regulatory mechanism called MITF, which affects not only gene expression, but also protein stability and activity.

2-4. Анализ путей передачи сигналов, которые опосредуют меланогенез, с помощью кПЦР-РВ в меланоцитах человека2-4. Analysis of signaling pathways that mediate melanogenesis using qRT-PCR in human melanocytes

Экспрессию генов MITF, TYR, TYRP1 и TYRP2 с помощью 9 мкрРНК анализировали с применением эпидермальных меланоцитов человека, полученных из ткани кожи человека дикого типа. Эпидермальные меланоциты человека (Invitrogen, США) распределяли по 1×105 клеток/лунку в 12-луночный планшет (Falcon, США) с последующим культивированием при 37°C/5% CO2 в культуре клеток млекопитающих/культуре первичных клеток (Gibco, США), содержащий добавку-2 для роста меланоцитов человека (Gibco, США). На следующий день клетки обрабатывали каждой из miR-8485, miR-7978, miR-6074, miR-3132, miR-4644, miR-3139, miR-3189, miR-3199 и miR-933 при концентрации 5 мкМ. После культивирования в течение 96 часов общую РНК экстрагировали из клеточного лизата с применением набора Universal RNA extraction kit (Bioneer, KR) и, используя эту РНК в качестве матрицы, анализировали уровни экспрессии мРНК генов (набор Human qPCR panel kit, Bioneer, KR) и RPL13A (набор Human reference qPCR primer set, Bioneer, KR) с помощью кПЦР-РВ с применением AccuPower GreenStar™ qRT-PCR Master Mix (Bioneer, KR) в соответствии с протоколом изготовителя.Expression of the MITF, TYR, TYRP1 and TYRP2 genes by 9 miRNAs was analyzed using human epidermal melanocytes obtained from wild-type human skin tissue. Human epidermal melanocytes (Invitrogen, USA) were distributed at 1×10 5 cells/well in a 12-well plate (Falcon, USA), followed by cultivation at 37°C/5% CO 2 in mammalian cell culture/primary cell culture (Gibco, USA), containing additive-2 for the growth of human melanocytes (Gibco, USA). The next day, cells were treated with each of miR-8485, miR-7978, miR-6074, miR-3132, miR-4644, miR-3139, miR-3189, miR-3199, and miR-933 at a concentration of 5 μM. After culturing for 96 hours, total RNA was extracted from the cell lysate using the Universal RNA extraction kit (Bioneer, KR) and, using this RNA as a template, gene mRNA expression levels were analyzed (Human qPCR panel kit, Bioneer, KR) and RPL13A (Human reference qPCR primer set, Bioneer, KR) by qRT-PCR using AccuPower GreenStar™ qRT-PCR Master Mix (Bioneer, KR) according to the manufacturer's protocol.

Таким образом, в меланоцитах человека дикого типа, в отличие от результатов для клеток меланомы М21, экспрессия гена MITF с применением miR-8485, miR-7978, miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-933 увеличилась примерно в 1,2-1,7 раз по сравнению с группой отрицательного контроля. Кроме того, экспрессия TYR увеличилась примерно в 1,2-3,1 раза с применением 9 мкрРНК. Для TYRP1 и TYRP2 различия в паттернах экспрессии наблюдались для каждой из 9 мкрРНК. Для miR-8485, miR-7978, miR-3189, miR-3199 и miR-933, экспрессия как TYRP1, так и TYRP2 имела тенденцию к увеличению, а для miR-6074, miR-3139 и miR-4644 увеличилась только экспрессия TYRP2 (фиг. 5).Thus, in wild-type human melanocytes, in contrast to the results for M21 melanoma cells, MITF gene expression using miR-8485, miR-7978, miR-3139, miR-3189, miR-3199 or miR-933 increased by approximately 1 .2-1.7 times compared to the negative control group. In addition, TYR expression increased approximately 1.2- to 3.1-fold with 9 miRNAs. For TYRP1 and TYRP2, differences in expression patterns were observed for each of the 9 miRNAs. For miR-8485, miR-7978, miR-3189, miR-3199 and miR-933, the expression of both TYRP1 and TYRP2 tended to increase, while for miR-6074, miR-3139 and miR-4644 only the expression of TYRP2 increased (Fig. 5).

2-5. Анализ путей передачи сигналов, которые опосредуют меланогенез, с помощью вестерн-блоттинга в клетках SK-MEL-282-5. Analysis of signal transduction pathways that mediate melanogenesis using Western blotting in SK-MEL-28 cells

Вестерн-блоттинг проводили для анализа экспрессии белков MITF и TYR, которые являются важными факторами в процессе меланогенеза. Клетки SK-MEL-28 распределяли по 1×105 клеток/лунку в 6-луночный планшет (Falcon, США) и затем культивировали при 37°C/5% CO2. На следующий день клетки SK-MEL-28 трансфицировали каждой из miR-3139, miR-3189, miR-3199 и miR-8485 с помощью способа по примеру 2-1. После культивирования в течение 96 часов проводили анализ в соответствии с протоколом вестерн-блоттинга. В качестве первичных антител использовали MITF (Santa Cruz Biotechnology, Inc, США) и тирозиназу (Santa Cruz Biotechnology, Inc, США), а HRP-связанный анти-мышиный IgG (Cell Signaling Technology, США) и HRP-связанный анти-кроличий IgG (Cell Signaling Technology, США) использовали в качестве вторичных антител.Western blotting was performed to analyze the protein expression of MITF and TYR, which are important factors in the process of melanogenesis. SK-MEL-28 cells were distributed at 1×10 5 cells/well in a 6-well plate (Falcon, USA) and then cultured at 37°C/5% CO 2 . The next day, SK-MEL-28 cells were transfected with each of miR-3139, miR-3189, miR-3199 and miR-8485 using the method of Example 2-1. After culturing for 96 hours, analysis was performed according to the Western blotting protocol. MITF (Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA) and tyrosinase (Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA) were used as primary antibodies, and HRP-linked anti-mouse IgG (Cell Signaling Technology, USA) and HRP-linked anti-rabbit IgG (Cell Signaling Technology, USA) were used as secondary antibodies.

Таким образом, было подтверждено, что экспрессия белков MITF и TYR увеличилась с применением 9 мкрРНК, как и результаты кПЦР-РВ, представленные выше (фиг. 6). На основании результатов изменения окрашивания клеток, количества синтезированного меланина и экспрессии основных генов и белков в меланогенезе с обработкой выбранными лучшими 9 мкрРНК, были окончательно отобраны 4 типа miR-3139, miR-3189, miR-3199 и miR-8485 с самым высоким количеством синтезированного меланина и четкой экспрессией генов и белков MITF, TYR и TYRP1/2 (таблица 5).Thus, it was confirmed that the expression of MITF and TYR proteins increased with 9 miRNAs, similar to the qRT-PCR results presented above (Fig. 6). Based on the results of changes in cell staining, the amount of synthesized melanin and the expression of major genes and proteins in melanogenesis with treatment with the selected top 9 miRNAs, 4 types miR-3139, miR-3189, miR-3199 and miR-8485 with the highest amount of synthesized were finally selected melanin and clear expression of MITF, TYR and TYRP1/2 genes and proteins (Table 5).

Таблица 5. Окончательно отобранные 4 последовательности мкрРНКTable 5. Final selected 4 miRNA sequences SEQ ID NO:9SEQ ID NO:9 hsa-miR-3139hsa-miR-3139 Цепь 1Chain 1 CAGGCAUCUGUUGAGCUCCUAUUCAGGCAUCUGUUGAGCUCCUAUU SEQ ID NO:10SEQ ID NO:10 hsa-miR-3139hsa-miR-3139 Цепь 2Chain 2 UAGGAGCUCAACAGAUGCCUGUUUAGGAGCUCAACAGAUGCCUGUU SEQ ID NO:5SEQ ID NO:5 hsa-miR-3189hsa-miR-3189 Цепь 1Chain 1 UGCCCCAUCUGUGCCCUGGGUAGGAUGCCCCAUCUGUGCCCUGGGUAGGA SEQ ID NO:6SEQ ID NO:6 hsa-miR-3189hsa-miR-3189 Цепь 2Chain 2 CCCUUGGGUCUGAUGGGGUAGCCCUUGGGUCUGAUGGGGUAG SEQ ID NO:15SEQ ID NO:15 hsa-miR-3199hsa-miR-3199 Цепь 1Chain 1 CUUUCUCCUAAGGCAGUCCCUUUCUUUCUCCUAAGGCAGUCCCUUU SEQ ID NO:16SEQ ID NO:16 hsa-miR-3199hsa-miR-3199 Цепь 2Chain 2 AGGGACUGCCUUAGGAGAAAGUUAGGGACUGCCUUAGGAGAAAGUU SEQ ID NO:1SEQ ID NO:1 hsa-miR-8485hsa-miR-8485 Цепь 1Chain 1 ACGUGUGUGUGUGUGUGUGUUACGUGUGUGUGUGUGUGUGUU SEQ ID NO:2SEQ ID NO:2 hsa-miR-8485hsa-miR-8485 Цепь 2Chain 2 CACACACACACACACACGUAUCACACACACACACACACGUAU

Пример 3. Оценка меланогенной функции окончательно отобранных 4 мкрРНК на выщипанных седых волосах человекаExample 3. Assessment of melanogenic function of the final selected 4 miRNAs on plucked gray human hair

Меланогенную функцию оценивали на выщипанных седых волосах человека с применением окончательно отобранных 4 мкрРНК. Волосы собирали путем выдергивания седых волос с их кончиков в день эксперимента, и волосы отрезали на расстоянии примерно 1-2 см от корня волоса и культивировали в 200 мкл среды DMEM/F12 (Gibco, США) с добавлением 10% ФБС (Hyclone, США) и 1% пенициллина-стрептомицина (Hyclone, США) в 24-луночном планшете (Falcon, США). Выщипанные седые волосы обрабатывали каждой из 4 мкрРНК при концентрации 5 мкМ в течение 35 дней с 2-дневными интервалами, и наблюдали за пролиферацией первичных клеток, происходящих из волосяного фолликула, изменением цвета волос и появлением седых волос.Melanogenic function was assessed in human plucked gray hairs using the final selected 4 miRNAs. Hairs were collected by plucking gray hairs from their ends on the day of the experiment, and the hairs were cut at a distance of approximately 1-2 cm from the hair root and cultured in 200 μl of DMEM/F12 medium (Gibco, USA) supplemented with 10% FBS (Hyclone, USA) and 1% penicillin-streptomycin (Hyclone, USA) in a 24-well plate (Falcon, USA). Plucked gray hairs were treated with each of the 4 miRNAs at a concentration of 5 μM for 35 days at 2-day intervals, and the proliferation of primary hair follicle-derived cells, hair color change, and the appearance of gray hair were observed.

