RU2819936C1 - METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs3802963 (CG) OF C11orf58 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES - Google Patents
METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs3802963 (CG) OF C11orf58 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES Download PDFInfo
- Publication number
- RU2819936C1 RU2819936C1 RU2023134783A RU2023134783A RU2819936C1 RU 2819936 C1 RU2819936 C1 RU 2819936C1 RU 2023134783 A RU2023134783 A RU 2023134783A RU 2023134783 A RU2023134783 A RU 2023134783A RU 2819936 C1 RU2819936 C1 RU 2819936C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- c11orf58
- allele
- insdseq
- insdqualifier
- Prior art date
Links
- 101000615355 Homo sapiens Small acidic protein Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 30
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 241000218657 Picea Species 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 101100224481 Dictyostelium discoideum pole gene Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101150110488 POL2 gene Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102100021255 Small acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001876 chaperonelike Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
Способ генотипирования полиморфного локуса rs3802963 (C>G) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме реального времени с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов.A method for genotyping the polymorphic locus rs3802963 (C>G) of the C11orf58 gene in humans using real-time PCR using allele-specific fluorescent probes.
Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs3802963 (C>G) гена C11orf58 молекулярно-генетическим методом исследования.The technical field to which the invention relates. The invention relates to the field of biotechnology, molecular genetic diagnostics, in particular to the assessment of single nucleotide polymorphism rs3802963 (C>G) of the C11orf58 gene using a molecular genetic research method.
Уровень техники. Ген C11orf58 кодирует белок, открытый в 2020 г. японскими учеными [Tsuboyama K. et al. A widespread family of heat-resistant obscure (Hero) proteins protect against protein instability and aggregation //PLoS Biology. - 2020. - Vol. 18. - №. 3. - P. e3000632]. Данный белок характеризуется высокой устойчивостью к воздействию неблагоприятных физических и химических факторов и способствует восстановлению нативной третичной или четвертичной структуры других белков в условиях стресса, что доказывает его выраженные шапероноподобные свойства. Потенциально значимая роль данного белка в широком спектре заболеваний (нейродегенеративных, атеросклероза и др.) определяет необходимость проведения молекулярно-генетических исследований гена C11orf58 и разработки методик генотипирования полиморфных вариантов данного гена.State of the art. The C11orf58 gene encodes a protein discovered in 2020 by Japanese scientists [Tsuboyama K. et al. A widespread family of heat-resistant obscure (Hero) proteins protect against protein instability and aggregation //PLoS Biology. - 2020. - Vol. 18. - No. 3. - P. e3000632]. This protein is characterized by high resistance to adverse physical and chemical factors and promotes the restoration of the native tertiary or quaternary structure of other proteins under stress conditions, which proves its pronounced chaperone-like properties. The potentially significant role of this protein in a wide range of diseases (neurodegenerative, atherosclerosis, etc.) determines the need for molecular genetic studies of the C11orf58 gene and the development of methods for genotyping polymorphic variants of this gene.
