RU2816850C2 - Antibodies for treating cancer, in which claudin 6 is expressed - Google Patents
Antibodies for treating cancer, in which claudin 6 is expressed Download PDFInfo
- Publication number
- RU2816850C2 RU2816850C2 RU2018145274A RU2018145274A RU2816850C2 RU 2816850 C2 RU2816850 C2 RU 2816850C2 RU 2018145274 A RU2018145274 A RU 2018145274A RU 2018145274 A RU2018145274 A RU 2018145274A RU 2816850 C2 RU2816850 C2 RU 2816850C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cell
- cldn6
- antibodies
- cells
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title description 160
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title description 63
- 102000003859 Claudin-6 Human genes 0.000 title description 19
- 108090000229 Claudin-6 Proteins 0.000 title description 19
- 102100038449 Claudin-6 Human genes 0.000 claims abstract description 429
- 101000882898 Homo sapiens Claudin-6 Proteins 0.000 claims abstract description 429
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 204
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 98
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 82
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 81
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 79
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 58
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 43
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 537
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 109
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 105
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 31
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 3
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 claims description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 50
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 105
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 73
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 66
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 66
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 66
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 64
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 63
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 62
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 60
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 59
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 52
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 50
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 48
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 47
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 47
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 46
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 45
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 39
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 37
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 37
- 102000002029 Claudin Human genes 0.000 description 34
- 108050009302 Claudin Proteins 0.000 description 34
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 34
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 33
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 32
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 30
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 29
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 27
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 27
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 27
- 101000912661 Homo sapiens Claudin-9 Proteins 0.000 description 26
- 230000006870 function Effects 0.000 description 26
- 102100026097 Claudin-9 Human genes 0.000 description 25
- 101000882908 Homo sapiens Claudin-3 Proteins 0.000 description 25
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 24
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 23
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 23
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 23
- 101000882890 Homo sapiens Claudin-4 Proteins 0.000 description 22
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 21
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 21
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 20
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 20
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 20
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 20
- 102100038423 Claudin-3 Human genes 0.000 description 19
- 102100038447 Claudin-4 Human genes 0.000 description 19
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 19
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 19
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 19
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 19
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 18
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 18
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 17
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 17
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 16
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 16
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 16
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 16
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 16
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 15
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 15
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 15
- -1 aromatic amino acid Chemical class 0.000 description 15
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 15
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 15
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 15
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 241000894007 species Species 0.000 description 15
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 15
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 14
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 14
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 14
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 14
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 14
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 14
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 14
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 14
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 14
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 13
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 13
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 13
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 12
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 12
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 12
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 description 11
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 11
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 11
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 11
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 11
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 11
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 10
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 10
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 10
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 10
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 10
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 9
- 201000009051 Embryonal Carcinoma Diseases 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 9
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 208000034176 Neoplasms, Germ Cell and Embryonal Diseases 0.000 description 9
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 9
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 9
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 9
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 9
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 9
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 8
- 206010004593 Bile duct cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000030808 Clear cell renal carcinoma Diseases 0.000 description 8
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 8
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 8
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 8
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 8
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 8
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 208000003373 basosquamous carcinoma Diseases 0.000 description 8
- 208000026900 bile duct neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 8
- 206010073251 clear cell renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 8
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 8
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 8
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 229940099472 immunoglobulin a Drugs 0.000 description 8
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 8
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 8
- 201000011330 nonpapillary renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 8
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 8
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 7
- 208000036832 Adenocarcinoma of ovary Diseases 0.000 description 7
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 201000000274 Carcinosarcoma Diseases 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 206010061328 Ovarian epithelial cancer Diseases 0.000 description 7
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 7
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 7
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 7
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 7
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 7
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 7
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 7
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 7
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 7
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 208000013371 ovarian adenocarcinoma Diseases 0.000 description 7
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 7
- 201000006588 ovary adenocarcinoma Diseases 0.000 description 7
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 7
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 7
- 201000010198 papillary carcinoma Diseases 0.000 description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 7
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 7
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 7
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 7
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 6
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 6
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 6
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 description 6
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 6
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 description 6
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 208000019487 Clear cell papillary renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 6
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 6
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 6
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 6
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 6
- 208000033133 Testicular seminomatous germ cell tumor Diseases 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 6
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 6
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 6
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 102000050015 human CLDN3 Human genes 0.000 description 6
- 201000002312 ileal neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 6
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 6
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 6
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 206010073373 small intestine adenocarcinoma Diseases 0.000 description 6
- 201000002314 small intestine cancer Diseases 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 208000024662 testicular seminoma Diseases 0.000 description 6
- 208000004238 testicular teratoma Diseases 0.000 description 6
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 6
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 5
- 208000036652 Adenocarcinoma of the small intestine Diseases 0.000 description 5
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 208000032320 Germ cell tumor of testis Diseases 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 101000878602 Homo sapiens Immunoglobulin alpha Fc receptor Proteins 0.000 description 5
- 102100038005 Immunoglobulin alpha Fc receptor Human genes 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 5
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 5
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 5
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 208000002918 testicular germ cell tumor Diseases 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 5
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 4
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 4
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 4
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 4
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 4
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 4
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 4
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 4
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 4
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 4
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 4
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 3
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Chemical class 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 3
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 3
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 206010025598 Malignant hydatidiform mole Diseases 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 3
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 3
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 description 3
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Chemical class 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Chemical class 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102000050035 human CLDN4 Human genes 0.000 description 3
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 3
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 3
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 201000008824 placental choriocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 3
- 231100000336 radiotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001690 radiotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 10043-66-0 Chemical compound [131I][131I] PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 0.000 description 2
- OOVOQEZEKOHUDM-UHFFFAOYSA-N 2-butoxy-6-methylphenol Chemical compound CCCCOC1=CC=CC(C)=C1O OOVOQEZEKOHUDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 2
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N Asp-Tyr Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NALWOULWGHTVDA-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003170 Bronchiolo-Alveolar Adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 102100040836 Claudin-1 Human genes 0.000 description 2
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 208000021309 Germ cell tumor Diseases 0.000 description 2
- OPINTGHFESTVAX-BQBZGAKWSA-N Gln-Arg Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N OPINTGHFESTVAX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- NKCZYEDZTKOFBG-GUBZILKMSA-N Gln-Gln-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NKCZYEDZTKOFBG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000749331 Homo sapiens Claudin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 2
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 2
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 2
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N Lomustine Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)NC1CCCCC1 GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 2
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 2
- BLXXJMDCKKHMKV-UHFFFAOYSA-N Nabumetone Chemical compound C1=C(CCC(C)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 BLXXJMDCKKHMKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- RTQKBZIRDWZLDF-BZSNNMDCSA-N Pro-Pro-Trp Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)O)CCN1C(=O)[C@@H]1CCCN1 RTQKBZIRDWZLDF-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 2
- 201000010208 Seminoma Diseases 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 2
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 description 2
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 2
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L barium sulfate Chemical compound [Ba+2].[O-]S([O-])(=O)=O TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 2
- 229960005243 carmustine Drugs 0.000 description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 2
- RZEKVGVHFLEQIL-UHFFFAOYSA-N celecoxib Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C1=CC(C(F)(F)F)=NN1C1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 RZEKVGVHFLEQIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 2
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 208000009060 clear cell adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N deoliosyl-3C-alpha-L-digitoxosyl-MTM Natural products CC=1C(O)=C2C(O)=C3C(=O)C(OC4OC(C)C(O)C(OC5OC(C)C(O)C(OC6OC(C)C(O)C(C)(O)C6)C5)C4)C(C(OC)C(=O)C(O)C(C)O)CC3=CC2=CC=1OC(OC(C)C1O)CC1OC1CC(O)C(O)C(C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N diclofenac Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- HUPFGZXOMWLGNK-UHFFFAOYSA-N diflunisal Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(C=2C(=CC(F)=CC=2)F)=C1 HUPFGZXOMWLGNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 2
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 2
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 159000000011 group IA salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 2
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 2
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 2
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 2
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 229940055742 indium-111 Drugs 0.000 description 2
- APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N indium-111 Chemical compound [111In] APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N 0.000 description 2
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- DKYWVDODHFEZIM-UHFFFAOYSA-N ketoprofen Chemical compound OC(=O)C(C)C1=CC=CC(C(=O)C=2C=CC=CC=2)=C1 DKYWVDODHFEZIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L lucifer yellow dye Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC(C(N(C(=O)NN)C2=O)=O)=C3C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC3=C1N DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 2
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N mithramycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](C)[C@@H](O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N naproxen Chemical compound C1=C([C@H](C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- OFPXSFXSNFPTHF-UHFFFAOYSA-N oxaprozin Chemical compound O1C(CCC(=O)O)=NC(C=2C=CC=CC=2)=C1C1=CC=CC=C1 OFPXSFXSNFPTHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 229960003171 plicamycin Drugs 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 2
- AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N propranolol Chemical compound C1=CC=C2C(OCC(O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 208000015347 renal cell adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940063683 taxotere Drugs 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 2
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 2
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N (2e)-3-ethyl-2-[(z)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S\1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C/1=N/N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N 0.000 description 1
- RDJGLLICXDHJDY-NSHDSACASA-N (2s)-2-(3-phenoxyphenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](C)C1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 RDJGLLICXDHJDY-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWWSFMDVAYGXBV-MYPASOLCSA-N (7r,9s)-7-[(2r,4s,5s,6s)-4-amino-5-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-6,9,11-trihydroxy-9-(2-hydroxyacetyl)-4-methoxy-8,10-dihydro-7h-tetracene-5,12-dione;hydrochloride Chemical compound Cl.O([C@@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MWWSFMDVAYGXBV-MYPASOLCSA-N 0.000 description 1
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- NNYBQONXHNTVIJ-QGZVFWFLSA-N (R)-etodolac Chemical compound C1CO[C@](CC)(CC(O)=O)C2=C1C(C=CC=C1CC)=C1N2 NNYBQONXHNTVIJ-QGZVFWFLSA-N 0.000 description 1
- WUIABRMSWOKTOF-OCBSMOPSSA-N 3-[[2-[2-[2-[[2-[[4-[[2-[[6-amino-2-[3-amino-1-[(2,3-diamino-3-oxopropyl)amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2r,3s,4s,5r,6r)-4-carbamoyloxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxym Chemical compound OS([O-])(=O)=O.N=1C(C=2SC=C(N=2)C(=O)NCCC[S+](C)C)=CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C WUIABRMSWOKTOF-OCBSMOPSSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMTAFVWTTFSTOG-UHFFFAOYSA-N Butylate Chemical compound CCSC(=O)N(CC(C)C)CC(C)C BMTAFVWTTFSTOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150071146 COX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100114534 Caenorhabditis elegans ctc-2 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004161 Claudin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000601 Claudin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 108010037462 Cyclooxygenase 2 Proteins 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 101100012887 Drosophila melanogaster btl gene Proteins 0.000 description 1
- 101100012878 Drosophila melanogaster htl gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014405 Electrocution Diseases 0.000 description 1
- MBYXEBXZARTUSS-QLWBXOBMSA-N Emetamine Natural products O(C)c1c(OC)cc2c(c(C[C@@H]3[C@H](CC)CN4[C@H](c5c(cc(OC)c(OC)c5)CC4)C3)ncc2)c1 MBYXEBXZARTUSS-QLWBXOBMSA-N 0.000 description 1
- 208000005431 Endometrioid Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 101150074355 GS gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101001066129 Homo sapiens Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 229920000869 Homopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000012960 Immunoglobulin kappa-Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010090227 Immunoglobulin kappa-Chains Proteins 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-AHCXROLUSA-N Iodine-123 Chemical compound [123I] ZCYVEMRRCGMTRW-AHCXROLUSA-N 0.000 description 1
- OIRFJRBSRORBCM-UHFFFAOYSA-N Iopanoic acid Chemical compound CCC(C(O)=O)CC1=C(I)C=C(I)C(N)=C1I OIRFJRBSRORBCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N L-ascorbyl-6-palmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N 0.000 description 1
- 239000011786 L-ascorbyl-6-palmitate Substances 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 206010050017 Lung cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N Metrizamide Chemical compound CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(=O)N[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)OC2O)O)=C1I BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N 0.000 description 1
- VFKZTMPDYBFSTM-KVTDHHQDSA-N Mitobronitol Chemical compound BrC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CBr VFKZTMPDYBFSTM-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N Naproxen Natural products C1=C(C(C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150000187 PTGS2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 102220517048 SCO-spondin_W51A_mutation Human genes 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-UHFFFAOYSA-N SJ000285215 Natural products N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2C1CC1CC2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2CC1CC AUVVAXYIELKVAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102220602178 Synaptotagmin-3_L50A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N Technetium-99 Chemical compound [99Tc] GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N Thiotepa Chemical compound C1CN1P(N1CC1)(=S)N1CC1 FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- KTVKGXZZBQCBGD-UHFFFAOYSA-M Tyropanoate sodium Chemical compound [Na+].CCCC(=O)NC1=C(I)C=C(I)C(CC(CC)C([O-])=O)=C1I KTVKGXZZBQCBGD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGQOVCHZGQWAOI-UHFFFAOYSA-N UNPD55612 Natural products N1C(O)C2CC(C=CC(N)=O)=CN2C(=O)C2=CC=C(C)C(O)=C12 VGQOVCHZGQWAOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220475438 Vacuolar protein sorting-associated protein 33A_W30A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- VWQVUPCCIRVNHF-OUBTZVSYSA-N Yttrium-90 Chemical compound [90Y] VWQVUPCCIRVNHF-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 229940013181 advil Drugs 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 description 1
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K aluminium tristearate Chemical compound [Al+3].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940063655 aluminum stearate Drugs 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 1
- VGQOVCHZGQWAOI-HYUHUPJXSA-N anthramycin Chemical compound N1[C@@H](O)[C@@H]2CC(\C=C\C(N)=O)=CN2C(=O)C2=CC=C(C)C(O)=C12 VGQOVCHZGQWAOI-HYUHUPJXSA-N 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009833 antibody interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 159000000032 aromatic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010385 ascorbyl palmitate Nutrition 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N benzathine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNCCNCC1=CC=CC=C1 JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N boldenone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229940005375 calcium iopodate Drugs 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-BJUDXGSMSA-N carbon-11 Chemical compound [11C] OKTJSMMVPCPJKN-BJUDXGSMSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 229940047495 celebrex Drugs 0.000 description 1
- 229960000590 celecoxib Drugs 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002737 cell proliferation kit Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- HVZGHKKROPCBDE-HZIJXFFPSA-L chembl2068725 Chemical compound [Ca+2].CN(C)\C=N\C1=C(I)C=C(I)C(CCC([O-])=O)=C1I.CN(C)\C=N\C1=C(I)C=C(I)C(CCC([O-])=O)=C1I HVZGHKKROPCBDE-HZIJXFFPSA-L 0.000 description 1
- NDAYQJDHGXTBJL-MWWSRJDJSA-N chembl557217 Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 NDAYQJDHGXTBJL-MWWSRJDJSA-N 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N chloroprocaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1Cl VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002023 chloroprocaine Drugs 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009643 clonogenic assay Methods 0.000 description 1
- 231100000096 clonogenic assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000002445 cystadenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 229940070230 daypro Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N dehydrotestosterone Natural products O=C1C=CC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)O)C4C3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960001259 diclofenac Drugs 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043237 diethanolamine Drugs 0.000 description 1
- 229960000616 diflunisal Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 208000018459 dissociative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940072701 dolobid Drugs 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N emetine Chemical compound N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@@H]1CC AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N 0.000 description 1
- 229960002694 emetine Drugs 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-UWBTVBNJSA-N emetine Natural products N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@H]1CC AUVVAXYIELKVAI-UWBTVBNJSA-N 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 208000001991 endodermal sinus tumor Diseases 0.000 description 1
- 201000003908 endometrial adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000028730 endometrioid adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 229940012017 ethylenediamine Drugs 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- RDJGLLICXDHJDY-UHFFFAOYSA-N fenoprofen Chemical compound OC(=O)C(C)C1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 RDJGLLICXDHJDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001419 fenoprofen Drugs 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 1
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 210000001650 focal adhesion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 125000003712 glycosamine group Chemical group 0.000 description 1
- LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N guaiacol Chemical compound COC1=CC=CC=C1O LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000044350 human CLDN9 Human genes 0.000 description 1
- 102000047486 human GAPDH Human genes 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940096329 human immunoglobulin a Drugs 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001680 ibuprofen Drugs 0.000 description 1
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 1
- 230000037189 immune system physiology Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 229940089536 indocin Drugs 0.000 description 1
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229960002979 iopanoic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000991 ketoprofen Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229960002247 lomustine Drugs 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 201000009546 lung large cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 1
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 229960000554 metrizamide Drugs 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960005485 mitobronitol Drugs 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 229940072709 motrin Drugs 0.000 description 1
- 201000010879 mucinous adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229960004270 nabumetone Drugs 0.000 description 1
- 229940089466 nalfon Drugs 0.000 description 1
- 229940090008 naprosyn Drugs 0.000 description 1
- 229960002009 naproxen Drugs 0.000 description 1
- 238000013188 needle biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100001221 nontumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 230000006548 oncogenic transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 229960002739 oxaprozin Drugs 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 201000010279 papillary renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 210000004197 pelvis Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical class OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 description 1
- QYSPLQLAKJAUJT-UHFFFAOYSA-N piroxicam Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)N(C)C=1C(=O)NC1=CC=CC=N1 QYSPLQLAKJAUJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940063179 platinol Drugs 0.000 description 1
- 208000004333 pleomorphic adenoma Diseases 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 229960003712 propranolol Drugs 0.000 description 1
- 239000000473 propyl gallate Substances 0.000 description 1
- 235000010388 propyl gallate Nutrition 0.000 description 1
- 229940075579 propyl gallate Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000005892 protein maturation Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940087462 relafen Drugs 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- RZJQGNCSTQAWON-UHFFFAOYSA-N rofecoxib Chemical compound C1=CC(S(=O)(=O)C)=CC=C1C1=C(C=2C=CC=CC=2)C(=O)OC1 RZJQGNCSTQAWON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102200006663 rs121917757 Human genes 0.000 description 1
- 102220036763 rs587780032 Human genes 0.000 description 1
- 102220058909 rs746495820 Human genes 0.000 description 1
- 102220099379 rs770702450 Human genes 0.000 description 1
- 150000003873 salicylate salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 208000019694 serous adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000004548 serous cystadenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 208000000649 small cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229940083542 sodium Drugs 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- ZEYOIOAKZLALAP-UHFFFAOYSA-M sodium amidotrizoate Chemical compound [Na+].CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I ZEYOIOAKZLALAP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M sodium bisulfate Chemical compound [Na+].OS([O-])(=O)=O WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000342 sodium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940100996 sodium bisulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 229940001482 sodium sulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 229960003037 sodium tyropanoate Drugs 0.000 description 1
- PUZPDOWCWNUUKD-ULWFUOSBSA-M sodium;fluorine-18(1-) Chemical compound [18F-].[Na+] PUZPDOWCWNUUKD-ULWFUOSBSA-M 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- MLKXDPUZXIRXEP-MFOYZWKCSA-N sulindac Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(F)=CC=C2\C1=C/C1=CC=C(S(C)=O)C=C1 MLKXDPUZXIRXEP-MFOYZWKCSA-N 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011885 synergistic combination Substances 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 150000004579 taxol derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940056501 technetium 99m Drugs 0.000 description 1
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 1
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 1
- 229960002372 tetracaine Drugs 0.000 description 1
- GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N tetracaine Chemical compound CCCCNC1=CC=C(C(=O)OCCN(C)C)C=C1 GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960001196 thiotepa Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 1
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000014723 transformation of host cell by virus Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 208000029387 trophoblastic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004222 uncontrolled growth Effects 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 229940063674 voltaren Drugs 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
В последнее десятилетие антитела успешно внедряются в клиническую практику для применения при лечении рака; они представляются наиболее многообещающим терапевтическим средством в онкологии. По сравнению с обычными лекарственными средствами для лечения рака терапевтические методы, основанные на антителах, обладают потенциально более высокой специфичностью и меньшим спектром побочных эффектов, потому что антитела точно различают нормальные и неопластические клетки и их действие базируется на менее токсичных иммунологических противоопухолевых механизмах, например активации комплемента и мобилизации цитотоксических клеток иммунной системы.In the last decade, antibodies have been successfully introduced into clinical practice for use in the treatment of cancer; they appear to be the most promising therapeutic agent in oncology. Compared with conventional cancer drugs, antibody-based therapeutics have potentially higher specificity and fewer side effects because antibodies accurately distinguish between normal and neoplastic cells and rely on less toxic immunological antitumor mechanisms such as complement activation. and mobilization of cytotoxic cells of the immune system.
Клаудины - это интегральные мембранные белки, располагающиеся в местах плотных контактов между эпителием и эндотелием. Считается, что в клаудиновой молекуле четыре трансмембранных сегмента с двумя внеклеточными «петлями», а N- и С-концы находятся в цитоплазме. Трансмембранные белки семейства клаудинов (CLDN) играют ключевую роль в поддержании плотных контактов между эпителием и эндотелием, а также, возможно, участвуют в поддержании цитоскелета и в клеточных сигнальных механизмах. Экспрессия этих белков существенно различается в нормальных клетках и в опухолевых, что, наряду с их мембранной локализацией, делает их заманчивой мишенью иммунотерапии рака; применение терапевтических методов, основанных на антителах, для прицельного воздействия на клаудины при лечении рака сулит высокую специфичность терапевтического воздействия. Claudins are integral membrane proteins located at tight junctions between the epithelium and endothelium. It is believed that the claudin molecule has four transmembrane segments with two extracellular “loops”, and the N- and C-termini are located in the cytoplasm. Transmembrane proteins of the claudin family (CLDN) play a key role in maintaining tight junctions between the epithelium and endothelium, and are also possibly involved in cytoskeletal maintenance and cellular signaling mechanisms. The expression of these proteins differs significantly between normal and tumor cells, which, along with their membrane localization, makes them an attractive target for cancer immunotherapy; The use of antibody-based therapeutics to target claudins in cancer treatment promises high specificity of therapeutic effects.
Однако клиническое применение терапевтических воздействий, нацеленных на клаудины, сталкивается с рядом препятствий. В силу повсеместного присутствия клаудинов в организме и их важной роли в поддержании плотных контактов необходима высокая специфичность нацеленных на клаудины терапевтических воздействий, чтобы обеспечить максимальную специфичность лечения и свести к минимуму системную токсичность. However, the clinical application of claudin-targeted therapeutics faces several obstacles. Due to the ubiquitous presence of claudins in the body and their important role in maintaining tight junctions, high specificity of claudin-targeted therapeutic interventions is required to maximize treatment specificity and minimize systemic toxicity.
Публикация WO 2009/087978 относится к антителам, направленным против калудина-6 и их применению в качестве противораковых агентов. В частности описываются моноклональные антитела, обозначенные AB3-1, AE1-16, AE49-11 и AE3-20. Однако, как показал анализ методом флуоресцентно-активируемой клеточной сортировки (FACS), описанный в примере 5, ни одно из этих антител не было специфичным в отношении клаудина-6. Антитела AE3-20 взаимодействовали с CLDN9, тогда как антитела AE1-16 и AE49-11 проявляли значительную реактивность в отношении CLDN9 и также взаимодействовали с CLDN4. Прочность связывания антител AB3-1 с CLDN6 была такой же, как с CLDN9. В примере 7 описывается, что введение антител AE49-11 мышам с модельными опухолями подавляло опухолевый рост и продлевало жизнь. Но с учетом неспецифичности использованных в этом примере антител остается неясным, действительно ли наблюдавшийся эффект был обусловлен связыванием этих антител с CLDN6.Publication WO 2009/087978 relates to antibodies directed against caludin-6 and their use as anti-cancer agents. In particular, monoclonal antibodies designated AB3-1, AE1-16, AE49-11 and AE3-20 are described. However, as shown by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis described in Example 5, none of these antibodies were specific for claudin-6. Antibodies AE3-20 interacted with CLDN9, whereas antibodies AE1-16 and AE49-11 showed significant reactivity against CLDN9 and also interacted with CLDN4. The strength of AB3-1 antibody binding to CLDN6 was the same as to CLDN9. Example 7 describes that administration of AE49-11 antibodies to mice with model tumors suppressed tumor growth and prolonged life. But given the nonspecificity of the antibodies used in this example, it remains unclear whether the observed effect was actually due to the binding of these antibodies to CLDN6.
Таким образом, до сих пор не были описаны антитела, специфичные в отношении CLDN6, которые бы избирательно связывались с поверхностью клеток, в которых экспрессируется CLDN6. А для основанных на антителах терапевтических воздействий, нацеленных на CLDN6, требуются как раз специфичные антитела. Thus, CLDN6-specific antibodies have not yet been described that selectively bind to the surface of cells in which CLDN6 is expressed. And antibody-based therapeutics targeting CLDN6 require specific antibodies.
Показанное на фигуре 1 сравнение аминокислотных последовательностей CLDN3, CLDN4, CLDN6 и CLDN9 демонстрирует высокую консервативность CLDN6 относительно других клаудинов. Высокая степень гомологии CLDN6 с другими клаудинами, в особенности с CLDN9 и CLDN4, и тот факт, что в работе WO 2009/087978 не удалось получить антитела, специфичные к CLDN6, заставляют предполагать, что невозможно получить антитела, специфически связывающиеся с CLDN6.The amino acid sequence comparison of CLDN3, CLDN4, CLDN6 and CLDN9 shown in Figure 1 demonstrates the high conservation of CLDN6 relative to other claudins. The high degree of homology of CLDN6 with other claudins, especially CLDN9 and CLDN4, and the fact that WO 2009/087978 failed to obtain antibodies specific for CLDN6 suggest that it is not possible to obtain antibodies that specifically bind to CLDN6.
Раскрытие изобретенияDisclosure of the Invention
Описываемые в настоящем документе результаты экспериментов подтверждают, что у человека CLDN6 экспрессируется в различных раковых клетках, тогда как в нормальных тканях его экспрессия ограничена плацентой. The experimental results described herein confirm that in humans, CLDN6 is expressed in a variety of cancer cells, whereas in normal tissues its expression is limited to the placenta.
В данном изобретении впервые описывается успешное получение антител, специфичных в отношении CLDN6 и способных связываться с поверхностью интактных клеток, в которых экспрессируется CLDN6. Исследование интактных клеток, в которых экспрессируется CLDN6, методом флуоресцентно-активируемой клеточной сортировки (FACS) продемонстрировало специфическое связывание антител против CLDN6 в то время как в случае клеток, в которых экспрессируются другие клаудиновые белки, в частности CLDN3, CLDN4 and CLDN9, или клеток, в которых не образуются ни один из этих белков, связывание вообще не наблюдалось. Таким образом, настоящее изобретение неожиданно показало, что можно получить антитела, специфически взаимодействующие с CLDN6 на поверхности клеток, в которых экспрессируется CLDN6, но не проявляющие существенной реактивности в отношении других высокогомологичных клаудинов как антигенов. This invention describes for the first time the successful production of antibodies that are specific for CLDN6 and are capable of binding to the surface of intact cells in which CLDN6 is expressed. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) studies of intact cells expressing CLDN6 demonstrated specific binding of anti-CLDN6 antibodies, whereas in cells expressing other claudin proteins, particularly CLDN3, CLDN4 and CLDN9, or cells in which neither of these proteins are formed, no binding was observed at all. Thus, the present invention unexpectedly showed that it is possible to obtain antibodies that specifically interact with CLDN6 on the surface of cells in which CLDN6 is expressed, but do not exhibit significant reactivity against other highly homologous claudins as antigens.
В общем, настоящим изобретением предлагаются антитела, полезные в качестве терапевтических средств для лечения и/или предотвращения заболеваний, при которых играют ту или иную роль клетки экспрессирующие CLDN6, у которых CLDN6 связан с их клеточной поверхностью, включая заболевания, сопровождающиеся образованием опухолей, в частности рак, например рак яичника, в том числе аденокарциному яичника и тератокарциному яичника, рак легких, в том числе мелкоклеточный рак легких (SCLC) и немелкоклеточный рак легких (NSCLC), в особенности плоскоклеточную карциному легких и аденокарциному, рак желудка, рак молочной железы, рак печени, рак поджелудочной железы, рак кожи, в частности базальноклеточную карциному и плоскоклеточную карциному, злокачественную меланому, рак головы и шеи, в том числе злокачественную полиморфную аденому, саркому, в частности синовиальную саркому и карциносаркому, рак желчного протока, рак мочевого пузыря, в частности переходноклеточная карцинома и папиллярная карцинома, рак почек, в частности почечно-клеточная карцинома, включая светлоклеточную почечно-клеточную карциному и папиллярную почечно-клеточную карциному, рак толстого кишечника, рак тонкого кишечника, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциному тонкого кишечника и аденокарциному подвздошной кишки, эмбриональную карциному яичка, хориокарциному плацентарной площадки, рак шейки матки, рак яичка, в частности семиному яичка, тератому яичка и эмбриональный рак яичка, рак матки, герминогенные опухоли, например тератокарциному или эмбриональную карциному, в частности герминогенную опухоль яичка, и их метастазирующие формы.In general, the present invention provides antibodies useful as therapeutic agents for the treatment and/or prevention of diseases in which cells expressing CLDN6 play a role, in which CLDN6 is associated with their cell surface, including diseases accompanied by the formation of tumors, in particular cancer, such as ovarian cancer, including ovarian adenocarcinoma and ovarian teratocarcinoma, lung cancer, including small cell lung cancer (SCLC) and non-small cell lung cancer (NSCLC), especially squamous cell lung carcinoma and adenocarcinoma, stomach cancer, breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, skin cancer, in particular basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma, malignant melanoma, head and neck cancer, including malignant polymorphic adenoma, sarcoma, in particular synovial sarcoma and carcinosarcoma, bile duct cancer, bladder cancer, in particular transitional cell carcinoma and papillary carcinoma, kidney cancer, in particular renal cell carcinoma, including clear cell renal cell carcinoma and papillary renal cell carcinoma, colon cancer, small intestine cancer, including ileal cancer, in particular small intestine adenocarcinoma and ileal adenocarcinoma, embryonal testicular carcinoma, placental site choriocarcinoma, cervical cancer, testicular cancer, particularly testicular seminoma, testicular teratoma and embryonal testicular cancer, uterine cancer, germ cell tumors, such as teratocarcinoma or embryonal carcinoma, particularly testicular germ cell tumor, and their metastasizing forms.
Один из вариантов данного изобретения относится к антителам, способным связываться с CLDN6, ассоциированным с поверхностью клеток, в которых экспрессируется CLDN6. Предпочтительно, эти антитела не способны в основном связываться с CLDN9, ассоциированным с поверхностью клеток, в которых экспрессируется CLDN9. Предпочтительно, эти антитела не способны в основном связываться с CLDN4, ассоциированным с поверхностью клеток, в которых экспрессируется CLDN4 и/или не способны в основном связываться с CLDN3, ассоциированным с поверхностью клеток, в которых экспрессируется CLDN3. Наиболее предпочтительно, эти антитела не способны связываться ни с каким другим клаудином, кроме CLDN6, ассоциированным с поверхностью клеток, в которых экспрессируется указанный клаудин, и специфичны в отношении CLDN6. Предпочтительно, указанные клетки, в которых экспрессируется указанный клаудин, являются интактными, в частности с ненарушенной проницаемостью клеточной мембраны, и указанный клаудин, ассоциированный с поверхностью клетки, обладает нативной конформацией т.е. не денатурирован. Предпочтительно, эти антитела способны связываться с одним или более эпитопами CLDN6 в их нативной конформации.One embodiment of the present invention provides antibodies capable of binding to CLDN6 associated with the surface of cells in which CLDN6 is expressed. Preferably, these antibodies are unable to substantially bind to CLDN9 associated with the surface of cells in which CLDN9 is expressed. Preferably, these antibodies are unable to bind substantially to CLDN4 associated with the surface of cells in which CLDN4 is expressed and/or are unable to bind substantially to CLDN3 associated with the surface of cells in which CLDN3 is expressed. Most preferably, these antibodies are not capable of binding to any claudin other than CLDN6 associated with the surface of cells in which the specified claudin is expressed, and are specific for CLDN6. Preferably, said cells in which said claudin is expressed are intact, in particular with an unpermeabilized cell membrane, and said claudin associated with the cell surface has a native conformation, i.e. not denatured. Preferably, these antibodies are capable of binding to one or more CLDN6 epitopes in their native conformation.
В одном из воплощений данного изобретения предлагаемые антитела способны связываться с эпитопом, находящимся в пределах внеклеточной части CLDN6, причем указанная часть CLDN6 предпочтительно содержит какую-либо аминокислотную последовательность из числа следующих: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7, более предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Предпочтительно, предлагаемые антитела способны связываться с эпитопом, находящимся в пределах одной из следующих аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, предпочтительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7. In one embodiment of the present invention, the antibodies of the invention are capable of binding to an epitope located within the extracellular portion of CLDN6, wherein said portion of CLDN6 preferably comprises any of the following amino acid sequences: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 14 and SEQ ID NO: 15, preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7, more preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. Preferably, the antibodies of the invention are capable of binding to an epitope located within one of the following amino acids sequences: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7.
В одном из воплощений данного изобретения предлагаемые антитела способны связываться с CLDN6 путем взаимодействия с по меньшей мере одним, предпочтительно более чем с одним, например с двумя, тремя, четырьмя или пятью, предпочтительно со всеми аминокислотными остатками, выбираемыми из группы, состоящей из Thr33, Phe35, Gly37, Ser39, Ile40 и Leu151, предпочтительно путем взаимодействия с по меньшей мере одним, предпочтительно с более чем одним, предпочтительно со всеми аминокислотными остатками, выбираемыми из группы, состоящей из Thr33, Phe35, Gly37, Ser39 и Ile40, более предпочтительно путем взаимодействия с по меньшей мере одним, предпочтительно с более чем одним, предпочтительно со всеми аминокислотными остатками, выбираемыми из группы, состоящей из Phe35, Gly37, Ser39 и Ile40, или состоящей из Thr33, Phe35, Gly37 и Ser39, и в особенности путем взаимодействия с по меньшей мере одним, предпочтительно с более чем одним, предпочтительно со всеми аминокислотными остатками, выбираемыми из группы, состоящей из Phe35, Gly37,и Ser39. Предпочтительно, предлагаемые антитела не взаимодействуют с одним или более, предпочтительно всеми аминокислотными остатками, выбираемыми из группы, состоящей из Glu154, Ala155, Arg158 и Gly161, и предпочтительно не взаимодействуют с одним или более, предпочтительно всеми аминокислотными остатками, выбираемыми из группы, состоящей из Arg158 и Gly161.In one embodiment of the present invention, the antibodies of the invention are capable of binding to CLDN6 by interacting with at least one, preferably more than one, for example two, three, four or five, preferably all amino acid residues selected from the group consisting of Thr33, Phe35, Gly37, Ser39, Ile40 and Leu151, preferably by interaction with at least one, preferably more than one, preferably all amino acid residues selected from the group consisting of Thr33, Phe35, Gly37, Ser39 and Ile40, more preferably by interaction with at least one, preferably more than one, preferably all amino acid residues selected from the group consisting of Phe35, Gly37, Ser39 and Ile40, or consisting of Thr33, Phe35, Gly37 and Ser39, and in particular by interaction with at least one, preferably more than one, preferably all, amino acid residues selected from the group consisting of Phe35, Gly37, and Ser39. Preferably, the antibodies of the invention do not react with one or more, preferably all, amino acid residues selected from the group consisting of Glu154, Ala155, Arg158 and Gly161, and preferably do not interact with one or more, preferably all amino acid residues selected from the group consisting of Arg158 and Gly161.
Взаимодействие между антителами и CLDN6, в частности в его нативной конформации, можно изучить путем мутагенеза на основе сканирования аланином. Мутантные CLDN6 можно характеризовать по их способности связываться со специфичными моноклональными антителами. Нарушение связывания специфичного моноклонального антитела с мутантным CLDN6 позволяет полагать, что аминокислотный остаток, по которому имела место мутация, важен для контакта с антителом. Определять связывание можно, например. путем проточной цитометрии.The interaction between antibodies and CLDN6, particularly in its native conformation, can be studied by alanine scanning-based mutagenesis. Mutant CLDN6 can be characterized by their ability to bind to specific monoclonal antibodies. The impaired binding of a specific monoclonal antibody to mutant CLDN6 suggests that the amino acid residue at which the mutation has occurred is important for contact with the antibody. You can define binding, for example. by flow cytometry.
В одном воплощении данного изобретения предлагаемые антитела получают способом, включающим стадию иммунизации животного пептидом с аминокислотной последовательностью, являющейся какой-либо из следующих: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, предпочтительна аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 или иммунологически эквивалентный пептид, или нуклеотидная последовательность, или клетка-хозяин, в которой экспрессируется указанный пептид. In one embodiment of the present invention, the antibodies of the invention are produced by a method comprising the step of immunizing an animal with a peptide having an amino acid sequence being any of the following: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15. preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 or an immunologically equivalent peptide or nucleotide sequence or host cell in which said peptide is expressed.
В других воплощениях данного изобретения CLDN6, с которым способно связываться предлагаемое антитело, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Особенно предпочтительно, чтобы предлагаемое антитело было способно связываться с CLDN6, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и с CLDN6, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.In other embodiments of the present invention, the CLDN6 to which the inventive antibody is capable of binding has the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence SEQ ID NO: 8. It is particularly preferred that the inventive antibody is capable of binding to CLDN6 having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2, and with CLDN6 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит тяжелую цепь, включающую по меньшей мере одну, предпочтительно две, более предпочтительно все три последовательности CDR (области, определяющие комплементарность) из последовательности тяжелой цепи антитела, выбираемые из SEQ ID NO: 34, 36, 38 и 40 или их вариантов. На фигуре 25 последовательности CDR в упомянутых выше последовательностях тяжелой цепи антитела выделены квадратной рамочкой.In one embodiment of the present invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain comprising at least one, preferably two, more preferably all three CDR (complementarity determining region) sequences from the antibody heavy chain sequence selected from SEQ ID NO: 34, 36, 38 and 40 or their variants. In Figure 25, the CDR sequences in the above-mentioned antibody heavy chain sequences are highlighted with a square frame.
В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит тяжелую цепь, включающую последовательность CDR3 Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3, где Xaa1 представляет любую аминокислоту, предпочтительно ароматическую аминокислоту, более предпочтительно Phe или Tyr, наиболее предпочтительно Tyr, Xaa2 представляет любую аминокислоту, предпочтительно ароматическую аминокислоту, более предпочтительно Phe или Tyr, наиболее предпочтительно Tyr, и Xaa3 представляет любую аминокислоту, предпочтительно Leu или Phe, более предпочтительно Leu. В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит тяжелую цепь, включающую последовательность CDR3 Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 или Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, где Xaa1, Xaa2 и Xaa3 представляют аминокислоты, указанные выше. В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит тяжелую цепь, включающую последовательность CDR3 Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, где Xaa1, Xaa2 и Xaa3 представляют аминокислоты, указанные выше. В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит тяжелую цепь, включающую последовательность CDR3 Ala Arg Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp Tyr, где Xaa1, Xaa2 and Xaa3 представляют аминокислоты, указанные выше. В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело по указанным выше воплощениям содержит последовательность CDR1, соответствующую SEQ ID NO: 47 или ее варианту, и/или последовательность CDR2, соответствующую SEQ ID NO: 48 или ее варианту.In one embodiment of the present invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain comprising the sequence CDR3 Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3, where Xaa1 is any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more preferably Phe or Tyr, most preferably Tyr, Xaa2 is any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more preferably Phe or Tyr, most preferably Tyr, and Xaa3 is any amino acid, preferably Leu or Phe, more preferably Leu. In one embodiment of the present invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain comprising the sequence CDR3 Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 or Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, where Xaa1, Xaa2 and Xaa3 represent the amino acids specified above. In one embodiment of the present invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain comprising the sequence CDR3 Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, where Xaa1, Xaa2 and Xaa3 represent the amino acids specified above. In one embodiment of the present invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain comprising the sequence CDR3 Ala Arg Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp Tyr, where Xaa1, Xaa2 and Xaa3 represent the amino acids specified above. In one embodiment of the present invention, the proposed antibody according to the above embodiments contains a CDR1 sequence corresponding to SEQ ID NO: 47 or a variant thereof, and/or a CDR2 sequence corresponding to SEQ ID NO: 48 or a variant thereof.
В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит тяжелую цепь, включающую последовательность из антительной тяжелой цепи, выбираемую из SEQ ID NO: 34, 36, 38 и 40 или их вариантов.In one embodiment of the present invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain comprising a sequence from an antibody heavy chain selected from SEQ ID NOs: 34, 36, 38 and 40 or variants thereof.
В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит легкую цепь, включающую по меньшей мере одну, предпочтительно две, более предпочтительно все три последовательности CDR из последовательности легкой цепи антитела, выбираемые из SEQ ID NO: 35, 37, 39 и 41 или их вариантов. На фигуре 26 последовательности CDR в упомянутых выше последовательностях легкой цепи антитела выделены квадратной рамочкой.In one embodiment of the present invention, the antibody of the invention comprises a light chain comprising at least one, preferably two, more preferably all three CDR sequences from the antibody light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 35, 37, 39 and 41 or variants thereof. In Figure 26, the CDR sequences in the above-mentioned antibody light chain sequences are highlighted with a square box.
В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит легкую цепь, включающую последовательность CDR3 Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro, где Xaa1 представляет любую аминокислоту, предпочтительно Ser или Asn, наиболее предпочтительно Ser, Xaa2 представляет любую аминокислоту, предпочтительно Tyr, Ser, Ile, Asn или Thr, более предпочтительно Tyr, Ser или Asn, наиболее предпочтительно Asn, и Xaa3 представляет любую аминокислоту, предпочтительно Ser или Tyr, более предпочтительно Tyr. В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит легкую цепь, включающую последовательность CDR3 Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro, где Xaa1, Xaa2 и Xaa3 представляют аминокислоты, указанные выше. В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит легкую цепь, включающую последовательность CDR3 Gln Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro Trp Thr, где Xaa1, Xaa2 и Xaa3 представляют аминокислоты, указанные выше. В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело по указанным выше воплощениям содержит содержит легкую цепь, включающую последовательность CDR1, соответствующую SEQ ID NO: 52 или ее варианту, и/или последовательность CDR2, соответствующую SEQ ID NO: 53 или ее варианту.In one embodiment of the present invention, the antibody of the invention comprises a light chain comprising the sequence CDR3 Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro, where Xaa1 is any amino acid, preferably Ser or Asn, most preferably Ser, Xaa2 is any amino acid, preferably Tyr, Ser, Ile, Asn or Thr, more preferably Tyr, Ser or Asn, most preferably Asn, and Xaa3 is any amino acid, preferably Ser or Tyr, more preferably Tyr. In one embodiment of the present invention, the antibody of the present invention contains a light chain comprising the sequence CDR3 Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro, where Xaa1, Xaa2 and Xaa3 represent the amino acids specified above. In one embodiment of the present invention, the antibody of the present invention contains a light chain comprising the sequence CDR3 Gln Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro Trp Thr, where Xaa1, Xaa2 and Xaa3 represent the amino acids specified above. In one embodiment of the present invention, the antibody according to the above embodiments comprises a light chain comprising a CDR1 sequence corresponding to SEQ ID NO: 52 or a variant thereof, and/or a CDR2 sequence corresponding to SEQ ID NO: 53 or a variant thereof.
В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит легкую цепь, включающую последовательность легкой цепи антитела, выбираемую из SEQ ID NO: 35, 37, 39, 41, 54 и 55 или их вариантов.In one embodiment of the present invention, the antibody of the invention comprises a light chain comprising an antibody light chain sequence selected from SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 54 and 55 or variants thereof.
В различных воплощениях настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит тяжелую цепь, как указано выше, и легкую цепь, как указано выше. In various embodiments of the present invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain as defined above and a light chain as defined above.
В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит:In one embodiment of the present invention, the proposed antibody contains:
(i) тяжелую цепь, включающую по меньшей мере одну, предпочтительно две, более предпочтительно все три последовательности CDR из последовательности тяжелой цепи антитела SEQ ID NO: x или ее варианта, и (i) a heavy chain comprising at least one, preferably two, more preferably all three CDR sequences from the antibody heavy chain sequence SEQ ID NO: x or a variant thereof, and
(ii) легкую цепь, включающую по меньшей мере одну, предпочтительно две, более предпочтительно все три последовательности CDR легкой цепи антитела SEQ ID NO: x+1 или ее варианта;(ii) a light chain comprising at least one, preferably two, more preferably all three light chain CDR sequences of the antibody SEQ ID NO: x+1 or a variant thereof;
где x выбирают из 34, 36, 38 и 40.where x is chosen from 34, 36, 38 and 40.
На фигурах 25 и 26 соответственно указанные последовательности CDR в упомянутых выше последовательностях тяжелой и легкой цепей антитела выделены квадратными рамочками.In Figures 25 and 26, respectively, the indicated CDR sequences in the above-mentioned antibody heavy and light chain sequences are highlighted in square frames.
В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит:In one embodiment of the present invention, the proposed antibody contains:
(i) тяжелую цепь, включающую последовательность CDR3, выбираемую из группы, состоящей из Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3, Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3, Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp и Ala Arg Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp Tyr, где Xaa1 представляет любую аминокислоту, предпочтительно ароматическую аминокислоту, более предпочтительно Phe или Tyr, наиболее предпочтительно Tyr, Xaa2 представляет любую аминокислоту, предпочтительно ароматическую аминокислоту, более предпочтительно Phe или Tyr, наиболее предпочтительно Tyr, и Xaa3 представляет любую аминокислоту, предпочтительно Leu или Phe, более предпочтительно Leu. (i) a heavy chain comprising a CDR3 sequence selected from the group consisting of Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3, Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3, Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp and Ala Arg Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp Tyr, where Xaa1 is any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more preferably Phe or Tyr, most preferably Tyr, Xaa2 is any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more preferably Phe or Tyr, most preferably Tyr, and Xaa3 is any amino acid, preferably Leu or Phe, more preferably Leu.
(ii) легкую цепь антитела, включающую последовательность CDR3, выбираемую из группы. состоящей из Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro, Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro, Gln Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro Trp Thr, где Xaa1 представляет любую аминокислоту, предпочтительно Ser или Asn, наиболее предпочтительно Ser, Xaa2 представляет любую аминокислоту, предпочтительно Tyr, Ser, Ile, Asn или Thr, более предпочтительно Tyr, Ser или Asn, наиболее предпочтительно Asn, и Xaa3 представляет любую аминокислоту, предпочтительно Ser или Tyr, более предпочтительно Tyr. (ii) an antibody light chain comprising a CDR3 sequence selected from the group. consisting of Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro, Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro, Gln Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro Trp Thr, where Xaa1 represents any amino acid, preferably Ser or Asn, most preferably Ser, Xaa2 represents any amino acid, preferably Tyr, Ser, Ile, Asn or Thr, more preferably Tyr, Ser or Asn, most preferably Asn, and Xaa3 is any amino acid, preferably Ser or Tyr, more preferably Tyr.
В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело по одному из упомянутых выше воплощений содержит: (i) тяжелую цепь антитела, включающую последовательность CDR1, соответствующую SEQ ID NO: 47 или ее вариант и/или последовательность CDR2, соответствующую SEQ ID NO: 48 или ее вариант и/или (ii) легкую цепь антитела, включающую последовательность CDR1, соответствующую SEQ ID NO: 52, или ее вариант и/или последовательность CDR2, соответствующую SEQ ID NO: 53, или ее вариант.In one embodiment of the present invention, the proposed antibody according to one of the above embodiments contains: (i) an antibody heavy chain comprising a CDR1 sequence corresponding to SEQ ID NO: 47 or a variant thereof and/or a CDR2 sequence corresponding to SEQ ID NO: 48 or its variant and/or (ii) an antibody light chain comprising a CDR1 sequence corresponding to SEQ ID NO: 52, or a variant thereof and/or a CDR2 sequence corresponding to SEQ ID NO: 53, or a variant thereof.
В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит:In one embodiment of the present invention, the proposed antibody contains:
(i) тяжелую цепь, включающую последовательность тяжелой цепи, выбираемую из SEQ ID NO 34, 36, 38 и 40 или их вариантов, предпочтительно SEQ ID NO: 36 или ее вариант, и(i) a heavy chain comprising a heavy chain sequence selected from
(ii) легкую цепь, включающую последовательность легкой цепи антитела, выбираемую из SEQ ID NO 35, 37, 39, 41, 54 и 55 или их вариантов, предпочтительно SEQ ID NO: 35 или ее вариант.(ii) a light chain comprising an antibody light chain sequence selected from
В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит:In one embodiment of the present invention, the proposed antibody contains:
(i) тяжелую цепь, включающую последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 36 или ее вариант, и(i) a heavy chain comprising the heavy chain sequence of SEQ ID NO: 36 or a variant thereof, and
(ii) легкую цепь, включающую последовательность легкой цепи антитела, выбираемую из SEQ ID NO 35, 54 и 55 или их вариантов.(ii) a light chain comprising an antibody light chain sequence selected from
В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит:In one embodiment of the present invention, the proposed antibody contains:
(i) тяжелую цепь, включающую последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 36 или ее вариант, и(i) a heavy chain comprising the heavy chain sequence of SEQ ID NO: 36 or a variant thereof, and
(ii) легкую цепь, включающую последовательность легкой цепи антитела, выбираемую из SEQ ID NO 54 и 55 или их вариантов.(ii) a light chain comprising an antibody light chain sequence selected from
В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит:In one embodiment of the present invention, the proposed antibody contains:
(i) тяжелую цепь, включающую последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 36 или ее вариант, и(i) a heavy chain comprising the heavy chain sequence of SEQ ID NO: 36 or a variant thereof, and
(ii) легкую цепь, включающую последовательность легкой цепи антитела SEQ ID NO 35 или ее вариант.(ii) a light chain comprising the antibody light chain sequence of SEQ ID NO 35 or a variant thereof.
В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит:In one embodiment of the present invention, the proposed antibody contains:
(i) тяжелую цепь, включающую последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: х или ее вариант, и(i) a heavy chain comprising the heavy chain sequence of SEQ ID NO: x or a variant thereof, and
(ii) легкую цепь, включающую последовательность легкой цепи антитела SEQ ID NO х+1 или ее вариант,(ii) a light chain comprising the antibody light chain sequence SEQ ID NO x+1 or a variant thereof,
где х выбирают из 34, 36, 38 и 40.where x is chosen from 34, 36, 38 and 40.
В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения предлагаемое антитело содержит тяжелую цепь, включающую константную область гамма-1 тяжелой цепи, предпочтительно константную область гамма-1 тяжелой цепи антитела человека, например такую последовательность, как SEQ ID NO: 25, и/или содержит легкую цепь, включающую константную область каппа легкой цепи антитела, предпочтительно константную область каппа легкой цепи антитела человека, например такую последовательность, как SEQ ID NO: 27.In preferred embodiments of the present invention, the antibody of the invention comprises a heavy chain comprising a gamma-1 heavy chain constant region, preferably a gamma-1 heavy chain constant region of a human antibody, for example a sequence such as SEQ ID NO: 25, and/or contains a light chain comprising a kappa light chain constant region of an antibody, preferably a human kappa light chain constant region, such as a sequence such as SEQ ID NO: 27.
В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения предлагаемые антитела обладают одной или более из следующих активностей: (i) уничтожают клетки, в которых экспрессируется CLDN6, (ii) ингибируют пролиферацию клеток, в которых экспрессируется CLDN6, (iii) ингибируют образование колоний клетками, в которых экспрессируется CLDN6, (iv) опосредуют ремиссию, т.е. уменьшение размеров, предпочтительно полную ремиссию, т.е. полное исчезновение сформировавшихся опухолей, (v) предотвращают образование или восстановление ранее существовавших опухолей и (vi) подавляют метастазирование клеток, в которых экспрессируется CLDN6. Соответственно, антитела по данному изобретению можно применять для достижения одного или более из вышеуказанных явлений, в частности при введении пациенту. Уничтожение клеток и/или ингибирование одной или более из их активностей можно использовать в терапевтических целях, как описано в настоящем документе. В частности, уничтожение клеток, ингибирование пролиферации клеток и/или ингибирование образования колоний клеток можно использовать для лечения или предотвращения рака, включая образование метастазов. Ингибирование пролиферации, образования колоний и/или метастазирования клеток можно использовать, в частности, для лечения или предотвращения образования метастазов при раке и метастатического распространения раковых клеток. Предпочтительно антитела по данному изобретению опосредуют уничтожение клеток, вызывая лизис, опосредуемый комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC), лизис, опосредуемый антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC), апоптоз, гомотипическую адгезию и/или фагоцитоз, предпочтительно вызывая лизис, опосредуемый комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC), и/или лизис, опосредуемый антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC). Настоящее изобретение также включает воплощения, в которых предлагаемые антитела проявляют свои описанные здесь активности, например уничтожение клеток и/или ингибирование одной или более клеточных активностей, например пролиферации клеток и/или образования колоний, не вызывая лизис, опосредуемый комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC), лизис, опосредуемый антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC), апоптоз, гомотипическую адгезию и/или фагоцитоз. Так, антитела по данному изобретению могут оказывать свое действие. просто связываясь с CLDN6 на клеточной поверхности и таким образом блокируя пролиферацию клеток, например. В одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемые антитела не вызывают лизис клеток, опосредуемый комплемент-зависимой токсичностью.In preferred embodiments of the present invention, the provided antibodies have one or more of the following activities: (i) kill cells in which CLDN6 is expressed, (ii) inhibit proliferation of cells in which CLDN6 is expressed, (iii) inhibit colony formation of cells in which CLDN6 is expressed , (iv) mediate remission, i.e. reduction in size, preferably complete remission, i.e. complete disappearance of established tumors, (v) prevent the formation or restoration of pre-existing tumors, and (vi) inhibit metastasis of cells in which CLDN6 is expressed. Accordingly, the antibodies of this invention can be used to achieve one or more of the above phenomena, particularly when administered to a patient. Killing cells and/or inhibiting one or more of their activities can be used for therapeutic purposes, as described herein. In particular, killing cells, inhibiting cell proliferation, and/or inhibiting the formation of cell colonies can be used to treat or prevent cancer, including the formation of metastases. Inhibition of cell proliferation, colony formation and/or metastasis can be used, in particular, to treat or prevent the formation of cancer metastases and the metastatic spread of cancer cells. Preferably, the antibodies of the present invention mediate cell killing by causing complement-dependent cytotoxicity (CDC)-mediated lysis, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC)-mediated lysis, apoptosis, homotypic adhesion and/or phagocytosis, preferably causing complement-dependent cytotoxicity-mediated lysis ( CDC), and/or lysis mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). The present invention also includes embodiments in which the antibodies of the invention exhibit their activities described herein, such as killing cells and/or inhibiting one or more cellular activities, such as cell proliferation and/or colony formation, without causing complement-dependent cytotoxicity (CDC)-mediated lysis. , lysis, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), apoptosis, homotypic adhesion and/or phagocytosis. Thus, the antibodies of this invention can exert their effect. simply by binding to CLDN6 on the cell surface and thus blocking cell proliferation, for example. In one embodiment of the present invention, the antibodies of the invention do not cause cell lysis mediated by complement-dependent toxicity.
Предпочтительно лизис, опосредуемый антителозависимой клнточной цитотоксичностью, происходит в присутствии эффекторных клеток, которые в конкретных воплощениях данного изобретения выбирают из группы, состоящее из моноцитов, мононуклеарных клеток, NK-клеток (естественных киллеров) и полиморфноядерных лейкоцитов (PMN), а фагоцитоз осуществляется макрофагами.Preferably, lysis mediated by antibody-dependent cell cytotoxicity occurs in the presence of effector cells, which in particular embodiments of the present invention are selected from the group consisting of monocytes, mononuclear cells, NK cells (natural killer cells) and polymorphonuclear leukocytes (PMN), and phagocytosis is carried out by macrophages.
Активность, состоящую в ингибировании или уменьшении пролиферации клеток, в которых экспрессируется CLDN6, предпочтительно раковых клеток, можно измерить in vitro, определяя пролиферацию раковых клеток, в которых экспрессируется CLDN6, с помощью аналитического метода с использованием бромдезоксиуридина (5-бром-2-дезоксиуридина, BrdU). Бромдезоксиуридин представляет собой синтетический нуклеотид, являющийся аналогом тимидина, который может включаться в новосинтезированную ДНК реплицирующейся клетки (во время S-фазы клеточного цикла), замещая собой тимидин в процессе репликации ДНК. Определяя количество включившегося бромдезкосиуридина, например при помощи специфичных к нему антител, можно выявить клетки, в которых происходит активная репликация ДНК. The activity of inhibiting or reducing the proliferation of cells in which CLDN6 is expressed, preferably cancer cells, can be measured in vitro by determining the proliferation of cancer cells in which CLDN6 is expressed using a bromodeoxyuridine (5-bromo-2-deoxyuridine) assay. BrdU). Bromodeoxyuridine is a synthetic nucleotide that is an analogue of thymidine, which can be incorporated into newly synthesized DNA of a replicating cell (during the S phase of the cell cycle), replacing thymidine during DNA replication. By determining the amount of incorporated bromodecosiuridine, for example, using antibodies specific to it, it is possible to identify cells in which active DNA replication occurs.
Активность, состоящую в ингибировании или сокращении образования колоний клетками, в которых экспрессируется CLDN6, предпочтительно раковых клеток, можно измерить in vitro с помощью клоногенного теста. Клоногенный тест - это микробиологический метод для изучения эффективности влияния различных агентов на жизнеспособность и пролиферацию клеток. Его часто используют в онкологических исследованиях для определения воздействия лекарственных препаратов и облучения на размножающиеся опухолевые клетки. Такой эксперимент включает три основных этапа: (i) осуществление изучаемого воздействия на образец клеток, в частности раковых клеток, (ii) высевание клеток в сосуд для культуры ткани и (iii) рост клеток. Образующиеся колонии фиксируют, окрашивают и подсчитывают. Образование колоний важно потому, что оно связано со способностью отдельных опухолевых клеток, заселять органы, формируя метастазы. Ингибирующая активность антител в отношении образования колоний отражает их потенциальную эффективность в ингибировании метастазов. Антитела, обладающие такой активностью, т.е способные ингибировать или сокращать образование колоний в клоногенном тесте особенно полезны для лечения или предотвращения метастазов и метастатического распространения раковых клеток, в частности тех типов, которые обсуждаются в настоящем документе. The activity of inhibiting or reducing colony formation by cells expressing CLDN6, preferably cancer cells, can be measured in vitro using a clonogenic assay. The clonogenic test is a microbiological method for studying the effectiveness of various agents on cell viability and proliferation. It is often used in cancer research to determine the effects of drugs and radiation on proliferating tumor cells. Such an experiment involves three main steps: (i) exposing a sample of cells, particularly cancer cells, to be studied, (ii) seeding the cells in a tissue culture vessel, and (iii) growing the cells. The resulting colonies are fixed, stained and counted. Colony formation is important because it is associated with the ability of individual tumor cells to colonize organs, forming metastases. The colony formation inhibitory activity of antibodies reflects their potential effectiveness in inhibiting metastasis. Antibodies having such activity, ie, the ability to inhibit or reduce colony formation in a clonogenic test, are particularly useful for treating or preventing metastasis and metastatic spread of cancer cells, particularly those types discussed herein.
В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения предлагаемые антитела проявляют одну или более иммуноэффекторных функций против клеток, несущих CLDN6 в его нативной конформации, причем эти одна или более эффекторные функции предпочтительно выбирают из группы, состоящей из комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC), индукции апоптоза и ингибирования пролиферации; предпочтительными эффекторными функциями являются антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность и/или комплемент-зависимая цитотоксичность. In preferred embodiments of the present invention, the antibodies exhibit one or more immunoeffector functions against cells bearing CLDN6 in its native conformation, wherein the one or more effector functions are preferably selected from the group consisting of complement-dependent cytotoxicity (CDC), antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) ), induction of apoptosis and inhibition of proliferation; the preferred effector functions are antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and/or complement-dependent cytotoxicity.
Предпочтительно указанные одна или более активности или одна или более иммуноэффекторные функции, проявляемые указанными антителами индуцируются связыванием указанных антител с CLDN6, предпочтительно с эпитопом, расположенным в пределах внеклеточной части CLDN6, причем указанная внеклеточная часть CLDN6 предпочтительно содержит любую аминокислотную последовательность из следующих: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, предпочтительна аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7, более предпочтительна аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 6.Preferably, said one or more activities or one or more immunoeffector functions exhibited by said antibodies are induced by the binding of said antibodies to CLDN6, preferably to an epitope located within an extracellular portion of CLDN6, wherein said extracellular portion of CLDN6 preferably comprises any amino acid sequence of the following: SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is preferred or SEQ ID NO: 7, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is more preferred.
По данному изобретению клетки, в которых экспрессируется CLDN6, предпочтительно отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью. Клетки, в которых экспрессируется CLDN6 или клетки, несущие на своей поверхности CLDN6 в его нативной конформации, предпочтительно являются опухолевыми клетками, например раковыми клетками, предпочтительно раковыми клетками при раковых заболеваниях, выбираемых из группы, состоящей из рака яичника, в том числе аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легких, в том числе мелкоклеточного рака легких (SCLC) и немелкоклеточного рака легких (NSCLC), в особенности плоскоклеточной карциномы легких и аденокарциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в том числе злокачественной полиморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчного протока, рака мочевого пузыря, в частности переходноклеточной карциномы и папиллярной карциномы, рака почек, в частности почечно-клеточной карциномы, включая светлоклеточную почечно-клеточную карциному и папиллярную почечно-клеточную карциному, рака толстого кишечника, рака тонкого кишечника, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциному тонкого кишечника и аденокарциному подвздошной кишки, эмбриональной карциномы яичка, хориокарциномы плацентарной площадки, рака шейки матки, рака яичка, в частности семиномы яичка, тератомы яичка и эмбрионального рака яичка, рака матки, герминогенных опухолей, например тератокарциномы или эмбриональной карциномы, в частности герминогенной опухоли яичка, и их метастазирующих форм.According to the present invention, cells in which CLDN6 is expressed preferably have CLDN6 associated with their surface. Cells in which CLDN6 is expressed or cells bearing CLDN6 in its native conformation on their surface are preferably tumor cells, for example cancer cells, preferably cancer cells in cancers selected from the group consisting of ovarian cancer, including ovarian adenocarcinoma and teratocarcinoma of the ovary, lung cancer, including small cell lung cancer (SCLC) and non-small cell lung cancer (NSCLC), especially squamous cell lung carcinoma and adenocarcinoma, gastric cancer, breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, skin cancer, in particular basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma, malignant melanoma, head and neck cancer, including malignant polymorphic adenoma, sarcoma, in particular synovial sarcoma and carcinosarcoma, bile duct cancer, bladder cancer, in particular transitional cell carcinoma and papillary carcinoma, kidney cancer, in in particular renal cell carcinoma, including clear cell renal cell carcinoma and papillary renal cell carcinoma, colon cancer, small intestine cancer, including ileal cancer, in particular adenocarcinoma of the small intestine and adenocarcinoma of the ileum, embryonal testicular carcinoma, placental site choriocarcinoma, cervical cancer, testicular cancer, in particular testicular seminoma, testicular teratoma and embryonal testicular cancer, uterine cancer, germ cell tumors, such as teratocarcinoma or embryonal carcinoma, in particular testicular germ cell tumor, and metastatic forms thereof.
К антителам по данному изобретению можно присоединять один или более терапевтических эффекторов, например радиоактивные метки, цитотоксины, ферменты терапевтического назначения, агенты, вызывающие апоптоз и т.п., чтобы обеспечить прицельную цитотоксичность, т.е. уничтожение опухолевых клеток. One or more therapeutic effectors, such as radiolabels, cytotoxins, therapeutic enzymes, apoptotic agents, and the like, can be attached to the antibodies of the present invention to provide targeted cytotoxicity, i.e. destruction of tumor cells.
В одном из воплощений данного изобретения предлагаемые антитела (i) связываются с клетками, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 ассоциирован с клеточной поверхностью и (ii) не связываются с клетками, в которых не экспрессируется CLDN6 и у которых нет CLDN6, ассоциированного с клеточной поверхностью. Антитела по данному изобретению предпочтительно (i) опосредуют уничтожение и/или ингибируют пролиферацию клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 ассоциирован с клеточной поверхностью, и (ii) не опосредует уничтожение и/или не ингибирует пролиферацию клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и у которых нет CLDN6, ассоциированного с клеточной поверхностью.In one embodiment of the present invention, the antibodies of the invention (i) bind to cells that express CLDN6 and that have CLDN6 associated with the cell surface and (ii) do not bind to cells that do not express CLDN6 and that do not have CLDN6, associated with the cell surface. Antibodies of the present invention preferably (i) mediate the killing and/or inhibit the proliferation of cells in which CLDN6 is expressed and which are characterized in that CLDN6 is associated with the cell surface, and (ii) do not mediate the killing and/or inhibit the proliferation of cells in which express CLDN6 and which do not have cell surface associated CLDN6.
В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения предлагаемые антител связываются с нативными эпитопами CLDN6, находящимися на поверхности живых клеток, например с последовательностью SEQ ID NO: 6 или 7. В других предпочтительных воплощениях данного изобретения предлагаемые антитела специфичны в отношении раковых клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и не связываются с раковыми клетками, в которых не экспрессируется CLDN6.In a particularly preferred embodiment of the present invention, the antibodies of the invention bind to native CLDN6 epitopes found on the surface of living cells, such as SEQ ID NO: 6 or 7. In other preferred embodiments of the invention, the antibodies of the invention are specific for cancer cells that express CLDN6 and do not bind to cancer cells that do not express CLDN6.
Антитела по данному изобретению можно получить из различных видов живых организмов, включая (здесь перечислены не ограничивающие примеры) мышь, крысу, кролика, морскую свинку и человека. Антитела по данному изобретению включают также гибридные молекулы, в которых константная область, происходящая от одного вида живых организмов, предпочтительно человека, объединена с участком связывания антигена, происходящим от другого вида. Также антитела по данному изобретению включают гуманизированные молекулы, в которых участки связывания антигена, происходящие не от человека, объединены с константными и каркасными областями человеческого происхождения. Antibodies of this invention can be obtained from various types of living organisms, including but not limited to mouse, rat, rabbit, guinea pig and human. Antibodies of this invention also include hybrid molecules in which a constant region derived from one species of living organism, preferably human, is combined with an antigen binding site derived from another species. Also, the antibodies of this invention include humanized molecules in which non-human antigen-binding sites are combined with constant and framework regions of human origin.
Антитела по данному изобретению включают поликлональные и моноклональные антитела и антитела IgG2а (например, IgG2a, κ, λ), IgG2b (например, IgG2b, κ, λ), IgG3 (например, IgG3, κ, λ) и IgM. Но другие изотипы антител тоже входят в данное изобретение, включая IgG1, IgA1, IgA2, секреторный IgA, IgD, IgE. Предлагаемые антитела могут представлять собой полноразмерные антитела или же их антиген связывающие фрагменты, включая, например, Fab, F(ab')2, Fv, одноцепочечные фрагменты Fv или биспецифичные антитела. Кроме того, антиген связывающие фрагменты включают связывающий домен гибридных иммуноглобулинов, содержащий (i) полипептид, который формирует связывающий домен (например, вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область легкой цепи) который соединен с полипептидом, образующим шарнирную область имуноглобулиновой молекулы, (ii) константная областьСН2 тяжелой цепи иммуноглобулина, соединенная с шарнирной областью, и (iii) константная область CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина, соединенная с константной областью CH2. Такие гибридные белки также описываются в заявках на патент США №№ 2003/0118592 и 2003/0133939.Antibodies of this invention include polyclonal and monoclonal antibodies and IgG2a (eg, IgG2a, κ, λ), IgG2b (eg, IgG2b, κ, λ), IgG3 (eg, IgG3, κ, λ) and IgM antibodies. But other antibody isotypes are also included in this invention, including IgG1, IgA1, IgA2, secretory IgA, IgD, IgE. Antibodies of the invention may be full length antibodies or antigen binding fragments thereof, including, for example, Fab, F(ab') 2 , Fv, single chain Fv fragments, or bispecific antibodies. In addition, antigen binding fragments include a hybrid immunoglobulin binding domain comprising (i) a polypeptide that forms a binding domain (eg, a heavy chain variable region or a light chain variable region) that is linked to a polypeptide that forms the hinge region of the immunoglobulin molecule, (ii) a constant an immunoglobulin heavy chain CH2 region connected to the hinge region; and (iii) an immunoglobulin heavy chain constant region CH3 connected to a CH2 constant region. Such fusion proteins are also described in US patent applications No. 2003/0118592 and 2003/0133939.
Антитела по данному изобретению являются предпочтительно моноклональными, гибридными, человеческими или гуманизированными антителами или фрагментами антител. Антитела по данному изобретению включают полностью человеческие антитела. Такие антитела могут быть выработаны трансгенными животными (не человеком), например трансгенными мышами, способными производить множественные изотипы человеческих моноклональных антител против CLDN6, путем V-D-J рекомбинации и переключения изотипа. Таким трансгенным животным для производства поликлональных антител, например таких, какие описаны в заявке на патент США № 2003/0017534, может также быть кролик.The antibodies of this invention are preferably monoclonal, hybrid, human or humanized antibodies or antibody fragments. Antibodies of this invention include fully human antibodies. Such antibodies can be produced by non-human transgenic animals, for example transgenic mice capable of producing multiple isotypes of human monoclonal antibodies against CLDN6, by V-D-J recombination and isotype switching. Such a transgenic animal for the production of polyclonal antibodies, such as those described in US Patent Application No. 2003/0017534, may also be a rabbit.
Антитела по данному изобретению предпочтительно высвобождаются из комплекса с CLDN6 с константой диссоциации (KD) приблизительно 1-100 нM или меньше. Предпочтительно, антитела по данному изобретению не проявляют перекрестного взаимодействия (кросс-реактивности) с близкими антигенами клеточной поверхности и тем самым не ингибируют их функцию.Antibodies of this invention are preferably released from the complex with CLDN6 with a dissociation constant (KD) of approximately 1-100 nM or less. Preferably, the antibodies of this invention do not cross-react with related cell surface antigens and thereby do not inhibit their function.
