RU2818329C1 - Nucleotide sequence coding fusion protein consisting of soluble extracellular fragment of human il-6r and constant part of heavy chain of human igg4 - Google Patents
Nucleotide sequence coding fusion protein consisting of soluble extracellular fragment of human il-6r and constant part of heavy chain of human igg4 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2818329C1 RU2818329C1 RU2023131246A RU2023131246A RU2818329C1 RU 2818329 C1 RU2818329 C1 RU 2818329C1 RU 2023131246 A RU2023131246 A RU 2023131246A RU 2023131246 A RU2023131246 A RU 2023131246A RU 2818329 C1 RU2818329 C1 RU 2818329C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdseq
- insdqualifier
- fusion protein
- insdfeature
- fragment
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 40
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title description 11
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 108040006858 interleukin-6 receptor activity proteins Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102200010335 rs2228145 Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 11
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 23
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 42
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 42
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 208000005024 Castleman disease Diseases 0.000 description 4
- 229940124790 IL-6 inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 4
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 108700015048 receptor decoy activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 229960003323 siltuximab Drugs 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 102000011767 Acute-Phase Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010062271 Acute-Phase Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 3
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 3
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 3
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 3
- 230000007112 pro inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 108091007505 ADAM17 Proteins 0.000 description 2
- 102000043279 ADAM17 Human genes 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 101000599048 Homo sapiens Interleukin-6 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108010017324 STAT3 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004495 STAT3 Transcription Factor Human genes 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000000495 immunoinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000009862 primary prevention Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000009863 secondary prevention Effects 0.000 description 2
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 229960003989 tocilizumab Drugs 0.000 description 2
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 1
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241001212789 Dynamis Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001076407 Homo sapiens Interleukin-1 receptor antagonist protein Proteins 0.000 description 1
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010065159 Polychondritis Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229950001565 clazakizumab Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 229950002507 elsilimomab Drugs 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000046824 human IL1RN Human genes 0.000 description 1
- 102000052611 human IL6 Human genes 0.000 description 1
- 102000052623 human IL6R Human genes 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 208000036260 idiopathic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000017306 interleukin-6 production Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000037125 natural defense Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000031990 negative regulation of inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- -1 nucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 229950010006 olokizumab Drugs 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009745 pathological pathway Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 208000037920 primary disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000009169 relapsing polychondritis Diseases 0.000 description 1
- 208000015347 renal cell adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229950006348 sarilumab Drugs 0.000 description 1
- 208000037921 secondary disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 229950006094 sirukumab Drugs 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техникиField of technology
Изобретение относится к области биомолекулярной фармакологии, биотехнологии и генетической инженерии и касается молекул нуклеиновых кислот и кодируемых ими новых растворимых белков - функциональных антагонистов IL-6 человека, способных блокировать провоспалительный ответ, а также способа их получения. В основе изобретения лежит использование белка-рецептора IL-6R (Interleukin-6 receptor), в составе молекулы рецептора-ловушки.The invention relates to the field of biomolecular pharmacology, biotechnology and genetic engineering and concerns nucleic acid molecules and new soluble proteins encoded by them - functional antagonists of human IL-6, capable of blocking the pro-inflammatory response, as well as a method for their production. The invention is based on the use of the IL-6R receptor protein (Interleukin-6 receptor), as part of a decoy receptor molecule.
Уровень техникиState of the art
Цитокины включают класс белков, которые опосредуют воспаление и модулируют иммунитет. Одна группа цитокинов, интерлейкины, носит это название, поскольку считалось, что они опосредуют передачу сигналов между лейкоцитами (отсюда и название интерлейкины) (Dinarello, 2011). Цитокины играют решающую роль в развитии многих воспалительных заболеваний (Feldmann, 2008).Cytokines include a class of proteins that mediate inflammation and modulate immunity. One group of cytokines, interleukins, bear this name because they were thought to mediate signaling between leukocytes (hence the name interleukins) (Dinarello, 2011). Cytokines play a crucial role in the development of many inflammatory diseases (Feldmann, 2008).
Хроническое воспаление лежит в основе широкого спектра аутоиммунных и воспалительных заболеваний, приводящих к системному поражению органов (например, при системной красной волчанке) или целенаправленному поражению органов (например, в случае ревматоидного артрита, воспалительных заболеваний кишечника, диабета 1 типа и астмы) (Feldmann, 2008). До того, как были открыты методы лечения посредством ингибирования противоопухолевого фактора некроза-α (TNFα), противовоспалительные средства включали широкий спектр иммунодепрессантов и нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП). Хотя эти терапевтические агенты зачастую эффективны в подавлении иммунных ответов, они часто связаны с развитием нежелательных побочных эффектов, также значительная доля пациентов не отвечает на лечение такими препаратами (Feldmann, 2008; Kaur, Bansal et al. 2020). По этим причинам поиск препаратов с новыми механизмами действия является актуальным.Chronic inflammation underlies a wide range of autoimmune and inflammatory diseases, leading to systemic organ damage (eg, systemic lupus erythematosus) or targeted organ damage (eg, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, type 1 diabetes, and asthma) (Feldmann, 2008). Before the discovery of treatments through inhibition of antitumor necrosis factor-α (TNFα), anti-inflammatory drugs included a wide range of immunosuppressants and nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). Although these therapeutic agents are often effective in suppressing immune responses, they are often associated with the development of unwanted side effects, and a significant proportion of patients do not respond to treatment with such drugs (Feldmann, 2008; Kaur, Bansal et al. 2020). For these reasons, the search for drugs with new mechanisms of action is relevant.
Воспаление - это естественный защитный механизм организма, который включает миграцию лейкоцитов в поврежденные ткани для уничтожения триггера воспаления или поражения. Инфекционные и аллергические триггеры вызывают начальную фазу острого воспаления, которое, как считается, имеет ограниченный положительный эффект. Но продолжающееся острое воспаление приводит к хроническому воспалению, которое приводит к повреждению тканей. Острое воспаление характеризуется инфильтрацией нейтрофильных клеток, за которыми следуют моноцитарные клетки, тогда как хроническое воспаление характеризуется присутствием мононуклеарных клеток, таких как макрофаги и лимфоциты, в месте воспаления (Melnicoff, Horan et al., 1989)Inflammation is the body's natural defense mechanism that involves the migration of white blood cells into damaged tissues to destroy the trigger of inflammation or injury. Infectious and allergic triggers cause an initial phase of acute inflammation, which is thought to have limited benefit. But ongoing acute inflammation leads to chronic inflammation, which leads to tissue damage. Acute inflammation is characterized by the infiltration of neutrophil cells followed by monocytic cells, while chronic inflammation is characterized by the presence of mononuclear cells such as macrophages and lymphocytes at the site of inflammation (Melnicoff, Horan et al., 1989)
Помимо рекрутирования этих клеток в очаге воспаления, во время воспалительных процессов также вырабатываются различные цитокины. Они действуют синергически и обладают перекрывающейся активностью, которая может проявляться при взаимодействии с их рецепторами и транслироваться в путях внутриклеточной передачи сигнала. Эти цитокины в основном включают интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-1β (IL-1β), фактор некроза опухоли-α (TNF-α), интерферон-γ (IFN-γ) и трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), которые стимулируют выработку белков острой фазы (APP) (Kushner, 1993).In addition to the recruitment of these cells to the site of inflammation, various cytokines are also produced during inflammatory processes. They act synergistically and have overlapping activities that can occur upon interaction with their receptors and be translated into intracellular signal transduction pathways. These cytokines mainly include interleukin-6 (IL-6), interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ) and transforming growth factor-β (TGF -β), which stimulate the production of acute phase proteins (APP) (Kushner, 1993).