Ген C11orf58 (Gene ID: 10944) локализован на хромосоме 11p15.2. Согласно SNPinfo Web Server/ LD TAG SNP Selection [https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snptag.html] полиморфный вариант rs3802963 гена C11orf58 является таргетным (то есть репрезентативным однонуклеотидным полиморфизмом в геномной области с высокой степенью неравновесия по сцеплению с группами других полиморфных локусов, составляющих гаплотип). Однонуклеотидный полиморфизм rs3802963, позиция chr11:16739562 (GRCh38.p14) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs3802963] локализован в интроне и характеризуется заменой C>G. Согласно биоинформатическим ресурсам, данный генетический вариант влияет на уровень экспрессии гена C11orf58 посредством cis-eQTL-эффектов [https://gtexportal.org/home/snp/rs3802963], ассоциирован с модификациями гистонов, маркирующими промоторы/энхансеры в большинстве органов/тканей человека, определяет чувствительность к ДНКазе I и связывание с регуляторным белком POL2 [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs3802963]. Также установлено влияние rs3802963 на связывание с транскрипционными факторами в зависимости от носительства референсного/альтернативного аллелей [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Это доказывает высокую функциональную значимость данного генетического варианта и создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs3802963 (C>G) гена C11orf58.The C11orf58 gene (Gene ID: 10944) is located on chromosome 11p15.2. According to SNPinfo Web Server/LD TAG SNP Selection [https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snptag.html], the rs3802963 polymorphic variant of the C11orf58 gene is a target (that is, a representative single nucleotide polymorphism in a genomic region with a high degree of linkage disequilibrium with groups of other polymorphic loci that make up the haplotype). Single nucleotide polymorphism rs3802963, position chr11:16739562 (GRCh38.p14) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs3802963] is localized in the intron and is characterized by a C>G substitution. According to bioinformatics resources, this genetic variant affects the expression level of the C11orf58 gene through cis-eQTL effects [https://gtexportal.org/home/snp/rs3802963], is associated with histone modifications marking promoters/enhancers in most human organs/tissues , determines sensitivity to DNase I and binding to the regulatory protein POL2 [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs3802963]. The influence of rs3802963 on binding to transcription factors depending on the carriage of the reference/alternative alleles has also been established [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. This proves the high functional significance of this genetic variant and creates the need to create a method for identifying the single nucleotide polymorphism rs3802963 (C>G) of the C11orf58 gene that is easy to implement, inexpensive and accessible to researchers working in the field of genetic epidemiology.
Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 //Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - №. 2. - P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.There is a known method for analyzing genetic variations in the human genome by sequencing amplified sections of DNA [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 //Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - No. 2. - P. 213-218]. The disadvantages of the method are the high cost of equipment and reagents, which excludes the widespread implementation of the method in experimental studies, especially the study of multifactorial diseases that require large sample sizes to ensure high power of studies.
Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - №. 5. - P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.There is a known method for analyzing genetic variations in the human genome using matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDI). The method involves transferring the DNA to be analyzed onto a substrate, where it crystallizes with a matrix. The crystallized analytes are then transferred and irradiated with a laser, causing desorption and ionization of the molecules in a vacuum chamber. Positively charged DNA ions are accelerated and migrate through a vacuum tube to a highly sensitive detector at different speeds depending on the mass of the ions, resulting in different times of flight. Using the time of flight of individual ionized DNA analytes, the system determines mass and displays a mass spectrum identifying various genetic targets [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - No. 5. - P. 385-404]. The disadvantages of the method are labor intensity, high cost of equipment, high cost of the experiment, and the presence of highly qualified personnel.
За прототип выбран коммерческий набор по генотипированию rs3802963 (С/G) гена C11orf58 (Assay ID C_11593996_20; каталог 4351379) компании ThermoFisher. Однако, генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.A commercial kit for genotyping rs3802963 (C/G) of the C11orf58 gene (Assay ID C_11593996_20; catalog 4351379) from ThermoFisher was selected as the prototype. However, genotyping using commercial kits is characterized by high cost, and information about the structure of primers and allele-specific probes necessary for PCR is closed to researchers, and therefore it cannot be reproduced with a standard set of equipment and reagents.
Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs3802963 (C>G) гена C11orf58, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.Thus, there is a real need to create a fast, inexpensive and easily reproducible method for identifying the rs3802963 (C>G) polymorphism of the C11orf58 gene, with a structure of primers and allele-specific probes available to all researchers, which could be used as a “routine” genotyping method in any PCR laboratory.
Раскрытие сущности изобретения. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs3802963 (C>G), локализованного в позиции chr11:16739562 (GRCh38.p14) гена C11orf58 (Gene ID: 10944) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащих флуорофоры FAM и ROX.Disclosure of the invention. The technical result of this invention is the development of an easy-to-use and economically feasible method for genotyping the single nucleotide polymorphism rs3802963 (C>G), localized at position chr11:16739562 (GRCh38.p14) of the C11orf58 gene (Gene ID: 10944) using the polymerase chain reaction method in “real” mode time" using allele-specific signaling probes containing FAM and ROX fluorophores.
Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs3802963 (C>G) гена C11orf58 осуществляют с использованием прямого праймера rs3802963 5'-TCCTCAGCCCTCACCTCATA-3' (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs3802963 5'-TGGGCTAGGAGCTAGGACAA-3' (SEQ ID NO 2), rs3802963-С-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(FAM)TACTGCACTGCCG(RTQ1)-3' (SEQ ID NO 3),The technical result is achieved by the fact that identification of allelic variants rs3802963 (C>G) of the C11orf58 gene is carried out using forward primer rs3802963 5'-TCCTCAGCCCTCACCTCATA-3' (SEQ ID NO 1), reverse primer rs3802963 5'-TGGGCTAGGAGCTAGGACAA-3' (SEQ ID NO 2), rs3802963-C-allele-specific fluorescently labeled probe 5'-(FAM)TACTGCACTGCCG(RTQ1)-3' (SEQ ID NO 3),
rs3802963-G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(ROX)TACTGCAGTGCCG(BHQ2)-3' (SEQ ID NO 4).rs3802963-G allele-specific fluorescently labeled probe 5'-(ROX)TACTGCAGTGCCG(BHQ2)-3' (SEQ ID NO 4).
Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs3802963 (C>G) гена C11orf58 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs3802963-С/С показаны оранжевыми кругами, генотипы rs3802963-С/G показаны зелеными треугольниками, генотипы rs3802963-G/G показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.The invention is illustrated by the following figure: discrimination of alleles at the rs3802963 (C>G) locus of the C11orf58 gene when genotyping by real-time PCR using allele-specific fluorescent probes according to RFU values (relative fluorescence units) on a CFX96 amplifier: genotypes rs3802963- C/C are shown as orange circles, rs3802963-C/G genotypes are shown as green triangles, rs3802963-G/G genotypes are shown as blue squares; The black diamond indicates the negative control.
Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:Work on the design of oligonucleotides included several stages:
1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран сиквенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [С/G] rs3802963 C11orf58, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:1) Using the open database Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html], a sequence flanking the desired single nucleotide substitution [C/G] rs3802963 C11orf58 was selected, and then using the available online software Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] the sequence of oligonucleotides used to carry out the PCR reaction has been selected:
прямой общий праймер rs3802963 5'-TCCTCAGCCCTCACCTCATA-3' (SEQ ID NO 1),forward general primer rs3802963 5'-TCCTCAGCCCTCACCTCATA-3' (SEQ ID NO 1),
обратный общий праймер rs3802963 5'-TGGGCTAGGAGCTAGGACAA-3' (SEQ ID NO 2).reverse general primer rs3802963 5'-TGGGCTAGGAGCTAGGACAA-3' (SEQ ID NO 2).
Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена C11orf58 составляет 155 пар нуклеотидов:The size of the C11orf58 gene fragment amplified during PCR is 155 nucleotide pairs:
TCCTCAGCCCTCACCTCATAGGTTTTAATAGCAAACGGTTTATCCCTTAAAGTAACCCGTTAAATATTTACTGCA[С/G]TGCCGGGTGTTGGGAATTCGGAGAGAAATATGATGCTTATTTTAGGCCTTTTTGTATATTTGTCCTAGCTCCTAGCCCA.TCCTCAGCCCTCACCTCATAGGTTTTAATAGCAAACGGTTTATCCCTTAAAGTAACCCGTTAAATATTTACTGCA[C/G]TGCCGGGTGTTGGGAATTCGGAGAGAAATATGATGCTTATTTTAGGCCTTTTTGTATATTTGTCCTAGCTCCTAGCCCA.
2) Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New york: Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.2) For the design of probes, we used practical recommendations [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New york: Humana Press, 2015]. Hydrolysis probes were used in the reaction. The probe sequence was selected so that it would anneal to the template between the forward and reverse primers. Each probe was equipped with a fluorophore and a fluorescence quencher whose absorption spectrum corresponded to the wavelengths of the fluorophore spectrum. To quench FAM fluorescence, we used the RTQ1 quencher; for ROX fluorescence quenching - BHQ2 quencher.
На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:Based on the stated criteria and practical recommendations, probes with the following structure were selected:
rs3802963-С-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-(FAM)TACTGCACTGCCG(RTQ1)-3' (SEQ ID NO 3),rs3802963-C-allele-specific fluorescently labeled probe 5'-(FAM)TACTGCACTGCCG(RTQ1)-3' (SEQ ID NO 3),
rs3802963-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5'-(ROX)TACTGCAGTGCCG(BHQ2)-3' (SEQ ID NO 4).rs3802963-G allele-specific fluorescently labeled probe 5'-(ROX)TACTGCAGTGCCG(BHQ2)-3' (SEQ ID NO 4).
