RU2816314C1

RU2816314C1 - Types of combination therapy for treating cancer

Info

Publication number: RU2816314C1
Application number: RU2022124022A
Authority: RU
Inventors: Ифань Чжай; Дацзюнь Ян; Гуанфэн Ван; Мяочжэнь ЦЮ; Фань ЛО
Original assignee: Гуанчжоу Хэлсквест Фарма Ко., Лтд.; Ессентейдж Фарма (Сучжоу) Ко., Лтд.; Ессентейдж Фарма Груп Корп Лимитед
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2021-11-18
Publication date: 2024-03-28

Abstract

FIELD: medicine; pharmaceutics.

SUBSTANCE: group of inventions relates to agents for combined treatment of patients with cancer. Disclosed is a method of treating cancer by administering an effective amount of HQP-1351, where HQP-1351 has the following structure:

or a pharmaceutically acceptable salt thereof and asciminib. Also disclosed are a method of inhibiting mutants BCR-ABL, a method of treating non-small cell lung cancer.

EFFECT: group of inventions provides effective methods of therapy and means of treating cancer.

20 cl, 16 dwg, 6 tbl, 3 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES

[0001] Настоящее изобретение относится к одному или нескольким средствам комбинированного лечения пациентов с раком с помощью соединения формулы (I), описанного в данном документе, и аллостерического ингибитора или молекулы, являющейся иммунной контрольной точкой.[0001] The present invention provides one or more combination treatments for patients with cancer using a compound of formula (I) described herein and an allosteric inhibitor or immune checkpoint molecule.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION

[0002] Хронический миелоидный лейкоз (CML) представляет собой редкое гематологическое злокачественное новообразование с ежегодным коэффициентом частоты заболеваний, составляющим примерно 1,9 случая/100000. Ингибиторы тирозинкиназы BCR-ABL (TKI) значительно улучшили клиническое ведение CML. Однако, несмотря на клинические преимущества, обеспечиваемые TKI BCR-ABL первого поколения иматинибом (Gleevec^®) и несколькими TKI второго поколения, у многих пациентов развивается резистентность к лекарственным средствам. Такая приобретенная резистентность к TKI является серьезной проблемой при лечении CML. Мутации в киназе BCR-ABL представляют ключевой механизм приобретенной резистентности к лекарственным средствам; при этом T315I, наиболее распространенная мутация резистентности к лекарственным средствам, встречается у приблизительно 25% пациентов с CML, резистентной к лекарственным средствам. Пациенты с мутацией T315I резистентны к ингибиторам BCR-ABL как первого, так и второго поколения. Соответственно, существует постоянная потребность в новых видах терапии и средствах лечения, которые являются более эффективными. Способы по настоящему изобретению предоставляют пациентам с раком новые возможности.[0002] Chronic myeloid leukemia (CML) is a rare hematologic malignancy with an annual incidence rate of approximately 1.9 cases/100,000. BCR-ABL tyrosine kinase inhibitors (TKIs) have significantly improved the clinical management of CML. However, despite the clinical benefits provided by the first-generation BCR-ABL TKI imatinib (Gleevec ^® ) and several second-generation TKIs, many patients develop drug resistance. This acquired TKI resistance is a major problem in the treatment of CML. Mutations in the BCR-ABL kinase represent a key mechanism of acquired drug resistance; however, T315I, the most common drug resistance mutation, occurs in approximately 25% of patients with drug-resistant CML. Patients with the T315I mutation are resistant to both first- and second-generation BCR-ABL inhibitors. Accordingly, there is a constant need for new therapies and treatments that are more effective. The methods of the present invention provide new options for patients with cancer.

[0003] HQP-1351 представляет собой новый перорально активный мощный ингибитор BCR-ABL третьего поколения, предназначенный для эффективного нацеливания на мутантные формы BCR-ABL, включая T315I, и он разрабатывается для лечения пациентов с CML, резистентным к TKI первого и второго поколения.[0003] HQP-1351 is a novel, orally active, third-generation potent BCR-ABL inhibitor designed to effectively target BCR-ABL mutants, including T315I, and is being developed for the treatment of patients with CML resistant to first- and second-generation TKIs.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

[0004] В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ лечения рака, включающий совместное введение субъекту, нуждающемуся в этом:[0004] In one aspect of the present invention, there is provided a method of treating cancer, comprising co-administering to a subject in need thereof:

a) соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли иa) a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and

b) аллостерического ингибитора;b) an allosteric inhibitor;

где формула (I) имеет следующую структуру,where formula (I) has the following structure,

(I),(I),

гдеWhere

R₁ представляет собой водород, C_1-4алкил, C_3-6циклоалкил, C_1-4алкилокси или фенил; иR ₁ represents hydrogen, C _1-4 alkyl, C _3-6 cycloalkyl, C _1-4 alkyloxy or phenyl; And

R₂ представляет собой водород, C_1-4алкил, C_3-6циклоалкил или галоген.R ₂ represents hydrogen, C _1-4 alkyl, C _3-6 cycloalkyl or halogen.

[0005] В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ лечения рака, включающий совместное введение субъекту, нуждающемуся в этом:[0005] In another aspect of the present invention, there is provided a method of treating cancer, comprising co-administering to a subject in need thereof:

b) молекулы, являющейся иммунной контрольной точкой.b) an immune checkpoint molecule.

[0006] В одном варианте осуществления соединение формулы (I) представляет собой HQP-1351 со следующей структурой:[0006] In one embodiment, the compound of formula (I) is HQP-1351 with the following structure:

HQP-1351.HQP-1351.

[0007] В одном варианте осуществления аллостерический ингибитор представляет собой асциминиб.[0007] In one embodiment, the allosteric inhibitor is asciminib.

[0008] В одном варианте осуществления молекула, являющаяся иммунной контрольной точкой, представляет собой PD-1 или PD-L1.[0008] In one embodiment, the immune checkpoint molecule is PD-1 or PD-L1.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHIC MATERIALS

[0009] На фиг. 1А и 1В проиллюстрированы результаты исследования действия HQP-1351, понатиниба + ABL001 в клетках BaF3 (Bcr-Abl, T315I/F317L) с использованием анализов с WST.[0009] In FIG. 1A and 1B illustrate the results of a study of the effects of HQP-1351, ponatinib + ABL001 in BaF3 cells (Bcr-Abl, T315I/F317L) using WST assays.

[0010] На фиг. 2A-2D проиллюстрированы результаты исследования действия HQP-1351, понатиниба + ABL001 в клетках BaF3 (Bcr-Abl, T315I/Y253).[0010] In FIG. 2A-2D illustrate the results of a study of the effect of HQP-1351, ponatinib + ABL001 in BaF3 cells (Bcr-Abl, T315I/Y253).

[0011] На фиг. 3А и 3В проиллюстрированы результаты исследования действия понатиниба, HQP-1351 + ABL001 в клетках BaF3 (Bcr-Abl, E255V/T315I) с использованием анализов с WST.[0011] In FIG. 3A and 3B illustrate the results of a study of ponatinib, HQP-1351 + ABL001 in BaF3 cells (Bcr-Abl, E255V/T315I) using WST assays.

[0012] На фиг. 4А и 4В проиллюстрированы результаты исследования действия понатиниба, HQP-1351 + ABL001 в клетках BaF3 (Bcr-Abl, E255K/T315I).[0012] In FIG. 4A and 4B illustrate the results of a study of ponatinib, HQP-1351 + ABL001 in BaF3 cells (Bcr-Abl, E255K/T315I).

[0013] На фиг. 5 проиллюстрированы результаты исследования действия WB-TZ-04-2020-HQP-1351, понатиниба + ABL001 в клетках BaF3 Bcr-Abl-T315I.[0013] In FIG. Figure 5 illustrates the results of a study of the effect of WB-TZ-04-2020-HQP-1351, ponatinib + ABL001 in BaF3 Bcr-Abl-T315I cells.

[0014] На фиг. 6 проиллюстрированы результаты исследования 20201110-1111 действия WB-TZ-04-2020-HQP-1351, понатиниба + ABL001 в линиях клеток BaF3 Bcr-Abl-E255V/T315I.[0014] In FIG. Figure 6 illustrates the results of a study 20201110-1111 of the effect of WB-TZ-04-2020-HQP-1351, ponatinib + ABL001 in the BaF3 cell lines Bcr-Abl-E255V/T315I.

[0015] На фиг. 7A и 7B проиллюстрированы результаты исследования 20201111-1113 апоптоза, индуцированного HQP-1351, понатинибом + ABL001 в линиях клеток BaF3 Bcr-Abl-E255V/T315I.[0015] In FIG. 7A and 7B illustrate the results of the 20201111-1113 study of apoptosis induced by HQP-1351, ponatinib + ABL001 in the BaF3 Bcr-Abl-E255V/T315I cell lines.

[0016] На фиг. 8A и 8B проиллюстрирован превосходный эффект, получаемый в случае комбинирования HQP-1351 с ABL001 в модели ортотопической опухоли T315I.[0016] In FIG. 8A and 8B illustrate the superior effect obtained by combining HQP-1351 with ABL001 in the T315I orthotopic tumor model.

[0017] На фиг. 9A и 9B проиллюстрирован превосходный эффект, получаемый в случае комбинирования HQP-1351 с ABL001 в модели ортотопической опухоли Y253H/T315I.[0017] In FIG. 9A and 9B illustrate the superior effect obtained by combining HQP-1351 with ABL001 in the Y253H/T315I orthotopic tumor model.

[0018] На фиг. 10A и 10B проиллюстрирована превосходная эффективность HQP-1351 и ALB001 в модели ортотопической опухолиF317L/T315I.[0018] In FIG. 10A and 10B illustrate the superior efficacy of HQP-1351 and ALB001 in an orthotopic tumor modelF317L/T315I.

[0019] На фиг. 11A и 11B проиллюстрирована сравнимая эффективность HQP-1351 и ALB001 в модели ортотопической опухолиE255V/T315I.[0019] In FIG. 11A and 11B illustrate the comparable efficacy of HQP-1351 and ALB001 in an orthotopic tumor modelE255V/T315I.

[0020] На фиг. 12А-С проиллюстрировано, что HQP-1351 усиливает эффективность антитела к PD-1 in vitro.[0020] In FIG. 12A-C illustrate that HQP-1351 enhances the effectiveness of an anti-PD-1 antibody in vitro .

[0021] На фиг. 13A-F проиллюстрировано, что HQP-1351 усиливает эффективность антитела к PD-L1 in vivo.[0021] In FIG. 13A-F illustrate that HQP-1351 enhances the effectiveness of an anti-PD-L1 antibody in vivo .

[0022] На фиг. 14A-F проиллюстрировано, что HQP-1351 подавляет экспрессию p-SRC и PD-L1 в зависимости от дозы и времени.[0022] In FIG. 14A-F illustrate that HQP-1351 suppresses the expression of p-SRC and PD-L1 in a dose- and time-dependent manner.

[0023] На фиг. 15 показана кривая жизнеспособности клеток для клеток SUP-B15, обработанных HQP1351, в течение 72 часов.[0023] In FIG. 15 shows the cell viability curve for SUP-B15 cells treated with HQP1351 for 72 hours.

[0024] На фиг. 16 показаны значения IC50 антипролиферативной активности HQP1351 в линиях клеток лейкоза, положительных по филадельфийской хромосоме (Ph+ или BCR-ABL1+) и отрицательных по ней (Ph- или BCR-ABL1-).[0024] In FIG. 16 shows the IC50 values of the antiproliferative activity of HQP1351 in Philadelphia chromosome positive (Ph+ or BCR-ABL1+) and Philadelphia chromosome negative (Ph- or BCR-ABL1-) leukemia cell lines.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0025] Все опубликованные документы, цитируемые в данном документе, настоящим включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.[0025] All published documents cited herein are hereby incorporated herein by reference in their entirety.

[0026] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимает средний специалист в той области техники, к которой относится настоящее изобретение.[0026] Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the present invention relates.

[0027] Термин "приблизительно" используется в данном документе в значении примерно, порядка, ориентировочно или около. При использовании термина "приблизительно" в сочетании с числовым диапазоном он модифицирует этот диапазон, расширяя пределы в большую и меньшую сторону от приведенных числовых значений. Как правило, термин "приблизительно" используется в данном документе для модификации числового значения в большую и меньшую сторону от указанного значения с отклонением на 10%.[0027] The term “about” is used herein to mean approximately, on the order of, approximately, or about. When used in conjunction with a numeric range, the term "about" modifies that range by extending the range above and below the numeric values given. Generally, the term "about" is used herein to modify a numerical value up or down from a specified value within 10%.

[0028] Термин "содержит" относится к “включает без ограничения".[0028] The term “comprises” refers to “includes without limitation.”

[0029] Термины "лечение", "лечить" и "осуществление лечения" относятся к обращению вспять, смягчению, задержке начала проявления или подавлению прогрессирования заболевания или нарушения или одного или нескольких его симптомов, включая без ограничения терапевтическую пользу. В некоторых вариантах осуществления лечение проводят после развития одного или нескольких симптомов. В некоторых вариантах осуществления лечение можно проводить при отсутствии симптомов. Например, лечение можно проводить субъекту до появления симптомов (например, в свете наличия симптомов в анамнезе и/или в свете генетических или других факторов предрасположенности). Лечение также можно продолжать после устранения симптомов, например, для предупреждения или задержки их рецидива.[0029] The terms “treating,” “treating,” and “treating” refer to reversing, mitigating, delaying the onset of, or suppressing the progression of a disease or disorder or one or more symptoms thereof, including, without limitation, therapeutic benefit. In some embodiments, treatment is administered after the development of one or more symptoms. In some embodiments, treatment may be administered in the absence of symptoms. For example, treatment may be administered to a subject prior to the onset of symptoms (eg, in light of a history of symptoms and/or in light of genetic or other predisposing factors). Treatment can also be continued after symptoms have resolved, for example to prevent or delay their recurrence.

[0030] Термин “ABL001” относится к асциминибу.[0030] The term “ABL001” refers to asciminib.

[0031] Терапевтическая польза включает искоренение и/или уменьшение интенсивности проявлений первопричинного нарушения, лечение которого осуществляют, такого как рак; она также включает искоренение и/или уменьшение интенсивности проявлений одного или нескольких симптомов, ассоциированных с первопричинным нарушением, так что у субъекта наблюдается улучшение, несмотря на то, что субъект все еще может быть поражен первопричинным нарушением.[0031] Therapeutic benefit includes eradication and/or amelioration of the underlying disorder being treated, such as cancer; it also includes eradicating and/or reducing the severity of one or more symptoms associated with the underlying disorder such that the subject improves even though the subject may still be affected by the underlying disorder.

[0032] В некоторых вариантах осуществления "лечение" или "осуществление лечения" включает одно или несколько из следующего: (a) подавление нарушения (например, ослабление одного или нескольких симптомов, обусловленных нарушением, и/или уменьшение степени тяжести нарушения); (b) замедление или остановку развития одного или нескольких симптомов, ассоциированных с нарушением (например, стабилизацию нарушения и/или задержку усугубления или прогрессирования нарушения); и/или (c) облегчение нарушения (например, обеспечение регрессии клинических симптомов, уменьшение интенсивности проявлений нарушения, задержку прогрессирования нарушения и/или повышение качества жизни).[0032] In some embodiments, “treating” or “providing a treatment” includes one or more of the following: (a) suppressing the disorder (eg, reducing one or more symptoms associated with the disorder and/or reducing the severity of the disorder); (b) slowing or stopping the development of one or more symptoms associated with the disorder (eg, stabilizing the disorder and/or delaying the worsening or progression of the disorder); and/or (c) alleviation of the disorder (eg, providing regression of clinical symptoms, reducing the intensity of manifestations of the disorder, delaying the progression of the disorder, and/or improving quality of life).

[0033] Термины "осуществление введения" или "введение" охватывают доставку пациенту соединения или его фармацевтически приемлемой соли, или пролекарства, или другого его фармацевтически приемлемого производного с использованием любого подходящего состава или пути введения, например, как описано в данном документе.[0033] The terms “administration” or “administration” include delivery to a patient of a compound or a pharmaceutically acceptable salt or prodrug or other pharmaceutically acceptable derivative thereof using any suitable formulation or route of administration, for example, as described herein.

