RU2817234C2 - Reporter monoclonal cell line hek-293/5-ht4r, expressing murine recombinant serotonin receptor type 5ht4 - Google Patents
Reporter monoclonal cell line hek-293/5-ht4r, expressing murine recombinant serotonin receptor type 5ht4 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2817234C2 RU2817234C2 RU2022125909A RU2022125909A RU2817234C2 RU 2817234 C2 RU2817234 C2 RU 2817234C2 RU 2022125909 A RU2022125909 A RU 2022125909A RU 2022125909 A RU2022125909 A RU 2022125909A RU 2817234 C2 RU2817234 C2 RU 2817234C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ht4r
- cells
- cell
- receptor
- hek
- Prior art date
Links
- 108091032151 5-hydroxytryptamine receptor family Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 102000040125 5-hydroxytryptamine receptor family Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 241001529936 Murinae Species 0.000 title claims abstract description 11
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims abstract description 43
- 102100040385 5-hydroxytryptamine receptor 4 Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 8
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 230
- 108091005482 5-HT4 receptors Proteins 0.000 description 150
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 49
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 40
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 33
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 30
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 30
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 20
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 20
- 101000964065 Homo sapiens 5-hydroxytryptamine receptor 4 Proteins 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 16
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 15
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 15
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 13
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 11
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 11
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 11
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 10
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 9
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 8
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 8
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 7
- 108010072564 5-HT2A Serotonin Receptor Proteins 0.000 description 6
- 102000049773 5-HT2A Serotonin Receptor Human genes 0.000 description 6
- 102100027499 5-hydroxytryptamine receptor 1B Human genes 0.000 description 6
- 101710138639 5-hydroxytryptamine receptor 1B Proteins 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 4
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 3
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101000964064 Mus musculus 5-hydroxytryptamine receptor 4 Proteins 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 3
- 102100036321 5-hydroxytryptamine receptor 2A Human genes 0.000 description 2
- 101710138091 5-hydroxytryptamine receptor 2A Proteins 0.000 description 2
- 102100024959 5-hydroxytryptamine receptor 2C Human genes 0.000 description 2
- 101710138093 5-hydroxytryptamine receptor 2C Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101100356682 Caenorhabditis elegans rho-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 102100038389 Guanine nucleotide exchange factor for Rab-3A Human genes 0.000 description 2
- 101000743758 Homo sapiens Guanine nucleotide exchange factor for Rab-3A Proteins 0.000 description 2
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 2
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 2
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 2
- 101150111584 RHOA gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 229940126513 cyclase activator Drugs 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 2
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 150000003906 phosphoinositides Chemical class 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010072553 5-HT2C Serotonin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000006902 5-HT2C Serotonin Receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000007325 Amelogenin Human genes 0.000 description 1
- 108010007570 Amelogenin Proteins 0.000 description 1
- 206010003658 Atrial Fibrillation Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013830 Calcium-Sensing Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010050543 Calcium-Sensing Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091005462 Cation channels Proteins 0.000 description 1
- 108010029240 Cell-Tak Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 208000020401 Depressive disease Diseases 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 102100033299 Glia-derived nexin Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 101710111459 Hermansky-Pudlak syndrome 5 protein homolog Proteins 0.000 description 1
- 238000010867 Hoechst staining Methods 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000997803 Homo sapiens Glia-derived nexin Proteins 0.000 description 1
- 101000777646 Homo sapiens Uncharacterized protein encoded by LINC01587 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000001702 Intracellular Signaling Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010068964 Intracellular Signaling Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000019695 Migraine disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 101000964049 Rattus norvegicus 5-hydroxytryptamine receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000042463 Rho family Human genes 0.000 description 1
- 108091078243 Rho family Proteins 0.000 description 1
- 102100023361 SAP domain-containing ribonucleoprotein Human genes 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 101710139423 THO complex subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031590 Uncharacterized protein encoded by LINC01587 Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000164 antipsychotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940005529 antipsychotics Drugs 0.000 description 1
- 244000309743 astrovirus Species 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000009287 biochemical signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008758 canonical signaling Effects 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000003520 dendritic spine Anatomy 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000006277 exogenous ligand Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003400 hallucinatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000008991 intestinal motility Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 206010027599 migraine Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 230000001337 psychedelic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003196 psychodysleptic agent Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 102000030938 small GTPase Human genes 0.000 description 1
- 108060007624 small GTPase Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины, и касается создания репортерных клеток, экспрессирующих мышиный рекомбинантный серотониновый рецептор типа 5-НТ4 и способных дозозависимо детектировать появление серотонина во внешней среде. В основе изобретения - репортерные моноклональные модифицированные клетки HEK-293/5-HT4R, гетерологически экспрессирующие мышиный рекомбинантный рецептор серотонина типа 5-НТ4, слитый с флуоресцентным белком GFP. Полученные клетки могут быть использованы для неинвазивного оптического мониторинга локализации 5-НТ4 рецептора, а так же, за счет обогащения флуоресцентным генетически кодируемым белком-сенсором внутриклеточного сАМР, дозозависимых внутриклеточных сАМР-сигналов, инициируемых серотонином и другими лигандами 5-НТ4 рецептора, в частности, для доклинического скрининга потенциальных лекарственных соединений и регистрации секреции серотонина различными типами клеток.The invention relates to the field of experimental biology and medicine, and concerns the creation of reporter cells expressing murine recombinant serotonin receptor type 5-HT4 and capable of dose-dependently detecting the appearance of serotonin in the external environment. The invention is based on modified monoclonal reporter cells HEK-293/5-HT4R, heterologously expressing a murine recombinant serotonin receptor type 5-HT4 fused with the fluorescent protein GFP. The resulting cells can be used for non-invasive optical monitoring of the localization of the 5-HT4 receptor, and also, due to the enrichment of the fluorescent genetically encoded intracellular cAMP sensor protein, dose-dependent intracellular cAMP signals initiated by serotonin and other ligands of the 5-HT4 receptor, in particular, for preclinical screening of potential drug compounds and recording of serotonin secretion by various cell types.
Предшествующий уровень техникиPrior Art
Серотонин - возможно наиболее известный и наиболее изученный нейромедиатор, модулирующий практически все поведенческие реакции человека, а также многочисленные физиологические процессы, включая регуляцию сердечно-сосудистой и дыхательной систем, перистальтику кишечника, контроль мочевого пузыря, агрегацию тромбоцитов, развитие тканей и т.д. Рецепторы серотонина распространены не только в центральной нервной системе, но и на периферии, они являются мишенями примерно для 40% одобренных к настоящему моменту терапевтических препаратов и остаются одной из самых прибыльных и многообещающих мишеней для разработки новых лекарств от нервных заболеваний, начиная от мигрени и заканчивая нервно-психическими расстройствами, такими как шизофрения и депрессия. Согласно современной классификации, существует семь типов 5-НТ рецепторов (5-НТ1-7), которые представляют собой семи-трансмембранные GPCR (G-белок связанные рецепторы), за исключением 5-НТ3, являющегося лиганд-управляемым катионным каналом [1, 2].Serotonin is perhaps the best known and most studied neurotransmitter, modulating virtually all human behavioral responses, as well as numerous physiological processes, including regulation of the cardiovascular and respiratory systems, intestinal motility, bladder control, platelet aggregation, tissue development, etc. Serotonin receptors are distributed not only in the central nervous system but also in the periphery, they are targets for approximately 40% of currently approved therapeutic drugs and remain one of the most profitable and promising targets for the development of new drugs for nervous diseases ranging from migraine to neuropsychiatric disorders such as schizophrenia and depression. According to modern classification, there are seven types of 5-HT receptors (5-HT1-7), which are seven-transmembrane GPCRs (G-protein coupled receptors), with the exception of 5-HT3, which is a ligand-gated cation channel [1, 2 ].
Серотониновые GPCR связаны со всеми тремя каноническими сигнальными путями через Gαi, Gαq/11 и Gαs белки, позволяя этому семейству рецепторов модулировать несколько биохимических сигнальных путей и приводя к самым разнообразным физиологическим последствиям. При скрининге потенциальных лекарственных препаратов широко используются клеточные линии, экспрессирующие какой-либо подтип серотонинового рецептора, позволяющие проводить наблюдения за клетками прижизненно в условиях физиологического эксперимента.Serotonin GPCRs are linked to all three canonical signaling pathways via the Gαi, Gαq/11, and Gαs proteins, allowing this family of receptors to modulate multiple biochemical signaling pathways and leading to a wide variety of physiological consequences. When screening potential drugs, cell lines expressing any subtype of the serotonin receptor are widely used, allowing for intravital observations of cells under physiological experimental conditions.
Известно изобретение, где описан химерный флуоресцентный белок psychLight, созданный на основе рецептора серотонина типа 5-НТ2А и флуоресцентного белка cpGFP, вставленного на место 3й трансмембранной петли в рецептор 5-НТ2А, что позволяет визуализовать конформационные изменения рецептора вследствие связывания с лигандом. Авторы предполагают, что изобретение будет полезно для скрининга лекарств из ряда нейролептиков и психоделиков, мишенью для которых является серотониновый 5-НТ2А рецептор [3]. Хотя предложенное изобретение вероятно позволит оценить величину галлюциногенного эффекта препаратов, авторами не описывается, как влияет конформационное изменение, внесенное в структуру 5-НТ2А рецептора, на последующее взаимодействие рецептора с G-белками и сигнальным фосфолипазным каскадом, им активируемым.An invention is known that describes a chimeric fluorescent protein psychLight, created on the basis of the 5-HT2A serotonin receptor and the cpGFP fluorescent protein inserted in place of the 3rd transmembrane loop in the 5-HT2A receptor, which makes it possible to visualize conformational changes in the receptor due to binding to the ligand. The authors suggest that the invention will be useful for screening drugs from a number of antipsychotics and psychedelics, the target of which is the serotonin 5-HT2A receptor [3]. Although the proposed invention will likely make it possible to estimate the magnitude of the hallucinogenic effect of the drugs, the authors do not describe how the conformational change introduced into the structure of the 5-HT2A receptor affects the subsequent interaction of the receptor with G-proteins and the phospholipase signaling cascade activated by it.
Известно изобретение химерного флуоресцентного белка GRAB на основе рецептора серотонина типа 5-НТ2С и флуоресцентного белка cpGFP, так же вставленного в 3ю внутриклеточную петлю белка рецептора и меняющего интенсивность флуоресценции при связывании лиганда. Авторы продемонстрировали работу фосфоинозитидного каскада, активируемого лигандами 5-НТ2С рецептора, методом кальциевого имиджинга при окрашивании клеток флуоресцентным химическим зондом Cal590. Помимо временной экспресии белка GRAB в клетках НЕК-293Т, авторы проводили исследования на срезах мозга мыши и на самцах дрозофиллы, что позволило визуализовать секрецию серотонина в этих объектах [4].The invention of a chimeric fluorescent protein GRAB is known based on the serotonin receptor type 5-HT2C and the fluorescent protein cpGFP, which is also inserted into the 3rd intracellular loop of the receptor protein and changes the fluorescence intensity upon binding of the ligand. The authors demonstrated the operation of the phosphoinositide cascade, activated by ligands of the 5-HT2C receptor, using calcium imaging when staining cells with the fluorescent chemical probe Cal590. In addition to the temporary expression of the GRAB protein in HEK-293T cells, the authors conducted studies on mouse brain slices and male Drosophila, which made it possible to visualize the secretion of serotonin in these objects [4].
Известно изобретение, где GFP использовался для опосредованного мечения экспрессии 5-НТ1В рецептора серотонина. Для модификации первичной культуры нейронов и непосредственно животных авторы использовали генетическую конструкцию на базе вируса герпеса, в которой под двумя разными промоторами содержались нуклеотидные последовательности для независимой экспрессии GFP и 5-НТ1В [5]. Данный подход позволяет визуализовать модифицированные клетки, однако не позволяет оценить локализацию 5-НТ1В рецептора, так как рецептор должен встроится и функционировать в клеточной мембране, a GFP, являясь водорастворимым белком, полностью окрашивает цитоплазму клетки.An invention is known where GFP was used to indirectly mark the expression of the 5-HT1B serotonin receptor. To modify the primary culture of neurons and animals themselves, the authors used a genetic construct based on the herpes virus, which contained nucleotide sequences under two different promoters for independent expression of GFP and 5-HT1B [5]. This approach allows visualization of modified cells, but does not allow assessing the localization of the 5-HT1B receptor, since the receptor must be integrated and function in the cell membrane, and GFP, being a water-soluble protein, completely stains the cell cytoplasm.
Известно изобретение линий клеток с экспрессией крысиного рецептора серотонина типа 5-НТ2А и флуоресцентного белка GFP, где слияние двух этих белков осуществлено в плазмиде pEGFP-N1. Авторы получили несколько клеточных линий НЕК-293, с разным уровнем экспрессии рецептора 5-НТ2А, слитого с GFP, и выбрали две наиболее яркие линии для дальнейших экспериментов по исследованию интернализации 5-НТ2А рецептора под воздействием разных факторов [6].It is known to invent cell lines expressing the rat serotonin receptor type 5-HT2A and the fluorescent protein GFP, where the fusion of these two proteins is carried out in the pEGFP-N1 plasmid. The authors obtained several HEK-293 cell lines with different levels of expression of the 5-HT2A receptor fused with GFP, and selected the two most striking lines for further experiments to study the internalization of the 5-HT2A receptor under the influence of various factors [6].
Все вышеперечисленные рецепторы - 5-НТ2А, 5-НТ2С и 5-НТ1В - связаны с фосфоинозитидным каскадом, тогда как 5-НТ4 рецептор, используемый в нашем изобретении связан с аденилатциклазным сигнальным каскадом.All of the above receptors - 5-HT2A, 5-HT2C and 5-HT1B - are associated with the phosphoinositide cascade, while the 5-HT4 receptor used in our invention is associated with the adenylate cyclase signaling cascade.
Рецептор 5-НТ4 (5-HT4R) вызывает особый интерес, так как экспрессируется во многих тканях организма и его активация связана с обучением и памятью, депрессией, реакцией на стресс, контролем дыхания, питанием, транзитом пищи через желудочно-кишечный тракт и др. Так же предполагается, что антагонисты 5-HT4R обладают клиническим потенциалом в лечении мерцательной аритмии и сердечной недостаточности.The 5-HT4 receptor (5-HT4R) is of particular interest because it is expressed in many tissues of the body and its activation is associated with learning and memory, depression, stress response, respiratory control, nutrition, transit of food through the gastrointestinal tract, etc. It is also suggested that 5-HT4R antagonists have clinical potential in the treatment of atrial fibrillation and heart failure.
