RU2819908C1 - Enzymatic method of producing lactulose-containing postbiotic product - Google Patents
Enzymatic method of producing lactulose-containing postbiotic product Download PDFInfo
- Publication number
- RU2819908C1 RU2819908C1 RU2023125192A RU2023125192A RU2819908C1 RU 2819908 C1 RU2819908 C1 RU 2819908C1 RU 2023125192 A RU2023125192 A RU 2023125192A RU 2023125192 A RU2023125192 A RU 2023125192A RU 2819908 C1 RU2819908 C1 RU 2819908C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hours
- lactulose
- lactose
- temperature
- carried out
- Prior art date
Links
- JCQLYHFGKNRPGE-FCVZTGTOSA-N lactulose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 JCQLYHFGKNRPGE-FCVZTGTOSA-N 0.000 title claims abstract description 55
- 229960000511 lactulose Drugs 0.000 title claims abstract description 55
- PFCRQPBOOFTZGQ-UHFFFAOYSA-N lactulose keto form Natural products OCC(=O)C(O)C(C(O)CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O PFCRQPBOOFTZGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 55
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 title claims abstract description 7
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 44
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 39
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims abstract description 33
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims abstract description 22
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 20
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 19
- 108010059881 Lactase Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 16
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 14
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims abstract description 13
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims abstract description 13
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000008719 thickening Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 14
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 239000008267 milk Substances 0.000 abstract description 6
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 abstract description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 9
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 3
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 3
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 3
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 2
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 2
- 108030002154 Cellobiose epimerases Proteins 0.000 description 2
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000253911 Saccharomyces fragilis Species 0.000 description 2
- 235000018368 Saccharomyces fragilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 2
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229940031154 kluyveromyces marxianus Drugs 0.000 description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- DKXNBNKWCZZMJT-QMRWEYQWSA-N (2s,3r,4r,5r)-2,3,5,6-tetrahydroxy-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexanal Chemical compound O=C[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DKXNBNKWCZZMJT-QMRWEYQWSA-N 0.000 description 1
- 241000205585 Aquilegia canadensis Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 235000013956 Lactobacillus acidophilus Nutrition 0.000 description 1
- 241000218492 Lactobacillus crispatus Species 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940002008 bifidobacterium bifidum Drugs 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000014048 cultured milk product Nutrition 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000007407 health benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008821 health effect Effects 0.000 description 1
- 230000007366 host health Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- -1 isopropyl beta-D Chemical compound 0.000 description 1
- 229940039695 lactobacillus acidophilus Drugs 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-GFVSVBBRSA-N mannan Chemical class O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H](O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]3O)CO)[C@@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-GFVSVBBRSA-N 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021243 milk fat Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 235000020712 soy bean extract Nutrition 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002207 thermal evaporation Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006098 transglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000005918 transglycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Изобретение относится к пищевой биотехнологии и молочной промышленности и может быть использовано при производстве лактулозосодержащего продукта-постбиотика из вторичного молочного сырья ферментативным методом.The invention relates to food biotechnology and the dairy industry and can be used in the production of lactulose-containing postbiotic product from secondary dairy raw materials using the enzymatic method.
Уровень техникиState of the art
Лактулоза является пребиотиком, который находит широкое применение в медицине и пищевой промышленности. Производство лактулозы основано на изомеризации лактозы в щелочных средах при высоких температурах. Альтернативой являются ферментативные способы, которые считаются более экологически чистыми и позволяют проводить процессы в более мягких условиях. Еще одно преимущество биосинтеза лактулозы – это возможность использования в качестве источников лактозы вторичного молочного сырья. Lactulose is a prebiotic that is widely used in medicine and the food industry. Lactulose production is based on the isomerization of lactose in alkaline media at high temperatures. An alternative is enzymatic methods, which are considered more environmentally friendly and allow processes to be carried out under milder conditions. Another advantage of lactulose biosynthesis is the possibility of using secondary dairy raw materials as sources of lactose.
В настоящее время существует два основных пути ферментативного превращения лактозы в лактулозу – изомеризация (прямой) и трансгалактозилирование (с промежуточным гидролизом). Для первого применяют целлюлозо-2-эпимеразы, которые пока не имеют статуса безопасности, их не производят в промышленных масштабах, а побочным продуктом реакции является эпилактоза. Применение целлобиозо-эпимераз позволяет достигать высоких выходов лактулозы, но для получения этих ферментов используют методы генной инженерии и мутагенеза, что ставит под сомнение их безопасность (Биотехнология лактулозы: современные достижения, проблемы и перспективы / С. А. Рябцева, А. Г. Храмцов , М. А. Шпак , А. Д. Лодыгин , Г. С. Анисимов, С. Н. Сазанова, Ю. А. Табакова // Техника и технология пищевых производств. 2023. Т. 53. № 1. С. 97–122. (На англ.). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2023-1-2419). Currently, there are two main ways of enzymatic conversion of lactose into lactulose - isomerization (direct) and transgalactosylation (with intermediate hydrolysis). For the first, cellulose-2-epimerases are used, which do not yet have a safety status, they are not produced on an industrial scale, and the byproduct of the reaction is epilactose. The use of cellobiose epimerases makes it possible to achieve high yields of lactulose, but to obtain these enzymes, methods of genetic engineering and mutagenesis are used, which casts doubt on their safety (Biotechnology of lactulose: modern achievements, problems and prospects / S. A. Ryabtseva, A. G. Khramtsov , M. A. Shpak, A. D. Lodygin, G. S. Anisimov, S. N. Sazanova, Yu. A. Tabakova // Technology and technology of food production. 2023. T. 53. No. 1. P. 97 –122. (In English). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2023-1-2419