[0034] Термины “совместное введение” или “комбинированная терапия” понимаются как введение двух или более активных средств с использованием отдельных составов или одного фармацевтического состава или последовательное введение в любом порядке, так что существует период времени, в течение которого оба (или все) активные средства одновременно проявляют свою биологическую активность.[0034] The terms “co-administration” or “combination therapy” are understood to mean the administration of two or more active agents using separate formulations or a single pharmaceutical composition, or sequential administration in any order such that there is a period of time during which both (or all) active agents simultaneously exhibit their biological activity.

[0035] Термины "терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" относятся к количеству, которое является эффективным для того, чтобы вызвать требуемый биологический или медицинский ответ, в том числе к количеству соединения, которое при введении субъекту для лечения нарушения является достаточным для осуществления такого лечения нарушения. Эффективное количество будет меняться в зависимости от нарушения и степени его тяжести, а также возраста, массы и т. д. субъекта, подлежащего лечению. Эффективное количество может быть представлено одной или несколькими дозами (например, для достижения требуемой конечной точки лечения может потребоваться однократная доза или многократные дозы). Эффективное количество можно считать введенным в эффективном количестве, если в сочетании с одним или несколькими другими средствами может быть достигнут или достигается требуемый или благоприятный результат. Подходящие дозы любых совместно вводимых соединений могут быть необязательно снижены ввиду комбинированного действия, аддитивного или синергического действия соединения.[0035] The terms "therapeutically effective amount" or "effective amount" refer to an amount that is effective to produce a desired biological or medical response, including an amount of a compound that, when administered to a subject to treat a disorder, is sufficient to produce such treatment of the disorder. The effective amount will vary depending on the disorder and its severity, as well as the age, weight, etc. of the subject to be treated. The effective amount may be in one or more doses (eg, a single dose or multiple doses may be required to achieve the desired treatment endpoint). An effective amount may be considered administered in an effective amount if, in combination with one or more other agents, a desired or beneficial result can be achieved or is achieved. Suitable dosages of any co-administered compounds may optionally be reduced due to the combined effect, additive or synergistic effect of the compound.

[0036] Термин "пациент", которому предполагается введение, включает без ограничения людей (т. е. мужчину или женщину из любой возрастной группы, например, педиатрического субъекта (например, младенца, ребенка, подростка) или взрослого субъекта (например, молодого человека, человека среднего возраста или пожилого человека)) и/или других приматов (например, яванских макаков, макаков-резусов).[0036] The term "patient" to which administration is intended includes, without limitation, humans (i.e., a man or woman from any age group, e.g., a pediatric subject (e.g., an infant, a child, an adolescent) or an adult subject (e.g., a young adult , middle-aged or elderly person)) and/or other primates (eg, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys).

[0037] “Субъект”, подлежащий лечению с помощью способа по настоящему изобретению, может означать либо человека, либо отличное от человека животное, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человека. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется выявляемая опухоль до начала лечения с применением способов по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления у субъекта имеется выявляемая опухоль на момент начала лечения с применением способов по настоящему изобретению.[0037] The “subject” to be treated by the method of the present invention can mean either a human or a non-human animal, preferably a mammal, more preferably a human. In some embodiments, the subject has an identifiable tumor prior to treatment using the methods of the present invention. In certain embodiments, the subject has a detectable tumor at the time of initiation of treatment using the methods of the present invention.

[0038] Термины “осуществление предупреждения” или “предупреждение” относятся к снижению риска приобретения заболевания или нарушения. Для предупреждения не требуется, чтобы заболевание или состояние никогда не возникали или не рецидивировали у субъекта.[0038] The terms “providing prevention” or “prevention” refer to reducing the risk of acquiring a disease or disorder. Prevention does not require that the disease or condition has never occurred or recurred in the subject.

[0039] Термины "фармацевтически приемлемый" или "физиологически приемлемый" относятся к соединениям, солям, композициям, лекарственным формам и другим материалам, которые применимы при получении фармацевтической композиции, подходящей для фармацевтического применения в ветеринарии или медицине.[0039] The terms “pharmaceutically acceptable” or “physiologically acceptable” refer to compounds, salts, compositions, dosage forms and other materials that are useful in the preparation of a pharmaceutical composition suitable for pharmaceutical use in veterinary or human medicine.

[0040] Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к тем солям, которые в пределах здравого медицинского суждения подходят для применения в контакте с тканями людей и низших животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т. п. соизмеримо с разумным соотношением польза/риск. Фармацевтически приемлемые соли хорошо известны из уровня техники. Например, S. M. Berge и соавт. подробно описывают фармацевтически приемлемые соли в J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19. Фармацевтически приемлемые соли соединения 1 включают соли, полученные из подходящих неорганических и органических кислот и оснований.[0040] The term "pharmaceutically acceptable salt" refers to those salts which, within the bounds of sound medical judgment, are suitable for use in contact with the tissues of humans and lower animals without undue toxicity, irritation, allergic reaction, etc., commensurate with a reasonable balance of benefit/ risk. Pharmaceutically acceptable salts are well known in the art. For example, SM Berge et al. pharmaceutically acceptable salts are described in detail in J. Pharmaceutical Sciences , 1977, 66, 1-19. Pharmaceutically acceptable salts of Compound 1 include those derived from suitable inorganic and organic acids and bases.

[0041] Примерами фармацевтически приемлемых нетоксичных солей присоединения кислоты являются соли по аминогруппе, образованные с неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота, серная кислота и хлорная кислота, или с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, винная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота или малоновая кислота, или с использованием других способов, используемых в данной области техники, таких как ионный обмен.[0041] Examples of pharmaceutically acceptable non-toxic acid addition salts are amino salts formed with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid, sulfuric acid and perchloric acid, or with organic acids such as acetic acid, oxalic acid, maleic acid, tartaric acid, citric acid, succinic acid or malonic acid, or using other methods used in the art, such as ion exchange.

[0042] Другие фармацевтически приемлемые соли включают адипатные, альгинатные, аскорбатные, аспартатные, бензолсульфонатные, бензоатные, бисульфатные, боратные, бутиратные, камфоратные, камфорсульфонатные, цитратные, циклопентанпропионатные, диглюконатные, додецилсульфатные, этансульфонатные, формиатные, фумаратные, глюкогептонатные, глицерофосфатные, глюконатные, гемисульфатные, гептаноатные, гексаноатные, гидройодидные, 2-гидроксиэтансульфонатные, лактобионатные, лактатные, лауратные, лаурилсульфатные, малатные, малеатные, малонатные, метансульфонатные, 2-нафталинсульфонатные, никотинатные, нитратные, олеатные, оксалатные, пальмитатные, памоатные, пектинатные, персульфатные, 3-фенилпропионатные, фосфатные, пивалатные, пропионатные, стеаратные, сукцинатные, сульфатные, тартратные, тиоцианатные, п-толуолсульфонатные, ундеканоатные, валератные соли и т. п. Хотя фармацевтически приемлемые противоионы будут предпочтительными для получения фармацевтических составов, другие анионы вполне приемлемы в качестве промежуточных продуктов синтеза. Таким образом, это могут быть фармацевтически нежелательные анионы, такие как йодид, оксалат, трифторметансульфонат и т. п., если такие соли являются промежуточными химическими соединениями.[0042] Other pharmaceutically acceptable salts include adipate, alginate, ascorbate, aspartate, benzenesulfonate, benzoate, bisulfate, borate, butyrate, camphorate, camphorsulfonate, citrate, cyclopentanepropionate, digluconate, dodecyl sulfate, ethanesulfonate, formate, fumarate, glucoheptone solid, glycerophosphate, gluconate, hemisulfate, heptanoate, hexanoate, hydroiodide, 2-hydroxyethanesulfonate, lactobionate, lactate, laurate, lauryl sulfate, malate, maleate, malonate, methanesulfonate, 2-naphthalene sulfonate, nicotinate, nitrate, oleate, oxalate, palmitate, pamoate, pectinate, persulfate, 3- phenylpropionate, phosphate, pivalate, propionate, stearate, succinate, sulfate, tartrate, thiocyanate, p-toluenesulfonate, undecanoate, valerate salts, etc. Although pharmaceutically acceptable counterions will be preferred for the preparation of pharmaceutical formulations, other anions are quite acceptable as intermediates synthesis. Thus, these may be pharmaceutically undesirable anions such as iodide, oxalate, trifluoromethanesulfonate, etc., if such salts are chemical intermediates.

[0043] Термин "фармацевтически приемлемый носитель" используется в данном документе для обозначения материала, который совместим с получающим его субъектом, предпочтительно с млекопитающим, более предпочтительно с человеком, и подходит для доставки активного средства в сайт-мишень без прекращения активности средства. Токсичность или нежелательные эффекты, ассоциированные с носителем, если таковые имеются, предпочтительно должны быть соизмеримы с разумным соотношением риск/польза для предполагаемого применения активного средства.[0043] The term "pharmaceutically acceptable carrier" is used herein to mean a material that is compatible with a recipient subject, preferably a mammal, more preferably a human, and is suitable for delivering the active agent to the target site without interrupting the activity of the agent. Toxicity or adverse effects associated with the carrier, if any, should preferably be commensurate with a reasonable risk/benefit ratio for the intended use of the active agent.

[0044] Термин “перорально” относится к введению композиции, предназначенной для приема внутрь. Примеры пероральных форм включают без ограничения таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, растворы или суспензии и капли. Такие формы можно проглатывать целиком, или они могут быть представлены в жевательной форме.[0044] The term “oral” refers to the administration of a composition intended for oral administration. Examples of oral forms include, but are not limited to, tablets, pills, capsules, powders, granules, solutions or suspensions, and drops. Such forms may be swallowed whole, or they may be presented in chewable form.

[0045] Термин “иммунная контрольная точка” или “молекула, являющаяся иммунной контрольной точкой” означает молекулу в иммунной системе, которая модулирует сигнал. Молекула, являющаяся иммунной контрольной точкой, может являться молекулой, являющейся костимулирующей иммунной контрольной точкой, т. е. усиливающей сигнал, или молекулой, являющейся ингибирующей иммунной контрольной точкой, т. е. ослабляющей сигнал. Используемый в данном документе термин “молекула, являющаяся костимулирующей иммунной контрольной точкой” означает молекулу в иммунной системе, которая усиливает сигнал или является костимулирующей. Используемый в данном документе термин “ингибирующая молекула, представляющая собой иммунную контрольную точку” означает молекулу в иммунной системе, которая ослабляет сигнал или является коингибирующей.[0045] The term “immune checkpoint” or “immune checkpoint molecule” means a molecule in the immune system that modulates a signal. The immune checkpoint molecule may be a costimulatory immune checkpoint molecule, i.e. signal amplifier, or a molecule that is an inhibitory immune checkpoint, i.e. weakening the signal. As used herein, the term “immune checkpoint co-stimulatory molecule” means a molecule in the immune system that amplifies a signal or is co-stimulatory. As used herein, the term “immune checkpoint inhibitory molecule” means a molecule in the immune system that attenuates a signal or is coinhibitory.

[0046] Термин "модулятор молекулы, являющейся иммунной контрольной точкой" означает средство, способное изменять активность иммунной контрольной точки у субъекта. В определенных вариантах осуществления модулятор молекулы, являющейся иммунной контрольной точкой, изменяет функцию одной или нескольких молекул, являющихся иммунными контрольными точками, включая PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, TIM-3, LAG3, CD160, 2B4, TGF β, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, OX40, CD2, CD27, ICAM-1, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, LFA-1, 1COS, 4-1BB, GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT и CD83. Модулятор иммунной контрольной точки может быть активатором (например, агонистом) или ингибитором (например, антагонистом) иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах осуществления модулятор молекулы, являющейся иммунной контрольной точкой, представляет собой белок, связывающий иммунную контрольную точку (например, антитело, Fab-фрагмент антитела, двухвалентное антитело, конъюгат антитело-лекарственное средство, scFv, слитый белок, бивалентное антитело или четырехвалентное антитело). В некоторых вариантах осуществления модулятор молекулы, являющейся иммунной контрольной точкой, представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В других вариантах осуществления модулятор молекулы, являющейся иммунной контрольной точкой, представляет собой малую молекулу. В конкретном варианте осуществления модулятор молекулы, являющейся иммунной контрольной точкой, представляет собой антитело к PD1. В конкретном варианте осуществления модулятор молекулы, являющейся иммунной контрольной точкой, представляет собой антитело к PD-L1. В конкретном варианте осуществления модулятор молекулы, являющейся иммунной контрольной точкой, представляет собой антитело к CTLA-4.[0046] The term “immune checkpoint molecule modulator” means an agent capable of altering the activity of an immune checkpoint in a subject. In certain embodiments, the immune checkpoint molecule modulator alters the function of one or more immune checkpoint molecules, including PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, TIM-3, LAG3, CD160, 2B4 , TGF β, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, OX40, CD2, CD27, ICAM-1, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, LFA-1, 1COS, 4-1BB, GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT and CD83. An immune checkpoint modulator may be an activator (e.g. agonist) or inhibitor (eg. antagonist) immune checkpoint. In some embodiments, the immune checkpoint molecule modulator is an immune checkpoint binding protein (e.g. antibody, antibody Fab fragment, divalent antibody, antibody-drug conjugate, scFv, fusion protein, bivalent antibody or quadrivalent antibody). In some embodiments, the immune checkpoint molecule modulator is a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof. In other embodiments, the immune checkpoint molecule modulator is a small molecule. In a specific embodiment, the immune checkpoint molecule modulator is an anti-PD1 antibody. In a specific embodiment, the immune checkpoint molecule modulator is an anti-PD-L1 antibody. In a specific embodiment, the immune checkpoint molecule modulator is an anti-CTLA-4 antibody.

[0047] Используемый в данном документе термин “осуществление совместного введения” или “совместное введение” относится к введению соединения формулы (I) или HQP-1351 до, одновременно или практически одновременно, последовательно или периодически с введением аллостерического ингибитора или модулятора иммунной контрольной точки.[0047] As used herein, the term “co-administration” or “co-administration” refers to the administration of a compound of formula (I) or HQP-1351 prior to, simultaneously or substantially simultaneously, sequentially or periodically with the administration of an allosteric inhibitor or immune checkpoint modulator.

[0048] Термин “полная регрессия” относится к опухоли, которую нельзя выявить после лечения.[0048] The term “complete regression” refers to a tumor that cannot be detected after treatment.

[0049] Термин “частичная регрессия” относится к уменьшению объемов опухоли (например, уменьшению на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%) по сравнению с состоянием до лечения.[0049] The term “partial regression” refers to a decrease in tumor volume (eg, decrease by 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%) compared to the state before treatment.

[0050] Во всех случаях в данной заявке, в которых имеется серия указанных числовых значений, следует понимать, что любое из указанных числовых значений может являться верхним пределом или нижним пределом числового диапазона. Кроме того, следует понимать, что настоящее изобретение охватывает все такие числовые диапазоны, т. е. диапазон, содержащий комбинацию верхнего числового предела и нижнего числового предела, где числовое значение для каждого из верхнего предела и нижнего предела может представлять собой любое числовое значение, указанное в данном документе. Подразумевается, что представленные в данном документе диапазоны включают все значения в пределах диапазона. Например, подразумевается, что 1-10 включает все из значений 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10, а также дробные значения, в соответствующих случаях. Диапазоны, выраженные как “не более” определенного значения, например не более 5, подразумеваются как все значения, включая верхний предел диапазона, например, 0, 1, 2, 3, 4 и 5, и дробные значения, в соответствующих случаях. Подразумевается, что не более или в пределах недели включает 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней. Аналогичным образом подразумевается, что диапазоны, ограниченные выражением “по меньшей мере”, включают нижнее предусмотренное значение и все более высокие числа.[0050] In all cases in this application in which there is a series of specified numerical values, it should be understood that any of the specified numerical values may be the upper limit or lower limit of the numerical range. It is further understood that the present invention covers all such numerical ranges, i.e., a range comprising a combination of an upper numerical limit and a lower numerical limit, wherein the numerical value for each of the upper limit and lower limit may be any numerical value specified in this document. Ranges presented herein are intended to include all values within the range. For example, 1-10 is intended to include all of the values 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10, as well as fractional values, as appropriate. Ranges expressed as “not more than” a specific value, such as not more than 5, are intended to include all values, including the upper limit of the range, such as 0, 1, 2, 3, 4 and 5, and fractional values, as appropriate. Means not more than or within a week to include 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 days. Likewise, the ranges limited by the expression “at least” are intended to include the lower intended value and all higher numbers.