Таким образом, в необработанных седых волосах в течение периода лечения не было значительных изменений, но у обработанных miR-3139, miR-3189, miR-3199 или miR-8485 седых волос внешняя корневая оболочка волосяных фолликулов со временем расширялись, и наблюдалась повышенная пролиферация или миграция первичных клеток, происходящих из волосяных фолликулов, включая клетки дермальной папиллы, меланоциты и кератиноциты, а также увеличение длины волосяных фолликулов (фиг. 7). Кроме того, было подтверждено, что седой волосяной фолликул постепенно менялся на коричневый цвет (фиг. 8).In summary, there was no significant change in untreated gray hairs during the treatment period, but in miR-3139, miR-3189, miR-3199, or miR-8485-treated gray hairs, the outer root sheath of hair follicles expanded over time and exhibited increased proliferation or migration of primary cells derived from hair follicles, including dermal papilla cells, melanocytes and keratinocytes, and increase in hair follicle length (Fig. 7). In addition, it was confirmed that the gray hair follicle gradually changed to a brown color (Fig. 8).

Пример 4. Оценка меланогенной функции SAMiRNA-miR-3199 в клетках SK-MEL-28Example 4. Evaluation of the melanogenic function of SAMiRNA-miR-3199 in SK-MEL-28 cells

4-1. Клеточная культура и обработка с применением SAMiRNA-miR-31994-1. Cell culture and treatment using SAMiRNA-miR-3199

SK-MEL-28 (Корейский банк клеточных линий, KR), которая представляет собой клеточную линию рака кожи человеческого происхождения, использовали для оценки эффекта SAMiRNA-miR-3199 на стимулирование меланогенеза. Клетки SK-MEL-28 культивировали при 37°C/5% CO2 в МЕМ (Hyclone, США) с добавлением 10% ФБС (Hyclone, США) и 1% пенициллина-стрептомицина (Hyclone, США). Клетки SK-MEL-28 распределяли по 4×104 клеток/лунку в 12-луночный планшет (Falcon, США), а затем на следующий день обрабатывали при концентрации 5 мкМ.SK-MEL-28 (Korea Cell Line Bank, KR), which is a skin cancer cell line of human origin, was used to evaluate the effect of SAMiRNA-miR-3199 on promoting melanogenesis. SK-MEL-28 cells were cultured at 37°C/5% CO 2 in MEM (Hyclone, USA) supplemented with 10% FBS (Hyclone, USA) and 1% penicillin-streptomycin (Hyclone, USA). SK-MEL-28 cells were distributed at 4×10 4 cells/well in a 12-well plate (Falcon, USA) and then treated at a concentration of 5 μM the next day.

4-2. Анализ количества меланина, вырабатываемого при обработке SAMiRNA-miR-31994-2. Analysis of the amount of melanin produced by SAMiRNA-miR-3199 treatment

Клетки SK-MEL-28 обрабатывали SAMiRNA-miR-3199 с помощью способа по примеру 4-1. После культивирования в течение 72 часов все клетки собирали и наблюдали за изменением окрашивания. Для измерения количества вырабатываемого меланина реакцию проводили в 1 М растворе NaOH (Bioneer, KR) в течение 2 часов при 37°C в соответствии с протоколом экстракции меланина, после чего измеряли поглощение при длине волны 405 нм и, таким образом, анализировали количество вырабатываемого меланина.SK-MEL-28 cells were treated with SAMiRNA-miR-3199 using the method of Example 4-1. After culture for 72 hours, all cells were harvested and color changes were observed. To measure the amount of melanin produced, the reaction was carried out in 1 M NaOH solution (Bioneer, KR) for 2 hours at 37°C according to the melanin extraction protocol, after which the absorbance was measured at a wavelength of 405 nm and thus the amount of melanin produced was analyzed .

Таким образом, при обработке SAMiRNA-miR-3199 наблюдалось четкое изменение окрашивания и увеличение количества меланина по сравнению с отрицательным контролем (фиг. 9a).Thus, upon treatment with SAMiRNA-miR-3199, a clear change in staining and an increase in the amount of melanin was observed compared to the negative control (Fig. 9a).

4-3. Анализ сигнальных путей меланогенеза при обработке SAMiRNA-miR-31994-3. Analysis of melanogenesis signaling pathways upon treatment with SAMiRNA-miR-3199

кПЦР-РВ проводили для анализа меланогенных генов MITF, TYR, TYRP1 и TYRP2 с обработкой SAMiRNA-miR-3199. Клетки SK-MEL-28 обрабатывали SAMiRNA-miR-3199 с помощью способа по примеру 4-1. После культивирования в течение 96 часов общую РНК экстрагировали из клеточного лизата с применением набора Universal RNA extraction kit (Bioneer, KR), и, используя эту РНК в качестве матрицы, анализировали уровни экспрессии мРНК генов (Human qPCR panel kit, Bioneer, KR) и RPL13A (Human reference qPCR primer set, Bioneer, KR) с помощью кПЦР-РВ с применением AccuPower GreenStar™ qRT-PCR Master Mix (Bioneer, KR) в соответствии с протоколом изготовителя. Значения Ct двух генов, полученные массовой кПЦР, подвергали относительной количественной оценке с помощью метода типа «два дельта Ct» [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec; 25(4):4 02-8], в результате чего рассчитывали относительное количество (кратное изменение) мРНК каждого гена в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой.qRT-PCR was performed to analyze the melanogenic genes MITF, TYR, TYRP1 and TYRP2 with SAMiRNA-miR-3199 treatment. SK-MEL-28 cells were treated with SAMiRNA-miR-3199 using the method of Example 4-1. After culturing for 96 hours, total RNA was extracted from the cell lysate using a Universal RNA extraction kit (Bioneer, KR), and using this RNA as a template, gene mRNA expression levels were analyzed (Human qPCR panel kit, Bioneer, KR) and RPL13A (Human reference qPCR primer set, Bioneer, KR) by qRT-PCR using AccuPower GreenStar™ qRT-PCR Master Mix (Bioneer, KR) according to the manufacturer's protocol. The Ct values of the two genes obtained by bulk qPCR were subjected to relative quantification using the two-delta Ct method [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec; 25(4):4 02-8], as a result of which the relative amount (fold change) of mRNA of each gene in the experimental group was calculated compared to the control group.

Таким образом, было подтверждено, что экспрессия MITF, который является ключевым фактором транскрипции для синтеза меланина, была значительно увеличена при обработке SAMiRNA-miR-3199, а также была значительно увеличена экспрессия генов TYR, TYRP1 и TYRP2, которые являются ключевыми ферментами для синтеза меланина (фиг. 9b).In summary, it was confirmed that the expression of MITF, which is a key transcription factor for melanin synthesis, was significantly increased by SAMiRNA-miR-3199 treatment, and the expression of TYR, TYRP1 and TYRP2 genes, which are key enzymes for melanin synthesis, was also significantly increased. (Fig. 9b).

4-4. Анализ экспрессии меланогенного белка при обработке SAMiRNA-miR-31994-4. Analysis of melanogenic protein expression upon treatment with SAMiRNA-miR-3199

Иммуноблотинг проводили для анализа экспрессии белков MITF и TYR, которые являются ключевыми факторами меланогенеза. Клетки SK-MEL-28 распределяли по 1×105 клеток/лунку в 6-луночный планшет (Falcon, США) и затем культивировали при 37°C/5% CO2. На следующий день клетки SK-MEL-28 обрабатывали SAMiRNA-miR-3199. После культивирования в течение 96 часов проводили анализ в соответствии с протоколом иммуноблоттинга. В качестве первичных антител использовали MITF (Santa Cruz Biotechnology, Inc, US), тирозиназу (Santa Cruz Biotechnology, Inc, US) и альфа-тубулин (Cell Signaling Technology, US), а в качестве вторичных антител использовали HRP-связанный анти-мышиный IgG (Cell Signaling Technology, US) и HRP-связанный анти-кроличий IgG (Cell Signaling Technology, US).Immunoblotting was performed to analyze the expression of MITF and TYR proteins, which are key factors in melanogenesis. SK-MEL-28 cells were distributed at 1×10 5 cells/well in a 6-well plate (Falcon, USA) and then cultured at 37°C/5% CO 2 . The next day, SK-MEL-28 cells were treated with SAMiRNA-miR-3199. After culturing for 96 hours, analysis was performed according to the immunoblotting protocol. MITF (Santa Cruz Biotechnology, Inc, US), tyrosinase (Santa Cruz Biotechnology, Inc, US) and alpha-tubulin (Cell Signaling Technology, US) were used as primary antibodies, and HRP-linked anti-mouse was used as secondary antibodies. IgG (Cell Signaling Technology, US) and HRP-linked anti-rabbit IgG (Cell Signaling Technology, US).

Таким образом, было подтверждено, что экспрессия белков MITF и TYR значительно увеличилась при обработке SAMiRNA-miR-3199, как в случае результатов анализа экспрессии генов с помощью кПЦР-РВ (фиг. 9c).Therefore, it was confirmed that the protein expression of MITF and TYR was significantly increased by SAMiRNA-miR-3199 treatment, as was the case in the results of gene expression analysis by qRT-PCR (Fig. 9c).

4-5. Анализ внутриклеточной экспрессии меланогенного белка при обработке SAMiRNA-miR-31994-5. Analysis of intracellular expression of melanogenic protein upon treatment with SAMiRNA-miR-3199

Иммуноцитохимический анализ проводили для анализа внутриклеточной экспрессии белков MITF и TYR, которые являются ключевыми факторами меланогенеза. Перед распределением клеток покровное стекло помещали в 12-луночный планшет (Falcon, US) и покрывали поли-L-лизином (Sigma, US) на 1 час, после чего клетки SK-MEL-28 распределяли при 2×104 клеток/лунку и культивировали при 37°C/5% CO2. На следующий день клетки SK-MEL-28 обрабатывали SAMiRNA-miR-3199 с помощью способа по примеру 4-1. После культивирования в течение 96 часов реакцию проводили в 0,1% растворе Triton-X100 в течение 10 минут для пермеабилизации клеток, а затем блокировали в растворе, содержащем 1% БСА (Sigma, US) в течение 1 часа. Здесь, MITF (Abcam, UK) и тирозиназу (Santa Cruz Biotechnology, Inc, US) использовали в качестве первичных антител, а в качестве вторичных антител использовали антитела против IgG мыши, конъюгированные с Alexa Fluor 594 (Cell Signaling Technology, US), и антитела против IgG кролика, конъюгированные с Alexa Fluor 488 (Cell Signaling Technology, US). Для флуоресцентного анализа окрашенных клеток изображения анализировали с применением конфокального микроскопа с вращающимся диском (Dragonfly high-speed confocal image platform, Andor).Immunocytochemical analysis was performed to analyze the intracellular expression of MITF and TYR proteins, which are key factors in melanogenesis. Before spreading the cells, the coverslip was placed in a 12-well plate (Falcon, US) and coated with poly-L-lysine (Sigma, US) for 1 hour, after which the SK-MEL-28 cells were spread at 2×10 4 cells/well and cultured at 37°C/5% CO 2 . The next day, SK-MEL-28 cells were treated with SAMiRNA-miR-3199 using the method of Example 4-1. After culture for 96 hours, the reaction was performed in 0.1% Triton-X100 for 10 minutes to permeabilize the cells and then blocked in a solution containing 1% BSA (Sigma, US) for 1 hour. Here, MITF (Abcam, UK) and tyrosinase (Santa Cruz Biotechnology, Inc, US) were used as primary antibodies, and Alexa Fluor 594-conjugated anti-mouse IgG (Cell Signaling Technology, US) was used as secondary antibodies, and anti-rabbit IgG antibodies conjugated to Alexa Fluor 488 (Cell Signaling Technology, US). For fluorescence analysis of stained cells, images were analyzed using a spinning disk confocal microscope (Dragonfly high-speed confocal image platform, Andor).

