RU2818641C1 - Method of introducing primordial germ cells of birds into an embryo "in ovo" - Google Patents
Method of introducing primordial germ cells of birds into an embryo "in ovo" Download PDFInfo
- Publication number
- RU2818641C1 RU2818641C1 RU2023129031A RU2023129031A RU2818641C1 RU 2818641 C1 RU2818641 C1 RU 2818641C1 RU 2023129031 A RU2023129031 A RU 2023129031A RU 2023129031 A RU2023129031 A RU 2023129031A RU 2818641 C1 RU2818641 C1 RU 2818641C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- germ cells
- primordial germ
- embryo
- birds
- recipient
- Prior art date
Links
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 84
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims abstract description 34
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 26
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims abstract description 24
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 21
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 210000003278 egg shell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 7
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 claims description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 claims description 3
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 abstract description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 20
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 abstract description 16
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 8
- 238000011109 contamination Methods 0.000 abstract description 7
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 abstract 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 abstract 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 6
- 238000003822 preparative gas chromatography Methods 0.000 description 5
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000000998 shell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 210000004712 air sac Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области технологий живых систем, в частности, к группе клеточных технологий получения и введения донорских эмбриональных примордиальных половых клеток птиц без переноса содержимого яйца в специализированную кювету [C12N 5/00, A01K 41/00, A01K 67/00, G01N 1/00].The invention relates to the field of technologies of living systems, in particular, to the group of cellular technologies for obtaining and introducing donor embryonic primordial germ cells of birds without transferring the contents of the egg into a specialized cuvette [C12N 5/00, A01K 41/00, A01K 67/00, G01N 1/ 00].
Из уровня техники известна ПЕРЕДАЧА ПО ЗАРОДЫШЕВОЙ ЛИНИИ ПЕРВИЧНЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ЦЫПЛЯТ (PGCS) [US 2017086431 (A1), ОПУБЛ. 30.03.2017], при которой один трансфицированный PGC получают путем прямого культивирования цельной крови, полученной из куриного эмбриона на стадии 12-17, пассированного в течение по меньшей мере 40 дней in vitro.The prior art knows the GERM LINE TRANSMISSION OF PRIMARY GERMS CELLS OF CHICKENS (PGCS) [US 2017086431 (A1), PUBLISHED. 03/30/2017], in which one transfected PGC is obtained by direct culture of whole blood obtained from a chick embryo at stage 12-17, passaged for at least 40 days in vitro.
Недостатком данного метода является то, что примордиальные половые клетки получают из крови куриного эмбриона путем вскрытия скорлупы яйца и перемещения содержимого яйца в специализированную кювету, что приводит к чрезмерной травматизации и микробной контаминации эмбриона курицы.The disadvantage of this method is that primordial germ cells are obtained from the blood of a chicken embryo by opening the egg shell and moving the contents of the egg into a specialized cuvette, which leads to excessive trauma and microbial contamination of the chicken embryo.
Также известны СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРВИЧНЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК И ТРАНСГЕННЫХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ [WO 1998016630 (A1), ОПУБЛ. 1998-04-23], включающие создание клеточных линий, происходящих из первичных зародышевых клеток, трансформацию первичных зародышевых клеток и клеточных линий, происходящих из первичных зародышевых клеток, и использование этих трансформированных клеток и клеточных линий для создания трансгенных видов животных, не являющихся грызунами.Also known are METHODS FOR OBTAINING PRIMARY GERMS CELLS AND TRANSGENIC SPECIES OF ANIMALS [WO 1998016630 (A1), PUBLISHED. 1998-04-23], including the creation of cell lines derived from primordial germ cells, transformation of primordial germ cells and cell lines derived from primordial germ cells, and the use of these transformed cells and cell lines to create transgenic species of non-rodent animals.
Недостатком данного метода является то, что примордиальные половые клетки получают из крови куриного эмбриона путем вскрытия скорлупы яйца и перемещения содержимого яйца в специализированную кювету, что приводит к чрезмерной травматизации и микробной контаминации эмбриона курицы.The disadvantage of this method is that primordial germ cells are obtained from the blood of a chicken embryo by opening the egg shell and moving the contents of the egg into a specialized cuvette, which leads to excessive trauma and microbial contamination of the chicken embryo.