В предпочтительных воплощениях данного изобретения предлагаемые антитела отличаются одним или более из следующих свойств:In preferred embodiments of the present invention, the provided antibodies have one or more of the following properties:
a) специфичность в отношении CLDN6; a) specificity for CLDN6;
b) сродство связывания с CLDN6 около 100 нM или меньше. предпочтительно около 5-10 нM или меньше и более предпочтительно около1-3 нМ или меньше;b) binding affinity for CLDN6 is about 100 nM or less. preferably about 5-10 nM or less, and more preferably about 1-3 nM or less;
c) способность вызывать комплемент-зависимую цитотоксичность в отношении клеток. в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью; c) the ability to cause complement-dependent cytotoxicity to cells. in which CLDN6 is expressed and which are characterized in that CLDN6 is associated with their surface;
d) способность ингибировать пролиферацию клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью; d) the ability to inhibit the proliferation of cells in which CLDN6 is expressed and which are characterized in that CLDN6 is associated with their surface;
e) способность вызывать апоптоз клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью; e) the ability to induce apoptosis of cells in which CLDN6 is expressed and which differ in that CLDN6 is associated with their surface;
f) способность вызывать гомотипическую адгезию клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью; f) the ability to induce homotypic adhesion of cells in which CLDN6 is expressed and which differ in that CLDN6 is associated with their surface;
g) способность вызывать антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность в отношении клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью, в присутствии эффекторных клеток; g) the ability to cause antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against cells in which CLDN6 is expressed and which have CLDN6 associated with their surface, in the presence of effector cells;
h) способность продлевать жизнь пациента, имеющего опухолевые клетки, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью; h) the ability to prolong the life of a patient having tumor cells that express CLDN6 and which are characterized in that CLDN6 is associated with their surface;
i) способность уменьшать количество клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью; i) the ability to reduce the number of cells that express CLDN6 and that have CLDN6 associated with their surface;
j) способность агрегировать CLDN6 на поверхности живых клеток.j) the ability to aggregate CLDN6 on the surface of living cells.
Предпочтительные антитела, описанные в настоящем документе, - это антитела, произведенные клетками гибридомы (или полученные из них), хранящимися в Коллекции микроорганизмов и культур клеток Германии Института им. Лейбница (DSMZ) (Инхоффенштрассе, 7B, 38124 Брауншвейг, Германия, Germany) и имеющими следующие обозначения и регистрационные номера:Preferred antibodies described herein are those produced by (or derived from) hybridoma cells deposited in the Collection of Microorganisms and Cell Cultures of Germany at the German Institute. Leibniz (DSMZ) (Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig, Germany, Germany) and having the following designations and registration numbers:
1. GT512muMAB 59A, регистрационный номер DSM ACC3067, депонирована 21.06.2010;1.
2. GT512muMAB 60A, регистрационный номер DSM ACC3068, депонирована 21.06.2010;2.
3. GT512muMAB 61D, регистрационный номер DSM ACC3069, депонирована 21.06.2010;3.
4. GT512muMAB 64A, регистрационный номер DSM ACC3070, депонирована 21.06.2010;4.
5. GT512muMAB 65A, регистрационный номер DSM ACC3071, депонирована 21.06.2010;5.
6. GT512muMAB 66B, регистрационный номер DSM ACC3072, депонирована 21.06.2010; 6.
7. GT512muMAB 67A, регистрационный номер DSM ACC3073. депонирована 21.06.2010;7.
8. GT512muMAB 55A, регистрационный номер DSM ACC3089, депонирована 31.07.2010; или8. GT512muMAB 55A, registration number DSM ACC3089, deposited 07/31/2010; or
9. GT512muMAB 89A, регистрационный номер DSM ACC3090, депонирована 31.07.2010.9.
В обозначениях антител по данному изобретению в настоящем документе отражены обозначение самого антитела и/или клона, его производящего, например muMAB 59A.The designations of antibodies of this invention herein reflect the designation of the antibody itself and/or the clone that produces it, for
Также предпочтительны антитела обладающие специфичностью антител, вырабатываемых описанными выше гибридомами или получаемых из них, в частности тех, которые содержат антигенсвязывающий участок или антигенсвязывающий сайт, в частности вариабельную область, идентичную таковой антител, вырабатываемых описанными выше гибридомами или получаемых из них, или имеющую высокую степень гомологии с ними. Имеется в виду, что предпочтительные по данному изобретению антитела имеют область CDR, идентичную соответствующей области антител вырабатываемых описанными выше гибридомами или получаемых из них. Под высокой степенью гомологии понимается, что в каждой области CDR может быть от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, например от 1 до 3 или от 1 до 2 замен. особенно предпочтительны антитела, которые являются гибридными и гуманизированными формами антител, вырабатываемых описанными выше гибридомами или получаемых из них. Also preferred are antibodies having the specificity of antibodies produced by or derived from the hybridomas described above, in particular those containing an antigen binding region or antigen binding site, in particular a variable region identical to or having a high degree of homology with them. It is meant that the preferred antibodies of this invention have a CDR region identical to the corresponding region of the antibodies produced by or derived from the hybridomas described above. By high homology is meant that each CDR region may have from 1 to 5, preferably from 1 to 4, for example from 1 to 3 or from 1 to 2 substitutions. Particularly preferred are antibodies that are hybrid and humanized forms of antibodies produced by or derived from the hybridomas described above.
Таким образом, антитела по данному изобретению могут быть выбраны из группы, состоящей из i) антител, вырабатываемых клонами, депонированными под регистрационным номером DSM ACC3067 (GT512muMAB 59A), DSM ACC3068 (GT512muMAB 60A), DSM ACC3069 (GT512muMAB 61D), DSM ACC3070 (GT512muMAB 64A), DSM ACC3071 (GT512muMAB 65A), DSM ACC3072 (GT512muMAB 66B), DSM ACC3073 (GT512muMAB 67A), DSM ACC3089 (GT512muMAB 55A) или DSM ACC3090 (GT512muMAB 89A), либо получаемых из них; (ii) антител, являющихся гибридными или гуманизированными формами антител по пункту (i); (iii) антитела, обладающие специфичностью антител по пункту (i); (iv) антитела, содержащие участок связывания антигена или сайт связывания антигена, как у антител по пункту (i). Участок связывания антигена или сайт связывания антигена, как у антител по пункту (i) может включать вариабельную область антител по пункту (i).Thus, the antibodies of the present invention may be selected from the group consisting of i) antibodies produced by clones deposited under registration number DSM ACC3067 (
Данное изобретение относится также к таким клеткам, как клетки гибридомы, вырабатывающими описанные в настоящем документе антитела.The present invention also relates to cells, such as hybridoma cells, that produce the antibodies described herein.
Предпочтительны клетки гибридомы, имеющиеся в коллекции DSMZ (Inhoffeenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Germany) с каким-либо из следующих обозначений и регистрационных номеров: Preferred hybridoma cells are available in the DSMZ collection (Inhoffeenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Germany) with any of the following designations and registration numbers:
1. GT512muMAB 59A, регистрационный номер DSM ACC3067, депонирована 21.06.2010;1.
2. GT512muMAB 60A, регистрационный номер DSM ACC3068, депонирована депонирована 21.06.2010;2.
3. GT512muMAB 61D, регистрационный номер DSM ACC3069, депонирована 21.06.2010;3.
4. GT512muMAB 64A, регистрационный номер DSM ACC3070, депонирована 21.06.2010;4.
5. GT512muMAB 65A, регистрационный номер DSM ACC3071, депонирована 21.06.2010;5.
6. GT512muMAB 66B, регистрационный номер DSM ACC3072, депонирована 21.06.2010; 6.
7. GT512muMAB 67A, регистрационный номер DSM ACC3073. депонирована 21.06.2010;7.
8. GT512muMAB 55A, регистрационный номер DSM ACC3089, депонирована 31.08.2010; или8. GT512muMAB 55A, registration number DSM ACC3089, deposited 08/31/2010; or
9. GT512muMAB 89A, регистрационный номер DSM ACC3090, депонирована 31.08.2010.9.
Антитела против CLDN6 можно модифицировать, соединить или обеспечить совместную экспрессию с носителями иных специфичностей. В одном конкретном воплощении данного изобретения предлагаются биспецифичные или полиспецифичные антитела, обладающие по меньшей мере одной первой специфичностью в отношении CLDN6 (например, антитело против CLDN6 или его миметик) и второй специфичностью в отношении эффекторной клетки, например специфичностью связывания с рецептором Fc (например, рецептором Fc-γ, в том числе Fc-γRI, или любым другим рецептором Fc) или с рецептором на Т-клетках, например CD3.Antibodies against CLDN6 can be modified, combined or co-expressed with carriers of other specificities. In one specific embodiment of the present invention, bispecific or polyspecific antibodies are provided having at least one first specificity for CLDN6 (e.g., an anti-CLDN6 antibody or mimetic thereof) and a second specificity for an effector cell, such as an Fc receptor binding specificity (e.g. Fc-γ, including Fc-γRI, or any other Fc receptor) or with a receptor on T cells, such as CD3.
Соответственно сказанному выше данное изобретение включает биспецифичные и полиспецифичные молекулы, связывающиеся как с CLDN6, так и с рецептором Fc или с рецептором на Т-клетках, например CD3. Примерами рецепторов Fc являются рецептор IgG, рецептор Fcγ, например, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16). Другие рецепторы Fc, например рецепторы IgA (например, FcαRI) тоже могут служить мишенями. Рецептор Fc предпочтительно располагается на поверхности эффекторных клеток, например моноцитов, макрофагов или активированных мононуклеаров. В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения биспецифичные и полиспецифичные молекулы связываются с рецептором Fc в сайте, отличном от сайта связывания этим рецептором иммуноглобулинов (например, IgG или IgA), так что с ввязывание биспецифичных и полиспецифичных молекул не блокируется при физиологических уровнях иммуноглобулинов. Accordingly, the present invention includes bispecific and polyspecific molecules that bind to both CLDN6 and the Fc receptor or a receptor on T cells, such as CD3. Examples of Fc receptors are IgG receptor, Fcγ receptor, such as FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) and FcγRIII (CD16). Other Fc receptors, such as IgA receptors (eg, FcαRI) may also serve as targets. The Fc receptor is preferably located on the surface of effector cells, such as monocytes, macrophages or activated mononuclear cells. In one preferred embodiment of the present invention, the bispecific and polyspecific molecules bind to the Fc receptor at a site different from the receptor's binding site for immunoglobulins (eg, IgG or IgA), such that binding of the bispecific and polyspecific molecules is not blocked at physiological levels of immunoglobulins.
В еще одном варианте настоящего изобретения предлагаемые антитела против CLDN6 модифицируют, присоединяют или обеспечивают совместную экспрессию с другими функциональными молекулами, например иными пептидами или белками (например, Fab`-фрагментами). Так, антитела по данному изобретению можно функционально соединить (например, путем химического присоединения, слияния генетического материала, нековалентной ассоциации и проч.) с одной или более других молекулярных структур, например с другими антителами (например, для получения биспецифичных или полиспецифичных антител), цитотоксическими агентами, клеточными лигандами или антигенами (например, для получения иммуноконъюгата, например иммунотоксина). Антитела по данному изобретению можно соединить с другими терапевтическими агентами, например радиоактивными изотопами, лекарственными низкомолекулярными соединениями противоракового действия, рекомбинантными цитокинами или хемокинами. Таким образом, настоящее изобретение охватывает множество разнообразных конъюгатов антител, биспецифичных и полиспецифичных молекул и гибридных белков, которые все способны связываться с клетками, в которых экспрессируется CLDN6 и/или с клетками, отличающимися тем, что CLDN6 ассоциирован с их поверхностью; все эти агенты можно использовать для прицельного воздействия на указанные клетки.In yet another embodiment of the present invention, the anti-CLDN6 antibodies of the invention are modified, coupled to, or co-expressed with other functional molecules, such as other peptides or proteins (eg, Fab' fragments). Thus, the antibodies of this invention can be functionally linked (for example, by chemical addition, fusion of genetic material, non-covalent association, etc.) with one or more other molecular entities, for example with other antibodies (for example, to obtain bispecific or polyspecific antibodies), cytotoxic agents, cellular ligands or antigens (eg, to obtain an immunoconjugate, such as an immunotoxin). Antibodies of this invention can be combined with other therapeutic agents, for example radioactive isotopes, small molecule anticancer drugs, recombinant cytokines or chemokines. Thus, the present invention covers a variety of antibody conjugates, bispecific and polyspecific molecules and fusion proteins, all of which are capable of binding to cells in which CLDN6 is expressed and/or to cells characterized in that CLDN6 is associated with their surface; all of these agents can be used to target these cells.
В целом в контексте данного изобретения все производные антител, например их конъюгаты, биспецифичные и полиспецифичные молекулы и гибридные белки, в настоящем документе включаются в термин «антитела».In general, in the context of this invention, all derivatives of antibodies, such as their conjugates, bispecific and polyspecific molecules and fusion proteins, are herein included in the term "antibodies".
В другом своем варианте настоящее изобретение предусматривает белки, связывающие CLDN6, которые происходят не из иммуноглобулиновых доменов, в том числе одноцепочечные белки. Такие связывающие белки и способы их получения описаны, например, в работе Binz et al. (2005) Nature Biotechnology 23 (10): 1257-1268, включенной в настоящий документ путем отсылки. Следует учесть, что все сказанное в настоящем документе относительно иммуноглобулинов или происходящих из них связывающих молекул соответственно применимо к связывающим молекулам, происходящим из неиммуноглобулиновых доменов. В частности, используя такие связывающие молекулы, происходящие из неиммуноглобулиновых доменов, можно блокировать CLDN6 в клетках, в которых экспрессируется указанная мишень и которые отличаются тем, что указанная мишень ассоциирована с их поверхностью; таким образом можно достичь терапевтического эффекта, описанного в настоящем документе применительно к антителам по данному изобретению, в частности добиться ингибирования одной или более из множества активностей опухолевых клеток, описанных в настоящем документе, например пролиферации. Возможно также (хотя и не обязательно) придать таким неиммуноглобулиновым связывающим молекулам эффекторные функции антител путем, например, соединения их с Fc-областью антител.In another embodiment, the present invention provides CLDN6 binding proteins that are not derived from immunoglobulin domains, including single chain proteins. Such binding proteins and methods for their preparation are described, for example, in Binz et al. (2005) Nature Biotechnology 23 (10): 1257-1268, incorporated herein by reference. It should be noted that everything said herein regarding immunoglobulins or binding molecules derived therefrom applies correspondingly to binding molecules derived from non-immunoglobulin domains. In particular, using such binding molecules derived from non-immunoglobulin domains, it is possible to block CLDN6 in cells in which the specified target is expressed and which are characterized in that the specified target is associated with their surface; in this way, the therapeutic effect described herein with respect to the antibodies of this invention can be achieved, in particular the inhibition of one or more of the many tumor cell activities described herein, such as proliferation, can be achieved. It is also possible (though not necessary) to impart antibody effector functions to such non-immunoglobulin binding molecules by, for example, coupling them to the Fc region of antibodies.
В целом данное изобретение охватывает лечение и/или диагностирование заболеваний, в частности онкологических заболеваний, путем прицельного воздействия на CLDN6, который экспрессируется в клетках и ассоциирован с их поверхностью. Этот подход обеспечивает избирательное определение и/или ликвидацию таких клеток и тем самым сведение к минимуму негативного воздействия на нормальные клетки, в которых не экспрессируется CLDN6 и которым не свойственна связь CLDN6 с их поверхностью. Предпочтительными заболеваниями для лечения или диагностирования являются те, при которых задействованы клетки, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются связью CLDN, например онкологические заболевания, в частности раковые заболевания типа тех, что описаны в настоящем документе.In general, this invention covers the treatment and/or diagnosis of diseases, in particular cancer, by targeting CLDN6, which is expressed in cells and associated with their surface. This approach allows for the selective targeting and/or elimination of such cells and thereby minimizing the negative impact on normal cells that do not express CLDN6 and that do not have CLDN6 associated with their surface. Preferred diseases for treatment or diagnosis are those involving cells that express CLDN6 and that are characterized by CLDN binding, such as cancers, in particular cancers of the type described herein.
В одном из вариантов настоящего изобретения предлагаются композиции, например фармацевтические и диагностические композиции/наборы, включающие антитела или комбинации антител по данному изобретению. Фармацевтическая композиция по данному изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель и, при необходимости, один или более вспомогательных компонентов, стабилизирующих агентов и др. В одном конкретном воплощении данного изобретения такая композиция включает комбинацию антител, которые связываются с отдельными эпитопами или которые имеют различные функциональные свойства, например способны вызывать цитотоксичность, зависимую от комплемента и/или антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность и способность вызывать апоптоз. В этом воплощении данного изобретения антитела могут использоваться в сочетании, например в виде фармацевтической композиции, содержащей два или более моноклональных антитела против CLDN6. Например, моноклональные антитела против CLDN6, обладающие различными, но дополняющими друг друга активностями, можно сочетать в одном методе лечения для достижения желаемого терапевтического эффекта. В одном предпочтительном воплощении данного изобретения предлагаемая композиция включает антитела против CLDN6, которые опосредуют цитотоксичность, зависимую от комплемента, вместе с другими антителами против CLDN6. которые опосредуют апоптоз. В другом воплощении данного изобретения предлагаемая композиция включает антитела против CLDN6, которые опосредуют высоко эффективное уничтожение клеток-мишеней в присутствии эффекторных клеток, вместе с другими антителами против CLDN6. которые подавляют пролиферацию клеток с экспрессией CLDN6, отличающихся тем, что CLDN6 связан с их поверхностью. In one embodiment, the present invention provides compositions, for example pharmaceutical and diagnostic compositions/kits, comprising antibodies or combinations of antibodies according to this invention. The pharmaceutical composition of this invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier and, if necessary, one or more auxiliary components, stabilizing agents, etc. In one specific embodiment of this invention, such a composition includes a combination of antibodies that bind to distinct epitopes or that have different functional properties, for example, capable of causing complement-dependent and/or antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and the ability to induce apoptosis. In this embodiment of the present invention, the antibodies can be used in combination, for example in the form of a pharmaceutical composition containing two or more anti-CLDN6 monoclonal antibodies. For example, anti-CLDN6 monoclonal antibodies that have different but complementary activities can be combined in a single treatment to achieve the desired therapeutic effect. In one preferred embodiment of the present invention, the composition includes anti-CLDN6 antibodies that mediate complement-dependent cytotoxicity together with other anti-CLDN6 antibodies. which mediate apoptosis. In another embodiment of the present invention, the composition includes anti-CLDN6 antibodies that mediate highly effective killing of target cells in the presence of effector cells, together with other anti-CLDN6 antibodies. which inhibit the proliferation of cells expressing CLDN6, characterized in that CLDN6 is associated with their surface.
Настоящее изобретение также включает одновременное или последовательное введение двух или более антител против CLDN6, из которых по меньшей мере одно является гибридным антителом против CLDN6 и по меньшей мере одно другое антитело является человеческим антителом против CLDN6, причем эти антитела связываются с одними и теми же либо разными эпитопами CLDN6. Предпочтительно сначала пациенту вводят гибридные антитела против CLDN6, а затем человеческие антитела против CLDN6, причем человеческие антитела против CLDN6 предпочтительно вводят на протяжении некоторого (продолжительного) периода времени, например в качестве поддерживающей терапии.The present invention also includes the simultaneous or sequential administration of two or more anti-CLDN6 antibodies, at least one of which is a hybrid anti-CLDN6 antibody and at least one other antibody is a human anti-CLDN6 antibody, which antibodies bind to the same or different epitopes of CLDN6. Preferably, the patient is first administered the anti-CLDN6 hybrid antibodies and then the human anti-CLDN6 antibodies, with the human anti-CLDN6 antibodies preferably administered over a period of time, eg as maintenance therapy.
Антитела, конъюгаты, биспецифические/полиспецифические молекулы и композиции по данному изобретению можно использовать в различных способах для ингибирования пролиферации клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются теми, что CLDN6 связан с их поверхностью, и/или для избирательного уничтожения клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются теми, что CLDN6 связан с их поверхностью, путем воздействия на эти клетки эффективного количества указанных антител, конъюгатов, биспецифических/полиспецифических молекул и композиций таким образом, что пролиферация указанных клеток подавляется и/или они гибнут. В одном и воплощений данного изобретения такой способ включает уничтожение клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются теми, что CLDN6 связан с их поверхностью, при необходимости в присутствии эффекторных клеток, например путем цитотоксичности, зависимой от комплемента, апоптоза, цитотоксичности, зависимой от антител, фагоцитоза или путем комбинированного действия этих механизмов. К клеткам с экспрессией CLDN6, которые отличаются теми, что CLDN6 связан с их поверхностью и которые могут быть ингибированы или убиты с помощью антител по данному изобретению, относятся раковые клетки.Antibodies, conjugates, bispecific/multispecific molecules and compositions of this invention can be used in various methods to inhibit the proliferation of cells in which CLDN6 is expressed and which differ in that CLDN6 is associated with their surface, and/or to selectively kill cells in which it is expressed CLDN6 and which are characterized in that CLDN6 is associated with their surface by exposing these cells to an effective amount of said antibodies, conjugates, bispecific/multispecific molecules and compositions such that the proliferation of said cells is inhibited and/or they die. In one embodiment of the present invention, such a method includes killing cells that express CLDN6 and that have CLDN6 bound to their surface, optionally in the presence of effector cells, for example, by complement-dependent cytotoxicity, apoptosis, antibody-dependent cytotoxicity , phagocytosis, or through the combined action of these mechanisms. Cells that express CLDN6, which are distinguished by the fact that CLDN6 is associated with their surface and which can be inhibited or killed by the antibodies of this invention, include cancer cells.
Антитела, конъюгаты, биспецифические/полиспецифические молекулы и композиции по данному изобретению можно использовать для лечения и/или предотвращения различных заболеваний, при которых задействованы клетки, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются теми, что CLDN6 связан с их поверхностью, путем введения указанных антител пациентам, страдающим от этих заболеваний. Примеры заболеваний. которые можно лечить (например, облегчать течение болезни) или предотвращать таким образом, включают (но не ограничиваются перечисленным здесь) заболевания, при которых образуются опухоли. Примеры заболеваний, при которых образуются опухоли и которые можно лечить и/или предотвращать указанным образом, включают раковые заболевания, например рак яичника, в частности аденокарциному яичника и тератокарциному яичника, рак легких, в том числе мелкоклеточный рак легких (SCLC) и немелкоклеточный рак легких (NSCLC), в частности плоскоклеточную карциному легких и аденокарциному, рак желудка, рак молочной железы, рак печени, рак поджелудочной железы, рак кожи, в частности базальноклеточную карциному и плоскоклеточную карциному, злокачественную меланому, рак головы и шеи, в том числе злокачественную полиморфную аденому, саркому, в частности синовиальную саркому и карциносаркому, рак желчного протока, рак мочевого пузыря, в частности переходноклеточную карциному и папиллярную карциному, рак почек, в частности почечно-клеточную карциному, включая светлоклеточную почечно-клеточную карциному и папиллярную почечно-клеточную карциному, рак толстого кишечника, рак тонкого кишечника, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциному тонкого кишечника и аденокарциному подвздошной кишки, эмбриональную карциному яичка, хориокарциному плацентарной площадки, рак шейки матки, рак яичка, в частности семиному яичка, тератому яичка и эмбриональный рак яичка, рак матки, герминогенные опухоли, например тератокарциному или эмбриональную карциному, в частности герминогенную опухоль яичка, и их метастазирующие формы.The antibodies, conjugates, bispecific/multispecific molecules and compositions of this invention can be used to treat and/or prevent various diseases that involve cells that express CLDN6 and that have CLDN6 bound to their surface by administering said antibodies to patients suffering from these diseases. Examples of diseases. that can be treated (eg, alleviate a disease) or prevented in this way include, but are not limited to those listed herein, diseases in which tumors form. Examples of diseases in which tumors form and which can be treated and/or prevented in this manner include cancers, such as ovarian cancer, in particular ovarian adenocarcinoma and ovarian teratocarcinoma, lung cancer, including small cell lung cancer (SCLC) and non-small cell lung cancer (NSCLC), in particular squamous cell carcinoma of the lung and adenocarcinoma, gastric cancer, breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, skin cancer, in particular basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma, malignant melanoma, head and neck cancer, including malignant multiform adenoma, sarcoma, in particular synovial sarcoma and carcinosarcoma, bile duct cancer, bladder cancer, in particular transitional cell carcinoma and papillary carcinoma, kidney cancer, in particular renal cell carcinoma, including clear cell renal cell carcinoma and papillary renal cell carcinoma, colon cancer, small intestine cancer, including ileal cancer, in particular adenocarcinoma of the small intestine and adenocarcinoma of the ileum, embryonal testicular carcinoma, placental site choriocarcinoma, cervical cancer, testicular cancer, in particular testicular seminoma, testicular teratoma and embryonal testicular cancer, uterine cancer, germ cell tumors, for example teratocarcinoma or embryonal carcinoma, in particular testicular germ cell tumor, and metastatic forms thereof.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или предотвращения заболеваний или расстройств, при которых задействованы клетки, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются теми, что CLDN6 связан с их поверхностью, включающий введение пациенту антител, конъюгатов, биспецифичных/полиспецифичных молекул и композиций по данному изобретению. Предпочтительно эти болезни и расстройства являются такими, при которых образуются опухоли, и в конкретных воплощениях данного изобретения их выбирают из группы, состоящей из рака яичника, в том числе аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легких, в том числе мелкоклеточного рака легких (SCLC) и немелкоклеточного рака легких (NSCLC), в особенности плоскоклеточной карциномы легких и аденокарциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в том числе злокачественной полиморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчного протока, рака мочевого пузыря, в частности переходноклеточной карциномы и папиллярной карциномы, рака почек, в частности почечно-клеточной карциномы, включая светлоклеточную почечно-клеточную карциному и папиллярную почечно-клеточную карциному, рака толстого кишечника, рака тонкого кишечника, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциному тонкого кишечника и аденокарциному подвздошной кишки, эмбриональной карциномы яичка, хориокарциномы плацентарной площадки, рака шейки матки, рака яичка, в частности семиномы яичка, тератомы яичка и эмбрионального рака яичка, рака матки, герминогенных опухолей, например тератокарциномы или эмбриональной карциномы, в частности герминогенной опухоли яичка, и их метастазирующих форм. Предпочтительно CLDN6 экспрессируется на поверхности указанных клеток.In another aspect, the present invention provides a method of treating or preventing diseases or disorders involving cells that express CLDN6 and which are characterized in that CLDN6 is associated with their surface, comprising administering to a patient antibodies, conjugates, bispecific/polyspecific molecules and compositions according to this invention. Preferably, these diseases and disorders are those in which tumors form, and in specific embodiments of the present invention they are selected from the group consisting of ovarian cancer, including ovarian adenocarcinoma and ovarian teratocarcinoma, lung cancer, including small cell lung cancer (SCLC) and non-small cell lung cancer (NSCLC), especially squamous cell lung carcinoma and adenocarcinoma, stomach cancer, breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, skin cancer, especially basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma, malignant melanoma, head and neck cancer, in including malignant polymorphic adenoma, sarcoma, in particular synovial sarcoma and carcinosarcoma, bile duct cancer, bladder cancer, in particular transitional cell carcinoma and papillary carcinoma, kidney cancer, in particular renal cell carcinoma, including clear cell renal cell carcinoma and papillary renal - cell carcinoma, colon cancer, small intestine cancer, including ileal cancer, in particular adenocarcinoma of the small intestine and adenocarcinoma of the ileum, embryonal testicular carcinoma, placental site choriocarcinoma, cervical cancer, testicular cancer, in particular testicular seminoma, testicular teratoma and embryonal testicular cancer, uterine cancer, germ cell tumors, such as teratocarcinoma or embryonal carcinoma, in particular testicular germ cell tumor, and metastatic forms thereof. Preferably, CLDN6 is expressed on the surface of said cells.
Данное изобретение включает применение описанных в настоящем документе агентов и композиций для профилактики и лечения онкологических заболеваний, т.е.для лечения пациентов, которые страдают каким-либо онкологическим заболеванием или для которых повышен риск развития такого заболевания. В одном из аспектов данного изобретения предлагаются способы ингибирования опухолевого роста, включающие введение одного (одной) или более описанных в настоящем документе агентов и композиций. This invention includes the use of the agents and compositions described herein for the prevention and treatment of cancer, ie, for the treatment of patients who suffer from any cancer disease or who are at increased risk of developing such a disease. In one aspect of the present invention, methods of inhibiting tumor growth are provided, comprising administering one or more of the agents and compositions described herein.
Предпочтительно, описанные в настоящем документе агенты и композиции вводят пациентам таким образом, что терапевтически активное вещество не попадает или в основном не попадает в ткани или органы, где нет опухолей, в клетках которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью, например плацентарная ткань или плацента. Поэтому описанные в настоящем документе агенты и композиции можно вводить локально. Preferably, the agents and compositions described herein are administered to patients in such a way that the therapeutically active substance does not or substantially does not enter tissues or organs that do not contain tumors that express CLDN6 and that have CLDN6 associated with their surface , such as placental tissue or placenta. Therefore, the agents and compositions described herein can be administered locally.
В одном аспекте данного изобретения предлагаются антитела, описанные в настоящем документе, для применения в способах лечения, описанных в настоящем документе. В одном из воплощений данного изобретения предлагается описанная в настоящем документе фармацевтическая композиция для применения в способах лечения, описанных в настоящем документе.In one aspect of the present invention, the antibodies described herein are provided for use in the methods of treatment described herein. In one embodiment of the present invention, a pharmaceutical composition described herein is provided for use in the methods of treatment described herein.
В одном конкретном воплощении и данного изобретения пациент, которому вводят предлагаемые антитела, дополнительно получает химио- или лучевую терапию или агенты, которые модулируют, т.е. усиливают или ингибируют, экспрессию либо активность рецепторов Fc, например рецепторов Fcγ, например цитокинов. Цитокины для введения в ходе указанного лечения включают гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гамма-интерферон (IFN-γ) и фактор некроза опухолей (TNF). Химиотерапевтические агенты для введения в ходе указанного лечения включают, помимо прочих, антинеопластические агенты, например доксорубицин, цисплатин, таксотер, 5-фторурацил. метотрексат, гемцитабин и циклофосфамид. In one specific embodiment of this invention, the patient to whom the proposed antibodies are administered additionally receives chemotherapy or radiation therapy or agents that modulate, i.e. enhance or inhibit the expression or activity of Fc receptors, for example Fcγ receptors, for example cytokines. Cytokines to be administered during this treatment include granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), gamma interferon (IFN-γ) and tumor necrosis factor (TNF). Chemotherapeutic agents for administration during this treatment include, but are not limited to, antineoplastic agents, for example doxorubicin, cisplatin, Taxotere, 5-fluorouracil. methotrexate, gemcitabine and cyclophosphamide.
В другом своем аспекте данное изобретение относится к иммунизации животных, например мышей человеческим CLDN6 или пептидом, являющимся его фрагментом, для получения антител. Предпочтительными для иммунизации являются пептиды, выбираемые из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15 и иммунологически эквивалентных им пептидов. In another aspect, the present invention relates to the immunization of animals, for example mice, with human CLDN6 or a peptide fragment thereof to produce antibodies. Preferred peptides for immunization are selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 and immunologically equivalent peptides.
Животных дикого типа, а также трансгенных животных (которые не являются человеком), можно иммунизировать очищенными или обогащенными препаратами антигенов CLDN6 или пептидов, являющихся их фрагментами, и/или нуклеиновыми кислотами и/или клетками, в которых экспрессируется CLDN6 или его фрагмент. Предпочтительно, для этой цели трансгенные животные (которые не являются человеком) должны быть способны производить множественные изотипы моноклональных человеческих антител против CLDN6 (например, IgG, IgA или IgM) путем V-D-J рекомбинации и переключения изотипа. Переключение изотипа может происходить классическим либо неклассическим путем. Wild-type animals, as well as transgenic animals (which are not human), can be immunized with purified or enriched preparations of CLDN6 antigens or peptide fragments thereof, and/or nucleic acids and/or cells in which CLDN6 or a fragment thereof is expressed. Preferably, for this purpose, transgenic animals (which are non-human) should be capable of producing multiple isotypes of human monoclonal antibodies against CLDN6 (eg, IgG, IgA or IgM) by V-D-J recombination and isotype switching. Isotype switching can occur in a classical or non-classical way.
В другом аспекте данного изобретения предлагаются В-клетки животных (не человека), как описано выше. Выделенные В-клетки можно затем иммортализировать путем слияния с уже иммортализованными клетками, чтобы создать источник (например, гибридому) антител по данному изобретению. Такие гибридомы, производящие антитела по данному изобретению, также включаются в его объем.In another aspect of the present invention, animal (non-human) B cells are provided, as described above. The isolated B cells can then be immortalized by fusion with already immortalized cells to create a source (eg, hybridoma) of the antibodies of the present invention. Such hybridomas producing antibodies of this invention are also included within its scope.
В другом своем аспекте данное изобретение относится к способам диагностирования, выявления и наблюдения за течением онкологического заболевания, включающим выявление и/или определение количества CLDN6 или клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью, в образцах биологического материала, взятых у пациента с использованием антител по данному изобретению. Образцы биологического материала могут быть взяты у пациента с начавшимся или развившимся онкологическим заболеванием либо с подозрением на такое заболевание, либо с повышенным риском такого заболевания.In another aspect, this invention relates to methods for diagnosing, detecting and monitoring the course of cancer, including detecting and/or quantifying CLDN6 or cells in which CLDN6 is expressed and which have CLDN6 associated with their surface, in samples of biological material taken from a patient using the antibodies of this invention. Samples of biological material can be taken from a patient with the onset or development of cancer, or suspected of having such a disease, or at an increased risk of such a disease.
В одном из воплощений способа диагностирования, выявления и наблюдения за течением онкологического заболевания по данному изобретению образец биологического материала и/или контрольный образец/образец для сравнения берут из ткани или органа, соответствующих ткани или органу, подлежащим диагностированию, выявлению или наблюдению в отношении поражения онкологическим заболеванием; например, онкологическое заболевание, которое должно быть диагностировано, выявлено или отслежено, является раком яичника и образец биологического материала и/или контрольный образец/образец для сравнения берут из ткани яичника. Такие органы и ткани описаны в настоящем документе, например, в связи с различными онкологическими и раковыми заболеваниями. In one embodiment of the method for diagnosing, detecting and monitoring the course of an oncological disease according to this invention, a sample of biological material and/or a control/comparison sample is taken from a tissue or organ corresponding to the tissue or organ to be diagnosed, detected or monitored for a cancer lesion. disease; for example, the cancer to be diagnosed, detected or monitored is ovarian cancer and a biological sample and/or control/comparison sample is taken from ovarian tissue. Such organs and tissues are described herein, for example, in connection with various cancers and diseases.
В одном из воплощений способа диагностирования, выявления и наблюдения за течением онкологического заболевания по данному изобретению образец биологического материала и/или контрольный образец/образец для сравнения берут из ткани или органа, в клетках которых в отсутствие опухоли не экспрессируется CLDN6 и они не отличаются выраженным присутствием CLDN6 на своей поверхности. Предпочтительно указанная ткань не является плацентарной.In one embodiment of the method for diagnosing, detecting and monitoring the course of an oncological disease according to this invention, a sample of biological material and/or a control/comparison sample is taken from a tissue or organ in the cells of which, in the absence of a tumor, CLDN6 is not expressed and they do not have a pronounced presence CLDN6 on its surface. Preferably, said tissue is not placental.
Как правило, уровень молекул-мишеней в образце биологического материала сравнивают с каким-либо уровнем, принятым за контрольный или базовый, и тогда отклонение от этого последнего считается указанием на наличие и/или стадию онкологического заболевания у данного пациента. Уровень, взятый для сравнения, может быть тем, который имеет место в контрольном образце (например, в образце здоровой ткани того же пациента) или средней величиной, установленной по результатам определения у ряда здоровых индивидов. Под отклонением от указанного уровня, взятого для сравнения, понимается любое существенное изменение, например уменьшение или увеличение не менее чем на 10%, 20% или 30%, предпочтительно не менее чем на 40% или 50% или даже больше. Предпочтительно, если в образце биологического материала присутствуют СLDN6 или клетки, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью, или количество CLDN6 или клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью увеличено по сравнению с уровнем, взятым для сравнения, то это свидетельствует о наличии онкологического заболевания.As a rule, the level of target molecules in a sample of biological material is compared with some level taken as a control or baseline, and then a deviation from this latter is considered an indication of the presence and/or stage of cancer in a given patient. The level taken for comparison may be that which occurs in a control sample (for example, in a sample of healthy tissue from the same patient) or the average value established from the results of determination in a number of healthy individuals. By deviation from the specified level taken for comparison is meant any significant change, for example a decrease or increase of not less than 10%, 20% or 30%, preferably not less than 40% or 50% or even more. Preferably, the biological material sample contains CLDN6 or cells in which CLDN6 is expressed and which are characterized in that CLDN6 is associated with their surface, or the number of CLDN6 or cells in which CLDN6 is expressed and which are characterized in that CLDN6 is associated with their surface is increased compared to the level taken for comparison, this indicates the presence of cancer.
Как правило, выявление и/или определение количества в способах по данному изобретению включает использование меченых антител, специфически связывающихся с молекулами-мишенями.Typically, detection and/or quantification in the methods of this invention involves the use of labeled antibodies that specifically bind to target molecules.
В одном особом аспекте данное изобретение относится к способу выявления, т.е. определения локализации или распространения в организме онкологического заболевания, например какие ткани или органы поражены, который включает введение пациенту антител по данному изобретению, соединенных с детектируемой меткой. Мечение органа или ткани у указанного пациента может свидетельствовать о наличии или повышенном риске развития опухоли в этой ткани или органе. In one particular aspect, the present invention relates to a method for detecting, i.e. determining the location or distribution of an oncological disease in the body, for example which tissues or organs are affected, which involves administering to the patient antibodies of the present invention coupled with a detectable label. Labeling of an organ or tissue in a specified patient may indicate the presence or increased risk of developing a tumor in that tissue or organ.
Как отмечалось выше, антитела по данному изобретению могут быть получены непосредственно из клеток гибридомы, в которых эти антитела экспрессируются, или путем клонирования и рекомбинантной экспрессии в клетке-хозяине (например, в клетках CHO или лимфоцитах). К числу примеров клетки-хозяина относятся также такие микроорганизмы, как Escherichia coli и грибы, например дрожжи. Или же указанные антитела могут вырабатываться рекомбинантным путем у трансгенных животных (которые не являются человеком) или растений. Настоящее изобретение включает также воплощения, в которых указанные антитела производятся путем иммунизации или вакцинации in situ (в организме пациента) с помощью описанных в настоящем документе методов иммунизации.As noted above, the antibodies of this invention can be obtained directly from the hybridoma cells in which the antibodies are expressed, or by cloning and recombinant expression in a host cell (eg, CHO cells or lymphocytes). Examples of host cells also include microorganisms such as Escherichia coli and fungi such as yeast. Alternatively, said antibodies can be produced recombinantly in transgenic animals (which are not human) or plants. The present invention also includes embodiments in which said antibodies are produced by immunization or vaccination in situ (in the body of a patient) using the immunization methods described herein.
Данное изобретение относится также к нуклеиновым кислотам. включающим гены или нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или их фрагменты, например какую-либо цепь молекулы антитела, как описано в настоящем документе. Эти нуклеиновые кислоты могут быть включены в вектор, например в плазмиду, космиду, вирус, бактериофаг или иной вектор с помощью, например, обычно применяемых для таких целей методов генетической инженерии. Вектор может включать также другие гены, например маркерные гены, которые позволят вести отбор в подходящих клетках-хозяевах и в подходящих условиях. Кроме того, вектор может включать регуляторные элементы, обеспечивающие должную экспрессию кодирующих последовательностей в подходящей клетке-хозяине. Специалистам в данной области техники известны такие регуляторные элементы, включая промотор, кассеты экзонов, подлежащие альтернативному сплайсингу, и кодоны инициации трансляции. This invention also relates to nucleic acids. comprising genes or nucleotide sequences encoding antibodies or fragments thereof, such as any chain of an antibody molecule, as described herein. These nucleic acids can be incorporated into a vector, such as a plasmid, cosmid, virus, bacteriophage, or other vector, using, for example, genetic engineering techniques commonly used for such purposes. The vector may also include other genes, such as marker genes, which will allow selection in suitable host cells and under suitable conditions. In addition, the vector may include regulatory elements to ensure proper expression of the coding sequences in a suitable host cell. Such regulatory elements are known to those skilled in the art, including a promoter, alternatively spliced exon cassettes, and translation initiation codons.
Предпочтительно нуклеиновые кислоты по данному изобретению функционально соединены с упомянутыми выше последовательностями, обеспечивающими регуляцию экспрессии в эукариотических или прокариотических клетках. Регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в эукариотических или прокариотических клетках, хорошо известны специалистам в данной области техники. Preferably, the nucleic acids of the present invention are operably linked to the above-mentioned sequences that provide regulation of expression in eukaryotic or prokaryotic cells. Regulatory elements that enable expression in eukaryotic or prokaryotic cells are well known to those skilled in the art.
Методы создания молекул нуклеиновых кислот по данному изобретению и векторов, включающих эти молекулы, введения указанных векторов в соответственно выбранные клетки-хозяева и обеспечения экспрессии нужных последовательностей, хорошо известны в данной области техники. Methods for generating the nucleic acid molecules of the present invention and vectors comprising these molecules, introducing said vectors into suitably selected host cells, and causing expression of the desired sequences are well known in the art.
В еще одном своем аспекте данное изобретение относится к клеткам-хозяевам, несущим описанные в настоящем документе нуклеиновые кислоты или векторы. In another aspect, the present invention relates to host cells carrying the nucleic acids or vectors described herein.
Другие признаки и преимущества настоящего изобретения явствуют из нижеследующего подробного описания и формулы изобретения. Other features and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description and claims.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
Фигура 1. Выравнивание последовательностей CLDN3, CLDN4, CLDN6 и CLDN9Figure 1. Sequence alignment of CLDN3, CLDN4, CLDN6 and CLDN9
Фигура 2. Иммунофлуоресцентный анализ сыворотки крови, взятой у мышей, иммунизированных для получения антител, специфичных против CLDN6 Figure 2. Immunofluorescence analysis of blood serum collected from mice immunized to obtain antibodies specific against CLDN6
(A) Нефиксированные клетки CHO-K1, ко-трансфицированные нуклеиновой кислотой, кодирующей CLDN6, вместе с флуоресцентным белком GFP, тестировали с помощью мышиных моноклональных антител против CLDN6 (R&D Systems, MAB3656). CLDN6 локализован на плазматической мембране трансфицированных клеток и на живых клетках может служить мишенью для специфичных антител. (B) Сыворотка мышей, использованных для получения гибридом F3-6C3-H8, содержала антитела, связывающиеся с CLDN6 на поверхности нефиксированных клеток CHO-K1, ко-трансфицированных нуклеиновой кислотой, кодирующей CLDN6, вместе с флуоресцентным белком GFP.(A) Unfixed CHO-K1 cells co-transfected with nucleic acid encoding CLDN6 along with GFP fluorescent protein were tested with mouse monoclonal anti-CLDN6 antibodies (R&D Systems, MAB3656). CLDN6 is localized on the plasma membrane of transfected cells and can serve as a target for specific antibodies on living cells. (B) Serum from mice used to generate F3-6C3-H8 hybridomas contained antibodies that bind to CLDN6 on the surface of unfixed CHO-K1 cells co-transfected with nucleic acid encoding CLDN6 along with GFP fluorescent protein.
Фигура 3. Определение эндогенной экспрессии клаудинов в клетках HEK293T методом Вестерн-блоттингаFigure 3. Determination of endogenous expression of claudins in HEK293T cells by Western blotting
Белковый лизат клеток HEK293T, трансфицированных нуклеиновыми кислотами, кодирующими CLDN3, CLDN4, CLDN6 и CLDN9, соответственно, или контрольных клеток (с которыми проделали все те же манипуляции, но без нуклеиновой кислоты) анализировали методом Вестерн-блоттинга, используя готовые имеющиеся в продаже антитела против CLDN3(A) (Invitrogen, Cat No. 34-1700), против CLDN4(A) (Zymed, 32-9400), против CLDN6(A) (ARP, 01-8865) и против CLDN9(A) (Santa Cruz, sc-17672). Этими антителами выявлялась экспрессия соответствующих мишеней только в соответствующим образом трансфицированных клетках HEK293T. В нетрансфицированных клетках HEK293T не наблюдалось эндогенной экспрессии ни одного из перечисленных клаудинов. Protein lysates of HEK293T cells transfected with nucleic acids encoding CLDN3, CLDN4, CLDN6 and CLDN9, respectively, or control cells (which were subjected to the same manipulations, but without the nucleic acid) were analyzed by Western blotting using ready-made commercially available antibodies against CLDN3(A) (Invitrogen, Cat No. 34-1700), anti-CLDN4(A) (Zymed, 32-9400), anti-CLDN6(A) (ARP, 01-8865) and anti-CLDN9(A) (Santa Cruz, sc-17672). These antibodies detected expression of the corresponding targets only in appropriately transfected HEK293T cells. In untransfected HEK293T cells, no endogenous expression of any of the listed claudins was observed.
Фигура 4. Определение специфичности готовых имеющихся в продаже антител против CLDN методом проточной цитометрииFigure 4. Determination of the specificity of prepared commercially available anti-CLDN antibodies by flow cytometry.
Методом проточной цитометрии определяли связывание готовых имеющихся в продаже антител против CLDN с клетками HEK293T, трансфицированными нуклеиновыми кислотами, кодирующими CLDN3, CLDN4, CLDN6 и CLDN9, соответственно, и с нетрансфицированными клетками HEK293T. Специфичными к своей мишени оказались только готовые антитела против CLDN3.The binding of commercially available anti-CLDN antibodies to HEK293T cells transfected with nucleic acids encoding CLDN3, CLDN4, CLDN6 and CLDN9, respectively, and to untransfected HEK293T cells was determined by flow cytometry. Only ready-made antibodies against CLDN3 turned out to be specific to their target.
Фигура 5. Определение специфичности антител против CLDN, полученных по данному изобретению, методом проточной цитометрии Figure 5. Determination of the specificity of anti-CLDN antibodies obtained according to this invention by flow cytometry
Методом проточной цитометрии определяли связывание антител в супернатантах моноклональных субклонов гибридом с клетками HEK293T, трансфицированных одновременно двумя векторами, один из которых кодировал CLDN6, CLDN3, CLDN4 или CLDN9, а другой - флуоресцентный маркер. Flow cytometry was used to determine the binding of antibodies in the supernatants of monoclonal subclones of hybridomas with HEK293T cells simultaneously transfected with two vectors, one of which encoded CLDN6, CLDN3, CLDN4 or CLDN9, and the other a fluorescent marker.
(A) Антитела в супернатанте моноклонального субклона гибридом F3-6C3-H8 специфично связывались с клетками, трансфицированными CLDN6, но не с клетками, трансфицированными CLDN3, CLDN4 и CLDN9, соответственно. В противоположность этому антитела в супернатанте моноклонального субклона гибридом F4-4F7-F2 связывались с клетками, трансфицированными CLDN6 или CLDN9. Антитела в супернатанте моноклонального субклона гибридом F3-6C3-H8 также связывались с клетками, трансфицированными вариантом CLDN6 (I143V)-SNP. (A) Antibodies in the supernatant of the monoclonal hybridoma subclone F3-6C3-H8 bound specifically to cells transfected with CLDN6 but not to cells transfected with CLDN3, CLDN4, and CLDN9, respectively. In contrast, antibodies in the supernatant of the monoclonal hybridoma subclone F4-4F7-F2 bound to cells transfected with CLDN6 or CLDN9. Antibodies in the supernatant of the monoclonal hybridoma subclone F3-6C3-H8 also bound to cells transfected with the CLDN6 (I143V)-SNP variant.
(B) Антитела в из супернатанта моноклонального субклона гибридом F3-7B3-B4 связывались с клетками, трансфицированными CLDN6, CLDN3 или CLDN9. Моноклональные антитела в супернатанте субклона гибридом F3-3F7-A5 связывались с клетками, трансфицированными CLDN6, CLDN4 или CLDN9(B) Antibodies from the supernatant of the monoclonal hybridoma subclone F3-7B3-B4 bound to cells transfected with CLDN6, CLDN3, or CLDN9. Monoclonal antibodies in the supernatant of the hybridoma subclone F3-3F7-A5 bound to cells transfected with CLDN6, CLDN4 or CLDN9
Фигура 6. Специфичность связывания мышиных мноклональных антител против CLDN6 muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B и 67A Figure 6. Binding specificity of murine
Связывание антител против CLDN6 с человеческими белками CLDN6, 3, 4, 9 и CLDN6 SNP (однонуклеотидный полиморфизм) вариант I143V определяли путем проточной цитометрии, используя клетки HEK293T с транзиентной (временной) экспрессией соответствующего человеческого клаудина. Эти клетки одновременно трансфицировали флуоресцентным маркером, чтобы отличать нетрансфицированные клетки (популяции Q1 и Q3) от трансфицированных (популяции Q2 и Q4). Концентрацию антител брали насыщающей места связывания с CLDN6 (25 мкг/мл). Экспрессию человеческих белков CLDN6, 3, 4, 9 и CLDN6-SNP(I143V) подтверждали с помощью готовых имеющихся в продаже моноклональных антител против клаудина-6 человека (R&D Systems, MAB3656), клаудина-3 человека (R&D Systems, MAB4620) и клаудина-4 человека (R&D Systems, MAB 4219).The binding of anti-CLDN6 antibodies to human CLDN6, 3, 4, 9 and CLDN6 SNP (single nucleotide polymorphism) variant I143V proteins was determined by flow cytometry using HEK293T cells transiently expressing the corresponding human claudin. These cells were simultaneously transfected with a fluorescent marker to distinguish untransfected cells (populations Q1 and Q3) from transfected ones (populations Q2 and Q4). The antibody concentration was taken to saturate the binding site with CLDN6 (25 μg/ml). Expression of human CLDN6, 3, 4, 9 and CLDN6-SNP(I143V) proteins was confirmed using commercially available monoclonal antibodies against human claudin-6 (R&D Systems, MAB3656), human claudin-3 (R&D Systems, MAB4620) and claudin -4 people (R&D Systems, MAB 4219).
Фигура 7. Относительная аффинность мышиных монолкональных антител против CLDN6 muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B и 67A Figure 7. Relative affinity of murine anti-CLDN6
Для определения относительной аффинности анализировали связывание антител против CLDN6 с человеческим белком CLDN6, стабильно экспрессирующимся на поверхности клеток HEK293, методом проточной цитометрии. По данным о насыщении мест связывания строили график зависимости сигнала FACS (средней интенсивности флуоресценции) от концентрации антител. Рассчитывали EC50 (концентрацию антител, при которой в равновесии занята половина мест их связывания), используя метод нелинейной регрессии. Для специфичных в отношении CLDN6 антител muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B и 67A получались очень низкие значения EC50 (200-500нг/мл) и насыщение мест связывания достигалось при низких концентрациях.To determine relative affinity, the binding of anti-CLDN6 antibodies to human CLDN6 protein stably expressed on the surface of HEK293 cells was analyzed by flow cytometry. Based on data on the saturation of binding sites, a graph of the FACS signal (average fluorescence intensity) versus antibody concentration was constructed. EC 50 (antibody concentration at which half of their binding sites are occupied at equilibrium) was calculated using the nonlinear regression method. For the CLDN6-
Фигура 8. Активность, проявляющаяся комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC), мышиных моноклональных антител против CLDN6 muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B и 67AFigure 8. Complement dependent cytotoxicity (CDC) activity of murine anti-CLDN6
Активность, проявляющуюся комплемент-зависимой цитотоксичностью, антител против CLDN6 определяли в люциферазной системе, выявляющей эндогенный аденозинтрифосфат в нелизированных клетках. Клетки CHO-K1 со стабильной экспрессией человеческого CLDN6 инкубировали с различными концентрациями антител muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B и 67A. В случае антител MuMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B и 67A наблюдалась зависимая от дозы цитотоксичность, зависимая от комплемента, причем она возникала при низких концентрациях антител. The complement-dependent cytotoxicity activity of anti-CLDN6 antibodies was determined in a luciferase system that detects endogenous adenosine triphosphate in unlysed cells. CHO-K1 cells stably expressing human CLDN6 were incubated with various concentrations of
Фигура 9. Активность, проявляющаяся комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC), мышиных моноклональных антител против CLDN6 muMAB 65A и 66B в отношении клеток NEC8 с эндогенной экспрессией CLDN6 и клеток NEC8 LVTS2 54 (нокдаунных по CLDN6)Figure 9. Complement-dependent cytotoxicity (CDC) activity of mouse anti-CLDN6
Мышиные моноклональные антитела против CLDN6 muMAB 65A и 66B вызывали цитотоксичность в отношении клеток NEC8 в зависимости от дозы. Специфичность muMAB 65A и 66B в отношении мишени подтверждалась в опыте с клетками NEC8 LVTS2 54 (нокдаунными по CLDN6).Mouse anti-CLDN6
Фигура 10. Терапевтический эффект мышиных моноклональных антител против CLDN6 muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B и 67A на ранних стадиях развития ксенотрансплантата опухоли у мышей, где мышам прививали линию опухолевых клеток NEC8Figure 10. Therapeutic effect of murine anti-CLDN6
Бестимусным мышам линии Nude-Foxn1nu вводили клетки NEC8 с эндогенной экспрессией CLDN6. Мышиные моноклональные антитела против CLDN6 muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B и 67A подавляли опухолевый рост по сравнению с особями контрольной группы, которые получали вместо антител физиологический раствор.Athymic Nude-Foxn1 nu mice were injected with NEC8 cells with endogenous expression of CLDN6. Mouse monoclonal antibodies against
Фигура 11. Специфичность связывания гибридных моноклональных антител против CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A и 89A Figure 11. Binding specificity of anti-CLDN6 hybrid
Методом проточной цитометрии определяли связывание антител против CLDN6 с человеческими белками CLDN6, 3, 4 и 9, используя клетки HEK293 со стабильной экспрессией соответствующего человеческого клаудина. Концентрация антител была насыщающей места связывания (25 мкг/мл). Экспрессию человеческих белков CLDN3, 4, 6 и 9 подтверждали с помощью готовых имеющихся в продаже моноклональных антител против человеческого клаудина-3 (R&D Systems, MAB4620) и человеческого клаудина-4 (R&D Systems, MAB 4219), и CLDN6/9-реактивных мышиных моноклональных антител muMAB 5F2D2, соответственно. Для отрицательного контроля проделывали те же манипуляции в тех же условиях, но без первых антител.The binding of anti-CLDN6 antibodies to human CLDN6, 3, 4 and 9 proteins was determined by flow cytometry using HEK293 cells stably expressing the corresponding human claudin. The antibody concentration saturates the binding site (25 μg/ml). Expression of human CLDN3, 4, 6 and 9 proteins was confirmed using commercially available monoclonal antibodies against human claudin-3 (R&D Systems, MAB4620) and human claudin-4 (R&D Systems, MAB 4219), and CLDN6/9-reactive mouse monoclonal antibodies muMAB 5F2D2, respectively. For the negative control, the same manipulations were performed under the same conditions, but without the first antibodies.
Фигура 12. Относительное сродство моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A и 89A к клеткам HEK293-CLDN6 Figure 12. Relative affinity of anti-CLDN6 monoclonal
Методом проточной цитометрии определяли связывание антител против CLDN6 с человеческим CLDN6, стабильно экспрессирующимся на поверхности клеток HEK293. Результаты опыта с насыщением мест связывания представляли в виде графика, откладывая по оси ординат сигнал FACS (среднюю интенсивность флуоресценции), а по оси абсцисс - концентрацию антител. Рассчитывали EC50 (концентрацию антител, при которой в равновесии занята половина мест их связывания), используя метод нелинейной регрессии. Для специфичных в отношении CLDN6 антител chimAB 64A и 89А получались очень низкие значения EC50 (450-600 нг/мл) и насыщение мест связывания достигалось при низких концентрациях. Антитела сhimAB 67A и 61D характеризовались низким (1000 нг/мл) и средним (2300 ng/ml) значениями EC50 соответственно.The binding of anti-CLDN6 antibodies to human CLDN6 stably expressed on the surface of HEK293 cells was determined by flow cytometry. The results of the experiment with saturation of binding sites were presented in the form of a graph, plotting the FACS signal (average fluorescence intensity) on the ordinate axis, and the antibody concentration on the abscissa axis. EC 50 (antibody concentration at which half of their binding sites are occupied at equilibrium) was calculated using the nonlinear regression method. For the CLDN6
Фигура 13. Относительное сродство моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A и 89A к клеткам NEC8 Figure 13. Relative affinity of anti-CLDN6 monoclonal
Чтобы установить сродство антител против CLDN6 к опухолевым клеткам, в которых эндогенно экспрессируется человеческий CLDN6, методом проточной цитометрии определяли связывание этих антител с клетками линии NEC8 (рак яичка). Для специфичных в отношении CLDN6 антител chimAB 64A и 89А получались очень низкие значения EC50 (600-650 нг/мл) и насыщение мест связывания достигалось при низких концентрациях. Антитела сhimAB 61D и 67A характеризовались средним (1700 нг/мл) и высоким (6100 нг/мл) значениями EC50 соответственно.To determine the affinity of anti-CLDN6 antibodies to tumor cells that endogenously express human CLDN6, the binding of these antibodies to NEC8 (testicular cancer) cells was determined by flow cytometry. For the CLDN6
Фигура 14. Относительное сродство моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A и 89A к клеткам OV90Figure 14. Relative affinity of monoclonal fusion antibodies against
Чтобы установить сродство антител против CLDN6 к опухолевым клеткам, в которых эндогенно экспрессируется человеческий CLDN6, методом проточной цитометрии определяли связывание этих антител с клетками линии OV90 (рак яичника). Для специфичных в отношении CLDN6 антител chimAB 64A и 89А получались очень низкие значения EC50 (550-600 нг/мл) и насыщение мест связывания достигалось при низких концентрациях. Антитела сhimAB 61D и 67A характеризовались средними значениями EC50 (1500 нг/мл и 2300 нг/мл, соответственно). To determine the affinity of anti-CLDN6 antibodies to tumor cells that endogenously express human CLDN6, the binding of these antibodies to OV90 (ovarian cancer) cells was determined by flow cytometry. For the CLDN6
Фигура 15. Активность, проявляющаяся комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC), моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A и 89A в отношении клеток NEC8 дикого типа и нокдаунныхFigure 15. Complement dependent cytotoxicity (CDC) activity of anti-CLDN6 monoclonal
Активность, проявляющуюся комплемент-зависимой цитотоксичностью, антител против CLDN6 определяли в люциферазной системе, выявляющей эндогенный аденозинтрифосфат в нелизированных клетках. Клетки NEC8 дикого типа (NEC8 LVTS2 77) с эктопической экспрессией люциферазы инкубировали с различными концентрациями антител chimAB 61D, 64A, 67A и 89A. Антитела chimAB 61D, 64A, 67A и 89A влияли на клетки NEC8 зависимым от дозы образом, тогда как в случае клеток NEC8, нокдаунных по CLDN6 (NEC8 LVTS2 54), ни одно из указанных антител не вызывало неспецифического лизиса. Эти результаты демонстрируют специфичные в отношении мишени эффекторные функции chimAB 61D, 64A, 67A и 89A.The complement-dependent cytotoxicity activity of anti-CLDN6 antibodies was determined in a luciferase system that detects endogenous adenosine triphosphate in unlysed cells. Wild-type NEC8 cells (NEC8 LVTS2 77) with ectopic luciferase expression were incubated with various concentrations of
Фигура 16. Активность, проявляющаяся антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (ADDC), моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A и 89A в отношении клеток NEC8 дикого типа и нокдаунныхFigure 16. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADDC) activity of anti-CLDN6 monoclonal
Активность, проявляющуюся зависимой от антител клеточно-опосредованной цитотоксичностью (ADDC), антител против CLDN6 определяли в люциферазной системе, выявляющей эндогенный аденозинтрифосфат в нелизированных клетках. Клетки NEC8 дикого типа (NEC8 LVTS2 77) инкубировали с различными концентрациями антител chimAB 61D, 64A, 67A и 89A. Активность антител chimAB 61D, 64A, 67A и 89A, проявляющаяся ADDC, зависила от дозы и возникала даже при низких концентрациях антител. Чтобы продемонстрировать специфичность антител в отношении мишени, использовали клетки NEC8 стабильно нокдаунные по CLDN6 (NEC8 LVTS2 54).Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADDC) activity of anti-CLDN6 antibodies was determined in a luciferase system that detects endogenous adenosine triphosphate in unlysed cells. Wild-type NEC8 cells (NEC8 LVTS2 77) were incubated with various concentrations of
Фигура 17. Долгосрочный терапевтический эффект мышиных моноклональных антител против CLDN6 muMAB 61D, 64A и 67A у мышей с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8 при воздействии на ранних стадиях развития опухолейFigure 17. Long-term therapeutic effect of mouse monoclonal antibodies against
Бестимусные мыши Nude-Foxn1nu с ксенографтами клеток NEC8, в которых эндогенно экспрессируется CLDN6, в течение 46 суток получали антитела, специфичные к CLDN6. После этого воздействия на протяжении 60 суток отслеживали опухолевый рост. Даже после прекращения этой иммунотерапии у мышей, получавших мышиные моноклональные антитела muMAB 61D, 64A и 67A роста опухолей не наблюдалось. Athymic Nude-Foxn1 nu mice with xenografts of NEC8 cells, in which CLDN6 is endogenously expressed, received antibodies specific to CLDN6 for 46 days. After this exposure, tumor growth was monitored for 60 days. Even after discontinuation of this immunotherapy, no tumor growth was observed in mice treated with
Фигура 18. Терапевтический эффект мышиных моноклональных антител против CLDN6 muMAB 89A у мышей с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8 при воздействии на ранних стадиях развития опухолей Figure 18. Therapeutic effect of mouse monoclonal antibodies against
Использовали бестимусные мышей Nude-Foxn1nu с ксенографтами клеток NEC8, в которых эндогенно экспрессируется CLDN6. Разбросанные кружочки представляют значения объема опухолей в различные моменты времени в ходе лечения антителами в ранний период развития ксенографтов NEC8 у бестимусных мышей Nude-Foxn1nu. По сравнению с контрольными особями у мышей, получавших muMAB 89A, наблюдалось ингибирование опухолевого роста (А). Введение антител, специфичных к CLDN6, либо PBS (контроль) продолжалось 47 суток, в течение которых и на протяжении последующих 51 суток регистрировали опухолевый рост. К концу ксперимента у мышей, получавших muMAB89A, опухолей не обнаруживалось - в отличие от контрольных особей, получавших PBS (B). We used athymic Nude-Foxn1 nu mice with xenografts of NEC8 cells in which CLDN6 is endogenously expressed. Scattered circles represent tumor volumes at various time points during antibody treatment during early development of NEC8 xenografts in Nude-Foxn1 nu nude mice. Compared to controls, mice treated with
Фигура 19. Терапевтический эффект мышиных моноклональных антител против CLDN6 muMAB 64A у мышей с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8 при воздействии на поздних стадиях развития опухолей Figure 19. Therapeutic effect of mouse monoclonal antibodies against
Разбросанные кружочки представляют значения объема опухолей в различные моменты времени в ходе лечения антителами в поздний период развития ксенографтов NEC8 у бестимусных мышей Nude-Foxn1nu. При иммунотерапии мышиными моноклональными антителами против CLDN6 muMAB 64A наблюдалось ингибирование роста солидных опухолей, развившихся из ксенографтов NEC8, по сравнению с обеими контрольными группами, в одной из которых мыши получали PBS без антител, а во второй - неспецифичные антитела. Scattered circles represent tumor volumes at various time points during antibody treatment late in the development of NEC8 xenografts in Nude-Foxn1 nu nude mice. Immunotherapy with the murine anti-CLDN6
Фигура 20. Долгосрочный терапевтический эффект мышиных моноклональных антител против CLDN6 muMAB 64A у мышей с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8 при воздействии на поздних стадиях развития опухолей Figure 20. Long-term therapeutic effect of mouse monoclonal antibodies against
Через 15 суток после введения опухолевых клеток 15 мыши в течение 45 суток получали специфичные к CLDN6 антитела muMAB 64A. На протяжении еще 49 суток регистрировали опухолевый рост (А). График, представляющий выживание мышей, показывает, что животные, получавшие специфичные к CLDN6 антитела muMAB 64A жили дольше (B).15 days after the injection of
Фигура 21. Терапевтический эффект мышиных моноклональных антител против CLDN6 muMAB 61D, 67A и 89A у мышей с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8 при воздействии на поздних стадиях развития опухолей Figure 21. Therapeutic effect of mouse monoclonal antibodies against
Разбросанные кружочки, треугольники и квадратики представляют значения объема опухолей в различные моменты времени в ходе лечения антителами в поздний период развития ксенографтов NEC8. Мышиные моноклональные антитела против CLDN6 muMAB 61D, 67A и 89A подавляли опухолевый рост - в отличие от контрольных воздействий (PBS без антител и неспецифичные антитела. Scattered circles, triangles, and squares represent tumor volumes at various time points during antibody treatment late in the development of NEC8 xenografts. Mouse monoclonal antibodies against
Фигура 22. Долгосрочный терапевтический эффект мышиных моноклональных антител против CLDN6 muMAB 61D, 67A и 89A у мышей с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8 при воздействии на поздних стадиях развития опухолей Figure 22. Long-term therapeutic effect of mouse monoclonal antibodies against
Через 17 суток после введения опухолевых клеток мыши на протяжении 42 суток получали специфичные к CLDN6 антитела muMAB 61D, 67A и 89A. В период иммунотерапии и на протяжении еще 49 суток регистрировали опухолевый рост (А). График, представляющий выживание мышей, показывает, что животные, получавшие специфичные к CLDN6 антитела muMAB 61D и 67A жили дольше (B).17 days after the injection of tumor cells, mice received CLDN6-
Фигура 23. Терапевтический эффект мышиных моноклональных антител против CLDN6 muMAB 64A и 89A у мышей с ксенографтами опухолевых клеток NEC8 дикого типа и клеток NEC8, стабильно нокдаунных по CLDN6 Figure 23. Therapeutic effect of mouse anti-CLDN6
Антитела muMAB 64A и 89A оказывали терапевтическое действие только у мышей с ксенографтами NEC8 дикого типа, а у животных, которым были введены клетки NEC8, нокдаунные по CLDN6, такого эффекта не наблюдалось, что демонстрирует специфичность этих антител в отношении мишени in vivo.
Фигура 24. Картирование с высоким разрешением эпитопов, с которыми взаимодействуют антитела chimAB 61D, 64A, 67A и 89A Figure 24. High-resolution mapping of epitopes interacted with by
Аланиновые мутантные варианты обозначенные « остаток дикого типа номер аланин» или «остаток дикого типа номер)глицин» в случаях наличия в данном положении аланина в белке дикого типа; аминокислоты названы однобуквенным обозначениями. Для взаимодействия со специфичными к CLDN6 гибридными антителами chimAB 61D, 64A, 67A и 89A важны аминокислотные остатки F35, G37, S39 и, вероятно, T33 первого внеклеточного домена CLDN6. Аминокислотный остаток 140 имеет существенное значение для связывания chimAB 89A и участвует в связывании chimAB 61D and 67A. Кроме того, аминокислотный остаток L151 второго внеклеточного домена участвует во взаимодействии с антителами chimAB 67A. Хотя иммунофлуоресцентный анализ подтвердил экспрессию мутантных вариантов CLDN6 P28A, W30A, G49A, L50A, W51A, C54A и C64A, они не давали окрашивания мембран. Поэтому нельзя исключить взаимодействия антител по данному изобретению с этими аминокислотами. В целом идентифицированные эпитопы согласуются с теми ДНК и пептидами домена ЕС1 CLDN6, которые использовались для иммунизации.Alanine mutant variants are designated “wild-type residue number alanine” or “wild-type residue number glycine” when alanine is present at this position in the wild-type protein; amino acids are named with single letter designations. For interaction with CLDN6-specific
Фигура 25. Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи специфичных к CLDN6 антител по данному изобретениюFigure 25. Alignment of the amino acid sequences of the heavy chain variable region of the CLDN6-specific antibodies of the present invention.
Участки, определяющие комплементарность (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) показаны рамкой.The complementarity determining regions (HCDR1, HCDR2 and HCDR3) are shown with a frame.
Фигура 26. Выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи специфичных к CLDN6 антител по данному изобретениюFigure 26. Amino acid sequence alignment of the light chain variable region of the CLDN6-specific antibodies of the present invention.
Участки, определяющие комплементарность (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) показаны рамкой.The complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3) are shown with a frame.
Фигура 27. Специфичность связывания моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS Figure 27. Binding specificity of monoclonal hybrid antibodies against
Специфичность связывания антител против CLDN6 определяли методом проточной цитометрии, используя клетки HEK293T, временно трансфицированные человеческими CLDN6, 3, 4 и 9,соответственно. Чтобы отличать нетрансфицированные клетки от трансфицированных, клетки одновременно трансфицировали флуоресцентным маркером. Концентрация антител была насыщающей места связывания (100 мкг/мл). Экспрессию человеческих белков CLDN3, 4, 6 и 9 подтверждали с помощью готовых имеющихся в продаже моноклональных антител против человеческого клаудина-3 (R&D Systems, MAB4620) и человеческого клаудина-4 (R&D Systems, MAB 4219), и CLDN6/9-реактивных мышиных моноклональных антител muMAB 5F2D2, соответственно.. Моноклональные гибридные антитела chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS связывались с CLDN6, но не взаимодействовали с CLDN3, 4 и 9, соответственно.The binding specificity of anti-CLDN6 antibodies was determined by flow cytometry using HEK293T cells transiently transfected with human CLDN6, 3, 4 and 9, respectively. To distinguish untransfected from transfected cells, cells were simultaneously transfected with a fluorescent marker. The antibody concentration was saturating the binding site (100 μg/ml). Expression of human CLDN3, 4, 6 and 9 proteins was confirmed using commercially available monoclonal antibodies against human claudin-3 (R&D Systems, MAB4620) and human claudin-4 (R&D Systems, MAB 4219), and CLDN6/9-reactive mouse monoclonal antibodies muMAB 5F2D2, respectively. Monoclonal
Фигура 28. Относительное сродство связывания (аффинность) моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS с клетками HEK293-CLDN6Figure 28. Relative binding affinities of anti-CLDN6 monoclonal
Для оценки относительного сродства (аффинности) методом проточной цитометрии определяли связывание антител против CLDN6 с человеческим CLDN6, стабильно экспрессирующимся на поверхности клеток HEK293. По результатам опыта с насыщением мест связывания строили график зависимости сигнала FACS (средней интенсивности флуоресценции) от концентрации антител. Рассчитывали EC50 (концентрацию антител, при которой в равновесии занята половина мест их связывания), используя метод нелинейной регрессии. Специфичные к CLDN6 антитела характеризовались сходными низкими значениями EC50, и насыщение мест связывания достигалось при низких концентрациях.To assess relative affinity, the binding of anti-CLDN6 antibodies to human CLDN6 stably expressed on the surface of HEK293 cells was determined by flow cytometry. Based on the results of the experiment with saturation of binding sites, a graph was constructed of the dependence of the FACS signal (average fluorescence intensity) on the antibody concentration. EC 50 (antibody concentration at which half of their binding sites are occupied at equilibrium) was calculated using the nonlinear regression method. CLDN6-specific antibodies had similar low EC 50 values and saturation of binding sites was achieved at low concentrations.
