RU2815835C1 - Plasmid for genome editing of bacteria of genus bacillus and method of modifying genome of bacteria of genus bacillus - Google Patents
Plasmid for genome editing of bacteria of genus bacillus and method of modifying genome of bacteria of genus bacillus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815835C1 RU2815835C1 RU2022134564A RU2022134564A RU2815835C1 RU 2815835 C1 RU2815835 C1 RU 2815835C1 RU 2022134564 A RU2022134564 A RU 2022134564A RU 2022134564 A RU2022134564 A RU 2022134564A RU 2815835 C1 RU2815835 C1 RU 2815835C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plasmid
- cpf1
- gene
- promoter
- puce194
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 156
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 36
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims abstract description 35
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 37
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 35
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 33
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 101150102540 cpf1 gene Proteins 0.000 claims abstract 7
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 42
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 claims description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 33
- SQMWSBKSHWARHU-SDBHATRESA-N n6-cyclopentyladenosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(NC3CCCC3)=C2N=C1 SQMWSBKSHWARHU-SDBHATRESA-N 0.000 claims description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 14
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 14
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 claims description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 11
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 claims description 10
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 claims description 10
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 8
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 7
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 6
- 101150009206 aprE gene Proteins 0.000 claims description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 5
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 abstract description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 28
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 27
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 27
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 27
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 27
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 20
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 13
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 13
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 10
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 9
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 101150007424 amyS gene Proteins 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 5
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 description 4
- 241000187480 Mycobacterium smegmatis Species 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 241000498991 Bacillus licheniformis DSM 13 = ATCC 14580 Species 0.000 description 3
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 3
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 2
- 241000588088 Francisella tularensis subsp. novicida U112 Species 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 description 2
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 2
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 2
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 101100144644 Arabidopsis thaliana RMV1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 1
- 108010040467 CRISPR-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 240000002989 Euphorbia neriifolia Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000035109 Pneumococcal Infections Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101100329635 Pseudomonas protegens (strain DSM 19095 / LMG 27888 / CFBP 6595 / CHA0) csrA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000012361 double-strand break repair Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011090 industrial biotechnology method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N nebularine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC=C2N=C1 MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 101150037668 prmA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 101150049119 rimO gene Proteins 0.000 description 1
- 101150080444 rsmE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 229940072172 tetracycline antibiotic Drugs 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Группа изобретений относится к области биотехнологии и генетической инженерии, а именно к плазмиде, применяемой для геномного редактирования бактерий рода Bacillus и способу внесения модификаций в геном бактерий рода Bacillus.The group of inventions relates to the field of biotechnology and genetic engineering, namely to a plasmid used for genome editing of bacteria of the genus Bacillus and a method for introducing modifications into the genome of bacteria of the genus Bacillus.
Уровень техникиState of the art
Бактерии рода Bacillus - востребованный объект промышленной биотехнологии, что связано с их способностью к продукции ряда метаболитов, таких как витамины [1], пуриновые нуклеозиды [2], поли-гамма-глутаминовой кислоты [3], инсектициды, антимикробных соединений (бактериоцины, пептидные антибиотики). Также бактерии рода Bacillus способны синтезировать и секретировать большие количества белка ферментов (амилазы, протеазы) во внеклеточную среду [4,5]. Эти особенности позволяют рассматривать бактерии рода Bacillus в качестве эффективных штаммов-продуцентов, что требует эффективных методов манипуляции с геномом бактерий.Bacteria of the genus Bacillus are a sought-after object of industrial biotechnology, which is associated with their ability to produce a number of metabolites, such as vitamins [1], purine nucleosides [2], poly-gamma-glutamic acid [3], insecticides, antimicrobial compounds (bacteriocins, peptide antibiotics). Also, bacteria of the genus Bacillus are capable of synthesizing and secreting large amounts of protein enzymes (amylase, protease) into the extracellular environment [4,5]. These features make it possible to consider bacteria of the genus Bacillus as effective producer strains, which requires effective methods for manipulating the bacterial genome.
Существует ряд инструментов для манипуляции с геномом бактерий рода Bacillus [6,7], чаще всего они основаны на использовании селективных маркеров и гомологичной рекомбинации или системы Cre/lox [8].There are a number of tools for manipulating the genome of bacteria of the genus Bacillus [6,7], most often they are based on the use of selectable markers and homologous recombination or the Cre/lox system [8].
Также существуют методы внесения модификации в геном бактерий рода Bacillus с помощью систем CRISPR/Cas. Данная система представляет собой вектор, обеспечивающий экспрессию Cas нуклеазы и направляющей ее гидовой РНК (гидРНК или crРНК), которые образуют комплекс и связываются со специфической последовательностью (протоспейсером) ДНК для ее разрезания. При этом фрагменты, кодирующие Cas нуклеазу и гидРНК могут находиться на разных плазмидах (двухплазмидная система) или на одной плазмиде (одноплазмидная система). Чаще всего в качестве нуклеазы в подобных системах используется Cas9 нуклеаза или ее модификации, реже используется нуклеаза Cpf1 (другое название Cas12a) или ее модификации.There are also methods for introducing modifications into the genome of bacteria of the genus Bacillus using CRISPR/Cas systems. This system is a vector that provides expression of Cas nuclease and its guide RNA (hydrRNA or crRNA), which form a complex and bind to a specific sequence (protospacer) of DNA to cut it. In this case, fragments encoding Cas nuclease and guideRNA can be located on different plasmids (two-plasmid system) or on one plasmid (single-plasmid system). Most often, Cas9 nuclease or its modifications are used as a nuclease in such systems; less commonly, Cpf1 nuclease (another name for Cas12a) or its modifications is used.
Cas нуклеаза и направляющая ее гидРНК образуют комплекс Cas/гидРНК, который связывается со специфической последовательностью ДНК и вносит в нее двунитевой разрыв, что приводит, к гибели клонов дикого типа и выживанию мутантных клонов. Репарация двунитевого разрыва ДНК может происходить по пути гомологичной рекомбинации в присутствии плечей гомологии или по пути негомологичного соединения концов (non-homologous end joining, NHEJ). В результате репарации происходит делеция, инсерция или другая мутация в области ДНК (протоспейсер), которая ранее распознавалась комплексом Cas/гидРНК. Мутация в специфичной последовательности протоспейсера (или в ПАМ элементе) не позволяет комплексу Cas/гидРНК произвести разрыв ДНК, что и приводит к выживанию мутантов.Cas nuclease and its guideRNA form a Cas/guideRNA complex, which binds to a specific DNA sequence and introduces a double-strand break into it, which leads to the death of wild-type clones and the survival of mutant clones. Repair of DNA double-strand breaks can occur via homologous recombination in the presence of homology arms or via non-homologous end joining (NHEJ). As a result of repair, a deletion, insertion, or other mutation occurs in a region of DNA (protospacer) that was previously recognized by the Cas/hydrRNA complex. A mutation in a specific protospacer sequence (or in a PAM element) prevents the Cas/hydrRNA complex from producing a DNA break, which leads to the survival of the mutants.
В клетках эукариот негомологичное соединение концов является основным способом репарации двуцепочечных разрывов ДНК. В то же время в клетках бактерий негомологичное соединение концов встречается редко и происходит с низкой частотой [9-11]. Вместе с тем, этот метод позволяет быстро и эффективно вводить делеции в требуемый сайт в отсутствие плечей гомологии. Кроме того, данный способ позволяет вносить делеции в штаммах, дефектных по системе гомологичной рекомбинации (штаммы recA-), что необходимо для целей конструирования.In eukaryotic cells, nonhomologous end joining is the main method of repair of double-stranded DNA breaks. At the same time, in bacterial cells, nonhomologous end joining is rare and occurs with low frequency [9-11]. At the same time, this method allows you to quickly and efficiently introduce deletions into the desired site in the absence of homology arms. In addition, this method allows the introduction of deletions in strains defective in the homologous recombination system (recA - strains), which is necessary for design purposes.
Известны системы негомологичного соединения концов у микобактерий (Mycobacterium tuberculosis или Mycobacterium smegmatis) [12,13]. Показано, что эти системы из Mycobacterium tuberculosis или Mycobacterium smegmatis способны работать в клетках Leptospira [14], Escherichia coli [15,16] и Bacillus subtilis [17]. Гены, кодирующие элементы системы негомологичного соединения концов идентифицированы и в других бактериях, включая Bacillus subtilis [9], однако их функциональность не доказана.Systems of non-homologous end joining are known in mycobacteria (Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium smegmatis) [12,13]. These systems from Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium smegmatis have been shown to be able to work in Leptospira [14], Escherichia coli [15,16] and Bacillus subtilis [17] cells. Genes encoding elements of the nonhomologous end joining system have been identified in other bacteria, including Bacillus subtilis [9], but their functionality has not been proven.
Предложенный авторами изобретения способ позволяет с помощью плазмиды, кодирующей Cas/гидРНК вносить делеции неконтролируемого размера в геномы бактерий рода Bacillus с использованием собственной системы негомологичного соединения концов. Кроме того, этот способ позволяет отбирать случайные мутации в области ПАМ-элемента и протоспейсера ДНК мишени.The method proposed by the authors of the invention allows, using a plasmid encoding Cas/hydrRNA, to introduce deletions of uncontrolled size into the genomes of bacteria of the genus Bacillus using its own system of non-homologous end joining. In addition, this method makes it possible to select random mutations in the region of the PAM element and protospacer of the target DNA.
Впервые предложена плазмида для внесения модификаций в геном бактерий рода Bacillus с использованием системы репарации негомологичного соединения концов, содержащая ген cpƒ1 под контролем индуцируемого промотора, ген, кодирующий репрессор для соответствующего индуцируемого промотора, операторную последовательностью cre, область для встраивания последовательности направляющей гидРНК (crРНК), включающей спейсер к ДНК мишени, расположенную под контролем сильного конститутивного промотора (Фиг. 3а).For the first time, a plasmid has been proposed for introducing modifications into the genome of bacteria of the genus Bacillus using a non-homologous end joining repair system, containing the cpƒ1 gene under the control of an inducible promoter, a gene encoding a repressor for the corresponding inducible promoter, a cre operator sequence, a region for inserting a guide RNA (crRNA) sequence, including a spacer to the target DNA, located under the control of a strong constitutive promoter (Fig. 3a).
Идуцируемый промотор выбирают из группы, включающей промоторы Pxy1A, Pgrac, Pspac, PmanP, PtetA, Pmt1A или другой индуцируемый промотор [18-22].The inducible promoter is selected from the group consisting of Pxy1A, Pgrac, Pspac, PmanP, PtetA, Pmt1A promoters or another inducible promoter [18-22].
Сильный конститутивный промотор выбирают из группы, включающей промоторы Pveg, Р43, PymdA, PserA или другой конститутивный промотор [23,24].A strong constitutive promoter is selected from the group consisting of Pveg, P43, PymdA, PserA or other constitutive promoter [23,24].
В одном из вариантов в качестве индуцируемого промотора плазмида содержит промоторы Pxy1A или Pgrac.In one embodiment, the plasmid contains the Pxy1A or Pgrac promoters as an inducible promoter.
В одном из вариантов плазмида представляет плазмиду pUCE194_cpf1-crSpcR, содержащую ген нуклеазы Cpf1 под контролем индуцируемого промотора Pxy1A, ген, кодирующий репрессор Xy1R для промотора Pxy1A, операторную последовательность cre для репрессии гена cpƒ1 белком репрессором СсрА, область для встраивания последовательности направляющей гидРНК, включающей спейсер к гену устойчивости к спектиномицину, расположенную под контролем сильного конститутивного промотора Pveg. Плазмида pUCE194_cpf1-crSpcR депонирована в БРЦ ВКПМ под номером В-14351 (Фиг. 3).In one embodiment, the plasmid is the plasmid pUCE194_cpf1-crSpcR, containing the Cpf1 nuclease gene under the control of the inducible Pxy1A promoter, a gene encoding the Xy1R repressor for the Pxy1A promoter, the cre operator sequence for repression of the cpƒ1 gene by the CCPA repressor protein, a region for inserting a guide sequence of guide RNA, including a spacer to the spectinomycin resistance gene, located under the control of the strong constitutive Pveg promoter. Plasmid pUCE194_cpf1-crSpcR was deposited in the BRC VKPM under number B-14351 (Fig. 3).
В еще одном варианте плазмида представляет плазмиду pUCE194_Pgrac-cpf1_crSpcR содержащую ген нуклеазы Cpf1 под контролем индуцируемого промотора Pgrac, ген, кодирующий репрессор для промотора Pgrac, операторную последовательность cre для репрессии гена нуклеазы Cpf1 белком репрессором СсрА, область для встраивания последовательности направляющей гидРНК, включающей спейсер к гену устойчивости к спектиномицину, расположенную под контролем сильного конститутивного промотора Р43 (Фиг. 4).In yet another embodiment, the plasmid is the pUCE194_Pgrac-cpf1_crSpcR plasmid containing the Cpf1 nuclease gene under the control of the inducible Pgrac promoter, a gene encoding a repressor for the Pgrac promoter, a cre operator sequence for repression of the Cpf1 nuclease gene by the CCPA repressor protein, a region for inserting a guide RNA sequence including a spacer to spectinomycin resistance gene, located under the control of the strong constitutive P43 promoter (Fig. 4).
В еще одном варианте плазмида представляет плазмиду pUCE194_cpf1-crAmyS содержащую ген cpƒ1 под контролем индуцируемого промотора Pxy1A, ген, кодирующий репрессор для промотора PxylA, операторную последовательность cre для репрессии гена cpƒ1 белком репрессором СсрА, область для встраивания последовательности направляющей гидРНК, включающей спейсер к гену термостабильной альфа-амилазы amyS, расположенную под контролем сильного конститутивного промотора Pveg (Фиг. 5).In yet another embodiment, the plasmid is the pUCE194_cpf1-crAmyS plasmid containing the cpƒ1 gene under the control of the inducible Pxy1A promoter, a gene encoding a repressor for the PxylA promoter, a cre operator sequence for repression of the cpƒ1 gene by the CCPA repressor protein, a region for inserting a guide RNA sequence including a spacer to the thermostable gene alpha-amylase amyS, located under the control of the strong constitutive Pveg promoter (Fig. 5).
В еще одном варианте плазмида представляет плазмиду pUCE194_cpf1-crAprE содержащую ген cpƒ1 под контролем индуцируемого промотора Pxy1A, ген, кодирующий репрессор для промотора PxylA, операторную последовательность cre для репрессии гена cpƒ1 белком репрессором СсрА, область для встраивания последовательности направляющей гидРНК, включающей спейсер к гену щелочной протеазы aprE, расположенную под контролем сильного конститутивного промотора Pveg (Фиг. 6).In yet another embodiment, the plasmid is the pUCE194_cpf1-crAprE plasmid containing the cpƒ1 gene under the control of the inducible Pxy1A promoter, a gene encoding a repressor for the PxylA promoter, a cre operator sequence for repression of the cpƒ1 gene by the CCPA repressor protein, a region for inserting a guide RNA sequence including a spacer to the alkaline gene aprE protease, located under the control of the strong constitutive Pveg promoter (Fig. 6).
