RU2818349C2 - Novel fusion protein specific for cd137 and pd-l1 - Google Patents
Novel fusion protein specific for cd137 and pd-l1 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2818349C2 RU2818349C2 RU2020139055A RU2020139055A RU2818349C2 RU 2818349 C2 RU2818349 C2 RU 2818349C2 RU 2020139055 A RU2020139055 A RU 2020139055A RU 2020139055 A RU2020139055 A RU 2020139055A RU 2818349 C2 RU2818349 C2 RU 2818349C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- nos
- fusion protein
- cells
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 427
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 427
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 claims abstract description 214
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 claims abstract description 214
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 43
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 27
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 19
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 233
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 114
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 110
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 93
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 79
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 73
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 69
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 66
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 66
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 61
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 52
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 51
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 38
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 35
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 34
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 23
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 21
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 claims description 18
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 claims description 18
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 18
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 13
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 12
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 claims description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 claims description 9
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 claims description 9
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 claims description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 claims description 7
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 6
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims description 3
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims description 3
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 83
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 72
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 abstract description 42
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 abstract description 42
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 11
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 298
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 description 274
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 250
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 250
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 153
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 152
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 135
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 134
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 132
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 111
- 101001023833 Homo sapiens Neutrophil gelatinase-associated lipocalin Proteins 0.000 description 101
- 102000047202 human LCN2 Human genes 0.000 description 101
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 98
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 91
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 81
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 81
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 80
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 79
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 71
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 70
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 69
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 60
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 57
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 51
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 48
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 36
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 34
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 31
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 31
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 29
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 29
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 28
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 27
- 102000050327 human TNFRSF9 Human genes 0.000 description 26
- 102000002627 4-1BB Ligand Human genes 0.000 description 24
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 24
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 23
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 17
- 102000048776 human CD274 Human genes 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 16
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 16
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 15
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 15
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 description 15
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 13
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 13
- -1 2 and 3 (Yao et al. Proteins 0.000 description 12
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 11
- 108010057281 Lipocalin 1 Proteins 0.000 description 10
- 102000013519 Lipocalin-2 Human genes 0.000 description 10
- 108010051335 Lipocalin-2 Proteins 0.000 description 10
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 10
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 10
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 10
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 8
- 102000003752 Lipocalin 1 Human genes 0.000 description 8
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 8
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 101000946124 Homo sapiens Lipocalin-1 Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 229950009791 durvalumab Drugs 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 7
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 6
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 6
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 6
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 6
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 6
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 5
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 5
- 229950002916 avelumab Drugs 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 5
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 5
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 5
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 5
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100022954 Apolipoprotein D Human genes 0.000 description 4
- 108010025614 Apolipoproteins D Proteins 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 4
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 102100034724 Lipocalin-1 Human genes 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 4
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 4
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 4
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710189812 Bilin-binding protein Proteins 0.000 description 3
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000020385 T cell costimulation Effects 0.000 description 3
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 3
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229960003852 atezolizumab Drugs 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008275 binding mechanism Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000029752 retinol binding Human genes 0.000 description 3
- 108091000053 retinol binding Proteins 0.000 description 3
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 2
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 2
- 108091007914 CDKs Proteins 0.000 description 2
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 2
- 231100000491 EC50 Toxicity 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101000757556 Homo sapiens Apolipoprotein D Proteins 0.000 description 2
- 101000979342 Homo sapiens Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 102100035405 Neutrophil gelatinase-associated lipocalin Human genes 0.000 description 2
- 101710147507 Neutrophil gelatinase-associated lipocalin Proteins 0.000 description 2
- 102100023050 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Human genes 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000048176 Prostaglandin-D synthases Human genes 0.000 description 2
- 108030003866 Prostaglandin-D synthases Proteins 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 101710165434 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 2
- 238000012436 analytical size exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000056778 human APOD Human genes 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 2
- 229940066453 tecentriq Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003634 thrombocyte concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 2
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010061424 Anal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010073478 Anaplastic large-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000007860 Anus Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000018623 Apolipoproteins M Human genes 0.000 description 1
- 108010027018 Apolipoproteins M Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 102000000119 Beta-lactoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006143 Brain stem glioma Diseases 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108091007381 CBL proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150091609 CD274 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010007953 Central nervous system lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 208000001976 Endocrine Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710147132 Epididymal-specific lipocalin-5 Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 description 1
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102000004240 Glycodelin Human genes 0.000 description 1
- 108010081520 Glycodelin Proteins 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100407305 Homo sapiens CD274 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000777628 Homo sapiens Leukocyte antigen CD37 Proteins 0.000 description 1
- 101001121920 Homo sapiens Odorant-binding protein 2a Proteins 0.000 description 1
- 101001121918 Homo sapiens Odorant-binding protein 2b Proteins 0.000 description 1
- 101000904196 Homo sapiens Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2 Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 101000818543 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase ZAP-70 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N Hydroxylysine Natural products NCC(O)CC(N)CC(O)=O LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091008028 Immune checkpoint receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000037978 Immune checkpoint receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150055061 LCN2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 208000032004 Large-Cell Anaplastic Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102100031586 Leukocyte antigen CD37 Human genes 0.000 description 1
- 102100034721 Lipocalin-15 Human genes 0.000 description 1
- 101710155631 Lipocalin-15 Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010052178 Lymphocytic lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N Lys-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O YEIYAQQKADPIBJ-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- 101710196975 Major allergen Can f 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000032271 Malignant tumor of penis Diseases 0.000 description 1
- 208000025205 Mantle-Cell Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102100027196 Odorant-binding protein 2a Human genes 0.000 description 1
- 102100027202 Odorant-binding protein 2b Human genes 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000012271 PD-L1 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100024019 Pancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2 Human genes 0.000 description 1
- 208000000821 Parathyroid Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 208000002471 Penile Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034299 Penile cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 1
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 201000005746 Pituitary adenoma Diseases 0.000 description 1
- 206010061538 Pituitary tumour benign Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101710094000 Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000930457 Rattus norvegicus Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108700011201 Streptococcus IgG Fc-binding Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 102000004398 TNF receptor-associated factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000920 TNF receptor-associated factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 108010028230 Trp-Ser- His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys Proteins 0.000 description 1
- 102100021125 Tyrosine-protein kinase ZAP-70 Human genes 0.000 description 1
- 108010083111 Ubiquitin-Protein Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000006275 Ubiquitin-Protein Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 208000023915 Ureteral Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010046392 Ureteric cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046431 Urethral cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010046458 Urethral neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101710153009 Uterocalin Proteins 0.000 description 1
- 201000003761 Vaginal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010047741 Vulval cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 201000005188 adrenal gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 108010001122 alpha(2)-microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005475 antiinfective agent Drugs 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 201000011165 anus cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M asparaginate Chemical class [O-]C(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003914 endometrial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001343 fallopian tube carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N hydroxy-L-lysine Natural products NCCCCC(NO)C(O)=O QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 230000005746 immune checkpoint blockade Effects 0.000 description 1
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 208000029559 malignant endocrine neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000026045 malignant tumor of parathyroid gland Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000014925 multi-organism signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 201000005962 mycosis fungoides Diseases 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 238000002888 pairwise sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 238000002732 pharmacokinetic assay Methods 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 208000021310 pituitary gland adenoma Diseases 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 108010094020 polyglycine Proteins 0.000 description 1
- 229920000232 polyglycine polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 208000016800 primary central nervous system lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009712 regulation of translation Effects 0.000 description 1
- 201000007444 renal pelvis carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 201000006845 reticulosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029922 reticulum cell sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229960003471 retinol Drugs 0.000 description 1
- 235000020944 retinol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011607 retinol Substances 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000008786 sensory perception of smell Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229950005972 urelumab Drugs 0.000 description 1
- 201000011294 ureter cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 101710177047 von Ebner gland protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710177003 von Ebner gland protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 201000004916 vulva carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000013013 vulvar carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000012447 xenograft mouse model Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
I. Уровень техникиI. State of the art
[0001] Лиганд программируемой клеточной смерти 1 или PD-L1 (также известный как кластер дифференцировки 274 или CD274 и B7 гомолог 1 или B7-H1) представляет собой однопроходный мембранный белок I типа, принадлежащий к семейству B7 костимулирующих/коингибиторных молекул презентации антигенов. Внеклеточная часть PD-L1 содержит два домена, N-концевой IgV-подобный домен и IgC-подобный домен. PD-L1 имеет короткий цитоплазматический домен без какого-либо очевидного мотива сигнальной трансдукции, вследствие чего возникло первоначальное убеждение, что PD-L1 как рецептору не присуща передача сигналов. Однако последние данные показывают, что цитоплазматический домен PD-L1 содержит неклассические консервативные мотивы сигнальной трансдукции, способные ингибировать трансдукцию интерферона (IFN) и защищать раковые клетки от цитотоксичности IFN (Gato-Canas et al., Cell Rep, 2017).[0001] Programmed cell death ligand 1 or PD-L1 (also known as cluster of differentiation 274 or CD274 and B7 homolog 1 or B7-H1) is a type I single-pass membrane protein belonging to the B7 family of co-stimulatory/co-inhibitory antigen presentation molecules. The extracellular portion of PD-L1 contains two domains, an N-terminal IgV-like domain and an IgC-like domain. PD-L1 has a short cytoplasmic domain without any obvious signal transduction motif, leading to the initial belief that PD-L1 as a receptor lacks signal transduction. However, recent data indicate that the cytoplasmic domain of PD-L1 contains non-classical conserved signal transduction motifs capable of inhibiting interferon (IFN) transduction and protecting cancer cells from IFN cytotoxicity (Gato-Canas et al., Cell Rep, 2017).
[0002] PD-L1 играет ключевую роль в подавлении иммунной системы во время беременности, хронических инфекций, тканевой аллотрансплантации, аутоиммунных заболеваний и рака. PD-L1 экспрессируется на различных типах клеток, включая В-клетки, Т-клетки, макрофаги, миелоидные дендритные клетки, тучные клетки, эпителиальные клетки и клетки эндотелия сосудов. Он также экспрессируется при нескольких типах рака, включая, помимо прочего, меланому, рак легкого, мочевого пузыря, ободочной кишки и молочной железы. Высокие уровни экспрессии PD-L1 сопряжены с повышенной агрессивностью опухоли, опосредуя истощение и анергию опухоль-инфильтрирующих Т-клеток, секрецию иммуносупрессивных цитокинов и защиту от лизиса цитотоксическими Т-клетками. [0002] PD-L1 plays a key role in suppressing the immune system during pregnancy, chronic infections, tissue allotransplantation, autoimmune diseases and cancer. PD-L1 is expressed on a variety of cell types, including B cells, T cells, macrophages, myeloid dendritic cells, mast cells, epithelial cells, and vascular endothelial cells. It is also expressed in several types of cancer, including but not limited to melanoma, lung, bladder, colorectal, and breast cancers. High levels of PD-L1 expression are associated with increased tumor aggressiveness, mediating exhaustion and anergy of tumor-infiltrating T cells, secretion of immunosuppressive cytokines, and protection from lysis by cytotoxic T cells.
[0003] PD-L1 представляет собой лиганд белка программируемой клеточной смерти 1 (PD-1) - ключевого ингибирующего рецептора иммунной контрольной точки, который в основном экспрессируется на активированных Т-клетках, но также и на других клетках иммунной системы, в том числе B-клетках и моноцитах. PD-1 является членом семейства иммуноглобулинов, содержащим IgV-подобный внеклеточный домен, трансмембранный домен и цитоплазматический хвост с ITIM (иммунорецепторным ингибирующим мотивом на основе тирозина) и ITSM (иммунорецепторным мотивом переключения на основе тирозина). Связывание PD-1 с PD-L1 приводит к привлечению тирозинфосфатаз 1 и 2, содержащих домен гомологии 2 с Src (SHP 1 и 2), во внутриклеточные мотивы переключения PD-1, и к экспрессии убиквитинлигаз E3 семейства CBL. Затем эти убиквитинлигазы убиквитинируют и инактивируют ключевые медиаторы сигнальной трансдукции TCR, что приводит к удалению TCR с клеточной поверхности (Karwacz et al., EMBO Mol Med, 2011). Фосфатазы SHP 1 и SHP 2 ингибируют передачу сигналов TCR напрямую, прекращая фосфорилирование ZAP70 и PI3K. Кроме того, PD-1, связанный посредством PD-L1, может вызывать ингибирование сигнальных путей TCR, влияя на экспрессию и активность CK2 и циклинзависимых киназ (CDK) (Arasanz et al., Oncotarget, 2017). Также было показано, что связывание PD-1 приводит к перепрограммированию метаболизма Т-клеток от повышенного гликолиза, который необходим для выработки энергии для эффекторных функций, до β-окисления жирных кислот, которое связано с долгоживущими клетками. Это также может объяснить выживание и персистенцию клеток с высоким уровнем экспрессии PD-1 у пациентов с хроническими инфекциями и раком (Patsoukis et al., Nat Commun, 2015).[0003] PD-L1 is a ligand for programmed cell death protein 1 (PD-1), a key inhibitory immune checkpoint receptor that is primarily expressed on activated T cells, but also on other cells of the immune system, including B -cells and monocytes. PD-1 is a member of the immunoglobulin family containing an IgV-like extracellular domain, a transmembrane domain, and a cytoplasmic tail with ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) and ITSM (immunoreceptor tyrosine-based switching motif). Binding of PD-1 to PD-L1 results in the recruitment of Src homology domain 2-containing tyrosine phosphatases 1 and 2 (SHP 1 and 2) to intracellular PD-1 switch motifs and the expression of CBL family E3 ubiquitin ligases. These ubiquitin ligases then ubiquitinate and inactivate key TCR signal transduction mediators, resulting in the removal of the TCR from the cell surface (Karwacz et al., EMBO Mol Med, 2011). Phosphatases SHP 1 and SHP 2 inhibit TCR signaling directly by stopping phosphorylation of ZAP70 and PI3K. In addition, PD-1 bound through PD-L1 can cause inhibition of TCR signaling pathways by affecting the expression and activity of CK2 and cyclin-dependent kinases (CDKs) (Arasanz et al., Oncotarget, 2017). PD-1 binding has also been shown to reprogram T cell metabolism from increased glycolysis, which is required to produce energy for effector functions, to fatty acid β-oxidation, which is associated with long-lived cells. This may also explain the survival and persistence of cells with high levels of PD-1 expression in patients with chronic infections and cancer (Patsoukis et al., Nat Commun, 2015).
[0004] Блокирование взаимодействия PD-1/PD-L1 агентами, нацеленными против PD-1 или против PD-L1, может обратить вспять функцию иммунных контрольных точек и ослабить торможение Т-клеточных ответов. В настоящее время для лечения рака одобрены три антитела к PD-L1: атезолизумаб (TECENTRIQ, MPDL3280A, RG7466), авелумаб (BAVENCIO, MSB0010718C) и дурвалумаб (IMFINZI, MEDI4736). Несколько успешных клинических исследований этих антител показали высокую частоту объективного ответа, устойчивость ответа или улучшение показателей выживаемости при раке мочевого пузыря, раке кожи и раке легкого (Xu-Monette et al., Front Immunol, 2017).[0004] Blocking the PD-1/PD-L1 interaction with anti-PD-1 or anti-PD-L1-targeted agents can reverse immune checkpoint function and reduce the inhibition of T cell responses. There are currently three anti-PD-L1 antibodies approved for cancer treatment: atezolizumab (TECENTRIQ, MPDL3280A, RG7466), avelumab (BAVENCIO, MSB0010718C) and durvalumab (IMFINZI, MEDI4736). Several successful clinical studies of these antibodies have shown high objective response rates, sustained response, or improved survival rates in bladder cancer, skin cancer, and lung cancer (Xu-Monette et al., Front Immunol, 2017).
[0005] Кластер дифференцировки 137 или CD137 (также известный как 4-1BB или TNFRS9) является костимулирующим иммунным рецептором и членом суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR). Он главным образом экспрессируется на активированных CD4+ и CD8+ T-клетках, активированных B-клетках и естественных киллерах (NK), но также может быть обнаружен на покоящихся моноцитах и дендритных клетках (Li and Liu, Clin Pharmacol, 2013) или эндотелиальных клетках (Snell et al., Immunol Rev, 2011). CD137 играет важную роль в регуляции иммунного ответа и, таким образом, является мишенью для иммунотерапии рака. Лиганд CD137 (CD137L) является единственным известным природным лигандом CD137 и конститутивно экспрессируется на нескольких типах антигенпрезентирующих клеток, таких как активированные В-клетки, моноциты и дендритные клетки селезенки, и может быть индуцирован на Т-лимфоцитах.[0005] Cluster of differentiation 137 or CD137 (also known as 4-1BB or TNFRS9) is a costimulatory immune receptor and a member of the tumor necrosis factor receptor (TNFR) superfamily. It is primarily expressed on activated CD4+ and CD8+ T cells, activated B cells and natural killer (NK) cells, but can also be found on resting monocytes and dendritic cells (Li and Liu, Clin Pharmacol, 2013) or endothelial cells (Snell et al., Immunol Rev, 2011). CD137 plays an important role in regulating the immune response and is thus a target for cancer immunotherapy. CD137 ligand (CD137L) is the only known natural CD137 ligand and is constitutively expressed on several types of antigen presenting cells, such as activated B cells, monocytes and splenic dendritic cells, and can be induced on T lymphocytes.
[0006] CD137L представляет собой тримерный белок, который существует в виде мембраносвязанной формы и растворимого варианта. Однако, способность растворимого CD137L активировать CD137, например, на CD137-экспрессирующих лимфоцитах, ограничена, и чтобы вызвать эффект, необходимы большие концентрации (Wyzgol et al., J Immunol, 2009). Естественный путь активации CD137 - взаимодействие CD137-положительной клетки с CD137L-положительной клеткой. Полагают, что затем активация CD137 индуцируется кластеризацией посредством CD137L на противоположной клетке, что приводит к сигнализации с помощью TRAF1, 2 и 3 (Yao et al., Nat Rev Drug Discov, 2013, Snell et al., Immunol Rev, 2011) и дальнейшим сопутствующим нисходящим эффектам в CD137-положительной T-клетке. В случае Т-клеток, активируемых распознаванием их соответствующих родственных мишеней, эффекты, вызываемые костимуляцией CD137, представляют собой дальнейшую усиленную активацию, увеличенную выживаемость и пролиферацию, продукцию провоспалительных цитокинов и улучшенную способность к уничтожению. [0006] CD137L is a trimeric protein that exists as a membrane-bound form and a soluble variant. However, the ability of soluble CD137L to activate CD137, for example on CD137-expressing lymphocytes, is limited and large concentrations are required to produce an effect (Wyzgol et al., J Immunol, 2009). The natural pathway for CD137 activation is the interaction of a CD137-positive cell with a CD137L-positive cell. It is believed that CD137 activation is then induced by clustering via CD137L on the opposite cell, leading to signaling by TRAF1, 2 and 3 (Yao et al., Nat Rev Drug Discov, 2013, Snell et al., Immunol Rev, 2011) and further concomitant downstream effects in CD137-positive T cell. In the case of T cells activated by recognition of their respective cognate targets, the effects caused by CD137 costimulation are further enhanced activation, increased survival and proliferation, production of proinflammatory cytokines, and improved killing capacity.
[0007] Преимущества костимуляции CD137 для уничтожения раковых клеток были продемонстрированы на ряде моделей in vivo. Например, принудительная экспрессия CD137L на опухоли приводит к отторжению опухоли (Melero et al., Eur J Immunol, 1998). Точно так же, принудительная экспрессия анти-CD137 ScFv на опухоли приводит к зависимому от CD4+ Т-клеток и NK-клеток устранению опухоли (Yang et al., Cancer Res, 2007, Zhang et al., Mol Cancer Ther, 2006, Ye et al., Nat Med, 2002). Было показано, что системно вводимое антитело к CD137 приводит к замедлению роста опухоли (Martinet et al., Gene Ther, 2002). [0007] The benefits of CD137 costimulation for killing cancer cells have been demonstrated in a number of in vivo models. For example, forced expression of CD137L on a tumor results in tumor rejection (Melero et al., Eur J Immunol, 1998). Similarly, forced expression of anti-CD137 ScFv on tumors results in CD4 + T cell and NK cell dependent tumor clearance (Yang et al., Cancer Res, 2007, Zhang et al., Mol Cancer Ther, 2006, Ye et al., Nat Med, 2002). Systemically administered anti-CD137 antibody has been shown to slow tumor growth (Martinet et al., Gene Ther, 2002).
[0008] Было показано, что CD137 является отличным маркером для естественных опухоль-реактивных Т-клеток в опухолях человека (Ye et al., Clin Cancer Res, 2014), и что анти-CD137 антитела могут быть использованы для улучшения экспансии и активности CD8+ опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов меланомы для применения в адоптивной Т-клеточной терапии (Chacon et al., PLoS One, 2013).[0008] It has been shown that CD137 is an excellent marker for natural tumor-reactive T cells in human tumors (Ye et al., Clin Cancer Res, 2014), and that anti-CD137 antibodies can be used to improve CD8 expansion and activity + tumor-infiltrating melanoma lymphocytes for use in adoptive T-cell therapy (Chacon et al., PLoS One, 2013).
[0009] Доклиническая демонстрация потенциальной терапевтической эффективности костимуляции CD137 стимулировала разработку терапевтических антител, нацеленных на CD137, включая BMS-663513 (описано в патенте США № 7,288,638) и PF-05082566 (Fisher et al., Cancer Immunol Immunother, 2012).[0009] Preclinical demonstration of the potential therapeutic efficacy of CD137 costimulation has stimulated the development of therapeutic antibodies targeting CD137, including BMS-663513 (described in US Pat. No. 7,288,638) and PF-05082566 (Fisher et al., Cancer Immunol Immunother, 2012).
[0010] В настоящем описании предложены, среди прочего, новые подходы для одновременного связывания CD137 и PD-L1 с помощью одного или более слитых белков, обладающих свойствами специфичности связывания с CD137 и специфичности связывания с PD-L1.[0010] Proposed herein are, among other things, novel approaches for simultaneously binding CD137 and PD-L1 using one or more fusion proteins having CD137 binding specificity and PD-L1 binding specificity.
II. ОПРЕДЕЛЕНИЯII. DEFINITIONS
[0011] В следующем списке определены термины, фразы и сокращения, используемые в настоящем описании. Все термины, перечисленные и определенные в настоящем документе, охватывают все грамматические формы.[0011] The following list defines the terms, phrases and abbreviations used in this description. All terms listed and defined herein cover all grammatical forms.
[0012] В контексте настоящего документа, если не указано иное, «CD137» означает человеческий CD137 (huCD137). Человеческий CD137 означает полноразмерный белок, определенный UniProt Q07011, его фрагмент или вариант. CD137 также известен как 4-1BB, член 9 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (TNFRSF9), и индуцируемый активацией лимфоцитов (ILA). В некоторых частных вариантах осуществления используется CD137 отличного от человека вида, например, CD137 яванского макака и мышиный CD137. [0012] As used herein, unless otherwise indicated, "CD137" means human CD137 (huCD137). Human CD137 means the full-length protein as defined by UniProt Q07011, a fragment or variant thereof. CD137 is also known as 4-1BB, tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 (TNFRSF9), and inducible lymphocyte activation (ILA). In some particular embodiments, CD137 from a non-human species is used, for example, cynomolgus CD137 and murine CD137.
[0013] В контексте настоящего документа, если не указано иное, «лиганд программируемой клеточной смерти 1» или «PD-L1» означает человеческий PD-L1 (huPD-L1). Человеческий PD-L1 означает полноразмерный белок, определенный UniProt Q9NZQ7, его фрагмент или вариант. Человеческий PD-L1 кодируется геном CD274. PD-L1 также известен как кластер дифференцировки 274 (CD274) или гомолог B7 1-го типа (B7-H1). В некоторых частных вариантах осуществления используется PD-L1 отличного от человека вида, например, PD-L1 яванского макака и мышиный PD-L1. [0013] As used herein, unless otherwise specified, “programmed cell death ligand 1” or “PD-L1” means human PD-L1 (huPD-L1). Human PD-L1 means the full-length protein defined by UniProt Q9NZQ7, a fragment or variant thereof. Human PD-L1 is encoded by the CD274 gene. PD-L1 is also known as cluster of differentiation 274 (CD274) or B7 homolog type 1 (B7-H1). In some particular embodiments, PD-L1 from a non-human species is used, for example, cynomolgus PD-L1 and murine PD-L1.
[0014] В контексте настоящего документа «аффинность связывания» описывает способность биомолекулы (например, полипептида или белка) согласно изобретению (например, мутеина липокалина, антитела, слитого белка или любого другого пептида или белка) к связыванию определенной мишени и образованию комплекса. Аффинность связывания измеряют с помощью ряда методов, известных специалистам в данной области техники, включая, не ограничиваясь перечисленным, флуоресцентное титрование, анализы на основе твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), в том числе прямого и конкурентного ELISA, калориметрические методы, например, изотермическая титрационная калориметрия (ITC), и поверхностный плазмонный резонанс (SPR). Эти методы хорошо известны в данной области техники, и некоторые примеры таких методов дополнительно описаны в настоящем документе. Аффинность связывания, таким образом, выражают значением константы диссоциации (KD), полумаксимальной эффективной концентрации (EC50) или концентрации полумаксимального ингибирования (IC50), измеренного с использованием таких методов. Более низкое значение KD, EC50 или IC50 отражают лучшую (более высокую) связывающую способность (аффинность). Соответственно, аффинность связывания двух биомолекул с определенной мишенью может быть измерена и сопоставлена. При сравнении аффинностей связывания двух биомолекул с определенной мишенью термин «приблизительно такая же», «по существу такая же» или «по существу аналогичная» означает, что один биомолекула имеет аффинность связывания, выраженную значением KD, EC50 или IC50, идентичным или схожим с другой молекулой в пределах вариабельности результатов эксперимента по измерению аффинности связывания. Вариабельность результатов эксперимента по измерению аффинности связывания зависит от конкретного используемого метода и известна специалистам в данной области техники.[0014] As used herein, “binding affinity” describes the ability of a biomolecule (eg, a polypeptide or protein) of the invention (eg, a lipocalin mutein, antibody, fusion protein, or any other peptide or protein) to bind a specific target and form a complex. Binding affinity is measured using a number of methods known to those skilled in the art, including, but not limited to, fluorescence titration, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) assays, including direct and competitive ELISA, calorimetric methods, such as isothermal titration calorimetry (ITC), and surface plasmon resonance (SPR). These methods are well known in the art, and some examples of such methods are further described herein. Binding affinity is thus expressed by the value of the dissociation constant (K D ), the half-maximal effective concentration (EC 50 ) or the half-maximal inhibition concentration (IC 50 ) measured using such methods. A lower KD , EC 50 or IC 50 value reflects better (higher) binding capacity (affinity). Accordingly, the binding affinity of two biomolecules to a specific target can be measured and compared. When comparing the binding affinities of two biomolecules to a particular target, the term “approximately the same,” “substantially the same,” or “substantially similar” means that one biomolecule has a binding affinity, expressed by a K D , EC 50 or IC 50 value, identical or similar to another molecule within the variability of the binding affinity experiment. The variability in experimental results for measuring binding affinity depends on the specific method used and is known to those skilled in the art.
[0015] В контексте настоящего документа термин «по существу» может также относиться к качественному условию демонстрации полной или почти полной степени или величины характеристики или свойства, представляющего интерес. Специалисту в области биологии будет ясно, что биологические и химические явления редко, если вообще когда-либо, доходят до завершения и/или протекают до завершения, или достигают или избегают абсолютного результата. Таким образом, термин «по существу» используется в настоящем документе для обозначения потенциального отсутствия полноты, присущего многим биологическим и химическим явлениям.[0015] As used herein, the term “substantially” may also refer to the qualitative condition of demonstrating the full or nearly full extent or magnitude of the characteristic or property of interest. It will be clear to one skilled in the field of biology that biological and chemical phenomena rarely, if ever, reach and/or proceed to completion, or achieve or avoid an absolute outcome. Thus, the term “substantially” is used herein to refer to the potential lack of completeness inherent in many biological and chemical phenomena.
[0016] В контексте настоящего документа термин «обнаруживать», «обнаружение», «обнаружимый» или «проведение обнаружения» понимается как на количественном, так и на качественном уровне, а также в их комбинации. Таким образом, он включает количественные, полуколичественные и качественные измерения, осуществленные в отношении биомолекулы согласно изобретению.[0016] As used herein, the term “detect,” “detect,” “detectable,” or “perform detection” is understood at both a quantitative and qualitative level, as well as a combination thereof. Thus, it includes quantitative, semi-quantitative and qualitative measurements carried out on the biomolecule according to the invention.
[0017] В контексте настоящего документа «обнаружимая аффинность» обычно означает, что связывающая способность между биомолекулой и ее мишенью, выраженная значением KD, EC50 или IC50, составляет не более чем приблизительно 10-5 М, или ниже. Аффинность связывания, выраженная значением KD, EC50 или IC50, превышающим 10-5 M, как правило, уже не поддается измерению с помощью обычных методов, таких как ELISA и SPR, и поэтому имеет второстепенное значение.[0017] As used herein, “detectable affinity” generally means that the binding capacity between a biomolecule and its target, expressed as a K D , EC 50 or IC 50 value, is no more than about 10 -5 M, or lower. Binding affinity, expressed by a K D , EC 50 or IC 50 value greater than 10 -5 M, is generally no longer measurable by conventional methods such as ELISA and SPR and is therefore of secondary importance.
[0018] Следует отметить, что образование комплекса между биомолекулой согласно изобретению и ее мишенью зависит от многих различных факторов, таких как концентрации соответствующей мишени, присутствие конкурентов, рН и ионная сила используемой буферной системы, экспериментальный метод, используемый для определения аффинности связывания (например, флуоресцентное титрование, конкурентный ELISA (также называемый конкурирующим ELISA) и поверхностный плазмонный резонанс), и даже математический алгоритм, используемый для оценки экспериментальных данных. Следовательно, специалисту ясно, что аффинность связывания, выраженная значением KD, EC50 или IC50, может варьироваться в пределах определенного экспериментального диапазона, в зависимости от используемого метода и условий эксперимента. Это означает, что может иметь место небольшое отклонение измеренных значений KD, EC50 или IC50 или диапазон допустимых значений в зависимости, например, от того, были ли такие значения определены с помощью ELISA (включая прямой или конкурентный ELISA), SPR, или другим методом.[0018] It should be noted that the formation of a complex between the biomolecule of the invention and its target depends on many different factors, such as the concentration of the relevant target, the presence of competitors, the pH and ionic strength of the buffer system used, the experimental method used to determine binding affinity (e.g. fluorescence titration, competitive ELISA (also called competitive ELISA) and surface plasmon resonance), and even a mathematical algorithm used to evaluate experimental data. Therefore, one skilled in the art will appreciate that binding affinity, expressed as K D , EC 50 or IC 50 , may vary within a certain experimental range, depending on the method used and the experimental conditions. This means that there may be a slight variation in the measured KD , EC 50 or IC 50 values or range of acceptable values depending, for example, on whether such values were determined by ELISA (including direct or competitive ELISA), SPR, or another method.
[0019] В контексте настоящего документа термины «специфичный к», «специфичное связывание», «специфически связывать» или «специфичность связывания» относятся к способности биомолекулы различать желаемую мишень (например, CD137 и PD-L1) и одну или более референсных мишеней (например, клеточный рецептор липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов). Подразумевается, что такая специфичность является не абсолютным, а относительным свойством и может быть определена, например, согласно SPR, вестерн-блоттингу, ELISA, флуоресцентно-активированной сортировке клеток (FACS), радиоиммуноанализу (RIA), электрохемилюминесценции (ECL), иммунорадиометрическому анализу (IRMA), иммуногистохимии (IHC) и пептидному сканированию.[0019] As used herein, the terms “specific to,” “binding specific,” “binding specifically,” or “binding specificity” refer to the ability of a biomolecule to distinguish between a desired target (e.g., CD137 and PD-L1) and one or more reference targets ( for example, cellular receptor for neutrophil gelatinase-associated lipocalin). It is understood that such specificity is not an absolute but a relative property and can be determined, for example, by SPR, Western blotting, ELISA, fluorescence-activated cell sorting (FACS), radioimmunoassay (RIA), electrochemiluminescence (ECL), immunoradiometric analysis ( IRMA), immunohistochemistry (IHC) and peptide scanning.
[0020] При использовании в настоящем документе в контексте слитого белка согласно настоящему изобретению, который связывается с CD137 и PD-L1, термин «специфичный к», «специфическое связывание», «специфически связывать» или «специфичность связывания» означает, что слитый белок связывается, реагирует с или направлен против CD137 и PD-L1, как описано в настоящем документе, но по существу не связывает другой белок. Термин «другой белок» включает любые белки, которые не являются CD137 или PD-L1, или белками, родственными CD137 или PD-L1 или гомологичными им. Однако CD137 или PD-L1 видов, отличных от человека, и фрагменты и/или варианты CD137 или PD-L1 не исключаются термином «другой белок». Термин «по существу не связывает» означает, что слитые белки согласно настоящему изобретению связывают другой белок с более низкой аффинностью связывания, чем CD137 и/или PD-L1, т. е. проявляют перекрестную реактивность менее 30%, предпочтительно 20%, более предпочтительно 10%, особенно предпочтительно менее 9, 8, 7, 6 или 5%. Способность слитого белка специфически реагировать, как определено выше в настоящем документе, может быть легко проверена, среди прочего, путем сравнения реакции слитого белка согласно настоящему изобретению с CD137 и/или PD-L1 и реакции указанного слитого белка с другим белком(ами).[0020] When used herein in the context of a fusion protein of the present invention that binds to CD137 and PD-L1, the term “specific to,” “binding specific,” “binding specifically,” or “binding specificity” means that the fusion protein binds to, reacts with, or is directed against CD137 and PD-L1 as described herein, but does not substantially bind another protein. The term “other protein” includes any proteins that are not CD137 or PD-L1, or proteins related to or homologous to CD137 or PD-L1. However, CD137 or PD-L1 of non-human species, and fragments and/or variants of CD137 or PD-L1 are not excluded by the term “other protein.” The term “substantially does not bind” means that the fusion proteins of the present invention bind another protein with a lower binding affinity than CD137 and/or PD-L1, i.e., exhibit less than 30% cross-reactivity, preferably 20%, more preferably 10%, particularly preferably less than 9, 8, 7, 6 or 5%. The ability of a fusion protein to specifically respond as defined hereinabove can be readily tested, among other things, by comparing the response of the fusion protein of the present invention with CD137 and/or PD-L1 and the response of said fusion protein with other protein(s).
[0021] В контексте настоящего документа термин «липокалин» относится к мономерному белку массой приблизительно 18-20 кДа, имеющему супервторичную структурную область цилиндрического β-складчатого листа, содержащую множество β-цепей (предпочтительно восемь β-цепей, обозначенных как А-Н), соединенных попарно множеством петель (предпочтительно четырьмя) на одном конце, содержащих, таким образом, лиганд-связывающий карман и образующих вход в лиганд-связывающий карман. Предпочтительно петли, содержащие лиганд-связывающий карман, используемые в настоящем изобретении, представляют собой петли, соединяющие открытые концы β-цепей А и В, С и D, Е и F, и G и Н, и обозначенные как петли AB, CD, EF и GH. Точно установлено, что разнообразие указанных петель в составе в остальном жесткого каркаса липокалина приводит к возникновению различных механизмов связывания у членов семейства липокалинов, каждый из которых способен вмещать мишени различных размеров, формы и химического характера (обзор приведен, например, в Skerra, Biochim Biophys Acta, 2000, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996). Согласно имеющимся сведениям семейство белков липокалинов естественным образом эволюционировало, чтобы связывать широкий спектр лигандов, характеризуясь необычно низкими уровнями общей консервативности последовательностей (часто с идентичностью последовательностей менее 20%), но сохраняя при этом высококонсервативный общий характер фолдинга. Соответствие между положениями в различных липокалинах также хорошо известно специалистам в данной области техники (см., например, патент США № 7,250,297). Белки, попадающие под определение «липокалин» в контексте настоящего документа, включают, не ограничиваясь перечисленным, человеческие липокалины, включая липокалин слезной жидкости (Tlc, Lcn1), липокалин-2 (Lcn2) или липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (NGAL), аполипопротеин D (ApoD), аполипопротеин M, α1-кислый гликопротеин 1, α1-кислый гликопротеин 2, α1-микроглобулин, компонент комплемента 8γ, ретинол-связывающий белок (RBP), эпидидимальный белок, связывающий ретиноевую кислоту, гликоделин, одорант-связывающий белок IIa, одорант-связывающий белок IIb, липокалин-15 (Lcn15) и простагландин D-синтазу. [0021] As used herein, the term "lipocalin" refers to a monomeric protein of approximately 18-20 kDa having a supersecondary structural region of a cylindrical β-pleated sheet containing multiple β chains (preferably eight β chains, designated A-H) , connected in pairs by a plurality of loops (preferably four) at one end, thus containing the ligand-binding pocket and forming the entrance to the ligand-binding pocket. Preferably, the loops containing the ligand binding pocket used in the present invention are loops connecting the open ends of β-strands A and B, C and D, E and F, and G and H, and are designated AB, CD, EF loops and G.H. It is well established that the diversity of these loops within the otherwise rigid lipocalin scaffold gives rise to different binding mechanisms among members of the lipocalin family, each capable of accommodating targets of different sizes, shapes and chemical natures (reviewed, for example, in Skerra, Biochim Biophys Acta , 2000, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996). The lipocalin family of proteins is reported to have naturally evolved to bind a wide range of ligands, characterized by unusually low levels of overall sequence conservation (often with less than 20% sequence identity), while maintaining a highly conserved overall folding pattern. The correspondence between positions in different lipocalins is also well known to those skilled in the art (see, for example, US Pat. No. 7,250,297). Proteins falling within the definition of “lipocalin” as used herein include, but are not limited to, human lipocalins, including tear lipocalin (Tlc, Lcn1), lipocalin-2 (Lcn2) or neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), apolipoprotein D (ApoD), apolipoprotein M, α 1 -acid glycoprotein 1, α 1 -acid glycoprotein 2, α 1 -microglobulin, complement component 8γ, retinol binding protein (RBP), epididymal retinoic acid binding protein, glycodelin, odorant- binding protein IIa, odorant binding protein IIb, lipocalin-15 (Lcn15) and prostaglandin D synthase.
[0022] В контексте настоящего документа, если не указано иное, «липокалин слезной жидкости» относится к человеческому липокалину слезной жидкости (hTlc) и также относится к зрелому человеческому липокалину слезной жидкости. Термин «зрелый», при использовании для характеристики белка, означает белок, по существу не содержащий сигнального пептида. «Зрелый hTlc» в настоящем изобретении относится к зрелой форме человеческого липокалина слезной жидкости, не содержащей сигнального пептида. Зрелый hTlc описывается остатками 19-176 последовательности, депонированной в банке данных SWISS-PROT под регистрационным номером P31025, и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 1. [0022] As used herein, unless otherwise specified, “tear lipocalin” refers to human tear lipocalin (hTlc) and also refers to mature human tear lipocalin. The term "mature", when used to characterize a protein, means a protein substantially free of a signal peptide. “Mature hTlc” as used herein refers to the mature form of human tear lipocalin that does not contain a signal peptide. Mature hTlc is described by residues 19-176 of the sequence deposited in the SWISS-PROT data bank under accession number P31025, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
[0023] В контексте настоящего документа «липокалин-2» или «липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов» относится к человеческому липокалину-2 (hLcn2) или человеческому липокалину, ассоциированному с желатиназой нейтрофилов (hNGAL), и также относится к зрелому человеческому липокалину-2 или зрелому человеческому липокалину, ассоциированному с желатиназой нейтрофилов. Термин «зрелый», при использовании для характеристики белка, означает белок, по существу не содержащий сигнального пептида. «Зрелый hNGAL» в настоящем изобретении относится к зрелой форме человеческого липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов, не содержащей сигнального пептида. Зрелый hNGAL описывается остатками 21-198 последовательности, депонированной в банке данных SWISS-PROT под регистрационным номером P80188, и его аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 2. [0023] As used herein, “lipocalin-2” or “neutrophil gelatinase-associated lipocalin” refers to human lipocalin-2 (hLcn2) or human neutrophil gelatinase-associated lipocalin (hNGAL), and also refers to mature human lipocalin-2 (hLcn2) or human neutrophil gelatinase-associated lipocalin (hNGAL). 2 or mature human lipocalin associated with neutrophil gelatinase. The term "mature", when used to characterize a protein, means a protein substantially free of a signal peptide. “Mature hNGAL” as used herein refers to the mature form of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin, which does not contain a signal peptide. Mature hNGAL is described by residues 21-198 of the sequence deposited in the SWISS-PROT data bank under accession number P80188, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
[0024] В контексте настоящего документа «нативная последовательность» относится к белку или полипептиду, имеющему последовательность, которая встречается в природе, или имеющему последовательность дикого типа, независимо от способа его получения. Такой белок или полипептид с нативной последовательностью может быть выделен из природных источников или может быть получен с помощью других средств, например, рекомбинантными или синтетическими методами. [0024] As used herein, “native sequence” refers to a protein or polypeptide having a naturally occurring or wild-type sequence, regardless of how it is produced. Such a native sequence protein or polypeptide may be isolated from natural sources or may be produced by other means, such as recombinant or synthetic methods.
[0025] «Липокалин с нативной последовательностью» относится к липокалину, имеющему ту же аминокислотную последовательность, что и соответствующий полипептид природного происхождения. Таким образом, липокалин с нативной последовательностью может иметь аминокислотную последовательность соответствующего природного липокалина (дикого типа) из любого организма, в частности, млекопитающего. Термин «нативная последовательность» применительно к липокалину, в частности, охватывает природные укороченные или секретируемые формы липокалина, природные вариантные формы, такие как альтернативно сплайсированные формы, и природные аллельные варианты липокалина. Термины «липокалин с нативной последовательностью» и «липокалин дикого типа» используются в настоящем документе взаимозаменяемо.[0025] “Native sequence lipocalin” refers to a lipocalin having the same amino acid sequence as the corresponding naturally occurring polypeptide. Thus, a native sequence lipocalin may have the amino acid sequence of the corresponding natural lipocalin (wild type) from any organism, particularly a mammal. The term "native sequence" as applied to lipocalin specifically covers naturally occurring truncated or secreted forms of lipocalin, naturally occurring variant forms such as alternatively spliced forms, and naturally occurring allelic variants of lipocalin. The terms “native sequence lipocalin” and “wild type lipocalin” are used interchangeably herein.
[0026] В контексте настоящего документа «мутеин», «мутированный» фрагмент (будь то фрагмент белка или нуклеиновой кислоты) или «мутант» относится к обмену, делеции или вставке одной или нескольких аминокислот или нуклеотидов по сравнению с природным белком или нуклеиновой кислотой (дикого типа). Указанный термин также включает фрагменты мутеина, как описано в настоящем документе. Настоящее изобретение явным образом охватывает мутеины липокалина, как описано в настоящем документе, имеющие супервторичную структурную область цилиндрического β-складчатого листа, содержащую восемь β-цепей, соединенных попарно четырьмя петлями на одном конце, содержащими, таким образом, лиганд-связывающий карман и образующими вход в лиганд-связывающий карман, где по меньшей мере одна аминокислота каждой из по меньшей мере трех из четырех указанных петель была мутирована по сравнению с липокалином с нативной последовательностью. Мутеины липокалина согласно настоящему изобретению предпочтительно обладают функцией связывания CD137, как описано в настоящем документе. [0026] As used herein, a "mutein", a "mutated" fragment (whether a protein or nucleic acid fragment) or a "mutant" refers to the exchange, deletion or insertion of one or more amino acids or nucleotides from the naturally occurring protein or nucleic acid ( wild type). The term also includes mutein fragments as described herein. The present invention explicitly covers lipocalin muteins, as described herein, having a supersecondary structural region of a cylindrical β-pleated sheet containing eight β-strands connected in pairs by four loops at one end, thereby containing a ligand-binding pocket and forming an entrance into a ligand-binding pocket where at least one amino acid of each of at least three of the four loops has been mutated from the native sequence lipocalin. The lipocalin muteins of the present invention preferably have CD137 binding function as described herein.
[0027] В контексте настоящего документа термин «фрагмент» применительно к мутеинам липокалина согласно изобретению относится к белкам или полипептидам, полученным из полноразмерного зрелого hTlc или hNGAL, или мутеинам липокалина, усеченным с N-конца и/или C-конца, т. е. лишенным по меньшей мере одной из N-концевых и/или C-концевых аминокислот. Такие фрагменты могут включать по меньшей мере 10 или более, например, 20 или 30 или более последовательно расположенных аминокислот первичной последовательности зрелого hTlc или hNGAL или мутеина липокалина, из которого они получены, и обычно являются обнаружимыми в иммуноанализе на зрелый hTlc или hNGAL. В таком фрагменте может отсутствовать до 2, до 3, до 4, до 5, до 10, до 15, до 20, до 25 или до 30 (включая все числа между ними) N-концевых и/или C-концевых аминокислот. В качестве иллюстративного примера, в таком фрагменте может отсутствовать одна, две, три или четыре N-концевые (His-His-Leu-Leu) и/или одна или две C-концевые аминокислоты (Ser-Asp) зрелого hTlc. Подразумевается, что фрагмент предпочтительно представляет собой функциональный фрагмент зрелого hTlc или hNGAL или мутеина липокалина, из которого он получен, что означает, что он предпочтительно сохраняет специфичность связывания, предпочтительно с CD137, зрелых hTlc/hNGAL или мутеина липокалина, из которого он получен. В качестве иллюстративного примера такой функциональный фрагмент может содержать по меньшей мере аминокислоты в положениях 5-153, 5-150, 9-148, 12-140, 20-135 или 26-133, соответствующих линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc. В качестве еще одного иллюстративного примера такой функциональный фрагмент может содержать по меньшей мере аминокислоты в положениях 13-157, 15-150, 18-141, 20-134, 25-134 или 28-134, соответствующих линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL. [0027] As used herein, the term “fragment” in relation to the lipocalin muteins of the invention refers to proteins or polypeptides derived from full-length mature hTlc or hNGAL, or lipocalin muteins truncated at the N-terminus and/or C-terminus, i.e. . lacking at least one of the N-terminal and/or C-terminal amino acids. Such fragments may comprise at least 10 or more, for example 20 or 30 or more, consecutive amino acids of the primary sequence of mature hTlc or hNGAL or the lipocalin mutein from which they are derived, and are typically detectable in a mature hTlc or hNGAL immunoassay. Such a fragment may be missing up to 2, up to 3, up to 4, up to 5, up to 10, up to 15, up to 20, up to 25 or up to 30 (including all numbers in between) N-terminal and/or C-terminal amino acids. As an illustrative example, such a fragment may lack one, two, three or four N-terminal (His-His-Leu-Leu) and/or one or two C-terminal amino acids (Ser-Asp) of mature hTlc. The fragment is intended to preferably be a functional fragment of the mature hTlc or hNGAL or lipocalin mutein from which it is derived, meaning that it preferably retains the binding specificity, preferably to CD137, of the mature hTlc/hNGAL or lipocalin mutein from which it is derived. As an illustrative example, such a functional fragment may contain at least amino acids at positions 5-153, 5-150, 9-148, 12-140, 20-135, or 26-133, corresponding to the linear polypeptide sequence of mature hTlc. As yet another illustrative example, such a functional fragment may comprise at least amino acid positions 13-157, 15-150, 18-141, 20-134, 25-134, or 28-134, corresponding to the linear polypeptide sequence of mature hNGAL.
[0028] «Фрагмент» применительно к соответствующей мишени CD137 или PD-L1 слитого белка согласно изобретению относится к усеченному с N-конца и/или C-конца CD137 или PD-L1, или белковым доменам CD137 или PD-L1. Фрагменты CD137 или фрагменты PD-L1, как описано в настоящем документе, сохраняют способность полноразмерного CD137 или PD-L1 распознаваться и/или быть связанным слитым белком согласно изобретению. В качестве иллюстративного примера фрагмент может представлять собой внеклеточный домен CD137 или PD-L1. В качестве иллюстративного примера такой внеклеточный домен может содержать аминокислоты внеклеточных субдоменов CD137, такие как отдельные или комбинированные аминокислотные последовательности домена 1 (остатки 24-45 UniProt Q07011), домена 2 (остатки 46-86), домена 3 (87-118) и домена 4 (остатки 119-159). В качестве еще одного иллюстративного примера такой внеклеточный домен может содержать аминокислотные остатки 19-238 UniProt Q9NZQ7.[0028] "Fragment" in relation to a corresponding target CD137 or PD-L1 fusion protein of the invention refers to N-terminally and/or C-terminally truncated CD137 or PD-L1, or CD137 or PD-L1 protein domains. CD137 fragments or PD-L1 fragments, as described herein, retain the ability of full-length CD137 or PD-L1 to be recognized and/or bound by the fusion protein of the invention. As an illustrative example, the fragment may be the extracellular domain of CD137 or PD-L1. As an illustrative example, such an extracellular domain may comprise the amino acids of CD137 extracellular subdomains, such as the individual or combined amino acid sequences of domain 1 (residues 24-45 of UniProt Q07011), domain 2 (residues 46-86), domain 3 (87-118), and domain 4 (residues 119-159). As another illustrative example, such an extracellular domain may comprise amino acid residues 19-238 of UniProt Q9NZQ7.
[0029] В контексте настоящего документа термин «вариант» относится к производным белка или полипептида, которые включают мутации, например, путем замен, делеций, вставок и/или химических модификаций аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах осуществления такие мутации и/или химические модификации не снижают функциональность белка или пептида. Такие замены могут быть консервативными, т. е. аминокислотный остаток может быть заменен химически схожим аминокислотным остатком. Примерами консервативных замен являются замены среди членов следующих групп: 1) аланин, серин, треонин и валин; 2) аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, глутамин, аспарагин и гистидин; 3) аргинин, лизин, глутамин, аспарагин и гистидин; 4) изолейцин, лейцин, метионин, валин, аланин, фенилаланин, треонин и пролин; и 5) изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, тирозин и триптофан. Такие варианты включают белки или полипептиды, в которых одна или более аминокислот были заменены их соответствующими D-стереоизомерами или аминокислотами, отличными от 20 природных аминокислот, такими как, например, орнитин, гидроксипролин, цитруллин, гомосерин, гидроксилизин, норвалин. Такие варианты также включают, например, белки или полипептиды, в которых добавлены или удалены один или более аминокислотных остатков на N- и/или C-конце. Как правило, вариант обладает по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95% или по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью аминокислотной последовательности с белком или полипептидом с нативной последовательностью. Вариант предпочтительно сохраняет биологическую активность, например связывание с той же мишенью, белка или полипептида, из которого он получен. [0029] As used herein, the term “variant” refers to derivatives of a protein or polypeptide that include mutations, for example, by substitutions, deletions, insertions and/or chemical modifications of an amino acid sequence or nucleotide sequence. In some embodiments, such mutations and/or chemical modifications do not reduce the functionality of the protein or peptide. Such substitutions may be conservative, that is, an amino acid residue may be replaced by a chemically similar amino acid residue. Examples of conservative substitutions are substitutions among members of the following groups: 1) alanine, serine, threonine and valine; 2) aspartic acid, glutamic acid, glutamine, asparagine and histidine; 3) arginine, lysine, glutamine, asparagine and histidine; 4) isoleucine, leucine, methionine, valine, alanine, phenylalanine, threonine and proline; and 5) isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tyrosine and tryptophan. Such variants include proteins or polypeptides in which one or more amino acids have been replaced with their corresponding D-stereoisomers or amino acids other than the 20 naturally occurring amino acids, such as, for example, ornithine, hydroxyproline, citrulline, homoserine, hydroxylysine, norvaline. Such variants also include, for example, proteins or polypeptides in which one or more amino acid residues at the N- and/or C-terminus are added or deleted. Typically, the variant has at least about 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, or at least about 98% amino acid sequence identity to a protein or polypeptide with native sequence. The variant preferably retains biological activity, such as binding to the same target, of the protein or polypeptide from which it is derived.
[0030] Термин «вариант» в контексте настоящего документа применительно к соответствующему белку лиганда CD137 или PD-L1 слитого белка согласно изобретению относится к CD137 или PD-L1 или его фрагменту, соответственно, имеющему одну или более, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или более замен, делеций и/или вставок аминокислот по сравнению с нативной последовательностью CD137 или PD-L1 (CD137 или PD-L1 дикого типа), например, CD137, депонированным как UniProt Q07011, или PD-L1, депонированным как UniProt Q9NZQ7, как описано в настоящем документе. Вариант CD137 или вариант PD-L1, соответственно, предпочтительно обладает по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичностью аминокислотной последовательности CD137 или PD-L1 дикого типа. Вариант CD137 или вариант PD-L1, как описано в настоящем документе, сохраняет способность связывать слитые белки, специфичные к CD137 и PD-L1, раскрытые в настоящем изобретении. [0030] The term “variant” as used herein in relation to the corresponding CD137 ligand or PD-L1 fusion protein of the invention refers to CD137 or PD-L1 or a fragment thereof, respectively, having one or more, for example, 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60, 70, 80 or more substitutions, deletions, and /or amino acid insertions compared to the native sequence of CD137 or PD-L1 (CD137 or wild-type PD-L1), for example, CD137 deposited as UniProt Q07011, or PD-L1 deposited as UniProt Q9NZQ7, as described herein. The CD137 variant or PD-L1 variant, respectively, preferably has at least 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, or 95% amino acid sequence identity to wild-type CD137 or PD-L1. The CD137 variant or PD-L1 variant, as described herein, retains the ability to bind the CD137-PD-L1 specific fusion proteins disclosed in the present invention.
[0031] Термин «вариант», используемый в настоящем документе применительно к мутеину липокалина, относится к мутеину липокалина или его фрагменту согласно изобретению, где последовательность имеет мутации, включая замены, делеции и вставки, и/или химические модификации. Описанный в настоящем документе вариант мутеина липокалина сохраняет биологическую активность, например, связывание с CD137, мутеина липокалина, из которого он получен. Как правило, вариант мутеина липокаина обладает по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% идентичностью аминокислотной последовательности с мутеином липокалина, из которого он получен.[0031] The term “variant” as used herein in relation to a lipocalin mutein refers to a lipocalin mutein or fragment thereof according to the invention, wherein the sequence has mutations, including substitutions, deletions and insertions, and/or chemical modifications. The lipocalin mutein variant described herein retains the biological activity, eg, binding to CD137, of the lipocalin mutein from which it is derived. Typically, a lipocaine mutein variant has at least about 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% amino acid sequence identity with the lipocaine mutein from which it is derived. received.
[0032] В контексте настоящего документа термин «мутагенез» относится к введению мутаций в полинуклеотидную или аминокислотную последовательность. Мутации предпочтительно вводят в таких экспериментальных условиях, что природная аминокислота в данном положении последовательности белка или полипептида может быть изменена, например, заменена, по меньшей мере одной аминокислотой. Термин «мутагенез» также включает (дополнительную) модификацию длины сегментов последовательности путем делеции или вставки одной или более аминокислот. Таким образом, в рамках изобретения, например, одна аминокислота в выбранном положении последовательности может быть заменена отрезком из трех аминокислот, что приводит к добавлению двух аминокислотных остатков по сравнению с длиной соответствующего сегмента нативной аминокислотной последовательности белка или полипептида. Такая вставка или делеция могут быть введены независимо друг от друга в любой из сегментов последовательности, которые могут быть подвергнуты мутагенезу в изобретении. В одном иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения вставка может быть введена в сегмент аминокислотной последовательности, соответствующий петле AB липокалина с нативной последовательностью (см. публикацию международной патентной заявки WO 2005/019256, полностью включенную в настоящий документ посредством ссылки).[0032] As used herein, the term "mutagenesis" refers to the introduction of mutations into a polynucleotide or amino acid sequence. Mutations are preferably introduced under experimental conditions such that the natural amino acid at a given position in the protein or polypeptide sequence can be changed, for example, replaced by at least one amino acid. The term "mutagenesis" also includes (additional) modification of the length of sequence segments by deletion or insertion of one or more amino acids. Thus, within the scope of the invention, for example, one amino acid at a selected position in the sequence may be replaced by a stretch of three amino acids, resulting in the addition of two amino acid residues compared to the length of the corresponding segment of the native amino acid sequence of the protein or polypeptide. Such an insertion or deletion can be introduced independently of each other into any of the sequence segments that can be mutagenized in the invention. In one illustrative embodiment of the present invention, the insert may be introduced into a segment of the amino acid sequence corresponding to the AB loop of the native sequence lipocalin (see International Patent Application Publication WO 2005/019256, incorporated herein by reference in its entirety).
[0033] В контексте настоящего документа термин «случайный мутагенез» означает, что в определенном положении последовательности нет заранее определенной мутации (изменения аминокислоты), но что по меньшей мере две аминокислоты с определенной вероятностью могут быть включены в заранее определенное положение последовательности во время мутагенеза.[0033] As used herein, the term “random mutagenesis” means that there is no predetermined mutation (amino acid change) at a particular sequence position, but that at least two amino acids are likely to be included at a predetermined sequence position during mutagenesis.
[0034] В контексте настоящего документа термин «идентичность последовательностей» или «идентичность» означает свойство последовательностей, которое является мерой их сходства или родства. Термин «идентичность последовательностей» или «идентичность» в контексте настоящего документа означает процент попарно идентичных остатков - после (гомологичного) выравнивания последовательности белка или полипептида согласно изобретению с рассматриваемой последовательностью - относительно количества остатков в более длинной из этих двух последовательностей. Идентичность последовательностей измеряют путем деления количества идентичных аминокислотных остатков на общее количество остатков и умножения результата на 100.[0034] As used herein, the term “sequence identity” or “identity” means a property of sequences that is a measure of their similarity or relatedness. The term "sequence identity" or "identity" as used herein means the percentage of pairwise identical residues - after (homologous) alignment of the sequence of a protein or polypeptide according to the invention with the sequence in question - relative to the number of residues in the longer of the two sequences. Sequence identity is measured by dividing the number of identical amino acid residues by the total number of residues and multiplying the result by 100.
[0035] В контексте настоящего документа термин «гомология последовательностей» или «гомология» имеет свое обычное значение, и гомологичная аминокислота включает идентичные аминокислоты, а также аминокислоты, которые считаются консервативными заменами, в эквивалентных положениях в линейной аминокислотной последовательности белка или полипептида согласно изобретению (например, любых слитых белках или мутеинах липокалина согласно изобретению).[0035] As used herein, the term "sequence homology" or "homology" has its ordinary meaning, and a homologous amino acid includes identical amino acids, as well as amino acids that are considered conservative substitutions, at equivalent positions in the linear amino acid sequence of a protein or polypeptide of the invention ( for example, any lipocalin fusion proteins or muteins according to the invention).
[0036] Специалисту известны доступные компьютерные программы, например, BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 1997), BLAST2 (Altschul et al., J Mol Biol, 1990) и Смита-Ватермана (Smith and Waterman, J Mol Biol, 1981), для определения гомологии последовательностей или идентичности последовательностей с использованием стандартных параметров. Процент гомологии последовательностей или идентичности последовательностей может, например, быть определен в настоящем документе с использованием программы BLASTP, версия 2.2.5 (16 ноября 2002 г.; (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 1997). В этом варианте осуществления процент гомологии основан на выравнивании целых последовательностей белка или полипептида (матрица: BLOSUM 62; вес гэпов: 11,1; пороговое значение установлено на 10-3), включая пропептидные последовательности, предпочтительно с использованием белкового каркаса дикого типа в качестве эталона при попарном сравнении. Он рассчитывается как процент числа «положительных» (гомологичных аминокислот), указанных в качестве результата в выходных данных программы BLASTP, деленный на общее количество аминокислот, выбранных программой для выравнивания.[0036] One skilled in the art will be aware of available computer programs such as BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 1997), BLAST2 (Altschul et al., J Mol Biol, 1990) and Smith and Waterman (J Mol Biol , 1981), to determine sequence homology or sequence identity using standard parameters. The percentage of sequence homology or sequence identity can, for example, be determined herein using the BLASTP program, version 2.2.5 (November 16, 2002; (Altschul et al., Nucleic Acids Res, 1997). In this embodiment, the percentage of homology is based on the alignment of entire protein or polypeptide sequences (matrix: BLOSUM 62; gap weight: 11.1; threshold set to 10 -3 ), including propeptide sequences, preferably using the wild-type protein scaffold as a reference in pairwise comparisons. It is calculated. as the percentage of the number of "positive" (homologous amino acids) reported as a result in the BLASTP program output, divided by the total number of amino acids selected by the program for alignment.
[0037] В частности, чтобы определить, отличается ли аминокислотный остаток в аминокислотной последовательности мутеина липокалина от липокалина дикого типа, соответствующий определенному положению в аминокислотной последовательности липокалина дикого типа, специалист может использовать средства и методы, хорошо известные в данной области техники, например, выравнивания, вручную или с использованием компьютерных программ, таких как BLAST 2.0, что расшифровывается как средство поиска основного локального выравнивания, или ClustalW, или любой другой подходящей программы, которая подходит для генерации выравниваний последовательностей. Соответственно, последовательность липокалина дикого типа может служить «рассматриваемой последовательностью» или «референсной последовательностью», в то время как аминокислотная последовательность мутеина липокалина, отличная от липокалина дикого типа, описанного в настоящем документе, служит «искомой последовательностью». Термины «последовательность дикого типа», «референсная последовательность» и «рассматриваемая последовательность» используются в настоящем документе взаимозаменяемо. Предпочтительной последовательностью липокалина дикого типа является последовательность hTLc, представленная в SEQ ID NO: 1, или hNGAL, представленная в SEQ ID NO: 2.[0037] In particular, to determine whether an amino acid residue in the amino acid sequence of a lipocalin mutein differs from wild-type lipocalin corresponding to a particular position in the amino acid sequence of wild-type lipocalin, one skilled in the art may use tools and methods well known in the art, such as alignments , manually or using computer programs such as BLAST 2.0, which stands for Basic Local Alignment Search Tool, or ClustalW, or any other suitable program that is suitable for generating sequence alignments. Accordingly, a wild-type lipocalin sequence may serve as a “target sequence” or a “reference sequence,” while an amino acid sequence of a lipocalin mutein other than the wild-type lipocalin described herein serves as a “target sequence.” The terms "wild type sequence", "reference sequence" and "subject sequence" are used interchangeably herein. The preferred wild-type lipocalin sequence is the hTLc sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or hNGAL set forth in SEQ ID NO: 2.
[0038] «Гэпы» представляют собой пропуски в выравнивании, которые являются результатом добавлений или делеций аминокислот. Таким образом, две копии одной и той же последовательности имеют 100% идентичность, но последовательности, которые не обладают столь высокой консервативностью и имеют делеции, добавления или замены, могут иметь более низкую степень идентичности.[0038] "Gaps" are gaps in the alignment that result from additions or deletions of amino acids. Thus, two copies of the same sequence have 100% identity, but sequences that are not as highly conserved and have deletions, additions, or substitutions may have a lower degree of identity.
[0039] В контексте настоящего документа термин «положение» означает положение либо аминокислоты в аминокислотной последовательности, показанной в настоящем документе, либо положение нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в настоящем документе. Следует понимать, что при использовании термина «соответствует» или «соответствующий», в настоящем документе в контексте положений аминокислотной последовательности одного или более мутеинов липокалина соответствующее положение определяется не только количеством предшествующих нуклеотидов или аминокислот. Соответственно, абсолютное положение данной аминокислоты согласно изобретению может варьироваться относительно соответствующего положения из-за делеций или добавлений аминокислот в других местах липокалина (мутантного или дикого типа). Аналогичным образом, абсолютное положение данного нуклеотида согласно настоящему изобретению может отличаться от соответствующего положения из-за делеций или дополнительных нуклеотидов в других местах в 5'-нетранслируемой области (UTR) мутеина липокалина или липокалина дикого типа, включая промотор и/или любые другие регуляторные последовательности или ген (включая экзоны и интроны).[0039] As used herein, the term “position” means the position of either an amino acid in an amino acid sequence shown herein or a nucleotide position in a nucleic acid sequence shown herein. It should be understood that when the term “corresponds” or “corresponding” is used herein in the context of positions in the amino acid sequence of one or more lipocalin muteins, the corresponding position is determined not only by the number of preceding nucleotides or amino acids. Accordingly, the absolute position of a given amino acid according to the invention may vary relative to the corresponding position due to deletions or additions of amino acids elsewhere in lipocalin (mutant or wild type). Likewise, the absolute position of a given nucleotide according to the present invention may differ from the corresponding position due to deletions or additional nucleotides elsewhere in the 5' untranslated region (UTR) of a lipocalin mutein or wild-type lipocalin, including the promoter and/or any other regulatory sequences or gene (including exons and introns).
[0040] «Соответствующее положение» согласно изобретению может представлять собой положение последовательности, которое совпадает с положением последовательности, которому оно соответствует при попарном или множественном выравнивании последовательностей согласно настоящему изобретению. Предпочтительно подразумевается, что для «соответствующего положения» согласно изобретению абсолютные положения нуклеотидов или аминокислот могут отличаться от соседних нуклеотидов или аминокислот, но указанные соседние нуклеотиды или аминокислоты, которые могли быть заменены, удалены, или добавлены, могут охватываться одним или более «соответствующими положениями».[0040] A “matching position” according to the invention may be a sequence position that matches the sequence position to which it corresponds in a pairwise or multiple sequence alignment according to the present invention. It is preferably meant that for a "corresponding position" according to the invention, the absolute positions of the nucleotides or amino acids may differ from adjacent nucleotides or amino acids, but said adjacent nucleotides or amino acids that may have been replaced, deleted, or added may be covered by one or more "corresponding positions" .
[0041] Кроме того, для соответствующего положения в мутеине липокалина на основе референсной последовательности согласно изобретению предпочтительно подразумевается, что положения нуклеотидов или аминокислот мутеина липокалина могут структурно соответствовать положениям в других местах референсного липокалина (липокалина дикого типа) или другого мутеина липокалина, даже если они могут отличаться по абсолютным номерам положений, что ясно специалистам с учетом высококонсервативного общего характера фолдинга, присущего липокалинам.[0041] In addition, for a corresponding position in a lipocalin mutein based on a reference sequence according to the invention, it is preferably understood that the nucleotide or amino acid positions of the lipocalin mutein may structurally correspond to positions elsewhere in the reference lipocalin (wild type lipocalin) or other lipocalin mutein, even if they may differ in absolute position numbers, which is clear to specialists taking into account the highly conservative general nature of folding inherent in lipocalins.
[0042] Используемые здесь взаимозаменяемо, термины «конъюгат», «конъюгация», «гибридизовать», «слияние» или «связанный» относятся к соединению вместе двух или более субъединиц посредством всех форм ковалентного или нековалентного связывания, включая, помимо прочего, генетическое слияние, химическую конъюгацию, связывание с помощью линкера или сшивающего агента и нековалентную ассоциацию.[0042] Used interchangeably herein, the terms “conjugate,” “conjugation,” “hybridize,” “fusion,” or “linked” refer to the joining together of two or more subunits through all forms of covalent or non-covalent linking, including, but not limited to, genetic fusion , chemical conjugation, linking via a linker or cross-linker, and non-covalent association.
[0043] В контексте настоящего документа термин «слитый полипептид» или «слитый белок» относится к полипептиду или белку, содержащему две или более субъединиц. В некоторых вариантах осуществления слитый белок, как описано в настоящем документе, содержит две или более субъединиц, по меньшей мере одна из которых способна специфически связываться с CD137, а другая субъединица способна специфически связываться с PD-L1. Внутри слитого белка эти субъединицы могут быть связаны ковалентной или нековалентной связью. Предпочтительно, слитый белок представляет собой трансляционное слияние двух или более субъединиц. Трансляционное слияние может быть произведено путем генетической модификации кодирующей последовательности для одной субъединицы в рамке считывания с кодирующей последовательностью другой субъединицы. Обе субъединицы могут быть разделены нуклеотидной последовательностью, кодирующей линкер. Однако субъединицы слитого белка согласно настоящему изобретению также могут быть связаны посредством химической конъюгации. Субъединицы, образующие слитый белок, как правило, связаны друг с другом путем связывания C-конца одной субъединицы с N-концом другой субъединицы, или C-конца одной субъединицы с C-концом другой субъединицы, или N-конца одной субъединицы с N-концом другой субъединицы, или N-конца одной субъединицы с С-концом другой субъединицы. Субъединицы слитого белка могут быть связаны в любом порядке и могут включать более одной из любых составляющих субъединиц. Если одна или более субъединиц являются частью белка (комплекса), который состоит из более чем одной полипептидной цепи, термин «слитый белок» может также относиться к белку, содержащему слитые последовательности и все другие полипептидные цепи (цепь) белка (комплекса). В качестве иллюстративного примера, когда полноразмерный иммуноглобулин слит с мутеином липокалина посредством тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, термин «слитый белок» может относиться к одной полипептидной цепи, содержащей мутеин липокалина и тяжелую или легкую цепь иммуноглобулина. Термин «слитый белок» может также относиться ко всему иммуноглобулину (как легкой, так и тяжелой цепям) и липокалину мутеина, слитому с одной или обеими из его тяжелой и/или легкой цепей.[0043] As used herein, the term “fusion polypeptide” or “fusion protein” refers to a polypeptide or protein containing two or more subunits. In some embodiments, a fusion protein as described herein comprises two or more subunits, at least one of which is capable of specifically binding to CD137 and the other subunit is capable of specifically binding to PD-L1. Within the fusion protein, these subunits can be linked covalently or non-covalently. Preferably, the fusion protein is a translational fusion of two or more subunits. A translational fusion can be produced by genetically modifying the coding sequence for one subunit in frame with the coding sequence of another subunit. Both subunits can be separated by a nucleotide sequence encoding a linker. However, the fusion protein subunits of the present invention can also be linked through chemical conjugation. The subunits forming a fusion protein are typically linked to each other by linking the C-terminus of one subunit to the N-terminus of another subunit, or the C-terminus of one subunit to the C-terminus of another subunit, or the N-terminus of one subunit to the N-terminus another subunit, or the N-terminus of one subunit with the C-terminus of another subunit. The fusion protein subunits may be linked in any order and may include more than one of any of the constituent subunits. If one or more subunits are part of a protein (complex) that consists of more than one polypeptide chain, the term "fusion protein" may also refer to a protein containing the fusion sequences and all other polypeptide chains (chain) of the protein (complex). As an illustrative example, when a full-length immunoglobulin is fused to a lipocalin mutein via an immunoglobulin heavy or light chain, the term "fusion protein" may refer to a single polypeptide chain comprising a lipocalin mutein and an immunoglobulin heavy or light chain. The term "fusion protein" can also refer to the entire immunoglobulin (both light and heavy chains) and mutein lipocalin fused to one or both of its heavy and/or light chains.
[0044] В контексте настоящего документа термин «субъединица» слитого белка, описанного в настоящем документе, относится к одному белку или отдельной полипептидной цепи, которая сама по себе может образовывать стабильную свернутую структуру и определять уникальную функцию обеспечения связывающего мотива к мишени. В некоторых вариантах осуществления предпочтительной субъединицей согласно изобретению является мутеин липокалина. В некоторых других вариантах осуществления предпочтительной субъединицей согласно изобретению является полноразмерный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий домен.[0044] As used herein, the term “subunit” of a fusion protein described herein refers to a single protein or single polypeptide chain that itself can form a stable folded structure and define a unique function of providing a binding motif to a target. In some embodiments, a preferred subunit of the invention is a lipocalin mutein. In some other embodiments, a preferred subunit of the invention is a full-length immunoglobulin or an antigen-binding domain thereof.
