RU2819002C1

RU2819002C1 - Levorotatory bicyclic morpholine and salt thereof, method for preparation, pharmaceutical composition and use thereof

Info

Publication number: RU2819002C1
Application number: RU2022117193A
Authority: RU
Inventors: Сун У; Хуа СУНЬ; Цзиньлань ЧЖАН; Вэньсюань ЧЖАН; Чжэ ВАН; Цинюнь ЯН; Линь ЦЗЯН; Цзыхань ЧЭНЬ; Цзин ШЭНЬ; Цзе Чжан; Чи ЧЖАН; Чжуньшэн ХАНЬ; Тун ЦИНЬ; Юаньюань Чжан
Original assignee: Инститьют Оф Материя Медика, Чайниз Экедеми Оф Медикал Сайенсез; Чанчунь Интелликраун Фармасьютикал Ко., Лтд.
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2020-09-15
Publication date: 2024-05-08

Abstract

FIELD: medicine; pharmaceutics; chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to pharmaceutical chemistry, specifically to levorotatory bicyclic morpholine or a pharmaceutically acceptable salt thereof, characterized by that the structure of levorotatory bicyclic morpholine is represented by compound 5 and its pharmaceutically acceptable salt has structural formula (I), method for its preparation, a pharmaceutical composition thereof and use thereof in the manufacture of medicinal preparations for preventing or treating liver diseases.

EFFECT: obtaining levorotatory bicyclic morpholine and its pharmaceutically acceptable salt, having better pharmacological activity and pharmacokinetic properties in terms of anti-inflammatory action and liver protection than racemate and dextrorotatory morpholine and its salts.

9 cl, 1 dwg, 8 tbl, 7 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES

Изобретение относится к области фармацевтической химии, и оно конкретно относится к левовращающему бициклическому морфолину и его фармацевтически приемлемой соли, способу его получения, его фармацевтической композиции и его применению при производстве лекарственных препаратов для предотвращения или лечения заболеваний печени и других подобных заболеваний. The invention relates to the field of pharmaceutical chemistry, and it specifically relates to levorotatory bicyclic morpholine and a pharmaceutically acceptable salt thereof, a method for its preparation, a pharmaceutical composition thereof and its use in the manufacture of medicinal products for the prevention or treatment of liver diseases and other similar diseases.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART

Заболевания печени представляют собой тип заболеваний, широко распространенных во всем мире, и Китай является страной, в которой наблюдается высокая частота возникновения заболеваний печени. В настоящее время в Китае имеется множество пациентов с поражениями и воспалениями печени, вызванными различными причинами, преимущественно, вирусным гепатитом. По статистике, прямые экономические потери в год от хронического гепатита (включая цирроз печени и рак печени, вызванный хроническим гепатитом на поздних стадиях) в Китае достигают 900 млрд юаней. На протяжении последних лет, также наблюдается тенденция к увеличению из года в год частоты возникновения заболеваний печени, вызванных приемом лекарств, алкогольного и неалкогольного жирового гепатоза и аутоиммунных заболеваний печени. Поиск безопасных и эффективных лекарственных средств для профилактики и лечения заболеваний печени всегда является чрезвычайно важной темой исследований для различных научно-исследовательских институтов и фармацевтических компаний по всему миру.Liver disease is a type of disease that is widespread throughout the world, and China is a country that experiences a high incidence of liver disease. Currently, in China there are many patients with liver lesions and inflammation caused by various causes, mainly viral hepatitis. According to statistics, the direct economic loss per year from chronic hepatitis (including liver cirrhosis and liver cancer caused by late-stage chronic hepatitis) in China reaches 900 billion yuan. Over the past few years, there has also been a year-on-year increase in the incidence of drug-induced liver disease, alcoholic and non-alcoholic fatty liver disease, and autoimmune liver disease. Finding safe and effective drugs for the prevention and treatment of liver diseases is always an extremely important research topic for various research institutes and pharmaceutical companies around the world.

Бициклол представляет собой тип химических лекарственных средств первой линии для лечения гепатита в Китае, защищенный в Китае независимыми правами на объекты интеллектуальной собственности, который впервые был разработан Институтом фармакологии Китайской академии медицинских наук (Institute of Materia Medica Chinese Academy of Medical Science), и при применении в клинике он обладает рядом преимуществ, обусловленных высокой эффективностью по защите печени и ферментативной деградацией, определенной активностью против вируса гепатита, удобным способом введения без каких-либо значительных побочных реакций и широкой фармакологической активностью. Связанные с бициклолом научные достижения последовательно из года в год отмечаются множеством наград, в том числе "Награда за достижение в решении национальных ключевых задач в области науки и техники в девятой пятилетке" (2002 год), "Десять самых важных событий в китайской фармацевтической промышленности в 2002 году", Первая премия Пекинского научно-технического прогресса (2005 год), Вторая премия Национального научно-технического прогресса (2007 год) и другие подобные награды, а патентные права на соединение бициклол защищены в шестнадцати странах/регионах, например, в США, Европейском Союзе, Японии, Корее и других странах, и в регионе Тайвань, и он продается в такие страны как Украина. С того дня, когда на пресс-конференции, состоявшейся в Доме народных собраний в 2001 году, было объявлено о появлении бициклола на рынке фармацевтических препаратов, он принес для Китая огромную социальную и экономическую выгоду.Bicyclol is a type of first-line chemical medicine for the treatment of hepatitis in China, protected by independent intellectual property rights in China, which was first developed by the Institute of Materia Medica Chinese Academy of Medical Science, and when used in the clinic, it has a number of advantages due to its high efficiency in protecting the liver and enzymatic degradation, certain activity against the hepatitis virus, a convenient route of administration without any significant adverse reactions and broad pharmacological activity. Bicyclol-related scientific achievements have been consistently recognized year after year with numerous awards, including the "Achievement Award for Achieving National Key Challenges in Science and Technology in the Ninth Five-Year Plan" (2002), "Ten Most Important Events in the Chinese Pharmaceutical Industry in 2002", Beijing Science and Technology Progress First Prize (2005), National Science and Technology Progress Second Prize (2007) and other similar awards, and the patent rights for the compound bicyclol are protected in sixteen countries/regions, such as the United States, European Union, Japan, Korea and other countries, and in the Taiwan region, and it is sold to countries such as Ukraine. Since the day bicyclol was announced on the pharmaceutical market at a press conference held at the Great Hall of the People in 2001, it has brought enormous social and economic benefits to China.

Однако бициклол имеет недостаточную биологическую растворимость в воде, вследствие чего он не обладает высокой биодоступностью. Исследователи из Института фармакологии Китайской академии медицинских наук (Institute of Materia Medica Chinese Academy of Medical Science) оптимизировали структуру бициклола и обнаружили, что бициклический морфолин и его соли обладают хорошей фармакологической активностью и фармакокинетическими свойствами (Wu Song, Sun Hua, et al., Bicyclol Derivative and Preparations and Applications Thereof, 201610922563.5). На основании предыдущих результатов, исследователи выделили рацемат бициклического морфолина и обнаружили, что левовращающий бициклический морфолин и его соли обладают лучшей фармакологической активностью и фармакокинетическими свойствами с точки зрения противовоспалительного действия и защиты печени, чем рацемат и правоврающий морфолин и его соли.However, bicyclol has insufficient biological solubility in water, as a result of which it does not have high bioavailability. Researchers from the Institute of Materia Medica Chinese Academy of Medical Science optimized the structure of bicyclol and found that bicyclic morpholine and its salts have good pharmacological activity and pharmacokinetic properties (Wu Song, Sun Hua, et al., Bicyclol Derivative and Preparations and Applications Thereof, 201610922563.5). Based on previous results, the researchers isolated the racemate of bicyclic morpholine and found that levorotatory bicyclic morpholine and its salts had better pharmacological activity and pharmacokinetic properties in terms of anti-inflammatory effects and liver protection than the racemate and dextrorotatory morpholine and its salts.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Технической задачей, решаемой в изобретении, является создание левовращающего бициклического морфолина и его фармацевтически приемлемой соли, способа его получения и применения при производстве лекарственных препаратов для предотвращения или лечения заболевания печени и других подобных заболеваний. The technical problem solved in the invention is the creation of levorotatory bicyclic morpholine and its pharmaceutically acceptable salt, a method for its preparation and use in the production of drugs for the prevention or treatment of liver disease and other similar diseases.

Для решения этой технической задачи, в изобретении предлагаются следующие технические решения.To solve this technical problem, the invention proposes the following technical solutions.

В первом аспекте технического решения по изобретению, предлагается левовращающий бициклический морфолин со структурой, представленной как соединение 5, и его фармацевтически приемлемая соль, имеющая структура, представленную формулой (I):In the first aspect of the technical solution according to the invention, there is provided a levorotatory bicyclic morpholine with the structure represented by compound 5, and a pharmaceutically acceptable salt thereof having the structure represented by formula (I):

. .

В изобретении, фармацевтически приемлемая соль присоединения кислоты может быть получена из неорганических кислот и органических кислот. В изобретении, X выбирают из неорганических кислот и органических кислот, и неорганические кислоты выбирают из фтористоводородной кислоты, хлористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, йодистоводородной кислоты, уксусной кислоты, серной кислоты и фосфорной кислоты; органические кислоты выбирают из уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, пропионовой кислоты, щавелевой кислоты, яблочной кислоты, малоновой кислоты, янтарной кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, лимонной кислоты, бензойной кислоты, коричной кислоты, миндальной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, п- толуолсульфоновой кислоты, салициловой кислоты, хинной кислоты, камфорной кислоты, камфорсульфоновой кислоты, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, пироглутаминовой кислоты, L-винной кислоты, L-дибензоилвинной кислоты, L-ди-п-метилбензоилвинной кислоты, L-диэтилтартрата, L-яблочной кислоты, L-камфорной кислоты, L-10-камфорсульфоновой кислоты, R-(-)-миндальной кислоты, L-хинной кислоты, L-аспарагиновой кислоты, L-глутаминовой кислоты, L-пироглутаминовой кислоты, D-винной кислоты, D-дибензоилвинной кислоты, D-ди-п-метилбензоилвинной кислоты, D-диэтилтартрата, D- яблочной кислоты, D-камфорной кислоты, D-10-камфорсульфоновой кислоты, S-(-)- миндальной кислоты, D-хинной кислоты, D-аспарагиновой кислоты, D-глутаминовой кислоты и D- пироглутаминовой кислоты, где отношение свободного основания к кислоте составляет необязательно 1:1, 2:1 или 3:1. В изобретении, предпочтительная структура представлена ниже:In the invention, a pharmaceutically acceptable acid addition salt can be prepared from inorganic acids and organic acids. In the invention, X is selected from inorganic acids and organic acids, and the inorganic acids are selected from hydrofluoric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, acetic acid, sulfuric acid and phosphoric acid; organic acids are selected from acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, oxalic acid, malic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid acid, p-toluenesulfonic acid, salicylic acid, quinic acid, camphoric acid, camphorsulfonic acid, aspartic acid, glutamic acid, pyroglutamic acid, L-tartaric acid, L-dibenzoyltartaric acid, L-di-p-methylbenzoyltartaric acid, L-diethyl tartrate , L-malic acid, L-camphoric acid, L-10-camphorsulfonic acid, R-(-)-mandelic acid, L-quinic acid, L-aspartic acid, L-glutamic acid, L-pyroglutamic acid, D-tartaric acid, D-dibenzoyltartaric acid, D-di-p-methylbenzoyltartaric acid, D-diethyl tartrate, D-malic acid, D-camphoric acid, D-10-camphorsulfonic acid, S-(-)-mandelic acid, D-quinic acid , D-aspartic acid, D-glutamic acid and D-pyroglutamic acid, wherein the ratio of free base to acid is optionally 1:1, 2:1 or 3:1. In the invention, the preferred structure is shown below:

. .

Во втором аспекте технического решения по изобретению, предлагается способ получения левовращающего бициклического морфолина и его фармацевтически приемлемой соли по первому аспекту, который представлен ниже:In the second aspect of the technical solution according to the invention, there is provided a method for producing levorotatory bicyclic morpholine and a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the first aspect, which is presented below:

a) хлорирование гидроксильной группы бициклола с получением соединения 2;a) chlorination of the hydroxyl group of bicyclol to obtain compound 2;

b) реакция соединения 2 с морфолином с получением соединения 3;b) reacting compound 2 with morpholine to obtain compound 3;

c) образование соли путем реакции соединения 3 с хиральной кислотой Y, и проведение разделения в органическом растворителе с использованием различия растворимости соли с получением соли 4 в форме левоврающего энантиомера, при этом левоврающий энантиомер имеет энантиомерную чистоту (%e.e.) более чем 95,0%, где хиральную кислоту Y выбирают из L-винной кислоты, L-дибензоилвинной кислоты, L-ди-п-метилбензоилвинной кислоты, L-диэтилтартрата, L-яблочной кислоты, L-камфорной кислоты, L-10-камфорсульфоновой кислоты, R-(-)-миндальной кислоты, L-хинной кислоты, L-аспарагиновой кислоты, LL-пироглутаминовой кислоты, D-винной кислоты, D-дибензоилвинной кислоты, D-ди-п-метилбензоилвинной кислоты, D-диэтилтартрата, D- яблочной кислоты, D-камфорной кислоты, D-10-камфорсульфоновой кислоты, S-(-)-миндальной кислоты, D-хинной кислоты, D-аспарагиновой кислоты, D-глутаминовой кислоты, D- пироглутаминовой кислоты и производных указанных выше кислот, где отношение свободного основания к кислоте составляет необязательно 1:1, 2:1 или 3:1, органический растворитель выбирают из этилацетата, ацетона, метанола, этанола, изопропанола и смешанных растворителей;c) forming a salt by reacting compound 3 with chiral acid Y, and performing a separation in an organic solvent using the difference in salt solubility to obtain salt 4 in the form of a left-handed enantiomer, the left-handed enantiomer having an enantiomeric purity (%e.e.) of greater than 95.0% wherein the chiral acid Y is selected from L-tartaric acid, L-dibenzoyltartaric acid, L-di-p-methylbenzoyltartaric acid, L-diethyl tartrate, L-malic acid, L-camphoric acid, L-10-camphorsulfonic acid, R-( -)-mandelic acid, L-quinic acid, L-aspartic acid, LL-pyroglutamic acid, D-tartaric acid, D-dibenzoyltartaric acid, D-di-p-methylbenzoyltartaric acid, D-diethyl tartrate, D-malic acid, D -camphoric acid, D-10-camphorsulfonic acid, S-(-)-mandelic acid, D-quinic acid, D-aspartic acid, D-glutamic acid, D-pyroglutamic acid and derivatives of the above acids, where the ratio of free base to acid is optionally 1:1, 2:1 or 3:1, the organic solvent is selected from ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol, isopropanol and mixed solvents;

d) перевод соли 4 в форму свободного амина путем реакции с основанием;d) converting salt 4 into the free amine form by reaction with a base;

e) образование соли путем реакции свободной формы амина 5 с кислотой X с получением соединения формулы I. e) forming a salt by reacting the free form of amine 5 with acid X to give a compound of formula I.