Авторы неожиданно обнаружили, что полное подавление синтеза нуклеазы cpƒ1 позволяет создать систему редактирования генома бактерий рода Bacillus с использованием собственной системы негомологичного соединения концов в геноме бактерий без обеспечения плечей для гомологичной рекомбинации, которая при этом не оказывает токсичного эффекта на клетки в состоянии без индукции промотора. Полное подавление синтеза нуклеазы cpƒ1 достигается двойной репрессией транкрипции гена cpƒ1 - посредством репрессора для индуцируемого промотора и репрессора СсрА.The authors unexpectedly discovered that complete suppression of cpƒ1 nuclease synthesis makes it possible to create a genome editing system for bacteria of the genus Bacillus using the proprietary system of non-homologous end joining in the bacterial genome without providing arms for homologous recombination, which does not have a toxic effect on cells in a state without promoter induction. Complete suppression of the cpƒ1 nuclease synthesis is achieved by double repression of the cpƒ1 gene transcription - through the repressor for the inducible promoter and the CspA repressor.
Следовательно, другим аспектом изобретения является способ модификации генома бактерий рода Bacillus путем внесения мутаций с помощью репарации по пути негомологичного соединения концов, предусматривающий трансформацию бактерий плазмидой согласно изобретению, содержащей Cpf1/гидРНК, выращивание культуры клеток до титра 106 - 109 и индукцию промотора для синтеза нуклеазы Cpf1 с последующим отбором мутаций. Образование эффекторного комплекса Cpf1/гидРНК вносит двунитевой разрыв в ДНК бактерий с последующей репарацией. Использование строго контролируемого индуцируемого промотора позволяет выращивать культуру клеток до высокого титра без токсичного влияния на клетку, что позволяет обойти низкую эффективность репарации без использования плечей для гомологичной рекомбинации, что является преимуществом представленной системы редактирования над известной системой «All-in-One» [25].Therefore, another aspect of the invention is a method for modifying the genome of bacteria of the genus Bacillus by introducing mutations using repair along the non-homologous end joining pathway, providing for the transformation of bacteria with a plasmid according to the invention containing Cpf1/hydrRNA, growing a cell culture to a titer of 10 6 - 10 9 and inducing a promoter for synthesis of Cpf1 nuclease followed by selection of mutations. The formation of the Cpf1/hydrRNA effector complex introduces a double-strand break into bacterial DNA, followed by repair. The use of a strictly controlled inducible promoter allows one to grow a cell culture to a high titer without toxic effects on the cell, which allows one to bypass the low efficiency of repair without using arms for homologous recombination, which is an advantage of the presented editing system over the well-known “All-in-One” system [25] .
После внесения модификаций в геном, плазмида с системой редактирования гидРНК/Cpf1, легко элиминируется из клеток при повышенной температуре (37-43°С) без селективного давления антибиотика, что является дополнительным преимуществом представленной системы редактирования над известной системой «All-in-One» [25].After modifications are made to the genome, the plasmid with the guideRNA/Cpf1 editing system is easily eliminated from cells at elevated temperatures (37-43°C) without the selective pressure of an antibiotic, which is an additional advantage of the presented editing system over the well-known “All-in-One” system. [25].
В одном из вариантов предложенного способа клетки бактерий В. subtilis трансформируют плазмидой pUCE194_cpf1-crSpcR.In one of the variants of the proposed method, B. subtilis bacterial cells are transformed with the plasmid pUCE194_cpf1-crSpcR.
В другом варианте способа клетки бактерий В. subtilis трансформируют плазмидой pUCE194_Pgrac-cpf1_crSpcR.In another variant of the method, B. subtilis bacterial cells are transformed with the plasmid pUCE194_Pgrac-cpf1_crSpcR.
В еще одном варианте способа клетки бактерий В. licheniformis трансформируют плазмидой pUCE194_cpf1-crAmyS.In another variant of the method, B. licheniformis bacterial cells are transformed with the plasmid pUCE194_cpf1-crAmyS.
В еще одном варианте способа клетки бактерий В. amyloliquefaciens трансформируют плазмидой pUCE194_cpf1-crAprE.In another variant of the method, B. amyloliquefaciens bacterial cells are transformed with the plasmid pUCE194_cpf1-crAprE.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the invention
Техническим результатом является то, что предложена плазмида для внесения модификаций в геном бактерий рода Bacillus с использованием системы репарации негомологичного соединения концов, содержащая ген cpƒ1 под контролем индуцируемого промотора, ген, кодирующий репрессор для соответствующего индуцируемого промотора, операторную последовательностью cre для дополнительной репрессии гена cpƒ1 репрессором СсрА, область для встраивания последовательности направляющей гидРНК, включающую спейсер к ДНК мишени, расположенную под контролем сильного конститутивного промотора (Фиг. 3а).The technical result is that a plasmid is proposed for introducing modifications into the genome of bacteria of the genus Bacillus using a non-homologous end joining repair system, containing the cpƒ1 gene under the control of an inducible promoter, a gene encoding a repressor for the corresponding inducible promoter, a cre operator sequence for additional repression of the cpƒ1 gene by a repressor CCPA, a region for insertion of a guide RNA sequence, including a spacer to the target DNA, located under the control of a strong constitutive promoter (Fig. 3a).
Индуцируемый промотор выбирают из группы, включающей промоторы Pxy1A, Pgrac, Pspac, PmanP, PtetA, Pmt1A или другой индуцируемый промотор.The inducible promoter is selected from the group consisting of Pxy1A, Pgrac, Pspac, PmanP, PtetA, Pmt1A promoters or another inducible promoter.
Сильный конститутивный промотор выбирают из группы, включающей промоторы Pveg, Р43, PymdA, PserA или другой конститутивный промотор.The strong constitutive promoter is selected from the group consisting of Pveg, P43, PymdA, PserA or other constitutive promoter.
В одном из вариантов плазмида представляет плазмиду pUCE194_cpf1-crSpcR, содержащую ген нуклеазы Cpf1 под контролем индуцируемого промотора Pxy1A, ген, кодирующий репрессор Xy1R для промотора Pxy1A, операторную последовательность cre для репрессии гена cpƒ1 белком репрессором СсрА, область для встраивания последовательности направляющей гидРНК, включающей спейсер к гену устойчивости к спектиномицину, расположенную под контролем сильного конститутивного промотора Pveg, депонированную в БРЦ ВКПМ под номером В-14351 (Фиг. 3). Конструирование плазмиды описано в примере 3. Последовательность спейсера представлена в табл. 2.In one embodiment, the plasmid is the plasmid pUCE194_cpf1-crSpcR, containing the Cpf1 nuclease gene under the control of the inducible Pxy1A promoter, a gene encoding the Xy1R repressor for the Pxy1A promoter, the cre operator sequence for repression of the cpƒ1 gene by the CCPA repressor protein, a region for inserting a guide sequence of guide RNA, including a spacer to the spectinomycin resistance gene, located under the control of the strong constitutive Pveg promoter, deposited in the BRC VKPM under number B-14351 (Fig. 3). The construction of the plasmid is described in example 3. The spacer sequence is presented in table. 2.
В еще одном варианте плазмида представляет плазмиду pUCE194_Pgrac-cpf1_crSpcR, содержащую ген cpƒ1 под контролем индуцируемого промотора Pgrac, ген, кодирующий репрессор для промотора Pgrac, операторную последовательность cre для репрессии гена cpƒ1 белком репрессором СсрА, область для встраивания последовательности направляющей гидРНК, включающей спейсер к гену устойчивости к спектиномицину, расположенную под контролем сильного конститутивного промотора Р43 (Фиг. 4). Конструирование плазмиды описано в примере 4. Последовательность спейсера указана в таблице 2.In yet another embodiment, the plasmid is the plasmid pUCE194_Pgrac-cpf1_crSpcR, containing the cpƒ1 gene under the control of the inducible Pgrac promoter, a gene encoding a repressor for the Pgrac promoter, a cre operator sequence for repression of the cpƒ1 gene by the CCPA repressor protein, a region for inserting a guide RNA sequence including a spacer for the gene spectinomycin resistance, located under the control of the strong constitutive P43 promoter (Fig. 4). The construction of the plasmid is described in example 4. The spacer sequence is shown in table 2.
В еще одном варианте плазмида представляет плазмиду pUCE194_cpf1-crAmyS содержащую ген cpƒ1 под контролем индуцируемого промотора Pxy1A, ген, кодирующий репрессор для промотора Pxy1A, операторную последовательность cre для репрессии гена cpƒ1 белком репрессором СсрА, область для встраивания последовательности направляющей гидРНК, включающей спейсер к гену термостабильной альфа-амилазы, расположенную под контролем сильного конститутивного промотора Pveg (Фиг. 5). Конструирование плазмиды описано в примере 5. Последовательность спейсера указана в таблице 2.In yet another embodiment, the plasmid is the pUCE194_cpf1-crAmyS plasmid containing the cpƒ1 gene under the control of the inducible Pxy1A promoter, a gene encoding a repressor for the Pxy1A promoter, a cre operator sequence for repression of the cpƒ1 gene by the CCPA repressor protein, a region for inserting a guide RNA sequence including a spacer to the thermostable gene alpha-amylase, located under the control of the strong constitutive Pveg promoter (Fig. 5). The construction of the plasmid is described in example 5. The spacer sequence is shown in Table 2.
В еще одном варианте плазмида представляет плазмиду pUCE194_cpf1-crAprE содержащую ген нуклеазы Cpf1 под контролем индуцируемого промотора Pxy1A, ген, кодирующий репрессор для промотора Pxy1A, операторную последовательность cre для репрессии гена cpƒ1 белком репрессором СсрА, область для встраивания последовательности направляющей гидРНК, включающей спейсер к гену щелочной протеазы aprE, расположенную под контролем сильного конститутивного промотора Pveg (Фиг. 6). Конструирование плазмиды описано в примере 6. Последовательность спейсера указана в таблице 2.In yet another embodiment, the plasmid is the pUCE194_cpf1-crAprE plasmid containing the Cpf1 nuclease gene under the control of the inducible Pxy1A promoter, a gene encoding a repressor for the Pxy1A promoter, a cre operator sequence for repression of the cpƒ1 gene by the CCPA repressor protein, a region for inserting a guide RNA sequence including a spacer for the gene alkaline protease aprE, located under the control of the strong constitutive Pveg promoter (Fig. 6). The construction of the plasmid is described in example 6. The spacer sequence is shown in table 2.
Праймеры, используемые при конструировании плазмид, приведены в таблице 1.Primers used in the construction of plasmids are given in Table 1.
Одним из преимуществ использования предложенной плазмиды относительно известных систем редактирования является полное подавление синтеза нуклеазы Cpf1 в отсутствии индуктора, что позволяет совместить на одной плазмиде ген нуклеазы, последовательность кодирующую гидРНК, и производить разрыв мишени ДНК в строго определенное время путем добавления индуктора. В качестве индуктора в зависимости от соответствующего индуцируемого промотора могут быть использованы индукторы, выбираемые из группы, включающей ксилозу, лактозу, ИПТГ, галактозу, арабинозу, маннозу, мальтозу, ангидротетрациклин, кумат и другие.One of the advantages of using the proposed plasmid relative to well-known editing systems is the complete suppression of the synthesis of the Cpf1 nuclease in the absence of an inducer, which makes it possible to combine the nuclease gene, the sequence encoding guideRNA on one plasmid, and break the target DNA at a strictly defined time by adding an inducer. As an inducer, depending on the corresponding inducible promoter, inducers selected from the group including xylose, lactose, IPTG, galactose, arabinose, mannose, maltose, anhydrotetracycline, cumate and others can be used.
Предложенная согласно изобретению плазмида для редактирования генома бактерий рода Bacillus, обеспечивая полное подавление синтеза нуклеазы cpƒ1 посредством репрессора для индуцируемого промотора и репрессора СсрА, при этом не оказывает токсичного эффекта на клетки в состоянии без индукции промотора, позволяя выращивать клетки до титра 106 - 109 с последующей индукцией промотора, что приводит к синтезу Cpf1 нуклеазы и образованию эффекторного комплекса Cpf1/гидРНК, который вносит двунитевой разрыв в ДНК бактерий, и позволяет эффективно отбирать редкие события, такие как модификации с использованием системы репарации - негомологичного соединения концов или спонтанные мутации в области протоспейсера или ПАМ-элемента ДНК мишени, осуществляя негативную селекцию путем разрушения ДНК клеток дикого типа и оставляя в живых мутанты. После внесения модификации плазмиду при необходимости элиминируют при культивировании при повышенной температуре без селективного давления (без использования маркеров устойчивости к антибиотикам).The plasmid proposed according to the invention for editing the genome of bacteria of the genus Bacillus, providing complete suppression of the synthesis of cpƒ1 nuclease through the repressor for the inducible promoter and the repressor CсрА, does not have a toxic effect on cells in a state without promoter induction, allowing cells to be grown to a titer of 10 6 - 10 9 followed by promoter induction, which leads to the synthesis of Cpf1 nuclease and the formation of the Cpf1/hydrRNA effector complex, which introduces a double-strand break into bacterial DNA and allows for the effective selection of rare events, such as modifications using the repair system - non-homologous end joining or spontaneous mutations in the region protospacer or PAM element of the target DNA, carrying out negative selection by destroying the DNA of wild-type cells and leaving mutants alive. After modification, the plasmid is eliminated, if necessary, by cultivation at elevated temperatures without selective pressure (without the use of antibiotic resistance markers).
Следовательно, еще одним аспектом изобретения является способ внесения модификаций в геном бактерий рода Bacillus с использованием негомологичного соединения концов, предусматривающий трансформацию бактерий плазмидой согласно изобретению, содержащей Cpf1/гидРНК, выращивание культуры клеток до титра 106 - 109 и индукцию промотора для экспрессии гена нуклеазы Cpf1 с последующим отбором мутантов. При необходимости, последующая элиминация плазмиды Cpf1/гидРНК из культуры клеток осуществляется при повышенной температуре без селективного давления.Therefore, another aspect of the invention is a method for introducing modifications into the genome of bacteria of the genus Bacillus using non-homologous end joining, which involves transforming bacteria with a plasmid according to the invention containing Cpf1/hydrRNA, growing a cell culture to a titer of 10 6 - 10 9 and inducing a promoter for expression of the nuclease gene Cpf1 followed by selection of mutants. If necessary, subsequent elimination of the Cpf1/hydrRNA plasmid from the cell culture is carried out at elevated temperature without selective pressure.
Предложенный способ позволяет отбирать редкие события, такие как модификации с использованием системы репарации - негомологичного соединения концов или спонтанные мутации в области протоспейсера или ПАМ-элемента ДНК мишени, осуществляя негативную селекцию путем разрушения ДНК клеток дикого типа и оставляя в живых мутанты (Примеры 7-9).The proposed method makes it possible to select rare events, such as modifications using the repair system - non-homologous end joining or spontaneous mutations in the protospacer region or PAM element of the target DNA, carrying out negative selection by destroying the DNA of wild-type cells and leaving mutants alive (Examples 7-9 ).
Модификации может быть подвержен любой штамм В. subtilis или другой штамм бактерий рода Bacillus, чувствительный к тетрациклину и совместимый с репликоном Е194. Для модификации, в качестве мишени может использоваться любая нуклеотидная последовательность ДНК на хромосоме бактерий (в области протоспейсера), граничащая с последовательностью ПАМ-элемента (протоспейсер ассоциированный мотив), который представлен тремя нуклеотидами 5'-TTN-3'.Any strain of B. subtilis or another strain of bacteria of the genus Bacillus that is sensitive to tetracycline and compatible with the E194 replicon can be modified. For modification, any DNA nucleotide sequence on the bacterial chromosome (in the protospacer region), adjacent to the sequence of the PAM element (protospacer associated motif), which is represented by three nucleotides 5'-TTN-3', can be used as a target.