Известно изобретение, где предлагается способ идентификации химических соединений, специфически связывающихся с 5-HT4R млекопитающих. Авторы впервые выделили и клонировали нуклеотидную последовательность 5-НТ4 рецептора крысы и человека в плазмиды pBluescript-hS10, pcEXV-S10-87 и pcEXV-S10-95 (плазмиды, содержащие последовательности 5-HT4R, задепонированы в американской коллекции АТСС (№№75392, 75390, 75391) и в настоящий момент недоступны для поиска и приобретения). Авторы разработали антитела, специфичные к 5-HT4R, и антисмысловые нуклеотидные последовательности, уменьшающие уровень экспрессии 5-HT4R при введении в объект исследования. Для получения клеточных мембран, содержащих 5-HT4R, авторы осуществили временную экспрессию рецептора в клетках COS-7, для чего последовательность 5-HT4R была клонирована в плазмиду pcDNA1-Amp, которая не содержит гена маркера селекции для клеток млекопитающих и не содержит последовательности флуоресцентного белка, позволяющего неинвазивно оценить уровень экспрессии целевого белка в клетках [7, 8].An invention is known that proposes a method for identifying chemical compounds that specifically bind to mammalian 5-HT4R. The authors were the first to isolate and clone the nucleotide sequence of the rat and human 5-HT4 receptor into the plasmids pBluescript-hS10, pcEXV-S10-87 and pcEXV-S10-95 (plasmids containing the 5-HT4R sequences were deposited in the American ATCC collection (No. 75392, 75390, 75391) and are currently not available for search and purchase). The authors developed antibodies specific to 5-HT4R and antisense nucleotide sequences that reduce the level of 5-HT4R expression when introduced into the test subject. To obtain cell membranes containing 5-HT4R, the authors transiently expressed the receptor in COS-7 cells, for which the 5-HT4R sequence was cloned into the pcDNA1-Amp plasmid, which does not contain the selection marker gene for mammalian cells and does not contain a fluorescent protein sequence , which allows non-invasive assessment of the level of expression of the target protein in cells [7, 8].
Известно изобретение, авторы которого описывают 2 сплайс-варианта серотонинового 5-HT4R человека (5-НТ4(с) и 5-HT4(d)). Основываясь на полученных нуклеотидных последовательностях, авторы описывают два полипептида (или любые их полипептидные фрагменты или биологически активные производные), имеющих фармакологическую активность серотонинового 5-HT4R. Для экспрессии рецептора в клетках млекопитающих, авторы клонировали 5-HT4R в плазмиду pRc/CMV, которая содержит ген маркера селекции для клеток млекопитающих, но не содержит последовательности флуоресцентного маркерного белка. При проведении исследований авторы использовали клетки COS-7, временно экспрессирующие 5-HT4R, и клетки СНО, стабильно экспрессирующие плазмиду pRc/CMV с рецептором 5-НТ4. Полученные клетки CHO+pRc/CMV+5-HT4R обладают устойчивостью к антибиотику генецитину (G418), что уменьшает возможности дальнейшей дополнительной модификации клеток, поскольку это наиболее распространенный маркер селекции. Неинвазивная визуализация локализации рецептора 5-НТ4 в клетках CHO+pRc/CMV+5-HT4R невозможна [9].An invention is known, the authors of which describe 2 splice variants of human serotonin 5-HT4R (5-HT4(c) and 5-HT4(d)). Based on the obtained nucleotide sequences, the authors describe two polypeptides (or any polypeptide fragments or biologically active derivatives thereof) having pharmacological activity of the serotonin 5-HT4R. To express the receptor in mammalian cells, we cloned 5-HT4R into the pRc/CMV plasmid, which contains the mammalian cell selection marker gene but does not contain the fluorescent marker protein sequence. In conducting the studies, the authors used COS-7 cells that transiently express 5-HT4R and CHO cells that stably express the pRc/CMV plasmid with the 5-HT4 receptor. The resulting CHO+pRc/CMV+5-HT4R cells are resistant to the antibiotic genecitin (G418), which reduces the possibility of further additional cell modification, since this is the most common selection marker. Non-invasive visualization of 5-HT4 receptor localization in CHO+pRc/CMV+5-HT4R cells is not possible [9].
Известно изобретение, описывающее экспрессию 5-HT4R в разных тканях человека: мозге, желудочно-кишечном тракте, ткани сердца, печени, легких и т.д. Для скрининга экспрессии авторы брали последовательность 5-HT4R человека из базы данных под обозначением Y12505 SEQ ID NO: 1. Так же авторы описывают праймеры для выделения последовательности 5-HT4R и возможные способы получения плазмид, пригодных для гетерогенной экспрессии 5-HT4R в различных клетках, однако клеточной линии, экспрессирующей 5-HT4R получено не было [10].An invention is known that describes the expression of 5-HT4R in various human tissues: brain, gastrointestinal tract, heart tissue, liver, lungs, etc. For expression screening, the authors took the human 5-HT4R sequence from the database under the designation Y12505 SEQ ID NO: 1. The authors also describe primers for isolating the 5-HT4R sequence and possible methods for obtaining plasmids suitable for heterogeneous expression of 5-HT4R in various cells, however, no cell line expressing 5-HT4R has been obtained [10].
Известно изобретение, в котором для оценки эффективности препаратов, мишенью которых является 5-HT4R, использовались клетки СНО-К1, с постоянной оверэкспрессией 5-НТ4(b) - человеческого сплайс-варианта рецептора. Авторы использовали слияние 5-HT4R на N- конце с FLAG-тагом, клетки использовались для анализа продукции сАМР под влиянием исследуемых препаратов методом иммуногистохимии, проведение исследований осуществлялось на фиксированных (дополнительно обработанных неживых) клетках [11].An invention is known in which CHO-K1 cells with constant overexpression of 5-HT4(b), a human splice variant of the receptor, were used to evaluate the effectiveness of drugs targeting 5-HT4R. The authors used a fusion of 5-HT4R at the N-terminus with a FLAG tag; the cells were used to analyze the production of cAMP under the influence of the studied drugs using immunohistochemistry; the studies were carried out on fixed (additionally treated non-living) cells [11].
Известно использование эндогенных рецепторов серотонина 5-НТ4, слитых с разными метками (НА, FLAG, RhoTag), для изучения влияния димеризации рецептора 5-HT4R на активацию G-белка в клетках COS-7, временно экспрессирующих рецепторы 5-НТ4 [12].It is known to use endogenous serotonin 5-HT4 receptors fused with different tags (HA, FLAG, RhoTag) to study the effect of 5-HT4R receptor dimerization on G-protein activation in COS-7 cells transiently expressing 5-HT4 receptors [12].
Известно изучение разницы в интернализации двух изоформ 5-HT4R после активации серотонином и экзогенным лигандом и участие в этом процессе внутриклеточных молекул на клетках НЕК-293 с постоянной экспрессией серотониновых рецепторов. Авторы работы использовали мечение рецепторов специфичными тагами, узнаваемыми коммерческими антителами, используемыми в методе ELISA и при получении микрофотографий на конфокальном микроскопе. Хотя в работе показана зависимость процента интернализованного рецептора от времени, измерения выполнялись в отдельных временных точках на разных препаратах фиксированных клеток, мониторинг в реальном времени не проводился, так же для визуализации экспрессии рецептора клетки дополнительно обрабатывались [13].It is known to study the difference in the internalization of two 5-HT4R isoforms after activation by serotonin and an exogenous ligand and the participation of intracellular molecules in this process on HEK-293 cells with constant expression of serotonin receptors. The authors of the work used tagging of receptors with specific tags, recognizable commercial antibodies, used in the ELISA method and when obtaining micrographs on a confocal microscope. Although the work shows the dependence of the percentage of internalized receptor on time, measurements were performed at separate time points on different preparations of fixed cells, real-time monitoring was not carried out, and cells were additionally processed to visualize receptor expression [13].
Известно исследование взаимодействия С-конца 5-HT4R с внутриклеточными сигнальными белками, где авторы использовали клетки НЕК-293, временно экспрессирующие RhoTag-5-HT4R и нексин HA-SNX27, участвующий в интернализации 5-HT4R. При помощи иммуноцитохимии, требующей фиксации и обработки клеток, было показано взаимодействие и колокализация этих белков [14].There is a known study of the interaction of the C-terminus of 5-HT4R with intracellular signaling proteins, where the authors used HEK-293 cells transiently expressing RhoTag-5-HT4R and nexin HA-SNX27, which is involved in the internalization of 5-HT4R. Using immunocytochemistry, which requires fixation and processing of cells, the interaction and colocalization of these proteins has been demonstrated [14].
Существенным недостатком ряда перечисленных изобретений является использование для визуализации рецептора меток-тагов, специфичных для определенных коммерческих вторичных антител. Этот подход достаточно информативен, но используя его можно визуализовать локализацию белка только постфактум на обработанных неживых клетках. Так же отметим, что при использовании иммуноферментного/радиоиммунного анализа, измерения проводятся в одной временной точке каждый раз на новом препарате клеток, что не позволяет вести наблюдения в реальном времени и затрудняет осуществление внутреннего контроля. Описанные выше примеры не дают возможности мониторинга изменений концентрации внутриклеточных молекул на коротких промежутках времени, что особенно важно при исследовании влияния агонистов рецепторов. Так же данные, полученные на клеточном лизате, могут не отражать важных характеристик физиологического ответа живых клеток.A significant drawback of a number of the listed inventions is the use of tags specific for certain commercial secondary antibodies for receptor visualization. This approach is quite informative, but using it it is possible to visualize protein localization only after the fact on treated non-living cells. We also note that when using enzyme immunoassay/radioimmunoassay, measurements are carried out at one time point each time on a new cell preparation, which does not allow for real-time observations and complicates internal control. The examples described above do not make it possible to monitor changes in the concentration of intracellular molecules over short periods of time, which is especially important when studying the effect of receptor agonists. Also, data obtained from cell lysates may not reflect important characteristics of the physiological response of living cells.
Использование экспрессионной плазмиды, обеспечивающей слияние рецептора с флуоресцентным белком, позволяет осуществить мониторинг локализации рецептора (провести физиологические эксперименты) в реальном времени на живых клетках.The use of an expression plasmid that ensures the fusion of the receptor with a fluorescent protein makes it possible to monitor the localization of the receptor (carry out physiological experiments) in real time on living cells.
Наиболее близким по сути к предлагаемому изобретению является работа, в которой осуществлена прижизненная визуализация 5-HT4R, где использовался эндогенный рецептор серотонина, клонированный в плазмиду pcDNA 3.1 и слитый на С-конце с флуоресцентным белком (eGFP, mCherry или mCerulean), временно экспрессируемый в клетках нейробластомы N1E-115, в которой была визуализована ретракция мембраны при участии G-белка G13 и малой GTPaзы семейства Rho - RhoA. [15]. Изобретение можно считать прототипом, однако авторы использовали другую клеточную линию. Мы предлагаем использовать клетки НЕК-293, доступные к приобретению в России, которые наиболее часто используются в качестве исходных клеток для получения репортерных линий.The closest in essence to the proposed invention is the work in which intravital visualization of 5-HT4R was carried out, where the endogenous serotonin receptor was used, cloned into the pcDNA 3.1 plasmid and fused at the C-terminus with a fluorescent protein (eGFP, mCherry or mCerulean), temporarily expressed in neuroblastoma cells N1E-115, in which membrane retraction was visualized with the participation of the G-protein G13 and the small GTPase of the Rho family - RhoA. [15]. The invention can be considered a prototype, but the authors used a different cell line. We propose to use HEK-293 cells, available for purchase in Russia, which are most often used as source cells for obtaining reporter lines.
Другим существенным недостатком прототипа (как и ряда других работ [7-9, 12, 14]) является использование временной трансфекции без получения стабильной клеточной линии. Следует отметить, что сама процедура липофекции отрицательно сказывается на физиологии клеток, что может оказывать влияние на достоверность полученных результатов. Так же требуется перед каждым экспериментом повторять процедуру трансфекции клеток, для чего требуется большое количество исходных клеток, реактивов для осуществления трансфекции, плазмиды, кодирующей белок интереса. После осуществления трансфекции (временная экспрессия) только часть клеток популяции экспрессирует целевой белок (5-30% в зависимости от условий трансфекции), уровень экспрессии значительно варьируется от клетки к клетке, так же клетки без селекции могут экспрессировать целевой белок ограниченное время после введения фрагмента его ДНК в клетку, поскольку защитные системы элиминируют введенные чужеродные ДНК-последовательности (спустя 7 и более дней после трансфекции не наблюдалось экспрессии флуоресцентных целевых белков в клеточной популяции, прошедшей трансфекцию). Это приводит к тому, что при каждом эксперименте объект исследований будет несколько различным, что может привести к получению противоречивых результатов исследований.Another significant drawback of the prototype (as well as a number of other works [7-9, 12, 14]) is the use of temporary transfection without obtaining a stable cell line. It should be noted that the lipofection procedure itself has a negative effect on cell physiology, which may affect the reliability of the results obtained. It is also necessary to repeat the cell transfection procedure before each experiment, which requires a large number of starting cells, reagents for transfection, and a plasmid encoding the protein of interest. After transfection (temporary expression), only part of the population cells expresses the target protein (5-30% depending on transfection conditions), the level of expression varies significantly from cell to cell, and cells without selection can express the target protein for a limited time after the introduction of its fragment DNA into the cell, since protective systems eliminate introduced foreign DNA sequences (7 or more days after transfection, no expression of fluorescent target proteins was observed in the transfected cell population). This leads to the fact that in each experiment the object of research will be slightly different, which can lead to conflicting research results.
Получение клеточной линии, стабильно экспрессирующей белок интереса, что осуществлено в некоторых изобретениях [9, 11, 13], более удобно в эксперименте по сравнению с временной экспрессией, однако так же имеет свои недостатки - поскольку получаемая линия поликлональна (имеет в составе множество клеток-родителей), только около половины клеток полученной популяции несут целевые белки, уровень экспрессии от клетки к клетке различается, их содержание падает с течением времени (при постоянном культивировании клеток более 1 месяца в популяции может остаться менее 10% позитивных клеток) за счет случайных мутаций.Obtaining a cell line that stably expresses a protein of interest, which is carried out in some inventions [9, 11, 13], is more convenient in an experiment compared to temporary expression, but it also has its drawbacks - since the resulting line is polyclonal (has many cells - parents), only about half of the cells in the resulting population carry the target proteins, the level of expression varies from cell to cell, their content decreases over time (with constant cell culture for more than 1 month, less than 10% of positive cells may remain in the population) due to random mutations.
В настоящее время не описано постоянных клеточных линий, позволяющих осуществлять прижизненный мониторинг локализации 5-HT4R на мембране и его возможное перераспределение под действием агонистов. Ни одно из существующих технических решений не позволяет проводить серию экспериментов по прижизненной регистрации локализации мышиного серотонинового рецептора типа 5-НТ4 и его перераспределения под воздействием лигандов на мембране клеток.Currently, no permanent cell lines have been described that allow for intravital monitoring of 5-HT4R localization on the membrane and its possible redistribution under the influence of agonists. None of the existing technical solutions allows us to conduct a series of experiments on intravital recording of the localization of the mouse serotonin receptor type 5-HT4 and its redistribution under the influence of ligands on the cell membrane.