В изобретении, определения для X являются такими же, как определения в первом аспекте технического решения по изобретению. In the invention, the definitions for X are the same as those in the first aspect of the invention.

В третьем аспекте технического решения по изобретению, предлагается фармацевтическая композиция, включающая терапевтически и/или профилактически эффективное количество левовращающего бициклического морфолина и его фармацевтически приемлемой соли по первому аспекту настоящего изобретения, и, необязательно, один или более фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ. In a third aspect of the invention, a pharmaceutical composition is provided comprising a therapeutically and/or prophylactically effective amount of a levorotatory bicyclic morpholine and a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the first aspect of the invention, and optionally one or more pharmaceutically acceptable carriers or excipients.

Фармацевтическая композиция может быть приготовлена хорошо известными в данной области методами. Соединение по изобретению может быть объединено с одним или более фармацевтически приемлемыми твердыми или жидкими вспомогательными веществами и/или адъювантами для приготовления любой лекарственной формы, подходящей для применения в случае человека или животного. Соединение по изобретению обычно присутствует в фармацевтической композиции в количестве от 0,1 до 95% по массе. The pharmaceutical composition can be prepared by methods well known in the art. The compound of the invention may be combined with one or more pharmaceutically acceptable solid or liquid excipients and/or adjuvants to prepare any dosage form suitable for use in humans or animals. The compound of the invention is typically present in the pharmaceutical composition in an amount of from 0.1 to 95% by weight.

Соединение по изобретению или содержащие его фармацевтические композиции могут быть введены в лекарственной форме с разовой дозой, и способы введения могут быть энтеральными или парентеральными, такими как пероральное введение, внутривенная инъекция, внутримышечная инъекция, подкожная инъекция, введение через носовую полость, введение через слизистую оболочку полости рта, внутриглазное введение, введение через легкие и дыхательные пути, введение через кожу, вагинальное введение, ректальное введение и другие подобные способы.The compound of the invention or pharmaceutical compositions containing it can be administered in a single dose dosage form, and the routes of administration can be enteral or parenteral, such as oral administration, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, nasal administration, transmucosal administration oral cavity, intraocular administration, pulmonary and respiratory tract administration, transdermal administration, vaginal administration, rectal administration and other similar methods.

Лекарственная форма для введения может быть жидкой лекарственной формой, твердой лекарственной формой или полутвердой лекарственной формой. Жидкая лекарственная форма может представлять собой раствор (включая истинный раствор и коллоидный раствор), эмульсию (включая эмульсию типа масло-в-воде, типа вода-в-масле и комплексную эмульсию), суспензию, инъекцию (включая водную инъекцию, порошок для инъекций и инфузию), глазные капли, капли в нос, лосьон и линимент; твердая лекарственная форма может представлять собой таблетку (включая обычную таблетку, таблетку с энтеросолюбильным покрытием, буккальную таблетку, диспергируемую таблетку, жевательную таблетку, шипучую таблетку и таблетку, распадающуюся во рту), капсулу (включая твердую капсулу, мягкую капсулу и капсулу с энтеросолюбильным покрытием), гранулы, порошок, микросферы, матричные пилюли, суппозиторий, пленка, пластырь, аэрозоль (порошок), спрей и другие подобные формы; полутвердая лекарственная форма может представлять собой мазь, гель, пасту и другие подобные формыThe dosage form for administration may be a liquid dosage form, a solid dosage form or a semi-solid dosage form. The liquid dosage form may be a solution (including true solution and colloidal solution), emulsion (including oil-in-water emulsion, water-in-oil emulsion and complex emulsion), suspension, injection (including aqueous injection, powder injection and infusion), eye drops, nasal drops, lotion and liniment; The solid dosage form may be a tablet (including a regular tablet, an enteric-coated tablet, a buccal tablet, a dispersible tablet, a chewable tablet, an effervescent tablet and an orodisintegrating tablet), a capsule (including a hard capsule, a soft capsule and an enteric-coated capsule) , granules, powder, microspheres, matrix pills, suppository, film, patch, aerosol (powder), spray and other similar forms; semi-solid dosage form may be ointment, gel, paste and other similar forms

Соединение по изобретению может быть приготовлено в обычной форме лекарственного препарата, а также в форме препарата с замедленным высвобождением, в форме препарата с контролируемым высвобождением, в форме препарата с направленной доставкой к ткани или органу-мишени и в форме различных систем введения микрочастиц. The compound of the invention may be formulated in a conventional dosage form, as well as a sustained release formulation, a controlled release formulation, a tissue or organ targeted formulation, and various microparticulate delivery systems.

Для того чтобы приготовить соединение по изобретению в форме таблетки, может быть использован целый ряд различных вспомогательных веществ, известных в фармацевтике, в том числе разбавители, связующие вещества, смачивающие вещества, разрыхлители, смазывающие вещества и сорастворители. Разбавители могут представлять собой крахмал, декстрин, сахарозу, глюкозу, лактозу, маннит, сорбит, ксилит, микрокристаллическую целлюлозу, сульфат кальция, гидрофосфат кальция, карбонат кальция и другие подобные вещества; смачивающие вещества могут представлять собой воду, этанол, изопропанол и другие подобные вещества; связующие вещества могут представлять собой крахмальную суспензию, декстрин, сиропы, пчелиный мед, раствор глюкозы, микрокристаллические целлюлозы, суспензию аравийской камеди, суспензию желатина, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, этилцеллюлозу, акриловую смолу, полимеры акриловой кислоты, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и другие подобные вещества; разрыхлители могут представлять собой сухой крахмал, микрокристаллическую целлюлозу, низкозамещенную гидроксипропилцеллюлозу, сшитый поливинилпирролидон, сшитую карбоксиметилцеллюлозу натрия, карбоксиметилкрахмал натрия, бикарбонат натрия и лимонную кислоту, эфир полиоксиэтилена сорбита и жирных кислот, додецилсульфат натрия и другие подобные вещества; смазывающие вещества и сорастворители могут представлять собой порошок талька, силикагель, стеарат, винную кислоту, жидкий парафин и полиэтиленгликоль.In order to prepare the compound of the invention in tablet form, a number of different excipients known in the pharmaceutical art may be used, including diluents, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants and cosolvents. Diluents may include starch, dextrin, sucrose, glucose, lactose, mannitol, sorbitol, xylitol, microcrystalline cellulose, calcium sulfate, calcium hydrogen phosphate, calcium carbonate and the like; wetting agents may be water, ethanol, isopropanol and the like; the binders may be starch suspension, dextrin, syrups, bee honey, glucose solution, microcrystalline celluloses, gum acacia suspension, gelatin suspension, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, ethylcellulose, acrylic resin, acrylic acid polymers, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol and the like substances; disintegrants may be dry starch, microcrystalline cellulose, low-substituted hydroxypropylcellulose, cross-linked polyvinylpyrrolidone, cross-linked sodium carboxymethylcellulose, sodium carboxymethyl starch, sodium bicarbonate and citric acid, polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester, sodium dodecyl sulfate and the like; lubricants and co-solvents may include talc powder, silica gel, stearate, tartaric acid, liquid paraffin and polyethylene glycol.

Таблетки могут быть также приготовлены в форме таблеток, покрытых оболочкой, такой как таблетки с сахарным покрытием, таблетки с пленочным покрытием, таблетки с энтеросолюбильным покрытием или таблетки с двухслойным покрытием и многослойным покрытием.Tablets may also be prepared in the form of film-coated tablets, such as sugar-coated tablets, film-coated tablets, enteric-coated tablets, or double-coated and multi-layer-coated tablets.

Для того чтобы приготовить разовую дозу для введения в форме капсул, действующий ингредиент, соединение по изобретению, смешивают с разбавителем и сорастворителем, и полученную смесь непосредственно помещают в твердые капсулы или мягкие капсулы. Также, действующий ингредиент, соединение по изобретению, смешивают с разбавителем, связующим веществом и разрыхлителем для приготовления гранул или микросфер, и затем помещают в твердые капсулы или мягкие капсулы. Различные виды разбавителя, связующего вещества, смачивающего вещества, разрыхлителя и сорастворителя для приготовления таблеток соединения по изобретению могут быть также использованы для приготовления капсул соединения по изобретению. In order to prepare a unit dose for administration in capsule form, the active ingredient, a compound of the invention, is mixed with a diluent and a co-solvent, and the resulting mixture is directly filled into hard capsules or soft capsules. Also, the active ingredient, the compound of the invention, is mixed with a diluent, a binder and a disintegrant to prepare granules or microspheres, and then filled into hard capsules or soft capsules. Various types of diluent, binder, wetting agent, disintegrant and cosolvent for preparing tablets of the compound of the invention can also be used for preparing capsules of the compound of the invention.

Для того чтобы приготовить соединение по изобретению в форме инъекции, в качестве растворителя могут быть использованы вода, этанол, изопропанол, пропиленгликоль или их смеси, и могут быть добавлены соответствующие количества солюбилизаторов, сорастворителей, регуляторов pH и регуляторов осмотического давления, обычно используемых в фармацевтике; солюбилизаторы или сорастворители могут представлять собой полоксамер, лецитин, гидроксипропил-β-циклодекстрин и другие подобные вещества; регуляторы pH могут представлять собой фосфат, ацетат, хлористоводородную кислоту, гидроксид натрия и другие подобные вещества; регуляторы осмотического давления могут представлять собой хлорид натрия, маннит, глюкозу, фосфат, ацетат и другие подобные вещества. В случае приготовления лиофилизированного порошка для инъекции, могут быть добавлены маннит и глюкоза в качестве проппанта. In order to prepare the compound of the invention in injection form, water, ethanol, isopropanol, propylene glycol or mixtures thereof may be used as a solvent, and appropriate amounts of solubilizers, co-solvents, pH adjusters and osmotic pressure regulators commonly used in pharmaceuticals may be added; solubilizers or cosolvents may be poloxamer, lecithin, hydroxypropyl-β-cyclodextrin and the like; pH adjusters may be phosphate, acetate, hydrochloric acid, sodium hydroxide and the like; Osmotic pressure regulators can be sodium chloride, mannitol, glucose, phosphate, acetate and other similar substances. In the case of preparing a lyophilized powder for injection, mannitol and glucose can be added as a proppant.

Кроме того, в лекарственную форму могут быть также добавлены окрашивающие вещества, консерванты, ароматизаторы или другие добавки, если это желательно.In addition, coloring agents, preservatives, flavorings, or other additives may also be added to the dosage form if desired.

Для достижения целей введения и усиления терапевтических эффектов, лекарственные средства или фармацевтические композиции по изобретению могут быть введены любыми известными способами введения. To achieve the purposes of administration and enhance therapeutic effects, drugs or pharmaceutical compositions of the invention can be administered by any known route of administration.

Доза введения фармацевтических композиций, включающих соединение по изобретению, может изменяться в широком диапазоне в зависимости от природы и тяжести предотвращаемых или подвергаемых лечению заболеваний, индивидуального состояния пациентов или животных, способов введения и лекарственных форм. Обычно, подходящим диапазоном суточной дозы для соединений по изобретению является диапазон 0,001-5 мг/кг массы тела. Упомянутая выше доза может быть введена в форме разовой дозы или может быть разделена на несколько единиц дозы, в зависимости от клинического опыта лечащего врача и режима дозирования, включая использование других терапевтических средств. The dosage of administration of pharmaceutical compositions comprising a compound of the invention may vary widely depending on the nature and severity of the diseases being prevented or treated, the individual condition of the patients or animals, routes of administration and dosage forms. Typically, a suitable daily dosage range for the compounds of the invention is 0.001-5 mg/kg body weight. The above dosage may be administered in the form of a single dose or may be divided into multiple dosage units, depending on the clinical experience of the attending physician and the dosage regimen, including the use of other therapeutic agents.

Соединения или композиции по изобретению могут быть введены в форме монотерапии или в комбинации с другими терапевтическими или симптоматическими лекарственными средствами. В случае, когда соединение по изобретению проявляет синергетические эффекты при использовании с другими терапевтическими средствами, его доза должна быть скорректирована в соответствии с реальной ситуацией.The compounds or compositions of the invention may be administered in the form of monotherapy or in combination with other therapeutic or symptomatic drugs. In the case where the compound of the invention exhibits synergistic effects when used with other therapeutic agents, its dosage should be adjusted according to the actual situation.