[0045] «Линкер», который может содержаться в слитом белке согласно настоящему изобретению, объединяет две или более субъединиц слитого белка, как описано в настоящем документе. Связь может быть ковалентной или нековалентной. Предпочтительная ковалентная связь образована посредством пептидной связи, такой как пептидная связь между аминокислотами. Предпочтительным линкером является пептидный линкер. Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления указанный линкер содержит одну или более аминокислот, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более аминокислот. В настоящем документе описаны предпочтительные пептидные линкеры, включая глицин-сериновые (GS) линкеры, гликозилированные GS линкеры и пролин-аланин-сериновые полимерные (PAS) линкеры. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления для соединения вместе субъединиц слитого белка используют GS линкер, представляющий собой (G4S)3, как описано в SEQ ID NO: 13. Другие предпочтительные линкеры включают химические линкеры.[0045] A “linker,” which may be contained in a fusion protein of the present invention, joins two or more subunits of the fusion protein as described herein. The bond may be covalent or non-covalent. A preferred covalent bond is formed through a peptide bond, such as a peptide bond between amino acids. A preferred linker is a peptide linker. Accordingly, in a preferred embodiment, said linker contains one or more amino acids, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more amino acids. Preferred peptide linkers are described herein, including glycine-serine (GS) linkers, glycosylated GS linkers, and proline-alanine-serine polymer (PAS) linkers. In some preferred embodiments, a GS linker of (G 4 S) 3 is used to join together the subunits of the fusion protein, as described in SEQ ID NO: 13. Other preferred linkers include chemical linkers.
[0046] В контексте настоящего документа термин «альбумин» включает все альбумины млекопитающих, такие как человеческий сывороточный альбумин, или бычий сывороточный альбумин, или крысиный сывороточный альбумин.[0046] As used herein, the term “albumin” includes all mammalian albumins, such as human serum albumin, or bovine serum albumin, or rat serum albumin.
[0047] В контексте настоящего документа термин «органическая молекула» или «малая органическая молекула» обозначает органическую молекулу, содержащую по меньшей мере два атома углерода, но предпочтительно не более 7 или 12 вращающихся углеродных связей, имеющую молекулярную массу в диапазоне от 100 до 2000 дальтон, предпочтительно от 100 до 1000 дальтон, и необязательно включающую один или два атома металла.[0047] As used herein, the term "organic molecule" or "small organic molecule" means an organic molecule containing at least two carbon atoms, but preferably no more than 7 or 12 rotatable carbon bonds, having a molecular weight in the range of 100 to 2000 dalton, preferably from 100 to 1000 dalton, and optionally including one or two metal atoms.
[0048] «Образец» определен как биологический образец, взятый у любого субъекта. Биологические образцы включают, не ограничиваясь перечисленным, кровь, сыворотку, мочу, фекалии, сперму или ткань, включая опухолевую ткань.[0048] "Sample" is defined as a biological sample taken from any subject. Biological samples include, but are not limited to, blood, serum, urine, feces, semen, or tissue, including tumor tissue.
[0049] «Субъект» представляет собой позвоночное животное, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человека. Термин «млекопитающее» используется в настоящем документе для обозначения любого животного, классифицируемого как млекопитающее, включая, не ограничиваясь перечисленным, например, людей, домашних и сельскохозяйственных животных, а также животных из зоопарков, животных для спорта или домашних питомцев, таких как овцы, собаки, лошади, кошки, коровы, крысы, свиньи, обезьяны, такие как яванские макаки. Предпочтительно «млекопитающее» в контексте настоящего документа представляет собой человека.[0049] The "subject" is a vertebrate animal, preferably a mammal, more preferably a human. The term "mammal" is used herein to mean any animal classified as a mammal, including, but not limited to, humans, domestic and farm animals, and zoo animals, sporting animals, or pets such as sheep, dogs , horses, cats, cows, rats, pigs, monkeys such as cynomolgus macaques. Preferably, "mammal" as used herein is a human.
[0050] «Эффективное количество» представляет собой количество, достаточное для получения полезных или желаемых результатов. Эффективное количество можно вводить за одно или несколько отдельных введений или доз.[0050] An "effective amount" is an amount sufficient to produce useful or desired results. An effective amount may be administered in one or more separate administrations or doses.
[0051] В контексте настоящего документа «антитело» включает целые антитела или любой их антигенсвязывающий фрагмент (т. е. «антигенсвязывающую часть») или одну их цепь. Целое антитело относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые цепи (HC) и две легкие цепи (LC), соединенные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного домена тяжелой цепи (VH или HCVR) и константной области тяжелой цепи (CH). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного домена легкой цепи (VL или LCVR) и константной области легкой цепи (CL). Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в следующем порядке от аминоконца к карбоксиконцу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном (например, PD-L1). Константные области антител могут необязательно опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.[0051] As used herein, “antibody” includes whole antibodies or any antigen-binding fragment (ie, “antigen-binding portion”) or one chain thereof. A whole antibody refers to a glycoprotein containing at least two heavy chains (HC) and two light chains (LC) linked by disulfide bonds. Each heavy chain consists of a heavy chain variable domain ( VH or HCVR) and a heavy chain constant region ( CH ). The heavy chain constant region consists of three domains: CH1 , CH2 and CH3 . Each light chain consists of a light chain variable domain (V L or LCVR) and a light chain constant region ( CL ). The light chain constant region consists of a single domain, C L . The V H and V L regions can be further subdivided into regions of hypervariability called complementarity determining regions (CDRs), interspersed with more conserved regions called framework regions (FR). Each V H and V L consists of three CDRs and four FRs, arranged in the following order from amino terminus to carboxy terminus: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The heavy and light chain variable regions contain a binding domain that interacts with an antigen (eg, PD-L1). Antibody constant regions may optionally mediate binding of the immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (eg, effector cells) and the first component (C1q) of the classical complement system.
[0052] В контексте настоящего документа «антигенсвязывающий фрагмент» антитела относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, PD-L1). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, включают (i) фрагмент Fab, состоящий из доменов VH, VL, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab′)2, содержащий два фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fab′, состоящий из доменов VH, VL, CL и CH1 и области между доменами CH1 и CH2; (iv) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (v) одноцепочечный фрагмент Fv, состоящий из доменов VH и VL одного плеча антитела, (vi) фрагмент dAb (Ward et al., Nature, 1989), состоящий из домена VH; и (vii) выделенную определяющую комплементарность область (CDR) или комбинацию двух или более выделенных CDR, которые необязательно могут быть соединены синтетическим линкером; (VIII) «диатело», содержащее VH и VL, соединенные в одной и той же полипептидной цепи с помощью короткого линкера (см., например, патентные документы EP 404,097; WO 93/11161; и Holliger et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1993); (ix) «фрагмент доменного антитела», содержащий только VH или VL, где в некоторых случаях ковалентно соединены две или более областей VH.[0052] As used herein, an “antigen-binding fragment” of an antibody refers to one or more antibody fragments that retain the ability to specifically bind an antigen (eg, PD-L1). It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody. Examples of binding fragments encompassed by the term “antigen binding fragment” of an antibody include (i) a Fab fragment consisting of the VH , VL , CL, and CH1 domains; (ii) fragment F(ab′) 2 containing two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) a Fab′ fragment consisting of the V H , V L , C L and C H1 domains and the region between the CH1 and CH2 domains; (iv) Fd fragment consisting of VH and CH1 domains; (v) a single-chain Fv fragment consisting of the V H and V L domains of one arm of the antibody, (vi) a dAb fragment (Ward et al., Nature, 1989) consisting of a V H domain; and (vii) a dedicated complementarity determining region (CDR) or a combination of two or more dedicated CDRs, which may optionally be connected by a synthetic linker; (VIII) a “diabody” containing V H and V L joined in the same polypeptide chain by a short linker (see, for example, patent documents EP 404,097; WO 93/11161; and Holliger et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1993); (ix) a “domain antibody fragment” containing only VH or VL , where in some cases two or more VH regions are covalently linked.
[0053] Антитела могут быть поликлональными или моноклональными; ксеногенными, аллогенными или сингенными; или их модифицированными формами (например, гуманизированными, химерными или полиспецифическими). Антитела также могут быть полностью человеческими. [0053] Antibodies can be polyclonal or monoclonal; xenogeneic, allogeneic or syngeneic; or modified forms thereof (eg, humanized, chimeric or polyspecific). Antibodies can also be entirely human.
[0054] В контексте настоящего документа «каркас» или «FR» относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельной области (CDR).[0054] As used herein, “framework” or “FR” refers to variable domain residues other than hypervariable region residues (CDR).
[0055] «Область кристаллизующегося фрагмента» или «Fc-область» относится к C-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fc-области с нативной последовательностью и вариантные области Fc. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG обычно определена как лежащая от аминокислотного остатка в положении Cys226, или от Pro230, до его карбоксильного конца, где нумерация соответствует индексу EU Кабат (Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 2000). С-концевой лизин (остаток 447 согласно индексу EU Кабат) Fc-области может быть удален, например, во время продуцирования или очистки антитела или путем генетической модификации нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Соответственно, композиция интактных антител может включать популяции антител с полностью удаленными остатками K447, популяции антител, в которых не удалены остатки K447, и популяции антител, содержащие смесь антител с остатком K447 и без него. Подходящие Fc-области с нативной последовательностью для применения в антителах согласно изобретению включают человеческий IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 и IgG4.[0055] A “crystallizable fragment region” or “Fc region” refers to the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain, including native sequence Fc regions and variant Fc regions. Although the boundaries of the Fc region of the immunoglobulin heavy chain can vary, the Fc region of the human IgG heavy chain is generally defined as lying from the amino acid residue at position Cys226, or Pro230, to its carboxyl terminus, where the numbering corresponds to the EU Kabat index (Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 2000). The C-terminal lysine (residue 447 according to the EU Kabat index) of the Fc region can be removed, for example, during production or purification of the antibody or by genetic modification of the nucleic acid encoding the heavy chain of the antibody. Accordingly, an intact antibody composition may include antibody populations with K447 residues completely deleted, antibody populations in which K447 residues have not been deleted, and antibody populations containing a mixture of antibodies with and without K447 residue. Suitable native sequence Fc regions for use in antibodies of the invention include human IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 and IgG4.
[0056] «Fc-рецептор» или «FcR» относится к рецептору, который связывается с Fc-областью антитела.[0056] "Fc receptor" or "FcR" refers to a receptor that binds to the Fc region of an antibody.
[0057] В контексте настоящего документа «выделенное антитело» относится к антителу, по существу свободному от его естественного окружения. Например, выделенное антитело практически не содержит клеточного материала и других белков из клеточного или тканевого источника, из которого оно получено. «Выделенное антитело» также относится к антителу, которое по существу не содержит других антител, обладающих другой антигенной специфичностью. В данном случае выделенное антитело, которое специфически связывает PD-L1, по существу не содержит антител, специфически связывающих антигены, отличные от PD-L1. Однако выделенное антитело, которое специфически связывает PD-L1, может иметь перекрестную реактивность с другими антигенами, такими как молекулы PD-L1 других видов.[0057] As used herein, “isolated antibody” refers to an antibody substantially free from its natural environment. For example, an isolated antibody contains substantially no cellular material or other proteins from the cellular or tissue source from which it is derived. "Isolated antibody" also refers to an antibody that is substantially free of other antibodies having a different antigenic specificity. Here, the isolated antibody that specifically binds PD-L1 is substantially free of antibodies that specifically bind antigens other than PD-L1. However, an isolated antibody that specifically binds PD-L1 may have cross-reactivity with other antigens, such as PD-L1 molecules from other species.
[0058] В контексте настоящего документа «моноклональное антитело» относится к препарату молекул антитела с одним типом молекулы в составе. Композиция моноклонального антитела демонстрирует единственную специфичность связывания и аффинность к определенному эпитопу.[0058] As used herein, “monoclonal antibody” refers to a preparation of antibody molecules with one type of molecule in the composition. A monoclonal antibody composition exhibits a single binding specificity and affinity for a particular epitope.
[0059] В контексте настоящего документа «гуманизированное антитело» относится к антителу, состоящему из CDR антител, полученных от млекопитающих, отличных от человека, и области FR и константной области человеческого антитела или полученных из человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит вариабельный домен, который имеет аминокислотную последовательность вариабельной области, которая, в целом, ближе к человеческой, чем к другим видам, по оценке с использованием инструмента DomainGapAlign от Immunogenetics Information System (IMGT), как описано Ehrenmann et al. (2010). В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело может быть использовано в качестве эффективного компонента терапевтического агента из-за пониженной антигенности. В контексте настоящего документа термин «терапевтический агент» или «терапевтически активный агент» относится к агенту, который является терапевтически пригодным. Терапевтический агент может представлять собой любой агент для предупреждения, облегчения или лечения заболеваний, физиологического состояния, симптома или для их оценки или диагностики.[0059] As used herein, “humanized antibody” refers to an antibody consisting of the CDR of an antibody derived from a non-human mammal and the FR region and constant region of a human antibody or derived from a human antibody. In some embodiments, a humanized antibody comprises a variable domain that has a variable region amino acid sequence that is generally closer to human than to other species, as assessed using the DomainGapAlign tool from the Immunogenetics Information System (IMGT), as described by Ehrenmann et al . (2010). In some embodiments, a humanized antibody may be used as an effective component of a therapeutic agent due to reduced antigenicity. As used herein, the term “therapeutic agent” or “therapeutically active agent” refers to an agent that is therapeutically useful. A therapeutic agent can be any agent for the prevention, amelioration, or treatment of a disease, physiological condition, symptom, or for the evaluation or diagnosis thereof.
[0060] В контексте настоящего документа «человеческое антитело» включает антитела, имеющие вариабельные области, в которых как каркасная область, так и области CDR получены из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Кроме того, если антитело содержит константную область, эта константная область также получена из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие антитела согласно изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo). Однако термин «человеческое антитело» в контексте настоящего документа не подразумевает антитела, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии другого вида млекопитающих, такого как мышь, были привиты на человеческие каркасные последовательности.[0060] As used herein, “human antibody” includes antibodies having variable regions in which both the framework region and the CDR regions are derived from human germline immunoglobulin sequences. In addition, if the antibody contains a constant region, the constant region is also derived from human germline immunoglobulin sequences. Human antibodies of the invention may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (eg, mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or somatic mutation in vivo). However, the term “human antibody” as used herein does not imply antibodies in which CDR sequences derived from the germ line of another mammalian species, such as a mouse, have been grafted onto human framework sequences.
III. Описание графических материаловIII. Description of graphic materials
[0061] Фиг. 1: представляет собой обзор конструкции иллюстративных слитых белков, описанных в данной заявке, которые являются биспецифическими для мишеней CD137 и PD-L1. Иллюстративные слитые белки были созданы на основе антитела, специфичного к PD-L1 (например, антитела, тяжелые цепи которого представлены SEQ ID NO: 86, или содержат вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 77, или содержат последовательности CDR GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61) и VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62), и легкие цепи представлены SEQ ID NO: 87, или содержат вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 82, или содержат последовательности CDR QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2) и QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64)), и одного или более мутеинов липокалина, специфичных к CD137 (например, мутеина липокалина с SEQ ID NO: 42). Один или более мутеинов липокалина были генетически слиты с C- и/или N-концом тяжелой цепи либо легкой цепи PD-L1-специфического антитела, как показано на фиг. 1A-1I, в результате чего были получены слитые белки, например, SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87 и SEQ ID NO: 90 и 91. Полученные слитые белки могут быть бивалентными к CD137 (например, как продемонстрировано на фиг. 1A-1D), или четырехвалентными к CD137 (например, как продемонстрировано на фиг. 1E-1H), или иметь даже более высокую валентность к CD137 (например, как продемонстрировано на фиг. 1I). Дополнительные моноспецифические слитые белки были получены путем слияния одного или более CD137-специфических мутеинов липокалина (например, как продемонстрировано на фиг. 1J-1K) с С-концом Fc-области антитела, полученного, как описано в настоящем документе, посредством пептидного линкера. Полученные моноспецифические слитые белки представлены, например, в SEQ ID NO: 88 и SEQ ID NO: 89.[0061] FIG. 1: is an overview of the design of exemplary fusion proteins described herein that are bispecific for the targets CD137 and PD-L1. Exemplary fusion proteins were generated from an antibody specific for PD-L1 (e.g., antibodies whose heavy chains are represented by SEQ ID NO: 86, or contain the heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 77, or contain the CDR sequences GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2; SEQ ID NO: 61) and VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62), and the light chains represented by SEQ ID NO: 87, or contain the heavy chain variable domain SEQ ID NO: 82, or contain the CDR sequences QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), and QQSNWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64)), and one or more CD137-specific lipocalin muteins (e.g., lipocalin mutein SEQ ID NO: 42). One or more lipocalin muteins have been genetically fused to the C- and/or N-terminus of a PD-L1-specific antibody heavy chain or light chain, as shown in FIG. 1A-1I, resulting in fusion proteins such as SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NO: 94 and 87 and SEQ ID NOs: 90 and 91. The resulting fusion proteins may be CD137 bivalent (eg, as demonstrated in FIGS. 1A-1D), or CD137 tetravalent (eg, as demonstrated in FIGS. 1E-1H), or have an even higher valence to CD137 (eg, as demonstrated in Fig. 1I). Additional monospecific fusion proteins were produced by fusing one or more CD137-specific lipocalin muteins (eg, as demonstrated in Fig. 1J-1K) to the C-terminus of the Fc region of an antibody prepared as described herein via a peptide linker. The resulting monospecific fusion proteins are shown, for example, in SEQ ID NO: 88 and SEQ ID NO: 89.
[0062] Фиг. 2: демонстрирует результаты экспериментов ELISA, в которых связывание с PD-L1 или CD137 иллюстративных слитых белков определяли, как описано в примере 4. PD-L1 или CD137 (с C-концевой меткой His или Fc) наносили на планшет для микротитрования и титровали тестируемые агенты, начиная с наивысшей концентрации 100 нМ. Изучаемые связанные агенты детектировали с помощью антител к человеческому IgG Fc-HRP или к NGAL-HRP, соответственно. Данные аппроксимировали моделью связывания 1:1 со значением EC50 и максимальным сигналом в качестве свободных параметров, и угловым коэффициентом, который был установлен равным единице. Полученные значения EC50 представлены в таблице 4.[0062] FIG. 2: Shows the results of ELISA experiments in which binding to PD-L1 or CD137 of exemplary fusion proteins was determined as described in Example 4. PD-L1 or CD137 (with a C-terminal His or Fc tag) was applied to a microtiter plate and titrated to test agents starting at the highest concentration of 100 nM. The bound agents studied were detected using anti-human IgG Fc-HRP or anti-NGAL-HRP antibodies, respectively. The data were fitted to a 1:1 binding model with EC 50 and maximum signal as free parameters, and the slope was set to one. The obtained EC 50 values are presented in Table 4.
[0063] Фиг. 3: иллюстрирует результаты эксперимента ELISA, в котором определяли способность иллюстративных слитых белков одновременно связывать обе мишени, PD-L1 и CD137, как описано в примере 5. Рекомбинантный huPD-L1-His или huCD137-His наносили на планшет для микротитрования с последующим титрованием слитых белков, начиная с наивысшей концентрации 100 нМ. Затем добавляли постоянную концентрацию биотинилированного huCD137-His или биотинилированного huPD-L1-His, соответственно, которые детектировали с помощью ExtrAvidin-пероксидазы.[0063] FIG. 3: Illustrates the results of an ELISA experiment in which the ability of exemplary fusion proteins to simultaneously bind both targets, PD-L1 and CD137, as described in Example 5 was determined. Recombinant huPD-L1-His or huCD137-His was applied to a microtiter plate followed by titration of the fusions proteins, starting with the highest concentration of 100 nM. A constant concentration of biotinylated huCD137-His or biotinylated huPD-L1-His, respectively, was then added and detected using ExtrAvidin peroxidase.
[0064] Фиг. 4: демонстрирует результаты оценки связывания с мишенью слитых белков с помощью проточной цитометрии с использованием клеток Flp-In-CHO, экспрессирующих CD137 человека или яванского макака (фиг. 4A-4B), а также PD-L1 человека или яванского макака (фиг. 4C-4D), как описано в примере 6. Связывание не наблюдалось при использовании ложно трансфицированных клеток Flp-In-CHO (фиг. 4E). Средние геометрические значения интенсивности флуоресценции использовали для расчета значений EC50 с использованием нелинейной регрессии (общая нижняя асимптота, наклон =1). Значения EC50 представлены в таблице 6.[0064] FIG. 4: Shows results of flow cytometry assessment of target binding of fusion proteins using Flp-In-CHO cells expressing human or cynomolgus CD137 (Figures 4A-4B) and human or cynomolgus PD-L1 (Figure 4C -4D) as described in Example 6. No binding was observed using mock-transfected Flp-In-CHO cells (Fig. 4E). Geometric mean fluorescence intensities were used to calculate EC 50 values using nonlinear regression (overall lower asymptote, slope = 1). EC 50 values are presented in Table 6.
[0065] Фиг. 5: демонстрирует связывание слитых белков с PD-L1-положительными опухолевыми клетками, оцененное с помощью проточной цитометрии путем инкубации клеток РКО и слитых белков, как описано в примере 7.[0065] FIG. 5: Demonstrates binding of fusion proteins to PD-L1 positive tumor cells assessed by flow cytometry by incubating PKO cells and fusion proteins as described in Example 7.
[0066] Фиг. 6: демонстрирует примеры эксперимента на основе SPR с мультисвязыванием, предназначенного для исследования того, затрудняет ли связывание CD137L с CD137 взаимодействия слитого белка с CD137, как описано в примере 8. Это оценивают путем создания комплекса huCD137 (C-концевое слияние с Fc) и huCD137L (с C-концевой His-меткой) на сенсорном чипе SPR и проверки того, могут ли слитые белки по-прежнему связывать комплекс huCD137 и CD137L. Для сравнения, huCD137 в отсутствие huCD137L также инкубируют с тестируемыми слитыми белками. Кривая SPR для связывания соответствующего слитого белка только с huCD137 отмечена стрелкой со сплошным стержнем. Кривая SPR для связывания соответствующего слитого белка с huCD137, насыщенного huCD137L, отмечена стрелкой с пунктирным стержнем. В качестве контролей использовали холостые введения без слитых белков. Эксперимент показывает, что все протестированные слитые белки способны связывать CD137 в присутствии CD137L.[0066] FIG. 6: shows examples of a multi-binding SPR experiment designed to examine whether binding of CD137L to CD137 impairs the interactions of the fusion protein with CD137 as described in Example 8. This is assessed by creating a complex of huCD137 (C-terminal Fc fusion) and huCD137L (with a C-terminal His tag) on the SPR sensor chip and testing whether the fusion proteins could still bind the huCD137 and CD137L complex. For comparison, huCD137 in the absence of huCD137L was also incubated with the test fusion proteins. The SPR curve for binding of the corresponding fusion protein to huCD137 alone is indicated by a solid arrow. The SPR curve for binding of the corresponding huCD137 fusion protein saturated with huCD137L is indicated by a dotted arrow. Blank injections without fusion proteins were used as controls. The experiment shows that all fusion proteins tested are able to bind CD137 in the presence of CD137L.
[0067] Фиг. 7: демонстрирует, что слитые белки конкурируют с PD-L1 за связывание с PD-1, как проиллюстрировано в исследованиях методом конкурентного ELISA, как описано в примере 9. Постоянную концентрацию huPD-1-His наносили на планшет для микротитрования с последующим добавлением смеси тестируемых молекул в различных концентрациях и индикатора huPD-L1-Fc в фиксированной концентрации. Связанный индикатор детектировали с использованием меченого HRP антитела к Fc IgG. Наблюдали дозозависимое ингибирование связывания huPD-L1-Fc с PD-1 биспецифическими слитыми белками к CD137 и PD-L1 или специфическими антителами к PD-L1.[0067] FIG. 7: demonstrates that the fusion proteins compete with PD-L1 for binding to PD-1, as illustrated in competitive ELISA studies as described in Example 9. A constant concentration of huPD-1-His was applied to a microtiter plate followed by the addition of the test mixture molecules at various concentrations and the huPD-L1-Fc indicator at a fixed concentration. The bound tracer was detected using an HRP-labeled anti-Fc IgG antibody. Dose-dependent inhibition of huPD-L1-Fc binding to PD-1 by bispecific fusion proteins to CD137 and PD-L1 or specific antibodies to PD-L1 was observed.
[0068] Фиг. 8: Потенциал иллюстративных слитых белков в отношении костимуляции активации Т-клеток зависимым от мишени PD-L1 образом оценивали с использованием биоанализа с CD137. Клетки NFκB-luc2/CD137 Jurkat культивировали совместно с линией опухолевых клеток RKO, экспрессирующих PD-L1, в присутствии различных концентраций слитых белков или контролей. Через 4 часа добавляли реагент для анализа люциферазы и измеряли люминесцентные сигналы. Анализ с использованием четырехпараметрической логистической кривой был выполнен с помощью GraphPad Prism® для расчета значений EC50 (см. таблицу 9). Слитые белки костимулируют активацию Т-клеток только в присутствии PD-L1 (фиг. 8A и 8C), но не в отсутствие PD-L1 (фиг. 8B и 8D). Напротив, референсное mAb к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29) демонстрирует аналогичную активацию в присутствии и в отсутствие PD-L1-положительных клеток RKO.[0068] FIG. 8: The potential of exemplary fusion proteins to costimulate T cell activation in a PD-L1 target-dependent manner was assessed using a CD137 bioassay. NFκB-luc2/CD137 Jurkat cells were cocultured with the PD-L1-expressing RKO tumor cell line in the presence of varying concentrations of fusion proteins or controls. After 4 h, luciferase assay reagent was added and luminescent signals were measured. Four-parameter logistic curve analysis was performed using GraphPad Prism ® to calculate EC 50 values (see Table 9). The fusion proteins co-stimulate T cell activation only in the presence of PD-L1 (Figures 8A and 8C) but not in the absence of PD-L1 (Figures 8B and 8D). In contrast, the reference mAb to CD137 (SEQ ID NOs: 28 and 29) shows similar activation in the presence and absence of PD-L1-positive RKO cells.
[0069] Фиг. 9: демонстрирует результаты иллюстративного эксперимента, в котором была исследована способность выбранных слитых белков индуцировать активацию Т-клеток. Антитела к PD-L1, включая соответствующее антитело к PD-L1-строительный блок, CD137-связывающие мутеины липокалина в виде слияний с Fc и референсное антитело анти-CD137, тестировали по отдельности и в комбинации в виде коктейля анти-PD-L1/анти-CD137. В эксперименте человеческие мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) инкубировали со слитыми белками, антителами, слияниями мутеина липокалина с Fc, коктейлями или контролем в присутствии 1 нг/мл стафилококкового энтеротоксина B (SEB). Уровни секретируемого интерлейкина 2 (IL-2), отражающие активацию Т-клеток, определяли с помощью анализа на основе электрохемолюминесценции в качестве считываемой величины, отражающей активацию Т-клеток, и нормировали к уровням соответствующего контрольного IgG4, как описано в примере 11. Все слитые белки способны индуцировать активацию Т-клеток, и индуцируют в большей степени или по меньшей мере сопоставимо с отдельными строительными блоками или смесью референсных антител анти-PD-L1/анти-CD137.[0069] FIG. 9: Shows the results of an illustrative experiment in which the ability of selected fusion proteins to induce T cell activation was examined. Anti-PD-L1 antibodies, including the corresponding anti-PD-L1 building block antibody, CD137-binding lipocalin muteins as Fc fusions, and the reference anti-CD137 antibody, were tested individually and in combination as an anti-PD-L1/anti cocktail. -CD137. In the experiment, human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were incubated with fusion proteins, antibodies, lipocalin mutein Fc fusions, cocktails, or control in the presence of 1 ng/ml staphylococcal enterotoxin B (SEB). Levels of secreted interleukin 2 (IL-2), reflecting T cell activation, were determined using an electrochemoluminescence-based assay as a readout value reflecting T cell activation and normalized to the levels of the corresponding control IgG4 as described in Example 11. All fusions proteins are capable of inducing T cell activation, and induce to a greater extent or at least comparable to individual building blocks or a mixture of anti-PD-L1/anti-CD137 reference antibodies.
[0070] Фиг. 10: демонстрирует способность иллюстративных слитых белков костимулировать активацию Т-клеток зависимым от мишени PD-L1 образом. Антитела к PD-L1, включая соответствующее антитело к PD-L1-строительный блок, CD137-связывающие мутеины липокалина в виде слияний с Fc и референсное антитело анти-CD137, тестировали по отдельности и в комбинации в виде коктейля анти-PD-L1/анти-CD137. Различные линии опухолевых клеток, экспрессирующие разные уровни PD-L1 (высокий: RKO; средний: HCC827; отрицательный: HepG), высевали в планшеты, покрытые антителами к человеческому CD3. Добавляли пан-T-клетки и различные концентрации слитых белков и отдельных строительных блоков и инкубировали в течение 3 дней. Уровни секретируемого IL-2 определяли с помощью анализа на основе электрохемолюминесценции, как описано в примере 12. Все слитые белки способны повышать секрецию IL-2 зависимым от PD-L1 образом. [0070] FIG. 10: Demonstrates the ability of the exemplary fusion proteins to co-stimulate T cell activation in a PD-L1 target-dependent manner. Anti-PD-L1 antibodies, including the corresponding anti-PD-L1 building block antibody, CD137-binding lipocalin muteins as Fc fusions, and the reference anti-CD137 antibody, were tested individually and in combination as an anti-PD-L1/anti cocktail. -CD137. Different tumor cell lines expressing different levels of PD-L1 (high: RKO; medium: HCC827; negative: HepG) were seeded on anti-human CD3-coated plates. Pan-T cells and various concentrations of fusion proteins and individual building blocks were added and incubated for 3 days. Levels of secreted IL-2 were determined using an electrochemoluminescence assay as described in Example 12. All fusion proteins are capable of increasing IL-2 secretion in a PD-L1 dependent manner.
[0071] Фиг. 11: иллюстрирует стабильность слитых белков при хранении в PBS или 25 мМ гистидина, 60 мМ NaCl, 200 мМ аргинина при рН 6 после 1-, 2-, 3- или 4-недельной инкубации при 37°C или 40°C в концентрации 1 мг/мл или 20 мг/мл. Стабильность оценивают по проценту пика мономеров в аналитической эксклюзионной хроматографии или по проценту найденных функциональных белков в количественном ELISA, как описано в примере 13.[0071] FIG. 11: Illustrates the stability of fusion proteins when stored in PBS or 25 mM histidine, 60 mM NaCl, 200 mM arginine at pH 6 after 1-, 2-, 3-, or 4-week incubation at 37°C or 40°C at concentration 1 mg/ml or 20 mg/ml. Stability is assessed by the percentage of monomer peak in analytical size exclusion chromatography or the percentage of functional proteins detected in a quantitative ELISA as described in Example 13.
[0072] Фиг. 12: демонстрирует способность иллюстративного слитого белка (SEQ ID NO: 90 и 87) стимулировать секрецию IL-2 в реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR) с CD4+ Т-клетками. Слитые белки, антитело к PD-L1-строительный блок (SEQ ID NO: 86 и 87), CD137-связывающий мутеин липокалина в виде слияния с Fc (SEQ ID NO: 89) и референсное антитело к CD137 или референсное антитело к PD-L1, по отдельности или в комбинации в виде коктейля анти-PD-L1/анти-CD137, тестировали при эквимолярных концентрациях, как описано в примере 14. Секрецию IL-2 измеряли в супернатантах спустя 6 дней инкубации с общими человеческими CD4+ Т-клетками и моноцитарными дендритными клетками (moDC) от разных здоровых доноров. Фиг. 12A иллюстрирует, что слитый белок с последовательностями SEQ ID NO: 90 и 87 показал значительное повышение секреции IL-2 по сравнению с строительным блоком по отдельности (антитело к PD-L1 с последовательностями SEQ ID NO: 86 и 87 или CD137-специфический мутеин липокалина с последовательностью SEQ ID NO: 89) и референсным антителом к PD-L1 или к CD137 (SEQ ID NO: 26 и 27 или SEQ ID NO: 28 и 29, соответственно), при эквимолярных концентрациях (эквивалентных 10 или 0,1 мкг/мл тестируемого слитого белка). Приведены данные из 8 независимых экспериментов. Фиг. 12B демонстрирует, что слитый белок с последовательностями SEQ ID NO: 90 и 87 был способен индуцировать дозозависимую секрецию IL-2 в диапазоне концентраций от 0,001 до 20 мкг/мл. Уровни IL-2, индуцированные слитым белком, были выше по сравнению с эквимолярными концентрациями коктейля из референсного антитела к PD-L1 (SEQ ID NO: 26 и 27) и референсного антитела к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29). Показаны данные для иллюстративного донора.[0072] FIG. 12: Demonstrates the ability of the exemplary fusion protein (SEQ ID NOs: 90 and 87) to stimulate IL-2 secretion in a mixed lymphocyte culture reaction (MLR) with CD4 + T cells. Fusion proteins, anti-PD-L1 building block antibody (SEQ ID NOs: 86 and 87), CD137-binding lipocalin mutein Fc fusion (SEQ ID NO: 89) and reference anti-CD137 antibody or reference anti-PD-L1 antibody , alone or in combination as an anti-PD-L1/anti-CD137 cocktail, were tested at equimolar concentrations as described in Example 14. IL-2 secretion was measured in supernatants after 6 days of incubation with total human CD4 + T cells and monocytic dendritic cells (moDC) from different healthy donors. Fig. 12A illustrates that the fusion protein with SEQ ID NOs: 90 and 87 showed a significant increase in IL-2 secretion compared to the building block alone (anti-PD-L1 antibody with SEQ ID NOs: 86 and 87 or CD137-specific lipocalin mutein with the sequence SEQ ID NO: 89) and a reference antibody to PD-L1 or CD137 (SEQ ID NOs: 26 and 27 or SEQ ID NO: 28 and 29, respectively), at equimolar concentrations (equivalent to 10 or 0.1 μg/ ml of test fusion protein). Data from 8 independent experiments are presented. Fig. 12B demonstrates that the fusion protein with the sequences SEQ ID NO: 90 and 87 was able to induce dose-dependent secretion of IL-2 in the concentration range from 0.001 to 20 μg/ml. IL-2 levels induced by the fusion protein were higher compared to equimolar concentrations of a cocktail of reference anti-PD-L1 antibody (SEQ ID NOs: 26 and 27) and reference anti-CD137 antibody (SEQ ID NOs: 28 and 29). Data are shown for an illustrative donor.
[0073] Фиг. 13: демонстрирует способность иллюстративного слитого белка (SEQ ID NO: 90 и 87) индуцировать секрецию эффекторных молекул CD8+ Т-клеток. Слитый белок культивировали с moDC и CD8+ Т-клетками от несовместимых здоровых доноров в течение 6 дней, после чего количественно определяли секрецию IL-2 и эффекторных молекул CD8+ Т-клеток в супернатантах с использованием анализа Luminex, как описано в примере 15. Слитый белок с последовательностями SEQ ID NO: 90 и 87 показал повышение секреции IL-2 и цитотоксических факторов (перфорин, гранзим B и гранзим A) при 10 мкг/мл по сравнению с референсным антителом к PD-L1 (SEQ ID NO: 26 и 27) и референсным антителом к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29), при использовании по отдельности или в виде коктейля. [0073] FIG. 13: Demonstrates the ability of the exemplary fusion protein (SEQ ID NOs: 90 and 87) to induce the secretion of CD8 + T cell effector molecules. The fusion protein was cultured with moDC and CD8 + T cells from unmatched healthy donors for 6 days, after which the secretion of IL-2 and CD8 + T cell effector molecules in the supernatants was quantified using the Luminex assay as described in Example 15. Fusion protein with SEQ ID NOs: 90 and 87 showed increased secretion of IL-2 and cytotoxic factors (perforin, granzyme B and granzyme A) at 10 μg/ml compared to the reference anti-PD-L1 antibody (SEQ ID NOs: 26 and 27 ) and the reference antibody to CD137 (SEQ ID NOs: 28 and 29), when used alone or as a cocktail.
[0074] Фиг. 14: демонстрирует, что слитые белки связывают перекрывающиеся эпитопы с клинически активным антителом к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29), как проиллюстрировано в исследованиях методом конкурентного ELISA, как описано в примере 17. Постоянную концентрацию SEQ ID NO: 28 и 29 наносили на планшет для микротитрования с последующим добавлением смеси тестируемых молекул в различных концентрациях и индикатора биотинилированного huCD137-Fc в фиксированной концентрации. Связанный индикатор детектировали с использованием ExtrAvidin-пероксидазы. Слитые белки конкурируют с антителом к CD137 за связывание с CD137.[0074] FIG. 14: demonstrates that the fusion proteins bind overlapping epitopes to the clinically active anti-CD137 antibody (SEQ ID NOs: 28 and 29), as illustrated in competitive ELISA studies as described in Example 17. A constant concentration of SEQ ID NOs: 28 and 29 was applied onto a microtiter plate followed by the addition of a mixture of test molecules at various concentrations and the biotinylated huCD137-Fc indicator at a fixed concentration. The bound indicator was detected using ExtrAvidin peroxidase. The fusion proteins compete with the anti-CD137 antibody for binding to CD137.
[0075] Фиг. 15: демонстрирует потенциал иллюстративных слитых белков блокировать ингибирующий сигнал, опосредованный взаимодействием PD-1/PD-L1, оцененный с использованием биоанализа блокады PD-1/PD-L1, как описано в примере 18. T-клетки PD-1-NFAT-luc Jurkat (линия клеток Jurkat, экспрессирующая PD-1 и NFAT-опосредованный ген люциферазы под контролем промотора NFAT) культивировали совместно с клетками PD-L1 aAPC/CHO-K1 в присутствии различных концентраций тестируемых молекул. Через 6 часов добавляли реагент для анализа люциферазы и измеряли люминесцентные сигналы. Фоновый сигнал представляет собой Т-клетки PD-1-NFAT-luc Jurkat, культивируемые только совместно с клетками PD-L1 aAPC/CHO-K1. Слитый белок с последовательностями SEQ ID NO: 90 и 87 блокирует сигнальный путь PD-1/PD-L1 на уровне, сопоставимом с протестированными антителами к PD-L1, включая антитело к PD-L1-строительный блок, представленное в SEQ ID NO: 86 и 87, и референсное антитело к PD-L1, представленное в SEQ ID NO: 26 и 27.[0075] FIG. 15: Demonstrates the potential of the exemplary fusion proteins to block an inhibitory signal mediated by the PD-1/PD-L1 interaction, assessed using a PD-1/PD-L1 blockade bioassay as described in Example 18. PD-1-NFAT-luc T Cells Jurkat (a Jurkat cell line expressing PD-1 and the NFAT-mediated luciferase gene under the control of the NFAT promoter) was co-cultured with PD-L1 aAPC/CHO-K1 cells in the presence of various concentrations of test molecules. After 6 h, luciferase assay reagent was added and luminescent signals were measured. The background is PD-1-NFAT-luc Jurkat T cells co-cultured with PD-L1 aAPC/CHO-K1 cells only. The fusion protein of SEQ ID NOs: 90 and 87 blocks the PD-1/PD-L1 signaling pathway at levels comparable to tested anti-PD-L1 antibodies, including the anti-PD-L1 building block antibody shown in SEQ ID NO: 86 and 87, and the reference anti-PD-L1 antibody shown in SEQ ID NOs: 26 and 27.
[0076] Фиг. 16: демонстрирует способность иллюстративного слитого белка индуцировать активацию Т-клеток. Также были протестированы антитело к PD-L1-строительный блок и референсное антитело к CD137 при использовании по отдельности и в комбинации с антителом к PD-L1. В эксперименте человеческие МНПК инкубировали со слитым белком, антителами, коктейлями или контролем в присутствии 0,1 нг/мл SEB. Уровни секретируемого IL-2 определяли с помощью анализа на основе электрохемилюминесценции в качестве считываемой величины, отражающей активацию Т-клеток, как описано в примере 19 и изображено на фиг. 16A. Фиг. 16B демонстрирует кратность повышения уровней секреции IL-2, индуцированного тестируемыми молекулами, по сравнению с уровнем фоновой секреции IL-2 (МНПК стимулировали с помощью 0,1 нг/мл SEB и без каких-либо тестируемых молекул). Слитый белок вызывает дозозависимое повышение секреции IL-2 на уровне, превышающем антитело к PD-L1 или антитело к CD137, по отдельности или в комбинации.[0076] FIG. 16: Demonstrates the ability of an exemplary fusion protein to induce T cell activation. An anti-PD-L1 building block antibody and a reference anti-CD137 antibody were also tested when used alone and in combination with an anti-PD-L1 antibody. In the experiment, human PBMCs were incubated with fusion protein, antibodies, cocktails, or control in the presence of 0.1 ng/ml SEB. Levels of secreted IL-2 were determined using an electrochemiluminescence-based assay as a readout value reflecting T cell activation as described in Example 19 and depicted in FIG. 16A. Fig. 16B shows the fold increase in IL-2 secretion levels induced by test molecules compared to background IL-2 secretion levels (PBMCs stimulated with 0.1 ng/ml SEB and without any test molecules). The fusion protein causes a dose-dependent increase in IL-2 secretion at levels greater than anti-PD-L1 or anti-CD137, alone or in combination.
[0077] Фиг. 17: демонстрирует способность иллюстративного слитого белка осуществлять костимуляцию активации Т-клеток в присутствии PD-L1. Параллельно тестировали антитело к PD-L1-строительный блок, референсное антитело к CD137 и коктейль из антитела к CD137 и референсного антитела к PD-L1. Клетки СНО, трансфицированные человеческим PD-L1 (фиг. 17A) или ложно трансфицированные (отрицательные по человеческому PD-L1, фиг. 17B), высевали в планшеты, покрытые антителом к человеческому CD3. Добавляли пан-T-клетки, а также различные концентрации тестируемых молекул, и инкубировали в течение 2 дней. Уровни секретируемого IL-2 в супернатанте определяли с помощью анализа на основе электрохемолюминесценции, как описано в примере 20. Уровни секреции IL-2 были нормированы к фоновым уровням (пан-T-клетки + анти-CD3 + клетки CHO), чтобы отобразить кратность повышения секреции IL-2 в присутствии клеток CHO, экспрессирующих человеческий PD-L1 (фиг. 17C), или ложно трансфицированных клеток CHO (фиг. 17D). Слитый белок индуцирует сильное дозозависимое повышение секреции IL-2 только в присутствии PD-L1, на уровне, превышающем референсное антитело к CD137 по отдельности или в комбинации с референсным антителом к PD-L1.[0077] FIG. 17: Demonstrates the ability of an exemplary fusion protein to co-stimulate T cell activation in the presence of PD-L1. In parallel, we tested an anti-PD-L1 building block antibody, a reference anti-CD137 antibody, and a cocktail of an anti-CD137 antibody and a reference anti-PD-L1 antibody. CHO cells transfected with human PD-L1 (Fig. 17A) or mock transfected (negative for human PD-L1, Fig. 17B) were seeded on plates coated with anti-human CD3 antibody. Pan-T cells were added, as well as various concentrations of test molecules, and incubated for 2 days. Levels of secreted IL-2 in the supernatant were determined using an electrochemiluminescence-based assay as described in Example 20. Levels of IL-2 secretion were normalized to background levels (pan-T cells + anti-CD3 + CHO cells) to reflect the fold increase IL-2 secretion in the presence of CHO cells expressing human PD-L1 (Fig. 17C) or mock-transfected CHO cells (Fig. 17D). The fusion protein induces a strong dose-dependent increase in IL-2 secretion only in the presence of PD-L1, at levels above the reference CD137 antibody alone or in combination with the reference PD-L1 antibody.
[0078] Фиг. 18: демонстрирует результат фармакокинетических анализов биспецифических слитых белков и антитела к PD-L1-строительного блока (SEQ ID NO: 86 и 87) у мышей, как описано в примере 21. Самцам мышей CD-1 (3 мыши на временную точку) внутривенно вводили слитые белки в дозе 10 мг/кг. Уровни лекарственного средства определяли с помощью сэндвич-ELISA, детектируя целую молекулу посредством мишеней PD-L1 и CD137. Уровни антител к PD-L1 в плазме определяли с использованием сэндвич-ELISA с мишенями PD-L1 и человеческим Fc. [0078] FIG. 18: Shows the result of pharmacokinetic assays of bispecific fusion proteins and anti-PD-L1 building block antibodies (SEQ ID NOs: 86 and 87) in mice as described in Example 21. Male CD-1 mice (3 mice per time point) were intravenously administered fusion proteins at a dose of 10 mg/kg. Drug levels were determined using a sandwich ELISA, detecting the whole molecule through the targets PD-L1 and CD137. Plasma anti-PD-L1 antibody levels were determined using a sandwich ELISA targeting PD-L1 and human Fc.
[0079] Фиг. 19: демонстрирует результаты фармакокинетического анализа иллюстративного слитого белка (SEQ ID NO: 90 и 87) по сравнению с двумя ранее описанными CD137- и PD-L1-связывающими слитыми белками (SEQ ID NO: 147 и SEQ ID NO: 148) у мышей, как описано в примере 22. Самцам мышей CD-1 (2 мыши на временную точку) внутривенно вводили тестируемые молекулы в дозе 2 мг/кг. Уровни лекарственного средства определяли с помощью ELISA в указанных временных точках. Данные были нанесены на график зависимости концентрации от времени. SEQ ID NO: 90 и 87, описанный в настоящем документе, но не SEQ ID NO: 147 или SEQ ID NO: 148, демонстрирует благоприятный фармакокинетический профиль или антителоподобную фармакокинетику.[0079] FIG. 19: Shows the results of a pharmacokinetic analysis of an exemplary fusion protein (SEQ ID NO: 90 and 87) compared to two previously described CD137- and PD-L1-binding fusion proteins (SEQ ID NO: 147 and SEQ ID NO: 148) in mice, as described in Example 22. Male CD-1 mice (2 mice per time point) were intravenously administered test molecules at a dose of 2 mg/kg. Drug levels were determined by ELISA at the indicated time points. The data were plotted on a graph of concentration versus time. SEQ ID NOs: 90 and 87 described herein, but not SEQ ID NO: 147 or SEQ ID NO: 148, demonstrate a favorable pharmacokinetic profile or antibody-like pharmacokinetics.
IV. Подробное описание изобретенияIV. Detailed Description of the Invention
[0080] Как описано в настоящем документе, настоящее изобретение включает установление того, что бивалентной CD137-связывающей молекулы, такой как антитело, самой по себе может быть недостаточно для кластеризации CD137 на Т-клетках или NK-клетках и обеспечения эффективной активации, подобно отсутствию активности трехвалентного растворимого CD137L. В недавних публикациях с использованием доклинических моделей на мышах in vivo были представлены доказательства того, что механизм действия других антител к TNFR требует взаимодействия антител посредством их Fc-части с Fc-гамма-рецепторами на клетках, экспрессирующих Fc-гамма-рецепторы (Bulliard et al., Immunol Cell Biol, 2014, Bulliard et al., J Exp Med, 2013). Таким образом, в механизме действия этих антител к TNFR может преобладать нецелевая кластеризация посредством Fc-гамма-рецепторов, в зависимости от присутствия клеток, экспрессирующих Fc-гамма-рецептор, который не обязательно может быть сверхэкспрессирован в микроокружении опухоли-мишени по сравнению с нормальными тканями. [0080] As described herein, the present invention includes the recognition that a bivalent CD137-binding molecule, such as an antibody, by itself may not be sufficient to cluster CD137 on T cells or NK cells and provide effective activation, similar to the absence of activity of trivalent soluble CD137L. Recent publications using preclinical in vivo mouse models have provided evidence that the mechanism of action of other anti-TNFR antibodies requires interaction of the antibodies through their Fc moiety with Fc gamma receptors on cells expressing Fc gamma receptors (Bulliard et al ., Immunol Cell Biol, 2014, Bulliard et al., J Exp Med, 2013). Thus, the mechanism of action of these TNFR antibodies may be dominated by off-target clustering through Fc-gamma receptors, depending on the presence of cells expressing the Fc-gamma receptor, which may not necessarily be overexpressed in the target tumor microenvironment compared to normal tissues .
[0081] Таким образом, существует неудовлетворенная потребность в создании терапевтических средств, которые кластеризуют и активируют CD137 со специфическим, нацеленным на опухоль механизмом действия. [0081] Thus, there is an unmet need to create therapeutics that cluster and activate CD137 with a specific, tumor-targeting mechanism of action.
[0082] Для удовлетворения этой неудовлетворенной потребности в настоящем описании предложены, среди прочего, новые подходы для одновременного связывания CD137 и PD-L1 с помощью одного или более слитых белков, обладающих специфичностью связывания с CD137 и специфичностью связывания с PD-L1.Предложенные слитые белки разработаны для способствования кластеризации CD137 путем соединения CD137-положительных Т-клеток с PD-L1, экспрессируемым в микроокружении опухоли. Такие биспецифические молекулы могут сочетать CD137-индуцированную активацию и экспансию Т-клеток с блокадой иммунных контрольных точек, опосредованной анти-PD-L1, и, таким образом, могут преодолевать определенные ограничения монотерапии и обеспечивать преимущества, например, для резистентных или невосприимчивых пациентов. Слитые белки также разработаны для обеспечения возможностей комбинированной терапии в одной молекуле, и в то же время позволяют осуществлять локализованную индукцию антигенспецифических Т-клеток в микроокружении опухоли, потенциально снижая периферическую токсичность.[0082] To address this unmet need, the present disclosure provides, among other things, novel approaches for simultaneously binding CD137 and PD-L1 using one or more fusion proteins having CD137 binding specificity and PD-L1 binding specificity. Proposed Fusion Proteins designed to promote CD137 clustering by linking CD137-positive T cells to PD-L1 expressed in the tumor microenvironment. Such bispecific molecules may combine CD137-induced T cell activation and expansion with anti-PD-L1-mediated immune checkpoint blockade and thus may overcome certain limitations of monotherapy and provide benefits, for example, to resistant or refractory patients. Fusion proteins are also designed to provide combination therapy capabilities in a single molecule, while allowing localized induction of antigen-specific T cells in the tumor microenvironment, potentially reducing peripheral toxicity.
[0083] В некоторых аспектах настоящего изобретения предложены слитые белки, связывающие CD137 и PD-L1, а также способы и их полезные применения. В изобретении также предложены способы получения слитых белков, связывающих CD137 и PD-L1, описанных в настоящем документе, а также композиции, содержащие такие белки. Слитые белки, связывающие CD137 и PD-L1, согласно изобретению, а также содержащие их композиции могут быть использованы в способах обнаружения CD137 и/или PD-L1 в образце, в способах связывания CD137 и/или PD-L1 у субъекта, или в способах модуляции иммунных ответов у субъекта. Подобные слитые белки, обладающие этими характеристиками, соответствующими применениям, предусмотренным настоящим изобретением, ранее не были описаны. В отличие от слитых белков, предложенных в настоящем документе, ранее известные слитые белки, нацеленные как на CD137, так и на PD-L1, имели один или более из следующих недостатков: плохая фармакокинетика, неприемлемая степень нецелевого связывания, сниженная или иным образом ухудшенная способность связывать одну или обе мишени отдельно взятого слитого белка (например, PD-L1 и/или CD137) и/или неприемлемая степень неспецифической (например, независимой от PD-L1) активации, например, иммунной системы.[0083] Some aspects of the present invention provide fusion proteins that bind CD137 and PD-L1, as well as methods and useful applications thereof. The invention also provides methods for producing the CD137-PD-L1 binding fusion proteins described herein, as well as compositions containing such proteins. The CD137 and PD-L1 binding fusion proteins of the invention, as well as compositions containing them, can be used in methods of detecting CD137 and/or PD-L1 in a sample, in methods of binding CD137 and/or PD-L1 in a subject, or in methods modulating immune responses in a subject. Similar fusion proteins having these characteristics relevant to the applications contemplated by the present invention have not been previously described. In contrast to the fusion proteins proposed herein, previously known fusion proteins targeting both CD137 and PD-L1 had one or more of the following disadvantages: poor pharmacokinetics, unacceptable degree of off-target binding, reduced or otherwise impaired ability bind one or both targets of a single fusion protein (eg, PD-L1 and/or CD137) and/or an unacceptable degree of nonspecific (eg, PD-L1-independent) activation of, for example, the immune system.
A. Иллюстративные слитые белки, специфичные к CD137 и PD-L1, согласно изобретению.A. Exemplary CD137 and PD-L1 specific fusion proteins of the invention.
[0084] В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок содержит по меньшей мере две субъединицы в любом порядке: (1) первую субъединицу, содержащую полноразмерный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий домен, специфичный к PD-L1, и (2) вторую субъединицу, содержащую мутеин липокалина, специфичный к CD137. [0084] In some embodiments, the proposed fusion protein contains at least two subunits in any order: (1) a first subunit containing a full-length immunoglobulin or a PD-L1-specific antigen binding domain thereof, and (2) a second subunit containing a lipocalin mutein , specific for CD137.
[0085] В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок также может содержать по меньшей мере одну дополнительную субъединицу, например, третью субъединицу. Например, слитый белок может содержать третью субъединицу, специфичную к CD137. В некоторых вариантах осуществления третья субъединица может представлять собой или содержать мутеин липокалина, специфичный к CD137. Например, два мутеина липокалина могут быть слиты с первой субъединицей иммуноглобулина, один на С-конце и один на N-конце иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления мутеины липокалина могут быть слиты с тяжелой цепью или легкой цепью иммуноглобулина. [0085] In some embodiments, the proposed fusion protein may also contain at least one additional subunit, such as a third subunit. For example, the fusion protein may contain a third subunit specific for CD137. In some embodiments, the third subunit may be or comprise a CD137-specific lipocalin mutein. For example, two lipocalin muteins can be fused to the first immunoglobulin subunit, one at the C-terminus and one at the N-terminus of the immunoglobulin. In some embodiments, lipocalin muteins may be fused to an immunoglobulin heavy chain or light chain.
[0086] В некоторых вариантах осуществления предложенные слитые белки могут содержать одну или более дополнительных субъединиц (например, четвертую, пятую или шестую субъединицу).[0086] In some embodiments, the proposed fusion proteins may contain one or more additional subunits (eg, a fourth, fifth, or sixth subunit).
[0087] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна субъединица может быть слита на ее N-конце и/или ее С-конце с другой субъединицей. [0087] In some embodiments, at least one subunit may be fused at its N-terminus and/or its C-terminus to another subunit.
[0088] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна субъединица может быть связана с другой субъединицей посредством линкера. В некоторых дополнительных вариантах осуществления линкер представляет собой пептидный линкер, например, неструктурированный глицин-сериновый (GS) линкер, гликозилированный GS линкер или пролин-аланин-сериновый полимерный (PAS) линкер. В некоторых вариантах осуществления GS линкер представляет собой линкер (Gly4Ser)3 ((G4S)3), представленный в SEQ ID NO: 13. Другие иллюстративные линкеры представлены в SEQ ID NO: 14-23. В некоторых вариантах осуществления пептидный линкер может содержать от 1 до 50 аминокислот, например, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот. Например, когда первая субъединица содержит полноразмерный иммуноглобулин, вторая субъединица может быть связана посредством пептидного линкера между N-концом второй субъединицы и C-концом константной области тяжелой цепи (СН) указанного иммуноглобулина. В некоторых дополнительных вариантах осуществления третья субъединица может быть связана посредством пептидного линкера между N-концом третьей субъединицы и C-концом константной области легкой цепи (CL) указанного иммуноглобулина. [0088] In some embodiments, at least one subunit may be linked to another subunit via a linker. In some further embodiments, the linker is a peptide linker, such as a non-structured glycine-serine (GS) linker, a glycosylated GS linker, or a proline-alanine-serine polymer (PAS) linker. In some embodiments, the GS linker is the (Gly 4 Ser) 3 ((G 4 S) 3 ) linker set forth in SEQ ID NO: 13. Other exemplary linkers are set forth in SEQ ID NO: 14-23. In some embodiments, the peptide linker may contain from 1 to 50 amino acids, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 25, 30 , 35, 40, 45 or 50 amino acids. For example, when the first subunit contains a full-length immunoglobulin, the second subunit can be linked through a peptide linker between the N-terminus of the second subunit and the C-terminus of the heavy chain constant region (CH) of the immunoglobulin. In some further embodiments, the third subunit may be linked via a peptide linker between the N-terminus of the third subunit and the C-terminus of the light chain constant region (CL) of the immunoglobulin.
[0089] В некоторых вариантах осуществления одна субъединица может быть связана с другой субъединицей по существу как описано на фиг. 1. Как правило, одна субъединица может быть слита на ее N-конце и/или ее С-конце с другой субъединицей. Например, в некоторых вариантах осуществления субъединица мутеина липокалина может быть слита на ее N-конце и/или на ее C-конце с субъединицей иммуноглобулина. В качестве еще одного примера, один мутеин липокалина может быть связан, предпочтительно посредством пептидной связи, с C-концом домена тяжелой цепи иммуноглобулина (HC), N-концом HC, C-концом легкой цепи иммуноглобулина (LC) и/или N-концом LC (фиг. 1A-1D).[0089] In some embodiments, one subunit may be linked to another subunit substantially as described in FIG. 1. Typically, one subunit may be fused at its N-terminus and/or its C-terminus to another subunit. For example, in some embodiments, a lipocalin mutein subunit may be fused at its N-terminus and/or at its C-terminus to an immunoglobulin subunit. As yet another example, one lipocalin mutein may be linked, preferably via a peptide bond, to the C terminus of an immunoglobulin heavy chain (HC) domain, the N terminus of an HC domain, the C terminus of an immunoglobulin light chain (LC), and/or the N terminus LC (Fig. 1A-1D).
[0090] В некоторых вариантах осуществления субъединица мутеина липокалина может быть слита на ее N-конце и/или на ее C-конце с фрагментом иммуноглобулина. Например, в некоторых вариантах осуществления мутеин липокалина может быть связан, предпочтительно посредством пептидного линкера, на C-конце константной области тяжелой цепи (CH) или C-конце константной области легкой цепи (CL) иммуноглобулина. [0090] In some embodiments, a lipocalin mutein subunit may be fused at its N-terminus and/or at its C-terminus to an immunoglobulin moiety. For example, in some embodiments, a lipocalin mutein may be linked, preferably through a peptide linker, at the C-terminus of a heavy chain constant region (CH) or the C-terminus of a light chain constant region (CL) of an immunoglobulin.
[0091] В некоторых вариантах осуществления, когда одна субъединица содержит полноразмерный иммуноглобулин, вторая субъединица может быть связана между N-концом второй субъединицы и C-концом константной области тяжелой цепи (СН) указанного иммуноглобулина. [0091] In some embodiments, when one subunit contains a full-length immunoglobulin, the second subunit may be linked between the N-terminus of the second subunit and the C-terminus of the heavy chain constant region (CH) of said immunoglobulin.
[0092] В некоторых вариантах осуществления третья субъединица может быть связана между N-концом третьей субъединицы и C-концом константной области легкой цепи (CL) указанного иммуноглобулина. [0092] In some embodiments, the third subunit may be linked between the N-terminus of the third subunit and the C-terminus of the light chain constant region (CL) of said immunoglobulin.
[0093] В некоторых вариантах осуществления в отношении слитого белка согласно изобретению, где по меньшей мере одна субъединица может представлять собой или содержать полноразмерный иммуноглобулин, Fc-функция Fc-области полноразмерного иммуноглобулина по отношению к Fc-рецептор-положительной клетке может быть сохранена, и слитый белок при этом может одновременно связывать CD137 и PD-L1.[0093] In some embodiments, with respect to a fusion protein of the invention, wherein at least one subunit may be or comprise a full-length immunoglobulin, the Fc function of the Fc region of the full-length immunoglobulin relative to the Fc receptor-positive cell may be preserved, and the fusion protein can simultaneously bind CD137 and PD-L1.
[0094] В некоторых вариантах осуществления, где по меньшей мере одна субъединица предложенного слитого белка может представлять собой или содержать полноразмерный иммуноглобулин, Fc-функция Fc-области полноразмерного иммуноглобулина по отношению к Fc-рецептор-положительной клетке может быть снижена или полностью подавлена посредством белковой инженерии, и слитый белок при этом может одновременно связывать CD137 и PD-L1. В некоторых вариантах осуществления это может быть достигнуто, например, путем замены остова IgG1 на IgG4, поскольку известно, что IgG4 демонстрирует сниженные взаимодействия с Fc-гамма-рецептором по сравнению с IgG1. В некоторых вариантах осуществления, чтобы дополнительно снизить остаточное связывание с Fc-гамма-рецепторами, в остов IgG4 могут быть введены мутации, такие как F234A и L235A. В некоторых вариантах осуществления мутация S228P также может быть введена в остов IgG4 для минимизации обмена половинами молекул IgG4 (Silva et al., J Biol Chem, 2015). В некоторых вариантах осуществления могут быть введены мутации F234A и L235A для снижения ADCC (антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности) и ADCP (антителозависимого клеточноопосредованного фагоцитоза) (Glaesner et al., Diabetes Metab Res Rev, 2010) и/или мутации M428L и N434S или мутации M252Y, S254T и T256E для увеличения периода полувыведения из сыворотки (Dall'Acqua et al., J Biol Chem, 2006, Zalevsky et al., Nat Biotechnol, 2010). В некоторых вариантах осуществления в тяжелой цепи иммуноглобулина в составе слитого белка может присутствовать дополнительная мутация N297A для того, чтобы удалить природный мотив гликозилирования.[0094] In some embodiments, where at least one subunit of the proposed fusion protein may be or contain a full-length immunoglobulin, the Fc function of the Fc region of the full-length immunoglobulin relative to the Fc receptor-positive cell may be reduced or completely suppressed by the protein engineering, and the fusion protein can simultaneously bind CD137 and PD-L1. In some embodiments, this may be achieved, for example, by replacing the IgG1 backbone with IgG4, since IgG4 is known to exhibit reduced interactions with the Fc gamma receptor compared to IgG1. In some embodiments, mutations such as F234A and L235A can be introduced into the IgG4 backbone to further reduce residual binding to Fc-gamma receptors. In some embodiments, the S228P mutation may also be introduced into the IgG4 backbone to minimize the exchange of IgG4 halves (Silva et al., J Biol Chem, 2015). In some embodiments, the F234A and L235A mutations may be introduced to reduce ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) and ADCP (antibody-dependent cell-mediated phagocytosis) (Glaesner et al., Diabetes Metab Res Rev, 2010) and/or the M428L and N434S mutations or the M252Y mutation, S254T and T256E to increase serum half-life (Dall'Acqua et al., J Biol Chem, 2006, Zalevsky et al., Nat Biotechnol, 2010). In some embodiments, an additional N297A mutation may be present in the immunoglobulin heavy chain of the fusion protein to remove the natural glycosylation motif.
[0095] В некоторых вариантах осуществления Fc-часть иммуноглобулина, включенная в слитый белок согласно изобретению, может способствовать поддержанию сывороточных уровней слитого белка. Например, когда Fc-часть связывается с Fc-рецепторами на эндотелиальных клетках и фагоцитах, слитый белок может интернализоваться и возвращаться обратно в кровоток, увеличивая свой период полувыведения из организма.[0095] In some embodiments, the Fc portion of an immunoglobulin included in a fusion protein of the invention may help maintain serum levels of the fusion protein. For example, when the Fc moiety binds to Fc receptors on endothelial cells and phagocytes, the fusion protein can be internalized and released back into the bloodstream, increasing its half-life from the body.
[0096] В одном из аспектов слитые белки согласно изобретению связывают CD137 с высокой аффинностью. В еще одном аспекте предложенные слитые белки связывают PD-L1 с высокой аффинностью. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления предложенные слитые белки одновременно связывают CD137 и PD-L1. В некоторых вариантах осуществления изобретения одновременное связывание с CD137 и PD-L1 позволяет предложенным слитым белкам демонстрировать устойчивый противоопухолевый или противоинфекционный ответ. [0096] In one aspect, the fusion proteins of the invention bind CD137 with high affinity. In yet another aspect, the proposed fusion proteins bind PD-L1 with high affinity. In some preferred embodiments, the proposed fusion proteins simultaneously bind CD137 and PD-L1. In some embodiments, simultaneous binding to CD137 and PD-L1 allows the proposed fusion proteins to demonstrate a sustained antitumor or anti-infective response.
[0097] В некоторых вариантах осуществления слитый белок согласно изобретению может быть способен связывать PD-L1 со значением KD не более чем приблизительно 2 нМ или даже ниже, например, приблизительно 1,5 нМ или ниже, приблизительно 1 нМ или ниже, приблизительно 0,6 нМ или ниже или приблизительно 0,4 нМ или ниже. В некоторых вариантах осуществления слитый белок согласно изобретению может быть способен связывать PD-L1 со значением KD, сопоставимым или более низким, чем значение KD иммуноглобулина, специфичного к PD-L1, входящего в состав такого слитого белка, такого как антитело, имеющее тяжелую и легкую цепи, представленные SEQ ID NO: 86 и 87. Значения KD предложенных слитых белков могут быть измерены, например, в анализе методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR), таком как анализ методом SPR, как по существу описано в примере 3. [0097] In some embodiments, the fusion protein of the invention may be capable of binding PD-L1 with a K D value of no more than about 2 nM or even lower, such as about 1.5 nM or lower, about 1 nM or lower, about 0 .6 nM or lower or approximately 0.4 nM or lower. In some embodiments, a fusion protein of the invention may be capable of binding PD-L1 with a K D value comparable to or lower than the K D value of a PD-L1-specific immunoglobulin contained in such a fusion protein, such as an antibody having a severe and the light chain represented by SEQ ID NOs: 86 and 87. The K D values of the proposed fusion proteins can be measured, for example, in a surface plasmon resonance (SPR) assay, such as an SPR assay as substantially described in Example 3.
[0098] В некоторых вариантах осуществления слитый белок согласно изобретению может быть способен связывать CD137 со значением KD не более чем приблизительно 10 нМ или даже ниже, например, приблизительно 7 нМ, приблизительно 6 нМ или приблизительно 5 нМ, приблизительно 4 нМ, приблизительно 3 нМ, приблизительно 2 нМ или даже ниже. В некоторых вариантах осуществления слитый белок согласно изобретению может быть способен связывать CD137 со значением KD, сопоставимым или более низким, чем значение KD мутеина липокалина, специфичного к CD137, включенного в состав конкретного слитого белка, например, SEQ ID NO: 42, или мутеина липокалина, слитого с Fc-областью антитела, например, SEQ ID NO: 89. Значения KD предложенных слитых белков могут быть измерены, например, в анализе методом SPR, таком как анализ методом SPR, как по существу описано в примере 3.[0098] In some embodiments, the fusion protein of the invention may be capable of binding CD137 with a K D value of no more than about 10 nM or even lower, such as about 7 nM, about 6 nM, or about 5 nM, about 4 nM, about 3 nM, approximately 2 nM or even lower. In some embodiments, the fusion protein of the invention may be capable of binding CD137 with a K D value comparable to or lower than the K D value of the CD137-specific lipocalin mutein included in the particular fusion protein, e.g., SEQ ID NO: 42, or a lipocalin mutein fused to the Fc region of an antibody, for example, SEQ ID NO: 89. The K D values of the proposed fusion proteins can be measured, for example, in an SPR assay, such as the SPR assay as substantially described in Example 3.
[0099] В некоторых вариантах осуществления слитый белок согласно изобретению может быть способен связывать PD-L1 со значением EC50 не более чем приблизительно 0,5 нМ или даже ниже, например, приблизительно 0,3 нМ или ниже, приблизительно 0,2 нМ или ниже, приблизительно 0,15 нМ или ниже или приблизительно 0,1 нМ или ниже. В некоторых вариантах осуществления слитый белок согласно изобретению может быть способен связывать PD-L1 со значением EC50, сопоставимым или более низким, чем значение EC50 иммуноглобулина, специфичного к PD-L1, входящего в состав конкретного слитого белка, такого как антитело, имеющее тяжелую и легкую цепи, представленные SEQ ID NO: 86 и 87. Значения EC50 предложенных слитых белков могут быть измерены, например, в анализе методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), таком как анализ ELISA, как по существу описано в примере 4. [0099] In some embodiments, the fusion protein of the invention may be capable of binding PD-L1 with an EC 50 value of no more than about 0.5 nM or even lower, for example, about 0.3 nM or lower, about 0.2 nM, or below, about 0.15 nM or below, or about 0.1 nM or below. In some embodiments, a fusion protein of the invention may be capable of binding PD-L1 with an EC 50 value comparable to or lower than the EC 50 value of a PD-L1-specific immunoglobulin contained in the particular fusion protein, such as an antibody having a severe and the light chain represented by SEQ ID NOs: 86 and 87. The EC 50 values of the proposed fusion proteins can be measured, for example, in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) assay, such as an ELISA assay as substantially described in Example 4.
[00100] В некоторых вариантах осуществления слитый белок согласно изобретению может быть способен связывать CD137 со значением EC50 не более чем приблизительно 0,6 нМ или даже ниже, например, приблизительно 0,5 нМ или ниже, приблизительно 0,2 нМ или ниже, приблизительно 0,15 нМ или ниже или приблизительно 0,1 нМ или ниже. В некоторых вариантах осуществления слитый белок согласно изобретению может быть способен связывать CD137 со значением EC50, сопоставимым или более низким, чем значение EC50 мутеина липокалина, специфичного к CD137, включенного в состав конкретного слитого белка, например, SEQ ID NO: 42, или мутеина липокалина, слитого с Fc-областью антитела, например, SEQ ID NO: 89. Значения EC50 предложенных слитых белков могут быть измерены, например, в анализе методом ELISA, таком как анализ ELISA, как по существу описано в примере 4.[00100] In some embodiments, the fusion protein of the invention may be capable of binding CD137 with an EC 50 value of no more than about 0.6 nM or even lower, for example, about 0.5 nM or lower, about 0.2 nM or lower, about 0.15 nM or lower or about 0.1 nM or lower. In some embodiments, the fusion protein of the invention may be capable of binding CD137 with an EC 50 value comparable to or lower than the EC 50 value of the CD137-specific lipocalin mutein included in the particular fusion protein, for example, SEQ ID NO: 42, or a lipocalin mutein fused to the Fc region of an antibody, for example, SEQ ID NO: 89. The EC 50 values of the proposed fusion proteins can be measured, for example, in an ELISA assay, such as an ELISA assay as substantially described in Example 4.
[00101] В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению обладают перекрестной реактивностью с PD-L1 яванского макака. В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок может быть способен связывать PD-L1 яванского макака со значением EC50 не более чем приблизительно 0,5 нМ или даже ниже, например, приблизительно 0,2 нМ или ниже, приблизительно 0,1 нМ или ниже или приблизительно 0,05 нМ. или ниже. Значения EC50 предложенных слитых белков могут быть измерены, например, измерены в анализе методом ELISA, таком как анализ ELISA, как по существу описано в примере 4.[00101] In some embodiments, the fusion proteins of the invention are cross-reactive with cynomolgus PD-L1. In some embodiments, the proposed fusion protein may be capable of binding cynomolgus PD-L1 with an EC 50 value of no more than about 0.5 nM or even lower, such as about 0.2 nM or lower, about 0.1 nM or lower, or approximately 0.05 nM. or lower. The EC 50 values of the proposed fusion proteins can be measured, for example, measured in an ELISA assay, such as an ELISA assay as substantially described in Example 4.