Задачей изобретения является получение репортерной моноклональной линии клеток, стабильно и на высоком уровне экспрессирующей мышиный рекомбинантный рецептор серотонина типа 5-НТ4, слитый с флуоресцентным белком.The objective of the invention is to obtain a reporter monoclonal cell line that stably and at a high level expresses the murine recombinant 5-HT4 serotonin receptor fused with a fluorescent protein.
Поставленная задача решается за счет получения клеточной линии НЕК-293/5-HT4R, все клетки которой будут характеризоваться стабильной оверэкспрессией мышиного рецептора серотонина типа 5-НТ4, слитого на С-конце с зеленым флуоресцентным белком GFP, на основе линии клеток почек эмбриона человека НЕК-293.This problem is solved by obtaining the HEK-293/5-HT4R cell line, all cells of which will be characterized by stable overexpression of the mouse serotonin receptor type 5-HT4, fused at the C-terminus with the green fluorescent protein GFP, based on the human embryonic kidney cell line HEK -293.
Техническим результатом является стабильная оверэкспрессия мышиного рекомбинантного рецептора серотонина типа 5-НТ4, слитого на С-конце с зеленым флуоресцентным белком GFP (химерный белок AcGFPl/5-HT4R) в полученной репортерной моноклональной линии HEK-293/5-HT4R. Экспрессия белка AcGFPl/5-HT4R сохраняется в клетках полученной линии как минимум в течение 3-х месяцев непрерывного культивирования.The technical result is the stable overexpression of the mouse recombinant 5-HT4 type serotonin receptor fused at the C-terminus with the green fluorescent protein GFP (chimeric protein AcGFPl/5-HT4R) in the resulting monoclonal reporter line HEK-293/5-HT4R. Expression of the AcGFPl/5-HT4R protein is maintained in the cells of the resulting line for at least 3 months of continuous cultivation.
Приобретенные (экспрессия химерного белка AcGFP1/5-HT4R и гена устойчивости к селективному антибиотику гигромицину) и сохраненные (адгезия, эпителиоподобная морфология с наличием дендрито-подобных отростков у клеток, жизнеспособность и время удвоения популяции) свойства делают полученную репортерную моноклональную линию клеток HEK-293/5-HT4R пригодной для исследования прижизненной динамики локализации 5-HT4R под действием различных лигандов. С помощью дополнительной модификации путем встраивания в клетки флуоресцентного белка-сенсора сАМР для визуализации работы аденилатциклазного сигнального каскада, линия HEK-293/5-HT4R может использоваться для проведения доклинического тестирования потенциальных лекарственных соединений, а так же для детекции секреции серотонина клетками различных типов [16]. Заданные и приобретенные свойства репортерной моноклональной линии клеток НЕК-293/5-HT4R делают ее уникальным объектом для проведения неинвазивного оптического мониторинга в соответствующей области исследований.Acquired (expression of the chimeric protein AcGFP1/5-HT4R and the resistance gene to the selective antibiotic hygromycin) and retained (adhesion, epithelial-like morphology with the presence of dendrite-like processes in cells, viability and population doubling time) properties make the resulting reporter monoclonal cell line HEK-293 /5-HT4R suitable for studying the intravital dynamics of 5-HT4R localization under the influence of various ligands. With the help of additional modification by incorporating the fluorescent cAMP sensor protein into cells to visualize the operation of the adenylate cyclase signaling cascade, the HEK-293/5-HT4R line can be used for preclinical testing of potential drug compounds, as well as for detecting serotonin secretion by various types of cells [16 ]. The specified and acquired properties of the reporter monoclonal cell line HEK-293/5-HT4R make it a unique object for non-invasive optical monitoring in the relevant field of research.
Изобретение иллюстрируют графические материалы:The invention is illustrated by graphic materials:
Фиг. 1 Схематичная карта плазмидного вектора pAcGFP1-Hyg-N1, гдеFig. 1 Schematic map of the plasmid vector pAcGFP1-Hyg-N1, where
pUC ori - область начала репликации (ориджин) плазмиды;pUC ori - region of origin of replication (origin) of the plasmid;
Р CMV IE - конститутивный промотор цитомегаловируса, регулирующий экспрессию целевого белка (5-HT4R);P CMV IE - constitutive promoter of cytomegalovirus, regulating the expression of the target protein (5-HT4R);
MCS - кассета множественных сайтов для встраивания последовательности целевого белка, содержащая сайт HindIII - непосредственно сайт встраивания 5-HT4R;MCS - multiple site cassette for insertion of the target protein sequence, containing a HindIII site - directly the 5-HT4R insertion site;
AcGFP1 - последовательность гена флуоресцентного зеленого белка GFP;AcGFP1 - sequence of the fluorescent green protein GFP gene;
SV40 poly А - сигнал полиаденилирования;SV40 poly A - polyadenylation signal;
SV40 ori Р SV40 е - регуляторный элемент для экспрессии гена устойчивости к гигромицину;SV40 ori P SV40 e - regulatory element for expression of the hygromycin resistance gene;
Hyg - ген устойчивости к антибиотику гигромицину для селекции стабильных линий клеток млекопитающих;Hyg - resistance gene to the antibiotic hygromycin for selection of stable mammalian cell lines;
Р - бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину;P - bacterial promoter of the ampicillin resistance gene;
Amp - Ampicillin resistance gene - ген устойчивости к ампициллину для наработки плазмиды в E.coli.Amp - Ampicillin resistance gene - ampicillin resistance gene for plasmid production in E.coli.
Фиг. 2 Конфокальные изображения клеток HEK-293/5-HT4R, гдеFig. 2 Confocal images of HEK-293/5-HT4R cells, where
А - фотография клеток в проходящем свете, Б - флуоресценция клеток, индуцированная экспрессией мышиного рекомбинантного рецептора серотонина типа 5-НТ4, слитого на С-конце с зеленым флуоресцентным белком GFP (химерный белок AcGFP1/5-HT4R) (длина волны возбуждения флуоресценции = 496 нм, длина волны эмиссии флуоресценции = 500 - 560 нм); г - те же клетки в проходящем свете. Масштаб изображений указан в правом нижнем углу.A - photograph of cells in transmitted light, B - fluorescence of cells induced by the expression of the mouse recombinant serotonin receptor type 5-HT4 fused at the C-terminus with the green fluorescent protein GFP (chimeric protein AcGFP1/5-HT4R) (fluorescence excitation wavelength = 496 nm, fluorescence emission wavelength = 500 - 560 nm); d - the same cells in transmitted light. The scale of the images is indicated in the lower right corner.
Фиг. 3 Конфокальные изображения клеток в составе разных моноклональных линий HEK-293/5-HT4R в проходящем свете с наложенной флуоресценцией белка AcGFP1/5-HT4R, где:Fig. 3 Confocal images of cells in different monoclonal lines HEK-293/5-HT4R in transmitted light with superimposed fluorescence of the AcGFP1/5-HT4R protein, where:
А - изображение клеток «плохого» клона, который был отбракован; Б - изображение клеток «хорошего» клона, клетки которого были протестированы в физиологических экспериментах и криоконсервированы. Длина волны возбуждения флуоресценции=496 нм, длина волны эмиссии флуоресценции = 500 - 560 нм, масштаб изображений указан в правом нижнем углу.A - image of cells from a “bad” clone that was rejected; B - image of cells from a “good” clone, the cells of which were tested in physiological experiments and cryopreserved. Fluorescence excitation wavelength = 496 nm, fluorescence emission wavelength = 500 - 560 nm, image scale is indicated in the lower right corner.
Фиг. 4 Репрезентативная регистрация флуоресценции Pink Flamindo (λex = 572 ± 17.5 λem =634 ± 34 нм) одиночной клетки HEK-293/5-HT4R при стимуляции активатором аденилатциклазы Forskolin (35 мкМ), активатором 5-HT4R серотонином (10 нМ). Моменты и продолжительность аппликаций веществ обозначены горизонтальными линиями выше экспериментальной кривой.Fig. 4 Representative registration of Pink Flamindo fluorescence (λ ex = 572 ± 17.5 λ em = 634 ± 34 nm) of a single HEK-293/5-HT4R cell upon stimulation with the adenylate cyclase activator Forskolin (35 μM), the 5-HT4R activator serotonin (10 nM). The moments and duration of application of substances are indicated by horizontal lines above the experimental curve.
Фиг. 5 Репрезентативная регистрация флуоресценции Pink Flamindo (λex = 572 ± 17.5 нм, λem = 634 ± 34 нм) одиночной клетки HEK-293/5-HT4R при стимуляции активатором 5-HT4R серотонином в разных концентрациях (0,3 - 100 нМ), демонстрирующая дозозависимость клеточных ответов. Моменты, продолжительность аппликаций обозначены горизонтальными линиями выше экспериментальной кривой, над линиями указана концентрация серотонина.Fig. 5 Representative registration of Pink Flamindo fluorescence (λ ex = 572 ± 17.5 nm, λ em = 634 ± 34 nm) of a single HEK-293/5-HT4R cell upon stimulation with the 5-HT4R activator serotonin at different concentrations (0.3 - 100 nM) , demonstrating dose dependence of cellular responses. The moments and duration of applications are indicated by horizontal lines above the experimental curve; the concentration of serotonin is indicated above the lines.
Описание изобретенияDescription of the invention
Поскольку большинство животных моделей различных заболеваний создано на мышах для удобства содержания, воспроизводства и проведения исследований, представляется актуальным получение клеточной модели с подтипом именно мышиного серотонинового рецептора 5-НТ4, что позволит проводить эксперименты и интерпретировать результаты, сопоставляя их с данными, полученными на животных (мышиных) моделях. В изобретении использована последовательность белка мышиного рецептора серотонина 5-НТ4, соответствующая аминокислотной последовательности NP_032339 мышиного белка 5-НТ4 из базы данных NCBI [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_032339.2], соответствующая нуклеотидам 207-1376 последовательности NM_008313.4 из базы данных NCBI [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_008313.4] и имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 3.Since most animal models of various diseases were created in mice for ease of maintenance, reproduction and research, it seems relevant to obtain a cell model with a subtype of the mouse serotonin 5-HT4 receptor, which will allow experiments and interpretation of the results, comparing them with data obtained in animals ( mouse) models. The invention uses the sequence of the mouse serotonin 5-HT4 receptor protein, corresponding to the amino acid sequence NP_032339 of the mouse 5-HT4 protein from the NCBI database [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_032339.2], corresponding to nucleotides 207 -1376 sequence NM_008313.4 from the NCBI database [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_008313.4] and having the nucleotide sequence SEQ ID No. 3.
Для экспрессии белка мышиного рекомбинантного серотонинового рецептора типа 5-НТ4 использовалась коммерческая плазмида (вектор) для экспрессии белков в клетках млекопитающих pAcGFP1-Hyg-N1 (Takara Bio) (Фиг. 1), где по сайту HindIII в рамку слияния с геном белка GFP была вставлена последовательность SEQ ID No. 3, соответствующая участку гена мышиного рецептора серотонина 5-НТ4, что позволяет экспрессировать в клетках химерный белок, состоящий из функциональных фрагментов рецептора и флуоресцентного белка GFP. Полученная плазмида pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R содержит ген устойчивости к ампициллину для наработки плазмиды в E.coli, и ген устойчивости к селективному антибиотику гигромицину для возможности осуществления селективного отбора в клетках млекопитающих [https://www.takarabio.com/documents/Vector%20Documents/PT3837-5.pdf], что позволит при необходимости осуществить дополнительную модификацию клеток плазмидами с генами устойчивости к другим антибиотикам, в частности наиболее распространенному G418 (генецитин).To express the mouse recombinant serotonin receptor type 5-HT4 protein, a commercial plasmid (vector) was used for protein expression in mammalian cells pAcGFP1-Hyg-N1 (Takara Bio) (Fig. 1), where the HindIII site in frame fusion with the GFP protein gene was SEQ ID No. inserted. 3, corresponding to a region of the mouse serotonin 5-HT4 receptor gene, which allows the expression in cells of a chimeric protein consisting of functional fragments of the receptor and the GFP fluorescent protein. The resulting plasmid pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R contains a resistance gene to ampicillin for production of the plasmid in E. coli, and a resistance gene to the selective antibiotic hygromycin to enable selective selection in mammalian cells [https://www.takarabio.com/ documents/Vector%20Documents/PT3837-5.pdf], which will allow, if necessary, additional modification of cells with plasmids with genes for resistance to other antibiotics, in particular the most common G418 (genecitin).
Флуоресцентный белок GFP, экспрессия которого обусловлена использованием плазмиды pAcGFP1-Hyg-N1, обладает спектральными характеристиками (λex = 498 нм, λem = 522 нм), которые в дальнейшем при необходимости позволят одновременно использовать: 1) белок-сенсор Pink Flamindo (λex = 567 нм, λem = 590 нм) для мониторинга уровня с AMP; 2) флуоресцентный химический Са2+ зонд - Fura-2 (λex = 340 нм, λех =380 нм, λem1 = 520 нм); 3) белок-сенсор GEM-GECO1 (λex = 390 нм, λem1 = 455 нм, λem2 = 511 нм) для мониторинга уровня внутриклеточного Са2+, и т.д. [16-18]. Спектры возбуждения перечисленных белков-сенсоров и красителей не пересекаются, что позволяет осуществлять прижизненный мониторинг локализации рецептора в мембране и его возможную интернализацию, и проводить после дополнительной модификации клеток одновременный и независимый мониторинг работы внутриклеточных сигнальных каскадов, через наблюдение за динамикой внутриклеточных сАМР и Са2+.The GFP fluorescent protein, the expression of which is due to the use of the pAcGFP1-Hyg-N1 plasmid, has spectral characteristics (λ ex = 498 nm, λ em = 522 nm), which in the future, if necessary, will allow the simultaneous use of: 1) Pink Flamindo sensor protein (λ ex = 567 nm, λ em = 590 nm) for level monitoring with AMP; 2) fluorescent chemical Ca2+ probe - Fura-2 (λ ex = 340 nm, λ ex =380 nm, λ em1 = 520 nm); 3) sensor protein GEM-GECO1 (λ ex = 390 nm, λ em1 = 455 nm, λ em2 = 511 nm) for monitoring the level of intracellular Ca 2+ , etc. [16-18]. The excitation spectra of the listed sensor proteins and dyes do not overlap, which allows for intravital monitoring of the localization of the receptor in the membrane and its possible internalization, and after additional cell modification, simultaneous and independent monitoring of the operation of intracellular signaling cascades, through monitoring the dynamics of intracellular cAMP and Ca 2+ .