Известен способ получения лактулозы с помощью цельноклеточного катализа (патент CN104004699A, опубл. 2014-08-27), согласно которому в качестве продуцирующих штаммов бактерий берут рекомбинантную кишечную палочку E. coli BL 21 (DE3) для получения целлобиозоэпимеразы, вместо изопропил-бета-D-сульфогалактозида (ИПТГ) используют лактозу в качестве индуцирующего агента для ферментного культивирования, а осадок, полученный центрифугированием, подвергают пермеабилизации этиловым спиртом и сушке вымораживанием в вакууме, чтобы они служили клеточным биокатализатором для прямого превращения лактозы в лактулозу. 1-100 мл центрифужного осадка ферментированной жидкости суспендируют в 1 л в этаноле 1-90% (предпочтительно 40%) (об./об.) при 4-30°С, перемешивании в течение 5-120 мин. Порошок получают путем вакуумной лиофилизации, используют для получения лактулозы в качестве клеточного катализатора. Лактозу смешивают с буферной жидкостью до 50-800 г/л, регулируют рН до 6,0-9,5. Клеточный биокатализатор добавляют в раствор субстрата, условие конверсии: катализатор 1-100 ЕД/мл, температура реакции 40-95°С, время реакции 1-24 часа. К недостаткам способа относится применение генно-модифицированных микроорганизмов и фермента с недоказанной безопасностью, дополнительные этапы центрифугирования клеток, их пермеабилизации (для повышения проницаемости клеточных стенок для фермента, с внесением больших количеств этилового спирта) и лиофильной сушки.There is a known method for producing lactulose using whole-cell catalysis (patent CN104004699A, published 2014-08-27), according to which recombinant Escherichia coli E. coli BL 21 (DE3) is taken as producing strains of bacteria to produce cellobiose epimerase , instead of isopropyl beta-D α-sulfogalactoside (IPTG) uses lactose as the inducing agent for enzyme culture, and the centrifugation precipitate is permeabilized with ethyl alcohol and freeze-dried under vacuum to serve as a cellular biocatalyst for the direct conversion of lactose to lactulose. 1-100 ml of the centrifugal sediment of the fermented liquid is suspended in 1 liter in ethanol 1-90% (preferably 40%) (v/v) at 4-30°C, stirring for 5-120 minutes. The powder is obtained by vacuum lyophilization and is used to obtain lactulose as a cellular catalyst. Lactose is mixed with a buffer liquid to 50-800 g/l, pH is adjusted to 6.0-9.5. The cellular biocatalyst is added to the substrate solution, conversion condition: catalyst 1-100 U/ml, reaction temperature 40-95°C, reaction time 1-24 hours. The disadvantages of this method include the use of genetically modified microorganisms and an enzyme with unproven safety, additional stages of centrifugation of cells, their permeabilization (to increase the permeability of cell walls for the enzyme, with the addition of large quantities of ethyl alcohol) and freeze drying.
Второй возможный путь ферментативного получения лактулозы основан на трансгалактозилировании лактозы в присутствии фруктозы, для которого чаще всего применяют β-галактозидазы (лактазы), имеющие международный статус безопасности (GRAS) и доступные на рынке, с хорошо изученным механизмом действия. Основными продуцентами β-галактозидаз для получения лактулозы являются дрожжи Kluyveromyces lactis или плесени Aspergillus оryzae. Синтез лактулозы в основном осуществляют с использованием коммерческих (очищенных, концентрированных) препаратов β-галактозидазы, что существенно удорожает стоимость готового продукта (Биотехнология лактулозы: современные достижения, проблемы и перспективы / С. А. Рябцева, А. Г. Храмцов , М. А. Шпак, А. Д. Лодыгин , Г. С. Анисимов, С. Н. Сазанова, Ю. А. Табакова // Техника и технология пищевых производств. 2023. Т. 53. № 1. С. 97–122. (На англ.). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2023-1-2419).The second possible route for the enzymatic production of lactulose is based on the transgalactosylation of lactose in the presence of fructose, for which β-galactosidases (lactases) have an international safety status (GRAS) and are available on the market, with a well-studied mechanism of action, most often used. The main producers of β-galactosidases for the production of lactulose are the yeast Kluyveromyces lactis or the mold Aspergillus oryzae. Lactulose synthesis is mainly carried out using commercial (purified, concentrated) β-galactosidase preparations, which significantly increases the cost of the finished product (Lactulose biotechnology: modern achievements, problems and prospects / S. A. Ryabtseva, A. G. Khramtsov, M. A Shpak, A. D. Lodygin, G. S. Anisimov, S. N. Sazanova, Yu. A. Tabakova // Technology and technology of food production. 2023. T. 53. No. 1. P. 97–122 ( In English). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2023-1-2419).
Источником лактазы могут быть и другие микроорганизмы, возможно также применение частично очищенных или неочищенных ферментов, полученных в едином цикле производства лактулозы. Известен ферментный метод получения лактулозы (патент CN104805152A, опубл.12.07.2015). Способ начинается с получения лактазы с использованием мутантного штамма Arthrobacter. Культивирование проводят в среде, содержащей: источник углерода (глюкоза 1 %, лактоза 2 % или глицерин 0,2 %), один или несколько источников азота (дрожжевой экстракт 0,5 – 1,4 % и/или пептон 0,5 – 1 % или кукурузный экстракт 2,5 %), неорганическую соль (хлорид кальция, Zn 2+, сульфат магния, гидрофосфат калия, один или несколько первичных фосфатов калия или хлорида железа, их концентрация составляет 12-28 ммоль/л. Условия культивирования штамма Arthrobacter: температура 25 – 30 °С, продолжительность 0,8 – 1,5 ч при постоянном перемешивании со скоростью 200 об/мин. Затем полученный раствор центрифугируют в течение 10 – 15 минут при скорости 5000-6000 об/мин. Осадок растворяют в буфере с фосфорной кислотой того же объема (10 ммоль/л, pH 7,0). Далее проводят разрушение клеток ультразвуком и раствор еще раз центрифугируют в течение 10-15 минут при 10000-12000 об/мин. Отбирают надосадочную жидкость, которая представляет собой ферментный препарат лактазы. Для синтеза лактулозы используют субстрат, состоящий из: фосфорнокислого буферного раствора рН 5,5-8,0, лактозы 300 г/л и фруктозы 250 г/л. Дополнительно субстрат может содержать 10 ммоль/л Zn2+ и 4-6 ммоль/л хлорида железа. Ферментный препарат лактазы добавляют в количестве 600 ед/л, раствор выдерживают при 20°С в течение 1,5 ч. С целью доочистки в полученную смесь вносят безводный спирт, доводя его конечную концентрацию до 65 %, центрифугируют в течение 10 мин при 12000 об/мин, надосадочную жидкость концентрируют при 65°C и определяют количество лактулозы. Недостатки: использование мутантного штамма и сложных дорогих питательных сред для его культивирования, неоднократное центрифугирование для отделения клеток, использование больших объемов этилового спирта для выделения лактулозы.Other microorganisms can also be a source of lactase; it is also possible to use partially purified or unpurified enzymes obtained in a single lactulose production cycle. An enzymatic method for producing lactulose is known (patent CN104805152A, publ. 07/12/2015). The method begins with the production of lactase using a mutant strain of Arthrobacter. Cultivation is carried out in a medium containing: a carbon source (glucose 1%, lactose 2% or glycerol 0.2%), one or more nitrogen sources (yeast extract 0.5 - 1.4% and/or peptone 0.5 - 1 % or corn extract 2.5%), inorganic salt (calcium chloride, Zn 2+ , magnesium sulfate, potassium hydrogen phosphate, one or more primary potassium phosphates or ferric chloride, their concentration is 12-28 mmol/l. Conditions for cultivating the Arthrobacter strain : temperature 25 - 30 °C, duration 0.8 - 1.5 hours with constant stirring at a speed of 200 rpm. Then the resulting solution is centrifuged for 10 - 15 minutes at a speed of 5000-6000 rpm. with phosphoric acid of the same volume (10 mmol/l, pH 7.0). Next, the cells are destroyed by ultrasound and the solution is centrifuged again for 10-15 minutes at 10,000-12,000 rpm. The supernatant liquid, which is an enzyme, is collected. lactase preparation. For the synthesis of lactulose, a substrate is used, consisting of: a phosphate buffer solution pH 5.5-8.0, lactose 300 g/l and fructose 250 g/l. Additionally, the substrate may contain 10 mmol/l Zn 2+ and 4-6 mmol/l ferric chloride. The lactase enzyme preparation is added in an amount of 600 units/l, the solution is kept at 20°C for 1.5 hours. For the purpose of additional purification, anhydrous alcohol is added to the resulting mixture, bringing its final concentration to 65%, and centrifuged for 10 minutes at 12,000 rpm /min, the supernatant is concentrated at 65°C and the amount of lactulose is determined. Disadvantages: the use of a mutant strain and complex expensive nutrient media for its cultivation, repeated centrifugation to separate cells, the use of large volumes of ethyl alcohol to isolate lactulose.