Фигура 29. Относительное сродство связывания (аффинность) моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS с клетками NEC8 Figure 29. Relative binding affinities of anti-CLDN6 monoclonal
Для оценки относительного сродства (аффинности) методом проточной цитометрии определяли связывание антител против CLDN6 с опухолевыми клетками, в которых эндогенно экспрессируется человеческий CLDN6, а именно с клетками линии NEC8 (рак яичка). По сравнению со специфичными к CLDN6 антителами chimAB 64A, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS вариант c комбинацией легких цепей mAb206-LCC проявлял втрое большую аффинность по отношению к клеткам NEC8. Во всех случаях насыщение мест связывания достигалось при низких концентрациях.To assess relative affinity, the binding of anti-CLDN6 antibodies to tumor cells that endogenously express human CLDN6, namely NEC8 (testicular cancer) cells, was determined by flow cytometry. Compared with the CLDN6-
Фигура 30. Относительное сродство связывания (аффинность) моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS с клетками OV90. Figure 30. Relative binding affinities of anti-CLDN6 monoclonal
Методом проточной цитометрии определяли сродство связывания (аффинность) антител против CLDN6 с человеческими клетками линии OV90 (рак яичника). Антитела, специфичные к CLDN6, характеризовались сходными низкими значениями EC50. Вариант c комбинацией легких цепей mAb206-LCC проявлял наибольшую прочность связывания с клетками OV90. The binding affinity of antibodies against CLDN6 to human OV90 cells (ovarian cancer) was determined by flow cytometry. Antibodies specific for CLDN6 had similar low EC 50 values. The variant with the mAb206-LCC light chain combination exhibited the highest binding strength to OV90 cells.
Фигура 31a. Активность моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC и mAb206-SUBG, проявляющаяся комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC) в отношении клеток NEC8 дикого типа и нокдаунных клеток NEC8. Figure 31a. Complement-dependent cytotoxicity (CDC) activity of anti-CLDN6 monoclonal
Активность, проявляющуюся комплемент-зависимой цитотоксичностью, антител против CLDN6 определяли в люциферазной системе, выявляющей эндогенный аденозинтрифосфат в нелизированных клетках. Клетки NEC8 дикого типа с эктопической экспрессией люциферазы инкубировали с различными концентрациями антител chimAB 64A, mAb206-LCC и mAb206-SUBG. Эти антитела влияли на клетки NEC8 зависимым от дозы образом, тогда как в случае клеток NEC8, нокдаунных по CLDN6 (NEC8 LVTS2 54), ни одно из них не вызывало неспецифического лизиса. Эти результаты демонстрируют специфичные в отношении мишени эффекторные функции chimAB 64A, mAb206-LCC и mAb206-SUBG.The complement-dependent cytotoxicity activity of anti-CLDN6 antibodies was determined in a luciferase system that detects endogenous adenosine triphosphate in unlysed cells. Wild-type NEC8 cells with ectopic luciferase expression were incubated with various concentrations of
Фигура 31b. Активность моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS, проявляющаяся комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC) в отношении клеток NEC8. Figure 31b. Activity of monoclonal hybrid antibodies against
Эти антитела вызывали CDC в отношении клеток NEC8 зависимым от дозы образом. По сравнению с антителами chimAB 64A варианты с аминокислотными заменами mAb206-SUBG и mAb206-SUBS обладали сходной активностью.These antibodies induced CDC against NEC8 cells in a dose-dependent manner. Compared to
Фигура 32a. Активность моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS, проявляющаяся антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (ADDC), в отношении клеток NEC8 и OV90.Figure 32a. Anti-CLDN6 monoclonal
Активность антител против CLDN6, проявляющуюся антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью, определяли в люциферазной системе, выявляющей эндогенный аденозинтрифосфат в нелизированных клетках. Клетки NEC8 и OV90 инкубировали с различными концентрациями гибридных антител против CLDN6. В обеих линий опухолевых клеток все указанные антитела вызывали ADCC даже в низких концентрациях, причем эффект ADDC зависел от дозы. The activity of antibodies against CLDN6, manifested by antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, was determined in a luciferase system that detects endogenous adenosine triphosphate in unlysed cells. NEC8 and OV90 cells were incubated with various concentrations of anti-CLDN6 fusion antibodies. In both tumor cell lines, all of these antibodies induced ADCC even at low concentrations, and the effect of ADDC was dose dependent.
Фигура 32b. Активность моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC и mAb206-SUBG, проявляющаяся антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АDDC), в отношении клеток NEC8 дикого типа и нокдаунных клеток NEC8. Figure 32b. The activity of monoclonal hybrid antibodies against
Чтобы продемонстрировать специфичность антител в отношении мишени, использовали клетки NEC8, стабильно нокдаунные по CLDN6.To demonstrate the target specificity of the antibodies, NEC8 cells stably knocked down for CLDN6 were used.
Фигура 33. Терапевтический эффект моноклональных гибридных антител против CLDN6 mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS у мышей с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8 при воздействии на поздних стадиях развития опухолей. Figure 33. Therapeutic effect of monoclonal hybrid antibodies against CLDN6 mAb206-LCC, mAb206-SUBG and mAb206-SUBS in mice with xenografts of NEC8 tumor cells when exposed to late stages of tumor development.
Использовали бестимусных мышей линии Nude-Foxn1nu с ксенографтами клеток NEC8. Через 17 суток после введения опухолевых клеток мышам вводили специфичные к CLDN6 антитела mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS и затем регистрировали опухолевый рост. Разбросанные кружочки, треугольники и квадратики представляют значения объема опухолей в различные моменты времени в ходе лечения антителами в поздний период развития ксенографтов NEC8. По сравнению с контролем (мыши получали неспецифичные антитела) моноклональные гибридные антитела против CLDN6 mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS подавляли опухолевый рост.Nude-Foxn1 nu athymic mice with NEC8 cell xenografts were used. 17 days after the injection of tumor cells, mice were injected with CLDN6-specific antibodies mAb206-LCC, mAb206-SUBG and mAb206-SUBS, and then tumor growth was recorded. Scattered circles, triangles, and squares represent tumor volumes at various time points during antibody treatment late in the development of NEC8 xenografts. Compared with the control (mice received nonspecific antibodies), monoclonal hybrid antibodies against CLDN6 mAb206-LCC, mAb206-SUBG and mAb206-SUBS suppressed tumor growth.
Фигура 34. Терапевтический эффект моноклональных гибридных антител против CLDN6 mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS у мышей с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8 при воздействии на поздних стадиях развития опухолей Figure 34. Therapeutic effect of monoclonal hybrid antibodies against CLDN6 mAb206-LCC, mAb206-SUBG and mAb206-SUBS in mice with xenografts of NEC8 tumor cells when exposed to late stages of tumor development
Для сравнения с фиг. 33 данные по опухолевому росту во времени представлены более подробно. Видно, что моноклональные гибридные антитела против CLDN6 способны подавлять опухолевый рост (А). Кривая выживания показывает, что мыши, получавшие специфичные к CLDN6 антитела, жили дольше (B).For comparison with Fig. 33 data on tumor growth over time are presented in more detail. It can be seen that monoclonal hybrid antibodies against CLDN6 are able to suppress tumor growth (A). The survival curve shows that mice treated with CLDN6-specific antibodies lived longer (B).
Фигура 35. Картирование с высоким разрешением эпитопов, с которыми взаимодействуют антитела chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG and mAb206-SUBS Figure 35. High-resolution mapping of epitopes interacted with by
Аланоновые мутантные варианты названы «остаток дикого типа номер аланин»; аминокислоты названы однобуквенным обозначениями. Для взаимодействия со специфичными к CLDN6 гибридными антителами важны аминокислотные остатки F35, G37, S39 и, вероятно, T33 первого внеклеточного домена CLDN6. Антитела сhimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS характеризовались одинаковыми особенностями связывания. Alanone mutant variants are named “wild-type residue number alanine”; amino acids are named with single letter designations. For interaction with CLDN6-specific hybrid antibodies, amino acid residues F35, G37, S39, and, probably, T33 of the first extracellular domain of CLDN6 are important.
Фигура 36. Терапевтический эффект мышиных моноклональных антител против CLDN6 muMAB 64A в отношении метастазирования у мышей с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8.Figure 36. Therapeutic effect of murine anti-CLDN6
Бестимусным мышам линии Nude-Foxn1nu вводили в хвостовую вену клетки NEC8, а через трое суток эти животные получали специфичные к CLDN6 антитела muMAB 64A. Спустя 8 недель определяли опухолевую нагрузку в ткани легких с помощью полимеразной цепной реакции. Мышиные моноклональные антитела против CLDN6 muMAB 64A по сравнению с контролем (PBS без антител) вызывали отчетливое ингибирование опухолевого роста.Nude-Foxn1 nu athymic mice were injected into the tail vein of NEC8 cells, and three days later these animals received
Фигура 37. Иммуногистохимическое окрашивание раковых и нормальных тканей человека с использованием моноклональных антител muMAB 64A, mAb206-LCC и mAb206-SUBG.Figure 37. Immunohistochemical staining of human cancerous and normal tissues using
В противоположность нормальным тканям в срезах опухолей яичников и яичек наблюдалось выраженное равномерное окрашивание. Очень интенсивное окрашивание мембран имело место в злокачественных эпителиальных клетках, тогда как соседние стромальные клетки и незлокачественные эпителиальные клетки не окрашивались. Эти результаты с очевидностью свидетельствуют, что специфичные к CLDN6 антитела по данному изобретению специфично связываются со злокачественными клетками, полученными от пациентов с опухолями. (Пояснение: число тканей, окрашивающихся антителами/ число изученных тканей). In contrast to normal tissues, sections of ovarian and testicular tumors showed pronounced uniform staining. Very intense membrane staining occurred in malignant epithelial cells, whereas adjacent stromal cells and nonmalignant epithelial cells were not stained. These results clearly indicate that the CLDN6-specific antibodies of the present invention specifically bind to malignant cells obtained from tumor patients. (Explanation: number of tissues stained with antibodies / number of tissues examined).
Определения терминовDefinitions of terms
Чтобы облегчить понимание настоящего изобретения мы вначале дадим определение некоторым терминам. Дополнительные определения даются по ходу раскрытия изобретения. To facilitate understanding of the present invention, we will first define some terms. Additional definitions are given as the invention progresses.
В нижеследующем описании и в прилагаемой формуле изобретения слова «включает» и «содержит» и их производные (и синонимы, например «в их число входит») следует понимать так (если не оговорено иного), что указанные члены, целые числа или стадии или группы членов, целых чисел или стадий входят в рассматриваемую группу, но не исключается, что в нее входят и другие члены, целые числа или стадии или группы членов, целых чисел или стадий. Определенный и неопределенный артикль и их аналоги в описании данного изобретения и особенно в формуле изобретения подразумевают как единственное, так и множественное число, если не оговорено иного или если это явно не противоречит конкретному контексту. Диапазоны значений приводятся здесь для сокращенного указания всех значений, входящих в данный диапазон, вместо того, чтобы указывать их каждое в отдельности. И, если не оговорено иного, каждое отдельное значение включено в настоящее описание, как если бы оно было указано в отдельности. Все описанные здесь способы могут быть осуществлены в любом нужном порядке, если не оговорено иного или если это явно не противоречит конкретному контексту. Любой приведенный здесь пример и все они вместе взятые, а также употребление здесь выражений типа «такой/такие, как» или «например» или «в том числе» служат только для иллюстрации данного изобретения и не накладывают ограничений на объем изобретения, если не указано иного. Никакие словесные конструкции в настоящем описании не следует истолковывать как указывающие на какой-либо незаявленный элемент, существенный для практического осуществления данного изобретения. In the following description and in the accompanying claims, the words “includes” and “comprises” and their derivatives (and synonyms, such as “includes”) are to be understood to mean (unless otherwise stated) that the terms, integers or steps or groups of members, integers or stages are included in the group under consideration, but it is possible that it also includes other members, integers or stages or groups of members, integers or stages. The definite and indefinite articles and their analogues in the description of this invention and especially in the claims imply both the singular and the plural unless otherwise stated or unless clearly inconsistent with the particular context. Value ranges are provided here to provide an abbreviation for all values within a given range, rather than specifying each value individually. And, unless otherwise stated, each individual value is included herein as if it were individually stated. All methods described herein can be performed in any desired order unless otherwise noted or unless clearly inconsistent with the particular context. Any example given herein and taken together, as well as the use here of expressions such as "such as" or "for example" or "including" serve only to illustrate the present invention and do not impose limitations on the scope of the invention unless specified other. Nothing in this specification should be construed as indicating any unclaimed element essential to the practice of the invention.
Клаудины - это семейство белков, которые являются очень важными компонентами плотных контактов, где они образуют околоклеточный барьер, регулирующий поток веществ в межклеточном пространстве эпителия. Клаудины представляют собой трансмембранные белки; молекулы клаудина пересекает мембрану четыре раза, причем и N-конец, и С-конец находятся в цитоплазме. Первая внеклеточная петля состоит из в среднем 53 аминокислотных остатков, вторая - из около 24 аминокислотных остатков. В семействе клаудинов белки CLDN6 и CLDN9 наиболее сходны между собой. В настоящем документе сокращение "CLDN" означает «клаудин» (claudin) и включает белки CLDN6, CLDN9, CLDN4 и CLDN3. Предпочтительно, CLDN является человеческим клаудином.Claudins are a family of proteins that are very important components of tight junctions, where they form a pericellular barrier that regulates the flow of substances in the intercellular space of the epithelium. Claudins are transmembrane proteins; The claudin molecule crosses the membrane four times, with both the N-terminus and the C-terminus located in the cytoplasm. The first extracellular loop consists of an average of 53 amino acid residues, the second - of about 24 amino acid residues. In the claudin family, proteins CLDN6 and CLDN9 are most similar to each other. As used herein, the abbreviation “CLDN” stands for “claudin” and includes the proteins CLDN6, CLDN9, CLDN4 and CLDN3. Preferably, the CLDN is a human claudin.
Обозначение "CLDN6" относится предпочтительно к человеческому CLDN6, в частности к (i) нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, например, к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, или (ii) к белку, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Первая внеклеточная петля CLDN6 предпочтительно содержит аминокислотные остатки с 28 пo 80, более предпочтительно аминокислотные остатки с 28 пo 76 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, или аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8, например аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 7. Вторая внеклеточная петля CLDN6 предпочтительно содержит аминокислотные остатки с 138 пo 160, предпочтительно аминокислотные остатки с 141 по 159, более предпочтительно аминокислотные остатки с 145 пo 157 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, или аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 8, например аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 6. Указанные первая и вторая внеклеточные петли предпочтительно формируют внеклеточную часть CLDN6.The designation "CLDN6" preferably refers to human CLDN6, in particular to (i) a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, for example, a nucleic acid containing the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1, or (ii) to a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. The first extracellular loop of CLDN6 preferably contains amino acid residues 28 to 80, more preferably amino acid residues 28 at the 76 amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, for example the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7. The second extracellular loop of CLDN6 preferably contains
Обозначение "CLDN9" относится предпочтительно к человеческому CLDN9, в частности к (i) нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или (ii) к белку, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9. Первая внеклеточная петля CLDN9 предпочтительно содержит аминокислотные остатки с 28 пo 76, аминокислотной последовательности показанной в SEQ ID NO: 9. Вторая внеклеточная петля CLDN9 предпочтительно содержит аминокислотные остатки с 141 пo 159 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 9. Указанные первая и вторая внеклеточные петли предпочтительно формируют внеклеточную часть CLDN9.The designation "CLDN9" preferably refers to human CLDN9, in particular to (i) a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or (ii) a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. First extracellular loop CLDN9 preferably contains amino acid residues 28 to 76 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9. The second extracellular loop of CLDN9 preferably contains
Обозначение "CLDN4" относится предпочтительно к человеческому CLDN4, в частности к (i) нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или (ii) к белку, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. Первая внеклеточная петля CLDN4 предпочтительно содержит аминокислотные остатки с 28 пo 76 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10. Вторая внеклеточная петля CLDN4 предпочтительно содержит аминокислотные остатки с 141 пo 159 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10. Указанные первая и вторая внеклеточные петли предпочтительно формируют внеклеточную часть CLDN4.The designation "CLDN4" preferably refers to human CLDN4, in particular to (i) a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or (ii) a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. First extracellular loop CLDN4 preferably contains amino acid residues 28 to 76 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10. The second extracellular loop of CLDN4 preferably contains
Обозначение "CLDN3" относится предпочтительно к человеческому CLDN3, в частности к (i) нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или (ii) к белку, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. Первая внеклеточная петля CLDN3 предпочтительно содержит аминокислотные остатки с 27 пo 75 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 11. Вторая внеклеточная петля CLDN9 предпочтительно содержит аминокислотные остатки с 140 пo 158 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 11. Указанные первая и вторая внеклеточные петли предпочтительно формируют внеклеточную часть CLDN3.The designation "CLDN3" preferably refers to human CLDN3, in particular to (i) a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or (ii) a protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11. First extracellular loop CLDN3 preferably contains amino acid residues 27 to 75 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11. The second extracellular loop of CLDN9 preferably contains
Описанные выше последовательности CLDN включают любые варианты указанных последовательностей, в частности мутантные формы, варианты сплайсинга, конформации, изоформы, аллельные варианты, варианты и гомологичные формы различного видового происхождения, в том числе те, которые встречаются в природе. Аллельные варианты относятся к изменениям нормальной последовательности гена, значение которых часто остается неясным. При определении полной нуклеотидной последовательности гена часто выявляются многочисленные варианты этого гена. Гомологичные формы различного видового происхождения - это соответственные нуклеотидные или аминокислотные последовательности, имеющиеся у разных видов. Термин «клаудин» (обозначаемый "CLDN") охватывает (i) варианты сплайсинга CLDN, (ii) варианты посттрансляционной модификации CLDN, в частности различные варианты гликозилирования, например гликозилирования N-концевого участка полипептидной цепи, (iii) конформационные варианты CLDN, (iv) варианты CLDN, связанные с раком, и несвязанные с раком. Предпочтительно, чтобы СLDN присутствовал в своей нативной конформации. The CLDN sequences described above include any variants of the said sequences, in particular mutant forms, splice variants, conformations, isoforms, allelic variants, variants and homologous forms of various species origin, including those that occur in nature. Allelic variants refer to changes in the normal sequence of a gene, the meaning of which is often unclear. When determining the complete nucleotide sequence of a gene, numerous variants of this gene are often identified. Homologous forms of different species origin are the corresponding nucleotide or amino acid sequences found in different species. The term "claudin" (denoted "CLDN") covers (i) splicing variants of CLDN, (ii) post-translational modification variants of CLDN, in particular various glycosylation variants, such as glycosylation of the N-terminal region of the polypeptide chain, (iii) conformational variants of CLDN, (iv ) cancer-associated and non-cancer-associated CLDN variants. Preferably, CLDN is present in its native conformation.
Экспрессия CLDN6 обнаружена, например. в опухолевой ткани при раке яичника, раке легких, желудка, молочной железы, печени, поджелудочной железы, кожи, при меланомах, раке головы и шеи, саркомах, раке желчного протока, почечноклеточном раке и раке мочевого пузыря. CLDN6 представляет особенно предпочтительную мишень для лечения и/или предотвращения рака яичника, в частности аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, а также рака легких, включая мелкоклеточный рак легких (SCLC) и немелкоклеточный рак легких (NSCLC), в том числе плоскоклеточную карциному и аденокарциному легких, рак желудка, молочной железы, печени, поджелудочной железы, кожи, в частности базальноклеточную карциному и плоскоклеточную карциному, злокачественную меланому, рак головы и шеи, в том числе злокачественную полиморфную аденому, саркому, в частности синовиальную саркому и карциносаркому, рак желчного протока, рак мочевого пузыря, в частности переходноклеточную карциному и папиллярную карциному, рак почек, в частности почечно-клеточную карциному, включая светлоклеточную почечно-клеточную карциному и папиллярную почечно-клеточную карциному, рак толстого кишечника, рак тонкого кишечника, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциному тонкого кишечника и аденокарциному подвздошной кишки, эмбриональную карциному яичка, хориокарциному плацентарной площадки, рак шейки матки, рак яичка, в частности семиному яичка, тератому яичка и эмбриональный рак яичка, рак матки, герминогенные опухоли, например тератокарциному или эмбриональную карциному, в частности герминогенную опухоль яичка, и их метастазирующие формы. В одном из воплощений данного изобретения раковое заболевание, связанное с экспрессией CLDN6, выбирают из группы, состоящей из рака яичника, рака легких, метастазирующего рака яичника и метастазирующего рака легких. предпочтительно рак яичника является карциномой или аденокарциномой. Предпочтительно, рак легких является карциномой или аденокарциномой, предпочтительно бронихиолярным раком, например бронихиолярной карциномой или бронихиолярной аденокациномой. В одном из воплощений данного изобретения опухолевые клетки, связанные с экспрессией CLDN6, являются раковыми клетками указанных заболеваний. Expression of CLDN6 has been detected, e.g. in tumor tissue in ovarian cancer, lung cancer, stomach, breast, liver, pancreas, skin, melanomas, head and neck cancer, sarcomas, bile duct cancer, renal cell cancer and bladder cancer. CLDN6 is a particularly preferred target for the treatment and/or prevention of ovarian cancer, in particular ovarian adenocarcinoma and ovarian teratocarcinoma, as well as lung cancer, including small cell lung cancer (SCLC) and non-small cell lung cancer (NSCLC), including squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma , cancer of the stomach, breast, liver, pancreas, skin, in particular basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma, malignant melanoma, head and neck cancer, including malignant polymorphic adenoma, sarcoma, in particular synovial sarcoma and carcinosarcoma, bile duct cancer, bladder cancer, in particular transitional cell carcinoma and papillary carcinoma, kidney cancer, in particular renal cell carcinoma, including clear cell renal cell carcinoma and papillary renal cell carcinoma, colon cancer, small intestine cancer, including ileal cancer, in particular adenocarcinoma of the small intestine and adenocarcinoma of the ileum, embryonal testicular carcinoma, placental site choriocarcinoma, cervical cancer, testicular cancer, in particular testicular seminoma, testicular teratoma and embryonal testicular cancer, uterine cancer, germ cell tumors, for example teratocarcinoma or embryonal carcinoma, in particular germ cell carcinoma testicular tumors and their metastatic forms. In one embodiment of the present invention, the cancer associated with CLDN6 expression is selected from the group consisting of ovarian cancer, lung cancer, metastatic ovarian cancer and metastatic lung cancer. preferably the ovarian cancer is a carcinoma or adenocarcinoma. Preferably, the lung cancer is a carcinoma or adenocarcinoma, preferably a bronchiolar cancer, such as bronchiolar carcinoma or bronchiolar adenocacinoma. In one embodiment of the present invention, the tumor cells associated with the expression of CLDN6 are cancer cells of the specified diseases.
Термин «участок» относится к части. Применительно к таким конкретным структурам, как аминокислотная последовательность или белок термин «участок» может означать непрерывную или составную часть указанной структуры. Предпочтительно участок аминокислотной последовательности содержит по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислотных остатков указанной аминокислотной последовательности. Предпочтительно, если участок является составной частью указанная составная часть состоит из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более частей структуры, причем каждая часть является непрерывным элементом этой структуры. Например, составная часть аминокислотной последовательности может быть образована из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более, предпочтительно не более 4 частей указанной аминокислотной последовательности, причем каждая часть предпочтительно содержит по меньшей мере 5 непрерывно расположенных аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 непрерывно расположенных аминокислотных остатков, предпочтительно по меньшей мере 20 непрерывно расположенных аминокислотных остатков, предпочтительно по меньшей мере 30 непрерывно расположенных аминокислотных остатков данной аминокислотной последовательности.The term "section" refers to a part. When applied to specific structures such as an amino acid sequence or a protein, the term "region" can mean a continuous or integral part of the specified structure. Preferably, the amino acid sequence region comprises at least 1%, at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, preferably at least 40%, preferably at least 50%, more preferably at least 60%, more preferably at least 70%, even more preferably at least 80%, and most preferably at least 90% of the amino acid residues of said amino acid sequence. Preferably, if the section is a component, said component consists of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or more parts of a structure, each part being a continuous element of that structure. For example, a constituent amino acid sequence may be formed from 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or more, preferably no more than 4 parts of said amino acid sequence, each part preferably containing at least 5 contiguous amino acid residues, according to at least 10 contiguous amino acid residues, preferably at least 20 contiguous amino acid residues, preferably at least 30 contiguous amino acid residues of a given amino acid sequence.
Термины «часть» и «фрагмент» в настоящем документе употребляются как синонимы и относятся к непрерывным элементам. Например, часть такой структуры, как аминокислотная последовательность или белок, относится к непрерывному элементу указанной структуры. В участке, части или фрагменте структуры предпочтительно заключено одно или более функциональных свойств указанной структуры. Например, участок, часть или фрагмент эпитопа или пептида предпочтительно иммунологически эквивалентны эпитопу или пептиду, из которого они происходят.The terms “part” and “fragment” are used interchangeably herein and refer to continuous elements. For example, part of a structure such as an amino acid sequence or a protein refers to a contiguous element of the structure. A section, part or fragment of a structure preferably contains one or more functional properties of said structure. For example, a region, part or fragment of an epitope or peptide is preferably immunologically equivalent to the epitope or peptide from which it is derived.
Термин «внеклеточный участок CLDN" в контексте данного изобретения относится к части клаудина, обращенной во внеклеточное пространство и предпочтительно доступной извне указанной клетки, например для находящихся снаружи клетки антител. Предпочтительно, данный термин относится к одной или более внеклеточных петель или их частей или к любой другой внеклеточной части CLDN, которая предпочтительно специфична для указанного CLDN. предпочтительно. указанная часть содержит по меньшей мере 5, по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 50 аминокислотных остатков или больше. The term "extracellular region of CLDN" in the context of this invention refers to the portion of claudin that faces the extracellular space and is preferably accessible from the outside of said cell, for example to antibodies external to the cell. Preferably, the term refers to one or more extracellular loops or portions thereof, or any another extracellular portion of the CLDN, which is preferably specific to said CLDN, preferably said portion comprising at least 5, at least 8, at least 10, at least 15, at least 20, at least 30 or at least 50 amino acid residues or more.
Термин «CLDN, связанный/ассоциированный с поверхностью клетки» следует понимать как относящийся к нативному CLDN, т.е. CLDN в его не денатурированном виде, предпочтительно в естественной конформации. Предпочтительно термин «CLDN, связанный/ассоциированный с поверхностью клетки» означает, что между этим белком и плазматической мембраной существует связь и что он располагается на клеточной мембране, где по меньшей мере часть СLDN , предпочтительно внеклеточный участок, обращен во внеклеточное пространство указанной клетки и доступен снаружи от нее, например для антител, находящихся вне клетки. Связь может быть прямой либо непрямой. Например, связь может осуществляться за счет одного или более трансмембранных доменов, одной или более липидных заякоривающих структур и/или благодаря взаимодействию с каким-либо другим белком, липидом, сахаридом или другой структурой, находящейся на наружном слое плазматической мембраны клетки. Например, CLDN, связанный с поверхностью клетки, может быть трансмембранным белком, т.е. белком, встроенным в мембрану (интегральным мембранным), имеющим внеклеточный участок, или CLDN может быть белком, связанным с клеточной поверхностью за счет взаимодействия с другим белком, являющимся трансмембранным. The term “cell surface bound/associated CLDN” should be understood to refer to native CLDN, i.e. CLDN in its non-denatured form, preferably in its natural conformation. Preferably, the term "cell surface bound/associated CLDN" means that there is an association between the protein and the plasma membrane and that it is located on the cell membrane where at least a portion of the CLDN, preferably an extracellular region, faces the extracellular space of said cell and is accessible outside of it, for example for antibodies located outside the cell. The connection can be direct or indirect. For example, the association may be through one or more transmembrane domains, one or more lipid anchoring structures, and/or through interaction with some other protein, lipid, saccharide, or other structure located on the outer layer of the cell's plasma membrane. For example, CLDN associated with the cell surface may be a transmembrane protein, i.e. a protein embedded in a membrane (integral membrane) having an extracellular region, or CLDN may be a protein associated with the cell surface through interaction with another protein that is transmembrane.
CLDN6 связан с поверхностью клетки, если он располагается на ее поверхности и доступен для связывания с добавленными к таким клеткам антителами, специфичными к CLDN6.. В предпочтительных воплощениях данного изобретения клетки, отличающиеся тем, что CLDN6 ассоциирован с их поверхностью, - это клетки, в которых CLDN6 экспрессируется. Следует подчеркнуть, что если в клетке имеет место экспрессия CLDN6, то CLDN6, связанный с клеточной поверхностью, может быть только из числа этих белковых молекул. CLDN6 is associated with the surface of a cell if it is located on the surface of a cell and is available for binding to CLDN6-specific antibodies added to such cells. In preferred embodiments of the present invention, cells characterized in that CLDN6 is associated with their surface are cells in which which CLDN6 is expressed. It should be emphasized that if CLDN6 is expressed in a cell, then the CLDN6 associated with the cell surface can only be from among these protein molecules.
Выражение «клетка, несущая CLDN» предпочтительно означает, что указанная клетка имеет на своей поверхности молекулы клаудина, т.е. он связан с поверхностью указанной клетки. The expression “CLDN-bearing cell” preferably means that said cell has claudin molecules on its surface, i.e. it is connected to the surface of the specified cell.
Словосочетания «клеточная поверхность» или «поверхность клетки» используются в их обычном для данной области техники смысле, т.е. включают наружную поверхность клетки, доступную для связывания с белками и другими веществами извне. The phrases “cell surface” or “cell surface” are used in their usual sense in the art, i.e. include the outer surface of the cell, accessible for binding to proteins and other substances from the outside.
Выражение «CLDN, экспрессируемый на поверхности клетки» означает, что клаудин, образующийся в данной клетке, оказывается связан с ее поверхностью.The expression “CLDN expressed on the cell surface” means that claudin produced in a given cell becomes associated with its surface.
По данному изобретению считается, что в клетках нет существенной экспрессии CLDN6 и на них нет существенного количества этого белка, связанного с клеточной поверхностью, если уровень экспрессии и количество CLDN6 на клеточной поверхности меньше, чем в плацентарных клетках или в ткани плаценты. Предпочтительно уровень экспрессии и количество CLDN6 на клеточной поверхности должны быть менее 10%, предпочтительно менее 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% или 0,05% от уровня экспрессии и количества этого белка на клеточной поверхности в плацентарных клетках или в ткани плаценты (или даже ниже). Предпочтительно, в клетках нет существенной экспрессии CLDN6 и на них нет существенного количества этого белка, связанного с клеточной поверхностью, если уровень экспрессии и количество CLDN6 на клеточной поверхности превышают таковые в неопухолевых нераковых тканях, отличных от ткани плаценты, не более чем в 2 раза, предпочтительно не более чем в 1,5 раза и предпочтительно не превышают уровень экспрессии и количество СLDN6 на клеточной поверхности в указанных неопухолевых нераковых тканях. Предпочтительно, в клетках нет существенной экспрессии CLDN6 и на них нет существенного количества этого белка, связанного с клеточной поверхностью, если уровень экспрессии и количество CLDN6 на клеточной поверхности ниже предела чувствительности метода определения и/или если уровень экспрессии и количество CLDN6 на клеточной поверхности слишком низкие для того, чтобы происходило связывание специфичных к CLDN6 антител, добавленных к этим клеткам. For purposes of the present invention, cells are considered to have no significant expression of CLDN6 and no significant amount of this protein associated with the cell surface if the level of expression and amount of CLDN6 on the cell surface is less than that of placental cells or placental tissue. Preferably, the expression level and amount of CLDN6 on the cell surface should be less than 10%, preferably less than 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% or 0.05% of the expression level and amount of this protein on the cell surface in placental cells or in placental tissue (or even below). Preferably, the cells do not have significant expression of CLDN6 and do not have a significant amount of this protein associated with the cell surface if the level of expression and amount of CLDN6 on the cell surface exceeds those in non-tumor, non-cancerous tissues other than placental tissue by no more than 2 times, preferably no more than 1.5-fold and preferably not greater than the expression level and amount of cell surface CLDN6 in said non-tumor non-cancerous tissues. Preferably, cells do not have significant expression of CLDN6 and do not have significant amounts of this protein associated with the cell surface if the expression level and amount of CLDN6 on the cell surface is below the detection limit of the detection method and/or if the expression level and amount of CLDN6 on the cell surface is too low in order for CLDN6-specific antibodies added to these cells to bind.
По данному изобретению считается, что в клетках экспрессируется CLDN6 и этот белок имеется на клеточной поверхностью, если уровень экспрессии и количество CLDN6 на клеточной поверхности превышают таковые в неопухолевых нераковых тканях, отличных от ткани плаценты, предпочтительно более чем в 2 раза, предпочтительно в 10, 100, 1000 или 10 000 раз. Предпочтительно в клетках экспрессируется CLDN6 и этот белок имеется на клеточной поверхностью, если уровень экспрессии и количество CLDN6 на клеточной поверхности превышают предел чувствительности метода определения и/или если уровень экспрессии и количество CLDN6 на клеточной поверхности достаточны для того, чтобы происходило связывание специфичных к CLDN6 антител, добавленных к этим клеткам. Предпочтительно, экспрессируемый в клетках CLDN6 экспонируется на их клеточной поверхности. For the purposes of this invention, cells are considered to express CLDN6 and have this protein on the cell surface if the level of expression and amount of CLDN6 on the cell surface exceeds those in non-tumor non-cancerous tissues other than placental tissue, preferably by more than 2-fold, preferably by 10-fold. 100, 1000 or 10,000 times. Preferably, CLDN6 is expressed in cells and the protein is present on the cell surface if the expression level and amount of CLDN6 on the cell surface exceeds the detection limit of the detection method and/or if the expression level and amount of CLDN6 on the cell surface is sufficient to allow CLDN6-specific antibodies to bind added to these cells. Preferably, CLDN6 expressed in cells is displayed on their cell surface.
Термин «рафт (плотик)» означает микродомен липидного бислоя клеточной мембраны, обогащённый холестерином и сфинголипидами, который расположен во внешнем слое плазматической мембраны клетки. Некоторые белки способны связываться в такие домены, образовывать агрегаты или участки фокальной адгезии, что влияет на функционирование белков. Например, перенос молекул CLDN6 в такие структуры после того как этот белок связался с антителами по данному изобретению, приводит к образованию комплексов высокой плотности антиген (СLDN6)-антитело в плазматической мембране. Высокая плотность комплексов антиген (СLDN6)-антитело имеет значение для эффективной активации системы комплемента при комплемент-зависимой цитотоксичности. The term “raft” means a microdomain of the lipid bilayer of the cell membrane, enriched in cholesterol and sphingolipids, which is located in the outer layer of the plasma membrane of the cell. Some proteins are capable of binding into such domains, forming aggregates or focal adhesion sites, which affects the functioning of proteins. For example, the transfer of CLDN6 molecules into such structures after the protein has bound to the antibodies of this invention results in the formation of high density antigen (CLDN6)-antibody complexes in the plasma membrane. The high density of antigen (CLDN6)-antibody complexes is important for efficient activation of the complement system during complement-dependent cytotoxicity.
По данному изобретению термин «заболевание/болезнь» относится к любому патологическому состоянию, включая рак, в частности к тем раковым заболеваниям, которые упоминаются в настоящем документе.As used herein, the term “disease/illness” refers to any pathological condition, including cancer, in particular those cancers referred to herein.
Выражение « заболевания с участием клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью», по данному изобретению означает, что экспрессия и количество этого белка на клеточной поверхности в пораженной ткани или органе предпочтительно увеличены по сравнению с состоянием в здоровом органе или ткани. Под увеличением понимается увеличение по меньшей мере на 10%, в частности по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 500%, по меньшей мере на 1000%, по меньшей мере на 10 000% или даже больше. В одном из воплощений данного изобретения экспрессия CLDN6 и его наличие на клеточной поверхности имеют место только в пораженной ткани, а в здоровых тканях его экспрессия подавлена. По данному изобретению заболевания с участием клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью, включают онкологические заболевания, например раковые заболевания. Также по данному изобретению онкологические заболевания, например раковые заболевания, - это предпочтительно те, при которых в опухолевых клетках или раковых клетках экспрессируется CLDN6 и этот белок связан с их клеточной поверхностью.The expression "diseases involving cells in which CLDN6 is expressed and which are characterized in that CLDN6 is associated with their surface" according to this invention means that the expression and amount of this protein on the cell surface in the affected tissue or organ is preferably increased compared to the state in healthy organ or tissue. By increase is meant an increase of at least 10%, in particular at least 20%, at least 50%, at least 100%, at least 200%, at least 500%, at least at least 1000%, at least 10,000% or even more. In one embodiment of the present invention, CLDN6 is expressed and present on the cell surface only in diseased tissue, and its expression is suppressed in healthy tissues. According to the present invention, diseases involving cells in which CLDN6 is expressed and which are characterized in that CLDN6 is associated with their surface include oncological diseases, such as cancer. Also according to the present invention, oncological diseases, such as cancers, are preferably those in which CLDN6 is expressed in tumor cells or cancer cells and this protein is associated with their cell surface.
В настоящем документе термины «онкологическое заболевание», «заболевание, ассоциированное с опухолью» или «онкогенное заболевание» включают заболевания, отличающиеся нарушением регуляции клеточного роста, пролиферации, дифференцировки, адгезии и/или миграции, что может приводить к образованию опухолей и/или метастазов или к возникновению тенденции к их образованию. Под «опухолевыми клетками» понимаются аномальные клетки, которым свойственна быстрая бесконтрольная пролиферация и продолжение клеточного роста и которые продолжают размножаться и после того, как фактор, инициировавший клеточный рост, прекратил свое действие. As used herein, the terms “cancer,” “tumor-associated disease,” or “oncogenic disease” include diseases characterized by dysregulation of cellular growth, proliferation, differentiation, adhesion and/or migration, which can lead to the formation of tumors and/or metastases. or to the emergence of a tendency towards their formation. “Tumor cells” are understood as abnormal cells that are characterized by rapid, uncontrolled proliferation and continued cell growth and that continue to multiply even after the factor that initiated cell growth has ceased to act.
Под «опухолью» понимается аномальная группа клеток или ткань, быстро растущая за счет бесконтрольной пролиферации и продолжающая расти после прекращения действия фактора, вызвавшего клеточный рост. Опухолям свойственно частичное или полное отсутствие структурной организации и функциональной координации с нормальной тканью; обычно опухоль представляет собой отдельную массу ткани, которая может быть доброкачественной, предраковой или злокачественной. A “tumor” is defined as an abnormal group of cells or tissue that grows rapidly through uncontrolled proliferation and continues to grow after the cessation of the agent that caused the cell growth. Tumors are characterized by a partial or complete lack of structural organization and functional coordination with normal tissue; Typically, a tumor is a discrete mass of tissue that may be benign, precancerous, or malignant.
Предпочтительно «онкологическое заболевание», «заболевание, ассоциированное с опухолью» или «онкогенное заболевание» по данному изобретению являются раковыми заболеваниями, т.е. злокачественными заболеваниями, а опухолевая клетка является раковой клеткой. Предпочтительно «онкологическое заболевание», «заболевание, ассоциированное с опухолями» или «онкогенное заболевание» отличаются тем, что имеются клетки, в которых экспрессируется CLDN6 и он связан с их поверхностью, и в опухолевых клетках экспрессируется CLDN6 и он связан с их поверхностью. Preferably, the “cancer disease”, “tumor-associated disease” or “oncogenic disease” of the present invention is a cancer disease, i.e. malignant diseases, and a tumor cell is a cancer cell. Preferably, the “oncological disease”, “tumor-associated disease” or “oncogenic disease” is characterized in that there are cells that express CLDN6 and are associated with their surface, and tumor cells express CLDN6 and are associated with their surface.
Клетки, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что этот белок связан с их поверхностью, предпочтительно являются опухолевыми клетками или раковыми клетками, предпочтительно тех опухолей и раковых заболеваний, которые описаны в настоящем документе. Предпочтительно такие клетки не являются плацентарными клетками. Cells in which CLDN6 is expressed and which have the protein associated with their surface are preferably tumor cells or cancer cells, preferably those tumors and cancers described herein. Preferably, such cells are not placental cells.
Предпочтительные раковые заболевания и злокачественные опухоли по данному изобретению выбирают из группы, состоящей из рака яичника, в том числе аденокарциномы яичника и тератокарциномы яичника, рака легких, в том числе мелкоклеточного рака легких (SCLC) и немелкоклеточного рака легких (NSCLC), в особенности плоскоклеточной карциномы легких и аденокарциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака кожи, в частности базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы, злокачественной меланомы, рака головы и шеи, в том числе злокачественной полиморфной аденомы, саркомы, в частности синовиальной саркомы и карциносаркомы, рака желчного протока, рака мочевого пузыря, в частности переходноклеточной карциномы и папиллярной карциномы, рака почек, в частности почечно-клеточной карциномы, включая светлоклеточную почечно-клеточную карциному и папиллярную почечно-клеточную карциному, рака толстого кишечника, рака тонкого кишечника, включая рак подвздошной кишки, в частности аденокарциному тонкого кишечника и аденокарциному подвздошной кишки, эмбриональной карциномы яичка, хориокарциномы плацентарной площадки, рака шейки матки, рака яичка, в частности семиномы яичка, тератомы яичка и эмбрионального рака яичка, рака матки, герминогенных опухолей, например тератокарциномы или эмбриональной карциномы, в частности герминогенной опухоли яичка, и их метастазирующих форм.Preferred cancers and malignancies of the present invention are selected from the group consisting of ovarian cancer, including ovarian adenocarcinoma and ovarian teratocarcinoma, lung cancer, including small cell lung cancer (SCLC) and non-small cell lung cancer (NSCLC), especially squamous cell lung carcinoma and adenocarcinoma, stomach cancer, breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, skin cancer, in particular basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma, malignant melanoma, head and neck cancer, including malignant polymorphic adenoma, sarcoma, in particular synovial sarcoma and carcinosarcoma, bile duct cancer, bladder cancer, in particular transitional cell carcinoma and papillary carcinoma, kidney cancer, in particular renal cell carcinoma, including clear cell renal cell carcinoma and papillary renal cell carcinoma, colon cancer, small intestine cancer , including ileal cancer, in particular adenocarcinoma of the small intestine and adenocarcinoma of the ileum, embryonal testicular carcinoma, placental site choriocarcinoma, cervical cancer, testicular cancer, in particular testicular seminoma, testicular teratoma and embryonal testicular cancer, uterine cancer, germ cell tumors, e.g. teratocarcinoma or embryonal carcinoma, in particular testicular germ cell tumor, and their metastatic forms.
Основными типами рака легкого являются мелкоклеточная карцинома легкого (SCLC) и немелкоклеточная карцинома легкого (NSCLC). Немелкоклеточную карциному легкого подразделяют на три основных подтипа: плоскоклеточная карцинома легкого, аденокарцинома и крупноклеточная карцинома легкого. На долю аденокарциномы приходится приблизительно 10% всех случаев рака легких. Раковые поражения этого вида обычно заметны на периферии легких - в противоположность мелкоклеточному и плоскоклеточному раку, которым свойственна более центральная локализация.The main types of lung cancer are small cell lung carcinoma (SCLC) and non-small cell lung carcinoma (NSCLC). Non-small cell lung carcinoma is divided into three main subtypes: squamous cell lung carcinoma, adenocarcinoma, and large cell lung carcinoma. Adenocarcinoma accounts for approximately 10% of all lung cancer cases. Cancerous lesions of this type are usually visible on the periphery of the lungs - in contrast to small cell and squamous cell carcinomas, which are characterized by a more central localization.
Рак кожи - это злокачественные новообразования в коже. Наиболее распространенными раковыми заболеваниями кожи являются базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак и меланома. Злокачественная меланома - весьма агрессивное заболевание. Оно обусловлено неконтролируемым ростом пигментных клеток, называемых меланоцитами. Skin cancer is a malignant growth of the skin. The most common skin cancers are basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, and melanoma. Malignant melanoma is a very aggressive disease. It is caused by the uncontrolled growth of pigment cells called melanocytes.
По данному изобретению карцинома (рак) - это злокачественная опухоль, происходящая из эпителиальных клеток того или иного органа. According to this invention, carcinoma (cancer) is a malignant tumor originating from the epithelial cells of a particular organ.
Бронхиолярная карцинома - это рак легкого, происходящий, как полагают, из эпителия мелких дыхательных путей (бронхиол); при этом заболевании неопластическая ткань простирается вдоль стенок альвеол и прорастает небольшими массами внутри альвеол. В некоторых клетках обнаруживается муцин, который присутствует и в альвеолах, где также имеются денудированные клетки. Bronchiolar carcinoma is a lung cancer believed to originate from the epithelium of the small airways (bronchioles); In this disease, neoplastic tissue extends along the walls of the alveoli and grows in small masses within the alveoli. Some cells contain mucin, which is also present in the alveoli, where there are also denudated cells.
Аденокарцинома - это опухоль, происходящая из железистой ткани. Железистая ткань относится к эпителиальной ткань, которая включат кожу, железы и разнообразные выстилки полостей и органов. В процессе эмбрионального развития эпителий происходит из эктодермы, эндодермы или мезодермы. Для того чтобы клетки можно было назвать аденокарциномными, они не обязательно должны быть частью железы - достаточно того, что они способны к секреции. Такая карцинома встречается у высших животных и человека. Высоко дифференцированная аденокарцинома похожа на железистую ткань, из которой она происходит, тогда как малодифференцированная аденокарцинома может быть на нее вовсе не похожа. Путем окрашивания клеток в материале биопсии патологоанатом может определить, является рассматриваемая опухоль аденокарциномой или же иным злокачественным образованием. Аденокарциномы могут возникать в различных тканях организма, поскольку те или иные железы имеются в нем повсюду. У каждой железы свой специфический состав секрета, но всякая клетка, обладающая экзокринной функцией, считается железистой, и ее злокачественная форма называется аденокарциномной. Злокачественные аденокарциномы прорастают в другие ткани и часто дают метастазы, если развивались достаточно долго. Наиболее частый тип карциномы яичника - аденокарцинома. Аденокарцинома яичника включает серозную, муцинозную, светлоклеточную и эндометриоидную аденокарциномы. Adenocarcinoma is a tumor originating from glandular tissue. Glandular tissue refers to epithelial tissue, which includes the skin, glands, and various linings of cavities and organs. During embryonic development, the epithelium originates from the ectoderm, endoderm, or mesoderm. In order for cells to be called adenocarcinoma, they do not have to be part of the gland - it is enough that they are capable of secretion. This type of carcinoma occurs in higher animals and humans. Well-differentiated adenocarcinoma resembles the glandular tissue from which it originates, whereas poorly differentiated adenocarcinoma may not resemble it at all. By staining the cells in the biopsy material, the pathologist can determine whether the tumor in question is an adenocarcinoma or another malignancy. Adenocarcinomas can occur in various tissues of the body, since certain glands are present throughout the body. Each gland has its own specific secretion composition, but any cell that has an exocrine function is considered glandular, and its malignant form is called adenocarcinoma. Malignant adenocarcinomas grow into other tissues and often metastasize if they develop long enough. The most common type of ovarian carcinoma is adenocarcinoma. Ovarian adenocarcinoma includes serous, mucinous, clear cell and endometrioid adenocarcinoma.
Цистаденокарцинома - это злокачественная форма поверхностной эпителиально-стромальной опухоли, разновидность рака яичника.Cystadenocarcinoma is a malignant form of superficial epithelial-stromal tumor, a type of ovarian cancer.
Поверхностные эпителиально-стромальные опухоли - это группа неопластических образований в яичнике, которые, как считается, происходят из поверхностного эпителия яичника (видоизмененного перитонеума) или из эктопической эндометриоидной ткани либо ткани фаллопиевой трубы. Такие опухоли составляют большинство всех онкологических поражений яичника.Superficial epithelial-stromal tumors are a group of neoplastic formations of the ovary that are thought to originate from the superficial epithelium of the ovary (modified peritoneum) or from ectopic endometrioid or fallopian tube tissue. Such tumors make up the majority of all ovarian cancers.
Тератокарциномой называют герминогенную опухоль, представляющую собой смесь тератомы и эмбриональной карциномы, или хориокарциномы, или той и другой. Хориокарцинома - это злокачественная трофобластическая опухоль, весьма агрессивная, обычно развивающаяся из плаценты. Для нее характерно раннее распространение через кровь в легкие. Teratocarcinoma is a germ cell tumor that is a mixture of teratoma and embryonal carcinoma, or choriocarcinoma, or both. Choriocarcinoma is a malignant trophoblastic tumor, highly aggressive, usually arising from the placenta. It is characterized by early spread through the blood to the lungs.
Саркома - это рак соединительной ткани (костной, хрящевой, жировой), при котором происходит пролиферация клеток, происходящих из мезодермы, в отличие от карцином, происхождение которых эпителиальное. Синовиальная саркома - это довольно редко встречающееся раковое поражение мягких тканей в области суставов конечностей.Sarcoma is a cancer of connective tissue (bone, cartilage, fat), in which proliferation of cells originating from the mesoderm occurs, in contrast to carcinomas, whose origin is epithelial. Synovial sarcoma is a fairly rare cancer of soft tissue in the joints of the extremities.
Почечноклеточная карцинома, известная также под названиями «почечноклеточный рак» или «почечноклеточная аденокарцинома», - это рак почек, развивающийся и выстилки проксимальных извитых канальцев, где происходит фильтрация крови и удаляются отходы. На сегодняшний день почечноклеточная карцинома является наиболее распространенным раковым поражением почек у взрослых; из всех опухолей мочеполовой системы это раковое заболевание отличается наивысшей летальностью. Почечноклеточная карцинома подразделяется на светлоклеточную и папиллярную. Светлоклеточная почечноклеточная карцинома встречается чаще других форм почечноклеточной карциномы. Клетки светлоклеточной почечноклеточной карциномы под микроскопом выглядят очень бледными или прозрачными. Также часто встречается папиллярная почечноклеточная карцинома. При этом заболевании в большинстве случаев опухоль образует характерные небольшие пальцевидные выросты (папиллы). Renal cell carcinoma, also known as renal cell carcinoma or renal cell adenocarcinoma, is a cancer of the kidney that develops in the lining of the proximal convoluted tubule, where blood is filtered and waste is removed. Today, renal cell carcinoma is the most common kidney cancer in adults; Of all tumors of the genitourinary system, this cancer has the highest mortality rate. Renal cell carcinoma is divided into clear cell and papillary. Clear cell renal cell carcinoma is more common than other forms of renal cell carcinoma. Clear cell renal cell carcinoma cells appear very pale or clear under a microscope. Papillary renal cell carcinoma is also common. In most cases, the tumor forms characteristic small finger-like projections (papillae).
Герминогенная опухоль - это новообразование, происходящее из клеток зародышевой линии. Герминогенные опухоли могут быть злокачественными (раковыми) либо доброкачественными. Клетки зародышевой линии в норме находятся в гонадах (яичниках или семенниках). Герминогенные опухоли, возникающие вне гонад (например, в области головы и шеи, во рту, в тазовой области; в эмбрионах, у новорожденных и маленьких детей - чаще всего по средней линии тела, в частности на конце копчика) могут быть врожденными дефектами, возникшими вследствие ошибок в ходе индивидуального развития. A germ cell tumor is a neoplasm that originates from germline cells. Germ tumors can be malignant (cancerous) or benign. Germline cells are normally found in the gonads (ovaries or testes). Germ tumors that occur outside the gonads (eg, in the head and neck, mouth, pelvis; in fetuses, newborns, and young children - most often along the midline of the body, particularly at the tip of the coccyx) may be birth defects arising due to errors in the course of individual development.
Различают два основных класса герминогенных опухолей - семиномы и несеминомные опухоли. Последние включают тератокарциномы, эмбриональные карциномы, опухоли желточного мешка, хориокарциномы и дифференцированные тератомы. Большинство клеточных линий, полученные из несеминомных опухолей, эквивалентны эмбриональным карциномам, т.е. они состоят полностью из стволовых клеток, не дифференцирующихся при обычных условиях, хотя некоторые такие опухоли могут реагировать на индукторы дифференцировки, например на ретиноевую кислоту. There are two main classes of germ cell tumors: seminomas and nonseminoma tumors. The latter include teratocarcinomas, embryonal carcinomas, yolk sac tumors, choriocarcinomas, and differentiated teratomas. Most cell lines derived from nonseminoma tumors are equivalent to embryonal carcinomas, i.e. they are composed entirely of stem cells that do not differentiate under normal conditions, although some such tumors may respond to differentiation inducers such as retinoic acid.
Метастаз - это результат распространения раковых клеток из места первоначального злокачественного поражения в другие части тела. Метастазирование, т.е. образование метастазов, представляет собой очень сложный процесс, зависящий от отделения злокачественных клеток от первичной опухоли, их внедрения в межклеточный матрикс, проникновения через базальную мембрану и эндотелий в полости тела и в просвет сосудов, переноса кровью и включения в органы-мишени. Когда образовалась новая опухоль, ее рост зависит от прорастания ее сосудами. Метастазы нередко образуются даже после удаления первичной опухоли, потому что в организме могут остаться опухолевые клетки или компоненты, способные к метастазированию. В одном из воплощений данного изобретения термин «метастаз» относится к отдаленным метастазам, т.е. находящимся вне области распространения от первичной опухоли по лимфатическим сосудам и узлам в регионе пораженного органа.Metastasis is the result of cancer cells spreading from the site of the original malignant lesion to other parts of the body. Metastasis, i.e. the formation of metastases is a very complex process that depends on the separation of malignant cells from the primary tumor, their penetration into the intercellular matrix, penetration through the basement membrane and endothelium into the body cavities and into the lumen of blood vessels, transport by blood and inclusion in target organs. When a new tumor has formed, its growth depends on the germination of its blood vessels. Metastases often form even after the primary tumor is removed, because tumor cells or components capable of metastasizing may remain in the body. In one embodiment of the present invention, the term "metastasis" refers to distant metastases, i.e. located outside the area of spread from the primary tumor through the lymphatic vessels and nodes in the region of the affected organ.
Клетки вторичной опухоли (метастаза) такие же, как в первичной опухоли. Это означает, например, что если рак яичника метастазирует в печень, то вторичная опухоль состоит из аномальных клеток яичника, а не из аномальных клеток печени. Соответственно, эта опухоль в печени называется метастатическим раком яичника, а не раком печени. The cells of the secondary tumor (metastasis) are the same as those in the primary tumor. This means, for example, that if ovarian cancer metastasizes to the liver, the secondary tumor consists of abnormal ovarian cells rather than abnormal liver cells. Accordingly, this tumor in the liver is called metastatic ovarian cancer and not liver cancer.
Термин «лечение» означает введение пациенту описанного в настоящем документе вещества или композиции с целью предотвратить или ликвидировать болезнь, включая уменьшение опухоли в размерах или числа опухолей у данного больного; приостановление или замедление прогрессирования заболевания; ингибирование или замедление развития нового заболевания у данного пациента; снижение частоты проявления или тяжести симптомов и/или рецидивирования у пациента, у которого на данный момент имеет место рак или же он был ранее; и/или продление, т.е. увеличение продолжительности, жизни больного. The term “treatment” means administering to a patient a substance or composition described herein for the purpose of preventing or eliminating a disease, including reducing the tumor size or number of tumors in that patient; stopping or slowing the progression of the disease; inhibiting or slowing the development of a new disease in a given patient; reducing the incidence or severity of symptoms and/or recurrence in a patient who currently has or has previously had cancer; and/or extension, i.e. increasing the patient's life expectancy.
Термин «лечение заболевания» включает излечение, сокращение продолжительности болезненного состояния, ослабление его тяжести, предотвращение развития или ингибирование прогрессирования патологического процесса или ухудшения состояния больного или задержка начала развития заболевания или его симптомов. The term “treating a disease” includes curing, shortening the duration of a disease state, reducing its severity, preventing the development or inhibiting the progression of a disease process or deterioration of a patient's condition, or delaying the onset of a disease or its symptoms.
Выражения «находиться в группе риска», «существует риск развития заболевания», «повышен риск развития заболевания» означают, что для данного индивида (больного, пациента) вероятность развития того или иного заболевания, в частности рака, выше «нормальной», т.е. средней, в данной популяции. Кроме того, риск развития заболевания, в частности рака, повышен для индивидов, у которых было данное заболевание в прошлом или оно имеется в настоящее время, так как у такого индивида возможно продолжение развития этого заболевания. Для индивидов, у которых был или имеется в настоящее время рак, также повышена вероятность метастазирования рака.The expressions “to be at risk”, “there is a risk of developing a disease”, “increased risk of developing a disease” mean that for a given individual (patient) the probability of developing a particular disease, in particular cancer, is higher than “normal”, i.e. e. average in this population. In addition, the risk of developing a disease, particularly cancer, is increased for individuals who have had the disease in the past or currently have it, since such an individual may continue to develop the disease. Individuals who have had or currently have cancer also have an increased likelihood of cancer metastasis.
Термин «иммунотерапия» относится к лечению, при котором используются те или иные иммунологические процессы. В контексте настоящего изобретения термины «защищать», «предотвращать», «профилактический», «превентивный» или «защитный» относятся к предотвращению или лечению, или к тому и другому вместе возникновения и/или распространения опухоли у индивида. В контексте настоящего изобретения термин «иммунотерапия» предпочтительно относится к активной иммунизации или вакцинации опухоли. Профилактическое применение иммунотерапии, например введение композиции по данному изобретению, предпочтительно защищает пациента от развития опухолевого роста. Терапевтическое применение иммунотерапии, например терапевтическое введение композиции по данному изобретению, может вести к ингибированию развития/роста опухоли, включающему замедление развития/роста опухоли, в частности к прерыванию прогрессирования опухоли, что предпочтительно ведет к ее ликвидации. Применение иммунотерапии в лечебных целях может защитить индивида, например, от распространения или метастазирования существующей опухоли. The term "immunotherapy" refers to treatments that use certain immunological processes. As used herein, the terms “protect,” “prevent,” “prophylactic,” “prophylactic,” or “protective” refer to preventing or treating, or both, the occurrence and/or spread of a tumor in an individual. In the context of the present invention, the term "immunotherapy" preferably refers to active immunization or vaccination of a tumor. The prophylactic use of immunotherapy, for example the administration of a composition according to this invention, preferably protects the patient from the development of tumor growth. The therapeutic use of immunotherapy, for example the therapeutic administration of a composition according to this invention, can lead to inhibition of tumor development/growth, including inhibition of tumor development/growth, in particular to interruption of tumor progression, which preferably leads to its elimination. The use of immunotherapy for therapeutic purposes can protect an individual from, for example, the spread or metastasis of an existing tumor.
Термин «иммунизация» или «вакцинация» означает процесс введения индивиду антигена для того, чтобы вызывать у него иммунный ответ с целью лечения или профилактики. The term "immunization" or "vaccination" refers to the process of introducing an antigen to an individual in order to elicit an immune response for the purpose of treatment or prevention.
Термины «индивид», «особь», «больной», «пациент», «объект лечения/профилактики» или «организм» употребляются в настоящем документе как синонимы и относятся к позвоночным, предпочтительно к млекопитающим. Например, млекопитающие в контексте данного изобретения - это люди и другие приматы, домашние животные (собаки, кошки, овцы, крупный рогатый скот, козы, свиньи, лошади и проч.), лабораторные животные (мыши, крысы, кролики, морские свинки и др.), а также животные, содержащиеся в неволе (например, в зоопарке). Термин «животное» в настоящем документе включает также человека. Термины «индивид», «особь», «объект лечения/профилактики» могут также включать значение «пациент/больной», т.е. животное, предпочтительно человек, страдающий от той или иной болезни, предпочтительно от болезни, связанной с экспрессией CLDN6, предпочтительно от онкогенного заболевания, например рака.The terms “individual”, “individual”, “diseased”, “patient”, “treatment/prevention target” or “organism” are used interchangeably herein and refer to vertebrates, preferably mammals. For example, mammals in the context of this invention are humans and other primates, domestic animals (dogs, cats, sheep, cattle, goats, pigs, horses, etc.), laboratory animals (mice, rats, rabbits, guinea pigs, etc. .), as well as animals kept in captivity (for example, in a zoo). The term "animal" as used herein also includes a human. The terms “individual”, “individual”, “object of treatment/prevention” may also include the meaning “patient/sick”, i.e. an animal, preferably a human, suffering from a disease, preferably a disease associated with the expression of CLDN6, preferably an oncogenic disease, such as cancer.
Термин «адъювант» относится к веществам, которые продлевают или усиливают или ускоряют иммунный ответ. Композиции по данному изобретению предпочтительно оказывают свое действие без добавления адъювантов. Тем не менее, композиции по данной заявке на патент могут содержать любой известный адъювант. К адъювантам относятся различные вещества, например масляные эмульсии (например, адъювант Фрейнда и его модификации), минеральные вещества (например, квасцы), продукты бактериального происхождения (например, токсин Bordetella pertussis), липосомы, иммуностимулирующие комплексы. Примеры адъювантов: монофосфорил-липид--A (MPL SmithKline Beecham), сапонины, например QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, и QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), неполные адъюванты Фрейнда, полные адъюванты Фрейнда, витамин Е, монтанид, квасцы, СpG-олигонуклеотиды (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549) и различные эмульсии типа «вода в масле», получаемые из масел, подлежащих биологическому расщеплению, например скваленов и/или токоферола. The term "adjuvant" refers to substances that prolong or enhance or accelerate the immune response. The compositions of this invention preferably exert their effect without the addition of adjuvants. However, the compositions of this patent application may contain any known adjuvant. Adjuvants include various substances, for example, oil emulsions (for example, Freund's adjuvant and its modifications), mineral substances (for example, alum), products of bacterial origin (for example, Bordetella pertussis toxin), liposomes, immunostimulating complexes. Examples of adjuvants: monophosphoryl lipid-A (MPL SmithKline Beecham), saponins such as QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, and QS-L1 (So et al. , 1997, Mol. Cells 7: 178-186), incomplete Freund's adjuvants, complete Freund's adjuvants, vitamin E, montanide, alum, CpG oligonucleotides (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549) and various emulsions such as “water in oil”, obtained from oils subject to biodegradation, such as squalene and/or tocopherol.
По данному изобретению образец может быть любым, какой можно использовать соответственно настоящему описанию, в частности биологическим образцом, например образцом ткани, включая жидкости тела и/или клеточные образцы, и который может быть получен обычными методами, например путем биопсии, включая пункционную биопсию, путем забора крови, бронхиального аспирата, мокроты, мочи, кала или иных жидкостей тела. По данному изобретению термин «биологический образец» также включает фракции биологических образцов.According to the present invention, the sample can be any one that can be used according to the present description, in particular a biological sample, for example a tissue sample, including body fluids and/or cellular samples, and which can be obtained by conventional methods, for example by biopsy, including needle biopsy, by collection of blood, bronchial aspirate, sputum, urine, feces or other body fluids. For purposes of this invention, the term "biological sample" also includes fractions of biological samples.
Термин «антитело» относится к гликопротеинам, содержащим по меньшей мере две тяжелых (Н) цепи и две легких (L) цепи, соединенных между собой дисульфидными связями, и включает любое вещество/молекулу, содержащую участок, связывающий антиген. Термин «антитела» включает моноклональные антитела и их фрагменты или производные, в том числе (перечисленные здесь примеры не являются ограничивающими): человеческие моноклональные антитела, гуманизированные моноклональные антитела, гибридные моноклональные антитела, одноцепочечные антитела, например scFv, и фрагменты антител, связывающие антиген, например фрагменты Fab и Fab'; также этот термин включает все рекомбинантные формы антител, (например, антитела, экспрессирующиеся у прокариот), дегликозилированные антитела и любые антиген-связывающие фрагменты и производные, описанные в настоящем документе. Каждая тяжелая цепь антитела состоит из вариабельной области (обозначается сокращением VH) и константной области. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области (сокращенно VL) и константной области. Области VH и VL можно далее подразделить на гипервариабельные участки, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), между которыми имеются более консервативные по структуре участки, называемые каркасными (FR). Каждая вариабельная область как легкой, так и тяжелой цепи образована тремя CDR и четырьмя FR, располагающимися в следующем порядке (считая от N-конца к С-концу полипептидной цепи): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области легких и тяжелых цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание молекулы иммуноглобулина с тканями или факторами собственного организма, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) системы комплемента.The term "antibody" refers to glycoproteins containing at least two heavy (H) chains and two light (L) chains linked together by disulfide bonds, and includes any substance/molecule containing an antigen-binding site. The term "antibodies" includes monoclonal antibodies and fragments or derivatives thereof, including (the examples listed herein are not limiting): human monoclonal antibodies, humanized monoclonal antibodies, hybrid monoclonal antibodies, single chain antibodies, such as scFv, and antigen binding antibody fragments, for example Fab and Fab' fragments; the term also includes all recombinant forms of antibodies (eg, antibodies expressed in prokaryotes), deglycosylated antibodies, and any antigen-binding fragments and derivatives described herein. Each antibody heavy chain consists of a variable region (abbreviated VH) and a constant region. Each light chain consists of a variable region (abbreviated VL) and a constant region. The VH and VL regions can be further subdivided into hypervariable regions called complementarity determining regions (CDRs), between which there are more structurally conserved regions called framework (FR). Each variable region of both the light and heavy chains is formed by three CDRs and four FRs, arranged in the following order (counting from the N-terminus to the C-terminus of the polypeptide chain): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The variable regions of the light and heavy chains contain a binding domain that interacts with the antigen. Antibody constant regions can mediate the binding of an immunoglobulin molecule to tissues or factors of the body's own, including various cells of the immune system (eg, effector cells) and the first component (Clq) of the complement system.
По данному изобретению выражение «по меньшей мере одна из последовательностей CDR» предпочтительно означает по меньшей мере одну последовательность CDR3. Выражение «последовательности CDR цепи антитела» предпочтительно относится к участкам CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой или легкой цепи антитела. In the present invention, the expression “at least one of the CDR sequences” preferably means at least one CDR3 sequence. The expression “antibody CDR sequences” preferably refers to the CDR1, CDR2 and CDR3 regions of the heavy or light chain of an antibody.
По данному изобретению если указывается, что какая-либо цепь антитела содержит конкретную последовательность CDR, например последовательность CDR3, это означает, что указанная конкретная последовательность CDR либо образует участок CDR, например участок CDR3 указанной цепи антитела (то есть участок CDR состоит из указанной конкретной последовательности CDR), либо образует часть участка CDR, например участка СDR3 указанной цепи антитела (то есть участок CDR содержит указанную конкретную последовательность CDR).According to the present invention, if a particular antibody chain is stated to contain a particular CDR sequence, such as a CDR3 sequence, it means that the particular CDR sequence either forms a CDR region, such as the CDR3 region of the specified antibody chain (i.e., the CDR region consists of the specified specific sequence CDR), or forms part of a CDR region, such as the CDR3 region of the specified antibody chain (that is, the CDR region contains the specified specific CDR sequence).
Если по данному изобретению указывается, что антитело содержит конкретную тяжелую цепь и/или конкретную легкую цепь, например цепь, содержащую определенные последовательности CDR, то предпочтительно, чтобы обе тяжелые цепи и/или обе легкие цепи данного антитела каждая состояли из определенной тяжелой цепи и/или определенной легкой цепи. If the present invention specifies that an antibody contains a particular heavy chain and/or a particular light chain, for example a chain containing particular CDR sequences, then it is preferred that both heavy chains and/or both light chains of the antibody each consist of a particular heavy chain and/or or a specific light chain.
Термин «гуманизированные антитела» относится к молекулам, в которых имеется антиген-связывающий участок, происходящий в основном из нечеловеческого иммуноглобулина, а остальная часть молекулы имеет основой последовательность и/или структуру человеческого иммуноглобулина. У такого антитела антиген-связывающий участок может содержать либо полностью вариабельные домены, присоединенные с константным доменам, либо только области, определяющие комплементарность (CDR), присоединенные к каркасным участкам вариабельных доменов. Участки, связывающие антиген, при этом могут быть нативными или же модифицированными путем одной или более аминокислотных замен, например модифицированными таким образом, чтобы было больше сходство с иммуноглобулинами человека. В некоторых формах гуманизированных антител сохраняются все последовательности CDR (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все шесть последовательностей CDR из мышиного антитела). В других формах гуманизированных антител имеется одна или более последовательностей CDR, измененных по сравнению с исходным антителом. The term “humanized antibodies” refers to molecules that have an antigen-binding region derived primarily from a non-human immunoglobulin and the remainder of the molecule is based on the sequence and/or structure of a human immunoglobulin. In such an antibody, the antigen-binding region may contain either the entire variable domains attached to the constant domains, or only the complementarity determining regions (CDRs) attached to the framework regions of the variable domains. The antigen binding sites may be native or modified by one or more amino acid substitutions, for example modified to be more similar to human immunoglobulins. Some forms of humanized antibodies retain all CDR sequences (for example, a humanized mouse antibody that contains all six CDR sequences from a mouse antibody). Other forms of humanized antibodies have one or more CDR sequences that are changed from the original antibody.
Термин «гибридные антитела» относится к таким антителам, в которых одна часть каждой аминокислотной последовательности как легких, так и тяжелых цепей гомологична соответствующим последовательностям антител, происходящих от определенного вида животных или принадлежащим к определенному классу, в то время как остальная часть той же гомологична соответствующим последовательностям других антител. Обычно вариабельные области как легких, так и тяжелых цепей походят на вариабельные области антител, происходящих от одного вида млекопитающих, а константные части гомологичны последовательностям антител, происходящих от другого вида. Одно из явных преимуществ таких гибридных форм состоит в том, что вариабельная область может происходить из известных источников, что удобно, так как можно использовать легко доступные В-клетки или гибридомы от других (не от человека) организмов в сочетании с константными областями, происходящими из, например, препаратов человеческих клеток. Если вариабельные области сравнительно легко получить и их специфичность не зависит от источника, то константные области, будучи человеческими, с меньшей вероятностью вызовут иммунный ответ у человека при введении таких антител, чем вызывали бы константные области, происходящие от другого вида живых организмов. Впрочем, данное определение не ограничивается этим конкретным примером. The term "hybrid antibodies" refers to those antibodies in which one part of each amino acid sequence of both the light and heavy chains is homologous to the corresponding sequences of antibodies derived from a particular animal species or belonging to a particular class, while the rest of the same is homologous to the corresponding sequences of other antibodies. Typically, the variable regions of both the light and heavy chains are similar to the variable regions of antibodies originating from one species of mammal, and the constant portions are homologous to sequences of antibodies originating from another species. One of the distinct advantages of such hybrid forms is that the variable region can be derived from known sources, which is convenient since readily available B cells or hybridomas from non-human organisms can be used in combination with constant regions derived from , for example, preparations of human cells. If variable regions are relatively easy to obtain and their specificity is independent of source, then constant regions, being human, are less likely to elicit an immune response in humans when administered with such antibodies than would constant regions originating from another living organism. However, this definition is not limited to this specific example.