Исходным материалом для получения репортерной моноклональной линии клеток HEK-293/5-HT4R является линия НЕК-293 - клетки почки эмбриона человека женского пола, трансформированные ДНК аденовируса типа 5 (Ad 5), которая часто используется как модельная система для встраивания различных мембранных и цитоплазматических белков, и которая доступна для приобретения в России (Российская коллекция клеточных культур (РККК) при Институте Цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). Исходная линия культивируется в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (4.5 г/л) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone), 100 мг/мл гентамицина (Sigma), 2 мМ глутамина (Sigma) (ростовая среда) во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2 в воздухе при 37°С как адгезионная культура. Для пересева используется смесь трипсин 0.25%: версен 0.02% (1:2), кратность рассева составляет 1:2 - 1:6, оптимальная плотность 3.0-5.0×104 кл/см2, жизнеспособность 85%.The starting material for obtaining the reporter monoclonal cell line HEK-293/5-HT4R is the HEK-293 line - female human embryonic kidney cells transformed with DNA of adenovirus type 5 (Ad 5), which is often used as a model system for the integration of various membrane and cytoplasmic proteins, and which is available for purchase in Russia (Russian Collection of Cell Cultures (RCCC) at the Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences (St. Petersburg, Russia). The original line is cultured in DMEM with a high glucose content (4.5 g/l) with the addition of 10% embryonic bovine serum (HyClone), 100 mg/ml gentamicin (Sigma), 2 mM glutamine (Sigma) (growth medium) in a humid atmosphere with 5% CO 2 in air at 37°C as an adhesion culture, a trypsin mixture of 0.25 is used for subculture. %: versen 0.02% (1:2), sieving ratio is 1:2 - 1:6, optimal density 3.0-5.0×10 4 cells/cm 2 , viability 85%.
Клеточная линия HEK-293/5-HT4R получена путем трансфекции клеток исходной линии клеток человека НЕК-293 плазмидой pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R, содержащей участок гена мышиного серотонинового рецептора 5-НТ4 и последующей многоэтапной селекцией (отбор клеток на антибиотике, отбор на клеточном сортере, визуальный отбор, физиологическое тестирование).The HEK-293/5-HT4R cell line was obtained by transfecting cells of the original human cell line HEK-293 with the pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R plasmid containing a region of the mouse serotonin receptor 5-HT4 gene and subsequent multi-stage selection (cell selection on an antibiotic, cell sorter selection, visual selection, physiological testing).
Клетки полученной репортерной моноклональной линии HEK-293/5-HT4R культивируются прикрепленными к пластику до достижения монослоя в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (4.5 г/л) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone), 100 мг/мл гентамицина (Sigma), 2 мМ глутамина (Sigma), 200 мкг/мл селективного антибиотика гигромицина во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2 в воздухе при 37°С как адгезионная культура. Для пересева используется смесь трипсин 0.25%: версен 0.02% (1:2), кратность рассева составляет 1:2 - 1:4, оптимальная плотность 3.0-5.0×104 кл/см2, время удвоения около 30 часов. Для криоконсервации при температуре -196°С используется смесь из 90% эмбриональной бычьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида при концентрации клеток 1-2×106 в 1 мл. Жизнеспособность после криоконсервации составила 75-85% по окраске трипановым синим, после разморозки клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2-3 пассажей. Контроль полученной клеточной линии на посторонние контаминанты осуществлялся культивированием в среде без антибиотиков с последующей оценкой с помощью световой микроскопиии и окраской по Хехсту - бактерии, грибы и микоплазма не обнаружены.Cells of the resulting reporter monoclonal line HEK-293/5-HT4R are cultured attached to plastic until a monolayer is achieved in DMEM with a high glucose content (4.5 g/l) supplemented with 10% fetal bovine serum (HyClone), 100 mg/ml gentamicin (Sigma ), 2 mM glutamine (Sigma), 200 μg/ml of the selective antibiotic hygromycin in a humid atmosphere with 5% CO 2 in the air at 37°C as an adhesion culture. For reseeding, a mixture of trypsin 0.25%: versene 0.02% (1:2) is used, the sieving ratio is 1:2 - 1:4, the optimal density is 3.0-5.0×10 4 cells/cm 2 , the doubling time is about 30 hours. For cryopreservation at a temperature of -196°C, a mixture of 90% fetal bovine serum and 10% dimethyl sulfoxide is used at a cell concentration of 1-2×10 6 in 1 ml. Viability after cryopreservation was 75-85% as determined by trypan blue staining; after thawing, the cells restored their original growth and morphological properties within 2-3 passages. Control of the resulting cell line for foreign contaminants was carried out by cultivation in a medium without antibiotics, followed by evaluation using light microscopy and Hoechst staining - bacteria, fungi and mycoplasma were not detected.
Полученная клеточная линия HEK-293/5-HT4R характеризуется экспрессией серотонинового рецептора мыши типа 5-НТ4, слитого с GFP (Фиг. 2, 3), и фактора устойчивости к селективному антибиотику гигромицину, а так же следующими свойствами:The resulting cell line HEK-293/5-HT4R is characterized by the expression of the mouse serotonin receptor type 5-HT4, fused with GFP (Fig. 2, 3), and the resistance factor to the selective antibiotic hygromycin, as well as the following properties:
- средней степенью адгезивности;- average degree of adhesiveness;
- эпителиоподобной морфологией;- epithelial-like morphology;
- клетки равномерно распределяются по дну культуральной посуды при пересеве, прикрепляются к пластику в течение 24-30 часов, распластываются и формируют длинные и дендритоподобные отростки, которые укорачиваются в процессе культивирования, по мере роста и деления образуют сеть на поверхности и приобретают полигональную форму с небольшими отростками, со временем образуют плотный монослой, полностью покрывающий дно культуральной посуды;- cells are evenly distributed along the bottom of the culture dish during reseeding, attached to the plastic within 24-30 hours, spread out and form long and dendrite-like processes, which shorten during cultivation, as they grow and divide, they form a network on the surface and acquire a polygonal shape with small shoots, over time form a dense monolayer that completely covers the bottom of the culture dish;
- вариативностью формы и размеров (диапазон 10-15 мкм), ядра клеток крупные с неправильной овальной формой, цитоплазма слабозерниста;- variability in shape and size (range 10-15 µm), cell nuclei are large with an irregular oval shape, the cytoplasm is slightly granular;
- время удвоения роста клеток составляет около 30 часов;- cell growth doubling time is about 30 hours;
- жизнеспособность клеток составляет 75-85%;- cell viability is 75-85%;
- культивирование клеток проводят в стандартных условиях (подробно описано выше) в присутствии селективного антибиотика гигромицина.- cell cultivation is carried out under standard conditions (described in detail above) in the presence of the selective antibiotic hygromycin.
В клеточной популяции полученной репортерной моноклональной клеточной линии HEK-293/5-HT4R все клетки стабильно и на высоком уровне экспрессируют мышиный рекомбинантный рецептор серотонина типа 5-НТ4, сохраняющий физиологическую активность, что позволяет использовать полученную линию для проведения физиологических экспериментов с высокой эффективностью за счет однородности клеточной популяции (Фиг. 3Б). Высокий стабильный уровень экспрессии 5-HT4R в клетках полученной линии сохранялся длительное время - не детектировалось заметного уменьшения экспрессии целевого белка спустя 3 месяца постоянного культивирования клеточного клона. Репортерная моноклональная клеточная линия HEK-293/5-HT4R, экспрессирующая мышиный рекомбинантный рецептор серотонина типа 5НТ4, слитый на С-конце с флуоресцентным белком GFP, может использоваться в in vivo экспериментах по изучению локализации рецептора, в частности, его интернализации во время и после воздействия некоторых препаратов. Полученная линия предполагает как возможность прижизненной визуализации, так и, при необходимости, визуализацию рецептора можно осуществить на обработанных (зафиксированных тем или иным образом) клетках, причем это не требует дополнительных манипуляций (окрашивания антителами), поскольку при обработке происходит фиксация белка рецептора 5-НТ4, слитого с флуоресцентным белком GFP.In the cell population of the obtained reporter monoclonal cell line HEK-293/5-HT4R, all cells stably and at a high level express the murine recombinant serotonin receptor type 5-HT4, which retains physiological activity, which allows the obtained line to be used for physiological experiments with high efficiency due to homogeneity of the cell population (Fig. 3B). A high stable level of 5-HT4R expression in the cells of the resulting line was maintained for a long time - no noticeable decrease in the expression of the target protein was detected after 3 months of constant cultivation of the cell clone. The reporter monoclonal cell line HEK-293/5-HT4R, expressing the murine recombinant serotonin receptor type 5HT4 fused at the C-terminus with the fluorescent protein GFP, can be used in in vivo experiments to study the localization of the receptor, in particular, its internalization during and after effects of certain drugs. The resulting line suggests both the possibility of intravital visualization and, if necessary, visualization of the receptor can be carried out on treated (fixed in one way or another) cells, and this does not require additional manipulations (antibody staining), since the treatment fixes the 5-HT4 receptor protein fused to the fluorescent protein GFP.
Получение репортерной моноклональной линии HEK-293/5-HT4R.Generation of the monoclonal reporter line HEK-293/5-HT4R.
Получение линии клеток HEK-293/5-HT4R, стабильно и на высоком уровне экспрессирующих мышиный серотониновый рецептор типа 5-НТ4, соответствующий аминокислотной последовательности NP_032339 мышиного белка 5-HT4R из базы данных NCBI [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_032339.2], слитый с зеленым флуоресцентным белком GFP выполнялось в несколько последовательных этапов (раундов селекции/отбора):Obtaining a HEK-293/5-HT4R cell line that stably and at a high level expresses the mouse serotonin receptor type 5-HT4, corresponding to the amino acid sequence NP_032339 of the mouse 5-HT4R protein from the NCBI database [https://www.ncbi.nlm.nih .gov/protein/NP_032339.2], fused with the green fluorescent protein GFP, was carried out in several successive stages (selection/selection rounds):
A) На первом этапе получали экспрессионный вектор pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R, содержащий последовательность участка гена серотонинового рецептора типа 5-НТ4, соответствующий SEQ ID No. 3, для чего последовательно осуществляли:A) At the first stage, the expression vector pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R was obtained, containing the sequence of the 5-HT4 serotonin receptor gene region corresponding to SEQ ID No. 3, for which we sequentially carried out:
1) Клонирование полноразмерной кДНК, кодирующей серотониновый рецептор 5-НТ4 из ткани мозга мыши;1) Cloning of full-length cDNA encoding the serotonin 5-HT4 receptor from mouse brain tissue;
2) Амплификацию полноразмерной кДНК рецептора 5-НТ4 мыши;2) Amplification of the full-length cDNA of the mouse 5-HT4 receptor;
3) Очистку полученного ПЦР-фрагмента при помощи набора для экстракции из геля QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen);3) Purification of the resulting PCR fragment using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen);
4) Клонирование очищенного ПЦР-фрагмента в вектор pAcGFP1-Hyg-N1 (Takara Bio). Идентичность последовательности 5-HT4R в составе рекомбинантного плазмидного вектора pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R была подтверждена секвенированием по Сенгеру.4) Cloning the purified PCR fragment into the pAcGFP1-Hyg-N1 vector (Takara Bio). The identity of the 5-HT4R sequence in the recombinant plasmid vector pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R was confirmed by Sanger sequencing.
Б) На втором этапе осуществляли трансфекцию клеток НЕК-293 экспрессионным плазмидным вектором pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R для временной экспрессии белка 5-HT4R.B) At the second stage, HEK-293 cells were transfected with the expression plasmid vector pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R for temporary expression of the 5-HT4R protein.
B) На третьем этапе при помощи многоэтапной селекции (отбора) получали репортерную моноклональную линию клеток HEK-293/5-HT4R, все клетки которой стабильно и на высоком уровне экспрессируют химерный белок AcGFP1/5-HT4R (слитый с флуоресцентным белком GFP и сцепленный с аденилатциклазным каскадом серотониновый рецептор мыши типа 5-НТ4, сохраняющий функциональную активность), процедура получения включала:B) At the third stage, using multi-stage selection (selection), a reporter monoclonal cell line HEK-293/5-HT4R was obtained, all cells of which stably and at a high level express the chimeric protein AcGFP1/5-HT4R (fused with the fluorescent protein GFP and linked to adenylate cyclase cascade mouse serotonin receptor type 5-HT4, which retains functional activity), the production procedure included:
1) химическую селекцию путем культивирования трансфицированных на этапе Б) клеток в присутствии антибиотика гигромицина;1) chemical selection by cultivating cells transfected at stage B) in the presence of the antibiotic hygromycin;
2) механический отбор клеток HEK-293/5-HT4R, обладающих наибольшей интенсивностью флуоресценции GFP (λex = 488 нм, λem = 525 ± 20, где: λех - длина волны возбуждения флуоресценции, λem - длина волны эмиссии флуоресценции) с помощью клеточного сортера;2) mechanical selection of HEK-293/5-HT4R cells with the highest GFP fluorescence intensity (λ ex = 488 nm, λ em = 525 ± 20, where: λex is the fluorescence excitation wavelength, λem is the fluorescence emission wavelength) using cell sorter;
3) визуальный отбор (селекцию) моноклональных линий клеток HEK-293/5-HT4R с помощью флуоресцентного микроскопа по интенсивности свечения GFP и процентному отношению флуоресцирующих клеток в популяции (Фиг. 2, 3) и последующее наращивание отобранных моноклональных линий клеток HEK-293/5-HT4R в количестве, достаточном для проведения физиологических экспериментов и криоконсервации (до 10-20×106 клеток каждого клона);3) visual selection (selection) of monoclonal cell lines HEK-293/5-HT4R using a fluorescent microscope based on the intensity of GFP luminescence and the percentage of fluorescent cells in the population (Fig. 2, 3) and subsequent expansion of selected monoclonal cell lines HEK-293/ 5-HT4R in an amount sufficient for physiological experiments and cryopreservation (up to 10-20×10 6 cells of each clone);
4) физиологическое тестирование клеток моноклональных линий HEK-293/5-HT4R с помощью метода микрофотометрии по чувствительности клеток к серотонину (пример 7, Фиг. 4, 5) для оценки функциональности рецептора 5-НТ4.4) physiological testing of HEK-293/5-HT4R monoclonal cell lines using the microphotometric method for cell sensitivity to serotonin (example 7, Fig. 4, 5) to assess the functionality of the 5-HT4 receptor.
Г) На четвертом этапе проводили криоконсервацию отобранных клонов и их размещение в криохранилище.D) At the fourth stage, cryopreservation of selected clones was carried out and their placement in cryostorage.