В одном из вариантов предложенного способа клетки бактерий В. subtilis трансформируют плазмидой pUCE194_cpf1-crSpcR (пример 7). Для отбора (тестирования) модификаций использовали штамм Bacillus subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR, который получен на основе дикого штамма Bacillus subtilis 168 [26] (депонирован в БРЦ ВКПМ под номером В-1727 (АТСС 23857)) в результате введения в этот штамм направленных генетических модификаций: инактивации трех генов prmA, rsmE, rimO встраиванием в эту область гена spcR, сообщающего устойчивость клеток В. subtilis к спектиномицину.In one of the variants of the proposed method, B. subtilis bacterial cells are transformed with the plasmid pUCE194_cpf1-crSpcR (example 7). To select (test) modifications, we used the strain Bacillus subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR, which was obtained on the basis of the wild strain Bacillus subtilis 168 [26] (deposited in the BRC VKPM under number B-1727 (ATCC 23857)) as a result of introduction into this strain of targeted genetic modifications: inactivation of three genes prmA, rsmE, rimO by insertion into this region of the spcR gene, which imparts resistance to B. subtilis cells to spectinomycin.
Для внесения модификаций в геном штамма В. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR плазмида pUCE194cpf1-crSpcR содержит спейсер, комплементарный протоспейсеру в последовательности гена spcR, таким образом гидРНК нацеливает нуклеазу cpƒ1 на последовательность гена spcR.To introduce modifications into the genome of the B. subtilis strain ΔprmA-rsmE-rimO::spcR, the pUCE194cpf1-crSpcR plasmid contains a spacer complementary to the protospacer in the spcR gene sequence, thus the guideRNA targets the cpƒ1 nuclease to the spcR gene sequence.
В другом варианте предложенного способа клетки штамма Bacillus subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR бактерий В. subtilis трансформируют плазмидой pUCE194_Pgrac-cpf1_crSpcR (пример 7).In another variant of the proposed method, cells of the Bacillus subtilis strain ΔprmA-rsmE-rimO::spcR bacteria B. subtilis are transformed with the plasmid pUCE194_Pgrac-cpf1_crSpcR (example 7).
В другом варианте осуществления способа для получения мутантов использовали штамм Bacillus licheniformis АТСС 14580 (депонирован в БРЦ ВКПМ под номером В-8054 [27]. Для получения мутантов по гену альфа-амилазы использовалась плазмида pUCE194_cpf1-crAmyS, содержащая спейсер, комплементарный протоспейсеру в последовательности гена термостабильной альфа-амилазы amyS, таким образом гидРНК нацеливает нуклеазу cpƒ1 на последовательность гена альфа-амилазы amyS (пример 8).In another embodiment of the method, the strain Bacillus licheniformis ATCC 14580 was used to obtain mutants (deposited in the BRC VKPM under the number B-8054 [27]. To obtain mutants for the alpha-amylase gene, the plasmid pUCE194_cpf1-crAmyS was used, containing a spacer complementary to the protospacer in the gene sequence thermostable alpha-amylase amyS, thus guideRNA targets cpƒ1 nuclease to the amyS alpha-amylase gene sequence (example 8).
В еще одном варианте осуществления способа клетки штамма Bacillus amyloliquefaciens HK1 [28] трансформируют плазмидой pUCE194_cpf1-crAprE и отбирают мутации в гене щелочной протеазы aprE.In another embodiment of the method, cells of the Bacillus amyloliquefaciens strain HK1 [28] are transformed with the plasmid pUCE194_cpf1-crAprE and mutations in the alkaline protease gene aprE are selected.
В соответствии с изобретением после индукции двунитевого разрыва ДНК происходит его репарация с использованием системы негомологичного соединения концов, или отбираются спонтанные мутанты, с мутациями в области протоспейсера или ПАМ-элемента, которые были подвержены разрыву эффекторным комплексом Cpf1/гидРНК. В результате, выживают мутантные клоны, в которых изменена последовательность протоспейсера (или ПАМ-элемента). Клоны дикого типа, в протоспейсере (или ПАМ-элементе) которых не произошла модификация, погибают. Из полученных клонов выделяется ДНК, и проверяется на наличие внесенных модификаций методом ПЦР [29] и секвенированием (Фиг. 7-12, Примеры 7-9).In accordance with the invention, after the induction of a double-stranded DNA break, its repair occurs using a non-homologous end joining system, or spontaneous mutants with mutations in the protospacer or PAM element region, which were subject to breakage by the Cpf1/hydrRNA effector complex, are selected. As a result, mutant clones survive in which the sequence of the protospacer (or PAM element) is changed. Wild-type clones in which no modification has occurred in the protospacer (or PAM element) die. DNA is isolated from the resulting clones and checked for the presence of modifications using PCR [29] and sequencing (Fig. 7-12, Examples 7-9).
ОпределенияDefinitions
CRISPR - (от англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeats - короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) - особые локусы бактерий и архей, состоящие из прямых повторяющихся последовательностей, которые разделены уникальными последовательностями (спейсерами). Спейсеры заимствуются из чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивалась клетка (бактериофагов, плазмид). РНК, транскрибирующиеся с локусов CRISPR, процессируется в короткие зрелые гидРНК длиной 42-44 нуклеотида совместно с ассоциированными белками Cas обеспечивают адаптивный иммунитет за счет комплементарного связывания РНК с нуклеиновыми кислотами чужеродных элементов и последующего разрушения их Cas нуклеазами.CRISPR - (from the English clustered regularly interspaced short palindromic repeats - short palindromic repeats regularly arranged in groups) - special loci of bacteria and archaea, consisting of direct repeating sequences that are separated by unique sequences (spacers). Spacers are borrowed from foreign genetic elements that the cell has encountered (bacteriophages, plasmids). RNA transcribed from CRISPR loci is processed into short mature guideRNAs of 42-44 nucleotides in length, together with associated Cas proteins, providing adaptive immunity due to the complementary binding of RNA to the nucleic acids of foreign elements and their subsequent destruction by Cas nucleases.
гидРНК (или crРНК) - последовательность РНК, состоящая из консервативной части и вариабельной части, называемой спейсером длиной 23-25 нуклеотидов.guideRNA (or crRNA) is an RNA sequence consisting of a conservative part and a variable part, called a spacer, 23-25 nucleotides long.
Спейсер - последовательность ДНК, комплементарная последовательности протоспейсера. Спейсер заимствуются из чужеродных генетических элементов, с которыми сталкивалась клетка и интегрируется в последовательность CRISPR.Spacer is a DNA sequence complementary to the protospacer sequence. The spacer is taken from foreign genetic elements encountered by the cell and integrated into the CRISPR sequence.
Протоспейсер - последовательность ДНК, в которой происходит двунитевой разрыв комплексом Cas/гидРНК при наличии ПАМ элемента.Protospacer is a DNA sequence in which a double-strand break occurs by the Cas/hydrRNA complex in the presence of a PAM element.
ПАМ элемент - (от англ. protospacer adjacent motif - протоспейсер-ассоциированный мотив) - для нуклеазы Cas12a (Cpf1) это последовательность 5'-TTN-3', прилегающая к последовательности протоспейсера, в присутствии ПАМ элемента комплекс Cpf1/гидРНК вносит двунитевой разрыв ДНК в области протоспейсера, с образованием липких концов.PAM element - (from the English protospacer adjacent motif - protospacer-associated motif) - for the Cas12a nuclease (Cpf1) this is the sequence 5'-TTN-3' adjacent to the protospacer sequence; in the presence of the PAM element, the Cpf1/hydrRNA complex introduces a double-strand DNA break in the protospacer region, forming sticky ends.
Cpf1 (альтернативное название Cas12a) - CRISPR associated protein 12а, РНК-зависимая ДНК-эндонуклеаза, направляемая гидРНК, последовательность гена амплифицирована из генома бактерии Francisella novicida U112.Cpf1 (alternative name Cas12a) - CRISPR associated protein 12a, RNA-dependent DNA endonuclease guided by guideRNA, gene sequence amplified from the genome of the bacterium Francisella novicida U112.
Комплекс Cpf1/гидРНК - эффекторный комплекс, белка нуклеазы Cpf1 (Cas12a) и гидРНК образует нуклеопротеиновый комплекс, который распознает и разрезает таргетируемую ДНК в области протоспейсера.The Cpf1/guideRNA effector complex, the nuclease protein Cpf1 (Cas12a) and guideRNA, forms a nucleoprotein complex that recognizes and cuts targeted DNA in the protospacer region.
Челночная плазмида - в данном изобретении означает, что плазмида способна к репликации в клетках Е. coli и В. subtilis.Shuttle plasmid - in this invention means that the plasmid is capable of replication in E. coli and B. subtilis cells.
pE194ts - термочувствительный репликон, позволяющий реплицироваться плазмиде pUCE194_cpf1_crEmpty в клетках В. subtilis при температуре 30°С. При повышеной температуре репликация плазмиды не происходит. Репликон получен из плазмиды pXen5 [30].pE194ts is a temperature-sensitive replicon that allows the plasmid pUCE194_cpf1_crEmpty to replicate in B. subtilis cells at a temperature of 30°C. At elevated temperatures, plasmid replication does not occur. The replicon was obtained from the pXen5 plasmid [30].
рМВ1 - репликон, позволяющий реплицироваться плазмиде в клетках Е. coli, получен из плазмиды pUC18 (Thermo scientific).pMB1 is a replicon that allows the plasmid to replicate in E. coli cells, obtained from the pUC18 plasmid (Thermo scientific).
tetR - ген устойчивости клеток Е. coli и бактерий В. subtilis к тетрациклину, получен из плазмиды pHY300PLK [31].tetR is a gene for resistance of E. coli cells and B. subtilis bacteria to tetracycline, obtained from the pHY300PLK plasmid [31].
bla - ген β-лактамазы, сообщающий устойчивость клеток Е. coli к ампициллину, получен из плазмиды pUC18.bla is a β-lactamase gene that confers resistance to ampicillin in E. coli cells, obtained from the pUC18 plasmid.
spcR - ген сообщающий устойчивость клеток В. subtilis к спектиномицину.spcR is a gene that imparts resistance to spectinomycin in B. subtilis cells.
Pxy1A-cre - индуцируемый ксилозой промотор, репрессируется в отсутствии ксилозы собственным репрессором Xy1R. В присутствии глюкозы обеспечивается катаболитная репрессия посредством белка СсрА, связывающегося с операторной последовательностью cre-элементом. Промотор клонирован из плазмиды pPxy1Acre_MCS [32].Pxy1A-cre is a xylose-inducible promoter that is repressed in the absence of xylose by its own repressor Xy1R. In the presence of glucose, catabolite repression is ensured by the CCPA protein, which binds to the operator sequence cre element. The promoter was cloned from the pPxy1Acre_MCS plasmid [32].
NHEJ (англ. non-homologous end joining) - негомологичное соединение концов, путь репарации ДНК для внесения модификаций в геном Bacillus.NHEJ (English: non-homologous end joining) is a non-homologous end joining, a DNA repair pathway for introducing modifications into the Bacillus genome.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
На Фиг. 1 изображена схема плазмиды pUCE194_cpf1_crEmptyIn FIG. Figure 1 shows a diagram of the plasmid pUCE194_cpf1_crEmpty
На Фиг. 2 представлена схема плазмиды pUCE194_Pgrac-cpf1-crEmptyIn FIG. Figure 2 shows a diagram of the plasmid pUCE194_Pgrac-cpf1-crEmpty
На Фиг. 3а представлена схема плазмиды для редактирования генома бактерий рода Bacillus с использованием системы репарации негомологичного соединения концов, кодирующая Cpf1/гидРНКIn FIG. Figure 3a shows a diagram of a plasmid for editing the genome of bacteria of the genus Bacillus using a non-homologous end joining repair system, encoding Cpf1/hydrRNA
На Фиг. 3 представлена схема плазмиды pUCE194_cpf1-crSpcRIn FIG. Figure 3 shows a diagram of the plasmid pUCE194_cpf1-crSpcR
На Фиг. 4 представлена схема плазмиды pUCE194_Pgrac-cpf1-crSpcRIn FIG. Figure 4 shows a diagram of the plasmid pUCE194_Pgrac-cpf1-crSpcR
На фиг. 5 представлена схема плазмиды pUCE194_cpf1-crAmySIn fig. Figure 5 shows a diagram of the plasmid pUCE194_cpf1-crAmyS
На Фиг. 6 представлена схема плазмиды pUCE194_cpf1-crAprEIn FIG. Figure 6 shows a diagram of the plasmid pUCE194_cpf1-crAprE
На Фиг. 7 изображена делеция 134 п.н. в геноме В. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR в последовательности гена spcR с использованием негомологичного соединения концов.In FIG. Figure 7 shows a 134 bp deletion. in the B. subtilis genome ΔprmA-rsmE-rimO::spcR in the spcR gene sequence using non-homologous end joining.
На Фиг. 8 изображена делеция 30 п.н. в геноме В. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR в последовательности гена spcR с использованием негомологичного соединения концов.In FIG. Figure 8 shows a 30 bp deletion. in the B. subtilis genome ΔprmA-rsmE-rimO::spcR in the spcR gene sequence using non-homologous end joining.
На Фиг. 9 изображена замена А->Т в ПАМ элементе, в геноме В. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR в последовательности гена spcR с использованием негомологичного соединения концов.In FIG. Figure 9 shows the A->T substitution in the PAM element, in the genome of B. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR in the spcR gene sequence using non-homologous end joining.
На Фиг. 10 изображена замена Т->А в протоспейсере, в геноме В. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR в последовательности гена spcR с использованием негомологичного соединения концов.In FIG. 10 shows the T->A substitution in the protospacer, in the genome of B. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR in the spcR gene sequence using non-homologous end joining.
На Фиг. 11 изображена вставка двух нуклеотидов AT в протоспейсере, в геноме В. subtilis AprmA-rsmE-rimO::spcR в последовательности гена spcR с использованием негомологичного соединения концов.In FIG. 11 shows the insertion of two AT protospacer nucleotides in the genome of B. subtilis AprmA-rsmE-rimO::spcR into the spcR gene sequence using non-homologous end joining.
На Фиг. 12 изображена делеция 47 п.н. в геноме В. licheniformis АТСС 14580 в последовательности гена amyS с использованием негомологичного соединения концов.In FIG. Figure 12 shows a 47 bp deletion. in the genome of B. licheniformis ATCC 14580 in the amyS gene sequence using non-homologous end joining.
Примеры осуществления настоящего изобретенияExamples of implementation of the present invention
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pUCE194_cpf1_crEmpty с нуклеотидной последовательностью Seq ID N1.Example 1. Construction of the recombinant plasmid pUCE194_cpf1_crEmpty with the nucleotide sequence Seq ID N1.
Плазмида pUCE194_cpf1_crEmpty представляет челночную плазмиду, основанную на репликоне рМВ1 для Е. coli и репликоне pE194ts для В. subtilis, содержащую ген нуклеазы Cpf1 под индуцируемым промотором Pxy1A-cre [32], область для клонирования гидРНК под сильным конститутивным промотором Pveg, маркеры устойчивости к ампицилину и тетрациклину для Е. coli и В. subtilis соответственно.Plazmide PUCE194_CPF1_crempty represents a shuttle plasmid based on the RMV1 replicon for E. coli and the PE194TS replicon for V. Subtilis, containing the Nuclease CPF1 gene under the PXY1A-CRE induced carrier [32], the area for cloning the hydroelectric power station under strong constitutional soluble Pveg Thor, Markers of Ampicilin resistance and tetracycline for E. coli and B. subtilis, respectively.