Интерлейкин-6 (IL-6) представляет собой плейотропный провоспалительный цитокин, который активно участвует в воспалительных и иммуномодулирующих механизмах. Нарушение регуляции IL-6 связано с хроническим воспалением и многофакторными аутоиммунными нарушениями. Он стимулирует выработку так называемых белков острой фазы, действует как агент созревания В-лимфоцитов, стимулирует синтез и секрецию различных иммуноглобулинов и индуцирует пролиферацию Т-клеток. IL-6 не только вызывает реакции острой фазы, но также приводит к развитию специфических клеточных и гуморальных иммунных ответов, посредством влияния на конечную стадию дифференцировки B-клеток, секрецию иммуноглобулинов и активацию Т-клеток. Таким образом, IL-6 является важным модулятором перехода от острой фазы воспаления к хронической (Kaplanski, Marin et al., 2003). IL-6 выполняет свою биологическую роль посредством гексамерного комплекса, состоящего из самого IL-6, его рецептора IL-6R и гликопротеина 130 (IL-6/IL-6R/gp130). Этот комплекс, в свою очередь, активирует различные механизмы передачи сигналов (классические и транссигнальные) для выполнения различных биохимических функций. Интересно, что ни IL-6, ни IL-6R не обнаруживают значительного сродства к gp130 (Rose-John, 2012, Zunke and Rose-John, 2017). Высокой аффинностью к gp130 обладает комплекс IL-6 и IL-6R. В то время как gp130 присутствует на всех клетках организма, IL-6R преимущественно представлен на гепатоцитах и некоторых лейкоцитах. Однако IL-6R может быть отщеплен от клеточной мембраны с помощью протеолитического действия ADAM17, в результате чего образуется растворимый фрагмент рецептора IL-6R (sIL-6R) (Riethmueller et al., 2017). Интересно, что sIL-6R может связывать лиганд IL-6, а комплекс IL-6 и sIL-6R может связываться с gp130 на клетках, которые не экспрессируют IL-6R (Rose-John, 2012; Zunke and Rose-John, 2017). Такие клетки, которые не были бы чувствительны к IL-6, сенсибилизируются за счет взаимодействия IL-6/sIL-6R комплекса с gp130. Такой путь получил название транссигнального пути IL-6 (Zunke and Rose-John, 2017). Известно, что транссигнальный механизм активирует различные патологические пути, такие как JAK/STAT3, Ras/MAPK, PI3K-PKB/Akt, а также регуляцию CD4+ Т-клеток и уровня VEGF. Разбалансировка этой регуляции в конечном счёте может приводить к широкому спектру различных отклонений, включая различные иммуновоспалительные состояния и онкологические заболевания.Interleukin-6 (IL-6) is a pleiotropic proinflammatory cytokine that is actively involved in inflammatory and immunomodulatory mechanisms. Dysregulation of IL-6 is associated with chronic inflammation and multifactorial autoimmune disorders. It stimulates the production of so-called acute phase proteins, acts as a maturation agent for B lymphocytes, stimulates the synthesis and secretion of various immunoglobulins and induces the proliferation of T cells. IL-6 not only induces acute phase reactions, but also leads to the development of specific cellular and humoral immune responses by influencing the final stage of B cell differentiation, immunoglobulin secretion and T cell activation. Thus, IL-6 is an important modulator of the transition from the acute to the chronic phase of inflammation (Kaplanski, Marin et al., 2003). IL-6 performs its biological role through a hexameric complex consisting of IL-6 itself, its receptor IL-6R and glycoprotein 130 (IL-6/IL-6R/gp130). This complex, in turn, activates various signaling mechanisms (classical and trans-signaling) to perform various biochemical functions. Interestingly, neither IL-6 nor IL-6R shows significant affinity for gp130 (Rose-John, 2012, Zunke and Rose-John, 2017). The complex of IL-6 and IL-6R has high affinity for gp130. While gp130 is present on all cells of the body, IL-6R is predominantly present on hepatocytes and some leukocytes. However, IL-6R can be cleaved from the cell membrane through the proteolytic action of ADAM17, resulting in the formation of a soluble fragment of the IL-6R receptor (sIL-6R) (Riethmueller et al., 2017). Interestingly, sIL-6R can bind IL-6 ligand, and the complex of IL-6 and sIL-6R can bind to gp130 on cells that do not express IL-6R (Rose-John, 2012; Zunke and Rose-John, 2017) . Such cells, which would not be sensitive to IL-6, are sensitized due to the interaction of the IL-6/sIL-6R complex with gp130. This pathway is called the IL-6 transsignaling pathway (Zunke and Rose-John, 2017). The trans-signaling mechanism is known to activate various pathological pathways such as JAK/STAT3, Ras/MAPK, PI3K-PKB/Akt, as well as the regulation of CD4+ T cells and VEGF levels. Imbalance of this regulation can ultimately lead to a wide range of different abnormalities, including various immunoinflammatory conditions and cancers.
Из литературы известен однонуклеотидный полиморфизм (rs2228145) в гене IL-6R, который приводит к аминокислотной замене аспарагиновой кислоты 358 на аланин 358 (D358A) вблизи сайта расщепления IL-6R металлопротеазой ADAM17 (Zunke and Rose-John, 2017). Известно, что замена D358A приводит к более эффективному расщеплению IL-6R металлопротеазами и, следовательно, к повышению уровня sIL-6R примерно на 50% (Garbers et al., 2014). В нескольких генетических исследованиях было обнаружено, что минорная аллель rs2228145, приводящая к замене D358A, обеспечивает защиту от ишемической болезни сердца, ревматоидного артрита, других воспалительных заболеваний, а также диабета второго типа (Sarwar et al., 2012, Ferreira et al., 2013, Interleukin-6 Receptor Mendelian Randomisation Analysis (IL6R MR) Consortium., 2012). Несмотря на то, что механизм действия данной аллели все еще остается не до конца изученным, такие результаты были объяснены буферной активностью sIL-6R по отношению к связыванию IL-6 (Calabrese et al., 2014).A single nucleotide polymorphism (rs2228145) in the IL-6R gene is known from the literature, which leads to an amino acid substitution from aspartic acid 358 to alanine 358 (D358A) near the cleavage site of IL-6R by the metalloprotease ADAM17 (Zunke and Rose-John, 2017). It is known that the D358A substitution results in more efficient cleavage of IL-6R by metalloproteases and, consequently, an increase in sIL-6R levels by approximately 50% (Garbers et al., 2014). Several genetic studies have found that the minor allele of rs2228145, resulting in the D358A substitution, provides protection against coronary heart disease, rheumatoid arthritis, other inflammatory diseases, and type 2 diabetes (Sarwar et al., 2012, Ferreira et al., 2013 , Interleukin-6 Receptor Mendelian Randomisation Analysis (IL6R MR) Consortium., 2012). Although the mechanism of action of this allele is still not fully understood, these results were explained by the buffering activity of sIL-6R against IL-6 binding (Calabrese et al., 2014).
Участие IL-6 в патофизиологии таких заболеваний как рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, Ревматоидный артрит (РА), болезнь Кастлемана (БК), воспалительные заболевания кишечника и болезнь Крона делает его одной из важнейших мишеней для терапии. IL-6 также является основным цитокином в микроокружении опухоли, и известно, что его регуляция при раке нарушается. Он сверхэкспрессируется почти во всех типах опухолей, таких как рак молочной железы, рак простаты, карцинома яичников, рак поджелудочной железы, рак легких, почечно-клеточный рак, рак шейки матки и множественная миелома. IL-6 активирует сигнальные пути JAK/STAT3, Ras/MAPK и PI3K-PKB/Akt, которые, в свою очередь, регулируют многие генные продукты, вызывающие клеточную пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, ангиогенез и метастазирование (Kaur, Bansal et al., 2020). Клинические исследования по использованию моноклональных антител против IL-6 (mAbs, BE-8 или CNTO 328) у пациентов, страдающих множественной миеломой, почечно-клеточным раком и B-лимфопролиферативными расстройствами, доказали эффективность этих моноклональных антител у всех пациентов. Таким образом, полагают, что терапия подавления IL-6 может быть полезна при лечении рака на ранних стадиях (Unver and McAllister, 2018).The involvement of IL-6 in the pathophysiology of diseases such as multiple sclerosis, Alzheimer's disease, Rheumatoid arthritis (RA), Castleman's disease (CD), inflammatory bowel diseases and Crohn's disease makes it one of the most important targets for therapy. IL-6 is also a major cytokine in the tumor microenvironment and is known to be dysregulated in cancer. It is overexpressed in almost all types of tumors such as breast cancer, prostate cancer, ovarian carcinoma, pancreatic cancer, lung cancer, renal cell cancer, cervical cancer and multiple myeloma. IL-6 activates the JAK/STAT3, Ras/MAPK and PI3K-PKB/Akt signaling pathways, which in turn regulate many gene products that cause cell proliferation, differentiation, apoptosis, angiogenesis and metastasis (Kaur, Bansal et al., 2020). Clinical studies using anti-IL-6 monoclonal antibodies (mAbs, BE-8 or CNTO 328) in patients suffering from multiple myeloma, renal cell carcinoma and B-lymphoproliferative disorders have demonstrated the effectiveness of these monoclonal antibodies in all patients. Thus, it is believed that IL-6 suppression therapy may be useful in the treatment of early-stage cancer (Unver and McAllister, 2018).
Анти-IL-6 моноклональные антитела используются для лечения различных иммуновоспалительных заболеваний, резистентных к обычным лекарствам. Тоцилизумаб (человеческое анти-IL-6R антитело) и силтуксимаб (ингибитор IL-6) являются одобренными моноклональными антителами, которые используются для лечения БК, РА и системных ювенильных идиопатических заболеваний (Yoshizaki, Murayama et al/, 2018). Тоцилизумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против IL-6R, одобренное FDA для лечения РА и системного ювенильного идиопатического артрита. Он также одобрен в Японии для лечения БК и в настоящее время проходит фазу 2 исследований по оценке его эффективности при рецидивирующем полихондрите. Клинические исследования моноклональных антител против IL-6, таких как сирукумаб (CNTO136), олокизумаб (CP6038), PF-423691, силтуксимаб (CNTO328), элсилимомаб (BE-8), клазакизумаб (BMS945429), сарилумаб (REGN88) и MEDI5117 находятся на разных стадиях клинических исследований с целью установления их эффективности и безопасности при различных болезненных состояниях. Многие исследования показали, что эти моноклональные антитела демонстрируют благоприятные терапевтические эффекты при IL-6-опосредованных болезненных состояниях. Некоторые из этих моноклональных антител также достигли огромного коммерческого успеха, но их основными ограничениями остаются высокая стоимость, инвазивный путь введения, высокая степень иммуногенности, а также спектр других осложнений, осложняющий их использование во многих случаях. Следовательно, существует необходимость в разработке новых ингибиторов IL-6, обладающих низкой антигенностью и удобных для пациентов. В литературе сообщается о нескольких синтетических и встречающихся в природе молекулах как об ингибиторах IL-6. Они действуют посредством вмешательства в различные пути, участвующие в выработке IL-6 и путях передачи сигнала (Kaur, Bansal et al., 2020).Anti-IL-6 monoclonal antibodies are used to treat various immunoinflammatory diseases that are resistant to conventional drugs. Tocilizumab (human anti-IL-6R antibody) and siltuximab (IL-6 inhibitor) are approved monoclonal antibodies that are used to treat CD, RA, and systemic juvenile idiopathic diseases (Yoshizaki, Murayama et al/, 2018). Tocilizumab is a humanized anti-IL-6R monoclonal antibody approved by the FDA for the treatment of RA and systemic juvenile idiopathic arthritis. It is also approved in Japan for the treatment of CD and is currently undergoing phase 2 studies evaluating its effectiveness in relapsing polychondritis. Clinical studies of anti-IL-6 monoclonal antibodies such as sirukumab (CNTO136), olokizumab (CP6038), PF-423691, siltuximab (CNTO328), elsilimomab (BE-8), clazakizumab (BMS945429), sarilumab (REGN88) and MEDI5117 are underway. different stages of clinical trials in order to establish their effectiveness and safety in various disease states. Many studies have shown that these monoclonal antibodies demonstrate beneficial therapeutic effects in IL-6-mediated disease states. Some of these monoclonal antibodies have also achieved enormous commercial success, but their main limitations remain high cost, invasive route of administration, high degree of immunogenicity, and a range of other complications that complicate their use in many cases. Therefore, there is a need to develop new IL-6 inhibitors that are low antigenic and patient-friendly. Several synthetic and naturally occurring molecules have been reported in the literature as IL-6 inhibitors. They act by interfering with various pathways involved in IL-6 production and signal transduction pathways (Kaur, Bansal et al., 2020).