Таким образом изобретение состоит в создании репортерной моноклональной линии клеток HEK-293/5-HT4R, полученной на основе клеток линии НЕК-293, экспрессирующей на клеточной мембране мышиный рекомбинантный рецептор серотонина типа 5-НТ4, слитый с флуоресцентным белком GFP. Экспрессия обеспечивается плазмидным вектором pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R, содержащим участок гена 5-НТ4 рецептора, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 3, соответствующую номерам нуклеотидов от 207 по 1376 последовательности NM_008313.4 базы данных NCBI. Полученная моноклональная клеточная линия сохраняет уровень экспрессии рецептора серотонина 5-НТ4 в период не менее 3-х месяцев, что обеспечивает многоэтапный отбор: селекция антибиотиком гигромицином, отбор на клеточном сортере, визуальный отбор; депонирована в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ-Оболенск) при ФБУН ГНЦ ПМБ под регистрационным номером С-4 (свидетельство о депонировании №448).Thus, the invention consists of creating a reporter monoclonal cell line HEK-293/5-HT4R, derived from cells of the HEK-293 line, expressing on the cell membrane a mouse recombinant serotonin receptor type 5-HT4 fused with the fluorescent protein GFP. Expression is provided by the plasmid vector pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R, containing a region of the 5-HT4 receptor gene having the nucleotide sequence SEQ ID No. 3, corresponding to nucleotide numbers from 207 to 1376 of the NCBI database sequence NM_008313.4. The resulting monoclonal cell line maintains the level of expression of the serotonin 5-HT4 receptor for a period of at least 3 months, which ensures multi-stage selection: selection with the antibiotic hygromycin, selection on a cell sorter, visual selection; deposited in the State Collection of Pathogenic Microorganisms and Cell Cultures (GKPM-Obolensk) at the Federal Budgetary Institution of Scientific Research Center for PMB under registration number C-4 (certificate of deposit No. 448).
Изобретение иллюстрируют следующие примеры:The invention is illustrated by the following examples:
Пример 1. Получение экспрессионного вектора pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4RExample 1. Preparation of the expression vector pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R
Для экспрессии мышиного серотонинового рецептора типа 5-HT4R плазмидный вектор pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R должен содержать вставку участка гена, кодирующего последовательность мышиного рецептора серотонина 5-НТ4 без стоп-кодона и имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 3, соответствующую аминокислотной последовательности NP_032339 мышиного белка 5-HT4R из базы данных NCBI для чего последовательно осуществляли:To express the mouse serotonin receptor type 5-HT4R, the plasmid vector pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R must contain an insertion of a gene region encoding the sequence of the mouse serotonin 5-HT4 receptor without a stop codon and having the nucleotide sequence SEQ ID No. 3, corresponding to the amino acid sequence NP_032339 of the mouse 5-HT4R protein from the NCBI database, for which the following was sequentially carried out:
1) Клонирование полноразмерной кДНК, кодирующей серотониновый рецептор 5-НТ4 из ткани мозга мыши.1) Cloning of full-length cDNA encoding the serotonin 5-HT4 receptor from mouse brain tissue.
Для этого из образца мозга мыши выделяли тотальную РНК с помощью набора реагентов RNeasy Mini Kit (Qiagen). РНК обрабатывали ДНказой I (BioLabs) при следующем температурном режиме: 10 мин - 37°С, 10 мин - 75°С. Реакцию обратной транскрипции проводили при помощи коммерческого набора реактивов Superscript IV Reverse Transcriptase (Invitrogen) по протоколу производителя: 20 мкл реакционной смеси содержали реакционный буфер, смесь дезоксирибонуклеотидов, 5 мМ DTT, 2,5 мкМ и рандомные праймеры, 150 нг РНК. Температурный режим проведения реакции: 50°С - 10 мин, 80°С- 10 мин.To do this, total RNA was isolated from a mouse brain sample using the RNeasy Mini Kit reagents (Qiagen). RNA was treated with DNase I (BioLabs) at the following temperature conditions: 10 min - 37°C, 10 min - 75°C. The reverse transcription reaction was carried out using a commercial Superscript IV Reverse Transcriptase reagent kit (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol: 20 μl of the reaction mixture contained reaction buffer, a mixture of deoxyribonucleotides, 5 mM DTT, 2.5 μM and random primers, 150 ng RNA. Temperature conditions for the reaction: 50°C - 10 minutes, 80°C - 10 minutes.
2) Амплификацию полноразмерной кДНК рецептора 5-НТ4 мыши проводили с использованием ДНК-полимеразы Phusion Hot Start II DNA Polymerase (ThermoFisher), одноцепочечной кДНК в качестве матрицы, полученной на первом этапе, и ген-специфичных праймеров TATAAGCTT CCTGTAATGGACAAACTTGATG (SEQ ID No. 1) и TATAAGCTTAGTATCACTGGGCTGAGC (SEQ ID No. 2), подобранных на основании последовательности NM_008313.4, представленной в базе данных NCBI [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_008313.4]. В состав обоих ген-специфичных праймеров входит сайт рестрикции HindIII для вставки в плазмидный вектор pAcGFP1-Hyg-N1 (выделено курсивом и подчеркнуто). Прямой (forward) специфичный праймер также содержит последовательность Козак (выделена жирным шрифтом). Размер ожидаемого продукта реакции - 1169 п.н. Температурный режим программы амплификации: денатурация при 98°С в течение 30 с, затем 30 циклов, включающих денатурацию при 98°С в течение 10 секунд, отжиг праймеров при температуре 69°С в течение 15 секунд и элонгацию при 72°С в течение 30 с. Размер полученного ПЦР-фрагмента при проведении электрофореза совпал с ожидаемым.2) Amplification of the full-length cDNA of the mouse 5-HT4 receptor was carried out using DNA polymerase Phusion Hot Start II DNA Polymerase (ThermoFisher), single-stranded cDNA as a template obtained in the first step, and gene-specific primers TAT AAGCTT CCTGTA ATGGACAAACTTGATG (SEQ ID No . 1) and TAT AAGCTT AGTATCACTGGGCTGAGC (SEQ ID No. 2), selected based on the sequence NM_008313.4 presented in the NCBI database [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_008313.4]. Both gene-specific primers include a HindIII restriction site for insertion into the plasmid vector pAcGFP1-Hyg-N1 (italicized and underlined). The forward specific primer also contains the Kozak sequence (shown in bold). The size of the expected reaction product is 1169 bp. Temperature regime of the amplification program: denaturation at 98°C for 30 s, then 30 cycles, including denaturation at 98°C for 10 seconds, primer annealing at 69°C for 15 seconds and elongation at 72°C for 30 With. The size of the resulting PCR fragment during electrophoresis coincided with the expected one.
3) Очистку полученного ПЦР-фрагмента при помощи набора для экстракции из геля QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).3) Purification of the resulting PCR fragment using the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
4) Клонирование очищенного ПЦР-фрагмента в вектор pAcGFP1-Hyg-N1 (Фиг. 1) (Takara Bio), осуществляли по сайту HindIII в рамку слияния с белком GFP. Последовательность 5-HT4R не содержит стоп-кодон, поэтому транскрипция рецептора происходит вместе с последовательностью флуоресцентного белка GFP, в результате чего в клетках млекопитающих в дальнейшем экспрессируется химерный рекомбинантный белок AcGFP1/5-HT4R. Встройка в экспрессионную плазмиду происходит таким образом, что GFP располагается в С-концевой области белка рецептора и не влияет на конформацию рецепторного белка и его чувствительность к лигандам. В дальнейшем зеленая флуоресценция GFP позволяет визуализировать экспрессию и локализацию рекомбинантного белка 5-HT4R в трансфицированных клетках и не мешает проведению физиологических экспериментов (Фиг. 3).4) Cloning of the purified PCR fragment into the pAcGFP1-Hyg-N1 vector (Fig. 1) (Takara Bio) was carried out at the HindIII site in the fusion frame with the GFP protein. The 5-HT4R sequence does not contain a stop codon, so transcription of the receptor occurs together with the GFP fluorescent protein sequence, resulting in the subsequent expression of the chimeric recombinant protein AcGFP1/5-HT4R in mammalian cells. Incorporation into the expression plasmid occurs in such a way that GFP is located in the C-terminal region of the receptor protein and does not affect the conformation of the receptor protein and its sensitivity to ligands. Subsequently, green GFP fluorescence allows visualization of the expression and localization of the recombinant 5-HT4R protein in transfected cells and does not interfere with physiological experiments (Fig. 3).
5) Идентичность последовательности 5-HT4R в составе рекомбинантного плазмидного вектора pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R была подтверждена секвенированием по Сенгеру.5) The identity of the 5-HT4R sequence in the recombinant plasmid vector pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R was confirmed by Sanger sequencing.
Полученная экспрессионная плазмида pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R включает:The resulting expression plasmid pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R includes:
1) фрагмент ДНК, содержащий последовательность Козак длиной 6 п.о.; последовательность ДНК химерного белка AcGFP1/5-HT4R (кодирует мышиный рецептор серотонина 5-НТ4 размером 1169 п.о. без стоп-кодона (имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 3) слитый с зеленым флуоресцентным белком AcGFP1);1) a DNA fragment containing a 6 bp Kozak sequence; the DNA sequence of the chimeric protein AcGFP1/5-HT4R (encodes the mouse serotonin 5-HT4 receptor of 1169 bp in size without a stop codon (having the nucleotide sequence SEQ ID No. 3) fused with the green fluorescent protein AcGFP1);
2) регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию химерного белка AcGFP1/5-HT4R в клетках млекопитающих: промотор-энхансер цитомегаловируса (CMV) и сигнал полиаденилирования SV40;2) regulatory elements that ensure the expression of the chimeric protein AcGFP1/5-HT4R in mammalian cells: the cytomegalovirus (CMV) promoter-enhancer and the SV40 polyadenylation signal;
3) ген устойчивости к антибиотику гигромицину (Hyg) для селекции стабильных клеточных линий млекопитающих, промотор и сигнал полиаденилирования вируса SV40 для его экспрессии;3) a gene for resistance to the antibiotic hygromycin (Hyg) for the selection of stable mammalian cell lines, a promoter and a polyadenylation signal for the SV40 virus for its expression;
4) промотер pUC, обеспечивающий конститутивную репликацию плазмиды в клетках E. coli.;4) pUC promoter, which ensures constitutive replication of the plasmid in E. coli cells;
5) ген устойчивости к антибиотику ампициллину (Amp) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину, позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в E. coli.5) the ampicillin antibiotic resistance gene (Amp) and the bacterial promoter of the ampicillin resistance gene, allowing for the preparative production of the plasmid in E. coli.
Пример 2. Культивирование и описание материнской линии клеток НЕК-293Example 2. Cultivation and characterization of the maternal cell line HEK-293
Клетки линии НЕК-293 (Российская коллекция клеточных культур позвоночных) - гипотриплоидная линия клеток почки эмбриона человека, трансформированных ДНК аденовируса типа 5 [19]. Растут прикрепленными к пластику в монослое, имеют эпителиоподобную структуру. Условия культивирования: среда ЕМЕМ + NEAA 1% или DMEM (ИНЦ РАН) с высоким содержанием глюкозы (4.5 г/л) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки или инактивированной лошадиной, 100 мг/мл гентамицина (Sigma), 2 мМ глутамина (Sigma) (ростовая среда) во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2 в воздухе при 37°С. Процедура пересева включает снятие клеток, используя смесь трипсин 0.25%: версен 0.02% (1:2 - 1:3), кратность рассева составляет 1:2 - 1:3, оптимальная плотность 3.0-5.0×104 кл/см2, клетки прикрепляются к субстрату в течение суток - нескольких дней. Криоконсервация осуществляется в сыворотке или ростовой среде с добавлением 10% DMSO, плотность клеток в криоконсервирующем растворе - 2-5×106/мл. Жизнеспособность после криоконсервации по окраске трипановым синим на нулевом пассаже составляет 90%. Контаминации бактериями, грибами и микоплазмой не обнаружено. Видовая идентичность контролировалась кариологическим анализом; кариология: 2n = 46, модальное число хромосом 72, количество маркеров - 12 (дифференциальная окраска), количество полиплоидов - 2.4%. ДНК профиль по STR: Amelogenin: X, X; CSF1PO: 11, 12; D13S317: 12,12; D16S539: 9,13; D5S818: 8, 9; D7S820: 11,12; THO1: 7, 9.3; ТРОХ: 11, 11; vWA: 16, 19. Линия НЕК-293 характеризуется чувствительностью к аденовирусам человека и астровирусам; присутствием и экспрессией трансформирующих генов Ad 5. Клетки линии НЕК-293 туморогенны в иммунодефицитных мышах линии nude. Основная область применения: биотехнология (титрование аденовирусов человека), вирусология, трансформация. Линия клеток НЕК-293 (РКККП) соответствует линиям в других коллекциях под обозначениями: №300192*CLS, CRL-1573*ATCC, №85120602*ЕСАСС.Cells of the HEK-293 line (Russian collection of vertebrate cell cultures) are a hypotriploid line of human embryonic kidney cells transformed with DNA of adenovirus type 5 [19]. They grow attached to plastic in a monolayer and have an epithelial-like structure. Cultivation conditions: EMEM +
Пример 3. Трансфекция клеток НЕК-293 экспрессионным плазмидным вектором pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R для временной экспрессии белка 5-HT4RExample 3. Transfection of HEK-293 cells with the expression plasmid vector pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R for temporary expression of the 5-HT4R protein
Накануне трансфекции клетки НЕК-293 рассевали в ростовой среде из расчета 5-10×105 клеток в 1 лунку 12-лучночного планшета. К 800 мкл ростовой среды в лунку добавляли трансфекционную смесь, которая содержала 200 мкл среды OptiMEM (Gibco), 2 мкл Р3000 Reagent (Invitrogen), 2 мкл Lipofectamine 3000 (Invitrogen), 1 мкг плазмидного вектора pAcGFPl-Hyg-N1/5-HT4R. Через 24 ч оценивали эффективность трансфекции непосредственно в планшете на инвертированном флуоресцентном микроскопе по интенсивности флуоресценции GFP. Далее клетки использовали для получения стабильной репортерной моноклональной клеточной линии HEK-293/5-HT4R.On the eve of transfection, HEK-293 cells were seeded in growth medium at the rate of 5-10×10 5 cells per well of a 12-well plate. A transfection mixture was added to 800 μl of growth medium per well, which contained 200 μl of OptiMEM medium (Gibco), 2 μl of P3000 Reagent (Invitrogen), 2 μl of Lipofectamine 3000 (Invitrogen), 1 μg of plasmid vector pAcGFPl-Hyg-N1/5-HT4R . After 24 hours, the transfection efficiency was assessed directly in the plate using an inverted fluorescence microscope based on the intensity of GFP fluorescence. The cells were then used to generate a stable reporter monoclonal cell line HEK-293/5-HT4R.