Термочувствительная область начала репликации (ori) E194, обеспечивающая репликацию плазмиды в В. subtilis, амплифицирована методом ПЦР с помощью пары праймеров Р1/Р2 с плазмиды pXen5, используемой в качестве матрицы. Полученный линейный фрагмент ДНК размером 1719 п.н. собирают методом Гибсона с фрагментом 2240 п.н. линерезованной плазмиды pUC18 по сайтам рестрикции NdeI/PvuII. В результате получают челночную плазмиду pUCE194.The temperature-sensitive region of the origin of replication (ori) E194, which ensures replication of the plasmid in B. subtilis, was amplified by PCR using the primer pair P1/P2 from the plasmid pXen5, used as a template. The resulting linear DNA fragment measuring 1719 bp. assembled using the Gibson method with a 2240 bp fragment. lineated plasmid pUC18 at NdeI/PvuII restriction sites. The result is the shuttle plasmid pUCE194.
С помощью пар праймеров Р3/Р4 и Р5/Р6 из плазмиды pHY300PLK, используемой в качестве матрицы, методом ПЦР амплифицируют два линейных фрагмента ДНК, кодирующие ген устойчивости к антибиотику тетрациклину с заменами в сайтах рестрикции BsmBI и AarI, добавляют сайт рестрикции SmaI перед промотором гена устойчивости к тетрациклину. Фрагменты ДНК, используя сборку Гибсона, встраивают в плазмиду pUCE194 по сайту ClaI. В результате получают плазмиду pUCE194_tet. Используя пару праймеров Р7/Р8 и плазмиду pPxy1Acre_MCS в качестве матрицы, получают линейный фрагмент ДНК размером 2109 п.н. Данный фрагмент ДНК кодирует репрессор xy1R, промотор Pxy1A-cre, сайт множественного клонирования, и терминатор t1t2 гена rrnB. Фрагмент ДНК размером 2109 п.н. элюируется из геля и встраивается методом Гибсона в плазмиду pUCE194_tet по сайту PstI. В результате получают плазмиду pUCE194_Pxy1A_MCS.Using primer pairs P3/P4 and P5/P6 from the pHY300PLK plasmid used as a template, two linear DNA fragments encoding the tetracycline antibiotic resistance gene with substitutions in the BsmBI and AarI restriction sites are amplified by PCR, and a SmaI restriction site is added in front of the gene promoter resistance to tetracycline. Using Gibson assembly, DNA fragments are inserted into the pUCE194 plasmid at the ClaI site. The result is the plasmid pUCE194_tet. Using the P7/P8 primer pair and the pPxy1Acre_MCS plasmid as a template, a linear DNA fragment of 2109 bp in size is obtained. This DNA fragment encodes the xy1R repressor, the Pxy1A-cre promoter, a multiple cloning site, and the t1t2 terminator of the rrnB gene. DNA fragment size 2109 bp. elutes from the gel and is inserted using the Gibson method into the pUCE194_tet plasmid at the PstI site. The result is the plasmid pUCE194_Pxy1A_MCS.
Плазмиду pUCE194_Pxy1A_MCS обрабатывают рестриктазами AatII/XbaI, в полученный фрагмент размером 7470 п.н. встраивают кассету из терминаторов сборкой Гибсона с использованием праймеров Р9/Р10. Кассету терминаторов, используемую в качестве матрицы ДНК, синтезировали ранее коммерческой фирмой. В результате проведенных манипуляций получают плазмиду pUCE194_Pxy1A_MCS_T.Plasmid pUCE194_Pxy1A_MCS is treated with restriction enzymes AatII/XbaI, resulting in a fragment of 7470 bp in size. a cassette of terminators is inserted using Gibson assembly using primers P9/P10. The terminator cassette used as a DNA template was previously synthesized by a commercial company. As a result of these manipulations, the plasmid pUCE194_Pxy1A_MCS_T is obtained.
В плазмиду pUCE194_Pxy1A_MCS_T по сайтам NotI/ApaI сборкой Гибсона встраивают амплифицированный с использованием праймеров Р11/Р12 фрагмент ДНК, кодирующий ген cpƒ1, сайт посадки рибосом, ssrA-tag - метку ускоренного протеолиза. В качестве матрицы для ПЦР реакции используют геномную ДНК Francisella novicida U112. В результате проведенных манипуляций получают плазмиду с названием pUCE194_tet_Pxy1A_MCS_T_cpf1.A DNA fragment, amplified using primers P11/P12, encoding the cpƒ1 gene, a ribosome landing site, and ssrA-tag, a tag for accelerated proteolysis, is inserted into the plasmid pUCE194_Pxy1A_MCS_T at the NotI/ApaI sites using the Gibson assembly. Francisella novicida U112 genomic DNA is used as a template for the PCR reaction. As a result of these manipulations, a plasmid named pUCE194_tet_Pxy1A_MCS_T_cpf1 is obtained.
В плазмиду pUCE194_tet_Pxy1A_MCS_T_cpf1 по сайту BamHI встраивают последовательность ДНК, кодирующую сильный конститутивный промотор Pveg, сайты рестрикции, терминатор транскрипции Teno. Данную последовательность амплифицируют с использованием праймеров Р13/Р14. В качестве матрицы используют ДНК, синтезированную ранее коммерческой фирмой. В результате проведенных манипуляций получают плазмиду с названием pUCE194_tet_Pxy1A_MCS_T_cpf1_Pveg.A DNA sequence encoding a strong constitutive Pveg promoter, restriction sites, and a Teno transcription terminator is inserted into the pUCE194_tet_Pxy1A_MCS_T_cpf1 plasmid at the BamHI site. This sequence is amplified using primers P13/P14. DNA previously synthesized by a commercial company is used as a template. As a result of these manipulations, a plasmid named pUCE194_tet_Pxy1A_MCS_T_cpf1_Pveg is obtained.
В плазмиду pUCE194_tet_Pxy1A_MCS_T_cpf1_Pveg перед промотором гена устойчивости к тетрациклину по сайту SmaI сборкой Гибсона встраивают два терминатора, синтезированные двумя парами Р15/Р16, Р17/Р18 перекрывающихся праймеров; последовательности терминаторов разделены сайтом рестрикции SmaI. В результате проведенной манипуляции получена плазмида pUCE194_tet_Pxy1A_MCS_T_cpf1_Pveg_T-SmaI-T.Two terminators synthesized by two pairs of P15/P16, P17/P18 overlapping primers are inserted into the plasmid pUCE194_tet_Pxy1A_MCS_T_cpf1_Pveg before the promoter of the tetracycline resistance gene at the SmaI site by the Gibson assembly; the terminator sequences are separated by a SmaI restriction site. As a result of the manipulation, plasmid pUCE194_tet_Pxy1A_MCS_T_cpf1_Pveg_T-SmaI-T was obtained.
В плазмиду pUCE194_tet_Pxy1A_MCS_T_cpf1_Pveg_T-SmaI-T, под промотор Pveg, сборкой Гибсона по сайтам BamHI/ApaI встраивают фрагмент ДНК, амплифицированный с использованием праймеров Р19/20. Праймеры перекрываются в 3'-области и выступают в качестве матрицы для ПЦР. Встроенный фрагмент ДНК содержит два прямых палиндромных повтора, между которыми встроены два сайта рестрикции BsmBI, необходимые для встраивания последовательности спейсера. В результате проведенных манипуляций получают плазмиду с названием pUCE194_cpf1_crEmpty, схема данной плазмиды представлена на Фигуре 1, последовательность представлена в SEQ ID NO: 1. Данная плазмида депонирована в БРЦ ВКПМ под номером В-14352.A DNA fragment amplified using primers P19/20 is inserted into the plasmid pUCE194_tet_Pxy1A_MCS_T_cpf1_Pveg_T-SmaI-T under the Pveg promoter using Gibson assembly at the BamHI/ApaI sites. The primers overlap in the 3' region and act as a template for PCR. The inserted DNA fragment contains two direct palindromic repeats, between which are embedded two BsmBI restriction sites necessary for insertion of the spacer sequence. As a result of these manipulations, a plasmid named pUCE194_cpf1_crEmpty is obtained, the diagram of this plasmid is presented in Figure 1, the sequence is presented in SEQ ID NO: 1. This plasmid was deposited in the BRC VKPM under the number B-14352.
Пример 2. Получение плазмиды pUCE194_Pgrac-cpf1_crEmpty.Example 2. Preparation of plasmid pUCE194_Pgrac-cpf1_crEmpty.
В плазмиду pUCE194_tet (из примера 1) по сайту PstI из плазмиды pHT01 клонируют индуцируемый промотор Pgrac и ген репрессора lacI (с убранными последовательностями сайтов рестрикции BsmBI), получив в результате плазмиду pUCE194_tet_Pgrac. Следующие этапы конструирования плазмиды pUCE194_Pgrac-cpf1_crEmpty соответствуют этапам из примера 1, за исключением встраивания констиутивного промотора, где в плазмиду pUCE194_tet_Pgrac_MCS_T_cpf1 по сайту BamHI встраивают последовательность ДНК, кодирующую сильный конститутивный промотор Р43, сайты рестрикции, терминатор транскрипции Teno, в результате проведенных манипуляций получают плазмиду с названием pUCE194_tet_Pgrac_MCS_T_cpf1_P43.The inducible Pgrac promoter and the lacI repressor gene (with the BsmBI restriction site sequences removed) are cloned into the pUCE194_tet plasmid (from example 1) at the PstI site from the pHT01 plasmid, resulting in the pUCE194_tet_Pgrac plasmid. The following stages of construction of the plasmid pUCE194_Pgrac-cpf1_crEmpty correspond to the stages from example 1, with the exception of the insertion of a constitutive promoter, where a DNA sequence encoding a strong constitutive P43 promoter, restriction sites, and a transcription terminator Teno is inserted into the plasmid pUCE194_tet_Pgrac_MCS_T_cpf1 at the BamHI site, as a result of the manipulations obtain a plasmid with named pUCE194_tet_Pgrac_MCS_T_cpf1_P43.
В плазмиду pUCE194_tet_Pgrac_MCS_T_cpf1_P43 аналогично примеру 1, перед промотором гена устойчивости к тетрациклину по сайту SmaI сборкой Гибсона встраивают два терминатора, последовательности терминаторов разделены сайтом рестрикции SmaI. В результате проведенной манипуляции получена плазмида pUCE194_tet_Pgrac_MCS_T_cpf1_P43_T-SmaI-T.In the plasmid pUCE194_tet_Pgrac_MCS_T_cpf1_P43, similarly to example 1, before the promoter of the tetracycline resistance gene at the SmaI site, two terminators are inserted by the Gibson assembly, the terminator sequences are separated by the SmaI restriction site. As a result of the manipulation, plasmid pUCE194_tet_Pgrac_MCS_T_cpf1_P43_T-SmaI-T was obtained.
В плазмиду pUCE194_tet_Pgrac_MCS_T_cpf1_P43_T-SmaI-T, аналогично примеру 1, под промотор Р43, сборкой Гибсона по сайтам BamHI/ApaI встраивают фрагмент ДНК содержащий два прямых палиндромных повтора, между которыми встроены два сайта рестрикции BsmBI, необходимые для встраивания последовательности спейсера. В результате получают плазмиду pUCE194_Pgrac-cpf1_crEmpty, схема данной плазмиды представлена на Фигуре 2.In the plasmid pUCE194_tet_Pgrac_MCS_T_cpf1_P43_T-SmaI-T, similarly to example 1, under the P43 promoter, a DNA fragment containing two direct palindromic repeats is inserted using Gibson assembly at the BamHI/ApaI sites, between which are built two BsmBI restriction sites, necessary for inserting the spacer sequence. As a result, the plasmid pUCE194_Pgrac-cpf1_crEmpty is obtained; the diagram of this plasmid is presented in Figure 2.
Пример 3. Получение рекомбинантной плазмиды pUCE194_cpf1-crSpcR для внесения модификаций в геном В. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR с использованием негомологичного соединения концов.Example 3. Preparation of the recombinant plasmid pUCE194_cpf1-crSpcR for introducing modifications into the genome of B. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR using non-homologous end joining.
К плазмиде pUCE194_cpf1_crEmpty (пример 1), обработанной эндонуклеазой рестрикции BsmBI, добавляют олигонуклеотиды Р21/Р22 и проводят реакцию лигирования, встроив таким образом последовательность спейсера к гену устойчивости к спектиномицину, между прямыми палиндромными повторами и получив в результате плазмиду pUCE194_cpf1-crSpcR, используемую для модификации генома В. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR, схема данной плазмиды представлена на Фигуре 3. Последовательность спейсера указана в таблице 2.P21/P22 oligonucleotides are added to the pUCE194_cpf1_crEmpty plasmid (example 1), treated with BsmBI restriction endonuclease, and a ligation reaction is performed, thus inserting the spacer sequence to the spectinomycin resistance gene between direct palindromic repeats, resulting in the pUCE194_cpf1-crSpcR plasmid used for modification genome of B. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR, the diagram of this plasmid is presented in Figure 3. The spacer sequence is indicated in Table 2.
Пример 4. Получение рекомбинантной плазмиды pUCE194_Pgrac-cpf1_crSpcR для внесения модификаций в геном В. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR с использованием негомологичного соединения концов.Example 4. Preparation of the recombinant plasmid pUCE194_Pgrac-cpf1_crSpcR for introducing modifications into the genome of B. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR using non-homologous end joining.
К плазмиде pUCE194_Pgrac-cpf1_crEmpty (пример 2), обработанной эндонуклеазой рестрикции BsmBI, добавляют олигонуклеотиды Р21/Р22 и проводят реакцию лигирования, встроив таким образом последовательность спейсера к гену устойчивости к спектиномицину, между прямыми палиндромными повторами и получив в результате плазмиду pUCE194_Pgrac-cpf1_crSpcR, используемую для модификации генома В. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR, схема данной плазмиды представлена на Фигуре 4. Последовательность спейсера указана в таблице 2.Oligonucleotides P21/P22 are added to the plasmid pUCE194_Pgrac-cpf1_crEmpty (example 2), treated with restriction endonuclease BsmBI, and a ligation reaction is carried out, thus inserting the spacer sequence to the spectinomycin resistance gene between direct palindromic repeats, resulting in the plasmid pUCE194_Pgrac-cpf1_crSpc R used to modify the genome of B. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO::spcR, the diagram of this plasmid is presented in Figure 4. The spacer sequence is indicated in Table 2.
Пример 5. Получение рекомбинантной плазмиды pUCE194_cpf1-crAmyS для внесения модификаций в геном Bacillus licheniformis АТСС 14580 с использованием негомологичного соединения концов.Example 5. Production of recombinant plasmid pUCE194_cpf1-crAmyS for introducing modifications into the genome of Bacillus licheniformis ATCC 14580 using non-homologous end joining.