[00102] В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению обладают перекрестной реактивностью с CD137 яванского макака. В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок может быть способен связывать CD137 яванского макака со значением EC50 не более чем приблизительно 15 nM или даже ниже, например, приблизительно 10 нМ или ниже, приблизительно 8 нМ или ниже, приблизительно 6 нМ или ниже, приблизительно 3 нМ или ниже, приблизительно 1 нМ или ниже, приблизительно 0,5 нМ или ниже, приблизительно 3 нМ или ниже или приблизительно 0,1 нМ или ниже. Значения EC50 предложенных слитых белков могут быть измерены, например, в анализе методом ELISA, таком как анализ ELISA, как по существу описано в примере 4. В некоторых вариантах осуществления связывание предложенного слитого белка с CD137 яванского макака может быть усилено за счет эффекта авидности, как описано в примере 22. [00102] In some embodiments, the fusion proteins of the invention are cross-reactive with cynomolgus CD137. In some embodiments, the proposed fusion protein may be capable of binding cynomolgus CD137 with an EC 50 value of no more than about 15 nM or even lower, e.g., about 10 nM or lower, about 8 nM or lower, about 6 nM or lower, about 3 nM or lower, about 1 nM or lower, about 0.5 nM or lower, about 3 nM or lower, or about 0.1 nM or lower. The EC 50 values of the proposed fusion proteins may be measured, for example, in an ELISA assay, such as the ELISA assay as substantially described in Example 4. In some embodiments, the binding of the proposed fusion protein to cynomolgus CD137 may be enhanced by an avidity effect, as described in example 22.
[00103] В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут быть способны одновременно связывать CD137 и PD-L1. В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок может быть способен одновременно связывать CD137 и PD-L1 со значением EC50 не более чем приблизительно 1 нМ или даже ниже, например, 0,8 нМ или ниже, 0,6 нМ или ниже или 0,4 нМ или ниже. В некоторых других вариантах осуществления предложенный слитый белок может быть способен одновременно связывать CD137 и PD-L1 со значением EC50 не более чем приблизительно 10 нМ или даже ниже, например, 8 нМ или ниже, 6 нМ или ниже, 3 нМ или ниже или 2 нМ или ниже. Одновременное связывание может быть определено, например, в анализе методом ELISA, таком как анализ ELISA, как по существу описано в примере 5.[00103] In some embodiments, fusion proteins of the invention may be capable of simultaneously binding CD137 and PD-L1. In some embodiments, the proposed fusion protein may be capable of simultaneously binding CD137 and PD-L1 with an EC 50 value of no more than about 1 nM or even lower, such as 0.8 nM or lower, 0.6 nM or lower, or 0.4 nM or lower. In some other embodiments, the proposed fusion protein may be capable of simultaneously binding CD137 and PD-L1 with an EC 50 value of no more than about 10 nM or even lower, such as 8 nM or lower, 6 nM or lower, 3 nM or lower, or 2 nM or lower. Simultaneous binding can be determined, for example, in an ELISA assay, such as an ELISA assay as substantially described in Example 5.
[00104] В некоторых вариантах осуществления слитый белок согласно изобретению может быть способен связывать CD137, экспрессируемый на клетке, со значением EC50 не более чем приблизительно 60 нМ или даже ниже, например, приблизительно 50 нМ или даже ниже, приблизительно 40 нМ или даже ниже, приблизительно 30 нМ или ниже, приблизительно 10 нМ или ниже, приблизительно 7 нМ или ниже, приблизительно 5 нМ или ниже, приблизительно 3 нМ или ниже или приблизительно 1 нМ или даже ниже. Значение EC50 предложенного слитого белка может быть измерено, например, в анализе методом проточной цитометрии, как по существу описано в примере 6. Клетка, экспрессирующая CD137, может представлять собой, например, клетку СНО, трансфицированную человеческим CD137 или CD137 яванского макака.[00104] In some embodiments, the fusion protein of the invention may be capable of binding CD137 expressed on a cell to an EC 50 value of no more than about 60 nM or even lower, such as about 50 nM or even lower, about 40 nM or even lower , about 30 nM or lower, about 10 nM or lower, about 7 nM or lower, about 5 nM or lower, about 3 nM or lower, or about 1 nM or even lower. The EC 50 value of the proposed fusion protein can be measured, for example, in a flow cytometry assay as essentially described in Example 6. The cell expressing CD137 can be, for example, a CHO cell transfected with human CD137 or cynomolgus CD137.
[00105] В некоторых вариантах осуществления слитый белок согласно изобретению может быть способен связывать PD-L1, экспрессируемый на клетке, со значением EC50 не более чем приблизительно 10 нМ или даже ниже, например, приблизительно 8 нМ или даже ниже, приблизительно 6 нМ или даже ниже, приблизительно 4 нМ или ниже, приблизительно 2 нМ или ниже или приблизительно 1 или даже ниже. Значение EC50 предложенного слитого белка может быть измерено, например, в анализе методом проточной цитометрии, как по существу описано в примере 6. Клетка, экспрессирующая PD-L1, может представлять собой, например, клетку СНО, трансфицированную человеческим PD-L1 или PD-L1 яванского макака.[00105] In some embodiments, the fusion protein of the invention may be capable of binding PD-L1 expressed on a cell with an EC 50 value of no more than about 10 nM or even lower, such as about 8 nM or even lower than about 6 nM or even lower, about 4 nM or lower, about 2 nM or lower, or about 1 nM or even lower. The EC 50 value of the proposed fusion protein can be measured, for example, in a flow cytometry assay as essentially described in Example 6. The cell expressing PD-L1 can be, for example, a CHO cell transfected with human PD-L1 or PD-L1. L1 cynomolgus macaque.
[00106] В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут быть способны связывать PD-L1, экспрессируемый на опухолевых клетках. В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок может быть способен связывать PD-L1, экспрессируемый на опухолевой клетке, со значением EC50 не более чем приблизительно 2 нМ или даже ниже, например, приблизительно 1,5 нМ или ниже, приблизительно 1 нМ или ниже, приблизительно 0,6 нМ или ниже или приблизительно 0,3 нМ или даже ниже. Значение EC50 слитого белка для связывания опухолевых клеток, экспрессирующих PD-L1, может быть измерено, например, в анализе методом проточной цитометрии, как по существу описано в примере 7. Опухолевые клетки, экспрессирующие PD-L1, могут представлять собой, например, клетки RKO.[00106] In some embodiments, fusion proteins of the invention may be capable of binding PD-L1 expressed on tumor cells. In some embodiments, the proposed fusion protein may be capable of binding PD-L1 expressed on a tumor cell with an EC 50 value of no more than about 2 nM or even lower, for example, about 1.5 nM or lower, about 1 nM or lower, about 0.6 nM or lower or about 0.3 nM or even lower. The EC 50 value of the fusion protein for binding tumor cells expressing PD-L1 can be measured, for example, in a flow cytometry assay as substantially described in Example 7. Tumor cells expressing PD-L1 can be, for example, RKO.
[00107] В некоторые варианты осуществления слитые белки согласно изобретению по существу не влияют на связывание CD137 с CD137L. В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут быть способны связывать CD137, находящийся в комплексе с CD137L. В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут быть способны связывать CD137 с помощью механизма, подобного антителу к CD137, имеющему тяжелую и легкую цепи, представленные SEQ ID NO: 28 и 29. Механизм связывания с CD137 слитого белка может быть определен, например, посредством анализа методом SPR, такого как анализ методом SPR, как по существу описано в примере 8.[00107] In some embodiments, the fusion proteins of the invention do not substantially affect the binding of CD137 to CD137L. In some embodiments, fusion proteins of the invention may be capable of binding CD137 complexed with CD137L. In some embodiments, the fusion proteins of the invention may be capable of binding CD137 through a mechanism similar to the anti-CD137 antibody having the heavy and light chains represented by SEQ ID NOs: 28 and 29. The CD137 binding mechanism of the fusion protein can be determined, for example, by an SPR assay, such as an SPR assay as substantially described in Example 8.
[00108] В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут быть способны конкурировать с PD-1 за связывание с PD-L1. В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок может быть способен конкурировать с PD-1 за связывание с PD-L1 со значением IC50 не более чем приблизительно 5 нМ или даже ниже, например, приблизительно 3 нМ или ниже, приблизительно 2 нМ или ниже или приблизительно 1 или даже ниже. Механизм ингибирующего действия может быть определен, например, посредством анализа методом ELISA, такого как анализ ELISA, как по существу описано в примере 9.[00108] In some embodiments, fusion proteins of the invention may be able to compete with PD-1 for binding to PD-L1. In some embodiments, the proposed fusion protein may be capable of competing with PD-1 for binding to PD-L1 with an IC 50 value of no more than about 5 nM or even lower, such as about 3 nM or lower, about 2 nM or lower, or about 1 or even lower. The mechanism of inhibitory action can be determined, for example, through an ELISA assay, such as an ELISA assay as substantially described in Example 9.
[00109] В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут быть способны конкурировать с антителом к CD137, представленным в SEQ ID NO: 28 и 29, за связывание с CD137. Такую конкуренцию можно оценить с помощью анализа методом ELISA, как по существу описано в примере 17. В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок может иметь перекрывающийся эпитоп с антителом к CD137, представленным в SEQ ID NO: 28 и 29.[00109] In some embodiments, the fusion proteins of the invention may be capable of competing with the anti-CD137 antibody set forth in SEQ ID NOs: 28 and 29 for binding to CD137. Such competition can be assessed using an ELISA assay as substantially described in Example 17. In some embodiments, the proposed fusion protein may have an overlapping epitope with the anti-CD137 antibody set forth in SEQ ID NOs: 28 and 29.
[00110] В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут быть способны костимулировать Т-клеточные ответы. В некоторых вариантах осуществления предложенные слитые белки приводят к сопоставимой или более сильной активации Т-клеток по сравнению с антителом к PD-L1, таким как антитело к PD-L1-строительный блок с последовательностями SEQ ID NO: 86 и 87 или референсное антитело к PD-L1 с последовательностями SEQ ID NO: 26 и 27, или антитело к CD137, такое как референсное антитело с последовательностями SEQ ID NO: 28 и 29. В некоторых вариантах осуществления предложенные слитые белки приводят к активации Т-клеток с сопоставимой или лучшей эффективностью по сравнению с комбинацией антитела к PD-L1 и молекулы, нацеленной на CD137, такой как антитело к CD137 или ранее известный CD137-специфический мутеин липокалина. Стимулированный Т-клеточный ответ или активация Т-клеток могут быть измерены, например, в биоанализе с CD137, как по существу описано в примере 10, в биоанализе с блокадой PD-1/PD-L1, как описано в примере 18, или в функциональном анализе активации Т-клеток, как по существу описано в примере 11, примере 12, примере 19 и примере 20.[00110] In some embodiments, fusion proteins of the invention may be capable of co-stimulating T cell responses. In some embodiments, the proposed fusion proteins result in comparable or greater T cell activation compared to an anti-PD-L1 antibody, such as an anti-PD-L1 building block antibody of SEQ ID NOs: 86 and 87 or a reference anti-PD antibody -L1 with the sequences SEQ ID NOs: 26 and 27, or an anti-CD137 antibody, such as the reference antibody with the sequences SEQ ID NOs: 28 and 29. In some embodiments, the proposed fusion proteins result in T cell activation with comparable or better potency compared to a combination of an anti-PD-L1 antibody and a molecule targeting CD137, such as an anti-CD137 antibody or the previously known CD137-specific lipocalin mutein. Stimulated T cell response or T cell activation can be measured, for example, in a CD137 bioassay as essentially described in Example 10, in a PD-1/PD-L1 blockade bioassay as described in Example 18, or in a functional T cell activation assay as essentially described in Example 11, Example 12, Example 19 and Example 20.
[00111] В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут быть способны индуцировать повышенную секрецию IL-2. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления предложенные слитые белки могут быть способны индуцировать зависимую от концентрации секрецию IL-2 и/или демонстрируют тенденцию к индукции повышенной секреции IL-2 при более высоких концентрациях, предпочтительно концентрациях при нанесении в виде покрытия. В некоторых вариантах осуществления предложенные слитые белки могут приводить к повышенной секреции IL-2 с сопоставимой или лучшей эффективностью по сравнению с комбинацией антитела к PD-L1 и молекулы, нацеленной на CD137, такой как антитело к CD137 или ранее известный CD137-специфический мутеин липокалина. Секреция IL-2 может быть измерена, например, в функциональном анализе активации Т-клеток, как по существу описано в примере 11 и примере 19.[00111] In some embodiments, fusion proteins of the invention may be capable of inducing increased secretion of IL-2. In some preferred embodiments, the proposed fusion proteins may be capable of inducing concentration-dependent secretion of IL-2 and/or tend to induce increased secretion of IL-2 at higher concentrations, preferably concentrations when applied as a coating. In some embodiments, the proposed fusion proteins may result in increased IL-2 secretion with comparable or better efficacy than a combination of an anti-PD-L1 antibody and a CD137-targeting molecule, such as an anti-CD137 antibody or the previously known CD137-specific lipocalin mutein. IL-2 secretion can be measured, for example, in a functional T-cell activation assay as substantially described in Example 11 and Example 19.
[00112] В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут быть способны костимулировать Т-клеточные ответы PD-L1-зависимым образом. В некоторых вариантах осуществления предложенные слитые белки могут приводить к локальной индукции продукции IL-2 Т-клетками вблизи PD-L1-положительных клеток, таких как клетки, трансфицированные PD-L1, или PD-L1-положительные опухолевые клетки. «Вблизи PD-L1-положительных клеток» в контексте настоящего документа относится к Т-клетке и PD-L1-положительной клетке, сближенным друг с другом посредством предложенного слитого белка, который одновременно связывает CD137 и PD-L1. PD-L1-зависимая активация Т-клеток предложенными слитыми белками может быть определена, например, в биоанализе с CD137, по существу описанном в примере 10, в биоанализе с блокадой PD-1/PD-L1, по существу описанном в примере 18, или в функциональном анализе активации Т-клеток, по существу описанном в примере 12 и примере 20. [00112] In some embodiments, fusion proteins of the invention may be capable of co-stimulating T cell responses in a PD-L1 dependent manner. In some embodiments, the proposed fusion proteins may result in local induction of IL-2 production by T cells in the vicinity of PD-L1 positive cells, such as PD-L1 transfected cells or PD-L1 positive tumor cells. “In the vicinity of PD-L1 positive cells” as used herein refers to a T cell and a PD-L1 positive cell brought into proximity to each other by a proposed fusion protein that simultaneously binds CD137 and PD-L1. PD-L1-dependent T cell activation by the proposed fusion proteins can be determined, for example, in a CD137 bioassay substantially described in Example 10, in a PD-1/PD-L1 blockade bioassay substantially described in Example 18, or in a functional T cell activation assay substantially described in Example 12 and Example 20.
[00113] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления предложенные слитые белки могут быть способны костимулировать Т-клеточные ответы в присутствии опухолевых клеток, экспрессирующих PD-L1, и/или в микроокружении опухоли. В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок может быть способен костимулировать Т-клеточные ответы в присутствии PD-L1-положительных опухолевых клеток со значением EC50 приблизительно 1 нМ или ниже, приблизительно 0,5 нМ или ниже, приблизительно 0,3 нМ или ниже, приблизительно 0,1 нМ или ниже или приблизительно 0,05 нМ или ниже. Активация Т-клеток предложенными слитыми белками в присутствии опухолевых клеток, экспрессирующих PD-L1, и/или в микроокружении опухоли может быть оценена, например, в CD137-биоанализе, по существу описанном в примере 10, или в функциональном анализе активации Т-клеток, по существу описанном в примере 12.[00113] In some preferred embodiments, the proposed fusion proteins may be capable of co-stimulating T cell responses in the presence of tumor cells expressing PD-L1 and/or in the tumor microenvironment. In some embodiments, the proposed fusion protein may be capable of co-stimulating T cell responses in the presence of PD-L1 positive tumor cells with an EC 50 value of about 1 nM or lower, about 0.5 nM or lower, about 0.3 nM or lower, about 0.1 nM or lower or about 0.05 nM or lower. Activation of T cells by the proposed fusion proteins in the presence of tumor cells expressing PD-L1 and/or in the tumor microenvironment can be assessed, for example, in a CD137 bioassay substantially described in Example 10, or in a functional T cell activation assay. essentially described in example 12.
[00114] В некоторых вариантах осуществления предложенные слитые белки неспособны костимулировать Т-клеточные ответы в отсутствие PD-L1. В некоторых вариантах осуществления предложенные слитые белки неспособны костимулировать Т-клеточные ответы в отсутствие клеток, экспрессирующих PD-L1. В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок может быть лучше способен распознавать присутствие PD-L1 и приводить к соответствующей активации Т-клеток, чем антитело к CD137, представленное в SEQ ID NO: 28 и 29. PD-L1-зависимое действие слитых белков может быть определено, например, в биоанализе с CD137, по существу описанном в примере 10, в биоанализе с блокадой PD-1/PD-L1, по существу описанном в примере 18, или в функциональном анализе активации Т-клеток, по существу описанном в примере 12 и примере 20.[00114] In some embodiments, the proposed fusion proteins are unable to co-stimulate T cell responses in the absence of PD-L1. In some embodiments, the proposed fusion proteins are unable to co-stimulate T cell responses in the absence of cells expressing PD-L1. In some embodiments, the proposed fusion protein may be better able to recognize the presence of PD-L1 and lead to appropriate T cell activation than the anti-CD137 antibody set forth in SEQ ID NOs: 28 and 29. The PD-L1-dependent effect of the fusion proteins may be determined, for example, in the CD137 bioassay substantially described in Example 10, in the PD-1/PD-L1 blockade bioassay substantially described in Example 18, or in the functional T cell activation assay substantially described in Example 12 and example 20.
[00115] В некоторых вариантах осуществления предложенные слитые белки могут быть способны блокировать ингибирующий сигнал, опосредованный связыванием PD-1 с PD-L1. В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок может быть способен ослабить тормоз активации Т-клеток или привести к успешной активации Т-клеток путем блокирования взаимодействия PD-1/PD-L1. Блокада ингибирующего сигнала PD-1 может быть измерена, например, в биоанализе с блокадой PD-1/PD-L1, как описано в примере 18.[00115] In some embodiments, the proposed fusion proteins may be capable of blocking an inhibitory signal mediated by PD-1 binding to PD-L1. In some embodiments, the proposed fusion protein may be able to relieve the brake on T cell activation or result in successful T cell activation by blocking the PD-1/PD-L1 interaction. Blockade of the PD-1 inhibitory signal can be measured, for example, in a PD-1/PD-L1 blockade bioassay as described in Example 18.
[00116] В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут быть способны стимулировать пролиферацию и/или активацию Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления предложенные слитые белки могут быть способны стимулировать пролиферацию и/или активацию CD4+ Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления предложенные слитые белки могут быть способны индуцировать секрецию IL-2, предпочтительно дозозависимую секрецию IL-2. В некоторых вариантах осуществления предложенные слитые белки могут быть способны индуцировать более высокий уровень секреции IL-2 по сравнению с комбинацией антитела к PD-L1 и молекулы, нацеленной на CD137, такой как антитело к CD137 или ранее известный CD137-специфический мутеин липокалина. Секреция IL-2 в контексте настоящего документа может быть мерой активации Т-клеток. Пролиферация и/или активация CD4+ Т-клеток, стимулированная предложенными слитыми белками, может быть оценена с помощью, например, анализа реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR), как по существу описано в примере 14.[00116] In some embodiments, the fusion proteins of the invention may be capable of promoting T cell proliferation and/or activation. In some embodiments, the proposed fusion proteins may be capable of promoting the proliferation and/or activation of CD4 + T cells. In some embodiments, the proposed fusion proteins may be capable of inducing the secretion of IL-2, preferably a dose-dependent secretion of IL-2. In some embodiments, the proposed fusion proteins may be capable of inducing a higher level of IL-2 secretion compared to a combination of an anti-PD-L1 antibody and a CD137-targeting molecule, such as an anti-CD137 antibody or the previously known CD137-specific lipocalin mutein. Secretion of IL-2 as used herein may be a measure of T cell activation. The proliferation and/or activation of CD4 + T cells stimulated by the proposed fusion proteins can be assessed using, for example, a mixed lymphocyte response (MLR) assay, as essentially described in Example 14.
[00117] В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут быть способны стимулировать пролиферацию и/или активацию CD8+ Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления предложенные слитые белки могут быть способны индуцировать продукцию IL-2 и эффекторных молекул, таких как перфорин, гранзим А и гранзим В. В некоторых вариантах осуществления предложенные слитые белки могут быть способны индуцировать повышенную продукцию IL-2 и цитотоксических факторов, таких как перфорин, гранзим В и гранзим А, по сравнению с комбинацией антитела к PD-L1 и молекулы, нацеленной на CD137, такой как антитело к CD137 или ранее известный CD137-специфический мутеин липокалина. Пролиферация и/или активация CD8+ Т-клеток, стимулированная предложенными слитыми белками, может быть оценена с помощью, например, анализа MLR, как по существу описано в примере 15.[00117] In some embodiments, the fusion proteins of the invention may be capable of promoting the proliferation and/or activation of CD8 + T cells. In some embodiments, the proposed fusion proteins may be capable of inducing the production of IL-2 and effector molecules such as perforin, granzyme A, and granzyme B. In some embodiments, the proposed fusion proteins may be capable of inducing increased production of IL-2 and cytotoxic factors such as as perforin, granzyme B and granzyme A, compared with a combination of an anti-PD-L1 antibody and a molecule targeting CD137, such as an anti-CD137 antibody or the previously known CD137-specific lipocalin mutein. The proliferation and/or activation of CD8 + T cells stimulated by the proposed fusion proteins can be assessed using, for example, an MLR assay, as essentially described in Example 15.
[00118] В некоторых вариантах осуществления предложенные слитые белки обладают благоприятным профилем стабильности и фармакокинетическим профилем. В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок имеет фармакокинетический профиль, сопоставимый с антителом-строительным блоком с последовательностями SEQ ID NO: 86 и 87. В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок имеет антителоподобную фармакокинетику. В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок имеет конечный период полувыведения приблизительно 200 часов или дольше, приблизительно 250 часов или дольше, приблизительно 300 часов или дольше, приблизительно 350 часов или дольше, приблизительно 400 часов или дольше, или даже дольше. В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок имеет более благоприятный фармакокинетический профиль, чем SEQ ID NO: 147. В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок имеет более благоприятный фармакокинетический профиль, чем SEQ ID NO: 148. Фармакокинетические профили предложенных слитых белков могут быть проанализированы, как описано в примере 21 и примере 22. В некоторых вариантах осуществления можно считать, что благоприятный фармакокинетический профиль или антителоподобная фармакокинетика достигнуты, если % cmax был выше 10% спустя 336 часов.[00118] In some embodiments, the proposed fusion proteins have a favorable stability profile and pharmacokinetic profile. In some embodiments, the proposed fusion protein has a pharmacokinetic profile comparable to the building block antibody of SEQ ID NOs: 86 and 87. In some embodiments, the proposed fusion protein has antibody-like pharmacokinetics. In some embodiments, the proposed fusion protein has a terminal half-life of about 200 hours or longer, about 250 hours or longer, about 300 hours or longer, about 350 hours or longer, about 400 hours or longer, or even longer. In some embodiments, the proposed fusion protein has a more favorable pharmacokinetic profile than SEQ ID NO: 147. In some embodiments, the proposed fusion protein has a more favorable pharmacokinetic profile than SEQ ID NO: 148. The pharmacokinetic profiles of the proposed fusion proteins can be analyzed as described in Example 21 and Example 22. In some embodiments, a favorable pharmacokinetic profile or antibody-like pharmacokinetics may be considered to have been achieved if the % cmax was greater than 10% after 336 hours.
[00119] В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 88-94.[00119] In some embodiments, the proposed fusion protein contains an amino acid sequence presented in any of SEQ ID NO: 88-94.
[00120] В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или даже более высокой идентичностью последовательности с аминокислотными последовательностями, представленными в любой из SEQ ID NO: 88-94.[00120] In some embodiments, the proposed fusion protein contains an amino acid sequence having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92% , at least 95%, at least 97%, at least 98% or even higher sequence identity with the amino acid sequences presented in any of SEQ ID NOs: 88-94.
[00121] В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок содержит аминокислоты, представленные в SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87 или SEQ ID NO: 90 и 91.[00121] In some embodiments, the proposed fusion protein contains the amino acids shown in SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NO : 94 and 87 or SEQ ID NO: 90 and 91.
[00122] В некоторых вариантах осуществления предложенный слитый белок содержит аминокислотные последовательности, обладающие по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или даже более высокой идентичностью последовательности с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87 или SEQ ID NO: 90 и 91.[00122] In some embodiments, the proposed fusion protein contains amino acid sequences having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92% , at least 95%, at least 97%, at least 98% or even higher sequence identity with the amino acid sequences presented in SEQ ID NO: 90 and 87, SEQ ID NO: 86 and 91, SEQ ID NO: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NOs: 94 and 87, or SEQ ID NOs: 90 and 91.
B. Иллюстративные иммуноглобулины, входящие в состав слитых белков.B. Illustrative immunoglobulins included in fusion proteins.
[00123] В некоторых вариантах осуществления в отношении предложенного слитого белка первая субъединица может представлять собой или содержать полноразмерный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий домен, специфичный к PD-L1. В некоторых вариантах осуществления иммуноглобулин, например, может представлять собой IgG1, IgG2 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления иммуноглобулин представляет собой или содержит IgG4. В некоторых вариантах осуществления иммуноглобулин представляет собой моноклональное антитело к PD-L1.[00123] In some embodiments of a fusion protein of the invention, the first subunit may be or comprise a full-length immunoglobulin or a PD-L1-specific antigen binding domain thereof. In some embodiments, the immunoglobulin, for example, may be IgG1, IgG2, or IgG4. In some embodiments, the immunoglobulin is or contains IgG4. In some embodiments, the immunoglobulin is an anti-PD-L1 monoclonal antibody.
[00124] Иллюстративные примеры PD-L1-связывающих антител согласно изобретению могут содержать антигенсвязывающую область, которая перекрестно блокирует или связывается с тем же эпитопом, что и PD-L1-связывающее антитело, содержащее области вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и вариабельного домена легкой цепи (VL) известного антитела, такого как атезолизумаб (также известно как MPDL3280A или RG7446, торговое наименование Tecentriq®), авелумаб (также известно как MSB0010718C, торговое наименование Bavencio®), дурвалумаб (ранее известно как MEDI4736, торговое наименование Imfinzi®) и BMS-936559 (также известно как MDX-1105), 5C10 (включая гуманизированное 5C10), 5F10 (включая гуманизированное 5F10) и 9F6 (включая гуманизированное 9F6). В некоторых вариантах осуществления PD-L1-связывающее антитело согласно изобретению может содержать антигенсвязывающую область, такую как любая из трех определяющих комплементарность областей (CDR) тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) и трех CDR легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) из антитела, выбранного из группы, состоящей из атезолизумаба, авелумаба, дурвалумаба, BMS-936559, 5C10, 5F10 и 9F6.[00124] Illustrative examples of PD-L1 binding antibodies of the invention may comprise an antigen binding region that cross-blocks or binds to the same epitope as a PD-L1 binding antibody comprising heavy chain variable domain ( VH ) and variable domain regions light chain (V L ) of a known antibody such as atezolizumab (also known as MPDL3280A or RG7446, trade name Tecentriq® ), avelumab (also known as MSB0010718C, trade name Bavencio® ), durvalumab (formerly known as MEDI4736, trade name Imfinzi® ) and BMS-936559 (also known as MDX-1105), 5C10 (including humanized 5C10), 5F10 (including humanized 5F10) and 9F6 (including humanized 9F6). In some embodiments, a PD-L1 binding antibody of the invention may comprise an antigen binding region, such as any of three heavy chain complementarity determining regions (CDRs) (HCDR1, HCDR2, and HCDR3) and three light chain CDRs (LCDR1, LCDR2, and LCDR3) of an antibody selected from the group consisting of atezolizumab, avelumab, durvalumab, BMS-936559, 5C10, 5F10 and 9F6.
[00125] В некоторых вариантах осуществления предложенное антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий домен может иметь вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75-79, и/или вариабельную область легкой цепи (LCVR), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 80-84.[00125] In some embodiments, a proposed anti-PD-L1 antibody or antigen binding domain thereof may have a heavy chain variable region (HCVR) selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 75-79 and/or a light chain variable region (LCVR ), selected from the group consisting of SEQ ID NO: 80-84.
[00126] В некоторых вариантах осуществления предложенное антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий домен может иметь тяжелую цепь, представляющую собой любую из SEQ ID NO: 85-86, и/или легкую цепь, представляющую собой SEQ ID NO: 87.[00126] In some embodiments, a provided anti-PD-L1 antibody or antigen binding domain thereof may have a heavy chain of any of SEQ ID NO: 85-86 and/or a light chain of SEQ ID NO: 87.
[00127] В некоторых вариантах осуществления пара тяжелой цепи и легкой цепи предложенного антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего домена представляет собой или содержит следующие HCVR и LCVR, соответственно: SEQ ID NO: 75 и 80, SEQ ID NO: 76 и 81, SEQ ID NO: 77 и 82, SEQ ID NO: 78 и 83 или SEQ ID NO:79 и 84.[00127] In some embodiments, the heavy chain and light chain pair of the proposed anti-PD-L1 antibody or antigen binding domain thereof is or comprises the following HCVR and LCVR, respectively: SEQ ID NOs: 75 and 80, SEQ ID NOs: 76 and 81, SEQ ID NOs: 77 and 82, SEQ ID NOs: 78 and 83, or SEQ ID NOs: 79 and 84.
[00128] В некоторых вариантах осуществления пара тяжелой цепи и легкой цепи предложенного антитела к PD-L1 представляет собой или содержит аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 85 и 87 или SEQ ID NO: 86 и 87.[00128] In some embodiments, the heavy chain and light chain pair of the proposed anti-PD-L1 antibody is or contains the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 85 and 87 or SEQ ID NOs: 86 and 87.
[00129] В некоторых вариантах осуществления предложенное антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий домен может иметь HCVR, обладающую по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или даже более высокой идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75-79, и/или LCVR, обладающую по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или даже более высокой идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 80-84. В других вариантах осуществления предложенное антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий домен может иметь тяжелую цепь, обладающую по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или даже более высокой идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 85-86, и/или легкую цепь, обладающую по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или даже более высокой идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 87.[00129] In some embodiments, a proposed anti-PD-L1 antibody or antigen binding domain thereof may have an HCVR of at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90 %, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or even higher sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 75-79, and /or LCVR having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98% or even higher sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 80-84. In other embodiments, the proposed anti-PD-L1 antibody or antigen binding domain thereof may have a heavy chain having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97%, at least 98% or even higher sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 85-86, and/or light chain having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 95%, at least 97 %, at least 98% or even higher sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 87.
[00130] В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи предложенного антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего домена может иметь три CDR, имеющие следующие последовательности: GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62). В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи предложенного антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего домена может иметь три CDR, имеющие следующие последовательности: GFDIKDTY (HCDR1, SEQ ID NO: 65), IDPADGNT (HCDR2, SEQ ID NO: 66), ARGLGAWFAS (HCDR3; SEQ ID NO: 67). В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи предложенного антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего домена может иметь три CDR, имеющие следующие последовательности: GFNIKDTY (HCDR1, SEQ ID NO: 70), IDPANGNT (HCDR2, SEQ ID NO: 71), SRGPPGGIGEYIYAMDY (HCDR3; SEQ ID NO: 72).[00130] In some embodiments, the heavy chain variable region of a proposed anti-PD-L1 antibody or antigen binding domain thereof may have three CDRs having the following sequences: GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61 ), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62). In some embodiments, the heavy chain variable region of a proposed anti-PD-L1 antibody or antigen binding domain thereof may have three CDRs having the following sequences: GFDIKDTY (HCDR1, SEQ ID NO: 65), IDPADGNT (HCDR2, SEQ ID NO: 66), ARGLGAWFAS (HCDR3; SEQ ID NO: 67). In some embodiments, the heavy chain variable region of a proposed anti-PD-L1 antibody or antigen binding domain thereof may have three CDRs having the following sequences: GFNIKDTY (HCDR1, SEQ ID NO: 70), IDPANGNT (HCDR2, SEQ ID NO: 71), SRGPPGGIGEYIYAMDY (HCDR3; SEQ ID NO: 72).
[00131] В некоторых вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи предложенного антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего домена может иметь три CDR, имеющие следующие последовательности: QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64). В некоторых вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи предложенного антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего домена может иметь три CDR, имеющие следующие последовательности: QDITNS (LCDR1, SEQ ID NO: 68), YTS (LCDR2), QQGHTLPPT (LCDR3; SEQ ID NO: 69). В некоторых вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи предложенного антитела к PD-L1 или его антигенсвязывающего домена может иметь три CDR, имеющие следующие последовательности: SSVSSSY (LCDR1, SEQ ID NO: 73), STS (LCDR2), HQYHRSPPT (LCDR3; SEQ ID NO: 74).[00131] In some embodiments, the light chain variable region of a proposed anti-PD-L1 antibody or antigen binding domain thereof may have three CDRs having the following sequences: QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64). In some embodiments, the light chain variable region of a proposed anti-PD-L1 antibody or antigen binding domain thereof may have three CDRs having the following sequences: QDITNS (LCDR1, SEQ ID NO: 68), YTS (LCDR2), QQGHTLPPT (LCDR3; SEQ ID NO: 68) : 69). In some embodiments, the light chain variable region of a proposed anti-PD-L1 antibody or antigen binding domain thereof may have three CDRs having the following sequences: SSVSSSY (LCDR1, SEQ ID NO: 73), STS (LCDR2), HQYHRSPPT (LCDR3; SEQ ID NO: 73), STS (LCDR2), HQYHRSPPT (LCDR3; SEQ ID NO: 73). : 74).
[00132] В некоторых вариантах осуществления предложенное антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую три CDR, имеющие следующие последовательности: GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62), и вариабельную область легкой цепи, имеющую три CDR, имеющие следующие последовательности: QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64). В некоторых вариантах осуществления предложенное антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую три CDR, имеющие следующие последовательности: GFDIKDTY (HCDR1, SEQ ID NO: 65), IDPADGNT (HCDR2, SEQ ID NO: 66), ARGLGAWFAS (HCDR3; SEQ ID NO: 67), и вариабельную область легкой цепи, имеющую три CDR, имеющие следующие последовательности: QDITNS (LCDR1, SEQ ID NO: 68), YTS (LCDR2), QQGHTLPPT (LCDR3; SEQ ID NO: 69).В некоторых вариантах осуществления предложенное антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую три CDR, имеющие следующие последовательности: GFNIKDTY (HCDR1, SEQ ID NO: 70), IDPANGNT (HCDR2, SEQ ID NO: 71), SRGPPGGIGEYIYAMDY (HCDR3; SEQ ID NO: 72), и вариабельную область легкой цепи, имеющую три CDR, имеющие следующие последовательности: SSVSSSY (LCDR1, SEQ ID NO: 73), STS (LCDR2), HQYHRSPPT (LCDR3; SEQ ID NO: 74).[00132] In some embodiments, the proposed anti-PD-L1 antibody or antigen binding domain thereof comprises a heavy chain variable region having three CDRs having the following sequences: GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 60). 61), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62), and a light chain variable region having three CDRs having the following sequences: QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64). In some embodiments, the proposed anti-PD-L1 antibody or antigen binding domain thereof comprises a heavy chain variable region having three CDRs having the following sequences: GFDIKDTY (HCDR1, SEQ ID NO: 65), IDPADGNT (HCDR2, SEQ ID NO: 66), ARGLGAWFAS (HCDR3; SEQ ID NO: 67), and a light chain variable region having three CDRs having the following sequences: QDITNS (LCDR1, SEQ ID NO: 68), YTS (LCDR2), QQGHTLPPT (LCDR3; SEQ ID NO: 69 In some embodiments, the proposed anti-PD-L1 antibody or antigen binding domain thereof comprises a heavy chain variable region having three CDRs having the following sequences: GFNIKDTY (HCDR1, SEQ ID NO: 70), IDPANGNT (HCDR2, SEQ ID NO: 71 ), SRGPPGGIGEYIYAMDY (HCDR3; SEQ ID NO: 72), and a light chain variable region having three CDRs having the following sequences: SSVSSSY (LCDR1, SEQ ID NO: 73), STS (LCDR2), HQYHRSPPT (LCDR3; SEQ ID NO: : 74).
[00133] Если не указано иное, все раскрытые в настоящем документе последовательности CDR определены согласно методу IMGT, как описано в Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999). CDR1 состоит из положений с 27 по 38, CDR2 состоит из положений с 56 по 65, CDR3 для генов V зародышевой линии состоит из положений со 105 по 116, CDR3 для реаранжированных генов V-J или генов V-D-J состоит из положений со 105 по 117 (положение, предшествующее J-PHE или J-TRP 118) с гэпами наверху петли для реаранжированной CDR3-IMGT с менее чем 13 аминокислотами, или с дополнительными положениями 112.1, 111.1, 112.2, 111.2 и т. д. для реаранжированной CDR3-IMGT с более чем 13 аминокислотами. Положения, приведенные в этом абзаце, соответствуют нумерации IMGT, описанной в Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999).[00133] Unless otherwise stated, all CDR sequences disclosed herein are determined according to the IMGT method as described in Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999). CDR1 consists of positions 27 to 38, CDR2 consists of positions 56 to 65, CDR3 for germline V genes consists of positions 105 to 116, CDR3 for rearranged V-J genes or V-D-J genes consists of positions 105 to 117 (position preceding J-PHE or J-TRP 118) with gaps at the top of the loop for a rearranged CDR3-IMGT with less than 13 amino acids, or with additional positions 112.1, 111.1, 112.2, 111.2, etc. for a rearranged CDR3-IMGT with more than 13 amino acids. The provisions given in this paragraph correspond to the IMGT numbering described in Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999).
[00134] Антитела, специфически связывающиеся с PD-L1, входящие в состав слитых белков согласно изобретению, могут содержать Fc-часть, которая позволяет продлить период полувыведения in vivo биспецифической связывающей молекулы согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления такая Fc-часть предпочтительно имеет происхождение от человека, более предпочтительно, представляет собой человеческую Fc-часть антитела IgG1 или lgG4, еще более предпочтительно генетически модифицированную человеческую Fc-часть IgG1 или lgG4 с активированными или подавленными эффекторными функциями. В некоторых вариантах осуществления подавление эффекторных функций может быть предпочтительнее активации эффекторных функций. В некоторых вариантах осуществления такую Fc-часть генетически модифицируют для подавления эффекторных функций посредством мутации(ий) в положениях 234 и/или 235, нумерация согласно индексу EU Кабат (Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 2000). В некоторых вариантах осуществления для подавления эффекторных функций могут быть введены мутации в положениях F234 и L235 предложенного антитела к PD-L1. В других вариантах осуществления для подавления эффекторной функции могут быть введены мутации в положениях D265 и P329 предложенного антитела к PD-L1. Нумерация для обоих наборов этих возможных мутаций приведена согласно индексу EU Кабат (Shields et al., J Biol Chem, 2001).[00134] Antibodies that specifically bind to PD-L1 included in the fusion proteins of the invention may contain an Fc moiety that allows the in vivo half-life of the bispecific binding molecule of the invention to be extended. In some embodiments, such Fc portion is preferably of human origin, more preferably a human IgG1 or IgG4 Fc portion, even more preferably a genetically modified human IgG1 or IgG4 Fc portion with activated or suppressed effector functions. In some embodiments, suppression of effector functions may be preferable to activation of effector functions. In some embodiments, such an Fc portion is genetically modified to suppress effector functions through mutation(s) at positions 234 and/or 235, numbered according to the EU Kabat index (Johnson and Wu, Nucleic Acids Res, 2000). In some embodiments, mutations may be introduced at positions F234 and L235 of the proposed anti-PD-L1 antibody to suppress effector functions. In other embodiments, mutations may be introduced at positions D265 and P329 of the proposed anti-PD-L1 antibody to suppress effector function. The numbering for both sets of these possible mutations is given according to the EU Kabat index (Shields et al., J Biol Chem, 2001).
[00135] Различные способы получения антител и их фрагментов хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в Altshuler et al. (2010). Таким образом, например, поликлональные антитела могут быть получены из крови животного после иммунизации антигеном в смеси с добавками и адъювантами, а моноклональные антитела могут быть получены любым методом, который обеспечивает антитела, продуцируемые культурами стабильных клеточных линий. Примеры таких методов описаны, например, Harlow and Lane (1999), (1988), и включают гибридомную технологию, впервые описанную Köhler and Milstein, 1975, триомную технологию, технологию гибридомы из человеческих B-клеток (см., например, Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, Kozbor and Roder, Immunol Today, 1983) и технологию EBV-гибридомы для получения человеческих моноклональных антител (Cole et al., Cancer Res, 1984). Кроме того, рекомбинантные антитела могут быть получены из моноклональных антител или могут быть получены de novo с использованием различных методов дисплея, таких как фаговый, рибосомный, мРНК или клеточный дисплей. В некоторых вариантах осуществления подходящая система для экспрессии рекомбинантных (гуманизированных) антител или их фрагментов может быть выбрана, например, из линий клеток бактерий, дрожжей, насекомых, млекопитающих или трансгенных животных или растений см., например, патент США № 6,080,560; Holliger and Hudson, Nat Biotechnol, 2005). Кроме того, методы, описанные для получения одноцепочечных антител (см., среди прочего, патент США № 4,946,778), могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител, специфичных к мишени согласно данному изобретению. Поверхностный плазмонный резонанс, используемый в системе BIAcore, может быть использован для повышения эффективности фаговых антител.[00135] Various methods for producing antibodies and fragments thereof are well known in the art and are described, for example, in Altshuler et al. (2010). Thus, for example, polyclonal antibodies can be obtained from the blood of an animal after immunization with an antigen in a mixture with additives and adjuvants, and monoclonal antibodies can be obtained by any method that provides antibodies produced by cultures of stable cell lines. Examples of such methods are described, for example, by Harlow and Lane (1999), (1988), and include hybridoma technology, first described by Köhler and Milstein, 1975, triome technology, human B-cell hybridoma technology (see, for example, Li et al ., Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, Kozbor and Roder, Immunol Today, 1983) and EBV-hybridoma technology for the production of human monoclonal antibodies (Cole et al., Cancer Res, 1984). In addition, recombinant antibodies can be produced from monoclonal antibodies or can be produced de novo using various display methods such as phage, ribosomal, mRNA or cellular display. In some embodiments, a suitable system for expressing recombinant (humanized) antibodies or fragments thereof may be selected, for example, from bacterial, yeast, insect, mammalian, or transgenic animal or plant cell lines, see, for example, US Pat. No. 6,080,560; Holliger and Hudson, Nat Biotechnol, 2005). In addition, methods described for the production of single chain antibodies (see, inter alia, US Pat. No. 4,946,778) can be adapted to produce single chain antibodies specific for the target of this invention. Surface plasmon resonance used in the BIAcore system can be used to improve the effectiveness of phage antibodies.
C. Иллюстративные мутеины липокалина согласно изобретению.C. Exemplary lipocalin muteins according to the invention.
[00136] Липокалины представляют собой белковые связывающие молекулы, которые естественным образом эволюционировали до связывания лигандов. Липокалины содержатся во многих организмах, включая позвоночных, насекомых, растений и бактерии. Члены семейства белков липокалинов (Pervaiz and Brew, FASEB J, 1987), как правило, представляют собой небольшие секретируемые белки и имеет одну полипептидную цепь. Они характеризуются рядом различных свойств молекулярного распознавания: их связыванием с различными, преимущественно гидрофобными малыми молекулами (такими как ретиноиды, жирные кислоты, холестерины, простагландины, биливердины, феромоны, вкусовые добавки и отдушки) и их связыванием с определенными рецепторами клеточной поверхности и образованием ими макромолекулярных комплексов. Хотя в прошлом их классифицировали в первую очередь как транспортные белки, теперь ясно, что липокалины выполняют множество физиологических функций. Они включают роль в транспорте ретинола, обонянии, феромоновой сигнализации и синтезе простагландинов. Липокалины также участвуют в регуляции иммунного ответа и опосредовании клеточного гомеостаза (обзор приведен, например, в Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996).[00136] Lipocalins are protein binding molecules that have naturally evolved to bind ligands. Lipocalins are found in many organisms, including vertebrates, insects, plants and bacteria. Members of the lipocalin family of proteins (Pervaiz and Brew, FASEB J, 1987) are typically small secreted proteins and have a single polypeptide chain. They are characterized by a number of different molecular recognition properties: their binding to various, predominantly hydrophobic small molecules (such as retinoids, fatty acids, cholesterols, prostaglandins, biliverdins, pheromones, flavoring agents and odorants) and their binding to certain cell surface receptors and their formation of macromolecular complexes. Although in the past they were classified primarily as transport proteins, it is now clear that lipocalins have a variety of physiological functions. These include roles in retinol transport, olfaction, pheromone signaling, and prostaglandin synthesis. Lipocalins are also involved in regulating the immune response and mediating cellular homeostasis (reviewed in, for example, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996).
[00137] Липокалины обладают необычно низким уровнем общей консервативности последовательностей, часто с идентичностью последовательностей менее 20%. Напротив, их общий характер фолдинга в высокой степени консервативен. Центральная часть структуры липокалина состоит из одного восьмицепочечного антипараллельного β-листа, образующего замкнутую фигуру, представляющую собой непрерывно связанный водородными связями β-цилиндр. Этот β-цилиндр образует центральную полость. Один конец цилиндра стерически заблокирован N-концевым пептидным сегментом, который проходит через его дно, а также тремя пептидными петлями, соединяющими β-цепи. Другой конец β-цилиндра открыт для растворителя и охватывает сайт связывания мишени, который образован четырьмя гибкими пептидными петлями (AB, CD, EF и GH). Именно разнообразие петель в составе в остальном жесткого каркаса липокалина приводит к возникновению различных механизмов связывания, каждый из которых способен вмещать мишени различного размера, формы и химического характера (обзор приведен, например, в Skerra, Biochim Biophys Acta, 2000, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996).[00137] Lipocalins have an unusually low level of overall sequence conservation, often with less than 20% sequence identity. In contrast, their general folding pattern is highly conservative. The central part of the lipocalin structure consists of a single eight-stranded antiparallel β-sheet forming a closed figure representing a continuously hydrogen-bonded β-cylinder. This β-cylinder forms the central cavity. One end of the barrel is sterically blocked by an N-terminal peptide segment that extends through its bottom, as well as by three peptide loops connecting the β-strands. The other end of the β-barrel is solvent-exposed and encloses the target binding site, which is formed by four flexible peptide loops (AB, CD, EF, and GH). It is the diversity of loops within the otherwise rigid lipocalin framework that gives rise to different binding mechanisms, each capable of accommodating targets of different size, shape and chemical nature (reviewed, for example, in Skerra, Biochim Biophys Acta, 2000, Flower et al., Biochim Biophys Acta, 2000, Flower, Biochem J, 1996).
[00138] Мутеин липокалина согласно настоящему изобретению может представлять собой мутеин любого липокалина. Примеры подходящих липокалинов (также иногда называемых «референсный липокалин», «липокалин дикого типа», «референсные белковые каркасы» или просто «каркасы»), мутеин которых можно использовать, включают, не ограничиваясь перечисленным, липокалин слезной жидкости (липокалин-1, Tlc или белок железы фон Эбнера), ретинол-связывающий белок, нейтрофильную простагландин-D-синтазу липокалинового типа, β-лактоглобулин, билин-связывающий белок (BBP), аполипопротеин D (APOD), липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (NGAL), белок, связанный с α2-микроглобулином (A2m), 24p3/утерокалин (24p3), белок железы фон Эбнера 1 (VEGP 1), белок железы фон Эбнера 2 (VEGP 2) и мажорный аллерген Can f 1 (ALL-1). В связанных вариантах осуществления мутеин липокалина получают из группы липокалинов, состоящей из человеческого липокалина слезной жидкости (hTlc), человеческого липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (hNGAL), человеческого аполипопротеина D (hAPOD) и билин-связывающего белка из Pieris brassicae.[00138] The lipocalin mutein of the present invention may be any lipocalin mutein. Examples of suitable lipocalins (also sometimes referred to as "reference lipocalin", "wild type lipocalin", "reference protein scaffolds" or simply "scaffolds") whose mutein may be used include, but are not limited to, tear lipocalin (lipocalin-1, Tlc or von Ebner gland protein), retinol binding protein, neutrophil prostaglandin D-synthase lipocalin type, β-lactoglobulin, bilin binding protein (BBP), apolipoprotein D (APOD), neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), protein , α2-microglobulin-related (A2m), 24p3/uterocalin (24p3), von Ebner gland protein 1 (VEGP 1), von Ebner gland protein 2 (VEGP 2) and major allergen Can f 1 (ALL-1). In related embodiments, the lipocalin mutein is derived from the group of lipocalins consisting of human tear lipocalin (hTlc), human neutrophil gelatinase-associated lipocalin (hNGAL), human apolipoprotein D (hAPOD), and bilin binding protein from Pieris brassicae.
[00139] Аминокислотная последовательность мутеина липокалина согласно изобретению может обладать высокой идентичностью последовательности по сравнению с референсным липокалином (или липокалином дикого типа), из которого он получен, например, hTlc или hNGAL, по сравнению с идентичностью последовательностей с другим липокалином (см. также выше). В этом общем контексте аминокислотная последовательность мутеина липокалина согласно изобретению по меньшей мере по существу схожа с аминокислотной последовательностью соответствующего референсного липокалина (дикого типа) при условии, что при выравнивании могут быть использованы гэпы (как определено в настоящем документе), которые является результатом добавлений или делеций аминокислот. Соответствующая последовательность мутеина липокалина согласно изобретению, будучи по существу схожей с последовательностями соответствующего референсного липокалина (дикого типа), в некоторых вариантах осуществления обладает по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 90% идентичностью, в том числе по меньшей мере 95% идентичностью последовательности соответствующего липокалина. При этом мутеин липокалина согласно изобретению, безусловно, может содержать замены, как описано в настоящем документе, которые придают мутеину липокалина способность связываться с CD137.[00139] The amino acid sequence of a lipocalin mutein according to the invention may have high sequence identity compared to the reference lipocalin (or wild type lipocalin) from which it is derived, for example hTlc or hNGAL, compared to sequence identity to another lipocalin (see also above ). In this general context, the amino acid sequence of a lipocalin mutein according to the invention is at least substantially similar to the amino acid sequence of the corresponding reference lipocalin (wild type), provided that the alignment may utilize gaps (as defined herein) that result from additions or deletions amino acids. The corresponding lipocalin mutein sequence of the invention, while being substantially similar to the sequences of the corresponding reference lipocalin (wild type), in some embodiments has at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 82%, at least 85%, at least 87%, at least 90% identity, including at least 95% sequence identity to the corresponding lipocalin. However, the lipocalin mutein of the invention may of course contain substitutions, as described herein, that impart the ability to bind CD137 to the lipocalin mutein.
[00140] Как правило, мутеин липокалина содержит один или более мутированных аминокислотных остатков - относительно аминокислотной последовательности липокалина дикого типа или референсного липокалина, например, hTlc и hNGAL - в четырех петлях на открытом конце, которые содержат лиганд-связывающий карман и образуют вход в лиганд-связывающий карман (см. выше). Как объяснялось выше, эти области имеют ключевое значение для определения специфичности связывания мутеина липокалина к желаемой мишени. В некоторых вариантах осуществления мутеин липокалина согласно изобретению может также содержать области мутированных аминокислотных остатков за пределами четырех петель. В некоторых вариантах осуществления мутеин липокалина согласно изобретению может содержать один или более мутированных аминокислотных остатков в одной или более из трех пептидных петель (обозначенных BC, DE и FG), соединяющих β-цепи на закрытом конце липокалина. В некоторых вариантах осуществления мутеин, полученный из липокалина слезной жидкости, липокалина NGAL или его гомолога, может иметь 1, 2, 3, 4 или более мутантных аминокислотных остатков в любом положении последовательности в N-концевой области и/или в трех пептидных петлях BC, DE и FG, расположенных на конце β-цилиндрической структуры, противоположной естественному связывающему карману липокалина. В некоторых вариантах осуществления мутеин, полученный из липокалина слезной жидкости, липокалина NGAL или его гомолога, может не иметь мутированных аминокислотных остатков в пептидной петле DE, расположенной на конце β-цилиндрической структуры, по сравнению с последовательностью липокалина слезной жидкости дикого типа.[00140] Typically, a lipocalin mutein contains one or more mutated amino acid residues - relative to the amino acid sequence of wild-type lipocalin or reference lipocalin, for example, hTlc and hNGAL - in four open-end loops that contain the ligand-binding pocket and form the entrance to the ligand -binding pocket (see above). As explained above, these regions are key to determining the binding specificity of the lipocalin mutein to the desired target. In some embodiments, the lipocalin mutein of the invention may also contain regions of mutated amino acid residues beyond the four loops. In some embodiments, the lipocalin mutein of the invention may contain one or more mutated amino acid residues in one or more of three peptide loops (designated BC, DE and FG) connecting the β-strands at the closed end of the lipocalin. In some embodiments, a mutein derived from tear lipocalin, NGAL lipocalin, or a homolog thereof may have 1, 2, 3, 4 or more mutated amino acid residues at any sequence position in the N-terminal region and/or the three BC peptide loops, DE and FG located at the end of the β-barrel structure opposite the natural lipocalin binding pocket. In some embodiments, a mutein derived from tear lipocalin, NGAL lipocalin, or a homologue thereof may not have mutated amino acid residues in the DE peptide loop located at the end of the β-barrel structure compared to the wild-type tear lipocalin sequence.
[00141] В некоторых вариантах осуществления мутеин липокалина согласно изобретению может включать один или более, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже более мутированных аминокислотных остатков по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующего референсного липокалина (дикого типа), при условии, что такой мутеин липокалина должен быть способен связываться с CD137. В некоторых вариантах осуществления мутеин липокалина согласно изобретению включает по меньшей мере два, включая 2, 3, 4, 5 или даже более, мутированных аминокислотных остатков, где нативный аминокислотный остаток соответствующего референсного липокалина (дикого типа) замещен остатком аргинина. [00141] In some embodiments, the lipocalin mutein of the invention may include one or more, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20 or even more mutated amino acid residues compared to the amino acid sequence of the corresponding reference lipocalin (wild type), provided that such lipocalin mutein must be able to bind to CD137. In some embodiments, the lipocalin mutein of the invention includes at least two, including 2, 3, 4, 5, or even more, mutated amino acid residues, wherein the native amino acid residue of the corresponding reference lipocalin (wild type) is replaced by an arginine residue.
[00142] Рассматриваются любые типы и количества мутаций, включая замены, делеции и вставки, при условии, что полученный мутеин липокалина сохраняет свою способность связывать CD137 и/или обладает по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, или более высокой идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью референсного липокалина (дикого типа), например, зрелого hTlc или зрелого hNGAL. [00142] Any type and number of mutations are contemplated, including substitutions, deletions and insertions, as long as the resulting lipocalin mutein retains its ability to bind CD137 and/or has at least 60%, such as at least 65%, 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, or greater sequence identity to the amino acid sequence of reference lipocalin (wild type), for example, mature hTlc or mature hNGAL.
[00143] В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой консервативную замену. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой неконсервативную замену или одну или более из приведенных ниже иллюстративных замен.[00143] In some embodiments, the replacement is a conservative replacement. In some embodiments, the substitution is a non-conservative substitution or one or more of the following exemplary substitutions.
[00144] В частности, чтобы определить, соответствует ли аминокислотный остаток в аминокислотной последовательности мутеина липокалина, отличающийся от референсного липокалина (дикого типа), определенному положению в аминокислотной последовательности референсного липокалина (дикого типа), специалист может использовать средства и методы, хорошо известные в данной области техники, например, выравнивания, вручную или с использованием компьютерных программ, таких как BLAST 2.0, что расшифровывается как средство поиска основного локального выравнивания, или ClustalW, или любой другой подходящей программы, которая подходит для генерации выравниваний последовательностей. Соответственно, аминокислотная последовательность референсного липокалина (дикого типа) может служить «рассматриваемой последовательностью» или «референсной последовательностью», в то время как аминокислотная последовательность мутеина липокалина служит «искомой последовательностью» (см. также выше). [00144] In particular, to determine whether an amino acid residue in the amino acid sequence of a lipocalin mutein that is different from the reference lipocalin (wild type) corresponds to a particular position in the amino acid sequence of the reference lipocalin (wild type), one of ordinary skill in the art may use tools and methods well known in the art. art, such as alignment, manually or using computer programs such as BLAST 2.0, which stands for Basic Local Alignment Search Tool, or ClustalW, or any other suitable program that is suitable for generating sequence alignments. Accordingly, the amino acid sequence of a reference lipocalin (wild type) may serve as a “target sequence” or “reference sequence,” while the amino acid sequence of a lipocalin mutein serves as a “target sequence” (see also above).
[00145] Консервативные замены обычно представляют собой следующие замены, перечисленные в соответствии с подлежащей мутации аминокислотой, за каждой из которых следует одна или более замен, которые можно считать консервативными: Ala → Ser, Thr или Val; Arg → Lys, Gln, Asn или His; Asn → Gln, Glu, Asp или His; Asp → Glu, Gln, Asn или His; Gln → Asn, Asp, Glu или His; Glu → Asp, Asn, Gln или His; His → Arg, Lys, Asn, Gln, Asp или Glu; Ile → Thr, Leu, Met, Phe, Val, Trp, Tyr, Ala или Pro; Leu → Thr, Ile, Val, Met, Ala, Phe, Pro, Tyr или Trp; Lys → Arg, His, Gln или Asn; Met → Thr, Leu, Tyr, Ile, Phe, Val, Ala, Pro или Trp; Phe → Thr, Met, Leu, Tyr, Ile, Pro, Trp, Val или Ala; Ser → Thr, Ala или Val; Thr → Ser, Ala, Val, Ile, Met, Val, Phe, Pro или Leu; Trp → Tyr, Phe, Met, Ile или Leu; Tyr → Trp, Phe, Ile, Leu или Met; Val → Thr, Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Ser или Pro. Другие замены также допустимы и могут быть определены эмпирически или в соответствии с другими известными консервативными или неконсервативными заменами. В качестве дополнительного ориентира каждая из следующих групп содержит аминокислоты, которые обычно можно использовать для определения консервативных замен друг друга:[00145] Conservative substitutions are typically the following substitutions, listed according to the amino acid being mutated, each followed by one or more substitutions that may be considered conservative: Ala → Ser, Thr or Val; Arg → Lys, Gln, Asn or His; Asn → Gln, Glu, Asp or His; Asp → Glu, Gln, Asn or His; Gln → Asn, Asp, Glu or His; Glu → Asp, Asn, Gln or His; His → Arg, Lys, Asn, Gln, Asp or Glu; Ile → Thr, Leu, Met, Phe, Val, Trp, Tyr, Ala or Pro; Leu → Thr, Ile, Val, Met, Ala, Phe, Pro, Tyr or Trp; Lys → Arg, His, Gln or Asn; Met → Thr, Leu, Tyr, Ile, Phe, Val, Ala, Pro or Trp; Phe → Thr, Met, Leu, Tyr, Ile, Pro, Trp, Val or Ala; Ser → Thr, Ala or Val; Thr → Ser, Ala, Val, Ile, Met, Val, Phe, Pro or Leu; Trp → Tyr, Phe, Met, Ile or Leu; Tyr → Trp, Phe, Ile, Leu or Met; Val → Thr, Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Ser or Pro. Other substitutions are also acceptable and may be determined empirically or in accordance with other known conservative or non-conservative substitutions. As an additional guide, each of the following groups contains amino acids that can generally be used to determine conservative substitutions for each other:
(a) Аланин (Ala), серин (Ser), треонин (Thr), валин (Val)(a) Alanine (Ala), serine (Ser), threonine (Thr), valine (Val)
(b) Аспарагиновая кислота (Asp), глутаминовая кислота (Glu), глутамин (Gln), аспарагин (Asn), гистидин (His)(b) Aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu), glutamine (Gln), asparagine (Asn), histidine (His)
(c) Аргинин (Arg), лизин (Lys), глутамин (Gln), аспарагин (Asn), гистидин (His)(c) Arginine (Arg), lysine (Lys), glutamine (Gln), asparagine (Asn), histidine (His)
(d) Изолейцин (Ile), лейцин (Leu), метионин (Met), валин (Val), аланин (Ala), фенилаланин (Phe), треонин (Thr), пролин (Pro)(d) Isoleucine (Ile), Leucine (Leu), Methionine (Met), Valine (Val), Alanine (Ala), Phenylalanine (Phe), Threonine (Thr), Proline (Pro)
(e) Изолейцин (Ile), лейцин (Leu), метионин (Met), фенилаланин (Phe), тирозин (Tyr), триптофан (Trp).(e) Isoleucine (Ile), leucine (Leu), methionine (Met), phenylalanine (Phe), tyrosine (Tyr), tryptophan (Trp).
[00146] Если такие консервативные замены приводят к изменению биологической активности, могут быть внесены более существенные изменения, такие как следующие, или как дополнительно описано ниже со ссылкой на классы аминокислот, и продукты могут быть подвергнуты скринингу на наличие желаемых характеристик. Примерами таких более существенных изменений являются: Ala → Leu или Phe; Arg → Glu; Asn → Ile, Val или Trp; Asp → Met; Cys → Pro; Gln → Phe; Glu → Arg; His → Gly; Ile → Lys, Glu или Gln; Leu → Lys или Ser; Lys → Tyr; Met → Glu; Phe → Glu, Gln или Asp; Trp → Cys; Tyr → Glu или Asp; Val → Lys, Arg, His. [00146] If such conservative substitutions result in a change in biological activity, more significant changes, such as the following, or as further described below with reference to amino acid classes, can be made, and products can be screened for the desired characteristics. Examples of such more significant changes are: Ala → Leu or Phe; Arg → Glu; Asn → Ile, Val or Trp; Asp → Met; Cys → Pro; Gln → Phe; Glu → Arg; His → Gly; Ile → Lys, Glu or Gln; Leu → Lys or Ser; Lys → Tyr; Met → Glu; Phe → Glu, Gln or Asp; Trp → Cys; Tyr → Glu or Asp; Val → Lys, Arg, His.
[00147] В некоторых вариантах осуществления существенные модификации физических и биологических свойств липокалина (мутеина) достигаются путем выбора замен, которые значительно различаются по своему влиянию на поддержание (а) структуры полипептидного остова в области замены, например, в виде листовой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте, или (c) объема боковой цепи. [00147] In some embodiments, significant modifications to the physical and biological properties of the lipocalin (mutein) are achieved by selecting substitutions that vary significantly in their effect on maintaining (a) the structure of the polypeptide backbone in the region of the substitution, e.g., a sheet or helical conformation, ( b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the target site, or (c) the volume of the side chain.
[00148] Природные остатки делятся на группы на основе общих свойств боковой цепи: (1) гидрофобные: метионин, аланин, валин, лейцин, изолейцин; (2) нейтральные гидрофильные: цистеин, серин, треонин, аспарагин, глутамин; (3) кислые: аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; (4) основные: гистидин, лизин, аргинин; (5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: глицин, пролин; и (6) ароматические: триптофан, тирозин, фенилаланин. В некоторых вариантах осуществления замены могут повлечь за собой замену члена одного из этих классов на другой класс.[00148] Natural residues are divided into groups based on general side chain properties: (1) hydrophobic: methionine, alanine, valine, leucine, isoleucine; (2) neutral hydrophilic: cysteine, serine, threonine, asparagine, glutamine; (3) acidic: aspartic acid, glutamic acid; (4) basic: histidine, lysine, arginine; (5) residues affecting chain orientation: glycine, proline; and (6) aromatic: tryptophan, tyrosine, phenylalanine. In some embodiments, replacements may involve replacing a member of one of these classes with another class.
[00149] Любой остаток цистеина, не участвующий в поддержании надлежащей конформации соответствующего липокалина, также может быть заменен, обычно серином, для улучшения окислительной устойчивости молекулы и предотвращения аберрантного перекрестного связывания. И наоборот, цистеиновая связь (связи) может быть добавлена к липокалину для улучшения его стабильности.[00149] Any cysteine residue not involved in maintaining the proper conformation of the corresponding lipocalin can also be replaced, usually with serine, to improve the oxidative stability of the molecule and prevent aberrant cross-linking. Conversely, cysteine linkage(s) can be added to lipocalin to improve its stability.
D. Иллюстративные CD137-специфические мутеины липокалина согласно изобретению.D. Exemplary CD137-specific lipocalin muteins according to the invention.
[00150] Как отмечалось выше, липокалин представляет собой полипептид, определяемый его супервторичной структурой, а именно, супервторичной структурной областью цилиндрического β-складчатого листа, содержащей восемь β-цепей, соединенных попарно четырьмя петлями на одном конце, образуя, таким образом, связывающий карман. Настоящее описание не ограничивается мутеинами липокалина, конкретно раскрытыми в настоящем документе. В этой связи изобретение относится к мутеину липокалина, имеющему супервторичную структурную область цилиндрического β-складчатого листа, содержащую восемь β-цепей, соединенных попарно четырьмя петлями на одном конце, образуя, таким образом, связывающий карман, в котором по меньшей мере одна аминокислота каждой из по меньшей мере трех из четырех указанных петель была мутирована, и где указанный липокалин эффективен для связывания CD137 с обнаружимой аффинностью. [00150] As noted above, lipocalin is a polypeptide defined by its supersecondary structure, namely, a supersecondary structural region of a cylindrical β-pleated sheet containing eight β-strands linked in pairs by four loops at one end, thereby forming a binding pocket . The present description is not limited to the lipocalin muteins specifically disclosed herein. In this regard, the invention relates to a lipocalin mutein having a supersecondary structural region of a cylindrical β-pleated sheet containing eight β-strands linked in pairs by four loops at one end, thereby forming a binding pocket in which at least one amino acid of each at least three of the four loops have been mutated, and wherein said lipocalin is effective for binding CD137 with detectable affinity.
[00151] В некоторых вариантах осуществления мутеины липокалина, раскрытые в настоящем документе, могут представлять собой или содержать мутеин зрелого человеческого липокалина слезной жидкости (hTlc). Мутеин зрелого hTlc может называться в настоящем документе «мутеином hTlc». В некоторых других вариантах осуществления мутеин липокалина, раскрытый в настоящем документе, представляет собой мутеин зрелого человеческого липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (hNGAL). Мутеин зрелого hNGAL может называться в настоящем документе «мутеином hNGAL».[00151] In some embodiments, the lipocalin muteins disclosed herein may be or contain a mature human tear lipocalin (hTlc) mutein. Mature hTlc mutein may be referred to herein as “hTlc mutein.” In some other embodiments, the lipocalin mutein disclosed herein is a mature human neutrophil gelatinase-associated lipocalin (hNGAL) mutein. Mature hNGAL mutein may be referred to herein as “hNGAL mutein.”
[00152] В одном из аспектов настоящее изобретение включает любое количество мутеинов липокалина, полученных из референсного липокалина (дикого типа), предпочтительно полученных из зрелого hTlc или зрелого hNGAL, которые связывают CD137 с обнаружимой аффинностью. В связанном аспекте изобретение включает различные мутеины липокаинов, способные активировать нисходящие сигнальные пути CD137 путем связывания с CD137. В этом смысле CD137 можно рассматривать как неприродную мишень референсного липокалина (дикого типа), предпочтительно hTlc или hNGAL, где «неприродная мишень» относится к веществу, которое не связывается с референсным липокалином (дикого типа) при физиологических условиях. Путем генетической модификации референсных липокалинов (дикого типа) с помощью одной или более мутаций в определенных положениях последовательности авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что возможно достижение высокой аффинности и высокой специфичности к неприродной мишени, CD137. В некоторых вариантах осуществления в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или даже более триплетах нуклеотидов, кодирующих определенные положения последовательности в липокалинах дикого типа, может быть осуществлен случайный мутагенез путем замены подмножества нуклеотидных триплетов в этих положениях с целью создания мутеина липокалина, способного связывать CD137.[00152] In one aspect, the present invention includes any number of lipocalin muteins derived from reference lipocalin (wild type), preferably derived from mature hTlc or mature hNGAL, that bind CD137 with detectable affinity. In a related aspect, the invention includes various lipocaine muteins capable of activating CD137 downstream signaling pathways by binding to CD137. In this sense, CD137 can be considered as a non-natural target of the reference lipocalin (wild type), preferably hTlc or hNGAL, where "non-natural target" refers to a substance that does not bind to the reference lipocalin (wild type) under physiological conditions. By genetically modifying reference lipocalins (wild type) with one or more mutations at specific sequence positions, we have demonstrated that it is possible to achieve high affinity and high specificity for a non-natural target, CD137. In some embodiments, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 or even more triplets of nucleotides encoding specific sequence positions in wild-type lipocalins may be subject to random substitution mutagenesis subsets of nucleotide triplets at these positions to create a lipocalin mutein capable of binding CD137.
[00153] В некоторых вариантах осуществления мутеины липокалинов согласно изобретению могут иметь мутацию, включая замену, делецию и вставку аминокислотного остатка(ов) в одном или более положениях последовательности, соответствующих линейной полипептидной последовательности референсного липокалина, предпочтительно hTlc или hNGAL. В некоторых вариантах осуществления количество аминокислотных остатков мутеина липокалина согласно изобретению, которые являются мутированными по сравнению с аминокислотной последовательностью референсного липокалина, предпочтительно hTlc или hNGAL, составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более, например, 25, 30, 35, 40, 45 или 50, где 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 является предпочтительным, а 9, 10 или 11 даже более предпочтительным. Однако предпочтительно, чтобы мутеин липокалина согласно изобретению оставался способным связывать CD137.[00153] In some embodiments, the lipocalin muteins of the invention may have a mutation, including substitution, deletion, and insertion of amino acid residue(s) at one or more sequence positions corresponding to the linear polypeptide sequence of the reference lipocalin, preferably hTlc or hNGAL. In some embodiments, the number of amino acid residues of a lipocalin mutein according to the invention that are mutated from the amino acid sequence of a reference lipocalin, preferably hTlc or hNGAL, is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more, for example, 25, 30, 35, 40, 45 or 50, where 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 is preferred, and 9, 10 or 11 is even more preferred. However, it is preferred that the lipocalin mutein of the invention remains capable of binding CD137.
[00154] В некоторых вариантах осуществления в мутеине липокалина согласно настоящему изобретению может отсутствовать 1, 2, 3, 4 или более аминокислот на его N-конце и/или 1, 2 или более аминокислот на его C-конце, по сравнению с соответствующим референсным липокалином (дикого типа); например, SEQ ID NO: 34-40. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает мутеины hTlc, как определено выше, в которых первые один, два, три или четыре N-концевых аминокислотных остатка последовательности зрелого hTlc (His-His-Leu-Leu; положения 1-4) и/или последние один или два C-концевых аминокислотных остатка (Ser-Asp; положения 157-158) линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc были подвергнуты делеции (например, SEQ ID NO: 34-40). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает мутеины hNGAL, как определено выше, в которых аминокислотные остатки (Lys-Asp-Pro, положения 46-48) линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL были подвергнуты делеции (SEQ ID NO: 45). Кроме того, мутеин липокалина согласно изобретению может включать (природную) аминокислотную последовательность дикого типа референсного липокалина (дикого типа), предпочтительно hTlc или hNGAL, вне мутированных положений аминокислотной последовательности. [00154] In some embodiments, the lipocalin mutein of the present invention may lack 1, 2, 3, 4 or more amino acids at its N-terminus and/or 1, 2 or more amino acids at its C-terminus, compared to the corresponding reference lipocalin (wild type); for example, SEQ ID NO: 34-40. In some embodiments, the present invention covers hTlc muteins as defined above, wherein the first one, two, three, or four N-terminal amino acid residues of the mature hTlc sequence (His-His-Leu-Leu; positions 1-4) and/or the last one or two C-terminal amino acid residues (Ser-Asp; positions 157-158) of the mature hTlc linear polypeptide sequence have been deleted (eg, SEQ ID NO: 34-40). In some embodiments, the present invention covers hNGAL muteins, as defined above, in which amino acid residues (Lys-Asp-Pro, positions 46-48) of the linear polypeptide sequence of mature hNGAL have been deleted (SEQ ID NO: 45). In addition, the lipocalin mutein of the invention may include the (natural) wild-type amino acid sequence of the reference lipocalin (wild-type), preferably hTlc or hNGAL, outside of mutated amino acid sequence positions.