Пример 4. Получение репортерной моноклональной клеточной линии НЕК-293/5-HT4RExample 4. Preparation of reporter monoclonal cell line HEK-293/5-HT4R
Для получения стабильной репортерной моноклональной клеточной линии НЕК-293/5-HT4R, экспрессирующей мышиный серотониновый рецептор типа 5-НТ4, слитый с флуоресцентным белком GFP, использовали клетки, временно экспрессирующие 5-HT4R (химерный белок AcGFP1/5-HT4R), спустя 24 часа после трансфекции. Клетки в лунке 12 луночного планшета промывали раствором Версена (Sigma) и обрабатывали 0.125% раствором трипсина (Sigma), затем рассевали в соотношении 1:10 в чашку Петри 60 мм.To obtain a stable reporter monoclonal cell line HEK-293/5-HT4R expressing the murine serotonin receptor type 5-HT4 fused with the fluorescent protein GFP, cells transiently expressing 5-HT4R (chimeric protein AcGFP1/5-HT4R) were used after 24 hours after transfection. Cells in well 12 of the well plate were washed with Versene solution (Sigma) and treated with 0.125% trypsin solution (Sigma), then seeded in a ratio of 1:10 into a 60 mm Petri dish.
Первый раунд селекции: для осуществления химической селекции в чашку Петри к клеткам спустя 24 часа после пересева (48 часов после трансфекции) непосредственно в ростовую среду добавляли 1000 мкг (200 мкг/мл) селективного антибиотика гигромицина (Hygromycin В, InvivoGen), так как использованная плазмида несет ген устойчивости к нему. В присутствии селективного антибиотика клетки культивировали в течение 2-3 недель, каждые 2-3 дня среда менялась на свежую с добавлением 200 мкг/мл гигромицина и последующее наращивание клеток, стабильно экспрессирующих 5-HT4R до количества, достаточного для проведения отбора с помощью клеточного сортера (5-10×106 клеток). За это время большая часть клеток гибла, погибшие клетки всплывали и удалялись при смене среды, выживали только клетки, несущие плазмиду pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R и способные экспрессировать ген устойчивости к гигромицину. Выжившие клетки сохраняли способность к адгезии и образовывали на дне культуральной посуды неравномерные колонии, когда большая часть колоний достигла размеров 2-6 мм, клетки были пересеяны в новую культуральную чашку Петри, где образовали монослой. В результате химической селекции была получена поликлональная клеточная линия НЕК-293/5-HT4R, стабильно экспрессирующая 5-HT4R, слитый с GFP (химерный белок AcGFP1/5-HT4R) примерно в 50% клеточной популяции, то есть при визуальной оценке уровня экспрессии целевого белка клетки в популяции заметно варьировали - от видимого отсутствия до достоверно визуально детектируемого уровня флуоресценции разной интенсивности.First round of selection: to carry out chemical selection in a Petri dish, 1000 μg (200 μg/ml) of the selective antibiotic hygromycin (Hygromycin B, InvivoGen) was added directly to the growth medium in a Petri dish 24 hours after subculture (48 hours after transfection), since the used The plasmid carries a gene for resistance to it. In the presence of a selective antibiotic, cells were cultured for 2-3 weeks, every 2-3 days the medium was changed to fresh with the addition of 200 μg/ml hygromycin, and subsequent expansion of cells stably expressing 5-HT4R to a quantity sufficient for selection using a cell sorter (5-10×10 6 cells). During this time, most of the cells died, the dead cells floated up and were removed when the medium was changed, only cells carrying the pAcGFP1-Hyg-N1/5-HT4R plasmid and capable of expressing the hygromycin resistance gene survived. The surviving cells retained the ability to adhere and formed uneven colonies at the bottom of the culture dish; when most of the colonies reached a size of 2-6 mm, the cells were transferred to a new Petri culture dish, where they formed a monolayer. As a result of chemical selection, a polyclonal cell line HEK-293/5-HT4R was obtained, stably expressing 5-HT4R fused with GFP (chimeric protein AcGFP1/5-HT4R) in approximately 50% of the cell population, that is, by visual assessment of the level of expression of the target protein cells in the population varied noticeably - from visible absence to reliably visually detectable levels of fluorescence of varying intensity.
Второй раунд селекции: полученную популяцию клеток использовали для получения клеточных моноклонов с высоким уровнем экспрессии белка 5-HT4R с помощью механического отбора клеточным сортером FACSAria SORP (BD Biosciences) по интенсивности флуоресценции GFP. Накануне сортировки 3-4×106 клеток переносили в 25 см2 культуральный флакон в 5 мл ростовой среды. Непосредственно перед сортировкой клетки однократно обрабатывали раствором Версена и затем инкубировали в 0.5 мл 0.125% раствора трипсина до полного открепления клеток от пластика, ферментативную реакцию останавливали добавлением 1 мл ростовой среды и переносили клетки в коническую микропробирку объемом 1,5 мл. Затем клетки осаждали центрифугированием при 50 g и ресуспендировали в 1 мл среды для сортировки клеток на основе фосфатного буфера (рН 7.4) и 1% эмбриональной бычьей сыворотки. Для получения суспензии одиночных клеток их пропускали через клеточное сито с размером ячейки 40 мкм (Corning cell strainer, Sigma). Полученную суспензию клеток анализировали с помощью сортера клеток FACSAria SORP (BD Biosciences). Флуоресценцию клеток возбуждали при длине волны 488 нм, эмиссию регистрировали в области 523 ± 23 нм. Для получения моноклонов отбирали клетки, обладающие наибольшей интенсивностью флуоресценции, и с помощью программы клеточного сортера помещали их по одной в каждую лунку 96-луночного планшета (всего было отобрано 3 планшета), содержащую 150 мкл ростовой среды с повышенным до 15% содержанием сыворотки. Планшеты с клетками помещали в СО2-инкубатор, на 7 день культивирования в лунки добавляли по 50 мкл ростовой среды, содержащей 10% сыворотки. На 14 день проводили частичную смену среды в лунках, для этого из каждой лунки отбирали 100 мкл старой среды и затем добавляли такой же объем новой ростовой среды, содержащей 200 мкг/мл гигромицина. На 17 день проводили первичный визуальный контроль наличия в лунках живых моноклонов и оценку интенсивности их флуоресценции с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 135 (Zeiss), флуоресценцию клеток возбуждали при 495 ± 5 нм, эмиссию регистрировали в области 545 ± 25 нм. Всего в трех 96-луночночных планшетах в 83 лунках наблюдались выжившие клетки, из которых: в 19-ти лунках клетки не обладали визуально детектируемой флуоресценцией; в 17 лунках наблюдался более чем один клон - в лунке присутствовали или несколько точек роста или две популяции клеток - со свечением и без - такие клетки не исследовались далее; в 30 лунках клетки в популяции клона сильно различались по интенсивности свечения или обладали низкой его интенсивностью; в 5 лунках клеточные клоны прекратили деление и не достигли размера, достаточного для перенесения в культуральную посуду большего размера.Second round of selection: the resulting cell population was used to obtain cell monoclones with high levels of 5-HT4R protein expression using mechanical selection using a FACSAria SORP cell sorter (BD Biosciences) based on GFP fluorescence intensity. On the eve of sorting, 3-4×10 6 cells were transferred into a 25 cm 2 culture flask in 5 ml of growth medium. Immediately before sorting, the cells were treated once with Versene solution and then incubated in 0.5 ml of 0.125% trypsin solution until the cells were completely detached from the plastic, the enzymatic reaction was stopped by adding 1 ml of growth medium, and the cells were transferred to a 1.5 ml conical microtube. Cells were then pelleted by centrifugation at 50 g and resuspended in 1 ml of cell sorting medium based on phosphate buffer (pH 7.4) and 1% fetal bovine serum. To obtain a suspension of single cells, they were passed through a cell sieve with a mesh size of 40 μm (Corning cell strainer, Sigma). The resulting cell suspension was analyzed using a FACSAria SORP cell sorter (BD Biosciences). Cell fluorescence was excited at a wavelength of 488 nm, and emission was recorded in the region of 523 ± 23 nm. To obtain monoclones, cells with the highest fluorescence intensity were selected, and using a cell sorter program, they were placed one at a time into each well of a 96-well plate (a total of 3 plates were selected) containing 150 μl of growth medium with a serum content increased to 15%. The plates with cells were placed in a CO 2 incubator; on the 7th day of cultivation, 50 μl of growth medium containing 10% serum was added to the wells. On day 14, the medium in the wells was partially changed; for this purpose, 100 μl of the old medium was taken from each well and then the same volume of new growth medium containing 200 μg/ml hygromycin was added. On day 17, initial visual monitoring of the presence of living monoclones in the wells and assessment of the intensity of their fluorescence was carried out using an inverted fluorescence microscope Axiovert 135 (Zeiss), cell fluorescence was excited at 495 ± 5 nm, emission was recorded in the region of 545 ± 25 nm. In total, in three 96-well plates, surviving cells were observed in 83 wells, of which: in 19 wells, cells did not have visually detectable fluorescence; in 17 wells more than one clone was observed - in the well there were either several growth points or two populations of cells - with and without luminescence - such cells were not studied further; in 30 wells, cells in the clone population varied greatly in luminescence intensity or had low intensity; In 5 wells, cell clones stopped dividing and did not reach a size sufficient to be transferred to a larger culture dish.
Третий раунд селекции: в результате для дальнейшего наращивания (культивирование подробно описано в примере 5) было отобрано 12 клонов по наиболее яркой и однородной флуоресценции клеток в составе клона (первичный визуальный отбор), эти клоны были пересеяны на 24-луночный планшет. По мере нарастания клеточные клоны пересаживали в культуральную посуду большей площади, последовательно в 12- и 6 луночный. На этом этапе часть клеток каждого клона оценивали визуально на конфокальном микроскопе (вторичный визуальный отбор) для визуализации локализации рецептора и оценки однородности клеточной популяции по содержанию клеток с флуоресценцией GFP. По результатам визуального тестирования (Фиг. 2, 3) было отобрано 6 моноклональных клеточных линий, 100% клеток которых обладало флуоресценцией GFP, локализованной в мембране клеток. Поскольку GFP слит с рецептором 5-HT4R (химерный белок AcGFP1/5-HT4R), это подтверждает и локализацию белка рецептора.Third round of selection: as a result, for further expansion (cultivation is described in detail in example 5), 12 clones were selected based on the brightest and most uniform fluorescence of the cells within the clone (primary visual selection), these clones were seeded onto a 24-well plate. As they grew, cell clones were transplanted into culture dishes of a larger area, sequentially into 12- and 6-wells. At this stage, a portion of the cells of each clone were assessed visually on a confocal microscope (secondary visual selection) to visualize the localization of the receptor and assess the homogeneity of the cell population based on the content of cells with GFP fluorescence. Based on the results of visual testing (Fig. 2, 3), 6 monoclonal cell lines were selected, 100% of whose cells had GFP fluorescence localized in the cell membrane. Since GFP is fused to the 5-HT4R receptor (chimeric protein AcGFP1/5-HT4R), this also confirms the localization of the receptor protein.
Данный пример, в частности, демонстрирует возможность использования полученной клеточной линии для наблюдения локализации мышиного рекомбинантного рецептора серотонина типа 5-НТ4 и ее изменения под воздействием лигандов, лекарственных соединений и физиологических агентов.This example, in particular, demonstrates the possibility of using the resulting cell line to observe the localization of the murine recombinant serotonin receptor type 5-HT4 and its changes under the influence of ligands, drug compounds and physiological agents.
Четвертый раунд селекции: оценка функциональных свойств 5-HT4R, экспрессируемого клетками HEK-293/5-HT4R по чувствительности клеток к серотонину с помощью дополнительной модификации клеток плазмидой Pink Flamindo и физиологических экспериментов методом микрофотометрии с использованием регистрации флуоресцентного сигнала от генетически кодируемого белка-сенсора сАМР Pink Flamindo (пример 7). В результате для криоконсервации (пример 6) было отобрано 4 моноклональных клеточных линии, клетки которых характеризовались наибольшей амплитудой флуоресцентного сигнала, полученного от Pink Flamindo в ответ на аппликацию 10 нМ серотонина.Fourth round of selection: assessment of the functional properties of 5-HT4R expressed by HEK-293/5-HT4R cells in terms of cell sensitivity to serotonin using additional modification of cells with the Pink Flamindo plasmid and physiological experiments using microphotometry using registration of a fluorescent signal from the genetically encoded cAMP sensor protein Pink Flamindo (example 7). As a result, 4 monoclonal cell lines were selected for cryopreservation (example 6), the cells of which were characterized by the highest amplitude of the fluorescent signal obtained from Pink Flamindo in response to the application of 10 nM serotonin.
Пример 5. Культивирование клеточных клонов HEK-293/5-HT4RExample 5 Cultivation of HEK-293/5-HT4R Cell Clones
Все полученные репортерные моноклональные клеточные линии HEK-293/5-HT4R сохранили морфо-функциональные характеристики материнской линии НЕК-293. Полученные линии клеток обладают адгезионными характеристиками, сопоставимыми с материнской линией НЕК-293, и растут прикрепленными к пластику в монослое, сохранили эпителиоподобную структуру (клетки имеют отростки и некоторую зернистость цитоплазмы). Жизнеспособность клеточных линий составляет 75-85% по тестированию окрашиванием трипановым синим, время удвоения клеточной популяции около 30 часов.All obtained reporter monoclonal cell lines HEK-293/5-HT4R retained the morpho-functional characteristics of the maternal line HEK-293. The resulting cell lines have adhesive characteristics comparable to the maternal line HEK-293, and grow attached to the plastic in a monolayer, retaining an epithelial-like structure (the cells have processes and some granularity of the cytoplasm). The viability of cell lines is 75-85% as tested by trypan blue staining, and the doubling time of the cell population is about 30 hours.
Все клетки линии экспрессируют слитый с флуоресцентным белком GFP целевой рецепторный белок 5-HT4R (химерный белок AcGFP1/5-HT4R), сохраняющий функциональность, и ген устойчивости к селективному антибиотику гигромицину.All cells of the line express the target receptor protein 5-HT4R (chimeric protein AcGFP1/5-HT4R) fused with the fluorescent protein GFP, which retains functionality, and the gene for resistance to the selective antibiotic hygromycin.