Термин «участок, связывающий антиген» (антиген-связывающий участок) антитела (или просто - «участок связывания») в настоящем документе относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном. Показано, что функция связывания антигена может осуществляться фрагментами антитела, т.е. вся его последовательность для этого не требуется. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антиген-связывающий участок», включают: (i) фрагменты Fab - одновалентные фрагменты, состоящие из доменов VL, VH, CL и CH; (ii) фрагменты F(ab')2 - двухвалентные фрагменты, содержащие два фрагмента Fab, соединенных дисульфидным «мостиком» в шарнирной области; (iii) фрагменты Fd, состоящие из доменов VH и CH; (iv) фрагменты Fv, состоящие из доменов VL и VH одного «плеча» молекулы антитела, (v) фрагменты dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), состоящие из домена VH; (vi) изолированные участки, определяющие комплементарность (CDR) и (vii) комбинации двух или более изолированных CDR, которые при необходимости могут быть соединены синтетической линкерной структурой. Также, хотя два домена фрагмента Fv - VL и VH - кодируются отдельными генами, их можно соединить, применяя технологию рекомбинантной ДНК, с помощью линкерной структуры, что позволяет получать их как единую полипептидную цепь, в которой области VL и VH составляют пару, образующую одновалентную молекулу (называемую одноцепочечным Fv, сокращенно scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела тоже охватываются термином «антиген-связывающий участок» антитела. Другой пример - гибридные белки типа «связывающий домен-иммуноглобулин», содержащие (i) полипептид, являющийся связывающим доменом и присоединенный к полипептиду, представляющему собой шарнирную область молекулы иммуноглобулина, (ii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулиновой молекулы CH2, присоединенную к шарнирной области, и (iii) константную область тяжелой цепи иммуноглобулиновой молекулы CH3, присоединенную к константной области CH2. Полипептид, формирующий связывающий домен, может быть вариабельной областью тяжелой цепи или вариабельной областью легкой цепи. Гибридные белки типа «связывающий домен-иммуноглобулин» также описаны в заявках на патент США 2003/0118592 и 2003/0133939. Эти фрагменты антител получены с применением обычных методов, известных специалистам в данной области техники; возможность практического использования таких фрагментов выявляется таким же образом, как интактных антител.The term “antigen-binding site” (antigen-binding region) of an antibody (or simply “binding site”) as used herein refers to one or more antibody fragments that retain the ability to specifically bind an antigen. It has been shown that the antigen binding function can be performed by antibody fragments, i.e. its entire sequence is not required for this. Examples of binding fragments encompassed by the term "antigen-binding region" include: (i) Fab fragments - monovalent fragments consisting of VL, VH, CL and CH domains; (ii) F(ab') 2 fragments - divalent fragments containing two Fab fragments connected by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) Fd fragments consisting of VH and CH domains; (iv) Fv fragments, consisting of the VL and VH domains of one arm of the antibody molecule, (v) dAb fragments (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), consisting of a VH domain; (vi) isolated complementarity determining regions (CDRs); and (vii) combinations of two or more isolated CDRs, which can optionally be connected by a synthetic linker structure. Also, although the two domains of the Fv fragment - VL and VH - are encoded by separate genes, they can be connected using recombinant DNA technology using a linker structure, which allows them to be obtained as a single polypeptide chain in which the VL and VH regions form a pair, forming a monovalent molecule (called single chain Fv, abbreviated scFv); see, for example, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Such single chain antibodies are also encompassed by the term "antigen-binding region" of an antibody. Another example is binding domain-immunoglobulin fusion proteins containing (i) a polypeptide that is a binding domain attached to a polypeptide that is the hinge region of an immunoglobulin molecule, (ii) a heavy chain constant region of an immunoglobulin molecule CH2 attached to the hinge region, and (iii) a CH3 immunoglobulin heavy chain constant region attached to a CH2 constant region. The polypeptide forming the binding domain may be a heavy chain variable region or a light chain variable region. Immunoglobulin binding domain fusion proteins are also described in US patent applications 2003/0118592 and 2003/0133939. These antibody fragments are prepared using conventional methods known to those skilled in the art; the possibility of practical use of such fragments is revealed in the same way as intact antibodies.
Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте молекулы, то есть к той части молекулы, которая распознается иммунной системой, например, которая распознается антителами. Например, эпитопы являются дискретными пространственными структурами на антигенной молекуле, распознаваемыми иммунной системой. В контексте настоящего изобретения эпитоп предпочтительно происходит из белка CLDN. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных группировок, например аминокислотных остатков или боковых цепей сахаров, и обладают специфическими свойствами в отношении пространственной структуры и электрического заряда. Различают конформационные и неконформационные эпитопы: первые утрачивают способность к связыванию в присутствии денатурирующих растворителей, а вторые нет. Эпитопы таких белков, как клаудины, предпочтительно содержат непрерывные (секвенциальные) или составные (прерывистые, комбинированные) участки указанных белков и содержат предпочтительно от 5 до 100, предпочтительно от 5 до 50, более предпочтительно от 8 до 30, наиболее предпочтительно от 10 до 25 аминокислотных остатков; например, эпитоп может быть длиной предпочтительно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислотных остатков.The term "epitope" refers to the antigenic determinant of a molecule, that is, that part of the molecule that is recognized by the immune system, for example, which is recognized by antibodies. For example, epitopes are discrete spatial structures on an antigenic molecule that are recognized by the immune system. In the context of the present invention, the epitope preferably comes from the CLDN protein. Epitopes typically consist of chemically active surface moieties, such as amino acid residues or sugar side chains, and have specific properties in terms of spatial structure and electrical charge. There are conformational and non-conformational epitopes: the former lose their ability to bind in the presence of denaturing solvents, while the latter do not. Epitopes of proteins such as claudins preferably contain continuous (sequential) or composite (discontinuous, combined) regions of these proteins and contain preferably from 5 to 100, preferably from 5 to 50, more preferably from 8 to 30, most preferably from 10 to 25 amino acid residues; for example, the epitope may be preferably 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 or 25 amino acid residues in length.
Термин «прерывистый (составной, комбинированный) эпитоп» в настоящем документе означает конформационный эпитоп на белковой антигенной молекуле, сформированный по меньшей мере двумя раздельными участками первичной структуры (аминокислотной последовательности) этого антигенного белка. The term “discontinuous epitope” as used herein means a conformational epitope on a protein antigenic molecule formed by at least two distinct regions of the primary structure (amino acid sequence) of that antigenic protein.
Термин «молекула с двойной специфичностью» («биспецифичная молекула») подразумевает любой агент, например белок, пептид или белковый или пептидный комплекс, который обладает двумя различными специфичностями связывания. Например, такая молекула может связываться (взаимодействовать) с (а) антигеном клеточной поверхности и (b) рецептором Fc на поверхности эффекторной клетки. Термин «полиспецифичная молекула» или «гетероспецифичная молекула» подразумевает любой агент, например белок, пептид или белковый или пептидный комплекс, который обладает более чем двумя различными специфичностями связывания. Например, такая молекула может связываться (взаимодействовать) с (а) антигеном клеточной поверхности и (b) рецептором Fc на поверхности эффекторной клетки (b) и (с) еще по меньшей мере с одним иным компонентом. Соответственно, данное изобретение включает (но не ограничивается перечисленным здесь) молекулы с двумя, тремя, четырьмя и многими специфичностями связывания, направленные CLDN6 и против других мишеней, например рецепторов Fc на эффекторных клетках. Термин «биспецифичные антитела» также включает диантитела. Диантитела представляют собой бивалентные биспецифичные антитела, в которых домены VH и VL синтезируются как единая полипептидная цепь, но с использованием линкерной структуры, слишком короткой, чтобы допустить объединение двух доменов одной и той же цепи, тем самым вынуждая соединяться комплементарные домены различных цепей, так что создаются два участка связывания антигена (см., например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). The term "dual-specific molecule" ("bispecific molecule") refers to any agent, such as a protein, peptide, or protein or peptide complex, that has two different binding specificities. For example, such a molecule may bind (interact) with (a) a cell surface antigen and (b) an Fc receptor on the surface of an effector cell. The term "multispecific molecule" or "heterospecific molecule" refers to any agent, such as a protein, peptide, or protein or peptide complex, that has more than two different binding specificities. For example, such a molecule may bind (interact) with (a) a cell surface antigen and (b) an Fc receptor on the surface of an effector cell (b) and (c) at least one other component. Accordingly, the present invention includes, but is not limited to, molecules with two, three, four, and multiple binding specificities directed against CLDN6 and other targets, such as Fc receptors on effector cells. The term "bispecific antibodies" also includes diantibodies. Diantibodies are bivalent bispecific antibodies in which the VH and VL domains are synthesized as a single polypeptide chain, but using a linker structure too short to allow two domains of the same chain to join, thereby forcing complementary domains of different chains to join, so that two antigen binding sites are created (see, for example, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).
В настоящем документе термин «гетероантитела» относится к двум или более антителам, производные или антиген-связывающие участки которых соединены вместе, причем по меньшей мере два из них обладают различной специфичностью. Эти различные специфичности включают специфичность связывания с рецептором Fc на эффекторных клетках и специфичность связывания с антигеном или эпитопом на клетке-мишени, например на опухолевой клетке.As used herein, the term “heteroantibodies” refers to two or more antibodies whose derivatives or antigen-binding regions are linked together, at least two of which have different specificities. These various specificities include specificity for binding to an Fc receptor on effector cells and specificity for binding to an antigen or epitope on a target cell, such as a tumor cell.
Антитела, описываемые в настоящем документе, могут быть человеческими. Термин «человеческое антитело» в данном описании подразумевает антитела, имеющие вариабельные и константные области, происходящие из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии человека. Человеческие антитела по данному изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые иммуноглобулиновыми последовательностями зародышевой линии человека (например, мутации, возникшие путем случайного или же направленного (сайт-специфического) мутагенеза in vitro или путем соматических мутаций in vivo. The antibodies described herein may be human. The term “human antibody” as used herein refers to antibodies having variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. The human antibodies of the present invention may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations arising by random or site-directed mutagenesis in vitro or by somatic mutations in vivo.
Термин «моноклональные антитела» в настоящем документе относится к препаратам антител, включающим молекулы одного состава и строения. Моноклональное антитело обладает единственной специфичностью связывания и сродством к определенному эпитопу. В одном из воплощений данного изобретения моноклональные антитела производятся гибридомами, включающими В-клетки, полученные от животных (не человека), например мыши, слитые с иммортализованными клетками. The term “monoclonal antibodies” as used herein refers to antibody preparations comprising molecules of the same composition and structure. A monoclonal antibody has a single binding specificity and affinity for a specific epitope. In one embodiment of the present invention, monoclonal antibodies are produced by hybridomas comprising B cells derived from non-human animals, such as mice, fused with immortalized cells.
Термин «рекомбинантные антитела» в настоящем документе включает все антитела, полученные, экспрессируемые, синтезируемые или выделяемые с помощью методов, использующих рекомбинацию, например (а) антитела, выделенные у животного (например, у мыши), трансгенного или трансхромосомного в отношении генов иммуноглобулинов, или из полученной из него гибридомы, (b) антитела,выделенные из клетки-хозяина, трансформированной таким образом, чтобы в ней экспрессировалось данное антитело, например из трансфектом, (с) антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител, и (d) антитела, полученные, экспрессируемые, синтезированные или выделенные любыми другими способами с использованием сплайсинга генов иммуноглобулинов с другими последовательностями ДНК.The term “recombinant antibodies” as used herein includes all antibodies produced, expressed, synthesized or isolated by methods utilizing recombination, for example (a) antibodies isolated from an animal (e.g., mouse) that is transgenic or transchromosomal for immunoglobulin genes, or from a hybridoma derived therefrom, (b) antibodies isolated from a host cell transformed to express the antibody, for example from a transfectome, (c) antibodies isolated from a recombinant antibody combinatorial library, and (d) antibodies , obtained, expressed, synthesized or isolated by any other means using splicing of immunoglobulin genes with other DNA sequences.
Термин «трансфектома» в настоящем документе включает рекомбинантные эукариотические клетки-хозяева, в которых экспрессируются антитела, например клетки СНО, NS/0, HEK293, HEK293T, растительные клетки или грибы, включая дрожжи. The term “transfectome” as used herein includes recombinant eukaryotic host cells in which antibodies are expressed, for example CHO cells, NS/0, HEK293, HEK293T, plant cells or fungi, including yeast.
Термин «гетерологичные антитела» в настоящем документе определяется относительно трансгенного организма, производящего такие антитела. Этот термин относится к антителам, обладающим аминокислотной последовательностью или кодирующей нуклеотидной последовательностью, соответствующей таковым у организма, не являющегося трансгенным, и происходящим, как правило, из организма не того вида, к которому относится трансгенный организм.The term “heterologous antibodies” as used herein is defined with respect to the transgenic organism producing such antibodies. This term refers to antibodies having an amino acid sequence or coding nucleotide sequence corresponding to that of an organism that is not transgenic, and usually originating from an organism of a species other than that of the transgenic organism.
Термин «гетерогибридные антитела» в настоящем документе относится к антителам, в которых легкие цепи и тяжелые цепи происходят от разных организмов. Например, антитела, в которых тяжелая цепь человеческая, а легкая цепь мышиная, являются гетерогибридными. The term “heterohybrid antibodies” as used herein refers to antibodies in which the light chains and heavy chains are derived from different organisms. For example, antibodies in which the heavy chain is human and the light chain is mouse are heterohybrid.
Данное изобретение включает все антитела и производные антител, описанные в настоящем документе, которые в целях данного изобретения охватываются термином «антитела». Термин «производные антител» относится к любым модифицированным формам антител, например к конъюгатам антител и иного агента или антитела, или фрагмента антитела. This invention includes all antibodies and antibody derivatives described herein, which for the purposes of this invention are encompassed by the term "antibodies". The term "antibody derivatives" refers to any modified forms of antibodies, such as conjugates of an antibody and another agent or an antibody or antibody fragment.
Антитела, описываемые в настоящем документе, являются предпочтительно изолированными. Под изолированными антителами в настоящем документе подразумеваются антитела в основном без примеси других антител с иными антигенными специфичностями (например, изолированные антитела, специфично связывающиеся с CLDN6, в основном не содержат антител специфично связывающихся с антигенами, отличными от CLDN6). Изолированные антитела, специфично связывающиеся с эпитопом, изоформой или вариантом человеческого CLDN6, могут, однако, проявлять перекрестную реактивность в отношении других, родственных антигенов, например от других видов живых организмов (например, гомологичных CLDN6). Кроме того, изолированное антитело в основном не содержит другой клеточный материал и/или химические вещества. В одном из воплощений данного изобретения «комбинация изолированных моноклональных антител» означает антитела с разными специфичностями, объединенные в определенной композиции. The antibodies described herein are preferably isolated. By isolated antibodies, as used herein, we mean antibodies substantially free of other antibodies with different antigen specificities (eg, isolated antibodies that specifically bind CLDN6 are substantially free of antibodies that specifically bind antigens other than CLDN6). Isolated antibodies that specifically bind to an epitope, isoform or variant of human CLDN6 may, however, exhibit cross-reactivity against other, related antigens, for example from other species (eg, homologous to CLDN6). In addition, the isolated antibody is substantially free of other cellular material and/or chemicals. In one embodiment of the present invention, “combination of isolated monoclonal antibodies” means antibodies with different specificities combined in a specific composition.
По данному изобретению антитела способны связываться с предопределенной мишенью, если они имеют значительное сродство к указанной предопределенной мишени и связываются с указанной предопределенной мишенью в стандартных аналитических системах наподобие описанных в настоящем документе. Предпочтительно антитела способны связываться с некоторой мишенью, если связывание указанных антител с указанной мишенью на поверхности интактных клеток можно выявить и измерить методом проточной цитометрии (FACS). Предпочтительно связывание антител с указанной мишенью можно выявить и измерить при концентрации антител 10 мкг/мл или меньше, 5 мкг/мл или меньше, либо 2 мкг/мл или меньше. Предпочтительно связывание антител с указанной мишенью можно выявить и измерить при концентрации антител 50 нМ или меньше, 30 нМ или меньше, либо 15 нМ или меньше. Сродство (сродство связывания) часто количественно определяют константой равновесия реакции диссоциации (KD). Предпочтительно термин «значительное сродство» относится к связыванию с предопределенной мишенью, для которого (KD) = 10-5 M или меньше, 10-6 M или меньше, 10-7 M или меньше, 10-8 M или меньше, 10-9 M или меньше, 10-10 M или меньше, 10-11 M или меньше, or 10-12 M или меньше. Для антител по данному изобретению предпочтительно величина EC50 при связывании с CLDN6 составляет 6500 нг/мл или меньше, 3000 нг/мл или меньше, 2500 нг/мл или меньше, 2000 нг/мл или меньше, 1500 нг/мл или меньше, 1000 нг/мл или меньше, 500 нг/мл или меньше, 400 нг/мл или меньше, 300 нг/мл или меньше, 200 нг/мл или меньше либо 100 нг/мл или меньше.According to this invention, antibodies are capable of binding to a predetermined target if they have significant affinity for the specified predetermined target and bind to the specified predetermined target in standard analytical systems such as those described herein. Preferably, the antibodies are capable of binding to a target if the binding of said antibodies to said target on the surface of intact cells can be detected and measured by flow cytometry (FACS). Preferably, the binding of antibodies to the specified target can be detected and measured at an antibody concentration of 10 μg/ml or less, 5 μg/ml or less, or 2 μg/ml or less. Preferably, antibody binding to said target can be detected and measured at antibody concentrations of 50 nM or less, 30 nM or less, or 15 nM or less. Affinity (binding affinity) is often quantified by the equilibrium constant of the dissociation reaction ( KD ). Preferably, the term "significant affinity" refers to binding to a predetermined target for which (K D ) = 10 -5 M or less, 10 -6 M or less, 10 -7 M or less, 10 -8 M or less, 10 - 9 M or less, 10 -10 M or less, 10 -11 M or less, or 10 -12 M or less. For the antibodies of the present invention, the EC 50 value for binding to CLDN6 is preferably 6500 ng/ml or less, 3000 ng/ml or less, 2500 ng/ml or less, 2000 ng/ml or less, 1500 ng/ml or less, 1000 ng/ml or less, 500 ng/ml or less, 400 ng/ml or less, 300 ng/ml or less, 200 ng/ml or less, or 100 ng/ml or less.
Антитела не способны (практически) связываться с данной мишенью, если отсутствует значительное сродство к указанной мишени и при использовании стандартных аналитических систем не выявляется значительного связывания этих антител с указанной мишенью. Предпочтительно, антитела не способны (практически0 связываться с данной мишенью, если при анализе методом проточной цитометрии (FACS) не выявляется связывания с указанной мишенью на поверхности интактных клеток. Предпочтительно связывание антител с указанной мишенью не выявляется при концентрации антител до 2 мкг/мл, предпочтительно до 5 мкг/мл, предпочтительно до 10 мкг/мл, предпочтительно до 20 мкг/мл, более предпочтительно до 50 мкг/мл, в особенности до 100 мкг/мл или до 150 мкг/мл, до 200 мкг/мл или более. Предпочтительно связывание антител с указанной мишенью не выявляется при концентрации антител до 15 нМ, предпочтительно до 30 нМ, предпочтительно до 50 н, предпочтительно до 100 нм, предпочтительно до 150 нм или до 170 нм, до 300 нм, до 600 нм, до 1000 нм, до 1300 нм или более. Предпочтительно связывание антител с указанной мишенью не выявляется при насыщающей концентрации антител для связывания с данной мишенью, т.е. с CLDN6. Предпочтительно значительное сродство антител к данной мишени отсутствует, если KD по меньшей мере в 10, 100, 103, 104, 105 или 106 раз больше, чем KD для связывания с предопределенной мишенью, с которой данные антитела способны связываться. Например, если KD для связывания данных антител с предопределенной мишенью, с которой они способны связываться, составляет 10-7 M, то KD для связывания этих антител с мишенью, к которой нет значительного сродства, будет по меньшей мере 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M или 10-1 M.Antibodies are (virtually) unable to bind to a given target unless there is significant affinity for the target and the antibodies are not found to bind to the target using standard assay systems. Preferably, antibodies are incapable of essentially binding to a given target if analysis by flow cytometry (FACS) does not detect binding to the specified target on the surface of intact cells. Preferably, the binding of antibodies to the specified target is not detected at antibody concentrations up to 2 μg/ml, preferably up to 5 μg/ml, preferably up to 10 μg/ml, preferably up to 20 μg/ml, more preferably up to 50 μg/ml, especially up to 100 μg/ml or up to 150 μg/ml, up to 200 μg/ml or more. Preferably, antibody binding to said target is not detected at antibody concentrations up to 15 nM, preferably up to 30 nM, preferably up to 50 nM, preferably up to 100 nM, preferably up to 150 nm or up to 170 nm, up to 300 nm, up to 600 nm, up to 1000 nm , up to 1300 nm or more. Preferably, antibody binding to the target is not detected at the saturating concentration of antibodies for binding to the target, i.e., CLDN6. Preferably, there is no significant antibody affinity for the target if KD at least 10, 100, 103, 104, 105 or 106 times greater than KD to bind to a predetermined target to which the antibodies are capable of binding. For example, if KD for the binding of these antibodies to a predetermined target with which they are able to bind is 10-7 M, then KD for these antibodies to bind to a target for which there is no significant affinity, there will be at least 10-6 M,10-5 M,10-4 M,10-3 M,10-2 M or 10-1 M.
Антитела являются специфичными к предопределенной мишени, если они способны связываться с указанной предопределенной мишенью, но не способны связываться с другими мишенями, т.е. не имеют значительного сродства к другим мишеням и в стандартных аналитических системах не выявляется значительного связывания с другими мишенями. По данному изобретению антитела являются специфичными в отношении CLDN6, если они способны связываться с CLDN6, но не способны связываться с другими мишенями, в частности с другими клаудиноывми белками, отличными от CLDN6, например с CLDN9, CLDN4, CLDN3 и CLDN1. Предпочтительно, антитела являются специфичными в отношении CLDN6, если сродство к другим клаудиновым белкам, отличным от CLDN6, например к CLDN9, CLDN4, CLDN3 и CLDN1, и связывание с ними не превышают существенно сродство и связывание с белками, не родственными клаудинам, например с бычьим сывороточным альбумином (BSA), казеином, человеческим сывороточным альбумином (HSA) или с неклаудиновыми трансмембранными белками, например с белками MHC или с рецептором трансферрина или с любым другим известным полипептидом. Предпочтительно антитела являются специфичными к предопределенной мишени, если они связываются с указанной мишенью с KD, величина которой по меньшей мере в 10, 100, 103, 104, 105 или 106 раз меньше, чем KD для связывания с мишенью, в отношении которой эти антитела не специфичны. Например, если KD для связывания данных антител с предопределенной мишенью, в отношении которой они специфичны, составляет 10-7 M, то KD для связывания этих антител с мишенью, к которой они не специфичны, будет по меньшей мере 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M или 10-1 M.Antibodies are specific for a predetermined target if they are able to bind to said predetermined target but are unable to bind to other targets, i.e. do not have significant affinity for other targets and do not show significant binding to other targets in standard analytical systems. According to the present invention, antibodies are specific for CLDN6 if they are able to bind to CLDN6, but are not able to bind to other targets, in particular to other claudin proteins other than CLDN6, for example CLDN9, CLDN4, CLDN3 and CLDN1. Preferably, the antibodies are specific for CLDN6 if the affinity for and binding to other claudin proteins other than CLDN6, such as CLDN9, CLDN4, CLDN3 and CLDN1, does not significantly exceed the affinity and binding to non-claudin proteins, such as bovine serum albumin (BSA), casein, human serum albumin (HSA) or non-claudin transmembrane proteins, such as MHC proteins or transferrin receptor or any other known polypeptide. Preferably, antibodies are specific for a predetermined target if they bind to said target with a K D that is at least 10, 100, 10 3 , 10 4 , 10 5 or 10 6 times less than the K D for binding to the target, for which these antibodies are not specific. For example, if the K D for binding of these antibodies to a predetermined target for which they are specific is 10 -7 M, then the K D for binding of these antibodies to a target for which they are not specific will be at least 10 -6 M. 10 -5 M, 10 -4 M, 10 -3 M, 10 -2 M or 10 -1 M.
Связывание антител с мишенью можно определить экспериментальным путем с помощью любого подходящего метода; см., например, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), и способов, описанных в настоящем документе. Сродство можно легко определить с помощью обычно применяемых для этой цели методов, например путем равновесного диализа; с помощью биосенсоров BIAcore 2000 путем стандартной процедуры согласно инструкциям производителя; путем радиоиммунологического анализа с использованием радиоактивно меченного антигена-мишени или любым другим путем, известным специалистам в данной области техники. Анализ данных по сродству можно проводить, например, по методу, описанному в работе Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). Численные значения параметров сродства для данного взаимодействия антитело-антиген могут варьировать в зависимости от условий их определения, например от концентрации солей, величины рН. Таким образом, определенные экспериментальным путем значения сродства иди других параметров, характеризующих взаимодействие антитела с антигеном, могут варьировать в зависимости от условий определения, например от концентрации солей и величины рН. Таким образом, при измерениях сродства и других параметров, характеризующих взаимодействие антитела с антигеном, например KD и IC50, предпочтительно использовать стандартизованные растворы антител и антигенов и стандартные буферные растворы. The binding of antibodies to the target can be determined experimentally using any suitable method; see, for example, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, NY (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, NY (1992), and the methods described herein. Affinity can be easily determined using methods commonly used for this purpose, for example by equilibrium dialysis; using
Уникальным свойством антител по данному изобретению является их способность связывать клаудин 6 клеточной поверхности. Это демонстрируется результатами анализа клеток, в которых экспрессируется клаудин 6, методом проточной цитометрии.A unique property of the antibodies of this invention is their ability to bind cell surface claudin 6. This is demonstrated by flow cytometry analysis of cells expressing claudin 6.
Для того, чтобы определить связывание моноклональных антител с живыми клетками, в которых экспрессируются клаудины, можно применить метод проточной цитометрии. Вкратце, поступают следующим образом. Клетки нужных линий, в которых экспрессируются связанные с мембраной клаудины, (выращенные в стандартных условиях культивирования) смешивают с раствором антител (в различной концентрации) в PBS, содержащем 2% инактивированной гагреванием FCS и 0,1% NaN3 при 4°C в течение 30 мин. Затем клетки промывают, после чего они взаимодействуют с флуоресцентно меченными вторыми антителами в тех же условиях, в каких проводилась реакция с первыми антителами. Образцы анализируют путем FACS, регистрируя прямое и боковое светорассеяние каждой отдельной клетки и определяют связывание меченых антител. In order to determine the binding of monoclonal antibodies to living cells in which claudins are expressed, flow cytometry can be used. Briefly, proceed as follows. Cells of the desired lines expressing membrane-bound claudins (grown under standard culture conditions) are mixed with a solution of antibodies (at various concentrations) in PBS containing 2% heat-inactivated FCS and 0.1% NaN 3 at 4°C for 30 min. The cells are then washed and reacted with fluorescently labeled second antibodies under the same conditions as the first antibodies. Samples are analyzed by FACS, recording forward and side scatter of light from each individual cell and determining the binding of labeled antibodies.
Термин «связывание» по данному изобретению относится предпочтительно к специфичному связыванию, определение которому дано выше.The term "binding" according to this invention refers preferably to specific binding, as defined above.
В настоящем документе термин «изотип» относится к классу антител (например, IgM или IgG1), которые кодируются генами константной области тяжелой цепи. As used herein, the term “isotype” refers to a class of antibodies (eg, IgM or IgG1) that are encoded by heavy chain constant region genes.
В настоящем документе термин «переключение изотипа» относится к явлению, состоящему в том, что синтез иммуноглобулинов переключается с одного изотипа (класса) на другой. As used herein, the term “isotype switching” refers to the phenomenon that the synthesis of immunoglobulins switches from one isotype (class) to another.
Термин «природный»/«встречающийся в природе» в настоящем документе употребляется применительно к объектам, которые можно найти в естественных условиях (в природе). Например, это полипептид или нуклеотидная последовательность, имеющиеся у какого-либо организма (включая вирусов), которые могут быть выделены из природного источника, которые не подвергались намеренной модификации человеком в лабораторных условиях и которые встречаются в природе.The term “natural”/“naturally occurring” is used in this document to refer to objects that can be found naturally (in nature). For example, it is a polypeptide or nucleotide sequence found in an organism (including viruses), that can be isolated from a natural source, that has not been intentionally modified by humans in a laboratory setting, and that occurs in nature.
Термин «перестроенный» в настоящем документе относится к иммуноглобулинам с такой конфигурацией тяжелой или легкой цепи, когда сегмент V располагается непосредственно рядом с сегментом D-J или J, что соответствует практически полному домену VH или VL cоответственно. Перестроенный локус генов иммуноглобулинов (антител) можно идентифицировать путем сравнения с ДНК клеток зародышевой линии: перестроенный локус должен иметь по меньшей мере один рекомбинировавший гомологичный элемент гептамер/нонамер. The term “rearranged” as used herein refers to immunoglobulins with a heavy or light chain configuration such that the V segment is located immediately adjacent to the D-J or J segment, corresponding to substantially the entire VH or VL domain, respectively. The rearranged immunoglobulin (antibody) gene locus can be identified by comparison with the DNA of germline cells: the rearranged locus must have at least one recombined homologous heptamer/nonamer element.
Термин «неперестроенный» или «конфигурация зародышевой линии» в настоящем документе применительно к сегменту V относится к конфигурации, в которой сегмент V не рекомбинировал таким образом, чтобы оказаться в непосредственном соседстве к сегменту D или J. The term “unrearranged” or “germline configuration” as used herein in relation to a V segment refers to a configuration in which the V segment has not recombined to be in close proximity to a D or J segment.
Термин «молекула нуклеиновой кислоты» в настоящем документе подразумевает молекулы ДНК и РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, предпочтительно это двухцепочечная (двуспиральная) ДНК. Молекулы нуклеиновых кислот могут использоваться для введения в клетки (трансфекции), например в форме РНК, которую можно получить in vitro путем транскрипции с ДНК-матрицы. Перед применением РНК может быть модифицирована путем стабилизации последовательности, кэпирования и полиаденилирования. The term "nucleic acid molecule" as used herein refers to DNA and RNA molecules. The nucleic acid molecule can be single-stranded or double-stranded, preferably double-stranded DNA. Nucleic acid molecules can be used for introduction into cells (transfection), for example in the form of RNA, which can be obtained in vitro by transcription from a DNA template. Before use, RNA can be modified by sequence stabilization, capping, and polyadenylation.
Нуклеиновые кислоты по данному изобретению, предпочтительно являются изолированными. Термин «изолированная нуклеиновая кислота» по данному изобретению означает, что данная нуклеиновая кислота была (i) амплифицирована in vitro, например с помощью полимеразной цепной реакции (PCR), (ii) произведена рекомбинантным образом путем клонирования, (iii) очищена, например, путем расщепления и фракционирования гель-электрофорезом или (iv) синтезирована, например химическим путем. Изолированная нуклеиновая кислота служит для использования в методах рекомбинантной ДНК. The nucleic acids of this invention are preferably isolated. The term "isolated nucleic acid" as used herein means that the nucleic acid has been (i) amplified in vitro, for example by polymerase chain reaction (PCR), (ii) produced recombinantly by cloning, (iii) purified, for example by digestion and fractionation by gel electrophoresis or (iv) synthesized, for example chemically. The isolated nucleic acid is used for use in recombinant DNA techniques.
Нуклеиновые кислоты по данному изобретению могут использоваться по отдельности или в сочетании с другими нуклеиновыми кислотами, которые могут быть гомологичными или гетерологичными. В предпочтительных воплощениях данного изобретения нуклеиновые кислоты функционально связаны с последовательностями. регулирующими экспрессию, которые могут быть гомологичными либо гетерологичными по отношению к данной нуклеиновой кислоте, причем термин «гомологичная» означает, что данная нуклеиновая кислота также естественным образом (от природы) функционально связана с последовательностями, регулирующими экспрессию, а термин «гетерологичная» означает, что данная нуклеиновая кислота функционально не связана естественным образом (от природы) с последовательностями, регулирующими экспрессию.The nucleic acids of this invention can be used alone or in combination with other nucleic acids, which may be homologous or heterologous. In preferred embodiments of the present invention, the nucleic acids are operably linked to the sequences. expression regulators that may be homologous or heterologous to a given nucleic acid, the term “homologous” meaning that the nucleic acid is also naturally (naturally) operably linked to expression regulatory sequences, and the term “heterologous” meaning that the nucleic acid is not functionally linked naturally to expression control sequences.
Нуклеиновая кислота, например нуклеиновая кислота для экспрессии РНК и/или белка или пептида, и последовательности, регулирующие экспрессию, являются функционально связанными друг с другом, если они ковалентно соединены таким образом, что экспрессия или транскрипция данной нуклеиновой кислоты оказывается под контролем или под влиянием данных регуляторных последовательностей. Если данная нуклеиновая кислота должна транслироваться с образованием функционального белка, то при наличии последовательности, регулирующей экспрессию, которая функционально связана с кодирующей последовательностью, индукция данной регуляторной последовательности приводит к транскрипции данной нуклеиновой кислоты без сдвига рамки считывания в этой кодирующей последовательности или данная кодирующая последовательность не может транслироваться с образованием желаемого белка или пептида.A nucleic acid, such as an RNA and/or protein or peptide expression nucleic acid, and expression control sequences are operably linked to each other if they are covalently linked such that the expression or transcription of the nucleic acid is controlled or influenced by the data regulatory sequences. If a given nucleic acid is to be translated to form a functional protein, then in the presence of an expression regulatory sequence that is operably linked to a coding sequence, induction of that regulatory sequence results in transcription of that nucleic acid without a frameshift in that coding sequence or the coding sequence cannot translated to form the desired protein or peptide.
Термин «последовательность, регулирующая экспрессию» (регуляторная последовательность) по данному изобретению включает промоторы, участки связывания с рибосомой, энхансеры и другие регуляторные элементы, влияющие на транскрипцию гена или трансляцию матричной РНК. В некоторых конкретных воплощениях данного изобретения последовательности, регулирующие экспрессию, могут в свою очередь регулироваться. Структура последовательностей, регулирующих экспрессию, может быть различной: она зависит от вида живого организма или типа клетки, но как правило в ней имеются 5`-не транскрибируемая и 5`- и 3`- не транслируемые последовательности, которые участвуют в инициации транскрипции и трансляции, соответственно, например ТАТА-бокс, кэп-последовательность, последовательность СААТ и проч. В частности, 5`-не транскрибируемая регуляторная последовательность содержит промоторный участок, который включает промоторную последовательность для регуляции транскрипции функционально сопряженной нуклеиновой кислоты. Последовательности, регулирующие экспрессию, могут также содержать энхансерные последовательности или вышерасположенные активирующие последовательности (UAS).The term "expression control sequence" (regulatory sequence) as used herein includes promoters, ribosome binding sites, enhancers, and other regulatory elements that influence gene transcription or messenger RNA translation. In some specific embodiments of the present invention, expression control sequences may themselves be regulated. The structure of sequences regulating expression can be different: it depends on the type of living organism or cell type, but as a rule it contains 5'-non-transcribed and 5'- and 3'-non-translated sequences that are involved in the initiation of transcription and translation , respectively, for example TATA box, cap sequence, CAAT sequence, etc. In particular, the 5' non-transcribed regulatory sequence contains a promoter region that includes a promoter sequence for regulating the transcription of an operably linked nucleic acid. Expression control sequences may also contain enhancer sequences or upstream activating sequences (UAS).
По данному изобретению термин «промотор» или «промоторная область»» относится к нуклеотидной последовательности, расположенной «выше», т.е. в направлении 5` от нуклеотидной последовательности, которая экспрессируется. и регулирующей экспрессию этой последовательности, содержа сайт узнавания и связывания с РНК-полимеразой. Промоторная область может включать другие сайты распознавания и связывания для других факторов, участвующих в регуляции транскрипции данного гена. Промотор может регулировать транскрипцию прокариотического или эукариотического гена. Также промотор может быть индуцируемым и инициировать транскрипцию в ответ на индуцирующий агент или же промотор может быть конститутивным (не индуцируемым) и тогда транскрипция не регулируется индуцирующим агентом. Ген, регулируемый индуцируемым промотором, в отсутствие индуцирующего агента не экспрессируется или экспрессируется лишь в небольшой степени. В присутствии индуцирующего агента ген «включается» или увеличивается уровень транскрипции. Это опосредуется, как правило, связыванием специфического фактора транскрипции.In this invention, the term "promoter" or "promoter region" refers to the nucleotide sequence located "upstream", i.e. in the 5` direction from the nucleotide sequence that is expressed. and regulating the expression of this sequence, containing a site for recognition and binding to RNA polymerase. The promoter region may include other recognition and binding sites for other factors involved in the regulation of transcription of a given gene. A promoter can regulate the transcription of a prokaryotic or eukaryotic gene. Also, the promoter can be inducible and initiate transcription in response to an inducing agent, or the promoter can be constitutive (not inducible) and then transcription is not regulated by the inducing agent. A gene regulated by an inducible promoter is not expressed or only expressed to a small extent in the absence of the inducing agent. In the presence of an inducing agent, the gene is “turned on” or the level of transcription increases. This is usually mediated by the binding of a specific transcription factor.
Промоторы, предпочтительные по данному изобретению, включают промоторы для полимераз SP6, T3 и T7, человеческий промотор U6, промотор CMV и искусственные гибридные промоторы (например, CMV), в которых какая-то часть (или части) соединена с частью (или частями) промоторов генов, кодирующих другие клеточные белки, например человеческую глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH), включая или не включая дополнительный интрон (интроны).Promoters preferred in this invention include the promoters for the SP6, T3 and T7 polymerases, the human U6 promoter, the CMV promoter, and artificial hybrid promoters (e.g., CMV) in which a portion(s) are coupled to a portion(s) promoters of genes encoding other cellular proteins, for example human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), including or not including additional intron(s).
По данному изобретению термин «экспрессия» употребляется в его наиболее общем значении и включает образование РНК или РНК и белка/пептида. Он также включает частичную экспрессию нуклеиновых кислот. Экспрессия может осуществляться временно (транзиентная экспрессия) или постоянно (стабильная экспрессия). По данному изобретению термин «экспрессия» также включает понятия «аберрантная экспрессия» и «аномальная экспрессия». As used herein, the term “expression” is used in its most general meaning and includes the production of RNA or RNA and protein/peptide. It also involves partial expression of nucleic acids. Expression can occur temporarily (transient expression) or permanently (stable expression). As used herein, the term “expression” also includes the terms “aberrant expression” and “abnormal expression”.
«Аберрантная экспрессия» или «аномальная экспрессия» по данному изобретению означает измененную экспрессию, предпочтительно усиленную, по сравнению с уровнем, принятым за нормальный, предпочтительно по сравнению с уровнем экспрессии в нормальных клетках (не онкогенных) или у здорового индивида. Усилением экспрессии считается повышение ее уровня на по меньшей мере 10%, в частности по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 50% или по меньшей мере на 100%. В одном из воплощений настоящего изобретения экспрессия имеет место только в пораженной ткани, тогда как в нормальной ткани она подавлена. "Aberrant expression" or "abnormal expression" as used herein means altered expression, preferably increased, compared to a level considered normal, preferably compared to the level of expression in normal cells (non-tumorigenic) or in a healthy individual. An increase in expression is considered to be an increase in its level by at least 10%, in particular by at least 20%, at least 50% or at least 100%. In one embodiment of the present invention, expression occurs only in diseased tissue, whereas in normal tissue it is suppressed.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты присутствует в векторе, где снабжена промотором, регулирующим экспрессию данной нуклеиновой кислоты. Термин «вектор» в настоящем документе употребляется в его наиболее общем значении и включает любое вспомогательное средство, позволяющее указанной нуклеиновой кислоте, например, проникнуть в прокариотические и/или эукариотические клетки и, если нужно, встроиться в геном. Такие векторы предпочтительно реплицируются и/или экспрессируются в клетках. Векторы включают плазмиды, фагмиды, бактериофаги или вирусные геномы. Термин «плазмида» в настоящем документе употребляется, как правило, применительно к конструкциям из внехромосомного генетического материала, обычно кольцевым двуспиральным ДНК, которые могут реплицироваться независимо от хромосомной ДНК.In a preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid molecule is present in a vector where it is provided with a promoter that regulates the expression of the nucleic acid. The term “vector” as used herein is used in its most general sense and includes any adjuvant that allows said nucleic acid, for example, to enter prokaryotic and/or eukaryotic cells and, if desired, integrate into the genome. Such vectors are preferably replicated and/or expressed in cells. Vectors include plasmids, phagemids, bacteriophages, or viral genomes. The term "plasmid" as used herein generally refers to constructs of extrachromosomal genetic material, typically circular double-stranded DNA, that can replicate independently of chromosomal DNA.
В качестве вектора для экспрессии антител можно использовать такие векторы, с которыми тяжелая цепь и легкая цепь антитела представлены разными векторами или же такие векторы, с которыми тяжелая цепь и легкая цепь антитела представлены в одном векторе. As a vector for the expression of antibodies, one can use vectors with which the heavy chain and the light chain of the antibody are represented by different vectors, or vectors with which the heavy chain and the light chain of the antibody are presented in one vector.
Содержащиеся в настоящем документе утверждения относительно конкретных нуклеиновых кислот и аминокислотных последовательностей, например приведенных в Списке последовательностей, подразумевают также модификации, то есть варианты, указанных конкретных последовательностей, в результате которых получаются последовательности, функционально эквивалентные указанным конкретным последовательностям, например аминокислотные последовательности, обладающие свойствами, идентичными таковым (или сходными с ними) данных конкретных последовательностей и нуклеотидных последовательностей, кодирующих эти аминокислотные последовательности, обладающие свойствами, идентичными таковым (или сходными с ними) аминокислотных последовательностей, кодируемых этими конкретными нуклеотидными последовательностями. Одно из важных свойств состоит в сохранении способности связываться со своей мишенью или поддерживать эффекторные функции антител, например комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), и/или антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC). Предпочтительно, когда последовательность, модифицированная по сравнению с какой-либо конкретной последовательностью, заменяет эту конкретную последовательность в молекуле антитела, сохраняются способность указанного антитела связываться с соответствующей мишенью и предпочтительно функции указанного антитела, как это описано в настоящем документе.Statements made herein regarding specific nucleic acids and amino acid sequences, such as those set forth in the Sequence Listing, also include modifications, i.e., variations, of the specific sequences that result in sequences that are functionally equivalent to the specific sequences, such as amino acid sequences having properties identical to (or similar to) those particular sequences and nucleotide sequences encoding those amino acid sequences having properties identical to (or similar to) those of the amino acid sequences encoded by those particular nucleotide sequences. One important property is the retention of the ability to bind to its target or support antibody effector functions, such as complement-dependent cytotoxicity (CDC) and/or antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Preferably, when a sequence modified from a particular sequence replaces that particular sequence in an antibody molecule, the ability of said antibody to bind to the corresponding target and preferably the functions of said antibody as described herein are retained.
Аналогично, содержащиеся в настоящем документе утверждения относительно конкретных антител или гибридом, производящих определенные антитела, следует относить также к антителам, отличающимся аминокислотной последовательностью и/или кодирующей ее нуклеотидной последовательностью, модифицированной по сравнению с аминокислотной последовательностью и/или кодирующей ее нуклеотидной последовательностью этих конкретных антител, но функционально им эквивалентным. Важным свойством является сохранение связывания антител с их мишенью или сохранение их эффекторной функции. Предпочтительно последовательность, модифицированная по сравнению с какой-либо конкретной последовательностью, заменяя последнюю в молекуле антитела, сохраняет способность связывания с данного антитела с его мишенью и предпочтительно функции данного антитела, например лизис, опосредованный CDC или ADCC. Likewise, statements made herein regarding specific antibodies or hybridomas producing specific antibodies should also apply to antibodies that differ in the amino acid sequence and/or nucleotide sequence encoding it, modified from the amino acid sequence and/or nucleotide sequence encoding it of those particular antibodies. , but functionally equivalent to them. An important property is the preservation of the binding of antibodies to their target or the preservation of their effector function. Preferably, the sequence modified from any particular sequence, replacing the latter in the antibody molecule, retains the ability of the antibody to bind to its target and preferably the function of the antibody, eg, CDC- or ADCC-mediated lysis.
Специалистам в данной области техники понятно, что, в частности, последовательности CDR, гипервариабельные и вариабельные области можно модифицировать без потери способности связываться с мишенью. Например, области CDR окажутся идентичны или высоко гомологичны областям антител, описанным в настоящем документе. Термин «высоко гомологичный» подразумевает, что в CDR может быть произведено от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, например от 1 до 3 или 1, или 2, замен. Кроме того, гипервариабельные и вариабельные области могут быть модифицированы таким образом, что они будут в значительной степени гомологичны определенным областям конкретных антител, описанных в настоящем документе. Those skilled in the art will understand that, in particular, CDR sequences, hypervariable regions and variable regions can be modified without losing the ability to bind the target. For example, the CDR regions will be identical or highly homologous to the regions of the antibodies described herein. The term “highly homologous” implies that 1 to 5, preferably 1 to 4, eg 1 to 3 or 1 or 2, substitutions can be made in the CDR. In addition, hypervariable and variable regions can be modified so that they are substantially homologous to certain regions of specific antibodies described herein.
Следует учитывать, что описанные в настоящем документе конкретные нуклеиновые кислоты также включают нуклеиновые кислоты, модифицированные ради оптимизации частоты использования кодонов в определенных хозяйских клетках или организме. Различия в частоте использования кодонов между организмами могут приводить к разнообразным проблемам, касающимся гетерологичной генной экспрессии. В результате оптимизации кодонов путем изменения одного или более нуклеотидов в исходной последовательности возможна оптимизация экспрессии данной нуклеиновой кислоты, в частности оптимизация эффективности трансляции, в гомологичном или гетерологичном организме-хозяине, у которого должна экспрессироваться данная нуклеиновая кислота. It should be appreciated that the specific nucleic acids described herein also include nucleic acids modified to optimize codon frequency in a particular host cell or organism. Differences in codon frequency between organisms can lead to a variety of problems regarding heterologous gene expression. As a result of codon optimization by changing one or more nucleotides in the original sequence, it is possible to optimize the expression of a given nucleic acid, in particular the optimization of translation efficiency, in a homologous or heterologous host organism in which the given nucleic acid is to be expressed.
По данному изобретению вариант, производное, модифицированная форма или фрагмент нуклеотидной последовательности, аминокислотной последовательности или пептида предпочтительно обладает функциональным свойством той нуклеотидной последовательности, аминокислотной последовательности или пептида, от которых они происходят. Такие функциональные свойства включают взаимодействие или связывание с другими молекулами. В одном из воплощений данного изобретения вариант, производное, модифицированная форма или фрагмент нуклеотидной последовательности, аминокислотной последовательности или пептида иммунологически эквивалентны той нуклеотидной последовательности, аминокислотной последовательности или пептида, от которых они происходят.According to the present invention, a variant, derivative, modified form or fragment of a nucleotide sequence, amino acid sequence or peptide preferably has a functional property of the nucleotide sequence, amino acid sequence or peptide from which it is derived. Such functional properties include interaction or binding with other molecules. In one embodiment of the present invention, a variant, derivative, modified form or fragment of a nucleotide sequence, amino acid sequence or peptide is immunologically equivalent to the nucleotide sequence, amino acid sequence or peptide from which it is derived.
Предпочтительно степень идентичности какой-либо нуклеотидной последовательности и нуклеотидной последовательности, модифицированной по сравнению с данной конкретной последовательностью, или являющейся ее вариантом, должна составлять по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.Preferably, the degree of identity of any nucleotide sequence and a nucleotide sequence modified from or a variant thereof should be at least 70%, preferably at least 75%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, or most preferably at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99%.
Что касается вариантов нуклеотидной последовательности, соответствующей CLDN6, то степень идентичности предпочтительно берется для области протяженностью по меньшей мере около 300, по меньшей мере около 400, по меньшей мере около 450, по меньшей мере около 500, по меньшей мере около 550, по меньшей мере около 600 или по меньшей мере около 630 нуклеотидов. В предпочтительных воплощениях данного изобретения степень идентичности берется для всей длины нуклеотидной последовательности, с которой проводится сравнение, например тех нуклеотидных последовательностей, которые приведены в Списке последовательностей. Предпочтительно, две нуклеотидные последовательности способны гибридизоваться друг с другом и образовывать стабильную двойную спираль предпочтительно, если это происходит в условиях, в которых возможна специфическая гибридизация полинуклеотидов (жесткие условия). Жесткие условия гибридизации описаны, например, в работах Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 или Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York и относятся, например, к гибридизации при температуре 65°C в буферном растворе (3,5 x SSC, 0,02% фикол, 0,02% поливинилпирролидон, 0,02%бычий сывороточный альбумин, 2,5 мM NaH2PO4 (pH 7), 0,5% SDS, 2 мM EDTA). Аббревиатурой SSC обозначен раствор 0,15 M хлорид натрия//0,15 M цитрат натрия, pH 7. После гибридизации мембрану, на которую шел перенос ДНК, промывают, например, дважды SSC при комнатной температуре и затем в 0,1-0,5 × SSC/0,1 × SDS при температуре до 68°C.With regard to nucleotide sequence variants corresponding to CLDN6, the degree of identity is preferably taken over a region of at least about 300, at least about 400, at least about 450, at least about 500, at least about 550, at least about 600 or at least about 630 nucleotides. In preferred embodiments of the present invention, the degree of identity is taken over the entire length of the nucleotide sequence to which comparison is made, for example those nucleotide sequences that are shown in the Sequence List. Preferably, the two nucleotide sequences are capable of hybridizing to each other and forming a stable double helix, preferably under conditions in which specific hybridization of the polynucleotides is possible (harsh conditions). Stringent hybridization conditions are described, for example, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 or Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York and refer, for example, to hybridization at 65°C in buffer solution (3.5 x SSC, 0.02% Ficol, 0.02% PVP , 0.02% bovine serum albumin, 2.5 mM NaH 2 PO 4 (pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA). The abbreviation SSC denotes a solution of 0.15 M sodium chloride//0.15 M sodium citrate, pH 7. After hybridization, the membrane to which the DNA was transferred is washed, for example, twice with SSC at room temperature and then with 0.1-0. 5 × SSC/0.1 × SDS at temperatures up to 68°C.
Термин «вариант» по данному изобретению также включает мутантов, варианты сплайсинга, конформации, изоформы, аллельные варианты, видовые варианты и видовые гомологи, в частности существующие в природе. Под аллельным вариантом понимается изменение в нормальной нуклеотидной последовательности гена, причем значение этого изменения зачастую остается неясным. При определении полной последовательности ген нередко выявляются многочисленные аллельные варианты данного гена. Видовый гомолог - это нуклеотидная либо аминокислотная последовательность иного видового происхождения, нежели таковое данной нуклеотидной или аминокислотной последовательности.The term “variant” as used herein also includes mutants, splice variants, conformations, isoforms, allelic variants, species variants and species homologues, particularly those existing in nature. An allelic variant is a change in the normal nucleotide sequence of a gene, and the meaning of this change often remains unclear. When determining the complete sequence of a gene, numerous allelic variants of a given gene are often identified. A species homologue is a nucleotide or amino acid sequence of a different species origin than that of a given nucleotide or amino acid sequence.
Для целей данного изобретения варианты аминокислотной последовательности включают варианты вследствие инсерций либо делеций, добавления и/или замен аминокислотных остатков. Возникшие в результате делеции варианты, включающие делецию на N-конце и/или на С-конце белка, называются также укороченными по N-либо С-концу вариантами.For the purposes of this invention, amino acid sequence variants include variants due to insertions or deletions, additions and/or substitutions of amino acid residues. Variants resulting from deletion, including a deletion at the N-terminus and/or the C-terminus of the protein, are also called N-terminal or C-terminal truncated variants.
Варианты, возникшие в результате инсерции аминокислотных остатков включают инсерции одного или двух или больше аминокислотных остатков в определенной аминокислотной последовательности. В случае вариантов аминокислотной последовательности, содержащих инсерцию, один или более аминокислотных остатков встраиваются в определенное место аминокислотной последовательности, хотя возможны также инсерции в случайные места с должным скринингом получающегося продукта. Variants resulting from insertions of amino acid residues include insertions of one or two or more amino acid residues in a particular amino acid sequence. In the case of amino acid sequence variants containing an insertion, one or more amino acid residues are inserted at a specific location in the amino acid sequence, although insertions at random locations are also possible with due screening of the resulting product.
Варианты, возникшие в результате добавления аминокислотных остатков включают присоединение одного или больше аминокислотных остатков (например, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 или более) к амино- и/или карбоксильному концу полипептидной цепи.Variations resulting from the addition of amino acid residues include the addition of one or more amino acid residues (eg, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 or more) to the amino and/or carboxyl terminus of the polypeptide chain.
Варианты, возникшие в результате делеции аминокислотных остатков отличаются тем, что один или больше аминокислотных остатков (например, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 или более) удалены из полипептидной цепи. Делеции возможны в любом положении полипептидной цепи. Variants resulting from deletion of amino acid residues are characterized in that one or more amino acid residues (eg, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 or more) are removed from the polypeptide chain. Deletions are possible at any position of the polypeptide chain.
Варианты, возникшие в результате замены аминокислотных остатков отличаются тем, что по меньшей мере один аминокислотный остаток удален из полипептидной цепи, а на его место введен другой аминокислотный остаток. Предпочтение отдается изменениям в таких положениях аминокислотной последовательности, которые не являются консервативными среди гомологичных белков или пептидов и/или предпочтительно, чтобы заменяемые и заменяющие аминокислотные остатки обладали сходными свойствами. Предпочтительно, чтобы аминокислотные замены в вариантах белка были консервативными, то есть чтобы заменяемый и заменяющий аминокислотные остатки имели сходный электрический заряд. Консервативная аминокислотная замена подразумевает, что заменяющая аминокислота относится к той же группе по свойствам боковых цепей, что и заменяемая. Существующие в природе аминокислоты в целом подразделяются на четыре группы: кислотные (аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), основные (лизин, аргинин, гистидин), неполярные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан) и полярные, несущие заряд (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин). Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда выделяют в группу ароматических аминокислот. Variants resulting from the replacement of amino acid residues are characterized in that at least one amino acid residue is removed from the polypeptide chain, and another amino acid residue is introduced in its place. Preference is given to changes at positions in the amino acid sequence that are not conserved among homologous proteins or peptides and/or it is preferred that the amino acid residues being replaced and those being replaced have similar properties. It is preferred that amino acid substitutions in protein variants be conservative, that is, that the amino acid residue being replaced and the amino acid residue being replaced have a similar electrical charge. A conservative amino acid substitution implies that the replacing amino acid belongs to the same group in terms of side chain properties as the one being replaced. Naturally occurring amino acids are generally divided into four groups: acidic (aspartic acid, glutamic acid), basic (lysine, arginine, histidine), nonpolar (alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan) and polar. charge-bearing (glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, tyrosine). Phenylalanine, tryptophan and tyrosine are sometimes classified as aromatic amino acids.
В отношении аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 37, термин «вариант» относится в частности к последовательности, в которой остаток цистеина в положении 436 заменен на остаток другой аминокислоты из числа перечисленных выше, предпочтительно на глицин, аланин, серин, треонин, валин или лейцин. With respect to the amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 37, the term “variant” refers in particular to a sequence in which the cysteine residue at position 436 is replaced by another amino acid residue from those listed above, preferably glycine, alanine, serine, threonine, valine or leucine.
Степень сходства, предпочтительно идентичности между данной аминокислотной последовательностью и последовательностью, модифицированной по сравнению с данной, или являющейся ее вариантом, например между значительно гомологичными аминокислотными последовательностями, предпочтительно составляет по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Степень сходства или идентичности берется предпочтительно для участка полипептидной цепи, составляющего по меньшей мере около 10%, по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90% или около 100% все длины аминокислтной последовательности, с которой проводится сравнение. Например, если аминокислтная последовательность, с которой проводится сравнение, состоит из 200 аминокислотных остатков, то степень сходства или идентичности берется предпочтительно для по меньшей мере около 20, по меньшей мере около 40, по меньшей мере около 60, по меньшей мере около 80, по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 120, по меньшей мере около 140, по меньшей мере около 160, по меньшей мере около 180 или около 200 аминокислотных остатков, предпочтительно расположенных непрерывно. Что касается вариантов полипептидной цепи CLDN6, то степень сходства или идентичности берется предпочтительно для участка, состоящего из по меньшей мере около 100, по меньшей мере около 120, по меньшей мере около 140, по меньшей мере около 160, по меньшей мере около 180, по меньшей мере около 200 или по меньшей мере около 210 аминокислотных остатков. В предпочтительных воплощениях данного изобретения степень сходства или идентичности берется для всей длины аминокислотной последовательности, с которой проводится сравнение, например аминокислотных последовательностей, приведенных в Списке последовательностей. Для выравнивания последовательностей с целью определения их сходства, предпочтительно идентичности, можно применять средства, известные в данной области техники, предпочтительно с использованием наилучшего выравнивания, например при помощи программ Align, предпочтительно EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.The degree of similarity, preferably identity, between a given amino acid sequence and a sequence modified from or a variant thereof, for example between significantly homologous amino acid sequences, is preferably at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, or most preferably at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99%. The degree of similarity or identity is preferably taken to be a portion of the polypeptide chain that is at least about 10%, at least about 20%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 90%, or about 100% of the entire length of the amino acid sequence being compared. For example, if the amino acid sequence being compared consists of 200 amino acid residues, then the degree of similarity or identity is preferably taken to be at least about 20, at least about 40, at least about 60, at least about 80, to at least about 100, at least about 120, at least about 140, at least about 160, at least about 180, or about 200 amino acid residues, preferably contiguous. With respect to CLDN6 polypeptide chain variants, the degree of similarity or identity is preferably taken over a region consisting of at least about 100, at least about 120, at least about 140, at least about 160, at least about 180, at least about 200 or at least about 210 amino acid residues. In preferred embodiments of the present invention, the degree of similarity or identity is taken over the entire length of the amino acid sequence to which comparison is made, for example the amino acid sequences shown in the Sequence List. To align sequences to determine their similarity, preferably identity, tools known in the art can be used, preferably using the best alignment, for example using Align programs, preferably EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.
«Сходство последовательностей» указывает доля аминокислотных остатков (в процентах), которые идентичны либо представляют консервативные аминокислотные замены. «Идентичность последовательностей» при сравнении двух полипептидов или нуклеотидных последовательностей указывает долю аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые в сравниваемых последовательностях одинаковы.“Sequence similarity” indicates the percentage of amino acid residues that are identical or represent conserved amino acid substitutions. "Sequence identity" when comparing two polypeptides or nucleotide sequences indicates the proportion of amino acid residues or nucleotides that are the same in the sequences being compared.
«Идентичность (в процентах)» получают после наилучшего выравнивания, причем эта величина чисто статистическая и различия между двумя сравниваемыми последовательностями распределяются равномерно по всей длине последовательностей. Сравнение двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей обычно осуществляется после оптимального выравнивания, причем сравнение проводят с помощью сегмента или окна сравнения, чтобы идентифицировать и сравнить локальные области сходства последовательностей. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проделать, помимо «вручную», с помощью алгоритма локальной гомологии Смита и Уотермана (см. Smith, Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482), СС помощью алгоритма локальной гомологии Нидлмана и Уанча (Neddleman, Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443), с помощью метода поиска подобия Пирсона и Липмана (Pearson, Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444) или с помощью компьютерных программ, в которых используются эти алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N, TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Мадисон, шт. Висконсин, США). “Identity (percentage)” is obtained after the best alignment, and this value is purely statistical and the differences between the two compared sequences are distributed evenly over the entire length of the sequences. Comparison of two nucleotide or amino acid sequences is usually made after an optimal alignment, with the comparison being made using a comparison segment or window to identify and compare local areas of sequence similarity. Optimal alignment of sequences for comparison can be done, in addition to “manually”, using the local homology algorithm of Smith and Waterman (see Smith, Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482), CC using the local homology algorithm of Needleman and Unch (Neddleman , Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443), using the Pearson and Lipman similarity search method (Pearson, Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444) or using computer programs, in which these algorithms are used (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N, TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA).
Идентичность (в процентах) рассчитывается путем определения числа одинаковых позиций в двух сравниваемых последовательностях и деления его на число сравненных позиций и умножения полученного результата на 100, так что в итоге получается процентная идентичность двух последовательностей. Identity (percentage) is calculated by determining the number of identical positions in the two sequences being compared and dividing it by the number of positions being compared and multiplying the result by 100, so that the resulting percentage identity of the two sequences is obtained.
Консервативные замены можно сделать, например, исходя из сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы рассматриваемых аминокислотных остатков. Например: (а) неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин); (b) полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; (с) положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и (d) отрицательно заряженные (кислотные) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Как правило, замены осуществляются в пределах групп (a)-(d). Кроме того, глицин и пролин могут заменять друг друга, так как и та и другая аминокислоты способны нарушать правильную альфа-спиральную структуру полипептидной цепи. Некоторые предпочтительные замены делаются в пределах следующих групп: (i) S и T; (ii) P и G; и (iii) A, V, L и I. Зная генетический код и располагая технологией рекомбинантной ДНК и возможностями ее синтеза, специалист в данной области техники вполне может создать ДНК, кодирующую консервативные варианты аминокислотных последовательностей.Conservative substitutions can be made, for example, based on the similarity in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the amino acid residues in question. For example: (a) non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine); (b) polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine; (c) positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine; and (d) negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid. As a rule, substitutions are made within groups (a)-(d). In addition, glycine and proline can replace each other, since both amino acids are capable of disrupting the correct alpha-helical structure of the polypeptide chain. Some preferred substitutions are made within the following groups: (i) S and T; (ii) P and G; and (iii) A, V, L and I. Knowing the genetic code and having recombinant DNA technology and the ability to synthesize it, it is quite possible for one skilled in the art to create DNA encoding conserved variants of amino acid sequences.
В настоящее изобретение входят антитела, в которых сделаны изменении, затрагивающие область Fc, с целью изменить функциональные или фармакокинетические свойства этих антител. Такие изменения могут приводить к ослаблению или усилению связывания C1q и к комплемент-зависимой цитотоксичности или к усилению либо ослабления связывания FcγR и к антителозависимой клеточной (клеточно-опосредованной) цитотоксичности. Возможны, например, замены одного или более аминокислотных остатков в константной области тяжелой цепи, что должно вызвать изменение эффекторной функции при сохранении способности к связыванию антигена по сравнению с модифицированными антителами (см. для сравнения патенты США 5,624,821 и 5,648,260).The present invention includes antibodies in which changes are made affecting the Fc region in order to change the functional or pharmacokinetic properties of these antibodies. Such changes may result in decreased or increased C1q binding and complement-dependent cytotoxicity, or increased or decreased FcγR binding and antibody-dependent cellular cytotoxicity. It is possible, for example, to substitute one or more amino acid residues in the heavy chain constant region, which would cause a change in effector function while maintaining antigen-binding ability compared to modified antibodies (for comparison, see US patents 5,624,821 and 5,648,260).
Время жизни (полужизни) антител in vivo можно увеличить, модифицируя эпитоп связывания рецептора реутилизации в константном домене иммуноглобулина или в подобном домене таким образом, чтобы молекула не содержала интактного домена CH2 или интактной области Fc (см. для сравнения патенты США 6,121,022 и 6,194,551. Время жизни (полужизни) антител может быть также увеличено путем мутаций в области Fc, например путем замены треонина в положении 252 на лейцин, треонина в положении 254 на серин или треонина в положении 256 на фенилаланин (см. для сравнения патент США 6,277,375). The half-life of antibodies in vivo can be increased by modifying the salvage receptor binding epitope in the immunoglobulin constant domain or similar domain so that the molecule does not contain an intact CH2 domain or an intact Fc region (for comparison, see US Patents 6,121,022 and 6,194,551. Time The half-life of antibodies can also be increased by mutations in the Fc region, for example by replacing the threonine at position 252 with leucine, the threonine at position 254 with serine, or the threonine at position 256 with phenylalanine (for comparison, see US Pat. No. 6,277,375).
Для изменения эффекторной функции антител можно также модифицировать паттерн гликозилирования молекул антител. Например, экспрессию антител можно осуществлять в трансфектомах, где не происходит присоединения фукозы, которая в норме присоединяется к остатку аспарагина в положении 297 области; в результате увеличится сродство области Fc к рецептору Fc, что в свою очередь приведет к усилению антителозависимой клеточной цитотоксичности в присутствии естественных киллеров (NK-клеток); см. для сравнения Shield et al. (2002) JBC, 277: 26733. Для модифицирования комплемент-зависимой цитотоксичности можно проводить модификацию галактозилирования.To change the effector function of antibodies, the glycosylation pattern of antibody molecules can also be modified. For example, expression of antibodies can be carried out in transfectomes where there is no attachment of fucose, which is normally attached to the asparagine residue at position 297 of the region; as a result, the affinity of the Fc region for the Fc receptor will increase, which in turn will lead to increased antibody-dependent cellular cytotoxicity in the presence of natural killer (NK) cells; for comparison, see Shield et al. (2002) JBC, 277: 26733. Galactosylation can be modified to modify complement-dependent cytotoxicity.
В другом воплощении данного изобретения мутации вызывают случайным образом по всей последовательности, кодирующей антитело против CLDN6, или в какой-то ее части, например, путем насыщающего мутагенеза, и получающиеся в результате модифицированные антитела против CLDN6 можно проверить на активность связывания с мишенью.In another embodiment of the present invention, mutations are generated randomly throughout the entire anti-CLDN6 antibody coding sequence or some portion thereof, for example, by saturation mutagenesis, and the resulting modified anti-CLDN6 antibodies can be tested for target binding activity.
По данному изобретению термины «клетка» и «клетка-хозяин» предпочтительно относятся к интактной клетке, то есть к клетке с неповрежденной и неизмененной мембраной, которая не теряла свои в норме внутриклеточные компоненты, например ферменты, органеллы или генетический материал. Интактная клетка является предпочтительно жизнеспособной, то есть живой клеткой, способной нормально осуществлять свойственные ей метаболические функции. Предпочтительно указанные термины по данному изобретению относятся к любой клетке, которая может быть трансформирована или трансфецирована с использованием экзогенной нуклеиновой кислоты. Термин «клетка» по данному изобретению включает прокариотические клетки (например, Ecsherichia coli) или эукариотические клетки (например, дендритные клетки, В-клетки, клетки СНО, СОS, K562, HEK293, HELA, дрожжевые клетки и клетки насекомых). Экзогенная нуклеиновая кислота внутри такой клетки может находиться (i) сама по себе, в свободно распределенном состоянии, (ii) включенная в рекомбинантный вектор или (iii) интегрированная в геном клетки-хозяина или в митохондриальную ДНК. Особенно предпочтительны клетки млекопитающих, например мыши, хомячка, свиньи, козы и приматов, включая человека. Клетки по данному изобретению могут происходить из различных типов ткани и включают эмбриональные клетки и клеточные линии. Конкретные примеры включают кератиноциты, лейкоциты периферической крови, стволовые клетки костного мозга и эмбриональные стволовые клетки. В других воплощениях данного изобретения клетки являются представляющими антиген, например это дендритные клетки, моноциты или макрофаги. Термин «клетка-хозяин» в настоящем документе предпочтительно относится к клеткам, в которые введен рекомбинантный вектор экспрессии. As used herein, the terms “cell” and “host cell” preferably refer to an intact cell, that is, a cell with an intact and unaltered membrane that has not lost its normal intracellular components, such as enzymes, organelles, or genetic material. An intact cell is preferably a viable cell, that is, a living cell capable of normally performing its inherent metabolic functions. Preferably, the terms of this invention refer to any cell that can be transformed or transfected using exogenous nucleic acid. The term “cell” as used herein includes prokaryotic cells (eg, Ecsherichia coli) or eukaryotic cells (eg, dendritic cells, B cells, CHO, COS, K562, HEK293, HELA, yeast and insect cells). The exogenous nucleic acid within such a cell may be (i) on its own in a freely distributed state, (ii) incorporated into a recombinant vector, or (iii) integrated into the host cell genome or mitochondrial DNA. Particularly preferred are mammalian cells, such as mouse, hamster, pig, goat and primates, including humans. The cells of this invention can be derived from a variety of tissue types and include embryonic cells and cell lines. Specific examples include keratinocytes, peripheral blood leukocytes, bone marrow stem cells, and embryonic stem cells. In other embodiments of the present invention, the cells are antigen presenting cells, such as dendritic cells, monocytes or macrophages. The term “host cell” as used herein preferably refers to cells into which the recombinant expression vector has been introduced.
В клетке, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно экспрессируется пептид или белок, кодируемый этой нуклеиновой кислотой.A cell containing a nucleic acid molecule preferentially expresses the peptide or protein encoded by the nucleic acid.
Термин «трансгенное животное» относится к животным, геном которых содержит один или более чужеродных генов (трансгенов), предпочтительно генов тяжелых и/или легких цепей антител, или чужеродных хромосом (трансхромосом), интегрированных или не интегрированных в природную геномную ДНК данного животного, и которые предпочтительно способны к экспрессии этих трансгенов. Например, у трансгенной мыши может иметься трансген или трансхромосома - человеческий ген легкой цепи антитела и человеческий ген тяжелой цепи или человеческая хромосома с нуклеотидной последовательностью, кодирующей тяжелую цепь, так что у этой мыши после иммунизации антигеном CLDN6 и/или клетками, в которых экспрессируется CLDN6, образуются человеческие антитела против CLDN6. Трансген человеческой тяжелой цепи может быть интегрирован в мышиную хромосомную ДНК, как в случае трансгенных мышей, например мышей HuMAb, HCo7 или HCol2, или трансген человеческой тяжелой цепи может существовать вне хромом, как в случае трансхромосомных мышей (например, КМ), описанных в публикации WO 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши могут быть способными к образованию множества изотипов человеческих моноклональных антител против CLDN6 (например, IgG, IgA и/или IgE) за счет рекомбинации V-D-J и переключения изотипов. The term "transgenic animal" refers to animals whose genome contains one or more foreign genes (transgenes), preferably antibody heavy and/or light chain genes, or foreign chromosomes (transchromosomes), whether or not integrated into the natural genomic DNA of that animal, and which are preferentially capable of expressing these transgenes. For example, a transgenic mouse may have a transgene or transchromosome—a human antibody light chain gene and a human heavy chain gene or human chromosome with a nucleotide sequence encoding the heavy chain, such that the mouse, after immunization with CLDN6 antigen and/or cells in which CLDN6 is expressed, , human antibodies against CLDN6 are produced. The human heavy chain transgene may be integrated into the mouse chromosomal DNA, as in the case of transgenic mice, such as HuMAb, HCo7, or HCol2 mice, or the human heavy chain transgene may exist outside the chromium, as in the case of transchromosomal mice (eg, KM) described in the publication WO 02/43478. Such transgenic and transchromosomal mice may be capable of producing multiple isotypes of human anti-CLDN6 monoclonal antibodies (eg, IgG, IgA, and/or IgE) through V-D-J recombination and isotype switching.