3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.3) The production of primers and probes was carried out at the service center of NPK Synthol, Moscow.
4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 52°C в течение 1 минуты].4) Using practical experiments, optimal conditions for genotyping were selected, which included the following steps: 50°C for 2 minutes, 95°C for 10 minutes, then 39 cycles [95°C for 10 seconds and 52°C for for 1 minute].
5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 200 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs3802963 6 человек (3%) оказались гомозиготами по аллелю С (генотип С/С); 68 человек (34%) - гетерозиготами (генотип С/G), 126 человек (63%) индивидуумов были гомозиготами по аллелю G (генотип G/G).5) The developed method was tested in the laboratory of genomic research on 200 DNA samples of healthy individuals in the biobank of the Research Institute of Genetic and Molecular Epidemiology of KSMU. Genotyping was carried out according to the RFU (relative fluorescence units) values of probes with fluorescent dyes. According to the results of genotyping rs3802963, 6 people (3%) turned out to be homozygous for the C allele (genotype C/C); 68 people (34%) were heterozygotes (genotype C/G), 126 people (63%) individuals were homozygotes for the G allele (genotype G/G).
6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs3802963 (C>G) гена C11orf58 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).6) Validation of the method was carried out by mass spectrometric analysis on a genomic time-of-flight mass spectrometer MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). The results of both genotyping methods completely coincided (100% of genotypes). However, the patented method for genotyping the polymorphic locus rs3802963 (C>G) of the C11orf58 gene using real-time PCR using allele-specific probes can significantly (by 6 hours) reduce the time of analysis, and also reduces the cost of analysis (by 4-5 once).
Осуществление изобретенияCarrying out the invention
Способ осуществляют следующим образом:The method is carried out as follows:
1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.1. Isolation of DNA from peripheral venous blood. At the first stage, 0.5 ml of PBS was added to 0.5 ml of blood and centrifuged for 10 min at 12 thousand rpm. The supernatant was discarded, 1 ml of PBS was added and centrifuged again under the same conditions. The supernatant was discarded, 200 μl of TE buffer was added, pipetted until the sediment dissolved, and then 10 μl of 1% sodium dodecyl sulfate SDS and 5 μl of proteinase K were sequentially added. The tubes were incubated in a thermostat at t=37°C for 12 hours. During the second stage Four successive centrifugations with phenol and chloroform were performed according to the protocol (10 min, 8 thousand rpm), after which the DNA was precipitated with an ice-cold solution of 95% ethyl alcohol and centrifuged for 10 min at 14.3 thousand rpm. After the alcohol had evaporated, the DNA was dissolved in 100 μl of deionized distilled water. The resulting DNA solution in water had a purity in the range A260/280=1.5-2.0 and an average concentration of about 180-200 ng/μl.
2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.2. Preparation of DNA samples for genotyping. The quality of the isolated DNA was assessed by the degree of purity and concentration of the solution using a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, USA). All analyzed DNA samples were diluted with deionized water to a concentration of 15-20 ng/μl at A260/280=1.5-2.0.
3. Анализ полиморфизма rs3802963 (C>G) гена C11orf58 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: С-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).3. Analysis of the rs3802963 (C>G) polymorphism of the C11orf58 gene using real-time polymerase chain reaction using allele-specific probes. For genotyping, two flanking primers were used, forward (SEQ ID NO 1) and reverse (SEQ ID NO 2), as well as allele-specific probes: C-allele-specific fluorescently labeled probe (SEQ ID NO 3), G-allele- specific fluorescently labeled probe (SEQ ID NO 4).
ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкM каждого праймера, по 5 мкM каждого зонда, 0.03 мM каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl2; 1xПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 52°C в течение 1 минуты].Real-time PCR was carried out in 25 ml of a reaction mixture containing 1.25 U of Hot Start Taq DNA polymerase (Biolabmix, Novosibirsk, Russia), 20 ng of DNA, 10 μM of each primer, 5 μM of each probe, 0.03 mM each dNTP, 2.5 mM MgCl2; 1xPCR buffer [67 mM Tris-HCl, pH 8.8, 16.6 mM (NH4)2SO4, 0.01% Tween-20]. The amplification reaction consisted of a heating step of 50°C for 2 minutes, 95°C for 10 minutes, then 39 cycles [95°C for 10 seconds and 52°C for 1 minute].