Таким образом, было подтверждено, что с обработкой с применением SAMiRNA-miR-3199 экспрессия MITF, который является фактором транскрипции, значительно увеличилась в ядре, и экспрессия TYR, которая является ключевым ферментом для синтеза меланина, значительно увеличилась в цитоплазме с меланосомами (фиг. 9d).Thus, it was confirmed that with SAMiRNA-miR-3199 treatment, the expression of MITF, which is a transcription factor, was significantly increased in the nucleus, and the expression of TYR, which is a key enzyme for melanin synthesis, was significantly increased in the cytoplasm with melanosomes (Fig. 9d).

Пример 5. Анализ механизма меланогенеза SAMiRNA-miR-3199Example 5. Analysis of the mechanism of melanogenesis SAMiRNA-miR-3199

5-1. Идентификация целевого гена miR-31995-1. Identification of miR-3199 target gene

Среди многих генов, которые согласно прогнозам с применением программы прогнозирования генов-мишеней мкрРНК (TargetScan, http://www/targetscan.org/) могут связываться с затравочной последовательностью miR-3199, был выбран ген GSK3β, известный как ключевая сигнальная молекула в меланогенезе. Было предсказано связывание miR-3199 с 4153-4159 3'-UTR GSK3β (фиг. 10а).Among the many genes predicted by the miRNA target gene prediction program (TargetScan, http://www/targetscan.org/) to bind to the miR-3199 seed sequence, the GSK3β gene, known as a key signaling molecule in melanogenesis, was selected . miR-3199 was predicted to bind to 4153–4159 3′-UTR of GSK3β (Fig. 10a).

5-2. Анализ ингибирующих эффектов SAMiRNA-miR-3199 на мРНК GSK3β5-2. Analysis of the inhibitory effects of SAMiRNA-miR-3199 on GSK3β mRNA

кПЦР-РВ проводили для анализа воздействия SAMiRNA-miR-3199 на ингибирование мРНК гена-мишени GSK3β. Клетки SK-MEL-28 распределяли по 4×104 клеток/лунку в 12-луночный планшет (Falcon, US) и затем культивировали при 37°C/5% CO2. На следующий день клетки SK-MEL-28 обрабатывали SAMiRNA-miR-3199 с помощью способа по примеру 4-1. После культивирования в течение 24 часов общую РНК экстрагировали из клеточного лизата с применением набора Universal RNA extraction kit (Bioneer, KR), и, используя эту РНК в качестве матрицы, анализировали уровни экспрессии мРНК GSK3β (Bioneer, KR) и RPL13A (Human reference qPCR primer set, Bioneer, KR) с помощью кПЦР-РВ с применением AccuPower GreenStar™ qRT-PCR Master Mix (Bioneer, KR) в соответствии с протоколом изготовителя. Значения Ct двух генов, полученные массовой кПЦР, подвергали относительной количественной оценке с помощью метода типа «два дельта Ct» [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec; 25(4):4 02-8], в результате чего рассчитывали относительное количество (кратное изменение) мРНК каждого гена в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой. Ниже показаны последовательности праймеров для GSK3β (таблица 6).qRT-PCR was performed to analyze the effect of SAMiRNA-miR-3199 on mRNA inhibition of the target gene GSK3β. SK-MEL-28 cells were distributed at 4x10 4 cells/well in a 12-well plate (Falcon, US) and then cultured at 37°C/5% CO 2 . The next day, SK-MEL-28 cells were treated with SAMiRNA-miR-3199 using the method of Example 4-1. After culture for 24 hours, total RNA was extracted from the cell lysate using the Universal RNA extraction kit (Bioneer, KR), and using this RNA as a template, the expression levels of GSK3β (Bioneer, KR) and RPL13A mRNA were analyzed (Human reference qPCR primer set, Bioneer, KR) by qRT-PCR using AccuPower GreenStar™ qRT-PCR Master Mix (Bioneer, KR) according to the manufacturer's protocol. The Ct values of the two genes obtained by bulk qPCR were subjected to relative quantification using the two-delta Ct method [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec; 25(4):4 02-8], as a result of which the relative amount (fold change) of mRNA of each gene in the experimental group was calculated compared to the control group. The primer sequences for GSK3β are shown below (Table 6).

Таблица 6. Последовательности праймеров для GSK3β человекаTable 6. Primer sequences for human GSK3β hGSK3β-прямойhGSK3β-direct 5’- GCAGCATGAAAGTTAGCAGAG -3’ (SEQ ID NO: 29)5’- GCAGCATGAAAGTTAGCAGAG -3’ (SEQ ID NO: 29) hGSK3β-обратныйhGSK3β-reverse 5’- TGACTTCTTGTGGCCTGTC -3’ (SEQ ID NO: 30)5’- TGACTTCTTGTGGCCTGTC -3’ (SEQ ID NO: 30)

Таким образом, было подтверждено, что экспрессия гена-мишени GSK3β значительно снижалась при обработке SAMiRNA-miR-3199 (фиг. 10b).Therefore, it was confirmed that the expression of the target gene GSK3β was significantly decreased by SAMiRNA-miR-3199 treatment (Fig. 10b).

5-3. Анализ ингибирующих эффектов SAMiRNA-miR-3199 на белок GSK3β5-3. Analysis of the inhibitory effects of SAMiRNA-miR-3199 on GSK3β protein

Чтобы проанализировать эффекты SAMiRNA-miR-3199 на ингибирование белка GSK3β, проводили иммуноблоттинг. Клетки SK-MEL-28 распределяли по 1×105 клеток/лунку в 6-луночный планшет (Falcon, US) и затем культивировали при 37°C/5% CO2. Клетки SK-MEL-28 обрабатывали SAMiRNA-miR-3199 с помощью способа по примеру 4-1. После культивирования в течение 96 часов проводили анализ в соответствии с протоколом иммуноблоттинга. GSK3β (Cell Signaling Technology, Inc, US), бета-катенин (Becton, Dickinson and Company Inc, US) и альфа-тубулин (Cell Signaling Technology, US) использовали в качестве первичных антител, а в качестве вторичных антител использовали HRP-связанный анти-мышиный IgG (Cell Signaling Technology, US) и HRP-связанный анти-кроличий IgG (Cell Signaling Technology, US).To analyze the effects of SAMiRNA-miR-3199 on the inhibition of GSK3β protein, immunoblotting was performed. SK-MEL-28 cells were distributed at 1×10 5 cells/well in a 6-well plate (Falcon, US) and then cultured at 37°C/5% CO 2 . SK-MEL-28 cells were treated with SAMiRNA-miR-3199 using the method of Example 4-1. After culturing for 96 hours, analysis was performed according to the immunoblotting protocol. GSK3β (Cell Signaling Technology, Inc, US), beta-catenin (Becton, Dickinson and Company Inc, US) and alpha-tubulin (Cell Signaling Technology, US) were used as primary antibodies, and HRP-linked was used as secondary antibodies. anti-mouse IgG (Cell Signaling Technology, US) and HRP-linked anti-rabbit IgG (Cell Signaling Technology, US).

Таким образом, было подтверждено, что экспрессия белка GSK3β снижалась при обработке SAMiRNA-miR-3199, как и результаты анализа экспрессии гена GSK3β с помощью кПЦР-РВ. GSK3β фосфорилирует бета-катенин, чтобы способствовать деградации белка, снижая стабильность белка, а когда экспрессия GSK3β ингибируется, стабильность белка бета-катенина повышается. Следовательно, было подтверждено, что экспрессия белка бета-катенина повышалась при обработке SAMiRNA-miR-3199 (фиг. 10c).Therefore, it was confirmed that the protein expression of GSK3β was decreased by SAMiRNA-miR-3199 treatment, similar to the results of GSK3β gene expression analysis by qRT-PCR. GSK3β phosphorylates beta-catenin to promote protein degradation, reducing protein stability, and when GSK3β expression is inhibited, beta-catenin protein stability is increased. Therefore, it was confirmed that beta-catenin protein expression was increased by SAMiRNA-miR-3199 treatment (Fig. 10c).

5-4. Анализ внутриклеточной экспрессии белка GSK3β при обработке SAMiRNA-miR-31995-4. Analysis of intracellular GSK3β protein expression upon treatment with SAMiRNA-miR-3199

Иммуноцитохимический анализ проводили для анализа внутриклеточной экспрессии белка GSK3β с обработкой SAMiRNA-miR-3199. Перед распределением клеток покровное стекло помещали в 12-луночный планшет (Falcon, US) и покрывали поли-L-лизином (Sigma, US) на 1 час, после чего клетки SK-MEL-28 распределяли по 2×104 клеток/лунку и культивировали при 37°C/5% CO2. На следующий день клетки SK-MEL-28 обрабатывали SAMiRNA-miR-3199 с помощью способа по примеру 4-1. После культивирования в течение 48 часов реакцию проводили в 0,1% растворе Triton-X100 в течение 10 минут для пермеабилизации клеток с последующей блокировкой в растворе, содержащем 1% БСА, в течение 1 часа. Здесь, в качестве первичных антител использовали GSK3β (Cell Signaling Technology, Inc, US) и бета-катенин (Becton, Dickinson and Company Inc, US), а в качестве вторичных антител использовали антитела против IgG мыши, конъюгированные с Alexa Fluor 594 (Cell Signaling Technology, US), и антитела против IgG кролика, конъюгированные с Alexa Fluor 488 (Cell Signaling Technology, US). Для флуоресцентного анализа окрашенных клеток изображения анализировали с применением конфокального микроскопа с вращающимся диском (Dragonfly high-speed confocal image platform, Andor).Immunocytochemical analysis was performed to analyze the intracellular protein expression of GSK3β with SAMiRNA-miR-3199 treatment. Before cell distribution, the coverslip was placed in a 12-well plate (Falcon, US) and coated with poly-L-lysine (Sigma, US) for 1 hour, after which SK-MEL-28 cells were distributed at 2×10 4 cells/well and cultured at 37°C/5% CO 2 . The next day, SK-MEL-28 cells were treated with SAMiRNA-miR-3199 using the method of Example 4-1. After culture for 48 hours, the reaction was performed in 0.1% Triton-X100 for 10 minutes to permeabilize the cells, followed by blocking in a solution containing 1% BSA for 1 hour. Here, GSK3β (Cell Signaling Technology, Inc, US) and beta-catenin (Becton, Dickinson and Company Inc, US) were used as primary antibodies, and anti-mouse IgG conjugated to Alexa Fluor 594 (Cell) was used as secondary antibodies. Signaling Technology, US), and anti-rabbit IgG antibodies conjugated to Alexa Fluor 488 (Cell Signaling Technology, US). For fluorescence analysis of stained cells, images were analyzed using a spinning disk confocal microscope (Dragonfly high-speed confocal image platform, Andor).