Применение неочищенных ферментов снижает стоимость готовых продуктов. Более того, ферментированные смеси могут содержать разнообразные полезные для здоровья человека продукты метаболизма и компоненты клеток микроорганизмов-продуцентов ферментов, и могут быть использованы для получения продуктов-постбиотиков, которые считаются очень перспективными (Рожкова И.В., Леонова В.А., Бегунова А.В. Постбиотики как потенциальные компоненты кисломолочных продуктов с функциональными свойствами // Молочная промышленность. 2022. № 3. С. 16-18.) Хотя этот новый термин появился недавно, и его определение уточняется, многие ученые считают, что концепция постбиотиков включает инактивированные микроорганизмы, благотворно влияющие на здоровье хозяина. (Salminen, S.; Collado, M.C.; Endo, A.; et al. The International Scientific Association of Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on the definition and scope of postbiotics. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2021, 18, 649–667.). В последние годы появились патенты на способы получения продуктов-постбиотиков.The use of crude enzymes reduces the cost of finished products. Moreover, fermented mixtures can contain a variety of metabolic products beneficial to human health and components of the cells of enzyme-producing microorganisms, and can be used to obtain postbiotic products, which are considered very promising (Rozhkova I.V., Leonova V.A., Begunova A.V. Postbiotics as potential components of fermented milk products with functional properties // Dairy Industry 2022. No. 3. P. 16-18.) Although this new term has appeared recently, and its definition is being clarified, many scientists believe that the concept of postbiotics includes inactivated microorganisms that have a beneficial effect on the health of the host. (Salminen, S.; Collado, M.C.; Endo, A.; et al. The International Scientific Association of Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on the definition and scope of postbiotics. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2021, 18 , 649–667). In recent years, patents have appeared on methods for obtaining postbiotic products.
В патенте CN115606805 (2023-01-17 Postbiotic composition and application thereof in oral health) описано получение постбиотической композиции, которая включает следующие компоненты в массовых частях: 2-25 частей инактивированной Lactobacillus crispatus, 5-50 частей дрожжевого бета-глюкана и 1-10 частей порошка цветков жимолости. Продукт предназначен для ухода за полостью рта, так как может эффективно ингибировать нежелательные микроорганизмы. Недостатком является сложность композиции, включающей дрожжевой бета-глюкан (иммуномодулятор) как отдельный компонент, что удорожает готовый продукт. The patent CN115606805 (2023-01-17 Postbiotic composition and application thereof in oral health) describes the preparation of a postbiotic composition, which includes the following components in mass parts: 2-25 parts of inactivated Lactobacillus crispatus, 5-50 parts of yeast beta-glucan and 1- 10 parts honeysuckle flower powder. The product is intended for oral care as it can effectively inhibit unwanted microorganisms. The disadvantage is the complexity of the composition, which includes yeast beta-glucan (immunomodulator) as a separate component, which increases the cost of the finished product.
В патенте RU2658777 (2018-06-22 Способ производства постбиотического продукта) готовят гидролизатно-молочную среду на основе гидролизата белкового компонента, полученного ферментативным гидролизом, включающего обезжиренное коровье молоко и экстракт соевых бобов в соотношении 9:1. Вводят в гидролизат стабилизирующие добавки и факторы роста микроорганизмов, стерилизуют полученную гидролизатно-молочную среду, раздельно вводят в нее суточные культуры микроорганизмов рода Lactobacillus и рода Bifidobacterium или рода Lactobacillus и рода Streptococcus в равных соотношениях и культивируют. Полученную смесь разрушают прогреванием 56-80°С в течение 45-90 мин или замораживанием при температурах -5-(-10)°С, выдерживают при этой температуре в течение 10-24 ч с последующим медленным размораживанием при комнатной температуре или введением в микробную суспензию органических кислот, выдерживают полученную смесь в течение суток при комнатной температуре и хранят готовый продукт при температуре 2-30°С. Недостатком способа является применение сложных по составу и дорогих питательных сред, отсутсвие постбиотиков дрожжевого происхождения и лактулозы. In patent RU2658777 (2018-06-22 Method for producing a postbiotic product), a hydrolyzate-milk medium is prepared based on the hydrolyzate of the protein component obtained by enzymatic hydrolysis, including skim cow's milk and soybean extract in a ratio of 9:1. Stabilizing additives and microbial growth factors are introduced into the hydrolyzate, the resulting hydrolyzate-milk medium is sterilized, daily cultures of microorganisms of the genus Lactobacillus and the genus Bifidobacterium or the genus Lactobacillus and the genus Streptococcus are separately introduced into it in equal proportions and cultivated. The resulting mixture is destroyed by heating 56-80°C for 45-90 minutes or freezing at temperatures -5-(-10)°C, maintained at this temperature for 10-24 hours, followed by slow thawing at room temperature or introduction into a microbial suspension of organic acids, keep the resulting mixture for 24 hours at room temperature and store the finished product at a temperature of 2-30°C. The disadvantage of this method is the use of complex and expensive nutrient media, the lack of postbiotics of yeast origin and lactulose.