В четвертом аспекте технического решения по настоящему изобретению предлагается применение левовращающего бициклического морфолина и его фармацевтически приемлемой соли по первому аспекту и фармацевтической композиции по третьему аспекту при производстве лекарственных препаратов для предотвращения или лечения заболеваний печени. В изобретении, заболевания печени выбирают из заболеваний, связанных с повреждением печени, и гепатитов, в частности гепатита A, гепатита B, гепатита C, заболеваний печени, обусловленных действием лекарственного средства, алкогольных заболеваний печени, неалкогольных заболеваний печени, аутоиммунных заболеваний печени, фиброза печени, вызванного прогрессированием заболевания печени, цирроза печени и печеночной недостаточности.In a fourth aspect, the technical solution of the present invention provides the use of levorotatory bicyclic morpholine and a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the first aspect and a pharmaceutical composition according to the third aspect in the manufacture of drugs for the prevention or treatment of liver diseases. In the invention, liver diseases are selected from diseases associated with liver damage and hepatitis, in particular hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, drug-related liver diseases, alcoholic liver diseases, non-alcoholic liver diseases, autoimmune liver diseases, liver fibrosis caused by progression of liver disease, cirrhosis and liver failure.

ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯPOSITIVE EFFECTS OF THE INVENTION

Левовращающий бициклический морфолин и его фармацевтически приемлемая соль в изобретении проявляют более высокую фармакологическую активность, чем правовращающий энантиомер и рацемат в различных экспериментальных моделях повреждения печени на животных, со статистически значимым различием (P < 0,05). Кроме того, левовращающий бициклический морфолин и его фармацевтически приемлемая соль характеризуются улучшенными фармакокинетическими свойствами по сравнению с правоврающим энантиомером и рацематом.Levorotatory bicyclic morpholine and its pharmaceutically acceptable salt in the invention exhibit higher pharmacological activity than the dextrorotatory enantiomer and racemate in various experimental animal models of liver injury, with a statistically significant difference (P < 0.05). In addition, levorotatory bicyclic morpholine and its pharmaceutically acceptable salt are characterized by improved pharmacokinetic properties compared to the dextrorotary enantiomer and racemate.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ DESCRIPTION OF DRAWINGS

На фигуре 1 представлены данные по снижающему воздействию IMM-H014 энантиомеров на повышение уровня лактатдегидрогеназы (LDH) в надосадочной жидкости культуры клеток, вызванного 4-ацетамидофенолом (n=3-4). **P < 0,01, при сравнении с контрольной группой с плацебо; ^#P < 0,05, при сравнении с моделируемой группой. Figure 1 presents data on the reducing effect of IMM-H014 enantiomers on the increase in lactate dehydrogenase (LDH) levels in cell culture supernatant caused by 4-acetamidophenol (n=3-4). **P < 0.01, when compared with the control group with placebo; ^# P < 0.05, when compared with the simulated group.

НАИЛУЧШИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯBEST OPTIONS FOR IMPLEMENTING THE INVENTION

В изобретении предлагается левовращающий бициклический морфолин и его фармацевтически приемлемая соль для лечения заболеваний печени, способ его получения, его фармацевтическая композиция и применение. Приведенные далее примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, но никоим образом не ограничивают изобретение. Для специалистов в данной области является очевидным, что в отношении изобретения могут быть сделаны различные изменения и модификации без отклонения от сущности и объем изобретения.The invention provides levorotatory bicyclic morpholine and its pharmaceutically acceptable salt for the treatment of liver diseases, a method for its preparation, its pharmaceutical composition and use. The following examples further illustrate the invention, but do not limit the invention in any way. It will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications may be made to the invention without departing from the spirit and scope of the invention.

Спектры ядерного магнитного резонанса предлагаемого в изобретении левовращающего бициклического морфолина и его соли регистрируют на ядерно-магнитном резонансном спектрометре Varian Mercury-500 с использованием тетраметилсилана (TMS) в качестве внутреннего стандарта, и масс-спектры регистрируют на масс-спектрометре ZAB-2F.Nuclear magnetic resonance spectra of the inventive levorotatory bicyclic morpholine and its salt are recorded on a Varian Mercury-500 nuclear magnetic resonance spectrometer using tetramethylsilane (TMS) as an internal standard, and mass spectra are recorded on a ZAB-2F mass spectrometer.

Пример 1. Получение левовращающего (-)IMM-H014Example 1. Preparation of levorotatory (-)IMM-H014

a. SOCl₂/DMF; b. TEA/CH₂Cl₂ или CH₃COCH₃; c. L-DBTA/EA; d. NaHCO₃/H₂O/EA; e. CH₃SO₃H/EA.a. SOCl ₂ /DMF; b. TEA/CH ₂ Cl ₂ or CH ₃ COCH ₃ ; c. L-DBTA/EA; d. NaHCO ₃ /H ₂ O/EA; e. CH ₃ SO ₃ H/EA.

Соединение 1 (то есть бициклол, 5,1 г, 13,1 ммоля) загружали в трехгорлую колбу объемом 100 мл, снабженную магнитной мешалкой и термометром, затем добавляли 50 мл осушенного DMF, и полностью растворяли твердые вещества. После охлаждения реакционной системы до 0°С на ледяной бане, медленно добавляли по каплям SOCl₂ (4,5 мл, 61,8 ммоль), осуществляя при этом контроль, чтобы температура в системе не превышала 5°С. После добавления по каплям, реакционную смесь выдерживали на ледяной бане в течение 30 мин до тех пор, пока анализ методом тонкослойной хроматографии (TLC) не указывал на полную конверсию исходных материалов. Реакционную смесь выливали в приблизительно 100 г дробленного льда и интенсивно перемешивали с осаждением большого количества белых твердых веществ, которые фильтровали, и осадок на фильтре промывали небольшими количествами дистиллированной воды и эфира, и сушили путем отвода воды. Продукт сушили естественным путем на воздухе и взвешивали, получая суммарно 4,9 г белых твердых веществ (соединение 2), выход: 91,7%.Compound 1 (ie bicyclol, 5.1 g, 13.1 mmol) was charged into a 100 mL three-neck flask equipped with a magnetic stirrer and thermometer, then 50 mL of dried DMF was added and the solids were completely dissolved. After cooling the reaction system to 0°C in an ice bath, SOCl ₂ (4.5 mL, 61.8 mmol) was slowly added dropwise while ensuring that the system temperature did not exceed 5°C. After addition dropwise, the reaction mixture was kept in an ice bath for 30 min until thin layer chromatography (TLC) analysis indicated complete conversion of the starting materials. The reaction mixture was poured into approximately 100 g of crushed ice and stirred vigorously to precipitate a large amount of white solids, which were filtered, and the filter cake was washed with small quantities of distilled water and ether, and dried by draining. The product was naturally air dried and weighed to give a total of 4.9 g of white solids (compound 2), yield: 91.7%.

Морфолин (1,28 г, 14,7 ммоль) загружали в круглодонную колбу объемом 50 мл и затем добавляли 25 мл ацетона и 2,2 мл триэтиламина при перемешивании при комнатной температуре, затем добавляли соединение 2 (2,76 г, 6,8 ммоль). Проводили реакцию при комнатной температуре в течение 5 часов и дополнительно выдерживали реакционную смесь в течение ночи. Анализ методом TLC указывал на полную конверсию исходных материалов, и в системе образовались розовые нерастворимые вещества. После фильтрации, фильтрат отгоняли при пониженном давлении с удалением растворителя. Полученное желтое масло отделяли на вакуумной перегонной колонке (петролейный эфир:этилацетат=2:1), и продуктовые компоненты собирали, получая суммарно 3,1 г бесцветного масла (соединение 3), выход: 92,3%. MS-FAB [M+H]⁺=460,1.Morpholine (1.28 g, 14.7 mmol) was charged into a 50 ml round bottom flask and then 25 ml of acetone and 2.2 ml of triethylamine were added with stirring at room temperature, then compound 2 (2.76 g, 6.8 mmol). The reaction was carried out at room temperature for 5 hours and the reaction mixture was further kept overnight. TLC analysis indicated complete conversion of the starting materials and pink insolubles were formed in the system. After filtration, the filtrate was distilled off under reduced pressure to remove the solvent. The resulting yellow oil was separated by a vacuum distillation column (petroleum ether:ethyl acetate=2:1), and the product components were collected to give a total of 3.1 g of colorless oil (compound 3), yield: 92.3%. MS-FAB [M+H] ⁺ =460.1.

Соединение 3 (3,0 г, 6,54 ммоль) взвешивали и растворяли в 45 мл этилацетата и добавляли L-дибензоилвинную кислоту (L-DBTA, 1,2 г, 3,27 ммоль). При комнатной температуре, смесь перемешивали с осаждением белых твердых веществ, и через 30 минут проводили фильтрацию для сбора твердых веществ, которые затем сушили при 60°С в течение 1 часа и затем взвешивали, получая суммарно 1,25 г белых твердых веществ (левовращающий бициклический морфолин:L-дибензоилвинная кислота=2:1), выход: 56,8%. Анализ методом хиральной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) показывал, что энантиомерная чистота (%e.e.) промежуточного соединения 4 составляла 98,0%, [α]₂₅= -130,4 (CH₂Cl₂). Compound 3 (3.0 g, 6.54 mmol) was weighed and dissolved in 45 ml ethyl acetate and L-dibenzoyltartaric acid (L-DBTA, 1.2 g, 3.27 mmol) was added. At room temperature, the mixture was stirred to precipitate white solids, and after 30 minutes, filtration was performed to collect the solids, which were then dried at 60°C for 1 hour and then weighed, yielding a total of 1.25 g of white solids (levorotatory bicyclic morpholine:L-dibenzoyltartaric acid=2:1), yield: 56.8%. Chiral high performance liquid chromatography (HPLC) analysis indicated that the enantiomeric purity (%ee) of intermediate 4 was 98.0%, [α] ₂₅ = -130.4 (CH ₂ Cl ₂ ).

Промежуточное соединение 4 (1,25 г) диспергировали в 25 мл этилацетата и промывали два раза 25 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия, и органическую фазу сушили над безводным сульфата натрия, фильтровали и концентрировали с получением бесцветного масла. Масло растворяли в 10 мл этилацетата и добавляли 120 мкл метансульфоновой кислоты. Проводили кристаллизацию при комнатной температуре при перемешивании. После проведения фильтрации, полученные твердые вещества перекристаллизовывали в 10 мл метанола с получением 0,7 г (-)IMM-H014 в виде белого твердого вещества, HPLC чистота >98,0%, [α]₂₅=-65,6 (CH₂Cl₂). ¹H ЯМР (500 МГц, хлороформ-d) δ 7,45 (с, 1H), 7,38 (с, 1H), 6,14 (с, 1H), 6,02 (с, 1H), 5,96 (д, J=8,9 Гц, 2H), 4,37 (дд, J=13,3, 4,0 Гц, 1H), 4,16 (т, J=12,0 Гц, 1H), 4,05 (д, J=19,7 Гц, 8H), 3,96-3,81 (м, 3H), 3,76 (с, 3H), 3,57 (д, J=11,8 Гц, 1H), 3,41 (д, J=12,5 Гц, 1H), 2,91 (с, 3H), 2,79-2,68 (м, 1H), 2,50 (д, J=11,3 Гц, 1H).Intermediate 4 (1.25 g) was dispersed in 25 ml of ethyl acetate and washed twice with 25 ml of saturated aqueous sodium bicarbonate, and the organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated to give a colorless oil. The oil was dissolved in 10 ml of ethyl acetate and 120 μl of methanesulfonic acid was added. Crystallization was carried out at room temperature with stirring. After filtration, the resulting solids were recrystallized in 10 ml methanol to obtain 0.7 g (-)IMM-H014 as a white solid, HPLC purity >98.0%, [α] ₂₅ = -65.6 (CH ₂ Cl ₂ ). ^1H NMR (500 MHz, chloroform-d) δ 7.45 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 6.14 (s, 1H), 6.02 (s, 1H), 5. 96 (d, J=8.9 Hz, 2H), 4.37 (dd, J=13.3, 4.0 Hz, 1H), 4.16 (t, J=12.0 Hz, 1H), 4.05 (d, J=19.7 Hz, 8H), 3.96-3.81 (m, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.57 (d, J=11.8 Hz , 1H), 3.41 (d, J=12.5 Hz, 1H), 2.91 (s, 3H), 2.79-2.68 (m, 1H), 2.50 (d, J= 11.3 Hz, 1H).

Сравнительный пример 1. Получение правоврающего энантиомера (+)IMM-H014Comparative Example 1: Preparation of the Right-Handed Enantiomer (+)IMM-H014

Дополнительно загружали соединение 3 (3,0 г, 6,54 ммоль) и растворяли в 45 мл этилацетата, и затем добавляли D-дибензоилвинную кислоту (1,2 г, 3,27 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре для осаждения белых твердых веществ, и через 30 минут твердые вещества собирали, сушили при 60°С в течение 1 часа и взвешивали с получением 1,2 г белых твердых веществ (правовращающий бициклический морфолин:D-дибензоилвинная кислота=2:1), выход: 54,5%. Анализ методом хиральной высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) показывал, что энантиомерная чистота (%e.e.) промежуточного соединения 4 составляла 97,3%, [α]₂₅= +133,2 (CH₂Cl₂).Compound 3 (3.0 g, 6.54 mmol) was further charged and dissolved in 45 mL of ethyl acetate, and then D-dibenzoyltartaric acid (1.2 g, 3.27 mmol) was added. The mixture was stirred at room temperature to precipitate white solids, and after 30 minutes, the solids were collected, dried at 60°C for 1 hour and weighed to obtain 1.2 g of white solids (dextrorotatory bicyclic morpholine: D-dibenzoyltartaric acid=2 :1), yield: 54.5%. Chiral high performance liquid chromatography (HPLC) analysis indicated that the enantiomeric purity (%ee) of intermediate 4 was 97.3%, [α] ₂₅ = +133.2 (CH ₂ Cl ₂ ).