[00155] В некоторых вариантах осуществления один или более мутированных аминокислотных остатков, включенных в мутеин липокалина согласно изобретению, существенно не затрудняют или не препятствуют связывающей активности к выбранной мишени и фолдингу мутеина. Такие мутации, включая замену, делецию и вставку, могут быть выполнены на уровне ДНК с использованием принятых стандартных методов (Sambrook and Russell, 2001, Molecular cloning: a laboratory manual). В некоторых вариантах осуществления мутированный аминокислотный остаток (остатки) в одном или более положениях последовательности, соответствующих линейной полипептидной последовательности референсного липокалина (дикого типа), предпочтительно hTlc или hNGAL, введен посредством случайного мутагенеза путем замены триплета(ов) нуклеотидов, кодирующих соответствующие положения последовательности референсного липокалина, подмножеством триплетов нуклеотидов. [00155] In some embodiments, one or more mutated amino acid residues included in the lipocalin mutein of the invention do not significantly hinder or interfere with the binding activity to the selected target and folding of the mutein. Such mutations, including substitution, deletion and insertion, can be performed at the DNA level using established standard methods (Sambrook and Russell, 2001, Molecular cloning: a laboratory manual). In some embodiments, the mutated amino acid residue(s) at one or more sequence positions corresponding to the linear polypeptide sequence of the reference lipocalin (wild type), preferably hTlc or hNGAL, is introduced by random mutagenesis by replacing the triplet(s) of nucleotides encoding the corresponding reference sequence positions lipocalin, a subset of nucleotide triplets.
[00156] В некоторых вариантах осуществления предложенный мутеин липокалина, который связывается с CD137 с обнаружимой аффинностью, может включать по меньшей мере одну аминокислотную замену нативного остатка цистеина другой аминокислотой, например, остатком серина. В некоторых вариантах осуществления мутеин липокалина, который связывает CD137 с обнаружимой аффинностью, может включать один или более ненативных остатков цистеина, заменяющих одну или более аминокислот референсного липокалина (дикого типа), предпочтительно hTlc или hNGAL. В некоторых вариантах осуществления мутеин липокалина согласно изобретению включает по меньшей мере две аминокислотные замены нативной аминокислоты остатком цистеина, чтобы образовать таким образом один или более цистеиновых мостиков. В некоторых вариантах осуществления указанный цистеиновый мостик может соединять по меньшей мере две петлевые области. Определение этих областей используется в настоящем документе в соответствии с (Biochim Biophys Acta, 2000), Flower (1996) и Breustedt et al. (2005). [00156] In some embodiments, a proposed lipocalin mutein that binds CD137 with detectable affinity may include at least one amino acid substitution of a native cysteine residue with another amino acid, such as a serine residue. In some embodiments, a lipocalin mutein that binds CD137 with detectable affinity may include one or more non-native cysteine residues replacing one or more amino acids of a reference lipocalin (wild type), preferably hTlc or hNGAL. In some embodiments, the lipocalin mutein of the invention includes at least two amino acid substitutions of a native amino acid with a cysteine residue to thereby form one or more cysteine bridges. In some embodiments, said cysteine bridge may connect at least two loop regions. The definition of these regions is used herein according to (Biochim Biophys Acta, 2000), Flower (1996) and Breustedt et al. (2005).
[00157] Как правило, мутеин липокалина согласно изобретению может обладать по меньшей мере 70%, в том числе по меньшей мере приблизительно 80%, например, по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1) или зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2). [00157] Typically, the lipocalin mutein of the invention may have at least 70%, including at least about 80%, such as at least about 85%, amino acid sequence identity with the amino acid sequence of mature hTlc (SEQ ID NO: 1 ) or mature hNGAL (SEQ ID NO: 2).
[00158] В некоторых аспектах настоящего изобретения предложены CD137-связывающие мутеины hTlc. В этом отношении в изобретении предложены один или более мутеинов hTlc, способных связывать CD137 с аффинностью, измеряемой посредством KD, равной приблизительно 300 нМ, 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ или ниже. В некоторых вариантах осуществления предложенные мутеины hTlc способны связывать CD137 со значением EC50 приблизительно 250 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 20 нМ или даже ниже. В некоторых других вариантах осуществления CD137-связывающие мутеины hTlc могут обладать перекрестной реактивностью с CD137 яванского макака (cyCD137). [00158] In some aspects of the present invention, CD137-binding hTlc muteins are provided. In this regard, the invention provides one or more hTlc muteins capable of binding CD137 with an affinity, measured by K D , of approximately 300 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM or lower. In some embodiments, the proposed hTlc muteins are capable of binding CD137 with an EC 50 value of approximately 250 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, or even lower. In some other embodiments, hTlc CD137-binding muteins may be cross-reactive with cynomolgus CD137 (cyCD137).
[00159] В некоторых вариантах осуществления мутеин hTlc согласно изобретению может препятствовать связыванию CD137L с CD137.[00159] In some embodiments, the hTlc mutein of the invention may interfere with the binding of CD137L to CD137.
[00160] В некоторых вариантах осуществления предложенные мутеины hTlc могут содержать мутированный аминокислотный остаток в одном или более положениях, соответствующих положениям 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 и 153 линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1). [00160] In some embodiments, the proposed hTlc muteins may contain a mutated amino acid residue at one or more positions corresponding to positions 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71 , 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 and 153 linear polypeptide sequence of mature hTlc (SEQ ID NO: 1).
[00161] В некоторых вариантах осуществления предложенные мутеины hTlc могут содержать мутированный аминокислотный остаток в одном или более положениях, соответствующих положениям 26-34, 55-58, 60-61, 65, 104-106 и 108 линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1). [00161] In some embodiments, the proposed hTlc muteins may contain a mutated amino acid residue at one or more positions corresponding to positions 26-34, 55-58, 60-61, 65, 104-106, and 108 of the linear mature hTlc polypeptide sequence (SEQ ID NO: 1).
[00162] В некоторых вариантах осуществления предложенные мутеины hTlc могут дополнительно содержать мутированный аминокислотный остаток в одном или более положениях, соответствующих положениям 101, 111, 114 и 153 линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1). [00162] In some embodiments, the proposed hTlc muteins may further comprise a mutated amino acid residue at one or more positions corresponding to positions 101, 111, 114, and 153 of the linear mature hTlc polypeptide sequence (SEQ ID NO: 1).
[00163] В некоторых вариантах осуществления предложенные мутеины hTlc могут содержать мутированный аминокислотный остаток в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или даже более положениях, соответствующих положениям 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 и 153 линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления предложенные мутеины hTlc способны связывать CD137, в частности, человеческий CD137.[00163] In some embodiments, the proposed hTlc muteins may contain a mutated amino acid residue at 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 or even more provisions corresponding to provisions 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 and 153 of the linear polypeptide sequence of mature hTlc (SEQ ID NO: 1). In some preferred embodiments, the proposed hTlc muteins are capable of binding CD137, in particular human CD137.
[00164] В некоторых вариантах осуществления предложенные мутеины hTlc могут содержать мутированный аминокислотный остаток в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или даже более положениях, соответствующих положениям 26-34, 55-58, 60-61, 65, 104-106 и 108 линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления предложенные мутеины hTlc способны связывать CD137, в частности, человеческий CD137.[00164] In some embodiments, the proposed hTlc muteins may contain a mutated amino acid residue at positions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, or even more, corresponding to positions 26-34, 55-58, 60-61, 65, 104-106 and 108 linear polypeptide sequence of mature hTlc (SEQ ID NO: 1). In some preferred embodiments, the proposed hTlc muteins are capable of binding CD137, in particular human CD137.
[00165] В некоторых вариантах осуществления мутеин липокалина согласно изобретению может включать по меньшей мере одну аминокислотную замену нативного остатка цистеина, например, остатком серина. В некоторых вариантах осуществления мутеин hTlc согласно изобретению включает аминокислотную замену нативного остатка цистеина в положениях, соответствующих положениям 61 и/или 153 линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1), другой аминокислотой, такой как остаток серина. В этом контексте следует отметить, что было обнаружено, что удаление структурной дисульфидной связи (на уровне соответствующей наивной библиотеки нуклеиновых кислот) hTlc дикого типа, которая образована остатками цистеина 61 и 153 (cf. Breustedt et al., J Biol Chem, 2005), может обеспечить мутеины hTlc, которые не только стабильно свернуты, но также способны связывать выбранную неприродную мишень с высокой аффинностью. В некоторых вариантах осуществления устранение структурной дисульфидной связи может обеспечить дополнительное преимущество, состоящее в возможности создания или преднамеренного введения неприродных дисульфидных связей в мутеины согласно изобретению, что повышает стабильность мутеинов. Однако мутеины hTlc, которые связывают CD137 и которые имеют дисульфидный мостик, образованный между Cys 61 и Cys 153, также являются частью настоящего изобретения. [00165] In some embodiments, the lipocalin mutein of the invention may include at least one amino acid substitution of a native cysteine residue, such as a serine residue. In some embodiments, the hTlc mutein of the invention comprises an amino acid replacement of a native cysteine residue at positions corresponding to positions 61 and/or 153 of the linear polypeptide sequence of mature hTlc (SEQ ID NO: 1) with another amino acid, such as a serine residue. In this context, it should be noted that removal of the structural disulfide bond (at the level of the corresponding naïve nucleic acid library) of wild-type hTlc, which is formed by cysteine residues 61 and 153 (cf. Breustedt et al., J Biol Chem, 2005), has been found to can provide hTlc muteins that are not only stably folded but also capable of binding a selected non-natural target with high affinity. In some embodiments, elimination of the structural disulfide bond may provide the additional benefit of allowing non-natural disulfide bonds to be created or intentionally introduced into the muteins of the invention, thereby increasing the stability of the muteins. However, hTlc muteins that bind CD137 and that have a disulfide bridge formed between Cys 61 and Cys 153 are also part of the present invention.
[00166] В некоторых частных вариантах осуществления мутеин hTlc согласно изобретению может включать одну или более аминокислотных замен Cys 61 → Ala, Phe, Lys, Arg, Thr, Asn, Gly, Gln, Asp, Asn, Leu, Tyr, Met, Ser, Pro или Trp и/или Cys 153 → Ser или Ala, в положениях, соответствующих положениям 61 и/или 153 линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1).[00166] In some particular embodiments, the hTlc mutein of the invention may include one or more amino acid substitutions Cys 61 → Ala, Phe, Lys, Arg, Thr, Asn, Gly, Gln, Asp, Asn, Leu, Tyr, Met, Ser, Pro or Trp and/or Cys 153 → Ser or Ala, at positions corresponding to positions 61 and/or 153 of the linear polypeptide sequence of mature hTlc (SEQ ID NO: 1).
[00167] В некоторых вариантах осуществления либо два, либо все три цистеиновых кодона в положениях, соответствующих положениям 61, 101 и 153 линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1), заменены кодоном другой аминокислоты. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления мутеин hTlc согласно изобретению включает аминокислотную замену нативного остатка цистеина в положении, соответствующем положению 101 линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1), остатком серина или гистидина. [00167] In some embodiments, either two or all three cysteine codons at positions corresponding to positions 61, 101, and 153 of the linear mature hTlc polypeptide sequence (SEQ ID NO: 1) are replaced by a codon of another amino acid. Additionally, in some embodiments, the hTlc mutein of the invention comprises an amino acid replacement of the native cysteine residue at position corresponding to position 101 of the mature hTlc linear polypeptide sequence (SEQ ID NO: 1) with a serine or histidine residue.
[00168] В некоторых вариантах осуществления мутеин согласно изобретению содержит аминокислотную замену нативной аминокислоты остатком цистеина в положениях, соответствующих положениям 28 или 105 линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1). Кроме того, в некоторых вариантах осуществления мутеин согласно изобретению содержит аминокислотную замену нативного остатка аргинина в положении, соответствующем положению 111 линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1), остатком пролина. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления мутеин согласно изобретению содержит аминокислотную замену нативного остатка лизина в положении, соответствующем положению 114 линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1), остатком триптофана или глутаминовой кислоты.[00168] In some embodiments, the mutein of the invention comprises an amino acid substitution of a native amino acid with a cysteine residue at positions corresponding to positions 28 or 105 of the linear mature hTlc polypeptide sequence (SEQ ID NO: 1). Additionally, in some embodiments, the mutein of the invention comprises an amino acid replacement of the native arginine residue at position corresponding to position 111 of the linear polypeptide sequence of mature hTlc (SEQ ID NO: 1) with a proline residue. Additionally, in some embodiments, the mutein of the invention comprises an amino acid substitution of a native lysine residue at a position corresponding to position 114 of the linear polypeptide sequence of mature hTlc (SEQ ID NO: 1) with a tryptophan or glutamic acid residue.
[00169] В некоторых вариантах осуществления предложенные CD137-связывающие мутеины hTlc могут содержать в одном или более положениях, соответствующих положениям 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 и 153 линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1), один или более из следующих мутированных аминокислотных остатков: Ala 5 → Val или Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Thr 42 → Ser; Gly 46 → Asp; Lys 52 → Glu; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg или Asn; Thr 71 → Ala; Val 85 → Asp; Lys 94 → Arg или Glu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Arg 148 → Ser; Ser 150 → Ile; и Cys 153 → Ser. В некоторых вариантах осуществления мутеин hTlc согласно изобретению содержит два или более, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или более, или даже все мутированные аминокислотные остатки в этих положениях последовательности зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1).[00169] In some embodiments, the proposed CD137-binding hTlc muteins may contain at one or more positions corresponding to positions 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71 , 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 and 153 of the mature hTlc linear polypeptide sequence (SEQ ID NO: 1), one or more of the following mutated amino acid residues: Ala 5 → Val or Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Thr 42 → Ser; Gly 46 → Asp; Lys 52 → Glu; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg or Asn; Thr 71 → Ala; Val 85 → Asp; Lys 94 → Arg or Glu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; Arg 148 → Ser; Ser 150 → Ile; and Cys 153 → Ser. In some embodiments, the hTlc mutein of the invention comprises two or more, for example, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26 or more, or even all of the mutated amino acid residues at these positions in the mature hTlc sequence (SEQ ID NO: 1).
[00170] В некоторых вариантах осуществления предложенные CD137-связывающие мутеины hTlc могут содержать один из следующих наборов мутированных аминокислотных остатков по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1):[00170] In some embodiments, the proposed CD137-binding hTlc muteins may contain one of the following sets of mutated amino acid residues compared to the linear mature hTlc polypeptide sequence (SEQ ID NO: 1):
(a) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; и Cys 153 → Ser; (a) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; and Cys 153 → Ser;
(b) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg; Val 85 → Asp; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; и Cys 153 → Ser; (b) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg; Val 85 → Asp; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; and Cys 153 → Ser;
(c) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Asn; Lys 94 → Arg; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; и Cys 153 → Ser; (c) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Asn; Lys 94 → Arg; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; and Cys 153 → Ser;
(d) Ala 5 → Val; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg; Lys 94 → Glu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; и Cys 153 → Ser; (d) Ala 5 → Val; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Lys 65 → Arg; Lys 94 → Glu; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Lys 121 → Glu; Ala 133 → Thr; and Cys 153 → Ser;
(e) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Thr 42 → Ser; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Ile; и Cys 153 → Ser; (e) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Thr 42 → Ser; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Ile; and Cys 153 → Ser;
(f) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Lys 52 → Glu; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Thr 71 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ala 133 → Thr; Arg 148 → Ser; Ser 150 → Ile; и Cys 153 → Ser; и(f) Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Lys 52 → Glu; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Thr 71 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ala 133 → Thr; Arg 148 → Ser; Ser 150 → Ile; and Cys 153 → Ser; And
(g) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Gly 46 → Asp; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Thr 71 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Ile; и Cys 153 → Ser.(g) Ala 5 → Thr; Arg 26 → Glu; Glu 27 → Gly; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Arg; Glu 30 → Pro; Met 31 → Trp; Leu 33 → Ile; Glu 34 → Phe; Gly 46 → Asp; Leu 56 → Ala; Ser 58 → Asp; Arg 60 → Pro; Cys 61 → Ala; Thr 71 → Ala; Cys 101 → Ser; Glu 104 → Val; Leu 105 → Cys; His 106 → Asp; Lys 108 → Ser; Arg 111 → Pro; Lys 114 → Trp; Ser 150 → Ile; and Cys 153 → Ser.
[00171] В некоторых вариантах осуществления остаточная область, то есть область, отличная от положений, соответствующих положениям 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 и 153 линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1), в мутеине hTlc согласно изобретению может содержать (природную) аминокислотную последовательность дикого типа линейной полипептидной последовательности зрелого hTlc вне мутированных положений аминокислотной последовательности. [00171] In some embodiments, a residual region, that is, a region other than positions corresponding to positions 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 and 153 of the linear polypeptide sequence of mature hTlc (SEQ ID NO: 1), in the hTlc mutein according to the invention may contain the (natural) wild-type amino acid sequence linear polypeptide sequence of mature hTlc outside the mutated positions of the amino acid sequence.
[00172] В некоторых вариантах осуществления мутеин hTlc согласно изобретению обладает по меньшей мере 70% идентичностью последовательности или по меньшей мере 70% гомологией последовательности с последовательностью зрелого hTlc (SEQ ID NO: 1). В качестве иллюстративного примера мутеин SEQ ID NO: 34 обладает идентичностью аминокислотной последовательности или гомологией последовательности, равной приблизительно 84%, с аминокислотной последовательностью зрелого hTlc.[00172] In some embodiments, the hTlc mutein of the invention has at least 70% sequence identity or at least 70% sequence homology to the mature hTlc sequence (SEQ ID NO: 1). As an illustrative example, the mutein of SEQ ID NO: 34 has an amino acid sequence identity or sequence homology of approximately 84% with the amino acid sequence of mature hTlc.
[00173] В некоторых вариантах осуществления мутеин hTlc согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 34-40, или ее фрагмент или вариант.[00173] In some embodiments, the hTlc mutein of the invention comprises the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 34-40, or a fragment or variant thereof.
[00174] В некоторых вариантах осуществления мутеин hTlc согласно изобретению обладает по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или более высокой идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34-40.[00174] In some embodiments, the hTlc mutein of the invention has at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or higher sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 34-40.
[00175] Настоящее изобретение также включает структурные гомологи мутеина hTlc, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 34-40, причем структурные гомологи обладают гомологией или идентичностью аминокислотной последовательности относительно указанного мутеина hTlc, равной более приблизительно 60%, предпочтительно более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 92% и наиболее предпочтительно более 95%. [00175] The present invention also includes structural homologues of an hTlc mutein having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 34-40, wherein the structural homologs have greater than about 60% homology or amino acid sequence identity to said hTlc mutein, preferably more than 65%, more than 70%, more than 75%, more than 80%, more than 85%, more than 90%, more than 92% and most preferably more than 95%.
[00176] В некоторых аспектах настоящего изобретения предложены CD137-связывающие мутеины hNGAL. В этом отношении в изобретении предложены один или более мутеинов hNGAL, способных связывать CD137 с аффинностью, измеряемой посредством KD, равной приблизительно 800 нМ, 700 нМ, 200 нМ, 140 нМ, 100 нМ или ниже, предпочтительно приблизительно 70 нМ, 50 нМ, 30 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 2 нМ, или даже ниже. В некоторых вариантах осуществления предложенные мутеины hNGAL способны связывать CD137 со значением EC50 приблизительно 1000 нМ, 500 нМ, 100 нМ, 80 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 18 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 5 нМ или ниже. [00176] In some aspects of the present invention, CD137-binding hNGAL muteins are provided. In this regard, the invention provides one or more hNGAL muteins capable of binding CD137 with an affinity, measured by K D , of about 800 nM, 700 nM, 200 nM, 140 nM, 100 nM or lower, preferably about 70 nM, 50 nM, 30 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, or even lower. In some embodiments, the proposed hNGAL muteins are capable of binding CD137 with an EC 50 value of approximately 1000 nM, 500 nM, 100 nM, 80 nM, 50 nM, 25 nM, 18 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, or lower.
[00177] В некоторых вариантах осуществления CD137-связывающие мутеины hNGAL могут обладать перекрестной реактивностью с CD137 яванского макака. В некоторых вариантах осуществления предложенные мутеины hNGAL способны связывать CD137 яванского макака с аффинностью, измеряемой посредством KD, равной приблизительно 50 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 2 нМ или даже ниже. В некоторых вариантах осуществления предложенные мутеины hNGAL способны связывать CD137 яванского макака со значением EC50 приблизительно 100 нМ, 80 нМ, 50 нМ, 30 нМ или даже ниже.[00177] In some embodiments, hNGAL CD137-binding muteins may be cross-reactive with cynomolgus CD137. In some embodiments, the proposed hNGAL muteins are capable of binding cynomolgus CD137 with an affinity, measured by K D , of about 50 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 2 nM, or even lower. In some embodiments, the proposed hNGAL muteins are capable of binding cynomolgus CD137 with an EC 50 value of approximately 100 nM, 80 nM, 50 nM, 30 nM, or even lower.
[00178] В некоторых вариантах осуществления мутеин hNGAL согласно изобретению может препятствовать связыванию CD137L с CD137 или конкурировать за него. В некоторых других вариантах осуществления мутеин hNGAL согласно изобретению может быть способен связывать CD137 в присутствии CD137L и/или связывать комплекс CD137/CD137L.[00178] In some embodiments, the hNGAL mutein of the invention may interfere with or compete for CD137L binding to CD137. In some other embodiments, the hNGAL mutein of the invention may be capable of binding CD137 in the presence of CD137L and/or binding the CD137/CD137L complex.
[00179] В некоторых вариантах осуществления предложенные мутеины hNGAL могут содержать мутированный аминокислотный остаток в одном или более положениях, соответствующих положениям 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2). [00179] In some embodiments, the proposed hNGAL muteins may contain a mutated amino acid residue at one or more positions corresponding to positions 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 and 134 linear polypeptide sequence of mature hNGAL (SEQ ID NO: 2).
[00180] В некоторых вариантах осуществления предложенные мутеины hNGAL могут содержать мутированный аминокислотный остаток в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или даже более положениях, соответствующих положениям 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления предложенные мутеины hNGAL способны связывать CD137, в частности, человеческий CD137.[00180] In some embodiments, the proposed hNGAL muteins may contain a mutated amino acid residue at 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 or even more provisions corresponding to provisions 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 and 134 linear polypeptide sequence of mature hNGAL (SEQ ID NO: 2). In some preferred embodiments, the proposed hNGAL muteins are capable of binding CD137, in particular human CD137.
[00181] В некоторых вариантах осуществления предложенные мутеины hNGAL могут содержать мутированный аминокислотный остаток в одном или более положениях, соответствующих положениям 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления предложенные мутеины hNGAL способны связывать CD137, в частности, человеческий CD137.[00181] In some embodiments, the proposed hNGAL muteins may contain a mutated amino acid residue at one or more positions corresponding to positions 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81 87, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 and 134 linear polypeptide sequence of mature hNGAL (SEQ ID NO: 2). In some preferred embodiments, the proposed hNGAL muteins are capable of binding CD137, in particular human CD137.
[00182] В некоторых вариантах осуществления предложенные мутеины hNGAL могут содержать мутированный аминокислотный остаток в одном или более положениях, соответствующих положениям 36, 87 и 96 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2), и в одном или более положениях, соответствующих положениям 28, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 94, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2). [00182] In some embodiments, the proposed hNGAL muteins may contain a mutated amino acid residue at one or more positions corresponding to positions 36, 87 and 96 of the linear polypeptide sequence of mature hNGAL (SEQ ID NO: 2), and at one or more positions corresponding to positions 28, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 94, 100, 103, 106, 125, 127, 132 and 134 linear polypeptide sequence of mature hNGAL (SEQ ID NO: 2).
[00183] В некоторых других вариантах осуществления предложенные мутеины hNGAL могут содержать мутированный аминокислотный остаток в одном или более положениях, соответствующих положениям 20, 25, 28, 33, 36, 40-41, 44, 49, 52, 59, 68, 70-73, 77-82, 87, 92, 96, 98, 100, 101, 103, 122, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2).[00183] In some other embodiments, the proposed hNGAL muteins may contain a mutated amino acid residue at one or more positions corresponding to positions 20, 25, 28, 33, 36, 40-41, 44, 49, 52, 59, 68, 70- 73, 77-82, 87, 92, 96, 98, 100, 101, 103, 122, 125, 127, 132 and 134 linear polypeptide sequence of mature hNGAL (SEQ ID NO: 2).
[00184] В других вариантах осуществления предложенные мутеины hNGAL могут содержать мутированный аминокислотный остаток в одном или более положениях 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2), и в одном или более положениях, соответствующих положениям 20, 25, 33, 44, 59, 71, 78, 80, 82, 87, 92, 98, 101 и 122 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2).[00184] In other embodiments, the proposed hNGAL muteins may contain a mutated amino acid residue at one or more positions 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 125, 127, 132 and 134 of the linear polypeptide sequence of mature hNGAL (SEQ ID NO: 2), and at one or more positions corresponding to positions 20, 25, 33, 44, 59, 71, 78, 80, 82, 87, 92 , 98, 101 and 122 linear polypeptide sequence of mature hNGAL (SEQ ID NO: 2).
[00185] В некоторых вариантах осуществления мутеин липокалина согласно изобретению может содержать по меньшей мере одну аминокислотную замену нативного остатка цистеина, например, остатком серина. В некоторых вариантах осуществления мутеин hNGAL согласно изобретению может содержать аминокислотную замену нативного остатка цистеина в положениях, соответствующих положениям 76 и/или 175 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2), другой аминокислотой, такой как остаток серина. В этом контексте следует отметить, что было обнаружено, что удаление структурной дисульфидной связи (на уровне соответствующей наивной библиотеки нуклеиновых кислот) hNGAL дикого типа, которая образована остатками цистеина 76 и 175 (cf. Breustedt et al., J Biol Chem, 2005), может обеспечить мутеины hNGAL, которые не только стабильно свернуты, но также способны связывать выбранную неприродную мишень с высокой аффинностью. В некоторых вариантах осуществления устранение структурной дисульфидной связи может обеспечить дополнительное преимущество, состоящее в возможности создания или преднамеренного введения неприродных дисульфидных связей в мутеины согласно изобретению, что повышает стабильность мутеинов. Однако мутеины hNGAL, которые связывают CD137 и которые имеют дисульфидный мостик, образованный между Cys 76 и Cys 175, также являются частью настоящего изобретения. [00185] In some embodiments, the lipocalin mutein of the invention may contain at least one amino acid substitution of a native cysteine residue, such as a serine residue. In some embodiments, the hNGAL mutein of the invention may comprise an amino acid replacement of the native cysteine residue at positions corresponding to positions 76 and/or 175 of the linear polypeptide sequence of mature hNGAL (SEQ ID NO: 2) with another amino acid, such as a serine residue. In this context, it should be noted that removal of the structural disulfide bond (at the level of the corresponding naïve nucleic acid library) of wild-type hNGAL, which is formed by cysteine residues 76 and 175 (cf. Breustedt et al., J Biol Chem, 2005), has been found to can provide hNGAL muteins that are not only stably folded but also capable of binding a selected non-natural target with high affinity. In some embodiments, elimination of the structural disulfide bond may provide the additional benefit of allowing non-natural disulfide bonds to be created or intentionally introduced into the muteins of the invention, thereby increasing the stability of the muteins. However, hNGAL muteins that bind CD137 and that have a disulfide bridge formed between Cys 76 and Cys 175 are also part of the present invention.
[00186] В некоторых вариантах осуществления предложенные CD137-связывающие мутеины hNGAL могут содержать в одном или более положениях, соответствующих положениям 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2), один или более из следующих мутированных аминокислотных остатков. Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg или Lys; Gln 49 → Val, Ile, His, Ser или Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met, Ala или Gly; Leu 70 → Ala, Lys, Ser или Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met, Arg, Thr или Asn; Trp 79 → Ala или Asp; Arg 81 → Met, Trp или Ser; Phe 83 → Leu; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu и Lys 134 → Tyr. В некоторых вариантах осуществления мутеин hNGAL согласно изобретению содержит два или более, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, даже более, например, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, или все мутированные аминокислотные остатки в этих положениях последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2).[00186] In some embodiments, the proposed CD137-binding muteins hNGAL may contain at one or more positions corresponding to positions 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 and 134 of the mature hNGAL linear polypeptide sequence (SEQ ID NO: 2), one or more of the following mutated amino acid residues. Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg or Lys; Gln 49 → Val, Ile, His, Ser or Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met, Ala or Gly; Leu 70 → Ala, Lys, Ser or Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met, Arg, Thr or Asn; Trp 79 → Ala or Asp; Arg 81 → Met, Trp or Ser; Phe 83 → Leu; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu and Lys 134 → Tyr. In some embodiments, the hNGAL mutein of the invention contains two or more, for example 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, even more, for example 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, or all mutated amino acid residues at these positions in the mature hNGAL sequence (SEQ ID NO: 2).
[00187] В некоторых вариантах осуществления предложенные CD137-связывающие мутеины hNGAL могут содержать в одном или более положениях, соответствующих положениям 20, 25, 28, 33, 36, 40-41, 44, 49, 52, 59, 68, 70-73, 77-82, 87, 92, 96, 98, 100, 101, 103, 122, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2), один или более из следующих мутированных аминокислотных остатков. Gln 20 → Arg; Asn 25 → Tyr или Asp; Gln 28 → His; Val 33 → Ile; Leu 36 →Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Glu 44 → Val или Asp; Gln 49 → His; Tyr 52 →Ser или Gly; Lys 59 → Asn; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln или His; Tyr 78 → His; Trp 79 → Ile; Ile 80 → Asn; Arg 81 → Trp или Gln; Thr 82 → Pro; Cys 87 → Ser; Phe 92 → Leu или Ser; Asn 96 → Phe; Lys 98 → Arg; Tyr 100 → Asp; Pro 101 → Leu; Leu 103 → His или Pro; Phe 122 → Tyr; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; и Lys 134 → Gly.[00187] In some embodiments, the proposed CD137-binding muteins hNGAL may contain at one or more positions corresponding to positions 20, 25, 28, 33, 36, 40-41, 44, 49, 52, 59, 68, 70-73 , 77-82, 87, 92, 96, 98, 100, 101, 103, 122, 125, 127, 132 and 134 of the linear polypeptide sequence of mature hNGAL (SEQ ID NO: 2), one or more of the following mutated amino acid residues. Gln 20 → Arg; Asn 25 → Tyr or Asp; Gln 28 → His; Val 33 → Ile; Leu 36 →Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Glu 44 → Val or Asp; Gln 49 → His; Tyr 52 →Ser or Gly; Lys 59 → Asn; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln or His; Tyr 78 → His; Trp 79 → Ile; Ile 80 → Asn; Arg 81 → Trp or Gln; Thr 82 → Pro; Cys 87 → Ser; Phe 92 → Leu or Ser; Asn 96 → Phe; Lys 98 → Arg; Tyr 100 → Asp; Pro 101 → Leu; Leu 103 → His or Pro; Phe 122 → Tyr; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; and Lys 134 → Gly.
[00188] В некоторых вариантах осуществления предложенные CD137-связывающие мутеины hNGAL могут содержать в одном или более положениях, соответствующих положениям 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2), один или более из следующих мутированных аминокислотных остатков. Leu 36 →Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 →Ser или Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln или His; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp или Gln; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His или Pro; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; и Lys 134 → Gly. В некоторых вариантах осуществления предложенные CD137-связывающие мутеины hNGAL могут содержать в одном или более положениях, соответствующих положениям 20, 25, 33, 44, 59, 71, 78, 80, 82, 87, 92, 98, 101 и 122 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2), один или более из следующих мутированных аминокислотных остатков. Gln 20 → Arg; Asn 25 → Tyr или Asp; Val 33 → Ile; Glu 44 → Val или Asp; Lys 59 → Asn; Phe 71 → Leu; Tyr 78 → His; Ile 80 → Asn; Thr 82 → Pro; Phe 92 → Leu или Ser; Lys 98 → Arg; Pro 101 → Leu; и Phe 122 → Tyr.[00188] In some embodiments, the proposed CD137-binding muteins hNGAL may contain at one or more positions corresponding to positions 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100 , 103, 125, 127, 132 and 134 of the linear polypeptide sequence of mature hNGAL (SEQ ID NO: 2), one or more of the following mutated amino acid residues. Leu 36 →Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 →Ser or Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln or His; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp or Gln; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His or Pro; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; and Lys 134 → Gly. In some embodiments, the proposed CD137-binding hNGAL muteins may be present at one or more positions corresponding to positions 20, 25, 33, 44, 59, 71, 78, 80, 82, 87, 92, 98, 101, and 122 of the linear polypeptide sequence mature hNGAL (SEQ ID NO: 2), one or more of the following mutated amino acid residues. Gln 20 → Arg; Asn 25 → Tyr or Asp; Val 33 → Ile; Glu 44 → Val or Asp; Lys 59 → Asn; Phe 71 → Leu; Tyr 78 → His; Ile 80 → Asn; Thr 82 → Pro; Phe 92 → Leu or Ser; Lys 98 → Arg; Pro 101 → Leu; and Phe 122 → Tyr.
[00189] В некоторых вариантах осуществления предложенные CD137-связывающие мутеины hNGAL могут содержать один из следующих наборов мутированных аминокислотных остатков по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2):[00189] In some embodiments, the proposed CD137-binding hNGAL muteins may contain one of the following sets of mutated amino acid residues compared to the linear polypeptide sequence of mature hNGAL (SEQ ID NO: 2):
(a) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; и Lys 134 → Tyr; (a) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; and Lys 134 → Tyr;
(b) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met; Leu 70 → Lys; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; и Lys 134 → Tyr; (b) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ile; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Met; Leu 70 → Lys; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Met; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; and Lys 134 → Tyr;
(c) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Ala; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; и Lys 134 → Tyr; (c) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Ala; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; and Lys 134 → Tyr;
(d) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Ala; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; и Lys 134 → Tyr; (d) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Ala; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Trp; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; and Lys 134 → Tyr;
(e) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Ser; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Ser; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Met; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; и Lys 134 → Tyr; (e) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Ser; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Ser; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Met; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; and Lys 134 → Tyr;
(f) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Val; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Arg; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; и Lys 134 → Tyr; (f) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Val; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Arg; Trp 79 → Asp; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; and Lys 134 → Tyr;
(g) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → His; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; и Lys 134 → Tyr; (g) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → His; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; and Lys 134 → Tyr;
(h) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Phe 83 → Leu; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; и Lys 134 → Tyr; или(h) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Lys; Gln 49 → Asn; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Gly; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Thr; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Phe 83 → Leu; Cys 87 → Ser; Leu 94 → Phe; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; and Lys 134 → Tyr; or
(i) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ser; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Asn; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; и Lys 134 → Tyr.(i) Gln 28 → His; Leu 36 → Gln; Ala 40 → Ile; Ile 41 → Arg; Gln 49 → Ser; Tyr 52 → Met; Asn 65 → Asp; Ser 68 → Ala; Leu 70 → Thr; Arg 72 → Asp; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Asn; Trp 79 → Ala; Arg 81 → Ser; Cys 87 → Ser; Asn 96 → Lys; Tyr 100 → Phe; Leu 103 → His; Tyr 106 → Ser; Lys 125 → Phe; Ser 127 → Phe; Tyr 132 → Glu; and Lys 134 → Tyr.
[00190] В некоторых дополнительных вариантах осуществления в остаточной области, то есть области, отличной от положений 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2), мутеин hNGAL согласно изобретению может включать (природную) аминокислотную последовательность дикого типа зрелого hNGAL вне мутированных положений аминокислотной последовательности. [00190] In some additional embodiments, in the residual region, that is, a region other than positions 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 and 134 of the mature hNGAL linear polypeptide sequence (SEQ ID NO: 2), the hNGAL mutein of the invention may include the (natural) wild-type amino acid sequence of mature hNGAL beyond the mutated amino acid positions sequences.
[00191] В некоторых других вариантах осуществления предложенные CD137-связывающие мутеины hNGAL могут содержать один из следующих наборов мутированных аминокислотных остатков по сравнению с линейной полипептидной последовательностью зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2):[00191] In some other embodiments, the proposed CD137-binding hNGAL muteins may contain one of the following sets of mutated amino acid residues compared to the linear polypeptide sequence of mature hNGAL (SEQ ID NO: 2):
(a) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; и Lys 134 → Gly;(a) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; and Lys 134 → Gly;
(b) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Lys 98 → Arg; Tyr 100 → Asp; Pro 101 → Leu; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; и Lys 134 → Gly;(b) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Lys 98 → Arg; Tyr 100 → Asp; Pro 101 → Leu; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; and Lys 134 → Gly;
(c) Asn 25 → Tyr; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Gln; Phe 92 → Ser; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; и Lys 134 → Gly;(c) Asn 25 → Tyr; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Gln; Phe 92 → Ser; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; and Lys 134 → Gly;
(d) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Tyr 78 → His; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; и Lys 134 → Gly;(d) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Tyr 78 → His; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; and Lys 134 → Gly;
(e) Asn 25 → Asp; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; и Lys 134 → Gly;(e) Asn 25 → Asp; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; and Lys 134 → Gly;
(f) Val 33 → Ile; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; и Lys 134 → Gly;(f) Val 33 → Ile; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; and Lys 134 → Gly;
(g) Gln 20 → Arg; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Glu 44 → Val; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Phe 122 → Tyr; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; и Lys 134 → Gly;(g) Gln 20 → Arg; Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Glu 44 → Val; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Phe 122 → Tyr; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; and Lys 134 → Gly;
(h) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Ile 80 → Asn; Arg 81 → Trp; Thr 82 → Pro; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Pro 101 → Leu; Leu 103 → Pro; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; и Lys 134 → Gly;(h) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Ile 80 → Asn; Arg 81 → Trp; Thr 82 → Pro; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Pro 101 → Leu; Leu 103 → Pro; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; and Lys 134 → Gly;
(i) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Lys 59 → Asn; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; и Lys 134 → Gly; и(i) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Gln 49 → His; Tyr 52 → Gly; Lys 59 → Asn; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → Gln; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; and Lys 134 → Gly; And
(j) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Glu 44 → Asp; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → His; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; и Lys 134 → Gly.(j) Leu 36 → Met; Ala 40 → Asn; Ile 41 → Leu; Glu 44 → Asp; Gln 49 → His; Tyr 52 → Ser; Ser 68 → Asp; Leu 70 → Met; Phe 71 → Leu; Arg 72 → Leu; Lys 73 → Asp; Asp 77 → His; Trp 79 → Ile; Arg 81 → Trp; Phe 92 → Leu; Asn 96 → Phe; Tyr 100 → Asp; Leu 103 → His; Lys 125 → Ser; Ser 127 → Ile; Tyr 132 → Trp; and Lys 134 → Gly.
[00192] В некоторых вариантах осуществления в остаточной области, то есть области, отличной от положений 20, 25, 28, 33, 36, 40-41, 44, 49, 52, 59, 68, 70-73, 77-82, 87, 92, 96, 98, 100, 101, 103, 122, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2), мутеин hNGAL согласно изобретению может включать (природную) аминокислотную последовательность дикого типа зрелого hNGAL вне мутированных положений аминокислотной последовательности. [00192] In some embodiments, in the residual region, that is, the region other than positions 20, 25, 28, 33, 36, 40-41, 44, 49, 52, 59, 68, 70-73, 77-82, 87, 92, 96, 98, 100, 101, 103, 122, 125, 127, 132 and 134 linear polypeptide sequence of mature hNGAL (SEQ ID NO: 2), the hNGAL mutein of the invention may include the (natural) amino acid sequence of wild type mature hNGAL outside of mutated positions in the amino acid sequence.
[00193] В некоторых вариантах осуществления мутеин hNGAL согласно изобретению обладает по меньшей мере 70% идентичностью последовательности или по меньшей мере 70% гомологией последовательности с последовательностью зрелого hNGAL (SEQ ID NO: 2). В качестве иллюстративного примера мутеин SEQ ID NO: 42 обладает идентичностью аминокислотной последовательности или гомологией последовательности, равной приблизительно 87%, с аминокислотной последовательностью зрелого hNGAL.[00193] In some embodiments, the hNGAL mutein of the invention has at least 70% sequence identity or at least 70% sequence homology to the mature hNGAL sequence (SEQ ID NO: 2). As an illustrative example, the mutein of SEQ ID NO: 42 has an amino acid sequence identity or sequence homology of approximately 87% with the amino acid sequence of mature hNGAL.
[00194] В некоторых вариантах осуществления мутеин hNGAL согласно изобретению содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 41-59, или ее фрагмент или вариант. [00194] In some embodiments, the hNGAL mutein of the invention comprises the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 41-59, or a fragment or variant thereof.
[00195] В некоторых вариантах осуществления мутеин hNGAL согласно изобретению обладает по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или более высокой идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41-59.[00195] In some embodiments, the hNGAL mutein of the invention has at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, or higher sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 41-59.
[00196] Настоящее изобретение также включает структурные гомологи мутеина hNGAL, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 41-59, причем структурные гомологи обладают гомологией или идентичностью аминокислотной последовательности относительно указанного мутеина hNGAL, равной приблизительно 60%, предпочтительно более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90%, более 92% и наиболее предпочтительно более 95%. [00196] The present invention also includes structural homologs of an hNGAL mutein having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 41-59, wherein the structural homologs have approximately 60% homology or amino acid sequence identity to said hNGAL mutein, preferably greater than 65%, greater than 70%, greater than 75%, greater than 80%, greater than 85%, greater than 90%, greater than 92%, and most preferably greater than 95%.
[00197] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен мутеин липокалина, который связывает CD137 с аффинностью, измеряемой посредством KD, равной приблизительно 5 нМ или ниже, где мутеин липокалина обладает по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или более высокой идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42. [00197] In some embodiments, the present invention provides a lipocalin mutein that binds CD137 with an affinity, measured by K D , of about 5 nM or less, wherein the lipocalin mutein has at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 98% or greater sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42.
[00198] В некоторых вариантах осуществления мутеин липокалина согласно настоящему изобретению может содержать гетерологичную аминокислотную последовательность на его N- или C-конце, предпочтительно C-конце, такую как метка Strep II tag (SEQ ID NO: 12) или последовательность сайта расщепления для некоторых ферментов рестрикции, не оказывающие влияния на биологическую активность мутеина липокалина (связывание с его мишенью, например, CD137).[00198] In some embodiments, the lipocalin mutein of the present invention may contain a heterologous amino acid sequence at its N- or C-terminus, preferably the C-terminus, such as a Strep II tag (SEQ ID NO: 12) or a cleavage site sequence for some restriction enzymes that do not affect the biological activity of lipocalin mutein (binding to its target, for example, CD137).
[00199] В некоторых вариантах осуществления в мутеин липокалина могут быть введены дополнительные модификации для того, чтобы модулировать некоторые характеристики мутеина, например, для улучшения стабильности фолдинга, стабильности в сыворотке, устойчивости белка или растворимости в воде, или для уменьшения склонности к агрегации, или чтобы придать мутину новые характеристики. В некоторых вариантах осуществления модификация(и) может привести к модуляции двух или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) характеристик предложенного мутеина.[00199] In some embodiments, additional modifications may be introduced into the lipocalin mutein in order to modulate certain characteristics of the mutein, for example, to improve folding stability, serum stability, protein stability, or water solubility, or to reduce the tendency to aggregate, or to give the mutin new characteristics. In some embodiments, the modification(s) may result in modulation of two or more (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10) characteristics of the proposed mutein.
[00200] Например, можно мутировать одно или более положений аминокислотной последовательности мутеина липокалина, чтобы ввести новые реакционноспособные группы, например, для конъюгации с другими соединениями, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), гидроксиэтилкрахмал (ГЭК), биотин, пептиды или белки, или для образования не встречающихся в природе дисульфидных связей. Конъюгированное соединение, например, ПЭГ и ГЭК, может в некоторых случаях увеличивать период полувыведения из сыворотки соответствующего мутеина липокалина.[00200] For example, one or more positions in the amino acid sequence of the lipocalin mutein can be mutated to introduce new reactive groups, for example, for conjugation with other compounds, such as polyethylene glycol (PEG), hydroxyethyl starch (HES), biotin, peptides or proteins, or for formation of non-naturally occurring disulfide bonds. A conjugate such as PEG and HES may, in some cases, increase the serum half-life of the corresponding lipocalin mutein.
[00201] В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная группа мутеина липокалина может естественным образом содержаться в его аминокислотной последовательности, например, природные остатки цистеина в указанной аминокислотной последовательности. В некоторых других вариантах осуществления такая реакционноспособная группа может быть введена посредством мутагенеза. В случае, если реакционноспособная группа вводится посредством мутагенеза, одной из возможностей является мутация аминокислоты в соответствующем положении в остаток цистеина. Примеры таких возможных мутаций для введения остатка цистеина в аминокислотную последовательность мутеина hTlc включают замены Thr 40 → Cys, Glu 73 → Cys, Arg 90 → Cys, Asp 95 → Cys и Glu 131 → Cys последовательности hTlc дикого типа (SEQ ID NO: 1). Примеры таких возможных мутаций для введения остатка цистеина в аминокислотную последовательность мутеина hNGAL включают введение остатка цистеина в одно или более положений последовательности, которые соответствуют положениям 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 или 158 последовательности hNGAL дикого типа (SEQ ID NO: 2).Образованный тиольный фрагмент может быть использован для ПЭГилирования или ГЭКилирования мутеина, например, для увеличения периода полувыведения из сыворотки соответствующего мутеина липокалина. [00201] In some embodiments, a reactive group of a lipocalin mutein may be naturally present in its amino acid sequence, for example, naturally occurring cysteine residues in said amino acid sequence. In some other embodiments, such a reactive group may be introduced through mutagenesis. In the event that a reactive group is introduced by mutagenesis, one possibility is to mutate the amino acid at the appropriate position to a cysteine residue. Examples of such possible mutations to introduce a cysteine residue into the amino acid sequence of the hTlc mutein include the Thr 40 → Cys, Glu 73 → Cys, Arg 90 → Cys, Asp 95 → Cys, and Glu 131 → Cys substitutions of the wild-type hTlc sequence (SEQ ID NO: 1) . Examples of such possible mutations to introduce a cysteine residue into the amino acid sequence of the hNGAL mutein include the introduction of a cysteine residue at one or more sequence positions that correspond to positions 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146, or 158 of the hNGAL sequence wild type (SEQ ID NO: 2). The generated thiol moiety can be used to PEGylate or GESylate a mutein, for example, to increase the serum half-life of the corresponding lipocalin mutein.
[00202] В некоторых вариантах осуществления, чтобы обеспечить подходящие боковые цепи аминокислот в качестве новых реакционноспособных групп для конъюгирования одного из вышеуказанных соединений с мутеином липокалина, в аминокислотную последовательность мутеина липокалина могут быть введены искусственные аминокислоты. Обычно такие искусственные аминокислоты предназначены для того, чтобы быть более реакционноспособными и, таким образом, облегчить конъюгацию с желаемым соединением. Такие искусственные аминокислоты могут быть введены путем мутагенеза, например, с использованием искусственной тРНК может быть введен пара-ацетилфенилаланин.[00202] In some embodiments, to provide suitable amino acid side chains as novel reactive groups for conjugating one of the above compounds to a lipocalin mutein, artificial amino acids may be introduced into the amino acid sequence of the lipocalin mutein. Typically, such artificial amino acids are designed to be more reactive and thus facilitate conjugation to the desired compound. Such artificial amino acids can be introduced by mutagenesis, for example para-acetylphenylalanine can be introduced using artificial tRNA.
[00203] В некоторых вариантах осуществления мутеин липокалина согласно изобретению слит на его N-конце или его C-конце с белком, белковым доменом или пептидом, например, антителом, сигнальной последовательностью и/или аффинной меткой. В некоторых других вариантах осуществления мутеин липокалина согласно изобретению конъюгирован на его N-конце или его C-конце с партнером, представляющим собой белок, белковый домен или пептид, например, антитело, сигнальную последовательность и/или аффинную метку.[00203] In some embodiments, the lipocalin mutein of the invention is fused at its N-terminus or its C-terminus to a protein, protein domain, or peptide, such as an antibody, signal sequence, and/or affinity tag. In some other embodiments, the lipocalin mutein of the invention is conjugated at its N-terminus or its C-terminus to a protein, protein domain, or peptide partner, such as an antibody, signal sequence, and/or affinity tag.
[00204] Аффинные метки, такие как метка Strep-tag или метка Strep-tag II (Schmidt et al., J Mol Biol, 1996), метка c-myc, FLAG-метка, His-метка или HA-метка, или белки, такие как глутатион-S-трансфераза, которые позволяют легко обнаруживать и/или очищать рекомбинантные белки, являются примерами подходящих партнеров по слиянию. Белки с хромогенными или флуоресцентными свойствами, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или желтый флуоресцентный белок (YFP), также являются подходящими партнерами по слиянию для мутеинов липокалина согласно изобретению. В целом мутеины липокалина согласно изобретению могут быть мечены любым подходящим химическим веществом или ферментом, который прямо или опосредованно генерирует детектируемое соединение или сигнал в химической, физической, оптической или ферментативной реакции. Например, флуоресцентная или радиоактивная метка может быть конъюгирована с мутеином липокалина для генерации флуоресценции или рентгеновских лучей в качестве детектируемого сигнала. Щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена и β-галактозидаза являются примерами ферментных меток (и в то же время оптических меток), которые катализируют образование хромогенных продуктов реакции. В целом все метки, обычно используемые для антител (за исключением меток, используемых исключительно с сахарным фрагментом в Fc-части иммуноглобулинов), также можно использовать для конъюгации с мутеинами липокалина согласно изобретению. [00204] Affinity tags such as Strep-tag or Strep-tag II (Schmidt et al., J Mol Biol, 1996), c-myc tag, FLAG tag, His tag or HA tag, or proteins , such as glutathione S-transferase, which allow easy detection and/or purification of recombinant proteins are examples of suitable fusion partners. Proteins with chromogenic or fluorescent properties, such as green fluorescent protein (GFP) or yellow fluorescent protein (YFP), are also suitable fusion partners for the lipocalin muteins of the invention. In general, the lipocalin muteins of the invention can be labeled with any suitable chemical or enzyme that directly or indirectly generates a detectable compound or signal in a chemical, physical, optical or enzymatic reaction. For example, a fluorescent or radioactive label may be conjugated to a lipocalin mutein to generate fluorescence or x-rays as a detectable signal. Alkaline phosphatase, horseradish peroxidase and β-galactosidase are examples of enzyme tags (and at the same time optical tags) that catalyze the formation of chromogenic reaction products. In general, all labels typically used for antibodies (with the exception of labels used exclusively with the sugar moiety in the Fc portion of immunoglobulins) can also be used for conjugation with the lipocalin muteins of the invention.
[00205] В некоторых вариантах осуществления мутеин липокалина согласно изобретению может быть слит или конъюгирован с фрагментом, который продлевает период полувыведения мутеина из сыворотки (в этой связи см. также публикацию международной патентной заявки WO 2006/056464, где описаны такие стратегии с ссылкой на мутеины человеческого липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (hNGAL), с аффинностью связывания с CTLA-4). Фрагмент, продлевающий период полувыведения из сыворотки, может представлять собой, например, молекулу ПЭГ, молекулу ГЭК, молекулу жирной кислоты, такую как пальмитиновая кислота (Vajo and Duckworth, Pharmacol Rev, 2000), Fc-часть иммуноглобулина, домен CH3 иммуноглобулина, домен CH4 иммуноглобулина, альбумин-связывающий пептид, альбумин-связывающий белок или трансферрин. [00205] In some embodiments, the lipocalin mutein of the invention may be fused or conjugated to a moiety that prolongs the serum half-life of the mutein (in this regard, see also International Patent Application Publication WO 2006/056464 which describes such strategies with reference to muteins human neutrophil gelatinase-associated lipocalin (hNGAL), with binding affinity for CTLA-4). The serum half-life prolonging moiety may be, for example, a PEG molecule, a HES molecule, a fatty acid molecule such as palmitic acid (Vajo and Duckworth, Pharmacol Rev, 2000), an immunoglobulin Fc portion, an immunoglobulin C H 3 domain, immunoglobulin C H 4 domain, albumin binding peptide, albumin binding protein or transferrin.
[00206] В некоторых вариантах осуществления, если в качестве партнера по конъюгации используется ПЭГ, молекула ПЭГ может быть замещенной, незамещенной, линейной или разветвленной. Он также может представлять собой активированное производное полиэтилена. Примерами подходящих соединений являются молекулы ПЭГ, как описано в публикации международной патентной заявки WO 1999/64016, в патенте США № 6,177,074 или в патенте США № 6,403,564 в отношении интерферона, или как описано для других белков, таких как ПЭГ-модифицированная аспарагиназа, ПЭГ-аденозиндезаминаза (ПЭГ-АДА) или ПЭГ-супероксиддисмутаза (Fuertges and Abuchowski, Journal of Controlled Release, 1990). Молекулярная масса такого полимера, такого как полиэтиленгликоль, может находиться в диапазоне от приблизительно 300 до приблизительно 70 000 дальтон, включая, например, полиэтиленгликоль с молекулярной массой приблизительно 10 000, приблизительно 20 000, приблизительно 30 000 или приблизительно 40 000 дальтон. Более того, как, например, описано в патентах США № 6,500,930 или 6,620,413, углеводные олигомеры и полимеры, такие как ГЭК, могут быть конъюгированы с мутеином согласно изобретению с целью увеличения периода полувыведения из сыворотки.[00206] In some embodiments, if PEG is used as the conjugation partner, the PEG molecule may be substituted, unsubstituted, linear, or branched. It may also be an activated polyethylene derivative. Examples of suitable compounds are PEG molecules as described in International Patent Application Publication WO 1999/64016, US Patent No. 6,177,074 or US Patent No. 6,403,564 for interferon, or as described for other proteins such as PEG-modified asparaginase, PEG- adenosine deaminase (PEG-ADA) or PEG superoxide dismutase (Fuertges and Abuchowski, Journal of Controlled Release, 1990). The molecular weight of such a polymer, such as polyethylene glycol, may range from about 300 to about 70,000 daltons, including, for example, polyethylene glycol with a molecular weight of about 10,000, about 20,000, about 30,000, or about 40,000 daltons. Moreover, as, for example, described in US Pat. No. 6,500,930 or 6,620,413, carbohydrate oligomers and polymers, such as HES, can be conjugated to the mutein of the invention to increase serum half-life.
[00207]v В некоторых вариантах осуществления, если Fc-часть иммуноглобулина используется с целью увеличения периода полувыведения из сыворотки мутеинов липокалинов согласно изобретению, может быть использована технология SynFusion™, коммерчески доступная от Syntonix Pharmaceuticals, Inc. (Массачусетс, США). Использование этой технологии Fc-слияния позволяет создавать биофармацевтические препараты длительного действия и может, например, состоять из двух копий мутеина, связанного с Fc-областью антитела, для улучшения фармакокинетики, растворимости и эффективности производства.[00207]v In some embodiments, if the Fc portion of an immunoglobulin is used to increase the serum half-life of the lipocalin muteins of the invention, SynFusion™ technology, commercially available from Syntonix Pharmaceuticals, Inc., can be used. (Massachusetts, USA). The use of this Fc-fusion technology allows the creation of long-acting biopharmaceuticals and can, for example, consist of two copies of a mutein linked to the Fc region of an antibody to improve pharmacokinetics, solubility and manufacturing efficiency.
[00208] Примерами альбумин-связывающих пептидов, которые могут быть использованы для увеличения периода полувыведения из сыворотки мутеина липокалина, являются, например, пептиды, имеющие консенсусную последовательность Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys, где Xaa1 представляет собой Asp, Asn, Ser, Thr или Trp; Xaa2 представляет собой Asn, Gln, His, Ile, Leu или Lys; Xaa3 представляет собой Ala, Asp, Phe, Trp или Tyr; и Xaa4 представляет собой Asp, Gly, Leu, Phe, Ser или Thr, как описано в патентной публикации US 20030069395 или в Dennis et al. (2002).Альбумин-связывающий белок, слитый или конъюгированный с мутеином липокалина для увеличения периода полувыведения из сыворотки, может представлять собой бактериальный альбумин-связывающий белок, антитело, фрагмент антитела, включая доменные антитела (см., например, патент США 6,696,245), или мутеин липокалина со связывающей активностью к альбумину. Примеры бактериальных альбумин-связывающих белков включают стрептококковый белок G (Konig and Skerra, J Immunol Methods, 1998).[00208] Examples of albumin-binding peptides that can be used to increase the serum half-life of lipocalin mutein include, for example, peptides having the consensus sequence Cys-Xaa 1 -Xaa 2 -Xaa 3 -Xaa 4 -Cys, where Xaa 1 is Asp, Asn, Ser, Thr or Trp; Xaa 2 is Asn, Gln, His, Ile, Leu or Lys; Xaa 3 is Ala, Asp, Phe, Trp or Tyr; and Xaa 4 is Asp, Gly, Leu, Phe, Ser or Thr, as described in US Patent Publication 20030069395 or Dennis et al. (2002). The albumin binding protein fused or conjugated to a lipocalin mutein to increase serum half-life may be a bacterial albumin binding protein, antibody, antibody fragment, including domain antibodies (see, for example, US Pat. No. 6,696,245), or lipocalin mutein with albumin binding activity. Examples of bacterial albumin-binding proteins include streptococcal protein G (Konig and Skerra, J Immunol Methods, 1998).
[00209] В некоторых вариантах осуществления, если альбумин-связывающий белок представляет собой фрагмент антитела, он может представлять собой доменное антитело. Доменные антитела (dAb) сконструированы для точного контроля биофизических свойств и периода полувыведения in vivo для создания оптимального профиля безопасности и эффективности продукта. Доменные антитела, например, коммерчески доступны от Domantis Ltd. (Кембридж, Великобритания и Массачусетс, США).[00209] In some embodiments, if the albumin binding protein is an antibody fragment, it may be a domain antibody. Domain-specific antibodies (dAbs) are engineered to precisely control biophysical properties and in vivo half-life to create an optimal product safety and efficacy profile. Domain antibodies, for example, are commercially available from Domantis Ltd. (Cambridge, UK and Massachusetts, USA).
[00210] В некоторых вариантах осуществления в качестве партнера мутеина липокалина согласно изобретению для увеличения периода полувыведения из сыворотки может быть использован альбумин как таковой (Osborn et al., J Pharmacol Exp Ther, 2002) или биологически активный фрагмент альбумина. Термин «альбумин» включает все альбумины млекопитающих, такие как человеческий сывороточный альбумин, или бычий сывороточный альбумин, или крысиный альбумин. Альбумин или его фрагмент могут быть получены рекомбинантно, как описано в патенте США № 5,728,553 или европейских патентных публикациях EP0330451 и EP0361991. Соответственно, рекомбинантный человеческий альбумин (например, Recombumin® от Novozymes Delta Ltd., Ноттингем, Великобритания) может быть конъюгирован или слит с мутеином липокалина согласно изобретению.[00210] In some embodiments, albumin itself (Osborn et al., J Pharmacol Exp Ther, 2002) or a biologically active fragment of albumin can be used as a partner of the lipocalin mutein of the invention to increase serum half-life. The term "albumin" includes all mammalian albumins, such as human serum albumin, or bovine serum albumin, or rat albumin. Albumin or a fragment thereof can be produced recombinantly, as described in US Patent No. 5,728,553 or European Patent Publications EP0330451 and EP0361991. Accordingly, recombinant human albumin (eg, Recombumin® from Novozymes Delta Ltd., Nottingham, UK) can be conjugated or fused to the lipocalin mutein according to the invention.
[00211] В некоторых вариантах осуществления, если в качестве партнера для увеличения периода полувыведения из сыворотки мутеинов липокалинов согласно изобретению используется трансферрин, мутеины могут быть генетически слиты с N- или C-концом, или с обоими, негликозилированного трансферрина. Негликозилированный трансферрин имеет период полувыведения 14-17 дней, и слитый с трансферрином белок аналогичным образом будет иметь увеличенный период полувыведения. Трансферрин в качестве носителя также обеспечивает высокую биодоступность, биораспределение и стабильность в кровотоке. Эта технология коммерчески доступна от BioRexis (BioRexis Pharmaceutical Corporation, Пенсильвания, США). Рекомбинантный человеческий трансферин (DeltaFerrin™) для применения в качестве стабилизатора белка/партнера для увеличения периода полувыведения также коммерчески доступен от Novozymes Delta Ltd. (Ноттингем, Великобритания). [00211] In some embodiments, when transferrin is used as a partner to increase the serum half-life of the lipocalin muteins of the invention, the muteins can be genetically fused to the N- or C-terminus, or both, of non-glycosylated transferrin. Non-glycosylated transferrin has a half-life of 14-17 days, and a transferrin fusion protein will similarly have an increased half-life. Transferrin as a carrier also provides high bioavailability, biodistribution and stability in the bloodstream. This technology is commercially available from BioRexis (BioRexis Pharmaceutical Corporation, Pennsylvania, USA). Recombinant human transferrin (DeltaFerrin™) for use as a protein stabilizer/partner to increase half-life is also commercially available from Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, UK).
[00212] Еще одним вариантом продления периода полувыведения мутеинов липокалинов согласно изобретению является слияние с N- или С-концом мутеина длинных, неструктурированных, гибких богатых глицином последовательностей (например, полиглицина с приблизительно 20-80 последовательно расположенными остатками глицина). Этот подход, раскрытый, например, в международной патентной публикации WO2007/038619, также был назван «рПЭГ» (рекомбинантная ПЭГ).[00212] Another option for extending the half-life of the lipocalin muteins of the invention is to fuse long, unstructured, flexible glycine-rich sequences (eg, polyglycine with approximately 20-80 consecutive glycine residues) to the N- or C-terminus of the mutein. This approach, disclosed for example in international patent publication WO2007/038619, has also been called "rPEG" (recombinant PEG).
E. Примеры вариантов и областей применения слитых белков, специфичных к CD137 и PD-L1E. Examples of Variants and Applications of CD137 and PD-L1 Specific Fusion Proteins
[00213] В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут обеспечивать синергетический эффект посредством двойного нацеливания на CD137 и PD-L1.В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут обеспечивать синергетический эффект посредством костимуляции CD137 и блокады сигнального пути PD-1/PD-L1.В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут обеспечивать локализованное противоопухолевое действие посредством двойного нацеливания на CD137 и PD-L1.Таким образом, существует множество возможных вариантов медицинского применения слитых белков согласно изобретению.[00213] In some embodiments, the fusion proteins of the invention may provide a synergistic effect by dual targeting CD137 and PD-L1. In some embodiments, the fusion proteins of the invention may provide a synergistic effect by co-stimulating CD137 and blocking the PD-1/PD-L1 signaling pathway. L1. In some embodiments, the fusion proteins of the invention may provide localized antitumor effects by dual targeting CD137 and PD-L1. Thus, there are many possible medical uses of the fusion proteins of the invention.
[00214] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению одного или более слитых белков, раскрытых в настоящем документе, или одной или более композиций, содержащих такие слитые белки, для одновременного связывания CD137 и PD-L1.[00214] In some embodiments, the present invention relates to the use of one or more fusion proteins disclosed herein, or one or more compositions containing such fusion proteins, to simultaneously bind CD137 and PD-L1.
[00215] Настоящее изобретение также включает применение одного или более описанных слитых белков для образования комплекса с CD137 и/или PD-L1.[00215] The present invention also includes the use of one or more of the described fusion proteins to form a complex with CD137 and/or PD-L1.
[00216] Следовательно, в одном из аспектов изобретения предложенные слитые белки могут применяться для обнаружения CD137 и PD-L1. Такое применение может включать в себя стадии приведения одного или более указанных слитых белков, в подходящих условиях, в контакт с образцом, предположительно содержащим CD137 и/или PD-L1, тем самым обеспечивая возможность образования комплекса между слитыми белками и CD137 и/или PD-L1, и обнаружение комплекса с помощью подходящего сигнала. Детектируемый сигнал может быть вызван меткой, как объяснено выше, или изменением физических свойств из-за связывания, т. е. образованием комплекса как таковым. Одним из примеров является поверхностный плазмонный резонанс, значение которого изменяется во время связывания партнеров по связыванию, один из которых иммобилизован на поверхности, такой как золотая фольга.[00216] Therefore, in one aspect of the invention, the proposed fusion proteins can be used to detect CD137 and PD-L1. Such use may include the steps of bringing one or more of these fusion proteins, under suitable conditions, into contact with a sample suspected of containing CD137 and/or PD-L1, thereby allowing the formation of a complex between the fusion proteins and CD137 and/or PD-L1. L1, and detection of the complex using a suitable signal. The detected signal may be caused by the label, as explained above, or by a change in physical properties due to binding, i.e., complex formation itself. One example is surface plasmon resonance, the value of which changes during the binding of binding partners, one of which is immobilized on a surface such as gold foil.
[00217] Слитые белки согласно изобретению могут быть также использованы для разделения CD137 и/или PD-L1. Такое применение может включать в себя стадии приведения одного или более указанных слитых белков, в подходящих условиях, в контакт с образцом, предположительно содержащим CD137 и/или PD-L1, тем самым обеспечивая возможность образования комплекса между слитыми белками и CD137 и/или PD-L1, и отделение комплекса от образца.[00217] The fusion proteins of the invention can also be used to separate CD137 and/or PD-L1. Such use may include the steps of bringing one or more of these fusion proteins, under suitable conditions, into contact with a sample suspected of containing CD137 and/or PD-L1, thereby allowing the formation of a complex between the fusion proteins and CD137 and/or PD-L1. L1, and separation of the complex from the sample.
[00218] В некоторых аспектах настоящего изобретения предложены диагностические и/или аналитические наборы, содержащие один или более слитых белков согласно изобретению.[00218] Some aspects of the present invention provide diagnostic and/or assay kits containing one or more fusion proteins of the invention.
[00219] Помимо применения в диагностике в еще одном аспекте изобретения рассматриваются фармацевтические композиции, содержащие один или более слитых белков согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.[00219] In addition to diagnostic use, another aspect of the invention provides pharmaceutical compositions comprising one or more fusion proteins of the invention and a pharmaceutically acceptable excipient.
[00220] Кроме того, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложены слитые белки, одновременно связывающие CD137 и/или PD-L1, для применения в качестве противоопухолевых и/или противоинфекционных агентов, а также иммуномодуляторов. В некоторых вариантах осуществления предусмотрено применение слитых белков согласно настоящему изобретению в способе предупреждения, облегчения или лечения заболеваний человека, таких как различные раковые заболевания, в том числе PD-L1-положительные раковые заболевания. Соответственно, также предложены способы предупреждения, облегчения или лечения заболеваний человека, таких как различные раковые заболевания, в том числе PD-L1-положительные раковые заболевания, у нуждающегося в этом субъекта, включающие введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества одного или более слитых белков согласно изобретению.[00220] In addition, some embodiments of the present invention provide fusion proteins that simultaneously bind CD137 and/or PD-L1 for use as antitumor and/or anti-infective agents, as well as immunomodulators. In some embodiments, the fusion proteins of the present invention are used in a method for preventing, ameliorating, or treating human diseases, such as various cancers, including PD-L1 positive cancers. Accordingly, also provided are methods of preventing, ameliorating, or treating human diseases, such as various cancers, including PD-L1 positive cancers, in a subject in need thereof, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of one or more fusion proteins of the invention. .
[00221] Примеры раковых заболеваний, подлежащих лечению с помощью слитых белков согласно изобретению, включают рак печени, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы и шеи, рак молочной железы, рак легкого, кожную или внутриглазную злокачественную меланому, рак почки, рак матки, рак яичника, колоректальный рак, рак ободочной кишки, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, рак яичка, рак матки, карциному маточных труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, неходжкинскую лимфому, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркому мягких тканей, рак уретры, рак полового члена, солидные опухоли детского возраста, лимфоцитарную лимфому, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, карциному почечной лоханки, новообразование центральной нервной системы (ЦНС), первичную лимфому ЦНС, опухолевый ангиогенез, опухоль оси позвоночника, глиому ствола головного мозга, аденому гипофиза, саркому Капоши, эпидермоидный рак, плоскоклеточный рак, раковые заболевания, вызванные факторами окружающей среды, в том числе вызванные асбестом, гематологические злокачественные новообразования, включая, например, множественную миелому, В-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина/первичную медиастинальную В-клеточную лимфому, неходжкинские лимфомы, острую миелоидную лимфому, хронический миелоидный лейкоз, хронический лимфолейкоз, фолликулярную лимфому, диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому, лимфому Беркитта, иммунобластную крупноклеточную лимфому, В-лимфобластную лимфому из клеток-предшественников, лимфому из клеток мантийной зоны, острый лимфобластный лейкоз, фунгоидный микоз, анапластическую крупноклеточную лимфому, Т-клеточную лимфому и T-лимфобластную лимфому из клеток-предшественников, а также любые комбинации указанных раковых заболеваний. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также применимо для лечения метастатических раковых заболеваний. [00221] Examples of cancers treatable with the fusion proteins of the invention include liver cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, breast cancer, lung cancer, cutaneous or intraocular malignant melanoma, kidney cancer , uterine cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, colon cancer, rectal cancer, anal cancer, stomach cancer, testicular cancer, uterine cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, non-Hodgkin's lymphoma , esophageal cancer, small bowel cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, childhood solid tumors, lymphocytic lymphoma, bladder cancer, kidney or ureter cancer , renal pelvis carcinoma, central nervous system (CNS) neoplasm, primary CNS lymphoma, tumor angiogenesis, spinal axis tumor, brainstem glioma, pituitary adenoma, Kaposi's sarcoma, epidermoid carcinoma, squamous cell carcinoma, cancers caused by environmental factors, in том числе вызванные асбестом, гематологические злокачественные новообразования, включая, например, множественную миелому, В-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина/первичную медиастинальную В-клеточную лимфому, неходжкинские лимфомы, острую миелоидную лимфому, хронический миелоидный лейкоз, хронический лимфолейкоз, фолликулярную лимфому, диффузную крупноклеточную B-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, immunoblastic large cell lymphoma, B-lymphoblastic progenitor cell lymphoma, mantle cell lymphoma, acute lymphoblastic leukemia, mycosis fungoides, anaplastic large cell lymphoma, T-cell lymphoma and T-cell lymphoma precursors, as well as any combination of these cancers. In some embodiments, the present invention is also applicable to the treatment of metastatic cancers.
[00222] В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут одновременно нацеливаться на опухолевые клетки, в которых экспрессируется PD-L1, и активировать лимфоциты иммунной системы хозяина вблизи таких опухолевых клеток. В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут увеличивать направленную противоопухолевую активность Т-клеток, повышать противоопухолевый иммунитет и/или оказывать прямое ингибирующее действие на рост опухоли, тем самым обеспечивая синергетические противоопухолевые результаты. В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут активировать иммунные ответы в микроокружении опухоли. В некоторых вариантах осуществления слитые белки согласно изобретению могут снижать побочные действия эффекторных лимфоцитов на здоровые клетки, т. е. нецелевую токсичность, например, посредством локального ингибирования активности онкогена и индукции активации лимфоцитов. [00222] In some embodiments, the fusion proteins of the invention can simultaneously target tumor cells that express PD-L1 and activate host immune system lymphocytes in the vicinity of such tumor cells. In some embodiments, the fusion proteins of the invention may enhance T cell targeting antitumor activity, enhance antitumor immunity, and/or have a direct tumor growth inhibitory effect, thereby providing synergistic antitumor results. In some embodiments, the fusion proteins of the invention can activate immune responses in the tumor microenvironment. In some embodiments, the fusion proteins of the invention can reduce the side effects of effector lymphocytes on healthy cells, i.e., off-target toxicity, for example, by locally inhibiting oncogene activity and inducing lymphocyte activation.