[0051] Термин “алкил” означает алкильную группу с разветвленной цепью или прямой цепью с определенным числом атомов углерода. Например, определение “C₁-C₅” в “C₁-C₅алкил” означает алкильную группу с прямой цепью или разветвленной цепью с 1, 2, 3, 4 или 5 атомами углерода. Например,“C₁-C₅алкил” включает метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, пентил и т. д.[0051] The term “alkyl” means a branched chain or straight chain alkyl group with a specific number of carbon atoms. For example, the definition of “C ₁ -C ₅ ” in “C ₁ -C ₅ alkyl” means a straight chain or branched chain alkyl group with 1, 2, 3, 4 or 5 carbon atoms. For example, “C ₁ -C ₅ alkyl” includes methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, tert-butyl, isobutyl, pentyl, etc.

[0052] Термин “циклоалкил” относится к конкретному одиночному насыщенному алкильному кольцу с определенным числом атомов углерода. Например, “циклоалкил” включает циклопропил-, метилциклопропил-, 2,2-диметилциклобутил, 2-этилциклопентил-, циклогексил и т. д.[0052] The term “cycloalkyl” refers to a specific single saturated alkyl ring with a specific number of carbon atoms. For example, “cycloalkyl” includes cyclopropyl-, methylcyclopropyl-, 2,2-dimethylcyclobutyl, 2-ethylcyclopentyl-, cyclohexyl, etc.

[0053] Термин “алкокси” относится к метокси, этокси, пропокси, изопропокси, бутокси, изобутокси, втор-бутокси или трет-бутокси.[0053] The term “alkoxy” refers to methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, sec-butoxy or tert-butoxy.

[0054] Термин “галоген” или “галогеновый радикал” означает хлор, фтор, бром и йод.[0054] The term “halogen” or “halogen radical” means chlorine, fluorine, bromine and iodine.

[0055] В данном документе описаны различные (пронумерованные) варианты осуществления настоящего изобретения. Следует понимать, что признаки, указанные в каждом варианте осуществления, могут быть объединены с другими указанными признаками с обеспечением дополнительных вариантов осуществления настоящего изобретения.[0055] Various (numbered) embodiments of the present invention are described herein. It should be understood that the features specified in each embodiment may be combined with other specified features to provide additional embodiments of the present invention.

[0056] Вариант осуществления 1. Способ лечения рака, включающий совместное введение субъекту, нуждающемуся в этом:[0056] Embodiment 1. A method of treating cancer, comprising co-administering to a subject in need thereof:

(I),(I),

гдеWhere

[0057] В одном варианте осуществления соединения формулы (I) R₁ представляет собой водород или C_1-4алкил.[0057] In one embodiment of the compound of formula (I), R ₁ is hydrogen or C _1-4 alkyl.

[0058] В другом варианте осуществления соединения формулы (I) R₁ представляет собой водород.[0058] In another embodiment of the compound of formula (I), R ₁ is hydrogen.

[0059] В другом варианте осуществления соединения формулы (I) R₂ представляет собой водород или C_1-4алкил.[0059] In another embodiment of the compound of formula (I), R ₂ is hydrogen or C _1-4 alkyl.

[0060] В другом варианте осуществления соединения формулы (I) R₂ представляет собой C_1-4алкил.[0060] In another embodiment of the compound of formula (I), R ₂ is C _1-4 alkyl.

[0061] В другом варианте осуществления соединения формулы (I) R₂ представляет собой метил или этил. В другом варианте осуществления R₂ представляет собой метил.[0061] In another embodiment of the compound of formula (I), R ₂ is methyl or ethyl. In another embodiment, R ₂ is methyl.

[0062] В другом варианте осуществления соединения формулы (I) R₁ представляет собой водород, и R₂ представляет собой C_1-4алкил.[0062] In another embodiment of the compound of formula (I), R ₁ is hydrogen and R ₂ is C _1-4 alkyl.

[0063] Соединения формулы (I) являются новыми селективными мощными ингибиторами широкого спектра мутаций в BCR-ABL, включая T3151, E255K/V, G250E, H396P, M351T, Q252H, Y253F/H или BCR-ABL^WT.[0063] The compounds of formula (I) are novel, selective, potent inhibitors of a broad range of mutations in BCR-ABL, including T3151, E255K/V, G250E, H396P, M351T, Q252H, Y253F/H or BCR-ABL ^WT .

[0064] Соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемая соль также являются мощными ингибиторами других киназ, включая KIT, BRAF, DDR1, PDGFR, FGFR, FLT3, RET, SRC, TIE1 и TIE2.[0064] The compounds of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof are also potent inhibitors of other kinases, including KIT, BRAF, DDR1, PDGFR, FGFR, FLT3, RET, SRC, TIE1 and TIE2.

[0065] Вариант осуществления 2. Способ согласно варианту осуществления 1, где соединение формулы (I) представляет собой HQP-1351 или его фармацевтически приемлемую соль, где HQP-1351 имеет следующую структуру:[0065] Embodiment 2. The method according to Embodiment 1, wherein the compound of formula (I) is HQP-1351 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein HQP-1351 has the following structure:

HQP-1351.HQP-1351.

[0066] HQP-1351 представляет собой новый перорально активный мощный ингибитор BCR-ABL третьего поколения, предназначенный для эффективного нацеливания на мутантные формы BCR-ABL, включая T315I, и он разрабатывается для лечения пациентов с CML, резистентным к ингибиторам тирозинкиназы (TKI) первого и второго поколения.[0066] HQP-1351 is a novel, orally active, third generation potent BCR-ABL inhibitor designed to effectively target BCR-ABL mutants, including T315I, and is being developed for the treatment of patients with CML refractory to first tyrosine kinase inhibitors (TKIs). and second generation.

[0067] Химическим названием HQP-1351 является 3-(2-(1H-пиразоло[3,4-b]пиридин-5-ил)этинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-(трифторметил)фенил)бензамид.[0067] The chemical name of HQP-1351 is 3-(2-(1H-pyrazolo[3,4-b]pyridin-5-yl)ethynyl)-4-methyl-N-(4-((4-methylpiperazine-1 -yl)methyl)-3-(trifluoromethyl)phenyl)benzamide.

[0066] Соединения формулы (I) или HQP-1351 или их фармацевтически приемлемая соль можно получить в соответствии со способами получения, описанными в патенте США № 8846671 B2, выданном 30 сентября 2014 г., который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте и для всех целей, или способом, аналогичным ему.[0066] The compounds of formula (I) or HQP-1351 or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be prepared in accordance with the methods of preparation described in US Patent No. 8846671 B2, issued September 30, 2014, which is incorporated herein by reference in its entirety completeness and for all purposes, or in a manner similar thereto.

[0067] Вариант осуществления 3. Способ согласно варианту осуществления 1 или 2, где аллостерический ингибитор представляет собой асциминиб.[0067] Embodiment 3. The method of Embodiment 1 or 2, wherein the allosteric inhibitor is asciminib.

[0070] В настоящем изобретении обнаружено, что HQP-1351, также известный как олверембатиниб, усиливал эффект аллостерического ингибитора при резистентности, обусловленной сочетанными мутациями в BCR-ABL. Лечение с помощью ингибиторов тирозинкиназы (TKI), направленное против АТФ-связывающего сайта BCR-ABL, содействует выздоровлению при Ph+ лейкозе. Однако возникновение мутации иммунной контрольной точки T315I и сочетанных мутантов придает резистентность к таким TKI. HQP-1351 представляет собой TKI нового поколения, нацеливающийся на BCR-ABL. Он является ингибитором АТФ-сайта и в настоящее время находится в разработке для лечения рецидивирующих и рефрактерных форм CML.[0070] The present invention found that HQP-1351, also known as olverembatinib, enhanced the allosteric inhibitor effect in resistance due to co-mutations in BCR-ABL. Treatment with tyrosine kinase inhibitors (TKIs) directed against ATP-binding BCR-ABL site, promotes recovery in Ph+ leukemia. However, the occurrence of the T315I immune checkpoint mutation and combination mutants confers resistance to such TKIs. HQP-1351 is a next-generation TKI targeting BCR-ABL. It is an ATP site inhibitor and is currently in development for the treatment of relapsed and refractory forms of CML.

[0071] Асциминиб представляет собой аллостерический ингибитор, нацеливающийся на миристоил-связывающий карман киназы BCR-ABL и нисходящую передачу сигнала. Исследования показывают, что комбинирование асциминиба с понатинибом может преодолевать только часть резистентности, вызванной сочетанными мутантами BCR-ABL. Новая комбинация HQP-1351 с асциминибом, нацеливающимися как на АТФ-карман, так и на аллостерическую область белка BCR-ABL, может содействовать ингибирующему эффекту у киназы, содержащей сочетанные мутации.[0071] Asciminib is an allosteric inhibitor that targets the myristoyl binding pocket of BCR-ABL kinase and downstream signaling. Studies show that combining asciminib with ponatinib may overcome only a portion of the resistance caused by BCR-ABL combination mutants. The novel combination of HQP-1351 with asciminib, targeting both the ATP pocket and the allosteric region of the BCR-ABL protein, may promote inhibitory effects on kinases harboring co-mutations.

[0072] Асциминиб можно получать в соответствии со способами, описанными в Nature (London, United Kingdom), 543 (7647), 733-737: 2017, или в соответствии со способами, описанными в публикации согласно РСТ WO2013/171639.[0072] Asciminib can be prepared in accordance with the methods described in Nature (London, United Kingdom), 543 (7647), 733-737: 2017, or in accordance with the methods described in PCT publication WO2013/171639.

[0073] Серии клеток с одиночными или сочетанными мутациями в BCR-ABL конструировали на основании клеток BaF3. Эффект HQP-1351 в качестве отдельного средства или в комбинации с асциминибом анализировали с использованием анализа антипролиферативного действия, вестерн-блоттинга и FACS-анализа in vitro. Эффективность in vivo оценивали с использованием сингенной мышиной модели, полученной за счет клеток BaF3 с T315I и/или сочетанными мутациями.[0073] A series of cells with single or combined mutations in BCR-ABL were constructed from BaF3 cells. The effect of HQP-1351 as a single agent or in combination with asciminib was analyzed using an antiproliferative assay, Western blot and in vitro FACS analysis. In vivo efficacy was assessed using a syngeneic mouse model derived from BaF3 cells with T315I and/or combined mutations.

[0074] Клеточные исследования антипролиферативного действия продемонстрировали превосходную активность HQP-1351 в отношении одиночных или сочетанных мутаций в BCR-ABL со значениями IC₅₀, находящимися в диапазоне 6-300 нМ. В частности, HQP-1351 был более эффективным, чем понатиниб, асциминиб и другие TKI, в отношении таких сочетанных мутаций. Более того, комбинация HQP-1351 с асциминибом была высокоэффективной в отношении сочетанных мутаций в BCR-ABL, особенно тех, которые содержат T315I. Исследования in vivo дополнительно показали, что совместное введение HQP-1351 с асциминибом приводило к значительному продлению выживаемости по сравнению с отдельными средствами. Важно отметить, что противоопухолевый эффект был более сильным, чем у понатиниба плюс асциминиб у моделей, несущих сочетанные мутации. С точки зрения механизма, комбинированное лечение синергически снижало фосфорилирование BCR-ABL и расположенные в нисходящем пути белков CRKL и STAT5, а усиленное расщепление каспазы-3 и PARP-1, тем самым, запускало апоптоз и впоследствии усиливало противоопухолевые эффекты.[0074] Cellular antiproliferative studies demonstrated superior activity of HQP-1351 against single or combined mutations in BCR-ABL with IC ₅₀ values ranging from 6-300 nM. In particular, HQP-1351 was more effective than ponatinib, asciminib and other TKIs against such co-mutations. Moreover, the combination of HQP-1351 with asciminib was highly effective against co-mutations in BCR-ABL, especially those containing T315I. In vivo studies further showed that coadministration of HQP-1351 with asciminib resulted in significantly prolonged survival compared with the individual agents. Importantly, the antitumor effect was greater than that of ponatinib plus asciminib in models harboring co-mutations. Mechanistically, the combination treatment synergistically decreased the phosphorylation of BCR-ABL and the downstream proteins CRKL and STAT5, and the increased cleavage of caspase-3 and PARP-1 thereby triggered apoptosis and subsequently enhanced the antitumor effects.

[0075] Результаты в примере 1 настоящего изобретения показывают, что комбинация ингибитора АТФ-связывающего сайта, HQP-1351, и аллостерического ингибитора может оказывать наилучший противоопухолевый эффект в отношении опухолевых клеток, несущих одиночные или сочетанные мутации в BCR-ABL. Такая новая стратегия может помочь преодолеть вторичные сочетанные мутации после лечения с помощью одиночных TKI.[0075] The results in Example 1 of the present invention show that the combination of an ATP binding site inhibitor, HQP-1351, and an allosteric inhibitor can have the best antitumor effect against tumor cells harboring single or combined mutations in BCR-ABL. Such a new strategy may help overcome secondary co-mutations after treatment with single TKIs.

[0076] Вариант осуществления 4. Способ согласно вариантам осуществления 1-3, где рак представляет собой гематологическое злокачественное новообразование.[0076] Embodiment 4. The method according to embodiments 1-3, wherein the cancer is a hematological malignancy.

[0077] Вариант осуществления 5. Способ согласно варианту осуществления 4, где гематологическое злокачественное новообразование представляет собой лейкоз.[0077] Embodiment 5. The method according to Embodiment 4, wherein the hematological malignancy is leukemia.

[0078] Вариант осуществления 6. Способ согласно варианту осуществления 4, где гематологическое злокачественное новообразование представляет собой хронический миелогенный лейкоз.[0078] Embodiment 6. The method of Embodiment 4, wherein the hematologic malignancy is chronic myelogenous leukemia.

[0079] Вариант осуществления 7. Способ согласно вариантам осуществления 1-6, где способ представляет собой лечение пациента с хроническим миелоидным лейкозом, резистентным к современным видам терапии ингибиторами тирозинкиназы.[0079] Embodiment 7. The method of embodiments 1-6, wherein the method is treating a patient with chronic myeloid leukemia resistant to current tyrosine kinase inhibitor therapies.

[0080] Вариант осуществления 8. Способ согласно варианту осуществления 7, где хронический миелоидный лейкоз, резистентный к современным видам терапии ингибиторами тирозинкиназы, у пациента вызван мутациями в BCR-ABL.[0080] Embodiment 8. The method of Embodiment 7, wherein the patient's chronic myeloid leukemia resistant to current tyrosine kinase inhibitor therapies is caused by mutations in BCR-ABL.

[0081] Вариант осуществления 9. Способ согласно варианту осуществления 8, где мутация в BCR-ABL представляет собой мутации T3151, E255K/V, G250E, H396P, M351T, Q252H, Y253F/H или BCR-ABL^WT.[0081] Embodiment 9. The method of Embodiment 8, wherein the mutation in BCR-ABL is T3151, E255K/V, G250E, H396P, M351T, Q252H, Y253F/H, or BCR-ABL ^WT mutations.

[0082] Вариант осуществления 10. Способ согласно варианту осуществления 8, где мутация в BCR-ABL представляет собой мутацию T3151.[0082] Embodiment 10. The method of Embodiment 8, wherein the mutation in BCR-ABL is a T3151 mutation.

[0083] Вариант осуществления 11. Способ согласно вариантам осуществления 1-3, где рак представляет собой рак молочной железы, рак шейки матки, рак яичника, рак эндометрия, рак предстательной железы, рак толстой кишки, рак мочевого пузыря, метастазы в кости, колоректальный рак, рак пищевода, рак головы и шеи, рак легкого, карциноидную опухоль легкого или карциному желудка.[0083] Embodiment 11. The method according to embodiments 1-3, wherein the cancer is breast cancer, cervical cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, prostate cancer, colon cancer, bladder cancer, bone metastasis, colorectal cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, lung cancer, lung carcinoid tumor or gastric carcinoma.