Наиболее близкими по технической сущности к предлагаемому способу являются способы, описанные в патенте ЕР 3542641 и патенте RU 2622078. The closest in technical essence to the proposed method are the methods described in patent EP 3542641 and patent RU 2622078.
В патенте ЕР 3542641 (Лактулозосодержащий продукт и способ получения лактулозосодержащего продукта, опубл. 25.09.2019) описан способ получения лактулозосодержащего продукта, включающий следующие стадии: а) получение лактозосодержащего субстрата, b) обработка лактозосодержащего субстрата β-галактозидазой и/или β-глюкозидазой в присутствии фруктозы для получения субстрата, содержащего лактулозу; c) инактивация β-галактозидазы и/или β-глюкозидазы путем нагревания; и d) получение лактулозосодержащего ретентата путем нанофильтрации и/или диафильтрации лактулозосодержащего субстрата. В качестве сырья используют пермеаты, полученные путем ультрафильтрации предпочтительно молока, сыворотки, производного молока или производного сыворотки. Пермеат нагревают (пастеризуют и/или стерилизуют). Для проведения стадии b) используют β-галактозидазу из Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis, Bacillus licheniformis или Bifidobacterium bifidum и/или β-глюкозидазу из Aspergillus oryzae или Pyrococcus furiosus. Процесс проводят при температуре от 2°С до 42°С, в частности от 5°С до 15°С, предпочтительно от 5°С до 7°С, в диапазоне рН от 4,0 до 7,0, в частности от 4,0 до 6,5, предпочтительно от 4,5 до 6,5, с ферментативной активностью, в частности нормализованной ферментативной активностью, от 0,1 нкат до 20 нкат, в частности от 1 нкат до 10 нкат, предпочтительно 2 нкат, на мл лактозосодержащего субстрата и в течение периода от 12 до 72 часов, в частности от 24 до 60 часов, предпочтительно от 40 до 56 часов. Этап с) проводят при температуре от 90°С до 150°С, в частности от 100°С до 130°С, предпочтительно от 120°С до 130°С. Нанофильтрацию проводят при трансмембранном перепаде давления от 10 до 50 бар, в частности от 10 до 40 бар, предпочтительно от 20 до 40 бар. Перед диафильтрацией снижают трансмембранный перепад давления, в частности, с 30 бар до 20 бар. Недостатки способа: применение дорогостоящих коммерческих (очищенных) ферментов, длительный и дорогостоящий процесс выделения лактулозы.The patent EP 3542641 (Lactulose-containing product and method for producing a lactulose-containing product, published on September 25, 2019) describes a method for producing a lactulose-containing product, including the following stages: a) obtaining a lactose-containing substrate, b) treating the lactose-containing substrate with β-galactosidase and/or β-glucosidase in the presence of fructose to obtain a substrate containing lactulose; c) inactivation of β-galactosidase and/or β-glucosidase by heating; and d) obtaining a lactulose-containing retentate by nanofiltration and/or diafiltration of the lactulose-containing substrate. Permeates obtained by ultrafiltration of preferably milk, whey, milk derivative or whey derivative are used as raw materials. The permeate is heated (pasteurized and/or sterilized). To carry out step b), β-galactosidase from Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis, Bacillus licheniformis or Bifidobacterium bifidum and/or β-glucosidase from Aspergillus oryzae or Pyrococcus furiosus is used. The process is carried out at a temperature from 2°C to 42°C, in particular from 5°C to 15°C, preferably from 5°C to 7°C, in a pH range from 4.0 to 7.0, in particular from 4 .0 to 6.5, preferably from 4.5 to 6.5, with an enzymatic activity, in particular normalized enzymatic activity, from 0.1 ncat to 20 ncat, in particular from 1 ncat to 10 ncat, preferably 2 ncat, per ml of lactose-containing substrate and for a period of 12 to 72 hours, in particular 24 to 60 hours, preferably 40 to 56 hours. Step c) is carried out at a temperature of from 90°C to 150°C, in particular from 100°C to 130°C, preferably from 120°C to 130°C. Nanofiltration is carried out at a transmembrane pressure drop of 10 to 50 bar, in particular 10 to 40 bar, preferably 20 to 40 bar. Before diafiltration, the transmembrane pressure drop is reduced, in particular from 30 bar to 20 bar. Disadvantages of the method: the use of expensive commercial (purified) enzymes, the lengthy and expensive process of lactulose isolation.
В патенте RU 2622078 (С1, МПК С12N 9/14. Способ получения комбинированного ферментного препарата бета-галактозидаз / Рябцева С.А., Скрипнюк А.А., Котова А.А., Храмцов А.Г., Родная А.Б., Лодыгин А.Д., Мартак А.А.// приор. 12.01.2016, опубл. 9.06.2017, бюл. № 16) описан способ получения комбинированного ферментного препарата бета-галактозидаз, включающий подготовку лактозосодержащего сырья, культивирование микроорганизмов, извлечение ферментов, их очистку методом ультрафильтрации и концентрирование, отличающийся тем, что в лактозосодержащем сырье с массовой долей лактозы 3-15 % культивируют одновременно лактозосбраживающие дрожжи и термофильные молочнокислые бактерии при температуре (30±2) °С в течение 7-16 ч, а извлечение ферментов проводят путем автолиза при температуре (50±5) °С в течение 6-12 часов. Недостатком является медленное развитие термофильных молочнокислых бактерий при температурах, оптимальных для дрожжей (30±2) °С, недостаточное накопление продуктов метаболизма продуцентов лактаз, и, как следствие, низкая эффективность автолиза и активность полученного ферментного препарата, особенно в отношении трансгалактозилирования для биосинтеза лактулозы.In patent RU 2622078 (C1, IPC C12N 9/14. Method for producing a combined enzyme preparation of beta-galactosidases / Ryabtseva S.A., Skripnyuk A.A., Kotova A.A., Khramtsov A.G., Rodnaya A.B. ., Lodygin A.D., Martak A.A.//prior. 01/12/2016, publ. 06/09/2017, bulletin No. 16) describes a method for producing a combined enzyme preparation of beta-galactosidases, including the preparation of lactose-containing raw materials, cultivation of microorganisms, extraction of enzymes, their purification by ultrafiltration and concentration, characterized in that in lactose-containing raw materials with a lactose mass fraction of 3-15%, lactose-fermenting yeast and thermophilic lactic acid bacteria are simultaneously cultivated at a temperature of (30±2) °C for 7-16 hours, and Enzyme extraction is carried out by autolysis at a temperature of (50±5) °C for 6-12 hours. The disadvantage is the slow development of thermophilic lactic acid bacteria at temperatures optimal for yeast (30±2) °C, insufficient accumulation of metabolic products of lactase producers, and, as a consequence, low efficiency of autolysis and activity of the resulting enzyme preparation, especially with regard to transgalactosylation for the biosynthesis of lactulose.