4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs3802963 (C>G) гена C11orf58 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю С, зонд с красителем ROX - аллелю G (фиг. 1). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов - соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот С/С. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот G/G. Кластер зеленых треугольников характеризует накопление уровня флуоресценции по обоим зондам позволяет идентифицировать гетерозигот С/G.4. Genotyping. When performing PCR in a cycler with fluorescent detection (Bio-Rad CFX96 or similar cycler), genotyping is carried out according to RFU (relative fluorescence units) values. For rs3802963 (C>G) of the C11orf58 gene, the probe with the fluorescent dye FAM corresponds to the C allele, and the probe with the ROX dye corresponds to the G allele (Fig. 1). The figure shows a clear division of the samples into clusters, where the black diamond corresponds to the negative control, the cluster of orange circles corresponds to the probe with the fluorescent dye FAM and allows the identification of C/C homozygotes. The cluster of blue squares corresponds to the ROX dye probe and allows the identification of G/G homozygotes. The cluster of green triangles characterizes the accumulation of fluorescence levels for both probes, allowing the identification of C/G heterozygotes.
РезюмеSummary
Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs3802963 (C>G) гена C11orf58 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена C11orf58, а также в научных целях.Thus, an effective and inexpensive method has been developed for the rapid identification of the polymorphic variant rs3802963 (C>G) of the C11orf58 gene in humans using real-time PCR using allele-specific fluorescent probes, which can be used in medicine to determine hereditary predisposition to the development of diseases associated with carriage of C11orf58 gene polymorphisms, as well as for scientific purposes.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Method
генотипирования полиморфного локуса rs3802963 (C G) гена C11orf58 у genotyping of the polymorphic locus rs3802963 (C G) of the C11orf58 gene in
человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением human by real-time PCR using
аллель-специфических флуоресцентных зондов.xml" softwareName="WIPO allele-specific fluorescent probes.xml" softwareName="WIPO
Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-04-17">Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-04-17">
<ApplicationIdentification> <ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>
<FilingDate></FilingDate> <FilingDate></FilingDate>
</ApplicationIdentification> </ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>1833</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>1833</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное <ApplicantName languageCode="ru">Federal state
бюджетное образовательное учреждение высшего образования budgetary educational institution of higher education
"Курский государственный медицинский университет" "Kursk State Medical University"
Министерства здравоохранения Российской Федерации,</ApplicantName>Ministry of Health of the Russian Federation,</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical <ApplicantNameLatin>Kursk State Medical
University</ApplicantNameLatin>University</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования <InventionTitle languageCode="en">Genotyping method
полиморфного локуса rs3802963 (C>G) гена C11orf58 у человека polymorphic locus rs3802963 (C>G) of the C11orf58 gene in humans
методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением real-time PCR method using
аллель-специфических флуоресцентных зондов</InventionTitle>allele-specific fluorescent probes</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"> <INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcctcagccctcacctcata</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tcctcagccctcacctcata</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"> <INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgggctaggagctaggacaa</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tgggctaggagctaggacaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>13</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>13</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..13</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..13</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"> <INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tactgcactgccg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tactgcactgccg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>13</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>13</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..13</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..13</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8"> <INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tactgcagtgccg</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tactgcagtgccg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (1)
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2819936C1 true RU2819936C1 (en) | 2024-05-28 |
Family
ID=
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006110735A2 (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-19 | Linkage Biosciences, Inc. | Genotyping hla loci |
WO2011056133A1 (en) * | 2009-11-03 | 2011-05-12 | Sva Statens Veterinärmedicinska Anstalt | Genotyping |