Таким образом, было подтверждено, что экспрессия гена-мишени GSK3β снижалась при обработке SAMiRNA-miR-3199, а также значительно повышалась экспрессия белка бета-катенина в ядре и цитоплазме (фиг. 10d).Therefore, it was confirmed that the expression of the target gene GSK3β was decreased by SAMiRNA-miR-3199 treatment, and the protein expression of beta-catenin in the nucleus and cytoplasm was significantly increased (Fig. 10d).

5-5. Анализ прямого связывания SAMiRNA-miR-3199 с 3’-UTR мРНК GSK3β5-5. Analysis of direct binding of SAMiRNA-miR-3199 to the 3'-UTR of GSK3β mRNA

Чтобы проанализировать, связывается ли miR-3199 напрямую с 3'-UTR мРНК GSK3β, был проведен анализ репортера люциферазы. Клетки SK-MEL-28 распределяли по 3×104 клеток/лунку в 12-луночный планшет (Falcon, US) и затем культивировали при 37°C/5% CO2. На следующий день клетки SK-MEL-28 трансфицировали конструкциями, в которые были вставлены GSK3β-дикого типа (WT) с сайтом связывания GSK3β дикого типа или GSK3β-мутант (MT) с мутированным сайтом связывания GSK3β с применением Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, US). Одновременно клетки обрабатывали SAMiRNA-miR-3199. После культивирования в течение 96 часов активность люциферазы измеряли и анализировали в соответствии с протоколом изготовителя с применением Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega™ Corporation, US).To analyze whether miR-3199 directly binds to the 3′-UTR of GSK3β mRNA, a luciferase reporter assay was performed. SK-MEL-28 cells were distributed at 3x10 4 cells/well in a 12-well plate (Falcon, US) and then cultured at 37°C/5% CO 2 . The next day, SK-MEL-28 cells were transfected with constructs inserted into either GSK3β-wild-type (WT) with a wild-type GSK3β binding site or GSK3β-mutant (MT) with a mutated GSK3β binding site using Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, US) . Simultaneously, cells were treated with SAMiRNA-miR-3199. After culture for 96 hours, luciferase activity was measured and analyzed according to the manufacturer's protocol using the Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega™ Corporation, US).

Таким образом, было подтверждено, что когда клетки, экспрессирующие GSK3β-WT с сайтом связывания дикого типа, обрабатывали SAMiRNA-miR-3199, активность люциферазы значительно снижалась, и не было изменений в активности люциферазы при обработке SAMiRNA-miR-3199 в клетках, экспрессирующих GSK3β-MT с мутантным сайтом связывания (фиг. 10е). Это указывает на то, что miR-3199 ингибировала GSK3β путем прямого связывания с 3'-UTR (4153-4159) мРНК GSK3β.Thus, it was confirmed that when cells expressing GSK3β-WT with a wild-type binding site were treated with SAMiRNA-miR-3199, luciferase activity was significantly reduced, and there was no change in luciferase activity when treated with SAMiRNA-miR-3199 in cells expressing GSK3β-MT with a mutated binding site (Fig. 10e). This indicated that miR-3199 inhibited GSK3β by directly binding to the 3′-UTR (4153–4159) of GSK3β mRNA.

Пример 6. Оценка меланогенной функции SAMiRNA-miR-3199 в меланоцитах человекаExample 6. Evaluation of melanogenic function of SAMiRNA-miR-3199 in human melanocytes

6-1. Клеточная культура и обработка SAMiRNA-miR-31996-1. Cell culture and treatment of SAMiRNA-miR-3199

Эпидермальные меланоциты человека (HEMs, Invitrogen, US), полученные из ткани кожи человека дикого типа, использовали для оценки эффективности SAMiRNA-miR-3199 в отношении стимулирования меланогенеза. HEM культивировали при 37°C/5% CO2 в культуре клеток млекопитающих/первичной среде для культивирования клеток (Gibco, US), содержащей добавку-2 для роста меланоцитов (Gibco, US). HEM распределяли по 1×105 клеток/лунку в 12-луночный планшет (Falcon, US) и на следующий день обрабатывали SAMiRNA-miR-3199 при концентрации 5 мкМ.Human epidermal melanocytes (HEMs, Invitrogen, US), derived from wild-type human skin tissue, were used to evaluate the efficacy of SAMiRNA-miR-3199 in promoting melanogenesis. HEM were cultured at 37°C/5% CO 2 in mammalian cell culture/primary cell culture medium (Gibco, US) containing Melanocyte Growth Supplement-2 (Gibco, US). HEMs were distributed at 1×10 5 cells/well in a 12-well plate (Falcon, US) and the next day treated with SAMiRNA-miR-3199 at a concentration of 5 μM.

6-2. Анализ количества меланина, вырабатываемого при обработке SAMiRNA-miR-31996-2. Analysis of the amount of melanin produced by SAMiRNA-miR-3199 treatment

Чтобы оценить эффективность SAMiRNA-miR-3199, изменение окрашивания и количество вырабатываемого меланина измеряли в HEM. HEM обрабатывали SAMiRNA-miR-3199 при концентрации 5 мкМ с помощью способа по примеру 6-1. После культивирования в течение 72 часов все клетки собирали и наблюдали изменение окрашивания. Для измерения количества вырабатываемого меланина реакцию проводили в 1 М NaOH (Bioneer, KR) в течение 2 часов при 37°C в соответствии с протоколом экстракции меланина, после чего измеряли поглощение при длине волны 405 нм и, таким образом, анализировали количество вырабатываемого меланина.To evaluate the efficacy of SAMiRNA-miR-3199, the staining change and the amount of melanin produced were measured in HEM. HEMs were treated with SAMiRNA-miR-3199 at a concentration of 5 μM using the method of Example 6-1. After culture for 72 hours, all cells were harvested and color changes were observed. To measure the amount of melanin produced, the reaction was carried out in 1 M NaOH (Bioneer, KR) for 2 hours at 37°C according to the melanin extraction protocol, after which the absorbance was measured at a wavelength of 405 nm and thus the amount of melanin produced was analyzed.

Таким образом, при обработке SAMiRNA-miR-3199 наблюдалось явное изменение цвета и увеличение количества меланина по сравнению с отрицательным контролем (фиг. 11a).Thus, upon treatment with SAMiRNA-miR-3199, a clear color change and increase in the amount of melanin were observed compared to the negative control (Fig. 11a).

6-3. Анализ путей передачи сигнала, которые опосредуют меланогенез, при обработке SAMiRNA-miR-31996-3. Analysis of signal transduction pathways that mediate melanogenesis upon SAMiRNA-miR-3199 treatment

кПЦР-РВ проводили для анализа экспрессии меланогенных генов MITF, TYR, TYRP1, TYRP2 и GSK3β после обработки SAMiRNA-miR-3199. HEM обрабатывали SAMiRNA-miR-3199 с помощью способа по примеру 6-1. После культивирования в течение 96 часов общую РНК экстрагировали из клеточного лизата с применением Universal RNA extraction kit (Bioneer, KR), и, используя эту РНК в качестве матрицы, анализировали уровни экспрессии мРНК генов (набор Human qPCR panel kit, Bioneer, KR) и RPL13A (набор праймеров Human reference qPCR primer set, Bioneer, KR) с помощью кПЦР-РВ с применением AccuPower GreenStar™ qRT-PCR Master Mix (Bioneer, KR) в соответствии с протоколом изготовителя. Значения Ct двух генов, полученные массовой кПЦР, подвергали относительной количественной оценке с помощью метода типа «два дельта Ct» [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec; 25(4):4 02-8], в результате чего рассчитывали относительное количество (кратное изменение) мРНК каждого гена в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой.qRT-PCR was performed to analyze the expression of melanogenic genes MITF, TYR, TYRP1, TYRP2 and GSK3β after treatment with SAMiRNA-miR-3199. HEM was treated with SAMiRNA-miR-3199 using the method of Example 6-1. After culturing for 96 hours, total RNA was extracted from the cell lysate using a Universal RNA extraction kit (Bioneer, KR), and using this RNA as a template, gene mRNA expression levels were analyzed (Human qPCR panel kit, Bioneer, KR) and RPL13A (Human reference qPCR primer set, Bioneer, KR) by qRT-PCR using AccuPower GreenStar™ qRT-PCR Master Mix (Bioneer, KR) according to the manufacturer's protocol. The Ct values of the two genes obtained by bulk qPCR were subjected to relative quantification using the two-delta Ct method [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Methods. Dec; 25(4):4 02-8], as a result of which the relative amount (fold change) of mRNA of each gene in the experimental group was calculated compared to the control group.

Таким образом, было подтверждено, что экспрессия MITF, TYR, TYRP1 и TYRP2 была значительно увеличена при обработке SAMiRNA-miR-3199 (фиг. 11b), а также что экспрессия GSK3β, который является геном-мишенью miR-3199, была снижена (фиг. 11b).Thus, it was confirmed that the expression of MITF, TYR, TYRP1 and TYRP2 was significantly increased by SAMiRNA-miR-3199 treatment (Fig. 11b), and also that the expression of GSK3β, which is a target gene of miR-3199, was decreased (Fig. 11b). .11b).