Промежуточное соединение (1,2 г) диспергировали в 25 мл этилацетата и промывали два раза 25 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия, и органическую фазу сушили над безводным сульфата натрия, фильтровали и концентрировали с получением бесцветного масла. Масло растворяли в 10 мл этилацетата и добавляли 120 мкл метансульфоновой кислоты. Проводили кристаллизацию при комнатной температуре при перемешивании. После проведения фильтрации, полученные твердые вещества перекристаллизовывали в 10 мл метанола с получением 0,6 г (+)IMM-H014, в виде белого твердого вещества, HPLC чистота >98,0%, [α]₂₅= -78,2 (CH₂Cl₂). ¹H ЯМР (500 МГц, хлороформ-d) δ 7,45 (с, 1H), 7,38 (с, 1H), 6,14 (с, 1H), 6,02 (с, 1H), 5,96 (д, J=8,9 Гц, 2H), 4,37 (дд, J=13,3, 4,0 Гц, 1H), 4,16 (т, J=12,0 Гц, 1H), 4,05 (д, J=19,7 Гц, 8H), 3,96-3,81 (м, 3H), 3,76 (с, 3H), 3,57 (д, J=11,8 Гц, 1H), 3,41 (д, J=12,5 Гц, 1H), 2,91 (с, 3H), 2,79-2,68 (м, 1H), 2,50 (д, J=11,3 Гц, 1H).The intermediate (1.2 g) was dispersed in 25 ml of ethyl acetate and washed twice with 25 ml of saturated aqueous sodium bicarbonate, and the organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated to give a colorless oil. The oil was dissolved in 10 ml of ethyl acetate and 120 μl of methanesulfonic acid was added. Crystallization was carried out at room temperature with stirring. After filtration, the resulting solids were recrystallized in 10 mL methanol to give 0.6 g (+)IMM-H014, as a white solid, HPLC purity >98.0%, [α] ₂₅ = -78.2 (CH ₂ Cl ₂ ). ^1H NMR (500 MHz, chloroform-d) δ 7.45 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 6.14 (s, 1H), 6.02 (s, 1H), 5. 96 (d, J=8.9 Hz, 2H), 4.37 (dd, J=13.3, 4.0 Hz, 1H), 4.16 (t, J=12.0 Hz, 1H), 4.05 (d, J=19.7 Hz, 8H), 3.96-3.81 (m, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.57 (d, J=11.8 Hz , 1H), 3.41 (d, J=12.5 Hz, 1H), 2.91 (s, 3H), 2.79-2.68 (m, 1H), 2.50 (d, J= 11.3 Hz, 1H).

Фармакологические экспериментыPharmacological experiments

Пример эксперимента 1. Воздействие оптических энантиомеров IMM-H014 на острое иммунное поражение печени, вызванное конканавалином (ConA)Experimental example 1: Effect of optical enantiomers of IMM-H014 on acute immune liver injury caused by concanavalin (ConA)

1. Метод создания модели острого иммунного повреждения печени у мышей, индуцированного с помощью ConA, и способ введения1. Method of establishing a model of acute immune liver injury in mice induced by ConA and method of administration

Самцов мышей линии ICR категории SPF (свободных от специфической патогенной микрофлоры) (20-22 г) после акклиматизации случайным образом подразделяли на 5 групп: контрольную группу с плацебо, модельную группу с индуцированным с помощью ConA поражением печени, группу введения 200 мг/кг (+)IMM-H014, группу введения 200 группа мг/кг (-) IMM-H014 и группу введения 200 мг/кг (±) IMM-H014, по 10 мышей в каждой группе. В каждой группе введения проводили внутрижелудочное введение один раз в сутки, и суммарно проводили введение три раза. Контрольной группе с плацебо и модельной группе внутрижелудочно вводили одну и ту же дозу физиологического раствора. Через 2 часа после последнего введения, мышам в каждой группе, кроме контрольной группы с плацебо, вводили однократно 20 мг/кг ConA в хвостовую вену, и доза каждого введения составляла 10 мл/кг. Мышей содержали в условиях голодания, но с доступом к воде, в течение 16 часов, а затем животных ожидала дальнейшая обработка.Male ICR mice of the SPF category (free from specific pathogenic microflora) (20-22 g) after acclimatization were randomly divided into 5 groups: a control group with placebo, a model group with ConA-induced liver damage, a group administered 200 mg/kg ( +)IMM-H014, 200 mg/kg group (-) IMM-H014 and 200 mg/kg group (±) IMM-H014, 10 mice in each group. In each administration group, intragastric administration was performed once a day, and a total of three administrations were performed. The placebo control group and the model group received the same dose of saline intragastrically. 2 hours after the last administration, mice in each group except the placebo control group were administered a single dose of 20 mg/kg ConA into the tail vein, and the dose of each administration was 10 ml/kg. The mice were kept under fasting conditions, but with access to water, for 16 hours, and then the animals awaited further treatment.

2. Определение биохимических показателей2. Determination of biochemical parameters

Мышей обезглавливали и собирали кровь, образцы крови выдерживали при комнатной температуре в течение 2 часов и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 минут для отделения сыворотки. Содержание аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови определяли на полностью автоматическом биохимическом анализаторе.Mice were decapitated and blood collected, blood samples were kept at room temperature for 2 hours and centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes to separate serum. The content of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and lactate dehydrogenase (LDH) in blood serum was determined using a fully automatic biochemical analyzer.

3. Статистический анализ3. Statistical analysis

Все данные были представлены как средняя величина±стандартное отклонение (±SD). Сравнения между группами проводили с использованием критерия Стьюдента, и значение P<0,05 указывало на наличие значимого различия.All data were presented as mean ± standard deviation ( ±SD). Comparisons between groups were performed using Student's t test, and a P value <0.05 indicated a significant difference.

4. Результаты эксперимента4. Experimental results

4.1. Воздействия энантиомеров IMM-H014 на увеличение содержания биомаркера АЛТ в сыворотке крови, обусловленное повреждениями печени, вызванными с помощью ConA 4.1. Effects of IMM-H014 Enantiomers on Increased Serum ALT Biomarker Associated with ConA-Induced Liver Injury

Уровень АЛТ в сыворотке крови прямо и положительно коррелирует со степенью поражения печени и является общепризнанным сывороточным биомаркером повреждений печени. Результаты в таблице 1 показали, что введение ConA в дозе 20 мг/кг вызывало значительные повреждения печени у мышей, а уровни АЛТ в сыворотке значимо повышались по сравнению с контрольной группой (P<0,001). Введение как (+)IMM-H014, так и (-)IMM-H014, позволяло значимо снижать вызванные ConA повышения уровня АЛТ в сыворотке (P<0,001). Процент снижения АЛТ при воздействии энантиомеров IMM-H014 составлял 95,3% и 97,3%, соответственно, а содержания АЛТ снижались до уровня контрольной группы. Как (+)IMM-H014, так и (-)IMM-H014 продемонстрировали значительное защитное действие в отношении вызванных ConA иммунных повреждений печени, и активность (-)IMM-H014 была немного выше, чем активность (+)IMM-Н014. По сравнению с (±) IMM-H014 в той же дозе, снижающие воздействия (+) IMM-H014 и (-) IMM-H014 на вызванное ConA повышение уровней АЛТ в сыворотке мышей превосходили воздействия (±)IMM-H014 (который также проявлял значительную эффективность, а процент снижения АЛТ составлял 88,6%), при этом снижающие воздействия (-)IMM-H014 на АЛТ имели статистически значимое различие (P<0,05) по сравнению с воздействиями (±)IMM-H014.Serum ALT levels directly and positively correlate with the degree of liver injury and are a well-established serum biomarker of liver injury. The results in Table 1 showed that administration of ConA at a dose of 20 mg/kg caused significant liver damage in mice, and serum ALT levels were significantly increased compared with the control group (P<0.001). Administration of both (+)IMM-H014 and (-)IMM-H014 significantly reduced ConA-induced increases in serum ALT levels (P<0.001). The percentage reduction in ALT when exposed to IMM-H014 enantiomers was 95.3% and 97.3%, respectively, and ALT contents were reduced to the level of the control group. Both (+)IMM-H014 and (-)IMM-H014 showed significant protective effects against ConA-induced immune liver injury, and the activity of (-)IMM-H014 was slightly higher than that of (+)IMM-H014. Compared with (±)IMM-H014 at the same dose, the reducing effects of (+)IMM-H014 and (-)IMM-H014 on ConA-induced increases in serum ALT levels in mice were superior to the effects of (±)IMM-H014 (which also exhibited significant efficacy, and the percentage reduction of ALT was 88.6%), while the reducing effects of (-)IMM-H014 on ALT had a statistically significant difference (P<0.05) compared with the effects of (±)IMM-H014.

Таблица 1. Снижающие воздействия энантиомеров IMM-H014 на ConA-индуцированные повышения АЛТ в сыворотке крови мышей (n=10)Table 1. Reducing effects of IMM-H014 enantiomers on ConA-induced increases in serum ALT in mice (n=10)

ГруппаGroup Дозы (мг/кг)Doses (mg/kg) АЛТ (Е/л)ALT (U/l) Процент снижения содержания АЛТ (%)Percentage of ALT reduction (%) Контрольная группа с плацебоControl group with placebo -- 39,5±9,639.5±9.6 -- Модельная группа с ConA-индуцированным повреждением печениModel group with ConA-induced liver damage -- 937,5±529,2***937.5±529.2*** -- (+)IMM-H014(+)IMM-H014 200200 44,4±29,1^### 44.4±29.1 ^### 95,395.3 (-)IMM-H014(-)IMM-H014 200200 25,6±17,4^###& 25.6±17.4 ^###& 97,397.3 (±)IMM-H014(±)IMM-H014 200200 107,0±108,7^### 107.0±108.7 ^### 88,688.6

***P<0,001, при сравнении с контрольной группой с плацебо; ^###P<0,001, при сравнении с модельной группой; ^&P<0,05, при сравнении с (±)IMM-H014 группой.***P<0.001, when compared with the control group with placebo; ^### P<0.001, when compared with the model group; ^& P < 0.05, when compared with (±)IMM-H014 group.

4.2. Воздействия энантиомеров IMM-H014 на увеличение содержания биомаркера АСТ в сыворотке крови, обусловленное повреждениями печени, вызванными с помощью ConA4.2. Effects of IMM-H014 Enantiomers on Increased Serum AST Biomarker Associated with ConA-Induced Liver Injury

Повышение уровня АСТ в сыворотке крови также является одним из важных маркеров повреждений гепатоцитов, в частности, повреждений митохондрий гепатоцитов, и в случае повреждений митохондрий, уровень АСТ в сыворотке крови значительно повышается, отражая тем самым тяжесть поражения гепатоцитов. Результаты представлены в таблице 2. Введение ConA в дозе 20 мг/кг вызывало значительное повреждение митохондрий гепатоцитов мышей, и уровень АСТ в сыворотке статистически значимо повышался по сравнению с контрольной группой с плацебо (P<0,001). Все энантиомеры (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014 проявляли способность снижать повышения уровня АСТ в сыворотке крови, вызванные с помощью ConA. По сравнению с модельной группой, процент снижения АСТ в группах введения (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014 составлял 44,8%, 72,9% и 22,2%, соответственно, при этом группа (-)IMM-H014 характеризовалась статистически значимой разницей (P<0,01) по сравнению с модельной группой. Активность (+)IMM-H014 и (-)IMM-H014 по снижению АСТ превосходила активность (±)IMM-H014, а активность (-)IMM-H014 была оптимальной и характеризовалась статистически значимой разницей (P<0,05) по сравнению с группой (±)IMM-H014 при той же самой дозе.An increase in the level of AST in the blood serum is also one of the important markers of damage to hepatocytes, in particular, damage to the mitochondria of hepatocytes, and in the case of mitochondrial damage, the level of AST in the blood serum increases significantly, thereby reflecting the severity of the damage to hepatocytes. The results are presented in Table 2. Administration of ConA at a dose of 20 mg/kg caused significant damage to the mitochondria of mouse hepatocytes, and serum AST levels were statistically significantly increased compared with the placebo control group (P<0.001). All enantiomers of (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 and (±)IMM-H014 exhibited the ability to reduce ConA-induced increases in serum AST levels. Compared with the model group, the percentage of AST reduction in the (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 and (±)IMM-H014 administration groups was 44.8%, 72.9% and 22.2%, respectively. while the (-)IMM-H014 group was characterized by a statistically significant difference (P<0.01) compared to the model group. The activity of (+)IMM-H014 and (-)IMM-H014 in reducing AST was superior to the activity of (±)IMM-H014, and the activity of (-)IMM-H014 was optimal and was characterized by a statistically significant difference (P<0.05) compared with group (±)IMM-H014 at the same dose.