RU2528742C2 (en) * | 2012-11-06 | 2014-09-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Геномная диагностика" (ООО "Геномная диагностика") | Synthetic oligonucleotide primers and method for genetic typing for personal identification by y-chromosome microsatellite dna markers system |
RU2651769C1 (en) * | 2017-03-27 | 2018-04-23 | .Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России) | Method of early diagnostics of acute infectious endocarditis |
RU2662972C1 (en) * | 2018-04-26 | 2018-07-31 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий" (ФГБНУ ЦЭЭРБ) | Method for carrying out pcr with allele-specific probes for genotyping cattle by the alleles a and k of the dgat1 gene |
RU2708559C1 (en) * | 2019-05-07 | 2019-12-09 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий" (ФГБНУ ЦЭЭРБ) | Method for real-time pcr for cattle genotyping by alleles 337c/g of fshr (rs43745234) gene |
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006110735A2 (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-19 | Linkage Biosciences, Inc. | Genotyping hla loci |
WO2011056133A1 (en) * | 2009-11-03 | 2011-05-12 | Sva Statens Veterinärmedicinska Anstalt | Genotyping |
RU2528742C2 (en) * | 2012-11-06 | 2014-09-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Геномная диагностика" (ООО "Геномная диагностика") | Synthetic oligonucleotide primers and method for genetic typing for personal identification by y-chromosome microsatellite dna markers system |
RU2651769C1 (en) * | 2017-03-27 | 2018-04-23 | .Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России) | Method of early diagnostics of acute infectious endocarditis |
RU2662972C1 (en) * | 2018-04-26 | 2018-07-31 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий" (ФГБНУ ЦЭЭРБ) | Method for carrying out pcr with allele-specific probes for genotyping cattle by the alleles a and k of the dgat1 gene |
RU2708559C1 (en) * | 2019-05-07 | 2019-12-09 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий" (ФГБНУ ЦЭЭРБ) | Method for real-time pcr for cattle genotyping by alleles 337c/g of fshr (rs43745234) gene |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2010506595A (en) | Allele typing method | |
CN110484621B (en) | Early warning method for liver cancer | |
JP4515524B2 (en) | Normal-tension glaucoma disease susceptibility gene and use thereof | |
AU2020204339B2 (en) | Major histocompatibility complex single nucleotide polymorphisms | |
RU2819936C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs3802963 (CG) OF C11orf58 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2819835C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs7951676 (GT) OF C11orf58 GENE IN PERSON BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2820348C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs11024032 (CT) OF C11orf58 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2819930C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs10832676 (A>G) OF C11orf58 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2819840C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs6677 (T>G) OF C11orf58 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2819255C1 (en) | Method for genotyping a polymorphic locus rs11024030 (t>c) of the c11orf58 gene in a human by real-time pcr using allele-specific fluorescent probes | |
RU2819931C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs11024031 (TC) OF THE C11orf58 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2822459C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs11826990 (T>G) OF C11ORF58 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2810472C1 (en) | METHOD OF GENOTYPING rs11666524 (G>A) POLYMORPHIC LOCUS OF C19orf53 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2820349C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs10766342 (GA) OF C11orf58 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2810474C1 (en) | METHOD OF GENOTYPING rs2901077 (C>T) POLYMORPHIC LOCUS OF C19orf53 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2821923C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs7155973 (A>G) OF HSP90AA1 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2808839C1 (en) | METHOD OF GENOTYPING rs346158 (T>C) POLYMORPHIC LOCUS OF C19orf53 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2821905C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs706121 (C>T) OF THE BAG1 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2821904C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs7949972 (C>T) OF ELF5 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2822882C1 (en) | Method for genotyping polymorphic locus rs13161158 (t>c) of hspa4 gene in human by real-time pcr using allele-specific fluorescent probes | |
RU2820347C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs9636867 (A>G) OF IFNAR2 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2808841C1 (en) | METHOD OF GENOTYPING rs346157 (A>G) POLYMORPHIC LOCUS OF C19orf53 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2822044C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs143334143 (G>A) OF CCHCR1 GENE IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2808846C1 (en) | METHOD OF GENOTYPING rs8107914 (CT) POLYMORPHIC LOCUS OF C19orf53 GENE IN HUMANS BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES | |
RU2821891C1 (en) | METHOD FOR GENOTYPING POLYMORPHIC LOCUS rs17713054 (G>A) IN HUMAN BY REAL-TIME PCR USING ALLELE-SPECIFIC FLUORESCENT PROBES |