6-4. Анализ экспрессии меланогенного белка при обработке SAMiRNA-miR-31996-4. Analysis of melanogenic protein expression upon treatment with SAMiRNA-miR-3199

Иммуноблотинг проводили для анализа экспрессии белков MITF и TYR, которые являются ключевыми факторами меланогенеза. HEM распределяли по 2×105 клеток/лунку в 6-луночный планшет (Falcon, US) и затем культивировали при 37°C/5% CO2. HEM обрабатывали SAMiRNA-miR-3199 с помощью способа по примеру 6-1. После культивирования в течение 96 часов проводили анализ в соответствии с протоколом иммуноблоттинга. Здесь, MITF (Santa Cruz Biotechnology, Inc, US), тирозиназу (Santa Cruz Biotechnology, Inc, US) и альфа-тубулин (Cell Signaling Technology, US) использовали в качестве первичных антител, а в качестве вторичного антитела использовали HRP-связанный анти-мышиный IgG (Cell Signaling Technology, US).Immunoblotting was performed to analyze the expression of MITF and TYR proteins, which are key factors in melanogenesis. HEM were distributed at 2x10 5 cells/well in a 6-well plate (Falcon, US) and then cultured at 37°C/5% CO 2 . HEM was treated with SAMiRNA-miR-3199 using the method of Example 6-1. After culturing for 96 hours, analysis was performed according to the immunoblotting protocol. Here, MITF (Santa Cruz Biotechnology, Inc, US), tyrosinase (Santa Cruz Biotechnology, Inc, US) and alpha-tubulin (Cell Signaling Technology, US) were used as primary antibodies, and HRP-linked anti was used as a secondary antibody. -mouse IgG (Cell Signaling Technology, US).

Таким образом, было подтверждено, что экспрессия белков MITF и TYR увеличивалась при обработке SAMiRNA-miR-3199, как в случае результатов анализа экспрессии генов с помощью кПЦР-РВ (фиг. 11c).Therefore, it was confirmed that the expression of MITF and TYR proteins was increased by SAMiRNA-miR-3199 treatment, as was the case with the results of gene expression analysis by qRT-PCR (Fig. 11c).

Пример 7. Оценка цитотоксичности и врожденной иммунотоксичности SAMiRNA-miR-3199Example 7. Evaluation of cytotoxicity and innate immunotoxicity of SAMiRNA-miR-3199

7-1. Оценка цитотоксичности SAMiRNA-miR-31997-1. Cytotoxicity assessment of SAMiRNA-miR-3199

Для оценки цитотоксичности SAMiRNA-miR-3199 использовали клетки дермальной папиллы фолликула человека (HFDPC, Promocell, DE), кератиноцит HaCaT (ATCC, US) и эпидермальные меланоциты человека (Invitrogen, US). HFDPC в количестве 3×103 клеток/лунку, HaCaT в количестве 4×103 клеток/лунку и HEM в количестве 5×103 клеток/лунку распределяли в 96-луночный планшет (Falcon, US) и затем культивировали при 37°C/5% CO2. На следующий день каждую клетку обрабатывали SAMiRNA-miR-3199 в разных концентрациях (0, 1, 5, 10 и 20 мкМ). После культивирования в течение 72 часов цитотоксичность анализировали в соответствии с протоколом изготовителя с применением набора WST assay kit (DOGEN, KR).To evaluate the cytotoxicity of SAMiRNA-miR-3199, human follicle dermal papillary cells (HFDPC, Promocell, DE), HaCaT keratinocyte (ATCC, US) and human epidermal melanocytes (Invitrogen, US) were used. HFDPC at 3x103 cells/well, HaCaT at 4x103 cells/well and HEM at 5x103 cells/well were distributed into a 96-well plate (Falcon, US) and then cultured at 37°C /5% CO 2 . The next day, each cell was treated with SAMiRNA-miR-3199 at different concentrations (0, 1, 5, 10, and 20 μM). After culture for 72 hours, cytotoxicity was assayed according to the manufacturer's protocol using the WST assay kit (DOGEN, KR).

Таким образом, цитотоксичность не наблюдалась во всех клеточных линиях даже при применении SAMiRNA-miR-3199 в высокой концентрации 20 мкМ (фиг. 12a).Thus, cytotoxicity was not observed in all cell lines even when SAMiRNA-miR-3199 was applied at a high concentration of 20 μM (Fig. 12a).

7-2. Оценка естественной иммунотоксичности SAMiRNA-miR-31997-2. Evaluation of natural immunotoxicity of SAMiRNA-miR-3199

Для оценки естественной иммунотоксичности SAMiRNA-miR-3199 использовали мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК) (Cellular Technology Limited, US). Клетки распределяли по 5×105 клеток/лунку в 12-луночный планшет (Falcon, US) и затем культивировали при 37°C/5% CO2. На следующий день клетки обрабатывали SAMiRNA-miR-3199 в различных концентрациях (0, 5, 10 и 20 мкМ). После культивирования в течение 6 часов общую РНК экстрагировали из клеточного лизата с применением набора Universal RNA extraction kit (Bioneer, KR), и, используя эту РНК в качестве матрицы, оценивали уровни экспрессии мРНК генов воспалительных цитокинов (набор Human Immune кПЦР panel kit, Bioneer, KR) и RPL13A (набор праймеров Human reference qPCR primer set, Bioneer, KR) с помощью кПЦР-РВ с применением AccuPower GreenStar™ qRT-PCR Master Mix (Bioneer, KR) в соответствии с протоколом изготовителя. Последовательности праймеров для отдельных генов показаны ниже (таблица 7).Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) (Cellular Technology Limited, US) were used to evaluate the natural immunotoxicity of SAMiRNA-miR-3199. Cells were distributed at 5×10 5 cells/well in a 12-well plate (Falcon, US) and then cultured at 37°C/5% CO 2 . The next day, cells were treated with SAMiRNA-miR-3199 at different concentrations (0, 5, 10, and 20 μM). After culturing for 6 hours, total RNA was extracted from the cell lysate using a Universal RNA extraction kit (Bioneer, KR), and using this RNA as a template, the levels of mRNA expression of inflammatory cytokine genes were assessed (Human Immune qPCR panel kit, Bioneer , KR) and RPL13A (Human reference qPCR primer set, Bioneer, KR) by qRT-PCR using AccuPower GreenStar™ qRT-PCR Master Mix (Bioneer, KR) according to the manufacturer's protocol. Primer sequences for individual genes are shown below (Table 7).

Таблица 7. Последовательности праймеров IL-1β, IL-6, IL-12β, TNF-альфа и INF-гамма человекаTable 7. Primer sequences of human IL-1β, IL-6, IL-12β, TNF-alpha and INF-gamma hIL-1β-прямойhIL-1β-direct 5’- CTGAGCTCGCCAGTGAAAT -3’5’- CTGAGCTCGCCAGTGAAAT -3’ 3131 hIL-1β-обратныйhIL-1β-reverse 5’- CTGTAGTGGTGGTCGGAGA -3’5’- CTGTAGTGGTGGTCGGAGA -3’ 3232 hIL-6-прямойhIL-6-direct 5’- AGATGCAATAACCACCCCTG -3’5’-AGATGCAATAACCACCCCTG -3’ 3333 hIL-6-обратныйhIL-6-reverse 5’- TGCGCAGAATGAGATGAGTT -3’5’- TGCGCAGAATGAGATGAGTT -3’ 3434 hIL-12β-прямойhIL-12β-direct 5’- ATTCTGGACGTTTCACCTGC -3’5’- ATTCTGGACGTTTCACCTGC -3’ 3535 hIL-12β-обратныйhIL-12β-reverse 5’- GTCCCCTCTGACTCTCTCTG -3’5’- GTCCCCTCTGACTCTCTCTG -3’ 3636 hTNF-α-прямойhTNF-α-direct 5’- CTGTAGCCCATGTTGTAGCA -3’5’- CTGTAGCCCATGTTGTAGCA -3’ 3737 hTNF-α-обратныйhTNF-α-reverse 5’- GGTTATCTCTCAGCTCCACG -3’5’- GGTTATCTCTCAGCTCCACG -3’ 3838 hINF-γ-прямойhINF-γ-direct 5’- GAATGTCCAACGCAAAGCAA -3’5’- GAATGTCCAACGCAAAGCAA -3’ 3939 hINF-γ-обратныйhINF-γ-reverse 5’- ACCTCGAAACAGCATCTGAC -3’5’- ACCTCGAAACAGCATCTGAC -3’ 4040

Таким образом, повышения уровня воспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-12β, TNF-альфа, INF-гамма и др.) не наблюдалось даже при применении SAMiRNA-miR-3199 в высокой концентрации 20 мкМ, что указывает на отсутствие естественной иммунотоксичности (фиг. 12b).Thus, no increase in the level of inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, IL-12β, TNF-alpha, INF-gamma, etc.) was observed even when using SAMiRNA-miR-3199 at a high concentration of 20 μM, which indicates lack of natural immunotoxicity (Fig. 12b).

Пример 8. Двухцепочечная олигонуклеотидная конструкция (SAMiRNA)Example 8: Double-stranded oligonucleotide construct (SAMiRNA)

Двухцепочечная олигонуклеотидная конструкция, изготовленная в соответствии с настоящим изобретением, имеет структуру представленной ниже структурной формулы (5).The double-stranded oligonucleotide construct manufactured in accordance with the present invention has the structure of the following structural formula (5).

C18-S-S-C6-5’ S 3’-полиэтиленгликоль 2000C 18 -SSC 6 -5' S 3'-polyethylene glycol 2000

3’ AS 5’-PO4 … Структурная формула (5)3' AS 5'-PO 4 ... Structural formula (5)

В структурной формуле (5) S представляет собой смысловую цепь мкрРНК, AS представляет собой антисмысловую цепь мкрРНК, PO4 представляет собой фосфатную группу, и полиэтиленгликоль представляет собой мономер гидрофильного материала, в котором полиэтиленгликоль 2000 связан через фосфатную группу (PO3-) в качестве линкера, C24 представляет собой гидрофобный материал и содержит дисульфидную связь, а 5' и 3' представляют концевые направления двухцепочечной олигоРНК. In the structural formula (5), S represents the sense strand of miRNA, AS represents the antisense strand of miRNA, PO 4 represents a phosphate group, and polyethylene glycol represents a hydrophilic material monomer, in which polyethylene glycol 2000 is linked through a phosphate group (PO 3- ) as linker, C 24 is hydrophobic material and contains a disulfide bond, and 5' and 3' represent the terminal directions of the double-stranded oligoRNA.