Наиболее близким по технической сущности является СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ ЗАРОДЫШЕВЫХ КЛЕТОК КУРИЦЫ ДЛЯ СОХРАНЕНИЯ СЕМЕННОГО РЕСУРСА ШТАММА [CN 116410933 (A), ОПУБЛ. 11.07.2023], включающий следующие этапы: отбор свежих яиц с зеленой скорлупой в качестве доноров развитых до 180 часов, вскрытие яичной скорлупы, вынимание куриного эмбриона и исследование его под микроскопом, отделение гонад после развития куриных эмбрионов до 132 часов, расщепление гонад на отдельные клетки трипсином, фильтрация отдельных клеток через сито с ячейками 40 мк и культивирование отдельных клеток при плотности 900 клеток на микролитр культуральной среды, замораживание в жидком азоте, и размораживание путем добавления свежей суспензии, а также инъекция примордиальных зародышевых клеток цыплят белоногим цыплятам, которые развиваются в течение 60 часов, методом периферической сосудистой инъекции и непрерывного вылупления, при этом количество инъекционных клеток составляет 20000-30000, защита ресурсов штамма слоя зеленой скорлупы каждого инъекция эмбрионов.The closest in technical essence is the METHOD FOR OBTAINING AND USING PRIMARY CHICKEN GERM CELLS TO PRESERVE THE SEED RESOURCE OF THE STRAIN [CN 116410933 (A), PUBLISHED. 07/11/2023], including the following stages: selection of fresh eggs with green shells as donors developed up to 180 hours, opening of the eggshell, removing the chicken embryo and examining it under a microscope, separation of the gonads after the development of chicken embryos up to 132 hours, splitting the gonads into separate cells with trypsin, filtering single cells through a 40-μm sieve and culturing single cells at a density of 900 cells per microliter of culture medium, freezing in liquid nitrogen, and thawing by adding a fresh suspension, and injecting chick primordial germ cells into developing white-footed chicks for 60 hours, by peripheral vascular injection method and continuous hatching, the number of injected cells is 20000-30000, protecting the resources of the green shell layer strain of each embryo injection.
Основной технической проблемой прототипа, содержащего этапы получения примордиальных клеток и получения химерных цыплят, является то, что примордиальные половые клетки получают из крови куриного эмбриона путем вскрытия скорлупы яйца и перемещения содержимого яйца в специализированную кювету, что приводит к чрезмерной травматизации и микробной контаминации эмбриона курицы, а также низкое количество полученных примордиальных половых клеток данным способом, которое обусловлено тем, что количество примордиальных половых клеток в гонадах на стадии формирования низкое, поскольку они дифференцируются и участвуют в закладке ткани гонад, а большая их часть до 7 дня культивирования циркулирует в кровяном русле эмбриона.The main technical problem of the prototype, which contains the stages of obtaining primordial cells and obtaining chimeric chickens, is that primordial germ cells are obtained from the blood of a chicken embryo by opening the egg shell and moving the contents of the egg into a specialized cuvette, which leads to excessive trauma and microbial contamination of the chicken embryo, as well as a low number of primordial germ cells obtained by this method, which is due to the fact that the number of primordial germ cells in the gonads at the formation stage is low, since they differentiate and participate in the formation of gonadal tissue, and most of them circulate in the bloodstream of the embryo until the 7th day of cultivation .
Задача изобретения является устранение недостатков прототипа.The objective of the invention is to eliminate the shortcomings of the prototype.
Технический результат изобретения заключается в увеличении эффективности процессов переноса примордиальных половых клеток реципиенту и получения эмбрионов птиц и цыплят с введенными донорскими (возможно генетически отредактированными) примордиальными половыми клетками за счет значительного снижения уровня травматизации эмбриона, а также уменьшения микробной контаминации, следовательно, в повышении выживаемости эмбрионов, а также в увеличении количества полученных примордиальных половых клеток с одного эмбриона.The technical result of the invention is to increase the efficiency of the processes of transferring primordial germ cells to the recipient and obtaining embryos of birds and chickens with introduced donor (possibly genetically edited) primordial germ cells due to a significant reduction in the level of trauma to the embryo, as well as a decrease in microbial contamination, therefore, increasing the survival rate of embryos , as well as in increasing the number of obtained primordial germ cells from one embryo.