Таблица 2. Снижающие воздействия энантиомеров IMM-H014 на ConA-индуцированные повышения АСТ в сыворотке крови мышей (n=10)Table 2. Reducing effects of IMM-H014 enantiomers on ConA-induced increases in AST in mouse serum (n=10)

ГруппаGroup Доза (мг/кг)Dose (mg/kg) АСТ (Е/л)AST (U/l) Процент снижения содержания АСТ (%)Percentage of reduction in AST content (%) Контрольная группа с плацебоControl group with placebo -- 72,0±24,572.0±24.5 -- Модельная группа с ConA-индуцированным повреждением печениModel group with ConA-induced liver damage -- 931,7±489,2***931.7±489.2*** -- (+)IMM-H014(+)IMM-H014 200200 514,3±310,7514.3±310.7 44,844.8 (-)IMM-H014(-)IMM-H014 200200 252,9±233,5^##& 252.9±233.5 ^##& 72,972.9 (±)IMM-H014(±)IMM-H014 200200 725,0±417,3725.0±417.3 22,222.2

***P<0,001, при сравнении с контрольной группой с плацебо; ^##P<0,01, при сравнении с модельной группой; &P<0,05, при сравнении с (±)IMM-H014 группой.***P<0.001, when compared with the control group with placebo; ^## P<0.01, when compared with the model group; &P<0.05, when compared with (±)IMM-H014 group.

4.3. Воздействия энантиомеров IMM-H014 на увеличение содержания биомаркера ЛДГ в сыворотке крови, обусловленное повреждениями печени, вызванными с помощью ConA4.3. Effects of IMM-H014 Enantiomers on Increased Serum LDH Biomarker Associated with ConA-Induced Liver Injury

При повреждении печени, уровень ЛДГ в сыворотке также может отражать состояние и степень повреждения гепатоцитов. Результаты представлены в таблице 3. Введение ConA в дозе 20 мг/кг путем инъекции в хвостовую вену вызывало серьезные повреждения гепатоцитов, и уровень ЛДГ в сыворотке был статистически значимо повышен по сравнению с контрольной группой с плацебо (P<0,001). Введение (-)IMM-H014 позволяло значительно понижать повышенный уровень ЛДГ в сыворотке крови, вызванный с помощью ConA, и процент снижения ЛДГ составлял до 54,4%, что характеризовалось статистически значимым различием (P<0,01) по сравнению с модельной группой. Введение (+)IMM-H014 также оказывало снижающее действие на повышенный уровень ЛДГ в сыворотке, и процент снижения составлял 27,6%, что не имело статистически значимого различия по сравнению с модельной группой. Введение (±)IMM-H014 в указанной дозе оказывало лишь слабое снижающее действие на повышенный уровень ЛДГ, и процент снижения составлял 6,4%. Что касается снижения уровня ЛДГ, то активность (-)IMM-H014 по-прежнему превосходила активность у (+)IMM-H014 и (±)IMM-H014, и наблюдалось статистически значимое различие (P<0,05) между (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014 при одной и той же дозе.In liver injury, serum LDH levels may also reflect the status and extent of hepatocyte injury. The results are shown in Table 3. Administration of ConA at a dose of 20 mg/kg by tail vein injection caused severe damage to hepatocytes, and serum LDH levels were statistically significantly increased compared with the placebo control group (P<0.001). Administration of (-)IMM-H014 significantly reduced the elevated serum LDH level induced by ConA, and the percentage of LDH reduction was up to 54.4%, which was statistically significant difference (P<0.01) compared with the model group . Administration of (+)IMM-H014 also had a reducing effect on elevated serum LDH levels, and the reduction percentage was 27.6%, which was not statistically significantly different compared with the model group. Administration of (±)IMM-H014 at the indicated dose had only a weak reducing effect on elevated LDH levels, and the percentage reduction was 6.4%. Regarding LDH reduction, the activity of (-)IMM-H014 was still superior to that of (+)IMM-H014 and (±)IMM-H014, and there was a statistically significant difference (P<0.05) between (-) IMM-H014 and (±)IMM-H014 at the same dose.

Таблица 3. Снижающие воздействия энантиомеров IMM-H014 на ConA-индуцированные повышения ЛДГ в сыворотке крови мышей (n=10)Table 3. Reducing effects of IMM-H014 enantiomers on ConA-induced increases in serum LDH in mice (n=10)

ГруппаGroup Доза (мг/кг)Dose (mg/kg) ЛДГ (Е/л)LDH (U/l) Процент снижения содержания ЛДГ (%)LDH reduction percentage (%) Контрольная группа с плацебоControl group with placebo -- 1158,5±289,71158.5±289.7 -- Модельная группа с ConA-индуцированным повреждением печениModel group with ConA-induced liver damage -- 3702,5±1221,0***3702.5±1221.0*** -- (+)IMM-H014(+)IMM-H014 200200 2680,0±1190,82680.0±1190.8 27,627.6 (-)IMM-H014(-)IMM-H014 200200 1690,0±929,3^##& 1690.0±929.3 ^##& 54,454.4 (±)IMM-H014(±)IMM-H014 200200 3466,7±1772,43466.7±1772.4 6,46.4

Пример эксперимента 2. Воздействия оптических энантиомеров IMM-H014 на вызванные этионином неалкогольные жировые гепатозыExample of experiment 2. Effects of optical enantiomers of IMM-H014 on ethionine-induced non-alcoholic fatty liver disease

1. Метод создания модели вызванного этионином неалкогольного жирового гепатоза и метод введения1. Method for creating a model of ethionine-induced non-alcoholic fatty liver disease and administration method

Самцов мышей линии ICR категории SPF (свободных от специфической патогенной микрофлоры) (20-22 г) после акклиматизации случайным образом подразделяли на 5 групп: контрольную группу с плацебо, модельную группу с индуцированным с помощью этионина жировым гепатозом, группу введения 200 мг/кг (+)IMM-H014, группу введения 200 группа мг/кг (-) IMM-H014 и группу введения 200 мг/кг (±) IMM-H014, по 5 мышей в каждой группе. За три дня до создания модели, в каждой группе введения проводили внутрижелудочное введение один раз в сутки, и суммарно проводили введение три раза. Животным в контрольной группе с плацебо и в модельной группе внутрижелудочно вводили одну и ту же дозу физиологического раствора. Каждая вводимая доза составляла 10 мл/кг. Через один час после последнего введения, мышам в каждой группе внутрижелудочно вводили разовую дозу 250 мг/кг этионина. Вводимая доза составляла 20 мл/кг. Мышей содержали в условиях голодания, но с доступом к воде, в течение 24 часов, а затем животных ожидала дальнейшая обработка.Male ICR mice of the SPF category (free from specific pathogenic microflora) (20-22 g) after acclimatization were randomly divided into 5 groups: a control group with placebo, a model group with ethionine-induced fatty hepatosis, a group administered 200 mg/kg ( +)IMM-H014, 200 mg/kg group (-) IMM-H014 and 200 mg/kg group (±) IMM-H014, 5 mice in each group. Three days before creating the model, each administration group underwent intragastric administration once a day, and a total of three administrations were performed. Animals in the control group with placebo and in the model group were intragastrically injected with the same dose of saline. Each dose administered was 10 ml/kg. One hour after the last administration, mice in each group were intragastrically administered a single dose of 250 mg/kg ethionine. The administered dose was 20 ml/kg. The mice were kept under fasting conditions, but with access to water, for 24 hours, and then the animals awaited further treatment.

2. Определения содержаний триглицерида и холестерина в тканях печени2. Determination of triglyceride and cholesterol content in liver tissues

Мышей подвергали торакотомии для извлечения печени, которую промывали физиологическим раствором при 4°С. Часть тканей печени перерабатывали в 10% гомогенат ткани печени с помощью лизата и электрического гомогенизатора, после чего одну часть гомогената использовали для измерения в ней содержания триглицеридов и холестерина с помощью набора для определения триглицеридов и набора для определения холестерина, а другую часть гомогената подвергали анализу для определения содержания белков с помощью набора для количественного определения белка ВСА. Содержание триглицерида и холестерина в тканях печени подвергали коррекции с учетом содержания белка.Mice underwent thoracotomy to remove the liver, which was washed with saline at 4°C. A portion of the liver tissue was processed into a 10% liver tissue homogenate using a lysate and an electrical homogenizer, after which one portion of the homogenate was used to measure its triglyceride and cholesterol content using a triglyceride test kit and a cholesterol test kit, and the other portion of the homogenate was analyzed for determination of protein content using the BCA protein quantitation kit. The content of triglyceride and cholesterol in liver tissues was corrected taking into account protein content.

3. Статистический анализ3. Statistical analysis

Путем использования пакета программ обработки статистических данных (SPSS), все данные были представлены как средняя величина±стандартное отклонение ( ±SD). Сравнения между группами проводили с использованием критерия Стьюдента, и значение P<0,05 указывало на наличие значимого различия.By using statistical software package (SPSS), all data were presented as mean ± standard deviation ( ±SD). Comparisons between groups were performed using Student's t test, and a P value <0.05 indicated a significant difference.

4. Результаты эксперимента4. Experimental results

4.1. Воздействия энантиомеров IMM-H014 на повышения содержания холестерина (TC) в ткани печени мышей, вызванные этионином 4.1. Effects of IMM-H014 enantiomers on ethionine-induced increases in cholesterol (TC) content in mouse liver tissue

Этионин, в силу того, что он препятствует метаболизму метионина и дополнительно влияет на синтез аполипопротеина, может приводить к тому, что синтезируемые в гепатоцитах холестерин, триглицерид и другие подобные вещества не могут переноситься в кровь, что вызывает накопление липидов гепатоцитов, и в результате чего формируется модель безалкогольного жирового гепатоза печени, вызванного воздействием лекарственного средства. Результаты представлены в таблице 4. Этионин в дозе 250 мг/кг может вызывать статистически достоверное повышение (P<0,05) содержания холестерина в тканях печени по сравнению с контрольной группой с плацебо. Введение как (+) IMM-H014, так и (-) IMM-H014, позволяет снижать вызванное этионином накопление ТС в ткани печени, и процент снижения ТС при воздействии энантиомеров IMM-H014 (то есть (+) IMM-H014 и (-) IMM -H014) составлял 27,2% и 32,4%, соответственно, при этом группа (-)IMM-H014 имела статистически значимое различие (P<0,05) по сравнению с модельной группой. (±)IMM-H014 также оказывал статистически значимое ингибирующее действие на индуцированное этионином увеличение ТС в ткани печени, и оно имело статистически значимое различие (P<0,05) по сравнению с модельной группой. Активность (-) IMM-H014 была немного выше, чем активность (±) IMM-H014.Ethionine, due to the fact that it interferes with the metabolism of methionine and additionally affects the synthesis of apolipoprotein, can lead to the fact that cholesterol, triglyceride and other similar substances synthesized in hepatocytes cannot be transferred into the blood, which causes the accumulation of lipids in hepatocytes, and as a result A model of non-alcoholic fatty liver hepatosis caused by drug exposure is being formed. The results are presented in Table 4. Ethionine at a dose of 250 mg/kg can cause a statistically significant increase (P<0.05) in cholesterol content in liver tissue compared to the placebo control group. Administration of both (+) IMM-H014 and (-) IMM-H014 reduces ethionine-induced accumulation of TC in liver tissue, and the percentage reduction in TC when exposed to enantiomers of IMM-H014 (i.e. (+) IMM-H014 and (- )IMM-H014) were 27.2% and 32.4%, respectively, with the (-)IMM-H014 group having a statistically significant difference (P<0.05) compared with the model group. (±)IMM-H014 also had a statistically significant inhibitory effect on ethionine-induced increase in TC in liver tissue, and it had a statistically significant difference (P<0.05) compared with the model group. The activity of (−) IMM-H014 was slightly higher than that of (±) IMM-H014.

Таблица 4. Снижающие воздействия энантиомеров IMM-H014 на вызванное этионином накопление TC в ткани печени мышей (n=10)Table 4. Reducing effects of IMM-H014 enantiomers on ethionine-induced TC accumulation in mouse liver tissue (n=10)

ГруппаGroup Доза (мг/кг)Dose (mg/kg) TC
(ммоль/г белка)TC
(mmol/g protein) Процент снижение TC (%)Percentage reduction in TC (%) Контрольная группа с плацебоControl group with placebo -- 0,060±0,0140.060±0.014 -- Модельная группа с этионин-индуцированным повреждением печениModel group with ethionine-induced liver damage -- 0,089±0,019*0.089±0.019* -- (+)IMM-H014(+)IMM-H014 200200 0,065±0,0220.065±0.022 27,227.2 (-)IMM-H014(-)IMM-H014 200200 0,061±0,013^# 0.061±0.013 ^# 32,432.4 (±)IMM-H014(±)IMM-H014 200200 0,063±0,013^# 0.063±0.013 ^# 30,030.0

*P<0,05, при сравнении с контрольной группой с плацебо; ^#P<0,05, при сравнении с модельной группой.*P<0.05, when compared with the control group with placebo; ^# P < 0.05, when compared with the model group.

4.2 Воздействия энантиомеров IMM-H014 на повышения содержания триглицерида (TG) в ткани печени мышей, вызванные этионином 4.2 Effects of IMM-H014 enantiomers on ethionine-induced increases in triglyceride (TG) content in mouse liver tissue

Результаты представлены в таблице 5. Этионин в дозе 250 мг/кг вызывал статистически значимое повышение (P<0,05) содержания TG в тканях печени по сравнению с содержанием TG в контрольной группе с плацебо, с проявлением симптомов неалкогольного жирового гепатоза печени. Введение (-)IMM-H014 позволяло статистически значимо снижать накопления TG в тканях печени, вызванные этионином, и процент снижения TG составлял 39,0%, что имело статистически значимое различие (P<0,05) по сравнению с модельной группой. Введение (+)IMM-H014 характеризовалось слабыми снижающими воздействиями на повышенное содержание TG в тканях печени, вызванное этионином, составляя процент снижения только 7,1%.The results are presented in Table 5. Ethionine at a dose of 250 mg/kg caused a statistically significant increase (P<0.05) in TG content in liver tissue compared to TG content in the control group with placebo, with the manifestation of symptoms of non-alcoholic fatty liver disease. Administration of (-)IMM-H014 could statistically significantly reduce ethionine-induced TG accumulation in liver tissue, and the percentage of TG reduction was 39.0%, which had a statistically significant difference (P<0.05) compared with the model group. Administration of (+)IMM-H014 had weak reducing effects on ethionine-induced elevated TG levels in liver tissue, accounting for a percentage reduction of only 7.1%.