[0084] Вариант осуществления 12. Способ согласно варианту осуществления 11, где рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).[0084] Embodiment 12. The method of Embodiment 11, wherein the lung cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC).

[0085] Вариант осуществления 13. Способ согласно варианту осуществления 11, где рак легкого представляет собой мелкоклеточный рак легкого (SCLC).[0085] Embodiment 13. The method according to Embodiment 11, wherein the lung cancer is small cell lung cancer (SCLC).

[0086] Вариант осуществления 14. Способ ингибирования мутантов BCR-ABL, включающий приведение мутантов BCR-ABL в контакт с a) соединением формулы (I) или его фармацевтически приемлемой солью и b) аллостерическим ингибитором;[0086] Embodiment 14. A method for inhibiting BCR-ABL mutants, comprising contacting the BCR-ABL mutants with a) a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and b) an allosteric inhibitor;

где соединение формулы (I) имеет следующую структуру,wherein the compound of formula (I) has the following structure,

(I),(I),

гдеWhere

[0087] Вариант осуществления 15. Способ согласно варианту осуществления 14, где соединение формулы (I) представляет собой HQP-1351 или его фармацевтически приемлемую соль, где HQP-1351 имеет следующую структуру:[0087] Embodiment 15. The method of Embodiment 14, wherein the compound of formula (I) is HQP-1351 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein HQP-1351 has the following structure:

HQP-1351.HQP-1351.

[0088] Вариант осуществления 16. Способ согласно вариантам осуществления 14 или 15, где аллостерический ингибитор представляет собой асциминиб.[0088] Embodiment 16. The method of Embodiments 14 or 15, wherein the allosteric inhibitor is asciminib.

[0089] Вариант осуществления 17. Способ согласно вариантам осуществления 14-16, где ингибирование осуществляют in vitro или in vivo.[0089] Embodiment 17. The method according to embodiments 14-16, wherein the inhibition is carried out in vitro or in vivo .

[0090] Вариант осуществления 18. Способ согласно вариантам осуществления 14-19, где ингибирование осуществляют у пациента с хроническим миелоидным лейкозом, резистентным к современным видам терапии ингибиторами тирозинкиназы.[0090] Embodiment 18. The method of embodiments 14-19, wherein the inhibition is performed in a patient with chronic myeloid leukemia resistant to current tyrosine kinase inhibitor therapies.

[0091] Вариант осуществления 19. Способ согласно варианту осуществления 18, где хронический миелоидный лейкоз, резистентный к современным видам терапии ингибиторами тирозинкиназы, у пациента вызван мутациями в BCR-ABL.[0091] Embodiment 19. The method of Embodiment 18, wherein the patient's chronic myeloid leukemia resistant to current tyrosine kinase inhibitor therapies is caused by mutations in BCR-ABL.

[0092] Вариант осуществления 20. Способ согласно варианту осуществления 19, где мутация в BCR-ABL представляет собой мутации T3151, E255K/V, G250E, H396P, M351T, Q252H, Y253F/H или BCR-ABL^WT.[0092] Embodiment 20. The method of Embodiment 19, wherein the mutation in BCR-ABL is T3151, E255K/V, G250E, H396P, M351T, Q252H, Y253F/H, or BCR-ABL ^WT mutations.

[0093] Вариант осуществления 21. Способ согласно варианту осуществления 19, где мутация в BCR-ABL представляет собой T3151.[0093] Embodiment 21. The method of Embodiment 19, wherein the mutation in BCR-ABL is T3151.

[0094] В настоящем изобретении дополнительно обнаружено, что HQP-1351 усиливал опосредованные Т-клетками противоопухолевые иммунные ответы при NSCLC. Обнаружение по настоящему изобретению предоставляет доказательства для поддержки комбинации HQP-1351 и антитела к PD-1/PD-L1 в качестве потенциального подхода для комбинированного лечения, чтобы повысить эффективности иммунотерапии при NSCLC.[0094] The present invention further found that HQP-1351 enhanced T cell-mediated antitumor immune responses in NSCLC. The discovery of the present invention provides evidence to support the combination of HQP-1351 and anti-PD-1/PD-L1 antibody as a potential combination treatment approach to improve the effectiveness of immunotherapy in NSCLC.

[0095] Хотя ингибиторы иммунных контрольных точек (ICI), включая антитело к PD-1/PD-L1, продемонстрировали положительные терапевтические ответы для некоторых средств лечения рака, значительная часть пациентов с раком все еще не проявляет ответ. Существенные ограничения по частоте отсутствия ответа подчеркивают необходимость в подходящих видах комбинированной терапии. Киназы семейства SRC сверхэкспрессируются или активируются при множестве злокачественных новообразованиях человека, что делает их кандидатом-мишенью для регуляции противоопухолевого иммунитета. HQP-1351, пероральный биодоступный мультикиназный ингибитор, продемонстрировал клиническую эффективность при хроническом миелоидном лейкозе. В настоящем изобретении демонстрируется, что HQP-1351 в качестве ингибитора SRC способен повышать противоопухолевый иммунитет при немелкоклеточном раке легкого (NSCLC), как показано в примере ниже.[0095] Although immune checkpoint inhibitors (ICIs), including anti-PD-1/PD-L1 antibodies, have demonstrated positive therapeutic responses for some cancer treatments, a significant proportion of cancer patients still do not respond. Significant limitations in non-response rates highlight the need for appropriate combination therapies. SRC family kinases are overexpressed or activated in a variety of human malignancies, making them candidate targets for regulating antitumor immunity. HQP-1351, an orally bioavailable multikinase inhibitor, has demonstrated clinical efficacy in chronic myeloid leukemia. The present invention demonstrates that HQP-1351, as an SRC inhibitor, is capable of enhancing antitumor immunity in non-small cell lung cancer (NSCLC), as shown in the example below.

[0096] PD-1. Белок 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1, также известный как CD279 и PDCD1) представляет собой ингибиторный рецептор, который осуществляет отрицательную регуляцию иммунной системы. В отличие от CTLA-4, который в основном влияет на наивные Т-клетки, PD-1 более широко экспрессируется на иммунных клетках и регулирует активность зрелых Т-клеток в периферических тканях и в микроокружении опухоли. PD-1 ингибирует Т-клеточные ответы за счет противодействия передаче сигнала через Т-клеточный рецептор. PD-1 имеет два лиганда, PD-L1 и PD-L2. Было разработано множество модуляторов иммунных контрольных точек, специфических для PD-1, и их можно применять, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления модулятор иммунных контрольных точек представляет собой средство, которое модулирует активность и/или экспрессию PD-1. В некоторых вариантах осуществления модулятор иммунных контрольных точек представляет собой средство, которое связывается с PD-1 (например, антитело к PD-1). В некоторых вариантах осуществления модулятор контрольных точек представляет собой агонист PD-1. В некоторых вариантах осуществления модулятор контрольных точек представляет собой антагонист PD-1. В некоторых вариантах осуществления модулятор иммунных контрольных точек представляет собой PD-1-связывающий белок (например, антитело), выбранный из группы, состоящей из пембролизумаба (Китруда; ранее ламбролизумаб; Merck & Co., Inc.) , ниволумаб (Опдиво; Bristol-Myers Squibb), пидилизумаб (CT-011, CureTech), JS-001 (Shanghai Junshi Bioscience Co., Ltd.), SHR-1210 (Incyte/Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.), MEDI0680 (также известный как AMP-514; Amplimmune Inc./Medimmune), PDR001 (Novartis), BGB-A317 (BeiGene Ltd.), TSR-042 (также известный как ANB011; AnaptysBio/Tesaro, Inc.), REGN2810 (также известный как цемиплимаб, Regeneron Pharmaceuticals, Inc./Sanofi-Aventis) и PF-06801591 (Pfizer). Дополнительные PD-1-связывающие белки (например, антитела) известны из уровня техники и раскрыты, например, в патентах США №№ 9181342, 8927697, 7488802, 7029674; публикациях заявок на патенты США №№ 2015/0152180, 2011/0171215, 2011/0171220 и публикациях согласно РСТ №№ WO 2004/056875, WO 2015/036394, WO 2010/029435, WO 2010/029434, WO 2014/194302, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки.[0096]PD-1. Programmed cell death protein 1 (PD-1, also known as CD279 and PDCD1) is an inhibitory receptor that negatively regulates the immune system. Unlike CTLA-4, which primarily affects naïve T cells, PD-1 is more widely expressed on immune cells and regulates the activity of mature T cells in peripheral tissues and in the tumor microenvironment. PD-1 inhibits T cell responses by antagonizing T cell receptor signaling. PD-1 has two ligands, PD-L1 and PD-L2. A variety of PD-1-specific immune checkpoint modulators have been developed and can be used as described herein. In some embodiments, the immune checkpoint modulator is an agent that modulates the activity and/or expression of PD-1. In some embodiments, the immune checkpoint modulator is an agent that binds to PD-1 (e.g. anti-PD-1 antibody). In some embodiments, the checkpoint modulator is a PD-1 agonist. In some embodiments, the checkpoint modulator is a PD-1 antagonist. In some embodiments, the immune checkpoint modulator is a PD-1 binding protein (e.g. antibody) selected from the group consisting of pembrolizumab (Keytruda; formerly lambrolizumab; Merck & Co., Inc.), nivolumab (Opdivo; Bristol-Myers Squibb), pidilizumab (CT-011, CureTech), JS-001 (Shanghai Junshi Bioscience Co., Ltd.), SHR-1210 (Incyte/Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.), MEDI0680 (also known as AMP-514; Amplimmune Inc./Medimmune), PDR001 (Novartis), BGB-A317 (BeiGene Ltd.), TSR-042 (also known as ANB011; AnaptysBio/Tesaro, Inc.), REGN2810 (also known as cemiplimab; Regeneron Pharmaceuticals, Inc./Sanofi-Aventis), and PF-06801591 (Pfizer). Additional PD-1 binding proteins (e.g. antibodies) are known in the art and are disclosed, for example, in US patents Nos. 9181342, 8927697, 7488802, 7029674; publications of US patent applications No. 2015/0152180, 2011/0171215, 2011/0171220 and publications under the PCT No. WO 2004/056875, WO 2015/036394, WO 2010/029435, WO 2010/029434, WO 201 4/194302, each of which are incorporated herein by reference.

[0097] PD-L1/PD-L2. Лиганд PD 1 (PD-L1, также известный как B7-H1) и лиганд PD 2 (PD-L2, также известный как PDCD1LG2, CD273 и B7-DC) связываются с рецептором PD-1. Оба лиганда принадлежат к тому же семейству B7, что и белки B7-1 и B7-2, которые взаимодействуют с CD28 и CTLA-4. PD-L1 может экспрессироваться на многих типах клеток, включая, например, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки и иммунные клетки. Связывание PDL-1 снижает выработку IFN, TNF и IL-2 и стимулирует выработку IL10, противовоспалительного цитокина, ассоциированного со снижением реактивности и пролиферации Т-клеток, а также с антигенспецифической анергией Т-клеток. PDL-2 преимущественно экспрессируется на антигенпрезентирующих клетках (APC). Связывание PDL2 также приводит к супрессии Т-клеток, однако если взаимодействия PDL-1-PD-1 подавляют пролиферацию посредством остановки клеточного цикла в фазе G1/G2, было продемонстрировано, что взаимодействие PDL2-PD-1 ингибирует TCR-опосредованную передачу сигнала путем блокирования сигналов B7:CD28 при низких концентрациях антигена и снижает выработку цитокинов при высоких концентрациях антигена. Было разработано множество модуляторов иммунных контрольных точек, специфических для PD-L1 и PD-L2, и их можно применять, как описано в данном документе.[0097] PD-L1/PD-L2 . PD ligand 1 (PD-L1, also known as B7-H1) and PD ligand 2 (PD-L2, also known as PDCD1LG2, CD273 and B7-DC) bind to the PD-1 receptor. Both ligands belong to the same B7 family as the B7-1 and B7-2 proteins, which interact with CD28 and CTLA-4. PD-L1 can be expressed on many cell types, including, for example, epithelial cells, endothelial cells and immune cells. PDL-1 binding reduces the production of IFN, TNF, and IL-2 and stimulates the production of IL10, an anti-inflammatory cytokine associated with decreased T-cell reactivity and proliferation, as well as antigen-specific T-cell anergy. PDL-2 is predominantly expressed on antigen presenting cells (APCs). PDL2 binding also leads to T cell suppression, however, while PDL-1-PD-1 interactions suppress proliferation through cell cycle arrest in G1/G2 phase, PDL2-PD-1 interaction has been demonstrated to inhibit TCR-mediated signaling by blocking B7:CD28 signaling at low antigen concentrations and reduces cytokine production at high antigen concentrations. A variety of PD-L1 and PD-L2 specific immune checkpoint modulators have been developed and can be used as described herein.

[0098] В некоторых вариантах осуществления модулятор иммунных контрольных точек представляет собой средство, которое модулирует активность и/или экспрессию PD-L1. В некоторых вариантах осуществления модулятор иммунных контрольных точек представляет собой средство, которое связывается с PD-L1 (например, антитело к PD-L1). В некоторых вариантах осуществления модулятор контрольных точек представляет собой агонист PD-L1. В некоторых вариантах осуществления модулятор контрольных точек представляет собой антагонист PD-L1. В некоторых вариантах осуществления модулятор иммунных контрольных точек представляет собой PD-L1-связывающий белок (например, антитело или Fc-слитый белок), выбранный из группы, состоящей из дурвалумаба (также известного как MEDI-4736; AstraZeneca/Celgene Corp./Medimmune), атезолизумаба (Тецентрик; также известного как MPDL3280A и RG7446; Genetech Inc.), авелумаба (также известного как MSB0010718C; Merck Serono/AstraZeneca); MDX-1105 (BMS-936559, Medarex/Bristol-Meyers Squibb), AMP-224 (Amplimmune, GlaxoSmithKline), LY3300054 (Eli Lilly and Co.), JS003 (Shanghai Junshi Bioscience Co., Ltd.), SHR-1316 (Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.), KN035 (Alphamab и 3D Medicines) или CK-301 (Checkpoint Therapeutics). Дополнительные PD-L1-связывающие белки известны из уровня техники и описаны, например, в патентах США №№ 2016/0084839, 2015/0355184, 2016/0175397 и публикациях согласно РСТ №№ WO 2014/100079, WO 2016/030350, WO 2013181634, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки.[0098] In some embodiments, the immune checkpoint modulator is an agent that modulates the activity and/or expression of PD-L1. In some embodiments, the immune checkpoint modulator is an agent that binds to PD-L1 (e.g. anti-PD-L1 antibody). In some embodiments, the checkpoint modulator is a PD-L1 agonist. In some embodiments, the checkpoint modulator is a PD-L1 antagonist. In some embodiments, the immune checkpoint modulator is a PD-L1 binding protein (e.g. antibody or Fc fusion protein) selected from the group consisting of durvalumab (also known as MEDI-4736; AstraZeneca/Celgene Corp./Medimmune), atezolizumab (Tecentriq; also known as MPDL3280A and RG7446; Genetech Inc.), avelumab ( also known as MSB0010718C; Merck Serono/AstraZeneca); MDX-1105 (BMS-936559, Medarex/Bristol-Meyers Squibb), AMP-224 (Amplimmune, GlaxoSmithKline), LY3300054 (Eli Lilly and Co.), JS003 (Shanghai Junshi Bioscience Co., Ltd.), SHR-1316 ( Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.), KN035 (Alphamab and 3D Medicines) or CK-301 (Checkpoint Therapeutics). Additional PD-L1 binding proteins are known in the art and are described, for example, in US Patent Nos. 2016/0084839, 2015/0355184, 2016/0175397 and PCT Publications Nos. WO 2014/100079, WO 2016/030350, WO 2013181634, each of which is incorporated herein by reference.