Слова «снизить» или «ингибировать» в настоящем документе означают способность вызвать в целом уменьшение уровня, например пролиферации клеток, предпочтительно на 5% илибольше,10% или больше, 20% или больше, более предпочтительно на 50% или больше, наиболее предпочтительно на 75% или больше. Термин «ингибировать» (или подобные выражения) включает полное или практически полное ингибирование, то есть снижение до нуля или практически до нуля. The words “reduce” or “inhibit” as used herein mean the ability to cause an overall reduction in the level of, for example, cell proliferation, preferably by 5% or more, 10% or more, 20% or more, more preferably by 50% or more, most preferably by 75% or more. The term "inhibit" (or similar expressions) includes complete or substantially complete inhibition, that is, reduction to zero or substantially zero.
Слова «увеличение» или «усиление» предпочтительно относятся к увеличению или усилению на по меньшей мере 10%, предпочтительно на по меньшей мере 20%, предпочтительно на по меньшей мере 30%, более предпочтительно на по меньшей мере 40%, более предпочтительно на по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно на по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно на по меньшей мере 100%. Эти слова могут также относиться к обстоятельствам, когда в момент времени «ноль» отсутствует определяемый/детектируемый сигнал для определенного вещества или состояния и в некоторый момент времени позже нулевого имеется детектируемый сигнал для данного вещества или состояния. The words "increase" or "amplification" preferably refer to an increase or amplification by at least 10%, preferably by at least 20%, preferably by at least 30%, more preferably by at least 40%, more preferably by at least 50%, even more preferably at least 80% and most preferably at least 100%. These words may also refer to circumstances where at time zero there is no detectable signal for a particular substance or state and at some time later than time zero there is a detectable signal for that substance or state.
Термин «иммунологически эквивалентный» означает, что иммунологически эквивалентный агент (молекула), например иммунологически эквивалентная аминокислотная последовательность, проявляет такие же или практически такие же иммунологические свойства и/или имеет такие же или практически такие же иммунологические эффекты, например в отношении типа иммунологического эффекта (индукция гуморального и/или клеточного иммунного ответа, интенсивность и/или продолжительность вызванной иммунологической реакции) или в отношении специфичности вызванной иммунологической реакции. В контексте настоящего изобретения термин «иммунологически эквивалентный» предпочтительно употребляется применительно к иммунологическим свойствам или эффектам пептида или варианта пептида, взятого для иммунизации. В частности иммунологическим свойством является способность связываться с антителами и вызывать иммунный ответ, предпочтительно путем стимуляции образования антител. Например, аминокислотная последовательность является иммунологически эквивалентной другой последовательности, взятой для сравнения, если указанная аминокислотная последовательность, предъявленная иммунной системе индивида, вызывает иммунологическую реакцию, предпочтительно образование антител, специфично реагирующих с последовательностью, взятой для сравнения, например с аминокислотной последовательностью, формирующей часть CLDN6. The term “immunologically equivalent” means that an immunologically equivalent agent (molecule), such as an immunologically equivalent amino acid sequence, exhibits the same or substantially the same immunological properties and/or has the same or substantially the same immunological effects, for example with respect to the type of immunological effect ( the induction of a humoral and/or cellular immune response, the intensity and/or duration of the induced immunological reaction) or in relation to the specificity of the induced immunological reaction. In the context of the present invention, the term "immunologically equivalent" is preferably used in relation to the immunological properties or effects of the peptide or peptide variant taken for immunization. In particular, the immunological property is the ability to bind to antibodies and induce an immune response, preferably by stimulating the formation of antibodies. For example, an amino acid sequence is immunologically equivalent to another comparison sequence if said amino acid sequence, when presented to the immune system of an individual, produces an immunological response, preferably the formation of antibodies that specifically react with the comparison sequence, for example, an amino acid sequence forming part of CLDN6.
Термин «иммунные эффекторные функции» в контексте настоящего изобретения включает любые функции, опосредуемые компонентами иммунной системы и приводящие к ингибированию опухолевого роста и/или ингибированию развития опухоли, включая ингибирование диссеминации опухоли и метастазирования. Предпочтительно иммунные эффекторные функции приводят к уничтожению опухолевых клеток. Предпочтительно иммунные эффекторные функции в контексте данного изобретения опосредуются антителами. Такие функции включают комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), индукцию апоптоза в клетках, несущих антигены, ассоциированные с опухолями, например путем связывания антител с поверхностным антигеном, и/или ингибирование пролиферации клеток, несущих антигены, ассоциированные с опухолями, предпочтительно ADCC и/или CDC. Таким образом, антитела, способные опосредовать одну или более иммунных эффекторных функций, предпочтительно способны опосредовать уничтожение клеток, вызывая лизис, опосредованный CDC, лизис, опосредованный ADCC, апоптоз, гомотипическую адгезию и/или фагоцитоз, предпочтительно вызывая лизис, опосредованный CDC, и/или лизис, опосредованный ADCC. Эффект антител может также осуществляться просто за счет связывания с антигенами, ассоциированными с опухолями, на поверхности опухолевых клеток. Например, антитела могут блокировать функцию антигенов, ассоциированных с опухолями, в результате связывания с антигенами, ассоциированными с опухолями, на поверхности опухолевых клеток. The term “immune effector functions” as used herein includes any functions mediated by components of the immune system that result in inhibition of tumor growth and/or inhibition of tumor development, including inhibition of tumor dissemination and metastasis. Preferably, the immune effector functions result in the killing of tumor cells. Preferably, immune effector functions in the context of this invention are mediated by antibodies. Such functions include complement-dependent cytotoxicity (CDC), antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), induction of apoptosis in cells bearing tumor-associated antigens, for example by binding of antibodies to a surface antigen, and/or inhibition of proliferation of cells bearing tumor-associated antigens. tumors, preferably ADCC and/or CDC. Thus, antibodies capable of mediating one or more immune effector functions are preferably capable of mediating cell killing by causing CDC-mediated lysis, ADCC-mediated lysis, apoptosis, homotypic adhesion and/or phagocytosis, preferably causing CDC-mediated lysis and/or ADCC-mediated lysis. Antibodies may also act simply by binding to tumor-associated antigens on the surface of tumor cells. For example, antibodies can block the function of tumor-associated antigens by binding to tumor-associated antigens on the surface of tumor cells.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
Механизм действия mAb Mechanism of action of mAbs
Хотя в изложенном ниже предлагаются рассуждения, касающиеся механизма, лежащего в основе лечебного действия антител, их не следует считать как-либо ограничивающими данное изобретение.Although the following offers considerations regarding the mechanism underlying the therapeutic action of antibodies, they should not be construed as limiting the present invention in any way.
Антитела, описанные в настоящем документе, могут взаимодействовать с компонентами иммунной системы, предпочтительно через цитотоксичность - ADCC или CDC. Антитела по данному изобретению можно также использовать для нацеливания нужного агента (например, радиоактивного изотопа, лекарственного вещества или токсина) с целью непосредственного уничтожения опухолевых клеток или применять в сочетании, предполагающем синергизм действия, с обычными химиотерапевтическими агентами, воздействуя на опухоль взаимодополняющими путями, которые могут включать противоопухолевый иммунный ответ, возможно, ослабленный вследствие цитотоксических побочных эффектов химиотерапевтических препаратов, влияющих на Т-лимфоциты. Однако эффект антител по данному изобретению может также осуществляться просто за счет связывания с CLDN6 на поверхности клеток, что блокирует пролиферацию клеток.Antibodies described herein can interact with components of the immune system, preferably through cytotoxicity - ADCC or CDC. The antibodies of this invention can also be used to target a desired agent (eg, a radioactive isotope, drug or toxin) to directly kill tumor cells or used in synergistic combination with conventional chemotherapeutic agents, targeting the tumor in complementary ways that may include an antitumor immune response, possibly weakened due to the cytotoxic side effects of chemotherapy drugs affecting T lymphocytes. However, the effect of the antibodies of this invention may also occur simply by binding to CLDN6 on the surface of cells, which blocks cell proliferation.
Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичностьAntibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
ADCC характеризует способность описанных в настоящем документе эффекторных клеток, в частности лимфоцитов, уничтожать другие клетки, для чего предпочтительно требуется, чтобы клетки-мишени были помечены антителами. ADCC characterizes the ability of the effector cells described herein, in particular lymphocytes, to kill other cells, which preferably requires that the target cells be labeled with antibodies.
Предпочтительно ADCC осуществляется, когда антитела связываются с антигеном на опухолевых клетках и домен Fc молекулы антитела связывается с рецептором Fc (FcR) на поверхности эффекторной клетки. Идентифицированы несколько семейств рецепторов Fc; определенным клеточным популяциям свойственна экспрессия определенных рецепторов Fc. ADCC можно рассматривать как механизм, предназначенный для того, чтобы непосредственно вызывать - в той или иной степени - немедленное разрушение опухоли, и ведущий к представлению антигена и индукции противоопухолевого Т-клеточного ответа. Предпочтительно индукция ADCC in vivo должна приводить к противоопухолевому Т-клеточному ответу и антительному ответу с участием собственных антител организма. Preferably, ADCC occurs when antibodies bind to an antigen on tumor cells and the Fc domain of the antibody molecule binds to the Fc receptor (FcR) on the surface of the effector cell. Several families of Fc receptors have been identified; Certain cell populations are characterized by the expression of certain Fc receptors. ADCC can be viewed as a mechanism designed to directly cause - to varying degrees - immediate tumor destruction, and leading to antigen presentation and induction of an antitumor T-cell response. Preferably, induction of ADCC in vivo should result in an antitumor T cell response and an antibody response involving the body's own antibodies.
Комплемент-зависимая цитотоксичность Complement-dependent cytotoxicity
CDC - это еще один опосредованный антителами путь уничтожения клеток. Наиболее эффективным для активации комплемента изотипом антител являются IgM. IgG1 и IgG3 тоже очень эффективно направляют CDC по классическому пути активации комплемента. В этом каскаде реакций предпочтительно образование комплексов антиген-антитело приводит к доступности множества участков связывания C1q поблизости от домена CH2 задействованных молекул антител, например IgG (C1q - это один из трех белков, комплекс которых представляет собой компонент C1 системы комплемента). Предпочтительно, когда эти участки связывания с C1q становятся доступными, сродство IgGк C1q, до того низкое, существенно возрастает, что инициирует каскад реакций, включающий ряд других белков системы комплемента и ведущий к протеолитическому высвобождению из эффекторной клетки хемотаксических/активирующих агентов C3a и C5a. Предпочтительно каскад системы комплемента завершается формированием комплекса, атакующего мембрану клетки-мишени и создающего в ней поры, способствующие свободному входу воды и растворенных веществ внутрь клетки и наружу.CDC is another antibody-mediated cell killing pathway. The most effective antibody isotype for activating complement is IgM. IgG1 and IgG3 are also very effective at directing CDC through the classical pathway of complement activation. In this cascade of reactions, the preferential formation of antigen-antibody complexes results in the availability of multiple C1q binding sites in the vicinity of the
Образование антителAntibody formation
Антитела по данному изобретению можно производить различными методами, включая обычную технологию моноклональных антител, например стандартный метод гибридизации соматических клеток по Кёлеру-Мильштейну (см. G.Kohler, C.Milstein, Nature 256: 495, 1975). Хотя метод гибридизации соматических клеток предпочтителен для получения антител по данному изобретению, в принципе можно применять и другие методы производства моноклональных антител, например вирусную или онкогенную трансформацию В-лимфоцитов или метод фагового дисплея с использованием библиотек генов антител. Antibodies of this invention can be produced by various methods, including conventional monoclonal antibody technology, for example the standard Kohler-Milstein somatic cell hybridization method (see G. Kohler, C. Milstein, Nature 256: 495, 1975). Although somatic cell hybridization is the preferred method for producing the antibodies of this invention, other methods for producing monoclonal antibodies, such as viral or oncogenic transformation of B cells or phage display using antibody gene libraries, can in principle be used.
Предпочтительной животной системой для получения гибридом, производящих моноклональные антитела, является мышиная система. Получение гибридом у мышей - налаженная лабораторная процедура. Протоколы иммунизации мышей и способы выделения активированных спленоцитов для гибридизации известны в данной области техники. Известны также пары для гибридизации (например, мышиные миеломные клетки) и методики слияния клеток. The preferred animal system for producing monoclonal antibody-producing hybridomas is the murine system. The production of hybridomas in mice is a well-established laboratory procedure. Protocols for immunization of mice and methods for isolating activated splenocytes for hybridization are known in the art. Hybridization pairs (eg, murine myeloma cells) and cell fusion techniques are also known.
К числу предпочтительных по данному изобретению животных систем для получения гибридом, секретирующих моноклональные антитела, также относятся крысиная и кроличья системы (например. описанные в работе Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995); см. также Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).Preferred animal systems for the production of monoclonal antibody-secreting hybridomas in this invention also include rat and rabbit systems (for example, those described in Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995) ; see also Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).
В еще одном предпочтительном воплощении данного изобретения человеческие моноклональные антитела, направленные против CLDN6, можно получать с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих элементы человеческой иммунной системы вместо соответствующих мышиных. К таким трансгенным и трансхромосомным мышам относятся животные, обозначаемые соответственно HuMAb и KM; в настоящем документе тех и других вместе называют трансгенными. Получение человеческих антител с помощью таких трансгенных мышей можно проделывать так, как подробно описано для CD20 в публикации WO2004 035607.In yet another preferred embodiment of the present invention, human monoclonal antibodies directed against CLDN6 can be produced using transgenic or transchromosomal mice carrying elements of the human immune system instead of the corresponding murine ones. These transgenic and transchromosomal mice include animals designated HuMAb and KM, respectively; in this document, both are collectively referred to as transgenic. The production of human antibodies using such transgenic mice can be done as described in detail for CD20 in WO2004 035607.
Другой подход к получению моноклональных антител - непосредственное выделение генов, кодирующих антитела, из лимфоцитов, производящих определенные антитела (см., например, Babcock et al., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy). Подробности получения рекомбинантных антител можно найти также в работах М.Welschof, J.Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 and Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.Another approach to obtaining monoclonal antibodies is to directly isolate genes encoding antibodies from lymphocytes that produce specific antibodies (see, for example, Babcock et al., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy ). Details of the production of recombinant antibodies can also be found in the works of M. Welschof, J. Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 and Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.
Иммунизация Immunization
Для получения антител против CLDN6, мышей можно иммунизировать конъюгированными с носителем пептидами, происходящими из аминокислотной последовательности CLDN6, обогащенным препаратом антигена CLDN6, экпрессирующегося как рекомбинантный белок, или их фрагментами и/или клетками, в которых экспрессируется CLDN или его фрагменты, как описано в настоящем документе. Или же мышей можно иммунизировать ДНК, кодирующей полную полипептидную цепь человеческого или его фрагменты. В случае, если иммунизация с использованием очищенного или обогащенного препарата антигена CLDN6 не приводит к образованию нужных антител, мышей для стимуляции иммунного ответа можно иммунизировать клетками, в которых экспрессируется CLDN6, например взятых из культуры клеток подходящей линии.To obtain antibodies against CLDN6, mice can be immunized with carrier-conjugated peptides derived from the amino acid sequence of CLDN6, enriched with a preparation of CLDN6 antigen expressed as a recombinant protein, or fragments thereof, and/or cells in which CLDN or fragments thereof are expressed, as described herein document. Alternatively, mice can be immunized with DNA encoding the complete human polypeptide chain or fragments thereof. If immunization with a purified or enriched CLDN6 antigen preparation does not produce the desired antibodies, mice can be immunized with cells in which CLDN6 is expressed, for example taken from a cell culture of an appropriate line, to stimulate an immune response.
Иммунный ответ можно отслеживать в ходе иммунизации по образцам плазмы и сыворотки крови из хвостовой вены или ретроорбитального венозного синуса. Для слияния клеток отбирают животных с достаточно высоким титром иммуноглобулинов против CLDN6. Чтобы увеличить интенсивность образования специфических антител гибридомами, мышам вводят клетки, в которых экспрессируется CLDN6, путем внутрибрюшинной или внутривенной инъекции за 3-5 дней до умерщвления и взятия селезенки.The immune response can be monitored during immunization using plasma and serum samples from the tail vein or retroorbital venous sinus. For cell fusion, animals with a sufficiently high titer of immunoglobulins against CLDN6 are selected. To enhance the production of specific antibodies by hybridomas, mice are injected with cells expressing CLDN6 by intraperitoneal or intravenous injection 3-5 days before sacrifice and spleen collection.
Создание гибридом, продуцирующих моноклональные антителаCreation of hybridomas producing monoclonal antibodies
Чтобы получить гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела против CLDN6, выделяют клетки из лимфатических узлов или селезенки, взятых у иммунизированных мышей. и сливают их с иммортализованными клетками подходящей линии, например с мышиными миеломными клетками. Получаемые в результате гибридомы проверяют на образование антиген-специфичных антител. Содержимое отдельных ячеек исследуют методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) на наличие гибридом, секретирующих антитела. Антитела, специфичные в отношении CLDN6, можно идентифицировать, применяя иммунофлуоресцентный анализ и метод FACS с использованием клеток, в которых экспрессируется СLDN6. Гибридомы, продуцирующие нужные антитела, пересевают, вновь проверяют и те, в которых образуются моноклональные антитела против CLDN6, можно субклонировать методом серийных разведений. Затем стабильные субклоны культивируют in vitro, чтобы получить антитела в культуральной среде и охарактеризовать их. To obtain hybridomas that produce monoclonal antibodies against CLDN6, cells are isolated from lymph nodes or spleens taken from immunized mice. and fuse them with immortalized cells of a suitable line, such as mouse myeloma cells. The resulting hybridomas are tested for the production of antigen-specific antibodies. The contents of individual cells are examined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the presence of antibody-secreting hybridomas. Antibodies specific for CLDN6 can be identified using immunofluorescence assays and FACS using cells in which CLDN6 is expressed. Hybridomas that produce the desired antibodies are subcultured, retested, and those that produce monoclonal antibodies against CLDN6 can be subcloned by serial dilution. Stable subclones are then cultured in vitro to obtain antibodies in the culture medium and characterize them.
Создание трансфектом, продуцирующих моноклональные антителаGeneration of transfectomes producing monoclonal antibodies
Антитела по данному изобретению можно также получать в трансфектомах клеток-хозяев, применяя, например, сочетание технологии рекомбинантной ДНК и методов трансфекции генов, хороши известных в данной области техники (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).Antibodies of this invention can also be produced in transfectomes of host cells, using, for example, a combination of recombinant DNA technology and gene transfection techniques well known in the art (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
Например, в одном из воплощений данного изобретения нужный ген (гены) , например гены антител, встраивают в вектор экспрессии, например в плазмиду эукариотической клетки, как описано для системы экспрессии гена GS в публикациях WO 87/04462 и WO 89/01036, а также в европейском патенте 338 841, или используют другую систему экспрессии, которые хорошо известны в данной области техники. Очищенные плазмиды, содержащие клонированные гены антител, вводят в эукариотические клетки-хозяева, например в клетки CHO, NS/0, HEK293T или HEK293, либо в иные эукариотические клетки, например в клетки растительного происхождения или в клетки грибов, включая дрожжи. Для введения генов по данному изобретению можно применять методы, описанные в литературе по данной области техники, например электропорез, использование липофектина, липофектамина и др. Клетки-хозяева, в которые введенные гены антител экспрессируются, можно выявить и отобрать. Уровень экспрессии генов антител в трансфицированных клетках (трансфектомах) можно повысить, затем размножить эти клетки и получать в нужном количестве продуцируемые ими антитела. Из супернатанта культуральной среды и/или клеток выделяют и очищают рекомбинантные антитела.For example, in one embodiment of the present invention, the gene(s) of interest, such as antibody genes, are inserted into an expression vector, such as a eukaryotic cell plasmid, as described for the GS gene expression system in WO 87/04462 and WO 89/01036, and in European patent 338 841, or use another expression system that is well known in the art. Purified plasmids containing cloned antibody genes are introduced into eukaryotic host cells, such as CHO, NS/0, HEK293T or HEK293 cells, or other eukaryotic cells, such as plant cells or fungal cells, including yeast. To introduce the genes of this invention, methods described in the literature can be used, such as electrocution, the use of lipofectin, lipofectamine, etc. The host cells in which the introduced antibody genes are expressed can be identified and selected. The expression level of antibody genes in transfected cells (transfectomes) can be increased, then these cells can be multiplied and the antibodies they produce can be obtained in the required quantities. Recombinant antibodies are isolated and purified from the supernatant of the culture medium and/or cells.
Или же экспрессию клонированных генов антител по данному изобретению можно получить в других экспрессионных системах, включая прокариотические клетки, например микроорганизмы, включая Escherichia coli. Также антитела по данному изобретению могут производиться трансгенными животными, например в составе молока у овец и кроликов или в составе яиц у кур, или в трансгенных растениях; см., например, Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; and Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839. Alternatively, cloned antibody genes of the present invention may be expressed in other expression systems, including prokaryotic cells, such as microorganisms, including Escherichia coli. Also, the antibodies of this invention can be produced by transgenic animals, for example in the milk of sheep and rabbits or in the eggs of chickens, or in transgenic plants; see, for example, Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; and Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380:825-839.
Экспрессия интактных антител с использованием частичных последовательностей (гуманизация, химеризация)Expression of intact antibodies using partial sequences (humanization, chimerization)
a) Химеризацияa) Chimerization
Для лечения людей можно использовать мышиные моноклональные антитела, меченные токсическими агентами или радиоактивными изотопами. Немеченые мышиные антитела при многократном применении сильно иммуногенны для человека, что снижает терапевтический эффект. Иммуногенность обусловлена в основном константными областями тяжелых цепей молекул антител. Иммуногенность мышиных антител для человека можно снизить или вообще снять, если эти антитела подвергнуть химеризации или гуманизации. Гибридные (или химерные) антитела - это антитела, в молекулах которых различные участки происходят от животных разных видов, например вариабельная область - от мышиного антитела, а константная - от человеческого иммуноглобулина. Химеризация антител достигается путем соединения тяжелой и легкой цепей вариабельной области мышиного антитела с тяжелой и легкой цепями константной области человеческого антитела (например, как описано в работе Kraus et al., in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения гибридные антитела сочетают в себе константную область человеческой легкой каппа-цепи и вариабельную область мышиной легкой цепи. В другом предпочтительном воплощении данного изобретения гибридные антитела образованы в результате присоединения константной области человеческой легкой лямбда-цепи к вариабельной области мышиной легкой цепи. Для получения гибридных антител предпочтительны константные области тяжелых цепей IgG1, IgG3 и IgG4. Для получения гибридных антител предпочтительны также константные области тяжелых цепей IgG2, IgA, IgD и IgM. Mouse monoclonal antibodies labeled with toxic agents or radioactive isotopes can be used to treat humans. Unlabeled murine antibodies are highly immunogenic in humans when used repeatedly, which reduces the therapeutic effect. Immunogenicity is mainly due to the constant regions of the heavy chains of antibody molecules. The immunogenicity of murine antibodies in humans can be reduced or even eliminated if these antibodies are chimerized or humanized. Hybrid (or chimeric) antibodies are antibodies in the molecules of which different regions originate from animals of different species, for example, the variable region is from a mouse antibody, and the constant region is from a human immunoglobulin. Chimerization of antibodies is achieved by combining the heavy and light chains of the variable region of a mouse antibody with the heavy and light chains of the constant region of a human antibody (for example, as described in Kraus et al., in Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0- 89603-918-8). In one preferred embodiment of the present invention, the hybrid antibodies combine a human kappa light chain constant region and a murine light chain variable region. In another preferred embodiment of the present invention, the hybrid antibodies are formed by joining the human lambda light chain constant region to the murine light chain variable region. For the production of hybrid antibodies, the constant regions of the heavy chains IgG1, IgG3 and IgG4 are preferred. For the production of hybrid antibodies, the heavy chain constant regions of IgG2, IgA, IgD and IgM are also preferred.
b) Гуманизацияb) Humanization
Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями преимущественно аминокислотными остатками, расположенными в шести участках, определяющих комплементарность (CDR). Поэтому аминокислотные последовательности в пределах CDR сильнее различаются у разных антител, чем последовательности вне CDR. Поскольку последовательности CDR обеспечивают большинство взаимодействий между антителом и антигеном, возможна экспрессия рекомбинантных антител, имитирующих свойства определенных природных антител, путем создания векторов экспрессии, которые включают последовательности CDR от определенных природных антител, объединенные с каркасными последовательностями от других антител с другими свойствами (см., например, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; and Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). Такие каркасные последовательности можно получить из общедоступных баз данных по ДНК, включающих нуклеотидные последовательности генов антител «зародышевой линии». Эти гаметные последовательности отличаются от последовательностей зрелых генов антител, потому что в них нет полностью собранных вариабельных последовательностей, которые образуются путем соединения сегментов V (D) J в ходе созревания В-клеток. Гаметные нуклеотидные последовательности также отличаются от последовательностей, соответствующих высокоаффинным антителам вторичного репертуара по всей вариабельной области. Например, соматические мутации относительно редки вблизи N-конца каркасного участка 1 и вблизи С-конца каркасного участка 4. Кроме того, многие соматические мутации существенно не влияют на связывание антител. По этой причине для того, чтобы воссоздать интактное рекомбинантное антитело, обладающее свойствами связывания, как у исходного антитела, нет необходимости получать полную последовательность ДНК данного антитела (см. WO 99/45962). Для этой цели обычно достаточен охват участков CDR частичных последовательностей тяжелых и легких цепей. Частичная последовательность используется, чтобы определить, какие вариабельные и соединяющие сегменты гена зародышевой линии (гаметной последовательности) участвуют в образовании вариабельных генов рекомбинированного антитела. Гаметная последовательность затем используется для заполнения недостающих частей вариабельных областей. Лидерные последовательности тяжелой и легкой цепи отщепляются в процессе созревания белка и не вносят вклад в формирование свойств конечного антитела. Для восполнения недостающих последовательностей клонированные последовательности кДНК можно комбинировать с синтетическими олигонуклеотидами путем лигирования или амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Или же можно синтезировать целую вариабельную область как набор коротких перекрывающихся олигонуклеотидов и объединить их посредством ПЦР-амплификации, чтобы создать полностью синтетический клон вариабельной области. Такой процесс обладает рядом преимуществ: элиминируются или включаются определенные сайты рестрикции либо оптимизируются определенные кодоны.Antibodies interact with target antigens primarily through amino acid residues located in six complementarity determining regions (CDRs). Therefore, amino acid sequences within the CDR vary more widely between antibodies than sequences outside the CDR. Because CDR sequences mediate the majority of interactions between an antibody and an antigen, it is possible to express recombinant antibodies that mimic the properties of certain natural antibodies by creating expression vectors that include CDR sequences from certain natural antibodies combined with framework sequences from other antibodies with different properties (see, for example, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; and Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10029-10033). Such framework sequences can be obtained from publicly available DNA databases containing nucleotide sequences of germline antibody genes. These gametic sequences differ from mature antibody gene sequences because they do not have fully assembled variable sequences, which are formed by joining of V(D)J segments during B cell maturation. Gametic nucleotide sequences also differ from the sequences corresponding to the high-affinity antibodies of the secondary repertoire throughout the variable region. For example, somatic mutations are relatively rare near the N-terminus of
Транскрипты нуклеотидных последовательностей тяжелых и легких цепей из гибридом используются для составления набора перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов для создания синтетических V-последовательностей, способных кодировать такие же аминокислотные последовательности, как природные нуклеотидные последовательности. Синтетические последовательности тяжелых и каппа-цепей могут отличаться от природных последовательностей в трех аспектах: вереницы повторяющихся нуклеотидов прерывают для облегчения синтеза олигонуклеотидов и амплификации методом ПЦР; включают оптимальные сайты инициации трансляции по Козаку (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870); сайты рестрикции эндонуклеазой HindIII располагают в сторону 5`-конца нуклеотидной последовательности от сайтов инициации трансляции. Transcripts of heavy and light chain nucleotide sequences from hybridomas are used to assemble a set of overlapping synthetic oligonucleotides to create synthetic V sequences capable of encoding the same amino acid sequences as natural nucleotide sequences. Synthetic heavy chain and kappa sequences may differ from natural sequences in three respects: strings of repeating nucleotides are interrupted to facilitate oligonucleotide synthesis and PCR amplification; include optimal Kozak translation initiation sites (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870); HindIII endonuclease restriction sites are located towards the 5' end of the nucleotide sequence from the translation initiation sites.
Для вариабельных областей как легких, так и тяжелых цепей оптимизированные кодирующие и соответствующие некодирующие последовательности разбивают на сегменты из 30-50 нуклеотидов примерно посередине соответствующего некодирующего олигонуклеотида. Таким образом для каждой цепи олигонуклеотиды можно собрать в перекрывающиеся двухцепочечные наборы, охватывающие сегменты из 150-400 нуклеотидов. Эти пулы затем используют как матрицы для получения продуктов амплификации методом ПЦР из 150-400 нуклеотидов. Как правило, из одного набора олигонуклеотидов вариабельной области получается два пула, которые амплифицируют по отдельности, чтобы получить два перекрывающихся продукта ПЦР. Эти перекрывающиеся продукты затем объединяют путем амплификации методом ПЦР, чтобы сформировать полную вариабельную область. Может оказаться желательным включить в амплификацию методом ПЦР также перекрывающийся фрагмент константной области тяжелой или легкой цепи, чтобы получить фрагменты, легко клонируемые в экспрессионных векторных конструкциях. For both light and heavy chain variable regions, the optimized coding and corresponding non-coding sequences are divided into segments of 30-50 nucleotides approximately in the middle of the corresponding non-coding oligonucleotide. Thus, for each strand, oligonucleotides can be assembled into overlapping double-stranded sets spanning segments of 150–400 nucleotides. These pools are then used as templates to obtain PCR amplification products of 150-400 nucleotides. Typically, one set of variable region oligonucleotides produces two pools that are amplified separately to produce two overlapping PCR products. These overlapping products are then combined by PCR amplification to form the complete variable region. It may be desirable to also include an overlapping fragment of the heavy or light chain constant region in the PCR amplification to obtain fragments that are easily cloned into expression vector constructs.
Затем сконструированные гибридные или гуманизированные вариабельные области тяжелых и легких цепей объединяют с клонированными промоторной и лидерной последовательностями, сайтом инициации трансляции, константной областью, 3`-нетранслируемой последовательностью, сайтом полиаденилирования и сайтом терминации транскрипции, чтобы сформировать экспрессионную векторную конструкцию. Экспрессионные конструкции для тяжелой и легкой цепей можно объединить в одном векторе, и провести совместную, последовательную или раздельную трансфекцию в клетки-хозяева, которые затем сливают, чтобы получить клетку-хозяин, в которой экспрессируются обе цепи. Известны плазмиды для использования при конструировании векторов экспрессии для человеческого IgGκ. Плазмиды можно сконструировать таким образом, что амплифицированные методом ПЦР последовательности кДНК вариабельных областей тяжелой цепи и легкой каппа-цепи можно использовать для воссоздания минигенов полных тяжелой и легкой цепей. Эти плазмиды можно использовать для экспрессии полностью человеческих или же гибридных IgG1, каппа или IgG4, каппа-антител. Подобные плазмиды можно сконструировать для экспрессии других изотипов тяжелых цепей или для экспрессии антител, содержащих легкие лямбда-цепи. The engineered hybrid or humanized heavy and light chain variable regions are then combined with the cloned promoter and leader sequences, translation initiation site, constant region, 3' untranslated sequence, polyadenylation site, and transcription termination site to form an expression vector construct. Expression constructs for the heavy and light chains can be combined in a single vector and transfected jointly, sequentially or separately into host cells, which are then fused to produce a host cell in which both chains are expressed. Plasmids are known for use in the construction of expression vectors for human IgGκ. Plasmids can be constructed such that PCR amplified cDNA sequences of the heavy chain and kappa light chain variable regions can be used to reconstitute full heavy and light chain minigenes. These plasmids can be used to express fully human or hybrid IgG1, kappa or IgG4, kappa antibodies. Such plasmids can be constructed to express other heavy chain isotypes or to express antibodies containing lambda light chains.
Таким образом, в другом аспекте данного изобретения структурные свойства антител против CLDN6 используются для создания структурно родственных гуманизированных антител против CLDN6, сохраняющих по меньшей мере одно функциональное свойство антител по данному изобретению, например связывание с CLDN6. Более конкретно, один или более участков CDR мышиных моноклональных антител можно объединить рекомбинантным путем с известными человеческими каркасными участками и участками CDR, чтобы получить дополнительные рекомбинантные гуманизированные антитела против CLDN6 по данному изобретению. Thus, in another aspect of the present invention, the structural properties of anti-CLDN6 antibodies are used to create structurally related humanized anti-CLDN6 antibodies retaining at least one functional property of the antibodies of the present invention, such as binding to CLDN6. More specifically, one or more CDR regions of murine monoclonal antibodies can be combined recombinantly with known human framework regions and CDR regions to produce additional recombinant humanized anti-CLDN6 antibodies of the present invention.
Связывание с клетками, в которых экспрессируется антигенBinding to cells in which the antigen is expressed
Способность антител по данному изобретению связываться с CLDN6 можно определить с помощью стандартных аналитических методов наподобие тех, которые представлены в примерах - например, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), Вестерн-блоттинга, иммунофлуореценции, проточной цитометрии. The ability of antibodies of this invention to bind to CLDN6 can be determined using standard analytical methods such as those presented in the examples - for example, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western blotting, immunofluorescence, flow cytometry.
Выделение и определение свойств антителIsolation and determination of the properties of antibodies
Для очистки антител против CLDN6 отобранные гибридомы выращивают в двухлитровых роллерных колбах для очистки моноклональных антител. Или же антитела против CLDN6 получают в биореакторах с диализом. Супернатант фильтруют и, при необходимости, концентрируют, после чего проводят аффинную хроматографию с белком G или белком А, иммобилизованным на сефарозе. Чистоту элюированного IgG проверяют методом гель-электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Буферный раствор обменивается на PBS, концентрацию определяют по оптической плотности на длине волны 280 нм (коэффициент экстинкции 1,43). Аликвоты моноклональных антител хранят при температуре -80°C.To purify anti-CLDN6 antibodies, selected hybridomas are grown in two-liter monoclonal antibody purification roller flasks. Alternatively, antibodies against CLDN6 are produced in bioreactors with dialysis. The supernatant is filtered and, if necessary, concentrated, after which affinity chromatography is carried out with protein G or protein A immobilized on Sepharose. The purity of the eluted IgG is checked by gel electrophoresis and high-performance liquid chromatography. The buffer solution is exchanged with PBS, the concentration is determined by optical density at a wavelength of 280 nm (extinction coefficient 1.43). Aliquots of monoclonal antibodies are stored at -80°C.
Чтобы определить, связываются ли отобранные моноклональные антитела против CLDN6 с данным эпитопом, можно использовать направленный (сайт-специфический) мутагенез и множественный сайт-специфический мутагенез.To determine whether selected anti-CLDN6 monoclonal antibodies bind to a given epitope, site-directed mutagenesis and multiple site-directed mutagenesis can be used.
Определение изотипаIsotype determination
Чтобы определить изотип очищенных антител, можно применить твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), используя различные готовые имеющиеся в продаже наборы (например, Zymed, Roche Diagnostics). Лунки титрационного микропланшета покрывают антимышиным Ig. После блокирования, проводят реакцию с моноклональными антителами или очищенным контрольным (по изотипу) образцом при комнатной температуре в течении 2 часов. Затем в ячейки вносят мышиные IgG1, IgG2a, IgG2b или IgG3, IgA, либо мышиные специфичные к IgM конъюгаты с пероксидазой. После промывания планшеты обрабатывают 2,2`-азино-бис-(3-этилбензотиазолин)-6-судьфоновой кислотой (ABTS) в качестве субстрата (1 мг/мл) и определяют оптическую плотность при 405-650 нм. Или же используют готовый набор IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, Cat. No. 1493027) согласно инструкции производителя.To determine the isotype of purified antibodies, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) can be used using various commercially available kits (eg, Zymed, Roche Diagnostics). The wells of a microtiter plate are coated with anti-mouse Ig. After blocking, react with monoclonal antibodies or a purified control (isotype) sample at room temperature for 2 hours. Mouse IgG1, IgG2a, IgG2b or IgG3, IgA, or mouse IgM-specific peroxidase conjugates are then added to the wells. After washing, the plates were treated with 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid (ABTS) as substrate (1 mg/ml) and the absorbance was determined at 405-650 nm. Or use a ready-made IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, Cat. No. 1493027) according to the manufacturer's instructions.
Проточная цитометрияFlow cytometry
Чтобы продемонстрировать присутствие антител против CLDN6 в сыворотке крови иммунизированных мышей или связывание моноклональных антител с живыми клетками, в которых экспрессируется CLDN6, можно применять метод проточной цитометрии. Образцы линий клеток, в которых CLDN6 экспрессируется от природы или после трансфекции, и отрицательный контроль (клетки без экспрессии CLDH6, выращенные в стандартных условиях культивирования) смешивают с моноклональными антителами в различной концентрации в супернатанте гибридом или в PBS, содержащем 1% FBS, и инкубируют при температуре 4°C в течение 30 мин. После промывания проводят связывание моноклональных антител, связавших CLDH6, с антителами против IgG, меченными аллофикоцианином (АРС) или Alexa647, в тех же условиях, в которых проводили окрашивание первичных антител. Образцы анализируют с помощью проточного цитофлуориметра FACS, определяя параметры прямого(переднего) и бокового светорассеяния единичных живых клеток. Чтобы отличить связывание моноклональных антител, специфичных в отношении CLDN6, от неспецифического связывания в каждом отдельном измерении, можно применять метод котрансфекции. Клетки временно трансфецируют плазмидами, кодирующими CLDN6 и флуоресцентный маркер, и окрашивают, как описано выше. Трансфицированные клетки выявляют в канале регистрации флуоресценции, отличном от такового для клеток, окрашенных антителами. Поскольку в большинстве траснфецированных клеток экспрессируются оба трансгена, моноклональные антитела, специфичные к СLDN6, связываются предпочтительно с клетками, в которых экспрессируется флуоресцентный маркер, тогда как неспецифичные антитела связываются в сравнимом количестве с нетрансфицированными клетками. В дополнение к проточной цитометрии или вместо нее можно применять флуоресцентную микроскопию. Для использования флуоресцентного микроскопа клетки окрашивают так же, как описано выше. Flow cytometry can be used to demonstrate the presence of anti-CLDN6 antibodies in the serum of immunized mice or the binding of monoclonal antibodies to living cells in which CLDN6 is expressed. Samples of cell lines that express CLDN6 naturally or after transfection and negative controls (cells without CLDH6 expression grown under standard culture conditions) are mixed with various concentrations of monoclonal antibodies in the hybridoma supernatant or in PBS containing 1% FBS and incubated at 4°C for 30 minutes. After washing, the CLDH6-binding monoclonal antibodies are coupled to allophycocyanin (APC)- or Alexa647-labeled anti-IgG antibodies under the same conditions as the primary antibody staining. Samples are analyzed using a FACS flow cytometer, determining the parameters of forward (front) and side light scattering of single living cells. To distinguish the binding of monoclonal antibodies specific for CLDN6 from non-specific binding in each individual dimension, a co-transfection method can be used. Cells were transiently transfected with plasmids encoding CLDN6 and a fluorescent marker and stained as described above. Transfected cells are detected in a fluorescence detection channel that is different from that of cells stained with antibodies. Because most transfected cells express both transgenes, monoclonal antibodies specific for CLDN6 bind preferentially to cells expressing the fluorescent marker, whereas nonspecific antibodies bind in comparable amounts to untransfected cells. Fluorescence microscopy can be used in addition to or instead of flow cytometry. To use a fluorescence microscope, cells are stained as described above.
Иммунофлуоресцентная микроскопияImmunofluorescence microscopy
Чтобы продемонстрировать присутствие антител против CLDN6 в сыворотке крови иммунизированных мышей или связывание моноклональных антител с живыми клетками, в которых экспрессируется CLDN6, можно применять метод иммунофлуоресцентной микроскопии. Например, образцы линий клеток, в которых CLDN6 экспрессируется спонтанно или после трансфекции, и отрицательный контроль (клетки без экспрессии CLDH6) выращивают в слайд-камерах при стандартных условиях культивирования в среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 2 мM L-глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина и l00 мкг/мл стрептомицицна. Затем клетки фиксируют метиловым спиртом или параформальдегидом либо ничем не обрабатывают. Затем в течение 30 мин клетки взаимодействуют с моноклональными антителами против CLDN6 при 25°C. После промывания проводят связывание клеток с вторичными антителами против мышиного IgG, меченными Alexa555 (Molecular Probes) в тех же условиях. Затем клетки исследуют методом флуоресцентной микроскопии.Immunofluorescence microscopy can be used to demonstrate the presence of anti-CLDN6 antibodies in the serum of immunized mice or the binding of monoclonal antibodies to living cells in which CLDN6 is expressed. For example, samples of cell lines in which CLDN6 is expressed spontaneously or after transfection and a negative control (cells without CLDH6 expression) are grown in slide chambers under standard culture conditions in DMEM/F12 medium containing 10% fetal calf serum (FCS), 2 mM L-glutamine, 100 IU/ml penicillin and l00 μg/ml streptomycin. Then the cells are fixed with methyl alcohol or paraformaldehyde or left untreated. Cells were then reacted with anti-CLDN6 monoclonal antibodies for 30 min at 25°C. After washing, cells are bound to secondary anti-mouse IgG antibodies labeled with Alexa555 (Molecular Probes) under the same conditions. The cells are then examined using fluorescence microscopy.
Суммарный уровень CLDN6 в клетках можно определить. когда клетки фиксированы метиловым спиртом или параформальдегидом и обработаны детергентом Triton X-100 для увеличения проницаемости. В живых клетках и в обработанных параформальдегидом, но с нормальной проницаемостью можно изучить локализацию CLDN6. Кроме того, можно изучить связывание CLDN6 в участках плотного контакта путем окрашивания маркерами плотных контактов, например ZO-1. Также можно изучить эффекты связывания антител и локализацию CLDN6 в клеточной мембране. The total level of CLDN6 in cells can be determined. when cells are fixed with methyl alcohol or paraformaldehyde and treated with Triton X-100 detergent to increase permeability. In living cells and in cells treated with paraformaldehyde but with normal permeability, the localization of CLDN6 can be studied. Additionally, CLDN6 binding at tight junction sites can be examined by staining with tight junction markers such as ZO-1. The effects of antibody binding and cell membrane localization of CLDN6 can also be studied.
Вестерн-блоттингWestern blotting
Взаимодействие иммуноглобулинов G против CLDN6 с антигеном CLDN6 можно также проверить с помощью метода вестерн-блоттинга. Вкратце делают следующее. Получают экстракты клеток, в которых экспрессируется CLDN6, и соответствующие отрицательные контроли и подвергают их электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS) Разделенные в результате электрофореза антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют и детектируют моноклональными антителами, подлежащими проверке. Связывание IgG можно выявить при помощи антимышиных IgG и пероксидазы, окрашивая субстратом для усиления хемилюминисценции (ECL).The interaction of anti-CLDN6 immunoglobulin G with CLDN6 antigen can also be tested using Western blotting. Briefly do the following. Extracts of cells expressing CLDN6 and corresponding negative controls are prepared and subjected to sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis. The electrophoresis-separated antigens are transferred to nitrocellulose membranes, blocked, and detected with monoclonal antibodies to be tested. IgG binding can be detected using anti-mouse IgG and peroxidase staining with enhanced chemiluminescence (ECL) substrate.
Иммуноцитохимический анализImmunocytochemical analysis
Взаимодействие иммуноглобулинов G против CLDN6 с антигеном CLDN6 можно также проверить иммуноцитохимическим методом, способы которого хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, используют замороженные срезы ткани, фиксированной параформальдегидом или ацетоном, или заключенные в парафин срезы ткани, фиксированной параформальдегидом, образцы которой берут из опухоли или здоровой ткани пациента в ходе хирургического вмешательства или у мышей с ксенографтами опухолей, инокулированных клетками линий со спонтанной или посттрансфекционной экспрессией CLDN6. Для иммунологического окрашивания, выявляющего антитела, способные взаимодействовать с CLDN6, можно использовать конъюгаты пероксидазы хрена с козьими антимышиными или антикроличьими антителами (производства DAKO) по инструкциям производителяThe interaction of anti-CLDN6 immunoglobulin G with the CLDN6 antigen can also be tested by immunocytochemistry, methods of which are well known to those skilled in the art. For example, frozen sections of paraformaldehyde- or acetone-fixed tissue, or paraffin-embedded sections of paraformaldehyde-fixed tissue, sampled from tumor or healthy tissue from a patient during surgery or from mice bearing tumor xenografts inoculated with spontaneously or posttransfectionally expressed cell lines are used. CLDN6. For immunostaining to detect antibodies that can interact with CLDN6, horseradish peroxidase conjugates with goat anti-mouse or anti-rabbit antibodies (manufactured by DAKO) can be used according to the manufacturer's instructions
Активность антител in vitro: фагоцитоз и гибель клеток-мишенейAntibody activity in vitro: phagocytosis and death of target cells
Помимо специфичного связывания с CLDN6, у антител против этого белка проверяют способность опосредовать фагоцитоз и гибель клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью. Результаты проверки активности моноклональных антител in vitro служат для первоначального скрининга, предшествующего проверке на моделях in vivo.In addition to specifically binding to CLDN6, antibodies against this protein are tested for their ability to mediate phagocytosis and death of cells that express CLDN6 and that differ in that CLDN6 is bound to their surface. The results of testing the activity of monoclonal antibodies in vitro serve as an initial screening prior to testing in in vivo models.
Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC):Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC):
Вкратце, проделывают следующее. полиморфноядерные клетки (РMN), естественные киллеры (NK-клетки), моноциты, мононуклеарные клетки или иные эффекторные клетки очищают путем центрифугирования в градиенте плотности в среде Ficoll Hypaquе, после чего осуществляют лизис эритроцитов. Промытые эффекторные клетки суспендируют в среде RPMI, содержащей 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки или же 5% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки и смешивают с меченными 51Cr клетками-мишенями, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью, при различных количественных соотношениях эффекторных клеток и клеток-мишеней. Или же клетки-мишени метят лигандом, обеспечивающим усиление флуоресценции (ВАTDA). С помощью флуориметра измеряют флуоресценцию комплекса хелата европия с усиливающим лигандом. Или же можно применить трансфекцию клеток-мишеней люциферазой. Добавленный краситель люциферовый желтый будет окисляться только жизнеспособными клетками. Затем добавляют очищенные иммуноглобулины G против CLDN6 в различных концентрациях. В качестве отрицательного контроля можно использовать другие человеческие IgG. Инкубация (при температуре 37°C) занимает от 4 до 20 часов в зависимости от типа взятых эффекторных клеток. Цитолиз в образцах определяют, измеряя высвобождение 51Cr в присутствии хелата EuTDA в культуральном супернатанте. Или же мерой количества жизнеспособных клеток может служить люминесценция в результате окисления люциферового желтого. In short, they do the following. polymorphonuclear cells (PMN), natural killer (NK) cells, monocytes, mononuclear cells or other effector cells are purified by density gradient centrifugation in Ficoll Hypaque medium, followed by lysis of red blood cells. The washed effector cells are suspended in RPMI containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum or 5% heat-inactivated human serum and mixed with 51 Cr-labeled target cells that express CLDN6 and that have CLDN6 bound to their surface. at different quantitative ratios of effector cells and target cells. Alternatively, target cells are labeled with a fluorescence enhancement ligand (BATDA). A fluorimeter is used to measure the fluorescence of the europium chelate complex with an enhancing ligand. Alternatively, transfection of target cells with luciferase can be used. The added Lucifer yellow dye will only be oxidized by viable cells. Purified anti-CLDN6 immunoglobulins G are then added at various concentrations. Other human IgGs can be used as negative controls. Incubation (at 37°C) takes from 4 to 20 hours depending on the type of effector cells taken. Cytolysis in the samples was determined by measuring the release of 51 Cr in the presence of EuTDA chelate in the culture supernatant. Or a measure of the number of viable cells can be luminescence resulting from the oxidation of Lucifer yellow.
Проверяют также, усиливают ли моноклональные антитела против CLDN6 цитолиз в различных комбинациях с другими антителами. It is also tested whether anti-CLDN6 monoclonal antibodies enhance cytolysis in various combinations with other antibodies.
Комплемент-зависимая цитотоксичность Моноклональные антитела против CLDN6 проверяют на способность опосредовать комплемент-зависимую цитотоксичность, для чего применяют разнообразные известные в данной области техники методы. Например, известными специалистам в данной области техники способами получают сыворотку крови, содержащую комплемент. Для определения активности моноклональных антител в отношении комплемент-зависимой цитотоксичности можно использовать разные методы. Например, можно измерять высвобождение 51Cr или оценивать изменение проницаемости мембраны с использованием пропидий иодида (PI). Вкратце проделывают следующее. Клетки-мишени промывают и 5 x 105/мл инкубируют с различными концентрациями моноклональных антител в течение 10-30 мин при комнатной температуре или при 37°C. Добавляют сыворотку или плазму крови до конечной концентрации 20% (объем/объем) и клетки инкубируют при температуре 37°C в течение 20-30 мин. Из каждого образца все клетки помещают в раствор пропидий йодида в пробирки для цитофлуориметра FACS и сразу же проводят анализ методом проточной цитометрии, используя FACS-планшет. Complement-Dependent Cytotoxicity Anti-CLDN6 monoclonal antibodies are tested for their ability to mediate complement-dependent cytotoxicity using a variety of methods known in the art. For example, blood serum containing complement is prepared by methods known to those skilled in the art. Various methods can be used to determine the activity of monoclonal antibodies against complement-dependent cytotoxicity. For example, the release of 51 Cr can be measured or the change in membrane permeability can be assessed using propidium iodide (PI). Briefly do the following. Target cells are washed and 5 x 10 5 /ml incubated with various concentrations of monoclonal antibodies for 10-30 minutes at room temperature or at 37°C. Serum or plasma is added to a final concentration of 20% (v/v) and the cells are incubated at 37°C for 20-30 min. From each sample, all cells are placed in propidium iodide solution in FACS tubes and immediately analyzed by flow cytometry using a FACS plate.
Или же индукцию комплемент-зависимой цитотоксичности можно определять на адгезивных клетках. В одном из вариантов осуществления этого подхода за 24 часа до опыта клетки высевают на плоскодонные планшеты для микротитрования с плотностью 3 x 104/на лунку. На следующий день удаляют культуральную среду и клетки инкубируют с антителами (в трех параллельных опытах). Контрольные клетки инкубируют с культуральной средой или с культуральной средой, содержащей 0,2% сапонина для определения фонового лизиса и максимального лизиса соответственно. Через 20 мин инкубации при комнатной температуре удаляют супернатант, а к клеткам прибавляют 20% (объем/объем) человеческой сыворотки или плазмы крови в среде DMEM (подогретой до 37°C) и инкубируют еще 20 мин при температуре 37°C. Все клетки из каждого образца помещают в раствор пропидия йодида (10 мкг/мл). Затем супернатанты заменяют на PBS, содержащий 2,5 мкг/мл этидия бромида и измеряют испускание флуоресценции при 600 нм (длина волны возбуждении 520 нм) с помощью микропланшетного ридера Tecan Safire. Долю (в процентах) специфичного лизиса рассчитывают следующим образом % специфичного лизиса = (флуоресценция образца-фоновая флуоресценция)/ (флуоресценция при максимальном лизисе - фоновая флуоресценция) x 100.Alternatively, the induction of complement-dependent cytotoxicity can be determined on adherent cells. In one embodiment of this approach, 24 hours before the experiment, cells are seeded onto flat-bottomed microtiter plates at a density of 3 x 10 4 /well. The next day, the culture medium is removed and the cells are incubated with antibodies (in three parallel experiments). Control cells are incubated with culture medium or with culture medium containing 0.2% saponin to determine background lysis and maximum lysis, respectively. After 20 min of incubation at room temperature, the supernatant was removed and 20% (v/v) human serum or plasma in DMEM (warmed to 37°C) was added to the cells and incubated for an additional 20 min at 37°C. All cells from each sample are placed in a solution of propidium iodide (10 μg/ml). The supernatants were then replaced with PBS containing 2.5 μg/ml ethidium bromide and fluorescence emission was measured at 600 nm (excitation wavelength 520 nm) using a Tecan Safire microplate reader. The percentage of specific lysis is calculated as % specific lysis = (sample fluorescence - background fluorescence) / (fluorescence at maximum lysis - background fluorescence) x 100.
Ингибирование пролиферации клеток моноклональными антителамиInhibition of cell proliferation by monoclonal antibodies
Чтобы проверить способность моноклональных антител против CLDN6 вызывать апоптоз, их можно, например, инкубировать с опухолевыми клетками, несущими CLDN6, или с опухолевыми клетками, трансфицированными CLDN6. Инкубацию проводят при температуре 37°C в течение 20 часов. Затем клетки собирают, промывают буферным раствором для связывания аннексина V (производство BD biosciences) и инкубируют с аннексином V, конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) или аллофикоцианином (APC) (BD biosciences), в течение 15 мин в темноте. Из каждого образца все клетки помещают в раствор йодистого пропидия (PI) (10 мкг/мл в PBS) в пробирки для цитофлуориметра FACS и сразу же проводят проточную цитометрию (как описано выше). Можно также определять общее ингибирование пролиферации клеток моноклональными антителами при помощи готовых имеющихся в продаже наборов. Так, набор DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin-Elmer, Cat. No. AD0200) позволяет осуществить иммунологический анализ без использования радиоактивных изотопов на основе количественного определения включения 5-бром-2’-дезоксиуридина (BrdU) в синтезируемую ДНК пролиферирующих клеток на микропланшетах. Включение BrdU выявляют с помощью меченных европием моноклональных антител. Для выявления антител клетки фиксируют и денатурируют ДНК, используя фиксирующий раствор. Не связавшиеся антитела отмывают и прибавляют индуктор DELFIA для диссоциации ионов европия, которые переходят из меченых антител в раствор, где образуют интенсивно флуоресцирующие хелатные комплексы с компонентами индуктора DELFIA. Получаемая в результате измерения (с временным разрешением) величина, характеризующая флуоресценцию, в каждой ячейке пропорциональна интенсивности синтеза ДНК в клетках.To test the ability of anti-CLDN6 monoclonal antibodies to induce apoptosis, they can, for example, be incubated with tumor cells harboring CLDN6 or with tumor cells transfected with CLDN6. Incubation is carried out at 37°C for 20 hours. Cells were then harvested, washed with Annexin V binding buffer (BD biosciences), and incubated with fluorescein isothiocyanate (FITC) or allophycocyanin (APC)-conjugated annexin V (BD biosciences) for 15 min in the dark. From each sample, all cells were placed in propidium iodide (PI) solution (10 μg/ml in PBS) in FACS tubes and immediately performed with flow cytometry (as described above). It is also possible to determine the general inhibition of cell proliferation by monoclonal antibodies using ready-made commercial kits. Thus, the DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin-Elmer, Cat. No. AD0200) allows for immunological analysis without the use of radioactive isotopes based on the quantitative determination of the incorporation of 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) into the synthesized DNA of proliferating cells on microplates. BrdU incorporation is detected using europium-labeled monoclonal antibodies. To detect antibodies, cells are fixed and DNA denatured using a fixative solution. Unbound antibodies are washed and the DELFIA inducer is added to dissociate europium ions, which pass from the labeled antibodies into the solution, where they form intensely fluorescent chelate complexes with the components of the DELFIA inducer. The resulting measurement (with time resolution) characterizing fluorescence in each cell is proportional to the intensity of DNA synthesis in the cells.
Доклинические исследованияPreclinical studies
Моноклональные антитела, связывающиеся с CLDN6, также можно проверять на моделях in vivo (например, у мышей с иммунодефицитом, имеющих опухоли-ксенографты, в которые инокулированы клетки с экспрессией CLDN6, возможно, после трансфекции), с целью определить их эффективность для регуляции пролиферации опухолевых клеток, в которых экспрессируется CLDN6. Monoclonal antibodies that bind to CLDN6 can also be tested in in vivo models (eg, immunodeficient mice bearing xenograft tumors inoculated with CLDN6-expressing cells, possibly after transfection), to determine their effectiveness in regulating tumor proliferation. cells in which CLDN6 is expressed.
В исследованиях in vivo с использованием мышей с ослабленной иммунной системой и ксенографтами опухолевых клеток, в которых экспрессируется CLDN6, можно применять антитела по данному изобретению. Эти антитела вводят мышам без опухолей, а затем этим животным вводят опухолевые клетки и оценивают производимый антителами эффект предотвращения образования опухолей или связанных с опухолями симптомов. Также изучаемые антитела вводят мышам с опухолями, чтобы оценить их лечебный эффект, т.е. ослабление опухолевого роста, метастазирования или связанных с опухолями симптомов. Применение антител по данному изобретению можно сочетать с применением других веществ, используемых в качестве цитостатических препаратов, ингибиторов факторов роста, агентов, блокирующих клеточный цикл или ангиогенез, или с другими антителами, чтобы оценить синергический эффект и потенциальную токсичность таких комбинаций. Для изучения токсических побочных эффектов, опосредуемых антителами по данному изобретению, животным вводят соответствующие антитела или регуляторные агенты и детально оценивают симптомы, которые могут быть связаны с лечебным влиянием антител против CLDN6. Возможные побочные эффекты применения антител против in vivo включают, в частности, токсичность для тканей, в которых экспрессируется CLDN6, включая плаценту. Антитела, распознающие CLDN6 у человека и других видов, например мыши, особенно полезны для предсказания возможных побочных эффектов, опосредуемых применением моноклональных антител против CLDN6 у человека.In in vivo studies using immunocompromised mice and tumor cell xenografts expressing CLDN6, antibodies of the present invention can be used. These antibodies are administered to tumor-free mice, which are then injected with tumor cells and the effect of the antibodies in preventing the formation of tumors or tumor-related symptoms is assessed. The antibodies under study are also administered to mice with tumors to evaluate their therapeutic effect, i.e. reducing tumor growth, metastasis or tumor-related symptoms. The use of antibodies of this invention can be combined with the use of other substances used as cytotoxic drugs, growth factor inhibitors, cell cycle or angiogenesis blocking agents, or other antibodies to evaluate the synergistic effect and potential toxicity of such combinations. To study the toxic side effects mediated by the antibodies of this invention, animals are administered the appropriate antibodies or regulatory agents and the symptoms that may be associated with the therapeutic effects of anti-CLDN6 antibodies are assessed in detail. Possible side effects of in vivo use of anti-antibodies include, but are not limited to, toxicity to tissues in which CLDN6 is expressed, including the placenta. Antibodies that recognize CLDN6 in humans and other species, such as mice, are particularly useful in predicting possible side effects mediated by the use of monoclonal antibodies against CLDN6 in humans.
Картирование эпитопов Epitope mapping
Картирование эпитопов, узнаваемых антителами по данному изобретению, может быть проделано, как подробно описано в работах Glenn E.Morris "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology), ISBN-089603-375-9 и Olwyn M.R. Westwood, Frank C. Hay "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248. Mapping of epitopes recognized by antibodies of this invention can be done as described in detail in Glenn E. Morris, "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology), ISBN-089603-375-9 and Olwyn M.R. Westwood, Frank C. Hay" Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248.
I. Биспецифичные/полиспецифичные вещества, связывающиеся с CLDN6I. Bispecific/polyspecific substances that bind to CLDN6
В другом воплощении настоящего изобретения антитела против CLDN6 модифицируют или присоединяют к иным функциональным молекулам, например пептидам или белкам (например, фрагментам Fab'), чтобы создать биспецифичные или полиспецифичные молекулы, связывающиеся со многими участками связывания или эпитопами мишени. Например, антитело по данному изобретению может быть функционально соединено (например, путем химического сопряжения, объединения генетического материала, нековалентной связи или как-то иначе) с одним или более других связывающих молекул, например другим антителом, пептидом или миметиком по связыванию.In another embodiment of the present invention, anti-CLDN6 antibodies are modified or coupled to other functional molecules, such as peptides or proteins (eg, Fab' fragments) to create bispecific or polyspecific molecules that bind to multiple target binding sites or epitopes. For example, an antibody of the present invention may be operably linked (eg, by chemical conjugation, association of genetic material, non-covalent linkage, or otherwise) to one or more other binding molecules, such as another antibody, peptide, or binding mimetic.
Соответственно, настоящее изобретение включает биспецифичные и полиспецифичные вещества, содержащие по меньшей мере одну первую специфичность связывания для CLDN6 и вторую специфичность связывания для второго эпитопа мишени. В одном конкретном воплощении данного изобретения второй эпитоп мишени является рецептором Fc, например человеческими рецепторами Fc-γRI (CD64) или Fc-α (CD89), или рецептором Т-клеток, например CD3. Таким образом. данное изобретение включает биспецифичные и полиспецифичные вещества, способные связываться как с эффекторными клетками (например, моноцитами, макрофагами или полиморфноядерными клетками), в которых экспрессируется Fc-γR, Fc-αR или Fc-αR, так и с клетками-мишенями, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются том, что CLDN6 связан с их поверхностью. Эти биспецифичные и полиспецифичные вещества делают клетки, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются том, что CLDN6 связан с их поверхностью, мишенью для эффекторных клеток и инициируют активность эффекторных клеток, опосредованную рецепторами Fc, например фагоцитоз клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются том, что CLDN6 связан с их поверхностью, антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность, высвобождение цитокинов или образование супероксид-аниона.Accordingly, the present invention includes bispecific and polyspecific substances comprising at least one first binding specificity for CLDN6 and a second binding specificity for a second target epitope. In one specific embodiment of the present invention, the second target epitope is an Fc receptor, such as the human Fc-γRI (CD64) or Fc-α (CD89) receptors, or a T cell receptor, such as CD3. Thus. This invention includes bispecific and polyspecific substances capable of binding both to effector cells (for example, monocytes, macrophages or polymorphonuclear cells) in which Fc-γR, Fc-αR or Fc-αR is expressed, and to target cells in which CLDN6 and which differ in that CLDN6 is bound to their surface. These bispecific and multispecific substances make cells that express CLDN6 and that differ in that CLDN6 is associated with their surface target effector cells and initiate Fc receptor-mediated activity of effector cells, such as phagocytosis of cells that express CLDN6 and that differ in that that CLDN6 is associated with their surface, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, cytokine release, or superoxide anion formation.
Биспецифичные и полиспецифичные агенты по данному изобретению могут также обладать третьей специфичностью связывания, в дополнение к специфичности связывания Fc и специфичности связывания CLDN6. В одном из воплощений данного изобретения третья специфичность связывания относится части направленной на фактор усиления (EF), например веществу, которое связывается с белком клеточной поверхности, участвующим в цитотоксической активности и таким образом усиливает иммунный ответ, направленный на клетки-мишени. Часть молекулы полиспецифичного агента, связывающаяся с фактором усиления, может быть антителом, функциональным фрагментом антитела или лигандом. связывающимся с данным веществом, например с антигеном или с рецептором, и таким образом вызывающая усиление эффекта детерминант связывания для рецептора Fc или антигена клетки-мишени. Часть молекулы полиспецифичного агента, связывающаяся с фактором усиления, может связываться с рецептором Fc или антигеном клетки-мишени. Или же часть молекулы полиспецифичного агента, связывающаяся с фактором усиления, может связываться со структурой, отличной от тех двух, к которым относятся первая и вторая специфичности данного агента. Например, часть молекулы полиспецифичного агента, связывающаяся с фактором усиления, может связываться с цитотоксической Т-клеткой (например, через CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 или с другой клеткой иммунной системы, что ведет к усилению иммунного ответа, направленного против клетки-мишени). Bispecific and polyspecific agents of this invention may also have a third binding specificity, in addition to the Fc binding specificity and the CLDN6 binding specificity. In one embodiment of the present invention, the third binding specificity relates to a portion directed to an enhancing factor (EF), for example a substance that binds to a cell surface protein involved in cytotoxic activity and thereby enhances the immune response directed to target cells. The portion of the molecule of the multispecific agent that binds to the enhancing factor may be an antibody, a functional antibody fragment, or a ligand. binding to a given substance, such as an antigen or a receptor, and thereby causing an enhanced effect of binding determinants for the Fc receptor or antigen of the target cell. The enhancing factor binding portion of the multispecific agent molecule may bind to the Fc receptor or antigen of the target cell. Or, the part of the molecule of a multispecific agent that binds to the enhancing factor may bind to a structure different from the two that comprise the first and second specificities of the agent. For example, the enhancing factor-binding portion of a multispecific agent molecule may bind to a cytotoxic T cell (e.g., via CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1, or another cell of the immune system, leading to increased immune response). response directed against the target cell).
В одном из воплощений данного изобретения биспецифичные и полиспецифичные агенты содержат по меньшей мере одно антитело, обеспечивающее специфичность связывания, включая, например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv или одноцепочечный Fv. Это антитело также может быть димером легкой или тяжелой цепи или любым их минимальным фрагментом, например Fv или одноцепочечной конструкцией, как описано в работе Ladner et al., патент США 4,946,778. Это антитело может также быть связывающим доменом гибридного иммуноглобулина, как описано в заявках на патент США 2003/0118592 и 2003/0133939. In one embodiment of the present invention, bispecific and polyspecific agents contain at least one antibody providing binding specificity, including, for example, Fab, Fab', F(ab') 2 , Fv or single chain Fv. The antibody may also be a light or heavy chain dimer or any minimal fragment thereof, such as an Fv or single chain construct as described in Ladner et al., US Pat. No. 4,946,778. This antibody may also be a fusion immunoglobulin binding domain, as described in US patent applications 2003/0118592 and 2003/0133939.
В одном из воплощений данного изобретения биспецифичные и полиспецифичные агенты обладают специфичностью связывания с Fc-γR или Fc-αR, присутствующих на поверхности эффекторных клеток, и второй специфичностью связывания с антигеном клетки-мишени, например CLDN6. In one embodiment of the present invention, bispecific and polyspecific agents have a specificity for binding to an Fc-γR or Fc-αR present on the surface of effector cells and a second specificity for binding to a target cell antigen, such as CLDN6.
В одном из воплощений данного изобретения специфичность связывания с рецептором Fc обеспечивается моноклональным антителом связывание которого не блокируется человеческим иммуноглобулином G (IgG). В настоящем документе термин «рецептор IgG» относится к любому из восьми генов гамма-цепей, находящихся в хромосоме 1. Эти гены кодируют в совокупности двенадцать трансмембранных или растворимых изоформ рецептора, которые группируются в три класса рецепторов Fc-γ: Fc-γRI (CD64), Fc-γRII (CD32) и Fc-γRIII (CD16). В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения рецептор Fc-γ является человеческим высокоаффинным Fc-γRI. In one embodiment of the present invention, Fc receptor binding specificity is provided by a monoclonal antibody whose binding is not blocked by human immunoglobulin G (IgG). As used herein, the term “IgG receptor” refers to any of the eight gamma chain genes found on
В другом предпочтительном воплощении данного изобретения специфичность связывания с рецептором Fc обеспечивается антителом, которое связывается с человеческим рецептором IgA, например с рецептором Fc-α (Fc-αRI (CD89)), причем это связывание предпочтительно не блокируется человеческим иммуноглобулином A (IgA). Термин «рецептор IgA» подразумевает продукт гена одного α-гена (Fc-αRI), расположенного в хромосоме 19. Известно, что этот ген кодирует несколько образующихся в результате альтернативного сплайсинга изоформ с молекулярной массой от 55 до 110 кДа. Fc-αRI (CD89) постоянно экспрессируется на моноцитах/макрофагах, гранулоцитах (эозинофилах и нейтрофилах), но не на эффекторных клетках. Fc-αRI обладает умеренным сродством к IgA1 и IgA2, которое увеличивается под действием цитокинов, например гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) или гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) (Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). Идентифицировано четыре моноклональных антитела, специфичных к Fc-αRI (обозначаются A3, A59, A62 и A77), которые связываются с Fc-αRI вне домена, обеспечивающего связывание с IgA (Monteiro, R. C. et al. (1992) J.Immunol. 148: 1764).In another preferred embodiment of the present invention, Fc receptor binding specificity is provided by an antibody that binds to a human IgA receptor, for example Fc-α receptor (Fc-αRI (CD89)), which binding is preferably not blocked by human immunoglobulin A (IgA). The term “IgA receptor” refers to the gene product of a single α gene (Fc-αRI), located on chromosome 19. This gene is known to encode several alternatively spliced isoforms with molecular weights ranging from 55 to 110 kDa. Fc-αRI (CD89) is constitutively expressed on monocytes/macrophages, granulocytes (eosinophils and neutrophils), but not on effector cells. Fc-αRI has a moderate affinity for IgA1 and IgA2, which is increased by cytokines such as granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) or granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) (Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). Four Fc-αRI-specific monoclonal antibodies have been identified (designated A3, A59, A62 and A77) that bind to Fc-αRI outside the IgA binding domain (Monteiro, R. C. et al. (1992) J. Immunol. 148: 1764).
В другом воплощении настоящего изобретения биспецифичные агенты содержат два моноклональных антитела по данному изобретению, обладающих комплементарными активностями, например одно антитело действует преимущественно путем индуцирования зависимой от комплемента цитотоксичности, а другое преимущественно вызывает апоптоз. In another embodiment of the present invention, the bispecific agents comprise two monoclonal antibodies of the invention having complementary activities, eg, one antibody acts primarily by inducing complement-dependent cytotoxicity and the other primarily induces apoptosis.
Термин «антитела, специфичные к эффекторным клеткам» в настоящем документе относится к антителам или функциональным фрагментам антител, которые связываются с рецептором Fc эффекторных клеток. Предпочтительно по данному изобретению используются антитела связываются с рецептором Fc эффекторных клеток в участке, который не связывается с эндогенными иммуноглобулинами. The term “effector cell-specific antibodies” as used herein refers to antibodies or functional antibody fragments that bind to the Fc receptor of effector cells. Preferably, the antibodies used in this invention bind to the Fc receptor of effector cells at a site that does not bind endogenous immunoglobulins.