Таблица 5. Снижающие воздействия энантиомеров IMM-H014 на вызванное этионином накопление TG в ткани печени мышей (n=10)Table 5. Reducing effects of IMM-H014 enantiomers on ethionine-induced TG accumulation in mouse liver tissue (n=10)

ГруппаGroup Доза (мг/кг)Dose (mg/kg) TG
(ммоль/г белка)TG
(mmol/g protein) Процент снижение TG (%)Percentage reduction in TG (%) Контрольная группа с плацебоControl group with placebo -- 0,152±0,00230.152±0.0023 -- Модельная группа с этионин-индуцированным повреждением печениModel group with ethionine-induced liver damage -- 0,253±0,078*0.253±0.078* -- (+)IMM-H014(+)IMM-H014 200200 0,235±0,0700.235±0.070 7,17.1 (-)IMM-H014(-)IMM-H014 200200 0,154±0,040^# 0.154±0.040 ^# 39,039.0 (±)IMM-H014(±)IMM-H014 200200 0,110±0,005^## 0.110±0.005 ^## 56,656.6

*P<0,05, при сравнении с контрольной группой с плацебо; ^#P<0,05, ^##P<0,01, при сравнении с модельной группой*P<0.05, when compared with the control group with placebo; ^# P<0.05, ^## P<0.01, when compared with the model group

Пример эксперимента 3. Воздействия оптических энантиомеров IMM-H014 на вызванные 4-ацетамидофенолом повреждения гепатоцитов Experimental example 3: Effects of optical enantiomers of IMM-H014 on 4-acetamidophenol-induced hepatocyte damage

1. Культура клеток1. Cell culture

Клетки линии рака печени HepG₂ человека хорошо сохраняют характеристики нормальных гепатоцитов человека, и их выращивали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (содержащей 100 Е/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) при условиях культивирования: 37°С, 5% CO₂ и максимальной влажности. Для дигерирования и пассажей использовали раствор, содержащий 0,25% трипсина и 0,02% EDTA.Human liver cancer HepG ₂ cells retain the characteristics of normal human hepatocytes well and were grown in DMEM containing 10% fetal calf serum (containing 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin) under culture conditions: 37°C, 5 % CO ₂ and maximum humidity. For digestion and passages, a solution containing 0.25% trypsin and 0.02% EDTA was used.

2. Защитное действие энантиомеров IMM-H014 при повреждении гепатоцитов, вызываемом 4-ацетамидофенолом in vitro2. Protective effect of IMM-H014 enantiomers against hepatocyte damage caused by 4-acetamidophenol in vitro

Использовали метод MTT. Клетки HepG₂ инокулировали в 96-луночном планшете для культивирования клеток, и через 24 часа культивирования, добавляли в нетоксичной концентрации (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014, и в тоже время добавляли 4-ацетамидофенол (APAP, конечная концентрация 8 мM). Для проведения эксперимента формировали группу положительного контроля с бициклолом, контрольную группу с растворителем и модельную группу. Культивирование продолжали в течение 24 часов. Отбирали 100 мкл культурального раствора и центрифугировали, и затем проводили определение уровня LDH на полностью автоматическом биохимическом анализаторе с использованием набора для обнаружения LDH. Оставшийся культуральный раствор отбрасывали, и в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора MTT (0,5 мг/мл) для продолжения культивирования в течение 4 часов. Раствор MTT отбрасывали, и в каждую лунку добавляли 150 мкл DMSO. Смесь перемешивали с помощью вибратора, и измеряли величину поглощения (OD) при длине волны 570 нм в считывающем устройстве для микропланшетов. Степень выживаемости клеток (%)=(средняя величина OD в группе введения/ средняя величина OD в контрольной группе с растворителем) ×100%.The MTT method was used. HepG ₂ cells were inoculated in a 96-well cell culture plate, and after 24 hours of culture, non-toxic concentrations of (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 and (±)IMM-H014 were added, and at the same time 4 -acetamidophenol (APAP, final concentration 8 mM). To conduct the experiment, a positive control group with bicyclol, a control group with a solvent, and a model group were formed. Cultivation was continued for 24 hours. 100 μL of the culture solution was collected and centrifuged, and then the LDH level was determined on a fully automatic chemistry analyzer using an LDH detection kit. The remaining culture solution was discarded, and 100 μL of MTT solution (0.5 mg/mL) was added to each well to continue culture for 4 hours. The MTT solution was discarded and 150 μL DMSO was added to each well. The mixture was stirred using a vibrator, and the absorbance value (OD) was measured at a wavelength of 570 nm in a microplate reader. Cell survival rate (%)=(average OD value in the injection group/average OD value in the vehicle control group) ×100%.

3. Статистический анализ3. Statistical analysis

Данные были представлены как средняя величина±стандартное отклонение ( ±SD). Сравнения между группами проводили с использованием критерия Стьюдента, и значение P<0,05 указывало на наличие значимого различияData were presented as mean ± standard deviation ( ±SD). Comparisons between groups were performed using Student's t test, and a P value of <0.05 indicated a significant difference.

4. Результаты эксперимента4. Experimental results

Проводили эксперимент по воздействия на клетки HepG₂ в течение 48 часов 10 мкМ (+)IMM-H014, 10 мкМ (-)IMM-H014 10 мкМ of the (±) IMM-H014 acted, и оказалось, что они не оказывали статистически значимого токсического действия на клетки, в каждом случае степень выживания клеток составляла 90%. Эту концентрацию использовали для исследования защитного действия при повреждении гепатоцитов, вызванным с помощью APAP. Результаты приведены в таблице 6, воздействие 8 мM APAP вызывало статистически значимое повреждение клеток HepG₂, и степень выживания клеток составляла только 38,33% (P<0,001) по сравнению с контрольной группой с плацебо. Введение (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014 в дозе 10 мкМ оказывало статистически значимое защитное действие при повреждении гепатоцитов человека, вызываемом APAP in vitro (P<0,05, P<0,001, P<0,01), и процент повышения выживаемости клеток составлял 41,4%, 74,8% и 32,1%, соответственно. Активность (-)IMM-H014 была относительно оптимальной, и она имела статистически значимое отличие по сравнению с группой (±) IMM-H014 при одной и той же дозе (P<0,05). Бициклол также позволял статистически значимо улучшать состояние поврежденных в результате воздействия APAP гепатоцитов (P<0,05).An experiment was conducted on exposing HepG ₂ cells to 10 µM (+)IMM-H014, 10 µM (-)IMM-H014, 10 µM of the (±) IMM-H014 acted for 48 hours, and it turned out that they did not have a statistically significant effect toxic effect on cells, in each case the cell survival rate was 90%. This concentration was used to study the protective effect on hepatocyte damage caused by APAP. The results are shown in Table 6, exposure to 8 mM APAP caused statistically significant damage to HepG ₂ cells, and the cell survival rate was only 38.33% (P<0.001) compared with the placebo control group. Administration of (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 and (±)IMM-H014 at a dose of 10 μM had a statistically significant protective effect against APAP-induced damage to human hepatocytes in vitro (P<0.05, P<0.001, P<0.01), and the percentage increase in cell survival was 41.4%, 74.8%, and 32.1%, respectively. The activity of (−)IMM-H014 was relatively optimal, and it had a statistically significant difference compared with the (±)IMM-H014 group at the same dose (P<0.05). Bicyclol also allowed a statistically significant improvement in the condition of hepatocytes damaged as a result of exposure to APAP (P<0.05).

Таблица 6. Воздействие энантиомеров IMM-H014 на степень выживаемости поврежденных в результате воздействия 4-ацетамидофенола гепатоцитов (n=3-4)Table 6. Impact of IMM-H014 enantiomers on the survival rate of hepatocytes damaged as a result of exposure to 4-acetamidophenol (n=3-4)

ГруппаGroup Концентрации (мкМ)Concentrations (µM) Средняя величина
OD±SDaverage value
OD±SD Степень выживаемости (%)Survival rate (%) Увеличение степени выживаемости клеток (%)Increased cell survival rate (%) Контрольная группа с плацебоControl group with placebo -- 0,845±0,0370.845±0.037 100,00100.00 -- Модельная группа с APAP-вызванным повреждением гепатоцитов Model group with APAP-induced hepatocyte injury -- 0,343±0,029***0.343±0.029*** 38,3338.33 -- (+)IMM-H014(+)IMM-H014 1010 0,489±0,098^# 0.489±0.098 ^# 54,5854.58 42,442.4 (-)IMM-H014(-)IMM-H014 1010 0,600±0,054^###& 0.600±0.054 ^###& 67,0167.01 74,874.8 (±)IMM-H014(±)IMM-H014 1010 0,453±0,032^## 0.453±0.032 ^## 50,6350.63 32,132.1 БициклолBicyclol 1010 0,454±0,092^# 0.454±0.092 ^# 50,6750.67 32,232.2

***P<0,001, при сравнении с контрольной группой с плацебо; ^#P<0,05, ^##P<0,01, ^###P<0,001, при сравнении с модельной группой; ^&P<0,05, при сравнении с группой (±)IMM-H014.***P<0.001, when compared with the control group with placebo; ^# P < 0.05, ^## P < 0.01, ^### P < 0.001, when compared with the model group; ^& P < 0.05, when compared with the (±)IMM-H014 group.

LDH (молочная дегидрогеназа) является одним из важных ферментов клеточного энергетического метаболизма. При гибели клеток, клеточная мембрана разрывается, и LDH высвобождается из цитоплазмы, причем уровень LDH пропорционален степени повреждения клеток. Результаты представлены на фигуре 1. Проводили исследование по воздействию 8 мМ АРАР на клетки HepG2 в течение 24 часов, и было обнаружено, что уровень LDH в надосадочной жидкости клеточной культуры статистически достоверно повышался по сравнению с контрольной группой с плацебо (P<0,01), что также указывало на значительные повреждения гепатоцитов. Воздействия (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014 в дозе 10 мкМ позволяет снижать уровни LDH, при этом уровни LDH в случае использования (-)IMM-H014 и (±) IMM-H014 имели статистически значимые различия (P<0,05, P<0,05) по сравнению с модельной группой, а снижающее действие в случае группы (-)IMM-H014 было немного выше, чем у группы (± )IMM-H014 при той же дозе. LDH (lactic dehydrogenase) is one of the important enzymes in cellular energy metabolism. When cells die, the cell membrane ruptures and LDH is released from the cytoplasm, with the level of LDH being proportional to the degree of cell damage. The results are shown in Figure 1. A study was conducted on the effect of 8 mM APAP on HepG2 cells for 24 hours, and it was found that the level of LDH in the cell culture supernatant was statistically significantly increased compared to the placebo control group (P<0.01) , which also indicated significant damage to hepatocytes. Exposure to (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 and (±)IMM-H014 at a dose of 10 µM reduces LDH levels, while LDH levels in the case of (-)IMM-H014 and (±)IMM-H014 had statistically significant differences (P<0.05, P<0.05) compared with the model group, and the reducing effect in the case of the (-)IMM-H014 group was slightly higher than that of the (±)IMM-H014 group at that same dose.

Пример эксперимента 4. Воздействия оптических энантиомеров IMM-H014 на вызванные тетрахлоридом углерода повреждения гепатоцитовExample Experiment 4: Effects of Optical Enantiomers of IMM-H014 on Carbon Tetrachloride-Induced Hepatocyte Damage

1. Культура клеток1. Cell culture

Клетки линии рака печени HepG₂ человека хорошо сохраняют характеристики нормальных гепатоцитов человека, и их выращивали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (содержащей 100 Е/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) при условиях культивирования: 37°С, 5% CO₂ и максимальной влажности. Для дигерирования и пассажей использовали раствор, содержащий 0,25% трипсина и 0,02% EDTAHuman liver cancer HepG ₂ cells retain the characteristics of normal human hepatocytes well and were grown in DMEM containing 10% fetal calf serum (containing 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin) under culture conditions: 37°C, 5 % CO ₂ and maximum humidity. For digestion and passages, a solution containing 0.25% trypsin and 0.02% EDTA was used

2. Защитное действие энантиомеров IMM-H014 при повреждении гепатоцитов, вызываемом тетрахлоридом углерода in vitro2. Protective effect of IMM-H014 enantiomers against hepatocyte damage caused by carbon tetrachloride in vitro

Использовали метод MTT. Клетки HepG₂ инокулировали в 96-луночном планшете для культивирования клеток, и через 24 часа культивирования, добавляли в нетоксичной концентрации (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014, и в тоже время добавляли тетрахлорид углерода (CCl₄, конечная концентрация 0,6%). Для проведения эксперимента формировали группу положительного контроля с бициклолом, контрольную группу с растворителем и модельную группу. Воздействие на клетки продолжалось непрерывно в течение 24 часов. Культуральный раствор отбрасывали, и в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора MTT (0,5 мг/мл) для продолжения культивирования в течение 4 часов. Раствор MTT отбрасывали, и в каждую лунку добавляли 150 мкл DMSO. Смесь перемешивали с помощью вибратора, и измеряли величину поглощения (OD) при длине волны 570 нм в считывающем устройстве для микропланшетов. Степень выживаемости клеток (%)=(средняя величина OD в группе введения/ средняя величина OD в контрольной группе с растворителем) ×100%.The MTT method was used. HepG ₂ cells were inoculated in a 96-well cell culture plate, and after 24 hours of culture, (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 and (±)IMM-H014 were added at a non-toxic concentration, and tetrachloride was added at the same time carbon (CCl ₄ , final concentration 0.6%). To conduct the experiment, a positive control group with bicyclol, a control group with a solvent, and a model group were formed. The exposure of the cells continued continuously for 24 hours. The culture solution was discarded, and 100 μL of MTT solution (0.5 mg/mL) was added to each well to continue culture for 4 hours. The MTT solution was discarded and 150 μL DMSO was added to each well. The mixture was stirred using a vibrator, and the absorbance value (OD) was measured at a wavelength of 570 nm in a microplate reader. Cell survival rate (%)=(average OD value in the injection group/average OD value in the vehicle control group) ×100%.