Осуществление изобретенияCarrying out the invention
Технический результат предлагаемого способа заключается в получении активного комбинированного препарата лактаз для биосинтеза лактулозы и производства лактулозосодержащего продукта-постбиотика из вторичного молочного сырья в рамках единого цикла. Данный технический результат достигается за счет двухэтапного культивирования продуцентов лактаз (лактозосбраживающих дрожжей и молочнокислых бактерий), их эффективного автолиза и биосинтеза лактулозы с использованием полученного неочищенного ферментного препарата, инактивации и концентрирования полученной ферментированной смеси. The technical result of the proposed method is to obtain an active combined lactase preparation for the biosynthesis of lactulose and the production of a lactulose-containing postbiotic product from secondary dairy raw materials within a single cycle. This technical result is achieved through two-stage cultivation of lactase producers (lactose-fermenting yeast and lactic acid bacteria), their effective autolysis and lactulose biosynthesis using the resulting crude enzyme preparation, inactivation and concentration of the resulting fermented mixture.
Предлагается ферментативный способ получения лактулозосодержащего продукта-постбиотика, включающий подготовку лактозосодержащего сырья, культивирование лактозосбраживающих дрожжей и термофильных молочнокислых бактерий, извлечение лактаз, биосинтез лактулозы с использованием полученных лактаз, инактивацию клеток и ферментов путем нагревания, концентрирование ферментированной смеси путем сгущения и/или сушки, отличающийся тем, что используют двухэтапное культивирование продуцентов лактаз: на первом этапе раздельное в аэробных условиях, дрожжи при температуре (25 ÷ 35) °С в течение (8 ÷ 24) ч. при интенсивном перемешивании, молочнокислые бактерии при температуре (37 ÷ 45) °С в течение (8 ÷ 24) ч. без перемешивания; на втором этапе совместное в анаэробных условиях при температуре (25 ÷ 40) °С в течение (12 ÷ 36) ч., извлечение ферментов проводят путем автолиза при температуре (40 ÷ 60) °С в течение (18 ÷ 30) ч., а биосинтез лактулозы проводят с использованием полученного неочищенного ферментного препарата при температуре (30 ÷ 60) °С в течение (0,1 ÷ 14) ч. An enzymatic method for producing a lactulose-containing postbiotic product is proposed, including preparation of lactose-containing raw materials, cultivation of lactose-fermenting yeast and thermophilic lactic acid bacteria, extraction of lactases, biosynthesis of lactulose using the obtained lactases, inactivation of cells and enzymes by heating, concentration of the fermented mixture by thickening and/or drying, characterized because they use two-stage cultivation of lactase producers: in the first stage, separate under aerobic conditions, yeast at a temperature of (25 ÷ 35) ° C for (8 ÷ 24) hours with intensive stirring, lactic acid bacteria at a temperature (37 ÷ 45) ° C for (8 ÷ 24) hours without stirring; at the second stage, combined under anaerobic conditions at a temperature of (25 ÷ 40) °C for (12 ÷ 36) hours, enzyme extraction is carried out by autolysis at a temperature of (40 ÷ 60) °C for (18 ÷ 30) hours, and lactulose biosynthesis is carried out using the resulting crude enzyme preparation at a temperature of (30 ÷ 60) °C for (0.1 ÷ 14) hours.
Способ заключается в следующем.The method is as follows.
В качестве сырья и питательной среды для культивирования микроорганизмов используют вторичное молочное сырье (в т.ч. подсырную и/или творожную сыворотку, ультрафильтрационные (УФ) пермеаты обезжиренного молока и сыворотки), содержащее лактозу, азотистые и минеральные вещества, необходимые для развития лактозосбраживающих дрожжей и молочнокислых микроорганизмов. При использовании молочной сыворотки, как правило, ее очищают от остатков молочного жира и казеиновой пыли на специальных сепараторах. Для уничтожения нежелательных микроорганизмов, которые могут влиять на культивирование продуцентов лактаз и качество готового продукта, проводят пастеризацию или стерилизацию сырья при режимах, принятых в отрасли. Например, могут быть использованы режимы высокотемпературной пастеризации при (85 ÷ 87) °С в течение 3-5 сек. Лактозосодержащее сырье может быть натуральным или подсгущенным, с массовой долей лактозы в исходном растворе от 3 до 15 %, что указано в патенте RU 2622078. Режимы обработки и желательный для культивирования состав молочного сырья известны и не являются отличительными признаками изобретения.As a raw material and nutrient medium for the cultivation of microorganisms, secondary dairy raw materials are used (including cheese and/or curd whey, ultrafiltration (UV) permeates of skim milk and whey), containing lactose, nitrogenous and mineral substances necessary for the development of lactose-fermenting yeast and lactic acid microorganisms. When using whey, as a rule, it is cleaned of residual milk fat and casein dust using special separators. To destroy undesirable microorganisms that can affect the cultivation of lactase producers and the quality of the finished product, pasteurization or sterilization of raw materials is carried out under the regimes accepted in the industry. For example, high-temperature pasteurization modes can be used at (85 ÷ 87) °C for 3-5 seconds. Lactose-containing raw materials can be natural or thickened, with a mass fraction of lactose in the initial solution from 3 to 15%, as indicated in patent RU 2622078. Processing modes and the composition of dairy raw materials desired for cultivation are known and are not distinctive features of the invention.
Подготовленное вторичное молочное сырье используют для двухэтапного культивирования продуцентов лактаз, в качестве которых используют безопасные лактозосбраживающие дрожжи и термофильные молочнокислые бактерии, применяемые в пищевой промышленности и биотехнологии, обладающие способностью вырабатывать лактазы, предпочтительно дрожжи Kluyveromyces marxianus или Kluyveromyces lactis, и термофильные молочнокислые микроорганизмы Lactobacillus acidophilus или Streptococcus thermophilus. Prepared secondary milk raw materials are used for two-stage cultivation of lactase producers, which are safe lactose-fermenting yeast and thermophilic lactic acid bacteria used in the food industry and biotechnology, with the ability to produce lactase, preferably the yeast Kluyveromyces marxianus or Kluyveromyces lactis, and thermophilic lactic acid microorganisms Lactobacillus acidophilus or Streptococcus thermophilus.