Fc-слитые белки хорошо зарекомендовали себя в качестве терапевтических и профилактических средств. Полученные с помощью этой технологии белки имеют эффекторную часть, связанную с Fc-доменом, который заметно удлиняет период полувыведения белков из плазмы крови, что продлевает их терапевтическую активность, а также приводит к более медленному почечному клиренсу для молекул большего размера. Также, молекулы обладают довольно низкой иммуногенностью, так как составляющие их части представляют собой естественные белки организма человека. Вместе с тем, такие молекулы обладают значительным терапевтическим потенциалом, так как способны связывать необходимые лиганды и, таким образом, блокировать цепочки передачи сигналов. В последнее время ведется активная разработка терапевтических средств на основе Fc-слитых белков (см. например, RU2689522, 28.05.2019; WO2023063842, 20.04.2023 (RU2787060)).Fc fusion proteins have proven themselves as therapeutic and prophylactic agents. Proteins produced using this technology have an effector portion associated with an Fc domain, which markedly lengthens the plasma half-life of proteins, which prolongs their therapeutic activity and also leads to slower renal clearance for larger molecules. Also, the molecules have a fairly low immunogenicity, since their constituent parts are natural proteins of the human body. At the same time, such molecules have significant therapeutic potential, since they are able to bind the necessary ligands and, thus, block signal transduction chains. Recently, there has been active development of therapeutic agents based on Fc-fusion proteins (see, for example, RU2689522, 05/28/2019; WO2023063842, 04/20/2023 (RU2787060)).
Целью изобретения является разработка эффективных антагонистов IL-6 на основе технологии Fc-слитых белков.The purpose of the invention is to develop effective IL-6 antagonists based on Fc fusion protein technology.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала технических средств для лечения и предотвращении развития воспалительных и аутоиммуных заболеваний, опосредованных дисрегуляцией передачи сигнала IL-6. В частности, задача касается получения полипептидных препаратов - антагонистов патологического сигнального пути IL-6, обладающих высокой аффинностью к этому интерлейкину; также задача касается разработки нуклеотидных последовательностей, кодирующих такие полипептиды и являющихся экспрессионной основой для их получения.The objective of the present invention is to expand the arsenal of technical means for treating and preventing the development of inflammatory and autoimmune diseases mediated by dysregulation of IL-6 signal transmission. In particular, the task concerns the production of polypeptide drugs - antagonists of the pathological signaling pathway IL-6, with high affinity for this interleukin; The task also concerns the development of nucleotide sequences encoding such polypeptides and being the expression basis for their production.
Решение поставленной задачи осуществляется путем создания слитого белка IL-6R-hFc, являющегося антагонистом IL-6, в структуру которого входит IL-6R человека, представленный аминокислотами 20-361, соответствующих естественной последовательности IL-6R, несущего замену D358A, а также константная часть тяжелой цепи (Fc-фрагмент) IgG4 человека. При этом Fc-фрагмент IgG4 человека присоединен к фрагменту белка IL-6R с С-конца непосредственно или посредством линкерной последовательности. В некоторых частных вариантах осуществления изобретения линкерный пептид представляет собой дипептид RS.The solution to this problem is carried out by creating a fusion protein IL-6R-hFc, which is an antagonist of IL-6, the structure of which includes human IL-6R, represented by amino acids 20-361, corresponding to the natural sequence of IL-6R, carrying the D358A substitution, as well as a constant part heavy chain (Fc fragment) of human IgG4. In this case, the Fc fragment of human IgG4 is attached to a fragment of the IL-6R protein from the C-terminus directly or through a linker sequence. In some particular embodiments of the invention, the linker peptide is an RS dipeptide.
В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-фрагмент IgG4 человека представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3.In some embodiments, the human IgG4 Fc fragment is represented by the amino acid sequence SEQ ID NO: 3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый белок дополнительно включает сигнальную последовательность, локализованную на N-конце слитого белка. В частных вариантах изобретения сигнальная последовательность представлена в последовательности SEQ ID NO: 4.In some embodiments, the fusion protein further includes a signal sequence located at the N-terminus of the fusion protein. In particular embodiments of the invention, the signal sequence is presented in the sequence SEQ ID NO: 4.
В некоторых частных вариантах изобретения слитый белок имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2.In some particular embodiments of the invention, the fusion protein has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
Поставленная задача также решается путем создания изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такой слитый белок.This problem is also solved by creating an isolated nucleic acid molecule encoding such a fusion protein.
В некоторых частных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность SEQ ID NO: 5.In some particular embodiments of the invention, the nucleic acid molecule has the sequence SEQ ID NO: 5.
Указанная задача также решается путем создания экспрессирующего вектора, несущего нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такой слитый белок, под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии данной нуклеотидной последовательности в клетке-хозяине; а также путем создания клетки-хозяина, включающей экспрессирующий вектор, описанный в настоящей заявке, обеспечивающей эффективную продукцию такого слитого белка с использованием вышеуказанной молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах воплощения изобретения в качестве таких клеток выступают клетки млекопитающих (в некоторых частных вариантах воплощения изобретения - клетки яичников китайских хомячков (CHO)).This problem is also solved by creating an expression vector carrying a nucleotide sequence corresponding to the sequence of an isolated nucleic acid molecule encoding such a fusion protein, under the control of regulatory elements necessary for the expression of this nucleotide sequence in the host cell; and by creating a host cell comprising an expression vector as described herein, allowing efficient production of such a fusion protein using the above nucleic acid molecule. In some embodiments, such cells are mammalian cells (in some particular embodiments, Chinese hamster ovary (CHO) cells).
Решение поставленной задачи может достигаться при применении вышеуказанного слитого белка для лечения широкого спектра воспалительных состояний и аутоиммунных заболеваний. Результатом изобретения является создание ингибитора IL-6, что достигается за счет использования фрагмента IL-6R(D358A) в составе слитого белка IL-6R-hFc, который является рецептором-ловушкой, направленной на связывание IL-6 и снижение патологической активации путей IL-6. Белок IL-6R(D358A)-hFc может вводиться пациенту в терапевтически эффективном количестве предпочтительно в составе фармацевтической композиции.The solution to this problem can be achieved by using the above fusion protein for the treatment of a wide range of inflammatory conditions and autoimmune diseases. The result of the invention is the creation of an IL-6 inhibitor, which is achieved through the use of the IL-6R(D358A) fragment as part of the IL-6R-hFc fusion protein, which is a decoy receptor aimed at binding IL-6 and reducing the pathological activation of IL-6 pathways. 6. The IL-6R(D358A)-hFc protein may be administered to a patient in a therapeutically effective amount, preferably as part of a pharmaceutical composition.
При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты:When implementing the invention, the following technical results are achieved:
- создан вариант терапевтического агента на основе слитого (гибридного) белка IL-6R(D358A)-hFc, содержащего функциональную часть IL-6R, представленного фрагментом экстраклеточного домена, соответствующего положениям 20-361 последовательности SEQ ID NO: 1 с заменой D358A, слитую с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека IgG4, и способного блокировать передачу сигнала IL-6 (провоспалительный ответ), а также разработаны нуклеотидные последовательности, кодирующие такие слитые белки и являющиеся экспрессионной основой для их получения;- a variant of the therapeutic agent was created based on the fusion (hybrid) protein IL-6R(D358A)-hFc, containing the functional part of IL-6R, represented by a fragment of the extracellular domain corresponding to positions 20-361 of the sequence SEQ ID NO: 1 with the replacement D358A, fused with the constant part (Fc domain) of human immunoglobulin IgG4, and capable of blocking IL-6 signal transmission (pro-inflammatory response), and nucleotide sequences have been developed that encode such fusion proteins and are the expression basis for their production;
- разработанный рекомбинантный полипептид имеет высокую степень безопасности терапевтического применения, основой которой являются особенности его конструкции, а именно: минимальная эффекторная функция для антителозависимой клеточной цитотоксичности (antibody-dependent cellular cytotoxicity - ADCC) и отсутствие комплемент-зависимой цитотоксичности (complement-dependent cytotoxicity - CDC), благодаря использованию константной части иммуноглобулина человека IgG4-изотипа;- the developed recombinant polypeptide has a high degree of safety for therapeutic use, the basis of which is the features of its design, namely: minimal effector function for antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and the absence of complement-dependent cytotoxicity (CDC) ), thanks to the use of the constant part of human immunoglobulin of the IgG4 isotype;
- рекомбинантный полипептид также обладает потенциально улучшенными фармакокинетическими свойствами, благодаря включению в слитый белок только части экстраклеточного домена (ак 20-361 вместо ак 20-365) (а также, дополнительно, в некоторых предпочтительных вариантах изобретения, благодаря наличию фрагмента шарнирного участка PPCPSCP), что позволяет экстраклеточному домену белка IL-6R и Fc-домену, входящим в молекулу, действовать независимо друг от друга за счет обеспечения гибкости на данном участке.- the recombinant polypeptide also has potentially improved pharmacokinetic properties due to the inclusion of only part of the extracellular domain (aa 20-361 instead of aa 20-365) in the fusion protein (and, additionally, in some preferred embodiments, due to the presence of a fragment of the PPCPSCP hinge region), which allows the extracellular domain of the IL-6R protein and the Fc domain included in the molecule to act independently of each other by providing flexibility in this area.