3. Статистический анализ3. Statistical analysis

Данные были представлены как средняя величина±стандартное отклонение ( ±SD). Сравнения между группами проводили с использованием критерия Стьюдента, и значение P<0,05 указывало на наличие значимого различия.Data were presented as mean ± standard deviation ( ±SD). Comparisons between groups were performed using Student's t test, and a P value <0.05 indicated a significant difference.

4. Результаты эксперимента4. Experimental results

Проводили эксперимент по воздействия на клетки HepG₂ в течение 48 часов 10 мкМ (+)IMM-H014, 10 мкМ (-)IMM-H014 10 мкМ of the (±) IMM-H014 acted, и оказалось, что они не оказывали статистически значимого токсического действия на клетки, в каждом случае степень выживания клеток составляла 90%. Эту концентрацию использовали для исследования защитного действия при повреждении гепатоцитов, вызванным с помощью CCl₄. Результаты приведены в таблице 7, воздействие 0,6% CCl₄ вызывало статистически значимое повреждение клеток HepG₂, и степень выживания клеток составляла 77,50% (P<0,001) по сравнению с контрольной группой с плацебо. Введение (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014 в дозе 10 мкМ оказывало статистически значимое защитное действие при повреждении гепатоцитов человека, вызываемом CCl₄ in vitro (P<0,05, P<0,01, P<0,01), и процент повышения выживаемости клеток составлял 12,59%, 34,66% и 18,74%, соответственно. По сравнению с (±)IMM-H014 при одной и той же дозе, (-)IMM-H014 имел более высокую активность при защите от повреждения гепатоцитов, вызванных CCl₄. Бициклол также позволял статистически значимо улучшать состояние поврежденных в результате воздействия CCl₄ гепатоцитов.An experiment was conducted on exposing HepG ₂ cells to 10 µM (+)IMM-H014, 10 µM (-)IMM-H014, 10 µM of the (±) IMM-H014 acted for 48 hours, and it turned out that they did not have a statistically significant effect toxic effect on cells, in each case the cell survival rate was 90%. This concentration was used to study the protective effect on hepatocyte damage caused by CCl ₄ . The results are shown in Table 7, exposure to 0.6% CCl ₄ caused statistically significant damage to HepG ₂ cells, and the cell survival rate was 77.50% (P<0.001) compared with the placebo control group. Administration of (+)IMM-H014, (-)IMM-H014 and (±)IMM-H014 at a dose of 10 µM had a statistically significant protective effect against damage to human hepatocytes caused by CCl ₄ in vitro (P<0.05, P<0 .01, P<0.01), and the percentage increase in cell survival was 12.59%, 34.66%, and 18.74%, respectively. Compared with (±)IMM-H014 at the same dose, (-)IMM-H014 had higher activity in protecting against CCl ₄ -induced hepatocyte damage. Bicyclol also made it possible to statistically significantly improve the condition of hepatocytes damaged as a result of exposure to CCl ₄ .

Таблица 7. Воздействие энантиомеров IMM-H014 на степень выживаемости поврежденных в результате воздействия тетрахлорида углерода гепатоцитов (n=3-4) Table 7. Effect of IMM-H014 enantiomers on the survival rate of hepatocytes damaged as a result of exposure to carbon tetrachloride (n=3-4)

ГруппаGroup Концентрации (мкМ)Concentrations (µM) Средняя величина
OD±SDaverage value
OD±SD Степень выживаемости (%)Survival rate (%) Увеличение степени выживаемости клеток (%)Increased cell survival rate (%) Контрольная группа с плацебоControl group with placebo -- 0,915±0,1280.915±0.128 100,00100.00 -- Модельная группа с CCl₄ вызванным повреждением гепатоцитовModel group with CCl ₄ -induced hepatocyte damage -- 0,709±0,043**0.709±0.043** 77,5077.50 -- (+)IMM-H014(+)IMM-H014 1010 0,799±0,014^# 0.799±0.014 ^# 87,3287.32 12,5912.59 (-)IMM-H014(-)IMM-H014 1010 0,956±0,120^## 0.956±0.120 ^## 104,44104.44 34,6634.66 (±)IMM-H014(±)IMM-H014 1010 0,843±0,050^## 0.843±0.050 ^## 92,0992.09 18,7418.74 БициклолBicyclol 1010 0,819±0,099^# 0.819±0.099 ^# 89,4789.47 15,3615.36

**P<0,01, при сравнении с контрольной группой с плацебо; ^#P<0.05, ^##P<0,01, при сравнении с модельной группой.**P<0.01, when compared with the control group with placebo; ^# P < 0.05, ^{# #} P < 0.01, when compared with the model group.

Фармакокинетические исследованияPharmacokinetic studies

Пример эксперимента 5Example experiment 5

1. Цели проведения эксперимента1. Objectives of the experiment

Самцам крыс линии SD внутрижелудочно вводили индивидуальный энантиомер и рацемат IMM-H014 с целью сравнения их фармакокинетических характеристик в организмах крыс.Male SD rats were intragastrically administered the individual enantiomer and racemate of IMM-H014 to compare their pharmacokinetic characteristics in rats.

2. Приборы и материалы для проведения эксперимента2. Instruments and materials for conducting the experiment

2.1. Приборы для проведения эксперимента2.1. Instruments for conducting the experiment

Тройной тандемный квадрупольный хромато-масс-спектрометр Agilent 6470 (Agilent Technologies Inc.), электронные аналитические весы модели Mettler AG135, пипетка-пистолет, центрифуга TDL-5-A, мини-центрифуга SIGMA, нагнетатель азота и весы для взвешивания животных. Agilent 6470 Triple Tandem Quadrupole Chromatography-Mass Spectrometer (Agilent Technologies Inc.), Mettler Model AG135 Electronic Analytical Balance, Pipette Gun, TDL-5-A Centrifuge, SIGMA Mini Centrifuge, Nitrogen Injector, and Animal Weighing Scale.

2.2. Материалы для проведения эксперимента2.2. Materials for the experiment

(+)IMM-H014, (-)IMM-H014, (±)IMM-H014; метанол (чистота для масс-спектрометрии, фирмы Fisher Scientific Inc., cat# 179097); ацетонитрил (чистота для масс-спектрометрии, фирмы Fisher Scientific Inc., cat# 177802); деионизированная вода (фирмы Hangzhou Wahaha Co.); муравьиная кислота (чистота для HPLC, ROE SCIENTIFIC INC, cat# 6F2941); этилацетат (чистота для масс-спектрометрии, фирмы Fisher Scientific Inc., cat# 166828); пробирки Эппендорфа объемом 1,5 мл.(+)IMM-H014, (-)IMM-H014, (±)IMM-H014; methanol (mass spectrometry grade, Fisher Scientific Inc., cat# 179097); acetonitrile (mass spectrometry grade, Fisher Scientific Inc., cat# 177802); deionized water (from Hangzhou Wahaha Co.); formic acid (HPLC grade, ROE SCIENTIFIC INC, cat# 6F2941); ethyl acetate (mass spectrometry grade, Fisher Scientific Inc., cat# 166828); 1.5 ml Eppendorf tubes.

2.3. Экспериментальные животные2.3. Experimental animals

36 самцов крыс линии SD (200±10 г) приобретали у компании Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Крыс содержали в несодержащей микробов комнате помещения для животных в Институте фармакологии Китайской академии медицинских наук (Institute of Materia Medica Chinese Academy of Medical Science) при освещении в течение 12 часов каждый день при температуре 23±2°С и при относительной влажности 55±5%. Экспериментальные животные имели свободный доступ к воде и корму, и через 2 недели периода акклиматизации, начинали проведение эксперимента. Исследование соответствовало требованиям, разработанным комиссией по этическим нормам проведения экспериментов над животными Института фармакологии Китайской академии медицинских наук.36 male SD rats (200 ± 10 g) were purchased from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Rats were kept in a germ-free room of the animal facility at the Institute of Materia Medica Chinese Academy of Medical Science under light for 12 hours each day at a temperature of 23 ± 2°C and a relative humidity of 55 ± 5% . The experimental animals had free access to water and food, and after a 2-week acclimatization period, the experiment began. The study complied with the requirements developed by the Ethical Standards Committee for Animal Experimentation of the Institute of Pharmacology of the Chinese Academy of Medical Sciences.

3. Эксперименты над животными3. Experiments on animals

3.1. Распределение животных по группам введения препаратов3.1. Distribution of animals by drug administration groups

36 самцов крыс линии SD случайным образом подразделяли на 6 групп, по 6 животных в каждой группе, включающих: группу внутрижелудочного введения (+)IMM-H014, группу внутрижелудочного введения (-)IMM-H014 и группу внутрижелудочного введения (±)IMM-H014. Вводимая доза составляла 50 мг/кг. Крысам не выдавали корм в течение 12 часов до начала введений, но они имели свободный доступ к питьевой воде.36 male SD rats were randomly divided into 6 groups, 6 animals in each group, including: intragastric group (+)IMM-H014, intragastric group (-)IMM-H014 and intragastric group (±)IMM-H014 . The administered dose was 50 mg/kg. Rats were fasted for 12 hours before administration but had free access to drinking water.

3.2. Приготовление растворов для введения3.2. Preparation of solutions for administration

100 мг исходного лекарственного средства IMM-H014 взвешивали и растворяли в 20 мл очищенной воды с получением раствора для введения 5 мг/мл, который вводили (1 мл/100 г) разовой дозой в соответствии с массами тел животных.100 mg of the original drug IMM-H014 was weighed and dissolved in 20 ml of purified water to obtain a 5 mg/ml administration solution, which was administered (1 ml/100 g) in a single dose according to the body weights of the animals.

3.3. Сбор образцов плазмы3.3. Collection of plasma samples

В моменты времени 0 часов до введений, и через 5 минут, 10 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 5 часов, 8 часов, 12 часов и 24 часа после введений, отбирали по 250 мкл крови из нижней крестцовой вены, помещали в пробирку Эппендорфа, содержащую 10 мкл гепарина натрия, и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 минут, и затем отбирали плазму крови и хранили в морозильнике при -80°С.At time points 0 hours before injections, and 5 minutes, 10 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 5 hours, 8 hours, 12 hours and 24 hours after injections, 250 μl of blood was collected from the lower sacral veins were placed in an Eppendorf tube containing 10 μl of sodium heparin and centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes, and then blood plasma was collected and stored in a freezer at -80°C.

4. Метод анализа4. Method of analysis

4.1. Приготовление раствора4.1. Preparation of the solution

4.1.1. Приготовление исходных растворов4.1.1. Preparation of stock solutions

5 мг контрольного образца IMM-H014 взвешивали с высокой точностью и помещали в мерную колбу объемом 5 мл, и растворяли и разбавляли до требуемой концентрации метанолом с получением контрольного исходного раствора с концентрацией 1,0 мг/мл.5 mg of control sample IMM-H014 was weighed accurately into a 5 mL volumetric flask, and dissolved and diluted to the required concentration with methanol to obtain a control stock solution with a concentration of 1.0 mg/mL.

4.1.2. Приготовление рабочих растворов внутренних стандартов 4.1.2. Preparation of working solutions of internal standards

5,0 мг контрольного образца карбамазепина взвешивали с большой точностью и помещали в мерную колбу объемом 5 мл, и растворяли и доводили до постоянного объема до требуемой концентрации метанолом с получением исходного раствора внутреннего стандарта с концентрацией 1,0 мг/мл. 50 мкл исходного раствора отбирали с высокой точностью пипеткой и помещали в мерную колбу объемом 10 мл, и растворяли и доводили до постоянного объема до требуемой концентрации метанолом с получением исходного раствора внутреннего стандарта с концентрацией 5,0 мкг/мл. 5,0 мл исходного концентрированного раствора внутреннего стандарта отбирали с высокой точностью пипеткой и помещали в мерную колбу объемом 50 мл, и растворяли и доводили до постоянного объема до требуемой концентрации метанолом с получением рабочего раствора внутреннего стандарта с концентрацией с 500 нг/мл.A 5.0 mg carbamazepine control sample was accurately weighed into a 5 mL volumetric flask and dissolved and adjusted to a constant volume to the required concentration with methanol to obtain an internal standard stock solution of 1.0 mg/mL. 50 μL of the stock solution was accurately pipetted into a 10 mL volumetric flask and dissolved and adjusted to a constant volume to the required concentration with methanol to obtain an internal standard stock solution of 5.0 μg/mL. 5.0 ml of the original concentrated internal standard solution was pipetted with high precision and placed in a 50 ml volumetric flask, and dissolved and brought to a constant volume to the required concentration with methanol to obtain a working solution of the internal standard with a concentration of 500 ng/ml.