Условия культивирования линии HEK293/5-HT4R: среда DMEM (Gibco) с высоким содержанием глюкозы (4.5 г/л) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone), 100 мг/мл гентамицина (Sigma), 200 мкг/мл селективного антибиотика гигромицина (Hygromycin В, InvivoGen), 2 мМ глутамина (Sigma) (ростовая среда) во влажной атмосфере с 5% содержанием CO2 в воздухе при 37°С. Для пересева последовательно удаляли старую ростовую среду, аккуратно отмывали клетки раствором Версена и обрабатывали 0.125% трипсином, кратность рассева составляла 1:2 - 1:4. Оптимальная плотность клеток при культивировании 1-3×105 кл/мл, пересев рекомендован 2-3 раза в неделю. После хранения в жидком азоте выживаемость составляет 75-85%, клетки восстанавливают физиологические и морфологические свойства в течение 2-3 пассажей.Cultivation conditions for the HEK293/5-HT4R line: DMEM medium (Gibco) with a high glucose content (4.5 g/l) with the addition of 10% fetal bovine serum (HyClone), 100 mg/ml gentamicin (Sigma), 200 μg/ml selective antibiotic hygromycin (Hygromycin B, InvivoGen), 2 mM glutamine (Sigma) (growth medium) in a humidified atmosphere with 5% CO2 in air at 37°C. For reseeding, the old growth medium was sequentially removed, the cells were carefully washed with Versene solution and treated with 0.125% trypsin, the sowing ratio was 1:2 - 1:4. The optimal cell density during cultivation is 1-3×10 5 cells/ml; reseeding is recommended 2-3 times a week. After storage in liquid nitrogen, the survival rate is 75-85%, the cells restore their physiological and morphological properties within 2-3 passages.
Пример 6. Криоконсервация клеток HEK-293/5-HT4RExample 6: Cryopreservation of HEK-293/5-HT4R cells
Для криоконсервации клетки 3х отобранных в результате 4х раундов селекции клеточных клонов наращивались до объема 20-25×106 клеток, а 1 клон - до объема 60×106 клеток (приготовление большего количества криоампул для параллельного депонирования). Предпочтительная плотность клеточной культуры при заморозке - 80%. Клетки промывали Версеном, обрабатывали 0,125% трипсином, ресуспендировали в присутствии ростовой среды и центрифугировали при 1,2 g в течении 2 минут. Супернатант удаляли, полученный осадок ресуспендировали в сыворотке с добавлением 10% DMSO, плотность клеток в среде для криоконсервации составляла 2-5×106/мл, затем клетки размещались в несколько криоампул, по 2-3×106 клеток в 1 ампуле для криоконсервации. Далее криопробирки с клетками помещали в криобокс и в холодильник с температурой -80°С, спустя 1-3 дня криоампулы переносили в жидкий азот.For cryopreservation, the cells of 3 cell clones selected as a result of 4 rounds of selection were expanded to a volume of 20-25×10 6 cells, and 1 clone - to a volume of 60×10 6 cells (preparing a larger number of cryoampoules for parallel deposition). The preferred cell culture density for freezing is 80%. Cells were washed with Versen, treated with 0.125% trypsin, resuspended in the presence of growth medium and centrifuged at 1.2 g for 2 minutes. The supernatant was removed, the resulting sediment was resuspended in serum with the addition of 10% DMSO, the cell density in the cryopreservation medium was 2-5×10 6 /ml, then the cells were placed in several cryoampoules, 2-3×10 6 cells in 1 cryopreservation ampoule . Next, cryovials with cells were placed in a cryobox and in a refrigerator at a temperature of -80°C; after 1-3 days, the cryovials were transferred to liquid nitrogen.
Пример 7. Применение репортерных моноклональных линий НЕК-293/5-HT4R для физиологических методов исследования внутриклеточной сигнализации, запускаемой лигандами, активирующими/ингибирующими 5-HT4R.Example 7. Application of reporter monoclonal lines HEK-293/5-HT4R for physiological methods of studying intracellular signaling triggered by ligands that activate/inhibit 5-HT4R.
Клеточная линия HEK-293/5-HT4R может использоваться для прижизненных физиологических методов исследования внутриклеточной сигнализации, запускаемой лигандами, активирующими/ингибирующими 5-HT4R. Известно, что 5-НТ4 рецептор серотонина сопряжен с аденилатциклазным сигнальным каскадом, то есть активация этих рецепторов приводит к изменению концентраций внутриклеточного сАМР. Таким образом, стимуляция клеток HEK-293/5-HT4R серотонином опосредует активацию аденилатциклазы и приводит к повышению концентрации внутриклеточного сАМР, как и в случае воздействия на клетки форсколином (специфический активатор аденилатциклазы) непосредственно [16-18]. Осуществить неинвазивный оптической мониторинг уровня внутриклеточного сАМР на клетках НЕК-293/5-HT4R можно посредством встраивания в клетки полученной линии генетически кодируемого флуоресцентного белка сенсора цитоплазматического сАМР - Pink Flamindo [17].The HEK-293/5-HT4R cell line can be used for intravital physiological methods to study intracellular signaling triggered by 5-HT4R activating/inhibiting ligands. It is known that the 5-HT4 serotonin receptor is associated with the adenylate cyclase signaling cascade, that is, activation of these receptors leads to changes in the concentrations of intracellular cAMP. Thus, stimulation of HEK-293/5-HT4R cells with serotonin mediates the activation of adenylate cyclase and leads to an increase in the concentration of intracellular cAMP, as in the case of exposure of cells to forskolin (a specific activator of adenylate cyclase) directly [16-18]. Non-invasive optical monitoring of the level of intracellular cAMP on HEK-293/5-HT4R cells can be carried out by integrating a genetically encoded fluorescent protein sensor of cytoplasmic cAMP, Pink Flamindo, into the cells of the resulting line [17].
Процедура подготовки клеток для физиологических экспериментов методом микрофотометрии с использованием регистрации флуоресцентного сигнала от генетически кодируемого белка-сенсора с AMP Pink Flamindo включает:The procedure for preparing cells for physiological experiments using microphotometry using registration of a fluorescent signal from a genetically encoded sensor protein with AMP Pink Flamindo includes:
1) Встраивание в клетки HEK-293/5-HT4R плазмидного вектора Pink Flamindo (#102356, Addgene). Для этого 5-10×105 клеток отсаживали на 1 лунку 12 луночного планшета и через сутки осуществляли липофекцию плазмидного вектора Pink Flamindo, для чего к клеткам в 800 мкл ростовой среды добавляют трансфекционную смесь, содержащую 200 мкл среды OptiMEM, 2 мкл Р3000 Reagent, 2 мкл Lipofectamine 3000, 1 мкг плазмидного вектора Pink Flamindo.1) Insertion of the Pink Flamindo plasmid vector (#102356, Addgene) into HEK-293/5-HT4R cells. To do this, 5-10×10 5 cells were seeded into 1 well of a 12-well plate and a day later lipofection of the Pink Flamindo plasmid vector was carried out, for which a transfection mixture containing 200 μl of OptiMEM medium, 2 μl of P3000 Reagent, 2
2) Проведение физиологических экспериментов осуществляется на клетках НЕК-293/5-HT4R с временной экспрессией белка-сенсора Pink Flamindo спустя 24-48-72 часа после трансфекции. Оценка активности аденилатциклазного сигнального каскада методом микрофотометрии осуществляется по характеристикам флуоресцентного сигнала, полученного от Pink Flamindo (λex = 572 ± 17.5 нм, λem = 634 ± 34 нм) в ответ на стимуляцию активатором аденилатциклазы Forskolin (10-50 мкМ) и лигандом 5-НТ4 рецептора серотонином (0,1-10 нМ). Клетки снимали 0,125% трипсином и ресуспендировали в 1 мл ростовой среды, затем 50 мкл клеточной суспензии помещали в одноразовые фотометрические камеры, где клетки прикреплялись ко дну с помощью адгезивного материала Cell Так (Corning), и выдерживали при комнатной температуре 30 мин. Внеклеточный раствор содержал (мМ): NaCl - 110, KCl - 5.5, CaCl2 - 2, MgCl2 -0.8, HEPES - 10, глюкозу - 10. Фотометрические эксперименты проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 135 (Zeiss), оборудованного объективом Plan NeoFluar 20×/0.75 и цифровой ECCD камерой LucaR (Andor Technology). Флуоресценцию клеток возбуждали при 572 ± 17.5 нм, эмиссию регистрировали в области 634 ± 34 нм. Количественный фотометрический анализ изображений осуществляли с использованием программы NIS Elements (Nikon). В ходе физиологических экспериментов клетки, обладающие флуоресценцией Pink Flamindo, демонстрировали обратимое увеличение ее интенсивности в ответ на стимуляцию Forskolin (10-50 мкМ) и серотонином (1-100 нМ), что соответствует существующим представлениям о работе 5-НТ4 рецептора (Фиг. 4, 5).2) Physiological experiments are carried out on HEK-293/5-HT4R cells with temporary expression of the Pink Flamindo sensor protein 24-48-72 hours after transfection. The activity of the adenylate cyclase signaling cascade is assessed by microphotometry based on the characteristics of the fluorescent signal obtained from Pink Flamindo (λ ex = 572 ± 17.5 nm, λ em = 634 ± 34 nm) in response to stimulation with the adenylate cyclase activator Forskolin (10-50 μM) and ligand 5 -HT4 receptor serotonin (0.1-10 nM). Cells were removed with 0.125% trypsin and resuspended in 1 ml of growth medium, then 50 μl of the cell suspension was placed in disposable photometric chambers, where the cells were attached to the bottom using Cell Tak adhesive material (Corning), and kept at room temperature for 30 min. The extracellular solution contained (mM): NaCl - 110, KCl - 5.5, CaCl 2 - 2, MgCl 2 -0.8, HEPES - 10, glucose - 10. Photometric experiments were carried out using an inverted fluorescence microscope Axiovert 135 (Zeiss) equipped with a Plan lens NeoFluar 20×/0.75 and LucaR digital ECCD camera (Andor Technology). Cell fluorescence was excited at 572 ± 17.5 nm, emission was recorded in the region of 634 ± 34 nm. Quantitative photometric image analysis was performed using NIS Elements software (Nikon). During physiological experiments, cells with Pink Flamindo fluorescence demonstrated a reversible increase in its intensity in response to stimulation with Forskolin (10-50 μM) and serotonin (1-100 nM), which corresponds to existing ideas about the functioning of the 5-HT4 receptor (Fig. 4 , 5).
Данный пример демонстрирует возможность использования полученной клеточной линии не только для исследования изменения локализации белка рецептора, но и для исследования внутриклеточного аденилатциклазного сигнального пути, активированного лигандами (потенциальными лекарственными соединениям) мышиного рецептора серотонина типа 5-НТ4.This example demonstrates the possibility of using the obtained cell line not only to study changes in the localization of the receptor protein, but also to study the intracellular adenylate cyclase signaling pathway activated by ligands (potential drug compounds) of the mouse serotonin receptor type 5-HT4.
Экспериментальная процедура, описанная в данном примере, использовалась для подтверждения физиологической функциональности серотонинового рецептора мыши типа 5-HT4R, встроенного в клетки репортерной линии HEK-293/5-HT4R. Для этого от каждого клеточного клона HEK-293/5-HT4R отсевали в 12-ти луночный планшет небольшую часть клеток (5-10×105) и в эти клетки встраивался плазмидный вектор Pink Flamindo с помощью набора для липофекции Lipofectamine 3000. Спустя 24-72 часа после трансфекции клетки HEK-293/5-HT4R+PinkFlamindo тестировались физиологически как описано выше.The experimental procedure described in this example was used to confirm the physiological functionality of the mouse serotonin receptor type 5-HT4R incorporated into the HEK-293/5-HT4R reporter cell line. To do this, from each HEK-293/5-HT4R cell clone, a small part of the cells (5-10×10 5 ) was selected into a 12-well plate and the Pink Flamindo plasmid vector was inserted into these cells using the Lipofectamine 3000 lipofection kit. After 24 -72 hours after transfection, HEK-293/5-HT4R+PinkFlamindo cells were tested physiologically as described above.
Промышленная применимостьIndustrial applicability
Описываемая в настоящем изобретении репортерная моноклональная клеточная линия HEK-293/5-HT4R позволяет проводить прижизненную визуализации локализации рецептора в клетках. Преимуществом применения клеток HEK-293/5-HT4R, получаемых описываемым способом, является возможность проведения неинвазивного оптического мониторинга локализации рецептора в мембране и его интернализации под воздействием лигандов - потенциальных лекарственных препаратов, мишенью которых является 5-НТ4 рецептор.The monoclonal reporter cell line HEK-293/5-HT4R described in the present invention allows for intravital imaging of receptor localization in cells. The advantage of using HEK-293/5-HT4R cells obtained by the described method is the possibility of non-invasive optical monitoring of the localization of the receptor in the membrane and its internalization under the influence of ligands - potential drugs whose target is the 5-HT4 receptor.
Источники информации:Information sources:
1. Barnes N.M. et al. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. CX. Classification of Receptors for 5-hydroxytryptamine; Pharmacology and Function. Pharmacol Rev. 2021. 73(1): 310-520.1. Barnes N.M. et al. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. CX. Classification of Receptors for 5-hydroxytryptamine; Pharmacology and Function. Pharmacol Rev. 2021. 73(1): 310-520.
2. McCorvy JD, Roth BL. Structure and Function of Serotonin G protein Coupled Receptors. Pharmacol Ther. 2015. 150:129-142.2. McCorvy JD, Roth BL. Structure and Function of Serotonin G protein Coupled Receptors. Pharmacol Ther. 2015. 150:129-142.
3. Dong C. et al. Psychedelic-inspired drug discovery using an engineered biosensor. Cell. 2021. 184(10):2779-2792.e18.3. Dong C. et al. Psychedelic-inspired drug discovery using an engineered biosensor. Cell. 2021. 184(10):2779-2792.e18.
4. Wan J. et al. A genetically encoded sensor for measuring serotonin dynamics. Nat Neurosci. 2021. 24(5):746-752.4. Wan J. et al. A genetically encoded sensor for measuring serotonin dynamics. Nat Neurosci. 2021. 24(5):746-752.
5. Riegert C. et al. Increased expression of 5-HT(1B) receptors by Herpes simplex virus gene transfer in septal neurons: New in vitro and in vivo models to study 5-HT(1B) receptor function. Brain Res Bull. 2008. 76(4): 439-53.5. Riegert C. et al. Increased expression of 5-HT(1B) receptors by Herpes simplex virus gene transfer in septal neurons: New in vitro and in vivo models to study 5-HT(1B) receptor function. Brain Res Bull. 2008. 76(4): 439-53.
6. Bhattacharyya S. et al. Internalization and recycling of 5-HT2A receptors activated by serotonin and protein kinase C-mediated mechanisms. Proc Natl Acad Sci USA. 2002. 99(22): 14470-5.6. Bhattacharyya S. et al. Internalization and recycling of 5-HT2A receptors activated by serotonin and protein kinase C-mediated mechanisms. Proc Natl Acad Sci USA. 2002. 99(22): 14470-5.