В плазмиду pUCE194_cpf1_crEmpty (пример 1) аналогично, примеру 3, по сайтам BsmBI встраивают последовательность спейсера к гену термостабильной альфа-амилазы amyS, получив в результате плазмиду pUCE194_cpfl-crAmyS для внесения делеций в ген термостабильной альфа-амилазы amyS на хромосоме В. licheniformis АТСС 14580, схема данной плазмиды представлена на Фигуре 5. Последовательность спейсера указана в таблице 2.In the plasmid pUCE194_cpf1_crEmpty (example 1), similarly to example 3, a spacer sequence is inserted into the thermostable alpha-amylase gene amyS at the BsmBI sites, resulting in the plasmid pUCE194_cpfl-crAmyS for introducing deletions into the thermostable alpha-amylase gene amyS on the chromosome of B. licheniformis ATCC 14 580 , the diagram of this plasmid is presented in Figure 5. The spacer sequence is shown in Table 2.
Пример 6. Получение рекомбинантной плазмиды pUCE194_cpf1-crAprE для внесения модификаций в геном Bacillus amyloliquefaciens с использованием негомологичного соединения концов.Example 6. Preparation of the recombinant plasmid pUCE194_cpf1-crAprE for introducing modifications into the genome of Bacillus amyloliquefaciens using non-homologous end joining.
В плазмиду pUCE194_cpf1_crEmpty (пример 1) Аналогично, примеру 3, по сайтам BsmBI встраивают последовательность спейсера к гену щелочной протеазы aprE, получив в результате плазмиду pUCE194_cpf1-crAprE для внесения делеций в ген щелочной протеазы aprE на хромосоме Bacillus amyloliquefaciens HK1 схема данной плазмиды представлена на Фигуре 6. Последовательность спейсера указана в таблице 2.Into the plasmid pUCE194_cpf1_crEmpty (example 1) Similarly to example 3, a spacer sequence is inserted into the alkaline protease aprE gene at the BsmBI sites, resulting in the plasmid pUCE194_cpf1-crAprE for introducing deletions into the alkaline protease gene aprE on the Bacillus amyloliquefaciens HK1 chromosome; the diagram of this plasmid is presented in Fig. gure 6. The spacer sequence is shown in Table 2.
Пример 7. Внесение модификаций в геном В. subtilis с использованием негомологичного соединения концов.Example 7. Modifications to the B. subtilis genome using non-homologous end joining.
Штамм В. subtilis ΔprmA-rsmE-rimO:.spcR трансформируют плазмидой полученной по примерам 3 или 4 (pUCE194_cpf1-crSpcR или pUCE194_Pgrac-cpfl_crSpcR). Клоны, содержащие данную плазмиду, инокулируют в жидкую среду LB с тетрациклином и выращивают в течение ночи на 30°С при постоянной аэрации (200 об/мин.). К ночной культуре клеток добавляют индуктор ксилозу или ИПТГ. Индукция длится в течении двух часов на 30°С при постоянной аэрации (200 об/мин). При титре культуры клеток 109 после индукции клетки титруют до разведения 10-3 и высевают на агаризованную среду LB с соответствующим индуктором (ксилозой или ИПТГ) и 20 мкг/мл тетрациклина и инкубируют на 30°С в течении 1-2 суток. После инкубации на чашках с разведением 10-3 вырастает порядка 20-50 клонов, которые пересевают на агаризованную LB среду с соответствующим индуктором и 20 мкг/мл тетрациклина. Из клонов выделяют хромасомальную ДНК методом [33], ставят ПЦР с праймерами Р27/Р28 и отправляют на секвенирование. Результаты четырех полученных модификаций показывают делеции разного размера, замены и вставки, расположенные в гене spcR, представленью на Фиг. 7-11.The B. subtilis strain ΔprmA-rsmE-rimO:.spcR is transformed with the plasmid obtained according to examples 3 or 4 (pUCE194_cpf1-crSpcR or pUCE194_Pgrac-cpfl_crSpcR). Clones containing this plasmid are inoculated into liquid LB medium with tetracycline and grown overnight at 30°C with constant aeration (200 rpm). The inducer xylose or IPTG is added to the overnight cell culture. Induction lasts for two hours at 30°C with constant aeration (200 rpm). When the cell culture titer is 10 9 after induction, the cells are titrated to a dilution of 10 -3 and plated on LB agar medium with the appropriate inducer (xylose or IPTG) and 20 μg/ml tetracycline and incubated at 30°C for 1-2 days. After incubation on dishes with a dilution of 10 -3, about 20-50 clones grow, which are subcultured onto LB agar medium with the appropriate inducer and 20 μg/ml tetracycline. Chromosomal DNA is isolated from the clones using the method [33], PCR is performed with primers P27/P28, and sent for sequencing. The results of the four modifications obtained show deletions of different sizes, substitutions and insertions located in the spcR gene, as shown in FIG. 7-11.
При необходимости избавления от плазмиды, клетки Bacillus выращивают в LB среде без тетрациклина при 37-43°С при постоянной аэрации (200 об/мин) в течении ночи, ночную культуру рассевают до отдельных колоний на агаризованную среду LB без тетрациклина и выращивают на 37-43°С. Отдельные колонии проверяют на чувствительность к тетрациклину. Отсутствие роста на среде с тетрациклином свидетельствует о потере плазмиды.If it is necessary to get rid of the plasmid, Bacillus cells are grown in LB medium without tetracycline at 37-43°C with constant aeration (200 rpm) overnight, the overnight culture is seeded to individual colonies on LB agar medium without tetracycline and grown at 37- 43°C. Individual colonies are tested for sensitivity to tetracycline. Lack of growth on tetracycline-containing medium indicates loss of the plasmid.
Пример 8 Внесение модификаций в геном В. licheniformis с использованием негомологичного соединения концов.Example 8 Modifications to the B. licheniformis genome using non-homologous end joining.
Штамм В. licheniformis АТСС 14580 трансформируют плазмидой полученной по примеру 5 (pUCE194_cpf1-crAmyS). Клоны, содержащие данную плазмиду, инокулируют в жидкую среду LB с тетрациклином и выращивают в течение ночи на 30°С при постоянной аэрации (200 об/мин). К ночной культуре клеток добавляют ксилозу. Индукция длится в течении двух часов на 30°С при постоянной аэрации (200 об/мин.). После индукции, при титре культуры клеток 109 клетки титруют до разведения 10-3 и высевают на агаризованную среду LB с индуктором ксилозой и 20 мкг/мл тетрациклина и инкубируют на 30°С в течении 1-2 суток. После инкубации на чашках с разведением 10-3 вырастает порядка 20-70 клонов, которые пересевают на агаризованную LB среду с ксилозой и 20 мкг/мл тетрациклина и инкубируют в течении суток на 30°С. Из клонов выделяют хромасомальную ДНК методом [33], ставят ПЦР с соответствующими праймерами и отправляют на секвенирование. В результате было проверено 10 случайных мутантных клонов, среди которых были получены модификации в виде делеций разного размера, замены и вставки, расположенные в гене термостабильной альфа-амилазы, одна из мутаций представлена на Фигуре 12.B. licheniformis strain ATCC 14580 is transformed with the plasmid obtained according to example 5 (pUCE194_cpf1-crAmyS). Clones containing this plasmid are inoculated into liquid LB medium with tetracycline and grown overnight at 30°C with constant aeration (200 rpm). Xylose is added to the overnight cell culture. Induction lasts for two hours at 30°C with constant aeration (200 rpm). After induction, when the cell culture titer is 10 9 , the cells are titrated to a dilution of 10 -3 and plated on LB agar medium with the inducer xylose and 20 μg/ml tetracycline and incubated at 30°C for 1-2 days. After incubation on dishes with a dilution of 10 -3 , about 20-70 clones grow, which are subcultured onto LB agar medium with xylose and 20 μg/ml tetracycline and incubated for 24 hours at 30°C. Chromosomal DNA is isolated from the clones using the method [33], PCR is performed with the appropriate primers, and sent for sequencing. As a result, 10 random mutant clones were tested, among which modifications were obtained in the form of deletions of different sizes, substitutions and insertions located in the thermostable alpha-amylase gene, one of the mutations is presented in Figure 12.
При необходимости избавления от плазмиды, клетки Bacillus выращивают в LB без тетрациклина на 37-43°С при постоянной аэрации (200 об/мин) в течении ночи, ночную культуру рассевают до отдельных колоний на агаризованную среду LB без тетрациклина и выращивают на 37-43°С. Отдельные колонии проверяют на чувствительность к тетрациклину. Отсутствие роста на среде с тетрациклином свидетельствует о потере плазмиды.If it is necessary to get rid of the plasmid, Bacillus cells are grown in LB without tetracycline at 37-43°C with constant aeration (200 rpm) overnight, the overnight culture is seeded to individual colonies on LB agar medium without tetracycline and grown at 37-43 °C. Individual colonies are tested for sensitivity to tetracycline. Lack of growth on tetracycline-containing medium indicates loss of the plasmid.
Пример 9. Внесение модификаций в геном Bacillus amyloliquefaciens с использованием негомологичного соединения концов.Example 9. Modifications to the genome of Bacillus amyloliquefaciens using non-homologous end joining.
Штамм Bacillus amyloliquefaciens HK1 трансформируют плазмидой, полученной по примеру 6 (pUCE194_cpf1-crAprE). Клоны, содержащие данную плазмиду, инокулируют в жидкую среду LB с тетрациклином и выращивают в течение ночи на 30°С при постоянной аэрации (200 об/мин.). К ночной культуре клеток добавляют индуктор ксилозу. Индукция длится в течении двух часов на 30°С при постоянной аэрации (200 об/мин).The Bacillus amyloliquefaciens strain HK1 is transformed with the plasmid obtained according to example 6 (pUCE194_cpf1-crAprE). Clones containing this plasmid are inoculated into liquid LB medium with tetracycline and grown overnight at 30°C with constant aeration (200 rpm). The inducer xylose is added to the overnight cell culture. Induction lasts for two hours at 30°C with constant aeration (200 rpm).
После индукции, при титре культуры клеток 109 клетки титруют до разведения 10-3 и высевают на агаризованную среду LB с индуктором ксилозой и 20 мкг/мл тетрациклина и инкубируют на 30°С в течении 1-2 суток. После инкубации на чашках с разведением 10-3 вырастает порядка 20-50 клонов, которые пересевают на агаризованную LB среду с ксилозой и 20 мкг/мл тетрациклина и инкубируют в течение суток на 30°С. Из клонов выделяют хромосомальную ДНК методом [33], ставят ПЦР с соответствующими праймерами и отправляют на секвенирование. В результате было проверено 10 случайных мутантных клонов, среди которых были получены модификации в виде делеций разного размера, замены и вставки, расположенные в гене щелочной протеазы aprE (данные не представлены).After induction, when the cell culture titer is 10 9 , the cells are titrated to a dilution of 10 -3 and plated on LB agar medium with the inducer xylose and 20 μg/ml tetracycline and incubated at 30°C for 1-2 days. After incubation on dishes with a dilution of 10 -3 , about 20-50 clones grow, which are subcultured onto LB agar medium with xylose and 20 μg/ml tetracycline and incubated for 24 hours at 30°C. Chromosomal DNA is isolated from the clones using the method [33], PCR is performed with the appropriate primers, and sent for sequencing. As a result, 10 random mutant clones were tested, among which modifications were obtained in the form of deletions of different sizes, substitutions, and insertions located in the aprE alkaline protease gene (data not shown).
При необходимости избавления от плазмиды, клетки Bacillus выращивают в LB среде без тетрациклина на 37-43°С при постоянной аэрации (200 об/мин.) в течении ночи, ночную культуру рассевают до отдельных колоний на агаризованную среду LB без тетрациклина и выращивают на 37-43°С. Отдельные колонии проверяют на чувствительность к тетрациклину. Отсутствие роста на среде с тетрациклином свидетельствует о потере плазмиды.If it is necessary to get rid of the plasmid, Bacillus cells are grown in LB medium without tetracycline at 37-43°C with constant aeration (200 rpm) overnight, the overnight culture is seeded to individual colonies on LB agar medium without tetracycline and grown at 37 -43°C. Individual colonies are tested for sensitivity to tetracycline. Lack of growth on tetracycline-containing medium indicates loss of the plasmid.
Источники информацииInformation sources
1. RU 2261273 C2 - Способ получения рибофлавина, штамм bacillus subtilis - продуцент рибофлавина (варианты) - Google Patents [Electronic resource]. URL: https://patents.google.com/patent/RU2261273C2/ru (accessed: 01.11.2022).1. RU 2261273 C2 - Method for producing riboflavin, bacillus subtilis strain - riboflavin producer (variants) - Google Patents [Electronic resource]. URL: https://patents.google.com/patent/RU2261273C2/ru (accessed: 11/01/2022).
2. RU 2405833 C2 - Method for microbiologial synthesis of purine nucleoside of 5'-aminoimidazole-4-carboxamide riboside (aicar) and bacillus subtilis strain - producer of aicar - Google Patents [Electronic resource]. URL:2. RU 2405833 C2 - Method for microbiologial synthesis of purine nucleoside of 5'-aminoimidazole-4-carboxamide riboside (aicar) and bacillus subtilis strain - producer of aicar - Google Patents [Electronic resource]. URL:
https://patents.google.com/patent/RU2405833C2/en (accessed: 01.11.2022).https://patents.google.com/patent/RU2405833C2/en (accessed: 11/01/2022).
3. RU 2313578 C2 - Method for preparing poly-gamma-glutamic acid and microorganism used in this method - Google Patents [Electronic resource]. URL: https://patents.google.com/patent/RU2313578C2/en (accessed: 01.11.2022).3. RU 2313578 C2 - Method for preparing poly-gamma-glutamic acid and microorganism used in this method - Google Patents [Electronic resource]. URL: https://patents.google.com/patent/RU2313578C2/en (accessed: 11/01/2022).
4. Pandey A. et al. Advances in microbial amylases // Biotechnol. Appl. Biochem. Wiley, 2000. Vol. 31, №2. P. 135.4. Pandey A. et al. Advances in microbial amylases // Biotechnol. Appl. Biochem. Wiley, 2000. Vol. 31, No. 2. P. 135.
5. Zukowski M M. Production of comercially valuable products. 1992. P. 311-337.5. Zukowski M M. Production of commercially valuable products. 1992. P. 311-337.
6. Fabret C., Ehrlich S.D., Noirot P. A new mutation delivery system for genome-scale approaches in Bacillus subtilis // Mol. Microbiol. Mol Microbiol, 2002. Vol. 46, №1. P. 25-36.6. Fabret C., Ehrlich S.D., Noirot P. A new mutation delivery system for genome-scale approaches in Bacillus subtilis // Mol. Microbiol. Mol Microbiol, 2002. Vol. 46, no. 1. P. 25-36.
7. Zhang X.Z. et al. mazF, a novel counter-selectable marker for unmarked chromosomal manipulation in Bacillus subtilis // Nucleic Acids Res. Nucleic Acids Res, 2006. Vol. 34, №9.7. Zhang X.Z. et al. mazF, a novel counter-selectable marker for unmarked chromosomal manipulation in Bacillus subtilis // Nucleic Acids Res. Nucleic Acids Res, 2006. Vol. 34, No. 9.
8. Yan X. et al. Cre/lox system and PCR-based genome engineering in Bacillus subtilis // Appl. Environ. Microbiol. Appl Environ Microbiol, 2008. Vol. 74, №17. P. 5556-5562.8. Yan X. et al. Cre/lox system and PCR-based genome engineering in Bacillus subtilis // Appl. Environ. Microbiol. Appl Environ Microbiol, 2008. Vol. 74, no. 17. P. 5556-5562.