Для смысловой цепи мкрРНК в структурной формуле (5) фосфодиэфирные связи, составляющие структуру остова РНК, соединяли с применением DMT-полиэтиленгликоля 2000-CPG в качестве носителя и с применением бета-цианоэтилфосфорамидита, в результате чего синтезировали конструкцию олигоРНК-гидрофильный материал, включающую смысловую цепь, в которой полиэтиленгликоль присоединен к 3'-концу, с последующим присоединением к 5'-концу гидрофобного C24, содержащего дисульфидную связь, в результате чего получали желаемую смысловую цепь конструкции РНК-полимер. Для отжига антисмысловой цепи со смысловой цепью фосфодиэфирные связи, составляющие структуру остова РНК, соединяли с применением бета-цианоэтилфосфорамидита с образованием антисмысловой цепи, имеющей последовательность, комплементарную смысловой цепи, с последующим присоединением фосфатной группы к 5'-концу с образованием антисмысловой цепи.For the sense strand of miRNA in structural formula (5), the phosphodiester bonds constituting the structure of the RNA backbone were connected using DMT-polyethylene glycol 2000-CPG as a carrier and using beta-cyanoethyl phosphoramidite, resulting in the synthesis of an oligoRNA-hydrophilic material construct including the sense strand , in which polyethylene glycol is attached to the 3' end, followed by the addition of a hydrophobic C24 containing a disulfide bond to the 5' end, resulting in the desired sense strand of the RNA polymer construct. To anneal the antisense strand to the sense strand, the phosphodiester bonds that make up the structure of the RNA backbone were linked using beta-cyanoethyl phosphoramidite to form an antisense strand having a sequence complementary to the sense strand, followed by the addition of a phosphate group to the 5' end to form the antisense strand.

Промышленная применимостьIndustrial applicability

Композиция в соответствии с настоящим изобретением может активировать меланоциты и способствовать меланогенезу, тем самым предотвращая поседение волос и замедляя его прогрессирование, и может преобразовывать волосы, которые уже подверглись поседению, в волосы до поседения, и, таким образом, может быть эффективно применена для фармацевтического применения и с косметической целью или для окрашивания волос без побочных эффектов, отличающегося от простых красителей, которые обычно многократно применяют для маскировки седых волос. Кроме того, композицию по настоящему изобретению можно применять в качестве фармацевтической или косметической композиции, которая может вызывать ослабление алопеции и стимулировать рост волос без побочных эффектов за счет стимулирования пролиферации клеток дермальной папиллы волосяного фолликула и кератиноцитов в дополнение к активации меланоцитов.The composition according to the present invention can activate melanocytes and promote melanogenesis, thereby preventing graying of hair and slowing down its progression, and can convert hair that has already undergone graying into pre-grey hair, and thus can be effectively used for pharmaceutical use and for cosmetic purposes or for hair coloring without side effects, different from simple dyes that are usually used repeatedly to disguise gray hair. In addition, the composition of the present invention can be used as a pharmaceutical or cosmetic composition, which can cause relief of alopecia and stimulate hair growth without side effects by promoting the proliferation of hair follicle dermal papilla cells and keratinocytes in addition to activating melanocytes.

Хотя конкретные варианты осуществления настоящего изобретения были подробно описаны выше, специалистам в данной области техники будет очевидно, что описание представляет собой просто предпочтительные иллюстративные варианты осуществления и не должно толковаться как ограничивающее объем настоящего изобретения. Таким образом, по существу объем настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.Although specific embodiments of the present invention have been described in detail above, those skilled in the art will appreciate that the descriptions are merely preferred illustrative embodiments and should not be construed as limiting the scope of the present invention. Thus, the essential scope of the present invention will be determined by the appended claims and their equivalents.

Свободный текст списка последовательностейFree text sequence list

Электронный файл прилагается.Electronic file is attached.

--->--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ LIST OF SEQUENCES

<110> BIONEER CORPORATION<110> BIONEER CORPORATION

SIPHKGEN THERAPEUTICS CORPORATION SIPHKGEN THERAPEUTICS CORPORATION

<120> КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ УМЕНЬШЕНИЯ ПОСЕДЕНИЯ ВОЛОС, СТИМУЛИРОВАНИЯ РОСТА ВОЛОС <120> COMPOSITION FOR REDUCING HAIR GRAYING AND STIMULATING HAIR GROWTH

И/ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ УМЕНЬШЕНИЯ ВЫПАДЕНИЯ ВОЛОС, СОДЕРЖАЩАЯ AND/OR PREVENTING OR REDUCING HAIR LOSS CONTAINING

ДВУХЦЕПОЧЕЧНУЮ MIPHK В КАЧЕСТВЕ АКТИВНОГО ИНГРЕДИЕНТА DOUBLE CHAIN MIPHK AS AN ACTIVE INGREDIENT

<130> PF-B2916<130>PF-B2916

<140> PCT/KR2022/002765<140> PCT/KR2022/002765

<141> 2022-02-25<141> 2022-02-25

<150> 10-2021-0025554<150> 10-2021-0025554

<151> 2021-02-25<151> 2021-02-25

<160> 40 <160> 40

<170> PatentIn version 3.5<170> Patent In version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 21<211> 21

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-8485<223> hsa-miR-8485

<400> 1<400> 1

acgugugugu gugugugugu u 21acgugugugu gugugugugu u 21

<210> 2<210> 2

<211> 21<211> 21

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-8485<223> hsa-miR-8485

<400> 2<400> 2

cacacacaca cacacacgua u 21cacacacaca cacacacgua u 21

<210> 3<210> 3

<211> 24<211> 24

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-3132<223> hsa-miR-3132

<400> 3<400> 3

cucugagcuc cuucucuacc cauu 24cucugagcuc cucucuacc cauu 24

<210> 4<210> 4

<211> 24<211> 24

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-3132<223> hsa-miR-3132

<400> 4<400> 4

uggguagaga aggagcucag agga 24uggguagaga aggagcucag agga 24

<210> 5<210> 5

<211> 25<211> 25

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-3189<223> hsa-miR-3189

<400> 5<400> 5

ugccccaucu gugcccuggg uagga 25ugccccaucu gugcccuggg uagga 25

<210> 6<210> 6

<211> 21<211> 21

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-3189<223> hsa-miR-3189

<400> 6<400> 6

cccuuggguc ugauggggua g 21cccuuggguc ugauggggua g 21

<210> 7<210> 7

<211> 20<211> 20

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-6074<223> hsa-miR-6074

<400> 7<400> 7

accuagccuc ugaauaucuu 20accuagccuc ugaauaucuu 20

<210> 8<210> 8

<211> 20<211> 20

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-6074<223> hsa-miR-6074

<400> 8<400> 8

gauauucaga ggcuaggugg 20gauauucaga ggcuaggugg 20

<210> 9<210> 9

<211> 23<211> 23

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-3139<223> hsa-miR-3139

<400> 9<400> 9

caggcaucug uugagcuccu auu 23caggcaucug uugagcuccu auu 23

<210> 10<210> 10

<211> 23<211> 23

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-3139<223> hsa-miR-3139

<400> 10<400> 10

uaggagcuca acagaugccu guu 23uaggagcuca acagaugccu guu 23

<210> 11<210> 11

<211> 22<211> 22

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-933<223> hsa-miR-933

<400> 11<400> 11

gagaggucuc ccugcgcaca uu 22gagaggucuc ccugcgcaca uu 22

<210> 12<210> 12

<211> 22<211> 22

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-933<223> hsa-miR-933

<400> 12<400> 12

ugugcgcagg gagaccucuc cc 22ugugcgcagg gagaccucuc cc 22

<210> 13<210> 13

<211> 21<211> 21

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-7978<223> hsa-miR-7978

<400> 13<400> 13

agcaacgcua uacaccagau u 21agcaacgcua uacaccagau u 21

<210> 14<210> 14

<211> 21<211> 21

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-7978<223> hsa-miR-7978

<400> 14<400> 14

ucugguguau agcguugcuc a 21ucugguguau agcguugcuc a 21

<210> 15<210> 15

<211> 23<211> 23

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-3199<223> hsa-miR-3199

<400> 15<400> 15

cuuucuccua aggcaguccc uuu 23cuuucuccua aggcaguccc uuu 23

<210> 16<210> 16

<211> 23<211> 23

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-3199<223> hsa-miR-3199

<400> 16<400> 16

agggacugcc uuaggagaaa guu 23agggacugcc uuaggagaaa guu 23

<210> 17<210> 17

<211> 23<211> 23

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-4644<223> hsa-miR-4644

<400> 17<400> 17

ucugucucuu uucucucucc auu 23ucugucucuu uucucucuccc auu 23

<210> 18<210> 18

<211> 23<211> 23

<212> РНК<212> RNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hsa-miR-4644<223> hsa-miR-4644

<400> 18<400> 18

uggagagaga aaagagacag aag 23uggagagaga aaagagacag aag 23

<210> 19<210> 19

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hMITF-прямой<223> hMITF-direct

<400> 19<400> 19

cgtctctcac tggattggtg 20cgtctctcac tggattggtg 20

<210> 20<210> 20

<211> 22<211> 22

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hMITF-обратный<223> hMITF-reverse

<400> 20<400> 20

cttataaaat ccctgctgcc gt 22cttataaaat ccctgctgcc gt 22

<210> 21<210> 21

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hTYR-прямой<223> hTYR-straight

<400> 21<400> 21

ggatagcgga tgcctctcaa 20ggatagga tgcctctcaa 20

<210> 22<210> 22

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hTYR-обратный<223> hTYR-reverse

<400> 22<400> 22

ggagccactg ctcaaaaata c 21ggagccactg ctcaaaaata from 21

<210> 23<210> 23

<211> 19<211> 19

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hTYRP1-прямой<223> hTYRP1-direct

<400> 23<400> 23

ccacagccct cagtatccc 19ccacagccct cagtatccc 19

<210> 24<210> 24

<211> 18<211> 18

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hTYRP1-обратный<223> hTYRP1-reverse

<400> 24<400> 24

cagctcctct ccagccag 18cagctcctct ccagccag 18

<210> 25<210> 25

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hTYRP2-прямой<223> hTYRP2-direct

<400> 25<400> 25

tcggatgtac aacatggttc c 21tcggatgtac aacatggttc from 21

<210> 26<210> 26

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hTYRP2-обратный<223> hTYRP2-reverse

<400> 26<400> 26

ccaacctgga gtttcttcaa c 21ccaacctgga gtttcttcaa from 21

<210> 27<210> 27

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hRPL13A-прямой<223> hRPL13A-straight

<400> 27<400> 27

ccagcaatca agtttgccta 20ccagcaatca agtttgccta 20

<210> 28<210> 28

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> hRPL13A-обратный<223> hRPL13A-reverse