[0099] В некоторых вариантах осуществления модулятор иммунных контрольных точек представляет собой средство, которое модулирует активность и/или экспрессию PD-L2. В некоторых вариантах осуществления модулятор иммунных контрольных точек представляет собой средство, которое связывается с PD-L2 (например, антитело к PD-L2). В некоторых вариантах осуществления модулятор контрольных точек представляет собой агонист PD-L2. В некоторых вариантах осуществления модулятор контрольных точек представляет собой антагонист PD-L2. PD-L2-связывающие белки (например, антитела) известны из уровня техники и описаны, например, в патентах США №№ 9255147, 8188238; публикациях заявок на патенты США №№ 2016/0122431, 2013/0243752, 2010/0278816, 2016/0137731, 2015/0197571, 2013/0291136, 2011/0271358 и публикациях согласно РСТ №№ WO 2014/022758 и WO 2010/036959, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки.[0099] In some embodiments, the immune checkpoint modulator is an agent that modulates the activity and/or expression of PD-L2. In some embodiments, the immune checkpoint modulator is an agent that binds to PD-L2 (e.g. anti-PD-L2 antibody). In some embodiments, the checkpoint modulator is a PD-L2 agonist. In some embodiments, the checkpoint modulator is a PD-L2 antagonist. PD-L2 binding proteins (eg antibodies) are known in the art and are described, for example, in US patents Nos. 9255147, 8188238; publications of US patent applications No. 2016/0122431, 2013/0243752, 2010/0278816, 2016/0137731, 2015/0197571, 2013/0291136, 2011/0271358 and publications according to PCT No. WO 2014/02 2758 and WO 2010/036959, each of which is incorporated herein by reference.

[0100] В определенных вариантах осуществления вводимая доза модулятора иммунных контрольных точек на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% ниже стандартной дозы модулятора иммунных контрольных точек для конкретной формы рака. В определенных вариантах осуществления вводимая доза модулятора иммунных контрольных точек составляет 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%. %, 30 %, 25%, 20 %, 15%, 10% или 5% от стандартной дозы модулятора иммунных контрольных точек для конкретного онкологического нарушения. В одном варианте осуществления, если вводят комбинацию модуляторов иммунных контрольных точек, то по меньшей мере один из модуляторов иммунных контрольных точек вводят в дозе, которая ниже стандартной дозы модулятора иммунных контрольных точек для конкретного онкологического нарушения. В одном варианте осуществления, если вводят комбинацию модуляторов иммунных контрольных точек, то по меньшей мере два из модуляторов иммунных контрольных точек вводят в дозе, которая ниже стандартной дозы модуляторов иммунных контрольных точек для конкретного онкологического нарушения. В одном варианте осуществления, если вводят комбинацию модуляторов иммунных контрольных точек, то по меньшей мере три из модуляторов иммунных контрольных точек вводят в дозе, которая ниже стандартной дозы модулятора иммунных контрольных точек для конкретного онкологического нарушения. В одном варианте осуществления, если вводят комбинацию модуляторов иммунных контрольных точек, то все из модуляторов иммунных контрольных точек вводят в дозе, которая ниже стандартной дозы модуляторов иммунных контрольных точек для конкретного онкологического нарушения. В некоторых вариантах осуществления модулятор иммунных контрольных точек вводят в дозе, которая ниже стандартной дозы модулятора иммунных контрольных точек, и соединение формулы (I) или HQP-1351 вводят в дозе, которая ниже стандартной дозы.[0100] In certain embodiments, the administered dose of the immune checkpoint modulator is 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, or 90% lower than the standard dose of the immune checkpoint modulator for a specific form of cancer. In certain embodiments, the dose of immune checkpoint modulator administered is 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%. %, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, or 5% of the standard immune checkpoint modulator dose for a specific cancer disorder. In one embodiment, if a combination of immune checkpoint modulators is administered, at least one of the immune checkpoint modulators is administered at a dose that is lower than the standard dose of the immune checkpoint modulator for the particular cancer disorder. In one embodiment, if a combination of immune checkpoint modulators is administered, at least two of the immune checkpoint modulators are administered at a dose that is lower than the standard dose of immune checkpoint modulators for the particular cancer disorder. In one embodiment, if a combination of immune checkpoint modulators is administered, at least three of the immune checkpoint modulators are administered at a dose that is lower than the standard dose of the immune checkpoint modulator for the particular cancer disorder. In one embodiment, if a combination of immune checkpoint modulators is administered, all of the immune checkpoint modulators are administered at a dose that is lower than the standard dose of immune checkpoint modulators for the particular cancer disorder. In some embodiments, the immune checkpoint modulator is administered at a dose that is lower than the standard dose of the immune checkpoint modulator, and the compound of formula (I) or HQP-1351 is administered at a dose that is lower than the standard dose.

[0101] Вариант осуществления 22. Способ лечения рака, включающий совместное введение субъекту, нуждающемуся в этом:[0101] Embodiment 22. A method of treating cancer, comprising co-administering to a subject in need thereof:

b) молекулы, являющейся иммунной контрольной точкой, где формула (I) имеет следующую структуру:b) an immune checkpoint molecule, wherein formula (I) has the following structure:

(I),(I),

гдеWhere

[0102] Вариант осуществления 23. Способ согласно варианту осуществления 22, где соединение формулы (I) представляет собой HQP-1351 или его фармацевтически приемлемую соль.[0102] Embodiment 23. The method according to Embodiment 22, wherein the compound of formula (I) is HQP-1351 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[0103] Вариант осуществления 24. Способ согласно вариантам осуществления 21-22, где молекула, являющаяся иммунной контрольной точкой, представляет собой PD-1 или PD-L1.[0103] Embodiment 24. The method of embodiments 21-22, wherein the immune checkpoint molecule is PD-1 or PD-L1.

[0104] Вариант осуществления 25. Способ согласно вариантам осуществления 21-22, где молекула, являющаяся иммунной контрольной точкой, представляет собой PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, TIM-3, LAG3, CD160, 2B4, TGF β, VISTA, BTLA, TIGIT или LAIR1.[0104] Embodiment 25. The method of embodiments 21-22, wherein the immune checkpoint molecule is PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, TIM-3, LAG3, CD160, 2B4 , TGF β, VISTA, BTLA, TIGIT or LAIR1.

[0105] Вариант осуществления 26. Способ согласно вариантам осуществления 21-22, где молекула, являющаяся иммунной контрольной точкой, представляет собой пембролизумаб, ипилимумаб, ниволумаб, атезолизумаб, авелумаб, дурвалумаб, цемиплимаб, лирилумаб, тремелимумаб или пидилизумаб.[0105] Embodiment 26. The method of embodiments 21-22, wherein the immune checkpoint molecule is pembrolizumab, ipilimumab, nivolumab, atezolizumab, avelumab, durvalumab, cemiplimab, lirilumab, tremelimumab, or pidilizumab.

[0106] Вариант осуществления 27. Способ согласно вариантам осуществления 21-22, где молекула, являющаяся иммунной контрольной точкой, представляет собой AMP-224, AMP-514, BGB-A317, цемиплимаб, JS001, PDR-001, PF-06801591, IBI-308, пидилизумаб, SHR-1210 или TSR-042.[0106] Embodiment 27. The method of embodiments 21-22, wherein the immune checkpoint molecule is AMP-224, AMP-514, BGB-A317, cemiplimab, JS001, PDR-001, PF-06801591, IBI -308, pidilizumab, SHR-1210 or TSR-042.

[0107] Вариант осуществления 28. Способ согласно вариантам осуществления 22-27, где рак представляет собой рак молочной железы, рак шейки матки, рак яичника, рак эндометрия, рак предстательной железы, рак толстой кишки, рак мочевого пузыря, метастазы в кости, колоректальный рак, рак пищевода, рак головы и шеи, рак легкого, карциноидную опухоль легкого или карциному желудка.[0107] Embodiment 28. The method of Embodiments 22-27, wherein the cancer is breast cancer, cervical cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, prostate cancer, colon cancer, bladder cancer, bone metastasis, colorectal cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, lung cancer, lung carcinoid tumor or gastric carcinoma.

[0108] Вариант осуществления 29. Способ согласно варианту осуществления 28, где рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого.[0108] Embodiment 29. The method of Embodiment 28, wherein the lung cancer is non-small cell lung cancer.

[0109] Вариант осуществления 30. Способ согласно варианту осуществления 29, где рак легкого представляет собой мелкоклеточный рак легкого.[0109] Embodiment 30. The method of Embodiment 29, wherein the lung cancer is small cell lung cancer.

[0110] Вариант осуществления 31. Способ согласно вариантам осуществления 1-13 и 22-30, где соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль вводят перорально пациентам, нуждающимся в этом.[0110] Embodiment 31. The method according to embodiments 1-13 and 22-30, wherein the compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered orally to patients in need thereof.

[0111] Вариант осуществления 32. Способ согласно любому из пунктов 1-30, где соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль вводят один раз в два дня (QOD) во время 28-дневного цикла лечения.[0111] Embodiment 32. The method according to any of paragraphs 1-30, wherein the compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered once every two days (QOD) during a 28-day treatment cycle.

[0112] Вариант осуществления 33. Способ согласно варианту осуществления 32, где соединение формулы (I) представляет собой HQP-1351.[0112] Embodiment 33. The method according to Embodiment 32, wherein the compound of formula (I) is HQP-1351.

[0113] Вариант осуществления 34. Способ согласно варианту осуществления 32, где HQP-1351 вводят один раз в два дня в количестве, составляющем приблизительно 1 мг, приблизительно 2 мг, приблизительно 4 мг или приблизительно 8 мг.[0113] Embodiment 34. The method of Embodiment 32, wherein HQP-1351 is administered once every two days in an amount of about 1 mg, about 2 mg, about 4 mg, or about 8 mg.

[0114] Вариант осуществления 35. Способ согласно варианту осуществления 32, где HQP-1351 вводят один раз в два дня в количестве, составляющем приблизительно 12 мг или приблизительно 20 мг.[0114] Embodiment 35. The method of Embodiment 32, wherein HQP-1351 is administered once every two days in an amount of about 12 mg or about 20 mg.

[0115] Вариант осуществления 36. Способ согласно варианту осуществления 32, где HQP-1351 вводят один раз в два дня в количестве, составляющем приблизительно 30 мг, приблизительно 40 мг или приблизительно 45 мг.[0115] Embodiment 36. The method of Embodiment 32, wherein HQP-1351 is administered once every two days in an amount of about 30 mg, about 40 mg, or about 45 mg.

[0116] Вариант осуществления 37. Способ согласно варианту осуществления 32, где HQP-1351 вводят один раз в два дня в количестве, составляющем приблизительно 50 мг или приблизительно 60 мг.[0116] Embodiment 37. The method of Embodiment 32, wherein HQP-1351 is administered once every two days in an amount of about 50 mg or about 60 mg.

[0117] В некоторых вариантах осуществления комбинированная терапия для лечения рака предусматривает по меньшей мере один 21-дневный цикл лечения, где соединение формулы (I), такое как HQP-1351, или его фармацевтически приемлемую соль вводят в терапевтически эффективном количестве.[0117] In some embodiments, the combination therapy for treating cancer comprises at least one 21-day treatment cycle wherein a compound of formula (I), such as HQP-1351, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered in a therapeutically effective amount.

[0118] В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество составляет от 0,5 мг до 100 мг, предпочтительно от 1 мг до 80 мг, более предпочтительно от 1 мг до 60 мг, наиболее предпочтительно приблизительно 1 мг, приблизительно 2 мг, приблизительно 4 мг или приблизительно 8 мг.[0118] In some embodiments, the therapeutically effective amount is from 0.5 mg to 100 mg, preferably from 1 mg to 80 mg, more preferably from 1 mg to 60 mg, most preferably about 1 mg, about 2 mg, about 4 mg or approximately 8 mg.

[0119] В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество HQP-1351 составляет приблизительно 12 мг или приблизительно 20 мг.[0119] In some embodiments, the therapeutically effective amount of HQP-1351 is about 12 mg or about 20 mg.

[0120] В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество HQP-1351 составляет приблизительно 30 мг, приблизительно 40 мг или приблизительно 45 мг.[0120] In some embodiments, the therapeutically effective amount of HQP-1351 is about 30 mg, about 40 mg, or about 45 mg.

[0121] В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество HQP-1351 составляет приблизительно 50 мг или приблизительно 60 мг.[0121] In some embodiments, the therapeutically effective amount of HQP-1351 is about 50 mg or about 60 mg.

[0122] В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество HQP-1351 вводят перорально раз в два дня пациенту, нуждающемуся в этом, в течение первых двух последовательных недель из 21-дневного цикла лечения и не вводят во время третьей недели цикла лечения.[0122] In some embodiments, a therapeutically effective amount of HQP-1351 is administered orally every other day to a patient in need thereof during the first two consecutive weeks of a 21-day treatment cycle and is not administered during the third week of the treatment cycle.

[0123] В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I), такое как HQP-1351, или его фармацевтически приемлемую соль вводят пациенту перорально в день 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 из 21-дневного цикла лечения.[0123] In some embodiments, a compound of formula (I), such as HQP-1351, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered orally to a patient on days 1, 3, 5, 7, 9, 11, and 13 of a 21-day treatment cycle.

[0124] В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I), такое как HQP-1351, или его фармацевтически приемлемую соль, не вводят в дни 14-21 из 21-дневного цикла лечения.[0124] In some embodiments, a compound of formula (I), such as HQP-1351, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, is not administered on days 14-21 of a 21-day treatment cycle.

[0125] В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I), такое как HQP-1351, или его фармацевтически приемлемую соль вводят пациенту перорально в количестве, составляющем от приблизительно 50 мг до приблизительно 200 мг, в день 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 из 21-дневного цикла лечения.[0125] In some embodiments, a compound of formula (I), such as HQP-1351, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered orally to a patient in an amount of from about 50 mg to about 200 mg on days 1, 3, 5, 7. 9, 11 and 13 of the 21-day treatment cycle.

[0126] В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I), такое как HQP-1351, или его фармацевтически приемлемую соль вводят пациенту перорально в количестве, составляющем приблизительно 50 мг, в дни 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 из 21-дневного цикла лечения.[0126] In some embodiments, a compound of formula (I), such as HQP-1351, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered orally to a patient in an amount of approximately 50 mg on days 1, 3, 5, 7, 9, 11, and 13 from a 21-day treatment cycle.

[0127] В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I), такое как HQP-1351, или его фармацевтически приемлемую соль вводят пациенту перорально в количестве, составляющем приблизительно 100 мг, в дни 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 из 21-дневного цикла лечения.[0127] In some embodiments, a compound of formula (I), such as HQP-1351, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered orally to a patient in an amount of approximately 100 mg on days 1, 3, 5, 7, 9, 11, and 13 from a 21-day treatment cycle.

[0128] В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I), такое как HQP-1351, или его фармацевтически приемлемую соль вводят пациенту перорально в количестве, составляющем приблизительно 150 мг, в дни 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 из 21-дневного цикла лечения.[0128] In some embodiments, a compound of formula (I), such as HQP-1351, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered orally to a patient in an amount of approximately 150 mg on days 1, 3, 5, 7, 9, 11, and 13 from a 21-day treatment cycle.

[0129] В некоторых вариантах осуществления соединение формулы (I), такое как HQP-1351, или его фармацевтически приемлемую соль вводят пациенту перорально в количестве, составляющем приблизительно 200 мг, в дни 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 из 21-дневного цикла лечения.[0129] In some embodiments, a compound of formula (I), such as HQP-1351, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered orally to a patient in an amount of approximately 200 mg on days 1, 3, 5, 7, 9, 11, and 13 from a 21-day treatment cycle.

[0130] В некоторых вариантах осуществления асциминиб вводят перорально.[0130] In some embodiments, asciminib is administered orally.

[0131] В некоторых вариантах осуществления PD-1 или PD-L1 вводят посредством внутривенной инфузии в количестве, составляющем 200 мг, в день 1 из 21-дневного цикла лечения.[0131] In some embodiments, PD-1 or PD-L1 is administered via intravenous infusion in an amount of 200 mg on day 1 of a 21-day treatment cycle.

[0132] В некоторых вариантах осуществления комбинированная терапия предусматривает по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 день из 21-дневного цикла лечения. В некоторых вариантах осуществления комбинированная терапия продолжается до прогрессирования заболевания или неприемлемой токсичности.[0132] In some embodiments, the combination therapy comprises at least day 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12 of a 21-day treatment cycle. In some embodiments, combination therapy is continued until disease progression or unacceptable toxicity.