1. Указанный технический результат достигается за счет того, что способ получения примордиальных половых клеток птиц и введения их в эмбрион in ovo характеризуется тем, что отбирают и инкубируют яйца птицы, проводят круговой надпил скорлупы яйца птицы, затем через отверстие в скорлупе яйца микроинъектором со стеклянной микроиглой из дорсальной аорты эмбриона птицы отбирают образец крови для культивирования, для введения примордиальных половых клеток кур с отредактированным геномом, в эмбрион-реципиент осуществляют круговой надпил скорлупы яйца-реципиента, далее через отверстие в скорлупе яйца-реципиента с помощью микроинъектора со стеклянной микроиглой, заполненной примордиальными половыми клетками, проводят инъекцию в дорсальную аорту эмбриона-реципиента примордиальных половых клеток.1. The specified technical result is achieved due to the fact that the method of obtaining primordial germ cells of birds and introducing them into the embryo in ovo is characterized by the fact that bird eggs are selected and incubated, a circular cut is made on the shell of the bird egg, then through a hole in the egg shell with a microinjector with a glass Using a microneedle, a blood sample is taken from the dorsal aorta of a bird embryo for cultivation, for the introduction of primordial germ cells of chickens with an edited genome, a circular cut of the recipient egg shell is made into the recipient embryo, then through a hole in the recipient egg shell using a microinjector with a glass microneedle filled primordial germ cells, an injection is carried out into the dorsal aorta of the embryo-recipient of primordial germ cells.
В частности, используют яйца индейки, курицы, перепела, фазана или утки, а также диких редких и исчезающих видов птиц.In particular, they use eggs from turkey, chicken, quail, pheasant or duck, as well as wild rare and endangered species of birds.
В частности, инкубацию проводят до получения эмбриона птицы на стадии 13-14 по Гамбургеру-Гамильтону.In particular, incubation is carried out until a bird embryo is obtained at the Hamburger-Hamilton stage 13-14.
В частности, иглу при отборе образца крови из дорсальной аорты эмбриона или инъекции примордиальных половых клеток в дорсальную аорту эмбриона проводят параллельно артерии, против направления кровотока эмбриона.In particular, when collecting a blood sample from the dorsal aorta of the embryo or injecting primordial germ cells into the dorsal aorta of the embryo, the needle is passed parallel to the artery, against the direction of blood flow of the embryo.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
На фиг. 1 представлен способ получения нативных примордиальных половых клеток и введения донорских примордиальных половых клеток in ovo.In fig. 1 shows a method for obtaining native primordial germ cells and introducing donor primordial germ cells in ovo.
Осуществление изобретенияCarrying out the invention
Способ получения примордиальных половых клеток птиц и введения их в эмбрион in ovo относится к биотехнологии и может быть использован для переноса донорских примордиальных половых клеток птиц, в том числе с отредактированным геномом, в эмбрионы-реципиенты, а также для получения стабильной эмбриональной клеточной линии примордиальных половых клеток птиц. Способ получения и введения примордиальных половых клеток птиц включает следующие этапы: отбор и подготовка яиц для инкубации, инкубация, вскрытие яйца и введение клеток или получение образцов крови, культивирование в специально подобранной среде с добавлением фактором роста клеток, оценка и подсчет примордиальных половых клеток, выделенных из эмбриона, криоконсервация и размораживание полученных примордиальных половых клеток.The method for obtaining primordial germ cells of birds and introducing them into an embryo in ovo relates to biotechnology and can be used to transfer donor primordial germ cells of birds, including those with an edited genome, into recipient embryos, as well as to obtain a stable embryonic cell line of primordial germ cells bird cages. The method for obtaining and introducing primordial germ cells of birds includes the following stages: selection and preparation of eggs for incubation, incubation, opening the egg and introducing cells or obtaining blood samples, cultivation in a specially selected medium with the addition of cell growth factor, evaluation and counting of primordial germ cells isolated from the embryo, cryopreservation and thawing of the resulting primordial germ cells.