9. Weller G.R. et al. Identification of a DNA nonhomologous end-joining complex in bacteria// Science (80-.). Science, 2002. Vol. 297, №5587. P. 1686-1689.9. Weller G.R. et al. Identification of a DNA nonhomologous end-joining complex in bacteria // Science (80-.). Science, 2002. Vol. 297, No. 5587. P. 1686-1689.
10. Shuman S., Glickman M.S. Bacterial DNA repair by non-homologous end joining // Nature Reviews Microbiology. Nat Rev Microbiol, 2007. Vol. 5, №11. P. 852-861.10. Shuman S., Glickman M.S. Bacterial DNA repair by non-homologous end joining // Nature Reviews Microbiology. Nat Rev Microbiol, 2007. Vol. 5, No. 11. P. 852-861.
11. Gupta R. et al. Mycobacteria exploit three genetically distinct DNA double-strand break repair pathways // Mol. Microbiol. Mol Microbiol, 2011. Vol. 79, №2. P. 316-330.11. Gupta R. et al. Mycobacteria exploit three genetically distinct DNA double-strand break repair pathways // Mol. Microbiol. Mol Microbiol, 2011. Vol. 79, no. 2. P. 316-330.
12. Sun B. et al. A CRISPR-Cpf1-Assisted Non-Homologous End Joining Genome Editing System of Mycobacterium smegmatis // Biotechnol. J. Wiley-VCH Verlag, 2018. Vol. 13, №9.12. Sun B. et al. A CRISPR-Cpf1-Assisted Non-Homologous End Joining Genome Editing System of Mycobacterium smegmatis // Biotechnol. J. Wiley-VCH Verlag, 2018. Vol. 13, No. 9.
13. Yan M.-Y. et al. A CRISPR-Assisted Nonhomologous End-Joining Strategy for Efficient Genome Editing in Mycobacterium tuberculosis // MBio / ed. Hatfull G.F. mBio, 2020. Vol. 11, №1.13. Yan M.-Y. et al. A CRISPR-Assisted Nonhomologous End-Joining Strategy for Efficient Genome Editing in Mycobacterium tuberculosis // MBio / ed. Hatfull G.F. mBio, 2020. Vol. 11, No. 1.
14. Fernandes L.G. V., Nascimento A.L.T.O. A Novel Breakthrough in Leptospira spp.Mutagenesis: Knockout by Combination of CRISPR/Cas9 and Non-homologous End-Joining Systems // Front. Microbiol. Frontiers Media SA, 2022. Vol. 13.14. Fernandes L.G. V., Nascimento A.L.T.O. A Novel Breakthrough in Leptospira spp.Mutagenesis: Knockout by Combination of CRISPR/Cas9 and Non-homologous End-Joining Systems // Front. Microbiol. Frontiers Media SA, 2022. Vol. 13.
15. Su T. et al. A CRISPR-Cas9 assisted non-homologous end-joining strategy for one-step engineering of bacterial genome // Sci. Rep.Nature Publishing Group, 2016. Vol. 6, №1. P. 1-11.15. Su T. et al. A CRISPR-Cas9 assisted non-homologous end-joining strategy for one-step engineering of the bacterial genome // Sci. Rep.Nature Publishing Group, 2016. Vol. 6, No. 1. P. 1-11.
16. Zheng X. et al. An efficient system for deletion of large DNA fragments in Escherichia coli via introduction of both Cas9 and the non-homologous end joining system from Mycobacterium smegmatis // Biochem. Biophys. Res. Commun. Elsevier B.V., 2017. Vol. 485, №4. P. 768-774.16. Zheng X. et al. An efficient system for deletion of large DNA fragments in Escherichia coli via introduction of both Cas9 and the non-homologous end joining system from Mycobacterium smegmatis // Biochem. Biophys. Res. Commun. Elsevier B.V., 2017. Vol. 485, No. 4. P. 768-774.
17. Tian J. et al. Efficient Large-Scale and Scarless Genome Engineering Enables the Construction and Screening of Bacillus subtilis Biofuel Overproducers // Int. J. Mol. Sci. MDPI, 2022. Vol. 23, №9.17. Tian J. et al. Efficient Large-Scale and Scarless Genome Engineering Enables the Construction and Screening of Bacillus subtilis Biofuel Overproducers // Int. J. Mol. Sci. MDPI, 2022. Vol. 23, No. 9.
18. Bhavsar A.P., Zhao X., Brown E.D. Development and Characterization of a Xylose-Dependent System for Expression of Cloned Genes in Bacillus subtilis: Conditional Complementation of a Teichoic Acid Mutant // Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67, №1. P. 403-410.18. Bhavsar A.P., Zhao X., Brown E.D. Development and Characterization of a Xylose-Dependent System for Expression of Cloned Genes in Bacillus subtilis: Conditional Complementation of a Teichoic Acid Mutant // Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67, no. 1. P. 403-410.
19. Phan T.T.P., Nguyen H.D., Schumann W. Novel plasmid-based expression vectors for intra- and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis // Protein Expr. Purif. Protein Expr Purif, 2006. Vol. 46, №2. P. 189-195.19. Phan T.T.P., Nguyen H.D., Schumann W. Novel plasmid-based expression vectors for intra- and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis // Protein Expr. Purif. Protein Expr Purif, 2006. Vol. 46, No. 2. P. 189-195.
20. Yansura D.G., Henner D.J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. National Academy of Sciences, 1984. Vol. 81, №2 I. P. 439-443.20. Yansura D.G., Henner D.J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. National Academy of Sciences, 1984. Vol. 81, No. 2 I. P. 439-443.
21. Sun Т., Altenbuchner J. Characterization of a mannose utilization system in bacillus subtilis // J. Bacteriol. American Society for Microbiology (ASM), 2010. Vol. 192, №8. P. 2128-2139.21. Sun T., Altenbuchner J. Characterization of a mannose utilization system in bacillus subtilis // J. Bacteriol. American Society for Microbiology (ASM), 2010. Vol. 192, No. 8. P. 2128-2139.
22. Falkenberg K.B. et al. The ProUSER2.0 Toolbox: Genetic Parts and Highly Customizable Plasmids for Synthetic Biology in Bacillus subtilis // ACS Synth. Biol. American Chemical Society, 2021. Vol. 10, №12. P. 3278-3289.22. Falkenberg K.B. et al. The ProUSER2.0 Toolbox: Genetic Parts and Highly Customizable Plasmids for Synthetic Biology in Bacillus subtilis // ACS Synth. Biol. American Chemical Society, 2021. Vol. 10, No. 12. P. 3278-3289.
23. Guiziou S. et al. A part toolbox to tune genetic expression in Bacillus subtilis. // Nucleic Acids Res. 2016. Vol. 44, №15. P. 7495-7508.23. Guiziou S. et al. A part toolbox to tune genetic expression in Bacillus subtilis. // Nucleic Acids Res. 2016. Vol. 44, No. 15. P. 7495-7508.
24. Song Y. et al. Promoter Screening from Bacillus subtilis in Various Conditions Hunting for Synthetic Biology and Industrial Applications // PLoS One / ed. Isalan M. Public Library of Science, 2016. Vol. 11, №7. P. e0158447.24. Song Y. et al. Promoter Screening from Bacillus subtilis in Various Conditions Hunting for Synthetic Biology and Industrial Applications // PLoS One / ed. Isalan M. Public Library of Science, 2016. Vol. 11, No. 7. P. e0158447.
25. Hao W. et al. Design and Construction of Portable CRISPR-Cpf1-Mediated Genome Editing in Bacillus subtilis 168 Oriented Toward Multiple Utilities // Front. Bioeng. Biotechnol. Frontiers Media S.A., 2020. Vol. 8.25. Hao W. et al. Design and Construction of Portable CRISPR-Cpf1-Mediated Genome Editing in Bacillus subtilis 168 Oriented Toward Multiple Utilities // Front. Bioeng. Biotechnol. Frontiers Media S.A., 2020. Vol. 8.
26. Kunst F. et al. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis // Nature. Nature Publishing Group, 1997. Vol. 390, №6657. P. 249-256.26. Kunst F. et al. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis // Nature. Nature Publishing Group, 1997. Vol. 390, No. 6657. P. 249-256.
27. Rey M.W. et al. Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species // Genome Biol. Genome Biol. 2004. Vol. 5, №10. P. r77.27. Rey M.W. et al. Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species // Genome Biol. Genome Biol. 2004. Vol. 5, No. 10. P. r77.
28. Bacillus amyloliquefaciens strain:HK1 (ID 358264) - BioProject - NCBI [Electronic resource]. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA358264 (accessed: 01.11.2022).28. Bacillus amyloliquefaciens strain:HK1 (ID 358264) - BioProject - NCBI [Electronic resource]. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA358264 (accessed: 11/01/2022).
29. Saiki R.K. et al. Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science (80-.). Science, 1985. Vol. 230, №4732. P. 1350-1354.29. Saiki R.K. et al. Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science (80-.). Science, 1985. Vol. 230, No. 4732. P. 1350-1354.
30. Francis K.P. et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. // Infect. Immun. 2001. Vol.69, №5. P. 3350-3358.30. Francis K.P. et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. // Infect. Immun. 2001. Vol.69, No. 5. P. 3350-3358.
31. Ishiwa H., Shibahara H. New shuttle vectors for Escherichia coli and Bacillus subtilis. II. Plasmid pHY300PLK, a multipurpose cloning vector with a polylinker, derived from pHY460 // Japanese J. Genet. 1985. Vol. 60, №3. P. 235-243.31. Ishiwa H., Shibahara H. New shuttle vectors for Escherichia coli and Bacillus subtilis. II. Plasmid pHY300PLK, a multipurpose cloning vector with a polylinker, derived from pHY460 // Japanese J. Genet. 1985. Vol. 60, no. 3. P. 235-243.
32. Gnuchikh E.Y., Manukhov I.V., Zavilgelsky G.B. Biosensors to Assess the Activity of Promoters and Chaperones in Bacillus subtilis Cells // Appl. Biochem. Microbiol. Pleiades journals, 2021. Vol. 57, №8. P. 877-885.32. Gnuchikh E.Y., Manukhov I.V., Zavilgelsky G.B. Biosensors to Assess the Activity of Promoters and Chaperones in Bacillus subtilis Cells // Appl. Biochem. Microbiol. Pleiades journals, 2021. Vol. 57, No. 8. P. 877-885.
33. Sidoruk K.V. et al. A Method of DNA Extraction from a Wide Range of Objects via Treatment with Ammonium Salts // Appl. Biochem. Microbiol. Pleiades journals, 2021. Vol. 57, №8. P. 899-906.33. Sidoruk K.V. et al. A Method of DNA Extraction from a Wide Range of Objects via Treatment with Ammonium Salts // Appl. Biochem. Microbiol. Pleiades journals, 2021. Vol. 57, No. 8. P. 899-906.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru" <ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="en"
nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3" nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"
fileName="Плазмида для редактирования генома бактерий рода Bacillus и fileName="Plasmid for editing the genome of bacteria of the genus Bacillus and
способ внесения модификаций в геном бактерий рода Bacillus.xml" method of introducing modifications into the genome of bacteria of the genus Bacillus.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"
productionDate="2022-12-13">productionDate="2022-12-13">
<ApplicationIdentification> <ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>
<FilingDate></FilingDate> <FilingDate></FilingDate>
</ApplicationIdentification> </ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference> <ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">НИЦ «Курчатовский <ApplicantName languageCode="ru">SRC "Kurchatovsky"
институт»</ApplicantName>Institute"</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>NRC Kurchatov Institute</ApplicantNameLatin> <ApplicantNameLatin>NRC Kurchatov Institute</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Плазмида для редактирования генома <InventionTitle languageCode="en">Plasmid for genome editing
бактерий рода Bacillus и способ внесения модификаций в геном бактерий bacteria of the genus Bacillus and a method for introducing modifications into the bacterial genome
рода Bacillus</InventionTitle>genus Bacillus</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq> <INSDSeq>
<INSDSeq_length>12406</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>12406</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature> <INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..12406</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..12406</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>
<INSDQualifier> <INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"> <INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Bacillus sp.</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>Bacillus sp.</INSDQualifier_value>
<NonEnglishQualifier_value>Bacillus <NonEnglishQualifier_value>Bacillus
sp.</NonEnglishQualifier_value>sp.</NonEnglishQualifier_value>
</INSDQualifier> </INSDQualifier>
</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>
</INSDFeature> </INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cccactttatccaattttcgtttgttgaactaatgggtgctttagttga <INSDSeq_sequence>cccactttatccaattttcgtttgttgaactaatgggtgctttagttga
agaataaaagaccacattaaaaaatgtggtcttttgtgtttttttaaaggatttgagcgtagcgaaaaatagaataaaagaccacattaaaaaatgtggtcttttgtgtttttttaaaggatttgagcgtagcgaaaaat