[0133] В определенных вариантах осуществления субъекту вводят по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 циклов комбинированной терапии. Субъекта оценивают по критериям ответа в конце каждого цикла. Субъекта также контролируют на всем протяжении каждого цикла в отношении нежелательных явлений (например, свертывания крови, анемии, функции печени и почек и т. д.), чтобы убедиться, что схема лечения адекватно переносится.[0133] In certain embodiments, the subject is administered at least 1, 2, 3, 4, or 5 cycles of the combination therapy. The subject is assessed against response criteria at the end of each cycle. The subject is also monitored throughout each cycle for adverse events (eg, blood clotting, anemia, liver and kidney function, etc.) to ensure that the treatment regimen is adequately tolerated.

[0134] Следующие примеры представлены в целях иллюстрации, а не ограничения.[0134] The following examples are presented for purposes of illustration and not limitation.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

[0135] Пример 1. Анализ антипролиферативного эффекта HQP-1351 для усиления эффекта аллостерического ингибитора в отношении устойчивости, вызванной сочетанными мутациями BCR-ABL[0135] Example 1: Analysis of the antiproliferative effect of HQP-1351 to enhance the effect of an allosteric inhibitor against resistance caused by combined BCR-ABL mutations

СпособыMethods

Антипролиферативный эффект определяли с помощью анализа на основе водорастворимого тетразолия (WST) с использованием набора для подсчета количества клеток Cell Counting Kit-8 (CCK-8, № D3100L4057, Shanghai life ilab bio technology co., LTD, Китай). Клетки высевали в 96-луночные планшеты и обрабатывали различными концентрациями тестируемых готовых продуктов. Эффект комбинации тестировали с использованием 9 различных концентраций асциминиба с 3 фиксированными дозами HQ-P1351. Каждую вариант обработки тестировали в трех повторностях. Затем планшет культивировали при 37ºC с 5% CO₂ в течение 72 часов. В конце вариантов обработки в каждую лунку непосредственно добавляли по 20 мкл/лунка реагента CCK-8. Затем планшет инкубировали при 37ºC с 5% CO₂ в течение 2-4 ч. Значение OD выявляли при 450 нм на ридере для микропланшетов (SpectraMax I3X, Molecular Devices, США). Значения IC₅₀ рассчитывали с помощью программного обеспечения Graphpad Prism 7.0 с использованием анализа данных типа нелинейной регрессии (аппроксимация кривых). Для анализа комбинированного эффекта жизнеспособность клеток нормализовали с использованием среднего значения OD трех повторов лунок для контроля с одним средством. Синергизм между двумя соединениями выявляли, если расчетная IC₅₀ кривых для комбинаций была меньше, чем IC₅₀ отдельного средства (кривые комбинации сдвигались влево), а индекс аддитивности (CI) составлял менее 1,0 (Calcusyn, версия 2.0, Zhou).The antiproliferative effect was determined by water-soluble tetrazolium (WST) assay using Cell Counting Kit-8 (CCK-8, No. D3100L4057, Shanghai life ilab bio technology co., LTD, China). Cells were seeded in 96-well plates and treated with varying concentrations of the finished products tested. The effect of the combination was tested using 9 different concentrations of asciminib with 3 fixed doses of HQ-P1351. Each treatment was tested in triplicate. The plate was then cultured at 37ºC with 5% CO ₂ for 72 hours. At the end of the treatments, 20 μl/well of CCK-8 reagent was directly added to each well. The plate was then incubated at 37ºC with 5% CO ₂ for 2-4 hours. The OD value was detected at 450 nm on a microplate reader (SpectraMax I3X, Molecular Devices, USA). IC ₅₀ values were calculated using Graphpad Prism 7.0 software using nonlinear regression type data analysis (curve fitting). To analyze the combined effect, cell viability was normalized using the average OD value of triplicate single-treatment control wells. Synergism between two compounds was detected if the calculated IC ₅₀ curves for the combinations were less than the IC ₅₀ of the individual agent (combination curves shifted to the left) and the additivity index (CI) was less than 1.0 (Calcusyn, version 2.0, Zhou).

Анализ методом проточной цитометрииFlow cytometry analysis

Апоптотические клетки определяли с использованием набора для окрашивания с помощью аннексина V-PI (йодид пропидия) (№ C1062L, Beyotime Biotechnology, Китай). Вкратце, клетки собирали после обработки тестируемыми готовыми продуктами в течение указанного времени и промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). Затем клетки окрашивали аннексином-V и PI и анализировали с помощью проточного цитометра (CytoFLEX, Beckman, США). Профили апоптоза получали посредством анализа 10000 клеток на обработку.Apoptotic cells were detected using Annexin V-PI (propidium iodide) staining kit (No. C1062L, Beyotime Biotechnology, China). Briefly, cells were harvested after treatment with the test finished products for the indicated times and washed with phosphate-buffered saline (PBS). The cells were then stained with Annexin-V and PI and analyzed using a flow cytometer (CytoFLEX, Beckman, USA). Apoptosis profiles were obtained by analyzing 10,000 cells per treatment.

Анализ методом вестерн-блоттингаWestern blot analysis

После обработки тестируемыми готовыми продуктами в течение указанного времени культивируемые клетки собирали и промывали с помощью PBS, охлажденного льдом. Клеточные осадки лизировали в буфере RIPA, содержащем 1% PMSF и 1% ингибиторов протеазы. Концентрацию белка определяли с использованием набора для анализа белка с использованием BCA (№ P0011, Beyotime Biotechnology, Китай). Лизаты клеток (20-50 мкг) разделяли на 8-12% SDS-PAGE. Разделенные белки переносили на мембрану из PVDF (№ 10600023, Amersham, США). Мембрану из PVDF промокали 1% буфером BSA в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембрану инкубировали с первичным антителом в 1 x TBST с 5% BSA при 4°C в течение ночи. Мембрану промывали с помощью 1 x TBST 3 раза. Мембрану инкубировали с HRP-конъюгированным вторичным антителом в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембрану промывали с помощью 1 x TBST 3 раза. Сигналы визуализировали с помощью Super ECL plus (№ 36208ES76, Yeasen Biotech, Китай) и системы визуализации (Azure C300, Azure Biosystems, США).After treatment with the test finished products for the indicated times, the cultured cells were harvested and washed with ice-cold PBS. Cell pellets were lysed in RIPA buffer containing 1% PMSF and 1% protease inhibitors. Protein concentration was determined using a BCA protein assay kit (No. P0011, Beyotime Biotechnology, China). Cell lysates (20–50 μg) were separated on 8–12% SDS-PAGE. The separated proteins were transferred to a PVDF membrane (No. 10600023, Amersham, USA). The PVDF membrane was blotted with 1% BSA buffer for 1 h at room temperature. The membrane was incubated with the primary antibody in 1x TBST with 5% BSA at 4°C overnight. The membrane was washed with 1 x TBST 3 times. The membrane was incubated with HRP-conjugated secondary antibody for 1 h at room temperature. The membrane was washed with 1 x TBST 3 times. Signals were visualized using Super ECL plus (No. 36208ES76, Yeasen Biotech, China) and an imaging system (Azure C300, Azure Biosystems, USA).

Эффективность in vivo в ортотопических моделяхIn vivo efficacy in orthotopic models

Эффективность in vivo оценивали с использованием сингенной мышиной модели, полученной за счет клеток BaF3 с T315I и/или сочетанными мутациями. Модели опухолей создавали посредством внутривенной инъекции опухолевых клеток (1×10⁵/мышь) в хвостовую вену в стерильных условиях. Мышей случайным образом распределяли на контрольную группу и группу лечения по 8-10 мышей в группе и начинали лечение со второго дня после инокуляции. Значения веса тела животных измеряли два раза в неделю. Кривые противоопухолевой активности тестируемых готовых продуктов строили с временем лечения (дни) на оси X и соответствующей коэффициентом выживаемости на оси Y. Проверку с помощью логрангового критерия (Мантеля-Кокса) использовали для анализа статистической значимости любых различий между группой лечения и контрольной группой. Prism версии 7 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) использовали для всего статистического анализа и для графического представления. In vivo efficacy was assessed using a syngeneic mouse model derived from BaF3 cells with T315I and/or combined mutations. Tumor models were created by intravenous injection of tumor cells (1×10 ⁵ /mouse) into the tail vein under sterile conditions. The mice were randomly assigned to a control group and a treatment group, 8–10 mice per group, and treatment was started on the second day after inoculation. Animals' body weights were measured twice a week. Antitumor activity curves of the finished products tested were plotted with treatment time (days) on the x-axis and the corresponding survival rate on the y-axis. The log-rank (Mantel-Cox) test was used to analyze the statistical significance of any differences between the treatment group and the control group. Prism version 7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) was used for all statistical analyzes and for graphical presentation.

Результатыresults

Серию линий клеток, экспрессирующих одиночные или сочетанные мутации BCR-ABL, конструировали на основе линии клеток мыши про-B BaF3. Эффект HQP-1351 в качестве отдельного средства или в комбинации с асциминибом анализировали с использованием анализа антипролиферативного эффекта, анализов методом вестерн-блота и FACS in vitro. Клеточные исследования антипролиферативного эффекта продемонстрировали превосходную активность HQP-1351 в отношении одиночных или сочетанных мутаций BCR-ABL со значениями IC₅₀, находящимися в диапазоне 6-300 нМ. В частности, HQP-1351 был более эффективным, чем понатиниб, асциминиб и другие TKI, в отношении этих сочетанных мутаций. Более того, комбинация HQP-1351 с асциминибом была высокоэффективной в отношении сочетанных мутаций в BCR-ABL, особенно тех, которые содержат T315I.A series of cell lines expressing single or combined BCR-ABL mutations were constructed from the mouse pro-B cell line BaF3. The effect of HQP-1351 as a single agent or in combination with asciminib was analyzed using antiproliferative effect assay, Western blot and in vitro FACS assays. Cellular antiproliferative studies demonstrated superior activity of HQP-1351 against single or combined BCR-ABL mutations with IC ₅₀ values ranging from 6-300 nM. Specifically, HQP-1351 was more effective than ponatinib, asciminib, and other TKIs against these co-mutations. Moreover, the combination of HQP-1351 with asciminib was highly effective against co-mutations in BCR-ABL, especially those containing T315I.

Исследования in vivo дополнительно показали, что совместное введение HQP-1351 с асциминибом (ABL001) приводило в результате к значительному повышению выживаемости по сравнению с таковой в случае отдельных средств. Важно отметить, что противоопухолевый эффект был более сильным, чем таковой понатиниба плюс асциминиба в моделях, несущих T315I или сочетанные мутации. Результаты показаны в таблицах 1-6 и на фигурах 1-11. In vivo studies further showed that co-administration of HQP-1351 with asciminib (ABL001) resulted in significantly improved survival compared with that of the individual agents. Importantly, the antitumor effect was greater than that of ponatinib plus asciminib in models harboring T315I or co-mutations. The results are shown in Tables 1-6 and Figures 1-11.

Результат исследования также показан на фигурах 8А и 8В.The result of the study is also shown in Figures 8A and 8B.

Результат исследования также показан на фигурах 9A и 9B.The result of the study is also shown in Figures 9A and 9B.

Результат исследования также показан на фигурах 10A и 10B.The result of the study is also shown in Figures 10A and 10B.

Результат исследования также показан на фигурах 11A и 11B.The result of the study is also shown in Figures 11A and 11B.

ЗаключениеConclusion

Результаты продемонстрировали, что комбинация ингибитора АТФ-связывающего сайта олверембатиниба и аллостерического ингибитора оказывает синергический противоопухолевый эффект в отношении опухолевых клеток, несущих одиночные или сочетанные мутации в BCR-ABL. Без ограничения теорией, комбинированное лечение обеспечивало синергическое снижение уровня фосфорилирования BCR-ABL и расположенных ниже в цепи передачи сигнала белков CRKL и STAT5, а усиленное расщепление Caspase-3 и PARP-1 запускало таким образом апоптоз и впоследствии усиливало противоопухолевые эффекты. Эта новая стратегия может помочь преодолеть вторичные сочетанные мутации после лечения с помощью TKI.The results demonstrated that the combination of the ATP-binding site inhibitor olverembatinib and an allosteric inhibitor has a synergistic antitumor effect against tumor cells harboring single or combined mutations in BCR-ABL. Without being limited by theory, combination treatment synergistically reduced phosphorylation of BCR-ABL and the downstream proteins CRKL and STAT5, and increased cleavage of Caspase-3 and PARP-1 thereby triggered apoptosis and subsequently enhanced antitumor effects. This new strategy may help overcome secondary co-mutations after TKI treatment.

[0136] Пример 2. Исследование HQP-1351 в качестве ингибитора SRC, который повышает противоопухолевый иммунитет при немелкоклеточном раке легкого[0136] Example 2: Study of HQP-1351 as an SRC inhibitor that enhances antitumor immunity in non-small cell lung cancer

Общий способGeneral method

Анализ цитотоксичности использовали для определения проявлений противоопухолевой активности HQP-1351 в линиях клеток NSCLC. Кроме того, экспрессию PD-L1 в клетках, обработанных с помощью HQP-1351, исследовали с помощью вестерн-блота, количественной ПЦР и проточной цитометрии. В дополнение, эффекты HQP-1351 отдельно или в комбинации с ICI в отношении усиления противоопухолевого иммунитета также были определены in vitro и in vivo. Для изучения основных механизмов применяли технику манипуляции генами для получения клеток NSCLC со стабильным нокдауном SRC.A cytotoxicity assay was used to determine the expression of antitumor activity of HQP-1351 in NSCLC cell lines. In addition, the expression of PD-L1 in cells treated with HQP-1351 was examined by Western blot, qPCR and flow cytometry. In addition, the effects of HQP-1351 alone or in combination with ICI in enhancing antitumor immunity have also been determined in vitro and in vivo . To study the underlying mechanisms, gene manipulation techniques were used to generate NSCLC cells with stable knockdown of SRC.

Культура клеток и регентыCell culture and reagents

Линии клеток NSCLC (A549, H1299, H460), линию клеток рака легкого Льюиса (LLC) и линию Т-клеток 293 получили из Американской коллекции типовых культур (ATCC, США) и валидировали с помощью анализа коротких тандемных повторов (STR). Клетки культивировали либо в среде RPMI-1640 (для линий клеток NSCLC), либо в среде DMEM (для клеток LLC и Т-клеток 293), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, и поддерживали при 37°C в увлажняемом инкубаторе с 5% CO2. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) культивировали в среде для Т-клеток (RPMI-1640 с добавлением 10% человеческой сыворотки крови, 5% раствора L-глутамина-пенициллина-стрептомицина (Sigma-Aldrich, США) и IL-2 (100 МЕ/мл). HQP-1351 был предоставлен Ascentage Pharma Group Inc. Для исследований in vitro HQP-1351 растворяли в DMSO при концентрации 10 мкМ и хранили при -20°C. Для исследований in vivo HQP-1351 растворяли в 0,2% HPMC.NSCLC cell lines (A549, H1299, H460), Lewis lung cancer cell line (LLC) and T cell line 293 were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, USA) and validated using short tandem repeat (STR) analysis. Cells were cultured in either RPMI-1640 (for NSCLC cell lines) or DMEM (for LLC cells and 293 T cells) containing 10% fetal bovine serum and maintained at 37°C in a humidified incubator with 5% CO2 . Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were cultured in T cell medium (RPMI-1640 supplemented with 10% human serum, 5% L-glutamine-penicillin-streptomycin solution (Sigma-Aldrich, USA) and IL-2 (100 IU /ml).HQP-1351 was provided by Ascentage Pharma Group Inc. For in vitro studies, HQP-1351 was dissolved in DMSO at a concentration of 10 μM and stored at -20°C. For in vivo studies, HQP-1351 was dissolved in 0.2% HPMC .