[00223] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает применение слитого белка согласно изобретению или композиции, содержащей предложенный слитый белок, для индукции локализованного ответа лимфоцитов вблизи PD-L1-положительных опухолевых клеток. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам индукции локализованного ответа лимфоцитов вблизи PD-L1-положительных опухолевых клеток, включающим применение одного или более слитых белков согласно изобретению или одной или более композиций, содержащих такие слитые белки. «Локализованный» означает, что при одновременном связывании Т-клеток посредством CD137 и взаимодействии с PD-L1-положительными опухолевыми клетками Т-клетки продуцируют цитокины, в частности, IL-2 и/или IFN гамма, вблизи PD-L1-положительных клеток. Такие цитокины отражают активацию Т-клеток, которые затем могут быть способны уничтожать PD-L1-положительные клетки, прямо или опосредованно, путем привлечения других клеток-киллеров, таких как Т-клетки или NK-клетки.[00223] In some embodiments, the present invention includes the use of a fusion protein of the invention or a composition comprising a fusion protein according to the invention to induce a localized lymphocyte response in the vicinity of PD-L1 positive tumor cells. Accordingly, in some embodiments, the present invention provides methods for inducing a localized lymphocyte response in the vicinity of PD-L1-positive tumor cells, comprising the use of one or more fusion proteins of the invention or one or more compositions containing such fusion proteins. “Localized” means that when T cells are simultaneously bound by CD137 and interact with PD-L1 positive tumor cells, the T cells produce cytokines, particularly IL-2 and/or IFN gamma, in the vicinity of the PD-L1 positive cells. Such cytokines reflect activation of T cells, which may then be able to kill PD-L1-positive cells, either directly or indirectly by recruiting other killer cells such as T cells or NK cells.
[00224] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает применение слитого белка согласно изобретению или композиции, содержащей такой слитый белок, для костимуляции Т-клеток и/или активации нисходящих сигнальных путей CD137. Предпочтительно предложенный слитый белок костимулирует Т-клетки и/или активирует нисходящие сигнальные пути CD137 при связывании с опухолевыми клетками, на которых экспрессируется PD-L1. Соответственно, в настоящем изобретении предложены способы индукции пролиферации Т-лимфоцитов и/или активации нисходящих сигнальных путей CD137, предпочтительно при связывании с опухолевыми клетками, на которых экспрессируется PD-L1, включающие применение одного или более слитых белков согласно изобретению и/или одной или более композиций, содержащих такие слитые белки.[00224] In some embodiments, the present invention includes the use of a fusion protein of the invention or a composition comprising such a fusion protein to co-stimulate T cells and/or activate CD137 downstream signaling pathways. Preferably, the proposed fusion protein co-stimulates T cells and/or activates CD137 downstream signaling pathways upon binding to tumor cells that express PD-L1. Accordingly, the present invention provides methods for inducing T lymphocyte proliferation and/or activating CD137 downstream signaling pathways, preferably upon binding to tumor cells expressing PD-L1, comprising the use of one or more fusion proteins of the invention and/or one or more compositions containing such fusion proteins.
[00225] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает применение слитого белка согласно изобретению или композиции, содержащей такой слитый белок, для индукции кластеризации и активации CD137 на Т-клетках и направления таких Т-клеток на опухолевые клетки, на которых экспрессируется PD-L1. [00225] In some embodiments, the present invention includes the use of a fusion protein of the invention or a composition comprising such a fusion protein to induce CD137 clustering and activation on T cells and directing such T cells to tumor cells that express PD-L1.
[00226] Дополнительные цели, преимущества и особенности данного изобретения будут ясны специалистам в данной области техники после изучения следующих примеров и прилагаемых к ним графических материалов, которые не должны толковаться ограничительно. Таким образом, следует понимать, что, хотя настоящее изобретение конкретно раскрыто с помощью иллюстративных вариантов осуществления и необязательных признаков, специалисты в данной области техники могут прибегать к модификации и вариации раскрытых в настоящем документе вариантов изобретения, и что такие модификации и вариации рассматриваются как входящие в объем данного изобретения.[00226] Additional objects, advantages and features of the present invention will become apparent to those skilled in the art upon examination of the following examples and accompanying drawings, which should not be construed in a limiting manner. Thus, it is to be understood that while the present invention is specifically disclosed by way of illustrative embodiments and optional features, modifications and variations may be made by those skilled in the art to the embodiments of the invention disclosed herein, and that such modifications and variations are considered to be within the scope of scope of this invention.
F. Получение иллюстративных предложенных слитых белков, специфичных к CD137 и PD-L1.F. Preparation of exemplary proposed fusion proteins specific for CD137 and PD-L1.
[00227] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложены молекулы нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК), которые включают нуклеотидные последовательности, кодирующие предложенные слитые белки. В некоторых вариантах осуществления изобретение охватывает клетку-хозяина, содержащую предложенную молекулу нуклеиновой кислоты. Поскольку вырожденность генетического кода допускает замены отдельных кодонов другими кодонами, определяющими ту же аминокислоту, изобретение не ограничивается конкретной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, как описано в настоящем документе, скорее, оно охватывает все молекулы нуклеиновой кислоты, которые включают нуклеотидные последовательности, кодирующие функциональный слитый белок. В этой связи настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, кодирующим предложенные слитые белки. [00227] In some embodiments, the present invention provides nucleic acid molecules (DNA and RNA) that include nucleotide sequences encoding the proposed fusion proteins. In some embodiments, the invention includes a host cell containing the proposed nucleic acid molecule. Since the degeneracy of the genetic code allows for the substitution of individual codons by other codons specifying the same amino acid, the invention is not limited to a particular nucleic acid molecule encoding a fusion protein as described herein, but rather embraces all nucleic acid molecules that include nucleotide sequences encoding a functional fusion protein. In this regard, the present invention also relates to nucleotide sequences encoding the proposed fusion proteins.
[00228] Молекула нуклеиновой кислоты, такая как ДНК, называется «способной экспрессировать молекулу нуклеиновой кислоты» или «способной обеспечивать экспрессию нуклеотидной последовательности», если она включает элементы последовательности, содержащие информацию, касающуюся регуляции транскрипции и/или трансляции, и такие последовательности «функционально связаны» с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок. Функциональная связь представляет собой связь, в которой элементы регуляторной последовательности и экспрессируемая последовательность связаны таким образом, чтобы обеспечить экспрессию гена. Точная природа регуляторных областей, необходимых для экспрессии генов, может различаться у разных видов, но в целом эти области включают промотор, который у прокариот содержит как промотор как таковой, то есть элементы ДНК, управляющие инициацией транскрипции, так и элементы ДНК, которые при транскрибировании в РНК будут сигнализировать об инициации трансляции. Такие промоторные области обычно включают 5'-некодирующие последовательности, участвующие в инициации транскрипции и трансляции, такие как -35/-10 боксы и элемент Шайна-Далгарно у прокариот или ТАТА-бокс, последовательности СААТ и 5'-кэпирующие элементы у эукариот. Эти области могут также включать энхансерные или репрессорные элементы, а также транслируемые сигнальные и лидерные последовательности для направления нативного белка в конкретный компартмент клетки-хозяина.[00228] A nucleic acid molecule, such as DNA, is said to be “capable of expressing a nucleic acid molecule” or “capable of expressing a nucleotide sequence” if it includes sequence elements containing information relating to the regulation of transcription and/or translation, and such sequences are “operably associated" with the nucleotide sequence encoding the protein. A functional link is a link in which the regulatory sequence elements and the expressed sequence are linked in such a way as to allow gene expression. The exact nature of the regulatory regions required for gene expression may vary between species, but in general these regions include the promoter, which in prokaryotes contains both the promoter itself, that is, DNA elements that control the initiation of transcription, and DNA elements that, when transcribed, in RNA will signal the initiation of translation. Such promoter regions typically include 5' non-coding sequences involved in initiation of transcription and translation, such as -35/-10 boxes and the Shine-Dalgarno element in prokaryotes or TATA box, CAAT sequences and 5' capping elements in eukaryotes. These regions may also include enhancer or repressor elements, as well as translated signal and leader sequences for targeting the native protein to a specific compartment of the host cell.
[00229] Кроме того, 3'-некодирующие последовательности могут содержать регуляторные элементы, участвующие в терминации транскрипции, полиаденилировании и т. п. Если, однако, эти терминирующие последовательности неудовлетворительно функционируют в конкретной клетке-хозяине, то они могут быть заменены сигналами, функционирующими в этой клетке.[00229] In addition, the 3' non-coding sequences may contain regulatory elements involved in transcription termination, polyadenylation, etc. If, however, these termination sequences do not function satisfactorily in a particular host cell, then they can be replaced by signals that function in this cage.
[00230] Следовательно, молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть «функционально связана» с одной или более регуляторными последовательностями, такими как промоторная последовательность, для обеспечения возможности экспрессии этой молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению включает промоторную последовательность и последовательность терминации транскрипции. Подходящими прокариотическими промоторами являются, например, промотор tet, промотор lacUV5 или промотор T7. Примерами промоторов, подходящих для экспрессии в эукариотических клетках, являются промотор SV40 или промотор CMV.[00230] Therefore, a nucleic acid molecule of the invention may be "operably linked" to one or more regulatory sequences, such as a promoter sequence, to enable expression of the nucleic acid molecule. In some embodiments, a nucleic acid molecule of the invention includes a promoter sequence and a transcription termination sequence. Suitable prokaryotic promoters are, for example, the tet promoter, the lacUV5 promoter or the T7 promoter. Examples of promoters suitable for expression in eukaryotic cells are the SV40 promoter or the CMV promoter.
[00231] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутеин липокалина, раскрытый в данной заявке, может быть «функционально связана» с другой молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуноглобулин согласно изобретению, чтобы обеспечить экспрессию слитого белка, раскрытого в настоящем документе. [00231] In some embodiments, a nucleic acid molecule encoding a lipocalin mutein disclosed herein may be "operably linked" to another nucleic acid molecule encoding an immunoglobulin of the invention to allow expression of a fusion protein disclosed herein.
[00232] В некоторых вариантах осуществления предложенные способы могут включать подвергание по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей зрелый hTlc, мутагенезу по нуклеотидным триплетам, кодирующим одно или более положений, соответствующих положениям 5, 26-31, 33-34, 42, 46, 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 и 153 линейной полипептидной последовательности hTlc (SEQ ID NO: 1), для получения мутеинов липокалинов, входящих в состав предложенных слитых белков. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы могут включать подвергание по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей зрелый hNGAL, мутагенезу по нуклеотидным триплетам, кодирующим одно или более положений, соответствующих положениям 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности hNGAL (SEQ ID NO: 2), для получения мутеинов липокалинов, входящих в состав предложенных слитых белков. В некоторых вариантах осуществления предложенный способ может включать подвергание по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей зрелый hNGAL, мутагенезу по нуклеотидным триплетам, кодирующим одно или более положений, соответствующих положениям 20, 25, 28, 33, 36, 40-41, 44, 49, 52, 59, 68, 70-73, 77-82, 87, 92, 96, 98, 100, 101, 103, 122, 125, 127, 132 и 134 линейной полипептидной последовательности hNGAL (SEQ ID NO: 2), для получения мутеинов липокалинов, входящих в состав предложенных слитых белков.[00232] In some embodiments, the proposed methods may include subjecting at least one nucleic acid molecule encoding mature hTlc to mutagenesis at nucleotide triplets encoding one or more positions corresponding to positions 5, 26-31, 33-34, 42, 46 , 52, 56, 58, 60-61, 65, 71, 85, 94, 101, 104-106, 108, 111, 114, 121, 133, 148, 150 and 153 linear hTlc polypeptide sequence (SEQ ID NO: 1 ), to obtain lipocalin muteins included in the proposed fusion proteins. In some embodiments, the proposed methods may include subjecting at least one nucleic acid molecule encoding mature hNGAL to mutagenesis at nucleotide triplets encoding one or more positions corresponding to positions 28, 36, 40-41, 49, 52, 65, 68, 70, 72-73, 77, 79, 81, 83, 87, 94, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132 and 134 linear polypeptide sequence hNGAL (SEQ ID NO: 2), to obtain lipocalin muteins, included in the proposed fusion proteins. In some embodiments, the proposed method may include subjecting at least one nucleic acid molecule encoding mature hNGAL to mutagenesis at nucleotide triplets encoding one or more positions corresponding to positions 20, 25, 28, 33, 36, 40-41, 44, 49, 52, 59, 68, 70-73, 77-82, 87, 92, 96, 98, 100, 101, 103, 122, 125, 127, 132 and 134 linear polypeptide sequence of hNGAL (SEQ ID NO: 2) , to obtain lipocalin muteins included in the proposed fusion proteins.
[00233] Кроме того, применительно к мутеинам hTlc или мутеинам hNGAL согласно изобретению, входящим в состав слитых белков, в некоторых вариантах осуществления природная дисульфидная связь между Cys 61 и Cys 153 или Cys 76 и Cys 175, соответственно, может быть удалена. Соответственно, такие мутеины могут продуцироваться в клеточном компартменте, имеющем восстанавливающую окислительно-восстановительную среду, например, в цитоплазме грамотрицательных бактерий.[00233] Additionally, for hTlc muteins or hNGAL muteins of the invention included in fusion proteins, in some embodiments, the native disulfide bond between Cys 61 and Cys 153 or Cys 76 and Cys 175, respectively, may be removed. Accordingly, such muteins can be produced in a cellular compartment that has a reducing redox environment, for example, in the cytoplasm of Gram-negative bacteria.
[00234] Кроме того, применительно к предложенным мутеинам hTlc или мутеинам hNGAL согласно изобретению, входящим в состав слитых белков, изобретение также включает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие мутеины, которые в некоторых вариантах осуществления могут включать одну или более дополнительных мутаций вне указанных положений экспериментального мутагенеза в последовательности. Такие мутации часто допустимы или даже могут оказаться полезными, например, если они вносят вклад в улучшенную эффективность фолдинга, стабильность в сыворотке, термостабильность или аффинность связывания лиганда мутеинов липокалинов и/или слитых белков. [00234] In addition, with respect to the proposed hTlc muteins or hNGAL muteins of the invention included in fusion proteins, the invention also includes nucleic acid molecules encoding such muteins, which in some embodiments may include one or more additional mutations beyond the specified experimental provisions mutagenesis in sequence. Such mutations are often tolerated or may even be beneficial, for example, if they contribute to improved folding efficiency, serum stability, thermostability, or ligand binding affinity of lipocalin muteins and/or fusion proteins.
[00235] В некоторых вариантах осуществления предложенные молекулы нуклеиновой кислоты также могут быть частью вектора или любого другого типа клонирующего носителя, такого как плазмида, фагмида, фаг, бакуловирус, космида или искусственная хромосома. [00235] In some embodiments, the nucleic acid molecules of the invention may also be part of a vector or any other type of cloning vehicle, such as a plasmid, phagemid, phage, baculovirus, cosmid, or artificial chromosome.
[00236] В некоторых вариантах осуществления предложенная молекула нуклеиновой кислоты может быть включена в фагмиду. В данном контексте фагмидный вектор означает вектор, кодирующий межгенную область умеренного фага, такого как M13 или f1, или его функциональную часть, слитую с представляющей интерес кДНК. Например, в некоторых вариантах осуществления после суперинфекции бактериальных клеток-хозяев таким предоставленным фагмидным вектором и подходящим фагом-помощником (например, M13K07, VCS-M13 или R408) получают интактные фаговые частицы, тем самым обеспечивая физическое связывание кодируемой гетерологичной кДНК с ее соответствующим полипептидом, экспонируемым на поверхности фага (Lowman, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 1997, Rodi and Makowski, Curr Opin Biotechnol, 1999).[00236] In some embodiments, the proposed nucleic acid molecule may be included in a phagemid. As used herein, a phagemid vector means a vector encoding the intergenic region of a temperate phage, such as M13 or f1, or a functional portion thereof fused to a cDNA of interest. For example, in some embodiments, following superinfection of bacterial host cells with such a provided phagemid vector and a suitable helper phage (e.g., M13K07, VCS-M13, or R408), intact phage particles are obtained, thereby allowing physical linkage of the encoded heterologous cDNA to its corresponding polypeptide, exposed on the surface of the phage (Lowman, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 1997, Rodi and Makowski, Curr Opin Biotechnol, 1999).
[00237] В соответствии с различными вариантами осуществления клонирующие носители могут включать, помимо регуляторных последовательностей, описанных выше, и последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, как описано в настоящем документе, репликационные и контрольные последовательности, происходящие от видов, совместимых с клеткой-хозяином, которая используется для экспрессии, а также селектируемые маркеры, придающие селектируемый фенотип трансформированным или трансфицированным клеткам. Большое количество подходящих клонирующих векторов известно в данной области техники и коммерчески доступно.[00237] In accordance with various embodiments, the cloning media may include, in addition to the regulatory sequences described above and nucleic acid sequences encoding the fusion protein as described herein, replication and control sequences derived from species compatible with the host cell , which is used for expression, as well as selectable markers that confer a selectable phenotype on transformed or transfected cells. A large number of suitable cloning vectors are known in the art and are commercially available.
[00238] В некоторых вариантах осуществления изобретение также относится к способам получения слитых белков согласно изобретению, начиная с нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок или любые его субъединицы, с использованием методов генной инженерии. В некоторых вариантах осуществления предложенный способ можно осуществлять in vivo, где предложенный слитый белок может, например, быть продуцирован в бактериальном или эукариотическом организме-хозяине, а затем выделен из этого организма-хозяина или его культуры. Также возможно получить слитый белок согласно изобретению in vitro, например, с использованием системы трансляции in vitro.[00238] In some embodiments, the invention also provides methods for producing the fusion proteins of the invention, starting from a nucleic acid encoding the fusion protein or any subunits thereof, using genetic engineering techniques. In some embodiments, the proposed method can be performed in vivo, where the proposed fusion protein can, for example, be produced in a bacterial or eukaryotic host organism and then isolated from that host organism or culture thereof. It is also possible to produce the fusion protein according to the invention in vitro, for example using an in vitro translation system.
[00239] При получении слитого белка in vivo нуклеиновая кислота, кодирующая такой слитый белок, может быть введена в подходящий бактериальный или эукариотический организм-хозяин с использованием технологии рекомбинантных ДНК, хорошо известной в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления молекула ДНК, кодирующая слитый белок, как описано в настоящем документе (например, SEQ ID NO: 138-144), и, в частности, клонирующий вектор, содержащий кодирующую последовательность такого слитого белка, может быть трансформирована в клетку-хозяина, способную экспрессировать ген. Трансформация может быть проведена стандартными методами. Таким образом, изобретение также относится к клеткам-хозяевам, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, как раскрыто в настоящем документе.[00239] When producing a fusion protein in vivo, the nucleic acid encoding the fusion protein can be introduced into a suitable bacterial or eukaryotic host organism using recombinant DNA technology well known in the art. In some embodiments, a DNA molecule encoding a fusion protein as described herein (e.g., SEQ ID NOs: 138-144), and in particular a cloning vector containing the coding sequence of such a fusion protein, can be transformed into a host cell , capable of expressing the gene. The transformation can be carried out using standard methods. Thus, the invention also relates to host cells containing a nucleic acid molecule as disclosed herein.
[00240] В некоторых вариантах осуществления трансформированные клетки-хозяева можно культивировать в условиях, подходящих для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления клетки-хозяева могут быть прокариотическими, такими как Escherichia coli (E. coli) или Bacillus subtilis, или эукариотическими, такими как Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, клетки насекомых SF9 или High5, иммортализованные линии клеток млекопитающих (например, клетки HeLa или клетки CHO) или первичная культура клеток млекопитающих.[00240] In some embodiments, the transformed host cells can be cultured under conditions suitable for expression of a nucleotide sequence encoding a fusion protein of the invention. In some embodiments, the host cells may be prokaryotic, such as Escherichia coli (E. coli) or Bacillus subtilis, or eukaryotic, such as Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, SF9 or High5 insect cells, immortalized mammalian cell lines (e.g., HeLa cells or CHO cells) or primary mammalian cell culture.
[00241] В некоторых вариантах осуществления, где мутеин липокалина согласно изобретению, в том числе входящий в состав слитого белка, раскрытого в настоящем документе, включает внутримолекулярные дисульфидные связи, может быть предпочтительным направлять формирующийся белок в клеточный компартмент, имеющий окисляющую окислительно-восстановительную среду, с использованием соответствующей сигнальной последовательности. Такая окисляющая среда может быть обеспечена периплазмой грамотрицательных бактерий, таких как E. coli, во внеклеточной среде грамположительных бактерий или просвете эндоплазматического ретикулума эукариотических клеток, и обычно способствует образованию структурных дисульфидных связей.[00241] In some embodiments, where the lipocalin mutein of the invention, including that of a fusion protein disclosed herein, includes intramolecular disulfide bonds, it may be preferable to direct the nascent protein to a cellular compartment having an oxidizing redox environment, using the appropriate signal sequence. Such an oxidizing environment may be provided by the periplasm of Gram-negative bacteria such as E. coli, the extracellular environment of Gram-positive bacteria, or the lumen of the endoplasmic reticulum of eukaryotic cells, and typically promotes the formation of structural disulfide bonds.
[00242] В некоторых вариантах осуществления также возможно продуцировать слитый белок согласно изобретению в цитозоле клетки-хозяина, предпочтительно E. coli. В этом случае предложенный слитый белок может быть либо непосредственно получен в растворимом и свернутом состоянии, либо выделен в форме телец включения с последующей ренатурацией in vitro. Еще одним вариантом является использование определенных штаммов-хозяев, имеющих окисляющую внутриклеточную среду, которая может, таким образом, обеспечить возможность образования дисульфидных связей в цитозоле (Venturi et al., J Mol Biol, 2002).[00242] In some embodiments, it is also possible to produce the fusion protein of the invention in the cytosol of a host cell, preferably E. coli. In this case, the proposed fusion protein can either be directly produced in a soluble and folded state, or isolated in the form of inclusion bodies followed by renaturation in vitro. Another option is the use of certain host strains that have an oxidizing intracellular environment, which may thus allow the formation of disulfide bonds in the cytosol (Venturi et al., J Mol Biol, 2002).
[00243] В некоторых вариантах осуществления слитый белок согласно изобретению, описанный в настоящем документе, не обязательно должен быть создан или продуцирован полностью или частично с использованием генной инженерии. Скорее, такой белок также может быть получен любым из многих традиционных и хорошо известных методов, таких как простые стратегии органического синтеза, методы твердофазного синтеза, коммерчески доступные автоматические синтезаторы, или с помощью транскрипции и трансляции in vitro. Например, возможно, что многообещающие слитые белки или мутеины липокалинов, включенные в такие слитые белки, будут идентифицированы с помощью молекулярного моделирования, синтезированы in vitro и исследованы на предмет связывающей активности к представляющей интерес мишени(ям). Методы твердофазного и/или жидкофазного синтеза белков хорошо известны в данной области техники (см., например, Bruckdorfer et al., Curr Pharm Biotechnol, 2004).[00243] In some embodiments, the fusion protein of the invention described herein need not be created or produced, in whole or in part, using genetic engineering. Rather, such a protein can also be produced by any of many traditional and well-known methods, such as simple organic synthesis strategies, solid phase synthesis methods, commercially available automated synthesizers, or by in vitro transcription and translation. For example, it is possible that promising lipocalin fusion proteins or muteins included in such fusion proteins will be identified by molecular modeling, synthesized in vitro, and screened for binding activity to the target(s) of interest. Methods for solid-phase and/or liquid-phase protein synthesis are well known in the art (see, for example, Bruckdorfer et al., Curr Pharm Biotechnol, 2004).
[00244] В некоторых вариантах осуществления слитый белок согласно изобретению может быть получен путем транскрипции/трансляции in vitro с использованием общепризнанных методов, известных специалистам в данной области техники. [00244] In some embodiments, the fusion protein of the invention can be produced by in vitro transcription/translation using conventional methods known to those skilled in the art.
[00245] В некоторых дополнительных вариантах осуществления слитые белки, как описано в настоящем документе, также могут быть получены обычными рекомбинантными методами, отдельно или в сочетании с обычными методами синтеза. [00245] In some additional embodiments, fusion proteins as described herein can also be produced by conventional recombinant methods, alone or in combination with conventional synthetic methods.
[00246] Более того, в некоторых вариантах осуществления слитый белок согласно настоящему изобретению может быть получен путем конъюгирования вместе отдельных субъединиц, например, иммуноглобулинов и мутеинов, входящих в состав слитого белка. Такая конъюгация может быть достигнута, например, с помощью всех форм ковалентной или нековалентной связи с использованием обычных методов.[00246] Moreover, in some embodiments, a fusion protein of the present invention can be produced by conjugating together individual subunits, such as immunoglobulins and muteins, of the fusion protein. Such conjugation can be achieved, for example, using all forms of covalent or non-covalent bonding using conventional methods.
[00247] Специалисту известны способы, подходящие для получения слитых белков, которые предусмотрены настоящим изобретением, но белковые последовательности или последовательности нуклеиновых кислот которых не раскрыты в настоящем документе в явном виде. В общих чертах, такие модификации аминокислотной последовательности включают, например, направленный мутагенез отдельных положений аминокислот для упрощения субклонирования гена белка или его частей путем включения сайтов расщепления для отдельных ферментов рестрикции. Кроме того, эти мутации могут быть включены для дальнейшего улучшения аффинности слитого белка к его мишеням (например, CD137 и PD-L1). Кроме того, могут быть введены мутации для модуляции одной или нескольких характеристик белка, например, для улучшения стабильности фолдинга, стабильности в сыворотке, устойчивости белка или растворимости в воде, или для уменьшения склонности к агрегации, если это необходимо. [00247] One skilled in the art will know methods suitable for producing fusion proteins that are contemplated by the present invention, but whose protein or nucleic acid sequences are not explicitly disclosed herein. In general terms, such amino acid sequence modifications include, for example, site-directed mutagenesis of individual amino acid positions to facilitate subcloning of a protein gene or portions thereof by incorporating cleavage sites for individual restriction enzymes. Additionally, these mutations can be included to further improve the affinity of the fusion protein for its targets (eg, CD137 and PD-L1). In addition, mutations can be introduced to modulate one or more characteristics of the protein, for example, to improve folding stability, serum stability, protein stability or water solubility, or to reduce aggregation propensity, if desired.
V. ПРИМЕРЫV. EXAMPLES
[00248] Пример 1: Экспрессия и анализ иллюстративных слитых белков[00248] Example 1: Expression and Analysis of Exemplary Fusion Proteins
[00249] В этом примере были получены иллюстративные слитые белки антитело-мутеин липокалина путем слияния PD-L1-специфического антитела, имеющего тяжелую цепь, представленную SEQ ID NO: 86, или содержащего вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 77, или содержащего CDR с последовательностями GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62), и легкие цепи, представленные SEQ ID NO: 87, или содержащего вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 82, или содержащего CDR с последовательностями QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64), и CD137-специфического мутеина липокалина с последовательностью SEQ ID NO: 42 посредством линкера, такого как неструктурированный линкер (G4S)3 с последовательностью SEQ ID NO: 13, для одновременного связывания PD-L1 и CD137. Различные созданные форматы показаны на фиг. 1. Например, такие слитые белки, например, SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87 и SEQ ID NO: 90 и 91, были получены путем слияния одного или более мутеинов липокалина с последовательностью SEQ ID NO: 42 с одним или более из четырех концов антитела, содержащего тяжелую цепь, представленную тяжелой цепью, представленной SEQ ID NO: 86, или содержащего вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 77, или содержащего CDR с последовательностями GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62), и легкие цепи, представленные SEQ ID NO: 87, или содержащего вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 82, или содержащего CDR с последовательностями QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64). Полученные слитые белки могут быть бивалентными к CD137 (например, как продемонстрировано на фиг. 1A-1D), или четырехвалентными к CD137 (например, как продемонстрировано на фиг. 1E-1H), или иметь даже более высокую валентность к CD137 (например, как продемонстрировано на фиг. 1I).[00249] In this example, exemplary antibody-lipocalin mutein fusion proteins were produced by fusing a PD-L1-specific antibody having the heavy chain represented by SEQ ID NO: 86, or containing the heavy chain variable domain of SEQ ID NO: 77, or containing the CDR with the sequences GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62), and light chains represented by SEQ ID NO: 87, or containing a variable domain heavy chain SEQ ID NO: 82, or containing CDRs with the sequences QSIGTN (LCDR1; SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64), and CD137-specific lipocalin mutein of the sequence SEQ ID NO: 42 via a linker, such as the unstructured linker (G 4 S) 3 with the sequence SEQ ID NO: 13, to simultaneously bind PD-L1 and CD137. The various formats created are shown in FIG. 1. For example, such fusion proteins as SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NOs: 94 and 87, and SEQ ID NOs: 90 and 91 were prepared by fusing one or more lipocalin muteins of the sequence SEQ ID NO: 42 with one or more of the four ends of an antibody containing the heavy chain represented by the heavy chain represented by SEQ ID NO: 86, or containing a heavy chain variable domain with the sequence SEQ ID NO: 77, or containing a CDR with the sequences GFSLSNYD (HCDR1, SEQ ID NO: 60), IWTGGAT (HCDR2, SEQ ID NO: 61), VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3; SEQ ID NO: 62), and light chains represented by SEQ ID NO: 87, or containing a heavy chain variable domain with the sequence SEQ ID NO: 82, or containing a CDR with the sequences QSIGTN (LCDR1, SEQ ID NO: 63), YAS (LCDR2), QQSNSWPYT (LCDR3; SEQ ID NO: 64). The resulting fusion proteins may be bivalent to CD137 (eg, as demonstrated in Figs. 1A-1D), or tetravalent to CD137 (eg, as demonstrated in Figs. 1E-1H), or have even higher valency to CD137 (eg, as demonstrated in Fig. 1I).
[00250] PD-L1-специфические антитела, а также все слитые белки антитела и мутеина липокалина, описанные в этом примере, имели сконструированный остов IgG4, который содержал мутацию S228P для минимизации обмена половинами молекул IgG4 in vitro и in vivo (Silva et al., J Biol Chem, 2015). Дополнительные мутации в остовах IgG4 также могут существовать во всех описанных здесь антителах и слитых белках, включая любую одну или более мутаций F234A, L235A, M428L, N434S, M252Y, S254T и T256E. Мутации F234A и L235A могут быть введены для снижения ADCC и ADCP (Glaesner et al., Diabetes Metab Res Rev, 2010). Мутации M428L и N434S или мутации M252Y, S254T и T256E могут быть введены для увеличения периода полувыведения из сыворотки (Dall'Acqua et al., J Biol Chem, 2006, Zalevsky et al., Nat Biotechnol, 2010). Все антитела были экспрессированы без карбоксиконцевого лизина, чтобы избежать неоднородности. [00250] The PD-L1-specific antibodies, as well as all antibody-lipocalin mutein fusion proteins described in this example, had an engineered IgG4 backbone that contained the S228P mutation to minimize the exchange of IgG4 halves in vitro and in vivo (Silva et al. , J Biol Chem, 2015). Additional mutations in the IgG4 backbone may also exist in all antibodies and fusion proteins described herein, including any one or more of the F234A, L235A, M428L, N434S, M252Y, S254T, and T256E mutations. The F234A and L235A mutations can be introduced to reduce ADCC and ADCP (Glaesner et al., Diabetes Metab Res Rev, 2010). The M428L and N434S mutations or the M252Y, S254T and T256E mutations can be introduced to increase serum half-life (Dall'Acqua et al., J Biol Chem, 2006, Zalevsky et al., Nat Biotechnol, 2010). All antibodies were expressed without the carboxy-terminal lysine to avoid heterogeneity.
[00251] Кроме того, были получены моноспецифические слияния мутеина липокалина и Fc путем слияния одного или более CD137-специфических мутеинов липокалина с последовательностью SEQ ID NO: 42 посредством линкера, например, неструктурированного (G4S)3 линкера с последовательностью SEQ ID NO: 13, с С-концом Fc-области антитела, представленного в SEQ ID NO: 30, как показано на фиг. 1J-1K. Полученная конструкция представлена в SEQ ID NO: 88-89. [00251] In addition, monospecific lipocalin mutein and Fc fusions have been prepared by fusing one or more CD137-specific lipocalin muteins with the sequence SEQ ID NO: 42 through a linker, for example, a unstructured (G4S)3 linker with the sequence SEQ ID NO: 13, with the C-terminus of the Fc region of the antibody shown in SEQ ID NO: 30, as shown in FIG. 1J-1K. The resulting design is shown in SEQ ID NO: 88-89.
[00252] Настоящее изобретение также включает форматы асимметричного слияния антитела и мутеина липокалина, в которых, например, одна легкая цепь антитела может быть слита с мутеином липокалина, а другая - нет. [00252] The present invention also includes asymmetric antibody-lipocalin mutein fusion formats, in which, for example, one light chain of an antibody may be fused to a lipocalin mutein and the other is not.
[00253] Конструкции слитых белков были созданы путем генного синтеза и клонированы в вектор экспрессии млекопитающих. Затем они были временно экспрессированы в клетках Expi293FTM (Life Technologies). Концентрацию слитых белков в среде для культивирования клеток измеряли с помощью ВЭЖХ (Agilent Technologies) с использованием аффинной колонки POROS® с белком A (Applied Biosystems). Сводные данные по титрам слитых белков приведены в таблице 1.[00253] Fusion protein constructs were generated by gene synthesis and cloned into a mammalian expression vector. They were then transiently expressed in Expi293FTM cells (Life Technologies). The concentration of fusion proteins in the cell culture medium was measured by HPLC (Agilent Technologies) using a POROS® Protein A affinity column (Applied Biosystems). A summary of fusion protein titers is given in Table 1.
[00254] Слитые белки очищали с использованием хроматографии с белком А с последующей эксклюзионной хроматографией (SEC) в натрий-фосфатном буфере (PBS). После очистки методом SEC фракции, содержащие мономерный белок, объединяли и снова анализировали с помощью аналитической SEC. [00254] The fusion proteins were purified using protein A chromatography followed by size exclusion chromatography (SEC) in sodium phosphate buffer (PBS). After purification by SEC, fractions containing monomeric protein were pooled and reanalyzed by analytical SEC.
[00255] Таблица 1: Титры временной экспрессии[00255] Table 1: Temporal Expression Titers
[мг/мл]Expression titer
[mg/ml]
[00256] Пример 2: Экспрессия слитых белков[00256] Example 2: Expression of Fusion Proteins
[00257] Конструкции иллюстративных слитых белков были созданы путем генного синтеза, включая оптимизацию кодонов, и клонированы в вектор экспрессии млекопитающих. Затем они были стабильно экспрессированы в клетках яичника китайского хомячка (СНО). Концентрацию слитых белков в среде для культивирования клеток измеряли с помощью Octet (ForteBio, Pall Corp.) с сенсорами на белок A и определяли количественно с использованием стандарта человеческого IgG1. Сводные данные по титрам слитых белков приведены в таблице 2. Данные дают основания полагать, что геометрия слитых белков может влиять на выход продукта и продуктивность клеток.[00257] Exemplary fusion protein constructs were generated by gene synthesis, including codon optimization, and cloned into a mammalian expression vector. They were then stably expressed in Chinese hamster ovary (CHO) cells. The concentration of fusion proteins in cell culture medium was measured using Octet (ForteBio, Pall Corp.) with Protein A sensors and quantified using a human IgG1 standard. A summary of the fusion protein titers is shown in Table 2. The data suggest that the geometry of the fusion proteins may influence product yield and cell productivity.
[00258] Таблица 2: Титры стабильной экспрессии[00258] Table 2: Stable Expression Titers
[мг/мл]Expression titer
[mg/ml]
[00259] Пример 3: Связывание слитых белков с PD-L1 или CD137, определенное методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR)[00259] Example 3: Binding of Fusion Proteins to PD-L1 or CD137 Determined by Surface Plasmon Resonance (SPR)
[00260] Кинетику связывания и аффинность иллюстративных слитых белков к huPD-L1-His или huCD137-His (человеческий PD-L1 или человеческий CD137 с С-концевой полигистидиновой меткой, R&D Systems) определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием Biacore 8K или Biacore T200 (GE Healthcare). [00260] The binding kinetics and affinity of exemplary fusion proteins to huPD-L1-His or huCD137-His (human PD-L1 or human CD137 with a C-terminal polyhistidine tag, R&D Systems) were determined by surface plasmon resonance (SPR) using Biacore 8K or Biacore T200 (GE Healthcare).
[00261] Антитело к человеческому Fc IgG (GE Healthcare) иммобилизовали на сенсорном чипе CM5 с использованием стандартной реакции аминов: карбоксильные группы на чипе были активированы с использованием 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS). Затем раствор антитела к Fc человеческого IgG (GE Healthcare) в концентрации 25 мкг/мл в 10 мМ ацетате натрия (pH 5,0) наносили при скорости потока 5 мкл/мин до уровня иммобилизации 6000-10000 единиц резонанса (RU). Остаточные непрореагировавшие сложные эфиры NHS блокировали пропусканием через поверхность раствора 1M этаноламина. Аналогичным образом был обработан референсный канал. Затем тестируемые слитые белки (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87, SEQ ID NO: 90 и 91, SEQ ID NO: 88 и SEQ ID NO: 89) при 0,25 мкг/мл или 0,5 мкг/мл в буфере HBS-EP+ захватывали антителом к человеческому Fc-IgG на поверхности чипа в течение 180 сек при скорости потока 10 мкл/мин. После каждого шага захвата иглу промывали. Антитела к PD-L1, включая референсное антитело (SEQ ID NO: 26 и 27) и антитело, входящее в состав слитых белков (SEQ ID NO: 86 и 87), и референсное антитело к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29) также тестировали в качестве контролей.[00261] Anti-human Fc IgG antibody (GE Healthcare) was immobilized onto the CM5 sensor chip using a standard amine reaction: the carboxyl groups on the chip were activated using 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). A solution of 25 μg/mL anti-human IgG Fc antibody (GE Healthcare) in 10 mM sodium acetate (pH 5.0) was then applied at a flow rate of 5 μL/min to an immobilization level of 6,000–10,000 resonance units (RU). Residual unreacted NHS esters were blocked by passing a 1 M ethanolamine solution through the surface. The reference channel was processed in a similar way. Then test fusion proteins (SEQ ID NO: 90 and 87, SEQ ID NO: 86 and 91, SEQ ID NO: 92 and 87, SEQ ID NO: 86 and 93, SEQ ID NO: 94 and 87, SEQ ID NO: 90 and 91, SEQ ID NO: 88 and SEQ ID NO: 89) at 0.25 μg/ml or 0.5 μg/ml in HBS-EP+ buffer was captured with anti-human Fc-IgG antibody on the chip surface for 180 sec at speed flow 10 µl/min. After each capture step, the needle was washed. Antibodies to PD-L1, including reference antibody (SEQ ID NOs: 26 and 27) and fusion protein antibody (SEQ ID NOs: 86 and 87), and reference antibody to CD137 (SEQ ID NOs: 28 and 29) also tested as controls.
[00262] Для определения аффинности были приготовлены разведения huPD-L1-His (10 нМ, 5 нМ и 2,5 нМ или huCD137-His (900 нМ, 300 нМ и 100 нМ) в буфере HBS-EP+ и нанесены на подготовленную поверхность чипа. Анализ связывания проводили при времени контакта 180 сек, времени диссоциации 900 сек и скорости потока 30 мкл/мин. Все измерения проводились при 25°C. Регенерация поверхности чипа достигалась введениями 3 М MgCl2 в течение 120 сек. Перед измерением белка было проведено три пусковых цикла для целей подготовки. Данные оценивали с помощью программного обеспечения для оценки Biacore T200 (v2.0) или с помощью программного обеспечения для оценки Biacore 8K (V1.1.1). Для аппроксимации необработанных данных использовали двойное сравнение с контролем и модель связывания 1:1.[00262] To determine the affinity, dilutions of huPD-L1-His (10 nM, 5 nM and 2.5 nM or huCD137-His (900 nM, 300 nM and 100 nM) were prepared in HBS-EP+ buffer and applied to the prepared chip surface The binding assay was performed at a contact time of 180 sec, a dissociation time of 900 sec and a flow rate of 30 µl/min. All measurements were carried out at 25°C. Regeneration of the chip surface was achieved by injecting 3 M MgCl 2 for 120 sec. starting cycles for preparation purposes. Data were evaluated using Biacore T200 evaluation software (v2.0) or Biacore 8K evaluation software (V1.1.1) A double comparison with control and binding model 1 were used to fit the raw data: 1.
[00263] Сводные значения, определенные для kon, koff и результирующей константы равновесной диссоциации (KD) для иллюстративных слитых белков приведены в таблице 3. Все биспецифические слитые белки (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87, и SEQ ID NO: 90 и 91) связывают PD-L1, а также CD137 с аффинностью в субнаномолярном или низком наномолярном диапазоне. Моноспецифические CD137-специфические слияния мутеин липокалина-Fc (SEQ ID NO: 88 и SEQ ID NO: 89) связывают только CD137 с аффинностью в низком наномолярном диапазоне.[00263] Summary values determined for k on , k off and the resulting equilibrium dissociation constant (K D ) for exemplary fusion proteins are shown in Table 3. All bispecific fusion proteins (SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NOs: 94 and 87, and SEQ ID NOs: 90 and 91) bind PD-L1 as well as CD137 with subnanomolar or low nanomolar affinity range. Monospecific CD137-specific lipocalin-Fc mutein fusions (SEQ ID NO: 88 and SEQ ID NO: 89) bind only CD137 with affinity in the low nanomolar range.
[00264] Таблица 3: Кинетические константы и аффинности слитых белков, определенные с помощью SPR[00264] Table 3: Kinetic constants and affinities of fusion proteins determined by SPR
[00265] Пример 4. Связывание слитых белков с PD-L1 или CD137 в твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA)[00265] Example 4: Binding of fusion proteins to PD-L1 or CD137 in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
[00266] Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) использовали для определения силы связывания иллюстративных слитых белков с человеческим PD-L1 и PD-L1 яванского макака. [00266] An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the binding strength of exemplary fusion proteins to human PD-L1 and cynomolgus PD-L1.
[00267] Рекомбинантный huPD-L1-His или cyPD-L1-His (PD-L1 человека или яванского макака с C-концевой полигистидиновой меткой, R&D Systems или Sino Biologics) в концентрации 1 мкг/мл в PBS наносили на ночь на планшеты для микротитрования при 4°С. После промывки PBS-0,05%T (PBS с добавкой 0,05% (об./об.) Tween 20) планшеты блокировали 2% BSA (мас./об.) в PBS-0,1%T (PBS с добавкой 0,1% (об./об.) Tween 20) в течение 1 ч при комнатной температуре. После пятикратной промывки 100 мкл PBS-0,05%T иллюстративные слитые белки (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87, SEQ ID NO: 90 и 91), CD137-специфические слияния Fc с мутеином липокалина (SEQ ID NO: 88 и SEQ ID NO: 89) и антитела к PD-L1 (SEQ ID NO: 26 и 27, SEQ ID NO: 86 и 87) в различных концентрациях добавляли в лунки и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего следовала еще одна стадия промывки. Изучаемые связанные молекулы детектировали путем инкубации с разведенным 1:5000 античеловеческим IgG Fc-HRP (Jackson Laboratory) в PBS-0,1%T-2%BSA. После дополнительной стадии промывки в каждую лунку добавляли флуорогенный субстрат HRP (QuantaBlu, Thermo) и определяли интенсивность флуоресценции с помощью считывающего флуоресценцию устройства для микропланшетов. [00267] Recombinant huPD-L1-His or cyPD-L1-His (human or cynomolgus PD-L1 with a C-terminal polyhistidine tag, R&D Systems or Sino Biologics) at a concentration of 1 μg/ml in PBS was applied overnight to plates for microtitration at 4°C. After washing with PBS-0.05%T (PBS supplemented with 0.05% (v/v) Tween 20), the plates were blocked with 2% BSA (w/v) in PBS-0.1%T (PBS with adding 0.1% (v/v) Tween 20) for 1 hour at room temperature. After washing five times with 100 μl PBS-0.05%T, the exemplary fusion proteins (SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NO: 94 and 87, SEQ ID NO: 90 and 91), CD137-specific lipocalin mutein Fc fusions (SEQ ID NO: 88 and SEQ ID NO: 89) and anti-PD-L1 antibodies (SEQ ID NO: 26 and 27 , SEQ ID NOs: 86 and 87) at various concentrations were added to the wells and incubated for 1 hour at room temperature, followed by another washing step. Bound molecules of interest were detected by incubation with a 1:5000 dilution of anti-human IgG Fc-HRP (Jackson Laboratory) in PBS-0.1%T-2%BSA. After an additional washing step, the fluorogenic substrate HRP (QuantaBlu, Thermo) was added to each well and the fluorescence intensity was determined using a fluorescence microplate reader.
[00268] Такую же схему ELISA также использовали для определения силы связывания слитых белков с CD137, где на планшет для микротитрования взаимен наносили huCD137-His (человеческий CD137 с C-концевой полигистидиновой меткой, R&D Systems) или cyCD137-Fc (CD137 яванского макака, слитый с Fc на C-конце). Тестируемые агенты титровали аналогичным образом и детектировали связанные агенты с помощью антитела к NGAL-HRP.[00268] The same ELISA scheme was also used to determine the binding strength of the fusion proteins to CD137, where huCD137-His (human CD137 with a C-terminal polyhistidine tag, R&D Systems) or cyCD137-Fc (cynomolgus CD137, fused to Fc at the C-terminus). The test agents were titrated in a similar manner and bound agents were detected using an anti-NGAL-HRP antibody.
[00269] Результаты иллюстративных экспериментов представлены на фиг. 2A-2D вместе с аппроксимирующими кривыми, полученными в результате аппроксимации сигмоидальной кривой связывания 1:1, где значение EC50 и максимальный сигнал были свободными параметрами, а наклон был установлен равным единице. Полученные значения EC50 представлены в таблице 4. [00269] The results of illustrative experiments are presented in FIG. 2A-2D along with fitting curves obtained from a 1:1 sigmoidal binding curve fit where EC 50 and maximum signal were free parameters and the slope was set to one. The obtained EC 50 values are presented in Table 4.
[00270] Наблюдаемые значения ЕС50 по отношению к двум человеческим мишеням предложенных слитых белков (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87, SEQ ID NO: 90 и 91, SEQ ID NO: 88, и SEQ ID NO: 89) были очень похожи или сопоставимы с тестируемыми антителами к PD-L1 (референсное антитело к PD-L1 с последовательностями SEQ ID NO: 26 и 27 и антитело к PD-L1 с последовательностью SEQ ID NO: 86 и 87, включенные в слитые белки), и/или CD137-специфическим мутеином липокалина, входящим в состав слитых белков (SEQ ID NO: 42). [00270] Observed EC 50 values relative to two human targets of the proposed fusion proteins (SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NOs: 94 and 87, SEQ ID NOs: 90 and 91, SEQ ID NO: 88, and SEQ ID NO: 89) were very similar or comparable to the anti-PD-L1 antibodies tested (reference anti-PD-L1 antibody with the sequences SEQ ID NOs: 26 and 27 and anti-PD-L1 antibody with SEQ ID NOs: 86 and 87 included in the fusion proteins) and/or CD137-specific lipocalin mutein included in the fusion proteins (SEQ ID NO: 42).
[00271] Все протестированные слитые белки демонстрируют перекрестную реактивность с PD-L1 яванского макака, при этом значения EC50 сопоставимы с референсным антителом к PD-L1 (SEQ ID NO: 26 и 27) или антителом к PD-L1, включенным в слитые белки (SEQ ID NO: 86 и 87). Только слитые белки, которые являются четырехвалентными к CD137 (SEQ ID NO: 94 и 87, SEQ ID NO: 90 и 91 и SEQ ID NO: 88), демонстрируют перекрестную реактивность с CD137 яванского макака на уровне, сопоставимом с человеческим CD137, т. е. связывают CD137 яванского макака со значениями ЕС50 в том же диапазоне, что и соответствующие ЕС50 для человеческого CD137. [00271] All fusion proteins tested exhibit cross-reactivity with cynomolgus PD-L1, with EC 50 values comparable to the reference anti-PD-L1 antibody (SEQ ID NOs: 26 and 27) or anti-PD-L1 antibody included in the fusion proteins (SEQ ID NO: 86 and 87). Only fusion proteins that are tetravalent to CD137 (SEQ ID NOs: 94 and 87, SEQ ID NOs: 90 and 91, and SEQ ID NO: 88) show cross-reactivity with cynomolgus CD137 at a level comparable to human CD137, i.e. e. associate cynomolgus CD137 with EC 50 values in the same range as the corresponding EC 50 for human CD137.
[00272] Таблица 4. Данные ELISA для связывания PD-L1 или CD137[00272] Table 4. ELISA data for PD-L1 or CD137 binding
Связывание с huPD-L1EC 50 [nM]
Binding to huPD-L1
Связывание с cyPD-L1EC 50 [nM]
Binding to cyPD-L1
Связывание с huCD137EC 50 [nM]
Binding to huCD137
Связывание с cyCD137EC 50 [nM]
Binding to cyCD137
[00273] Пример 5. Одновременное связывание слитых белков с PD-L1 и CD137 в ELISA[00273] Example 5: Simultaneous binding of PD-L1 and CD137 fusion proteins in ELISA
[00274] Чтобы продемонстрировать одновременное связывание иллюстративных слитых белков с PD-L1 и CD137, использовали формат ELISA с двойным связыванием. [00274] To demonstrate simultaneous binding of exemplary fusion proteins to PD-L1 and CD137, a dual-binding ELISA format was used.
[00275] Рекомбинантный huPD-L1-His (R&D Systems) в PBS (1 мкг/мл) наносили на ночь на планшеты для микротитрования при 4°C. Планшеты промывали пять раз после каждой стадии инкубации 100 мкл PBS-0,05%T. Планшеты блокировали 2% BSA (мас./об.) в PBS-0,1%T в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем снова промывали. В лунки добавляли различные концентрации тестируемых слитых белков и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с последующей стадией промывки. Затем добавляли биотинилированный huCD137-His (huCD137-His-Bio, Sino Biological) при постоянной концентрации 1 мкг/мл в PBS-0,1%T-2%BSA на 1 ч. После промывки в лунки добавляли разведенный 1:5000 ExtrAvidin-HRP (Sigma-Aldrich) в PBS-0,1%T-2% BSA и инкубировали в течение 1 ч. После дополнительной стадии промывки в каждую лунку добавляли флуорогенный субстрат HRP (QuantaBlu, Thermo) и определяли интенсивность флуоресценции с помощью считывающего флуоресценцию устройства для микропланшетов. [00275] Recombinant huPD-L1-His (R&D Systems) in PBS (1 μg/ml) was applied to microtiter plates overnight at 4°C. The plates were washed five times after each incubation step with 100 μl PBS-0.05%T. The plates were blocked with 2% BSA (w/v) in PBS-0.1%T for 1 h at room temperature and then washed again. Various concentrations of test fusion proteins were added to the wells and incubated for 1 h at room temperature, followed by a washing step. Then, biotinylated huCD137-His (huCD137-His-Bio, Sino Biological) was added at a constant concentration of 1 μg/ml in PBS-0.1%T-2%BSA for 1 hour. After washing, a diluted 1:5000 ExtrAvidin- HRP (Sigma-Aldrich) in PBS-0.1%T-2% BSA and incubated for 1 h. After an additional washing step, the fluorogenic HRP substrate (QuantaBlu, Thermo) was added to each well and the fluorescence intensity was determined using a fluorescence reading device for microplates.
[00276] Двойное связывание иллюстративных слитых белков также тестировали с использованием обратной схемы, где рекомбинантный 1 мкг/мл huCD137-His (R&D Systems) наносили на планшеты для микротитрования, а связанные слитые белки детектировали путем добавления биотинилированного huPD-L1-His (R&D Systems). [00276] Double binding of exemplary fusion proteins was also tested using a reverse design where recombinant 1 μg/ml huCD137-His (R&D Systems) was coated on microtiter plates and bound fusion proteins were detected by adding biotinylated huPD-L1-His (R&D Systems ).
[00277] Данные по двойному связыванию слитых белков (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87, и SEQ ID NO: 90 и 91) показаны на фиг. 3A и 3B вместе с аппроксимирующими кривыми, полученными в результате аппроксимации сигмоидальной кривой связывания 1:1, где значение EC50 и максимальный сигнал были свободными параметрами, а наклон был установлен равным единице. Сводные значения EC50 приведены в таблице 5. Все биспецифические слитые белки демонстрируют явные сигналы связывания, что говорит о том, что слитые белки способны одновременно связывать PD-L1 и CD137. Данные также дают основания полагать, что слияние CD137-специфических мутеинов липокалинов с С-концами PD-L1-специфических антител может быть более предпочтительным, чем с N-концами.[00277] Fusion protein double binding data (SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NOs: 94 and 87, and SEQ ID NOs: 90 and 91) are shown in FIG. 3A and 3B along with fitting curves obtained from a 1:1 sigmoidal binding curve fit where EC 50 and maximum signal were free parameters and the slope was set to one. Summary EC 50 values are shown in Table 5. All bispecific fusion proteins exhibit clear binding signals, indicating that the fusion proteins are capable of simultaneously binding PD-L1 and CD137. The data also suggest that fusion of CD137-specific lipocalin muteins to the C termini of PD-L1-specific antibodies may be favored over the N termini.
[00278] Таблица 5. Данные ELISA по одновременному целевому связыванию PD-L1 и CD37[00278] Table 5. ELISA Data for Simultaneous Targeting of PD-L1 and CD37 Binding
Захват PD-L1_детекция CD137EC 50 [nM]
PD-L1 capture_CD137 detection
Захват CD137_детекция PD-L1EC 50 [nM]
CD137 capture_PD-L1 detection
[00279] Пример 6. Анализ связывания слитых белков с клетками, экспрессирующими CD137 и PD-L1 человека и яванского макака, методом проточной цитометрии[00279] Example 6: Flow cytometry analysis of fusion protein binding to cells expressing human and cynomolgus CD137 and PD-L1
[00280] Целевое специфическое связывание слитых белков с клетками, экспрессирующими PD-L1 человека и яванского макака, и клетками, экспрессирующими CD137 человека и яванского макака, оценивали методом проточной цитометрии.[00280] Target specific binding of the fusion proteins to cells expressing human and cynomolgus PD-L1 and cells expressing human and cynomolgus CD137 was assessed by flow cytometry.
[00281] Клетки CHO стабильно трансфицировали человеческим PD-L1, PD-L1 яванского макака, человеческим CD137, CD137 яванского макака или имитационным контролем с использованием системы Flp-In (Life technologies) в соответствии с инструкциями производителя.[00281] CHO cells were stably transfected with human PD-L1, cynomolgus PD-L1, human CD137, cynomolgus CD137, or mock control using the Flp-In system (Life technologies) according to the manufacturer's instructions.
[00282] Трансфицированные клетки СНО поддерживали в среде F12 Хэма (Life technologies) с добавкой 10% фетальной телячьей сыворотки (Biochrom) и 500 мкг/мл гигромицина B (Roth). Клетки культивировали в колбах для клеточных культур в соответствии с инструкциями производителя (37°C, атмосфера 5% CO2).[00282] Transfected CHO cells were maintained in Ham's F12 medium (Life technologies) supplemented with 10% fetal calf serum (Biochrom) and 500 μg/ml hygromycin B (Roth). Cells were cultured in cell culture flasks according to the manufacturer's instructions (37°C, 5% CO2 atmosphere).
[00283] Для анализа методом проточной цитометрии соответствующие клеточные линии инкубировали со слитыми белками (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87, SEQ ID NO: 90 и 91, SEQ ID NO: 88, и SEQ ID NO: 89) и детектировали с использованием флуоресцентно меченого антитела к человеческому IgG в анализе FACS, как описано ниже:[00283] For flow cytometry analysis, appropriate cell lines were incubated with fusion proteins (SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NOs: 94 and 87, SEQ ID NOs: 90 and 91, SEQ ID NO: 88, and SEQ ID NO: 89) and detected using a fluorescently labeled anti-human IgG antibody in a FACS assay as described below:
[00284] 5 × 104 клеток на лунку инкубировали в течение 1 ч в ледяном PBS, содержащем 5% фетальной телячьей сыворотки (PBS-FCS). К клеткам добавляли последовательные разведения слитых белков и контрольных антител и инкубировали в течение 1 ч на льду. Клетки дважды промывали PBS и затем инкубировали с козьим антителом к hIgG, меченым Alexa647, в течение 30 мин на льду. Затем клетки промывали и анализировали с помощью проточного цитометра iQue (Intellicyte Screener). Средние геометрические значения сигналов флуоресценции наносили на график и аппроксимировали с помощью программного обеспечения Graphpad с использованием нелинейной регрессии (общая нижняя асимптота, наклон = 1).[00284] 5 x 10 4 cells per well were incubated for 1 hour in ice-cold PBS containing 5% fetal calf serum (PBS-FCS). Serial dilutions of the fusion proteins and control antibodies were added to the cells and incubated for 1 h on ice. Cells were washed twice with PBS and then incubated with Alexa647-labeled goat anti-hIgG antibody for 30 min on ice. Cells were then washed and analyzed using an iQue flow cytometer (Intellicyte Screener). Geometric means of fluorescence signals were plotted and fitted using Graphpad software using nonlinear regression (overall lower asymptote, slope = 1).
[00285] Способность слитых белков связывать PD-L1 и CD137 человека и яванского макака показана на фиг. 4. Аффинности связывания (EC50) биспецифических слитых белков (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87, и SEQ ID NO: 90 и 91) к клеткам, экспрессирующим PD-L1 человека и яванского макака, находятся в одноразрядном наномолярном диапазоне, демонстрируя полную перекрестную реактивность с яванским макаком (сводные данные представлены в таблице 6). Аффинности связывания слитых белков с клетками, экспрессирующими человеческий CD137, находится в низком наномолярном диапазоне. Протестированные слитые белки полностью перекрестно реагируют с CD137 яванского макака (SEQ ID NO: 94 и 87, SEQ ID NO: 90 и 91 и SEQ ID NO: 88), связывают CD137 яванского макака со сниженной в 6-13 раз аффинностью по сравнению с соответствующими аффинностями связывания с человеческим CD137 (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91 и SEQ ID NO: 89), или не связывают CD137 яванского макака (SEQ ID NO: 92 и 87 и 86 и 93). Ни один из слитых белков не связывается с ложно трансфицированными клетками.[00285] The ability of the fusion proteins to bind human and cynomolgus PD-L1 and CD137 is shown in FIG. 4. Binding affinities (EC 50 ) of bispecific fusion proteins (SEQ ID NO: 90 and 87, SEQ ID NO: 86 and 91, SEQ ID NO: 92 and 87, SEQ ID NO: 86 and 93, SEQ ID NO: 94 and 87, and SEQ ID NOs: 90 and 91) to cells expressing human and cynomolgus PD-L1 are in the single-digit nanomolar range, demonstrating complete cross-reactivity with cynomolgus (summarized in Table 6). The binding affinities of the fusion proteins to cells expressing human CD137 are in the low nanomolar range. The fusion proteins tested fully cross-reacted with cynomolgus CD137 (SEQ ID NOs: 94 and 87, SEQ ID NOs: 90 and 91, and SEQ ID NO: 88), binding cynomolgus CD137 with a 6- to 13-fold reduced affinity compared to the corresponding binding affinities to human CD137 (SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91 and SEQ ID NO: 89), or do not bind cynomolgus CD137 (SEQ ID NOs: 92 and 87 and 86 and 93). Neither fusion protein binds to mock-transfected cells.
[00286] [00286]
[00287] Таблица 6. Аффинности связывания слитых белков с клетками, экспрессирующими PD-L1 или CD137 человека и яванского макака [00287] Table 6. Binding affinities of fusion proteins to cells expressing human and cynomolgus PD-L1 or CD137
Flp-In-CHO::huCD137EC 50 [nM]
Flp-In-CHO::huCD137
Flp-In-CHO::cynoCD137EC 50 [nM]
Flp-In-CHO::cynoCD137
Flp-In-CHO::huPDL-1EC 50 [nM]
Flp-In-CHO::huPDL-1
Flp-In-CHO::cynoPDL-1EC 50 [nM]
Flp-In-CHO::cynoPDL-1
[00288] Пример 7. Аффинности связывания слитых белков с PD-L1-положительными опухолевыми клетками[00288] Example 7: Binding affinities of fusion proteins to PD-L1 positive tumor cells
[00289] Связывание слитых белков с опухолевыми клетками, экспрессирующими PD-L1, оценивали методом проточной цитометрии. [00289] The binding of fusion proteins to tumor cells expressing PD-L1 was assessed by flow cytometry.
[00290] Экспрессирующую PD-L1 линию клеток колоректального рака RKO поддерживали в RPMI1640 (Life technologies) с добавкой 10% FCS при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2.[00290] The PD-L1 expressing colorectal cancer cell line RKO was maintained in RPMI1640 (Life technologies) supplemented with 10% FCS at 37°C in a humidified atmosphere of 5% CO 2 .
[00291] Для анализа методом проточной цитометрии клетки RKO инкубировали со слитыми белками и детектировали с использованием флуоресцентно меченого антитела к человеческому IgG, как описано в примере 6.[00291] For flow cytometry analysis, RKO cells were incubated with the fusion proteins and detected using a fluorescently labeled anti-human IgG antibody as described in Example 6.
[00292] Способность слитых белков (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87, и SEQ ID NO: 90 и 91) связывать PD-L1-положительные опухолевые клетки показана на фиг. 5, а сводные данные по соответствующим аффинностям связывания (EC50) представлены в таблице 7. Аффинности связывания слитых белков с PD-L1-экспрессирующими клетками RKO находилась в низком наномолярном или субнаномолярном диапазоне и были сопоставимы с антителом к PD-L1, включенным в слитые белки (SEQ ID NO: 86 и 87).[00292] The ability of fusion proteins (SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NOs: 94 and 87, and SEQ ID NO: 90 and 91) to bind PD-L1 positive tumor cells is shown in FIG. 5, and a summary of the corresponding binding affinities (EC 50 ) is presented in Table 7. The binding affinities of the fusion proteins to PD-L1-expressing RKO cells were in the low nanomolar or subnanomolar range and were comparable to the anti-PD-L1 antibody included in the fusions proteins (SEQ ID NO: 86 and 87).
[00293] Таблица 7. Аффинности связывания слитых белков с PD-L1-положительными опухолевыми клетками[00293] Table 7. Binding affinities of fusion proteins to PD-L1 positive tumor cells
RKOEC 50 [nM]
RKO
[00294] Пример 8. Определение конкуренции между CD137L и слитыми белками за связывание с CD137 методом SPR[00294] Example 8 Determination of competition between CD137L and fusion proteins for binding to CD137 by SPR method
[00295] Для исследования конкуренции между человеческим CD137L (huCD137L-His, R&D Systems) и иллюстративными слитыми белками за связывание с человеческим CD137 использовали анализ методом SPR. Анализ конкуренции проводили при 25°C на приборе Biacore T200 (GE Healthcare). [00295] An SPR assay was used to examine the competition between human CD137L (huCD137L-His, R&D Systems) and exemplary fusion proteins for binding to human CD137. Competition assays were performed at 25°C on a Biacore T200 instrument (GE Healthcare).
[00296] Реагент BiotinCAPture (GE Healthcare) иммобилизовали на сенсорном чипе CAP при концентрации 50 мкг/мл и скорости потока 2 мкл/мин в течение 300 сек. Аналогичным образом был обработан референсный канал. Биотинилированный huCD137-Fc (R&D systems) был захвачен на поверхности чипа в течение 300 сек при концентрации 1 мкг/мл и при скорости потока 5 мкл/мин по другому каналу. [00296] BiotinCAPture reagent (GE Healthcare) was immobilized on the CAP sensor chip at a concentration of 50 μg/ml and a flow rate of 2 μl/min for 300 seconds. The reference channel was processed in a similar way. Biotinylated huCD137-Fc (R&D systems) was captured on the chip surface for 300 s at a concentration of 1 μg/mL and at a flow rate of 5 μL/min through the other channel.
[00297] Чтобы проанализировать, конкурируют ли тестируемые слитые белки (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 90 и 91, SEQ ID NO: 88, и SEQ ID NO: 89) с CD137L за связывание CD137, подвижный буфер (буфер HBS-EP+) либо 500 нМ huCD137L-His наносили на поверхность чипа на 180 с со скоростью потока 30 мкл/мин. Затем тестируемые слитые белки наносили на подготовленную поверхность чипа в буфере HBS-EP+ при фиксированной концентрации 1 мкМ. Анализ связывания проводили при времени контакта 180 сек, времени диссоциации 15 сек и скорости потока 30 мкл/мин. В качестве контроля осуществляли введения буфера с теми же параметрами. Регенерация поверхности чипа достигалась введениями 6M гуанидина-HCl, 0,25M NaOH в течение 120 сек при скорости потока 10 мкл/мин, с последующей дополнительной стадией промывки H2O (120 сек, 10 мкл/мин).[00297] To analyze whether the test fusion proteins (SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NOs: 90 and 91, SEQ ID NO: 88, and SEQ ID NO: 89) with CD137L for CD137 binding, running buffer (HBS-EP+ buffer) or 500 nM huCD137L-His was applied to the chip surface for 180 s at a flow rate of 30 μl/min. The test fusion proteins were then applied to the prepared chip surface in HBS-EP+ buffer at a fixed concentration of 1 μM. The binding assay was performed at a contact time of 180 s, a dissociation time of 15 s, and a flow rate of 30 μL/min. As a control, a buffer was introduced with the same parameters. Chip surface regeneration was achieved by injecting 6M guanidine-HCl, 0.25M NaOH for 120 sec at a flow rate of 10 µL/min, followed by an additional H 2 O washing step (120 sec, 10 µL/min).
[00298] Иллюстративные примеры для релевантного сегмента полученных сенсограмм представлены на фиг. 6 для слитых белков SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 90 и 91, SEQ ID NO: 88 и SEQ ID NO: 89. Кривая SPR для связывания соответствующего слитого белка только с huCD137-Fc отмечена стрелкой со сплошным стержнем. Кривая SPR для связывания слитого белка с huCD137-Fc, насыщенного huCD137L-His, отмечена стрелкой с пунктирным стержнем. Данные показывают, что все слитые белки связываются с huCD137 в присутствии huCD137L, но со слегка уменьшенными сигналами по сравнению с их связыванием с CD137 в отсутствие CD137L. Это дает основания полагать, что тестируемые слитые белки могут быть в некоторой степени стерически затруднены связыванием CD137L с CD137. Такое поведение связывания слитых белков (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 90 и 91, SEQ ID NO: 88 и SEQ ID NO: 89) аналогично поведению антитела к CD137 с последовательностями SEQ ID NO: 28 и 29. [00298] Illustrative examples for a relevant segment of acquired sensorgrams are presented in FIG. 6 for fusion proteins SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NOs: 90 and 91, SEQ ID NOs: 88 and SEQ ID NO: 89. The SPR curve for binding of the corresponding fusion protein to huCD137-Fc alone is indicated by a solid arrow. The SPR curve for binding of the huCD137-Fc fusion protein saturated with huCD137L-His is indicated by a dotted arrow. The data show that all fusion proteins bind to huCD137 in the presence of huCD137L, but with slightly reduced signals compared to their binding to CD137 in the absence of CD137L. This suggests that the fusion proteins tested may be somewhat sterically hindered by the binding of CD137L to CD137. This binding behavior of fusion proteins (SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NOs: 90 and 91, SEQ ID NO: 88 and SEQ ID NO: 89) behaves similarly to the anti-CD137 antibody with SEQ ID NOs: 28 and 29.
[00299] Пример 9. Конкуренция слитых белков с PD-L1 за связывание с PD-1, определенная с помощью ELISA[00299] Example 9: Competition of PD-L1 fusion proteins for binding to PD-1 determined by ELISA
[00300] Чтобы продемонстрировать способность слитых белков ингибировать взаимодействие между PD-1 и PD-L1, использовали конкурентный формат ELISA. [00300] To demonstrate the ability of the fusion proteins to inhibit the interaction between PD-1 and PD-L1, a competitive ELISA format was used.
[00301] Рекомбинантный huPD-1-His (Acrobiosystems) в PBS (1 мкг/мл) наносили на ночь на планшеты для микротитрования при 4°C. Планшеты промывали пять раз после каждой стадии инкубации 100 мкл PBS-0,05%T (PBS с добавкой 0,05% (об./об.) Tween 20). Планшеты блокировали 2% BSA (мас./об.) в PBS-0,1%T (PBS с добавкой 0,1% (об./об.) Tween 20) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем снова промывали. Слитые белки в различных концентрациях смешивали с 15 нМ рекомбинантного huPD-L1-Fc (R&D systems) в качестве индикатора и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Смеси слитых белков и индикатора добавляли в планшеты и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, после чего проводили пять этапов промывки 100 мкл PBS-0,05%T. Затем в лунки добавляли разведенные 1:5000 козьи антитела к человеческому Fc-IgG HRP (Jackson) и инкубировали в течение 1 ч. После дополнительной стадии промывки в каждую лунку добавляли флуорогенный субстрат HRP (QuantaBlu, Thermo) и определяли интенсивность флуоресценции с помощью считывающего флуоресценцию устройства для микропланшетов. [00301] Recombinant huPD-1-His (Acrobiosystems) in PBS (1 μg/ml) was applied to microtiter plates overnight at 4°C. The plates were washed five times after each incubation step with 100 μl PBS-0.05%T (PBS supplemented with 0.05% (v/v) Tween 20). Plates were blocked with 2% BSA (w/v) in PBS-0.1%T (PBS supplemented with 0.1% (v/v) Tween 20) for 1 h at room temperature and then washed again . Various concentrations of fusion proteins were mixed with 15 nM recombinant huPD-L1-Fc (R&D systems) as an indicator and incubated for 1 h at room temperature. Fusion protein and indicator mixtures were added to the plates and incubated for 20 min at room temperature, followed by five washing steps with 100 μl PBS-0.05%T. A 1:5000 dilution of goat anti-human Fc-IgG HRP antibody (Jackson) was then added to the wells and incubated for 1 h. After an additional washing step, the fluorogenic HRP substrate (QuantaBlu, Thermo) was added to each well and the fluorescence intensity was determined using a fluorescence reader. devices for microplates.
[00302] Данные по конкуренции иллюстративных слитых белков (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93 и SEQ ID NO: 90 и 91) показаны на фиг. 7 вместе с аппроксимирующими кривыми, полученными в результате аппроксимации сигмоидальной кривой связывания 1:1, где значение IC50 и максимальный сигнал были свободными параметрами, а наклон был установлен равным единице. Сводные значения IC50 приведены в таблице 9. Все биспецифические слитые белки продемонстрировали явное ингибирование взаимодействия PD-1/PD-L1 со значениями IC50, сопоставимыми с антителом-строительным блоком (SEQ ID NO: 86 и 87) и референсным антителом к PD-L1 (SEQ ID NO: 26 и 27).[00302] Competition Data for Exemplary Fusion Proteins (SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, and SEQ ID NOs: 90 and 91) are shown in Fig. 7 along with fitting curves obtained from a 1:1 sigmoidal binding curve fit where the IC 50 value and maximum signal were free parameters and the slope was set to unity. Summary of IC50 values are shown in Table 9. All bispecific fusion proteins demonstrated clear inhibition of the PD-1/PD-L1 interaction with IC50 values comparable to the building block antibody (SEQ ID NOs: 86 and 87) and the reference anti-PD-L1 antibody. L1 (SEQ ID NO: 26 and 27).