<400> 28<400> 28

gtggtggtgg tggtaattca 20gtggtggtgg tggtaattca 20

<210> 29<210> 29

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Праймер<223> Primer

<400> 29<400> 29

gcagcatgaa agttagcaga g 21gcagcatgaa agttagcaga g 21

<210> 30<210> 30

<211> 19<211> 19

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Праймер<223> Primer

<400> 30<400> 30

tgacttcttg tggcctgtc 19tgacttcttg tggcctgtc 19

<210> 31<210> 31

<211> 19<211> 19

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Праймер<223> Primer

<400> 31<400> 31

ctgagctcgc cagtgaaat 19ctgagctcgc cagtgaaat 19

<210> 32<210> 32

<211> 19<211> 19

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Праймер<223> Primer

<400> 32<400> 32

ctgtagtggt ggtcggaga 19ctgtagtggt ggtcggaga 19

<210> 33<210> 33

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Праймер<223> Primer

<400> 33<400> 33

agatgcaata accacccctg 20agatgcaata accacccctg 20

<210> 34<210> 34

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Праймер<223> Primer

<400> 34<400> 34

tgcgcagaat gagatgagtt 20tgcgcagaat gagatgagtt 20

<210> 35<210> 35

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Праймер<223> Primer

<400> 35<400> 35

attctggacg tttcacctgc 20attctggacg tttcacctgc 20

<210> 36<210> 36

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Праймер<223> Primer

<400> 36<400> 36

gtcccctctg actctctctg 20gtcccctctg actctctctg 20

<210> 37<210> 37

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Праймер<223> Primer

<400> 37<400> 37

ctgtagccca tgttgtagca 20ctgtagccca tgttgtagca 20

<210> 38<210> 38

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Праймер<223> Primer

<400> 38<400> 38

ggttatctct cagctccacg 20ggttatctct cagctccacg 20

<210> 39<210> 39

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Праймер<223> Primer

<400> 39<400> 39

gaatgtccaa cgcaaagcaa 20gaatgtccaa cgcaaagcaa 20

<210> 40<210> 40

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Праймер<223> Primer

<400> 40<400> 40

acctcgaaac agcatctgac 20acctcgaaac agcatctgac 20

<---<---

Claims (62)

1. Композиция для уменьшения поседения волос, стимулирования роста волос и/или предотвращения или уменьшения выпадения волос, содержащая в качестве активного ингредиента: 1. A composition for reducing graying of hair, stimulating hair growth and/or preventing or reducing hair loss, containing as an active ingredient: (i) hsa-miR3139, hsa-miR3189, hsa-miR3199 или hsa-miR8485,(i) hsa-miR3139, hsa-miR3189, hsa-miR3199 or hsa-miR8485, где hsa-miR-3139, hsa-miR-3189, hsa-miR-3199 и hsa-miR-8485 представляют собой двухцепочечный олигонуклеотид,where hsa-miR-3139, hsa-miR-3189, hsa-miR-3199 and hsa-miR-8485 are a double-stranded oligonucleotide, где hsa-miR-3139 содержит нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10,where hsa-miR-3139 contains the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10, где hsa-miR-3189 содержит нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5, и нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6,where hsa-miR-3189 contains the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, где hsa-miR-3199 содержит нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, и нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 16,where hsa-miR-3199 contains the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16, где hsa-miR-8485 содержит нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, и нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2; where hsa-miR-8485 contains the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2; (ii) двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию, имеющую структуру представленной ниже структурной формулы (1'): (ii) a double-stranded oligonucleotide construct having the structure of the following structural formula (1'): структурная формула (1'), в которой structural formula (1'), in which A представляет собой гидрофильный материал, A is a hydrophilic material, где гидрофильный материал представляет собой любой материал, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), поливинилпирролидона и полиоксазолина, илиwherein the hydrophilic material is any material selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), polyvinylpyrrolidone and polyoxazoline, or гидрофильный материал представлен (P)n, (Pm-J)n или (J-Pm)n, где P представляет собой мономер гидрофильного материала, n составляет от 1 до 200, m составляет от 1 до 15, а J представляет собой линкер, соединяющий m мономеров гидрофильного материала друг с другом или соединяющий m мономеров гидрофильного материала и олигонуклеотиды друг с другом,the hydrophilic material is represented by (P) n , ( Pm -J) n , or ( JPm ) n , where P is a monomer of the hydrophilic material, n is from 1 to 200, m is from 1 to 15, and J is a linker, connecting m monomers of hydrophilic material to each other or connecting m monomers of hydrophilic material and oligonucleotides to each other, при этом мономер гидрофильного материала (P) имеет структуру соединения (1), приведенного ниже:wherein the hydrophilic material monomer (P) has the structure of compound (1) below: соединение (1), в котором connection (1), in which G выбран из группы, состоящей из CH2, O, S и NH,G is selected from the group consisting of CH 2 , O, S and NH, B представляет собой гидрофобный материал, B is a hydrophobic material, где гидрофобный материал выбран из группы, состоящей из производного стероида, производного глицерида, эфира глицерина, полипропиленгликоля, ненасыщенного или насыщенного углеводорода C12-C50, диацилфосфатидилхолина, жирной кислоты, фосфолипида и липополиамина,wherein the hydrophobic material is selected from the group consisting of a steroid derivative, a glyceride derivative, a glycerol ether, polypropylene glycol, an unsaturated or saturated C 12 -C 50 hydrocarbon, diacylphosphatidylcholine, a fatty acid, a phospholipid and a lipopolyamine, X и Y, каждый, независимо представляют собой простую ковалентную связь или опосредованную линкером ковалентную связь, X and Y each independently represent a single covalent bond or a linker-mediated covalent bond, S представляет собой смысловую цепь hsa-miR-3139, hsa-miR-3189, hsa-miR-3199 или hsa-miR-8485, аS represents the sense strand of hsa-miR-3139, hsa-miR-3189, hsa-miR-3199 or hsa-miR-8485, and AS представляет собой антисмысловую цепь hsa-miR-3139, hsa-miR-3189, hsa-miR-3199 или hsa-miR-8485; или AS is the antisense strand of hsa-miR-3139, hsa-miR-3189, hsa-miR-3199, or hsa-miR-8485; or (iii) наночастицы, содержащие такую двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию, (iii) nanoparticles containing such a double-stranded oligonucleotide construct, и эта композиция дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. and the composition further comprises at least one pharmaceutically acceptable carrier. 2. Фармацевтическая композиция для уменьшения поседения волос, стимулирования роста волос и/или предотвращения или уменьшения выпадения волос, содержащая композицию по п.1 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.2. A pharmaceutical composition for reducing hair graying, stimulating hair growth and/or preventing or reducing hair loss, comprising a composition according to claim 1 and at least one pharmaceutically acceptable carrier. 3. Фармацевтическая композиция по п. 2, в которой гидрофильный материал имеет молекулярную массу от 200 до 10000.3. The pharmaceutical composition according to claim 2, in which the hydrophilic material has a molecular weight from 200 to 10,000. 4. Фармацевтическая композиция по п. 2, в которой линкер (J) выбран из группы, состоящей из PO3 -, SO3 и CO2. 4. The pharmaceutical composition according to claim 2, in which the linker (J) is selected from the group consisting of PO 3 - , SO 3 and CO 2 . 5. Фармацевтическая композиция по п. 2, в которой гидрофобный материал имеет молекулярную массу от 250 до 1000. 5. The pharmaceutical composition according to claim 2, in which the hydrophobic material has a molecular weight of 250 to 1000. 6. Фармацевтическая композиция по п. 2, в которой производное стероида выбрано из группы, состоящей из холестерина, холестанола, холевой кислоты, холестерилформиата, холестанилформиата и холестериламина. 6. The pharmaceutical composition according to claim 2, wherein the steroid derivative is selected from the group consisting of cholesterol, cholestanol, cholic acid, cholesteryl formate, cholestanyl formate and cholesterolamine. 7. Фармацевтическая композиция по п. 2, в которой производное глицерида выбрано из группы, состоящей из моно-, ди- и триглицеридов. 7. The pharmaceutical composition according to claim 2, wherein the glyceride derivative is selected from the group consisting of mono-, di- and triglycerides. 8. Фармацевтическая композиция по п. 2, в которой ковалентная связь, представленная X и Y, является нерасщепляемой связью или расщепляемой связью. 8. The pharmaceutical composition according to claim 2, wherein the covalent bond represented by X and Y is a non-cleavable bond or a cleavable bond. 9. Фармацевтическая композиция по п. 8, в которой нерасщепляемая связь представляет собой амидную связь или фосфатную связь. 9. The pharmaceutical composition according to claim 8, wherein the non-cleavable bond is an amide bond or a phosphate bond. 10. Фармацевтическая композиция по п. 8, в которой расщепляемая связь представляет собой дисульфидную связь, расщепляемую кислотой связь, сложноэфирную связь, ангидридную связь, биоразлагаемую связь или расщепляемую ферментами связь.10. The pharmaceutical composition according to claim 8, wherein the cleavable bond is a disulfide bond, an acid-cleavable bond, an ester bond, an anhydride bond, a biodegradable bond or an enzyme-cleavable bond. 11. Косметическая композиция для уменьшения поседения волос, стимулирования роста волос и/или предотвращения или уменьшения выпадения волос, содержащая в качестве активного ингредиента: 11. Cosmetic composition for reducing graying of hair, stimulating hair growth and/or preventing or reducing hair loss, containing as an active ingredient: (i) hsa-miR-3139, hsa-miR-3189, hsa-miR-3199 или hsa-miR-8485,(i) hsa-miR-3139, hsa-miR-3189, hsa-miR-3199 or hsa-miR-8485, где hsa-miR-3139, hsa-miR-3189, hsa-miR-3199 и hsa-miR-8485 представляют собой двухцепочечный олигонуклеотид,where hsa-miR-3139, hsa-miR-3189, hsa-miR-3199 and hsa-miR-8485 are a double-stranded oligonucleotide, где hsa-miR-3139 содержит нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10,where hsa-miR-3139 contains the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10, где hsa-miR-3189 содержит нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5, и нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6,where hsa-miR-3189 contains the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6, где hsa-miR-3199 содержит нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, и нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 16,where hsa-miR-3199 contains the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16, где hsa-miR-8485 содержит нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, и нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2;where hsa-miR-8485 contains the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2; (ii) двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию, имеющую структуру структурной формулы (1'), приведенную ниже:(ii) a double-stranded oligonucleotide construct having the structure of structural formula (1') given below: структурная формула (1'), в которой structural formula (1'), in which А – гидрофильный материал,A – hydrophilic material, где гидрофильный материал представляет собой любой материал, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), поливинилпирролидона и полиоксазолина, илиwherein the hydrophilic material is any material selected from the group consisting of polyethylene glycol (PEG), polyvinylpyrrolidone and polyoxazoline, or гидрофильный материал представлен (P)n, (Pm-J)n или (J-Pm)n, где P представляет собой мономер гидрофильного материала, n составляет от 1 до 200, m составляет от 1 до 15, а J представляет собой линкер, соединяющий m мономеров гидрофильного материала друг с другом или соединяющий m мономеров гидрофильного материала и олигонуклеотиды друг с другом,the hydrophilic material is represented by (P) n , ( Pm -J) n , or ( JPm ) n , where P is a monomer of the hydrophilic material, n is from 1 to 200, m is from 1 to 15, and J is a linker, connecting m monomers of hydrophilic material to each other or connecting m monomers of hydrophilic material and oligonucleotides to each other, где мономер гидрофильного материала (P) имеет структуру соединения (1), приведенного ниже:wherein the hydrophilic material monomer (P) has the structure of compound (1) below: соединение (1), в котором connection (1), in which G выбран из группы, состоящей из CH2, O, S и NH,G is selected from the group consisting of CH 2 , O, S and NH, B представляет собой гидрофобный материал,B is a hydrophobic material, где гидрофобный материал выбран из группы, состоящей из производного стероида, производного глицерида, эфира глицерина, полипропиленгликоля, ненасыщенного или насыщенного углеводорода C12-C50, диацилфосфатидилхолина, жирной кислоты, фосфолипида и липополиамина,wherein the hydrophobic material is selected from the group consisting of a steroid derivative, a glyceride derivative, a glycerol ether, polypropylene glycol, an unsaturated or saturated C 12 -C 50 hydrocarbon, diacylphosphatidylcholine, a fatty acid, a phospholipid and a lipopolyamine, X и Y каждый независимо представляет собой простую ковалентную связь или ковалентную связь, опосредованную линкером,X and Y each independently represent a single covalent bond or a linker-mediated covalent bond, S представляет собой смысловую цепь hsa-miR-3139, hsa-miR-3189, hsa-miR-3199 или hsa-miR-8485, аS represents the sense strand of hsa-miR-3139, hsa-miR-3189, hsa-miR-3199 or hsa-miR-8485, and AS представляет собой антисмысловую цепь hsa-miR-3139, hsa-miR-3189, hsa-miR-3199 или hsa-miR; илиAS is the antisense strand of hsa-miR-3139, hsa-miR-3189, hsa-miR-3199, or hsa-miR; or (iii) наночастицы, содержащие двухцепочечную олигонуклеотидную конструкцию по (ii),(iii) nanoparticles containing the double-stranded oligonucleotide construct according to (ii), и эта композиция дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.and the composition further comprises at least one pharmaceutically acceptable carrier. 12. Косметическая композиция по п. 11, в которой гидрофильный материал имеет молекулярную массу от 200 до 10000.12. Cosmetic composition according to claim 11, in which the hydrophilic material has a molecular weight from 200 to 10,000. 13. Косметическая композиция по п. 11, в которой линкер (J) выбран из группы, состоящей из PO3 -, SO3 и CO2. 13. Cosmetic composition according to claim 11, in which the linker (J) is selected from the group consisting of PO 3 - , SO 3 and CO 2 . 14. Косметическая композиция по п. 11, в которой гидрофобный материал имеет молекулярную массу от 250 до 1000. 14. Cosmetic composition according to claim 11, in which the hydrophobic material has a molecular weight from 250 to 1000. 15. Косметическая композиция по п. 11, в которой производное стероида выбрано из группы, состоящей из холестерина, холестанола, холевой кислоты, холестерилформиата, холестанилформиата и холестериламина.15. The cosmetic composition according to claim 11, wherein the steroid derivative is selected from the group consisting of cholesterol, cholestanol, cholic acid, cholesteryl formate, cholestanyl formate and cholesterolamine. 16. Косметическая композиция по п. 11, в которой производное глицерида выбрано из группы, состоящей из моно-, ди- и триглицеридов. 16. The cosmetic composition according to claim 11, wherein the glyceride derivative is selected from the group consisting of mono-, di- and triglycerides. 17. Косметическая композиция по п. 11, в которой ковалентная связь, представленная X и Y, является нерасщепляемой связью или расщепляемой связью. 17. The cosmetic composition according to claim 11, wherein the covalent bond represented by X and Y is a non-cleavable bond or a cleavable bond. 18. Косметическая композиция по п. 17, в которой нерасщепляемая связь представляет собой амидную связь или фосфатную связь. 18. The cosmetic composition according to claim 17, wherein the non-cleavable bond is an amide bond or a phosphate bond. 19. Косметическая композиция по п. 17, в которой расщепляемая связь представляет собой дисульфидную связь, расщепляемую кислотой связь, сложноэфирную связь, ангидридную связь, биоразлагаемую связь или разлагаемую ферментами связь. 19. The cosmetic composition according to claim 17, wherein the cleavable bond is a disulfide bond, an acid-cleavable bond, an ester bond, an anhydride bond, a biodegradable bond, or an enzymatically degradable bond. 20. Косметическая композиция по п. 11, где косметическая композиция выбрана из группы, состоящей из тоника для волос, кондиционера для волос, эссенции для волос, лосьона для волос, питательного лосьона для волос, шампуня для волос, ополаскивателя для волос, лечебных средств для волос, крема для волос, питательного крема для волос, крема для увлажнения волос, крема для массажа волос, воска для волос, аэрозоля для волос, маски для волос, питательной маски для волос, мыла для волос, очищающей пены для волос, масла для волос, средства для сушки волос, защитного средства для волос, краски для волос, средства для завивки волос, средства для обесцвечивания волос, геля для волос, блеска для волос, средства для укладки волос, лака для волос, увлажняющего средства для волос, мусса для волос и распылителя для волос.20. The cosmetic composition according to claim 11, where the cosmetic composition is selected from the group consisting of hair tonic, hair conditioner, hair essence, hair lotion, nourishing hair lotion, hair shampoo, hair rinse, medicinal products for hair, hair cream, nourishing hair cream, hair moisturizing cream, hair massage cream, hair wax, hair aerosol, hair mask, nourishing hair mask, hair soap, hair cleansing foam, hair oil , hair dryer, hair protectant, hair dye, hair curler, hair bleach, hair gel, hair gloss, hair styling product, hair spray, hair moisturizer, hair mousse and a hair spray.
RU2023121817A 2021-02-25 2022-02-25 Composition for reducing hair graying, stimulating hair growth and/or preventing or reducing hair loss, containing double-stranded mcrna as active ingredient RU2823325C1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0025554 2021-02-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2823325C1 true RU2823325C1 (en) 2024-07-22