Первый этап культивирования проводят раздельно в аэробных условиях для накопления биомассы продуцентов. Дрожжи культивируют при температуре (25 ÷ 35) °С в течение (8 ÷ 24) ч. при интенсивном перемешивании. При температурах ниже 25 °С дрожжи-продуценты лактаз развиваются очень медленно, выше 35° клетки начинают гибнуть. При культивировании менее 8 ч. не накапливается достаточной биомассы и не достигается необходимая активность ферментного препарата, после 24 ч. культивирования скорость прироста биомассы снижается, а у некоторых культур наблюдается снижение активности ферментного препарата. Интенсивное перемешивание способствует аэрации среды, при котором дрожжи накапливают биомассу быстрее, так как идет реакция полного окисления углеводов с выделением большого количества энергии. Термофильные молочнокислые бактерии лучше растут при более высокой температуре и без доступа кислорода (так как являются факультативными анаэробами), поэтому их культивируют отдельно, при температуре (37 ÷ 45) °С в течение (8 ÷ 24) ч. без перемешивания. При температурах ниже 37 °С термофильные бактерии развиваются медленно, выше 45° клетки начинают гибнуть. При культивировании менее 8 ч. не накапливается достаточной биомассы и не достигается необходимая активность ферментного препарата, после 24 ч. культивирования скорость прироста биомассы снижается, а у некоторых культур наблюдается снижение активности ферментного препарата.The first stage of cultivation is carried out separately under aerobic conditions to accumulate biomass of producers. Yeast is cultivated at a temperature of (25 ÷ 35) °C for (8 ÷ 24) hours with vigorous stirring. At temperatures below 25°C, lactase-producing yeasts develop very slowly; above 35°C, cells begin to die. When cultivated for less than 8 hours, sufficient biomass does not accumulate and the required activity of the enzyme preparation is not achieved; after 24 hours of cultivation, the rate of biomass growth decreases, and in some crops a decrease in the activity of the enzyme preparation is observed. Intensive mixing promotes aeration of the environment, in which the yeast accumulates biomass faster, as the reaction of complete oxidation of carbohydrates occurs, releasing a large amount of energy. Thermophilic lactic acid bacteria grow better at higher temperatures and without access to oxygen (since they are facultative anaerobes), so they are cultivated separately, at a temperature of (37 ÷ 45) °C for (8 ÷ 24) hours without stirring. At temperatures below 37 ° C, thermophilic bacteria develop slowly; above 45 ° C, cells begin to die. When cultivated for less than 8 hours, sufficient biomass does not accumulate and the required activity of the enzyme preparation is not achieved; after 24 hours of cultivation, the rate of biomass growth decreases, and in some crops a decrease in the activity of the enzyme preparation is observed.
Второй этап культивирования проводят совместно в анаэробных условиях при температуре (25 ÷ 40) °С в течение (12 ÷ 36) ч. Анаэробные условия необходимы для протекания процесса спиртового брожения дрожжей, при котором образуется этиловый спирт, который может способствовать пермеабилизации клеток дрожжей и молочнокислых бактерий, в результате чего облегчается процесс выхода (извлечения) лактаз из клеток. При анаэробном брожении также накапливаются другие продукты метаболизма молочнокислых бактерий и дрожжей, в т.ч. ферменты, молочная, уксусная и другие органические кислоты, витамины и др., которые могут способствовать интенсификации разрушения клеток и получению более активного ферментного препарата, а также обогащать продукт-постбиотик. The second stage of cultivation is carried out together under anaerobic conditions at a temperature of (25 ÷ 40) °C for (12 ÷ 36) hours. Anaerobic conditions are necessary for the process of alcoholic fermentation of yeast, which produces ethyl alcohol, which can contribute to the permeabilization of yeast cells and lactic acid cells. bacteria, as a result of which the process of release (extraction) of lactase from cells is facilitated. During anaerobic fermentation, other metabolic products of lactic acid bacteria and yeast also accumulate, incl. enzymes, lactic, acetic and other organic acids, vitamins, etc., which can help intensify cell destruction and obtain a more active enzyme preparation, as well as enrich the postbiotic product.
Извлечение ферментов проводят путем автолиза клеток продуцентов в совместной культуре при температуре (40 ÷ 60) °С в течение (18 ÷ 30) ч. При температуре ниже 40 °С автолиз клеток протекает медленно, выше 60 °С снижается активность ферментного препарата. При автолизе менее 18 ч. часть клеток продуцента остается неразрушенной, и они могут в дальнейшем утилизировать лактозу и лактулозу при биосинтезе. При автолизе более 30 ч. снижается активность ферментного препарата. Ферментный препарат не подвергается очистке, благодаря чему сохраняется его высокая трансгликозилирующая активность, и сразу используется для биосинтеза лактулозы.Enzyme extraction is carried out by autolysis of producer cells in a co-culture at a temperature of (40 ÷ 60) °C for (18 ÷ 30) hours. At temperatures below 40 °C, cell autolysis proceeds slowly; above 60 °C, the activity of the enzyme preparation decreases. With autolysis for less than 18 hours, some of the producer cells remain undestroyed, and they can further utilize lactose and lactulose during biosynthesis. When autolysis lasts more than 30 hours, the activity of the enzyme preparation decreases. The enzyme preparation is not purified, due to which its high transglycosylation activity is preserved, and is immediately used for the biosynthesis of lactulose.