Краткое описание рисунковBrief description of the drawings
Фиг.1. Схема экспрессирующего вектора, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5, кодирующую слитый белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.Fig.1. Schematic of an expression vector containing the nucleotide sequence SEQ ID NO: 5 encoding a fusion protein having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2.
Определения и терминыDefinitions and terms
Следующие термины и определения применяются в данном документе, если иное не указано явно. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.The following terms and definitions apply throughout this document unless otherwise expressly stated. References to techniques used in the description of this invention refer to well known techniques, including modifications of these techniques and replacement thereof with equivalent techniques known to those skilled in the art.
В документах данного изобретения термины «включает», «включающий» и т.п., а также «содержит», «содержащий» и т.п. интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего» (или «содержит, помимо всего прочего»). Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».As used herein, the terms “includes,” “including,” and the like, as well as “comprises,” “comprising,” and the like are used herein. are interpreted to mean “includes, but is not limited to” (or “contains, among other things”). These terms are not intended to be construed as “consisting only of.”
Термины «полипептид», «белок» и «пептид» используют в настоящем документе взаимозаменяемо, и все они означают полимер из аминокислотных остатков. Эти термины также могут использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо при обозначении конечного продукта, получаемого в результате экспрессии в клетке-хозяине последовательности нуклеиновой кислоты.The terms "polypeptide", "protein" and "peptide" are used interchangeably herein and all refer to a polymer of amino acid residues. These terms may also be used interchangeably herein to refer to the end product resulting from expression of a nucleic acid sequence in a host cell.
Под «слитым белком» («гибридным белком», «рекомбинантным белком», «слитым полипептидом», «рекомбинантным полипептидом», «гибридной конструкцией») понимают конструкцию из двух или более частей полипептидной природы, ковалентно связанных между собой, образующейся в результате экспрессии рекомбинантной молекулы ДНК, в которой соединены друг с другом в одной рамке считывания кодирующие участки, соответственно, двух или нескольких разных генов или их фрагментов.By “fusion protein” (“hybrid protein”, “recombinant protein”, “fusion polypeptide”, “recombinant polypeptide”, “hybrid construct”) is meant a construct of two or more parts of a polypeptide nature, covalently linked to each other, resulting from the expression a recombinant DNA molecule in which the coding regions of two or more different genes or their fragments are connected to each other in one reading frame.
Термин «изолированный» («выделенный») имеет свое общепринятое значение, известное среднему специалисту в данной области техники, и при использовании в отношении выделенной нуклеиновой кислоты или выделенного полипептида используется без ограничения для обозначения нуклеиновой кислоты или полипептида, которые, благодаря человеку, существуют отдельно от своего нативного окружения и поэтому не являются продуктом природы. Выделенная нуклеиновая кислота или полипептид могут существовать в очищенной форме или могут существовать в ненативном окружении, в таком как, например, клетка-хозяин.The term “isolated” (“isolated”) has its common meaning known to one of ordinary skill in the art, and when used in relation to an isolated nucleic acid or isolated polypeptide, is used without limitation to refer to a nucleic acid or polypeptide that, thanks to a person, exists separately from their native environment and are therefore not a product of nature. The isolated nucleic acid or polypeptide may exist in purified form or may exist in a non-native environment, such as, for example, a host cell.
Термин «синонимичная замена» относится к нуклеотидной последовательности, имеющей последовательность нуклеотидов, которая может отличаться от референсной последовательности нуклеиновой кислоты на одну или более замен, которые не ведут к изменению аминокислотной последовательности белка, кодируемой данной молекулой нуклеиновой кислоты. В связи с тем, что генетический код является «вырожденным», то есть различные по нуклеотидной последовательности триплеты могут кодировать одну и ту же аминокислоту, синонимичные замены в нуклеотидной последовательности не приводят к изменению аминокислотной последовательности белка.The term “synonymous substitution” refers to a nucleotide sequence having a nucleotide sequence that may differ from a reference nucleic acid sequence by one or more substitutions that do not result in a change in the amino acid sequence of the protein encoded by the nucleic acid molecule. Due to the fact that the genetic code is “degenerate”, that is, triplets with different nucleotide sequences can encode the same amino acid, synonymous substitutions in the nucleotide sequence do not lead to a change in the amino acid sequence of the protein.
Термин «рецептор-ловушка» (от англ. Decoy ligand, также трап) относится к гибридным белкам, состоящим из внеклеточного домена молекулы (рецептора) и Fc-домена иммуноглобулина. Внеклеточный домен рецептора отвечает за связывание мишени, а Fc-домен осуществляет димеризацию гибридного белка. Последнее необходимо для увеличения эффективности связывания и обеспечения большей стабильности высокомолекулярного комплекса. В рамках настоящего изобретения «рецептор-ловушка» состоит из функционального фрагмента человеческого белка IL-6R(D358A) и константной части тяжелой цепи IgG4 человека.The term “decoy receptor” (from the English Decoy ligand, also trap) refers to hybrid proteins consisting of the extracellular domain of the molecule (receptor) and the Fc domain of an immunoglobulin. The extracellular domain of the receptor is responsible for binding the target, and the Fc domain dimerizes the hybrid protein. The latter is necessary to increase the binding efficiency and ensure greater stability of the high-molecular complex. In the context of the present invention, the decoy receptor consists of a functional fragment of the human IL-6R(D358A) protein and a human IgG4 heavy chain constant portion.
Термин «лечение» означает излечение, замедление, остановку, либо реверсию прогрессирования заболевания или нарушения. В настоящем документе «лечение» также означает смягчение симптомов, ассоциированных с заболеванием или нарушением.The term “treatment” means to cure, slow, stop, or reverse the progression of a disease or disorder. As used herein, “treating” also means alleviating symptoms associated with a disease or disorder.
Термин «профилактика», «предотвращение», «превентивная терапия» охватывает устранение факторов риска, а также профилактическое лечение субклинических стадий заболевания у человека, направленное на уменьшение вероятности возникновения клинических стадий заболевания. Пациенты для профилактической терапии отбираются на основе факторов, которые, на основании известных данных, влекут увеличение риска возникновения клинических стадий заболевания по сравнению с общим населением. К профилактической терапии относится а) первичная профилактика и б) вторичная профилактика. Первичная профилактика определяется как профилактическое лечение у пациентов, клиническая стадия заболевания у которых ещё не наступила. Вторичная профилактика - это предотвращение повторного наступления того же или близкого клинического состояния заболевания.The term “prophylaxis”, “avoidance”, “preventive therapy” covers the elimination of risk factors, as well as prophylactic treatment of subclinical stages of the disease in humans, aimed at reducing the likelihood of the occurrence of clinical stages of the disease. Patients for prophylactic therapy are selected based on factors known to increase the risk of clinical stage disease compared with the general population. Preventive therapy includes a) primary prevention and b) secondary prevention. Primary prevention is defined as preventive treatment in patients who have not yet reached the clinical stage of the disease. Secondary prevention is the prevention of reoccurrence of the same or similar clinical condition of the disease.
Термин «уменьшение риска» охватывает терапию, которая снижает частоту возникновения клинической стадии заболевания. Примерами уменьшения риска заболевания является первичная и вторичная профилактика заболевания.The term "risk reduction" covers therapies that reduce the incidence of clinical disease. Examples of disease risk reduction are primary and secondary disease prevention.
Под «терапевтически/профилактически эффективным количеством (терапевтической дозой)» подразумевается количество лекарственного средства, вводимого пациенту, при котором у него с наибольшей вероятностью проявится ожидаемый терапевтический (профилактический) эффект. Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от многочисленных факторов, таких как тяжесть заболевания, возраст, масса тела, общее состояние организма, комбинированное лечение с другими препаратами и др. Введение лекарственного средства по изобретению субъекту, нуждающемуся в лечении и/или профилактике заболевания или состояния, осуществляется в дозе, достаточной для достижения терапевтического эффекта. При проведении лечения и/или профилактики введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в день, чаще в виде курсового введения на протяжении времени, достаточного для достижения терапевтического эффекта (от нескольких дней до недели, нескольких недель и до месяцев), при этом курсы введения лекарственного средства могут проводиться повторно. В частности, при среднетяжелых формах заболевания разовая доза, кратность и/или длительность введения лекарственного средства по изобретению могут быть увеличены. Предпочтительно слитый белок по изобретению вводят пациенту в составе фармацевтической композиции, включающей, помимо активного компонента, фармацевтически приемлемые носители и/или наполнители.By “therapeutically/prophylactically effective amount (therapeutic dose)” is meant the amount of drug administered to a patient that is most likely to produce the intended therapeutic (prophylactic) effect. The exact amount required may vary from subject to subject depending on numerous factors such as the severity of the disease, age, body weight, general condition of the body, combination treatment with other drugs, etc. Administration of a medicinal product of the invention to a subject in need of treatment and/or prevention of a disease or condition, carried out in a dose sufficient to achieve a therapeutic effect. When carrying out treatment and/or prophylaxis, administration can be carried out either once or several times a day, more often in the form of a course of administration for a time sufficient to achieve a therapeutic effect (from several days to a week, several weeks and up to months), while courses of drug administration can be repeated. In particular, in moderate forms of the disease, the single dose, frequency and/or duration of administration of the drug according to the invention can be increased. Preferably, the fusion protein of the invention is administered to a patient in a pharmaceutical composition comprising, in addition to the active ingredient, pharmaceutically acceptable carriers and/or excipients.
Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.Unless otherwise defined, technical and scientific terms in this application have their standard meanings commonly accepted in the scientific and technical literature.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
В настоящем изобретении предлагаются конструкции ДНК, кодирующие слитые белки (рекомбинантные полипептиды) - антагонисты IL-6, блокирующие провоспалительный ответ, индуцируемый IL-6.The present invention provides DNA constructs encoding IL-6 antagonist fusion proteins (recombinant polypeptides) that block the proinflammatory response induced by IL-6.
В частности, изобретение относится к нуклеотидным конструкциям, кодирующим полипептиды, содержащие IL-6R(D358A), слитые с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека IgG4, IL-6R(D358A)-hFc.In particular, the invention relates to nucleotide constructs encoding polypeptides containing IL-6R(D358A) fused to the constant part (Fc domain) of human immunoglobulin IgG4, IL-6R(D358A)-hFc.
Естественная последовательность белка IL-6R человека состоит из 468 аминокислот (ак) (SEQ ID NO: 1). В состав нативного белка входит сигнальный пептид (1-19 ак SEQ ID NO: 1), экстраклеточный домен (20-365 ак SEQ ID NO: 1), трансмембранный домен (366-386 ак SEQ ID NO: 1) и цитоплазматический домен (387-468 ак SEQ ID NO: 1).The natural sequence of the human IL-6R protein consists of 468 amino acids (aa) (SEQ ID NO: 1). The native protein includes a signal peptide (1-19 aa SEQ ID NO: 1), an extracellular domain (20-365 aa SEQ ID NO: 1), a transmembrane domain (366-386 aa SEQ ID NO: 1) and a cytoplasmic domain ( 387-468 ac SEQ ID NO: 1).
Согласно изобретению, слитый белок - антагонист IL-6, содержит фрагмент экстраклеточного домена белка IL-6R, представленного аминокислотной последовательностью, соответствующей положениям 20-361 последовательности SEQ ID NO: 1 с заменой D358A (Asp358Ala).According to the invention, the IL-6 antagonist fusion protein contains a fragment of the extracellular domain of the IL-6R protein, represented by an amino acid sequence corresponding to positions 20-361 of SEQ ID NO: 1 with the substitution D358A (Asp358Ala).
Терапевтические блокаторы IL-6 (в основном представляющие собой антитела) уже известны для лечения некоторых аутоиммунных заболеваний, однако системная блокировка неизбежно нейтрализует и защитные функции этого цитокина от инфекций. Предлагаемые антагонисты IL-6, представленные слитыми белками по изобретению, учитывают особенности молекулярных сигнальных механизмов в клетках-мишенях и различия в функции IL-6 в зависимости от типов клеток, его продуцирующих. Наличие в рекомбинантным белке замены, соответствующей мутации D358A, способно обеспечить противовоспалительный ответ, потенциально опосредованный через особенности взаимодействия с gp130 или за счет буферной активности IL-6R(D358A)-hFc по отношению к связыванию IL-6.Therapeutic blockers of IL-6 (mainly antibodies) are already known to treat some autoimmune diseases, but systemic blocking inevitably neutralizes the protective functions of this cytokine against infections. The proposed IL-6 antagonists, represented by the fusion proteins of the invention, take into account the features of molecular signaling mechanisms in target cells and differences in the function of IL-6 depending on the types of cells that produce it. The presence in the recombinant protein of a substitution corresponding to the D358A mutation can provide an anti-inflammatory response, potentially mediated through the interaction with gp130 or due to the buffering activity of IL-6R(D358A)-hFc towards IL-6 binding.
Благодаря константной части тяжелой цепи (Fc-фрагмента) IgG4-изотипа человека, входящей в рекомбинантный белок, разработанные гибридные конструкции обладают только минимальной эффекторной функцией антитело-зависимой клеточной цитотоксичности и не обладают комплемент-зависимой цитотоксичностью, что снижает возможный риск воспалительных реакций и сенсибилизацию при использовании терапевтического агента на основе слитого (гибридного) белка IL-6R(D358A)-hFc.Thanks to the constant part of the heavy chain (Fc fragment) of the human IgG4 isotype included in the recombinant protein, the developed hybrid constructs have only a minimal effector function of antibody-dependent cellular cytotoxicity and do not have complement-dependent cytotoxicity, which reduces the possible risk of inflammatory reactions and sensitization during using a therapeutic agent based on the IL-6R(D358A)-hFc fusion protein.
Еще одном преимуществом рекомбинантного белка по изобретению является структура шарнирного участка: включение в слитый белок только части экстраклеточного домена (ак 20-361 вместо ак 20-365) позволило исключить из области, граничащей с шарнирным участком аминокислоты, которые приводят к неструктурированности и снижению растворимости молекулы белка в целом. Одновременное с этим включение в конструкцию фрагмента шарнирного участка PPCPSCP константной части тяжелой цепи IgG4 человека, представленного ак 1-7 SEQ ID NO: 3, позволяет обеспечить необходимый поворот и жесткость без излишней неструктурированности. Таким образом, благодаря особенностям конструкции, рекомбинантный полипептид по изобретению обладает потенциально улучшенными фармакокинетическими свойствами, благодаря тому что экстраклеточный домен белка IL-6R и Fc-домен, входящие в молекулу, могут действовать независимо друг от друга за счет увеличения гибкости на данном участке.Another advantage of the recombinant protein according to the invention is the structure of the hinge region: the inclusion in the fusion protein of only part of the extracellular domain (aa 20-361 instead of aa 20-365) made it possible to exclude amino acids from the region bordering the hinge region, which lead to unstructuredness and reduced solubility of the molecule protein in general. Simultaneous inclusion in the design of a fragment of the hinge region PPCPSCP of the constant part of the human IgG4 heavy chain, represented by aa 1-7 SEQ ID NO: 3, allows us to provide the necessary rotation and rigidity without excessive unstructuredness. Thus, due to the design features, the recombinant polypeptide of the invention has potentially improved pharmacokinetic properties due to the fact that the extracellular domain of the IL-6R protein and the Fc domain included in the molecule can act independently of each other due to increased flexibility in this area.
В рамках настоящего изобретения в процессе разработки новых полипептидных препаратов - ингибиторов действия IL-6 было осуществлено клонирование последовательности, соответствующей функциональной части IL-6R и ее слияние в одной рамке считывания с последовательностью, кодирующей константную часть тяжелой цепи IgG4 человека посредством линкерной последовательности. Слитый белок IL-6R(D358A)-hFc по изобретению также может необязательно содержать сигнальную последовательность, которая может включать любую последовательность, известную квалифицированному специалисту в области управления секрецией полипептида или белка из клетки, и включать природные или синтетические последовательности. Обычно сигнальная последовательность размещается на N-конце слитого белка по настоящему изобретению. В частных вариантах изобретения сигнальная последовательность представлена SEQ ID NO: 4.Within the framework of the present invention, in the process of developing new polypeptide drugs - inhibitors of the action of IL-6, the sequence corresponding to the functional part of IL-6R was cloned and fused in one reading frame with the sequence encoding the constant part of the human IgG4 heavy chain through a linker sequence. The IL-6R(D358A)-hFc fusion protein of the invention may also optionally contain a signal sequence, which may include any sequence known to one skilled in the art of directing the secretion of a polypeptide or protein from a cell, and may include natural or synthetic sequences. Typically, the signal sequence is located at the N-terminus of the fusion protein of the present invention. In particular embodiments of the invention, the signal sequence is represented by SEQ ID NO: 4.
Слитый белок (рекомбинантный полипептид), являющийся объектом настоящего изобретения, может быть получен следующим образом.The fusion protein (recombinant polypeptide) of the present invention can be produced as follows.
Растворимые рекомбинантные полипептиды-антагонисты IL-6 производят в результате экспрессии кодирующих их нуклеотидных последовательностей в эукариотических клеточных линиях, с последующей очисткой синтезированных рекомбинантных белков при помощи аффинной, ионобменной или гидрофобной хроматографии, применяемых по отдельности или в различных сочетаниях друг с другом, а также при помощи иных способов очистки белков. Соответствующие нуклеотидные последовательности получают при помощи комбинирования участков ДНК, кодирующих выбранные домены IL-6R, несущие замену D358A, с последовательностью ДНК, кодирующей Fc-фрагмент IgG4 человека. В некоторых частных вариантах изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие полипептиды-антагонисты IL-6, имеют нуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 5.Soluble recombinant IL-6 antagonist polypeptides are produced by expression of the nucleotide sequences encoding them in eukaryotic cell lines, followed by purification of the synthesized recombinant proteins using affinity, ion exchange or hydrophobic chromatography, used individually or in various combinations with each other, as well as using other methods of protein purification. The corresponding nucleotide sequences are obtained by combining DNA sections encoding selected domains of IL-6R carrying the D358A substitution with a DNA sequence encoding the Fc fragment of human IgG4. In certain particular embodiments, the nucleic acid molecules encoding such IL-6 antagonist polypeptides have a nucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 5.