В настоящем документе термин «эффекторная клетка» употребляется применительно к клеткам иммунной системы, участвующим в эффекторной фазе иммунного ответа, - в отличие от стадии распознавания антигена и стадии активации эффекторных элементов. Примеры клеток иммунной системы, участвующих в эффекторной фазе иммунного ответа, включают клетки миелоидного и лимфоидного происхождения, например лимфоциты (например, В-клетки и Т-клетки, включая цитолитические Т-клетки (CTL)), киллерные клетки, естественные киллерные клетки (NK-клетки), макрофаги, моноциты, эозинофилы, нейтрофилы, полиморфноядерные клетки, гранулоциты, тучные клетки и базофилы. В некоторых эффекторных клетках экспрессируются специфические рецепторы Fc и эти клетки выполняют специфические функции. В предпочтительных воплощениях данного изобретения эффекторные клетки способны вызывать антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), например нейтрофилы могут вызывать ADCC. К примеру, моноциты и макрофаги, в которых экспрессируется FcR, участвуют в специфичном уничтожении клеток-мишеней и в представлении антигена другим компонентам иммунной системы или в связывании клеток, представляющих антигены. В других воплощениях данного изобретения эффекторные клетки могут поглощать путем фагоцитоза антиген-мишень, клетку-мишень или микроорганизм. Экспрессия конкретных FcR на эффекторных клетках может регулироваться гуморальными факторами, например цитокинами. Так, обнаружено, что экспрессия Fc-γRI регулируется, а именно усиливается, γ-интерфероном. В результате этого усиления экспрессии увеличивается направленная против клеток-мишеней цитотоксическая активность клеток, несущих Fc-γRI. Эффекторные клетки могут осуществлять фагоцитоз или лизис антигена-мишени или клеток-мишеней. As used herein, the term "effector cell" is used to refer to cells of the immune system that participate in the effector phase of an immune response, as opposed to the antigen recognition phase and the activation phase of effector elements. Examples of immune system cells involved in the effector phase of the immune response include cells of myeloid and lymphoid origin, such as lymphocytes (eg, B cells and T cells, including cytolytic T cells (CTL)), killer cells, natural killer (NK) cells -cells), macrophages, monocytes, eosinophils, neutrophils, polymorphonuclear cells, granulocytes, mast cells and basophils. Some effector cells express specific Fc receptors and these cells perform specific functions. In preferred embodiments of the present invention, effector cells are capable of causing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), for example, neutrophils can cause ADCC. For example, monocytes and macrophages in which FcR is expressed are involved in the specific killing of target cells and in presenting antigen to other components of the immune system or in binding antigen-presenting cells. In other embodiments of the present invention, effector cells can engulf a target antigen, target cell, or microorganism by phagocytosis. The expression of specific FcRs on effector cells can be regulated by humoral factors such as cytokines. Thus, it was found that the expression of Fc-γRI is regulated, namely enhanced, by γ-interferon. As a result of this increased expression, the cytotoxic activity of Fc-γRI-bearing cells directed against target cells increases. Effector cells can phagocytose or lyse the target antigen or target cells.
Термин «клетка-мишень» в настоящем документе означает любую нежелательную клетку у индивида (например, человека или животного), которая может быть мишенью для антител по данному изобретению. В предпочтительных воплощениях данного изобретения клетками-мишенями являются клетки, в которых экспрессируется или чрезмерно экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью. Клетки, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью, как правило, включают опухолевые клетки. The term “target cell” as used herein means any undesired cell in an individual (eg, human or animal) that may be a target for the antibodies of the present invention. In preferred embodiments of the present invention, the target cells are cells in which CLDN6 is expressed or overexpressed and which are characterized in that CLDN6 is associated with their surface. Cells that express CLDN6 and that are characterized by having CLDN6 associated with their surface typically include tumor cells.
II. ИммуноконъюгатыII. Immunoconjugates
В другом своем аспекте данное изобретение предлагает антитела против CLDN6, конъюгированные с играющей терапевтическую роль структурой или агентом, например, цитотоксином, лекарственным веществом (например, иммуносупрессором) или радиоактивным изотопом. Такие конъюгаты в настоящем документе называются иммуноконъюгатами. Иммуноконъюгаты, включающие один или более цитотоксинов, называются здесь иммунотоксинами. Цитотоксины или цитотоксические агенты включают любые агенты, губительные для живых клеток, в частности убивающие их. Примеры таких веществ включают таксол, цитохалазин В, грамицидин D, этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин и их аналоги или гомологичные им вещества. In another aspect, the invention provides anti-CLDN6 antibodies conjugated to a therapeutic structure or agent, eg, a cytotoxin, a drug (eg, an immunosuppressant), or a radioactive isotope. Such conjugates are referred to herein as immunoconjugates. Immunoconjugates comprising one or more cytotoxins are referred to herein as immunotoxins. Cytotoxins or cytotoxic agents include any agent that is harmful to living cells, in particular killing them. Examples of such substances include taxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracinedione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin and their analogues or substances homologous to them.
Терапевтические агенты, подходящие для образования иммуноконъюгатов по данному изобретению, включают (не ограничиваясь приведенными здесь примерами) антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, флударабин, 5-фторурацил, декарбазин), алкилирующие агенты (например, меклоретамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиаминплатина (II) (DDP) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин, ранее известный под названием дауномицина, и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин, ранее известный под название актиномицина, блеомицин, митрамицин и антрамицин) и агенты, подавляющие митоз (например, винкристин и винбластин). В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения терапевтическим агентом является цитотоксический или радиотоксический агент. В другом воплощении данного изобретения терапевтическим агентом является иммуносупрессор. В еще одном воплощении данного изобретения терапевтическим агентом является гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF). В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения терапевтическим агентом является доксорубицин, цисплатин, блеомицин, сульфат, кармустин, хлорамбуцил, циклофосфамид или рицин А. Therapeutic agents suitable for forming the immunoconjugates of this invention include, but are not limited to the examples provided herein, antimetabolites (e.g., methotrexate, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, fludarabine, 5-fluorouracil, decarbazine), alkylating agents (e.g., meclorethamine , thiotepa, chlorambucil, melphalan, carmustine (BSNU) and lomustine (CCNU), cyclophosphamide, busulfan, dibromomannitol, streptozotocin, mitomycin C and cis-dichlorodiamineplatinum (II) (DDP) cisplatin), anthracyclines (e.g. daunorubicin, formerly known as daunomycin, and doxorubicin), antibiotics (eg, dactinomycin, formerly known as actinomycin, bleomycin, mithramycin and anthramycin) and agents that inhibit mitosis (eg, vincristine and vinblastine). In one preferred embodiment of the present invention, the therapeutic agent is a cytotoxic or radiotoxic agent. In another embodiment of the present invention, the therapeutic agent is an immunosuppressant. In yet another embodiment of the present invention, the therapeutic agent is granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). In one preferred embodiment of the present invention, the therapeutic agent is doxorubicin, cisplatin, bleomycin, sulfate, carmustine, chlorambucil, cyclophosphamide, or ricin A.
Антитела по данному изобретению можно также конъюгировать с радиоактивными изотопами, например, иодом-131, иттрием-90 или индием-111, для создания цитотоксических радиоактивных лекарств для лечения расстройств, связанных с CLDN6, например рака. Конъюгаты антител по данному изобретению можно использовать для модификации той или иной биологической реакции, и обладающую лечебным эффектом структуру не следует считать ограниченной классическими химиотерапевтическими агентами. Например, этой структурой может быть белок или полипептид, обладающий желаемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно активные токсины или их активные фрагменты, например абрин, рицин А, экзотоксин Pseudomonas или дифтерийный токсин; белок, например фактор некроза опухолей или γ-интерферон; или модификаторы биологических реакций, например лимфокины, интерлейкин-1, интерлейкин-2, интерлейкин-6, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, гранулоцитраный колониестимулирующий факторили другие факторы роста. Antibodies of this invention can also be conjugated to radioactive isotopes, such as iodine-131, yttrium-90 or indium-111, to create cytotoxic radioactive drugs for the treatment of disorders associated with CLDN6, such as cancer. The antibody conjugates of this invention can be used to modify a particular biological response, and the therapeutic construct should not be considered limited to classical chemotherapeutic agents. For example, this structure may be a protein or polypeptide having the desired biological activity. Such proteins may include, for example, enzymatically active toxins or active fragments thereof, such as abrin, ricin A, Pseudomonas exotoxin or diphtheria toxin; a protein such as tumor necrosis factor or interferon-γ; or biological response modifiers, such as lymphokines, interleukin-1, interleukin-2, interleukin-6, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, or other growth factors.
Методики конъюгирования подобных структур, обладающих терапевтическим эффектом, с антителами хорошо известны в данной области техники; см., например, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al. (eds. ), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982). Techniques for conjugating such structures having a therapeutic effect with antibodies are well known in the art; see, for example, Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).
В еще одном воплощении данного изобретения антитела присоединяются к хелатообразующей линкерной структуре (линкеру-хелатору), например тиуксетану, которая позволяет присоединить к антителу радиоактивный изотоп. In yet another embodiment of the present invention, the antibodies are attached to a chelating linker structure, such as tiuxetan, which allows a radioactive isotope to be attached to the antibody.
III. Фармацевтические композицииIII. Pharmaceutical compositions
В другом аспекте настоящего изобретения предлагаются композиции, например фармацевтические композиции, содержащие один вариант антител или комбинацию антител по данному изобретению. В состав этих фармацевтических композиций могут входить фармацевтически приемлемые носители и разбавители, а также любые другие известные дополнительные компоненты и эксипиенты в соответствии с общепринятыми методиками, описанными в работе Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. В одном из воплощений данного изобретения предлагаемые композиции включают комбинацию множества (например, двух или более) изолированных антител по данному изобретению, действующих различными путями, например одно антитело, которое преимущественно вызывает зависимую от комплемента цитотоксичность, сочетают с другим антителом , которое преимущественно вызывает апоптоз.In another aspect, the present invention provides compositions, for example pharmaceutical compositions, containing one variant of antibodies or a combination of antibodies according to this invention. These pharmaceutical compositions may contain pharmaceutically acceptable carriers and diluents, as well as any other known additional components and excipients in accordance with generally accepted procedures described in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. In one embodiment of the present invention, the present compositions include a combination of multiple (e.g., two or more) isolated antibodies of the present invention acting through different pathways, for example, a single antibody that predominantly causes complement-dependent cytotoxicity is combined with another antibody that preferentially induces apoptosis.
Фармацевтические композиции по данному изобретению можно использовать как часть комбинированной терапии, то есть сочетать с другими лечебными агентами. Например, такая комбинированная терапия может включать композицию по данному изобретению вместе с по меньшей мере одним противовоспалительным агентом или с по меньшей мере одним иммуносупрессивным агентом. В одном из воплощений данного изобретения такие терапевтические агенты включают один или более противовоспалительных агентов, например стероидные препараты или нестероидные противовоспалительные средства. Предпочтительные агенты включают, например аспирин и другие салицилаты, ингибиторы циклоокисгеназы-2 (Сох-2), например рофекоксиб (Vioxx), целекоксиб (Celebrex), нестероидные противовоспалительные средства, например ибупрофен (Motrin, Advil), фенопрофен (Nalfon), напроксен (Naprosyn), сулиндак (Clinoril), диклофенак (Voltaren), пироксикам (Feldene), кетопрофен (Orudis), дифлунизал (Dolobid), набуметон (Relafen), этодолак (Lodine), oксапрозин (Daypro) и индометацин (Indocin). The pharmaceutical compositions of this invention can be used as part of a combination therapy, that is, combined with other therapeutic agents. For example, such combination therapy may include a composition of this invention together with at least one anti-inflammatory agent or with at least one immunosuppressive agent. In one embodiment of the present invention, such therapeutic agents include one or more anti-inflammatory agents, such as steroid drugs or non-steroidal anti-inflammatory drugs. Preferred agents include, for example, aspirin and other salicylates, cyclooxygenase-2 (Cox-2) inhibitors, for example, rofecoxib (Vioxx), celecoxib (Celebrex), non-steroidal anti-inflammatory drugs, for example, ibuprofen (Motrin, Advil), fenoprofen (Nalfon), naproxen ( Naprosyn), sulindac (Clinoril), diclofenac (Voltaren), piroxicam (Feldene), ketoprofen (Orudis), diflunisal (Dolobid), nabumetone (Relafen), etodolac (Lodine), oxaprozin (Daypro), and indomethacin (Indocin).
В другом воплощении данного изобретения такие терапевтические агенты включают агенты, вызывающие истощение или функциональную инактивацию регуляторных Т-клеток; это циклофосфамид в малых дозах, антитела против CTLA4, против интерлейкина-2 или против рецептора интерлейкина-2. In another embodiment of the present invention, such therapeutic agents include agents that cause depletion or functional inactivation of regulatory T cells; these are low-dose cyclophosphamide, anti-CTLA4, anti-interleukin-2 or anti-interleukin-2 receptor antibodies.
В еще одном воплощении настоящего изобретения такие терапевтические агенты включают химиотерапевтические препараты, например производные таксола, таксотер, гемцитабин, 5-фторурацил, доксорубицин (Adriamycin), цисплатин (Platinol), циклофосфамид (Cytoxan, Procytox, Neosar). В другом воплощении данного изобретения предлагаемые антитела можно вводить индивиду в сочетании с химиотерапевтическими агентами, которые предпочтительно проявляют терапевтическую эффективность у больных раком, например раковыми заболеваниями, описываемыми в настоящем документе. In yet another embodiment of the present invention, such therapeutic agents include chemotherapeutic drugs, for example, taxol derivatives, Taxotere, gemcitabine, 5-fluorouracil, doxorubicin (Adriamycin), cisplatin (Platinol), cyclophosphamide (Cytoxan, Procytox, Neosar). In another embodiment of the present invention, the antibodies of the invention may be administered to a subject in combination with chemotherapeutic agents that preferably exhibit therapeutic efficacy in patients with cancer, such as the cancers described herein.
В еще одном воплощении настоящего изобретения предлагаемые антитела можно вводить индивиду параллельно лучевой терапии и/или аутологичной трансплантации стволовых клеток периферической крови или костного мозга.In yet another embodiment of the present invention, the present antibodies can be administered to an individual in parallel with radiation therapy and/or autologous peripheral blood or bone marrow stem cell transplantation.
В настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любой растворитель, дисперсионную среду, оболочку, антибактериальные или противогрибковые агенты, агенты, обеспечивающие нужное осмотическое давление и агенты, задерживающие абсорбцию, а также иные агенты, являющиеся физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель по данному изобретению подходит для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения активное вещество, например антитела, биспецифичные и полиспецифичные соединения, может быть покрыто материалом для защиты активного вещества от воздействия кислот и других естественных факторов, которые могут инактивировать активное вещество. As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" includes any solvent, dispersion medium, coating, antibacterial or antifungal agents, osmotic pressure agents and absorption delaying agents, and other agents that are physiologically compatible. Preferably, the carrier of the present invention is suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous, parenteral, spinal or epidermal administration (eg, by injection or infusion). Depending on the route of administration, the active substance, such as antibodies, bispecific and polyspecific compounds, may be coated with a material to protect the active substance from acids and other natural factors that can inactivate the active substance.
Термин «фармацевтически приемлемая соль» в настоящем документе относится к солям, которые сохраняют биологическую активность исходного соединения и не привносят каких-либо нежелательных токсических эффектов (см., например, Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19).The term “pharmaceutically acceptable salt” as used herein refers to salts that retain the biological activity of the parent compound and do not introduce any undesirable toxic effects (see, for example, Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19).
Примеры таких солей включают кислотные аддукты солей и щелочные аддукты солей. Кислотные аддукты солей включают производные нетоксичных неорганических кислот, например соляной, азотной, фосфорной, серной, бромистоводородной, йодистоводородной, фосфористой кислот и проч., а также производные нетоксичных органических кислот, например алифатических моно- и дикарбоновых кислот, фенил-замещенных алкановых кислот, гидроксиалкановых кислот, ароматических кислот, алифатических и ароматических сульфоновых кислот и проч. Щелочные аддукты солей включают производные щелочных и щелочноземельных металлов, например натрия, калия, магния, кальция и проч., а также производные нетоксичных органических аминов, например N,N'-дибензилэтилендиамина, N-метилглюкамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, прокаина и проч. Examples of such salts include acid salt adducts and alkaline salt adducts. Acid salt adducts include derivatives of non-toxic inorganic acids, for example hydrochloric, nitric, phosphoric, sulfuric, hydrobromic, hydroiodic, phosphorous acids, etc., as well as derivatives of non-toxic organic acids, for example aliphatic mono- and dicarboxylic acids, phenyl-substituted alkanoic acids, hydroxyalkanoic acids acids, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids, etc. Alkaline salt adducts include derivatives of alkali and alkaline earth metals, for example sodium, potassium, magnesium, calcium, etc., as well as derivatives of non-toxic organic amines, for example N,N'-dibenzylethylenediamine, N-methylglucamine, chloroprocaine, choline, diethanolamine, ethylenediamine, procaine and so on.
Композиции по настоящему изобретению можно вводить индивиду различными методами, известными в данной области техники, специалистам в которой понятно, что путь и/или способ введения будут варьировать в зависимости от желаемых результатов. Активное вещество может быть объединено с носителем. который предотвратит его быстрое высвобождение, например активное вещество может входить в состав лекарственной формы с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, пластыри для трансдермального введения и системы на основе микрокапсул, в которые заключается активное вещество. Здесь могут использоваться подлежащие биологической деградации и биологически совместимые полимеры, например этиленвинилацета, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Методы изготовления таких препаратов общеизвестны в данной области техники; см., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. The compositions of the present invention can be administered to an individual by various methods known in the art, in which those skilled in the art will understand that the route and/or method of administration will vary depending on the desired results. The active substance may be combined with a carrier. which will prevent its rapid release, for example the active substance may be formulated in a controlled release dosage form, including implants, transdermal patches and microcapsule systems enclosing the active substance. Biodegradable and biocompatible polymers can be used here, for example ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters and polylactic acid. Methods for preparing such preparations are well known in the art; see, for example, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
Для применения некоторых способов введения активного вещества в организм может потребоваться покрыть это вещество материалом, предотвращающим его инактивацию, или вводить вместе с таким материалом. Например, активное вещество может вводиться индивиду в подходящем носителе, например в липосомах, или в разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический раствор и водные буферные растворы. Липосомы включают эмульсии типа «вода в масле в воде» (СGF Inc.), а также обычные липосомы (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27). Some methods of introducing an active substance into the body may require that the substance be coated with or administered together with a material that prevents inactivation. For example, the active substance may be administered to the individual in a suitable carrier, for example liposomes, or in a diluent. Pharmaceutically acceptable diluents include saline and aqueous buffer solutions. Liposomes include water-in-oil-in-water emulsions (CGF Inc.) as well as conventional liposomes (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления инъецируемого раствора или дисперсии непосредственно перед введением. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области техники. За исключением случаев несовместимости обычных сред или агентов с активным веществом по данному изобретению, любые среды и агенты могут использоваться в фармацевтических композициях по данному изобретению. В эти композиции могут входить также дополнительные активные вещества. Pharmaceutically acceptable carriers include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for preparation of an injectable solution or dispersion immediately prior to administration. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is known in the art. Except in cases of incompatibility of conventional vehicles or agents with the active substance of this invention, any vehicles and agents can be used in the pharmaceutical compositions of this invention. These compositions may also contain additional active substances.
Как правило, терапевтические композиции должны быть стерильными и стабильными в условиях изготовления и хранения. Композиции по данному изобретению могут быть представлены раствором, микроэмульсией, липосомами или другими упорядоченными структурами, подходящими для высокой концентрации лекарственного препарата. Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащие, например, воду, этиловый спирт, многоатомный спирт (Например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Нужная текучесть поддерживается, например, при помощи кроющего материала, например лецитина, путем достижения требующегося размера частиц (в случае дисперсий) и при помощи поверхностно-активных агентов. Во многих случаях предпочтительно включать в состав композиции агенты, обеспечивающие нужное осмотическое давление, например сахара, многоатомные спирты (например, манит, сорбит) или хлорид натрия. Продление абсорбции композиции, вводимой путем инъекции, достигается включением в ее состав агента, задерживающего абсорбцию, например однозамещенных солей стеариновой кислоты и желатина.In general, therapeutic compositions must be sterile and stable under the conditions of manufacture and storage. The compositions of this invention may be presented as a solution, microemulsion, liposomes, or other ordered structures suitable for high drug concentrations. The carrier may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethyl alcohol, polyhydric alcohol (For example, glycerin, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, etc.) and suitable mixtures thereof. The desired fluidity is maintained, for example, by using a coating material such as lecithin, by achieving the required particle size (in the case of dispersions) and by using surfactants. In many cases, it is preferable to include agents that provide the desired osmotic pressure, such as sugars, polyhydric alcohols (eg, mannitol, sorbitol) or sodium chloride. Prolongation of absorption of a composition administered by injection is achieved by including in its composition an agent that delays absorption, for example monosubstituted salts of stearic acid and gelatin.
Стерильные растворы для инъекций можно готовить путем объединения требующегося количества активного вещества в подходящем растворителе с одним из упомянутых выше ингредиентов или с их комбинацией и последующей стерилизацией микрофильтрацией.Sterile injection solutions can be prepared by combining the required amount of the active substance in a suitable solvent with one or a combination of the above ingredients and subsequent sterilization by microfiltration.
Как правило, дисперсии получают путем включения активного вещества в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из числа упомянутых выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций, то предпочтительными методами их получения являются высушивание в вакууме и высушивание замораживанием (лиофилизация), которые позволяют получить в виде порошка активное вещество вместе с любым дополнительным желаемым ингредиентом из их раствора, предварительно стерилизованного фильтрованием.Typically, dispersions are prepared by incorporating the active substance into a sterile vehicle containing a basic dispersion medium and other necessary ingredients from those mentioned above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injection solutions, the preferred methods for their preparation are vacuum drying and freeze drying (lyophilization), which allow the active substance to be obtained in powder form along with any additional desired ingredient from their solution, previously sterilized by filtration.
Дозировка и режим введения подбираются так, чтобы обеспечить оптимальную желаемую реакцию (например, лечебный эффект). Например, можно вводить некоторую дозу однократно или же в несколько приемов на протяжении некоторого промежутка времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от терапевтических показаний в конкретной ситуации. Особенно предпочтительно составлять композицию для парентерального введения как единичную лекарственную форму - это облегчает введение и обеспечивает единообразие дозировки. В настоящем документе термин единичная лекарственная форма означает физически отдельные единицы, удобные для разового введения нуждающемуся в том индивиду; каждая единица содержит заранее определенное количество активного вещества, рассчитанное таким образом, чтобы достичь желаемого терапевтического эффекта, вместе с нужным фармацевтическим носителем. The dosage and mode of administration are selected to ensure the optimal desired response (for example, therapeutic effect). For example, a dose may be administered as a single dose or in divided doses over a period of time, or the dose may be proportionally decreased or increased depending on the therapeutic indications in a particular situation. It is particularly preferable to formulate the composition for parenteral administration as a single dosage form to facilitate administration and ensure uniformity of dosage. As used herein, the term unit dosage form means physically separate units convenient for single administration to an individual in need; each unit contains a predetermined amount of active substance, calculated to achieve the desired therapeutic effect, together with the desired pharmaceutical carrier.
Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые вещества, например аскорбиновая кислота, цистеина гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и проч.; (2) жирорастворимые вещества, например аскорбилпальмитат, гидроксианизола бутилат (ВНА), гидрокситолуола бутилат (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, α-токоферол и проч.; (3) агенты, образующие комплексы с металлами (хелатирующие), например, лимонная кислота, этилендиаминтетраацетат (EDTA),сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и проч.Examples of pharmaceutically acceptable antioxidants include: (1) water-soluble substances such as ascorbic acid, cysteine hydrochloride, sodium bisulfate, sodium metabisulfite, sodium sulfite, etc.; (2) fat-soluble substances, such as ascorbyl palmitate, hydroxyanisole butylate (BHA), hydroxytoluene butylate (HNT), lecithin, propyl gallate, α-tocopherol, etc.; (3) metal complexing agents (chelating agents), such as citric acid, ethylenediaminetetraacetate (EDTA), sorbitol, tartaric acid, phosphoric acid, etc.
Составы терапевтических композиций по данному изобретению включают предназначенные для перорального, назального, местного (включая буккальное и подъязычное), ректального, вагинального и/или парентерального введения. Эти препараты могут быть для удобства представлены как единичная лекарственная форма и могут быть изготовлены любым методом, известным в области фармацевтики. Количество активного ингредиента, объединяемое с материалом носителя для получения единичной лекарственной формы варьирует в зависимости от индивидуальных потребностей пациента и конкретного способа введения препарата. Как правило, количество активного ингредиента, объединяемое с материалом носителя для получения единичной лекарственной формы, должно быть таким, чтобы вызвать терапевтический эффект. The therapeutic compositions of this invention include those intended for oral, nasal, topical (including buccal and sublingual), rectal, vaginal and/or parenteral administration. These preparations may be conveniently presented as a unit dosage form and may be manufactured by any method known in the pharmaceutical art. The amount of active ingredient combined with the carrier material to obtain a unit dosage form varies depending on the individual needs of the patient and the specific route of administration of the drug. Generally, the amount of active ingredient combined with the carrier material to produce a unit dosage form should be such as to produce a therapeutic effect.
Препараты по данному изобретению, пригодные для вагинального введения, включают также пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пенящиеся или аэрозольные составы, содержащие подходящие носители, известные в данной области техники. Лекарственные формы для местного и трансдермального введения композиций по данному изобретению включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и вдыхаемые препараты. Активное вещество можно смешивать в условиях стерильности с фармацевтически приемлемым носителем и при необходимости с любыми консервантами, забуферивающими агентами или пропеллентами.Formulations of this invention suitable for vaginal administration also include pessaries, tampons, creams, gels, pastes, foams or aerosol formulations containing suitable carriers known in the art. Dosage forms for topical and transdermal administration of the compositions of this invention include powders, sprays, ointments, pastes, creams, lotions, gels, solutions, patches and inhalable preparations. The active substance can be mixed under sterile conditions with a pharmaceutically acceptable carrier and, if necessary, with any preservatives, buffering agents or propellants.
Термин «парентеральное введение» и выражение «вводится парентерально» в настоящем документе означают способы введения препарата в организм помимо энтерального и местного путей; обычно они подразумевают инъекции и включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) внутривенные, внутримышечные, интраартериальные, интратекальные, интракапсулярные, интраорбитальные, интракардиальные, интрадермальные, интраперитонеальные, транстрахеальные, подкожные, субкутикулярные, внутрисуставные, субкапсулярные, субаракноидальные, интраспинальные, эпидуральные и интрастернальные инъекции и инфузии. The term “parenteral administration” and the expression “administered parenterally” as used herein mean methods of administering a drug to the body other than the enteral and local routes; they typically involve injections and include (but are not limited to those listed here) intravenous, intramuscular, intraarterial, intrathecal, intracapsular, intraorbital, intracardial, intradermal, intraperitoneal, transtracheal, subcutaneous, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidal, intraspinal, epidural, and intrasternal injections and infusions. Zia .
Примеры водных и неводных носителей, пригодных для использования в фармацевтических композициях по данному изобретению, включают воду, этиловый спирт, многоатомные спирты (например, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и подходящие их смеси, растительные масла (например, оливковое масло), пригодные для инъекций органические эфиры (например, этилолеат). Должная текучесть поддерживается, например, при помощи кроющих материалов, например лецитина, путем достижения требующегося размера частиц (в случае дисперсий) и при помощи поверхностно-активных агентов. Examples of aqueous and non-aqueous carriers suitable for use in the pharmaceutical compositions of this invention include water, ethyl alcohol, polyhydric alcohols (for example, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.) and suitable mixtures thereof, vegetable oils (for example, olive oil ), injectable organic esters (eg ethyl oleate). Proper fluidity is maintained, for example, by using coating materials such as lecithin, by achieving the required particle size (in the case of dispersions) and by using surfactants.
Композиции по данному изобретению могут также содержать дополнительные компоненты, например консерванты, увлажняющие агенты, эмульгирующие и диспергирующие агенты. Предотвратить присутствие микроорганизмов можно как путем стерилизации тем или иным способом, так и с помощью включения в состав композиции антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенов, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и т.п. Может быть также желательно включить в состав композиции агенты, обеспечивающие нужное осмотическое давление, например сахара, хлорид натрия и проч. Кроме того, продление абсорбции фармацевтической формы, вводимой путем инъекции, достигается включением в ее состав агентов, задерживающих абсорбцию, например однозамещенного стеарата алюминия и желатина.The compositions of this invention may also contain additional components, for example preservatives, wetting agents, emulsifying and dispersing agents. The presence of microorganisms can be prevented either by sterilization in one way or another, or by including antibacterial and antifungal agents in the composition, for example parabens, chlorobutanol, phenolsorbic acid, etc. It may also be desirable to include in the composition agents that provide the desired osmotic pressure, for example sugars, sodium chloride, etc. In addition, prolongation of absorption of the pharmaceutical form administered by injection is achieved by the inclusion of absorption delaying agents, for example monosubstituted aluminum stearate and gelatin.
Независимо от выбранного пути введения соединения по данному изобретению, которые можно использовать в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции по данному изобретению, включаются в состав фармацевтически приемлемых лекарственных форм при помощи методов, известных специалистам в данной области техники.Regardless of the route of administration chosen, the compounds of this invention, which can be used in a suitable hydrated form, and/or the pharmaceutical compositions of this invention are formulated into pharmaceutically acceptable dosage forms using methods known to those skilled in the art.
Конкретное содержание активных ингредиентов в фармацевтических композициях по данному изобретению и дозировка препарата могут варьировать таким образом, чтобы активный ингредиент присутствовал в эффективном количестве, вызывающем желаемый терапевтический эффект у конкретного пациента при конкретном составе препарата и при выбранном способе его введения, не оказывая в то же время токсического действия на данного индивида. Выбор концентрации активного ингредиента в препарате и дозировкиThe specific content of active ingredients in the pharmaceutical compositions of this invention and the dosage of the drug can be varied so that the active ingredient is present in an effective amount to produce the desired therapeutic effect in a particular patient for a particular formulation of the drug and for the chosen route of administration, without at the same time causing toxic effect on a given individual. Selecting the concentration of the active ingredient in the drug and dosage
препарата определяются рядом фармакокинетических факторов, включая активность конкретной применяемой композиции по данному изобретению, способ и режим введения препарата, скорость выведения данного соединения из организма, продолжительность курса лечения, другие лекарственные препараты, вещества и/или материалы, используемые в сочетании с данными композициями, возраст, пол, массу тела, общее состояние здоровья и конкретное состояние пациента, его историю болезни, а также другие факторы, хорошо известные в области медицины. of the drug are determined by a number of pharmacokinetic factors, including the activity of the specific composition used according to this invention, the method and mode of administration of the drug, the rate of elimination of this compound from the body, the duration of the course of treatment, other drugs, substances and/or materials used in combination with these compositions, age , gender, body weight, general and specific health of the patient, medical history, as well as other factors well known in the medical field.
Врачам и ветеринарам, ориентирующимся в данной области техники, не составит труда определить и назначить эффективное в конкретном случае количество нужной фармацевтической композиции. Например, применение соединений по данному изобретению в составе фармацевтических композиций у человека или животного можно начать с доз ниже требующихся для достижения желаемого лечебного эффекта и постепенно увеличивать дозировку до тех пор, пока желаемый эффект не будет достигнут. Вообще говоря, подходящей суточной дозой композиции по данному изобретению будет такая, при которой количество активного вещества минимально для эффективного оказания лечебного действия. Такая эффективная доза, как правило, зависит от рассмотренных выше факторов. Предпочтительные пути введения - внутривенный, внутримышечный, внутрибрюшинный или подкожный, причем место введения предпочтительно проксимально по отношению к локализации мишени. При желании эффективную суточную дозу терапевтической композиции можно вводить, разделив ее на два, три, четыре, пять, шесть или более приемов, распределенных с соответствующими интервалами на протяжении суток, при необходимости используя единичные лекарственные формы. Хотя соединение по данному изобретению возможно вводить само по себе, предпочтительно вводить его в составе фармацевтического препарата (композиции). It will not be difficult for doctors and veterinarians familiar with this field of technology to determine and prescribe the amount of the desired pharmaceutical composition that is effective in a particular case. For example, the use of the compounds of this invention in pharmaceutical compositions in humans or animals can be started at doses below those required to achieve the desired therapeutic effect and gradually increase the dosage until the desired effect is achieved. Generally speaking, a suitable daily dose of the composition of this invention will be one at which the amount of active substance is minimal to effectively provide a therapeutic effect. Such an effective dose will generally depend on the factors discussed above. Preferred routes of administration are intravenous, intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous, with the site of administration preferably proximal to the target location. If desired, an effective daily dose of the therapeutic composition may be administered in two, three, four, five, six or more divided doses spaced at appropriate intervals throughout the day, using unit dosage forms if necessary. Although the compound of this invention can be administered by itself, it is preferable to administer it as part of a pharmaceutical preparation (composition).
В одном из воплощений данного изобретения предлагаемые антитела вводят пациенту путем инфузии, предпочтительно медленно непрерывно на протяжении продолжительного времени, например долее 24 часов, чтобы уменьшить токсические побочные эффекты. Введение путем непрерывной инфузии можно также осуществлять за период от 2 до 24 часов, например от 2 до 12 часов, повторяя, если нужно, еще один или несколько раз через, например, 6 или 12 месяцев. Дозировку можно определить или нужным образом изменить, измеряя количество моноклональных антител против CLDN6 в кровотоке после введения биологического образца с помощью антиидиотипических антител, мишенью которых являются антитела против CLDN6.In one embodiment of the present invention, the antibodies of the invention are administered to a patient by infusion, preferably slowly over an extended period of time, for example over 24 hours, to reduce toxic side effects. Administration by continuous infusion can also be carried out over a period of 2 to 24 hours, for example from 2 to 12 hours, repeating, if necessary, one or more times after, for example, 6 or 12 months. The dosage can be determined or adjusted as appropriate by measuring the amount of anti-CLDN6 monoclonal antibodies in the bloodstream after administration of a biological sample using anti-idiotypic antibodies that target anti-CLDN6 antibodies.
В другом воплощении данного изобретения предлагаемые антитела вводят в режиме поддерживающей терапии, например раз в неделю на протяжении 6 месяцев или дольше.In another embodiment of the present invention, the antibodies of the invention are administered in a maintenance regimen, for example once a week for 6 months or longer.
В еще одном воплощении данного изобретения предлагаемые антитела вводят по схеме, включающей одну инфузию антител против CLDN6, после которой проводят инфузию антител против CLDN6, конъюгированных с радиоактивным изотопом. Эту схему можно повторить, например 7-9 суток спустя. In yet another embodiment of the present invention, the antibodies of the invention are administered in a regimen comprising a single infusion of anti-CLDN6 antibodies followed by an infusion of anti-CLDN6 antibodies conjugated to a radioactive isotope. This scheme can be repeated, for example 7-9 days later.
В одном из воплощений данного изобретения вещества терапевтического назначения включают в липосомы. В более предпочтительном воплощении данного изобретения липосомы несут нацеливающую структуру. В наиболее предпочтительном воплощении вещества терапевтического назначения в липосомах вводят в ударной дозе, причем место введения проксимально по отношению к нужному участку тела, например к месту расположения опухоли. Эта композиция должна быть достаточно жидкой, чтобы ее легко было вводить шприцем. И она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения, защищенной от загрязнения микроорганизмами, например бактериями и грибами. In one embodiment of the present invention, therapeutic substances are included in liposomes. In a more preferred embodiment of the present invention, the liposomes carry a targeting structure. In the most preferred embodiment, the therapeutic substances in liposomes are administered in a loading dose, with the site of administration proximal to the desired site of the body, for example the site of a tumor. The composition should be sufficiently liquid to be easily administered by syringe. And it must be stable under the conditions of manufacture and storage, protected from contamination by microorganisms such as bacteria and fungi.
В еще одном воплощении данного изобретения предлагаемые антитела обработаны таким образом. чтобы предотвратить или сократить их перенос через плаценту. Это достигается известными в данной области техники способами, например путем ПЭГилирования антител или при помощи фрагментов F(ab)2'. Можно также сослаться на работы Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J. Immunol. Methods, 152: 177-190; "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 279-283. In yet another embodiment of the present invention, the antibodies of the invention are processed in this manner. to prevent or reduce their transfer across the placenta. This is achieved by methods known in the art, for example by PEGylation of antibodies or using F(ab)2' fragments. Reference may also be made to Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J. Immunol. Methods, 152: 177-190; "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 279-283.
Терапевтически эффективную дозу при онкотерапии можно определить по объективной реакции опухоли, которая может быть полной или же частичной. Полная реакция (CR) - это отсутствие клинических, радиологических или каких-либо иных признаков болезни. Частичная реакция (PR) - это сокращение размеров опухолевого образования более чем на 50%. Продолжительность объективной реакции опухоли характеризуется средним временем до прогрессирования. The therapeutically effective dose for oncology therapy can be determined by the objective response of the tumor, which can be complete or partial. Complete response (CR) is the absence of clinical, radiological or any other signs of disease. Partial response (PR) is a reduction in tumor size by more than 50%. The duration of objective tumor response is characterized by the average time to progression.
Терапевтически эффективную дозу препарата при онкотерапии можно также определить по его способности стабилизировать прогрессирование болезни. Способность вещества подавлять рак можно оценить с помощью животных моделей, по которым можно предсказать эффективность препарата в отношении опухолей человека. Или же это свойство композиции можно оценить, изучая способность данного вещества подавлять пролиферацию клеток или апоптоз методами in vitro, известными специалистам в данной области техники. Терапевтически эффективное количество вещества лечебного назначения может обеспечить сокращение размеров опухоли или как-либо иначе ослабить симптомы болезни у пациента. Рядовой специалист в данной области техники вполне сможет определить это количество на основании таких факторов, как масса тела пациента, выраженность симптомов, конкретный состав композиции и выбранный способ введения препарата. The therapeutically effective dose of a drug for oncology therapy can also be determined by its ability to stabilize the progression of the disease. The ability of a substance to suppress cancer can be assessed using animal models, which can predict the drug's effectiveness against human tumors. Alternatively, this property of the composition can be assessed by studying the ability of the substance to inhibit cell proliferation or apoptosis by in vitro methods known to those skilled in the art. A therapeutically effective amount of a therapeutic agent may reduce the size of a tumor or otherwise reduce symptoms of a disease in a patient. One of ordinary skill in the art would be able to determine this amount based on factors such as the patient's body weight, severity of symptoms, the specific composition of the formulation, and the chosen route of administration.
Композиция по данному изобретению должна быть стерильной и достаточно жидкой, чтобы ее можно было вводить с помощью шприца. Помимо воды носитель может быть изотоническим буферным солевым раствором, этиловым спиртом, многоатомным спиртом (например, глицерином, пропиленгликолем, жидким полиэтиленгликолем и т.п.) и их подходящими смесями. Должная текучесть поддерживается, например, при помощи кроющих материалов, например лецитина, путем достижения требующегося размера частиц (в случае дисперсий) и при помощи поверхностно-активных агентов. Во многих случаях предпочтительно включать в состав композиции агенты, обеспечивающие нужное осмотическое давление, например сахара, многоатомные спирты (например, маннит или сорбит) и хлорид натрия. Длительная абсорбция композиции, вводимой путем инъекции, достигается включением в ее состав агентов, задерживающих абсорбцию, например однозамещенного стеарата алюминия или желатина.The composition of this invention must be sterile and liquid enough to be administered by syringe. In addition to water, the carrier may be isotonic buffered saline, ethyl alcohol, polyhydric alcohol (eg, glycerol, propylene glycol, liquid polyethylene glycol, etc.), and suitable mixtures thereof. Proper fluidity is maintained, for example, by using coating materials such as lecithin, by achieving the required particle size (in the case of dispersions) and by using surfactants. In many cases, it is preferable to include agents that provide the desired osmotic pressure, such as sugars, polyhydric alcohols (eg, mannitol or sorbitol) and sodium chloride. Prolonged absorption of the injectable composition is achieved by the inclusion of absorption delaying agents, such as aluminum stearate or gelatin.
Когда активное вещество должным образом защищено, как описано выше, его можно вводить перорально, например с инертным разбавителем или усваиваемым съедобным носителем. When the active substance is properly protected as described above, it can be administered orally, for example with an inert diluent or digestible edible carrier.
IV. Применения и способы по данному изобретениюIV. Applications and methods of this invention
Антитела по данному изобретению (включая иммуноконъюгаты, биспецифичные/полиспецифичные агенты, композиции и другие производные, описанные в настоящем документе) находят множество применений в терапевтических целях, имеющих отношение к лечению расстройств, затрагивающих клетки, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью. Например, антитела по данному изобретению можно вводить в культивируемые клетки, например in vitro или ex vivo, или пациентам (людям), например in vivo, для лечения или предотвращения различных расстройств, описанных в настоящем документе. Предпочтительные объекты такого воздействия включают пациентов (людей) с расстройствами, которые подлежат коррекции или при которых возможно облегчение состояния пациента путем уничтожения пораженных клеток, в частности клеток, отличающихся измененной по сравнению с нормальными клетками экспрессией CLDN6 и/или измененной связью CLDN6 с их поверхностью.The antibodies of this invention (including immunoconjugates, bispecific/multispecific agents, compositions and other derivatives described herein) have a variety of therapeutic uses relevant to the treatment of disorders affecting cells in which CLDN6 is expressed and which are characterized in that CLDN6 connected to their surface. For example, the antibodies of this invention can be administered to cultured cells, eg in vitro or ex vivo, or to human patients, eg in vivo, to treat or prevent various disorders described herein. Preferred targets include human patients with disorders that can be corrected or that can be alleviated by killing affected cells, particularly cells that have altered expression of CLDN6 compared to normal cells and/or altered association of CLDN6 with their surface.
Например, в одном из воплощений настоящего изобретения предлагаемые антитела используются для лечения пациента с онкогенным расстройством, например с расстройством, при котором характерно присутствие клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью. Примерами онкогенных заболеваний, которые можно лечить и/или предотвращать, являются все раковые заболевания и опухоли с экспрессией CLDN6, включая описанные в настоящем документе. For example, in one embodiment of the present invention, the antibodies of the invention are used to treat a patient with an oncogenic disorder, for example a disorder characterized by the presence of cells that express CLDN6 and that have CLDN6 associated with their surface. Examples of oncogenic diseases that can be treated and/or prevented are all cancers and tumors that express CLDN6, including those described herein.
Фармацевтические композиции и способы лечения по данному изобретению можно также использовать для иммунизации или вакцинации для предотвращения заболеваний, описанных в настоящем документе. The pharmaceutical compositions and methods of treatment of this invention can also be used for immunization or vaccination to prevent the diseases described herein.
В другом воплощении данного изобретения предлагаемые антитела используются для определения уровня CLDN6 или конкретных форм CLDN6, или количества клеток, содержащих CLDN6 на поверхности своей мембраны, и полученные таким образом величины затем связывают с определенными заболеваниями или симптомами наподобие описанных выше. Или же антитела по данному изобретению используют для истощения или нарушения функции клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью; тем самым выявляется важное участие этих клеток в развитии заболевания. Это реализуется путем инкубации изучаемого и контрольного образцов с антителами против CLDN6 в условиях, при которых возможно образование комплекса между взятыми антителами и CLDN6. Выявляются любые комплексы, образовавшиеся в результате взаимодействия взятых антител с CLDN6, и по ним сравниваются опытный и контрольный (референсный) образцы. In another embodiment of the present invention, the antibodies of the invention are used to determine the level of CLDN6 or specific forms of CLDN6, or the number of cells containing CLDN6 on the surface of their membrane, and the values thus obtained are then associated with certain diseases or symptoms such as those described above. Alternatively, the antibodies of this invention are used to deplete or disrupt the function of cells that express CLDN6 and that have CLDN6 associated with their surface; thereby revealing the important participation of these cells in the development of the disease. This is achieved by incubating the test and control samples with antibodies against CLDN6 under conditions that allow the formation of a complex between the antibodies taken and CLDN6. Any complexes formed as a result of the interaction of the taken antibodies with CLDN6 are identified, and the experimental and control (reference) samples are compared using them.
Вначале у антител по данному изобретению проверяют их связывающую активность, имеющую отношение к терапевтическим и диагностическим применениям, in vitro. Например, для этого можно применить метод проточной цитометрии, как описано в настоящем документе. First, the antibodies of this invention are tested for their binding activity relevant to therapeutic and diagnostic applications in vitro. For example, this can be done using flow cytometry as described herein.
С помощью антител по данному изобретению можно вызывать in vivo или in vitro одну или более из следующих биологических активностей: ингибирование пролиферации и/или дифференцировки клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью; уничтожение клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью; опосредование фагоцитоза клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью, или направленной на них антителозависимой клеточной цитотоксичности в присутствии эффекторных клеток; опосредование комплемент-зависимой цитотоксичности, направленной на клетки, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью, в присутствии комплемента; опосредование апоптоза клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью; индуцирование гомотипической адгезии; и/или индуцирование переноса в липидные рафты после связывания CLDN6.The antibodies of this invention can induce in vivo or in vitro one or more of the following biological activities: inhibition of proliferation and/or differentiation of cells in which CLDN6 is expressed and which are characterized in that CLDN6 is associated with their surface; killing cells that express CLDN6 and that have CLDN6 associated with their surface; mediating phagocytosis of cells in which CLDN6 is expressed and which differ in that CLDN6 is associated with their surface, or directed at them by antibody-dependent cellular cytotoxicity in the presence of effector cells; mediating complement-dependent cytotoxicity directed at cells that express CLDN6 and that have CLDN6 bound to their surface in the presence of complement; mediating apoptosis of cells in which CLDN6 is expressed and which differ in that CLDN6 is associated with their surface; induction of homotypic adhesion; and/or inducing trafficking into lipid rafts following CLDN6 binding.
В одном конкретном воплощении данного изобретения антитела используют in vivo или in vitro для лечения, предотвращения или диагностики различных заболеваний, ассоциированных с CLDN6. Примеры заболеваний, ассоциированных с CLDN6, включают помимо прочего раковые заболевания, например описанные в настоящем документе. In one specific embodiment of the present invention, the antibodies are used in vivo or in vitro for the treatment, prevention or diagnosis of various diseases associated with CLDN6. Examples of diseases associated with CLDN6 include, but are not limited to, cancers, such as those described herein.
Как говорилось выше, антитела против CLDN6 по данному изобретению можно вводить пациенту вместе с одним или более других терапевтических агентов, например цитотоксических агентов, радиоактивных агентов, агентов, препятствующих ангиогенезу, и/или иммуносупрессоров, для того, чтобы ослабить индукцию иммунного ответа против антител по данному изобретению. Эти антитела могут быть соединены с тем или иным агентом, образуя иммунокомплекс, или их вводят отдельно от взятого агента. В последнем случае (раздельное введение) антитела могут быть введены до, после или одновременно с дополнительным агентом или могут комбинироваться с другими известными терапевтическими подходами, например, с противораковой терапией, например с лучевой терапией. Такие терапевтические агенты включают, помимо прочего, агенты, препятствующие неоплазии, например упомянутые выше. Введение антител против CLDN6 по данному изобретению вместе с химиотерапевтическими агентами дает двоякое противораковое действие посредством различных механизмов, приводя к цитотоксическому эффекту в отношении опухолевых клеток. Такое совместное введение может решить проблемы развития невосприимчивости к препаратам или изменения антигенных свойств опухоли, что делает ее не способной взаимодействовать с данными антителами. As discussed above, the anti-CLDN6 antibodies of the present invention can be administered to a patient along with one or more other therapeutic agents, such as cytotoxic agents, radioactive agents, anti-angiogenesis agents, and/or immunosuppressants, in order to attenuate the induction of an immune response against the anti-CLDN6 antibodies. this invention. These antibodies can be combined with one or another agent, forming an immunocomplex, or they can be administered separately from the agent taken. In the latter case (separate administration), the antibodies can be administered before, after or simultaneously with an additional agent or can be combined with other known therapeutic approaches, for example, with anti-cancer therapy, such as radiation therapy. Such therapeutic agents include, but are not limited to, anti-neoplasia agents such as those mentioned above. Administration of the anti-CLDN6 antibodies of the present invention along with chemotherapeutic agents produces dual anticancer effects through different mechanisms, resulting in a cytotoxic effect on tumor cells. Such co-administration may solve the problem of developing drug resistance or changing the antigenic properties of the tumor, which makes it unable to interact with these antibodies.
Композиции (например, антитела, полиспецифичные и биспецифичные агенты, иммуноконъюгаты) по данному изобретению, содержащие места связывания комплемента, например участки в молекулах IgG1, -2 или -3 или IgM, связывающие комплемент, также можно использовать в присутствии комплемента. В одном из воплощений данного изобретения обработка популяции клеток, включающей клетки-мишени, ex vivo связывающим агентом по данному изобретению и соответствующими эффекторными клетками дополняется добавлением комплемента или сыворотки, содержащей комплемент. Связывание белков комплемента способствует фагоцитозу клеток-мишеней, несущих на своей поверхности связывающий агент по данному изобретению. В другом воплощении данного изобретения клетки, несущие на своей поверхности композиции по данному изобретению, подвергаются лизису при участии комплемента. В еще одном воплощении данного изобретения предлагаемые композиции не активируют комплемент. Compositions (eg, antibodies, polyspecific and bispecific agents, immunoconjugates) of this invention containing complement binding sites, such as complement binding sites in IgG1, -2 or -3 or IgM molecules, can also be used in the presence of complement. In one embodiment of the present invention, ex vivo treatment of a population of cells comprising target cells with the binding agent of the present invention and corresponding effector cells is supplemented by the addition of complement or serum containing complement. Binding of complement proteins promotes phagocytosis of target cells carrying on their surface the binding agent of this invention. In another embodiment of the present invention, cells bearing on their surface the compositions of this invention are subject to lysis with the participation of complement. In yet another embodiment of the present invention, the present compositions do not activate complement.
Композиции по данному изобретению можно вводить в организм вместе с комплементом. Соответственно, в объем данного изобретения входят композиции, содержащие антитела, полиспецифичные и биспецифичные агенты и сыворотку или комплемент. Эти композиции обладают тем преимуществом, что комплемент оказывается в тесной близости от антител, биспецифичных и полиспецифичных молекул. The compositions of this invention can be administered to the body along with complement. Accordingly, compositions containing antibodies, polyspecific and bispecific agents, and serum or complement are included within the scope of this invention. These compositions have the advantage that complement is in close proximity to antibodies, bispecific and polyspecific molecules.
Или же антитела, полиспецифичные и биспецифичные агенты по данному изобретению и сыворотку или комплемент вводят по отдельности Связывание композиций по данному изобретению с клетками-мишенями может вызывать перенос комплекса антиген CLDN6-антитело в липидный рафт («плотик») клеточной мембраны. Благодаря такому переносу создается высокая плотность комплексов антиген-антитело, что может эффективно активировать и/или усиливать цитотоксичность, зависимую от комплемента. Alternatively, the antibodies, polyspecific and bispecific agents of the invention, and serum or complement are administered separately. Binding of the compositions of the invention to target cells may cause the CLDN6 antigen-antibody complex to be transported into a lipid raft of the cell membrane. This transfer creates a high density of antigen-antibody complexes that can effectively activate and/or enhance complement-dependent cytotoxicity.
В объем данного изобретения входят также наборы, включающие композиции на основе антител (например, антитела и иммуноконъюгаты) и инструкции по их применению. Такой набор может также содержать один или более дополнительных реагентов, например иммуносупрессор, цитотоксический агент или радиоактивно токсический агент, или одно или более дополнительных антител по данному изобретению (например, антитела с комплементарной активностью). Also included within the scope of this invention are kits comprising antibody compositions (eg, antibodies and immunoconjugates) and instructions for their use. Such a kit may also contain one or more additional reagents, such as an immunosuppressive agent, a cytotoxic agent, or a radiotoxic agent, or one or more additional antibodies of the invention (eg, antibodies with complementary activity).
Соответственно, пациентам, получающим композиции на основе антител по данному изобретению, можно дополнительно вводить (до, одновременно с или после введения антител) другой терапевтический агент, например, цитотоксический или радиоактивно токсический агент, который усиливает или продлевает терапевтический эффект антител по данному изобретению.Accordingly, patients receiving antibody compositions of the present invention may be additionally administered (before, concurrently with, or after administration of the antibodies) another therapeutic agent, such as a cytotoxic or radiotoxic agent, that enhances or prolongs the therapeutic effect of the antibodies of the present invention.
В других воплощениях данного изобретения пациент может дополнительно получать агент, модулирующий, например усиливающий или ингибирующий, экспрессию или активность рецепторов Fc-γ или Fc-α путем; таким агентом может быть, например, цитокин. Предпочтительные в этом отношении цитокины включают гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарнов-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), γ-интерферон (IFN-γ) и фактор некроза опухолей (TNF). К числу важных агентов для увеличения терапевтической эффективности антител и фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе, относятся β-глюканы, которые представляют собой разветвленные гомополисахариды, состоящие из остатков глюкозы; они образуются у различных растений (например, в семенах злаков) и микроорганизмов, например бактерий, водорослей и грибов (включая дрожжи). Можно использовать также фрагменты молекул β-глюканов, производимых живыми организмами. Предпочтительны β-глюканы, являющиеся полимерами β(1,3) глюкозы, в которых по крайней мере некоторые из остатков глюкозы главной цепи, например 3-6% остатков глюкозы главной цепи, имеют β(1,6) ответвления.In other embodiments of the present invention, the patient may additionally receive an agent that modulates, for example enhancing or inhibiting, the expression or activity of Fc-γ or Fc-α receptors by; such an agent may be, for example, a cytokine. Preferred cytokines in this regard include granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ) and tumor necrosis factor (TNF). Important agents for enhancing the therapeutic efficacy of antibodies and pharmaceutical compositions described herein include β-glucans, which are branched homopolysaccharides consisting of glucose units; they are produced by a variety of plants (eg cereal seeds) and microorganisms such as bacteria, algae and fungi (including yeast). Fragments of β-glucan molecules produced by living organisms can also be used. Preferred β-glucans are polymers of β(1,3) glucose in which at least some of the main chain glucose residues, for example 3-6% of the main chain glucose residues, have β(1,6) branches.
В одном из конкретных воплощений данного изобретения предлагаются способы для выявления присутствия антигена CLDN6 в образце или измерения количества антигена CLDN6, включающие обработку анализируемого образца и контрольного образца антителами, специфично связывающимися с CLDN6, в условиях, обеспечивающих возможность образования комплекса данного антитела или его участка и CLDN6. Образование такого комплекса выявляется, и разница в соответствующем показателе между анализируемым и контрольным образцами служит мерой присутствия антигена CLDN6 в образце. In one specific embodiment, the present invention provides methods for detecting the presence of CLDN6 antigen in a sample or measuring the amount of CLDN6 antigen, comprising treating the test sample and a control sample with antibodies that specifically bind to CLDN6 under conditions that allow the antibody or portion thereof to form a complex with CLDN6 . The formation of such a complex is detected, and the difference in the corresponding indicator between the analyzed and control samples serves as a measure of the presence of the CLDN6 antigen in the sample.
В еще одном воплощении данного изобретения предлагается способ выявления присутствия или измерения количества клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью, in vivo или in vitro. Этот способ включает (i) введение в объект анализа (пациенту) композиции по данному изобретению, конъюгированной с выявляемым маркером; (ii) воздействие на объект анализа (пациента) средством для выявления указанного маркера с целью установить области, содержащие клетки, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью. In yet another embodiment of the present invention, a method is provided for detecting the presence or measuring the number of cells that express CLDN6 and that have CLDN6 associated with their surface, in vivo or in vitro. This method includes (i) introducing into the test subject (patient) a composition according to this invention conjugated with a detectable marker; (ii) exposing the subject of analysis (the patient) to an agent for detecting said marker in order to identify regions containing cells in which CLDN6 is expressed and which are characterized in that CLDN6 is associated with their surface.
Упомянутые выше способы можно использовать, в частности, для диагностирования заболеваний, при которых имеет значение CLDN6, и/или определения локализации поражений при связанных с CLDN6 заболеваниях, например при раковых заболеваниях. Предпочтительно указанием на наличие у индивида, в частности у человека, заболевания, связанного с CLDN6, является присутствие CLDN6 в анализируемом образце, взятом у указанного индивида, в количестве выше, чем в контрольном образце. The above methods can be used, in particular, for diagnosing diseases in which CLDN6 is important and/or determining the location of lesions in CLDN6-related diseases, such as cancer. Preferably, an indication that an individual, particularly a human, has a CLDN6-related disease is the presence of CLDN6 in a test sample taken from said individual in an amount greater than that in a control sample.
При использовании в способах, упомянутых выше, антитела, описанные в настоящем документе, могут нести метку, которая может выполнять следующие функции: (i) обеспечивать детектируемый сигнал; (ii) взаимодействовать со второй меткой для модификации детектируемого сигнала, обеспечиваемого первой или второй меткой, например при резонансном переносе энергии флуоресценции (FRET); (iii) влиять на подвижность, например на электрофоретическую подвижность, изменяя заряд, гидрофобность, форму или другие физические свойства, или (iv) предоставлять/создавать связывающую структуру, например обеспечивать аффинность, взаимодействие антиген/антитело или образование ионного комплекса. В качестве таких меток пригодны, например, следующие структуры: флуоресцентные метки, люминисцентные метки, хромофорные метки, радиоактивные метки, изотопные метки (предпочтительно стабильные), изобарные метки, ферментные метки, корпускулярные метки (в частности частицы металлов), магнитные корпускулярные метки, полимерные корпускулярные метки, низкомолекулярные органические соединения (например, биотин), лиганды рецепторов или связывающие соединения (например, адгезивные белки или лектины), последовательности, включающие нуклеиновые кислоты и/или остатки аминокислот, которые могут быть выявлены с помощью связывающих агентов, и проч. Метки включают (пне ограничиваясь перечисленным здесь) сульфат бария, йоцетамовая кислота, йопаноевая кислота, йоподат кальция, диатризоат натрия, диатризоат меглумина, метризамид, тиропаноат натрия и средства лучевой диагностики, включая источники позитронов (например, фтор-18 и углерод-11), источники γ-излучения (например. иод-123, технеций-99m, йод-131 и индий-111), нуклиды для ядерного магнитного резонанса (например, фтор и гадолиний).When used in the methods mentioned above, the antibodies described herein can carry a label that can perform the following functions: (i) provide a detectable signal; (ii) interact with a second label to modify the detectable signal provided by the first or second label, such as fluorescence resonance energy transfer (FRET); (iii) influence mobility, eg electrophoretic mobility, by changing charge, hydrophobicity, shape or other physical properties, or (iv) provide/create binding structure, eg provide affinity, antigen/antibody interaction or ionic complex formation. The following structures are suitable as such labels: fluorescent labels, luminescent labels, chromophore labels, radioactive labels, isotopic labels (preferably stable), isobaric labels, enzyme labels, corpuscular labels (in particular metal particles), magnetic corpuscular labels, polymer corpuscular tags, low molecular weight organic compounds (eg, biotin), receptor ligands or binding compounds (eg, adhesion proteins or lectins), sequences including nucleic acids and/or amino acid residues that can be detected using binding agents, and the like. Labels include (but are not limited to those listed here) barium sulfate, yocetamic acid, iopanoic acid, calcium iopodate, sodium diatrizoate, meglumine diatrizoate, metrizamide, sodium tyropanoate, and imaging agents including positron sources (e.g., fluorine-18 and carbon-11), γ-ray sources (eg iodine-123, technetium-99m, iodine-131 and indium-111), nuclear magnetic resonance nuclides (eg fluorine and gadolinium).
В еще одном воплощении данного изобретения для нацеливания соединений (например, терапевтических агентов, меток, цитокинов, радиоактивных веществ, иммуносупрессоров и проч.) на клетки, несущие на своей поверхности CLDN6, используются иммуноконъюгаты: такие соединения присоединяют к антителам. Таким образом, данным изобретением предлагаются также способы для выявления ex vivo или in vitro расположения клеток, в которых экспрессируется CLDN6 и которые отличаются тем, что CLDN6 связан с их поверхностью, например циркулирующих в кровотоке опухолевых клеток. In another embodiment of the present invention, immunoconjugates are used to target compounds (eg, therapeutic agents, tags, cytokines, radioactive substances, immunosuppressants, etc.) to cells bearing CLDN6 on their surface by attaching such compounds to antibodies. Thus, the present invention also provides methods for detecting ex vivo or in vitro the location of cells in which CLDN6 is expressed and which are characterized in that CLDN6 is associated with their surface, for example, tumor cells circulating in the bloodstream.
Далее настоящее изобретение иллюстрируется примерами, которые не следует считать ограничивающими объем данного изобретения. The present invention is further illustrated by examples, which should not be considered limiting the scope of the present invention.
ПримерыExamples
Методики и способы, использованные в данном изобретении, осуществлялись или описаны в настоящем документе известным по существу образом и так, как описывается, например, в работе Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Все методы, включая использование наборов и реагентов, осуществлялись согласно информации, предоставленной производителем, если не оговорено иного. The techniques and methods used in this invention were carried out or described herein in a manner known per se and as described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. All methods, including the use of kits and reagents, were performed according to the information provided by the manufacturer unless otherwise stated.
Пример 1: Количественная оценка экспрессии CLDN6 в нормальных тканях, раковых тканях и линиях клеток с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (RT-PCR)Example 1: Quantification of CLDN6 Expression in Normal Tissues, Cancer Tissues and Cell Lines by Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Из замороженных образцов ткани и линий раковых клеток выделяли тотальную клеточную РНК, используя набор RNeasy Mini Kit (Qiagen); для примирования использовали олиго(dT18), для обратной транскрипции Superscript II (GIBCO/Lifetech) согласно инструкциям производителя. Целостность полученной кДНК проверяли путем амплификации транскрипта p53 в 30 циклах PCR. Результаты нормализовали нормализовали относительно гена HPRT и рассчитывали величину экспрессии CLDN6, используя ΔΔCT. Total cellular RNA was isolated from frozen tissue samples and cancer cell lines using the RNeasy Mini Kit (Qiagen); For priming, oligo(dT 18 ) reverse transcription Superscript II (GIBCO/Lifetech) was used according to the manufacturer's instructions. The integrity of the resulting cDNA was verified by amplifying the p53 transcript in 30 cycles of PCR. The results were normalized to the HPRT gene and the expression value of CLDN6 was calculated using ΔΔCT.
Для каждой нормальной ткани исследовали образцы, взятые у трех индивидов. В нормальных тканях после 40 циклов RT-PCR обнаруживались лишь следовые количества транскриптов CLDN6. Единственной нормальной тканью с экспрессией CLDN6, несколько превышающей порог детекции, была плацента. For each normal tissue, samples taken from three individuals were examined. In normal tissues, only trace amounts of CLDN6 transcripts were detected after 40 cycles of RT-PCR. The only normal tissue with CLDN6 expression slightly above the detection threshold was the placenta.
Мы обнаружили, что в отличие от нормальных тканей в образцах из опухолевой ткани уровень экспрессии CLDN6 высокий при раке яичника (аденокарциноме), раке легкого (немелкоклеточном, с самой высокой частотой и уровнем экспрессии в аденокарциномах), раке желудка, раке молочной железы, раке печени, раке поджелудочной железы, раке кожи (базальноклеточной карциноме и плоскоклеточной карциноме), злокачественной меланоме, раке головы и шеи (злокачественной плеоморфной аденоме), саркоме (синовиальной саркоме и карциносаркоме), раке желчного протока, почечно-клеточном раке (светлоклеточной карциноме и папиллярной карциноме) и раке матки, а также в линиях клеток A2780 (рак яичника), NIH-OVCAR3 (рак яичника), HCT-116 (рак толстой кишки), EFO-27 (рак яичника), CPC-N (SCLC), NCI-H552 (NSCLC), SNU-1 (рак желудка), KATOIII (рак желудка), YAPC (рак поджелудочной железы), AGS (рак желудка), FU97 (рак желудка), MKN7 (рак желудка).We found that, in contrast to normal tissues, in samples from tumor tissue, the expression level of CLDN6 is high in ovarian cancer (adenocarcinoma), lung cancer (non-small cell, with the highest frequency and expression level in adenocarcinomas), gastric cancer, breast cancer, liver cancer , pancreatic cancer, skin cancer (basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma), malignant melanoma, head and neck cancer (malignant pleomorphic adenoma), sarcoma (synovial sarcoma and carcinosarcoma), bile duct cancer, renal cell carcinoma (clear cell carcinoma and papillary carcinoma ) and uterine cancer, as well as in cell lines A2780 (ovarian cancer), NIH-OVCAR3 (ovarian cancer), HCT-116 (colon cancer), EFO-27 (ovarian cancer), CPC-N (SCLC), NCI- H552 (NSCLC), SNU-1 (stomach cancer), KATOIII (stomach cancer), YAPC (pancreatic cancer), AGS (stomach cancer), FU97 (stomach cancer), MKN7 (stomach cancer).
Пример 2. Количественная оценка экспрессии CLDN6 в нормальных тканях, раковых тканях и линиях клеток с помощью Вестерн-блоттингаExample 2: Quantification of CLDN6 Expression in Normal Tissues, Cancer Tissues and Cell Lines by Western Blot
Для проведения анализа методом Вестерн-блоттинга брали 20 мкг тотального белка, выделенного из клеток, лизированных буфером Лемли для лизиса(Lemley P.V). Экстракты разбавляли восстанавливающим буферным раствором для образцов (фирма Roth), проводили электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), после чего осуществляли электроблоттинг на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF, корпорация Pall). Иммунологическое окрашивание проводили с поликлональными антителами против CLDN6 (фирма ARP) и β-актином (фирма Abcam), затем определяли первые антитела с помощью пероксидазы хрена, конъюгированной с козьими антимышиными и козьими антикроличьими вторыми антителами (фирма Dako).For Western blot analysis, 20 μg of total protein isolated from cells lysed with Lemley lysis buffer (Lemley P.V.) was taken. Extracts were diluted in reducing sample buffer (Roth), sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed, and then electroblotted onto a polyvinylidene fluoride (PVDF, Pall Corporation) membrane. Immunostaining was performed with polyclonal antibodies against CLDN6 (ARP) and β-actin (Abcam), then the primary antibodies were detected using horseradish peroxidase conjugated to goat anti-mouse and goat anti-rabbit secondary antibodies (Dako).
Для каждой нормальной ткани исследовали тканевые лизаты от пяти индивидов. Ни в одной из исследованных нормальных тканей не выявлялась экспрессия белка CLDN6. В противоположность нормальным тканям наблюдался высокий уровень экспрессии белка CLDN6 в образцах опухолевой ткани при раке яичника и раке легкого. Экспрессия CLDN6 была обнаружена в клетках линий NIH-OVCAR3 (рак яичника), MKN7 (рак желудка), AGS (рак желудка), CPC-N (мелкоклеточный рак легкого), HCT-116 (рак толстой кишки), FU97 (рак желудка), NEC8 (эмбриональная карцинома яичка), JAR (хориокарцинома плаценты), JEG3 (хориокарцинома плаценты), BEWO (хориокарцинома плаценты), and PA-1 (тератокарцинома яичника).For each normal tissue, tissue lysates from five individuals were examined. CLDN6 protein expression was not detected in any of the normal tissues examined. In contrast to normal tissues, high levels of CLDN6 protein expression were observed in tumor tissue samples from ovarian and lung cancer. Expression of CLDN6 was detected in the cell lines NIH-OVCAR3 (ovarian cancer), MKN7 (stomach cancer), AGS (stomach cancer), CPC-N (small cell lung cancer), HCT-116 (colon cancer), FU97 (stomach cancer) , NEC8 (embryonic testicular carcinoma), JAR (placental choriocarcinoma), JEG3 (placental choriocarcinoma), BEWO (placental choriocarcinoma), and PA-1 (teratocarcinoma of the ovary).
Пример 3. Иммуногистохимический анализ (IHC) экспрессии CLDN6 в нормальных тканях и раковых тканях Example 3 Immunohistochemical (IHC) Analysis of CLDN6 Expression in Normal Tissues and Cancer Tissues
Залитые парафином срезы ткани (4 мкм) инкубировали в течение 1 часа при температуре 58°C на нагревательном столике (HI 1220, Leica). Парафин из срезов удаляли путем инкубации стекол со срезами в растворителе Roticlear (Roth) два раза по 10 мин при комнатной температуре. Затем срезы регидратировали в спирте убывающей концентрации (99%, 2 x 96%, 80% и 70%, по 5 мин в каждом). Для демаскировки антигенных детерминант препараты кипятили при температуре 120°C, давление 15 psi (фунт/ дюйм2) в течение 15 мин в цитратном буферном растворе (10 мМ, рН 6,0) с 0,05% Tween-20. Тотчас после кипячения препараты инкубировали в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 5 мин. Эндогенную пероксидазную активность блокировали с помощью перекиси водорода (0,3%) в метиловом спирте в течение 15 мин при комнатной температуре. Чтобы избежать неспецифического связывания препараты блокировали козьей сывороткой (10%) в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем препараты инкубировали с поликлональными антителами, специфичными в отношении CLDN6 (1 мкг/мл) (ARP) в течение ночи при температуре 4°C. На следующий день препараты промывали PBS при комнатной температуре 3 раза по 5 мин, после чего инкубировали с 100 мкл вторых антител (PowerVision готовые к использованию антикроличьи поли-HRP IgG (ImmunoLogic)) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем препараты промывали РBS при комнатной температуре 3 раза по 5 мин. Окончательное окрашивание осуществляли с использованием набора VECTOR NovaRED Substrate Kit SK-4800 производства Vector Laboratories (Берлингейм, шт. Калифорния, США). Контрастное окрашивание срезов проводили гематоксилином в течение 90 секунд при комнатной температуре. Препараты обезвоживали в этиловом спирте возрастающей концентрации (70%, 80%, 2 x 96% и 99%, по 5 мин в каждом) и 10 мин инкубировали в ксилоле, после чего заливали X-tra Kit (Medite Histotechnic). Paraffin-embedded tissue sections (4 μm) were incubated for 1 hour at 58°C on a heating stage (HI 1220, Leica). Paraffin was removed from the sections by incubating the slides with the sections in Roticlear solvent (Roth) twice for 10 min at room temperature. The sections were then rehydrated in decreasing concentrations of alcohol (99%, 2 x 96%, 80% and 70%, 5 min each). To unmask antigenic determinants, preparations were boiled at 120°C, 15 psi (lb/ in2 ) for 15 minutes in citrate buffer solution (10 mM, pH 6.0) with 0.05% Tween-20. Immediately after boiling, the slides were incubated in phosphate buffered saline (PBS) for 5 min. Endogenous peroxidase activity was blocked using hydrogen peroxide (0.3%) in methyl alcohol for 15 min at room temperature. To avoid nonspecific binding, the preparations were blocked with goat serum (10%) in PBS for 30 min at room temperature. The slides were then incubated with CLDN6-specific polyclonal antibodies (1 μg/ml) (ARP) overnight at 4°C. The next day, slides were washed with PBS at
В нормальных тканях легких, яичников, желудка, толстой кишки, поджелудочной железы, печени, двенадцатиперстной кишки и почек экспрессия белка CLDN6 не обнаруживалась. В отличие от нормальных тканей в срезах опухолевой ткани наблюдалось интенсивное или по меньшей мере заметное окрашивание при раке яичника, легкого, кожи, поджелудочной железы, желудка, молочной железы, мочевого пузыря (переходноклеточной карциноме), шейки матки, яичка (семиноме) и матки. Окрашивание было явно сосредоточено на плазматической мембране злокачественных эпителиальных клеток, тогда как соседние стромальные клетки и незлокачественные эпителиальные клетки не окрашивались. Эти результаты свидетельствуют, что белок CLDN6 локализован на плазматической мембране злокачественных клеток.No CLDN6 protein expression was detected in normal tissues of the lung, ovary, stomach, colon, pancreas, liver, duodenum, and kidney. In contrast to normal tissue, tumor tissue sections showed intense or at least noticeable staining in cancers of the ovary, lung, skin, pancreas, stomach, breast, bladder (transitional cell carcinoma), cervix, testis (seminoma), and uterus. Staining was clearly focused on the plasma membrane of malignant epithelial cells, whereas adjacent stromal cells and nonmalignant epithelial cells were not stained. These results indicate that the CLDN6 protein is localized to the plasma membrane of malignant cells.