Биосинтез лактулозы проводят с использованием полученного неочищенного ферментного препарата, который вносят в лактозосодержащее сырье с добавлением фруктозы, при температуре (30 ÷ 60) °С в течение (0,1 ÷ 14) ч. При температуре ниже 30°С выше 60°С наблюдается скорость образования лактулозы резко снижается. Лактулоза начинает синтезироваться в первые минуты проведения реакции, и максимум ее концентрации при использовании некоторых комбинаций ферментов может быть достигнут уже через 6 мин., после 14 ч. ферментации наблюдается снижение ее концентрации, по-видимому, за счет преобладания реакции гидролиза. Содержание лактозы и фруктозы в субстрате может колебаться в широких пределах соотношений молярных концентраций, преимущественно при соотношении от 1:1 до 1:4, что известно из публикаций (Биотехнология лактулозы: современные достижения, проблемы и перспективы / С. А. Рябцева, А. Г. Храмцов , М. А. Шпак, А. Д. Лодыгин , Г. С. Анисимов, С. Н. Сазанова, Ю. А. Табакова // Техника и технология пищевых производств. 2023. Т. 53. № 1. С. 97–122. (На англ.). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2023-1-2419) и не является отличительным признаком изобретения.The biosynthesis of lactulose is carried out using the resulting crude enzyme preparation, which is added to lactose-containing raw materials with the addition of fructose, at a temperature of (30 ÷ 60) °C for (0.1 ÷ 14) hours. At temperatures below 30 °C, above 60 °C is observed the rate of lactulose formation decreases sharply. Lactulose begins to be synthesized in the first minutes of the reaction, and the maximum of its concentration when using some combinations of enzymes can be achieved after 6 minutes; after 14 hours of fermentation, a decrease in its concentration is observed, apparently due to the predominance of the hydrolysis reaction. The content of lactose and fructose in the substrate can vary within a wide range of molar concentration ratios, mainly at a ratio from 1:1 to 1:4, which is known from publications (Biotechnology of lactulose: modern achievements, problems and prospects / S. A. Ryabtseva, A. G. Khramtsov, M. A. Shpak, A. D. Lodygin, G. S. Anisimov, S. N. Sazanova, Yu. A. Tabakova // Technology and technology of food production. 2023. T. 53. No. 1. pp. 97–122. (In English). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2023-1-2419) and is not a distinctive feature of the invention.
Ферментированную смесь с лактулозой инактивируют нагреванием и концентрируют с получением лактулозосодержащего продукта-постбиотика с полезными для здоровья компонентами. Режимы инактивации клеток и ферментов известны (например, в рассмотренном выше патенте ЕР 3542641 при температуре от 90°С до 150°С), самый простой способ – кипячение в течение 3-5 минут. Благодаря тому, что в технологии используются заквасочные микроорганизмы с доказанной безопасностью, не требуется сложной очистки продукта от токсичных продуктов их метаболизма. Более того, продукты метаболизма и компоненты инактивированных клеток лактозосбраживающих дрожжей (например, витамины, антиоксиданты, глюканы, маннаны, аминокислоты, биоактивные пептиды и др.) и молочнокислых бактерий (органические кислоты, экзополисахариды, пептидогликаны и др.). обладают полезными для здоровья свойствами. При этом недорогое побочное молочное сырье (сыворотку или пермеат) используют как в качестве лактозосодержащего сырья для культивирования дрожжей и молочнокислых бактерий, так и в качестве источника лактозы для ее биотрансформации в лактулозу, что снижает стоимость готового продукта. Концентрирование ферментной смеси производят в вакуум-выпарных аппаратах и/или путём распылительной сушки при известных технологических режимах.The fermented lactulose mixture is heat inactivated and concentrated to produce a lactulose-containing postbiotic product with health benefits. Modes of inactivation of cells and enzymes are known (for example, in the patent EP 3542641 discussed above at temperatures from 90°C to 150°C), the simplest method is boiling for 3-5 minutes. Due to the fact that the technology uses starter microorganisms with proven safety, there is no need for complex purification of the product from toxic products of their metabolism. Moreover, metabolic products and components of inactivated cells of lactose-fermenting yeast (for example, vitamins, antioxidants, glucans, mannans, amino acids, bioactive peptides, etc.) and lactic acid bacteria (organic acids, exopolysaccharides, peptidoglycans, etc.). have beneficial health properties. In this case, inexpensive dairy by-products (whey or permeate) are used both as lactose-containing raw materials for the cultivation of yeast and lactic acid bacteria, and as a source of lactose for its biotransformation into lactulose, which reduces the cost of the finished product. Concentration of the enzyme mixture is carried out in vacuum evaporators and/or by spray drying under known technological conditions.
Способ подтверждается примерами.The method is confirmed by examples.
Пример 1. Подсырную сыворотку, очищенную от жира и казеиновой пыли, пастеризуют при (85 ÷ 87) °С в течение 3-5 сек. Далее сыворотку охлаждают и используют для культивирования продуцентов лактаз и для биосинтеза лактулозы в промышленных ферментерах. На первом этапе дрожжи Kluyveromyces lactis культивируют в аэробных условиях при температуре (25 ÷ 30) °С в течение (22 ÷ 24) ч. при интенсивном перемешивании, молочнокислые бактерии Lactobacillus acidophilus культивируют в аэробных условиях при температуре (37 ÷ 40) °С в течение (22 ÷ 24) ч. без перемешивания. Полученные суспензии дрожжей и молочнокислых бактерий объединяют и проводят второй этап совместного культивирования в анаэробных условиях при температуре (25 ÷ 30) °С в течение (12 ÷ 14) ч. После этого проводят извлечение лактаз из клеток микроорганизмов путем автолиза при температуре (40 ÷ 45) °С в течение (28 ÷ 30) ч. По окончании автолиза полученный ферментный препарат добавляют в пастеризованную и охлажденную подсырную сыворотку с растворенной в ней фруктозой при молярном соотношении лактоза:фруктоза 1:1 и проводят биосинтез лактулозы при температуре (30 ÷ 40) °С в течение (12 ÷ 14) ч., после чего смесь инактивируют кипячением в течение нескольких минут, охлаждают и отправляют на вакуум-сгущение, которое проводится при температуре 65 °С. Сгущение проводят до массовой доли сухих веществ (40-45) %. Получают сгущенный продукт-постбиотик, содержащий около 5% лактулозы, а также метаболиты и компоненты инактивированных клеток дрожжей и молочнокислых бактерий. Example 1. Cheese whey, cleared of fat and casein dust, is pasteurized at (85 ÷ 87) °C for 3-5 seconds. Next, the whey is cooled and used for the cultivation of lactase producers and for the biosynthesis of lactulose in industrial fermenters. At the first stage, the yeast Kluyveromyces lactis is cultivated under aerobic conditions at a temperature of (25 ÷ 30) °C for (22 ÷ 24) hours with intense stirring, the lactic acid bacteria Lactobacillus acidophilus is cultivated under aerobic conditions at a temperature of (37 ÷ 40) °C in for (22 ÷ 24) hours without stirring. The resulting suspensions of yeast and lactic acid bacteria are combined and the second stage of co-cultivation is carried out under anaerobic conditions at a temperature of (25 ÷ 30) °C for (12 ÷ 14) hours. After this, lactases are extracted from microorganism cells by autolysis at a temperature of (40 ÷ 45 ) °C for (28 ÷ 30) hours. At the end of autolysis, the resulting enzyme preparation is added to pasteurized and cooled cheese whey with fructose dissolved in it at a lactose:fructose molar ratio of 1:1 and lactulose biosynthesis is carried out at a temperature of (30 ÷ 40) °C for (12 ÷ 14) hours, after which the mixture is inactivated by boiling for several minutes, cooled and sent for vacuum condensation, which is carried out at a temperature of 65 °C. Thickening is carried out to a mass fraction of dry substances (40-45)%. A condensed postbiotic product is obtained containing about 5% lactulose, as well as metabolites and components of inactivated yeast cells and lactic acid bacteria.