Также указанная задача решается путем создания экспрессирующего вектора, содержащего данную молекулу нуклеиновой кислоты под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии данной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. В предпочтительных вариантах изобретения в качестве клетки-хозяина, включающей такой экспрессирующий вектор, могут выступать клетки яичников китайских хомячков CHO (например, клеточные линии CHO-К1 или CHO DG44), адаптированные для производства терапевтических белков. В настоящем изобретении экспрессирующий вектор предпочтительно подбирается для экспрессии гетерологичных последовательностей в клетках млекопитающих, но в некоторых вариантах изобретения экспрессирующий вектор может быть выбран для экспрессии в других системах, таких как, например, клетки насекомых, дрожжевые или бактериальные клетки. Соответственно, каждый экспрессирующий вектор имеет свой набор регуляторных элементов, позволяющих проводить экспрессию гетерологичной последовательности (продукта) в клетке-хозяине, таких как промоторы и/или энхансеры, последовательности Козак, polyA последовательности и другие регуляторные последовательности. А также может иметь последовательности, кодирующие лидерные (сигнальные) пептиды, обеспечивающие секрецию рекомбинантных полипептидов во внеклеточную среду. Терминация синтеза белка с заданной изолированной последовательности нуклеиновой кислоты определяется добавлением к ней с 3’-конца в одной рамке считывания одного или нескольких стоп-кодонов.Also, this problem is solved by creating an expression vector containing a given nucleic acid molecule under the control of regulatory elements necessary for the expression of this nucleic acid in the host cell. In preferred embodiments, the host cell comprising such an expression vector may be CHO Chinese hamster ovary cells (eg, CHO-K1 or CHO DG44 cell lines) adapted for the production of therapeutic proteins. In the present invention, the expression vector is preferably selected for expression of heterologous sequences in mammalian cells, but in some embodiments of the invention the expression vector may be selected for expression in other systems, such as, for example, insect cells, yeast or bacterial cells. Accordingly, each expression vector has its own set of regulatory elements that allow expression of a heterologous sequence (product) in the host cell, such as promoters and/or enhancers, Kozak sequences, polyA sequences and other regulatory sequences. It may also have sequences encoding leader (signal) peptides that ensure the secretion of recombinant polypeptides into the extracellular environment. Termination of protein synthesis from a given isolated nucleic acid sequence is determined by the addition of one or more stop codons to it from the 3’ end in one reading frame.
После трансфекции вектора в клетки эукариотической клеточной линии происходит синтез рекомбинантного полипептида и его секреция в культуральную бессывороточную среду. Полученный рекомбинантный полипептид очищают из среды при помощи, как правило, аффинной хроматографии на белок протеин-A или белок протеин-G, однако могут использоваться и другие методы очистки белков.After transfection of the vector into cells of a eukaryotic cell line, the recombinant polypeptide is synthesized and secreted into a serum-free culture medium. The resulting recombinant polypeptide is purified from the medium using, as a rule, affinity chromatography for protein A or protein G, but other protein purification methods can be used.
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.The following examples are provided to highlight the characteristics of the present invention and should not be construed as limiting the scope of the invention in any way.
Пример 1. Конструирование плазмидExample 1: Construction of Plasmids
Для конструирования плазмид с заявляемыми нуклеотидными последовательностями была использована последовательность, кодирующая белок человека IL-1RA, полученная из плазмиды RG221874 (OriGene, IL-6R, Human Tagged ORF clone). Последовательность, кодирующая IL-6R, была использована для клонирования. Для клонирования участка, соответствующему аминокислотам 20-361 для SEQ ID NO: 2 были подобраны следующие праймеры:To construct plasmids with the claimed nucleotide sequences, the sequence encoding the human IL-1RA protein, obtained from plasmid RG221874 (OriGene, IL-6R, Human Tagged ORF clone), was used. The IL-6R coding sequence was used for cloning. To clone the region corresponding to amino acids 20-361 for SEQ ID NO: 2, the following primers were selected:
IL-6R_F: TTAGAATTCGCTGGCCCCAAGGCGCTGC (SEQ ID NO:6)IL-6R_F: TTAGAATTCGCTGGCCCCAAGGCGCTGC (SEQ ID NO:6)
IL-6R_R: TATAGATCTTGAAGAAGAAGCTTGCACTGGGAGG (SEQ ID NO:7)IL-6R_R: TATAGATCTTGAAGAAGAAGCTTGCACTGGGAGG (SEQ ID NO:7)
Проведена ПЦР со следующими условиями: 98°С 1 мин, 30 циклов (98°С 10 сек, 65°С 10 сек, 72°С 2 мин), 72°С 5 мин. Компоненты реакции: полимераза - Phusion (Thermo), буфер, содержащий Mg2+ для Phusion-полимеразы (Thermo), по 10 пкмоль каждого из праймеров и 0,25 мM смеси трифосфатов нуклеотидов (Thermo). Амплификацию осуществляли с последовательности RG221874 (Origene). После ПЦР: ПЦР продукт очищали набором для очистки ПЦР продуктов GeneJet PCR purification kit (Fermentas). Концентрация и соответствие предсказанному молекулярному весу проверяли при помощи гель-электрофореза в 1% агарозе (ТАЕ буфер). Полученные ПЦР продукты были использованы для дальнейшего конструирования.PCR was carried out under the following conditions: 98°C for 1 min, 30 cycles (98°C for 10 sec, 65°C for 10 sec, 72°C for 2 min), 72°C for 5 min. Reaction components: polymerase - Phusion (Thermo), buffer containing Mg2+ for Phusion polymerase (Thermo), 10 pmol of each primer and 0.25 mM mixture of nucleotide triphosphates (Thermo). Amplification was performed from the sequence RG221874 (Origene). After PCR: The PCR product was purified using the GeneJet PCR purification kit (Fermentas). Concentration and consistency with predicted molecular weight were verified by gel electrophoresis in 1% agarose (TAE buffer). The obtained PCR products were used for further design.
Для клонирования целевых последовательностей использовался вектор pFUSE-hIgG4e-Fc2 (InvivoGen), который позволяет получить слитые с Fc-доменом IgG4 последовательности и проводить исследование их свойств. В один из праймеров был включен сайт рестрикции EcoRI (IL-6R_F), а в другой сайт рестрикции BglII (IL-6R_R), что после амплификации и рестрикции позволило получить фрагмент ДНК липкими EcoRI, BglII концами. Вектор и ПЦР-продукт обрабатывали рестриктазами EcoRI (Thermo) и BglII (Thermo) в течение 1 часа при 37°С, затем очищали с помощью GeneJet PCR purification kit (Fermentas) и лигировали, используя 1 Ед (ME) лигазы (Thermo) по протоколу производителя. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli XL1-Blue и высевали на среду LB, содержащую зеоцин. To clone target sequences, the pFUSE-hIgG4e-Fc2 vector (InvivoGen) was used, which allows one to obtain sequences fused to the IgG4 Fc domain and study their properties. One of the primers included an EcoRI restriction site (IL-6R_F), and the other a BglII restriction site (IL-6R_R), which, after amplification and restriction, made it possible to obtain a DNA fragment with sticky EcoRI, BglII ends. The vector and PCR product were treated with restriction enzymes EcoRI (Thermo) and BglII (Thermo) for 1 hour at 37°C, then purified using a GeneJet PCR purification kit (Fermentas) and ligated using 1 U (ME) ligase (Thermo) according to manufacturer's protocol. Competent E. coli XL1-Blue cells were transformed with the ligase mixture and plated on LB medium containing zeocin.
Чашки инкубировали в термостате в течение ночи при 37°C. На следующий день проверяли по 20 колоний из каждой лигазной смеси на присутствие нужной вставки, для этого часть колонии разводили в 20 мкл воды и кипятили в течение 5 минут. После охлаждения смесь откручивали и использовали 1 мкл в качестве матрицы в реакции ПЦР. ПЦР осуществляли при помощи Taq ДНК-полимеразы (Fermentas) и праймеров PROMF2 и FC. Присутствие вставки проверяли после электрофореза ПЦР продуктов. Из двух колоний, содержащих вставку, выделяли плазмидную ДНК, верифицировали длины рестрикционных фрагментов при помощи рестрикции с эндонуклеазами EcoRI и HindIII и секвенировали c использованием праймеров PROMF2 и FC на секвенаторе Applied Biosystems 3500 по инструкции производителя, используя праймеры PROMF2 (прямой) и FC (обратный).The dishes were incubated in a thermostat overnight at 37°C. The next day, 20 colonies from each ligase mixture were checked for the presence of the desired insert; for this, part of the colony was diluted in 20 μl of water and boiled for 5 minutes. After cooling, the mixture was spun and 1 μl was used as a template in the PCR reaction. PCR was performed using Taq DNA polymerase (Fermentas) and primers PROMF2 and FC. The presence of the insert was checked after electrophoresis of the PCR products. Plasmid DNA was isolated from two colonies containing the insert, the lengths of restriction fragments were verified using restriction endonucleases EcoRI and HindIII, and sequenced using primers PROMF2 and FC on an Applied Biosystems 3500 sequencer according to the manufacturer's instructions using primers PROMF2 (forward) and FC (reverse). ).