Пример 4. Получение мышиных антител против CLDN6Example 4: Production of mouse anti-CLDN6 antibodies
a. Получение экспрессионных векторов, кодирующих полный белок CLDN6 и фрагменты CLDN6 a. Preparation of expression vectors encoding the complete CLDN6 protein and CLDN6 fragments
Неприродные последовательности ДНК с оптимизированными кодонами (SEQ ID NO: 3) кодирующие полную полипептидную цепь CLDN6 (регистрационный номер Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) NP_067018.2, SEQ ID NO: 2) получали путем химического синтеза (GENEART AG, Германия) и клонировали в векторе pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen, США), в результате получали вектор p3953. Инсерция стоп-кодона позволяла белку CLDN6 экспрессироваться без слияния с кодируемой этим вектором меткой myc-His. Экспрессию CLDN6 проверяли путем Вестерн-блоттинга, проточной цитометрии и иммунофлуоресцентного анализа, используя готовые имеющиеся в продаже антитела против CLDN6 (ARP, 01-8865; R&D Systems, MAB3656). Non-natural codon optimized DNA sequences (SEQ ID NO: 3) encoding the complete polypeptide chain of CLDN6 (US National Center for Biotechnology Information (NCBI) registration number NP_067018.2, SEQ ID NO: 2) were obtained by chemical synthesis (GENEART AG, Germany) and cloned into the pcDNA3.1/myc-His vector (Invitrogen, USA), resulting in the p3953 vector. The insertion of a stop codon allowed the CLDN6 protein to be expressed without fusion with the myc-His tag encoded by this vector. CLDN6 expression was checked by Western blotting, flow cytometry, and immunofluorescence analysis using a commercially available anti-CLDN6 antibody (ARP, 01-8865; R&D Systems, MAB3656).
Кроме того получали последовательность ДНК с оптимизированными кодонами (SEQ ID NO: 4), кодирующую предполагаемый фрагмент внеклеточного домена 2 (EC2) CLDN6 (SEQ ID NO: 6) как объединение с сигнальным пептидом, происходящим из N-концевой лидерной последовательности иммуноглобулиновой κ-цепи, за которой следуют 4 дополнительных аминокислотных остатка для обеспечения правильного сайта расщепления сигнальной пептидазой (SEQ ID NO: 5) и клонировали ее в векторе pcDNA3.1/myc-His, что давало вектор p3974. До иммунизации экспрессию фрагмента EC2 подтверждали путем иммунофлуоресцентной микроскопии на временно трансфицированных и фиксированных параформальдегидом (PFA) клетках CHO-K1, используя готовые имеющиеся в продаже антитела против myc (Cell Signaling, MAB 2276).In addition, a codon optimized DNA sequence (SEQ ID NO: 4) encoding a putative extracellular domain 2 (EC2) fragment of CLDN6 (SEQ ID NO: 6) was obtained as an association with a signal peptide derived from the N-terminal leader sequence of the immunoglobulin κ chain , followed by 4 additional amino acid residues to provide the correct signal peptidase cleavage site (SEQ ID NO: 5) and cloned it into the pcDNA3.1/myc-His vector, resulting in the p3974 vector. Prior to immunization, EC2 fragment expression was confirmed by immunofluorescence microscopy on transiently transfected and paraformaldehyde (PFA)-fixed CHO-K1 cells using a commercially available anti-myc antibody (Cell Signaling, MAB 2276).
b. Получение линий клеток со стабильной экспрессией CLDN6b. Generation of cell lines with stable expression of CLDN6
Клетки линий HEK293 и P3X63Ag8U.1, в которых стабильно экспрессировался CLDN6, получали по стандартной методике, используя вектор p3953.Cell lines HEK293 and P3X63Ag8U.1, in which CLDN6 was stably expressed, were obtained according to standard methods using the p3953 vector.
c. Иммунизацияc. Immunization
Мышей линии Balb/c иммунизировали ДНК плазмиды p3974 в количестве 25 мкг вместе с 4 мкл полиэтилениминманнозы (PEI-Man; in vivo-jetPEI™-Man, производство компании PolyPlus Transfection) (водный раствор PEI-Man150 мM с 5% глюкозы) путем внутрибрюшинной инъекции в дни 0, 16 и 36. В дни 48 и 62 животных иммунизировали (путем внутрибрюшинной инъекции) миеломными клетками P3X63Ag8U.1, трансфицированными вектором p3953 для стабильной экспрессии CLDN6. Клетки, которые вводили мышам в день 62, перед инъекцией подвергали воздействию радиоактивного излучения (3000 рад). Присутствие антител против CLDN6 в сыворотке крови подопытных животных определяли путем иммунофлуоресцентной микроскопии в период с 20-го по 70-й день, используя клетки CHO-K1, трансфицированные нуклеиновой кислотой, кодирующей CLDN6 вместе с флуоресцентным белком GFP. Для этого через 24 часа после трансфекции клетки, фиксированные параформальдегидом и нефиксированные клетки инкубировали с сывороткой (разведение 1:100) иммунизированных мышей dilution в течение 45 мин при комнатной температуре. Клетки промывали, инкубировали с антимышиными иммуноглобулинами, меченными флуорофором Alexa555 (Molecular Probes) и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа. Balb/c mice were immunized with 25 μg of p3974 plasmid DNA together with 4 μl of polyethylenimine mannose (PEI-Man; in vivo-jetPEI™-Man, manufactured by PolyPlus Transfection) (150 mM aqueous solution of PEI-Man with 5% glucose) by i.p. injections on
Антитела, специфичные в отношении CLDN6 определяли в образцах сыворотки крови, взятой у мышей, которых использовали для получения гибридом F3-6C3-H8; см. фиг.2. Antibodies specific for CLDN6 were determined in serum samples collected from mice used to produce the F3-6C3-H8 hybridoma; see figure 2.
Для образования моноклональных антител мышей с заметным иммунным ответом против CLDN6 за 4 дня до взятия селезенки иммунизировали (путем внутрибрюшинной инъекции) клетками HEK293 (2 x 107), стабильно трансфицированными вектором p3953.To generate monoclonal antibodies, mice with a significant immune response against CLDN6 were immunized 4 days before spleen collection (by intraperitoneal injection) with HEK293 cells (2 x 10 7 ) stably transfected with the p3953 vector.
d. Получение гибридом, продуцирующих мышиные моноклональные антитела против CLDN6d. Preparation of hybridomas producing mouse monoclonal antibodies against CLDN6
Спленоциты, выделенные у иммунизированных мышей в количестве 6 x 107 клеток сливали с мышиными миеломными клетками линии P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) в количестве 3 x 107, используя PEG 1500 (Roche, CRL 10783641001). Клетки высевали на плоскодонные планшеты для микротитрования (приблизительно 5 x 104 на лунку) и культивировали в течение около двух недель в элективной среде RPMI, содержавшей 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки, 1% добавки для слияния и клонирования (HFCS, Roche, CRL 11363735), 10 мM HEPES, 1 мM пируват натрия, 4,5%глюкоза, 0,1 мM 2-меркаптоэтанол, 1 x пенициллин/стрептомицин и 1 x HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) (Invitrogen, CRL 21060). спустя 10-14 суток каждую лунку проверяли методом проточной цитометрии на присутствие моноклональных антител против CLDN6. Гибридомы, секретирующие нужные антитела, субклонировали методом серийных разведений и вновь проверяли на наличие моноклональных антител против CLDN6. Стабильные субклоны культивировали, чтобы получить небольшие количества антител в культуральной среде и охарактеризовать их. Отбирали по меньшей мере один клон от каждой гибридомы, сохранявший активность исходных клеток (проверяли методом проточной цитометрии). Для каждого клона делали запас из девяти ампул, которые хранили в жидком азоте. Splenocytes isolated from immunized mice in an amount of 6 x 10 7 cells were fused with mouse myeloma cells line P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) in an amount of 3 x 10 7 using PEG 1500 (Roche, CRL 10783641001). Cells were plated on flat-bottomed microtiter plates (approximately 5 x 10 4 per well) and cultured for about two weeks in RPMI selection medium containing 10% heat-inactivated fetal calf serum, 1% fusion and cloning supplement (HFCS, Roche, CRL 11363735), 10 mM HEPES, 1 mM sodium pyruvate, 4.5% glucose, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 x penicillin/streptomycin and 1 x HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) (Invitrogen, CRL 21060). After 10-14 days, each well was checked by flow cytometry for the presence of monoclonal antibodies against CLDN6. Hybridomas secreting the desired antibodies were subcloned by serial dilution and retested for the presence of monoclonal antibodies against CLDN6. Stable subclones were cultured to obtain small amounts of antibodies in the culture medium and characterize them. At least one clone from each hybridoma was selected that retained the activity of the original cells (checked by flow cytometry). For each clone, a stock of nine ampoules was made and stored in liquid nitrogen.
Пример 5. Связывающие свойства супернатантов гибридом и моноклональных антителExample 5. Binding properties of hybridoma supernatants and monoclonal antibodies
a. Качественный контроль временно трансфицированныхклеток HEK293T методами (i) Вестерн-блоттинга и (ii) проточной цитометрииa. Qualitative control of transiently transfected HEK293T cells by (i) Western blotting and (ii) flow cytometry
(i) Клетки HEK293T трансфицировали нуклеиновой кислотой, кодирующей CLDN3, CLDN4, CLDN6 и CLDN9 соответственно или для контроля проделывали все манипуляции без нуклеиновой кислоты. Экспрессию CLDN3, CLDN4, CLDN6 или CLDN9 в клетках HEK293T определяли путем Вестерн-блоттинга. Для этого через 24 часа после трансфекции клетки собирали и подвергали лизису. С лизатом проделывали электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, переносили (с помощью блота) на нитроцеллюлозную мембрану и окрашивали антителами против CLDN3(A) (Invitrogen, 34-1700), против CLDN4(A) (Zymed, 32-9400), против CDLN6(A) (ARP, 01-8865) или против CLDN9(A) (Santa Cruz, sc-17672), специфично связывающимися с С-концевым участком соответствующего клаудина в денатурирующих условиях. Инкубировали с вторыми антителами, меченными пероксидазой, проявляли электрохемилюминофором (ECL-реагентом), для визуализации использовали спектрометр LAS-3000 (Fuji). Полосы, соответствующие ожидаемым молекулярным массам CLDN3, CLDN4, CLDN6 и CLDN9, наблюдались только в случае трансфицированных клеток, но не в контроле (фиг.3); это демонстрирует, что клеткам HEK293T не свойственна эндогенная экспрессия ни одного из взятых клаудинов и, таким образом, они являются удобным инструментом для определения перекрестной реактивности антител против CLDN6. (i) HEK293T cells were transfected with nucleic acid encoding CLDN3, CLDN4, CLDN6 and CLDN9, respectively, or all manipulations were performed without nucleic acid as a control. The expression of CLDN3, CLDN4, CLDN6, or CLDN9 in HEK293T cells was determined by Western blotting. For this purpose, 24 hours after transfection, cells were collected and lysed. The lysate was subjected to sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, transferred (by blot) to a nitrocellulose membrane and stained with antibodies against CLDN3(A) (Invitrogen, 34-1700), against CLDN4(A) (Zymed, 32-9400), against CDLN6(A) (ARP, 01-8865) or anti-CLDN9(A) (Santa Cruz, sc-17672), which specifically bind to the C-terminal region of the corresponding claudin under denaturing conditions. They were incubated with peroxidase-labeled secondary antibodies, developed with electrochemiluminophore (ECL reagent), and a LAS-3000 spectrometer (Fuji) was used for visualization. Bands corresponding to the expected molecular masses of CLDN3, CLDN4, CLDN6, and CLDN9 were observed only in the transfected cells and not in the control (Fig. 3); this demonstrates that HEK293T cells do not endogenously express any of the claudins and are therefore a useful tool for determining the cross-reactivity of anti-CLDN6 antibodies.
(ii) Клетки HEK293T по (i) также анализировали методом проточной цитометрии, используя антитела против CLDN, распознающие нативные эпитопы (мышиные IgG2a против CLDN3 (R&D, MAB4620), мышиные IgG2a против CLDN4 (R&D, MAB4219), мышиные IgG2b против CLDN6 (R&D, MAB3656)). Эти антитела, производства фирмы Sigma (продукты под номерами M9144 и M8894) служили изотипическими контролями. Специфичность этих антиклаудиновых антител определяли с помощью клеток HEK293T, временно трансфицированных нуклеиновыми кислотами, кодирующими соответственно CLDN3, CLDN4, CLDN6 и CLDN9. У антител против CLDN6 наблюдалась перекрестная реактивность с CLDN3, CLDN4 и CLDN9. У антител против CLDN4 наблюдалась перекрестная реактивность с CLDN3, CLDN6 и CLDN9. Антитела против CLDN3 связывались специфично с CLDN3 (Фиг. 4).(ii) HEK293T cells from (i) were also analyzed by flow cytometry using anti-CLDN antibodies recognizing native epitopes (mouse anti-CLDN3 IgG2a (R&D, MAB4620), mouse anti-CLDN4 IgG2a (R&D, MAB4219), mouse anti-CLDN6 IgG2b (R&D , MAB3656)). These antibodies, manufactured by Sigma (product numbers M9144 and M8894), served as isotype controls. The specificity of these anticlaudin antibodies was determined using HEK293T cells transiently transfected with nucleic acids encoding CLDN3, CLDN4, CLDN6, and CLDN9, respectively. Antibodies against CLDN6 showed cross-reactivity with CLDN3, CLDN4 and CLDN9. Antibodies against CLDN4 showed cross-reactivity with CLDN3, CLDN6 and CLDN9. Anti-CLDN3 antibodies bound specifically to CLDN3 (Fig. 4).
b. Определение специфичности моноклональных антител, полученных по данному изобретению, методом проточной цитометрии b. Determination of the specificity of monoclonal antibodies obtained according to this invention by flow cytometry
Клетки HEK293T трансфицировали одновременно двумя векторами, из которых один кодировал различные клаудины, а другой - флуоресцентный маркер. Через 24 часа после трансфекции клетки собирали, используя раствор трипсин (0,05%)/EDTA и промывали буферным раствором для FACS (PBS, содержащий 2% FCS и 0,1% азида натрия). Клетки переносили на планшеты для микротитрования с U-образным дном в количестве 2 x 105 клеток на лунку и инкубировали с гибридомными супернатантами в течение 60 мин при температуре 4°C. Затем клетки промывали буферным раствором для FACS и инкубировали со специфичными вторыми антителами (антимышиные IgG 1+2a+2b+3, Dianova, 115-135-164), конъюгированными с аллофикоцианином (АРС). После этого клетки дважды промывали и определяли связывание при помощи проточного цитофлуориметра-биоанализатора BD FACSArray (фиг. 5). Экспрессия флуоресцентного маркера отложена по горизонтальной оси, а связывание антител - по вертикальной. Положительным контролем служили готовые имеющиеся в продаже мышиные антитела IgG2b против CLDN6 (R&D, MAB3656); изотипическим контролем служили антитела производства Sigma (каталожный номер продукта M8894).HEK293T cells were transfected simultaneously with two vectors, one encoding various claudins and the other a fluorescent marker. 24 hours after transfection, cells were harvested using trypsin (0.05%)/EDTA and washed with FACS buffer (PBS containing 2% FCS and 0.1% sodium azide). Cells were transferred to U-bottom microtiter plates at 2 x 105 cells per well and incubated with hybridoma supernatants for 60 min at 4°C. Cells were then washed with FACS buffer and incubated with specific secondary antibodies (
Моноклональные антитела в супернатантах от субклонов гибридом F3-6C3-H2, F3-6C3-H8, F3-6C3-H9, F3-6C3-D8 и F3-6C3-G4 (все происходят от гибридомы F3-6C3) были специфичны в отношении CLDN6 и не связывались с CLDN9, CLDN3 и CLDN4. На фиг. 5A приведены примеры результатов для субклона гибридом F3-6C3-H8. Моноклональные антитела в супернатанте от субклона гибридом F3-6C3-H8 также связывались с клетками, трансфицированными вариантом CLDN6 (I143V)-SNP. Моноклональные антитела в супернатанте от субклона гибридом F4-4F7-F2 связывались как с CLDN6, так и с CLDN9 (фиг. 5A). Моноклональные антитела в супернатанте от субклона гибридом F3-7B3-B4 связывались с CLDN6, CLDN3 и CLDN9 (фиг. 5B). Моноклональные антитела в супернатанте от субклона гибридом F3-3F7-A5 связывались с CLDN6, CLDN4 и CLDN9 (фиг. 5B).Monoclonal antibodies in supernatants from hybridoma subclones F3-6C3-H2, F3-6C3-H8, F3-6C3-H9, F3-6C3-D8 and F3-6C3-G4 (all derived from hybridoma F3-6C3) were specific for CLDN6 and did not bind to CLDN9, CLDN3, and CLDN4. In fig. 5A shows example results for the hybridoma subclone F3-6C3-H8. Monoclonal antibodies in the supernatant from the hybridoma subclone F3-6C3-H8 also bound to cells transfected with the CLDN6 variant (I143V)-SNP. Monoclonal antibodies in the supernatant from the hybridoma subclone F4-4F7-F2 bound to both CLDN6 and CLDN9 (Fig. 5A). Monoclonal antibodies in the supernatant from the hybridoma subclone F3-7B3-B4 bound to CLDN6, CLDN3, and CLDN9 (Fig. 5B). Monoclonal antibodies in the supernatant from the hybridoma subclone F3-3F7-A5 bound to CLDN6, CLDN4, and CLDN9 (Fig. 5B).
Пример 6. Получение и проверка моноклональных антител против CLDN6Example 6: Production and testing of monoclonal antibodies against CLDN6
a. Получение экспрессионных векторов, кодирующих внеклеточный домен 1 CLDN6a. Preparation of expression vectors encoding
Получали последовательность ДНК с оптимизированными кодонами (SEQ ID NO: 12), кодирующая фрагмент CLDN6, предположительно соответствующий внеклеточному домену 1 (EC1) этого белка (SEQ ID NO: 7), как объединение с сигнальным пептидом, происходящим из N-концевой лидерной последовательности иммуноглобулиновой κ-цепи, за которой следуют 4 дополнительных аминокислотных остатка для обеспечения правильного сайта расщепления сигнальной пептидазой (SEQ ID NO: 13) и клонировали ее в векторе pcDNA3.1/myc-His, что давало вектор p3974. До иммунизации экспрессию фрагмента EC1 подтверждали путем иммунофлуоресцентной микроскопии на временно трансфицированных и фиксированных параформальдегидом (PFA) клетках CHO-K1, используя готовые имеющиеся в продаже антитела против myc (Cell Signaling, MAB 2276).A codon optimized DNA sequence (SEQ ID NO: 12) encoding a fragment of CLDN6, presumably corresponding to the extracellular domain 1 (EC1) of this protein (SEQ ID NO: 7), was obtained as a combination with a signal peptide derived from the N-terminal leader sequence of the immunoglobulin κ chain followed by 4 additional amino acid residues to provide the correct signal peptidase cleavage site (SEQ ID NO: 13) and cloned into the pcDNA3.1/myc-His vector, resulting in the p3974 vector. Prior to immunization, EC1 fragment expression was confirmed by immunofluorescence microscopy on transiently transfected and paraformaldehyde (PFA)-fixed CHO-K1 cells using a commercially available anti-myc antibody (Cell Signaling, MAB 2276).
b. Иммунизацияb. Immunization
Мышей линии Balb/c иммунизировали ДНК плазмиды p3973 в количестве 25 мкг вместе с 4 мкл полиэтилениминманнозы (PEI-Man; in vivo-jetPEI™-Man, производство компании PolyPlus Transfection) (водный раствор PEI-Man 150 мM с 5% глюкозы) путем внутрибрюшинной инъекции в дни 0 и 14. В дни 28 и 44 животных иммунизировали (путем подкожной инъекции) конъюгированными с белком KLH пептидами SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15 (100 мкг каждый в PBS, производство JPT Peptide Technologies GmbH, Германия) вместе с очищенным путем ВЭЖХ олигонуклеотидом (PTO-CpG-ODN, 25 мкг в PBS; 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT; производство Eurofins MWG Operon,Германия). В дни 64, 77 и 97 животных иммунизировали (путем внутрибрюшинной инъекции) миеломными клетками P3X63Ag8U.1 (в количестве 2х107), трансфицированными вектором p3953 для стабильной экспрессии CLDN6. Перед иммунизацией клетки обрабатывали митомицином-С (2,5мкг/мл, Sigma-Aldrich, M4287). В дни 64 и 97 клетки вводили вместе с очищенным путем ВЭЖХ олигонуклеотидом PTO-CpG-ODN (50 мкг в PBS), в день 77 - вместе с неполным адъювантом Фрейнда.Balb/c mice were immunized with 25 μg of p3973 plasmid DNA along with 4 μl of polyethylenimine mannose (PEI-Man; in vivo-jetPEI™-Man, manufactured by PolyPlus Transfection) (150 mM aqueous solution of PEI-Man with 5% glucose) by intraperitoneal injection on
Для образования моноклональных антител мышей с заметным иммунным ответом против CLDN6 за четыре дня до взятия селезенки иммунизировали (путем внутрибрюшинной инъекции) клетками HEK293 (в количестве 2x107), стабильно трансфицированными вектором p3953.To generate monoclonal antibodies, mice with a significant immune response against CLDN6 were immunized four days before spleen collection (by intraperitoneal injection) with HEK293 cells (2x10 7 ) stably transfected with the p3953 vector.
c. Проверка моноклональных антител против CLDN6c. Screening of monoclonal antibodies against CLDN6
Проточная цитометрияFlow cytometry
Для проверки связывания моноклональных антител с CLDN6 и его гомологами, клетки HEK293T временно трансфицировали соответствующей плазмидой, кодирующей тот или иной клаудин, и определяли его экспрессию путем проточной цитометрии. Чтобы отличать трансфицированные клетки от нетрансфецированных, клетки HEK293T были одновременно трансфицированы флуоресцентным маркером. Через 24 часа после трансфекции клетки собирали с помощью раствора трипсина (0,05%)/EDTA, промывали буферным раствором для FACS (PBS, содержащий 2% FCS и 0,1% азида натрия) и ресуспендировали в буферном растворе для FACS в концентрации 2 x 106 клеток/мл. Эту суспензию клеток (100 мкл) инкубировали с соответствующими антителами в указанной концентрации в течение 30 мин при температуре 4°C. Для определения экспрессии CLDN6 и CLDN9 использовали перекрестно-реактивные антитела. В качестве положительного контроля служили готовые имеющиеся в продаже мышиные антитела против CLDN3 (R&D, MAB4620) и против CLDN4 (R&D, MAB4219); изотипическим контролем служили мышиные IgG2a (Sigma, M9144) и IgG2b (Sigma, M8894), соответственно. Клетки промывали три раза буферным раствором для FACS и инкубировали со специфичными вторыми антителами (антимышиные IgG 1+2a+2b+3, Dianova, 115-135-164), конъюгированными с аллофикоцианином (АРС) в течение 30 мин при температуре 4°С. После этого клетки дважды промывали и ресуспендировали в буферном растворе для FACS. Определяли связывание при помощи проточного цитофлуориметра-биоанализатора BD FACSArray. Экспрессия флуоресцентного маркера отложена по горизонтальной оси, а связывание антител - по вертикальной. To test the binding of monoclonal antibodies to CLDN6 and its homologues, HEK293T cells were transiently transfected with the corresponding plasmid encoding a particular claudin, and its expression was determined by flow cytometry. To distinguish transfected from nontransfected cells, HEK293T cells were simultaneously transfected with a fluorescent marker. 24 hours after transfection, cells were harvested with trypsin (0.05%)/EDTA, washed with FACS buffer (PBS containing 2% FCS and 0.1% sodium azide) and resuspended in FACS buffer at a concentration of 2 x 10 6 cells/ml. This cell suspension (100 μl) was incubated with the appropriate antibodies at the indicated concentration for 30 min at 4°C. Cross-reactive antibodies were used to determine the expression of CLDN6 and CLDN9. Commercially available mouse anti-CLDN3 (R&D, MAB4620) and anti-CLDN4 (R&D, MAB4219) antibodies served as positive controls; Mouse IgG2a (Sigma, M9144) and IgG2b (Sigma, M8894) served as isotype controls, respectively. Cells were washed three times with FACS buffer and incubated with specific secondary antibodies (
Комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC)Complement-dependent cytotoxicity (CDC)
Комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), определяли путем измерения содержания внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТР) в нелизированных клетках после добавления человеческого комплемента к клеткам-мишеням, инкубированным с антителами против CLDN6. Для количественного определения АТР применяли высокочувствительный метод с использованием люминесцентной реакции, катализируемой люциферазой. Complement-dependent cytotoxicity (CDC) was determined by measuring intracellular adenosine triphosphate (ATP) content in unlysed cells after addition of human complement to target cells incubated with anti-CLDN6 antibodies. A highly sensitive method using a luciferase-catalyzed luminescent reaction was used to quantify ATP.
Клетки CHO-K1, стабильно трансфицированные CLDN6 (CHO-K1-CLDN6), собирали с помощью раствора трипсина (0,05%)/EDTA, два раза промывали средой X-Vivo 15 (Lonza, BE04-418Q) и суспендировали в концентрации 1 x 107 клеток/мл в среде X-Vivo 15.Эту суспензию клеток (250 мкл) переносили в электропорационную кювету (0,4 см) и смешивали с 7 мкг РНК, траскрибированной in vitro и кодирующей люциферазу. Клетки подвергали электропорации при напряжении 200 В и емкости 300 мкФ, используя электропорационную систему Gene Pulser Xcell (Bio Rad). После электропорации клетки ресуспендировали в 2,4 мл предварительно подогретой среды D-MEM/F12 (1:1) со средой GlutaMax-I (Invitrogen, 31331-093), содержащей 10% (объем/объем) FCS, 1% (объем/объем) пенициллин/стрептомицин и 1,5 мг/мл селективного антибиотика G418. Суспензию клеток помещали в лунки (50 мкл на лунку) 96-луночного белого полипропиленового планшета и инкубировали при температуре 37°C в атмосфере с 7,5% CO2. Через 24 часа после электропорации к клеткам прибавляли 50 мкл моноклональных мышиных антител против CLDN6 (в указанных концентрациях) в смеси 60% среды RPMI (содержащей 20 мM HEPES) и 40% человеческой сыворотки крови (от шести здоровых доноров). Для контроля «тотальный лизис» добавляли 10 мкл на лунку смеси 8% (объем/объем) Triton X-100 в PBS; для контроля «максимальное количество жизнеспособных клеток» добавляли 10 мкл на лунку PBS; к опытным образцам добавляли также 10 мкл на лунку PBS. Инкубировали в течение 80 мин при температуре 37°C в атмосфере с 7,5% CO2, затем прибавляли 50 мкл на лунку «люцифериновой смеси» (3,84 мг/мл D-люциферин, 0,64 Ед/мл аденозинтрифосфатаза, 160 мM HEPES в дважды дистиллированной воде). Планшет инкубировали в темноте в течение 45 мин при комнатной температуре. Измеряли люминесценцию при помощи люминометра Infinite M200 (TECAN). Данные представлены как результаты цифрового интегрирования сигнала в относительных световых единицах (RLU). CHO-K1 cells stably transfected with CLDN6 (CHO-K1-CLDN6) were harvested with trypsin (0.05%)/EDTA solution, washed twice with X-Vivo 15 medium (Lonza, BE04-418Q) and suspended at a concentration of 1 x 10 7 cells/ml in X-Vivo 15 medium. This cell suspension (250 μl) was transferred to an electroporation cuvette (0.4 cm) and mixed with 7 μg of in vitro transcribed RNA encoding luciferase. Cells were electroporated at 200 V and 300 μF capacitance using a Gene Pulser Xcell electroporation system (Bio Rad). After electroporation, cells were resuspended in 2.4 ml of prewarmed D-MEM/F12 medium (1:1) with GlutaMax-I medium (Invitrogen, 31331-093) containing 10% (v/v) FCS, 1% (v/v) volume) penicillin/streptomycin and 1.5 mg/ml selective antibiotic G418. The cell suspension was placed into wells (50 μl per well) of a 96-well white polypropylene plate and incubated at 37°C in a 7.5% CO 2 atmosphere. 24 hours after electroporation, 50 μl of mouse monoclonal antibodies against CLDN6 (indicated concentrations) in a mixture of 60% RPMI medium (containing 20 mM HEPES) and 40% human serum (from six healthy donors) was added to the cells. For the “total lysis” control, 10 μl per well of a mixture of 8% (v/v) Triton X-100 in PBS was added; to control the “maximum number of viable cells”, 10 μl per well of PBS was added; 10 μl per well of PBS was also added to the experimental samples. Incubated for 80 min at 37°C in an atmosphere of 7.5% CO 2 , then 50 μl per well of “luciferin mixture” (3.84 mg/ml D-luciferin, 0.64 U/ml adenosine triphosphatase, 160 mM HEPES in double distilled water). The plate was incubated in the dark for 45 min at room temperature. Luminescence was measured using an Infinite M200 luminometer (TECAN). Data are presented as digital signal integration results in relative light units (RLU).
Клетки NEC8 подвергали электропорации при напряжении 200 В и емкости 400 мкФ и культивировали в смеси сред RPMI 1640 и GlutaMAX-I (Invitrogen, 61870), содержащей 10% (объем/объем) FCS.NEC8 cells were electroporated at 200 V and 400 μF capacitance and cultured in a mixture of RPMI 1640 and GlutaMAX-I media (Invitrogen, 61870) containing 10% (v/v) FCS.
Специфичный лизис рассчитывали следующим образом:Specific lysis was calculated as follows:
максимальное количество жизнеспособных клеток: 10 мкл PBS, без антител тотальный лизис: 10 мкл 8% (объем/объем) Triton X-100 в PBS, без антител.maximum viable cell count: 10 µl PBS, no antibody; total lysis: 10 µl 8% (v/v) Triton X-100 in PBS, no antibody.
Воздействие антителами на ранних стадияхExposure to antibodies in early stages
Для воздействия антителами на ранних стадиях бестимусным мышам Nude-Foxn1nu вводили подкожно в бок клетки NEC8 в количестве 2 × 107 в 200 мкл PBS. В каждой группе было по десять самок возрастом 6-8 недель. Через трое суток после этой инокуляции на протяжении 46 дней два раза в неделю животным вводили (чередуя внутривенные и внутрибрюшинные инъекции) по 200 мкг очищенных моноклональных мышиных антител muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B и 67A. Отрицательным контролем служили особи, которым вводили PBS. Дважды в неделю определяли размеры опухолей: Объем опухоли (TV) = (длина × ширина2)/2. TV выражали в кубических миллиметрах (мм3) и строили кривую роста опухоли во времени. Когда опухоль превышала 1500 мм3, животное умерщвляли.For early antibody exposure, Nude-Foxn1 nu nude mice were injected subcutaneously into the flank with 2 × 107 NEC8 cells in 200 μl PBS. There were ten females in each group, 6-8 weeks old. Three days after this inoculation, animals were administered (alternating intravenous and intraperitoneal injections) 200 μg of purified mouse
Результатыresults
Мышиные моноклональные антитела muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B и 67A прочно связывались с человеческими белками СLDN6 и CLDN6 SNP (однонуклеотидный полиморфизм) вариант I143V, но связывания с CLDN3, 4 и 9 не наблюдалось (фиг. 6).Mouse
Для антител MuMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B и 67A получились очень низкие значения EC50 (200-500 нг/мл) и насыщение мест связывания достигалось при низких концентрациях (фиг.7).For
В случае антител MuB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B и 67A наблюдалась зависимая от дозы CDC, причем она возникала при низких концентрациях антител (фиг. 8). Антитела против CLDN6 muMAB 65A и 66B вызывали CDC в отношении клеток NEC8 зависимым от дозы образом (фиг. 9). Специфичность muMAB 65A и 66B в отношении мишени подтверждалась опытом с клетками NEC8 LVTS2 54 (нокдаунными по CLDN6).For
Также антитела muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B и 67A подавляли рост опухолей у мышей, которым ввели клетки NEC8 (фиг.10).Also,
Пример 7. Получение и проверка гибридных моноклональных антител против CLDN6Example 7. Production and testing of hybrid monoclonal antibodies against CLDN6
a. Получение гибридных мышино-человеческих моноклональных антителa. Preparation of hybrid mouse-human monoclonal antibodies
Чтобы создать гибридные антитела, нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей мышиных антител, включая лидерные последовательности, амплифицировали путем полимеразной ПЦР, используя праймеры, указанные в приведенной ниже таблице. To generate the fusion antibodies, nucleotide sequences encoding the murine antibody heavy and light chain variable regions, including leader sequences, were amplified by polymerase PCR using the primers listed in the table below.
Нуклеотидные последовательности. соответствующие мышиным тяжелым цепям, соединялись в сайте рестрикции ApaI (5'-GGGCCC-3') с нуклеотидной последовательностью, соответствующей N-концевой части человеческой цепи Fcγ1, в экспрессионном векторе. Нуклеотидные последовательности, соответствующие вариабельным областям мышиной κ-цепи, включая лидерную последовательность, клонировали перед константной областью, используя сайт рестрикции BsiWI. Правильность полученной конструкции и ориентации для предшествующего промотора в векторе последовательности, соответствующей константной области, проверяли путем секвенирования. Вследствие положения сайта рестрикции ApaI амплификация вариабельной области, включая лидерную последовательность в любом случае включает первые 11 нуклеотидов последовательности, кодирующей человеческую константную область γ1, вместе с последовательностью сайта ApaI. Нуклеотидная последовательность, соответствующая константной области человеческой тяжелой цепи γ1, обозначена SEQ ID NO: 24; аминокислотная последовательность экспрессирующейся таким образом человеческой константной области γ1, обозначена SEQ ID NO: 25. Нуклеотидная последовательность, кодирующая константную часть легкой κ-цепи, обозначена SEQ ID NO: 26; соответствующая аминокислотная последовательность обозначена SEQ ID NO: 27.Nucleotide sequences. corresponding to the murine heavy chains were linked at an ApaI restriction site (5'-GGGCCC-3') to a nucleotide sequence corresponding to the N-terminal part of the human Fcγ1 chain in the expression vector. Nucleotide sequences corresponding to the murine κ chain variable regions, including the leader sequence, were cloned upstream of the constant region using the BsiWI restriction site. The correctness of the resulting construct and the orientation for the upstream promoter in the vector sequence corresponding to the constant region was verified by sequencing. Due to the position of the ApaI restriction site, the amplification of the variable region including the leader sequence in any case includes the first 11 nucleotides of the human γ1 constant region coding sequence together with the ApaI site sequence. The nucleotide sequence corresponding to the human γ1 heavy chain constant region is designated SEQ ID NO: 24; the amino acid sequence of the human γ1 constant region thus expressed is designated SEQ ID NO: 25. The nucleotide sequence encoding the κ light chain constant portion is designated SEQ ID NO: 26; the corresponding amino acid sequence is designated SEQ ID NO: 27.
Соответствующие мышиные участки гибридных моноклональных антител обозначены с приставкой “chim“( от англ. chimeric - гибридный), например chimAB 64A. The corresponding mouse regions of hybrid monoclonal antibodies are designated with the prefix “chim“ (from English chimeric - hybrid), for
Амплификацию нуклеотидных последовательностей, соответствующих мышиным вариабельным областям легкой и тяжелой цепей, включая лидерные последовательности, осуществляли методом ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК («step-out»), описанный в работе Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No. 6). Для этого получали тотальную РНК из гибридомных клеточных линий (см. таблицу 1) стандартными методами, известными специалистам в данной области техники, например с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen). Одноцепочечную кДНК получали методом со сменой матриц, также описанным в работе Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No. 6, 1558). В дополнение к олигомеру (dT)30 (SEQ ID NO: 28) использовался гибридный олигомер ДНК/РНК (SEQ ID NO: 29), служивший 5’-адаптором для смены матриц в процессе полимеризации цепи кДНК. В этом адапторном олигомере последние три нуклеотида были не дезоксирибо-, а рибонуклеотидами. В последующей “step-out” ПЦР использовался антисмысловой олигомер, мишенью которого были константная область мышиной κ-цепи или константной области подкласса 2а γ-цепи (SEQ ID NO: 30 и 31, соответственно). Подкласс IgG мышиных моноклональных антител, продуцируемых гибридомными клеточными линиями заранее определяли с помощью набора IsoStrip (Roche), и соответственно выбирали подходящий антисмысловой олигомер (см. таблицу 1). Смысловым олигомером в «step-out» ПЦР, включавшим два олигомера (SEQ ID NO: 32 и 33), была смесь праймеров. Amplification of nucleotide sequences corresponding to the mouse variable regions of the light and heavy chains, including leader sequences, was carried out by PCR with rapid amplification of cDNA ends (“step-out”), described in the work of Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No. 6). To do this, total RNA was obtained from hybridoma cell lines (see Table 1) using standard methods known to those skilled in the art, for example using the RNeasy Mini Kit (Qiagen). Single-stranded cDNA was prepared using the template-switching method also described by Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No. 6, 1558). In addition to the (dT)30 oligomer (SEQ ID NO: 28), a hybrid DNA/RNA oligomer (SEQ ID NO: 29) was used to serve as a 5' adapter for changing templates during cDNA strand polymerization. In this adapter oligomer, the last three nucleotides were not deoxyribo-nucleotides, but ribonucleotides. The subsequent step-out PCR used an antisense oligomer targeting the mouse κ chain constant region or the γ chain subclass 2a constant region (SEQ ID NO: 30 and 31, respectively). The IgG subclass of murine monoclonal antibodies produced by the hybridoma cell lines was previously determined using an IsoStrip kit (Roche), and the appropriate antisense oligomer was selected accordingly (see Table 1). The sense oligomer in the step-out PCR, which included two oligomers (SEQ ID NO: 32 and 33), was a mixture of primers.
Затем идентифицированные нуклеотидные последовательности, соответствующие мышиным вариабельным областям, включая лидерные последовательности, амплифицировали путем ПЦР исключая 5'-концевую нетранслируемую область (5`-UTR) и мышиную константную 3`-область, добавляя сайты рестрикции на концах, что давало возможность субклонирования в подготовленных экспрессионных векторах, несущих нуклеотидные последовательности, соответствующие человеческим константным областям. Кроме того, смысловые олигомеры обеспечивали консенсусную последовательность Козак (5'-GCCGCCACC-3’), а антисмысловые олигомеры для вариабельных областей тяжелых цепей включали первые 11 нуклеотидов константной области человеческой тяжелой цепи γ1 в дополнение к сайту рестрикции ApaI (см. таблицу 1, SEQ ID NO: 17-23). Нуклеотидные последовательности, соответствующие вариабельным областям легких κ-цепей, включая лидерные последовательности, клонировали, используя рестрикционные эндонуклеазы HindIII и BsiWI; для вариабельных областей тяжелых γ-цепей требовались ферменты HindIII и ApaI.Then, the identified nucleotide sequences corresponding to the mouse variable regions, including leader sequences, were amplified by PCR excluding the 5'-terminal untranslated region (5'-UTR) and the mouse 3'-constant region, adding restriction sites at the ends, which made it possible to subcloning into the prepared expression vectors carrying nucleotide sequences corresponding to human constant regions. In addition, the sense oligomers provided the Kozak consensus sequence (5'-GCCGCCACC-3'), and the antisense oligomers for the heavy chain variable regions included the first 11 nucleotides of the human γ1 heavy chain constant region in addition to the ApaI restriction site (see Table 1, SEQ ID NO: 17-23). Nucleotide sequences corresponding to the variable regions of κ light chains, including leader sequences, were cloned using HindIII and BsiWI restriction endonucleases; the heavy γ chain variable regions required the enzymes HindIII and ApaI.
Также были амплифицированы нуклеотидные последовательности. соответствующие другим вариабельным областям легких и тяжелых цепей мышиных антител и получены другие гибридные моноклональные антитела против CLDN6 согласно описанному выше. Nucleotide sequences were also amplified. corresponding to other variable regions of the light and heavy chains of murine antibodies and other hybrid monoclonal antibodies against CLDN6 were obtained as described above.
b. Получение гибридных моноклональных антител против CLDN6 b. Production of hybrid monoclonal antibodies against CLDN6
Гибридные моноклональные антитела временно экспрессировались в клетках HEK293T (ATCC CRL-11268), трансфицированных плазмидной ДНК, кодирующей легкие и тяжелые цепи соответствующих антител. За 24 часа до трансфекции клетки в количестве Hybrid monoclonal antibodies were transiently expressed in HEK293T cells (ATCC CRL-11268) transfected with plasmid DNA encoding the light and heavy chains of the corresponding antibodies. 24 hours before cell transfection in the amount
8 × 107 высевали на культуральные чашки (145 мм) и растили в 25 мл среды HEK293T (DMEM/F12 + GlutaMAX-I, 10% FCS, 1%пенициллин/стрептомицин). Плазмидную ДНК растворяли в среды HEK293T без добавок (20 мкг в 5 мл на одну чашку). Добавляли 75 мкл полиэтиленимина (PEI) (1 mg/ml) (Polyscience, 23966) и смесь DNA:PEI инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем эту трансфекционную смесь прибавляли по каплям к клеткам. Через 24 часа после трансфекции среду HEK293T-заменяли на среду Pro293a (Lonza, BE12-764Q), содержащую пенициллин/стрептомицин (1%). Для оптимальной экспрессии трансфицированные клетки культивировали в течение 96-120 часов при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 7,5% CO2). Собирали супернатант и очищали гибридные антитела методом быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC, используя колонки с белком А. Определяли концентрацию антител и проверяли их чистоту методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE).8 × 10 7 were sown on culture dishes (145 mm) and grown in 25 ml of HEK293T medium (DMEM/F12 + GlutaMAX-I, 10% FCS, 1% penicillin/streptomycin). Plasmid DNA was dissolved in HEK293T media without additives (20 μg in 5 ml per plate). 75 μl of polyethylenimine (PEI) (1 mg/ml) (Polyscience, 23966) was added and the DNA:PEI mixture was incubated for 15 min at room temperature. This transfection mixture was then added dropwise to the cells. 24 hours after transfection, HEK293T medium was replaced with Pro293a medium (Lonza, BE12-764Q) containing penicillin/streptomycin (1%). For optimal expression, transfected cells were cultured for 96-120 hours at 37°C in an atmosphere containing 7.5% CO 2 ). The supernatant was collected and the hybrid antibodies were purified by fast protein liquid chromatography (FPLC) using Protein A columns. Antibody concentrations were determined and purity was checked by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
c. Исследование свойств гибридных моноклональных антител против CLDN6c. Study of the properties of hybrid monoclonal antibodies against CLDN6
Проточная цитометрияFlow cytometry
Для определения специфичности и аффинности гибридных моноклональных антител, специфичных в отношении CLDN6, методом проточной цитометрии изучали их связывание с клетками HEK293, стабильно трансфицированными соответственно CLDN3, 4, 6 или 9, и с опухолевыми клетками линий с эндогенной экспрессией CLDN6. Клетки собирали с помощью раствора 0,05% трипсин/EDTA, промывали буферным раствором для FACS (PBS, содержащий 2% FCS и 0,1% азида натрия) и ресуспендировали в буферном растворе для FACS в концентрации 2 × 106 клеток/мл. Эту клеточную суспензию в количестве 100 мкл инкубировали с соответствующими антителами в указанных концентрациях в течение 60 мин при температуре 4°C. Для определения экспрессии CLDN6 и CLDN9 A использовали гибридные перекрестно-реактивные антитела (chimAB 5F2D2). Положительным контролем служили готовые имеющиеся в продаже мышиные антитела против CLDN3 (R&D, MAB4620) и против CLDN4 (R&D, MAB4219); отрицательным контролем служили человеческие IgG1-κ (Sigma, I5154). Клетки промывали три раза буферным раствором для FACS и инкубировали в течение 30 мин при температуре 4°C со специфичными вторыми антителами - соответственно козьими античеловеческими IgG Fc- γ, конъюгированными с аллофикоцианином (АРС) (Dianova, 109-136-170), или с антимышиными IgG 1+2a+2b+3a, конъюгированными с АРС (Dianova, 115-135-164). Клетки дважды промывали и ресуспендировали в буферном растворе для FACS. Связывание определяли при помощи проточного цитофлуориметра-биоанализатора BD FACSArray.To determine the specificity and affinity of CLDN6-specific hybrid monoclonal antibodies, their binding to HEK293 cells stably transfected with CLDN3, 4, 6, or 9, respectively, and to tumor cell lines with endogenous CLDN6 expression was studied by flow cytometry. Cells were collected using 0.05% trypsin/EDTA, washed with FACS buffer (PBS containing 2% FCS and 0.1% sodium azide) and resuspended in FACS buffer at a concentration of 2 × 106 cells/ml. This cell suspension in an amount of 100 μl was incubated with the appropriate antibodies at the indicated concentrations for 60 min at 4°C. Hybrid cross-reactive antibodies (chimAB 5F2D2) were used to determine the expression of CLDN6 and CLDN9 A. Commercially available mouse anti-CLDN3 (R&D, MAB4620) and anti-CLDN4 (R&D, MAB4219) antibodies served as positive controls; human IgG1-κ (Sigma, I5154) served as a negative control. Cells were washed three times with FACS buffer and incubated for 30 min at 4°C with specific secondary antibodies, respectively goat anti-human IgG Fc-γ conjugated to allophycocyanin (APC) (Dianova, 109-136-170), or with
Комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) Complement-dependent cytotoxicity (CDC)
Комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), определяли путем измерения содержания внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТР) в нелизированных клетках после добавления человеческого комплемента к клеткам-мишеням, инкубированным с антителами против CLDN6. Для количественного определения АТР применяли высокочувствительный метод с использованием люминесцентной реакции, катализируемой люциферазой.Complement-dependent cytotoxicity (CDC) was determined by measuring intracellular adenosine triphosphate (ATP) content in unlysed cells after addition of human complement to target cells incubated with anti-CLDN6 antibodies. A highly sensitive method using a luciferase-catalyzed luminescent reaction was used to quantify ATP.
Для этого исследования брали клетки NEC8 дикого типа (несущие CLDN6) и клетки NEC8, нокдаунные по этому белку (не имеющие CLDN6); и те, и другие были стабильно трансдуцированы люциферазной экспрессионной конструкцией. Клетки собирали с помощью раствора 0,05% трипсин/EDTA, разбавляли до концентрации 2 × 105 клеток/мл смесью сред RPMI и GlutaMax-I (Invitrogen, 61870-010), содержащей 10% (объем/объем) FCS. Клетки в количестве 1 x 104 высевали на белый полипропиленовый 96-луночный планшет и инкубировали 24 часа при температуре 37°C в атмосфере с 5% CO2. После этого к клеткам прибавляли 50 мкл моноклональных гибридных антител против CLDN6 (в указанных концентрациях) в смеси среды RPMI, содержащей 20 мМ HEPES (60%) и человеческой сыворотки крови, полученной от шести здоровых доноров (40%). Для контроля на тотальный лизис добавляли 10 мкл на лунку 8%-ного (объем/объем) раствора Triton X-100 в PBS; для контроля на максимальное количество жизнеспособных клеток добавляли 10 мкл на лунку PBS; в опытные образцы также добавляли 10 мкл на лунку PBS. Инкубировали в течение 80 мин при температуре 37°C в атмосфере с 7,5% CO2, затем прибавляли 50 мкл на лунку «люцифериновой смеси» (3,84 мг/мл D-люциферин, 0,64 Ед/мл аденозинтрифосфатаза, 160 мM HEPES в дважды дистиллированной воде). Планшет инкубировали в темноте в течение 45 мин при комнатной температуре. Измеряли люминесценцию при помощи люминометра Infinite M200 (TECAN). Данные представлены как результаты цифрового интегрирования сигнала в относительных световых единицах (RLU). For this study, we used wild-type NEC8 cells (carrying CLDN6) and NEC8 cells knocked down for this protein (lacking CLDN6); both were stably transduced with the luciferase expression construct. Cells were collected using 0.05% trypsin/EDTA, diluted to a concentration of 2 × 105 cells/ml with a mixture of RPMI and GlutaMax-I media (Invitrogen, 61870-010) containing 10% (v/v) FCS. Cells at 1 x 10 4 were seeded onto a white polypropylene 96-well plate and incubated for 24 hours at 37°C in an atmosphere of 5% CO 2 . Subsequently, 50 μl of anti-CLDN6 monoclonal fusion antibodies (at the indicated concentrations) in a mixture of RPMI medium containing 20 mM HEPES (60%) and human serum obtained from six healthy donors (40%) was added to the cells. To control for total lysis, 10 μl per well of an 8% (v/v) solution of Triton X-100 in PBS was added; to control the maximum number of viable cells, 10 μl per well of PBS was added; 10 μl per well of PBS was also added to the test samples. Incubated for 80 min at 37°C in an atmosphere of 7.5% CO 2 , then 50 μl per well of “luciferin mixture” (3.84 mg/ml D-luciferin, 0.64 U/ml adenosine triphosphatase, 160 mM HEPES in double distilled water). The plate was incubated in the dark for 45 min at room temperature. Luminescence was measured using an Infinite M200 luminometer (TECAN). Data are presented as digital signal integration results in relative light units (RLU).
Специфичный лизис рассчитывали следующим образом:Specific lysis was calculated as follows:
максимальное количество жизнеспособных клеток: 10 мкл PBS, без антител тотальный лизис: 10 мкл 8% (объем/объем) Triton X-100 в PBS, без антител.maximum viable cell count: 10 µl PBS, no antibody; total lysis: 10 µl 8% (v/v) Triton X-100 in PBS, no antibody.
Антитело-завивимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC)
Антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADDC), определяли путем измерения содержания внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТР) в нелизированных клетках после добавления человеческих мононуклеаров периферической крови (PBMC) к клеткам-мишеням, инкубированным с антителами против CLDN6. Для количественного определения АТР применяли высокочувствительный метод с использованием люминесцентной реакции, катализируемой люциферазой.Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADDC) was determined by measuring intracellular adenosine triphosphate (ATP) content in unlysed cells following the addition of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) to target cells incubated with anti-CLDN6 antibodies. A highly sensitive method using a luciferase-catalyzed luminescent reaction was used to quantify ATP.
Для этого исследования брали клетки NEC8 дикого типа (несущие CLDN6) и клетки NEC8, нокдаунные по этому белку (не имеющие CLDN6); и те, и другие были стабильно трансдуцированы люциферазной экспрессионной конструкцией. Клетки собирали с помощью раствора 0,05% трипсин/EDTA, разбавляли до концентрации 2 × 105 клеток/мл смесью сред RPMI и GlutaMax-I (Invitrogen, 61870-010), содержащей 10% (объем/объем) FCS и 20 мМ Hepes. Клетки в количестве 1 × 104 высевали на белый полипропиленовый 96-луночный планшет и инкубировали 4 часа при температуре 37°C в атмосфере с 5% CO2.For this study, we used wild-type NEC8 cells (carrying CLDN6) and NEC8 cells knocked down for this protein (lacking CLDN6); both were stably transduced with the luciferase expression construct. Cells were collected using 0.05% trypsin/EDTA, diluted to a concentration of 2 × 105 cells/ml with a mixture of RPMI and GlutaMax-I media (Invitrogen, 61870-010) containing 10% (v/v) FCS and 20 mM Hepes. Cells in an amount of 1 × 10 4 were seeded onto a white polypropylene 96-well plate and incubated for 4 hours at 37°C in an atmosphere of 5% CO 2 .
Мононуклеары периферической крови выделяли из человеческой донорской крови путем центрифугирования в градиенте плотности, используя фиколл/гипак (GE Healthcare, 17144003). Сбирали слой, содержащий PBMC, и клетки промывали два раза раствором PBS/EDTA (2 мM). PBMC в количестве 1 × 108 клеток вносили в 50 мл среды X-Vivo 15 (Lonza, BE04-418Q), содержащей 5% инактивированной нагреванием человеческой сыворотки крови (Lonza, US14-402E) и инкубировали в течение 2 часов при температуре 37°C в атмосфере с 5% CO2. Peripheral blood mononuclear cells were isolated from human donor blood by density gradient centrifugation using Ficoll/Hypaque (GE Healthcare, 17144003). The layer containing PBMC was collected, and the cells were washed twice with PBS/EDTA (2 mM). PBMC in the amount of 1 × 10 8 cells were added to 50 ml of X-Vivo 15 medium (Lonza, BE04-418Q) containing 5% heat-inactivated human serum (Lonza, US14-402E) and incubated for 2 hours at 37°C C in an atmosphere of 5% CO 2 .
Через 4 часа после этой манипуляции с клетками-мишенями (NEC-8) к клеткам прибавляли моноклональные гибридные антитела против CLDN6 в растворе PBS в указанных концентрациях. Собирали неадгезивные PBMC, которые за 2 часа инкубации отделялись от адгезивных моноцитов, и разводили их средой X-vivo 15 до концентрации 8 × 106 клеток/мл. Эту клеточную суспензию (25 мкл) прибавляли к клеткам-мишеням и моноклональным гибридным антителам против CLDN6. Планшеты инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°C в атмосфере с 5% CO2. 4 hours after this manipulation of the target cells (NEC-8), monoclonal fusion antibodies against CLDN6 in PBS solution were added to the cells at the indicated concentrations. Non-adherent PBMCs, which separated from adherent monocytes after 2 hours of incubation, were collected and diluted with X-vivo 15 medium to a concentration of 8 × 10 6 cells/ml. This cell suspension (25 μl) was added to target cells and anti-CLDN6 monoclonal fusion antibodies. The plates were incubated for 24 hours at 37°C in an atmosphere of 5% CO 2 .
Через 24 часа инкубации для контроля «тотальный лизис» прибавляли раствор Triton X-100 (8% объем/объем) в PBS в количестве 10 мкл на лунку; для контроля «максимальное количество жизнеспособных клеток» прибавляли PBS 10 мкл на лунку; к опытным образцам также прибавляли PBS 10 мкл на лунку. Затем прибавляли 50 мкл на лунку «люцифериновой смеси» (3,84 мг/мл D-люциферин, 0,64 Ед/мл аденозинтрифосфатаза, 160 мM HEPES в дважды дистиллированной воде). Планшет инкубировали в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. Измеряли люминесценцию при помощи люминометра Infinite M200 (TECAN). Данные представлены как результаты цифрового интегрирования сигнала в относительных световых единицах (RLU). After 24 hours of incubation, to control “total lysis,” a solution of Triton X-100 (8% v/v) in PBS was added in an amount of 10 μl per well; to control the “maximum number of viable cells,” 10 μl of PBS per well was added;
Специфичный лизис рассчитывали следующим образом:Specific lysis was calculated as follows:
максимальное количество жизнеспособных клеток: 10 мкл PBS, без антител тотальный лизис: 10 мкл 8% (объем/объем) Triton X-100 в PBS, без антител.maximum viable cell count: 10 µl PBS, no antibody; total lysis: 10 µl 8% (v/v) Triton X-100 in PBS, no antibody.
d. Результатыd. results
Гибридные моноклональные антитела против CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A и 89A прочно связывались с человеческим CLDN6, а связывания с CLDN3, 4 и 9 не наблюдалось (фиг. 11).Anti-CLDN6 fusion
При связывании с человеческим CLDN6, стабильно экспрессирующимся на поверхности клеток HEK293, гибридные моноклональные антитела против CLDN6 chimAB 64A и 89A характеризовались очень низкими значениями EC50 (450-600 нг/мл) и насыщение мест связывания достигалось при низких концентрациях. Антитела сhimAB 67A и 61D характеризовались низким (1000 нг/мл) и средним (2300нг/мл) значениями EC50 соответственно (фиг. 12).When bound to human CLDN6 stably expressed on the surface of HEK293 cells, anti-CLDN6 hybrid
При связывании с CLDN6, эндогенно экспрессирующимся в клетках NEC8, гибридные моноклональные антитела против CLDN6 chimAB 64A и 89A характеризовались очень низкими значениями EC50 (600-650 нг/мл) и насыщение мест связывания достигалось при низких концентрациях. Антитела сhimAB 61D и 67A характеризовались средним (1700 нг/мл) и высоким (6100нг/мл) значениями EC50 соответственно (фиг. 13).When bound to CLDN6 endogenously expressed in NEC8 cells, the anti-CLDN6 hybrid
При связывании с CLDN6, эндогенно экспрессирующимся в клетках OV90, гибридные моноклональные антитела против CLDN6 chimAB 64A и 89A характеризовались очень низкими значениями EC50 (550-600 нг/мл) и насыщение мест связывания достигалось при низких концентрациях. Антитела сhimAB 61D и 67A характеризовались средними значениями EC50 (1500 нг/мл 2300 нг/мл соответственно) (фиг. 14). When bound to CLDN6 endogenously expressed in OV90 cells, the anti-CLDN6 hybrid
Гибридные моноклональные антитела против CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A и 89A проявляли активность, выражающуюся в зависимой от комплемента цитотоксичности в отношении клеток NEC-8, причем эта активность зависела от дозы (фиг.15).Anti-CLDN6 fusion
Гибридные моноклональные антитела против CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A и 89A проявляли активность, выражающуюся в зависимой от антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности в отношении клеток NEC-8, причем эта активность зависела от дозы и цитотоксичность возникала даже при низких концентрациях антител (фиг.16).Anti-CLDN6 hybrid
Эти результаты ясно демонстрируют специфичность указанных гибридных моноклональных антител в отношении CLDN6.These results clearly demonstrate the specificity of these hybrid monoclonal antibodies for CLDN6.
Пример 8. Лечение с использованием моноклональных антител против CLDN6Example 8 Treatment Using Anti-CLDN6 Monoclonal Antibodies
Лечение на ранних стадияхTreatment in the early stages
Для воздействия антителами на ранних стадиях бестимусным мышам линии Nude-Foxn1nu вводили путем подкожной инъекции в бок клетки NEC8 в количестве 2 × 107 в 200 мкл среды RPMI (Gibco). В каждой группе было по десять самок возрастом 6-8 недель. Через трое суток после инокуляции опухолевых клеток животным на протяжении семи недель дважды в неделю вводили путем внутривенной или внутрибрюшинной инъекции (чередовали) 200 мкг очищенных мышиных моноклональных антител muMAB 89A. Отрицательным контролем служила группа особей, которым вводили такой же объем PBS. Два раза в неделю определяли размеры опухолей: объем опухоли (TV) = (длина × ширина2)/2). TV выражали в мм3 и строили графики роста опухолей во времени. Когда размеры опухоли превышали 1500 мм3, животное умерщвляли. For early antibody exposure, Nude-Foxn1 nu nude mice were injected subcutaneously into the flank with 2 × 107 NEC8 cells in 200 μl of RPMI medium (Gibco). There were ten females in each group, 6-8 weeks old. Three days after inoculation of tumor cells, the animals were administered twice a week by intravenous or intraperitoneal injection (alternating) 200 μg of purified mouse
Лечение на поздних стадияхTreatment in later stages
Для воздействия антителами на поздних стадиях развития опухолей-ксенографтов бестимусным мышам-самкам возрастом 6-8 недель линии Nude-Foxn1nu вводили путем подкожной инъекции в бок клетки NEC8 в количестве 2 × 107 в 200 мкл среды RPMI (Gibco). Два раза в неделю определяли размеры опухолей: объем опухоли (TV) = (длина × ширина2)/2). TV выражали в мм3 и строили графики роста опухолей во времени. Через 15-17 суток после инокуляции опухолевых клеток животных разделяли на группы для воздействия; в каждой группе было 8 особей с опухолями одинаковых размеров - более 80 мм3. На протяжении пяти недель дважды в неделю мышам вводили путем внутривенной или внутрибрюшинной инъекции (чередовали) 200 мкг очищенных мышиных моноклональных гибридных антител. Отрицательным контролем служила группа особей, которым вводили неспецифичные антитела. Когда размеры опухоли превышали 1500 мм3, животное умерщвляли. For exposure to antibodies at late stages of development of xenograft tumors, athymic female mice aged 6-8 weeks of the Nude-Foxn1 nu line were injected by subcutaneous injection into the flank of NEC8 cells in an amount of 2 × 10 7 in 200 μl of RPMI medium (Gibco). Tumor sizes were determined twice a week: tumor volume (TV) = (length × width 2 )/2). TV was expressed in mm 3 and graphs of tumor growth over time were plotted. 15-17 days after inoculation of tumor cells, animals were divided into groups for exposure; in each group there were 8 individuals with tumors of the same size - more than 80 mm 3 . For five weeks, mice were treated twice weekly by intravenous or intraperitoneal injection (alternating) with 200 μg of purified mouse monoclonal fusion antibodies. A group of individuals that were injected with nonspecific antibodies served as a negative control. When the tumor size exceeded 1500 mm 3 , the animal was sacrificed.
При воздействии на мышей с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8 мышиными моноклональными антителами muMAB 61D, 64A и 67A на ранних стадиях развития опухолей роста опухолей не наблюдалось даже после прекращения иммунотерапии (фиг. 17). When mice bearing xenografts of NEC8 tumor cells were exposed to
При воздействии на мышей с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8 мышиными моноклональными антителами muMAB 89А на ранних стадиях развития опухолей рост опухолей подавлялся и в конце исследования у мышей, получавших muMAB89A, заметных опухолей не было (фиг. 18). When mice bearing xenografts of NEC8 tumor cells were exposed to the mouse
При воздействии на мышей с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8 мышиными моноклональными антителами muMAB 64А на поздних стадиях развития опухолей рост опухолей подавлялся (фиг. 19). When mice with xenografts of NEC8 tumor cells were exposed to
При воздействии на мышей с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8 мышиными моноклональными антителами muMAB 64А на поздних стадиях развития продолжительность жизни подопытных особей увеличивалась (фиг. 20). When mice with xenografts of tumor cells of the NEC8 line were exposed to mouse
При воздействии на мышей с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8 мышиными моноклональными антителами muMAB 61D, 67A и 89A на поздних стадиях развития опухолей достигалось ингибирование опухолевого роста опухолей (фиг. 21). When mice with xenografts of NEC8 tumor cells were exposed to mouse
При воздействии на мышей с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8 особи, получавшие специфичные антитела против CLDN6 muMAB 61D или 67A на поздних стадиях развития опухолей, жили дольше (фиг. 22). When exposed to mice with xenografts of NEC8 tumor cells, individuals treated with the CLDN6-
При позднем воздействии на мышей с ксенографтами клеток линии NEC8 дикого типа и со стабильным нокдауном по CLDN6 антитела muMAB 64A и 89A оказывали терапевтическое действие только у мышей с ксенографтами клеток NEC8 дикого типа, а у мышей с ксенографтами клеток NEC8, нокдаунных по CLDN6, терапевтического эффекта этих антител не было, что демонстрирует специфичность антител против CLDN6 in vivo (фиг. 23). When exposed late to mice with wild-type NEC8 cell xenografts and stable CLDN6 knockdown,
Пример 9. Картирование с высоким разрешением эпитопов моноклональных антител против CLDN6 Example 9: High Resolution Epitope Mapping of Anti-CLDN6 Monoclonal Antibodies
При картировании эпитопов с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) специфичные моноклональные антитела против CLDN6 лишь очень слабо связывались с линейными эпитопами, что указывало на то, что они имеют конформационные эпитопы. Чтобы изучить взаимодействие описанных в настоящем документе антител с CLDN6 в его нативной конформации, для эпитопного картирования был применен метод сайт-специфического мутагенеза в культурах клеток млекопитающих. Был проведен сканирующий аланином мутагенез аминокислотных остатков 27-81 и 137-161 в первом и втором внеклеточных доменах, соответственно. После осуществления временной экспрессии в клетках HEK293T у мутантных вариантов CLDN6 определяли способность связываться со специфичными моноклональными антителами. Нарушение связывания специфичного моноклонального антитела с мутантным вариантом CLDN6 указывало на то, что затронутый мутацией аминокислотный остаток важен для контакта и/или пространственной структуры. Связывание определяли методом проточной цитометрии. Чтобы отличать трансфицированные клетки от нетрансфицированных трансфекцию проводили одновременно с флуоресцентным маркером. When mapping epitopes using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), specific monoclonal antibodies against CLDN6 bound only very weakly to linear epitopes, indicating that they have conformational epitopes. To study the interaction of the antibodies described herein with CLDN6 in its native conformation, site-directed mutagenesis in mammalian cell cultures was used for epitope mapping. Alanine scanning mutagenesis was performed at amino acid residues 27-81 and 137-161 in the first and second extracellular domains, respectively. After transient expression in HEK293T cells, the CLDN6 mutants were assessed for their ability to bind to specific monoclonal antibodies. The impaired binding of the specific monoclonal antibody to the CLDN6 mutant indicated that the affected amino acid residue was important for contact and/or spatial structure. Binding was determined by flow cytometry. To distinguish transfected cells from non-transfected ones, transfection was carried out simultaneously with a fluorescent marker.
В белке CLDN6 путем сканирования аланином были идентифицированы аминокислотные остатки, важные для взаимодействия со специфичными гибридными антителами против CLDN6. Путем сайт-специфического мутагенеза были получены замены на аланин и глицин (GENEART AG, Германия). Для проверки связывания моноклональных гибридных антител с CLDN6 дикого типа и его мутантными вариантами, клетки HEK293T временно трансфицировали соответствующими плазмидами, кодирующими тот или иной клаудин, и определяли экспрессию методом проточной цитометрии. Чтобы отличать трансфицированные клетки от нетрансфицированных, проводили одновременную трансфекцию клеток HEK293T флуоресцентным маркером. Через 24 часа после трансфекции клетки собирали с помощью раствора трипсина (0,05%)/EDTA, промывали буферным раствором для FACS (PBS, содержащий 2% FCS и 0,1% азида натрия) и ресуспендировали в буферном растворе для FACS в концентрации 2 x 106 клеток/мл. Эту суспензию клеток (100 мкл) инкубировали с антителами в концентрации 10 мкг/мл в течение 45 мин при температуре 4°C. В качестве контроля для определения экспрессии мутантных вариантов CLDN6 на поверхности клеток использовали готовые имеющиеся в продаже мышиные антитела против CLDN6 (R&D, MAB3656). Клетки промывали три раза буферным раствором для FACS и инкубировали со специфичными вторыми антителами - козьими античеловеческими IgG Fc-γ (Dianova, 109-136-170) или антимышиными IgG 1+2a+2b+3а (Dianova, 115-135-164), - конъюгированными с аллофикоцианином (АРС) в течение 30 мин при температуре 4°С. После этого клетки дважды промывали и ресуспендировали в буферном растворе для FACS. Определяли связывание с трансфицированными клетками при помощи проточного цитофлуориметра-биоанализатора BD FACSArray. Экспрессия флуоресцентного маркера откладывали по горизонтальной оси, связывание антител - по вертикальной. Среднюю интенсивность сигнала для связывания моноклональных гибридных антител, специфичных к CLDN6, с мутантными вариантами CLDN6 выражали как процент относительно связывания с CLDN6 дикого типа. Если аминокислотный остаток имел ключевое значение для связывания, то после его мутации связывания не происходило; если аминокислотный остаток имел поддерживающее значение, то после мутации связывание лишь снижалось по сравнению со связыванием CLDN6 дикого типа.In the CLDN6 protein, amino acid residues important for interaction with specific anti-CLDN6 hybrid antibodies were identified by alanine scanning. Substitutions for alanine and glycine were obtained by site-specific mutagenesis (GENEART AG, Germany). To test the binding of monoclonal fusion antibodies to wild-type CLDN6 and its mutant variants, HEK293T cells were transiently transfected with the appropriate plasmids encoding each claudin, and expression was determined by flow cytometry. To distinguish transfected from nontransfected cells, HEK293T cells were simultaneously transfected with a fluorescent marker. 24 hours after transfection, cells were harvested using trypsin (0.05%)/EDTA, washed with FACS buffer (PBS containing 2% FCS and 0.1% sodium azide) and resuspended in FACS buffer at a concentration of 2 x 10 6 cells/ml. This cell suspension (100 μl) was incubated with antibodies at a concentration of 10 μg/ml for 45 min at 4°C. A commercially available mouse anti-CLDN6 antibody (R&D, MAB3656) was used as a control to determine cell surface expression of CLDN6 mutants. The cells were washed three times with FACS buffer and incubated with specific second antibodies - goat anti-human IgG Fc-γ (Dianova, 109-136-170) or
Картирование эпитопов с высоким разрешением показало, что для взаимодействия со специфичными гибридными антителами против CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A и 89A важны аминокислотные остатки F35, G37, S39 и, вероятно, T33 первого внеклеточного домена CLDN6. Аминокислотный остаток I40 существенно важен для связывания с антителами chimAB 89A и участвует в связывании с chimAB 61D и 67A.Кроме того, аминокислотный остаток L151 второго внеклеточного домена CLDN6 важен для взаимодействия с chimAB 67A (фиг. 24).High-resolution epitope mapping showed that amino acid residues F35, G37, S39 and, probably, T33 of the first extracellular domain of CLDN6 are important for interaction with specific hybrid antibodies against
Пример 10. Получение и проверка усовершенствованных моноклональных антител против CLDN6Example 10: Production and Validation of Enhanced Anti-CLDN6 Monoclonal Antibodies
Оказалось, что антитела 64A, обладая превосходными качествами в отношении связывания с CLDN6 и эффективного лечения опухолей, содержат свободный остаток цистеина в положении 46 легкой цепи, который существенно ухудшает такие свойства белка, как растворимость, стабильность и способность к образованию агрегатов. Свободный остаток цистеина нежелателен также по другим причинам, например для регуляции. Поэтому мы попытались создать антитела на основе 64A, не содержащие свободного остатка цистеина в положении 46, не теряя при этом их желательных свойств. It turned out that
Были получены гибридные антитела mAb206-LCC, в которых объединены тяжелая цепь chimAB 64A и легкая цепь chimAB 61D. В результате аминокислотных замен были получены MAb206-SUBG и mAb206-SUBS, в которых цистеин в положении 46 легкой цепи chimAB 64A был заменен на глицин и серин, соответственно.Hybrid antibodies mAb206-LCC were obtained, which combine the
Получение моноклональных гибридных антител против CLDN6 в клетках HEK293TProduction of monoclonal hybrid antibodies against CLDN6 in HEK293T cells
Моноклональные гибридные антитела временно экспрессировались в клетках HEK293T (ATCC CRL-11268), трансфицированных плазмидной ДНК, кодирующей легкие и тяжелые цепи соответствующих антител, как описано в разделе b примера 7.Monoclonal fusion antibodies were transiently expressed in HEK293T cells (ATCC CRL-11268) transfected with plasmid DNA encoding the light and heavy chains of the corresponding antibodies, as described in section b of Example 7.