ccttttctttcttatcttgataataagggtaactattgccgtcgtccattccgacagcatcgccagtcacccttttctttcttatcttgataaagggtaactattgccgtcgtccattccgacagcatcgccagtcac
tatggcgtgctgctagaattgtatactgctgtcccatgtcatttcctcctttttctttttcatgtagtattatggcgtgctgctagaattgtatactgctgtcccatgtcatttcctcctttttctttttcatgtagtat
gcgcttgtatggaggaaaatattaaaaagccgctgaatgaggttcagcggcttttttgttaatcctgtttgcgcttgtatggaggaaaatattaaaaagccgctgaatgaggttcagcggcttttttgttaatcctgttt
gtaaagaagagctttcagggctcgttgttgtttctcatatacatgtaataatacggactaaaaagtatcggtaaagaagagctttcagggctcgttgttgtttctcatatacatgtaataatacggactaaaaagtatcg
gagctggataaaaccagctccgttttttatctttaattttttttgcgtttaaaagaagaaagctgctcgcgagctggataaaaccagctccgttttttatctttaattttttttgcgtttaaaagaagaaagctgctcgc
atagcgagcagctcttttttatgccaaaaataagtgaggaaaacccgcagaatagctgcgggttttttgtatagcgagcagctcttttttatgccaaaaataagtgaggaaaacccgcagaatagctgcgggttttttgt
tatcaaaaaagcctagagagaagggagaaggtgccatgtcactattgcttcagaaatactcctagaataatatcaaaaaagcctagagagaagggagaaggtgccatgtcactattgcttcagaaatactcctagaataa
aaaaactcatctttaaagatgagctgtccattccataaaaaattacattgtaatcatgtccagaaaatgaaaaaactcatctttaaagatgagctgtccattccataaaaaattacattgtaatcatgtccagaaaatga
tcaatcacaatggaggacattcctaatgccggtgcattctgtcctaaggaagatggcaataattcatagctcaatcacaatggaggacattcctaatgccggtgcattctgtcctaaggaagatggcaataattcatagc
tattgcctaattgggaataaacccttgatgatacttcacttctcattgaatttaaaaccataggatgcgatattgcctaattgggaataaacccttgatgatacttcacttctcattgaatttaaaaccataggatgcga
ttcaattatgctatttcttaaaattacggcttgtgggttgaaagtatttagaatattggtaaggcctattttcaattatgctatttcttaaaattacggcttgtgggttgaaagtatttagaatattggtaaggcctatt
cctaaatagaatccaaaattttgtaatgcatttaaggttccgatatcattcagatgggcgaggtttatgacctaaatagaatccaaaattttgtaatgcatttaaggttccgatatcattcagatgggcgaggtttatga
tatcttgataggacagttttttctctttggtctgaagagattttaataaagccttctctgaagcatacaatatcttgataggacagttttttctctttggtctgaagagattttaataaagccttctctgaagcatacaa
ttcccagcatcctcggtttccgcaactgcatttaggaccattaaagtctattgtcatatgtcccatttctttcccagcatcctcggtttccgcaactgcatttaggaccattaaagtctattgtcatatgtcccatttct
ccagagaagccgcttactcctctatataaatgattgttgataataacaccgatccctattcctgtgctgaccagagaagccgcttactcctctatataaatgattgttgataataacaccgatccctattcctgtgctga
tacttacgtaaataatgttatcgtgattttttgcagctccaaatactttttctccatatgcgccagcatttacttacgtaaataatgttatcgtgattttttgcagctccaaatactttttctccatatgcgccagcatt
tgcctcattttcaataaaaacaggcacattgtacttctcttgtatcgaagattttaagtcaatatctctctgcctcattttcaataaaaacaggcacattgtacttctcttgtatcgaagattttaagtcaatatctctc
cagttggagttcggagtgaaaacaattttttgatctttatcaatgagtccaggcacgcaaatacctataccagttggagttcggagtgaaaacaattttttgatctttatcaatgagtccaggcacgcaaatacctatac
caataagcccgtacggagattggggcatttgcgtaataaagtgatgaatcatatcaatcaaaatgtctttcaataagcccgtacggagattggggcatttgcgtaataaagtgatgaatcatatcaatcaaaatgtcttt
cgttatttctggagaattggattccaaatggcggtattgatcaagaacgattgttccttcaaggtctgttcgttatttctggagaattggattccaaatggcggtattgatcaagaacgattgttccttcaaggtctgtt
aaaatgccattaatataatccacaccaacatctattccaacggagtatcctgcctttttattaaaaacaaaaaatgccattaatataatccacaccaacatctattccaacggagtatcctgcctttttattaaaaacaa
gcatgacaggtcttcttccgccacttgattgtccttgacctatttcaaataccatactttctttcattaagcatgacaggtcttcttccgccacttgattgtccttgacctatttcaaataccatactttctttcattaa
cgtgtttacctgtgatgagacagttgatttatttaatccagtcatttcagataattttgctcttgaaatacgtgtttacctgtgatgagacagttgatttatttaatccagtcatttcagataattttgctcttgaaata
ggtgaatttttaaggatttcttttaataataacttttgatttacttttttgacaaaggtttgatcagcgaggtgaatttttaaggatttcttttaataataacttttgatttacttttttgacaaaggtttgatcagcga
tatccacttcatccactccatttgtttaatctttaaattaagtatcaacatagtacatagcgaatcttcctatccacttcatccactccatttgtttaatctttaaattaagtatcaacatagtacatagcgaatcttcc
ctttattatatctaatgtgttcataaaaaactaaaaaaaatattgaaaatactgacgaggttatataagactttattatatctaatgtgttcataaaaaactaaaaaaaatattgaaaatactgacgaggttatataaga
tgaaaataagttagtttgtttaaacaacaaactaataggtgatgtacttactatatgaaataaaatgcattgaaaataagttagtttgtttaaacaacaaactaataggtgatgtacttactatatgaaataaaatgcat
ctgtatttgaatgaatttatttttaagggggaaatcacatggctcaatctcattccagttcaatcaactactgtatttgaatgaatttatttttaagggggaaatcacatggctcaatctcattccagttcaatcaacta
ttttgtaagcgttaacaaagtggtttaagagctcggtaccgcggccgcatttgattaactaataagaggtttttgtaagcgttaacaaagtggtttaagagctcggtaccgcggccgcatttgattaactaataagaggt
gcaaacatgtcaatttatcaagaatttgttaataaatatagtttaagtaaaactctaagatttgagttaagcaaacatgtcaatttatcaagaatttgttaataaatatagtttaagtaaaactctaagatttgagttaa
tcccacagggtaaaacacttgaaaacataaaagcaagaggtttgattttagatgatgagaaaagagctaatccccacagggtaaaacacttgaaaacataaaagcaagaggtttgattttagatgatgagaaaagagctaa
agactacaaaaaggctaaacaaataattgataaatatcatcagttttttatagaggagatattaagttcgagactacaaaaaggctaaacaaataattgataaatatcatcagttttttatagaggagatattaagttcg
gtttgtattagcgaagatttattacaaaactattctgatgtttattttaaacttaaaaagagtgatgatggtttgtattagcgaagatttattacaaaactattctctgatgtttattttaaacttaaaaagagtgatgatg
ataatctacaaaaagattttaaaagtgcaaaagatacgataaagaaacaaatatctgaatatataaaggaataatctacaaaaagattttaaaagtgcaaaagatacgataaagaaacaaatatctgaatatataaagga
ctcagagaaatttaagaatttgtttaatcaaaaccttatcgatgctaaaaaagggcaagagtcagatttactcagagaaatttaagaatttgtttaatcaaaaccttatcgatgctaaaaaagggcaagagtcagattta
attctatggctaaagcaatctaaggataatggtatagaactatttaaagccaatagtgatatcacagataattctatggctaaagcaatctaaggataatggtatagaactatttaaagccaatagtgatatcacagata
tagatgaggcgttagaaataatcaaatcttttaaaggttggacaacttattttaagggttttcatgaaaatagatgaggcgttagaaataatcaaatcttttaaaggttggacaacttattttaagggttttcatgaaaa
tagaaaaaatgtttatagtagcaatgatattcctacatctattatttataggatagtagatgataatttgtagaaaaaatgtttatagtagcaatgatattcctacatctattatttataggatagtagatgataatttg
cctaaatttctagaaaataaagctaagtatgagagtttaaaagacaaagctccagaagctataaactatgcctaaatttctagaaaataaagctaagtatgagagtttaaaagacaaagctccagaagctataaactatg
aacaaattaaaaaagatttggcagaagagctaacctttgatattgactacaaaacatctgaagttaatcaaacaaattaaaaaagatttggcagaagagctaacctttgatattgactacaaaacatctgaagttaatca
aagagttttttcacttgatgaagtttttgagatagcaaactttaataattatctaaatcaaagtggtattaagagtttttcacttgatgaagtttttgagatagcaaactttaataattatctaaatcaaagtggtatt
actaaatttaatactattattggtggtaaatttgtaaatggtgaaaatacaaagagaaaaggtataaatgactaaatttaatactattattggtggtaaatttgtaaatggtgaaaatacaaagagaaaaggtataaatg
aatatataaatctatactcacagcaaataaatgataaaacactcaaaaaatataaaatgagtgttttattaatatataaatctatactcacagcaaataaatgataaaacactcaaaaaatataaaatgagtgttttatt
taagcaaattttaagtgatacagaatctaaatcttttgtaattgataagttagaagatgatagtgatgtataagcaaattttaagtgatacagaatctaaatcttttgtaattgataagttagaagatgatagtgatgta
gttacaacgatgcaaagtttttatgagcaaatagcagcttttaaaacagtagaagaaaaatctattaaaggttacaacgatgcaaagtttttatgagcaaatagcagcttttaaaacagtagaagaaaaatctattaaag
aaacactatctttattatttgatgatttaaaagctcaaaaacttgatttgagtaaaatttattttaaaaaaaacactatctttattatttgatgatttaaaagctcaaaaacttgatttgagtaaaatttattttaaaaa
tgataaatctcttactgatctatcacaacaagtttttgatgattatagtgttattggtacagcggtactatgataaatctcttactgatctatcacaacaagtttttgatgattatagtgttattggtacagcggtacta
gaatatataactcaacaaatagcacctaaaaatcttgataaccctagtaagaaagagcaagaattaataggaatatataactcaacaaatagcacctaaaaatcttgataaccctagtaagaaagagcaagaattaatag
ccaaaaaaactgaaaaagcaaaatacttatctctagaaactataaagcttgccttagaagaatttaataaccaaaaaaactgaaaaagcaaaatacttatctctagaaactataaagcttgccttagaagaatttaataa
gcatagagatatagataaacagtgtaggtttgaagaaatacttgcaaactttgcggctattccgatgatagcatagagatatagataaacagtgtaggtttgaagaaatacttgcaaactttgcggctattccgatgata
tttgatgaaatagctcaaaacaaagacaatttggcacagatatctatcaaatatcaaaatcaaggtaaaatttgatgaaatagctcaaaacaaagacaatttggcacagatctatcaaatatcaaaatcaaggtaaaa
aagacctacttcaagctagtgcggaagatgatgttaaagctatcaaggatcttttagatcaaactaataaaagacctacttcaagctagtgcggaagatgatgttaaagctatcaaggatcttttagatcaaactaataa
tctcttacataaactaaaaatatttcatattagtcagtcagaagataaggcaaatattttagacaaggattctcttacataaactaaaaatatttcatattagtcagtcagaagataaggcaaatattttagacaaggat
gagcatttttatctagtatttgaggagtgctactttgagctagcgaatatagtgcctctttataacaaaagagcatttttatctagtatttgaggagtgctactttgagctagcgaatatagtgcctctttataacaaaa
ttagaaactatataactcaaaagccatatagtgatgagaaatttaagctcaattttgagaactcgactttttagaaactatataactcaaaagccatatagtgatgagaaatttaagctcaattttgagaactcgacttt
ggctaatggttgggataaaaataaagagcctgacaatacggcaattttatttatcaaagatgataaatatggctaatggttgggataaaaataaagagcctgacaatacggcaattttatttatcaaagatgataaatat
tatctgggtgtgatgaataagaaaaataacaaaatatttgatgataaagctatcaaagaaaataaaggcgtatctgggtgtgatgaataagaaaaataacaaaatatttgatgataaagctatcaaagaaaataaaggcg
agggttataaaaaaattgtttataaacttttacctggcgcaaataaaatgttacctaaggttttcttttcagggttataaaaaaattgtttataaacttttacctggcgcaaataaaatgttacctaaggttttcttttc
tgctaaatctataaaattttataatcctagtgaagatatacttagaataagaaatcattccacacatacatgctaaatctataaaattttataatcctagtgaagatatacttagaataagaaatcattccacacataca
aaaaatggtagtcctcaaaaaggatatgaaaaatttgagtttaatattgaagattgccgaaaatttatagaaaaatggtagtcctcaaaaaggatatgaaaaatttgagtttaatattgaagattgccgaaaatttatag
atttttataaacagtctataagtaagcatccggagtggaaagattttggatttagattttctgatactcaatttttataaacagtctataagtaagcatccggagtggaaagattttggatttagattttctgatactca
aagatataattctatagatgaattttatagagaagttgaaaatcaaggctacaaactaacttttgaaaataagatataattctatagatgaattttatagagaagttgaaaatcaaggctacaaactaacttttgaaaat
atatcagagagctatattgatagcgtagttaatcagggtaaattgtacctattccaaatctataataaagatatcagagagctatattgatagcgtagttaatcagggtaaattgtacctattccaaatctataataaag
atttttcagcttatagcaaagggcgaccaaatctacatactttatattggaaagcgctgtttgatgagagatttttcagcttatagcaaagggcgaccaaatctacatactttatattggaaagcgctgtttgatgagag
aaatcttcaagatgtggtttataagctaaatggtgaggcagagcttttttatcgtaaacaatcaatacctaaatcttcaagatgtggtttataagctaaatggtgaggcagagcttttttatcgtaaacaatcaatacct
aaaaaaatcactcacccagctaaagaggcaatagctaataaaaacaaagataatcctaaaaaagagagtgaaaaaaatcactcacccagctaaagaggcaatagctaataaaaacaaagataatcctaaaaaagagagtg
tttttgaatatgatttaatcaaagataaacgctttactgaagataagtttttctttcactgtcctattactttttgaatatgatttaatcaaagataaacgctttactgaagataagtttttctttcactgtcctattac
aatcaattttaaatctagtggagctaataagtttaatgatgaaatcaatttattgctaaaagaaaaagcaaatcaattttaaatctagtggagctaataagtttaatgatgaaatcaatttattgctaaaagaaaaagca
aatgatgttcatatattaagtatagatagaggtgaaagacatttagcttactatactttggtagatggtaaatgatgttcatatattaagtatagatagaggtgaaagacatttagcttactatactttggtagatggta
aaggcaatatcatcaaacaagatactttcaacatcattggtaatgatagaatgaaaacaaactaccatgaaaggcaatatcatcaaacaagatactttcaacatcattggtaatgatagaatgaaaacaaactaccatga
taagcttgctgcaatagagaaagatagggattcagctaggaaagactggaaaaagataaataacatcaaataagcttgctgcaatagagaaagatagggattcagctaggaaagactggaaaaagataaataacatcaaa
gagatgaaagagggctatctatctcaggtagttcatgaaatagctaagctagttatagagtataatgctagagatgaaagagggctatctatctcaggtagttcatgaaatagctaagctagttatagagtataatgcta
ttgtggtttttgaggatttaaattttggatttaaaagagggcgtttcaaggtagagaagcaggtctatcattgtggtttttgaggatttaaattttggatttaaaagagggcgtttcaaggtagagaagcaggtctatca
aaagttagaaaaaatgctaattgagaaactaaactatctagttttcaaagataatgagtttgataaaactaaagttagaaaaaatgctaattgagaaactaaactatctagttttcaaagataatgagtttgataaaact
gggggagtgcttagagcttatcagctaacagcaccttttgagacttttaaaaagatgggtaaacaaacaggggggagtgcttagagcttatcagctaacagcaccttttgagacttttaaaaagatgggtaaacaaacag
gtattatctactatgtaccagctggttttacttcaaaaatttgtcctgtaactggttttgtaaatcagttgtattatctactatgtaccagctggttttacttcaaaaatttgtcctgtaactggttttgtaaatcagtt
atatcctaagtatgaaagtgtcagcaaatctcaagagttctttagtaagtttgacaagatttgttataacatatcctaagtatgaaagtgtcagcaaatctcaagagttctttagtaagtttgacaagatttgttataac
cttgataagggctattttgagtttagttttgattataaaaactttggtgacaaggctgccaaaggcaagtcttgataagggctattttgagtttagttttgattataaaaactttggtgacaaggctgccaaaggcaagt
ggactatagctagctttgggagtagattgattaactttagaaattcagataaaaatcataattgggatacggactatagctagctttgggagtagattgattaactttagaaattcagataaaaatcataattgggatac
tcgagaagtttatccaactaaagagttggagaaattgctaaaagattattctatcgaatatgggcatggctcgagaagtttatccaactaaagagttggagaaattgctaaaagattattctatcgaatatgggcatggc
gaatgtatcaaagcagctatttgcggtgagagcgacaaaaagttttttgctaagctaactagtgtcctaagaatgtatcaaagcagctatttgcggtgagagcgacaaaaagttttttgctaagctaactagtgtcctaa
atactatcttacaaatgcgtaactcaaaaacaggtactgagttagattatctaatttcaccagtagcagaatactatcttacaaatgcgtaactcaaaaacaggtactgagttagattatctaatttcaccagtagcaga
tgtaaatggcaatttctttgattcgcgacaggcgccaaaaaatatgcctcaagatgctgatgccaatggttgtaaatggcaatttctttgattcgcgacaggcgccaaaaaatatgcctcaagatgctgatgccaatggt
gcttatcatattgggctaaaaggtctgatgctactaggtaggatcaaaaataatcaagagggcaaaaaacgcttatcatattgggctaaaaggtctgatgctactaggtaggatcaaaaataatcaagagggcaaaaaac
tcaatttggttatcaaaaatgaagagtattttgagttcgtgcagaataggaataacgcaggcaaaacaaatcaatttggttatcaaaaatgaagagtattttgagttcgtgcagaataggaataacgcaggcaaaacaaa
ttcatttaatcaaaatgttgctcttgtttgttaataattcattcaagggggccactgcagatagaattttttcatttaatcaaaatgttgctcttgtttgttaataattcattcaagggggccactgcagatagaatttt
gtcaaaataattttattgacaacgtcttattaacgttgatataatttaaattttatttgacaaaaatggggtcaaaataattttattgacaacgtcttattaacgttgatataatttaaattttatttgacaaaaatggg