7. Gerald C. et al. Uses of the 5-HT4 receptor. Патент США US 6,331,401 B1, опубл. 1992-12-24/2001-12-18.7. Gerald C. et al. Uses of the 5-HT4 receptor. US Patent US 6,331,401 B1, publ. 1992-12-24/2001-12-18.
8. Gerald C. et al. DNA encoding 5-HT4 serotonin receptors and uses thereof. Патент США US5766879 (А), опубл. 1998-06-16.8. Gerald C. et al. DNA encoding 5-HT4 serotonin receptors and uses thereof. US Patent US5766879 (A), publ. 1998-06-16.
9. Fischmeister R. et al. Splice variants for human 5-HT4 serotonin receptor and their applications, in particular for screening. Патент США US 6,506,580 B1, опубл. 1997-11-28 / 2003-01-14.9. Fischmeister R. et al. Splice variants for human 5-HT4 serotonin receptor and their applications, in particular for screening. US Patent US 6,506,580 B1, publ. 1997-11-28 / 2003-01-14.
10. Golz S. et al. Diagnostics and therapeutics for diseases associated with 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 4 (5-HT4). Патент США US 2007/0065801 A1, опубл. 2007-03-22/2003-01-14. Международный номер WO 2004/072651 A2, WO/2004/104577.10. Golz S. et al. Diagnostics and therapeutics for diseases associated with 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 4 (5-HT4). US Patent US 2007/0065801 A1, publ. 2007-03-22/2003-01-14. International number WO 2004/072651 A2, WO/2004/104577.
11. Konen J.R. et al. Prokinetic actions of luminally acting 5-HT4 receptor agonists. Neurogastroenterol Motil. 2021. 33(4):e14026.11. Konen J.R. et al. Prokinetic actions of luminally acting 5-HT4 receptor agonists. Neurogastroenterol Motil. 2021. 33(4):e14026.
12. Pellissier L.P. et al. G protein activation by serotonin type 4 receptor dimers:12. Pellissier L.P. et al. G protein activation by serotonin type 4 receptor dimers:
evidence that turning on two protomers is more efficient. J Biol Chem. 2011. 286(12):9985-97.evidence that turning on two protomers is more efficient. J Biol Chem. 2011. 286(12):9985-97.
13. Mnie-Filali O. et al. Serotonin 4 receptor (5-HT4R) internalization is isoform-specific: Effects of 5-HT and RS67333 on isoforms A and B. Cellular Signalling. 2010. 22(3):501-509.13. Mnie-Filali O. et al. Serotonin 4 receptor (5-HT4R) internalization is isoform-specific: Effects of 5-HT and RS67333 on isoforms A and B. Cellular Signaling. 2010. 22(3):501-509.
14. Joubert L. et al. New sorting nexin (SNX27) and NHERF specifically interact with the 5-HT4(a) receptor splice variant: roles in receptor targeting. J Cell Sci. 2004. 117(22):5367-5379.14. Joubert L. et al. New sorting nexin (SNX27) and NHERF specifically interact with the 5-HT4(a) receptor splice variant: roles in receptor targeting. J Cell Sci. 2004. 117(22):5367-5379.
15. Schill Y. et al. Serotonin 5-HT4 receptor boosts functional maturation of dendritic spines via RhoA-dependent control of F-actin. Commun Biol. 2020. 14; 3(1): 76.15. Schill Y. et al. Serotonin 5-HT4 receptor boosts functional maturation of dendritic spines via RhoA-dependent control of F-actin. Commun Biol. 2020. 14; 3(1): 76.
16. Cherkashin A.P. et al. Taste Cells of the Type III Employ CASR to Maintain Steady Serotonin Exocytosis at Variable Ca2+ in the Extracellular Medium. Cells. 2022. 11(8): 1369.16. Cherkashin A.P. et al. Taste Cells of the Type III Employ CASR to Maintain Steady Serotonin Exocytosis at Variable Ca2+ in the Extracellular Medium. Cells. 2022. 11(8): 1369.
17. Harada K. Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging. Scientific Reports. 2017. 7(1), 7351.17. Harada K. Red fluorescent protein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivo imaging. Scientific Reports. 2017. 7(1), 7351.
18. Кочкина E.H., Рогачевская O.A., Котова П.Д. Анализ клеточных ответов на норадреналин с использованием синхронного мониторинга Са2+ и сАМР в клетках НЕК 293. Биологические мембраны. 2021. 38(6), с 474-477.18. Kochkina E.H., Rogachevskaya O.A., Kotova P.D. Analysis of cellular responses to norepinephrine using synchronous monitoring of Ca2+ and cAMP in HEK 293 cells. Biological membranes. 2021. 38(6), pp. 474-477.
19. Атлас хромосом постоянных линий человека и животных, С.Е. Мамаева, 2002. М. Научный мир.19. Atlas of chromosomes of permanent lines of humans and animals, S.E. Mamaeva, 2002. M. Scientific world.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="5-НТ4R, <ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="5-HT4R,
ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ МЫШИНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ СЕРОТОНИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР ТИПА EXPRESSING MOUSE RECOMBINANT SEROTONIN RECEPTOR TYPE
5НТ4.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0" 5НТ4.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"
productionDate="2022-11-23">productionDate="2022-11-23">
<ApplicationIdentification> <ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2022125909/20(056519)</ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText>2022125909/20(056519)</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-10-04</FilingDate> <FilingDate>2022-10-04</FilingDate>
</ApplicationIdentification> </ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>-</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>-</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification> <EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2022125909/20(056519)</ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText>2022125909/20(056519)</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-10-04</FilingDate> <FilingDate>2022-10-04</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification> </EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное <ApplicantName languageCode="ru">Federal state
бюджетное учреждение науки «Федеральный исследовательский центр budgetary institution of science "Federal Research Center
Пущинский научный центр биологических исследований Российской Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian
академии наук</ApplicantName>Academy of Sciences</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federal Research Center Pushchino Scientific <ApplicantNameLatin>Federal Research Center Pushchino Scientific
Center for Biological Research of the Russian Academy of Center for Biological Research of the Russian Academy of
Sciences</ApplicantNameLatin>Sciences</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">РЕПОРТЕРНАЯ МОНОКЛОНАЛЬНАЯ <InventionTitle languageCode="ru">REPORTER MONOCLONAL
КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ НЕК-293/5-НТ4R, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ МЫШИНЫЙ HEK-293/5-HT4R CELL LINE EXPRESSING MOUSE
РЕКОМБИНАНТНЫЙ СЕРОТОНИНОВЫЙ РЕЦЕПТОР ТИПА 5НТ4.</InventionTitle>RECOMBINANT SEROTONIN RECEPTOR TYPE 5HT4.</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>31</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>31</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..31</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..31</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1"> <INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tataagcttcctgtaatggacaaacttgatg</INSDSeq_sequence <INSDSeq_sequence>tataagcttcctgtaatggacaaacttgatg</INSDSeq_sequence
>>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"> <INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tataagcttagtatcactgggctgagc</INSDSeq_sequence> <INSDSeq_sequence>tataagcttagtatcactgggctgagc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"> <SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>1170</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>1170</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1170</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..1170</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q3"> <INSDQualifier id="q3">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cctgtaatggacaaacttgatgctaatgtgagttccaacgagggtttca <INSDSeq_sequence>cctgtaatggacaaacttgatgctaatgtgagttccaacgagggtttca
ggtccgtggagaaggtcgtgctgctcacgttccttgcagtggttatcctgatggccatcttgggcaacctggtccgtggagaaggtcgtgctgctcacgttccttgcagtggttatcctgatggccatcttgggcaacct
gctggtgatggtggctgtgtgcagggacaggcagctcaggaaaataaaaaccaactatttcattgtgtctgctggtgatggtggctgtgtgcagggacaggcagctcaggaaaataaaaaccaactatttcattgtgtct
ctcgcctttgctgacctgctggtttcggtgctggtgatgccctttggtgccattgagctggtccaagacactcgcctttgctgacctgctggtttcggtgctggtgatgccctttggtgccattgagctggtccaagaca
tctgggcttatggggagatgttctgcctggtccggacctctctggatgtcctacttaccacagcatcgattctgggcttatggggagatgttctgcctggtccggacctctctggatgtcctacttaccacagcatcgat
ctttcacctgtgctgtatttccctggacaggtattacgccatctgctgccagcctttggtttataggaacctttcacctgtgctgtatttccctggacaggtattacgccatctgctgccagcctttggtttataggaac
aagatgacccctctacgcatcgcattaatgttgggaggctgctgggtccttcccatgtttatatcttttcaagatgacccctctacgcatcgcattaatgttgggaggctgctgggtccttcccatgtttatatcttttc
tccccataatgcaaggctggaacaacatcggcatagttgatgtgatagagaaaaggaaattcagccacaatccccataatgcaaggctggaacaacatcggcatagttgatgtgatagagaaaaggaaattcagccacaa
ctctaactccacgtggtgtgtcttcatggtcaacaagccctatgctatcacctgctctgtggtggccttcctctaactccacgtggtgtgtcttcatggtcaacaagccctatgctatcacctgctctgtggtggccttc
tacatcccgtttctcctcatggtgctggcctattaccgaatctatgtcactgctaaggagcatgcccagctacatcccgtttctcctcatggtgctggcctattaccgaatctatgtcactgctaaggagcatgcccagc
agatacagatgttacaacgggcaggagccacctctgaaagcaggccccagccagctgaccagcacagcacagatacagatgttacaacgggcaggagccacctctgaaagcaggccccagccagctgaccagcacagcac
acatcgcatgaggacagagaccaaggcagccaagactttatgtgtcatcatgggctgcttctgtttctgcacatcgcatgaggacagagaccaaggcagccaagactttatgtgtcatcatgggctgcttctgtttctgc
tgggcccccttctttgtcaccaatattgtggaccctttcatagactacactgtccccgagcaggtgtggatgggcccccttctttgtcaccaatattgtggaccctttcatagactacactgtccccgagcaggtgtgga
ctgctttcctctggcttggctatatcaattcggggttgaacccttttctctatgccttcttgaataagtcctgctttcctctggcttggctatatcaattcggggttgaacccttttctctatgccttcttgaataagtc
tttcagacgtgccttcctcatcatcctctgctgtgatgatgagcgctacaaaagaccccccattctgggctttcagacgtgccttcctcatcatcctctgctgtgatgatgagcgctacaaaagaccccccattctgggc
cagactgtcccctgttcaaccacaaccattaatggatccacccatgtactaagggatacagtggaatgtgcagactgtcccctgttcaaccacaaccattaatggatccacccatgtactaagggatacagtggaatgtg
gtggccagtgggagagtcggtgtcacctcacagcaacttctcctttggtggctgctcagcccagtgatacgtggccagtgggagagtcggtgtcacctcacagcaacttctcctttggtggctgctcagcccagtgatac
t</INSDSeq_sequence>t</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (1)
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2022125909A RU2022125909A (en) | 2024-04-04 |
| RU2817234C2 true RU2817234C2 (en) | 2024-04-11 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHERKASHIN A.P. et al. Taste Cells of the Type III Employ CASR to Maintain Steady Serotonin Exocytosis at Variable Ca2+ in the Extracellular Medium. Cells. 2022 Apr 18;11(8):1369. doi: 10.3390/cells11081369. Найдено онлайн: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9030112/ Дата обращения 06.06.2023. MNIE-FILALI O. et al. Serotonin 4 receptor (5-HT4R) internalization is isoform-specific: effects of 5-HT and RS67333 on isoforms A and B. Cell Signal. 2010 Mar;22(3):501-9. doi: 10.1016/j.cellsig.2009.11.004. Найдено онлайн: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19922792/ Дата обращения 06.06.2023. KONEN J.R. et al. Prokinetic actions of luminally acting 5-HT4 receptor agonists. Neurogastroenterol Motil. 2021 Apr;33(4):e14026. doi: 10.1111/nmo.14026. Найдено онлайн: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7990683/ Дата обращения 06.06.2023. КОЧКИНА E.H. И ДР. Анализ клеточных ответов на норадреналин с использованием синхронного мониторинга Са2+ и сАМР в клетках НЕК 293. Биологические мем * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Koval et al. | Mix and match: investigating heteromeric and heterotypic gap junction channels in model systems and native tissues | |
| White et al. | Selective interactions among the multiple connexin proteins expressed in the vertebrate lens: the second extracellular domain is a determinant of compatibility between connexins. | |
| Craig et al. | Preferential addition of newly synthesized membrane protein at axonal growth cones | |
| Shanks et al. | Contribution of the global subunit structure and stargazin on the maturation of AMPA receptors | |
| Wong et al. | Protogenin defines a transition stage during embryonic neurogenesis and prevents precocious neuronal differentiation | |
| Balderas et al. | Mitochondrial calcium uniporter stabilization preserves energetic homeostasis during complex I impairment | |
| CN113501881A (en) | Fusion proteins | |
| JP2006525011A (en) | Screening method for the risk of cataract formation | |
| RU2817234C2 (en) | Reporter monoclonal cell line hek-293/5-ht4r, expressing murine recombinant serotonin receptor type 5ht4 | |
| Gee et al. | Synaptic scaffolding molecule binds to and regulates vasoactive intestinal polypeptide type-1 receptor in epithelial cells | |
| Pooley et al. | CytLEK1 is a regulator of plasma membrane recycling through its interaction with SNAP-25 | |
| Somara et al. | Real-time dynamic movement of caveolin-1 during smooth muscle contraction of human colon and aged rat colon transfected with caveolin-1 cDNA | |
| Tanaka et al. | Latrophilins are essential for endothelial junctional fluid shear stress mechanotransduction | |
| Morgenstern et al. | Controlling ion channel trafficking by targeted ubiquitination and deubiquitination | |
| Tower-Gilchrist et al. | Monitoring endosomal trafficking of the G protein-coupled receptor somatostatin receptor 3 | |
| Mitin et al. | RAS and the RAIN/RasIP1 effector | |
| Lo | Functional characterization of the CNPY4 and PEAK3 proteins as regulators of cell signaling | |
| Adstamongkonkul | Examination of Calcium’s Role in Mammalian Primary Intraciliary Protein Trafficking | |
| Welch et al. | Arf6 Modulates the β‐Actin Specific Capping Protein, βcap73 | |
| EP1637540A1 (en) | Hyperactive Stat molecules and their use in assays employing gene activation | |
| Husainie | Analysis of the Function of Protein Kinase C δ in Regulating Collective Cell Migration during Drosophila Oogenesis through Live Imaging | |
| Fisher | Primary cilia display a non-uniform response to intracellular calcium release | |
| Björk | Cell Model Systems in Characterizing Alpha2-Adrenoceptors as Drug Targets. | |
| KR101052621B1 (en) | Cell line which is stably expressing the HA-5-HT6R, for HTS of 5-HT6R's ligands | |
| Little | Investigating the Interaction between G Proteins and the 5-HT1E and 5-HT2C Serotonin Receptors Using BRET |