Пример 2. Сухой УФ-пермеат обезжиренного молока растворяют в горячей воде при (90 ÷ 95) °С исходя из достижения массовой доли лактозы в растворе 15 %. Далее пермеат охлаждают и используют для культивирования продуцентов лактаз и для биосинтеза лактулозы в промышленных ферментерах. На первом этапе дрожжи Kluyveromyces marxianus культивируют в аэробных условиях при температуре (30 ÷ 35) °С в течение (8 ÷ 10) ч. при интенсивном перемешивании, Молочнокислые бактерии Streptococcus thermophilus культивируют в аэробных условиях при температуре (40 ÷ 45) °С в течение (8 ÷ 10) ч. без перемешивания Полученные суспензии дрожжей и молочнокислых бактерий объединяют и проводят второй этап культивирования – совместное в анаэробных условиях при температуре (35 ÷ 40) °С в течение (34 ÷ 36) ч. После этого проводят извлечение лактаз из клеток микроорганизмов путем автолиза при температуре (55 ÷ 60) °С в течение (18 ÷ 20) ч. По окончании автолиза полученный ферментный препарат добавляют в пермеат с растворенной в нем фруктозой при молярном соотношении лактоза:фруктоза 1:2 и проводят биосинтез лактулозы при температуре (55 ÷ 60) °С в течение (0,1 ÷ 0,5) ч., после чего смесь инактивируют кипячением в течение нескольких минут, охлаждают и отправляют на распылительную сушку. Получают сухой продукт-постбиотик с массовой долей сухих веществ 95%, содержащий около 15% лактулозы, а также метаболиты и компоненты инактивированных клеток дрожжей и молочнокислых бактерий. Example 2. Dry UV permeate of skim milk is dissolved in hot water at (90 ÷ 95) °C based on achieving a mass fraction of lactose in the solution of 15%. Next, the permeate is cooled and used for the cultivation of lactase producers and for the biosynthesis of lactulose in industrial fermenters. At the first stage, the yeast Kluyveromyces marxianus is cultivated under aerobic conditions at a temperature of (30 ÷ 35) °C for (8 ÷ 10) hours with intense stirring. The lactic acid bacteria Streptococcus thermophilus are cultivated under aerobic conditions at a temperature of (40 ÷ 45) °C in for (8 ÷ 10) hours without stirring. The resulting suspensions of yeast and lactic acid bacteria are combined and the second stage of cultivation is carried out - joint cultivation under anaerobic conditions at a temperature of (35 ÷ 40) °C for (34 ÷ 36) hours. After this, lactase is extracted from microbial cells by autolysis at a temperature of (55 ÷ 60) °C for (18 ÷ 20) hours. At the end of autolysis, the resulting enzyme preparation is added to the permeate with fructose dissolved in it at a lactose:fructose molar ratio of 1:2 and lactulose biosynthesis is carried out at a temperature of (55 ÷ 60) °C for (0.1 ÷ 0.5) hours, after which the mixture is inactivated by boiling for several minutes, cooled and sent for spray drying. A dry postbiotic product is obtained with a mass fraction of dry substances of 95%, containing about 15% lactulose, as well as metabolites and components of inactivated cells of yeast and lactic acid bacteria.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2819908C1 true RU2819908C1 (en) | 2024-05-28 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3542641A1 (en) * | 2018-03-20 | 2019-09-25 | Universität Hohenheim | Lactulose-containing product and method for producing a lactulose-containing product |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3542641A1 (en) * | 2018-03-20 | 2019-09-25 | Universität Hohenheim | Lactulose-containing product and method for producing a lactulose-containing product |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RYABTSEVA S. et al. "Biotechnology of lactulose production: progress, challenges and prospects"; 2023, N 53 (1), с.97-122. ZOLKIEWICZ J. et al. "Postbiotics - a step beyond pre- and probiotics"; Nutrients, 2020, N 12, 2189, p.1-17. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5843906B2 (en) | Lactic acid bacteria survival improver, survival improvement method, and food and drink | |
| EP0778885B1 (en) | Preparation of galacto-oligosaccharide and beta-galactosidase enriched products fermented using streptococcus thermophilus | |
| FR2723960A1 (en) | Prodn. of Streptococcus thermophilus cultures rich in beta-galactosidase | |
| JP4802216B2 (en) | Bifidobacterium-containing composition and method for producing Bifidobacterium-containing composition | |
| CN101869139B (en) | Method for preparing lactobacillus cell high-permeability microcapsules and application | |
| CN114568530A (en) | Functional prebiotics goat milk powder and preparation method thereof | |
| US4329429A (en) | Lactase preparation | |
| Corre et al. | Production of concentrated Bifidobacterium bifidum | |
| RU2819908C1 (en) | Enzymatic method of producing lactulose-containing postbiotic product | |
| Godtfredsen et al. | Occurrence of α-acetolactate decarboxylases among lactic acid bacteria and their utilization for maturation of beer | |
| JP4115181B2 (en) | Method for enhancing immunostimulatory effect of lactic acid bacteria | |
| JPS6366199B2 (en) | ||
| US12043855B2 (en) | Method for producing galactooligosaccharides | |
| WO2005097972A1 (en) | Medium for lactic acid bacteria | |
| RU2622078C1 (en) | Method for combined enzyme beta-galactosidase production | |
| Bury et al. | Effect of yeast extract supplementation on beta-galactosidase activity of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 11842 grown in whey | |
| US20070134373A1 (en) | Process for the preparation of galactose | |
| Eveleva et al. | Technological features of production of lactate-containing additives from milk whey fermented with lactic acid bacteria | |
| RU2018313C1 (en) | Method for producing probiotics for animals and poultry | |
| RU2539741C1 (en) | Method for production of functional additive with galactooligosaccharides | |
| CN112980816B (en) | Beta-galactosidase fermentation medium and preparation method and application thereof | |
| JPH07265066A (en) | Peptone for culture medium for culturing microorganism | |
| RU2205217C1 (en) | Method for culturing bifidobacteria in milk | |
| WO2023166156A1 (en) | Method for preparing cultures of lactic acid bacteria, products and culture media therefore | |
| KR20240031807A (en) | Agent and method for improving survivability of lactic acid bacterium, and food composition |