Данный способ позволяет получить примордиальные половые клетки из кровотока эмбриона на 4-5 день культивирования в максимальном количестве. Кроме того, на данном этапе культивирования еще не запущены процессы дифференциации примордиальных половых клеток, что позволяет получить клетки с высоким уровнем плюрипотентности.This method allows you to obtain primordial germ cells from the bloodstream of the embryo on days 4-5 of cultivation in maximum quantities. In addition, at this stage of cultivation, the processes of differentiation of primordial germ cells have not yet started, which makes it possible to obtain cells with a high level of pluripotency.
В случае получения примордиальных половых клеток общепринятыми методами ферментативной обработки и механической диссоциации в культуре клеток, кроме примордиальных половых клеток присутствуют эмбриональные фибробласты, оставшиеся в клеточной суспензии после отделения других клеток, поскольку эти методы предполагают диссоциацию целого эмбриона, в котором присутствует набор клеток всех типов. Преимущество метода in ovo перед общепринятыми методами заключается в том, что при получении PGC через дорсальную аорту на 4-5 сутки инкубации методом in ovo, в образце присутствуют клетки крови, которые в течении 10 дней деградируют и остаются только PGC. Наличие PGC в культуре подтверждено с помощью анализа экспрессии специфичных для PGC генов.In the case of obtaining primordial germ cells using generally accepted methods of enzymatic treatment and mechanical dissociation in cell culture, in addition to primordial germ cells, there are embryonic fibroblasts remaining in the cell suspension after the separation of other cells, since these methods involve the dissociation of the whole embryo, in which a set of cells of all types is present. The advantage of the in ovo method over conventional methods is that when PGCs are obtained through the dorsal aorta on days 4-5 of incubation using the in ovo method, the sample contains blood cells, which degrade within 10 days and only PGCs remain. The presence of PGCs in culture was confirmed by analyzing the expression of PGC-specific genes.
Способ получения примордиальных половых клеток птиц и введения их в эмбрион in ovo осуществляется следующим образом.The method of obtaining primordial germ cells of birds and introducing them into the embryo in ovo is carried out as follows.
Первым этапом производят отбор неповрежденных и без дефектов яиц птиц в течение двух-трех дней до инкубации. Затем яйца перед закладкой в инкубатор дезинфицируют 70% раствором этанола и маркируют с указанием на них даты закладки, индивидуального номера и породы птицы. Инкубацию проводят до получения эмбриона птицы на стадии 13-14 по Гамбургеру-Гамильтону.The first step is to select undamaged and defect-free bird eggs within two to three days before incubation. Then, before being placed in the incubator, the eggs are disinfected with a 70% ethanol solution and marked with the date of laying, individual number and breed of bird. Incubation is carried out until a bird embryo is obtained at stage 13-14 according to Hamburger-Hamilton.
После инкубации проводится вскрытие яйца и яйца-реципиента с помощью электроинструмента дремель. С тупого конца яиц осуществляется круговой надпил скорлупы без повреждения оболочечной мембраны, отделяющей воздушный мешок от эмбриона. Через полученное отверстие с помощью микроинъектора со стеклянной микроиглой из дорсальной аорты эмбриона птицы отбирают образец крови. В то же время при введении донорских примордиальных половых клеток в эмбрион-реципиент в микроиглу предварительно набирается отмытый в PBS и сконцентрированный с помощью центрифугирования образец прокультивированных примордиальных половых клеток и инъецируется в дорсальную аорту эмбриона-реципиента. Не осуществляют перенос содержимого из яйца в специализированную кювету, все манипуляции (получение и введение) проводят внутри яйца под невскрытой оболочечной пленкой. Иглу при отборе образца крови из дорсальной аорты эмбриона или инъекции примордиальных половых клеток в дорсальную аорту эмбриона вводят параллельно артерии, против направления кровотока, которое хорошо видно при выведении изображения на экран (фиг. 1).After incubation, the egg and recipient egg are dissected using a Dremel power tool. From the blunt end of the eggs, a circular cut of the shell is made without damaging the shell membrane separating the air sac from the embryo. Through the resulting hole, a blood sample is taken from the dorsal aorta of the bird embryo using a microinjector with a glass microneedle. At the same time, when introducing donor primordial germ cells into a recipient embryo, a sample of cultured primordial germ cells, washed in PBS and concentrated by centrifugation, is first collected into a microneedle and injected into the dorsal aorta of the recipient embryo. The contents are not transferred from the egg to a specialized cuvette; all manipulations (receipt and administration) are carried out inside the egg under an unopened shell film. When collecting a blood sample from the dorsal aorta of the embryo or injecting primordial germ cells into the dorsal aorta of the embryo, the needle is inserted parallel to the artery, against the direction of blood flow, which is clearly visible when the image is displayed on the screen (Fig. 1).