Family

ID=

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007021142A1 (en) * 2005-08-17 2007-02-22 Bioneer Corporation Sirna-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of sirna and method thereof
WO2013124816A2 (en) * 2012-02-22 2013-08-29 Brainstem Biotec Ltd. Generation of neural stem cells and motor neurons
RU2558258C2 (en) * 2009-05-14 2015-07-27 Байонир Корпорейшн Sirna conjugate and method for producing it
US9649388B2 (en) * 2012-01-18 2017-05-16 Bioneer Corporation Magnetic nanoparticle-samirna complex and method for preparing same
WO2018038558A1 (en) * 2016-08-24 2018-03-01 (주)바이오니아 Double-stranded oligo rna structure comprising microrna
RU2670164C2 (en) * 2013-07-05 2018-10-18 Байонир Корпорейшн Improved nanoparticle type oligonucleotide structure having high efficiency and method for preparing same
WO2019103572A1 (en) * 2017-11-27 2019-05-31 (주)프로스테믹스 Composition, comprising mirna, for preventing hair loss or promoting hair restoration
US20200255906A1 (en) * 2018-12-12 2020-08-13 National University Corporation Nagoya University Extract from a body fluid comprising a micro rna
CN111621573A (en) * 2020-07-27 2020-09-04 江苏省苏北人民医院 Gastric cancer differentiation related marker miRNA composition and chip and application thereof
CN111662982A (en) * 2020-06-09 2020-09-15 山东大学齐鲁医院 Biomarker for early diagnosis and/or recurrence monitoring of brain glioma and application thereof

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007021142A1 (en) * 2005-08-17 2007-02-22 Bioneer Corporation Sirna-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of sirna and method thereof
RU2558258C2 (en) * 2009-05-14 2015-07-27 Байонир Корпорейшн Sirna conjugate and method for producing it
US9649388B2 (en) * 2012-01-18 2017-05-16 Bioneer Corporation Magnetic nanoparticle-samirna complex and method for preparing same
WO2013124816A2 (en) * 2012-02-22 2013-08-29 Brainstem Biotec Ltd. Generation of neural stem cells and motor neurons
RU2670164C2 (en) * 2013-07-05 2018-10-18 Байонир Корпорейшн Improved nanoparticle type oligonucleotide structure having high efficiency and method for preparing same
WO2018038558A1 (en) * 2016-08-24 2018-03-01 (주)바이오니아 Double-stranded oligo rna structure comprising microrna
US11123361B2 (en) * 2016-08-24 2021-09-21 Bioneer Corporation Double-stranded oligo RNA structure comprising miRNA
WO2019103572A1 (en) * 2017-11-27 2019-05-31 (주)프로스테믹스 Composition, comprising mirna, for preventing hair loss or promoting hair restoration
US20200255906A1 (en) * 2018-12-12 2020-08-13 National University Corporation Nagoya University Extract from a body fluid comprising a micro rna
CN111662982A (en) * 2020-06-09 2020-09-15 山东大学齐鲁医院 Biomarker for early diagnosis and/or recurrence monitoring of brain glioma and application thereof
CN111621573A (en) * 2020-07-27 2020-09-04 江苏省苏北人民医院 Gastric cancer differentiation related marker miRNA composition and chip and application thereof

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10612026B2 (en) Pharmaceutical composition for treating cancer comprising microrna as active ingredient
US9284554B2 (en) Micro-RNA scaffolds and non-naturally occurring micro-RNAs
EP2550360B1 (en) Bivalent antisense oligonucleotides
US11602568B2 (en) Engineered B lymphocytes and compositions having micro-RNA and methods for making and using them
US20170218360A1 (en) Oligonucleotides for modulating target rna activity
US20110152352A1 (en) Smad proteins control drosha-mediated mirna maturation
CN103476947A (en) Enhanced biodistribution of oligomers
US11041201B2 (en) Methods for detection of RNase activity
EP2298359A1 (en) Nucleic acid capable of controlling degranulation of mast cell
CN113454223B (en) DKK1 gene-targeted double-stranded oligonucleotide, construct comprising same, and hair loss prevention or hair growth composition comprising same
RU2823325C1 (en) Composition for reducing hair graying, stimulating hair growth and/or preventing or reducing hair loss, containing double-stranded mcrna as active ingredient
EP4299078A1 (en) Composition for alleviating hair graying, promoting hair growth and/or preventing or alleviating hair loss, comprising double-stranded mirna as active ingredient