Анализы жизнеспособности клетокCell Viability Assays

Клетки культивировали при плотности 3 × 10³ клеток на лунку, содержащую 200 мкл культивирующей среды, в 96-луночных планшетах в течение 12 часов. После прилипания клетки предварительно обрабатывали с помощью HQP-1351 в указанной концентрации в течение 72 часов. Добавляли 20 мкл реагентов CCK8 (Dojindo Laboratories, Япония) к 200 мкл питательной среды на лунку и инкубировали в течение 2-4 ч при 37°С. Затем измеряли значение поглощения с помощью спектрофотометра при 450 нм. Все эксперименты выполняли в 3 повторах на испытание и осуществляли их не менее трех раз. Кривые доза-ответ и значения полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50) анализировали с помощью нелинейной регрессии на GraphPad Prism версии 8.0.Cells were cultured at a density of 3 × 10 ³ cells per well containing 200 μl of culture medium in 96-well plates for 12 hours. After adherence, cells were pretreated with HQP-1351 at the indicated concentration for 72 h. 20 μl of CCK8 reagents (Dojindo Laboratories, Japan) was added to 200 μl of culture medium per well and incubated for 2–4 h at 37°C. Then the absorbance value was measured using a spectrophotometer at 450 nm. All experiments were performed in triplicate per test and were performed at least three times. Dose-response curves and half-maximal inhibitory concentration (IC50) values were analyzed using nonlinear regression on GraphPad Prism version 8.0.

Анализ методом вестерн-блотWestern blot analysis

Клетки обрабатывали указанными концентрациями и дважды промывали холодным PBS. Экстракты цельных клеток собирали в буфере для лизиса RIPA (Santa Cruz Biotechnology, Германия) и измеряли концентрацию белка в лизатах с использованием набора для анализа белков BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher, США). Образцы белка подвергали электрофорезу через 10% гель SDS-PAGE и переносили на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) (Roche, США). После блокирования мембраны зондировали первичными антителами (1:1000) к SRC, p-SRC, PD-L1, GAPDH, β-тубулину (Cell Signaling Technology, США) с последующей промывкой и инкубацией со вторичным антителом (1:5000), конъюгированным с пероксидазой хрена (Santa Cruz Biotechnology, США). Белковые полосы визуализировали путем применения хемилюминесцентного реагента (набор Pierce ECL, Thermo Fisher Scientific, США) и уровень белка определяли количественно с помощью Image Lab (Bio-Rad Laboratory, США).Cells were treated with the indicated concentrations and washed twice with cold PBS. Whole cell extracts were collected in RIPA lysis buffer (Santa Cruz Biotechnology, Germany) and the protein concentration of the lysates was measured using the BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher, USA). Protein samples were electrophoresed through a 10% SDS-PAGE gel and transferred to a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Roche, USA). After blocking, the membranes were probed with primary antibodies (1:1000) to SRC, p-SRC, PD-L1, GAPDH, β-tubulin (Cell Signaling Technology, USA), followed by washing and incubation with a secondary antibody (1:5000) conjugated to horseradish peroxidase (Santa Cruz Biotechnology, USA). Protein bands were visualized using a chemiluminescent reagent (Pierce ECL kit, Thermo Fisher Scientific, USA) and protein levels were quantified using Image Lab (Bio-Rad Laboratory, USA).

Экстракция РНК и количественная ПЦР в реальном времениRNA extraction and quantitative real-time PCR

Общую клеточную РНК выделяли с помощью Trizol (Invitrogen, США) для анализа мРНК. РНК подвергали обратному транскрибированию с получением профиля кДНК с использованием набора для синтеза кДНК Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit (Roche Applied Science, США), а затем реакции ПЦР в реальном времени осуществляли с использованием реагента FastStart SYBR Green Master (ROX) (Roche Applied Science, США) в соответствии с инструкциями производителя. Анализ методом ПЦР в реальном времени осуществляли с использованием системы Biorad CFX96 с SYBR green (Bio-Rad, США) и соответствующими праймерами для оценки уровня экспрессии мРНК SRC. Данные нормализовали по уровням GAPDH в образцах в трех повторах. Праймеры были следующими:Total cellular RNA was isolated using Trizol (Invitrogen, USA) for mRNA analysis. The RNA was reverse transcribed to produce a cDNA profile using the Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit (Roche Applied Science, USA), and then real-time PCR reactions were performed using FastStart SYBR Green Master (ROX) reagent (Roche Applied Science , USA) in accordance with the manufacturer's instructions. Real-time PCR analysis was performed using a Biorad CFX96 system with SYBR green (Bio-Rad, USA) and appropriate primers to assess the expression level of SRC mRNA. Data were normalized to GAPDH levels in triplicate samples. The primers were as follows:

SRC: прямой: GAGCGGCTCCAGATTGTCAA (SEQ ID NO: 1),SRC: straight: GAGCGGCTCCAGATTGTCAA (SEQ ID NO: 1),

обратный: CTGGGGATGTAGCCTGTCTGT (SEQ ID NO: 2);reverse: CTGGGGATGTAGCCTGTCTGT (SEQ ID NO: 2);

PDL1: прямой: TATGGTGGTGCCGACTACAA (SEQ ID NO: 3),PDL1: straight: TATGGTGGTGCCGACTACAA (SEQ ID NO: 3),

обратный: TGCTTGTCCAGATGACTTCG (SEQ ID NO: 4);reverse: TGCTTGTCCAGATGACTTCG (SEQ ID NO: 4);

GAPDH: прямой: GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG (SEQ ID NO: 5),GAPDH: direct: GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG (SEQ ID NO: 5),

обратный: CCTGGAAGATGGTGATGGGATT (SEQ ID NO: 6).reverse: CCTGGAAGATGGTGATGGGATT (SEQ ID NO: 6).

Трансфекция shRNA и плазмидной ДНКTransfection of shRNA and plasmid DNA

Осуществляли временную трансфекцию с помощью shRNA SRC и скрембл-контроля shRNA (GeneCopoeia, США) вместе с набором для упаковывания pSIH-H1-puro Lentivector Packaging Kit (System Biosciences, США). Процедуры трансфекции осуществляли в Т-клетках 293, выращенных до достижения степени формирования клеточного монослоя, составляющей ~80%, в чашках с диаметром 10 см с использованием реагента для трансфекции Lipofectamine 2000 (Life Technologies, США) и следуя инструкциям производителя. Клетки Н460 и Н1299 инфицировали и инкубировали с вирусными частицами в течение ночи при 37°С. Через 48 ч после трансфекции клетки подвергали пуромициновому отбору путем добавления в среду для роста пуромицина (1,5 мкг/мл для Н460 и 2 мкг/мл для Н1299). Стабильное подавление экспрессии генов подтверждалось посредством вестерн-блоттинга и RT-PCR.Transient transfection was carried out using shRNA SRC and scramble control shRNA (GeneCopoeia, USA) together with the pSIH-H1-puro Lentivector Packaging Kit (System Biosciences, USA). Transfection procedures were performed in 293 T cells grown to ~80% cell monolayer formation in 10 cm dishes using Lipofectamine 2000 transfection reagent (Life Technologies, USA) and following the manufacturer's instructions. H460 and H1299 cells were infected and incubated with viral particles overnight at 37°C. At 48 h posttransfection, cells were subjected to puromycin selection by adding puromycin (1.5 μg/ml for H460 and 2 μg/ml for H1299) to the growth medium. Stable downregulation of gene expression was confirmed by Western blotting and RT-PCR.

Анализ образования колонийColony formation assay

В качестве эффекторных клеток РВМС человека очищали из крови здоровых добровольцев с использованием центрифугирования в градиенте фиколла (Solarbio, Пекин). Чистота выделенных клеток составляла > 95%, как определено с помощью проточной цитометрии (FCM). Линии клеток NSCLC высевали в 96-луночный планшет, обработанный или не обработанный с помощью HQP-1351. Мононуклеарные клетки периферической крови человека активировали с помощью 100 нг/мл антитела к CD3, 100 нг/мл антитела к CD28 и 10 нг/мл IL-2, а затем культивировали совместно с клетками NSCLC. Клетки обрабатывали или не обрабатывали с помощью Ab к PD-L1 и культивировали совместно с активированными PBMC при нескольких соотношениях мишень-эффектор (1:0, 1:1, 1:4, 1:16) (все образцы в трех повторах). После 4 дней совместной инкубации лунки 24-луночных планшетов промывали дважды с помощью PBS для удаления PBMC, а затем выжившие опухолевые клетки фиксировали и окрашивали окрашивающим раствором Гимза. Высушенные пластины сканировали и количественно определяли интенсивность.As effector cells, human PBMCs were purified from the blood of healthy volunteers using Ficoll gradient centrifugation (Solarbio, Beijing). The purity of isolated cells was >95% as determined by flow cytometry (FCM). NSCLC cell lines were seeded in a 96-well plate treated or not with HQP-1351. Human peripheral blood mononuclear cells were activated with 100 ng/ml anti-CD3, 100 ng/ml anti-CD28, and 10 ng/ml IL-2 and then cocultured with NSCLC cells. Cells were treated or not with PD-L1 Ab and cocultured with activated PBMCs at several target-effector ratios (1:0, 1:1, 1:4, 1:16) (all samples in triplicate). After 4 days of co-incubation, wells of 24-well plates were washed twice with PBS to remove PBMCs, and then surviving tumor cells were fixed and stained with Giemsa staining solution. The dried plates were scanned and the intensity was quantified.

Активированные РВМС высевали при плотности 1 × 106/лунка в 6-луночные планшеты, а затем культивировали совместно с опухолевыми клетками, предварительно обработанными с помощью HQP-1351, при соотношении 4:1 в течение 24 ч. В соответствующие лунки добавляли антитело к человеческому PD-L1, атезолизумаб (Selleck Chemicals, США) (50 мкг/мл). После совместного культивирования выделяли PBMC и окрашивали с помощью антител к CD3 и к CD8 для оценки доли CD8+ клеток. Для анализа на IFN-γ, TNF-α и гранзим B собирали PBMC, а затем обрабатывали брефельдином A (Biolegend, США) при 37°C в течение дополнительных 3 ч для предупреждения внеклеточной секреции. Затем РВМС фиксировали и пермеабилизировали с помощью набора буферов для внутриклеточной фиксации и пермеабилизации Intracellular Fixation and Permeabilization Buffer Set Kit (eBioscience, США) в соответствии с инструкциями производителя. Затем осуществляли мечение посредством внутриклеточного окрашивания и выявление с помощью проточной цитометрии для определения процентного содержания клеток, положительных по IFN-γ, TNF или гранзиму B, среди CD8+ T-клеток. Антитела для анализа методом проточной цитометрии приобретали у eBiosciences, США. Совпадающие изотипические контроли использовали для каждого антитела для определения гейтов. Для анализа данных проточной цитометрии использовали программу FlowJo (Treestar, США). Стандартизированные значения интенсивности флуоресценции рассчитывали путем деления медианных значений интенсивности флуоресценции специфических антител на медианные значения интенсивности флуоресценции изотипических контролей. Результаты выражали как среднее ± стандартное отклонение по трем независимым экспериментам.Activated PBMCs were seeded at a density of 1 × 106/well in 6-well plates and then cocultured with tumor cells pretreated with HQP-1351 at a ratio of 4:1 for 24 h. Anti-human PD antibody was added to the appropriate wells -L1, atezolizumab (Selleck Chemicals, USA) (50 μg/ml). After coculture, PBMCs were isolated and stained with anti-CD3 and anti-CD8 antibodies to assess the proportion of CD8+ cells. For analysis of IFN-γ, TNF-α and granzyme B, PBMCs were collected and then treated with brefeldin A (Biolegend, USA) at 37°C for an additional 3 h to prevent extracellular secretion. PBMCs were then fixed and permeabilized using the Intracellular Fixation and Permeabilization Buffer Set Kit (eBioscience, USA) according to the manufacturer's instructions. Labeling by intracellular staining and detection by flow cytometry were then performed to determine the percentage of cells positive for IFN-γ, TNF, or granzyme B among CD8+ T cells. Antibodies for flow cytometry analysis were purchased from eBiosciences, USA. Matched isotype controls were used for each antibody to determine gates. FlowJo software (Treestar, USA) was used to analyze flow cytometry data. Standardized fluorescence intensities were calculated by dividing the median fluorescence intensities of specific antibodies by the median fluorescence intensities of isotype controls. Results were expressed as mean ± standard deviation from three independent experiments.

Исследования на мышах Mouse studies in vivoin vivo

Мышей C57BL/6 получали от Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd (Пекин, Китай) и содержали в специальном барьерном помещении, свободном от патогенов (SPF), в Центре животных Онкологического центра Университета Сунь Ятсена. Для всех экспериментов на животных использовали самок мышей в возрасте 8-12 недель. Эксперименты были одобрены институциональным комитетом Онкологического центра Университета Сунь Ятсена и проводились в соответствии с протоколами, одобренными Комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных провинции Гуандун.C57BL/6 mice were obtained from Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd (Beijing, China) and maintained in a special pathogen-free (SPF) barrier facility at the Animal Center of Sun Yat-sen University Cancer Center. Female mice aged 8–12 weeks were used for all animal experiments. The experiments were approved by the institutional committee of Sun Yat-sen University Cancer Center and were conducted in accordance with protocols approved by the Guangdong Provincial Laboratory Animal Care and Use Committee.

Клетки LLC (10 × 10⁵ клеток в 200 мкл среды для роста) вводили подкожно в правый бок иммунокомпетентным мышам C57BL/6. Рост опухоли измеряли штангенциркулем каждые 3 дня, а объемы опухоли рассчитывали по следующей формуле: 1/2 (длина х ширина2). Когда опухоли достигали приблизительно 100 мм3, мышей случайным образом распределяли в контрольную или экспериментальную группы. Терминальное событие определяли как опухоль, достигавшую размера 2000 мм3, после чего животных подвергали эвтаназии.LLC cells (10 × 10 ⁵ cells in 200 μl of growth medium) were injected subcutaneously into the right flank of immunocompetent C57BL/6 mice. Tumor growth was measured with a caliper every 3 days, and tumor volumes were calculated using the following formula: 1/2 (length x width2). When tumors reached approximately 100 mm3, mice were randomly assigned to control or experimental groups. A terminal event was defined as a tumor reaching a size of 2000 mm3, after which the animals were euthanized.

Мышей обрабатывали с помощью HQP-1351 или крысиного антитела к PD-L1 (αPD-L1, клон 10F.9G2; BioLegend, США) отдельно, с помощью комбинации HQP-1351 и αPD-L1 или физиологического раствора и IgG2bκ (клон RTK4530; BioLegend, США). HQP-1351 (50 мг/кг) вводили через желудочный зонд с дня 13 каждый день после имплантации опухоли. Средство терапии на основе антитела к PD-L1 (10 мг/кг) вводили внутрибрюшинно еженедельно в дни 16, 23, 30, 37 и 44. Анализ выживаемости выполняли с использованием анализа Каплана-Мейера и логарифмического рангового критерия.Mice were treated with HQP-1351 or rat anti-PD-L1 antibody (αPD-L1, clone 10F.9G2; BioLegend, USA) alone, with a combination of HQP-1351 and αPD-L1, or saline and IgG2bκ (clone RTK4530; BioLegend , USA). HQP-1351 (50 mg/kg) was administered via gastric tube from day 13 every day after tumor implantation. Anti-PD-L1 antibody therapy (10 mg/kg) was administered intraperitoneally weekly on days 16, 23, 30, 37, and 44. Survival analysis was performed using Kaplan-Meier analysis and the log-rank test.

Статистический анализStatistical analysis

Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения IBM SPSS Statistics 19 или GraphPad Prism с использованием t-критерия Стьюдента, или однофакторного ANOVA, или критерия Даннета. Все эксперименты повторяли в трех повторах. Данные выражали как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Статистическую значимость определяли как P < 0,05.Statistical analysis was performed using IBM SPSS Statistics 19 or GraphPad Prism software using Student's t test or one-way ANOVA or Dunnett's test. All experiments were repeated in triplicate. Data were expressed as mean ± standard deviation (SD). Statistical significance was defined as P < 0.05.