Отобранные из эмбриона пробы крови вносят в подготовленные пробирки с культуральной средой и хранят в термошкафу при температуре 37°C до момента переноса на культуральный планшет. Дальнейшие работы с примордиальными половыми клетками птиц с момента переноса образцов из пробирок в культуральные планшеты проводятся в стерильных условиях под ламинаром. Следующим этапом проводят культивирование примордиальных половых клеток в луночном планшете с культуральной средой с факторами роста клеток при температуре 37°С в течение 21 дня. После 10 дней культивирования в культуре примордиальных половых клеток не идентифицируются эмбриональные клетки других типов, поэтому с 10-12 дня культивирования примордиальных половых осуществляется количественная оценка культур примордиальных половых клеток, поскольку сразу после взятия образца крови из эмбриона птицы примордиальные клетки не видны, так как их количество в образце невелико по отношению к форменным элементам крови, и они полностью закрыты клетками крови. Способ дает возможность получить примордиальные половые клетки с концентрацией 1,5-2 млн из одного эмбриона.Blood samples taken from the embryo are added to prepared tubes with a culture medium and stored in a heating cabinet at a temperature of 37°C until transferred to a culture plate. Further work with primordial germ cells of birds, from the moment the samples are transferred from test tubes to culture plates, is carried out under sterile conditions under laminar. The next step is the cultivation of primordial germ cells in a well plate with a culture medium with cell growth factors at a temperature of 37°C for 21 days. After 10 days of cultivation in the culture of primordial germ cells, embryonic cells of other types are not identified, therefore, from the 10-12th day of cultivation of primordial germ cells, a quantitative assessment of the cultures of primordial germ cells is carried out, since immediately after taking a blood sample from a bird embryo, primordial cells are not visible, since they the amount in the sample is small in relation to blood cells, and they are completely covered by blood cells. The method makes it possible to obtain primordial germ cells with a concentration of 1.5-2 million from one embryo.
Для обеспечения длительного хранения полученных примордиальных половых клеток с целью создания биоресурсных коллекций, а также для хранения материала для биотехнологических процедур, например, для редактирования генома, используют методы криоконсервации и хранения в жидком азоте. Для проведения декриоконсервации примордиальных половых клеток пробирки с замороженной суспензией клеток достают пинцетом из жидкого азота, выдерживают при комнатной температуре до прекращения парения и размораживают, погружая в водяную баню при +4°С.To ensure long-term storage of obtained primordial germ cells in order to create bioresource collections, as well as to store material for biotechnological procedures, for example, genome editing, methods of cryopreservation and storage in liquid nitrogen are used. To carry out decryopreservation of primordial germ cells, tubes with a frozen cell suspension are removed from liquid nitrogen with tweezers, kept at room temperature until steaming stops, and thawed by immersing them in a water bath at +4°C.
Пример использования изобретения.An example of the use of the invention.
Способ получения примордиальных половых клеток птиц и введения их в эмбрион in ovo используется для получения линии примордиальных половых клеток курицы, которые после культивирования могут быть подвергнуты процессу генного редактирования, после чего введены данным методом in ovo в эмбрион-реципиент, или введению нативных культивируемых примордиальных половых клеток в эмбрионы-реципиенты с целью сохранения редких и исчезающих пород и диких видов птиц.The method of obtaining primordial germ cells of birds and introducing them into the embryo in ovo is used to obtain a line of primordial germ cells of chicken, which, after cultivation, can be subjected to a gene editing process, after which they are introduced by this method in ovo into the recipient embryo, or the introduction of native cultured primordial germ cells cells into recipient embryos in order to preserve rare and endangered breeds and wild species of birds.