4.1.3. Приготовление стандартных рабочих растворов с серией концентраций и стандартных растворов контроля качества4.1.3. Preparation of standard working solutions with a series of concentrations and standard quality control solutions

100 мкл исходного раствора 1,0 мг/мл IMM-H014 отбирали с высокой точностью пипеткой и помещали в мерную колбу объемом 10 мл, и разбавляли метанолом с получением раствора IMM-H014 с концентрацией 10 мкг/мл. Раствор последовательно разбавляли метанолом с получением серии стандартных растворов IMM-H014 с концентрациями 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000 и 5000 нг/мл.100 μL of 1.0 mg/mL IMM-H014 stock solution was accurately pipetted into a 10 mL volumetric flask and diluted with methanol to obtain a 10 μg/mL IMM-H014 solution. The solution was serially diluted with methanol to obtain a series of IMM-H014 standard solutions with concentrations of 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000 and 5000 ng/ml.

Исходный раствор 1,0 мг/мл IMM-H014 отбирали с высокой точностью пипеткой и последовательно разбавляли метанолом с получением стандартных растворов для количественного контроля с концентрациями 5, 100 и 4000 нг/мл.A stock solution of 1.0 mg/mL IMM-H014 was accurately pipetted and serially diluted with methanol to produce quantitative control standard solutions at concentrations of 5, 100, and 4000 ng/mL.

4.1.4. Приготовление матрицы образцов для построения калибровочной кривой и образцов для количественного контроля 4.1.4. Preparation of a matrix of samples for constructing a calibration curve and samples for quantitative control

50 мкл стандартных растворов с концентрациями 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000 и 5000 нг/мл, соответственно, отбирали с высокой точностью пипеткой и сушили в токе азота при 30°С, и добавляли 50 мкл контрольной плазмы крысы. После перемешивания смеси в течение 3 минут, получали матрицу образцов для построения калибровочной кривой. 50 μl of standard solutions with concentrations of 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 4000 and 5000 ng/ml, respectively, were pipetted with high precision and dried under a stream of nitrogen at 30°C, and 50 μl was added control rat plasma. After stirring the mixture for 3 minutes, a matrix of samples was obtained for constructing a calibration curve.

50 мкл стандартных растворов с концентрацией 5, 100 и 4000 нг/мл, соответственно, отбирали с высокой точностью пипеткой и сушили в токе азота при 30°С, и добавляли 50 мкл контрольной плазмы крысы. После перемешивания смеси в течение 3 минут, получали образцы для контроля качества.50 μl of standard solutions with a concentration of 5, 100 and 4000 ng/ml, respectively, were carefully pipetted and dried under a stream of nitrogen at 30°C, and 50 μl of control rat plasma was added. After stirring the mixture for 3 minutes, quality control samples were obtained.

4.2 Подготовка образцов для анализа4.2 Preparation of samples for analysis

50 мкл образца плазмы отбирали с высокой точностью пипеткой и затем добавляли 10 мкл рабочего раствора внутреннего стандарта, все это помещали в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл. перемешивали в течение 30 секунд и добавляли 500 мкл этилацетата. Затем перемешивали в течение 5 минут, и после выдерживания в течение еще 10 минут при 4°С, проводили центрифугирование в течение 5 минут при 13000 об/мин. Отбирали надосадочную жидкость и сушили в токе азота N₂ при 30°С. Остаток повторно растворяли путем добавления 100 мкл исходной подвижной фазы и центрифугировали в течение 5 минут при 13000 об/мин, и надосадочную жидкость переносили в емкость для образцов для проведения измерений.A 50 μL plasma sample was accurately pipetted and then 10 μL of internal standard working solution was added into a 1.5 mL Eppendorf tube. stirred for 30 seconds and added 500 μl of ethyl acetate. It was then stirred for 5 minutes, and after standing for another 10 minutes at 4°C, centrifugation was carried out for 5 minutes at 13,000 rpm. The supernatant liquid was collected and dried in a stream of nitrogen _N2 at 30°C. The residue was redissolved by adding 100 μL of the original mobile phase and centrifuged for 5 minutes at 13,000 rpm, and the supernatant was transferred to a sample container for measurements.

4.3. Условия проведения хроматографического анализа4.3. Conditions for chromatographic analysis

Хроматографическая колонка: Agilent ZORBAX SB-C18 (2,1×100 мм, 3,5 мкм)Chromatography column: Agilent ZORBAX SB-C18 (2.1×100 mm, 3.5 µm)

Подвижная фаза A: вода (0,1% муравьиная кислота, 1 мM ацетат аммония); подвижная фаза B: ацетонитрил (0,1% муравьиная кислота)Mobile phase A: water (0.1% formic acid, 1 mM ammonium acetate); mobile phase B: acetonitrile (0.1% formic acid)

Температура колонки: 35°С; количество образца: 3 мклColumn temperature: 35°C; sample quantity: 3 µl

Элюирование: 0-2 мин: 40%-53% B; 2-3 мин: 53%-40% BElution: 0-2 min: 40%-53% B; 2-3 min: 53%-40% B

4.4. Условия проведения масс-спектрометрии4.4. Conditions for mass spectrometry

Источник ионов: электрораспылительная ионизация (ESI); режим детекции: положительные ионы; температура осушающих газов: 300°С; расход осушающих газов: газообразный азот, 11 л/мин; распыляющий газ: азот, 0,1 МПа; капиллярное напряжение: 4000 в; режим сканирования: мониторинг множественных реакций (MRM); ионные пары и относящиеся к ним параметры напряжения приведены ниже: Ion source: electrospray ionization (ESI); detection mode: positive ions; temperature of drying gases: 300°C; drying gas flow rate: nitrogen gas, 11 l/min; atomizing gas: nitrogen, 0.1 MPa; capillary voltage: 4000 V; scan mode: multiple reaction monitoring (MRM); The ion pairs and their associated voltage parameters are given below:

СоединениеCompound Первичный ион
(m/z) Primary ion
(m/z) Вторичный ион
(m/z)Secondary ion
(m/z) CE (электрон-вольт)CE (electron volt) Фрагментор (вольт)Fragmentor (volts) ПолярностьPolarity IMM-H014IMM-H014 460,2460.2 373,1373.1 1717 135135 Положительный Positive IMM-H014IMM-H014 460,2460.2 343,1343.1 1717 135135 ПоложительныйPositive КарбамазепинCarbamazepine 237237 194194 1818 120120 ПоложительныйPositive

5. Обработка данных5. Data processing

Полученные после сбора образцов исходные данные подвергали обработке с использованием программного обеспечения MassHunter QQQ с получением данных по концентрации лекарственного средства в крови, затем рассчитывали фармакокинетические параметры с использованием программного обеспечения DAS, и, наконец, проводили статистическую проверку с использованием критерия Стьюдента, применяя программный продукт SPSS, при сравнении, существовали ли статистически значимые различия для лекарственных средств, имеющих одну и ту же оптическую активность, но в различных партиях, и для лекарственных средств, имеющих различную оптическую активность, при этом считали, что P<0,05 характеризует статистически значимые различия.The raw data obtained after sample collection was processed using MassHunter QQQ software to obtain blood drug concentration data, then pharmacokinetic parameters were calculated using DAS software, and finally statistical testing was carried out using Student's t test using SPSS software. , when comparing whether there were statistically significant differences between drugs having the same optical activity, but in different batches, and for drugs having different optical activity, P<0.05 was considered to indicate statistically significant differences .

При исследовании внутрижелудочного введения 3 группам крыс линии SD индивидуальнгого энантиомера и рацемата IMM-H014, соответственно, изучали их фармакокинетические характеристики в организме крыс. Результаты этого исследования позволили сделать вывлод, что уровни воздействия in vivo внутрижелудочно введеных (-)IMM-H014 и (±)IMM-H014 превосходили уровни воздействия (+)IMM-H014.In a study of intragastric administration of the individual enantiomer and racemate IMM-H014 to 3 groups of SD rats, respectively, their pharmacokinetic characteristics in the body of rats were studied. The results of this study concluded that in vivo exposure levels of intragastrically administered (-)IMM-H014 and (±)IMM-H014 were superior to those of (+)IMM-H014.

Таблица 8. Усредненные фармакокинетические параметры (исключая резко отклоняющиеся значения) для каждой группы крысTable 8. Average pharmacokinetic parameters (excluding outliers) for each group of rats

Параметр
(параметры)Parameter
(options) РазмерностьDimension (+)-IMM-H014(+)-IMM-H014 (-)-IMM-H014(-)-IMM-H014 (±)IMM-H014(±)IMM-H014 AUC (0-t)AUC(0-t) мкг/л•часµg/l•hour 2876±1978*2876±1978* 5866±29795866±2979 5242±34475242±3447 AUC (0-∞)AUC (0-∞) мкг/л•часµg/l•hour 2877±1977*2877±1977* 5892±30055892±3005 5268±34325268±3432 t1/2zt1/2z часhour 0,984±0,260.984±0.26 1,248±0,331.248±0.33 1,206±0,271.206±0.27 TmaxTmax часhour 0,334±0,190.334±0.19 0,30±0,180.30±0.18 0,209±0,150.209±0.15 CLz/FCLz/F л/час/кгl/hour/kg 25,0±15,725.0±15.7 10,7±6,210.7±6.2 14,0±9,314.0±9.3 CmaxCmax мкг/лµg/l 2277±20012277±2001 3280±15793280±1579 3324±23073324±2307

*: (+)-IMM-H014, при сравнении с рацемическим IMM-H014, P<0,05*: (+)-IMM-H014, compared with racemic IMM-H014, P<0.05

Claims

1. Levorotatory bicyclic morpholine or a pharmaceutically acceptable salt thereof, characterized in that the structure of the levorotatory bicyclic morpholine is represented by compound 5, and its pharmaceutically acceptable salt has the structural formula (I):

,

where X is selected from inorganic acids and organic acids.

2. Levorotatory bicyclic morpholine or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to claim 1, characterized in that the inorganic acids include hydrofluoric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, acetic acid, sulfuric acid and phosphoric acid; organic acids include acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, oxalic acid, malic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid , p-toluenesulfonic acid, salicylic acid, quinic acid, camphoric acid, camphorsulfonic acid, aspartic acid, glutamic acid, pyroglutamic acid.

3. Levorotatory bicyclic morpholine or its pharmaceutically acceptable salt according to claim 1, characterized in that the organic acids are selected from L-tartaric acid, L-dibenzoyltartaric acid, L-di-p-methylbenzoyltartaric acid, L-diethyl tartrate, L-malic acid , L-camphoric acid, L-10-camphorsulfonic acid, R-(-)-mandelic acid, L-quinic acid, L-aspartic acid, L-glutamic acid, L-pyroglutamic acid, D-tartaric acid, D-dibenzoyltartaric acid, D-di-p-methylbenzoyltartaric acid, D-diethyl tartrate, D-malic acid, D-camphoric acid, D-10-camphorsulfonic acid, S-(-)-mandelic acid, D-quinic acid, D-aspartic acid , D-glutamic acid and D-pyroglutamic acid.

4. Levorotatory bicyclic morpholine or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to claim 1, characterized in that the pharmaceutically acceptable salt thereof is selected from (-)-bicyclic morpholine methanesulfonate having the following formula:

.

5. A method for producing levorotatory bicyclic morpholine or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of claims. 1-4, characterized in that it includes the following stages:

a) chlorination of the hydroxyl group of bicyclol to obtain compound 2;

b) reacting compound 2 with morpholine to obtain compound 3;

c) forming a salt by reacting compound 3 with chiral acid Y and performing separation in an organic solvent using the difference in salt solubility to obtain levorotatory salt 4, wherein chiral acid Y is selected from L-tartaric acid, L-dibenzoyltartaric acid, L-di-n -methylbenzoyltartaric acid, L-diethyl tartrate, L-malic acid, L-camphoric acid, L-10-camphorsulfonic acid, R-(-)-mandelic acid, L-quinic acid, L-aspartic acid, L-glutamic acid, L -pyroglutamic acid, D-tartaric acid, D-dibenzoyltartaric acid, D-di-p-methylbenzoyltartaric acid, D-diethyl tartrate, D-malic acid, D-camphoric acid, D-10-camphorsulfonic acid, S-(-)- mandelic acid, D-quinic acid, D-aspartic acid, D-glutamic acid, D-pyroglutamic acid;

the organic solvent is selected from ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol and isopropanol and solvents obtained by mixing the above solvents at different ratios; enantiomeric purity values %e.e. the levorotatory enantiomer and the dextrorotatory enantiomer are, respectively, more than 95%;

d) converting salt 4 into the free amine form by reaction with a base;

e) forming a salt by reacting the free form of amine 5 with acid X to obtain a compound of formula I;

where the definitions for X are the same as in any one of paragraphs. 1-4.

6. Pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of liver diseases, characterized in that it includes a therapeutically and/or prophylactically effective amount of levorotatory bicyclic morpholine or its pharmaceutically acceptable salt according to any one of paragraphs. 1-4 and optionally one or more pharmaceutically acceptable carriers or excipients.

7. The use of levorotatory bicyclic morpholine or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to any one of paragraphs. 1-4 or a pharmaceutical composition according to claim 6 in the production of medicinal products for the prevention or treatment of liver diseases.

8. Use according to claim 7, characterized in that liver diseases include diseases associated with liver damage and hepatitis.

9. Use according to claim 7, characterized in that the liver diseases are selected from hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, drug-induced liver diseases, alcoholic liver diseases, non-alcoholic liver diseases, autoimmune liver diseases, liver fibrosis caused by progression liver disease, liver cirrhosis and liver failure.