[00303] Таблица 8. Конкуренция слитых белков с PD-L1 за связывание с PD-1[00303] Table 8. Competition of PD-L1 fusion proteins for binding to PD-1
[00304] Пример 10. PD-L1-зависимая костимуляция Т-клеток с помощью биоанализа с CD137[00304] Example 10: PD-L1-Dependent T Cell Costimulation Using CD137 Bioassay
[00305] Потенциал выбранных слитых белков в отношении индукции активации сигнального пути CD137 в присутствии PD-L1 оценивали с использованием коммерчески доступной дважды стабильно трансфицированной линии клеток Jurkat, экспрессирующей CD137 и ген luc2 (гуманизированная версия люциферазы светлячка), где экспрессия luc2 регулируется NFκB-отвечающим элементом. В этом биоанализе связывание CD137 приводит к внутриклеточной передаче сигнала CD137, что приводит к люминесценции, опосредованной NFκB.[00305] The potential of selected fusion proteins to induce activation of the CD137 signaling pathway in the presence of PD-L1 was assessed using a commercially available doubly stably transfected Jurkat cell line expressing CD137 and the luc2 gene (a humanized version of firefly luciferase), where luc2 expression is regulated by an NFκB response element. In this bioassay, CD137 binding results in intracellular CD137 signaling, resulting in NFκB-mediated luminescence.
[00306] Экспрессирующую PD-L1 линию клеток колоректального рака RKO культивировали, как описано в примере 7. За день до анализа клетки RKO высевали из расчета 1,25 × 104 клеток на лунку и оставляли на ночь для прикрепления при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2.[00306] The PD-L1-expressing colorectal cancer cell line RKO was cultured as described in Example 7. The day before analysis, RKO cells were seeded at 1.25 x 10 4 cells per well and allowed to attach overnight at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 .
[00307] На следующий день в каждую лунку добавляли 3,75 × 104 клеток NF-kB-Luc2/CD137 Jurkat с последующим добавлением различных концентраций, обычно в диапазоне от 0,001 до 5 нМ, слитых белков или референсного антитела к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29). Планшеты закрывали газопроницаемой пленкой и инкубировали при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2. Спустя 4 часа в каждую лунку добавляли 30 мкл реагента Bio-Glo™ и количественно определяли биолюминесцентный сигнал с помощью люминометра (PHERAstar). Анализ с использованием четырехпараметрической логистической кривой был выполнен с помощью GraphPad Prism® для расчета значений EC50 (общая нижняя асимптота, фиксированный наклон), которые обобщены в таблице 9. Чтобы продемонстрировать зависимость связывания CD137 слитыми белками от PD-L1, параллельно проводили этот же эксперимент в отсутствие клеток RKO. Анализ проводили в трех повторностях.[00307] The next day, 3.75 x 10 4 NF-kB-Luc2/CD137 Jurkat cells were added to each well, followed by the addition of various concentrations, typically ranging from 0.001 to 5 nM, of fusion proteins or reference anti-CD137 antibody (SEQ ID NO: 28 and 29). The plates were covered with a gas-permeable film and incubated at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 . After 4 hours, 30 μl of Bio-Glo™ reagent was added to each well and the bioluminescent signal was quantified using a luminometer (PHERAstar). Four-parameter logistic curve analysis was performed using GraphPad Prism® to calculate EC 50 (common lower asymptote, fixed slope) values, which are summarized in Table 9. To demonstrate the dependence of CD137 fusion protein binding on PD-L1, the same experiment was performed in parallel in the absence of RKO cells. The analysis was carried out in triplicate.
[00308] Результаты иллюстративного эксперимента представлены на фиг. 8A-8D. Данные показывают, что все протестированные слитые белки (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87 и SEQ ID NO: 86 и 93) индуцировали сильную костимуляцию Т-клеток, опосредованную CD137. На фиг. 8B и 8D показано, что активация CD137 слитыми белками зависит от PD-L1, поскольку активация клеток NF-kB-Luc2/CD137 Jurkat не была обнаружена в отсутствие опухолевых клеток, экспрессирующих PD-L1. Напротив, референсное mAb к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29) продемонстрировало опосредованную CD137 костимуляцию Т-клеток независимо от наличия или отсутствия клеток-мишеней.[00308] The results of an illustrative experiment are shown in FIG. 8A-8D. Data show that all fusion proteins tested (SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, and SEQ ID NOs: 86 and 93) induced strong CD137-mediated T cell co-stimulation . In fig. 8B and 8D show that activation of CD137 by fusion proteins is dependent on PD-L1, since activation of NF-κB-Luc2/CD137 Jurkat cells was not detected in the absence of tumor cells expressing PD-L1. In contrast, the reference mAb to CD137 (SEQ ID NOs: 28 and 29) demonstrated CD137-mediated costimulation of T cells regardless of the presence or absence of target cells.
[00309] Таблица 9. Оценка активации Т-клеток с помощью биоанализа с CD137[00309] Table 9. Assessment of T cell activation using CD137 bioassay
С клетками RKOEC 50 [nM]
With RKO cells
[00310] Пример 11. Оценка активации Т-клеток с использованием человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК)[00310] Example 11: Assessment of T Cell Activation Using Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs)
[00311] Анализ на T-клетках использовали для оценки способности выбранных слитых белков костимулировать Т-клеточные ответы, а также предотвращать коингибирование, опосредованное связыванием PD-L1 с PD-1. С этой целью слитые белки в различных концентрациях добавляли к стафилококковому энтеротоксину B (SEB), стимулированному человеческими мононуклеарными клетками периферической крови (МНПК), и инкубировали в течение 4 дней при 37°C. В супернатантах измеряли уровни секреции IL-2.[00311] A T cell assay was used to evaluate the ability of selected fusion proteins to costimulate T cell responses as well as prevent coinhibition mediated by PD-L1 binding to PD-1. For this purpose, fusion proteins at various concentrations were added to staphylococcal enterotoxin B (SEB)-stimulated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and incubated for 4 days at 37°C. IL-2 secretion levels were measured in the supernatants.
[00312] МНПК от здоровых добровольцев-доноров выделяли из лейкотромбоцитарного слоя центрифугированием в градиенте плотности полисахарозы (Biocoll, 1,077 г/мл, Biochrom), следуя протоколам Biochrom. Очищенные МНПК ресуспендировали в буфере, состоящем из 90% FCS и 10% ДМСО, немедленно замораживали и хранили в жидком азоте до дальнейшего использования. Для анализа МНПК размораживали и помещали в культуральную среду (RPMI 1640, Life Technologies) с добавкой 10% FCS и 1% пенициллин-стрептомицина (Life Technologies) на 16 ч при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2.[00312] PBMCs from healthy volunteer donors were isolated from the buffy platelet layer by polysucrose density gradient centrifugation (Biocoll, 1.077 g/ml, Biochrom) following Biochrom protocols. Purified PBMCs were resuspended in a buffer consisting of 90% FCS and 10% DMSO, immediately frozen, and stored in liquid nitrogen until further use. For analysis, PBMCs were thawed and placed in culture medium (RPMI 1640, Life Technologies) supplemented with 10% FCS and 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies) for 16 h at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 .
[00313] Следующая процедура была проведена в трех повторностях для каждого условия эксперимента: 2,5x104 МНПК инкубировали в каждой лунке 384-луночных планшетов с плоским дном для тканевых культур в культуральной среде. Последовательные разведения слитых белков (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87 и SEQ ID NO: 90 и 91), антитела к PD-L1-строительного блока (SEQ ID NO: 86 и 87), референсного антитела к PD-L1 (SEQ ID NO: 26 и 27), референсного антитела к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29), коктейля из референсного антитела к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29) и антитела к PD-L1 (SEQ ID NO: 86 и 87 или SEQ ID NO: 26 и 27) или изотипического контроля (SEQ ID NO: 24 и 25), обычно в диапазоне от 10 до 0,002 нМ, и SEB в концентрации 0,1 нг/мл добавляли в соответствующие лунки. Планшеты закрывали газопроницаемой пленкой (4titude) и инкубировали при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в течение четырех дней. Затем оценивали уровни IL-2 в супернатанте с использованием набора для определения человеческого IL-2 DuoSet (R&D Systems), как описано в следующих процедурах. [00313] The following procedure was performed in triplicate for each experimental condition: 2.5 x 10 4 PBMCs were incubated in each well of 384-well flat-bottom tissue culture plates in culture medium. Serial dilutions of fusion proteins (SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NOs: 94 and 87, and SEQ ID NO: 90 and 91), anti-PD-L1 building block antibody (SEQ ID NO: 86 and 87), reference anti-PD-L1 antibody (SEQ ID NO: 26 and 27), reference anti-CD137 antibody (SEQ ID NO: 28 and 29 ), a cocktail of reference anti-CD137 antibody (SEQ ID NO: 28 and 29) and anti-PD-L1 antibody (SEQ ID NO: 86 and 87 or SEQ ID NO: 26 and 27) or isotype control (SEQ ID NO: 24 and 25), typically ranging from 10 to 0.002 nM, and SEB at a concentration of 0.1 ng/ml was added to the appropriate wells. The plates were covered with gas permeable film (4titude) and incubated at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 for four days. IL-2 levels in the supernatant were then assessed using the Human IL-2 DuoSet kit (R&D Systems) as described in the following procedures.
[00314] 384-луночные планшеты покрывали на 2 ч при комнатной температуре 1 мкг/мл «антитела захвата к человеческому IL-2» в PBS. Затем лунки 5 раз промывали 80 мкл PBS с добавкой 0,05% Tween (PBS-T). Спустя 1 ч блокирования в PBS-0,05%T, содержащем 1% казеина (мас./мас.), супернатанты из анализа и серию концентраций стандарта IL-2, разведенного в культуральной среде, переносили в соответствующие лунки и инкубировали в течение ночи при 4°C. На следующий день добавляли смесь 100 нг/мл козьего детектирующего антитела анти-hIL-2-Bio (R&D Systems) и 1 мкг/мл меченого Sulfotag стрептавидина (Mesoscale Discovery) в PBS-T, содержащем 0,5% казеина, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После промывки в каждую лунку добавляли 25 мкл буфера для считывания (Mesoscale Discovery) и детектировали полученный сигнал электрохемилюминесценции (ECL) считывающим устройством Mesoscale Discovery. Анализ и количественную оценку проводили с использованием программного обеспечения Mesoscale Discovery.[00314] 384-well plates were coated for 2 hours at room temperature with 1 μg/ml "anti-human IL-2 capture antibody" in PBS. The wells were then washed 5 times with 80 μl PBS supplemented with 0.05% Tween (PBS-T). After 1 h of blocking in PBS-0.05%T containing 1% casein (w/w), assay supernatants and a series of concentrations of IL-2 standard diluted in culture medium were transferred to appropriate wells and incubated overnight. at 4°C. The next day, a mixture of 100 ng/ml goat anti-hIL-2-Bio detection antibody (R&D Systems) and 1 μg/ml Sulfotag-labeled streptavidin (Mesoscale Discovery) was added in PBS-T containing 0.5% casein and incubated at room temperature for 1 hour. After washing, 25 μl of reading buffer (Mesoscale Discovery) was added to each well and the resulting electrochemiluminescence (ECL) signal was detected by a Mesoscale Discovery reader. Analysis and quantification were performed using Mesoscale Discovery software.
[00315] Результат иллюстративного эксперимента представлен на фиг. 9. Биспецифические слитые белки SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87 и SEQ ID NO: 90 и 91 способны индуцировать активацию Т-клеток, о чем свидетельствуют повышенные уровни секреции IL-2 по сравнению с изотипическим контролем (hIgG4, Sigma). Самое большое повышение секреции IL-2 наблюдается для слитых белков, четырехвалентных к CD137 (SEQ ID NO: 94 и 87 и SEQ ID NO: 90 и 91), за ними следуют слитые белки, бивалентные к CD137, где мутеин липокалина слит с C-концом PD-L1-специфического антитела (SEQ ID NO: 90 и 87 и SEQ ID NO: 86 и 91). Самое маленькое повышение наблюдается для слитых белков, бивалентных к CD137, где мутеин липокалина слит с N-концом PD-L1-специфического антитела (SEQ ID NO: 92 и 87 и SEQ ID NO: 86 и 93), однако оно все еще сопоставимо с коктейлем из референсного антитела к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29) и референсного антитела к PD-L1 (SEQ ID NO: 26 и 27). Все слитые белки демонстрируют более высокие уровни секреции IL-2, чем отдельные строительные блоки, т. е. CD137-специфический мутеин липокалина-Fc (SEQ ID NO: 88 или SEQ ID NO: 89) или mAb к PD-L1-строительный блок (SEQ ID NO: 86 и 87).[00315] The result of an illustrative experiment is shown in FIG. 9. Bispecific Fusion Proteins SEQ ID NO: 90 and 87, SEQ ID NO: 86 and 91, SEQ ID NO: 92 and 87, SEQ ID NO: 86 and 93, SEQ ID NO: 94 and 87 and SEQ ID NO: 90 and 91 are able to induce T cell activation, as evidenced by increased levels of IL-2 secretion compared to isotype control (hIgG4, Sigma). The greatest increase in IL-2 secretion is observed for CD137 tetravalent fusion proteins (SEQ ID NOs: 94 and 87 and SEQ ID NOs: 90 and 91), followed by CD137 bivalent fusion proteins where the lipocalin mutein is fused to C- end of a PD-L1-specific antibody (SEQ ID NOs: 90 and 87 and SEQ ID NOs: 86 and 91). The smallest increase is observed for CD137 bivalent fusion proteins, where a lipocalin mutein is fused to the N-terminus of a PD-L1-specific antibody (SEQ ID NOs: 92 and 87 and SEQ ID NOs: 86 and 93), but is still comparable to a cocktail of a reference antibody to CD137 (SEQ ID NOs: 28 and 29) and a reference antibody to PD-L1 (SEQ ID NOs: 26 and 27). All fusion proteins exhibit higher levels of IL-2 secretion than the individual building blocks, i.e., CD137-specific lipocalin-Fc mutein (SEQ ID NO: 88 or SEQ ID NO: 89) or anti-PD-L1 building block mAb (SEQ ID NO: 86 and 87).
[00316] Пример 12. Оценка активации Т-клеток в присутствии опухолевых клеток, экспрессирующих различные уровни PD-L1[00316] Example 12: Assessing T Cell Activation in the Presence of Tumor Cells Expressing Various Levels of PD-L1
[00317] Дополнительный анализ на Т-клетках использовали для оценки способности слитых белков костимулировать активацию Т-клеток зависимым от мишени PD-L1 образом. Слитые белки применяли в различных концентрациях к Т-клеткам, стимулированным антителом к CD3, в присутствии линий опухолевых клеток с различными уровнями экспрессии PD-L1. Протестированные линии опухолевых клеток включают RKO (высокий уровень PD-L1), HCC827 (умеренный уровень PD-L1) и Hep-G2 (PD-L1-отрицательные). В супернатантах измеряли уровни секреции IL-2. [00317] An additional T cell assay was used to evaluate the ability of the fusion proteins to co-stimulate T cell activation in a PD-L1 target-dependent manner. The fusion proteins were applied at varying concentrations to anti-CD3-stimulated T cells in the presence of tumor cell lines with varying levels of PD-L1 expression. Tumor cell lines tested include RKO (high PD-L1), HCC827 (moderate PD-L1), and Hep-G2 (PD-L1 negative). IL-2 secretion levels were measured in the supernatants.
[00318] МНПК от здоровых добровольцев-доноров выделяли из лейкотромбоцитарного слоя, как описано в примере 11. Т-лимфоциты дополнительно выделяли из МНПК с помощью магнитно-активированной сортировки клеток с использованием набора для очистки пан-T-клеток (Miltenyi Biotec GmbH) в соответствии с инструкциями производителя. Очищенные пан-T-клетки ресуспендировали в буфере, состоящем из 90% FCS и 10% ДМСО, немедленно замораживали и хранили в жидком азоте до дальнейшего использования.[00318] PBMCs from healthy volunteer donors were isolated from the buffy platelet layer as described in Example 11. T lymphocytes were further isolated from PBMCs by magnetically activated cell sorting using a pan-T cell purification kit (Miltenyi Biotec GmbH) in according to the manufacturer's instructions. Purified pan-T cells were resuspended in a buffer consisting of 90% FCS and 10% DMSO, immediately frozen, and stored in liquid nitrogen until further use.
[00319] Для анализа T-клетки размораживали и помещали в культуральную среду (RPMI 1640, Life Technologies) с добавкой 10% FCS и 1% пенициллин-стрептомицина (Life Technologies) на 16 ч при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2.[00319] For analysis, T cells were thawed and placed in culture medium (RPMI 1640, Life Technologies) supplemented with 10% FCS and 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies) for 16 hours at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 .
[00320] Следующая процедура была проведена в трех повторах для каждого условия эксперимента: планшеты с плоским дном для тканевых культур предварительно покрывали 0,25 мкг/мл антитела к CD3 на 1 ч при 37°C, а затем дважды промывали PBS. Линии опухолевых клеток RKO, HCC827 или Hep-G2 обрабатывали в течение 30 минут 30 мкг/мл митомицина C (Sigma Aldrich) для блокирования пролиферации. Затем обработанные митомицином опухолевые клетки дважды промывали PBS и высевали из расчета 2,5 × 104 клеток на лунку в культуральную среду, чтобы обеспечить прикрепление, на ночь при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2. Клетки-мишени, до этого выращивавшиеся в стандартных условиях, отделяли с помощью Accutase (PAA Laboratories) и ресуспендировали в культуральной среде. [00320] The following procedure was performed in triplicate for each experimental condition: Flat-bottom tissue culture plates were precoated with 0.25 μg/ml anti-CD3 antibody for 1 hour at 37°C and then washed twice with PBS. RKO, HCC827, or Hep-G2 tumor cell lines were treated for 30 min with 30 μg/ml mitomycin C (Sigma Aldrich) to block proliferation. Mitomycin-treated tumor cells were then washed twice with PBS and seeded at 2.5 × 10 4 cells per well in culture medium to allow attachment overnight at 37°C in a humidified atmosphere of 5% CO 2 . Target cells previously grown under standard conditions were separated using Accutase (PAA Laboratories) and resuspended in culture medium.
[00321] В следующие дни после двукратной промывки планшетов PBS к опухолевым клеткам добавляли 1,25 × 104 Т-клеток на лунку. Последовательные разведения слитых белков (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87 и SEQ ID NO: 86 и 93), референсного антитела к PD-L1 (SEQ ID NO: 26 и 27) и референсного антитела к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29), использованных по отдельности или в комбинации, или изотипического контроля (SEQ ID NO: 24 и 25), обычно в диапазоне от 0,005 нМ до 10 нМ, добавляли в соответствующие лунки. Планшеты закрывали газопроницаемой пленкой и инкубировали при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в течение 3 дней. [00321] On the following days, after washing the plates twice with PBS, 1.25 x 10 4 T cells per well were added to the tumor cells. Serial dilutions of fusion proteins (SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, and SEQ ID NOs: 86 and 93), reference anti-PD-L1 antibody (SEQ ID NO: 26 and 27) and reference anti-CD137 antibody (SEQ ID NOs: 28 and 29), used alone or in combination, or isotype control (SEQ ID NOs: 24 and 25), typically ranging from 0.005 nM to 10 nM, was added to corresponding holes. The plates were covered with a gas-permeable film and incubated at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 for 3 days.
[00322] Спустя 3 дня совместного культивирования оценивали уровень IL-2 в супернатанте, как описано в примере 11.[00322] After 3 days of co-culture, the level of IL-2 in the supernatant was assessed as described in Example 11.
[00323] Иллюстративные данные показаны на фиг. 10. Совместное культивирование пан-T-клеток с клетками RKO (высокий уровень PD-L1) или HCC827 (умеренный уровень PD-L1) в присутствии слитых белков, где мутеин липокалина слит с C-концом PD-L1-специфического антитела (SEQ ID NO: 90 и 87 и SEQ ID NO: 86 и 91), приводило к явному повышению секреции IL-2 по сравнению с изотипическим контролем hIgG4. Повышение секреции IL-2, вызванное слитыми белками, где мутеин липокалина слит с N-концом PD-L1-специфического антитела (SEQ ID NO: 92 и 87 и SEQ ID NO: 86 и 93), было более слабым, но тем не менее выше, чем с коктейлем из референсного антитела к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29) и референсного антитела к PD-L1 (SEQ ID NO: 26 и 27). Никакого повышения секреции IL-2 не наблюдалось с коктейлем из строительных блоков: CD137-специфического мутеина липокалина (слияние с Fc, SEQ ID NO: 89) и антитела к PD-L1 (SEQ ID NO: 86 и 87). Кроме того, совместное культивирование с Hep-G2 (PD-L1-отрицательные) не вызывало повышения уровней секреции IL-2 ни с какими слитыми белками, в отличие от коктейля из референсного антитела к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29) и референсного антитела к PD-L1 (SEQ ID NO: 26 и 27).[00323] Exemplary data is shown in FIG. 10. Coculture of pan-T cells with RKO (high PD-L1) or HCC827 (moderate PD-L1) cells in the presence of fusion proteins where the lipocalin mutein is fused to the C-terminus of a PD-L1-specific antibody (SEQ ID NOs: 90 and 87 and SEQ ID NOs: 86 and 91) resulted in a clear increase in IL-2 secretion compared to the hIgG4 isotype control. The increase in IL-2 secretion caused by fusion proteins where a lipocalin mutein is fused to the N-terminus of a PD-L1-specific antibody (SEQ ID NOs: 92 and 87 and SEQ ID NOs: 86 and 93) was weaker, but still higher than with a cocktail of the reference antibody to CD137 (SEQ ID NO: 28 and 29) and the reference antibody to PD-L1 (SEQ ID NO: 26 and 27). No increase in IL-2 secretion was observed with the building block cocktail of CD137-specific lipocalin mutein (Fc fusion, SEQ ID NO: 89) and anti-PD-L1 antibody (SEQ ID NO: 86 and 87). In addition, co-culture with Hep-G2 (PD-L1 negative) did not increase levels of IL-2 secretion with any fusion proteins, unlike a cocktail of reference anti-CD137 antibody (SEQ ID NOs: 28 and 29) and reference antibodies to PD-L1 (SEQ ID NO: 26 and 27).
[00324] Данные показывают, что функциональная активность слитых белков, измеренная по их способности активировать Т-клетки или повышать секрецию IL-2, зависит от PD-L1. Напротив, активация Т-клеток или секреция IL-2, индуцированная референсным антителом к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29) при использовании в комбинации с референсным антителом к PD-L1 (SEQ ID NO: 26 и 27), не обязательно зависит от PD-L1 и ее трудно предсказать. Кроме того, данные показывают, что биспецифический формат нацеливания на PD-L1 и CD137 превосходит коктейль из двух отдельных молекул, нацеленных на CD137 и PD-L1, в присутствии клеток-мишеней, экспрессирующих PD-L1.[00324] Data indicate that the functional activity of the fusion proteins, as measured by their ability to activate T cells or increase IL-2 secretion, is dependent on PD-L1. In contrast, T cell activation or IL-2 secretion induced by the reference antibody to CD137 (SEQ ID NOs: 28 and 29) when used in combination with the reference antibody to PD-L1 (SEQ ID NOs: 26 and 27) is not necessarily affected by from PD-L1 and is difficult to predict. Additionally, the data show that the bispecific format of targeting PD-L1 and CD137 is superior to a cocktail of two separate molecules targeting CD137 and PD-L1 in the presence of PD-L1-expressing target cells.
[00325] Пример 13. Оценка стабильности слитых белков при хранении[00325] Example 13: Evaluation of Storage Stability of Fusion Proteins
[00326] Для оценки стабильности при хранении иллюстративные слитые белки (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87, SEQ ID NO: 88 и SEQ ID NO: 89) инкубировали в течение 1 недели при 37°C в концентрации 1 мг/мл в PBS. Затем определяли мономерные слитые белки с использованием аналитической эксклюзионной хроматографии путем нанесения 20 мкг образца на колонку Superdex 200, 3.2/300 Increase (GE Healthcare) при скорости потока 0,15 мл/мин и PBS в качестве подвижного буфера. Все протестированные слитые пептиды были стабильными после инкубации в течение 1 недели в PBS при 37°C. Иллюстративные результаты показаны на фиг. 11A.[00326] To evaluate storage stability, exemplary fusion proteins (SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NOs: 94 and 87, SEQ ID NO: 88 and SEQ ID NO: 89) were incubated for 1 week at 37°C at a concentration of 1 mg/ml in PBS. Monomeric fusion proteins were then determined using analytical size exclusion chromatography by applying 20 μg of sample to a Superdex 200, 3.2/300 Increase column (GE Healthcare) at a flow rate of 0.15 ml/min and PBS as running buffer. All fusion peptides tested were stable after incubation for 1 week in PBS at 37°C. Exemplary results are shown in FIG. 11A.
[00327] Дальнейшие оценки стабильности при хранении были выполнены для выбранного слитого белка с последовательностями SEQ ID NO: 90 и 87. Слитый белок в концентрации 20 мг/мл инкубировали в течение четырех недель при 40°C в 25 мМ гистидине, 60 мМ NaCl, 200 мМ аргинине, pH 6. Содержание функционального слитого белка измеряли с помощью количественного анализа ELISA, используя анализ одновременного связывания, как описано в примере 5. Иллюстративные результаты показаны на фиг. 11B.[00327] Further storage stability evaluations were performed on the selected fusion protein with SEQ ID NOs: 90 and 87. The fusion protein at a concentration of 20 mg/ml was incubated for four weeks at 40°C in 25 mM histidine, 60 mM NaCl, 200 mM arginine, pH 6. Functional fusion protein content was measured by quantitative ELISA using a co-binding assay as described in Example 5. Exemplary results are shown in FIG. 11B.
[00328] Пример 14. Оценка реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR) с CD4+ Т-клетками [00328] Example 14: Evaluation of Mixed Lymphocyte Culture Response (MLR) with CD4 + T Cells
[00329] Анализ реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR) использовали для оценки способности иллюстративного слитого белка индуцировать активацию CD4+ Т-клеток в присутствии антигенпрезентирующих клеток. Слитый белок (SEQ ID NO: 90 и 87) в различных концентрациях тестировали в присутствии моноцитарных дендритных клеток (moDC) и CD4+ Т-клеток от несовместимых здоровых доноров. Спустя 6 дней культивирования в присутствии тестируемых молекул количественно определяли секрецию IL-2 и IFN-гамма в супернатантах.[00329] A mixed lymphocyte response (MLR) assay was used to evaluate the ability of an exemplary fusion protein to induce CD4 + T cell activation in the presence of antigen presenting cells. The fusion protein (SEQ ID NOs: 90 and 87) at various concentrations was tested in the presence of monocytic dendritic cells (moDC) and CD4 + T cells from unmatched healthy donors. After 6 days of culture in the presence of the test molecules, the secretion of IL-2 and IFN-gamma in the supernatants was quantified.
[00330] МНПК очищали из пакета концентрата тромбоцитов, полученного аферезом, используя раствор Lymphoprep, следуя инструкциям производителя (StemCell). Суммарные CD4+ Т-лимфоциты очищали от МНПК с использованием набора от Miltenyi и замораживали в растворе 90% FBS 10% ДМСО. CD14+ моноциты очищали с использованием набора CD14+ микросфер (Miltenyi) и использовали в свежем виде.[00330] PBMCs were purified from the apheresis platelet concentrate packet using Lymphoprep solution following the manufacturer's instructions (StemCell). Total CD4 + T cells were purified from PBMCs using a kit from Miltenyi and frozen in 90% FBS 10% DMSO. CD14 + monocytes were purified using a CD14 + microsphere kit (Miltenyi) and used fresh.
[00331] MoDC были получены путем культивирования CD14+ моноцитов в RPMI1640 с 10% FBS и пенициллин/стрептомицином (LifeTech) в присутствии 50 нг/мл IL-4 и 100 нг/мл ГМ-КСФ (Miltenyi) в течение 6 дней при 2x106 клеток/мл. На 3-й день добавляли 10 мл свежей среды, содержащей цитокины. Фенотип (CD14, CD1a, HLADR, PD-L1) оценивали на 7-й день дифференцировки с помощью FACS.[00331] MoDCs were generated by culturing CD14 + monocytes in RPMI1640 with 10% FBS and penicillin/streptomycin (LifeTech) in the presence of 50 ng/ml IL-4 and 100 ng/ml GM-CSF (Miltenyi) for 6 days at 2x10 6 cells/ml. On day 3, 10 ml of fresh medium containing cytokines was added. Phenotype (CD14, CD1a, HLADR, PD-L1) was assessed at day 7 of differentiation using FACS.
[00332] 10000 moDC культивировали в присутствии 50000 CD4+ T-клеток в 96-луночных планшетах с U-образным дном в полной среде RPMI, в присутствии тестируемых молекул в течение 6 дней в RPMI в трех параллельных лунках. По окончании культивирования супернатанты немедленно замораживали и хранили для количественного определения цитокинов.[00332] 10,000 moDCs were cultured in the presence of 50,000 CD4 + T cells in 96-well U-bottom plates in complete RPMI medium, in the presence of test molecules, for 6 days in RPMI in three parallel wells. At the end of culture, supernatants were immediately frozen and stored for cytokine quantification.
[00333] Уровень IL-2 измеряли в супернатантах с использованием технологии Luminex, и иллюстративные данные показаны на фиг. 12. На фиг. 12A показано, что слитый белок (SEQ ID NO: 90 и 87) продемонстрировал значительно лучшую индукцию IL-2 при 10 и 0,1 мкг/мл по сравнению с соответствующими строительными блоками (SEQ ID NO: 89 и SEQ ID NO: 86 и 87) по отдельности или референсным антителом к CD137 или к PD-L1 (SEQ ID NO: 28 и 29 или SEQ ID NO: 26 и 27) в нескольких сериях экспериментов MLR (N=8). На фиг. 12B показано, что слитый белок (SEQ ID NO: 90 и 87) индуцировал дозозависимую секрецию IL-2 по сравнению с антителом изотипического контроля. Уровни IL-2, индуцированные слитым белком с последовательностями SEQ ID NO: 90 и 87, были выше по сравнению с эквимолярными концентрациями коктейля из референсного антитела к PD-L1 (SEQ ID NO: 26 и 27) и референсного антитела к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29) в диапазоне концентраций от 0,001 до 20 мкг/мл. [00333] The level of IL-2 was measured in the supernatants using Luminex technology, and exemplary data is shown in FIG. 12. In FIG. 12A shows that the fusion protein (SEQ ID NO: 90 and 87) demonstrated significantly better IL-2 induction at 10 and 0.1 μg/ml compared to the corresponding building blocks (SEQ ID NO: 89 and SEQ ID NO: 86 and 87) alone or with the reference anti-CD137 or anti-PD-L1 antibody (SEQ ID NOs: 28 and 29 or SEQ ID NOs: 26 and 27) in several series of MLR experiments (N=8). In fig. 12B shows that the fusion protein (SEQ ID NOs: 90 and 87) induced dose-dependent secretion of IL-2 compared to the isotype control antibody. IL-2 levels induced by the fusion protein SEQ ID NOs: 90 and 87 were higher compared to equimolar concentrations of a cocktail of the reference anti-PD-L1 antibody (SEQ ID NOs: 26 and 27) and the reference anti-CD137 antibody (SEQ ID NO: 28 and 29) in the concentration range from 0.001 to 20 µg/ml.
[00334] Пример 15. Оценка реакции смешанной культуры лимфоцитов с CD8+ Т-клетками [00334] Example 15. Evaluation of the reaction of a mixed culture of lymphocytes with CD8 + T cells
[00335] Учитывая сведения об экспрессии и активности CD137 в человеческих CD8+ Т-клетках, описанные в литературе, способность иллюстративного слитого белка индуцировать активацию CD8+ Т-клеток в присутствии антигенпрезентирующих клеток оценили в анализе MLR. Слитый белок (SEQ ID NO: 90 и 87) тестировали в присутствии moDC и суммарных CD8+ Т-клеток от несовместимых здоровых доноров. Спустя 6 дней культивирования в присутствии тестируемых молекул количественно определяли секрецию IL-2 и эффекторных молекул CD8 (перфорина, гранзима B и гранзима A) в супернатантах.[00335] Given the knowledge of the expression and activity of CD137 in human CD8 + T cells described in the literature, the ability of an exemplary fusion protein to induce CD8 + T cell activation in the presence of antigen presenting cells was assessed in an MLR assay. The fusion protein (SEQ ID NOs: 90 and 87) was tested in the presence of moDC and total CD8 + T cells from unmatched healthy donors. After 6 days of culture in the presence of test molecules, the secretion of IL-2 and CD8 effector molecules (perforin, granzyme B and granzyme A) in the supernatants was quantified.
[00336] МНПК очищали из пакета концентрата тромбоцитов, полученного аферезом, используя раствор Lymphoprep, следуя инструкциям производителя (StemCell). Суммарные CD8+ Т-лимфоциты очищали от МНПК с использованием набора от Miltenyi и использовали свежими. CD14-положительные моноциты очищали с использованием набора микросфер CD14+ (Miltenyi) и использовали в свежем виде.[00336] PBMCs were purified from the apheresis platelet concentrate packet using Lymphoprep solution following the manufacturer's instructions (StemCell). Total CD8 + T lymphocytes were purified from PBMCs using a kit from Miltenyi and used fresh. CD14-positive monocytes were purified using a CD14 + microsphere kit (Miltenyi) and used fresh.
[00337] MoDC были получены путем культивирования CD14+ моноцитов в RPMI1640 с 10% FBS и пенициллин/стрептомицином (LifeTech) в присутствии 50 нг/мл IL-4 и 100 нг/мл ГМ-КСФ (Miltenyi) в течение 6 дней при 2x106 клеток/мл. На 3-й день добавляли 10 мл свежей среды, содержащей цитокины. Фенотип (CD14, CD1a, HLADR, PD-L1) оценивали на 7-й день дифференцировки с помощью FACS.[00337] MoDCs were generated by culturing CD14 + monocytes in RPMI1640 with 10% FBS and penicillin/streptomycin (LifeTech) in the presence of 50 ng/ml IL-4 and 100 ng/ml GM-CSF (Miltenyi) for 6 days at 2x10 6 cells/ml. On day 3, 10 ml of fresh medium containing cytokines was added. Phenotype (CD14, CD1a, HLADR, PD-L1) was assessed at day 7 of differentiation using FACS.
[00338] 10000 moDC культивировали с 50000 CD8+ T-клеток в присутствии тестируемых молекул в 96-луночных планшетах с U-образным дном (в трех параллельных лунках) в полной среде RPMI в течение 6 дней. По окончании культивирования супернатанты немедленно замораживали и хранили для количественного определения секретированных факторов.[00338] 10,000 moDCs were cultured with 50,000 CD8 + T cells in the presence of test molecules in 96-well U-bottom plates (in three parallel wells) in complete RPMI medium for 6 days. At the end of culture, supernatants were immediately frozen and stored for quantification of secreted factors.
[00339] В супернатантах количественно определяли IL-2, перфорин, гранзим А и гранзим В с использованием технологии Luminex. Иллюстративные данные показаны на фиг. 13.[00339] IL-2, perforin, granzyme A and granzyme B were quantified in the supernatants using Luminex technology. Exemplary data is shown in FIG. 13.
[00340] На фиг. 13 показано, что слитый белок (SEQ ID NO: 90 и 87) продемонстрировал повышение секреции IL-2, перфорина, гранзима B и гранзима A по сравнению с эквимолярной концентрацией референсного антитела к PD-L1 (SEQ ID NO: 26 и 27), референсного антитела к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29) или коктейлем из этих двух антител в концентрации 10 мкг/мл (N=4). Данные также указывают на то, что слитый белок (SEQ ID NO: 90 и 87) обладает активностью в отношении цитотоксических CD8+ Т-клеток.[00340] In FIG. 13 shows that the fusion protein (SEQ ID NOs: 90 and 87) demonstrated increased secretion of IL-2, perforin, granzyme B and granzyme A compared to an equimolar concentration of the reference anti-PD-L1 antibody (SEQ ID NOs: 26 and 27), reference antibody to CD137 (SEQ ID NO: 28 and 29) or a cocktail of these two antibodies at a concentration of 10 μg/ml (N=4). Data also indicate that the fusion protein (SEQ ID NOs: 90 and 87) has activity against cytotoxic CD8 + T cells.
[00341] Пример 16. Оценка функциональной активности in vivo на мышиной модели ксенотрансплантата с привитыми человеческими МНПК[00341] Example 16. Evaluation of functional activity in vivo in a murine xenograft model with grafted human PBMCs
[00342] Чтобы исследовать активность предложенных слитых белков in vivo, будет использована мышиная модель ксенотрансплантата, полученного из клеточной линии. В соответствии с этим линия человеческих раковых клеток будет подкожно имплантирована самкам мышей NOG с иммунодефицитом, доставленным в возрасте 4-6 недель с по меньшей мере 1 неделей карантина. После того, как опухоли достигнут объема примерно 80-100 мм3, мышам будут переносить человеческие МНПК. Тестируемые соединения будут инъецированы не менее трех раз, и рост и активность опухоли будут постоянно измеряться. По достижении конца исследования мыши будут умерщвлены. Внутриопухолевую инфильтрацию CD3-, CD4- и CD8-положительными клетками будут оценивать с помощью иммуногистохимии. В качестве дополнительного показателя будет проведен анализ IFN-гамма методом RNAscope.[00342] To examine the in vivo activity of the proposed fusion proteins, a cell line-derived xenograft mouse model will be used. Accordingly, a human cancer cell line will be subcutaneously implanted into immunodeficient female NOG mice delivered at 4-6 weeks of age with at least 1 week of quarantine. Once the tumors have reached a volume of approximately 80-100 mm 3 , human PBMCs will be transferred to the mice. Test compounds will be injected at least three times, and tumor growth and activity will be continuously measured. Upon reaching the end of the study, mice will be sacrificed. Intratumoral infiltration of CD3-, CD4-, and CD8-positive cells will be assessed using immunohistochemistry. As an additional indicator, IFN-gamma analysis will be performed using the RNAscope method.
[00343] Пример 17. Анализ эпитопа слитых белков[00343] Example 17 Epitope Analysis of Fusion Proteins
[00344] Для оценки эпитопов, которые распознают слитые белки, и того, являются ли они клинически значимыми, был использован конкурентный формат ELISA для определения конкуренции между слитыми белками и референсным антителом к CD137. [00344] To evaluate the epitopes that recognize the fusion proteins and whether they are clinically significant, a competitive ELISA format was used to determine the competition between the fusion proteins and the reference CD137 antibody.
[00345] Планшеты для микротитрования покрывали референсным антителом к CD137 с последовательностями SEQ ID NO: 28 и 29 в PBS (4 мкг/мл) при 4°C на ночь. Планшеты промывали пять раз после каждой стадии инкубации 100 мкл PBS-0,05%T (PBS с добавкой 0,05% (об./об.) Tween 20). Планшеты блокировали 2% BSA (мас./об.) в PBS-0,1%T (PBS с добавкой 0,1% (об./об.) Tween 20) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем снова промывали. Слитые белки (SEQ ID NO: 90 и 87 и SEQ ID NO: 86 и 91), мутеин липокалина, специфичный к CD137 (SEQ ID NO: 42), референсное антитело к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29) и контрольное антитело (SEQ ID NO: 86 и 87) в различных концентрациях смешивали с 1 нМ биотинилированного человеческого CD137, слитого с Fc (huCD137-Fc-bio), в качестве индикатора и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Смеси тестируемых молекул и индикатора добавляли в планшеты и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре, после чего проводили пять этапов промывки 100 мкл PBS-0,05%T. Затем в лунки добавляли разведенный 1:5000 ExtrAvidin-HRP (Sigma-Aldrich) в PBS-0,1%T-2%BSA и инкубировали в течение 1 ч. После дополнительной стадии промывки в каждую лунку добавляли флуорогенный субстрат HRP (QuantaBlu, Thermo) и определяли интенсивность флуоресценции с помощью считывающего флуоресценцию устройства для микропланшетов.[00345] Microtiter plates were coated with the reference CD137 antibody of SEQ ID NOs: 28 and 29 in PBS (4 μg/ml) at 4°C overnight. The plates were washed five times after each incubation step with 100 μl PBS-0.05%T (PBS supplemented with 0.05% (v/v) Tween 20). Plates were blocked with 2% BSA (w/v) in PBS-0.1%T (PBS supplemented with 0.1% (v/v) Tween 20) for 1 h at room temperature and then washed again . Fusion proteins (SEQ ID NOs: 90 and 87 and SEQ ID NOs: 86 and 91), CD137-specific lipocalin mutein (SEQ ID NO: 42), CD137 reference antibody (SEQ ID NOs: 28 and 29) and control antibody (SEQ ID NO: 86 and 87) at various concentrations were mixed with 1 nM biotinylated human CD137 fused to Fc (huCD137-Fc-bio) as an indicator and incubated for 1 h at room temperature. Mixtures of test molecules and indicator were added to the plates and incubated for 20 min at room temperature, followed by five washing steps with 100 μl PBS-0.05%T. A 1:5000 dilution of ExtrAvidin-HRP (Sigma-Aldrich) in PBS-0.1%T-2%BSA was then added to the wells and incubated for 1 hour. After an additional washing step, fluorogenic HRP substrate (QuantaBlu, Thermo) was added to each well ) and fluorescence intensity was determined using a fluorescence microplate reader.
[00346] Данные о конкуренции для иллюстративного эксперимента показаны на фиг. 14, где на оси x обозначена концентрация тестируемой молекулы, а на оси y - измеренная концентрация индикаторной молекулы. Данные аппроксимировали сигмоидальной кривой 1:1, где значение IC50 и максимальный сигнал были свободными параметрами, а наклон был установлен равным единице. Результаты демонстрируют, что иллюстративные слитые белки (SEQ ID NO: 90 и 87 и SEQ ID NO: 86 и 91) конкурируют с антителом к CD137 с последовательностями SEQ ID NO: 28 и 29 за связывание с CD137, что позволяет предположить, что слитые белки связывают перекрывающиеся с антителом эпитопы.[00346] Competition data for an illustrative experiment is shown in FIG. 14, where the x-axis represents the concentration of the test molecule and the y-axis represents the measured concentration of the indicator molecule. The data were fitted to a 1:1 sigmoidal curve, where the IC 50 value and maximum signal were free parameters and the slope was set to unity. The results demonstrate that the exemplary fusion proteins (SEQ ID NOs: 90 and 87 and SEQ ID NOs: 86 and 91) compete with the anti-CD137 antibody of SEQ ID NOs: 28 and 29 for binding to CD137, suggesting that the fusion proteins bind epitopes that overlap with the antibody.
[00347] Таблица 10. Конкуренция слитых белков[00347] Table 10. Competition of Fusion Proteins
[00348] Пример 18. Оценка активации Т-клеток с помощью биоанализа блокады PD-1/PD-L1[00348] Example 18: Assessing T Cell Activation Using a PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay
[00349] Потенциал выбранных слитых белков в отношении блокады опосредованной PD-1/PD-L1 супрессии оценивали с использованием Т-клеток PD-1-NFAT-luc Jurkat (клеточная линия Jurkat, генетически модифицированная для экспрессии PD-1 и гена luc (гена люциферазы светлячка), управляемая элементом ответа NFAT (NFAT-RE)), совместно культивированных с клетками PD-L1 aAPC/CHO-K1 (клетки CHO-K1, экспрессирующие человеческий PD-L1 и генетически модифицированный белок клеточной поверхности, предназначенный для активации родственных TCR антиген-независимым образом). В этом биоанализе, когда T-клетки PD-1-NFAT-luc Jurkat и клетки PD-L1 aAPC/CHO-K1 совместно культивируются, взаимодействие PD-1/PD-L1 ингибирует передачу сигналов TCR и опосредованную NFAT-RE люминесценцию. Добавление агента, блокирующего PD-1/PD-L1, такого как слитые белки, специфичные к CD137 и PD-L1, как описано в настоящем документе, высвобождает ингибирующий сигнал и приводит к активации TCR и опосредованной NFAT-RE люминесценции.[00349] The potential of selected fusion proteins to block PD-1/PD-L1 mediated suppression was assessed using PD-1-NFAT-luc Jurkat T cells (a Jurkat cell line genetically modified to express PD-1 and the luc gene). firefly luciferase) driven by NFAT response element (NFAT-RE)) co-cultured with PD-L1 aAPC/CHO-K1 cells (CHO-K1 cells expressing human PD-L1 and a genetically modified cell surface protein designed to activate cognate TCRs in an antigen-independent manner). In this bioassay, when PD-1-NFAT-luc Jurkat T cells and PD-L1 aAPC/CHO-K1 cells are co-cultured, the PD-1/PD-L1 interaction inhibits TCR signaling and NFAT-RE-mediated luminescence. The addition of a PD-1/PD-L1 blocking agent, such as CD137-PD-L1 specific fusion proteins as described herein, releases the inhibitory signal and leads to TCR activation and NFAT-RE-mediated luminescence.
[00350] Клетки PD-L1 aAPC/CHO-K1 выращивали в среде F12 Хэма с добавкой 10% FCS и высевали из расчета 8,00 × 103 клеток на лунку и оставляли на ночь для прикрепления при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2. На следующий день культуральные среды отбрасывали. В каждую лунку добавляли 1,00 × 104 T-клеток PD-1-NFAT-luc Jurkat с последующим добавлением различных концентраций, обычно в диапазоне от 0,005 нМ до 50 нМ, слитого белка (SEQ ID NO: 90 и 87) или антитела к PD-L1 (SEQ ID NO: 86 и 87 или SEQ ID NO: 26 и 27). Планшеты закрывали газопроницаемой пленкой и инкубировали при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2. Через 6 ч в каждую лунку добавляли 30 мкл реагента Bio-Glo™ и количественно определяли биолюминесцентный сигнал с помощью люминометра. Анализ с использованием четырехпараметрической логистической кривой был выполнен с помощью GraphPad Prism® для расчета значений EC50, которые обобщены в таблице 11. Анализ проводили в трех повторностях.[00350] PD-L1 aAPC/CHO-K1 cells were grown in Ham's F12 medium supplemented with 10% FCS and seeded at 8.00 x 10 3 cells per well and allowed to attach overnight at 37°C in a humidified atmosphere with 5 % CO 2 . The next day, the culture media were discarded. 1.00 x 104 PD-1-NFAT-luc Jurkat T cells were added to each well, followed by the addition of various concentrations, typically ranging from 0.005 nM to 50 nM, of fusion protein (SEQ ID NOs: 90 and 87) or antibody to PD-L1 (SEQ ID NO: 86 and 87 or SEQ ID NO: 26 and 27). The plates were covered with a gas-permeable film and incubated at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 . After 6 h, 30 μl of Bio-Glo™ reagent was added to each well and the bioluminescent signal was quantified using a luminometer. Four-parameter logistic curve analysis was performed using GraphPad Prism® to calculate EC 50 values, which are summarized in Table 11. The analysis was performed in triplicate.
[00351] Результаты иллюстративного эксперимента представлены на фиг. 15 Данные демонстрируют, что тестируемый слитый белок ингибирует блокаду PD-1/PD-L1 и активирует Т-клетки дозозависимым образом со значением EC50, сопоставимым со значением EC50 для антитела к PD-L1 (SEQ ID NO: 86 и 87 или SEQ ID NO: 26 и 27). Используемые в качестве отрицательных контролей референсное антитело к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29) и/или антитело изотипического контроля (SEQ ID NO: 24 и 25) не приводят к увеличению сигнала люминесценции.[00351] The results of an illustrative experiment are shown in FIG. 15 Data demonstrate that the test fusion protein inhibits PD-1/PD-L1 blockade and activates T cells in a dose-dependent manner with an EC50 value comparable to that of anti-PD-L1 antibody (SEQ ID NOs: 86 and 87 or SEQ ID NO : 26 and 27). The CD137 reference antibody (SEQ ID NOs: 28 and 29) and/or the isotype control antibody (SEQ ID NOs: 24 and 25) used as negative controls did not result in an increase in the luminescence signal.
[00352] Таблица 11. Оценка активации Т-клеток с помощью биоанализа блокады PD-1/PD-L1[00352] Table 11. Assessment of T cell activation by PD-1/PD-L1 blockade bioassay
[00353] Пример 19. Оценка активации Т-клеток с использованием человеческих МНПК[00353] Example 19: Assessment of T Cell Activation Using Human PBMCs
[00354] Для оценки способности выбранных слитых белков костимулировать Т-клеточные ответы использовали дополнительный анализ на Т-клетках, в котором слитые белки в различных концентрациях добавляли к стимулированным SEB человеческим МНПК и инкубировали в течение 3 дней при 37°C. В супернатантах измеряли уровни секреции IL-2.[00354] To evaluate the ability of selected fusion proteins to co-stimulate T cell responses, an additional T cell assay was used in which various concentrations of fusion proteins were added to SEB stimulated human PBMCs and incubated for 3 days at 37°C. IL-2 secretion levels were measured in the supernatants.
[00355] МНПК от здоровых добровольцев-доноров выделяли и хранили, как описано в примере 11. Для анализа МНПК размораживали и помещали в культуральную среду (RPMI 1640, Life Technologies) с добавкой 10% FCS и 1% пенициллин-стрептомицина (Life Technologies) на 24 ч при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2.[00355] PBMCs from healthy volunteer donors were isolated and stored as described in Example 11. For analysis, PBMCs were thawed and placed in culture medium (RPMI 1640, Life Technologies) supplemented with 10% FCS and 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies) for 24 hours at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 .
[00356] Следующая процедура была проведена в трех повторностях для каждого условия эксперимента: 2,5x104 МНПК инкубировали в каждой лунке 384-луночных планшетов с плоским дном для тканевых культур в культуральной среде. Последовательные разведения выбранного слитого белка (SEQ ID NO: 90 и 87), антитела к PD-L1-строительного блока (SEQ ID NO: 86 и 87), референсного антитела к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29), использованного по отдельности или в комбинации с референсным антителом к PD-L1 (SEQ ID NO: 26 и 27), или изотипического контроля (SEQ ID NO: 24 и 25), обычно в диапазоне от 0,0002 до 10 нМ, и 0,1 нг/мл SEB добавляли в соответствующие лунки. Планшеты закрывали газопроницаемой пленкой (4titude) и инкубировали при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в течение трех дней. Затем оценивали уровень IL-2 в супернатанте, как описано в примере 11.[00356] The following procedure was performed in triplicate for each experimental condition: 2.5 x 10 4 PBMCs were incubated in each well of 384-well flat-bottom tissue culture plates in culture medium. Serial dilutions of selected fusion protein (SEQ ID NOs: 90 and 87), anti-PD-L1 building block antibody (SEQ ID NOs: 86 and 87), reference anti-CD137 antibody (SEQ ID NOs: 28 and 29) used separately or in combination with a reference anti-PD-L1 antibody (SEQ ID NOs: 26 and 27), or isotype control (SEQ ID NOs: 24 and 25), typically in the range of 0.0002 to 10 nM, and 0.1 ng/ ml of SEB was added to the appropriate wells. The plates were covered with gas permeable film (4titude) and incubated at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 for three days. The level of IL-2 in the supernatant was then assessed as described in Example 11.
[00357] Результаты иллюстративного эксперимента представлены на фиг. 16 Сводные значения EC50 тестируемых молекул в отношении индукции секреции IL-2 приведены в таблице 12. Биспецифический слитый белок с последовательностями SEQ ID NO: 90 и 87 индуцирует сильное дозозависимое повышение секреции IL-2 до более высоких уровней по сравнению с антителом к PD-L1-строительным блоком, референсным антителом к CD137 и коктейлем из референсных антител к PD-L1 и к CD137, а также снижает значение эффективности EC50 по сравнению с антителами к PD-L1 и к CD137, используемыми по отдельности или в комбинации. [00357] The results of an illustrative experiment are shown in FIG. 16 The summary EC values of the 50 molecules tested for inducing IL-2 secretion are shown in Table 12. The bispecific fusion protein of SEQ ID NOs: 90 and 87 induces a strong dose-dependent increase in IL-2 secretion to higher levels compared to the anti-PD-2 antibody. L1 building block, anti-CD137 reference antibody, and a cocktail of anti-PD-L1 and anti-CD137 reference antibodies, and also reduces the EC 50 potency value compared to anti-PD-L1 and anti-CD137 antibodies used alone or in combination.
[00358] Таблица 12. Оценка активации Т-клеток с использованием человеческих МНПК[00358] Table 12. Assessment of T cell activation using human PBMCs
[00359] Пример 20. Оценка PD-L1-зависимой активации Т-клеток, индуцированной слитыми белками[00359] Example 20: Evaluation of PD-L1-dependent T cell activation induced by fusion proteins
[00360] Зависимую от мишени PD-L1 костимуляцию Т-клеток слитыми белками дополнительно анализировали с использованием анализа активации Т-клеток. Слитые белки применяли в различных концентрациях к Т-клеткам, стимулированным антителом к CD3, совместно культивированным с клетками Flp-In-CHO, трансфицированными человеческим PD-L1 или ложно трансфицированными. В супернатантах измеряли уровни секреции IL-2.[00360] PD-L1 target-dependent costimulation of T cells by fusion proteins was further analyzed using a T cell activation assay. The fusion proteins were applied at various concentrations to T cells stimulated with anti-CD3 antibody cocultured with Flp-In-CHO cells transfected with human PD-L1 or mock transfected. IL-2 secretion levels were measured in the supernatants.
[00361] МНПК от здоровых добровольцев-доноров выделяли из лейкотромбоцитарного слоя, как описано в примере 11. Т-лимфоциты дополнительно очищали и хранили, как описано в примере 12.[00361] PBMCs from healthy volunteer donors were isolated from the buffy platelet layer as described in Example 11. T lymphocytes were further purified and stored as described in Example 12.
[00362] Для анализа T-клетки размораживали и помещали в культуральную среду (RPMI 1640, Life Technologies) с добавкой 10% FCS и 1% пенициллин-стрептомицина (Life Technologies) на ночь при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2.[00362] For analysis, T cells were thawed and placed in culture medium (RPMI 1640, Life Technologies) supplemented with 10% FCS and 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies) overnight at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 .
[00363] Следующая процедура была проведена в трех повторах для каждого условия эксперимента: планшеты с плоским дном для тканевых культур предварительно покрывали 0,25 мкг/мл антитела к CD3 на 2 ч при 37°C, а затем дважды промывали PBS. Клетки СНО, трансфицированные человеческим PD-L1 или ложно трансфицированные, обрабатывали в течение 30 минут 30 мкг/мл митомицина C (Sigma Aldrich) для блокирования пролиферации. Затем обработанные митомицином клетки дважды промывали PBS и высевали из расчета 1,0 × 107 клеток на лунку в культуральной среде, чтобы обеспечить прикрепление, в течение ночи при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2. Клетки CHO, до этого выращивавшиеся в стандартных условиях, отделяли с помощью Accutase (PAA Laboratories) и ресуспендировали в культуральной среде.[00363] The following procedure was performed in triplicate for each experimental condition: Flat-bottom tissue culture plates were precoated with 0.25 μg/ml anti-CD3 antibody for 2 hours at 37°C and then washed twice with PBS. CHO cells transfected with human PD-L1 or mock-transfected were treated for 30 min with 30 μg/ml mitomycin C (Sigma Aldrich) to block proliferation. Mitomycin-treated cells were then washed twice with PBS and seeded at 1.0 × 10 7 cells per well in culture medium to allow attachment overnight at 37°C in a humidified 5% CO 2 atmosphere. CHO cells previously grown under standard conditions were separated using Accutase (PAA Laboratories) and resuspended in culture medium.
[00364] В следующие дни к клеткам СНО добавляли 8,33 × 103 Т-клеток на лунку. Последовательные разведения иллюстративного слитого белка с последовательностями SEQ ID NO: 90 и 87, антитела к PD-L1-строительного блока (SEQ ID NO: 86 и 87), референсного антитела к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29) и коктейля из референсного антитела к PD-L1 (SEQ ID NO: 26 и 27) и референсного антитела к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29), или изотипического контроля (SEQ ID NO: 24 и 25), обычно в диапазоне от 0,003 нМ до 50 нМ, добавляли в соответствующие лунки. Планшеты закрывали газопроницаемой пленкой и инкубировали при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2 в течение 2 дней.[00364] On the following days, 8.33 x 10 3 T cells per well were added to the CHO cells. Serial dilutions of an exemplary fusion protein of SEQ ID NOs: 90 and 87, an anti-PD-L1 building block antibody (SEQ ID NOs: 86 and 87), a reference anti-CD137 antibody (SEQ ID NOs: 28 and 29), and a cocktail of reference anti-PD-L1 antibody (SEQ ID NO: 26 and 27) and reference anti-CD137 antibody (SEQ ID NO: 28 and 29), or isotype control (SEQ ID NO: 24 and 25), typically in the range of 0.003 nM to 50 nM were added to the appropriate wells. The plates were covered with a gas-permeable film and incubated at 37°C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 for 2 days.
[00365] Спустя 2 дня совместного культивирования оценивали уровни IL-2 в супернатанте, как описано в примере 11.[00365] After 2 days of coculture, IL-2 levels in the supernatant were assessed as described in Example 11.
[00366] Иллюстративные данные показаны на фиг. 17. Совместное культивирование пан-Т-клеток с клетками СНО, трансфицированными человеческим PD-L1, в присутствии слитого белка (SEQ ID NO: 90 и 87 и SEQ ID NO: 86 и 91) привело к сильной дозозависимой секреции IL-2 по сравнению с изотипическим контролем hIgG4 и намного более сильной, чем у референсных антител, где наблюдалось лишь небольшое повышение секреции IL-2 для референсного антитела к CD137 или коктейля из референсного антитела к CD137 и референсного антитела к PD-L1. При совместном культивировании с ложно трансфицированными клетками СНО (PD-L1-отрицательными) только референсное антитело к CD137 и коктейль из референсного антитела к CD137 и референсного антитела к PD-L1 показали небольшое дозозависимое повышение секреции IL-2. Результаты показывают, что активация Т-клеток слитыми белками зависит от PD-L1, тогда как референсное антитело к CD137 (SEQ ID NO: 28 и 29) продемонстрировало опосредованную CD137 костимуляцию Т-клеток независимо от наличия или отсутствия клеток-мишеней.[00366] Exemplary data is shown in FIG. 17. Co-culture of pan-T cells with CHO cells transfected with human PD-L1 in the presence of the fusion protein (SEQ ID NOs: 90 and 87 and SEQ ID NOs: 86 and 91) resulted in strong dose-dependent secretion of IL-2 compared with isotype control hIgG4 and much stronger than that of the reference antibodies, where only a small increase in IL-2 secretion was observed for the reference CD137 antibody or a cocktail of the reference CD137 antibody and the reference PD-L1 antibody. When co-cultured with mock-transfected CHO cells (PD-L1 negative), only the CD137 reference antibody and a cocktail of CD137 reference antibody and PD-L1 reference antibody showed a small dose-dependent increase in IL-2 secretion. The results indicate that T cell activation by the fusion proteins is dependent on PD-L1, while the reference CD137 antibody (SEQ ID NOs: 28 and 29) demonstrated CD137-mediated T cell co-stimulation regardless of the presence or absence of target cells.
[00367] Пример 21. Фармакокинетика слитых белков у мышей[00367] Example 21: Pharmacokinetics of Fusion Proteins in Mice
[00368] Проводили анализы фармакокинетики иллюстративных слитых белков (SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87 и SEQ ID NO: 90 и 91) на мышах. Самцам мышей CD-1 возрастом приблизительно 5 недель (3 мыши на временную точку; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH) вводили в хвостовую вену слитый белок в дозе 10 мг/кг. Тестируемые препараты вводили в виде болюса объемом 5 мл/кг. Образцы плазмы мышей получали во временных точках 5 мин, 1 час, 4 часа, 8 часов, 24 часа, 48 часов, 4 дня, 8 дней, 14 дней, 21 день и 28 дней. Собирали достаточное количество цельной крови – кровь брали под анестезией изофлураном – для получения не менее 100 мкл плазмы с Li-гепарином на животное и временную точку. Уровни лекарственного средства определяли с помощью сэндвич-ELISA, детектируя целую биспецифическую конструкцию посредством мишеней PD-L1 и CD137. Данные аппроксимировали с использованием двухкомпартментной модели с использованием программного обеспечения Prism GraphPad 5.[00368] Pharmacokinetics analyzes of exemplary fusion proteins (SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NOs: 94 and 87, and SEQ ID NO: 90 and 91) in mice. Male CD-1 mice approximately 5 weeks old (3 mice per time point; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH) were injected into the tail vein with 10 mg/kg fusion protein. The tested drugs were administered as a bolus of 5 ml/kg. Mouse plasma samples were obtained at time points of 5 min, 1 hour, 4 hours, 8 hours, 24 hours, 48 hours, 4 days, 8 days, 14 days, 21 days, and 28 days. Sufficient whole blood was collected—blood was drawn under isoflurane anesthesia—to obtain at least 100 μl of Li-heparin plasma per animal and time point. Drug levels were determined using a sandwich ELISA, detecting the entire bispecific construct through the targets PD-L1 and CD137. Data were fitted using a two-compartment model using Prism GraphPad 5 software.
[00369] На фиг. 18 показаны графики зависимости концентрации в плазме от времени для слитых белков SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 86 и 91, SEQ ID NO: 92 и 87, SEQ ID NO: 86 и 93, SEQ ID NO: 94 и 87 и SEQ ID NO: 90 и 91, нанесенные на график вместе со значениями, полученными для антитела к PD-L1-строительного блока (SEQ ID NO: 86 и 87) в качестве референсного. Фармакокинетика во всех случаях была схожей. Начиная с концентрации в плазме около 200 мкг/мл, уровни в плазме упали до уровня около 50 мкг/мл в течение 48 часов, а затем снижались гораздо медленнее до уровня около 10 мкг/мл в конце эксперимента через 28 дней. К этим данным был применен некомпартментный анализ. Сводные значения конечных периодов полувыведения приведены в таблице 13.[00369] In FIG. 18 shows graphs of plasma concentration versus time for the fusion proteins SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 91, SEQ ID NOs: 92 and 87, SEQ ID NOs: 86 and 93, SEQ ID NOs: 94 and 87 and SEQ ID NOs: 90 and 91, plotted along with the values obtained for the anti-PD-L1 building block antibody (SEQ ID NOs: 86 and 87) as a reference. Pharmacokinetics were similar in all cases. Starting with a plasma concentration of about 200 μg/ml, plasma levels fell to about 50 μg/ml within 48 hours and then decreased much more slowly to a level of about 10 μg/ml at the end of the experiment after 28 days. Non-compartmental analysis was applied to these data. Summary values for terminal half-lives are given in Table 13.
[00370] Данные демонстрируют, что слитые белки имеют длительные, антителоподобные конечные периоды полувыведения у мышей. Поскольку анализ, используемый для определения концентраций слитых белков в плазме, требует сохранения активности как в отношении PD-L1, так и CD137, результат также демонстрирует, что биспецифические молекулы остаются неизменными в течение 28 дней.[00370] Data demonstrate that the fusion proteins have long, antibody-like terminal half-lives in mice. Because the assay used to determine plasma concentrations of the fusion proteins requires persistence of activity against both PD-L1 and CD137, the result also demonstrates that the bispecific molecules remain unchanged over 28 days.
[00371][00371]
[00372] Таблица 13. Конечные периоды полувыведения у мышей, определенные с использованием некомпартментного анализа[00372] Table 13. Terminal half-lives in mice determined using non-compartmental analysis
[00373] Пример 22. Фармакокинетика слитых белков у мышей[00373] Example 22: Pharmacokinetics of Fusion Proteins in Mice
[00374] Был проведен анализ фармакокинетики иллюстративного слитого белка с последовательностями SEQ ID NO: 90 и 87 у мышей и сопоставлен с двумя ранее описанными CD137- и PD-L1-связывающими слитыми белками (SEQ ID NO: 147 и SEQ ID NO: 148). Самцам мышей CD-1 возрастом приблизительно 5 недель (2 мыши на временную точку; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH) вводили в хвостовую вену соответствующую молекулу в дозе 2 мг/кг. Образцы плазмы мышей получали во временных точках 5 мин, 24 часа, 168 часов и 336 часов. Собирали достаточное количество цельной крови – х овь брали под анестезией изофлураном – для получения не менее 30-50 мкл плазмы с Li-гепарином на животное и временную точку. [00374] The pharmacokinetics of an exemplary fusion protein of SEQ ID NOs: 90 and 87 was analyzed in mice and compared with two previously described CD137 and PD-L1 binding fusion proteins (SEQ ID NO: 147 and SEQ ID NO: 148) . Male CD-1 mice approximately 5 weeks old (2 mice per time point; Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH) were injected into the tail vein with the appropriate molecule at a dose of 2 mg/kg. Mouse plasma samples were obtained at time points of 5 min, 24 h, 168 h, and 336 h. Sufficient whole blood was collected—drawn under isoflurane anesthesia—to obtain at least 30–50 μl of Li-heparin plasma per animal and time point.
[00375] Затем анализировали уровни лекарственного средства в плазме с помощью ELISA. HuCD137-His (человеческий CD137 с C-концевой полигистидиновой меткой) растворяли в PBS (1 мкг/мл) и наносили на микротитровальные планшеты на ночь при 4 °C. Планшет пять раз промывали после каждой стадии инкубации 80 мкл PBS с добавкой 0,05% (об./об.) Tween 20. Планшеты блокировали PBS/BSA/Tween (PBS, содержащий 2% BSA (мас./об.) и 0,1% (об./об.) Tween 20) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем промывали. Образцы плазмы разводили в PBS/BSA/Tween до концентрации плазмы 20%, добавляли в лунки и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем проводили еще одну стадию промывки. Спустя 1 ч инкубации исследуемые связанные агенты детектировали смесью биотинилированного человеческого PD-L1 и стрептавидина SULFO-TAG (Mesoscale Discovery) в концентрации 1 мкг/мл каждый, разведенных в PBS, содержащем 2% BSA (мас./об.) и 0,1% (об./об.) Tween 20. После дополнительной стадии промывки в каждую лунку добавляли 35 мкл буфера для считывания и считывали сигнал электрохемилюминесценции (ECL) из каждой лунки с помощью считывающего устройства Mesoscale Discovery. Данные переносили в Excel для анализа и количественной оценки. Была построена градуировочная кривая со стандартными разведениями белка.[00375] Plasma drug levels were then analyzed using ELISA. HuCD137-His (human CD137 with a C-terminal polyhistidine tag) was dissolved in PBS (1 μg/ml) and applied to microtiter plates overnight at 4°C. The plate was washed five times after each incubation step with 80 μl PBS supplemented with 0.05% (v/v) Tween 20. The plates were blocked with PBS/BSA/Tween (PBS containing 2% BSA (w/v) and 0 .1% (v/v) Tween 20) for 1 h at room temperature and then washed. Plasma samples were diluted in PBS/BSA/Tween to a plasma concentration of 20%, added to wells, and incubated for 1 h at room temperature. Then another washing step was carried out. After 1 h of incubation, the bound agents of interest were detected with a mixture of biotinylated human PD-L1 and SULFO-TAG streptavidin (Mesoscale Discovery) at a concentration of 1 μg/ml each, diluted in PBS containing 2% BSA (w/v) and 0.1 % (v/v) Tween 20. After an additional washing step, 35 μl of readout buffer was added to each well and the electrochemiluminescence (ECL) signal was read from each well using a Mesoscale Discovery reader. Data were transferred to Excel for analysis and quantification. A calibration curve was constructed with standard protein dilutions.
[00376] На фиг. 19 показаны графики зависимости концентрации в плазме от времени для SEQ ID NO: 90 и 87, SEQ ID NO: 147 и SEQ ID NO: 148. SEQ ID NO: 90 и 87 демонстрирует благоприятный фармакокинетический профиль или антителоподобную фармакокинетику, в отличие от SEQ ID NO: 147 и SEQ ID NO: 148. В контексте настоящего документа можно считать, что благоприятный фармакокинетический профиль или антителоподобная фармакокинетика достигнуты, если % cmax был выше 10% спустя 336 часов.[00376] In FIG. 19 shows graphs of plasma concentration versus time for SEQ ID NOs: 90 and 87, SEQ ID NO: 147 and SEQ ID NO: 148. SEQ ID NOs: 90 and 87 demonstrate a favorable pharmacokinetic profile or antibody-like pharmacokinetics, in contrast to SEQ ID NO: 147 and SEQ ID NO: 148. As used herein, a favorable pharmacokinetic profile or antibody-like pharmacokinetics may be considered to have been achieved if the %c max was greater than 10% after 336 hours.
[00377] Варианты осуществления, описанные в настоящем документе в целях иллюстрации, могут подходящим образом быть осуществлены на практике при отсутствии какого-либо элемента или элементов, ограничения или ограничений, конкретно не раскрытых в настоящем документе. Таким образом, например, термины «содержащий», «включающий» и т. д. следует толковать расширительно и без ограничения. Кроме того, используемые в настоящем документе термины и выражения использовались как термины для описания, а не ограничения, и при использовании таких терминов и выражений не подразумевается исключение каких-либо эквивалентов показанных и описанных признаков или их частей, но считается, что в объеме заявленного изобретения возможны различные модификации. Таким образом, следует понимать, что, хотя настоящие варианты осуществления были конкретно раскрыты с помощью предпочтительных вариантов осуществления и необязательных признаков, специалисты в данной области техники могут прибегать к его модификации и вариациям, и что такие модификации и вариации рассматриваются как входящие в объем данного изобретения. Все патенты, патентные заявки, учебники и рецензируемые публикации, описанные в настоящем документе, настоящим полностью включены посредством ссылки. Кроме того, если определение или использование термина в источнике, включенном в настоящий документ посредством ссылки, не согласуется или противоречит определению этого термина, приведенному в настоящем документе, применяется определение этого термина, приведенное в настоящем документе, а определение этого термина в источнике не применяется. Каждый из более узких видов и субродовых групп, подпадающих под общее раскрытие, также составляет часть изобретения. Это включает общее описание изобретения с условием или отрицательным ограничением, исключающим любой объект из рода, независимо от того, упомянут ли конкретно удаленный материал в настоящем документе. Кроме того, если признаки описаны в виде групп Маркуша, специалисты в данной области техники поймут, что изобретение тем самым также описано посредством любого отдельного члена или подгруппы членов группы Маркуша. Дополнительные варианты осуществления станут очевидными из следующей формулы изобретения.[00377] The embodiments described herein for purposes of illustration may suitably be practiced in the absence of any element or elements, limitation or limitations not specifically disclosed herein. Thus, for example, the terms “comprising”, “including”, etc. should be construed broadly and without limitation. Further, the terms and expressions used herein are used as terms of description and not limitation, and the use of such terms and expressions is not intended to exclude any equivalents of the features shown and described, or portions thereof, but are deemed to be within the scope of the claimed invention. Various modifications are possible. Thus, it should be understood that while the present embodiments have been specifically disclosed by preferred embodiments and optional features, modifications and variations thereof may be made by those skilled in the art, and that such modifications and variations are considered to be within the scope of the present invention. . All patents, patent applications, textbooks, and peer-reviewed publications described herein are hereby incorporated by reference in their entirety. In addition, if the definition or use of a term in a source incorporated herein by reference is inconsistent with or inconsistent with the definition of that term provided herein, the definition of that term provided herein applies and the definition of that term in the source does not apply. Each of the narrower species and subgeneric groups falling within the general disclosure also forms part of the invention. This includes a general description of the invention with a condition or negative limitation excluding any subject matter from the class, whether or not the deleted material is specifically mentioned herein. Moreover, if features are described in terms of Markush groups, those skilled in the art will understand that the invention is thereby also described in terms of any individual member or subset of members of a Markush group. Additional embodiments will become apparent from the following claims.