В иных вариантах исполнения данного способа проводят получение и введение примордиальных половых клеток индейки, перепела, фазана или утки, а также диких редких и исчезающих видов птиц.In other embodiments of this method, primordial germ cells of turkey, quail, pheasant or duck, as well as wild rare and endangered species of birds are obtained and introduced.
Представленные варианты реализации заявленного изобретения с использованием яиц разных видов птиц позволяют достичь технический результат, так как обеспечивается повышение выживаемости эмбрионов птиц, увеличение количества полученных примордиальных половых клеток с одного эмбриона, а также увеличение эффективности процессов переноса примордиальных половых клеток реципиенту.The presented embodiments of the claimed invention using eggs of different species of birds make it possible to achieve a technical result, since it ensures increased survival of bird embryos, an increase in the number of primordial germ cells obtained from one embryo, as well as an increase in the efficiency of the processes of transfer of primordial germ cells to the recipient.
У заранее подготовленных и проинкубированных куриных яиц и куриных яиц-реципиентов вскрывают скорлупу с тупого конца яйца с помощью электроинструмента дремель. Осуществляется круговой надпил скорлупы диаметром 10-15 мм без повреждения оболочечной мембраны. Через данное отверстие под бинокуляром с помощью микроинъектора со стеклянной микроиглой из дорсальной аорты эмбриона курицы отбирают образец крови в объеме 3-5 мкл. В случае введения донорских примордиальных половых клеток в виде суспензии в объеме до 5 мкл делают инъекцию в дорсальную аорту эмбриона-реципиента курицы. Микроинъекции проводят против направления кровотока эмбрионов.For pre-prepared and incubated chicken eggs and recipient chicken eggs, the shell is opened from the blunt end of the egg using a Dremel power tool. A circular cut of the shell with a diameter of 10-15 mm is carried out without damaging the shell membrane. Through this hole under the binocular, using a microinjector with a glass microneedle, a blood sample in a volume of 3-5 μl is taken from the dorsal aorta of a chicken embryo. In the case of introducing donor primordial germ cells in the form of a suspension in a volume of up to 5 μl, an injection is made into the dorsal aorta of the chicken recipient embryo. Microinjections are carried out against the direction of embryonic blood flow.
В первом случае отобранный образец крови вносят в подготовленные пробирки с культуральной средой и отправляют далее на культивирование и длительное хранение для дальнейшего использования. Во втором случае после введения примордиальных половых клеток в эмбрион курицы отверстие в яйце закрывают и яйцо инкубируют до вылупления.In the first case, the selected blood sample is added to prepared tubes with a culture medium and sent further for cultivation and long-term storage for further use. In the second case, after the introduction of primordial germ cells into the chicken embryo, the hole in the egg is closed and the egg is incubated until hatching.
Технический результат изобретения заключается в увеличении эффективности процессов переноса примордиальных половых клеток реципиенту и получения эмбрионов птиц и цыплят с введенными донорскими (возможно генетически отредактированными) примордиальными половыми клетками за счет значительного снижения уровня травматизации эмбриона, а также уменьшения микробной контаминации, следовательно, в повышении выживаемости эмбрионов, а также в увеличении количества полученных примордиальных половых клеток с одного эмбриона.The technical result of the invention is to increase the efficiency of the processes of transferring primordial germ cells to the recipient and obtaining embryos of birds and chickens with introduced donor (possibly genetically edited) primordial germ cells due to a significant reduction in the level of trauma to the embryo, as well as a decrease in microbial contamination, therefore, increasing the survival rate of embryos , as well as in increasing the number of obtained primordial germ cells from one embryo.