PROMF2: GCCTGACCCTGCTTGCTCAACT (SEQ ID NO: 8) PROMF2: GCCTGACCCTGCTTGCTCAACT (SEQ ID NO: 8)
FC: CTCACGTCCACCACCACGCA (SEQ ID NO: 9) FC: CTCACGTCCACCACCACGCA (SEQ ID NO: 9)
Сконструированная в результате плазмида, содержащая целевые нуклеотидные последовательности, показана на Фиг. 1.The resulting plasmid containing the target nucleotide sequences is shown in FIG. 1.
Пример 2. Продукция гибридного белкаExample 2 Hybrid Protein Production
Для продукции гибридного белка проводилась временная трансфекция клеток CHO сконструированной плазмидой, кодирующей гибридный белок.To produce the fusion protein, CHO cells were transiently transfected with a constructed plasmid encoding the fusion protein.
Линию клеток СНО культивировали на среде Dynamis, с добавлением Glutamax (6 мМ), Anticlumping reagent B (0,5%) и зеоцина (500 мкг/мл). Культивирование осуществляли в шейкере-СО2-инкубаторе Multitron Cell (Infors, Швейцария) в атмосфере 5%-ного СО2 при температуре 37 °С и относительной влажности 95% в колбах Эрнленмейера (Сorning, США) объемом 125 мл (перемешивание 120 об/мин).The CHO cell line was cultured in Dynamis medium supplemented with Glutamax (6 mM), Anticlumping reagent B (0.5%) and Zeocin (500 μg/ml). Cultivation was carried out in a Multitron Cell shaker- CO2 incubator (Infors, Switzerland) in an atmosphere of 5% CO2 at a temperature of 37 °C and a relative humidity of 95% in Ernlenmeyer flasks (Corning, USA) with a volume of 125 ml (stirring 120 rpm). min).
Для трансфекции клеток CHO выделяли особо чистую («transfection grade») плазмидную ДНК с помощью набора EndoFree Plasmid MaxiKit (Qiagen) по протоколу фирмы-производителя. Линеаризацию сконструированной плазмиды осуществляли по сайту NotI (Thermo). Для трансфекции добавляли 20 мкг линеаризованной плазмиды на 100 мкл клеточной суспензии с концентрацией 5х107 клеток/мл. Электропорация проводилась по протоколу: 3 импульса по 1130 В продолжительностью 20 мс.For transfection of CHO cells, especially pure (“transfection grade”) plasmid DNA was isolated using the EndoFree Plasmid MaxiKit (Qiagen) according to the manufacturer’s protocol. Linearization of the constructed plasmid was carried out at the NotI site (Thermo). For transfection, 20 μg of linearized plasmid was added per 100 μl of cell suspension with a concentration of 5x107 cells/ml. Electroporation was carried out according to the protocol: 3 pulses of 1130 V each with a duration of 20 ms.
Селекцию трансфицированных клеток начинали через 48 часов после трансфекции путем добавления антибиотика зеоцина в концентрации 500 мкг/мл и продолжали ее при дальнейших пересевах.Selection of transfected cells began 48 hours after transfection by adding the antibiotic zeocin at a concentration of 500 μg/ml and continued with further subcultures.
Продукцию белка анализировали при помощи стандартного гель-электрофореза в полиакриамидном геле (SDS-PAGE). Секретируемый гибридный белок визуализировали с использованием кроличьих антител против человечьего Fc-домена (Jackson Immunoresearch, США). Также целевой белок IL-6R(D358A)-hFc из культуральной жидкости очищали путем FPLC хроматографии на колонке HiTrap ProteinA HP (Cytiva) и оценивали методом гель-электрофореза. При культивировании данных пулов была подтверждена продукция слитых полипептидов IL-6R(D358A)-hFc и их секреция в культуральной жидкости.Protein production was analyzed using standard polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The secreted fusion protein was visualized using rabbit anti-human Fc domain antibodies (Jackson Immunoresearch, USA). Also, the target protein IL-6R(D358A)-hFc from the culture liquid was purified by FPLC chromatography on a HiTrap ProteinA HP column (Cytiva) and assessed by gel electrophoresis. When culturing these pools, the production of IL-6R(D358A)-hFc fusion polypeptides and their secretion in the culture liquid was confirmed.
Таким образом, в результате проведенных исследований разработана нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок IL-6R(D358A)-hFc и являющаяся экспрессионной основой для его получения, а также получен слитый белок IL-6R(D358A)-hFc, содержащий фрагмент экстраклеточного домена IL-6R(D358A), слитый с константной частью (Fc-доменом) иммуноглобулина человека IgG4, способный эффективно блокировать IL-6, который может быть использован в терапии и предотвращении развития воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Данное изобретение обладает рядом улучшенных свойств по сравнению с аналогами и поэтому расширяет круг имеющихся кандидатов для лечения и предотвращения развития (снижения риска развития) воспалительных и аутоиммунных заболеваний, особенно ишемической болезни сердца, ревматоидного артрита, диабета второго типа, в патогенезе которых участвует IL-6.Thus, as a result of the research, a nucleotide sequence encoding the IL-6R(D358A)-hFc fusion protein was developed and is the expression basis for its production, and an IL-6R(D358A)-hFc fusion protein was obtained containing a fragment of the extracellular domain of IL-6R(D358A)-hFc. 6R(D358A), fused with the constant part (Fc domain) of human immunoglobulin IgG4, can effectively block IL-6, which can be used in the treatment and prevention of the development of inflammatory and autoimmune diseases. This invention has a number of improved properties compared to analogues and therefore expands the range of available candidates for the treatment and prevention of development (reducing the risk of development) of inflammatory and autoimmune diseases, especially coronary heart disease, rheumatoid arthritis, type 2 diabetes, in the pathogenesis of which IL-6 is involved .
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.Although the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that the specific experiments detailed are provided for purposes of illustrating the present invention only and should not be construed as limiting the scope of the invention in any way. It should be understood that various modifications can be made without departing from the spirit of the present invention.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"
fileName="IL-6R(D358A)-hFc.xml" softwareName="WIPO Sequence" fileName="IL-6R(D358A)-hFc.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-11-27">softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-11-27">
<ApplicantFileReference>4103252</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>4103252</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Общество с ограниченной <ApplicantName languageCode="ru">Limited company
ответственностью "Пальмира Биофарма" </ApplicantName>responsibility of Palmira Biopharma </ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>"PALMIRA BIOPHARMA" Limited Liability <ApplicantNameLatin>"PALMIRA BIOPHARMA" Limited Liability
Company</ApplicantNameLatin>Company</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, <InventionTitle languageCode="en">NUCLEOTIDE SEQUENCE,
КОДИРУЮЩАЯ СЛИТЫЙ БЕЛОК, СОСТОЯЩИЙ ИЗ РАСТВОРИМОГО ЭКСТРАКЛЕТОЧНОГО ENCODING A FUSION PROTEIN CONSISTING OF A SOLUBLE EXTRACELLULAR
ФРАГМЕНТА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО IL-6R И КОНСТАНТНОЙ ЧАСТИ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ FRAGMENT OF HUMAN IL-6R AND CONSTANT HEAVY CHAIN PART
ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО IgG4</InventionTitle>HUMAN IgG4</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>9</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>9</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>468</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>468</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..468</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..468</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"> <INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MLAVGCALLAALLAAPGAALAPRRCPAQEVARGVLTSLPGDSVTLTCPG <INSDSeq_sequence>MLAVGCALLAALLAAPGAALAPRRCPAQEVARGVLTSLPGDSVTLTTCPG
VEPEDNATVHWVLRKPAAGSHPSRWAGMGRRLLLRSVQLHDSGNYSCYRAGRPAGTVHLLVDVPPEEPQLVEPEDNATVHWVLRKPAAGSHPSRWAGMGRLLLRSVQLHDSGNYSCYRAGRPAGTVHLLVDVPPEEPQL
SCFRKSPLSNVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGDSSFYISCFRKSPLSNVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGDSSFYI
VSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYRAVSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYRA
ERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPAENEVSTERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPAENEVST
PMQALTTNKDDDNILFRDSANATSLPVQDSSSVPLPTFLVAGGSLAFGTLLCIAIVLRFKKTWKLRALKEPMQALTTNKDDDNILFRDSANATSLPVQDSSSVPLPTFLVAGGSLAFGTLLCIAIVLRFKKTWKLRALKE
GKTSMHPPYSLGQLVPERPRPTPVLVPLISPPVSPSSLGSDNTSSHNRPDARDPRSPYDISNTDYFFPR<GKTSMHPPYSLGQLVPERPRPTPVLVPLISPPVSPSSLGSDNTSSHNRPDARDPRSPYDISNTDYFFPR<
/INSDSeq_sequence>/INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>588</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>588</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..588</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..588</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"> <INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MYRMQLLSCIALSLALVTNSLAPRRCPAQEVARGVLTSLPGDSVTLTCP <INSDSeq_sequence>MYRMQLLSCIALSLALVTNSLAPRRCPAQEVARGVLTSLPGDSVTLTCP
GVEPEDNATVHWVLRKPAAGSHPSRWAGMGRRLLLRSVQLHDSGNYSCYRAGRPAGTVHLLVDVPPEEPQGVEPEDNATVHWVLRKPAAGSHPSRWAGMGRLLLRSVQLHDSGNYSCYRAGRPAGTVHLLVDVPPEEPQ
LSCFRKSPLSNVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGDSSFYLSCFRKSPLSNVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGDSSFY
IVSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYRIVSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYR
AERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPAENEVSAERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPAENEVS
TPMQALTTNKDDDNILFRDSANATSLPVQASSSRSPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPETPMQALTTNKDDDNILFRDSANATSLPVQASSSRSPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE
VTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGL
PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>224</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>224</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..224</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..224</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"> <INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPE <INSDSeq_sequence>PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPE
VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQ
PREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTV
DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>DKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"> <SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8"> <INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MYRMQLLSCIALSLALVTNS</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>MYRMQLLSCIALSLALVTNS</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5"> <SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>1764</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>1764</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1764</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..1764</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10"> <INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttg <INSDSeq_sequence>atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttg
tcacgaattcgctggccccaaggcgctgccctgcgcaggaggtggcgagaggcgtgctgaccagtctgcctcacgaattcgctggccccaaggcgctgccctgcgcaggaggtggcgagaggcgtgctgaccagtctgcc
aggagacagcgtgactctgacctgcccgggggtagagccggaagacaatgccactgttcactgggtgctcaggagacagcgtgactctgacctgcccgggggtagagccggaagacaatgccactgttcactgggtgctc
aggaagccggctgcaggctcccaccccagcagatgggctggcatgggaaggaggctgctgctgaggtcggaggaagccggctgcaggctcccaccccagcagatgggctggcatgggaaggaggctgctgctgaggtcgg
tgcagctccacgactctggaaactattcatgctaccgggccggccgcccagctgggactgtgcacttgcttgcagctccacgactctggaaactattcatgctaccgggccggccgcccagctgggactgtgcacttgct
ggtggatgttccccccgaggagccccagctctcctgcttccggaagagccccctcagcaatgttgtttgtggtggatgttccccccgaggagccccagctctcctgcttccggaagagccccctcagcaatgttgtttgt
gagtggggtcctcggagcaccccatccctgacgacaaaggctgtgctcttggtgaggaagtttcagaacagagtggggtcctcggagcaccccatccctgacgacaaaggctgtgctcttggtgaggaagtttcagaaca
gtccggccgaagacttccaggagccgtgccagtattcccaggagtcccagaagttctcctgccagttagcgtccggccgaagacttccaggagccgtgccagtattcccaggagtcccagaagttctcctgccagttagc
agtcccggagggagacagctctttctacatagtgtccatgtgcgtcgccagtagtgtcgggagcaagttcagtcccggagggagacagctctttctacatagtgtccatgtgcgtcgccagtagtgtcgggagcaagttc
agcaaaactcaaacctttcagggttgtggaatcttgcagcctgatccgcctgccaacatcacagtcactgagcaaaactcaaacctttcagggttgtggaatcttgcagcctgatccgcctgccaacatcacagtcactg
ccgtggccagaaacccccgctggctcagtgtcacctggcaagacccccactcctggaactcatctttctaccgtggccagaaacccccgctggctcagtgtcacctggcaagaccccactcctggaactcatctttcta
cagactacggtttgagctcagatatcgggctgaacggtcaaagacattcacaacatggatggtcaaggaccagactacggtttgagctcagatatcgggctgaacggtcaaagacattcacaacatggatggtcaaggac
ctccagcatcactgtgtcatccacgacgcctggagcggcctgaggcacgtggtgcagcttcgtgcccaggctccagcatcactgtgtcatccacgacgcctggagcggcctgaggcacgtggtgcagcttcgtgcccagg
aggagttcgggcaaggcgagtggagcgagtggagcccggaggccatgggcacgccttggacagaatccagaggagttcgggcaaggcgagtggagcgagtggagcccggaggccatgggcacgccttggacagaatccag
gagtcctccagctgagaacgaggtgtccacccccatgcaggcacttactactaataaagacgatgataatgagtcctccagctgagaacgaggtgtccacccccatgcaggcacttactactaataaagacgatgataat
attctcttcagagattctgcaaatgcgacaagcctcccagtgcaagcttcttcttcaagatctcccccatattctcttcagagattctgcaaatgcgacaagcctcccagtgcaagcttcttcttcaagatctcccccat
gcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggagcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaagga
cactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgagcactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgag
gtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtgtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagt
tcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtatcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagta
caagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagcaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcag
ccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgaccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggatgaccaagaaccaggtcagcctga
cctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaa
caactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtgcaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtg
gacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactgacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccact
acacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa</INSDSeq_sequence>acacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6"> <SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12"> <INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttagaattcgctggccccaaggcgctgc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ttagaattcgctggccccaaggcgctgc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7"> <SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>34</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>34</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..34</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..34</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14"> <INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tatagatcttgaagaagaagcttgcactgggagg</INSDSeq_seque <INSDSeq_sequence>tatagatcttgaagaagaagcttgcactgggagg</INSDSeq_seque
nce>nce>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8"> <SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16"> <INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcctgaccctgcttgctcaact</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>gcctgaccctgcttgctcaact</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9"> <SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18"> <INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctcacgtccaccaccacgca</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>ctcacgtccaccaccacgca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (13)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2818329C1 true RU2818329C1 (en) | 2024-05-02 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007009018A2 (en) * | 2005-07-13 | 2007-01-18 | Amgen Mountain View Inc. | Il-6 binding proteins |
| RU2369616C2 (en) * | 2003-12-30 | 2009-10-10 | Мерк Патент Гмбх | Fused proteins il-7 |
| US7927583B2 (en) * | 1998-09-25 | 2011-04-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Receptor based antagonists and methods of making and using |
| RU2780161C1 (en) * | 2018-12-28 | 2022-09-20 | Юнайтед Байомедикал, Инк. | Peptide immunogens targeting interleukin 6 (il-6) and compositions thereof for immunotherapy of diseases affected by impaired il-6 regulation |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7927583B2 (en) * | 1998-09-25 | 2011-04-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Receptor based antagonists and methods of making and using |
| RU2369616C2 (en) * | 2003-12-30 | 2009-10-10 | Мерк Патент Гмбх | Fused proteins il-7 |
| WO2007009018A2 (en) * | 2005-07-13 | 2007-01-18 | Amgen Mountain View Inc. | Il-6 binding proteins |
| RU2780161C1 (en) * | 2018-12-28 | 2022-09-20 | Юнайтед Байомедикал, Инк. | Peptide immunogens targeting interleukin 6 (il-6) and compositions thereof for immunotherapy of diseases affected by impaired il-6 regulation |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GARBERS C. et al., The interleukin-6 receptor Asp358Ala single nucleotide polymorphism rs2228145 confers increased proteolytic conversion rates by ADAM proteases, Biochimica et biophysica acta, 2014, vol. 1842 (9), pp. 1485-94. SALEMI R et al., Co-Occurrence of Interleukin-6 Receptor Asp358Ala Variant and High Plasma Levels of IL-6: An Evidence of IL-6 Trans-Signaling Activation in Deep Vein Thrombosis (DVT) Patients, Biomolecules, 2022, 12 (5): 681. * |
| JOSTOCK T et al., Immunoadhesins of interleukin-6 and the IL-6/soluble IL-6R fusion protein hyper-IL-6, Journal of Immunological Methods, Volume 223, Issue 2, 1999, pp. 171-183. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2018202982B2 (en) | Fusion immunomodulatory proteins and methods for making same | |
| RU2711979C2 (en) | Interleukin 15 protein complex and use thereof | |
| JP7231553B2 (en) | TGF-B-receptor ectodomain fusion molecule and uses thereof | |
| EP0617126B1 (en) | Polypeptide capable of inhibiting the binding between human IL-6 and its receptor | |
| JP5372917B2 (en) | Optimized TACI-Fc fusion protein | |
| JP4272348B2 (en) | Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use | |
| JP2008509666A (en) | Binding domain fusion protein | |
| AU2005296277A1 (en) | Chimeric protein | |
| US7696154B2 (en) | Methods for treating interleukin-18 mediated disorders with interleukin-18 binding proteins | |
| TW201841944A (en) | 4-1bbl variant and fused protein comprising same | |
| CA2399298A1 (en) | Use of il-18 inhibitors | |
| US20080292628A1 (en) | Chimeric Protein | |
| JP2022538139A (en) | Immune complex comprising mutant interleukin-2 and anti-CD8 antibody | |
| US7704944B2 (en) | Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use for the treatment of sepsis | |
| CN118085103A (en) | Compounds and methods for treating pain | |
| WO2015172305A1 (en) | Fusion protein inhibiting taci-baff complex formation and preparation method therefor and use thereof | |
| JP5390191B2 (en) | Soluble gp130 molecular variant useful as a medicine | |
| WO2023222035A1 (en) | Fusion protein of anti-tigit antibody and il2 or variant thereof, and application thereof | |
| JP2023542049A (en) | Interleukin-2 muteins and their uses | |
| CN115916831A (en) | Fusion proteins comprising anti-LAG-3 antibodies and IL-2 and uses thereof | |
| RU2818329C1 (en) | Nucleotide sequence coding fusion protein consisting of soluble extracellular fragment of human il-6r and constant part of heavy chain of human igg4 | |
| JP2017508446A (en) | Bifunctional fusion protein and production method and use thereof | |
| JP4635255B2 (en) | Antibody medicine | |
| RU2821896C1 (en) | NUCLEOTIDE SEQUENCE CODING FUSED PROTEIN CONSISTING OF FUNCTIONAL FRAGMENT OF HUMAN IL-1RA AND CONSTANT PART OF HEAVY CHAIN OF HUMAN IgG4 | |
| WO2021143733A1 (en) | Fusion protein, preparation method therefor and use thereof |