Получение моноклональных гибридных антител против CLDN6 клеток CHO, адаптированных к росту в суспензииPreparation of monoclonal hybrid antibodies against CLDN6 of CHO cells adapted to growth in suspension
Адаптированные к росту в суспензии клетки CHO субкультивировали в бессывороточной среде в CO2-инкубаторе с шейкером и увлажнением рабочей камеры. За сутки до трансфекции клетки высевали в бессывороточную среду в шейкерные колбы. CHO cells adapted to growth in suspension were subcultured in a serum-free medium in a CO 2 incubator with a shaker and a humidified working chamber. One day before transfection, cells were seeded in serum-free medium in shake flasks.
В день трансфекции клетки центрифугировали (5 мин при 200 g) и ресуспендировали в свежей среде DMEM (Invitrogen, 41965-039) в шейкерных колбах. К клеткам прибавляли ДНК и трансфекционный реагент и осторожно перемешивали встряхиванием. После накопительного культивирования в CO2-инкубаторе клетки разводили бессывороточной питательной средой и культивировали далее в шейкере-инкубаторе. В дни 0, 2, 4 и 6 клетки подпитывали готовым препаратом CHO CD EfficientFeed™ A и B, соответственно (Invitrogen, A1023401 и A1024001). Когда жизнеспособность клеток становилась ниже 90%, собирали гибридные антитела. Полученные антитела очищали путем жидкостной экспресс-хроматографии белков (FPLC), используя колонки с белком А. Концентрацию антител определяли по поглощению при 280 нм, чистоту проверяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.On the day of transfection, cells were centrifuged (5 min at 200 g) and resuspended in fresh DMEM (Invitrogen, 41965-039) in shake flasks. DNA and transfection reagent were added to the cells and mixed gently by shaking. After cumulative cultivation in a CO 2 incubator, the cells were diluted with serum-free nutrient medium and further cultivated in an incubator shaker. On
Проточная цитометрияFlow cytometry
Связывание специфичных гибридных моноклональных антител против CLDN6 с клетками, в которых экспрессируется их мишень, определяли методом проточной цитометрии. Клетки собирали с помощью раствора 0,05% трипсин/EDTA, промывали буферным раствором для FACS (PBS, содержащий 2% FCS и 0,1% азида натрия) и ресуспендировали в буферном растворе для FACS в концентрации 2 × 106 клеток/мл. Эту клеточную суспензию в количестве 100 мкл инкубировали с соответствующими антителами в указанных концентрациях в течение 30 мин при температуре 4°C. Для определения экспрессии CLDN6 и CLDN9 использовались антитела ChimAB 5F2D2. Положительным контролем служили готовые имеющиеся в продаже мышиные антитела против CLDN3 (R&D, MAB4620) и против CLDN4 (R&D, MAB4219); отрицательным контролем служили человеческие IgG1-κ (Sigma, I5154). Клетки промывали три раза буферным раствором для FACS и инкубировали в течение 30 мин при температуре 4°C со специфичными вторыми антителами - соответственно козьими античеловеческими IgG Fc-γ, конъюгированными с аллофикоцианином (АРС) (Dianova, 109-136-170), или с антимышиными IgG 1+2a+2b+3a, конъюгированными с АРС (Dianova, 115-135-164). Клетки дважды промывали и ресуспендировали в буферном растворе для FACS. Связывание определяли при помощи проточного цитофлуориметра-биоанализатора BD FACSArray.The binding of specific hybrid monoclonal antibodies against CLDN6 to cells in which their target is expressed was determined by flow cytometry. Cells were collected using 0.05% trypsin/EDTA, washed with FACS buffer (PBS containing 2% FCS and 0.1% sodium azide) and resuspended in FACS buffer at a concentration of 2 × 106 cells/ml. This cell suspension in an amount of 100 μl was incubated with the appropriate antibodies at the indicated concentrations for 30 min at 4°C. ChimAB 5F2D2 antibodies were used to determine the expression of CLDN6 and CLDN9. Commercially available mouse anti-CLDN3 (R&D, MAB4620) and anti-CLDN4 (R&D, MAB4219) antibodies served as positive controls; human IgG1-κ (Sigma, I5154) served as a negative control. Cells were washed three times with FACS buffer and incubated for 30 min at 4°C with specific secondary antibodies, respectively goat anti-human IgG Fc-γ conjugated to allophycocyanin (APC) (Dianova, 109-136-170), or with
Комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC)Complement-dependent cytotoxicity (CDC)
Комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), определяли путем измерения содержания внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТР) в нелизированных клетках после добавления человеческого комплемента к клеткам-мишеням, инкубированным с антителами против CLDN6, как описано в примере 7. Complement-dependent cytotoxicity (CDC) was determined by measuring intracellular adenosine triphosphate (ATP) content in unlysed cells after adding human complement to target cells incubated with anti-CLDN6 antibodies as described in Example 7.
Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичностьAntibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
Антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADDC), определяли путем измерения содержания внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТР) в нелизированных клетках после добавления человеческих мононуклеаров периферической крови (PBMC) к клеткам-мишеням, инкубированным с антителами против CLDN6. Для количественного определения АТР применяли высокочувствительный метод с использованием люминесцентной реакции, катализируемой люциферазой.Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADDC) was determined by measuring intracellular adenosine triphosphate (ATP) content in unlysed cells following the addition of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) to target cells incubated with anti-CLDN6 antibodies. A highly sensitive method using a luciferase-catalyzed luminescent reaction was used to quantify ATP.
Для этого исследования брали клетки NEC8 дикого типа (несущие CLDN6) и клетки NEC8, нокдаунные по этому белку (не имеющие CLDN6); и те, и другие были стабильно трансдуцированы люциферазной РНК, а клетки OV90 временно трансфицировали транскрибированной in vitro РНК, кодирующей люциферазу. Клетки собирали с помощью раствора 0,05% трипсин/EDTA, разбавляли до концентрации 2 × 105 клеток/мл (NEC-8 дикого типа и нокдаунные по СLD6) или 1 × 106 клеток/мл (OV90) соответствующей питательной средой, содержащей дополнительно 20 ммМ Hepes. Клетки в количестве, соответственно, 1 × 104 или 5 × 104 высевали на белый полипропиленовый 96-луночный планшет и инкубировали при температуре 37°C в атмосфере с 5% CO2.For this study, we used wild-type NEC8 cells (carrying CLDN6) and NEC8 cells knocked down for this protein (lacking CLDN6); both were stably transduced with luciferase RNA, and OV90 cells were transiently transfected with in vitro transcribed RNA encoding luciferase. Cells were collected using 0.05% trypsin/EDTA solution, diluted to a concentration of 2 × 10 5 cells/ml (NEC-8 wild type and CLD6 knockdown) or 1 × 10 6 cells/ml (OV90) with the appropriate growth medium containing additional 20 mmM Hepes. Cells in quantities of 1 × 10 4 or 5 × 10 4 were seeded onto a white polypropylene 96-well plate and incubated at 37°C in an atmosphere of 5% CO 2 .
Мононуклеары периферической крови выделяли из человеческой донорской крови путем центрифугирования в градиенте плотности, используя фиколл/гипак (GE Healthcare, 17144003). Собирали слой, содержащий PBMC, и клетки промывали два раза раствором PBS/EDTA (2 мM). PBMC в количестве 1 × 108 клеток вносили в 50 мл среды X-Vivo 15 (Lonza, BE04-418Q), содержащей 5% человеческой сыворотки крови (от шести здоровых доноров) и инкубировали в течение 2 часов при температуре 37°C в атмосфере с 5% CO2. Через 4 часа после этой манипуляции к клеткам прибавляли моноклональные гибридные антитела против CLDN6 (25 мкл) в растворе PBS в указанных концентрациях. Собирали неадгезивные PBMC, которые за 2 часа инкубации отделялись от адгезивных моноцитов, и разводили их средой X-vivo 15 до концентрации 1,6 × 107 клеток/мл (клетки NEC-8 дикого типа или нокдаунные по CLDN6) или 4 × 107 клеток/мл (клетки OV90). Эту клеточную суспензию (25 мкл) прибавляли к клеткам-мишеням и моноклональным гибридным антителам против CLDN6. Планшеты инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°C в атмосфере с 5% CO2. Peripheral blood mononuclear cells were isolated from human donor blood by density gradient centrifugation using Ficoll/Hypaque (GE Healthcare, 17144003). The layer containing PBMC was collected, and the cells were washed twice with PBS/EDTA (2 mM). PBMC in the amount of 1 × 10 8 cells were added to 50 ml of X-Vivo 15 medium (Lonza, BE04-418Q) containing 5% human serum (from six healthy donors) and incubated for 2 hours at 37°C in an atmosphere with 5% CO 2 . 4 hours after this manipulation, monoclonal hybrid antibodies against CLDN6 (25 μl) in PBS solution were added to the cells at the indicated concentrations. Non-adherent PBMC, which separated from adherent monocytes after 2 hours of incubation, were collected and diluted with X-vivo 15 medium to a concentration of 1.6 × 10 7 cells/ml (NEC-8 wild-type or CLDN6 knockdown cells) or 4 × 10 7 cells/ml (OV90 cells). This cell suspension (25 μl) was added to target cells and anti-CLDN6 monoclonal fusion antibodies. The plates were incubated for 24 hours at 37°C in an atmosphere of 5% CO 2 .
Через 24 часа инкубации для контроля «тотальный лизис» прибавляли раствор Triton X-100 (8% объем/объем) в PBS в количестве 10 мкл на лунку; для контроля «максимальное количество жизнеспособных клеток» прибавляли PBS 10 мкл на лунку; к опытным образцам также прибавляли PBS 10 мкл на лунку. Затем прибавляли 50 мкл на лунку «люцифериновой смеси» (3,84 мг/мл D-люциферин, 0,64 Ед/мл аденозинтрифосфатаза, 160 мM HEPES в дважды дистиллированной воде). Планшет инкубировали в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. Измеряли люминесценцию при помощи люминометра Infinite M200 (TECAN). Данные представлены как результаты цифрового интегрирования сигнала в относительных световых единицах (RLU). After 24 hours of incubation, to control “total lysis,” a solution of Triton X-100 (8% v/v) in PBS was added in an amount of 10 μl per well; to control the “maximum number of viable cells,” 10 μl of PBS per well was added;
Специфичный лизис рассчитывали следующим образом: Specific lysis was calculated as follows:
максимальное количество жизнеспособных клеток: 10 мкл PBS, без антител тотальный лизис: 10 мкл 8% (объем/объем) Triton X-100 в PBS, без антител.maximum viable cell count: 10 µl PBS, no antibody; total lysis: 10 µl 8% (v/v) Triton X-100 in PBS, no antibody.
Лечение на поздних стадияхTreatment in later stages
Для воздействия антителами на поздние стадии развития опухолей, возникших из - ксенографтов опухолевых клеток, бестимусным мышам-самкам линии Nude-Foxn1nu возрастом 6-8 недель вводили путем подкожной инъекции в бок 2 × 107 клеток NEC8 в 200 мкл среды RPMI (Gibco). Два раза в неделю определяли размеры опухолей: объем опухоли (TV) = (длина × ширина2)/2). TV выражали в мм3 и строили графики роста опухолей во времени. Через 17 суток после инокуляции опухолевых клеток животных разделяли на группы для воздействия; в каждой группе было 8 особей с опухолями одинаковых размеров - более 80 мм3. На протяжении пяти недель дважды в неделю мышам вводили путем внутривенной или внутрибрюшинной инъекции (чередовали) 200 мкг очищенных мышиных моноклональных гибридных антител. Отрицательным контролем служила группа особей, которым вводили неспецифичные антитела. Когда размеры опухоли превышали 1500 мм3, животное умерщвляли. To target the late stages of development of tumors arising from xenografts of tumor cells with antibodies, athymic female mice of the Nude-Foxn1 nu line, 6-8 weeks old, were injected by subcutaneous injection into the flank with 2 × 10 7 NEC8 cells in 200 μl of RPMI medium (Gibco) . Tumor sizes were determined twice a week: tumor volume (TV) = (length × width 2 )/2). TV was expressed in mm 3 and graphs of tumor growth over time were plotted. 17 days after tumor cell inoculation, animals were divided into treatment groups; in each group there were 8 individuals with tumors of the same size - more than 80 mm 3 . For five weeks, mice were treated twice weekly by intravenous or intraperitoneal injection (alternating) with 200 μg of purified mouse monoclonal fusion antibodies. A group of individuals that were injected with nonspecific antibodies served as a negative control. When the tumor size exceeded 1500 mm 3 , the animal was sacrificed.
Исследование метастазированияMetastasis research
Для изучения метастазирования клетки NEC8 собирали, фильтровали через сетку (70 мкм), чтобы удалить крупные клеточные агрегаты. Бестимусным мышам-самкам линии Nude-Foxn1nu возрастом 6 недель вводили путем инъекции в хвостовую вену 4 × 106 клеток NEC8. Через трое суток после введения опухолевых клеток два раза в неделю животным вводили путем внутривенной или внутрибрюшинной инъекции (чередовали) очищенные мышиные моноклональные антитела muMAB 64A в количестве 200 мкг в PBS либо PBS без антител. Через 8 недель мышей умерщвляли, извлекали легкие и замораживали образцы в жидком азоте. To study metastasis, NEC8 cells were harvested and filtered through a mesh (70 μm) to remove large cellular aggregates. Nude-Foxn1 nu female nude mice, 6 weeks old, were treated with 4 × 106 NEC8 cells by tail vein injection. Three days after the injection of tumor cells, twice a week the animals were administered by intravenous or intraperitoneal injection (alternating) purified mouse
Из замороженной ткани выделяли геномную ДНК согласно инструкциям "Blood & Cell Culture DNA Midi Kit" (Qiagen, 13343). Легочную ткань гомогенизировали при помощи диспергатора Ultra Torax T8.10 (IKA-Werke). Чтобы избежать загрязнения человеческой геномной ДНК, легочную геномную ДНК получали в стерильных условиях, используя количественную полимеразную цепную реакцию (qPCR). Чтобы определить опухолевую нагрузку человеческих клеток NEC8 в образцах мышиной легочной ткани, строили стандартную кривую с определенными количествами человеческой геномной ДНК клеток NEC8 и мышиной легочной геномной ДНК. Использовали следующие серии разведений (ДНК клеток NEC8 / мышиная легочная ДНК): 200/0, 40/160, 8/192, 1,6/198,4, 0,32/199,68, 0,064/199,94, 0,013/200 и 0/200 нг. Для qPCR брали 200 нг геномной ДНК, краситель 2xSYBR Green (Qiagen, 204145), 16 нмоль смысловой праймер (GGGATAATTTCAGCTGACTAAACAG, Eurofins) и 16 нмоль антисмысловой праймер (TTCCGTTTAGTTAGGTGCAGTTATC, Eurofins) в суммарном объеме 50 мкл; для анализа использовали систему ПЦР в режиме реального времени 7300 Real Time PCR-System (Applied Biosystems, США). Для отрицательного контроля вместо ДНК брали воду. Количественную ПЦР проводили при следующих условиях: 15 мин при 95°C (1 цикл), 30 c при 95°C / 30 с при 62°C / 30 c при 72°C (40 циклов), 15 c при 95°C / 30 c при 60°C / 15 c при 95°C (1 цикл). Все реакции qPCR проводили в трех повторах. Опухолевую нагрузку определяли методом стандартных кривых и рассчитывали с помощью прилагаемой к прибору 7300 System (Applied Biosystems) программы.Genomic DNA was isolated from frozen tissue according to the instructions of the Blood & Cell Culture DNA Midi Kit (Qiagen, 13343). Lung tissue was homogenized using Ultra Torax T8.10 dispersant (IKA-Werke). To avoid contamination of human genomic DNA, lung genomic DNA was obtained under sterile conditions using quantitative polymerase chain reaction (qPCR). To determine the tumor burden of human NEC8 cells in mouse lung tissue samples, a standard curve was generated with defined amounts of human NEC8 cell genomic DNA and mouse lung genomic DNA. The following dilution series were used (NEC8 cell DNA/mouse lung DNA): 200/0, 40/160, 8/192, 1.6/198.4, 0.32/199.68, 0.064/199.94, 0.013/ 200 and 0/200 ng. For qPCR, 200 ng of genomic DNA, 2xSYBR Green dye (Qiagen, 204145), 16 nmol sense primer (GGGATAATTTCAGCTGACTAAACAG, Eurofins) and 16 nmol antisense primer (TTCCGTTTAGTTAGGTGCAGTTATC, Eurofins) were taken in a total volume of 50 μl; The 7300 Real Time PCR-System (Applied Biosystems, USA) was used for analysis. For a negative control, water was taken instead of DNA. Quantitative PCR was carried out under the following conditions: 15 min at 95°C (1 cycle), 30 s at 95°C / 30 s at 62°C / 30 s at 72°C (40 cycles), 15 s at 95°C / 30 s at 60°C / 15 s at 95°C (1 cycle). All qPCR reactions were performed in triplicate. Tumor burden was determined by the standard curve method and calculated using the software supplied with the 7300 System instrument (Applied Biosystems).
Картирование эпитопов с высоким разрешениемHigh-resolution epitope mapping
Чтобы изучить взаимодействие антител по данному изобретению с CLDN6 в его нативной конформации применяли метод сайт-специфического мутагенеза в культурах клеток млекопитающих для картирования эпитопов. Проводили сканирование аланином аминокислотных остатков 27-81 и 137-161 первого и второго внеклеточных доменов CLDN6, соответственно. Замены на аланин осуществляли методом сайт-специфического мутагенеза (GENEART AG, Германия). После осуществления временной экспрессии в клетках HEK293T у мутантных вариантов CLDN6 определяли способность связываться со специфичными моноклональными антителами. Нарушение связывания специфичного моноклонального антитела с мутантным вариантом CLDN6 указывало на то, что затронутый мутацией аминокислотный остаток важен для контакта и/или пространственной структуры. Связывание определяли методом проточной цитометрии. Чтобы отличать трансфицированные клетки от нетрансфицированных, трансфекцию проводили одновременно с флуоресцентным маркером. Через 24 часа после трансфекции клетки собирали с помощью раствора трипсина (0,05%)/EDTA, промывали буферным раствором для FACS (PBS, содержащий 2% FCS и 0,1% азида натрия) и ресуспендировали в буферном растворе для FACS в концентрации 2 × 106 клеток/мл. Эту суспензию клеток (100 мкл) инкубировали с антителами в концентрации 10 мкг/мл в течение 30 мин при температуре 4°C. В качестве контроля для определения экспрессии мутантных вариантов CLDN6 на поверхности клеток использовали готовые имеющиеся в продаже мышиные антитела против CLDN6 (R&D, MAB3656). Клетки промывали три раза буферным раствором для FACS и инкубировали со специфичными вторыми антителами - козьими античеловеческими IgG Fc-γ (Dianova, 109-136-170) или антимышиными IgG 1+2a+2b+3а (Dianova, 115-135-164), - конъюгированными с аллофикоцианином (АРС) в течение 30 мин при температуре 4°С. После этого клетки дважды промывали и ресуспендировали в буферном растворе для FACS. Определяли связывание с трансфицированными клетками при помощи проточного цитофлуориметра-биоанализатора BD FACSArray. Экспрессия флуоресцентного маркера откладывали по горизонтальной оси, связывание антител - по вертикальной. Среднюю интенсивность сигнала для связывания моноклональных гибридных антител, специфичных к CLDN6, с мутантными вариантами CLDN6 выражали как процент относительно связывания с CLDN6 дикого типа. Если аминокислотный остаток имел ключевое значение для связывания, то после его мутации связывания не происходило; если аминокислотный остаток имел поддерживающее значение, то после мутации связывание лишь снижалось по сравнению со связыванием CLDN6 дикого типа.To study the interaction of the antibodies of this invention with CLDN6 in its native conformation, the method of site-directed mutagenesis in mammalian cell cultures was used to map epitopes. Alanine scanning was performed on amino acid residues 27-81 and 137-161 of the first and second extracellular domains of CLDN6, respectively. Substitutions to alanine were carried out by site-specific mutagenesis (GENEART AG, Germany). After transient expression in HEK293T cells, the CLDN6 mutants were assessed for their ability to bind to specific monoclonal antibodies. The impaired binding of the specific monoclonal antibody to the CLDN6 mutant indicated that the affected amino acid residue was important for contact and/or spatial structure. Binding was determined by flow cytometry. To distinguish transfected from nontransfected cells, transfection was performed simultaneously with a fluorescent marker. 24 hours after transfection, cells were harvested with trypsin (0.05%)/EDTA, washed with FACS buffer (PBS containing 2% FCS and 0.1% sodium azide) and resuspended in FACS buffer at a concentration of 2 × 10 6 cells/ml. This cell suspension (100 μl) was incubated with antibodies at a concentration of 10 μg/ml for 30 min at 4°C. A commercially available mouse anti-CLDN6 antibody (R&D, MAB3656) was used as a control to determine cell surface expression of CLDN6 mutants. The cells were washed three times with FACS buffer and incubated with specific second antibodies - goat anti-human IgG Fc-γ (Dianova, 109-136-170) or
Иммуногистохимический анализImmunohistochemical analysis
Криосрезы ткани (4 мкм) сразу после изготовления фиксировали ацетоном в течение 10 мин при температуре -20°C. Затем срезы высушивали в течение 10 мин при комнатной температуре и хранили при -80°C. Перед использованием срезы согревали (10 мин при комнатной температуре) и регидратировали в РBS в течение 5 мин. Блокировали эндогенную пероксидазную активность 0,3%-ной перекисью водорода в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре. Чтобы избежать неспецифичного связывания препараты инкубировали с козьей сывороткой (10%) в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого препараты инкубировали с мышиными моноклональными антителами, специфичными к CLDN6, muMAB 64A (0,2 мкг/мл в PBS, содержащем 10% козьей сыворотки), в течение ночи при температуре 4°C. На следующий день препараты промывали PBS (3 раза по 5 мин) при комнатной температуре и инкубировали с вторыми антителами (100 мкл готовых имеющихся в продаже антимышиных IgG (ImmunoLogic), конъюгированных с комплексом полимер-пероксидаза хрена (PowerVision)) в течение часа при комнатной температуре. Затем препараты промывали PBS (3 раза по 5 мин) при комнатной температуре. Окончательное окрашивание осуществляли в течение полутора минут, используя набор VECTOR NovaRED Substrate Kit SK-4800 производства Vector Laboratories (Берлингейм, шт. Калифорния, США). Контрастное окрашивание срезов проводили гематоксилином в течение 90 секунд при комнатной температуре. Препараты обезвоживали в этиловом спирте возрастающей концентрации (70%, 80%, 2 × 96% и 99%, по 5 мин в каждом) и 10 мин инкубировали в ксилоле, после чего заливали X-tra Kit (Medite Histotechnic). Cryosections of tissue (4 μm) immediately after preparation were fixed with acetone for 10 min at a temperature of -20°C. The sections were then dried for 10 min at room temperature and stored at −80°C. Before use, sections were warmed (10 min at room temperature) and rehydrated in PBS for 5 min. Endogenous peroxidase activity was blocked with 0.3% hydrogen peroxide in PBS for 15 min at room temperature. To avoid nonspecific binding, the preparations were incubated with goat serum (10%) in PBS for 30 min at room temperature. The slides were then incubated with the CLDN6-specific mouse
Чтобы использовать моноклональные гибридные антитела mAb206-LCC и mAb206-SUBG в человеческих тканях, их метили флуоресцеинизотиоцианатом (FITC, Squarix GmbH, Германия). Изготавливали криосрезы и обрабатывали их, как описано выше (фиксация, блокирование эндогенной пероксидазы, блокирование участков неспецифичного связывания). Затем препараты инкубировали с антителами mAb206-LCC-FITC и mAb206-SUBG-FITC (1 мкг/мл в PBS, содержащем 10% козьей сыворотки) в течение часа при комнатной температуре в темноте. После этого препараты промывали PBS (3 раза по 5 мин) при комнатной температуре и инкубировали с 200 мкл кроличьих анти-FITC-HRP антител (AbD Serotec, разведенные 1:300 в PBS, содержащем 10% козьей сыворотки) в течение 30 мин при комнатной температуре. Промывали PBS (3 раза по 5 мин) при комнатной температуре, после чего осуществляли реакцию с субстратом в течение 2 мин 30, используя набор VECTOR NovaRED Substrate Kit SK-4800 производства Vector Laboratories (Берлингейм, шт. Калифорния, США). Контрастное окрашивание, обезвоживание и заключение в среду осуществляли, как описано выше.To use the monoclonal hybrid antibodies mAb206-LCC and mAb206-SUBG in human tissues, they were labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC, Squarix GmbH, Germany). Cryosections were prepared and processed as described above (fixation, blocking of endogenous peroxidase, blocking of nonspecific binding sites). The slides were then incubated with mAb206-LCC-FITC and mAb206-SUBG-FITC antibodies (1 μg/ml in PBS containing 10% goat serum) for an hour at room temperature in the dark. After this, the preparations were washed with PBS (3 times for 5 min) at room temperature and incubated with 200 μl of rabbit anti-FITC-HRP antibodies (AbD Serotec, diluted 1:300 in PBS containing 10% goat serum) for 30 min at room temperature. temperature. Wash with PBS (3 times for 5 min) at room temperature, after which the substrate is reacted for 2
Изучение специфичности связывания моноклональных гибридных антител против CLDN6 методом проточной цитометрии с использованием клеток HEK293T, временно трансфицированных человеческими CLDN6, 3, 4 и 9, показало, что моноклональные гибридные антитела chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS связываются с CLDN6, но не взаимодействуют с CLDN3, 4 и 9, соответственно (фиг. 27).A flow cytometry study of the binding specificity of anti-CLDN6 monoclonal fusion antibodies using HEK293T cells transiently transfected with human CLDN6, 3, 4 and 9 showed that
Что касается связывания с человеческим CLDN6, стабильно экспрессирующимся на поверхности клеток HEK293, то моноклональные гибридные антитела против CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS характеризовались сходно низкими значениями EC50 и насыщение мест связывания достигалось при низких концентрациях (фиг. 28).Regarding binding to human CLDN6 stably expressed on the surface of HEK293 cells, the anti-CLDN6 monoclonal
Сродство связывания (аффинность) моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS с опухолевыми клетками, в которых эндогенно экспрессируется человеческий CLDN6, оценивали по связыванию с опухолевыми клетками линии NEC8 (рак яичка), которое определяли методом проточной цитометрии. По сравнению со специфичными к CLDN6 антителами chimAB 64A, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS вариант c комбинацией легких цепей mAb206-LCC проявлял втрое большую аффинность по отношению к клеткам NEC8. Во всех случаях насыщение мест связывания достигалось при низких концентрациях (фиг. 29).The binding affinity (affinity) of monoclonal hybrid antibodies against
Изучение специфичности связывания моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS с человеческими клетками линии OV90 (рак яичника) методом проточной цитометрии показало, что антитела, специфичные к CLDN6, характеризовались сходными низкими значениями EC50. Вариант c комбинацией легких цепей mAb206-LCC проявлял наибольшую прочность связывания с клетками OV90 (фиг. 30).A flow cytometry study of the binding specificity of monoclonal hybrid antibodies against
В отношении клеток NEC-8 моноклональные гибридные антитела против CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC и mAb206-SUBG обладали активностью, проявляющейся комплемент-зависимой цитотоксичностью (CDC), причем эффект зависел от дозы. А с клетками NEC-8, нокдаунными по CLDN6, ни одно из указанных антител не вызывало неспецифический лизис. Этот результат демонстрирует специфичную к мишени эффекторную функцию антител chimAB 64A, mAb206-LCC и mAb206-SUBG (фиг. 31a).In NEC-8 cells, anti-CLDN6 monoclonal
Активность антител chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS, проявляющаяся CDC в отношении клеток NEC8, зависела от дозы. По сравнению с chimAB 64A варианты с аминокислотными заменами mAb206-SUBG и mAb206-SUBS обладали сходной активностью, проявляющейся CDC в отношении клеток NEC8 (фиг. 31b).CDC activities of
Моноклональные гибридные антитела против CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS обладали зависимой от дозы активностью, проявляющейся антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (ADCC), и вызывали ADCC в отношении опухолевых клеток линий NEC8 и OV90 даже в низких концентрациях (фиг. 32a).Monoclonal hybrid antibodies against
Фиг. 32b демонстрирует активность, проявляющуюся антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (ADCC), моноклональных гибридных антител против CLDN6 chimAB 64A, mAb206-LCC и mAb206-SUBG в отношении клеток NEC8 дикого типа и нокдаунных клеток NEC8. Чтобы показать специфичность антител к мишени, использовали клетки NEC8, стабильно нокдаунные по CLDN6.Fig. 32b demonstrates the antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) activity of anti-CLDN6 monoclonal
В опытах с ксенографтами опухолевых клеток линии NEC8 у мышей воздействие специфичными к CLDN6 антителами mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS на поздних стадиях развития опухолей подавляло опухолевый рост по сравнению с контрольными воздействиями (фиг. 33).In experiments with xenografts of NEC8 tumor cells in mice, exposure to CLDN6-specific antibodies mAb206-LCC, mAb206-SUBG and mAb206-SUBS at late stages of tumor development suppressed tumor growth compared to control exposures (Fig. 33).
Кривые опухолевого роста, представленные на фиг. 34а, показывают, что моноклональные гибридные антитела против CLDN6 mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS способны подавлять опухолевый рост. График выживания (фиг. 34b) демонстрирует увеличение продолжительности жизни мышей, получавших антитела, специфичные к CLDN6.The tumor growth curves presented in Fig. 34a show that monoclonal hybrid antibodies against CLDN6 mAb206-LCC, mAb206-SUBG and mAb206-SUBS are able to suppress tumor growth. The survival graph (Fig. 34b) demonstrates the increase in lifespan of mice treated with CLDN6-specific antibodies.
Картирование эпитопов с высоким разрешением показало, что для взаимодействия cпецифичных к CLDN6 гибридных антител chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS с CLDN6 важны аминокислотные остатки F35, G37 и S39, а также, вероятно, Т33 первого внеклеточного домена CLDN6. Особенности связывания сhimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG и mAb206-SUBS были одинаковыми (фиг. 35).High-resolution mapping of epitopes showed that for the interaction of CLDN6-specific
Для изучения терапевтического эффекта мышиных моноклональных антител против CLDN6 muMAB 64A в отношении метастазирования использовали модель с ксенографтами опухолевых клеток: бестимусным мышам линии Nude-Foxn1nu вводили в хвостовую вену клетки NEC8, а через трое суток эти животные получали специфичные к CLDN6 антитела muMAB 64A. Спустя 8 недель определяли опухолевую нагрузку в ткани легких с помощью полимеразной цепной реакции. Мышиные моноклональные антитела против CLDN6 muMAB 64A по сравнению с контролем (PBS без антител) вызывали отчетливое ингибирование опухолевого роста (фиг. 36).To study the therapeutic effect of mouse monoclonal antibodies against
Иммуногистохимическое окрашивание раковых и нормальных тканей человека с использованием моноклональных антител muMAB 64A, mAb206-LCC и mAb206-SUBG показало, что в противоположность нормальным тканям в срезах опухолей яичников и яичек наблюдалось выраженное равномерное окрашивание. Очень интенсивное окрашивание мембран имело место в злокачественных эпителиальных клетках, тогда как соседние стромальные клетки и незлокачественные эпителиальные клетки не окрашивались (фиг. 37). Эти результаты с очевидностью свидетельствуют, что специфичные к CLDN6 антитела по данному изобретению специфично связываются со злокачественными клетками, полученными от пациентов с опухолями. (Пояснение: число тканей, окрашивающихся антителами/число изученных тканей). Immunohistochemical staining of human cancerous and normal tissues using
--->--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES
<110> Ganymed Pharmaceuticals AG et al.<110> Ganymed Pharmaceuticals AG et al.
<120> Antibodies for treatment of cancer<120> Antibodies for treatment of cancer
<130> 342-64 PCT<130> 342-64 PCT
<150> EP 11 004 004.5<150>
<151> 2011-05-13<151> 2011-05-13
<150> US 61/486,071<150>
<151> 2011-05-13<151> 2011-05-13
<160> 57 <160> 57
<170> PatentIn version 3.5<170> Patent In version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 1369<211> 1369
<212> DNA<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 1<400> 1
cgacactcgg cctaggaatt tcccttatct ccttcgcagt gcagctcctt caacctcgcc 60cgacactcgg cctaggaatt tcccttatct ccttcgcagt gcagctcctt caacctcgcc 60
atggcctctg ccggaatgca gatcctggga gtcgtcctga cactgctggg ctgggtgaat 120atggcctctg ccggaatgca gatcctggga gtcgtcctga cactgctggg ctgggtgaat 120
ggcctggtct cctgtgccct gcccatgtgg aaggtgaccg ctttcatcgg caacagcatc 180ggcctggtct cctgtgccct gcccatgtgg aaggtgaccg ctttcatcgg caacagcatc 180
gtggtggccc aggtggtgtg ggagggcctg tggatgtcct gcgtggtgca gagcaccggc 240gtggtggccc aggtggtgtg ggagggcctg tggatgtcct gcgtggtgca gagcaccggc 240
cagatgcagt gcaaggtgta cgactcactg ctggcgctgc cacaggacct gcaggctgca 300cagatgcagt gcaaggtgta cgactcactg ctggcgctgc cacaggacct gcaggctgca 300
cgtgccctct gtgtcatcgc cctccttgtg gccctgttcg gcttgctggt ctaccttgct 360cgtgccctct gtgtcatcgc cctccttgtg gccctgttcg gcttgctggt ctaccttgct 360
ggggccaagt gtaccacctg tgtggaggag aaggattcca aggcccgcct ggtgctcacc 420ggggccaagt gtaccacctg tgtggaggag aaggattcca aggcccgcct ggtgctcacc 420
tctgggattg tctttgtcat ctcaggggtc ctgacgctaa tccccgtgtg ctggacggcg 480tctgggattg tctttgtcat ctcaggggtc ctgacgctaa tccccgtgtg ctggacggcg 480
catgccatca tccgggactt ctataacccc ctggtggctg aggcccaaaa gcgggagctg 540catgccatca tccgggactt ctataacccc ctggtggctg aggcccaaaa gcgggagctg 540
ggggcctccc tctacttggg ctgggcggcc tcaggccttt tgttgctggg tggggggttg 600ggggcctccc tctacttggg ctgggcggcc tcaggccttt tgttgctggg tggggggttg 600
ctgtgctgca cttgcccctc gggggggtcc cagggcccca gccattacat ggcccgctac 660ctgtgctgca cttgcccctc gggggggtcc cagggcccca gccattacat ggcccgctac 660
tcaacatctg cccctgccat ctctcggggg ccctctgagt accctaccaa gaattacgtc 720tcaacatctg cccctgccat ctctcggggg ccctctgagt accctaccaa gaattacgtc 720
tgacgtggag gggaatgggg gctccgctgg cgctagagcc atccagaagt ggcagtgccc 780tgacgtggag gggaatgggg gctccgctgg cgctagagcc atccagaagt ggcagtgccc 780
aacagctttg ggatgggttc gtaccttttg tttctgcctc ctgctatttt tcttttgact 840aacagctttg ggatgggttc gtaccttttg tttctgcctc ctgctatttt tcttttgact 840
gaggatattt aaaattcatt tgaaaactga gccaaggtgt tgactcagac tctcacttag 900gaggatattt aaaattcatt tgaaaactga gccaaggtgt tgactcagac tctcacttag 900
gctctgctgt ttctcaccct tggatgatgg agccaaagag gggatgcttt gagattctgg 960gctctgctgt ttctcaccct tggatgatgg agccaaagag gggatgcttt gagattctgg 960
atcttgacat gcccatctta gaagccagtc aagctatgga actaatgcgg aggctgcttg 1020atcttgacat gcccatctta gaagccagtc aagctatgga actaatgcgg aggctgcttg 1020
ctgtgctggc tttgcaacaa gacagactgt ccccaagagt tcctgctgct gctgggggct 1080ctgtgctggc tttgcaacaa gacagactgt ccccaagagt tcctgctgct gctgggggct 1080
gggcttccct agatgtcact ggacagctgc cccccatcct actcaggtct ctggagctcc 1140gggcttccct agatgtcact ggacagctgc cccccatcct actcaggtct ctggagctcc 1140
tctcttcacc cctggaaaaa caaatgatct gttaacaaag gactgcccac ctccggaact 1200tctcttcacc cctggaaaaa caaatgatct gttaacaaag gactgcccac ctccggaact 1200
tctgacctct gtttcctccg tcctgataag acgtccaccc cccagggcca ggtcccagct 1260tctgacctct gtttcctccg tcctgataag acgtccaccc cccagggcca ggtcccagct 1260
atgtagaccc ccgcccccac ctccaacact gcacccttct gccctgcccc cctcgtctca 1320atgtagaccc ccgcccccac ctccaacact gcacccttct gccctgcccc cctcgtctca 1320
ccccctttac actcacattt ttatcaaata aagcatgttt tgttagtgc 1369ccccctttac actcacattt ttatcaaata aagcatgttt tgttagtgc 1369
<210> 2<210> 2
<211> 220<211> 220
<212> PRT<212>PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 2<400> 2
Met Ala Ser Ala Gly Met Gln Ile Leu Gly Val Val Leu Thr Leu Leu Met Ala Ser Ala Gly Met Gln Ile Leu Gly Val Val Leu Thr Leu Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val
20 25 30 20 25 30
Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu
35 40 45 35 40 45
Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys
50 55 60 50 55 60
Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Leu Leu Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Leu Leu
85 90 95 85 90 95
Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp
100 105 110 100 105 110
Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser
115 120 125 115 120 125
Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile
130 135 140 130 135 140
Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu
165 170 175 165 170 175
Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly
180 185 190 180 185 190
Pro Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Pro Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser
195 200 205 195 200 205
Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val
210 215 220 210 215 220
<210> 3<210> 3
<211> 805<211> 805
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial<213> Artificial
<220><220>
<223> codon-optimized nucleic acid sequence encoding human claudin 6<223> codon-optimized nucleic acid sequence encoding human claudin 6
<400> 3<400> 3
caagcgcgtc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct gttaattaac taaggtacca 60caagcgcgtc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct gttaattaac taaggtacca 60
agcttgccac catggccagc gccggcatgc agatcctggg agtggtgctg accctgctgg 120agcttgccac catggccagc gccggcatgc agatcctggg agtggtgctg accctgctgg 120
gctgggtgaa cggcctggtg tcctgcgccc tgcccatgtg gaaagtgacc gccttcatcg 180gctgggtgaa cggcctggtg tcctgcgccc tgcccatgtg gaaagtgacc gccttcatcg 180
gcaacagcat cgtggtggcc caggtcgtgt gggagggcct gtggatgagc tgtgtggtgc 240gcaacagcat cgtggtggcc caggtcgtgt gggagggcct gtggatgagc tgtgtggtgc 240
agagcaccgg ccagatgcag tgcaaggtgt acgacagcct gctggccctg cctcaggatc 300agagcaccgg ccagatgcag tgcaaggtgt acgacagcct gctggccctg cctcaggatc 300
tgcaggccgc cagagccctg tgtgtgatcg ccctgctggt cgccctgttc ggcctgctgg 360tgcaggccgc cagagccctg tgtgtgatcg ccctgctggt cgccctgttc ggcctgctgg 360
tgtacctcgc tggcgccaag tgcaccacct gtgtggagga aaaggacagc aaggcccggc 420tgtacctcgc tggcgccaag tgcaccacct gtgtggagga aaaggacagc aaggcccggc 420
tggtcctgac aagcggcatc gtgttcgtga tcagcggcgt gctgacactg atccccgtgt 480tggtcctgac aagcggcatc gtgttcgtga tcagcggcgt gctgacactg atccccgtgt 480
gctggaccgc ccacgccatc atccgggact tctacaaccc tctggtggcc gaggcccaga 540gctggaccgc ccacgccatc atccgggact tctacaaccc tctggtggcc gaggcccaga 540
agagagagct gggcgccagc ctgtatctgg gatgggccgc ctcaggactg ctgctgctgg 600agagagagct gggcgccagc ctgtatctgg gatgggccgc ctcaggactg ctgctgctgg 600
gcggaggcct gctgtgctgt acatgtccta gcggcggctc ccagggccct agccactaca 660gcggaggcct gctgtgctgt acatgtccta gcggcggctc ccagggccct agccactaca 660
tggcccggta cagcaccagc gcccctgcca tcagcagagg ccccagcgag taccccacca 720tggcccggta cagcaccagc gcccctgcca tcagcagagg ccccagcgag taccccacca 720
agaactacgt gtgataggaa ttcgagctct tatggcgcgc ccaattcgcc ctatagtgag 780agaactacgt gtgataggaa ttcgagctct tatggcgcgc ccaattcgcc ctatagtgag 780
tcgtattacg tcgcgctcac tggcc 805tcgtattacg tcgcgctcac tggcc 805
<210> 4<210> 4
<211> 165<211> 165
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial<213> Artificial
<220><220>
<223> codon-optimized nucleic acid sequence encoding the predicted <223> codon-optimized nucleic acid sequence encoding the predicted
extracellular loop 2 (EC2) of human claudin 6extracellular loop 2 (EC2) of human claudin 6
<400> 4<400> 4
ggcgcgccaa ggtaccaagc ttgccaccat ggaaaccgac accctgctgc tgtgggtgct 60ggcgcgccaa ggtaccaagc ttgccaccat ggaaaccgac accctgctgc tgtgggtgct 60
gctcctgtgg gtcccaggct ctacaggcga cgccgcccag cccagagact tctacaaccc 120gctcctgtgg gtcccaggct ctacaggcga cgccgcccag cccagagact tctacaaccc 120
cctggtggcc gaggcccaga agctcgagtc tagagggtta attaa 165cctggtggcc gaggcccaga agctcgagtc tagagggtta attaa 165
<210> 5<210> 5
<211> 38<211> 38
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial<213> Artificial
<220><220>
<223> predicted 2nd extracellular loop of human claudin 6 containing an<223> predicted 2nd extracellular loop of human claudin 6 containing an
Ig kappa leader sequenceIg kappa leader sequence
<220><220>
<221> SIGNAL<221> SIGNAL
<222> (1)..(21)<222> (1)..(21)
<223> Ig kappa leader sequence<223> Ig kappa leader sequence
<220><220>
<221> DOMAIN<221> DOMAIN
<222> (26)..(38)<222> (26)..(38)
<223> predicted 2nd extracellular loop (EC2) of human claudin 6<223> predicted 2nd extracellular loop (EC2) of human claudin 6
<400> 5<400> 5
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu
20 25 30 20 25 30
Val Ala Glu Ala Gln Lys Val Ala Glu Ala Gln Lys
35 35
<210> 6<210> 6
<211> 13<211> 13
<212> PRT<212>PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 6<400> 6
Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys
1 5 10 1 5 10
<210> 7<210> 7
<211> 53<211> 53
<212> PRT<212>PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 7<400> 7
Pro Met Trp Lys Val Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Pro Met Trp Lys Val Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Gln Val Val Trp Glu Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gln Val Val Trp Glu Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr
20 25 30 20 25 30
Gly Gln Met Gln Cys Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Gly Gln Met Gln Cys Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln
35 40 45 35 40 45
Asp Leu Gln Ala Ala Asp Leu Gln Ala Ala
50 50
<210> 8<210> 8
<211> 220<211> 220
<212> PRT<212>PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<220><220>
<221> VARIANT<221> VARIANT
<222> (143)..(143)<222> (143)..(143)
<223> human claudin 6 I143V polymorphism<223> human claudin 6 I143V polymorphism
<400> 8<400> 8
Met Ala Ser Ala Gly Met Gln Ile Leu Gly Val Val Leu Thr Leu Leu Met Ala Ser Ala Gly Met Gln Ile Leu Gly Val Val Leu Thr Leu Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val
20 25 30 20 25 30
Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu
35 40 45 35 40 45
Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys
50 55 60 50 55 60
Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Leu Leu Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Leu Leu
85 90 95 85 90 95
Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp
100 105 110 100 105 110
Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser
115 120 125 115 120 125
Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Val Ile Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Val Ile
130 135 140 130 135 140
Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu
165 170 175 165 170 175
Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Ser Gly Gly Ser Gln Gly
180 185 190 180 185 190
Pro Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser Pro Ser His Tyr Met Ala Arg Tyr Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ile Ser
195 200 205 195 200 205
Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Thr Lys Asn Tyr Val
210 215 220 210 215 220
<210> 9<210> 9
<211> 217<211> 217
<212> PRT<212>PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 9<400> 9
Met Ala Ser Thr Gly Leu Glu Leu Leu Gly Met Thr Leu Ala Val Leu Met Ala Ser Thr Gly Leu Glu Leu Leu Gly Met Thr Leu Ala Val Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Trp Leu Gly Thr Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Leu Trp Lys Val Gly Trp Leu Gly Thr Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Leu Trp Lys Val
20 25 30 20 25 30
Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu
35 40 45 35 40 45
Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys
50 55 60 50 55 60
Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Leu Leu Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Leu Leu
85 90 95 85 90 95
Val Ala Ile Thr Gly Ala Gln Cys Thr Thr Cys Val Glu Asp Glu Gly Val Ala Ile Thr Gly Ala Gln Cys Thr Thr Cys Val Glu Asp Glu Gly
100 105 110 100 105 110
Ala Lys Ala Arg Ile Val Leu Thr Ala Gly Val Ile Leu Leu Leu Ala Ala Lys Ala Arg Ile Val Leu Thr Ala Gly Val Ile Leu Leu Leu Ala
115 120 125 115 120 125
Gly Ile Leu Val Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile Gly Ile Leu Val Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile
130 135 140 130 135 140
Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Leu Lys Arg Glu Leu Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Leu Lys Arg Glu Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Met Leu Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Met Leu
165 170 175 165 170 175
Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Pro Pro Gln Val Glu Arg Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Pro Pro Gln Val Glu Arg
180 185 190 180 185 190
Pro Arg Gly Pro Arg Leu Gly Tyr Ser Ile Pro Ser Arg Ser Gly Ala Pro Arg Gly Pro Arg Leu Gly Tyr Ser Ile Pro Ser Arg Ser Gly Ala
195 200 205 195 200 205
Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val
210 215 210 215
<210> 10<210> 10
<211> 209<211> 209
<212> PRT<212>PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 10<400> 10
Met Ala Ser Met Gly Leu Gln Val Met Gly Ile Ala Leu Ala Val Leu Met Ala Ser Met Gly Leu Gln Val Met Gly Ile Ala Leu Ala Val Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Trp Leu Ala Val Met Leu Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Gly Trp Leu Ala Val Met Leu Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val
20 25 30 20 25 30
Thr Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Val Thr Ser Gln Thr Ile Trp Glu Thr Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Val Thr Ser Gln Thr Ile Trp Glu
35 40 45 35 40 45
Gly Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Gly Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys
50 55 60 50 55 60
Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Arg Ala Leu Val Ile Ile Ser Ile Ile Val Ala Ala Leu Gly Val Leu Arg Ala Leu Val Ile Ile Ser Ile Ile Val Ala Ala Leu Gly Val Leu
85 90 95 85 90 95
Leu Ser Val Val Gly Gly Lys Cys Thr Asn Cys Leu Glu Asp Glu Ser Leu Ser Val Val Gly Gly Lys Cys Thr Asn Cys Leu Glu Asp Glu Ser
100 105 110 100 105 110
Ala Lys Ala Lys Thr Met Ile Val Ala Gly Val Val Phe Leu Leu Ala Ala Lys Ala Lys Thr Met Ile Val Ala Gly Val Val Phe Leu Leu Ala
115 120 125 115 120 125
Gly Leu Met Val Ile Val Pro Val Ser Trp Thr Ala His Asn Ile Ile Gly Leu Met Val Ile Val Pro Val Ser Trp Thr Ala His Asn Ile Ile
130 135 140 130 135 140
Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Ser Gly Gln Lys Arg Glu Met Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Ser Gly Gln Lys Arg Glu Met
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Ala Ser Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu
165 170 175 165 170 175
Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Asn Cys Pro Pro Arg Thr Asp Lys Pro Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Asn Cys Pro Pro Arg Thr Asp Lys Pro
180 185 190 180 185 190
Tyr Ser Ala Lys Tyr Ser Ala Ala Arg Ser Ala Ala Ala Ser Asn Tyr Tyr Ser Ala Lys Tyr Ser Ala Ala Arg Ser Ala Ala Ala Ser Asn Tyr
195 200 205 195 200 205
Val Val
<210> 11<210> 11
<211> 220<211> 220
<212> PRT<212>PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 11<400> 11
Met Ser Met Gly Leu Glu Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Val Leu Gly Met Ser Met Gly Leu Glu Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Val Leu Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Trp Leu Gly Thr Ile Val Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Ser Trp Leu Gly Thr Ile Val Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Ser
20 25 30 20 25 30
Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Gln Asn Ile Trp Glu Gly Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Gln Asn Ile Trp Glu Gly
35 40 45 35 40 45
Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys
50 55 60 50 55 60
Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Ala Leu Ile Val Val Ala Ile Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val Ala Leu Ile Val Val Ala Ile Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val
85 90 95 85 90 95
Ala Leu Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val Gln Asp Asp Thr Ala Ala Leu Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val Gln Asp Asp Thr Ala
100 105 110 100 105 110
Lys Ala Lys Ile Thr Ile Val Ala Gly Val Leu Phe Leu Leu Ala Ala Lys Ala Lys Ile Thr Ile Val Ala Gly Val Leu Phe Leu Leu Ala Ala
115 120 125 115 120 125
Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Ser Trp Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Ser Trp Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg
130 135 140 130 135 140
Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu Met Gly Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu Met Gly
145 150 155 160 145 150 155 160
Ala Gly Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Gln Leu Leu Gly Ala Gly Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Gln Leu Leu Gly
165 170 175 165 170 175
Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg Glu Lys Lys Tyr Thr Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg Glu Lys Lys Tyr Thr
180 185 190 180 185 190
Ala Thr Lys Val Val Tyr Ser Ala Pro Arg Ser Thr Gly Pro Gly Ala Ala Thr Lys Val Val Tyr Ser Ala Pro Arg Ser Thr Gly Pro Gly Ala
195 200 205 195 200 205
Ser Leu Gly Thr Gly Tyr Asp Arg Lys Asp Tyr Val Ser Leu Gly Thr Gly Tyr Asp Arg Lys Asp Tyr Val
210 215 220 210 215 220
<210> 12<210> 12
<211> 159<211> 159
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial<213> Artificial
<220><220>
<223> codon-optimized nucleic acid sequence encoding the predicted <223> codon-optimized nucleic acid sequence encoding the predicted
extracellular loop 1 (EC1) of human claudin 6extracellular loop 1 (EC1) of human claudin 6
<400> 12<400> 12
cccatgtgga aagtgaccgc cttcatcggc aacagcatcg tggtggccca ggtggtctgg 60cccatgtgga aagtgaccgc cttcatcggc aacagcatcg tggtggccca ggtggtctgg 60
gagggcctgt ggatgagctg cgtggtgcag agcaccggcc agatgcagtg caaggtgtac 120gagggcctgt ggatgagctg cgtggtgcag agcaccggcc agatgcagtg caaggtgtac 120
gacagcctgc tggccctgcc tcaggatctg caggctgct 159gacagcctgc tggccctgcc tcaggatctg caggctgct 159
<210> 13<210> 13
<211> 106<211> 106
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial<213> Artificial
<220><220>
<223> predicted 1st extracellular loop of human claudin 6 containing an<223> predicted 1st extracellular loop of human claudin 6 containing an
Ig kappa leader sequenceIg kappa leader sequence
<220><220>
<221> Signal<221> Signal
<222> (1)..(21)<222> (1)..(21)
<223> Ig kappa leader sequence<223> Ig kappa leader sequence
<220><220>
<221> Domain<221> Domain
<222> (26)..(78)<222> (26)..(78)
<223> predicted 1st extracellular loop (EC1) of human claudin 6<223> predicted 1st extracellular loop (EC1) of human claudin 6
<400> 13<400> 13
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Pro Met Trp Lys Val Thr Ala Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Pro Met Trp Lys Val Thr Ala
20 25 30 20 25 30
Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu Gly Leu Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu Gly Leu
35 40 45 35 40 45
Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys Val Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys Val
50 55 60 50 55 60
Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Leu Glu Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Leu Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Arg Gly Pro Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Arg Gly Pro Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn
85 90 95 85 90 95
Met His Thr Gly His His His His His His Met His Thr Gly His His His His His
100 105 100 105
<210> 14<210> 14
<211> 13<211> 13
<212> PRT<212>PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 14<400> 14
Pro Met Trp Lys Val Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Pro Met Trp Lys Val Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile
1 5 10 1 5 10
<210> 15<210> 15
<211> 15<211> 15
<212> PRT<212>PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 15<400> 15
Met Trp Lys Val Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Met Trp Lys Val Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
<210> 16<210> 16
<211> 20<211> 20
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial<213> Artificial
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<400> 16<400> 16
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 17<210> 17
<211> 43<211> 43
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<400> 17<400> 17
gagaaagctt gccgccacca tgggatggag ctggatcttt ctc 43gagaaagctt gccgccacca tgggatggag ctggatcttt ctc 43
<210> 18<210> 18
<211> 43<211> 43
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<400> 18<400> 18
gagagggccc ttggtggagg ctgaagagac tgtgagagtg gtg 43gagagggccc ttggtggagg ctgaagagac tgtgagagtg gtg 43
<210> 19<210> 19
<211> 43<211> 43
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<400> 19<400> 19
gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtg 43gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtg 43
<210> 20<210> 20
<211> 43<211> 43
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<400> 20<400> 20
gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtg 43gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtg 43
<210> 21<210> 21
<211> 46<211> 46
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<400> 21<400> 21
gagaaagctt gccgccacca tgcattttca agtgcagatt ttcagc 46gagaaagctt gccgccacca tgcattttca agtgcagatt ttcagc 46
<210> 22<210> 22
<211> 33<211> 33
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<400> 22<400> 22
cacacgtacg tttgatttcc agcttggtgc ctc 33cacacgtacg tttgatttcc agcttggtgc ctc 33
<210> 23<210> 23
<211> 33<211> 33
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<400> 23<400> 23
cacacgtacg tttgatttcc agcttggtgc ctc 33cacacgtacg tttgatttcc agcttggtgc ctc 33
<210> 24<210> 24
<211> 993<211> 993
<212> DNA<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 24<400> 24
gcctccacca agggcccaag cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 60gcctccacca agggcccaag cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 60
ggcacagccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgagc 120ggcacagccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgagc 120
tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 180tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 180
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc 240ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agtggagccc 300tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agtggagccc 300
aagagctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgcccag ccccagagct gctgggcgga 360aagagctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgcccag ccccagagct gctgggcgga 360
cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag caggaccccc 420cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag caggaccccc 420
gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc cagaggtgaa gttcaactgg 480gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc cagaggtgaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga gcagtacaac 540tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga gcagtacaac 540
agcacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 600agcacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 600
gaatacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgccagccc ccatcgaaaa gaccatcagc 660gaatacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgccagccc ccatcgaaaa gaccatcagc 660
aaggccaagg gccagccacg ggagccccag gtgtacaccc tgccccccag ccgggaggag 720aaggccaagg gccagccacg ggagccccag gtgtacaccc tgccccccag ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 780atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac ccccccagtg 840gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac ccccccagtg 840
ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gtccaggtgg 900ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gtccaggtgg 900
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960
cagaagtccc tgagcctgag ccccggcaag tag 993cagaagtccc tgagcctgag ccccggcaag tag 993
<210> 25<210> 25
<211> 330<211> 330
<212> PRT<212>PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 25<400> 25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95 85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175 165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190 180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220 210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240 225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255 245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320 305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330 325 330
<210> 26<210> 26
<211> 324<211> 324
<212> DNA<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 26<400> 26
cgtacggtgg ccgctcccag cgtgttcatc ttccccccca gcgacgagca gctgaagtcc 60cgtacggtgg ccgctcccag cgtgttcatc ttccccccca gcgacgagca gctgaagtcc 60
ggcaccgcca gcgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgggaggc caaggtgcag 120ggcaccgcca gcgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgggaggc caaggtgcag 120
tggaaggtgg acaacgccct gcagagcggc aacagccagg agagcgtcac cgagcaggac 180tggaaggtgg acaacgccct gcagagcggc aacagccagg agagcgtcac cgagcaggac 180
agcaaggact ccacctacag cctgagcagc accctgaccc tgagcaaggc cgactacgag 240agcaaggact ccacctacag cctgagcagc accctgaccc tgagcaaggc cgactacgag 240
aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtgacc caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag 300aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtgacc caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag 300
agcttcaaca ggggcgagtg ctag 324agcttcaaca ggggcgagtg ctag 324
<210> 27<210> 27
<211> 107<211> 107
<212> PRT<212>PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 27<400> 27
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15 1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30 20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95 85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105 100 105
<210> 28<210> 28
<211> 32<211> 32
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<220><220>
<221> misc_feature<221> misc_feature
<222> (31)..(32)<222> (31)..(32)
<223> any nucleotide<223> any nucleotide
<400> 28<400> 28
tttttttttt tttttttttt tttttttttt nn 32tttttttttt tttttttttt tttttttttt nn 32
<210> 29<210> 29
<211> 30<211> 30
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<400> 29<400> 29
aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg 30aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg 30
<210> 30<210> 30
<211> 26<211> 26
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<400> 30<400> 30
ctgctcactg gatggtggga agatgg 26ctgctcactg gatggtggga agatgg 26
<210> 31<210> 31
<211> 25<211> 25
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<400> 31<400> 31
acaggggcca gtggatagac cgatg 25acaggggcca gtggatagac cgatg 25
<210> 32<210> 32
<211> 45<211> 45
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<400> 32<400> 32
gtaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45gtaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45
<210> 33<210> 33
<211> 22<211> 22
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<400> 33<400> 33
gtaatacgac tcactatagg gc 22gtaatacgac tcactatagg gc 22
<210> 34<210> 34
<211> 117<211> 117
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VH sequence<223> Antibody VH sequence
<400> 34<400> 34
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110 100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser Leu Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 35<210> 35
<211> 107<211> 107
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VL sequence<223> Antibody VL sequence
<400> 35<400> 35
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30 20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Val Tyr His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Val Tyr
35 40 45 35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Gly Gly Ser Ser Thr Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Gly Gly Ser
50 55 60 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ile Tyr Pro Pro Trp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ile Tyr Pro Pro Trp
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 36<210> 36
<211> 117<211> 117
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VH sequence<223> Antibody VH sequence
<400> 36<400> 36
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Phe Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ala Arg Asp Tyr Gly Phe Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110 100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser Leu Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 37<210> 37
<211> 107<211> 107
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VL sequence<223> Antibody VL sequence
<400> 37<400> 37
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30 20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Cys Ile Tyr His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Cys Ile Tyr
35 40 45 35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg
50 55 60 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 38<210> 38
<211> 117<211> 117
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VH sequence<223> Antibody VH sequence
<400> 38<400> 38
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ile Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ile Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asp Phe Gly Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ala Arg Asp Phe Gly Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110 100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser Leu Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 39<210> 39
<211> 107<211> 107
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VL sequence<223> Antibody VL sequence
<400> 39<400> 39
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30 20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45 35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Pro Trp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Pro Trp
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 40<210> 40
<211> 117<211> 117
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VH sequence<223> Antibody VH sequence
<400> 40<400> 40
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Arg Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Arg Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30 20 25 30
Thr Leu Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile Thr Leu Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110 100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser Leu Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 41<210> 41
<211> 107<211> 107
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VL sequence<223> Antibody VL sequence
<400> 41<400> 41
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30 20 25 30
His Trp Phe Gln Leu Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr His Trp Phe Gln Leu Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45 35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg
50 55 60 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Asn Tyr Pro Pro Trp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Asn Tyr Pro Pro Trp
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 42<210> 42
<211> 5<211> 5
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VH CDR3 sequence<223> Antibody VH CDR3 sequence
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more <223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more
preferably Phe or Tyr, most preferably Tyrpreferably Phe or Tyr, most preferably Tyr
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)<222> (3)..(3)
<223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more <223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more
preferably Phe or Tyr, most preferably Tyrpreferably Phe or Tyr, most preferably Tyr
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)<222> (5)..(5)
<223> Any amino acid, preferably Leu or Phe, more preferably Leu<223> Any amino acid, preferably Leu or Phe, more preferably Leu
<400> 42<400> 42
Xaa Gly Xaa Val Xaa Xaa Gly Xaa Val Xaa
1 5 15
<210> 43<210> 43
<211> 6<211> 6
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VH CDR3 sequence<223> Antibody VH CDR3 sequence
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)<222> (2)..(2)
<223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more <223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more
preferably Phe or Tyr, most preferably Tyrpreferably Phe or Tyr, most preferably Tyr
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)<222> (4)..(4)
<223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more <223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more
preferably Phe or Tyr, most preferably Tyrpreferably Phe or Tyr, most preferably Tyr
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)<222> (6)..(6)
<223> Any amino acid, preferably Leu or Phe, more preferably Leu<223> Any amino acid, preferably Leu or Phe, more preferably Leu
<400> 43<400> 43
Asp Xaa Gly Xaa Val Xaa Asp Xaa Gly Xaa Val Xaa
1 5 15
<210> 44<210> 44
<211> 6<211> 6
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VH CDR3 sequence<223> Antibody VH CDR3 sequence
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)<222> (1)..(1)
<223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more <223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more
preferably Phe or Tyr, most preferably Tyrpreferably Phe or Tyr, most preferably Tyr
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)<222> (3)..(3)
<223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more <223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more
preferably Phe or Tyr, most preferably Tyrpreferably Phe or Tyr, most preferably Tyr
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)<222> (5)..(5)
<223> Any amino acid, preferably Leu or Phe, more preferably Leu<223> Any amino acid, preferably Leu or Phe, more preferably Leu
<400> 44<400> 44
Xaa Gly Xaa Val Xaa Asp Xaa Gly Xaa Val Xaa Asp
1 5 15
<210> 45<210> 45
<211> 7<211> 7
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VH CDR3 sequence<223> Antibody VH CDR3 sequence
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)<222> (2)..(2)
<223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more <223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more
preferably Phe or Tyr, most preferably Tyrpreferably Phe or Tyr, most preferably Tyr
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)<222> (4)..(4)
<223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more <223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more
preferably Phe or Tyr, most preferably Tyrpreferably Phe or Tyr, most preferably Tyr
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)<222> (6)..(6)
<223> Any amino acid, preferably Leu or Phe, more preferably Leu<223> Any amino acid, preferably Leu or Phe, more preferably Leu
<400> 45<400> 45
Asp Xaa Gly Xaa Val Xaa Asp Asp Xaa Gly Xaa Val Xaa Asp
1 5 15
<210> 46<210> 46
<211> 10<211> 10
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VH CDR3 sequence<223> Antibody VH CDR3 sequence
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)<222> (4)..(4)
<223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more <223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more
preferably Phe or Tyr, most preferably Tyrpreferably Phe or Tyr, most preferably Tyr
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)<222> (6)..(6)
<223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more <223> Any amino acid, preferably an aromatic amino acid, more
preferably Phe or Tyr, most preferably Tyrpreferably Phe or Tyr, most preferably Tyr
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)<222> (8)..(8)
<223> Any amino acid, preferably Leu or Phe, more preferably Leu<223> Any amino acid, preferably Leu or Phe, more preferably Leu
<400> 46<400> 46
Ala Arg Asp Xaa Gly Xaa Val Xaa Asp Tyr Ala Arg Asp Xaa Gly Xaa Val Xaa Asp Tyr
1 5 10 1 5 10
<210> 47<210> 47
<211> 8<211> 8
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VH CDR1 sequence<223> Antibody VH CDR1 sequence
<400> 47<400> 47
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr
1 5 15
<210> 48<210> 48
<211> 8<211> 8
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VH CDR2 sequence<223> Antibody VH CDR2 sequence
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)<222> (8)..(8)
<223> Any amino acid, preferably Thr, Ser or Ile, most preferably Thr<223> Any amino acid, preferably Thr, Ser or Ile, most preferably Thr
<400> 48<400> 48
Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Xaa Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Xaa
1 5 15
<210> 49<210> 49
<211> 5<211> 5
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VL CDR3 sequence<223> Antibody VL CDR3 sequence
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)<222> (2)..(2)
<223> Any amino acid, preferably Ser or Asn, most preferably Ser<223> Any amino acid, preferably Ser or Asn, most preferably Ser
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)<222> (3)..(3)
<223> Any amino acid, preferably Tyr, Ser, Ile, Asn or Thr, more <223> Any amino acid, preferably Tyr, Ser, Ile, Asn or Thr, more
preferably Tyr, Ser, or Asn, most preferably Asnpreferably Tyr, Ser, or Asn, most preferably Asn
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)<222> (4)..(4)
<223> Any amino acid, preferably Ser or Tyr, more preferably Tyr<223> Any amino acid, preferably Ser or Tyr, more preferably Tyr
<400> 49<400> 49
Arg Xaa Xaa Xaa Pro Arg Xaa Xaa Xaa Pro
1 5 15
<210> 50<210> 50
<211> 7<211> 7
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VL CDR3 sequence<223> Antibody VL CDR3 sequence
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)<222> (3)..(3)
<223> Any amino acid, preferably Ser or Asn, most preferably Ser<223> Any amino acid, preferably Ser or Asn, most preferably Ser
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)<222> (4)..(4)
<223> Any amino acid, preferably Tyr, Ser, Ile, Asn or Thr, more <223> Any amino acid, preferably Tyr, Ser, Ile, Asn or Thr, more
preferably Tyr, Ser, or Asn, most preferably Asnpreferably Tyr, Ser, or Asn, most preferably Asn
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)<222> (5)..(5)
<223> Any amino acid, preferably Ser or Tyr, more preferably Tyr<223> Any amino acid, preferably Ser or Tyr, more preferably Tyr
<400> 50<400> 50
Gln Arg Xaa Xaa Xaa Pro Pro Gln Arg Xaa Xaa Xaa Pro Pro
1 5 15
<210> 51<210> 51
<211> 10<211> 10
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VL CDR3 sequence<223> Antibody VL CDR3 sequence
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)<222> (4)..(4)
<223> Any amino acid, preferably Ser or Asn, most preferably Ser<223> Any amino acid, preferably Ser or Asn, most preferably Ser
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)<222> (5)..(5)
<223> Any amino acid, preferably Tyr, Ser, Ile, Asn or Thr, more <223> Any amino acid, preferably Tyr, Ser, Ile, Asn or Thr, more
preferably Tyr, Ser, or Asn, most preferably Asnpreferably Tyr, Ser, or Asn, most preferably Asn
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)<222> (6)..(6)
<223> Any amino acid, preferably Ser or Tyr, more preferably Tyr<223> Any amino acid, preferably Ser or Tyr, more preferably Tyr
<400> 51<400> 51
Gln Gln Arg Xaa Xaa Xaa Pro Pro Trp Thr Gln Gln Arg Xaa Xaa Xaa Pro Pro Trp Thr
1 5 10 1 5 10
<210> 52<210> 52
<211> 5<211> 5
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VL CDR1 sequence<223> Antibody VL CDR1 sequence
<220><220>
<221> MISC_FEATURE<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)<222> (4)..(4)
<223> Any amino acid, preferably Ser or Asn, most preferably Ser<223> Any amino acid, preferably Ser or Asn, most preferably Ser
<400> 52<400> 52
Ser Ser Val Xaa Tyr Ser Ser Val Xaa Tyr
1 5 15
<210> 53<210> 53
<211> 3<211> 3
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VL CDR2 sequence<223> Antibody VL CDR2 sequence
<400> 53<400> 53
Ser Thr Ser Ser Thr Ser
1 1
<210> 54<210> 54
<211> 107<211> 107
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VL Sequence<223> Antibody VL Sequence
<400> 54<400> 54
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30 20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Gly Ile Tyr His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Gly Ile Tyr
35 40 45 35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg
50 55 60 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 55<210> 55
<211> 107<211> 107
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Antibody VL Sequence<223> Antibody VL Sequence
<400> 55<400> 55
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30 20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Ser Ile Tyr His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Ser Ile Tyr
35 40 45 35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg
50 55 60 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 56<210> 56
<211> 25<211> 25
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<400> 56<400> 56
gggataattt cagctgacta aacag 25gggataattt cagctgacta aacag 25
<210> 57<210> 57
<211> 25<211> 25
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Oligonucleotide<223> Oligonucleotide
<400> 57<400> 57
ttccgtttag ttaggtgcag ttatc 25ttccgtttag ttaggtgcag ttatc 25
<---<---
Claims (41)
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161486071P | 2011-05-13 | 2011-05-13 | |
US61/486,071 | 2011-05-13 | ||
EP11004004 | 2011-05-13 | ||
EP11004004.5 | 2011-05-13 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013155455A Division RU2676731C2 (en) | 2011-05-13 | 2012-04-20 | Antibodies for treatment of cancer expressing claudin 6 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2018145274A RU2018145274A (en) | 2019-01-24 |
RU2816850C2 true RU2816850C2 (en) | 2024-04-05 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2008125324A (en) * | 2005-11-24 | 2009-12-27 | Ганимед Фармасьютикалз Аг (De) | MONOCLONAL ANTIBODIES TO CLAUDIN-18 FOR CANCER TREATMENT |
WO2010094499A1 (en) * | 2009-02-20 | 2010-08-26 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer |
EP2241578A1 (en) * | 2008-01-11 | 2010-10-20 | The University of Tokyo | Anti-cldn6 antibody |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2008125324A (en) * | 2005-11-24 | 2009-12-27 | Ганимед Фармасьютикалз Аг (De) | MONOCLONAL ANTIBODIES TO CLAUDIN-18 FOR CANCER TREATMENT |
EP2241578A1 (en) * | 2008-01-11 | 2010-10-20 | The University of Tokyo | Anti-cldn6 antibody |
WO2010094499A1 (en) * | 2009-02-20 | 2010-08-26 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11859008B2 (en) | Antibodies for treatment of cancer expressing claudin 6 | |
JP6502992B2 (en) | An antibody specific for claudin 6 (CLDN6) | |
RU2816850C2 (en) | Antibodies for treating cancer, in which claudin 6 is expressed | |
JP6748282B2 (en) | Antibodies for the treatment of cancer |