Указанный технический результат достигается за счет того, что способ получения примордиальных половых клеток птиц и введения их в эмбрион in ovo характеризуется тем, что отбирают и инкубируют яйца птицы, проводят круговой надпил скорлупы яйца птицы, затем через отверстие в скорлупе яйца микроинъектором со стеклянной микроиглой из дорсальной аорты эмбриона птицы отбирают образец крови для культивирования, для введения примордиальных половых клеток кур с отредактированным геномом, в эмбрион-реципиент осуществляют круговой надпил скорлупы яйца-реципиента, далее через отверстие в скорлупе яйца-реципиента с помощью микроинъектора со стеклянной микроиглой, заполненной примордиальными половыми клетками, проводят инъекцию в дорсальную аорту эмбриона-реципиента примордиальных половых клеток.This technical result is achieved due to the fact that the method of obtaining primordial germ cells of birds and introducing them into the embryo in ovo is characterized by the fact that bird eggs are selected and incubated, a circular cut is made on the shell of the bird egg, then through a hole in the egg shell with a microinjector with a glass microneedle made of from the dorsal aorta of a bird embryo, a blood sample is taken for cultivation, for the introduction of primordial germ cells of chickens with an edited genome, a circular cut of the recipient egg shell is made into the recipient embryo, then through a hole in the recipient egg shell using a microinjector with a glass microneedle filled with primordial germ cells cells, an injection is carried out into the dorsal aorta of the embryo-recipient of primordial germ cells.
Для подтверждения достижения технического результата провели количественное определение числа полученных примордиальных половых клеток и количества выживших эмбрионов куриц после получения и введения примордиальных половых клеток. Исследования проводили заявленным способом без извлечения содержимого яйца в специализированную кювету и способом прототипа на 100 яйцах (по 50 яиц на каждый способ). По результатам исследований в полученном образце заявленным способом среднее количество примордиальных половых клеток от одного эмбриона составила около 1,5 млн клеток/эмбрион, в то же время получить способом прототипа удалось только чуть более чем 2000 клеток/эмбрион. В первом случае (заявленный способ) количество выживших эмбрионов составила 48 эмбрионов из 50, а во втором случае (прототип) выжило всего 29 эмбрионов из 50 исследуемых.To confirm the achievement of the technical result, a quantitative determination of the number of obtained primordial germ cells and the number of surviving chicken embryos was carried out after obtaining and introducing primordial germ cells. The studies were carried out using the stated method without extracting the contents of the egg into a specialized cuvette and using the prototype method on 100 eggs (50 eggs for each method). According to the results of studies in the sample obtained using the claimed method, the average number of primordial germ cells from one embryo was about 1.5 million cells/embryo, while at the same time it was possible to obtain only a little more than 2000 cells/embryo using the prototype method. In the first case (the claimed method), the number of surviving embryos was 48 embryos out of 50, and in the second case (prototype), only 29 embryos out of 50 studied survived.
Таким образом, заявленное изобретение позволяет увеличить эффективность процессов переноса примордиальных половых клеток реципиенту и получения эмбрионов птиц и цыплят с введенными донорскими, уменьшить уровень травматизации эмбриона и микробную контаминацию за счет отсутствия переноса содержимого яйца в специализированную кювету для взятия образца крови эмбриона и введения примордиальных половых клеток в аорту эмбриона-реципиента, а также повысить выживаемость эмбрионов на 38% в сравнении с прототипом, увеличить количество полученных примордиальных половых клеток с одного эмбриона в 750 раз и увеличить эффективность процессов переноса примордиальных половых клеток эмбриону реципиенту.Thus, the claimed invention makes it possible to increase the efficiency of the processes of transferring primordial germ cells to the recipient and obtaining embryos of birds and chickens with introduced donor ones, to reduce the level of trauma to the embryo and microbial contamination due to the absence of transfer of egg contents to a specialized cuvette for taking a blood sample of the embryo and introducing primordial germ cells into the aorta of the recipient embryo, as well as increase the survival rate of embryos by 38% in comparison with the prototype, increase the number of primordial germ cells obtained from one embryo by 750 times and increase the efficiency of the processes of transfer of primordial germ cells to the recipient embryo.