[00378] Эквиваленты: Специалисты в данной области техники поймут или смогут установить, используя не более чем обычное экспериментирование, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем документе. Подразумевается, что такие эквиваленты охватываются следующей формулой изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были специально и индивидуально указаны как включенные в настоящий документ посредством ссылки.[00378] Equivalents: Those skilled in the art will understand or be able to determine, using no more than routine experimentation, many equivalents to the specific embodiments described herein. Such equivalents are intended to be covered by the following claims. All publications, patents and patent applications mentioned in this specification are incorporated herein by reference to the same extent as if each individual publication, patent or patent application had been specifically and individually identified as being incorporated herein by reference.
VI. НЕПАТЕНТНЫЕ ИСТОЧНИКИVI. NON-PATENT SOURCES
1. GATO-CANAS, M., ZUAZO, M., ARASANZ, H., IBANEZ-VEA, M., LORENZO, L., FERNANDEZ-HINOJAL, G., VERA, R., SMERDOU, C., MARTISOVA, E., AROZARENA, I., WELLBROCK, C., LLOPIZ, D., RUIZ, M., SAROBE, P., BRECKPOT, K., KOCHAN, G. & ESCORS, D. 2017. PDL1 Signals through Conserved Sequence Motifs to Overcome Interferon-Mediated Cytotoxicity. Cell Rep, 20, 1818-1829.1. GATO-CANAS, M., ZUAZO, M., ARASANZ, H., IBANEZ-VEA, M., LORENZO, L., FERNANDEZ-HINOJAL, G., VERA, R., SMERDOU, C., MARTISOVA, E., AROZARENA, I., WELLBROCK, C., LLOPIZ, D., RUIZ, M., SAROBE, P., BRECKPOT, K., KOCHAN, G. & ESCORS, D. 2017. PDL1 Signals through Conserved Sequence Motifs to Overcome Interferon-Mediated Cytotoxicity. Cell Rep, 20, 1818–1829.
2. KARWACZ, K., BRICOGNE, C., MACDONALD, D., ARCE, F., BENNETT, C. L., COLLINS, M. & ESCORS, D. 2011. PD-L1 co-stimulation contributes to ligand-induced T cell receptor down-modulation on CD8+ T cells. EMBO Mol Med, 3, 581-92.2. KARWACZ, K., BRICOGNE, C., MACDONALD, D., ARCE, F., BENNETT, C. L., COLLINS, M. & ESCORS, D. 2011. PD-L1 co-stimulation contributes to ligand-induced T cell receptor down-modulation on CD8+ T cells. EMBO Mol Med, 3, 581-92.
3. ARASANZ, H., GATO-CANAS, M., ZUAZO, M., IBANEZ-VEA, M., BRECKPOT, K., KOCHAN, G. & ESCORS, D. 2017. PD1 signal transduction pathways in T cells. Oncotarget, 8, 51936-51945.3. ARASANZ, H., GATO-CANAS, M., ZUAZO, M., IBANEZ-VEA, M., BRECKPOT, K., KOCHAN, G. & ESCORS, D. 2017. PD1 signal transduction pathways in T cells. Oncotarget, 8, 51936-51945.
4. PATSOUKIS, N., BARDHAN, K., CHATTERJEE, P., SARI, D., LIU, B., BELL, L. N., KAROLY, E. D., FREEMAN, G. J., PETKOVA, V., SETH, P., LI, L. & BOUSSIOTIS, V. A. 2015. PD-1 alters T-cell metabolic reprogramming by inhibiting glycolysis and promoting lipolysis and fatty acid oxidation. Nat Commun, 6, 6692.4. PATSOUKIS, N., BARDHAN, K., CHATTERJEE, P., SARI, D., LIU, B., BELL, L. N., KAROLY, E. D., FREEMAN, G. J., PETKOVA, V., SETH, P., LI , L. & BOUSSIOTIS, V. A. 2015. PD-1 alters T-cell metabolic reprogramming by inhibiting glycolysis and promoting lipolysis and fatty acid oxidation. Nat Commun, 6, 6692.
5. XU-MONETTE, Z. Y., ZHANG, M., LI, J. & YOUNG, K. H. 2017. PD-1/PD-L1 Blockade: Have We Found the Key to Unleash the Antitumor Immune Response? Front Immunol, 8, 1597.5. XU-MONETTE, Z. Y., ZHANG, M., LI, J. & YOUNG, K. H. 2017. PD-1/PD-L1 Blockade: Have We Found the Key to Unleash the Antitumor Immune Response? Front Immunol, 8, 1597.
6. LI, S. Y. & LIU, Y. 2013. Immunotherapy of melanoma with the immune costimulatory monoclonal antibodies targeting CD137. Clin Pharmacol, 5, 47-53.6. LI, S. Y. & LIU, Y. 2013. Immunotherapy of melanoma with the immune costimulatory monoclonal antibodies targeting CD137. Clin Pharmacol, 5, 47-53.
7. SNELL, L. M., LIN, G. H., MCPHERSON, A. J., MORAES, T. J. & WATTS, T. H. 2011. T-cell intrinsic effects of GITR and 4-1BB during viral infection and cancer immunotherapy. Immunol Rev, 244, 197-217.7. SNELL, L. M., LIN, G. H., MCPHERSON, A. J., MORAES, T. J. & WATTS, T. H. 2011. T-cell intrinsic effects of GITR and 4-1BB during viral infection and cancer immunotherapy. Immunol Rev, 244, 197-217.
8. WYZGOL, A., MULLER, N., FICK, A., MUNKEL, S., GRIGOLEIT, G. U., PFIZENMAIER, K. & WAJANT, H. 2009. Trimer stabilization, oligomerization, and antibody-mediated cell surface immobilization improve the activity of soluble trimers of CD27L, CD40L, 41BBL, and glucocorticoid-induced TNF receptor ligand. J Immunol, 183, 1851-61.8. WYZGOL, A., MULLER, N., FICK, A., MUNKEL, S., GRIGOLEIT, G. U., PFIZENMAIER, K. & WAJANT, H. 2009. Trimer stabilization, oligomerization, and antibody-mediated cell surface immobilization improve the activity of soluble trimers of CD27L, CD40L, 41BBL, and glucocorticoid-induced TNF receptor ligand. J Immunol, 183, 1851-61.
9. YAO, S., ZHU, Y. & CHEN, L. 2013. Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation. Nat Rev Drug Discov, 12, 130-46.9. YAO, S., ZHU, Y. & CHEN, L. 2013. Advances in targeting cell surface signaling molecules for immune modulation. Nat Rev Drug Discov, 12, 130-46.
10. MELERO, I., BACH, N., HELLSTROM, K. E., ARUFFO, A., MITTLER, R. S. & CHEN, L. 1998. Amplification of tumor immunity by gene transfer of the co-stimulatory 4-1BB ligand: synergy with the CD28 co-stimulatory pathway. Eur J Immunol, 28, 1116-21.10. MELERO, I., BACH, N., HELLSTROM, K. E., ARUFFO, A., MITTLER, R. S. & CHEN, L. 1998. Amplification of tumor immunity by gene transfer of the co-stimulatory 4-1BB ligand: synergy with the CD28 co-stimulatory pathway. Eur J Immunol, 28, 1116-21.
11. YANG, Y., YANG, S., YE, Z., JAFFAR, J., ZHOU, Y., CUTTER, E., LIEBER, A., HELLSTROM, I. & HELLSTROM, K. E. 2007. Tumor cells expressing anti-CD137 scFv induce a tumor-destructive environment. Cancer Res, 67, 2339-44.11. YANG, Y., YANG, S., YE, Z., JAFFAR, J., ZHOU, Y., CUTTER, E., LIEBER, A., HELLSTROM, I. & HELLSTROM, K. E. 2007. Tumor cells expressing anti-CD137 scFv induce a tumor-destructive environment. Cancer Res, 67, 2339-44.
12. ZHANG, H., KNUTSON, K. L., HELLSTROM, K. E., DISIS, M. L. & HELLSTROM, I. 2006. Antitumor efficacy of CD137 ligation is maximized by the use of a CD137 single-chain Fv-expressing whole-cell tumor vaccine compared with CD137-specific monoclonal antibody infusion. Mol Cancer Ther, 5, 149-55.12. ZHANG, H., KNUTSON, K. L., HELLSTROM, K. E., DISIS, M. L. & HELLSTROM, I. 2006. Antitumor efficacy of CD137 ligation is maximized by the use of a CD137 single-chain Fv-expressing whole-cell tumor vaccine compared with CD137-specific monoclonal antibody infusion. Mol Cancer Ther, 5, 149-55.
13. YE, Z., HELLSTROM, I., HAYDEN-LEDBETTER, M., DAHLIN, A., LEDBETTER, J. A. & HELLSTROM, K. E. 2002. Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4-1BB. Nat Med, 8, 343-8.13. YE, Z., HELLSTROM, I., HAYDEN-LEDBETTER, M., DAHLIN, A., LEDBETTER, J. A. & HELLSTROM, K. E. 2002. Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4-1BB. Nat Med, 8, 343-8.
14. MARTINET, O., DIVINO, C. M., ZANG, Y., GAN, Y., MANDELI, J., THUNG, S., PAN, P. Y. & CHEN, S. H. 2002. T cell activation with systemic agonistic antibody versus local 4-1BB ligand gene delivery combined with interleukin-12 eradicate liver metastases of breast cancer. Gene Ther, 9, 786-92.14. MARTINET, O., DIVINO, C. M., ZANG, Y., GAN, Y., MANDELI, J., THUNG, S., PAN, P. Y. & CHEN, S. H. 2002. T cell activation with systemic agonistic antibody versus local 4 -1BB ligand gene delivery combined with interleukin-12 eradicate liver metastases of breast cancer. Gene Ther, 9, 786-92.
15. YE, Q., SONG, D. G., POUSSIN, M., YAMAMOTO, T., BEST, A., LI, C., COUKOS, G. & POWELL, D. J., JR. 2014. CD137 accurately identifies and enriches for naturally occurring tumor-reactive T cells in tumor. Clin Cancer Res, 20, 44-55.15. YE, Q., SONG, D. G., POUSSIN, M., YAMAMOTO, T., BEST, A., LI, C., COUKOS, G. & POWELL, D. J., JR. 2014. CD137 accurately identifies and enriches for naturally occurring tumor-reactive T cells in tumor. Clin Cancer Res, 20, 44-55.
16. CHACON, J. A., WU, R. C., SUKHUMALCHANDRA, P., MOLLDREM, J. J., SARNAIK, A., PILON-THOMAS, S., WEBER, J., HWU, P. & RADVANYI, L. 2013. Co-stimulation through 4-1BB/CD137 improves the expansion and function of CD8(+) melanoma tumor-infiltrating lymphocytes for adoptive T-cell therapy. PLoS One, 8, e60031.16. CHACON, J. A., WU, R. C., SUKHUMALCHANDRA, P., MOLLDREM, J. J., SARNAIK, A., PILON-THOMAS, S., WEBER, J., HWU, P. & RADVANYI, L. 2013. Co-stimulation through 4-1BB/CD137 improves the expansion and function of CD8(+) melanoma tumor-infiltrating lymphocytes for adoptive T-cell therapy. PLoS One, 8, e60031.
17. FISHER, T. S., KAMPERSCHROER, C., OLIPHANT, T., LOVE, V. A., LIRA, P. D., DOYONNAS, R., BERGQVIST, S., BAXI, S. M., ROHNER, A., SHEN, A. C., HUANG, C., SOKOLOWSKI, S. A. & SHARP, L. L. 2012. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunol Immunother, 61, 1721-33.17. FISHER, T. S., KAMPERSCHROER, C., OLIPHANT, T., LOVE, V. A., LIRA, P. D., DOYONNAS, R., BERGQVIST, S., BAXI, S. M., ROHNER, A., SHEN, A. C., HUANG, C. ., SOKOLOWSKI, S. A. & SHARP, L. L. 2012. Targeting of 4-1BB by monoclonal antibody PF-05082566 enhances T-cell function and promotes anti-tumor activity. Cancer Immunol Immunother, 61, 1721-33.
18. SKERRA, A. 2000. Lipocalins as a scaffold. Biochim Biophys Acta, 1482, 337-50.18. SKERRA, A. 2000. Lipocalins as a scaffold. Biochim Biophys Acta, 1482, 337-50.
19. FLOWER, D. R., NORTH, A. C. & SANSOM, C. E. 2000. The lipocalin protein family: structural and sequence overview. Biochim Biophys Acta, 1482, 9-24.19. FLOWER, D. R., NORTH, A. C. & SANSOM, C. E. 2000. The lipocalin protein family: structural and sequence overview. Biochim Biophys Acta, 1482, 9-24.
20. FLOWER, D. R. 1996. The lipocalin protein family: structure and function. Biochem J, 318 ( Pt 1), 1-14.20. FLOWER, D. R. 1996. The lipocalin protein family: structure and function. Biochem J, 318 (Pt 1), 1-14.
21. ALTSCHUL, S. F., MADDEN, T. L., SCHAFFER, A. A., ZHANG, J., ZHANG, Z., MILLER, W. & LIPMAN, D. J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 25, 3389-402.21. ALTSCHUL, S. F., MADDEN, T. L., SCHAFFER, A. A., ZHANG, J., ZHANG, Z., MILLER, W. & LIPMAN, D. J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 25, 3389-402.
22. ALTSCHUL, S. F., GISH, W., MILLER, W., MYERS, E. W. & LIPMAN, D. J. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 215, 403-10.22. ALTSCHUL, S. F., GISH, W., MILLER, W., MYERS, E. W. & LIPMAN, D. J. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 215, 403-10.
23. SMITH, T. F. & WATERMAN, M. S. 1981. Identification of common molecular subsequences. J Mol Biol, 147, 195-7.23. SMITH, T. F. & WATERMAN, M. S. 1981. Identification of common molecular subsequences. J Mol Biol, 147, 195-7.
24. WARD, E. S., GUSSOW, D., GRIFFITHS, A. D., JONES, P. T. & WINTER, G. 1989. Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature, 341, 544-6.24. WARD, E. S., GUSSOW, D., GRIFFITHS, A. D., JONES, P. T. & WINTER, G. 1989. Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature, 341, 544-6.
25. HOLLIGER, P., PROSPERO, T. & WINTER, G. 1993. "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 6444-8.25. HOLLIGER, P., PROSPERO, T. & WINTER, G. 1993. "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 6444-8.
26. JOHNSON, G. & WU, T. T. 2000. Kabat database and its applications: 30 years after the first variability plot. Nucleic Acids Res, 28, 214-8.26. JOHNSON, G. & WU, T. T. 2000. Kabat database and its applications: 30 years after the first variability plot. Nucleic Acids Res, 28, 214-8.
27. EHRENMANN, F., KAAS, Q. & LEFRANC, M. P. 2010. IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF. Nucleic Acids Res, 38, D301-7.27. EHRENMANN, F., KAAS, Q. & LEFRANC, M. P. 2010. IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign: a database and a tool for immunoglobulins or antibodies, T cell receptors, MHC, IgSF and MhcSF. Nucleic Acids Res, 38, D301-7.
28. BULLIARD, Y., JOLICOEUR, R., ZHANG, J., DRANOFF, G., WILSON, N. S. & BROGDON, J. L. 2014. OX40 engagement depletes intratumoral Tregs via activating FcgammaRs, leading to antitumor efficacy. Immunol Cell Biol, 92, 475-80.28. BULLIARD, Y., JOLICOEUR, R., ZHANG, J., DRANOFF, G., WILSON, N. S. & BROGDON, J. L. 2014. OX40 engagement depletes intratumoral Tregs via activating FcgammaRs, leading to antitumor efficacy. Immunol Cell Biol, 92, 475-80.
29. BULLIARD, Y., JOLICOEUR, R., WINDMAN, M., RUE, S. M., ETTENBERG, S., KNEE, D. A., WILSON, N. S., DRANOFF, G. & BROGDON, J. L. 2013. Activating Fc gamma receptors contribute to the antitumor activities of immunoregulatory receptor-targeting antibodies. J Exp Med, 210, 1685-93.29. BULLIARD, Y., JOLICOEUR, R., WINDMAN, M., RUE, S. M., ETTENBERG, S., KNEE, D. A., WILSON, N. S., DRANOFF, G. & BROGDON, J. L. 2013. Activating Fc gamma receptors contribute to the antitumor activities of immunoregulatory receptor-targeting antibodies. J Exp Med, 210, 1685-93.
30. SILVA, J. P., VETTERLEIN, O., JOSE, J., PETERS, S. & KIRBY, H. 2015. The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation. J Biol Chem, 290, 5462-9.30. SILVA, J. P., VETTERLEIN, O., JOSE, J., PETERS, S. & KIRBY, H. 2015. The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitative immunoassays and physiological matrix preparation. J Biol Chem, 290, 5462-9.
31. GLAESNER, W., VICK, A. M., MILLICAN, R., ELLIS, B., TSCHANG, S. H., TIAN, Y., BOKVIST, K., BRENNER, M., KOESTER, A., PORKSEN, N., ETGEN, G. & BUMOL, T. 2010. Engineering and characterization of the long-acting glucagon-like peptide-1 analogue LY2189265, an Fc fusion protein. Diabetes Metab Res Rev, 26, 287-96.31. GLAESNER, W., VICK, A. M., MILLICAN, R., ELLIS, B., TSCHANG, S. H., TIAN, Y., BOKVIST, K., BRENNER, M., KOESTER, A., PORKSEN, N., ETGEN, G. & BUMOL, T. 2010. Engineering and characterization of the long-acting glucagon-like peptide-1 analogue LY2189265, an Fc fusion protein. Diabetes Metab Res Rev, 26, 287-96.
32. DALL'ACQUA, W. F., KIENER, P. A. & WU, H. 2006. Properties of human IgG1s engineered for enhanced binding to the neonatal Fc receptor (FcRn). J Biol Chem, 281, 23514-24.32. DALL'ACQUA, W. F., KIENER, P. A. & WU, H. 2006. Properties of human IgG1s engineered for enhanced binding to the neonatal Fc receptor (FcRn). J Biol Chem, 281, 23514-24.
33. ZALEVSKY, J., CHAMBERLAIN, A. K., HORTON, H. M., KARKI, S., LEUNG, I. W., SPROULE, T. J., LAZAR, G. A., ROOPENIAN, D. C. & DESJARLAIS, J. R. 2010. Enhanced antibody half-life improves in vivo activity. Nat Biotechnol, 28, 157-9.33. ZALEVSKY, J., CHAMBERLAIN, A. K., HORTON, H. M., KARKI, S., LEUNG, I. W., SPROULE, T. J., LAZAR, G. A., ROOPENIAN, D. C. & DESJARLAIS, J. R. 2010. Enhanced antibody half-life improves in vivo activity . Nat Biotechnol, 28, 157-9.
34. SHIELDS, R. L., NAMENUK, A. K., HONG, K., MENG, Y. G., RAE, J., BRIGGS, J., XIE, D., LAI, J., STADLEN, A., LI, B., FOX, J. A. & PRESTA, L. G. 2001. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem, 276, 6591-604.34. SHIELDS, R. L., NAMENUK, A. K., HONG, K., MENG, Y. G., RAE, J., BRIGGS, J., XIE, D., LAI, J., STADLEN, A., LI, B., FOX , J. A. & PRESTA, L. G. 2001. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem , 276, 6591-604.
35. ALTSHULER, E. P., SEREBRYANAYA, D. V. & KATRUKHA, A. G. 2010. Generation of recombinant antibodies and means for increasing their affinity. Biochemistry (Mosc), 75, 1584-605.35. ALTSHULER, E. P., SEREBRYANAYA, D. V. & KATRUKHA, A. G. 2010. Generation of recombinant antibodies and means for increasing their affinity. Biochemistry (Mosc), 75, 1584-605.
36. HARLOW, E. & LANE, D. 1999. Using antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press.36. HARLOW, E. & LANE, D. 1999. Using antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
37. HARLOW, E. & LANE, D. 1988. Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory.37. HARLOW, E. & LANE, D. 1988. Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory.
38. LI, J., SAI, T., BERGER, M., CHAO, Q., DAVIDSON, D., DESHMUKH, G., DROZDOWSKI, B., EBEL, W., HARLEY, S., HENRY, M., JACOB, S., KLINE, B., LAZO, E., ROTELLA, F., ROUTHIER, E., RUDOLPH, K., SAGE, J., SIMON, P., YAO, J., ZHOU, Y., KAVURU, M., BONFIELD, T., THOMASSEN, M. J., SASS, P. M., NICOLAIDES, N. C. & GRASSO, L. 2006. Human antibodies for immunotherapy development generated via a human B cell hybridoma technology. Proc Natl Acad Sci U S A, 103, 3557-62.38. LI, J., SAI, T., BERGER, M., CHAO, Q., DAVIDSON, D., DESHMUKH, G., DROZDOWSKI, B., EBEL, W., HARLEY, S., HENRY, M. ., JACOB, S., KLINE, B., LAZO, E., ROTELLA, F., ROUTHIER, E., RUDOLPH, K., SAGE, J., SIMON, P., YAO, J., ZHOU, Y ., KAVURU, M., BONFIELD, T., THOMASSEN, M. J., SASS, P. M., NICOLAIDES, N. C. & GRASSO, L. 2006. Human antibodies for immunotherapy development generated via a human B cell hybridoma technology. Proc Natl Acad Sci U S A, 103, 3557-62.
39. KOZBOR, D. & RODER, J. C. 1983. The production of monoclonal antibodies from human lymphocytes. Immunol Today, 4, 72-9.39. KOZBOR, D. & RODER, J. C. 1983. The production of monoclonal antibodies from human lymphocytes. Immunol Today, 4, 72-9.
40. COLE, S. P., CAMPLING, B. G., LOUWMAN, I. H., KOZBOR, D. & RODER, J. C. 1984. A strategy for the production of human monoclonal antibodies reactive with lung tumor cell lines. Cancer Res, 44, 2750-3.40. COLE, S. P., CAMPLING, B. G., LOUWMAN, I. H., KOZBOR, D. & RODER, J. C. 1984. A strategy for the production of human monoclonal antibodies reactive with lung tumor cell lines. Cancer Res, 44, 2750-3.
41. HOLLIGER, P. & HUDSON, P. J. 2005. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nat Biotechnol, 23, 1126-36.41. HOLLIGER, P. & HUDSON, P. J. 2005. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nat Biotechnol, 23, 1126-36.
42. PERVAIZ, S. & BREW, K. 1987. Homology and structure-function correlations between alpha 1-acid glycoprotein and serum retinol-binding protein and its relatives. FASEB J, 1, 209-14.42. PERVAIZ, S. & BREW, K. 1987. Homology and structure-function correlations between alpha 1-acid glycoprotein and serum retinol-binding protein and its relatives. FASEB J, 1, 209-14.
43. SAMBROOK, J. & RUSSELL, D. W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press.43. SAMBROOK, J. & RUSSELL, D. W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
44. FLOWER, D. R. 2000. Beyond the superfamily: the lipocalin receptors. Biochim Biophys Acta, 1482, 327-36.44. FLOWER, D. R. 2000. Beyond the superfamily: the lipocalin receptors. Biochim Biophys Acta, 1482, 327-36.
45. BREUSTEDT, D. A., KORNDORFER, I. P., REDL, B. & SKERRA, A. 2005. The 1.8-A crystal structure of human tear lipocalin reveals an extended branched cavity with capacity for multiple ligands. J Biol Chem, 280, 484-93.45. BREUSTEDT, D. A., KORNDORFER, I. P., REDL, B. & SKERRA, A. 2005. The 1.8-A crystal structure of human tear lipocalin reveals an extended branched cavity with capacity for multiple ligands. J Biol Chem, 280, 484-93.
46. SCHMIDT, T. G., KOEPKE, J., FRANK, R. & SKERRA, A. 1996. Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, streptavidin. J Mol Biol, 255, 753-66.46. SCHMIDT, T. G., KOEPKE, J., FRANK, R. & SKERRA, A. 1996. Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, streptavidin. J Mol Biol, 255, 753-66.
47. VAJO, Z. & DUCKWORTH, W. C. 2000. Genetically engineered insulin analogs: diabetes in the new millenium. Pharmacol Rev, 52, 1-9.47. VAJO, Z. & DUCKWORTH, W. C. 2000. Genetically engineered insulin analogs: diabetes in the new millennium. Pharmacol Rev, 52, 1-9.
48. FUERTGES, F. & ABUCHOWSKI, A. 1990. The clinical efficacy of poly(ethylene glycol)-modified proteins. Journal of Controlled Release, 11, 139-148.48. FUERTGES, F. & ABUCHOWSKI, A. 1990. The clinical efficacy of poly(ethylene glycol)-modified proteins. Journal of Controlled Release, 11, 139-148.
49. DENNIS, M. S., ZHANG, M., MENG, Y. G., KADKHODAYAN, M., KIRCHHOFER, D., COMBS, D. & DAMICO, L. A. 2002. Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins. J Biol Chem, 277, 35035-43.49. DENNIS, M. S., ZHANG, M., MENG, Y. G., KADKHODAYAN, M., KIRCHHOFER, D., COMBS, D. & DAMICO, L. A. 2002. Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins. J Biol Chem, 277, 35035-43.
50. KONIG, T. & SKERRA, A. 1998. Use of an albumin-binding domain for the selective immobilisation of recombinant capture antibody fragments on ELISA plates. J Immunol Methods, 218, 73-83.50. KONIG, T. & SKERRA, A. 1998. Use of an albumin-binding domain for the selective immobilization of recombinant capture antibody fragments on ELISA plates. J Immunol Methods, 218, 73-83.
51. OSBORN, B. L., OLSEN, H. S., NARDELLI, B., MURRAY, J. H., ZHOU, J. X., GARCIA, A., MOODY, G., ZARITSKAYA, L. S. & SUNG, C. 2002. Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein in cynomolgus monkeys. J Pharmacol Exp Ther, 303, 540-8.51. OSBORN, B. L., OLSEN, H. S., NARDELLI, B., MURRAY, J. H., ZHOU, J. X., GARCIA, A., MOODY, G., ZARITSKAYA, L. S. & SUNG, C. 2002. Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumin-interferon-alpha fusion protein in cynomolgus monkeys. J Pharmacol Exp Ther, 303, 540-8.
52. LOWMAN, H. B. 1997. Bacteriophage display and discovery of peptide leads for drug development. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 26, 401-24.52. LOWMAN, H. B. 1997. Bacteriophage display and discovery of peptide leads to drug development. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 26, 401-24.
53. RODI, D. J. & MAKOWSKI, L. 1999. Phage-display technology--finding a needle in a vast molecular haystack. Curr Opin Biotechnol, 10, 87-93.53. RODI, D. J. & MAKOWSKI, L. 1999. Phage-display technology—finding a needle in a vast molecular haystack. Curr Opin Biotechnol, 10, 87-93.
54. VENTURI, M., SEIFERT, C. & HUNTE, C. 2002. High level production of functional antibody Fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm. J Mol Biol, 315, 1-8.54. VENTURI, M., SEIFERT, C. & HUNTE, C. 2002. High level production of functional antibody Fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm. J Mol Biol, 315, 1-8.
55. BRUCKDORFER, T., MARDER, O. & ALBERICIO, F. 2004. From production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future. Curr Pharm Biotechnol, 5, 29-43.55. BRUCKDORFER, T., MARDER, O. & ALBERICIO, F. 2004. From production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future. Curr Pharm Biotechnol, 5, 29-43.
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ LIST OF SEQUENCES
<110> Pieris Pharmaceuticals GmbH<110> Pieris Pharmaceuticals GmbH
LES LABORATOIRES SERVIER LES LABORATOIRES SERVIER
<120> Новый слитый белок, специфичный к CD137 и PD-L1<120> Novel fusion protein specific for CD137 and PD-L1
<130> PIE16305PCT<130>PIE16305PCT
<150> EP18186445.5<150>EP18186445.5
<151> 2018-07-31<151> 2018-07-31
<150> EP18204548.4<150> EP18204548.4
<151> 2018-11-06<151> 2018-11-06
<160> 148 <160> 148
<170> PatentIn версии 3.5<170> PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 158<211> 158
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 1<400> 1
His His Leu Leu Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr His His Leu Leu Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr
1 5 10 15 1 5 10 15
Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn Trp Tyr Leu Lys Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn
20 25 30 20 25 30
Leu Glu Ser Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ser Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn
35 40 45 35 40 45
Leu Glu Ala Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val Leu Glu Ala Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val
50 55 60 50 55 60
Lys Ala Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Lys Ala Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Gly Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Gly Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His
85 90 95 85 90 95
Tyr Ile Phe Tyr Cys Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Val Arg Gly Tyr Ile Phe Tyr Cys Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Val Arg Gly
100 105 110 100 105 110
Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu
115 120 125 115 120 125
Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile
130 135 140 130 135 140
Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly Ser Asp Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly Ser Asp
145 150 155 145 150 155
<210> 2<210> 2
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 2<400> 2
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 3<210> 3
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 3<400> 3
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 4<210> 4
<211> 152<211> 152
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 4<400> 4
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Cys Pro Glu Met Asn Leu Glu Ser Val Ala Met Thr Val Asp Arg Glu Cys Pro Glu Met Asn Leu Glu Ser Val
20 25 30 20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45 35 40 45
Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val Leu Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80 65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95 85 90 95
Ser Glu Gly Glu Cys His Gly Lys Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val Ser Glu Gly Glu Cys His Gly Lys Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110 100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125 115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140 130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150 145 150
<210> 5<210> 5
<211> 4<211> 4
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 5<400> 5
His His Leu Leu His His Leu Leu
1 1
<210> 6<210> 6
<211> 272<211> 272
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 6<400> 6
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20 25 30 20 25 30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35 40 45 35 40 45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
50 55 60 50 55 60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95 85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110 100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125 115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130 135 140 130 135 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145 150 155 160 145 150 155 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
165 170 175 165 170 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
180 185 190 180 185 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195 200 205 195 200 205
Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His Leu Val Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His Leu Val
210 215 220 210 215 220
Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr Phe Ile Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr Phe Ile
225 230 235 240 225 230 235 240
Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys Gly Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys Gly Ile
245 250 255 245 250 255
Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu Glu Thr Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu Glu Thr
260 265 270 260 265 270
<210> 7<210> 7
<211> 232<211> 232
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 7<400> 7
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15 1 5 10 15
Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30 20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45 35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60 50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95 85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110 100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125 115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140 130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160 145 150 155 160
Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu
165 170 175 165 170 175
Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg
180 185 190 180 185 190
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
195 200 205 195 200 205
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
210 215 220 210 215 220
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
225 230 225 230
<210> 8<210> 8
<211> 272<211> 272
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Macaca fascicularis<213> Macaca fascicularis
<400> 8<400> 8
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
20 25 30 20 25 30
Thr Ser Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln Thr Ser Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
35 40 45 35 40 45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Asn Tyr Arg Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Asn Tyr Arg
50 55 60 50 55 60
Gln Arg Ala Gln Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala Gln Arg Ala Gln Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Arg Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys Leu Arg Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
85 90 95 85 90 95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
100 105 110 100 105 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
115 120 125 115 120 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
130 135 140 130 135 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145 150 155 160 145 150 155 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Leu Asn Val Thr Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Leu Asn Val Thr
165 170 175 165 170 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Ala Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Ile Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Ala Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Ile
180 185 190 180 185 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
195 200 205 195 200 205
Pro Glu Leu Pro Leu Ala Leu Pro Pro Asn Glu Arg Thr His Leu Val Pro Glu Leu Pro Leu Ala Leu Pro Pro Asn Glu Arg Thr His Leu Val
210 215 220 210 215 220
Ile Leu Gly Ala Ile Phe Leu Leu Leu Gly Val Ala Leu Thr Phe Ile Ile Leu Gly Ala Ile Phe Leu Leu Leu Gly Val Ala Leu Thr Phe Ile
225 230 235 240 225 230 235 240
Phe Tyr Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Met Lys Lys Ser Gly Ile Phe Tyr Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Met Lys Lys Ser Gly Ile
245 250 255 245 250 255
Arg Val Thr Asn Ser Lys Lys Gln Arg Asp Thr Gln Leu Glu Glu Thr Arg Val Thr Asn Ser Lys Lys Gln Arg Asp Thr Gln Leu Glu Glu Thr
260 265 270 260 265 270
<210> 9<210> 9
<211> 231<211> 231
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Macaca fascicularis<213> Macaca fascicularis
<400> 9<400> 9
Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15 1 5 10 15
Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30 20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45 35 40 45
Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60 50 55 60
Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly Ala Glu Cys Ser Met Cys Glu Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly Ala Glu Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95 85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110 100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125 115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140 130 135 140
Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160 145 150 155 160
Ser Pro Gln Ile Ile Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Val Val Leu Ser Pro Gln Ile Ile Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Val Val Leu
165 170 175 165 170 175
Phe Leu Leu Phe Phe Leu Val Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Ser Phe Leu Leu Phe Phe Leu Val Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Ser
180 185 190 180 185 190
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
195 200 205 195 200 205
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
210 215 220 210 215 220
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
225 230 225 230
<210> 10<210> 10
<211> 4<211> 4
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> сайт расщепления<223> cleavage site
<400> 10<400> 10
Ile Glu Gly Arg Ile Glu Gly Arg
1 1
<210> 11<210> 11
<211> 10<211> 10
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый пептид<223> fusion peptide
<400> 11<400> 11
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10 1 5 10
<210> 12<210> 12
<211> 8<211> 8
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> пептид с меткой Step-Tag II<223> Step-Tag II peptide
<400> 12<400> 12
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 15
<210> 13<210> 13
<211> 15<211> 15
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> линкер<223> linker
<400> 13<400> 13
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
<210> 14<210> 14
<211> 18<211> 18
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> линкер<223> linker
<400> 14<400> 14
Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Ser Pro Ser
<210> 15<210> 15
<211> 14<211> 14
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> линкер<223> linker
<400> 15<400> 15
Gly Gly Ser Gly Asn Ser Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Gly Gly Ser Gly Asn Ser Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val
1 5 10 1 5 10
<210> 16<210> 16
<211> 20<211> 20
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> линкер<223> linker
<400> 16<400> 16
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Ser Ala Pro Ala
20 20
<210> 17<210> 17
<211> 66<211> 66
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> линкер<223> linker
<400> 17<400> 17
Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Pro Ser Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Pro Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser
20 25 30 20 25 30
Gly Gly Ser Gly Asn Ser Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly Gly Ser Gly Asn Ser Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Pro Ser
35 40 45 35 40 45
Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser
50 55 60 50 55 60
Ala Ser Ala Ser
65 65
<210> 18<210> 18
<211> 32<211> 32
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> линкер<223> linker
<400> 18<400> 18
Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Ser Gly Gly Ser Gly Asn Ser Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly Gly Ser Gly Asn Ser Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val
20 25 30 20 25 30
<210> 19<210> 19
<211> 74<211> 74
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> линкер<223> linker
<400> 19<400> 19
Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Pro Ser Ala Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Pro Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser
20 25 30 20 25 30
Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr
35 40 45 35 40 45
Pro Ser Pro Ser Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser Pro Ser Pro Ser Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser
50 55 60 50 55 60
Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ala Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ala Ser
65 70 65 70
<210> 20<210> 20
<211> 40<211> 40
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> линкер<223> linker
<400> 20<400> 20
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
20 25 30 20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
35 40 35 40
<210> 21<210> 21
<211> 10<211> 10
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> линкер<223> linker
<400> 21<400> 21
Val Asp Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Glu Val Asp Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Glu
1 5 10 1 5 10
<210> 22<210> 22
<211> 11<211> 11
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> линкер<223> linker
<400> 22<400> 22
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Arg Met Asp Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Arg Met Asp Glu
1 5 10 1 5 10
<210> 23<210> 23
<211> 10<211> 10
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> линкер<223> linker
<400> 23<400> 23
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 1 5 10
<210> 24<210> 24
<211> 327<211> 327
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 24<400> 24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95 85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110 100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125 115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140 130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175 165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190 180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205 195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220 210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255 245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270 260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285 275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300 290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320 305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325 325
<210> 25<210> 25
<211> 214<211> 214
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 25<400> 25
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140 130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 210
<210> 26<210> 26
<211> 448<211> 448
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> тяжелая цепь антитела<223> antibody heavy chain
<400> 26<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30 20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125 115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140 130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160 145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175 165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190 180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205 195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220 210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240 225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255 245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270 260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285 275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300 290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320 305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335 325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350 340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365 355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380 370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415 405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430 420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445 435 440 445
<210> 27<210> 27
<211> 214<211> 214
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> легкая цепь антитела<223> antibody light chain
<400> 27<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140 130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 210
<210> 28<210> 28
<211> 448<211> 448
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> тяжелая цепь антитела<223> antibody heavy chain
<400> 28<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30 20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Gly Glu Ile Asn His Gly Gly Tyr Val Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95 85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Asp Tyr Gly Pro Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
100 105 110 100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125 115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140 130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160 145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175 165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190 180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205 195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220 210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240 225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255 245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270 260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285 275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300 290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320 305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335 325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350 340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365 355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380 370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415 405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430 420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445 435 440 445
<210> 29<210> 29
<211> 216<211> 216
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> легкая цепь антитела<223> antibody light chain
<400> 29<400> 29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95 85 90 95
Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110 100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125 115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140 130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160 145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175 165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190 180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205 195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 210 215
<210> 30<210> 30
<211> 228<211> 228
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> фрагмент антитела<223> antibody fragment
<400> 30<400> 30
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30 20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60 50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95 85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110 100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140 130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160 145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175 165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190 180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205 195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220 210 215 220
Leu Ser Leu Gly Leu Ser Leu Gly
225 225
<210> 31<210> 31
<211> 228<211> 228
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> фрагмент антитела<223> antibody fragment
<400> 31<400> 31
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30 20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60 50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95 85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110 100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140 130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160 145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175 165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190 180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205 195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220 210 215 220
Leu Ser Leu Gly Leu Ser Leu Gly
225 225
<210> 32<210> 32
<211> 228<211> 228
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> фрагмент антитела<223> antibody fragment
<400> 32<400> 32
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30 20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60 50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95 85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110 100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140 130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160 145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175 165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190 180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205 195 200 205
Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220 210 215 220
Leu Ser Leu Gly Leu Ser Leu Gly
225 225
<210> 33<210> 33
<211> 228<211> 228
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> фрагмент антитела<223> antibody fragment
<400> 33<400> 33
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30 20 25 30
Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60 50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95 85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110 100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140 130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160 145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175 165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190 180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205 195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220 210 215 220
Leu Ser Leu Gly Leu Ser Leu Gly
225 225
<210> 34<210> 34
<211> 152<211> 152
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 34<400> 34
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30 20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45 35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80 65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95 85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110 100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125 115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140 130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150 145 150
<210> 35<210> 35
<211> 152<211> 152
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 35<400> 35
Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30 20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45 35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Arg Ala Val Leu Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Arg Ala Val Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80 65 70 75 80
Asp Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr Asp Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95 85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110 100 105 110
Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125 115 120 125
Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140 130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150 145 150
<210> 36<210> 36
<211> 152<211> 152
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 36<400> 36
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30 20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45 35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Asn Ala Val Leu Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Asn Ala Val Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80 65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Arg Asp His Tyr Ile Phe Tyr Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Arg Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95 85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110 100 105 110
Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125 115 120 125
Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140 130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150 145 150
<210> 37<210> 37
<211> 152<211> 152
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 37<400> 37
Val Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Val Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30 20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45 35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Arg Ala Val Leu Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Arg Ala Val Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80 65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Glu Asp His Tyr Ile Phe Tyr Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Glu Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95 85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110 100 105 110
Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys Gly Arg Asp Pro Glu Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125 115 120 125
Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140 130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150 145 150
<210> 38<210> 38
<211> 152<211> 152
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 38<400> 38
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30 20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Ser Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys Thr Pro Met Thr Leu Ser Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45 35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80 65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95 85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110 100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125 115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140 130 135 140
Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150 145 150
<210> 39<210> 39
<211> 152<211> 152
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 39<400> 39
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30 20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Glu Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Glu
35 40 45 35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Lys Ala Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His Glu Lys Ala Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80 65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95 85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110 100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125 115 120 125
Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Ser Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Ser
130 135 140 130 135 140
Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150 145 150
<210> 40<210> 40
<211> 152<211> 152
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 40<400> 40
Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val
20 25 30 20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Asp Gly Asn Leu Glu Ala Lys Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Asp Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45 35 40 45
Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Lys Ala Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His Glu Lys Ala Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His
65 70 75 80 65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95 85 90 95
Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val Ser Glu Gly Val Cys Asp Gly Ser Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110 100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125 115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140 130 135 140
Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150 145 150
<210> 41<210> 41
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 41<400> 41
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asn Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile Asn Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 42<210> 42
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 42<400> 42
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 43<210> 43
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 43<400> 43
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asp Val Thr Ala Val Ala Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Asp Ile Asp Val Thr Ala Val Ala Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Asp Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 44<210> 44
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 44<400> 44
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asp Val Thr Ala Val Ala Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Asp Ile Asp Val Thr Ala Val Ala Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Asp Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 45<210> 45
<211> 175<211> 175
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 45<400> 45
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Ser Lys Met Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Ser Lys Met
35 40 45 35 40 45
Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr
50 55 60 50 55 60
Gly Val Ser Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile Met Thr Phe Gly Val Ser Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile Met Thr Phe
65 70 75 80 65 70 75 80
Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser
85 90 95 85 90 95
Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr
100 105 110 100 105 110
Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu
115 120 125 115 120 125
Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu
130 135 140 130 135 140
Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu
145 150 155 160 145 150 155 160
Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
165 170 175 165 170 175
<210> 46<210> 46
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 46<400> 46
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
Val Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Val Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Arg Tyr Asp Ile Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Arg Tyr Asp Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Phe Gly Lys Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Phe Gly Lys
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 47<210> 47
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 47<400> 47
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
His Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr His Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 48<210> 48
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 48<400> 48
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Lys Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asn Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile Asp Val Thr Gly Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Thr Tyr Ala Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Thr Leu Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Phe Gly Lys Ser Thr Leu Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Phe Gly Lys
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 49<210> 49
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 49<400> 49
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
Ser Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Ser Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asp Val Thr Ala Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Asn Tyr Ala Ile Asp Val Thr Ala Val Thr Phe Asp Asp Lys Lys Cys Asn Tyr Ala Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ser Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 50<210> 50
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 50<400> 50
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Phe Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Phe
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 51<210> 51
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 51<400> 51
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95 85 90 95
Ile Arg Ser Asp Leu Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Ile Arg Ser Asp Leu Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 52<210> 52
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 52<400> 52
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Tyr Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Tyr Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Leu Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile Asn Val Thr Asp Val Met Leu Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Ser Thr Leu Gly Phe Gln Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Ser Thr Leu Gly Phe
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 53<210> 53
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 53<400> 53
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln His Ile Ile Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln His Ile Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 54<210> 54
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 54<400> 54
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asp Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asp Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 55<210> 55
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 55<400> 55
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Ile Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 56<210> 56
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 56<400> 56
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Arg Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Arg Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Val Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Val Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Tyr Phe Lys Ser Val Ile Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Tyr Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 57<210> 57
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 57<400> 57
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Asn Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Asn
65 70 75 80 65 70 75 80
Trp Pro Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Phe Trp Pro Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Phe
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Asp Leu Gly Pro Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Asp Leu Gly Pro Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 58<210> 58
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 58<400> 58
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Asn Glu Asp Lys Ser Tyr His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Asn Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 59<210> 59
<211> 178<211> 178
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 59<400> 59
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Asp Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Asp Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asn Val Thr Asp Val Met Leu Leu Asp Lys Lys Cys His Tyr Ile Ile Asn Val Thr Asp Val Met Leu Leu Asp Lys Lys Cys His Tyr Ile Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Asp Gly
<210> 60<210> 60
<211> 8<211> 8
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> CDR1 тяжелой цепи антитела<223> Antibody heavy chain CDR1
<400> 60<400> 60
Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Asp Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Asp
1 5 15
<210> 61<210> 61
<211> 7<211> 7
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> CDR2 тяжелой цепи антитела<223> CDR2 of antibody heavy chain
<400> 61<400> 61
Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr
1 5 15
<210> 62<210> 62
<211> 14<211> 14
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> CDR3 тяжелой цепи антитела<223> CDR3 of antibody heavy chain
<400> 62<400> 62
Val Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Val Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr
1 5 10 1 5 10
<210> 63<210> 63
<211> 6<211> 6
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> CDR1 легкой цепи антитела<223> Antibody light chain CDR1
<400> 63<400> 63
Gln Ser Ile Gly Thr Asn Gln Ser Ile Gly Thr Asn
1 5 15
<210> 64<210> 64
<211> 9<211> 9
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> CDR3 легкой цепи антитела<223> CDR3 antibody light chain
<400> 64<400> 64
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Thr
1 5 15
<210> 65<210> 65
<211> 8<211> 8
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> CDR1 тяжелой цепи антитела<223> Antibody heavy chain CDR1
<400> 65<400> 65
Gly Phe Asp Ile Lys Asp Thr Tyr Gly Phe Asp Ile Lys Asp Thr Tyr
1 5 15
<210> 66<210> 66
<211> 8<211> 8
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> CDR2 тяжелой цепи антитела<223> CDR2 of antibody heavy chain
<400> 66<400> 66
Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Thr Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Thr
1 5 15
<210> 67<210> 67
<211> 10<211> 10
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> CDR3 тяжелой цепи антитела<223> CDR3 of antibody heavy chain
<400> 67<400> 67
Ala Arg Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Ser Ala Arg Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Ser
1 5 10 1 5 10
<210> 68<210> 68
<211> 6<211> 6
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> CDR1 легкой цепи антитела<223> Antibody light chain CDR1
<400> 68<400> 68
Gln Asp Ile Thr Asn Ser Gln Asp Ile Thr Asn Ser
1 5 15
<210> 69<210> 69
<211> 9<211> 9
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> CDR3 легкой цепи антитела<223> CDR3 antibody light chain
<400> 69<400> 69
Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro Thr Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro Thr
1 5 15
<210> 70<210> 70
<211> 8<211> 8
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> CDR1 тяжелой цепи антитела<223> Antibody heavy chain CDR1
<400> 70<400> 70
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
1 5 15
<210> 71<210> 71
<211> 8<211> 8
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> CDR2 тяжелой цепи антитела<223> CDR2 of antibody heavy chain
<400> 71<400> 71
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr
1 5 15
<210> 72<210> 72
<211> 17<211> 17
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> CDR3 тяжелой цепи антитела<223> CDR3 of antibody heavy chain
<400> 72<400> 72
Ser Arg Gly Pro Pro Gly Gly Ile Gly Glu Tyr Ile Tyr Ala Met Asp Ser Arg Gly Pro Pro Gly Gly Ile Gly Glu Tyr Ile Tyr Ala Met Asp
1 5 10 15 1 5 10 15
Tyr Tyr
<210> 73<210> 73
<211> 7<211> 7
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> CDR1 легкой цепи антитела<223> Antibody light chain CDR1
<400> 73<400> 73
Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5 15
<210> 74<210> 74
<211> 9<211> 9
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> CDR3 легкой цепи антитела<223> CDR3 antibody light chain
<400> 74<400> 74
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Thr His Gln Tyr His Arg Ser Pro Pro Thr
1 5 15
<210> 75<210> 75
<211> 120<211> 120
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область тяжелой цепи антитела<223> antibody heavy chain variable region
<400> 75<400> 75
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15 1 5 10 15
Asn Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Asn Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30 20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45 35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val
85 90 95 85 90 95
Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120 115 120
<210> 76<210> 76
<211> 120<211> 120
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область тяжелой цепи антитела<223> antibody heavy chain variable region
<400> 76<400> 76
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15 1 5 10 15
Asn Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Asn Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30 20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45 35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Phe Lys Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Phe Lys
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Leu Gln Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Lys Met Ser Ser Leu Gln Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95 85 90 95
Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 77<210> 77
<211> 120<211> 120
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область тяжелой цепи антитела<223> antibody heavy chain variable region
<400> 77<400> 77
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30 20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45 35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95 85 90 95
Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 78<210> 78
<211> 117<211> 117
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область тяжелой цепи антитела<223> antibody heavy chain variable region
<400> 78<400> 78
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Lys Asp Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Ile Lys Asp Thr
20 25 30 20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asn Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60 50 55 60
Gln Asp Lys Thr Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala His Gln Asp Lys Thr Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala His
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ala Arg Gly Leu Gly Ala Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110 100 105 110
Val Thr Val Ser Ala Val Thr Val Ser Ala
115 115
<210> 79<210> 79
<211> 124<211> 124
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область тяжелой цепи антитела<223> antibody heavy chain variable region
<400> 79<400> 79
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30 20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60 50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ser Arg Gly Pro Pro Gly Gly Ile Gly Glu Tyr Ile Tyr Ala Met Asp Ser Arg Gly Pro Pro Gly Gly Ile Gly Glu Tyr Ile Tyr Ala Met Asp
100 105 110 100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 80<210> 80
<211> 106<211> 106
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область легкой цепи антитела<223> antibody light chain variable region
<400> 80<400> 80
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Glu Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30 20 25 30
Ile His Trp Phe Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Ile His Trp Phe Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 100 105
<210> 81<210> 81
<211> 107<211> 107
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область легкой цепи антитела<223> antibody light chain variable region
<400> 81<400> 81
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30 20 25 30
Ile His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ile His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 82<210> 82
<211> 107<211> 107
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область легкой цепи антитела<223> antibody light chain variable region
<400> 82<400> 82
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30 20 25 30
Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 83<210> 83
<211> 106<211> 106
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область легкой цепи антитела<223> antibody light chain variable region
<400> 83<400> 83
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Ser Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Ser
20 25 30 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
His Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly His Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 100 105
<210> 84<210> 84
<211> 107<211> 107
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область легкой цепи антитела<223> antibody light chain variable region
<400> 84<400> 84
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30 20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45 35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
85 90 95 85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 100 105
<210> 85<210> 85
<211> 450<211> 450
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> тяжелая цепь антитела<223> antibody heavy chain
<400> 85<400> 85
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30 20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45 35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95 85 90 95
Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140 130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160 145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175 165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190 180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205 195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220 210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala
225 230 235 240 225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255 245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270 260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285 275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300 290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320 305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335 325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350 340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365 355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380 370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400 385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415 405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430 420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445 435 440 445
Gly Lys Gly Lys
450 450
<210> 86<210> 86
<211> 446<211> 446
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> тяжелая цепь антитела<223> antibody heavy chain
<400> 86<400> 86
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30 20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45 35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95 85 90 95
Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140 130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160 145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175 165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190 180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205 195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220 210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255 245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270 260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285 275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300 290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320 305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335 325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350 340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365 355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380 370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400 385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415 405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430 420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445 435 440 445
<210> 87<210> 87
<211> 214<211> 214
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> легкая цепь антитела<223> antibody light chain
<400> 87<400> 87
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30 20 25 30
Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140 130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 210
<210> 88<210> 88
<211> 614<211> 614
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 88<400> 88
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30 20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60 50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95 85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110 100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140 130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160 145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175 165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190 180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205 195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220 210 215 220
Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu
245 250 255 245 250 255
Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly
260 265 270 260 265 270
Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp
275 280 285 275 280 285
Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp
290 295 300 290 295 300
Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met
305 310 315 320 305 310 315 320
Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr
325 330 335 325 330 335
Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg
340 345 350 340 345 350
Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe
355 360 365 355 360 365
Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr
370 375 380 370 375 380
Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp
405 410 415 405 410 415
Gln Cys Ile Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Cys Ile Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
420 425 430 420 425 430
Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro
435 440 445 435 440 445
Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His
450 455 460 450 455 460
Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu
465 470 475 480 465 470 475 480
Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
485 490 495 485 490 495
Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys
500 505 510 500 505 510
Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe
515 520 525 515 520 525
Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val
530 535 540 530 535 540
Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys
545 550 555 560 545 550 555 560
Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg
565 570 575 565 570 575
Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser
580 585 590 580 585 590
Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile
595 600 605 595 600 605
Asp Gln Cys Ile Asp Gly Asp Gln Cys Ile Asp Gly
610 610
<210> 89<210> 89
<211> 422<211> 422
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 89<400> 89
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30 20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60 50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95 85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110 100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125 115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140 130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160 145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175 165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190 180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205 195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220 210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro
245 250 255 245 250 255
Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His
260 265 270 260 265 270
Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu
275 280 285 275 280 285
Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu
290 295 300 290 295 300
Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys
305 310 315 320 305 310 315 320
Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe
325 330 335 325 330 335
Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val
340 345 350 340 345 350
Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys
355 360 365 355 360 365
Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg
370 375 380 370 375 380
Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser
385 390 395 400 385 390 395 400
Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile
405 410 415 405 410 415
Asp Gln Cys Ile Asp Gly Asp Gln Cys Ile Asp Gly
420 420
<210> 90<210> 90
<211> 639<211> 639
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 90<400> 90
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30 20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45 35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95 85 90 95
Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140 130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160 145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175 165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190 180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205 195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220 210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255 245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270 260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285 275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300 290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320 305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335 325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350 340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365 355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380 370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400 385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415 405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430 420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly
435 440 445 435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser
450 455 460 450 455 460
Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln
465 470 475 480 465 470 475 480
Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly
485 490 495 485 490 495
Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met
500 505 510 500 505 510
Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr
515 520 525 515 520 525
Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe
530 535 540 530 535 540
Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser
545 550 555 560 545 550 555 560
Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr
565 570 575 565 570 575
Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu
580 585 590 580 585 590
Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu
595 600 605 595 600 605
Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu
610 615 620 610 615 620
Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
625 630 635 625 630 635
<210> 91<210> 91
<211> 407<211> 407
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 91<400> 91
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30 20 25 30
Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140 130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220 210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro
225 230 235 240 225 230 235 240
Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe
245 250 255 245 250 255
His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg
260 265 270 260 265 270
Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys
275 280 285 275 280 285
Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys
290 295 300 290 295 300
Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu
305 310 315 320 305 310 315 320
Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu
325 330 335 325 330 335
Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe
340 345 350 340 345 350
Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly
355 360 365 355 360 365
Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe
370 375 380 370 375 380
Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro
385 390 395 400 385 390 395 400
Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
405 405
<210> 92<210> 92
<211> 639<211> 639
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 92<400> 92
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190 180 185 190
Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
195 200 205 195 200 205
Glu Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Glu Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn
210 215 220 210 215 220
Tyr Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Tyr Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
225 230 235 240 225 230 235 240
Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu
245 250 255 245 250 255
Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser
260 265 270 260 265 270
Leu Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
275 280 285 275 280 285
Val Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Val Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly
290 295 300 290 295 300
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
305 310 315 320 305 310 315 320
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
325 330 335 325 330 335
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
340 345 350 340 345 350
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
355 360 365 355 360 365
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
370 375 380 370 375 380
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
385 390 395 400 385 390 395 400
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
405 410 415 405 410 415
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
420 425 430 420 425 430
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
435 440 445 435 440 445
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
450 455 460 450 455 460
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
465 470 475 480 465 470 475 480
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
485 490 495 485 490 495
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
500 505 510 500 505 510
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
515 520 525 515 520 525
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
530 535 540 530 535 540
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
545 550 555 560 545 550 555 560
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
565 570 575 565 570 575
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
580 585 590 580 585 590
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
595 600 605 595 600 605
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
610 615 620 610 615 620
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
625 630 635 625 630 635
<210> 93<210> 93
<211> 407<211> 407
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 93<400> 93
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30 20 25 30
Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45 35 40 45
Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60 50 55 60
Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile
65 70 75 80 65 70 75 80
Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110 100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln
115 120 125 115 120 125
Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140 130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175 165 170 175
Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
180 185 190 180 185 190
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Val Thr Pro
195 200 205 195 200 205
Lys Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Lys Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr
210 215 220 210 215 220
Asn Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Asn Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu
225 230 235 240 225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
245 250 255 245 250 255
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu
260 265 270 260 265 270
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro
275 280 285 275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
290 295 300 290 295 300
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
305 310 315 320 305 310 315 320
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
325 330 335 325 330 335
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
340 345 350 340 345 350
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
355 360 365 355 360 365
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
370 375 380 370 375 380
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
405 405
<210> 94<210> 94
<211> 832<211> 832
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 94<400> 94
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30 20 25 30
Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Asp Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45 35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu Lys
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95 85 90 95
Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Arg Asp Ser Asn Tyr Arg Tyr Asp Glu Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140 130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160 145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175 165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190 180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205 195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220 210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255 245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270 260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285 275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300 290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320 305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335 325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350 340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365 355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380 370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400 385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415 405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430 420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly
435 440 445 435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser
450 455 460 450 455 460
Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln
465 470 475 480 465 470 475 480
Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly
485 490 495 485 490 495
Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met
500 505 510 500 505 510
Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr
515 520 525 515 520 525
Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe
530 535 540 530 535 540
Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser
545 550 555 560 545 550 555 560
Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr
565 570 575 565 570 575
Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu
580 585 590 580 585 590
Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu
595 600 605 595 600 605
Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu
610 615 620 610 615 620
Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Gly Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Gly
625 630 635 640 625 630 635 640
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp
645 650 655 645 650 655
Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu
660 665 670 660 665 670
Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val
675 680 685 675 680 685
Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys
690 695 700 690 695 700
Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val
705 710 715 720 705 710 715 720
Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr
725 730 735 725 730 735
Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys
740 745 750 740 745 750
Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn
755 760 765 755 760 765
Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg
770 775 780 770 775 780
Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser
785 790 795 800 785 790 795 800
Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro
805 810 815 805 810 815
Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly
820 825 830 820 825 830
<210> 95<210> 95
<211> 474<211> 474
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 95<400> 95
catcatctgc tggcctctga cgaagagatc caggatgtgt ccggcacctg gtatctgaag 60catcatctgc tggcctctga cgaagagatc caggatgtgt ccggcacctg gtatctgaag 60
gccatgaccg tggaccgcga gttccctgag atgaacctgg aaagcgtgac ccctatgaca 120gccatgaccg tggaccgcga gttccctgag atgaacctgg aaagcgtgac ccctatgaca 120
ctgaccacac tggaaggcgg caacctggaa gccaaagtga ccatgctgat ctccggccgg 180ctgaccacac tggaaggcgg caacctggaa gccaaagtga ccatgctgat ctccggccgg 180
tgccaagaag tgaaggccgt cctggaaaag accgacgagc ctggcaagta caccgctgat 240tgccaagaag tgaaggccgt cctggaaaag accgacgagc ctggcaagta caccgctgat 240
ggcggcaagc acgtggccta catcatcaga tcccacgtga aggaccacta catcttctac 300ggcggcaagc acgtggccta catcatcaga tcccacgtga aggaccacta catcttctac 300
tgcgagggcg agctgcacgg aaagcctgtt agaggcgtga agctcgtggg cagagatccc 360tgcgaggcg agctgcacgg aaagcctgtt agaggcgtga agctcgtggg cagagatccc 360
aagaacaatc tggaagccct ggaagatttc gagaaggccg ctggcgctag aggcctgtcc 420aagaacaatc tggaagccct ggaagatttc gagaaggccg ctggcgctag aggcctgtcc 420
acagagtcta tcctgattcc tcggcagtcc gagacatgct cccctggctc tgat 474acagagtcta tcctgattcc tcggcagtcc gagacatgct cccctggctc tgat 474
<210> 96<210> 96
<211> 534<211> 534
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 96<400> 96
caggatagca ccagcgatct gattccggcg ccgccgctga gcaaagtgcc gctgcagcag 60caggatagca ccagcgatct gattccggcg ccgccgctga gcaaagtgcc gctgcagcag 60
aactttcagg ataaccagtt tcagggcaaa tggtatgtgg tgggcctggc gggcaacgcg 120aactttcagg ataaccagtt tcagggcaaa tggtatgtgg tgggcctggc gggcaacgcg 120
attctgcgcg aagataaaga tccgcagaaa atgtatgcga ccatttatga actgaaagaa 180attctgcgcg aagataaaga tccgcagaaa atgtatgcga ccatttatga actgaaagaa 180
gataaaagct ataacgtgac cagcgtgctg tttcgcaaaa aaaaatgcga ttattggatt 240gataaaagct ataacgtgac cagcgtgctg tttcgcaaaa aaaaatgcga ttattggatt 240
cgcacctttg tgccgggctg ccagccgggc gaatttaccc tgggcaacat taaaagctat 300cgcacctttg tgccgggctg ccagccgggc gaatttaccc tgggcaacat taaaagctat 300
ccgggcctga ccagctatct ggtgcgcgtg gtgagcacca actataacca gcatgcgatg 360ccgggcctga ccagctatct ggtgcgcgtg gtgagcacca actataacca gcatgcgatg 360
gtgtttttta aaaaagtgag ccagaaccgc gaatatttta aaattaccct gtatggccgc 420gtgtttttta aaaaagtgag ccagaaccgc gaatatttta aaattaccct gtatggccgc 420
accaaagaac tgaccagcga actgaaagaa aactttattc gctttagcaa aagcctgggc 480accaaagaac tgaccagcga actgaaagaa aactttattc gctttagcaa aagcctgggc 480
ctgccggaaa accatattgt gtttccggtg ccgattgatc agtgcattga tggc 534ctgccggaaa accatattgt gtttccggtg ccgattgatc agtgcattga tggc 534
<210> 97<210> 97
<211> 534<211> 534
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 97<400> 97
caggatagca ccagcgatct gattccggcg ccgccgctga gcaaagtgcc gctgcagcag 60caggatagca ccagcgatct gattccggcg ccgccgctga gcaaagtgcc gctgcagcag 60
aactttcagg ataaccagtt tcatggcaaa tggtatgtgg tgggcctggc gggcaacgcg 120aactttcagg ataaccagtt tcatggcaaa tggtatgtgg tgggcctggc gggcaacgcg 120
attctgcgcg aagataaaga tccgcagaaa atgtatgcga ccatttatga actgaaagaa 180attctgcgcg aagataaaga tccgcagaaa atgtatgcga ccatttatga actgaaagaa 180
gataaaagct ataacgtgac cagcgtgctg tttcgcaaaa aaaaatgcga ttattggatt 240gataaaagct ataacgtgac cagcgtgctg tttcgcaaaa aaaaatgcga ttattggatt 240
cgcacctttg tgccgggcag ccagccgggc gaatttaccc tgggcaacat taaaagctat 300cgcacctttg tgccggggcag ccagccgggc gaatttaccc tgggcaacat taaaagctat 300
ccgggcctga ccagctatct ggtgcgcgtg gtgagcacca actataacca gcatgcgatg 360ccgggcctga ccagctatct ggtgcgcgtg gtgagcacca actataacca gcatgcgatg 360
gtgtttttta aaaaagtgag ccagaaccgc gaatatttta aaattaccct gtatggccgc 420gtgtttttta aaaaagtgag ccagaaccgc gaatatttta aaattaccct gtatggccgc 420
accaaagaac tgaccagcga actgaaagaa aactttattc gctttagcaa aagcctgggc 480accaaagaac tgaccagcga actgaaagaa aactttattc gctttagcaa aagcctgggc 480
ctgccggaaa accatattgt gtttccggtg ccgattgatc agtgcattga tggc 534ctgccggaaa accatattgt gtttccggtg ccgattgatc agtgcattga tggc 534
<210> 98<210> 98
<211> 534<211> 534
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 98<400> 98
caggatagca ccagcgatct gattccggcg ccgccgctga gcaaagtgcc gctgcagcag 60caggatagca ccagcgatct gattccggcg ccgccgctga gcaaagtgcc gctgcagcag 60
aactttcagg ataaccagtt tcatggcaaa tggtatgtgg tgggcctggc gggcaacgcg 120aactttcagg ataaccagtt tcatggcaaa tggtatgtgg tgggcctggc gggcaacgcg 120
attctgcgcg aagataaaga tccgcagaaa atgtatgcga ccatttatga actgaaagaa 180attctgcgcg aagataaaga tccgcagaaa atgtatgcga ccatttatga actgaaagaa 180
gataaaagct ataacgtgac cagcgtgctg tttcgcaaaa aaaaatgcga ttattggatt 240gataaaagct ataacgtgac cagcgtgctg tttcgcaaaa aaaaatgcga ttattggatt 240
cgcacctttg tgccgggcag ccagccgggc gaatttaccc tgggcaacat taaaagctat 300cgcacctttg tgccggggcag ccagccgggc gaatttaccc tgggcaacat taaaagctat 300
ccgggcctga ccagctatct ggtgcgcgtg gtgagcacca actataacca gcatgcgatg 360ccgggcctga ccagctatct ggtgcgcgtg gtgagcacca actataacca gcatgcgatg 360
gtgtttttta aaaaagtgag ccagaaccgc gaatatttta aaattaccct gtatggccgc 420gtgtttttta aaaaagtgag ccagaaccgc gaatatttta aaattaccct gtatggccgc 420
accaaagaac tgaccagcga actgaaagaa aactttattc gctttagcaa aagcctgggc 480accaaagaac tgaccagcga actgaaagaa aactttattc gctttagcaa aagcctgggc 480
ctgccggaaa accatattgt gtttccggtg ccgattgatc agtgcattga tggc 534ctgccggaaa accatattgt gtttccggtg ccgattgatc agtgcattga tggc 534
<210> 99<210> 99
<211> 456<211> 456
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 99<400> 99
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180
aaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240aaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240
gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300
tgcgatgggt ctcctgttcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360tgcgatgggt ctcctgttcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct cccagg 456
<210> 100<210> 100
<211> 456<211> 456
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 100<400> 100
acctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60acctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60
gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180
agagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgacgg cggtaaacat 240agagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgacgg cggtaaacat 240
gatgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300gatgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300
tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccga gaacaacctg 360tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccga gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaaaccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420gaagccttgg aggactttga gaaaaccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct cccagg 456
<210> 101<210> 101
<211> 456<211> 456
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 101<400> 101
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60
gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180
aacgcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240aacgcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240
gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaga gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaga gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300
tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gggaccccga gaacaacctg 360tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gggaccccga gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaaaccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatt 420gaagccttgg aggactttga gaaaaccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatt 420
ctcattccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456ctcattccca ggcagagcga aaccagctct cccagg 456
<210> 102<210> 102
<211> 456<211> 456
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 102<400> 102
gtctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60gtctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60
gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180
agagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240agagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240
gttgcctata tcattcgcag ccatgtggaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300gttgcctata tcattcgcag ccatgtggaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300
tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccga gaacaacctg 360tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccga gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaaaccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420gaagccttgg aggactttga gaaaaccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct cccagg 456
<210> 103<210> 103
<211> 456<211> 456
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 103<400> 103
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60
gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gtctaccctt 120gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gtctaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180
aaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240aaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240
gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300
tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagatcga aaccagctct ccaggg 456ctcatcccca ggcagatcga aaccagctct ccagg 456
<210> 104<210> 104
<211> 456<211> 456
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 104<400> 104
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60
gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc tgaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180gaaggcggca atctggaggc tgaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180
aaagcagtgt tagagaaggc agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240aaagcagtgt tagagaaggc agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240
gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300
tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaaaccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420gaagccttgg aggactttga gaaaaccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca gtcagatcga aaccagctct ccaggg 456ctcatcccca gtcagatcga aaccagctct ccagg 456
<210> 105<210> 105
<211> 456<211> 456
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 105<400> 105
acctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60acctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc gatgacggtg 60
gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120gatgaggggt gtcgtccttg gaatatattt tcagttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaagacggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180gaagacggca atctggaggc taaggtcacc atggcaatag atgggccggc acaggaggtg 180
aaagcagtgt tagagaaggc agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240aaagcagtgt tagagaaggc agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240
gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgtg 300
tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360tgcgatgggt ctcctgttcc gggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagatcga aaccagctct ccaggg 456ctcatcccca ggcagatcga aaccagctct ccagg 456
<210> 106<210> 106
<211> 534<211> 534
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 106<400> 106
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaag tggtatgtgg taggtcaggc agggaatatc 120aacttccagg acaaccaatt ccatgggaag tggtatgtgg taggtcaggc agggaatatc 120
aaactcagag aagacaaaga cccgaacaag atgatggcca ccatctatga gctgaaagaa 180aaactcagag aagacaaaga cccgaacaag atgatggcca ccatctatga gctgaaagaa 180
gacaagagct acaatgtcac cggtgtcact tttgacgaca agaagtgtac ttacgctatc 240gacaagagct acaatgtcac cggtgtcact tttgacgaca agaagtgtac ttacgctatc 240
tctacttttg ttccaggttc ccagccaggc gagttcacgc tgggcaaaat taagagtttc 300tctacttttg ttccaggttc ccagccaggc gagttcacgc tgggcaaaat taagagtttc 300
cctggacata cgagttctct cgtccgagtg gtgagcacca actacaacca gcatgctatg 360cctggacata cgagttctct cgtccgagtg gtgagcacca actacaacca gcatgctatg 360
gtgttcttca agttcgtttt ccaaaacagg gaggaattct acatcaccct ctacgggaga 420gtgttcttca agttcgtttt ccaaaacagg gaggaattct acatcaccct ctacggggaga 420
accaaggagc tgacttcgga actaaaggag aacttcatcc gcttctccaa atctctgggc 480accaaggagc tgacttcgga actaaaggag aacttcatcc gcttctccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534
<210> 107<210> 107
<211> 534<211> 534
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 107<400> 107
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120
aggctgcgtg aggataagga tccgattaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180aggctgcgtg aggataagga tccgattaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat atgacgtcac catggtgaag tttgatgata agaaatgcat gtacgatatt 240gataaatcat atgacgtcac catggtgaag tttgatgata agaaatgcat gtacgatatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300
ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534
<210> 108<210> 108
<211> 534<211> 534
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 108<400> 108
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120
aggctgcgtg aggataagga tccgaataaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180aggctgcgtg aggataagga tccgaataaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat atgacgtcac cgcggtggcg tttgatgata agaaatgcac gtacgatatt 240gataaatcat atgacgtcac cgcggtggcg tttgatgata agaaatgcac gtacgatatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300
ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534
<210> 109<210> 109
<211> 534<211> 534
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 109<400> 109
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120
aagctgcgtg aggataagga tccgaataaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180aagctgcgtg aggataagga tccgaataaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat atgacgtcac cgcggtggcg tttgatgata agaaatgcac gtacgatatt 240gataaatcat atgacgtcac cgcggtggcg tttgatgata agaaatgcac gtacgatatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300
ccgggccata catcatcttt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ccgggccata catcatcttt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534
<210> 110<210> 110
<211> 525<211> 525
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 110<400> 110
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120
aagctgcgtg aggatagtaa aatgatggcg accatttacg agttgaaaga agataaatca 180aagctgcgtg aggatagtaa aatgatggcg accatttacg agttgaaaga agataaatca 180
tatgacgtca ccggtgtgag ttttgatgat aagaaatgca cgtacgctat tatgaccttt 240tatgacgtca ccggtgtgag ttttgatgat aagaaatgca cgtacgctat tatgaccttt 240
gtgccgggga gccagccggg cgagtttact ttaggcaaga ttaaaagttt tccgggccat 300gtgccgggga gccagccggg cgagtttact ttaggcaaga ttaaaagttt tccgggccat 300
acatcatcgt tggtccgcgt cgtgagcacc aactacaacc agcatgccat ggtgttcttc 360acatcatcgt tggtccgcgt cgtgagcacc aactacaacc agcatgccat ggtgttcttc 360
aagtttgtgt ttcagaaccg cgaggagttt tatatcacac tgtacgggcg cacgaaagaa 420aagtttgtgt ttcagaaccg cgaggagttt tatatcacac tgtacgggcg cacgaaagaa 420
ctgacaagcg agctgaagga aaattttatc cgcttttcca aatctctggg cctccctgaa 480ctgacaagcg agctgaagga aaattttatc cgcttttcca aatctctggg cctccctgaa 480
aaccacatcg tcttccctgt cccaatcgac cagtgtatcg acggc 525aaccacatcg tcttccctgt cccaatcgac cagtgtatcg acggc 525
<210> 111<210> 111
<211> 534<211> 534
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 111<400> 111
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120
aagctgcgtg aggataagga tccggttaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180aagctgcgtg aggataagga tccggttaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat atgacgtcac cggggtgacg tttgatgata agaaatgcag gtacgatatt 240gataaatcat atgacgtcac cggggtgacg tttgatgata agaaatgcag gtacgatatt 240
tcgacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt ttggcaagat taaaagtttt 300tcgacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt ttggcaagat taaaagtttt 300
ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534
<210> 112<210> 112
<211> 534<211> 534
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 112<400> 112
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120
aggctgcgtg aggataagga tccgcataaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180aggctgcgtg aggataagga tccgcataaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat atgacgtcac cggggtgact tttgatgata agaaatgcac gtacgctatt 240gataaatcat atgacgtcac cggggtgact tttgatgata agaaatgcac gtacgctatt 240
tcgacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300tcgacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300
ccgggccata catcatcttt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ccgggccata catcatcttt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534
<210> 113<210> 113
<211> 534<211> 534
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 113<400> 113
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120
aagctgcgtg aggataagga tccgaataaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180aagctgcgtg aggataagga tccgaataaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat atgacgtcac cggggtgact tttgatgata agaaatgcac gtacgctatt 240gataaatcat atgacgtcac cggggtgact tttgatgata agaaatgcac gtacgctatt 240
tctacccttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt ttggcaagat taaaagtttt 300tctacccttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt ttggcaagat taaaagtttt 300
ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534
<210> 114<210> 114
<211> 534<211> 534
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 114<400> 114
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtacgttg tcgggcaggc cggaaatatt 120
aggctgcgtg aggataagga tccgtctaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180aggctgcgtg aggataagga tccgtctaaa atgatggcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat atgacgtcac cgctgtgacg tttgatgata agaaatgcaa ttacgctatt 240gataaatcat atgacgtcac cgctgtgacg tttgatgata agaaatgcaa ttacgctatt 240
tctacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300tctacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcaagat taaaagtttt 300
ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ccgggccata catcatcgtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca agtttgtgtt tcagaaccgc gaggagtttt atatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534
<210> 115<210> 115
<211> 534<211> 534
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 115<400> 115
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120aacttccagg acaaccaatt ccatgggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgagcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgagcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcttcat taaaagtgac 300tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcttcat taaaagtgac 300
ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534
<210> 116<210> 116
<211> 535<211> 535
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 116<400> 116
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgagcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgagcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat tagaagtgac 300tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat tagaagtgac 300
ctgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ctgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 117<210> 117
<211> 535<211> 535
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 117<400> 117
caggactcca cctcagacct gatccctgcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatccctgcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg actaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120aacttccagg actaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg cttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg cttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240
cagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtctactt taggcttcat taaaagtgac 300cagacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtctactt taggcttcat taaaagtgac 300
ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 118<210> 118
<211> 535<211> 535
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 118<400> 118
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca acacatcata 240gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca acacatcata 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagttaactt taggcttcat taaaagtgac 300tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagttaactt taggcttcat taaaagtgac 300
ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 119<210> 119
<211> 535<211> 535
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 119<400> 119
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acgaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120aacttccagg acgaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgttgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180ctgttgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagttgactt taggcttcat taaaagtgac 300tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagttgactt taggcttcat taaaagtgac 300
ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 120<210> 120
<211> 535<211> 535
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 120<400> 120
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatatcg tgggcatggc cggaaataat 120aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatatcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat taaaagtgac 300tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat taaaagtgac 300
ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 121<210> 121
<211> 535<211> 535
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 121<400> 121
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcgg 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcgg 60
aacttccagg acaaccaatt ccaagggaag tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120aacttccagg acaaccaatt ccaagggaag tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg tggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180ctgctgcgtg tggataagga tccgcacaaa atgggcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagttaactt taggcttcat taaaagtgac 300tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagttaactt taggcttcat taaaagtgac 300
ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgtacttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420gtgtacttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 122<210> 122
<211> 535<211> 535
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 122<400> 122
caggactcca cctcagatct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagatct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgagcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgagcgcga ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcaat 240gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcaat 240
tggccctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcttcat taaaagtgac 300tggccctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcttcat taaaagtgac 300
ctgggcccca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ctgggcccca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 123<210> 123
<211> 535<211> 535
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 123<400> 123
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggtgcga ccatttacga gttgaatgaa 180ctgctgcgtg aggataagga tccgcacaaa atgggtgcga ccatttacga gttgaatgaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg tttctggaca agaaatgcca atacatcatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat taaaagtgac 300tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat taaaagtgac 300
ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca agagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 124<210> 124
<211> 535<211> 535
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> мутеин липокалина<223> lipocalin mutein
<400> 124<400> 124
caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60
aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120aacttccagg acaaccaatt ccaagggaaa tggtatgtcg tgggcatggc cggaaataat 120
ctgctgcgtg atgataagga tccgcacaaa atgagcgcta ccatttacga gttgaaagaa 180ctgctgcgtg atgataagga tccgcacaaa atgagcgcta ccatttacga gttgaaagaa 180
gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg ttactggaca agaaatgcca ttacatcatt 240gataaatcat ataacgtcac cgacgtgatg ttactggaca agaaatgcca ttacatcatt 240
tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat taaaagtgac 300tggacctttg tgccggggag ccagccgggc gagcttactt taggcttcat taaaagtgac 300
ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360ccgggccaca catcatactt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360
gtgttcttca aaagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420gtgttcttca aaagcgtgat ccagaaccgc gagtggtttg gaatcacact gtacgggcgc 420
acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480
ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggca 535
<210> 125<210> 125
<211> 360<211> 360
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область тяжелой цепи антитела<223> antibody heavy chain variable region
<400> 125<400> 125
caggtgcaac tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagaa cctgtccatt 60caggtgcaac tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagaa cctgtccatt 60
acctgcactg tctctgggtt ctcattaagc aactatgata taagctggat tcgccagcca 120acctgcactg tctctgggtt ctcattaagc aactatgata taagctggat tcgccagcca 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctcggagta atatggactg gtggagccac aaattataat 180caggaaagg gtctggagtg gctcggagta atatggactg gtggagccac aaattataat 180
tcagctttca tgtccagact gagcatcagt agggacaact ccaagagcca agttttctta 240tcagctttca tgtccagact gagcatcagt agggacaact ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatatatt actgtgtgag agattcgaac 300aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatatatt actgtgtgag agattcgaac 300
tataggtacg acgagccgtt tacttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360tataggtacg acgagccgtt tacttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360
<210> 126<210> 126
<211> 360<211> 360
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область тяжелой цепи антитела<223> antibody heavy chain variable region
<400> 126<400> 126
caggtccagc tgcaggagtc aggccccggc ctggtgaagc ccagtgagaa cctgtcaatc 60caggtccagc tgcaggagtc aggccccggc ctggtgaagc ccagtgagaa cctgtcaatc 60
acctgcacag tctctggctt ctcactgagc aattacgaca tcagttggat tcgacagccc 120acctgcacag tctctggctt ctcactgagc aattacgaca tcagttggat tcgacagccc 120
cctggaaagg gcctggaatg gctgggcgtg atctggacag gcggggcaac taactataat 180cctggaaagg gcctggaatg gctgggcgtg atctggacag gcggggcaac taactataat 180
ccagccttta aaagccggct gaccatttcc agagacaact ccaagtctca ggtgtctctg 240ccagccttta aaagccggct gaccatttcc agagacaact ccaagtctca ggtgtctctg 240
aaaatgagct ccctgcaggc cgctgatacc gctgtgtact attgtgtcag ggacagcaat 300aaaatgagct ccctgcaggc cgctgatacc gctgtgtact attgtgtcag ggacagcaat 300
taccgctatg atgagccctt cacatactgg gggcagggaa ctctggtgac cgtctctagt 360taccgctatg atgagccctt cacatactgg gggcagggaa ctctggtgac cgtctctagt 360
<210> 127<210> 127
<211> 360<211> 360
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область тяжелой цепи антитела<223> antibody heavy chain variable region
<400> 127<400> 127
caggtccagc tgcaggagtc cggccccggc ctggtgaagc cctccgagac actgtctatc 60caggtccagc tgcaggagtc cggccccggc ctggtgaagc cctccgagac actgtctatc 60
acctgcacag tcagcggctt ctcactgagc aactacgaca tctcctggat tcgacagccc 120acctgcacag tcagcggctt ctcactgagc aactacgaca tctcctggat tcgacagccc 120
cctggaaagg gcctggaatg gctgggcgtg atctggacag gcggggcaac taactataat 180cctggaaagg gcctggaatg gctgggcgtg atctggacag gcggggcaac taactataat 180
ccagccctga aatctcggct gactattagt agagacaact caaagaatca ggtgtccctg 240ccagccctga aatctcggct gactattagt agagacaact caaagaatca ggtgtccctg 240
aaaatgagct ccgtcaccgc cgctgataca gctgtgtact attgtgtcag ggacagcaat 300aaaatgagct ccgtcaccgc cgctgataca gctgtgtact attgtgtcag ggacagcaat 300
taccgctatg atgagccctt tacctactgg gggcagggaa ctctggtgac cgtctctagt 360taccgctatg atgagccctt tacctactgg gggcagggaa ctctggtgac cgtctctagt 360
<210> 128<210> 128
<211> 351<211> 351
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область тяжелой цепи антитела<223> antibody heavy chain variable region
<400> 128<400> 128
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt cgacattaaa gacacctata tccactgggt gaagcagagg 120tcctgcacag cttctggctt cgacattaaa gacacctata tccactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cggacggtaa tactaggtat 180cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cggacggtaa tactaggtat 180
gacccgaagt tccaggacaa gaccactata acaaccgaca catcctccaa cacagcccac 240gacccgaagt tccaggacaa gaccactata acaaccgaca catcctccaa cacagcccac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagaggcctc 300ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagaggcctc 300
ggagcttggt ttgcttcctg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351ggagcttggt ttgcttcctg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 129<210> 129
<211> 372<211> 372
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область тяжелой цепи антитела<223> antibody heavy chain variable region
<400> 129<400> 129
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaagcagagg 120tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgtactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa tactaaatat 180
gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catccgccaa cacagcctac 240gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catccgccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgttc tagaggccct 300ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgttc tagaggccct 300
ccaggaggta tcggcgagta tatctatgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360cccaggaggta tcggcgagta tatctatgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360
accgtctcct ca 372accgtctcct ca 372
<210> 130<210> 130
<211> 318<211> 318
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область легкой цепи антитела<223> antibody light chain variable region
<400> 130<400> 130
gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt 60
ctctcctgca gggccagtca gagcattggc acaaacatac actggtttca gcaaagaaca 120ctctcctgca gggccagtca gagcattggc acaaacatac actggtttca gcaaagaaca 120
aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc 180
aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240aggtttagtg gcagtggatc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240
gaagatattg cagattacta ctgtcaacaa agtaatagct ggccgtacac gttcggaggg 300gaagatattg cagattacta ctgtcaacaa agtaatagct ggccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaata 318gggaccaagc tggaaata 318
<210> 131<210> 131
<211> 321<211> 321
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область легкой цепи антитела<223> antibody light chain variable region
<400> 131<400> 131
gaaatcgtgc tgacacagag ccctgacaca ctgagcgtga ctcccaagga gaaagtcacc 60gaaatcgtgc tgacacagag ccctgacaca ctgagcgtga ctcccaagga gaaagtcacc 60
ctgacatgcc gggcatcaca gagcatcgga acaaacattc actggttcca gcagagacca 120ctgacatgcc gggcatcaca gagcatcgga acaaacattc actggttcca gcagagacca 120
ggccagagcc ccaagctgct gatcaaatac gcctccgaat ctatcagtgg cattccttcc 180ggccagagcc ccaagctgct gatcaaatac gcctccgaat ctatcagtgg cattccttcc 180
cgattctcag gcagcgggtc cggaaccgac tttactctga ccattaactc tgtggaggct 240cgattctcag gcagcgggtc cggaaccgac tttactctga ccattaactc tgtggaggct 240
gaagatgccg ctacatacta ttgccagcag tctaatagtt ggccttatac cttcggccag 300gaagatgccg ctacatacta ttgccagcag tctaatagtt ggccttatac cttcggccag 300
gggacaaagc tggagatcaa a 321gggacaaagc tggagatcaa a 321
<210> 132<210> 132
<211> 321<211> 321
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область легкой цепи антитела<223> antibody light chain variable region
<400> 132<400> 132
gaaatcgtgc tgacacagtc tcctgatacc ctgagcgtga ctcccaagga gaaagtcacc 60gaaatcgtgc tgacacagtc tcctgatacc ctgagcgtga ctcccaagga gaaagtcacc 60
ctgacatgca gggcatcaca gagcatcgga acaaacattc actggttcca gcagaagcca 120ctgacatgca gggcatcaca gagcatcgga acaaacattc actggttcca gcagaagcca 120
ggccagagcc ccaagctgct gatcaaatac gcctccgaat ctattagtgg agtgccttcc 180ggccagagcc ccaagctgct gatcaaatac gcctccgaat ctattagtgg agtgccttcc 180
cgcttctcag gcagcgggtc cggaaccgac tttactctga ccatcaactc tgtggaggct 240cgcttctcag gcagcgggtc cggaaccgac tttactctga ccatcaactc tgtggaggct 240
gaagatgccg ctacatacta ttgccagcag tctaatagtt ggccttatac cttcggccag 300gaagatgccg ctacatacta ttgccagcag tctaatagtt ggccttatac cttcggccag 300
gggacaaagc tggagatcaa a 321gggacaaagc tggagatcaa a 321
<210> 133<210> 133
<211> 318<211> 318
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область легкой цепи антитела<223> antibody light chain variable region
<400> 133<400> 133
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattacc aattccttaa actggtatca gcagaaacca 120atcagttgca gggcaagtca ggacattacc aattccttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatccactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180gatggaactg ttaaactcct gatccactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtcatacgc ttcctccgac gttcggtgga 300gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtcatacgc ttcctccgac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatc 318ggcaccaagc tggaaatc 318
<210> 134<210> 134
<211> 321<211> 321
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> вариабельная область легкой цепи антитела<223> antibody light chain variable region
<400> 134<400> 134
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctaggga acgggtcacc 60
atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120
ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240
gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccacc cacgttcggt 300gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccacc cacgttcggt 300
ggaggcacca agctggaaat c 321ggaggcacca agctggaaat c 321
<210> 135<210> 135
<211> 1350<211> 1350
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> тяжелая цепь антитела<223> antibody heavy chain
<400> 135<400> 135
caggtccagc tgcaagagtc tggccctgga ctggtcaagc cttccgagac actgtccatc 60caggtccagc tgcaagagtc tggccctgga ctggtcaagc cttccgagac actgtccatc 60
acctgtaccg tgtccggctt ctccctgtcc aactacgaca tctcctggat cagacagcct 120acctgtaccg tgtccggctt ctccctgtcc aactacgaca tctcctggat cagacagcct 120
cctggcaaag gcctggaatg gctgggagtg atttggaccg gcggagccac caactacaac 180cctggcaaag gcctggaatg gctgggagtg atttggaccg gcggagccac caactacaac 180
cccgctctga agtcccggct gaccatctcc agagacaact ccaagaacca ggtgtccctg 240cccgctctga agtcccggct gaccatctcc agagacaact ccaagaacca ggtgtccctg 240
aagatgtcct ccgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgcgtgcg ggactccaac 300aagatgtcct ccgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgcgtgcg ggactccaac 300
tacagatacg acgagccctt cacctactgg ggccagggaa cactggtcac cgtgtcctct 360tacagatacg acgagccctt cacctactgg ggccagggaa cactggtcac cgtgtcctct 360
gcttccacca agggaccctc tgtgttccct ctggctcctt ccagcaagtc tacctctggc 420gcttccacca agggaccctc tgtgttccct ctggctcctt ccagcaagtc tacctctggc 420
ggaacagctg ctctgggctg cctggtcaag gactactttc ctgagccagt gaccgtgtct 480ggaacagctg ctctgggctg cctggtcaag gactactttc ctgagccagt gaccgtgtct 480
tggaactctg gcgctctgac atccggcgtg cacacctttc cagctgtgct gcaatcctcc 540tggaactctg gcgctctgac atccggcgtg cacacctttc cagctgtgct gcaatcctcc 540
ggcctgtact ctctgtccag cgtcgtgacc gtgccttcta gctctctggg cacccagacc 600ggcctgtact ctctgtccag cgtcgtgacc gtgccttcta gctctctggg cacccagacc 600
tacatctgca atgtgaacca caagcctagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660tacatctgca atgtgaacca caagcctagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
aagtcctgcg acaagaccca cacctgtcct ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgcc 720aagtcctgcg acaagaccca cacctgtcct ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgcc 720
ccttccgtgt ttctgttccc tccaaagcct aaggacaccc tgatgatctc tcggacccct 780ccttccgtgt ttctgttccc tccaaagcct aaggacaccc tgatgatctc tcggacccct 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct cacgaggatc ccgaagtgaa gttcaattgg 840gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct cacgaggatc ccgaagtgaa gttcaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac 900tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac 900
agcacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 960agcacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgctc ctatcgaaaa gaccatcagc 1020gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgctc ctatcgaaaa gaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagcctag ggaaccccag gtttacacct tgcctccatc tcgggacgag 1080aaggccaagg gccagcctag ggaaccccag gtttacacct tgcctccatc tcgggacgag 1080
ctgacaaaaa atcaggtttc cctgacctgc ctcgtgaagg gattctaccc ctccgatatc 1140ctgacaaaaa atcaggtttc cctgacctgc ctcgtgaagg gattctaccc ctccgatatc 1140
gccgtggaat gggagtctaa tggccagcct gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg 1200gccgtggaat gggagtctaa tggccagcct gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg 1200
ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga cagtggacaa gtccagatgg 1260ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga cagtggacaa gtccagatgg 1260
cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgtctctgtc ccctggcaaa 1350cagaagtccc tgtctctgtc ccctggcaaa 1350
<210> 136<210> 136
<211> 1338<211> 1338
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> тяжелая цепь антитела<223> antibody heavy chain
<400> 136<400> 136
caggtccagc tgcaagagtc tggccctgga ctggtcaagc cttccgagac actgtccatc 60caggtccagc tgcaagagtc tggccctgga ctggtcaagc cttccgagac actgtccatc 60
acctgtaccg tgtccggctt ctccctgtcc aactacgaca tctcctggat cagacagcct 120acctgtaccg tgtccggctt ctccctgtcc aactacgaca tctcctggat cagacagcct 120
cctggcaaag gcctggaatg gctgggagtg atttggaccg gcggagccac caactacaac 180cctggcaaag gcctggaatg gctgggagtg atttggaccg gcggagccac caactacaac 180
cccgctctga agtcccggct gaccatctcc agagacaact ccaagaacca ggtgtccctg 240cccgctctga agtcccggct gaccatctcc agagacaact ccaagaacca ggtgtccctg 240
aagatgtcct ccgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgcgtgcg ggactccaac 300aagatgtcct ccgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgcgtgcg ggactccaac 300
tacagatacg acgagccctt cacctactgg ggccagggaa cactggtcac cgtgtcctct 360tacagatacg acgagccctt cacctactgg ggccagggaa cactggtcac cgtgtcctct 360
gctagcacca aagggccgtc cgtcttcccc ctggccccct gcagccggtc gacgtccgag 420gctagcacca aagggccgtc cgtcttcccc ctggccccct gcagccggtc gacgtccgag 420
tccaccgccg ccctcgggtg cctggtcaag gactacttcc cggagccggt aaccgtgagc 480tccaccgccg ccctcgggtg cctggtcaag gactacttcc cggagccggt aaccgtgagc 480
tggaactccg gcgcgctgac ctccggcgtg cacacgttcc ccgccgtcct gcagtcctcc 540tggaactccg gcgcgctgac ctccggcgtg cacacgttcc ccgccgtcct gcagtcctcc 540
ggcctctact ccctctcgtc cgtcgtcacc gtcccgagca gttccctggg caccaagacc 600ggcctctact ccctctcgtc cgtcgtcacc gtcccgagca gttccctggg caccaagacc 600
tacacgtgca acgtcgacca caagccctcc aacaccaagg tagacaagcg cgtcgagtcc 660tacacgtgca acgtcgacca caagccctcc aacaccaagg tagacaagcg cgtcgagtcc 660
aaatacggcc ccccgtgccc gccctgtccg gcccccgagg ccgcgggcgg cccctcagtg 720aaatacggcc ccccgtgccc gccctgtccg gcccccgagg ccgcgggcgg cccctcagtg 720
ttcctgttcc cgccgaagcc caaggacacc ctgatgatct cgcgcacgcc cgaggtcacg 780ttcctgttcc cgccgaagcc caaggacacc ctgatgatct cgcgcacgcc cgaggtcacg 780
tgcgtggtcg tcgacgtctc acaggaagac cccgaggtgc agttcaactg gtatgtcgac 840tgcgtggtcg tcgacgtctc acaggaagac cccgaggtgc agttcaactg gtatgtcgac 840
ggcgtggagg ttcacaacgc gaagaccaag ccccgggagg agcagttcaa cagcacatac 900ggcgtggagg ttcacaacgc gaagaccaag ccccgggagg agcagttcaa cagcacatac 900
cgggtggtgt cggtcctcac cgtgctgcat caggactggc tgaacggtaa ggagtacaag 960cgggtggtgt cggtcctcac cgtgctgcat caggactggc tgaacggtaa ggagtacaag 960
tgcaaggtgt ccaacaaggg cctcccgagc agcatagaga agaccatctc caaggcgaag 1020tgcaaggtgt ccaacaaggg cctcccgagc agcatagaga agaccatctc caaggcgaag 1020
ggtcagcccc gcgaaccgca ggtgtacacc ctgccgccga gccaggagga gatgacgaag 1080ggtcagcccc gcgaaccgca ggtgtacacc ctgccgccga gccaggagga gatgacgaag 1080
aaccaggtct ccctgacgtg cctggtgaag ggtttctacc cctcggacat cgcggtcgaa 1140aaccaggtct ccctgacgtg cctggtgaag ggtttctacc cctcggacat cgcggtcgaa 1140
tgggaatcga acgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgccgccggt cctggactcc 1200tgggaatcga acgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgccgccggt cctggactcc 1200
gacgggtcct tcttcctgta ctcccggctg accgtagaca agtcgcgctg gcaggagggt 1260gacgggtcct tcttcctgta ctcccggctg accgtagaca agtcgcgctg gcaggagggt 1260
aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctccaca accactacac gcaaaagtcg 1320aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctccaca accactacac gcaaaagtcg 1320
ctctccctgt ccctgggc 1338ctctccctgt ccctggggc 1338
<210> 137<210> 137
<211> 642<211> 642
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> легкая цепь антитела<223> antibody light chain
<400> 137<400> 137
gaaattgtgc tgacccagtc tcctgacaca ctgagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60gaaattgtgc tgacccagtc tcctgacaca ctgagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60
ctgacctgcc gggccagcca gtctatcggc accaacatcc actggttcca gcagaagcct 120ctgacctgcc gggccagcca gtctatcggc accaacatcc actggttcca gcagaagcct 120
ggccagtctc caaagctgct gattaagtac gcctccgagt ccatctccgg cgtgccctct 180ggccagtctc caaagctgct gattaagtac gcctccgagt ccatctccgg cgtgccctct 180
agattttccg gctctggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatcaactc cgtggaagcc 240agattttccg gctctggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatcaactc cgtggaagcc 240
gaggatgccg ctacctacta ctgccagcag tccaactcct ggccttacac ctttggccag 300gaggatgccg ctacctacta ctgccagcag tccaactcct ggccttacac ctttggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gcggacagtg gccgctcctt ccgtgttcat cttcccacct 360ggcaccaagc tggaaatcaa gcggacagtg gccgctcctt ccgtgttcat cttcccacct 360
tccgacgagc agctgaagtc cggcacagct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420tccgacgagc agctgaagtc cggcacagct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420
cctcgggaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagtccgg caactcccaa 480cctcgggaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagtccgg caactcccaa 480
gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgtcctc cacactgacc 540gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgtcctc cacactgacc 540
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccatcagggc 600ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccatcagggc 600
ctgtctagcc ctgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gt 642ctgtctagcc ctgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gt 642
<210> 138<210> 138
<211> 1842<211> 1842
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 138<400> 138
gagtccaaat acggcccccc gtgcccgccc tgtccggccc ccgaggccgc gggcggcccc 60gagtccaaat acggcccccc gtgcccgccc tgtccggccc ccgaggccgc gggcggcccc 60
tcagtgttcc tgttcccgcc gaagcccaag gacaccctga tgatctcgcg cacgcccgag 120tcagtgttcc tgttcccgcc gaagcccaag gacaccctga tgatctcgcg cacgcccgag 120
gtcacgtgcg tggtcgtcga cgtctcacag gaagaccccg aggtgcagtt caactggtat 180gtcacgtgcg tggtcgtcga cgtctcacag gaagaccccg aggtgcagtt caactggtat 180
gtcgacggcg tggaggttca caacgcgaag accaagcccc gggaggagca gttcaacagc 240gtcgacggcg tggaggttca caacgcgaag accaagcccc gggaggagca gttcaacagc 240
acataccggg tggtgtcggt cctcaccgtg ctgcatcagg actggctgaa cggtaaggag 300acataccggg tggtgtcggt cctcaccgtg ctgcatcagg actggctgaa cggtaaggag 300
tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctc ccgagcagca tagagaagac catctccaag 360tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctc ccgagcagca tagagaagac catctccaag 360
gcgaagggtc agccccgcga accgcaggtg tacaccctgc cgccgagcca ggaggagatg 420gcgaagggtc agccccgcga accgcaggtg tacaccctgc cgccgagcca ggaggatg 420
acgaagaacc aggtctccct gacgtgcctg gtgaagggtt tctacccctc ggacatcgcg 480acgaagaacc aggtctccct gacgtgcctg gtgaagggtt tctacccctc ggacatcgcg 480
gtcgaatggg aatcgaacgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc gccggtcctg 540gtcgaatggg aatcgaacgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc gccggtcctg 540
gactccgacg ggtccttctt cctgtactcc cggctgaccg tagacaagtc gcgctggcag 600gactccgacg ggtccttctt cctgtactcc cggctgaccg tagacaagtc gcgctggcag 600
gagggtaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tccacaacca ctacacgcaa 660gagggtaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tccacaacca ctacacgcaa 660
aagtcgctct ccctgtccct gggcggaggc ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc 720aagtcgctct ccctgtccct gggcggaggc ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc 720
ggaggttctc aggactctac ctccgatctg atccccgctc ctccactgtc taaggtgcca 780ggaggttctc aggactctac ctccgatctg atccccgctc ctccactgtc taaggtgcca 780
ctgcagcaga acttccagga caaccagttc cacggcaagt ggtacgtcgt cggccaggcc 840ctgcagcaga acttccagga caaccagttc cacggcaagt ggtacgtcgt cggccaggcc 840
ggaaacatca gactgagaga ggacaaggac cccatcaaga tgatggctac catctacgag 900ggaaacatca gactgagaga ggacaaggac cccatcaaga tgatggctac catctacgag 900
ctgaaagagg ataagtccta cgacgtcacc atggtcaagt tcgacgacaa aaagtgtatg 960ctgaaagagg ataagtccta cgacgtcacc atggtcaagt tcgacgacaa aaagtgtatg 960
tacgacatct ggaccttcgt gcccggctct cagcctggcg agtttaccct gggcaagatc 1020tacgacatct ggaccttcgt gcccggctct cagcctggcg agtttaccct gggcaagatc 1020
aagagcttcc ccggccacac ctcttctctc gtgcgtgtgg tgtccaccaa ctacaaccag 1080aagagcttcc ccggccacac ctcttctctc gtgcgtgtgg tgtccaccaa ctacaaccag 1080
cacgccatgg tgttcttcaa gttcgtgttc cagaaccggg aagagttcta catcaccctg 1140cacgccatgg tgttcttcaa gttcgtgttc cagaaccggg aagagttcta catcaccctg 1140
tacggccgga ccaaagagct gacctccgaa ctgaaagaga acttcatccg gttctccaag 1200tacggccgga ccaaagagct gacctccgaa ctgaaagaga acttcatccg gttctccaag 1200
agcctgggcc tgccagagaa ccacatcgtg tttccagtgc ctatcgacca gtgcatcgat 1260agcctgggcc tgccagagaa ccacatcgtg tttccagtgc ctatcgacca gtgcatcgat 1260
ggcggaggcg gaggatctgg tggtggtgga tctggcggcg gaggttctca ggactctacc 1320ggcggaggcg gaggatctgg tggtggtgga tctggcggcg gaggttctca ggactctacc 1320
tccgatctga tccccgctcc tccactgtct aaggtgccac tgcagcagaa cttccaggac 1380tccgatctga tccccgctcc tccactgtct aaggtgccac tgcagcagaa cttccaggac 1380
aaccagttcc acggcaagtg gtacgtcgtc ggccaggccg gaaacatcag actgagagag 1440aaccagttcc acggcaagtg gtacgtcgtc ggccaggccg gaaacatcag actgagagag 1440
gacaaggacc ccatcaagat gatggctacc atctacgagc tgaaagagga taagtcctac 1500gacaaggacc ccatcaagat gatggctacc atctacgagc tgaaagagga taagtcctac 1500
gacgtcacca tggtcaagtt cgacgacaaa aagtgtatgt acgacatctg gaccttcgtg 1560gacgtcacca tggtcaagtt cgacgacaaa aagtgtatgt acgacatctg gaccttcgtg 1560
cccggctctc agcctggcga gtttaccctg ggcaagatca agagcttccc cggccacacc 1620cccggctctc agcctggcga gtttaccctg ggcaagatca agagcttccc cggccacacc 1620
tcttctctcg tgcgtgtggt gtccaccaac tacaaccagc acgccatggt gttcttcaag 1680tcttctctcg tgcgtgtggt gtccaccaac tacaaccagc acgccatggt gttcttcaag 1680
ttcgtgttcc agaaccggga agagttctac atcaccctgt acggccggac caaagagctg 1740ttcgtgttcc agaaccggga agagttctac atcaccctgt acggccggac caaagagctg 1740
acctccgaac tgaaagagaa cttcatccgg ttctccaaga gcctgggcct gccagagaac 1800acctccgaac tgaaagagaa cttcatccgg ttctccaaga gcctgggcct gccagagaac 1800
cacatcgtgt tccctgtgcc tatcgatcag tgtatcgacg gc 1842cacatcgtgt tccctgtgcc tatcgatcag tgtatcgacg gc 1842
<210> 139<210> 139
<211> 1266<211> 1266
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 139<400> 139
gagagcaagt acggccctcc ctgccccccc tgccctgccc ctgaagccgc gggcggacct 60gagagcaagt acggccctcc ctgccccccc tgccctgccc ctgaagccgc gggcggacct 60
tccgtgtttc tgttcccccc gaagcccaag gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa 120tccgtgtttc tgttcccccc gaagcccaag gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa 120
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccag gaagatccag aggtgcagtt caactggtat 180gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccag gaagatccag aggtgcagtt caactggtat 180
gttgacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gttcaactcc 240gttgacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gttcaactcc 240
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagag 300acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagag 300
tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg ccctccagca tcgaaaagac catctccaag 360tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg ccctccagca tcgaaaagac catctccaag 360
gccaagggcc agccccgcga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca ggaagagatg 420gccaagggcc agccccgcga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca ggaagagatg 420
accaagaacc aggtgtccct gacctgtctg gtgaaaggct tctacccctc cgacattgcc 480accaagaacc aggtgtccct gacctgtctg gtgaaaggct tctacccctc cgacattgcc 480
gtggaatggg agtccaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540gtggaatggg agtccaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540
gactccgacg gctccttctt cctgtactct cggctgacag tggataagtc ccggtggcag 600gactccgacg gctccttctt cctgtactct cggctgacag tggataagtc ccggtggcag 600
gaaggcaatg tgttctcctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctatacccag 660gaaggcaatg tgttctcctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctatacccag 660
aagtccctgt ccctgagcct gggcaagggc ggcggcggat ccggcggcgg cggctctggc 720aagtccctgt ccctgagcct gggcaagggc ggcggcggat ccggcggcgg cggctctggc 720
ggcggcggct ctcaggactc tacatccgat ctgatccccg ctcctccact gtccaaggtg 780ggcggcggct ctcaggactc tacatccgat ctgatccccg ctcctccact gtccaaggtg 780
cctctgcaac agaactttca ggacaaccag tttcatggca agtggtatgt ggtgggccag 840cctctgcaac agaactttca ggacaaccag tttcatggca agtggtatgt ggtgggccag 840
gctggcaata tcagactgag ggaggataag gaccctatca agatgatggc cacaatctac 900gctggcaata tcagactgag ggaggataag gaccctatca agatgatggc cacaatctac 900
gagctgaagg aggacaagtc ttacgatgtg acaatggtga agttcgacga caagaagtgc 960gagctgaagg aggacaagtc ttacgatgtg acaatggtga agttcgacga caagaagtgc 960
atgtacgaca tctggacatt cgtgccaggc tcccagcctg gcgagtttac actgggcaag 1020atgtacgaca tctggacatt cgtgccaggc tcccagcctg gcgagtttac actgggcaag 1020
atcaagtcct tcccaggcca tacctccagc ctggtgcggg tggtgtccac aaactataac 1080atcaagtcct tcccaggcca tacctccagc ctggtgcggg tggtgtccac aaactataac 1080
cagcatgcta tggtgttttt caagttcgtg ttccagaatc gggaggagtt ctacatcacc 1140cagcatgcta tggtgttttt caagttcgtg ttccagaatc gggaggagtt ctacatcacc 1140
ctgtacggcc ggaccaagga gctgacatct gagctgaagg agaacttcat cagattttcc 1200ctgtacggcc ggaccaagga gctgacatct gagctgaagg agaacttcat cagattttcc 1200
aagagcctgg gcctgcctga gaaccacatc gtgtttcccg tgccaatcga tcagtgtatc 1260aagagcctgg gcctgcctga gaaccacatc gtgtttcccg tgccaatcga tcagtgtatc 1260
gacggc 1266gacggc 1266
<210> 140<210> 140
<211> 1917<211> 1917
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 140<400> 140
caggtccagc tgcaagagtc tggccctgga ctggtcaagc cttccgagac actgtccatc 60caggtccagc tgcaagagtc tggccctgga ctggtcaagc cttccgagac actgtccatc 60
acctgtaccg tgtccggctt ctccctgtcc aactacgaca tctcctggat cagacagcct 120acctgtaccg tgtccggctt ctccctgtcc aactacgaca tctcctggat cagacagcct 120
cctggcaaag gcctggaatg gctgggagtg atttggaccg gcggagccac caactacaac 180cctggcaaag gcctggaatg gctgggagtg atttggaccg gcggagccac caactacaac 180
cccgctctga agtcccggct gaccatctcc agagacaact ccaagaacca ggtgtccctg 240cccgctctga agtcccggct gaccatctcc agagacaact ccaagaacca ggtgtccctg 240
aagatgtcct ccgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgcgtgcg ggactccaac 300aagatgtcct ccgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgcgtgcg ggactccaac 300
tacagatacg acgagccctt cacctactgg ggccagggaa cactggtcac cgtgtcctct 360tacagatacg acgagccctt cacctactgg ggccagggaa cactggtcac cgtgtcctct 360
gctagcacca aagggccgtc cgtcttcccc ctggccccct gcagccggtc gacgtccgag 420gctagcacca aagggccgtc cgtcttcccc ctggccccct gcagccggtc gacgtccgag 420
tccaccgccg ccctcgggtg cctggtcaag gactacttcc cggagccggt aaccgtgagc 480tccaccgccg ccctcgggtg cctggtcaag gactacttcc cggagccggt aaccgtgagc 480
tggaactccg gcgcgctgac ctccggcgtg cacacgttcc ccgccgtcct gcagtcctcc 540tggaactccg gcgcgctgac ctccggcgtg cacacgttcc ccgccgtcct gcagtcctcc 540
ggcctctact ccctctcgtc cgtcgtcacc gtcccgagca gttccctggg caccaagacc 600ggcctctact ccctctcgtc cgtcgtcacc gtcccgagca gttccctggg caccaagacc 600
tacacgtgca acgtcgacca caagccctcc aacaccaagg tagacaagcg cgtcgagtcc 660tacacgtgca acgtcgacca caagccctcc aacaccaagg tagacaagcg cgtcgagtcc 660
aaatacggcc ccccgtgccc gccctgtccg gcccccgagg ccgcgggcgg cccctcagtg 720aaatacggcc ccccgtgccc gccctgtccg gcccccgagg ccgcgggcgg cccctcagtg 720
ttcctgttcc cgccgaagcc caaggacacc ctgatgatct cgcgcacgcc cgaggtcacg 780ttcctgttcc cgccgaagcc caaggacacc ctgatgatct cgcgcacgcc cgaggtcacg 780
tgcgtggtcg tcgacgtctc acaggaagac cccgaggtgc agttcaactg gtatgtcgac 840tgcgtggtcg tcgacgtctc acaggaagac cccgaggtgc agttcaactg gtatgtcgac 840
ggcgtggagg ttcacaacgc gaagaccaag ccccgggagg agcagttcaa cagcacatac 900ggcgtggagg ttcacaacgc gaagaccaag ccccgggagg agcagttcaa cagcacatac 900
cgggtggtgt cggtcctcac cgtgctgcat caggactggc tgaacggtaa ggagtacaag 960cgggtggtgt cggtcctcac cgtgctgcat caggactggc tgaacggtaa ggagtacaag 960
tgcaaggtgt ccaacaaggg cctcccgagc agcatagaga agaccatctc caaggcgaag 1020tgcaaggtgt ccaacaaggg cctcccgagc agcatagaga agaccatctc caaggcgaag 1020
ggtcagcccc gcgaaccgca ggtgtacacc ctgccgccga gccaggagga gatgacgaag 1080ggtcagcccc gcgaaccgca ggtgtacacc ctgccgccga gccaggagga gatgacgaag 1080
aaccaggtct ccctgacgtg cctggtgaag ggtttctacc cctcggacat cgcggtcgaa 1140aaccaggtct ccctgacgtg cctggtgaag ggtttctacc cctcggacat cgcggtcgaa 1140
tgggaatcga acgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgccgccggt cctggactcc 1200tgggaatcga acgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgccgccggt cctggactcc 1200
gacgggtcct tcttcctgta ctcccggctg accgtagaca agtcgcgctg gcaggagggt 1260gacgggtcct tcttcctgta ctcccggctg accgtagaca agtcgcgctg gcaggagggt 1260
aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctccaca accactacac gcaaaagtcg 1320aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctccaca accactacac gcaaaagtcg 1320
ctctccctgt ccctgggcgg aggcggagga tctggtggtg gtggatctgg cggcggaggt 1380ctctccctgt ccctgggcgg aggcggagga tctggtggtg gtggatctgg cggcggaggt 1380
tctcaggact ctacctccga tctgatcccc gctcctccac tgtctaaggt gccactgcag 1440tctcaggact ctacctccga tctgatcccc gctcctccac tgtctaaggt gccactgcag 1440
cagaacttcc aggacaacca gttccacggc aagtggtacg tcgtcggcca ggccggaaac 1500cagaacttcc aggacaacca gttccacggc aagtggtacg tcgtcggcca ggccggaaac 1500
atcagactga gagaggacaa ggaccccatc aagatgatgg ctaccatcta cgagctgaaa 1560atcagactga gagaggacaa ggaccccatc aagatgatgg ctaccatcta cgagctgaaa 1560
gaggataagt cctacgacgt caccatggtc aagttcgacg acaaaaagtg tatgtacgac 1620gaggataagt cctacgacgt caccatggtc aagttcgacg acaaaaagtg tatgtacgac 1620
atctggacct tcgtgcccgg ctctcagcct ggcgagttta ccctgggcaa gatcaagagc 1680atctggacct tcgtgcccgg ctctcagcct ggcgagttta ccctgggcaa gatcaagagc 1680
ttccccggcc acacctcttc tctcgtgcgt gtggtgtcca ccaactacaa ccagcacgcc 1740ttccccggcc acacctcttc tctcgtgcgt gtggtgtcca ccaactacaa ccagcacgcc 1740
atggtgttct tcaagttcgt gttccagaac cgggaagagt tctacatcac cctgtacggc 1800atggtgttct tcaagttcgt gttccagaac cgggaagagt tctacatcac cctgtacggc 1800
cggaccaaag agctgacctc cgaactgaaa gagaacttca tccggttctc caagagcctg 1860cggaccaaag agctgacctc cgaactgaaa gagaacttca tccggttctc caagagcctg 1860
ggcctgccag agaaccacat cgtgttccct gtgcctatcg accagtgcat cgatggc 1917ggcctgccag agaaccacat cgtgttccct gtgcctatcg accagtgcat cgatggc 1917
<210> 141<210> 141
<211> 1221<211> 1221
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 141<400> 141
gaaattgtgc tgacccagtc tcctgacaca ctgagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60gaaattgtgc tgacccagtc tcctgacaca ctgagcgtga cccctaaaga aaaagtgacc 60
ctgacctgcc gggccagcca gtctatcggc accaacatcc actggttcca gcagaagcct 120ctgacctgcc gggccagcca gtctatcggc accaacatcc actggttcca gcagaagcct 120
ggccagtctc caaagctgct gattaagtac gcctccgagt ccatctccgg cgtgccctct 180ggccagtctc caaagctgct gattaagtac gcctccgagt ccatctccgg cgtgccctct 180
agattttccg gctctggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatcaactc cgtggaagcc 240agattttccg gctctggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatcaactc cgtggaagcc 240
gaggatgccg ctacctacta ctgccagcag tccaactcct ggccttacac ctttggccag 300gaggatgccg ctacctacta ctgccagcag tccaactcct ggccttacac ctttggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gcggacagtg gccgctcctt ccgtgttcat cttcccacct 360ggcaccaagc tggaaatcaa gcggacagtg gccgctcctt ccgtgttcat cttcccacct 360
tccgacgagc agctgaagtc cggcacagct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420tccgacgagc agctgaagtc cggcacagct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420
cctcgggaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagtccgg caactcccaa 480cctcgggaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagtccgg caactcccaa 480
gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgtcctc cacactgacc 540gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctaca gcctgtcctc cacactgacc 540
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccatcagggc 600ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccatcagggc 600
ctgtctagcc ctgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gtggtggcgg aggatctggc 660ctgtctagcc ctgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gtggtggcgg aggatctggc 660
ggaggtggaa gcggcggagg cggatctcaa gactctacct ccgatctgat ccccgctcct 720ggaggtggaa gcggcggagg cggatctcaa gactctacct ccgatctgat ccccgctcct 720
ccactgtcta aggtgccact gcagcagaac ttccaggaca accagttcca cggcaagtgg 780ccactgtcta aggtgccact gcagcagaac ttccaggaca accagttcca cggcaagtgg 780
tacgtcgtcg gccaggccgg aaacatcaga ctgagagagg acaaggaccc catcaagatg 840tacgtcgtcg gccaggccgg aaacatcaga ctgagagagg acaaggaccc catcaagatg 840
atggctacca tctacgagct gaaagaggat aagtcctacg acgtcaccat ggtcaagttc 900atggctacca tctacgagct gaaagaggat aagtcctacg acgtcaccat ggtcaagttc 900
gacgacaaaa agtgtatgta cgacatctgg accttcgtgc ccggctctca gcctggcgag 960gacgacaaaa agtgtatgta cgacatctgg accttcgtgc ccggctctca gcctggcgag 960
tttaccctgg gcaagatcaa gagcttcccc ggccacacct cttctctcgt gcgtgtggtg 1020tttaccctgg gcaagatcaa gagcttcccc ggccacacct cttctctcgt gcgtgtggtg 1020
tccaccaact acaaccagca cgccatggtg ttcttcaagt tcgtgttcca gaaccgggaa 1080tccaccaact acaaccagca cgccatggtg ttcttcaagt tcgtgttcca gaaccgggaa 1080
gagttctaca tcaccctgta cggccggacc aaagagctga cctccgaact gaaagagaac 1140gagttctaca tcaccctgta cggccggacc aaagagctga cctccgaact gaaagagaac 1140
ttcatccggt tctccaagag cctgggcctg cctgagaacc acatcgtgtt ccctgtgcct 1200ttcatccggt tctccaagag cctgggcctg cctgagaacc acatcgtgtt ccctgtgcct 1200
atcgaccagt gcatcgatgg c 1221atcgaccagt gcatcgatgg c 1221
<210> 142<210> 142
<211> 1917<211> 1917
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 142<400> 142
caggactcca cctccgatct gatccctgct cctccactgt ctaaggtgcc cctgcagcag 60caggactcca cctccgatct gatccctgct cctccactgt ctaaggtgcc cctgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540
ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc ggaggttctc aggtccagct gcaagagtct 600ggaggatctg gtggtggtgg atctggcggc ggaggttctc aggtccagct gcaagagtct 600
ggccctggac tggtcaagcc ttccgagaca ctgtccatca cctgtaccgt gtccggcttc 660ggccctggac tggtcaagcc ttccgagaca ctgtccatca cctgtaccgt gtccggcttc 660
tccctgtcca actacgacat ctcctggatc agacagcctc ctggcaaagg cctggaatgg 720tccctgtcca actacgacat ctcctggatc agacagcctc ctggcaaagg cctggaatgg 720
ctgggagtga tttggaccgg cggagccacc aactacaacc ccgctctgaa gtcccggctg 780ctggggagtga tttggaccgg cggagccacc aactacaacc ccgctctgaa gtcccggctg 780
accatctcca gagacaactc caagaaccag gtgtccctga agatgtcctc cgtgaccgct 840accatctcca gagacaactc caagaaccag gtgtccctga agatgtcctc cgtgaccgct 840
gctgataccg ccgtgtacta ctgcgtgcgg gactccaact acagatacga cgagcccttc 900gctgataccg ccgtgtacta ctgcgtgcgg gactccaact acagatacga cgagcccttc 900
acctactggg gccagggaac actggtcacc gtgtcctctg ctagcaccaa agggccgtcc 960acctactggg gccagggaac actggtcacc gtgtcctctg ctagcaccaa agggccgtcc 960
gtcttccccc tggccccctg cagccggtcg acgtccgagt ccaccgccgc cctcgggtgc 1020gtcttccccc tggccccctg cagccggtcg acgtccgagt ccaccgccgc cctcgggtgc 1020
ctggtcaagg actacttccc ggagccggta accgtgagct ggaactccgg cgcgctgacc 1080ctggtcaagg actacttccc ggagccggta accgtgagct ggaactccgg cgcgctgacc 1080
tccggcgtgc acacgttccc cgccgtcctg cagtcctccg gcctctactc cctctcgtcc 1140tccggcgtgc acacgttccc cgccgtcctg cagtcctccg gcctctactc cctctcgtcc 1140
gtcgtcaccg tcccgagcag ttccctgggc accaagacct acacgtgcaa cgtcgaccac 1200gtcgtcaccg tcccgagcag ttccctgggc accaagacct acacgtgcaa cgtcgaccac 1200
aagccctcca acaccaaggt agacaagcgc gtcgagtcca aatacggccc cccgtgcccg 1260aagccctcca acaccaaggt agacaagcgc gtcgagtcca aatacggccc cccgtgcccg 1260
ccctgtccgg cccccgaggc cgcgggcggc ccctcagtgt tcctgttccc gccgaagccc 1320ccctgtccgg cccccgaggc cgcgggcggc ccctcagtgt tcctgttccc gccgaagccc 1320
aaggacaccc tgatgatctc gcgcacgccc gaggtcacgt gcgtggtcgt cgacgtctca 1380aaggacaccc tgatgatctc gcgcacgccc gaggtcacgt gcgtggtcgt cgacgtctca 1380
caggaagacc ccgaggtgca gttcaactgg tatgtcgacg gcgtggaggt tcacaacgcg 1440caggaagacc ccgaggtgca gttcaactgg tatgtcgacg gcgtggaggt tcacaacgcg 1440
aagaccaagc cccgggagga gcagttcaac agcacatacc gggtggtgtc ggtcctcacc 1500aagaccaagc cccgggagga gcagttcaac agcacatacc gggtggtgtc ggtcctcacc 1500
gtgctgcatc aggactggct gaacggtaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1560gtgctgcatc aggactggct gaacggtaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1560
ctcccgagca gcatagagaa gaccatctcc aaggcgaagg gtcagccccg cgaaccgcag 1620ctcccgagca gcatagagaa gaccatctcc aaggcgaagg gtcagccccg cgaaccgcag 1620
gtgtacaccc tgccgccgag ccaggaggag atgacgaaga accaggtctc cctgacgtgc 1680gtgtacaccc tgccgccgag cccaggagg atgacgaaga accaggtctc cctgacgtgc 1680
ctggtgaagg gtttctaccc ctcggacatc gcggtcgaat gggaatcgaa cgggcagccg 1740ctggtgaagg gtttctaccc ctcggacatc gcggtcgaat gggaatcgaa cgggcagccg 1740
gagaacaact acaagaccac gccgccggtc ctggactccg acgggtcctt cttcctgtac 1800gagaacaact acaagaccac gccgccggtc ctggactccg acgggtcctt cttcctgtac 1800
tcccggctga ccgtagacaa gtcgcgctgg caggagggta acgtgttcag ctgcagcgtg 1860tcccggctga ccgtagacaa gtcgcgctgg caggagggta acgtgttcag ctgcagcgtg 1860
atgcacgagg ccctccacaa ccactacacg caaaagtcgc tctccctgtc cctgggc 1917atgcacgagg ccctccacaa ccactacacg caaaagtcgc tctccctgtc cctgggc 1917
<210> 143<210> 143
<211> 1221<211> 1221
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 143<400> 143
caggattcta cctccgatct gatccccgct cctccactgt ctaaggtgcc cctgcagcag 60caggattcta cctccgatct gatccccgct cctccactgt ctaaggtgcc cctgcagcag 60
aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120aacttccagg acaaccagtt ccacggcaag tggtacgtcg tcggccaggc cggaaacatc 120
agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180agactgagag aggacaagga ccccatcaag atgatggcta ccatctacga gctgaaagag 180
gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240gataagtcct acgacgtcac catggtcaag ttcgacgaca aaaagtgtat gtacgacatc 240
tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300tggaccttcg tgcccggctc tcagcctggc gagtttaccc tgggcaagat caagagcttc 300
cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360cccggccaca cctcttctct cgtgcgtgtg gtgtccacca actacaacca gcacgccatg 360
gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420gtgttcttca agttcgtgtt ccagaaccgg gaagagttct acatcaccct gtacggccgg 420
accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480accaaagagc tgacctccga actgaaagag aacttcatcc ggttctccaa gagcctgggc 480
ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540ctgcctgaga accacatcgt gttccctgtg cctatcgacc agtgcatcga tggcggaggc 540
ggaggatctg gcggaggtgg aagcggaggc ggtggatctg aaattgtgct gacccagtct 600ggaggatctg gcggaggtgg aagcggaggc ggtggatctg aaattgtgct gacccagtct 600
cctgacacac tgagcgtgac ccctaaagaa aaagtgaccc tgacctgccg ggccagccag 660cctgacacac tgagcgtgac ccctaaagaa aaagtgaccc tgacctgccg ggccagccag 660
tctatcggca ccaacatcca ctggttccag cagaagcctg gccagtctcc aaagctgctg 720tctatcggca ccaacatcca ctggttccag cagaagcctg gccagtctcc aaagctgctg 720
attaagtacg cctccgagtc catctccggc gtgccctcta gattttccgg ctctggctct 780attaagtacg cctccgagtc catctccggc gtgccctcta gattttccgg ctctggctct 780
ggcaccgact tcaccctgac catcaactcc gtggaagccg aggatgccgc tacctactac 840ggcaccgact tcaccctgac catcaactcc gtggaagccg aggatgccgc tacctactac 840
tgccagcagt ccaactcctg gccttacacc tttggccagg gcaccaagct ggaaatcaag 900tgccagcagt ccaactcctg gccttacacc tttggccagg gcaccaagct ggaaatcaag 900
cggacagtgg ccgctccttc cgtgttcatc ttcccacctt ccgacgagca gctgaagtcc 960cggacagtgg ccgctccttc cgtgttcatc ttcccacctt ccgacgagca gctgaagtcc 960
ggcacagctt ctgtcgtgtg cctgctgaac aacttctacc ctcgggaagc caaggtgcag 1020ggcacagctt ctgtcgtgtg cctgctgaac aacttctacc ctcgggaagc caaggtgcag 1020
tggaaggtgg acaatgccct gcagtccggc aactcccaag agtctgtgac cgagcaggac 1080tggaaggtgg acaatgccct gcagtccggc aactcccaag agtctgtgac cgagcaggac 1080
tccaaggaca gcacctacag cctgtcctcc acactgaccc tgtccaaggc cgactacgag 1140tccaaggaca gcacctacag cctgtcctcc acactgaccc tgtccaaggc cgactacgag 1140
aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc catcagggcc tgtctagccc tgtgaccaag 1200aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc catcagggcc tgtctagccc tgtgaccaag 1200
tctttcaacc ggggcgagtg t 1221tctttcaacc ggggcgagtg t 1221
<210> 144<210> 144
<211> 2496<211> 2496
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 144<400> 144
caggtccagc tgcaagagtc tggccctgga ctggtcaagc cttccgagac actgtccatc 60caggtccagc tgcaagagtc tggccctgga ctggtcaagc cttccgagac actgtccatc 60
acctgtaccg tgtccggctt ctccctgtcc aactacgaca tctcctggat cagacagcct 120acctgtaccg tgtccggctt ctccctgtcc aactacgaca tctcctggat cagacagcct 120
cctggcaaag gcctggaatg gctgggagtg atttggaccg gcggagccac caactacaac 180cctggcaaag gcctggaatg gctgggagtg atttggaccg gcggagccac caactacaac 180
cccgctctga agtcccggct gaccatctcc agagacaact ccaagaacca ggtgtccctg 240cccgctctga agtcccggct gaccatctcc agagacaact ccaagaacca ggtgtccctg 240
aagatgtcct ccgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgcgtgcg ggactccaac 300aagatgtcct ccgtgaccgc tgctgatacc gccgtgtact actgcgtgcg ggactccaac 300
tacagatacg acgagccctt cacctactgg ggccagggaa cactggtcac cgtgtcctct 360tacagatacg acgagccctt cacctactgg ggccagggaa cactggtcac cgtgtcctct 360
gctagcacca aagggccgtc cgtcttcccc ctggccccct gcagccggtc gacgtccgag 420gctagcacca aagggccgtc cgtcttcccc ctggccccct gcagccggtc gacgtccgag 420
tccaccgccg ccctcgggtg cctggtcaag gactacttcc cggagccggt aaccgtgagc 480tccaccgccg ccctcgggtg cctggtcaag gactacttcc cggagccggt aaccgtgagc 480
tggaactccg gcgcgctgac ctccggcgtg cacacgttcc ccgccgtcct gcagtcctcc 540tggaactccg gcgcgctgac ctccggcgtg cacacgttcc ccgccgtcct gcagtcctcc 540
ggcctctact ccctctcgtc cgtcgtcacc gtcccgagca gttccctggg caccaagacc 600ggcctctact ccctctcgtc cgtcgtcacc gtcccgagca gttccctggg caccaagacc 600
tacacgtgca acgtcgacca caagccctcc aacaccaagg tagacaagcg cgtcgagtcc 660tacacgtgca acgtcgacca caagccctcc aacaccaagg tagacaagcg cgtcgagtcc 660
aaatacggcc ccccgtgccc gccctgtccg gcccccgagg ccgcgggcgg cccctcagtg 720aaatacggcc ccccgtgccc gccctgtccg gcccccgagg ccgcgggcgg cccctcagtg 720
ttcctgttcc cgccgaagcc caaggacacc ctgatgatct cgcgcacgcc cgaggtcacg 780ttcctgttcc cgccgaagcc caaggacacc ctgatgatct cgcgcacgcc cgaggtcacg 780
tgcgtggtcg tcgacgtctc acaggaagac cccgaggtgc agttcaactg gtatgtcgac 840tgcgtggtcg tcgacgtctc acaggaagac cccgaggtgc agttcaactg gtatgtcgac 840
ggcgtggagg ttcacaacgc gaagaccaag ccccgggagg agcagttcaa cagcacatac 900ggcgtggagg ttcacaacgc gaagaccaag ccccgggagg agcagttcaa cagcacatac 900
cgggtggtgt cggtcctcac cgtgctgcat caggactggc tgaacggtaa ggagtacaag 960cgggtggtgt cggtcctcac cgtgctgcat caggactggc tgaacggtaa ggagtacaag 960
tgcaaggtgt ccaacaaggg cctcccgagc agcatagaga agaccatctc caaggcgaag 1020tgcaaggtgt ccaacaaggg cctcccgagc agcatagaga agaccatctc caaggcgaag 1020
ggtcagcccc gcgaaccgca ggtgtacacc ctgccgccga gccaggagga gatgacgaag 1080ggtcagcccc gcgaaccgca ggtgtacacc ctgccgccga gccaggagga gatgacgaag 1080
aaccaggtct ccctgacgtg cctggtgaag ggtttctacc cctcggacat cgcggtcgaa 1140aaccaggtct ccctgacgtg cctggtgaag ggtttctacc cctcggacat cgcggtcgaa 1140
tgggaatcga acgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgccgccggt cctggactcc 1200tgggaatcga acgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgccgccggt cctggactcc 1200
gacgggtcct tcttcctgta ctcccggctg accgtagaca agtcgcgctg gcaggagggt 1260gacgggtcct tcttcctgta ctcccggctg accgtagaca agtcgcgctg gcaggagggt 1260
aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctccaca accactacac gcaaaagtcg 1320aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctccaca accactacac gcaaaagtcg 1320
ctctccctgt ccctgggcgg aggcggagga tctggtggtg gtggatctgg cggcggaggt 1380ctctccctgt ccctgggcgg aggcggagga tctggtggtg gtggatctgg cggcggaggt 1380
tctcaggact ctacctccga tctgatcccc gctcctccac tgtctaaggt gccactgcag 1440tctcaggact ctacctccga tctgatcccc gctcctccac tgtctaaggt gccactgcag 1440
cagaacttcc aggacaacca gttccacggc aagtggtacg tcgtcggcca ggccggaaac 1500cagaacttcc aggacaacca gttccacggc aagtggtacg tcgtcggcca ggccggaaac 1500
atcagactga gagaggacaa ggaccccatc aagatgatgg ctaccatcta cgagctgaaa 1560atcagactga gagaggacaa ggaccccatc aagatgatgg ctaccatcta cgagctgaaa 1560
gaggataagt cctacgacgt caccatggtc aagttcgacg acaaaaagtg tatgtacgac 1620gaggataagt cctacgacgt caccatggtc aagttcgacg acaaaaagtg tatgtacgac 1620
atctggacct tcgtgcccgg ctctcagcct ggcgagttta ccctgggcaa gatcaagagc 1680atctggacct tcgtgcccgg ctctcagcct ggcgagttta ccctgggcaa gatcaagagc 1680
ttccccggcc acacctcttc tctcgtgcgt gtggtgtcca ccaactacaa ccagcacgcc 1740ttccccggcc acacctcttc tctcgtgcgt gtggtgtcca ccaactacaa ccagcacgcc 1740
atggtgttct tcaagttcgt gttccagaac cgggaagagt tctacatcac cctgtacggc 1800atggtgttct tcaagttcgt gttccagaac cgggaagagt tctacatcac cctgtacggc 1800
cggaccaaag agctgacctc cgaactgaaa gagaacttca tccggttctc caagagcctg 1860cggaccaaag agctgacctc cgaactgaaa gagaacttca tccggttctc caagagcctg 1860
ggcctgccag agaaccacat cgtgtttcca gtgcctatcg accagtgcat cgatggcgga 1920ggcctgccag agaaccacat cgtgtttcca gtgcctatcg accagtgcat cgatggcgga 1920
ggcggaggat ctggtggtgg tggatctggc ggcggaggtt ctcaggactc tacctccgat 1980ggcggaggat ctggtggtgg tggatctggc ggcggaggtt ctcaggactc tacctccgat 1980
ctgatccccg ctcctccact gtctaaggtg ccactgcagc agaacttcca ggacaaccag 2040ctgatccccg ctcctccact gtctaaggtg ccactgcagc agaacttcca ggacaaccag 2040
ttccacggca agtggtacgt cgtcggccag gccggaaaca tcagactgag agaggacaag 2100ttccacggca agtggtacgt cgtcggccag gccggaaaca tcagactgag agaggacaag 2100
gaccccatca agatgatggc taccatctac gagctgaaag aggataagtc ctacgacgtc 2160gaccccatca agatgatggc taccatctac gagctgaaag aggataagtc ctacgacgtc 2160
accatggtca agttcgacga caaaaagtgt atgtacgaca tctggacctt cgtgcccggc 2220accatggtca agttcgacga caaaaagtgt atgtacgaca tctggacctt cgtgcccggc 2220
tctcagcctg gcgagtttac cctgggcaag atcaagagct tccccggcca cacctcttct 2280tctcagcctg gcgagtttac cctgggcaag atcaagagct tccccggcca cacctcttct 2280
ctcgtgcgtg tggtgtccac caactacaac cagcacgcca tggtgttctt caagttcgtg 2340ctcgtgcgtg tggtgtccac caactacaac cagcacgcca tggtgttctt caagttcgtg 2340
ttccagaacc gggaagagtt ctacatcacc ctgtacggcc ggaccaaaga gctgacctcc 2400ttccagaacc gggaagagtt ctacatcacc ctgtacggcc ggaccaaaga gctgacctcc 2400
gaactgaaag agaacttcat ccggttctcc aagagcctgg gcctgccaga gaaccacatc 2460gaactgaaag agaacttcat ccggttctcc aagagcctgg gcctgccaga gaaccacatc 2460
gtgttccctg tgcctatcga tcagtgtatc gacggc 2496gtgttccctg tgcctatcga tcagtgtatc gacggc 2496
<210> 145<210> 145
<211> 442<211> 442
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> тяжелая цепь антитела<223> antibody heavy chain
<400> 145<400> 145
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30 20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45 35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60 50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110 100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125 115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140 130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175 165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe
180 185 190 180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205 195 200 205
Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro
210 215 220 210 215 220
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240 225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255 245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270 260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285 275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
290 295 300 290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320 305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335 325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
340 345 350 340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365 355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380 370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400 385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415 405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430 420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 435 440
<210> 146<210> 146
<211> 214<211> 214
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> легкая цепь антитела<223> antibody light chain
<400> 146<400> 146
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
20 25 30 20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45 35 40 45
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60 50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80 65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu
85 90 95 85 90 95
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110 100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125 115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140 130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175 165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190 180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205 195 200 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 210
<210> 147<210> 147
<211> 472<211> 472
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 147<400> 147
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ala Ile Lys Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ala Ile Lys
20 25 30 20 25 30
Pro Ile Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val Pro Ile Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Thr Thr Thr Ser Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Glu Ser Val Lys Ser Thr Thr Thr Ser Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60 50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95 85 90 95
Val Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Val Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly
100 105 110 100 105 110
Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly
115 120 125 115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
130 135 140 130 135 140
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
165 170 175 165 170 175
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
180 185 190 180 185 190
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
195 200 205 195 200 205
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
210 215 220 210 215 220
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
245 250 255 245 250 255
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
260 265 270 260 265 270
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
275 280 285 275 280 285
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
290 295 300 290 295 300
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
305 310 315 320 305 310 315 320
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
325 330 335 325 330 335
Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
340 345 350 340 345 350
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
355 360 365 355 360 365
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ile Asn Ala Met Gly Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ile Asn Ala Met Gly
370 375 380 370 375 380
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile
385 390 395 400 385 390 395 400
Glu Ser Gly Arg Asn Thr Val Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Glu Ser Gly Arg Asn Thr Val Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe
405 410 415 405 410 415
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser
420 425 430 420 425 430
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Leu Leu Lys Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Leu Leu Lys
435 440 445 435 440 445
Gly Asn Arg Val Val Ser Pro Ser Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gly Asn Arg Val Val Ser Pro Ser Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
450 455 460 450 455 460
Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly
465 470 465 470
<210> 148<210> 148
<211> 466<211> 466
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> слитый белок<223> fusion protein
<400> 148<400> 148
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ala Ile Lys Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ala Ile Lys
20 25 30 20 25 30
Pro Ile Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val Pro Ile Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Thr Thr Thr Ser Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Glu Ser Val Lys Ser Thr Thr Thr Ser Ser Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Glu Ser Val Lys
50 55 60 50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95 85 90 95
Val Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Val Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly
100 105 110 100 105 110
Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu
115 120 125 115 120 125
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
130 135 140 130 135 140
Ser Phe Ser Ile Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Phe Ser Ile Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys
145 150 155 160 145 150 155 160
Arg Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Glu Ser Gly Arg Asn Thr Val Tyr Arg Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Glu Ser Gly Arg Asn Thr Val Tyr
165 170 175 165 170 175
Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
180 185 190 180 185 190
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
195 200 205 195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Gly Leu Leu Lys Gly Asn Arg Val Val Ser Pro Ser Val Tyr Tyr Cys Gly Leu Leu Lys Gly Asn Arg Val Val Ser Pro Ser
210 215 220 210 215 220
Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly
225 230 235 240 225 230 235 240
Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly
245 250 255 245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270 260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285 275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300 290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320 305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335 325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350 340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365 355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380 370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400 385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415 405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430 420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445 435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460 450 455 460
Gly Lys Gly Lys
465 465
<---<---
Claims (53)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP18186445.5 | 2018-07-31 | ||
EP18204548.4 | 2018-11-06 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020139055A RU2020139055A (en) | 2022-09-01 |
RU2818349C2 true RU2818349C2 (en) | 2024-05-02 |
Family
ID=
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007107563A2 (en) * | 2006-03-20 | 2007-09-27 | Technische Universität München | Muteins of tear lipocalin with affinity for the t-cell coreceptor cd4 |
WO2015104406A2 (en) * | 2014-01-13 | 2015-07-16 | Pieris Ag | Multi-specific polypeptide useful for localized tumor immunomodulation |
WO2016177762A1 (en) * | 2015-05-04 | 2016-11-10 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Proteins specific for cd137 |
WO2016184882A1 (en) * | 2015-05-18 | 2016-11-24 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Anti-cancer fusion polypeptide |
WO2017123650A2 (en) * | 2016-01-11 | 2017-07-20 | Inhibrx Lp | Multivalent and multispecific 41bb-binding fusion proteins |
WO2017215590A1 (en) * | 2016-06-13 | 2017-12-21 | I-Mab | Anti-pd-l1 antibodies and uses thereof |
RU2016129959A (en) * | 2013-12-30 | 2018-02-02 | Эпимаб Биотерепьютикс Инк. | IMMUNOGLOBULIN WITH TANDEMIC LOCATION OF FAB-FRAGMENTS AND ITS APPLICATION |
EP3309177A1 (en) * | 2016-03-04 | 2018-04-18 | Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd. | Pdl-1 antibody, pharmaceutical composition thereof, and uses thereof |
WO2018087108A1 (en) * | 2016-11-09 | 2018-05-17 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Proteins specific for cd137 |
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007107563A2 (en) * | 2006-03-20 | 2007-09-27 | Technische Universität München | Muteins of tear lipocalin with affinity for the t-cell coreceptor cd4 |
RU2016129959A (en) * | 2013-12-30 | 2018-02-02 | Эпимаб Биотерепьютикс Инк. | IMMUNOGLOBULIN WITH TANDEMIC LOCATION OF FAB-FRAGMENTS AND ITS APPLICATION |
WO2015104406A2 (en) * | 2014-01-13 | 2015-07-16 | Pieris Ag | Multi-specific polypeptide useful for localized tumor immunomodulation |
WO2016177762A1 (en) * | 2015-05-04 | 2016-11-10 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Proteins specific for cd137 |
WO2016184882A1 (en) * | 2015-05-18 | 2016-11-24 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Anti-cancer fusion polypeptide |
WO2017123650A2 (en) * | 2016-01-11 | 2017-07-20 | Inhibrx Lp | Multivalent and multispecific 41bb-binding fusion proteins |
EP3309177A1 (en) * | 2016-03-04 | 2018-04-18 | Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd. | Pdl-1 antibody, pharmaceutical composition thereof, and uses thereof |
WO2017215590A1 (en) * | 2016-06-13 | 2017-12-21 | I-Mab | Anti-pd-l1 antibodies and uses thereof |
WO2018087108A1 (en) * | 2016-11-09 | 2018-05-17 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Proteins specific for cd137 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ARNAU J. et al. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins, Protein expression and purification, 2006, v. 48, n. 1, p.1-13. MULLER S. et al. Spliceosomal peptide P140 for immunotherapy of systemic lupus erythematosus: results of an early phase II clinical trial, Arthritis & Rheumatism: Official Journal of the American College of Rheumatology, 2008, v. 58, n. 12, p.3873-3883. COLMAN P. M. Effects of amino acid sequence changes on antibody-antigen interactions, Research in Immunology, 1994, v. 145, n. 1, p.33-36. SAFDARI Y. et al. Antibody humanization methods-a review and update, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 2013, v. 29, n. 2, p.175-186. CHEN X. et al. Fusion protein linkers: property, design and functionality, Advanced drug delivery reviews, 2013, v. 65, n. 10, p.1357-1369. MAEDA Y. et al. Engineering of functional chimeric protein G-Vargula Luciferase, Analytical biochemistry, 1997, v.249, n.2, p.147-1 * |
HINNER M. J. et al. Abstract B023: Costimulatory T-cell engagement via a novel bispecific anti-CD137 /anti-HER2 protein based on Anticalin technology, CANCER IMMUNOLOGY RESEARCH, 2016, v. 4, n. 1, p.B023, найдено в интернет [13/03/2023] по адресу: https://www.researchgate.net/publication/303390730_Abstract_B023_Costimulatory_T-cell_engagement_via_a_novel_bispecific_anti-CD137_anti-HER2_protein_based_on_AnticalinR_technology. HINNER M.J. et al. Costimulatory T cell engagement via a novel bispecific anti-CD137/anti-HER2 protein, Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2015, v.3(Suppl 2), p.P187, найдено в интернет [13/03/2023] по адресу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4649453/pdf/2051-1426-3-S2-P187.pdf. * |
PAKULA A.A. et al. Genetic analysis of protein stability and function. Anna. Rev. Genet. 1989, v.23, p.289-310. FRANKEL A.E. et al. Characterization of diphtheria fusion proteins targeted to the human interleukin-3 receptor, Protein Eng., 2000, v.13, n.8, p.575-581. TOKURIKI N. et al. Stability effects of mutations and protein evolvability, Curr. Opin. Struct. Biol., 2009, v.19, n.5, p.596-604;. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI837156B (en) | Novel fusion protein specific for cd137 and pd-l1 | |
US20210198380A1 (en) | Anti-cancer fusion polypeptide | |
RU2754466C2 (en) | Fused polypeptide with anti-cancer activity | |
JP7476219B2 (en) | Novel fusion proteins specific for CD137 and GPC3 | |
RU2628699C2 (en) | Trail r2-specific multimeric scaffolds | |
JP2018526989A (en) | Novel fusion polypeptide specific for LAG-3 and PD-1 | |
US11453722B2 (en) | Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory TNF receptor | |
TW201805310A (en) | Antigen binding molecules comprising a TNF family ligand trimer and a tenascin binding moiety | |
CN112409483A (en) | anti-PD-L1 nano antibody | |
WO2018134279A1 (en) | Novel fusion polypeptides specific for lag-3 and pd-1 | |
KR20230020443A (en) | 4-1BB targeting multimeric immunomodulatory agent | |
RU2818349C2 (en) | Novel fusion protein specific for cd137 and pd-l1 | |
RU2814653C2 (en) | Novel fusion proteins specific for cd137 and gpc3 | |
EA046634B1 (en) | A NEW FUSION PROTEIN SPECIFIC TO CD137 AND PD-L1 | |
WO2023089079A1 (en) | Novel fusion protein specific for ox40 and pd-l1 | |
RU2826084C2 (en) | Antibody molecules that bind pd-l1 and cd137 | |
TW202428603A (en) | Novel fusion protein specific for cd137 and cd228 | |
WO2024064713A1 (en) | Novel fusion protein specific for cd137 and cd228 |