Результатыresults

HQP-1351 усиливает эффективность антитела к PD-L1 in vitroHQP-1351 enhances the effectiveness of anti-PD-L1 antibody in vitro

Во-первых, чтобы исключить какие-либо основные отклонения, обусловленные изменчивостью уровня подавления роста, индуцируемого HQP-1351, авторы настоящего изобретения строили кривые ингибирования роста для различных линий клеток и установили ингибирующую концентрацию 50% (IC50) (фиг. 1а). Затем, чтобы выяснить, мог ли HQP-1351 в комбинации с блокадой PD-1/PD-L1 оказывать синергический иммунотерапевтический эффект, авторы настоящего изобретения протестировали эффективность комбинированного применения HQP-1351 и блокирующих антител к PD-L1 in vitro. HQP-1351 в комбинации с антителом к PD-L1 (атезолизумабом) продемонстрировал значительно более высокий уровень ингибирования роста опухоли по сравнению с HQP-1351 отдельно или блокадой PD-L1 отдельно. На фигурах 12A-C показано, что HQP-1351 усиливает эффективность антитела к PD-L1 in vitro. Цитотоксичность HQP-1351 в отношении различных человеческих раковых клеток определяли с помощью CCK8, как описано в материалах и способах. Каждая точка представляла собой среднее ± стандартное отклонение (SD) по проведенным трем независимым экспериментам. (B-C). Тест на цитотоксичность Т-клеток с помощью анализа образования колоний. Оценивали выживаемость клеток H460 и H1299, предварительно обработанных с помощью HQP-1351, клеток без предварительной обработки, обработанных с помощью Ab к PD-1 или без такой обработки и совместно культивируемых с РВМС (клетки-мишени:эффекторные клетки = 1:0, 1:1, 1:4, 1:8) в 24-луночных планшетах в течение 4 дней.First, to exclude any underlying bias due to variability in the level of growth inhibition induced by HQP-1351, we generated growth inhibition curves for different cell lines and set the inhibitory concentration to 50% (IC50) (Fig. 1a). Next, to investigate whether HQP-1351 in combination with PD-1/PD-L1 blockade could produce a synergistic immunotherapeutic effect, we tested the efficacy of the combined use of HQP-1351 and PD-L1 blocking antibodies in vitro. HQP-1351 in combination with an anti-PD-L1 antibody (atezolizumab) demonstrated significantly greater tumor growth inhibition compared with HQP-1351 alone or PD-L1 blockade alone. Figures 12A-C show that HQP-1351 enhances the effectiveness of anti-PD-L1 antibody in vitro . The cytotoxicity of HQP-1351 against various human cancer cells was determined using CCK8 as described in Materials and Methods. Each point represents the mean ± standard deviation (SD) of three independent experiments. (BC). T cell cytotoxicity test using colony formation assay. Survival of H460 and H1299 cells pretreated with HQP-1351, cells without pretreatment, treated with or without anti-PD-1 Ab, and cocultured with PBMCs (target cells:effector cells = 1:0, 1) was assessed. :1, 1:4, 1:8) in 24-well plates for 4 days.

HQP-1351 усиливает эффективность антитела к PD-L1 in vivoHQP-1351 enhances the effectiveness of anti-PD-L1 antibody in vivo

Среди несущих опухоли мышей с клетками LLC, у мышей, получавших лечение с помощью HQP-1351 плюс Ab к PD-L1, наблюдалась более значительная задержка роста опухоли (фиг. 2a-c) по сравнению с мышами, получавшими монотерапию с помощью HQP-1351 или Ab к PD-L1. Между тем, у подопытных мышей не наблюдалось значительной потери веса тела, что позволило предположить, что комбинированная схема относительно хорошо переносилась мышами. На фигурах 13A-F показано, что HQP-1351 усиливает эффективность антитела к PD-L1 in vivo. Объемы опухолей определяли в указанные дни при различных вариантах обработки у мышей C57BL/6 (n=5). Планки погрешностей представляют SEM по трем независимым экспериментам. (B) Изменение веса тела мышей C57BL/6 при различных вариантах обработки (n=5).Among tumor-bearing LLC cell-bearing mice, mice treated with HQP-1351 plus Ab to PD-L1 had a greater delay in tumor growth (Fig. 2a-c) compared to mice treated with HQP-1351 monotherapy or Ab to PD-L1. Meanwhile, the test mice did not experience significant loss of body weight, suggesting that the combination regimen was relatively well tolerated by the mice. Figures 13A-F show that HQP-1351 enhances the effectiveness of the anti-PD-L1 antibody in vivo . Tumor volumes were determined on the indicated days for different treatments in C57BL/6 mice (n=5). Error bars represent SEM from three independent experiments. (B) Changes in body weight of C57BL/6 mice across treatments (n=5).

HQP-1351 подавляет экспрессию p-STAT3 и PD-L1 в зависимости от дозы и времени.HQP-1351 suppresses the expression of p-STAT3 and PD-L1 in a dose- and time-dependent manner.

Для дальнейшего изучения потенциального механизма усиления антитела к PD-L1 с помощью HQP-1351 авторы настоящего изобретения дополнительно проверили ингибирующий эффект HQP-1351 в отношении экспрессии PD-L1. После обработки с помощью HQP-1351 в различных концентрациях авторы настоящего изобретения наблюдали, что HQP-1351 обеспечивал снижение уровня экспрессии PD-L1, а также фосфорилирования p-SRC в зависимости от концентрации в линиях клеток NSCLC (фигура 14A). Более того, клетки, обработанные с помощью 2 мкМ HQP-1351 в различные моменты времени, показали зависимое от времени подавление уровней PD-L1 и p-SRC (фигура 14B). Чтобы протестировать это, авторы настоящего изобретения также выполняли анализ методом ПЦР в реальном времени (RT-PCR) (фигура 14C). Эти результаты продемонстрировали, что HQP-1351 обеспечивал снижение уровня экспрессии p-SRC и PD-L1 в зависимости от времени и концентрации. На фигурах 14A-C показано, что HQP-1351 подавляет экспрессию p-SRC и PD-L1 в зависимости от дозы и времени. На фигуре 14A клетки H460 и A549 обрабатывали с помощью HQP-1351 в различных концентрациях в течение 24 ч, экспрессию p-SRC, SRC и PD-L1 измеряли с помощью вестерн-блота. На фигуре 14B клетки H460 и A549 обрабатывали 2 мкМ HQP-1351 в течение различных интервалов времени, измеряли экспрессию p-SRC, SRC и PD-L1 с помощью вестерн-блота. На фигуре 14C клетки H460 и A549 обрабатывали различными концентрациями HQP-1351 в течение 24 ч и обрабатывали 2 мкМ HQP-1351 в течение различных интервалов времени, измеряли экспрессию SRC и PD-L1 с помощью RT-PCR.To further explore the potential mechanism of anti-PD-L1 antibody enhancement by HQP-1351, we further tested the inhibitory effect of HQP-1351 on PD-L1 expression. After treatment with HQP-1351 at various concentrations, we observed that HQP-1351 provided a concentration-dependent reduction in PD-L1 expression as well as p-SRC phosphorylation in NSCLC cell lines (Figure 14A). Moreover, cells treated with 2 μM HQP-1351 at various time points showed a time-dependent suppression of PD-L1 and p-SRC levels (Figure 14B). To test this, we also performed real-time PCR (RT-PCR) analysis (Figure 14C). These results demonstrated that HQP-1351 provided time- and concentration-dependent downregulation of p-SRC and PD-L1 expression. Figures 14A-C show that HQP-1351 suppresses the expression of p-SRC and PD-L1 in a dose- and time-dependent manner. In Figure 14A, H460 and A549 cells were treated with HQP-1351 at different concentrations for 24 h, and the expression of p-SRC, SRC and PD-L1 was measured by Western blot. In Figure 14B, H460 and A549 cells were treated with 2 μM HQP-1351 for different time intervals, the expression of p-SRC, SRC and PD-L1 was measured by Western blot. In Figure 14C, H460 and A549 cells were treated with different concentrations of HQP-1351 for 24 h and treated with 2 μM HQP-1351 for different time intervals, the expression of SRC and PD-L1 was measured by RT-PCR.

ЗаключениеConclusion

Данные авторов настоящего изобретения продемонстрировали, что HQP1351 действует в качестве ингибитора SRC, усиливающего Т-клеточноопосредованные противоопухолевые иммунные ответы при NSCLC.The present inventors' data demonstrated that HQP1351 acts as an SRC inhibitor to enhance T cell-mediated antitumor immune responses in NSCLC.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что ингибитор SRC, представляющий собой HQP-1351, обеспечивал надежное снижение уровня экспрессии PD-L1 в клетках NSCLC и в моделях на животных. Наблюдаемый ингибирующий эффект зависел от времени и концентрации. Кроме того, результаты авторов настоящего изобретения показали, что объединенные HQP-1351 и антитело к PD-L1 обеспечивали улучшение в отношении опосредованного Т-клетками уничтожения опухолевых клеток in vitro и in vivo, что было ассоциировано с повышенной выработкой цитокинов активированных CD8+ Т-цитотоксических клеток, включающих IFN-γ, TNF-α и гранзим-B. Кроме того, авторы настоящего изобретения также наблюдали, что мыши, получавшие HQP-1351 в комбинации с блокадой PD-L1, показывали более длительную выживаемость, чем мыши, получавшие одно лекарственное средство отдельно.The present inventors found that the SRC inhibitor HQP-1351 robustly reduced PD-L1 expression in NSCLC cells and animal models. The observed inhibitory effect was time and concentration dependent. In addition, the present inventors' results showed that the combined HQP-1351 and anti-PD-L1 antibody provided improvements in T cell-mediated tumor cell killing in vitro and in vivo , which was associated with increased cytokine production of activated CD8+ T-cytotoxic cells , including IFN-γ, TNF-α and granzyme-B. In addition, the present inventors also observed that mice treated with HQP-1351 in combination with PD-L1 blockade showed longer survival than mice treated with either drug alone.

Авторы настоящего изобретения также предоставили доказательства, свидетельствующие в пользу применения комбинации HQP-1351 и антитела к PD-1/PD-L1 в качестве потенциального комбинированного терапевтического подхода для повышения эффективности иммунотерапии при NSCLC.We also provide evidence supporting the use of the combination of HQP-1351 and anti-PD-1/PD-L1 antibody as a potential combination therapeutic approach to improve the efficacy of immunotherapy in NSCLC.

[0137] Пример 3. Противоопухолевая активность HQP-1351 в линии клеток пре-B All, положительной по филадельфийской хромосоме (Ph+ All SUP-B15)[0137] Example 3: Antitumor activity of HQP-1351 in the Philadelphia chromosome positive pre-B All cell line (Ph+ All SUP-B15)

Анализ жизнеспособности клетокCell viability assay

Клетки лейкоза высевали при плотности 10000 клеток в непрозрачный 96-луночный планшет и инкубировали с возрастающими концентрациями HQP1351 или с средой-носителем (DMSO). После обработки жизнеспособность клеток измеряли с помощью набора для 3D-анализа жизнеспособности клеток с использованием люминесценции Promega^® Cell-Titer Glo^® в соответствии с инструкциями производителя (Promega, Мэдисон, Висконсин, США, № по кат. G7571). Сигнал люминесценции регистрировали с помощью гибридного многорежимного (микропланшетного) ридера BioTek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader (BioTek, Шанхай). Строили кривые пролиферативной активности клеток (т. е. жизнеспособности) и рассчитывали значения IC₅₀ антипролиферативного эффекта с использованием программного обеспечения Graphpad Prism версии 6.0 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США).Leukemia cells were seeded at a density of 10,000 cells in an opaque 96-well plate and incubated with increasing concentrations of HQP1351 or vehicle medium (DMSO). After treatment, cell viability was measured using the Promega Luminescence 3D Cell Viability Assay Kit^® Cell-Titer Glo^® according to the manufacturer's instructions (Promega, Madison, WI, USA, Cat. No. G7571). The luminescence signal was recorded using a BioTek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader (BioTek, Shanghai). Curves of cell proliferative activity (i.e., viability) were plotted and IC values were calculated₅₀ antiproliferative effect using Graphpad Prism software version 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

На фигуре 15 показана кривая жизнеспособности клеток SUP-B15, обработанных с помощью HQP1351 в течение 72 часов.Figure 15 shows the viability curve of SUP-B15 cells treated with HQP1351 for 72 hours.

На фигуре 16 показаны значения IC₅₀ для антипролиферативного эффекта HQP1351 в линиях клеток лейкоза, положительных (Ph+ или BCR-ABL1+) и отрицательных по филадельфийской хромосоме (Ph- или BCR-ABL1-). Данные продемонстрировали, что HQP1351 избирательно ингибировал пролиферацию Ph+ клеток, включая SUP-B15.Figure 16 shows the IC ₅₀ values for the antiproliferative effect of HQP1351 in Philadelphia chromosome positive (Ph+ or BCR-ABL1+) and Philadelphia chromosome negative (Ph- or BCR-ABL1-) leukemia cell lines. Data demonstrated that HQP1351 selectively inhibited the proliferation of Ph+ cells, including SUP-B15.

ЗаключениеConclusion

HQP1351 обеспечивает мощное ингибирование пролиферации Ph+ ALL SUP-B15 клеток и индуцирование апоптоза в первичных линиях клеток пре-B ALL и клеток ALL. HQP1351 provides potent inhibition of Ph+ ALL SUP-B15 cell proliferation and induction of apoptosis in primary pre-B ALL cell lines and ALL cells.

Claims

1. A method of treating cancer, comprising co-administering to a subject in need thereof an effective amount of:

a) HQP-1351 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and

b) asciminib;

wherein the cancer is leukemia;

where HQP-1351 has the following structure:

HQP-1351.

2. The method according to claim 1, where the cancer is chronic myelogenous leukemia.

3. The method according to claim 1 or 2, where the method is carried out in the treatment of a patient with chronic myeloid leukemia resistant to modern types of therapy with tyrosine kinase inhibitors.

4. The method according to claim 3, where the patient’s chronic myeloid leukemia, resistant to modern types of therapy with tyrosine kinase inhibitors, is caused by mutations in BCR-ABL.

5. The method of claim 4, wherein the mutation in BCR-ABL is T3151, E255K/V, G250E, H396P, M351T, Q252H, Y253F/H or BCR-ABL ^WT mutations.

6. The method of claim 4, wherein the mutation in BCR-ABL is the T3151 mutation.

7. A method of inhibiting BCR-ABL mutants, comprising contacting the BCR-ABL mutants with an effective amount of co-administered a) HQP-1351 or a pharmaceutically acceptable salt thereof and b) asciminib;

where HQP-1351 has the following structure:

HQP-1351.

8. The method according to claim 7, where the inhibition is carried out in vitro or in vivo .

9. The method according to claim 8, where the inhibition is carried out in a patient with chronic myeloid leukemia resistant to modern types of therapy with tyrosine kinase inhibitors.

10. The method according to claim 9, wherein the patient’s chronic myeloid leukemia, resistant to modern types of therapy with tyrosine kinase inhibitors, is caused by mutations in BCR-ABL.

11. The method of claim 10, wherein the mutation in BCR-ABL is the T3151, E255K/V, G250E, H396P, M351T, Q252H, Y253F/H, or BCR-ABL ^WT mutation.

12. The method of claim 10, wherein the mutation in BCR-ABL is T3151.

13. A method of treating non-small cell lung cancer, comprising co-administering to a subject in need thereof an effective amount of:

a) HQP-1351 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and

b) PD-L1,

where HQP-1351 has the following structure:

HQP-1351.

14. The method of claim 13, wherein the PD-L1 is atezolizumab, avelumab or durvalumab.

15. Method according to any one of paragraphs. 1-6 or 13, 14, wherein HQP-1351 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered orally to patients in need thereof.

16. Method according to any one of paragraphs. 1-6 or 13, 14, wherein HQP-1351 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered once every two days (QOD) during a 28-day treatment cycle.

17. The method of claim 16, wherein HQP-1351 is administered once every two days in an amount of about 1 mg, about 2 mg, about 4 mg, or about 8 mg.

18. The method of claim 16, wherein HQP-1351 is administered once every two days in an amount of about 12 mg or about 20 mg.

19. The method of claim 16, wherein HQP-1351 is administered once every two days in an amount of about 30 mg, about 40 mg, or about 45 mg.

20. The method of claim 16, wherein HQP-1351 is administered once every two days in an amount of about 50 mg or about 60 mg.