Claims (2)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2818641C1 true RU2818641C1 (en) | 2024-05-03 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2215029C2 (en) * | 1999-02-11 | 2003-10-27 | Ханми Фарм. Ко., Лтд. | Method for obtaining established embryonic germ cell line in poultry, line of chicken embryonic germ cells, method for obtaining somatic or sexual chimeras, method for transfection of foreign gene in embryonic germ cells |
| WO2019058376A1 (en) * | 2017-09-19 | 2019-03-28 | The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) | Genome-edited birds |
| CN116410933A (en) * | 2023-02-24 | 2023-07-11 | 广西大学 | Acquisition method and application of chicken primordial germ cells for strain resource seed preservation |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2215029C2 (en) * | 1999-02-11 | 2003-10-27 | Ханми Фарм. Ко., Лтд. | Method for obtaining established embryonic germ cell line in poultry, line of chicken embryonic germ cells, method for obtaining somatic or sexual chimeras, method for transfection of foreign gene in embryonic germ cells |
| WO2019058376A1 (en) * | 2017-09-19 | 2019-03-28 | The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) | Genome-edited birds |
| CN116410933A (en) * | 2023-02-24 | 2023-07-11 | 广西大学 | Acquisition method and application of chicken primordial germ cells for strain resource seed preservation |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Волкова Н.А. и др. Выделение, культивирование и характеристика примордиальных зародышевых клеток перепелов. Сельскохозяйственная биология. 2017, Т.52, 2. А.Н. ВЕТОХ и др. Генетическая модификация половых клеток петухов с использованием различных методических подходов. СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2020, том 55, 2, с. 306-314. WOODCOCK M.E. et al. Gene editing in birds takes flight. Mamm Genome. 2017, 28, 315-323. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CHANG et al. | Production of germline chimeric chickens by transfer of cultured primordial germ cells | |
| US7481179B2 (en) | In ovo activation of an egg in the shell | |
| FI94772C (en) | In vitro embryo culture techniques | |
| Petitte | Avian germplasm preservation: embryonic stem cells or primordial germ cells? | |
| Petitte et al. | Production of transgenic poultry | |
| CN114317419B (en) | Construction method of gymnocypris przewalskii muscle cell line | |
| Kuwana et al. | Conservation of a threatened indigenous fowl (Kureko Dori) using the germline chimeras transplanted from primordial germ cells | |
| van de Lavoir et al. | Avian embryonic stem cells | |
| RU2818641C1 (en) | Method of introducing primordial germ cells of birds into an embryo "in ovo" | |
| JP4267689B2 (en) | Method for culturing avian cell and cell line obtained by the culturing method | |
| JPH08127501A (en) | Freezing and preservation of primordial germ cell and germ cell | |
| KR20020092900A (en) | Avian blastodermal cell lines | |
| Matsubara et al. | Efficient harvesting methods for early‐stage snake and turtle embryos | |
| Ono et al. | Culture of naked quail (Coturnix coturnix japonica) ova in vitro for avian transgenesis: culture from the single-cell stage to hatching with pH-adjusted chicken thick albumen | |
| Ono | Ex ovo culture of quail embryos and its application for embryo manipulation | |
| Ronglin et al. | Cryopreservation of totipotent nuclei from honeybee (Apis mellifera) embryos by rapid freezing | |
| US20210289757A1 (en) | Dorsal aortic injection method of chicken embryos for improving transgenic efficiency | |
| JP2009183151A (en) | Reagent for fishes and utilization thereof | |
| Inada et al. | In vivo gene transfer to chicken via blastodermal cells of early developmental embryos | |
| Pokorny | Obtaining chicken chimeras after injecting cryopreserved blastoderm cells into the subgerminal cavity of recipient embryos | |
| CN116410933A (en) | Acquisition method and application of chicken primordial germ cells for strain resource seed preservation | |
| Wong et al. | Generation of transgenic poultry by transfection of primordial germ cells | |
| CN112920987A (en) | Separation and primary culture method of vascular sac cells of lateolabrax japonicus | |
| AU2001238413B2 (en) | In ovo activation of an avian egg in the shell | |
| Lollen et al. | SURROGATE BROODERS IN FISH PROPAGATION |