ctcgtgttgtacaataaatgtaggggcccgtctaagaactttaaataatttctactgttgtagatgagacctcgtgttgtacaataaatgtaggggcccgtctaagaactttaaataatttctactgttgtagatgagac
ggaagatatcgtctcagtctaagaactttaaatggcgcgccggatccacttaaacaagtaataaaaagacggaagatatcgtctcagtctaagaactttaaatggcgcgccggatccacttaaacaagtaataaaaagac
cgccgggattttctctcggcggcttttttatgctttctttagagagatccccatgccgaactcagaagtgcgccgggattttctctcggcggcttttttatgctttctttagagagatccccatgccgaactcagaagtg
aaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaata
aaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgaaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctga
gtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacggtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacg
cccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacccgccataaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttcta
caaactcttcctgtcgtcatatctacaagccatccccccacagatacggtaaactagcctcgtttttgcacaaactcttcctgtcgtcatatctacaagccatccccccacagatacggtaaactagcctcgtttttgca
tcagctcgattctcctcctctttctatattagtacttttgaaaattttagcatttttacatgctacctattcagctcgattctcctcctctttctatattagtacttttgaaaattttagcatttttacatgctacctat
cattatagcactatcgaatctcatctataaacttatattggtgaatataaataaaaagattgatgcgaatcattatagcactatcgaatctcatctataaacttatattggtgaatataaataaaaagattgatgcgaat
tctcacatcgaacggattgttgatgattacgaaaatattaagagcacagactattacacagaaaatcaagtctcacatcgaacggattgttgatgattacgaaaatattaagagcacagactattacacagaaaatcaag
aattaaaaaaacgtagagagagtttgaaagaagtagtgaatacatggaaagaggggtatcacgaaaaaagaattaaaaaaacgtagagagagtttgaaagaagtagtgaatacatggaaagaggggtatcacgaaaaaag
taaagaggttaataaattaaagcgagagaatgatagtttgaatgagcagttgaatgtatcagagaaattttaaagaggttaataaattaaagcgagagaatgatagtttgaatgagcagttgaatgtatcagagaaattt
caagctagtacagtgactttatatcgtgctgcgagggcgaatttccctgggtttgagaaagggtttaatacaagctagtacagtgactttatatcgtgctgcgagggcgaatttccctgggtttgagaaagggtttaata
ggcttaaagagaaattctttaatgattccaaatttgagcgtgtgggacagtttatggatgttgtacaggaggcttaaagagaaattctttaatgattccaaatttgagcgtgtgggacagtttatggatgttgtacagga
taatgtccagaaggtcgatagaaagcgtgagaaacagcgtacagacgatttagagatgtagaggtacttttaatgtccagaaggtcgatagaaagcgtgagaaacagcgtacagacgatttagagatgtagaggtacttt
tatgccgagaaaactttttgcgtgtgacagtccttaaaatatacttagagcgtaagcgaaagtagtagcgtatgccgagaaaactttttgcgtgtgacagtccttaaaatatacttagagcgtaagcgaaagtagtagcg
acagctattaactttcggttgcaaagctctaggatttttaatggacgcagcgcatcacacgcaaaaaggaacagctattaactttcggttgcaaagctctaggatttttaatggacgcagcgcatcacacgcaaaaagga
aattggaataaatgcgaaatttgagatgttaattaaagacctttttgaggtctttttttcttagatttttaattggaataaatgcgaaatttgagatgttaattaaagacctttttgaggtctttttttcttagattttt
ggggttatttaggggagaaaacataggggggtactacgacctcccccctaggtgtccattgtccattgtcggggttatttaggggagaaaacataggggggtactacgacctcccccctaggtgtccattgtccattgtc
caaacaaataaataaatattgggtttttaatgttaaaaggttgttttttatgttaaagtgaaaaaaacagcaaacaaataaataaatattgggtttttaatgttaaaaggttgttttttatgttaaagtgaaaaaaacag
atgttgggaggtacagtgatggttgtagatagaaaagaagagaaaaaagttgctgttactttaagacttaatgttgggaggtacagtgatggttgtagatagaaaagaagagaaaaaagttgctgttactttaagactta
caacagaagaaaatgagatattaaatagaatcaaagaaaaatataatattagcaaatcagatgcaaccggcaacagaagaaaatgagatattaaatagaatcaaagaaaaatataatattagcaaatcagatgcaaccgg
tattctaataaaaaaatatgcaaaggaggaatacggtgcattttaaacaaaaaaagatagacagcactggtattctaataaaaaaatatgcaaaggaggaatacggtgcattttaaacaaaaaagatagacagcactgg
catgctgcctatctatgactaaattttgttaagtgtattagcaccgttattatatcatgagcgaaaatgtcatgctgcctatctatgactaaattttgttaagtgtattagcaccgttattatatcatgagcgaaaatgt
aataaaagaaactgaaaacaagaaaaattcaagaggacgtaattggacatttgttttatatccagaatcaaataaaagaaactgaaaacaagaaaaattcaagaggacgtaattggacatttgttttatatccagaatca
gcaaaagccgagtggttagagtatttaaaagagttacacattcaatttgtagtgtctccattacatgatagcaaaagccgagtggttagagtatttaaaagagttacacattcaatttgtagtgtctccattacatgata
gggatactgatacagaaggtaggatgaaaaaagagcattatcatattctagtgatgtatgagggtaataagggatactgatacagaaggtaggatgaaaaaagagcattatcatattctagtgatgtatgagggtaataa
atcttatgaacagataaaaataattaacagaagaattgaatgcgactattccgcagattgcaggaagtgtatcttatgaacagataaaaataattaacagaagaattgaatgcgactattccgcagattgcaggaagtgt
gaaaggtcttgtgagatatatgcttcacatggacgatcctaataaatttaaatatcaaaaagaagatatggaaaggtcttgtgagatatatgcttcacatggacgatcctaataaatttaaatatcaaaaagaagatatg
atagtttatggcggtgtagatgttgatgaattattaaagaaaacaacaacagatagatataaattaattaatagtttatggcggtgtagatgttgatgaattattaaagaaaacaacaacagatagatataaattaatta
aagaaatgattgagtttattgatgaacaaggaatcgtagaatttaagagtttaatggattatgcaatgaaaagaaatgattgagtttattgatgaacaaggaatcgtagaatttaagagtttaatggattatgcaatgaa
gtttaaatttgatgattggttcccgcttttatgtgataactcggcgtatgttattcaagaatatataaaagtttaaatttgatgattggttcccgcttttatgtgataactcggcgtatgttattcaagaatatataaaa
tcaaatcggtataaatctgaccgatagattttgaatttaggtgtcacaagacactcttttttcgcaccagtcaaatcggtataaatctgaccgatagattttgaatttaggtgtcacaagacactcttttttcgcaccag
cgaaaactggtttaagccgactgcgcaaaagacataatccgggaattcctgttataaaaaaaggatcaatcgaaaactggtttaagccgactgcgcaaaagacataatccgggaattcctgttataaaaaaaggatcaat
tttgaactctctcccaaagttgatcccttaacgatttagaaatccctttgagaatgtttatatacattcatttgaactctctcccaaagttgatcccttaacgatttagaaatccctttgagaatgtttatatacattca
aggtaaccagccaactaatgacaatgattcctgaaaaaagtaataacaaattactatacagataagttgaaggtaaccagccaactaatgacaatgattcctgaaaaaagtaataacaaattactatacagataagttga
ctgatcaacttccataggtaacaacctttgatcaagtaagggtatggataataaaccacctacaattgcactgatcaacttccataggtaacaacctttgatcaagtaagggtatggataataaaccacctacaattgca
atacctgttccctctgataaaaagctggtaaagttaagcaaactcattccagcaccagcttcctgctgttatacctgttccctctgataaaaagctggtaaagttaagcaaactcattccagcaccagcttcctgctgtt
tcaagctacttgaaacaattgttgatataactgttttggtgaacgaaagcccacctaaaacaaatacgattcaagctacttgaaacaattgttgatataactgttttggtgaacgaaagcccacctaaaacaaatacgat
tataattgtcatgaaccatgatgttgtttctaaaagaaaggaagcagttaaaaagctaacagaaagaaattataattgtcatgaaccatgatgttgtttctaaaagaaaggaagcagttaaaaagctaacagaaagaaat
gtaactccgatgtttaacacgtataaaggacctcttctatcaacaagtatcccaccaatgtagccgaaaagtaactccgatgtttaacacgtataaaggacctcttctatcaacaagtatcccaccaatgtagccgaaaa
taatgacactcattgttccagggaaaataattacacttccgatttcggcagtacttagctggtgaacatctaatgacactcattgttccagggaaaataattacacttccgatttcggcagtacttagctggtgaacatc
tttcatcatataaggaaccatagagacaaaccctgctactgttccaaatataattcccccacaaagaacttttcatcatataaggaaccatagagacaaaccctgctactgttccaaatataattcccccacaaagaact
ccaatcataaaaggtatatttttccctaatccgggatcaacaaaaggatctgttactttcctgatatgttccaatcataaaaggtatatttttccctaatccgggatcaacaaaaggatctgttactttcctgatatgtt
ttacaaatatcaggaatgacagcacgctaacgataagaaaagaaatgctatatgatgttgtaaacaacatttacaaatatcaggaatgacagcacgctaacgataagaaaagaaatgctatatgatgttgtaaacaacat
aaaaaatacaatgcctacagacattagtataattcctttgatatcaaaatgaccttttatccttacttctaaaaaatacaatgcctacagacattagtataattcctttgatatcaaaatgaccttttatccttacttct
ttctttaataatttcataagaaacggaacagtgataattgttatcataggaatgagtagaagataggaccttctttaataatttcataagaaacggaacagtgataattgttatcataggaatgagtagaagataggacc
aatgaatataatgggctatcattccaccaatcgctggaccgactccttctcccatggctactatcgatccaatgaatataatgggctatcattccaccaatcgctggaccgactccttctcccatggctactatcgatcc
aataagaccaaatgctttacccctattttcctttggaatatagcgcgcaactacaaccattacgagtgctaataagaccaaatgctttacccctattttcctttggaatatagcgcgcaactacaaccattacgagtgct
ggaaatgcagctgcaccagccccttgaataaaacgagccataataagtaaggaaaagaaagaatggccaaggaaatgcagctgcaccagccccttgaataaaacgagccataataagtaaggaaaagaaagaatggccaa
caaacccaattaccgacccgaaacaatttattataattccaaataggagtaaccttttgatgcctaattgcaaacccaattaccgacccgaaacaatttattataattccaaataggagtaaccttttgatgcctaattg
atcagatagctttccatatacagctgttccaatggaaaaggttaacataaaggctgtgttcacccagtttatcagatagctttccatatacagctgttccaatggaaaaggttaacataaaggctgtgttcacccagttt
gtactcgccggtggtttattaaaatcatttgcaatatcaggtaatgacacgttcaaaaccatttcatttagtactcgccggtggtttattaaaatcatttgcaatatcaggtaatgacacgttcaaaaccatttcattta
atacgctaaaaaaagataaaatgcaaagccaaattaaaatttggttgtgtcgtaaattcgattgtgaataatacgctaaaaaaagataaaatgcaaagccaaattaaaatttggttgtgtcgtaaattcgattgtgaata
ggatgtattcacatttcaccctccaataatgagggcagacgtagtttatagggttaatgatacgcttcccggatgtattcacatttcaccctccaataatgagggcagacgtagtttatagggttaatgatacgcttccc
tcttttaattgaaccctgttacattcattattcattacacttcataattaattcctcctaaacttgattatcttttaattgaaccctgttacattcattattcattacacttcataattaattcctcctaaacttgatta
aaacattttaccacatataaactaagttttaaattcagtatttcatcacttatacaacaatatggcccgtaaacattttaccacatataaactaagttttaaattcagtatttcatcacttatacaacaatatggcccgt
tcgattcactgcattaatgaatcgcccaatgcattaagctgaaaaaacccctgccaggcggcagggggtttcgattcactgcattaatgaatcgcccaatgcattaagctgaaaaaacccctgccaggcggcaggggggtt
ttttaatccagtaactattacccgggtactaatgtagtaagaaaaaagccggcccattacaggccggcttttttaatccagtaactattacccgggtactaatgtagtaagaaaaaagccggcccattacaggccggctt
tttttacgctttaatggcggggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttctttttacgctttaatggcggggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttc
ctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtactcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggta
atacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggcca
ggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaa
tcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagc
tccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaatccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaa
gcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctggggcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctggg
ctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaac
ccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtagccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtag
gcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctg
cgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgct
ggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatccttggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctt
tgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatt
atcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatat
gagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttc
gttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggcccgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccc
cagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagcccagtgctgcaatgataccgcgagaccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagcc
ggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccggg
aagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggt
gtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatccgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcc
cccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagcccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcag
tgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttc
tgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccgtgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccg
gcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttgcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttctt
cggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaacggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaa
ctgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgca
aaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagca
tttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggt
tccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtc</INSDSeq_sequence>tccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq> </INSDSeq>
</SequenceData> </SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
Claims (14)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2815835C1 true RU2815835C1 (en) | 2024-03-22 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110951741A (en) * | 2019-12-27 | 2020-04-03 | 江南大学 | Bacillus subtilis polygene editing and expression regulation system based on CRISPR Cpf1 |
| WO2021175756A1 (en) * | 2020-03-04 | 2021-09-10 | Basf Se | Shuttle vector for expression in e. coli and bacilli |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110951741A (en) * | 2019-12-27 | 2020-04-03 | 江南大学 | Bacillus subtilis polygene editing and expression regulation system based on CRISPR Cpf1 |
| WO2021175756A1 (en) * | 2020-03-04 | 2021-09-10 | Basf Se | Shuttle vector for expression in e. coli and bacilli |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HAO W. et al. Design and Construction of Portable CRISPR-Cpf1-Mediated Genome Editing in Bacillus subtilis 168 Oriented Toward Multiple Utilities. Front Bioeng Biotechnol. 2020 Sep 2;8:524676. doi: 10.3389/fbioe.2020.524676. * |
| WU Y. et al. CAMERS-B: CRISPR/Cpf1 assisted multiple-genes editing and regulation system for Bacillus subtilis. Biotechnol Bioeng. 2020 Jun;117(6):1817-1825. doi: 10.1002/bit.27322. ТОЙМЕНЦЕВА А.А., АЛЬТЕНБУХНЕР ДЖ. Получение делеционных мутантов Bacillus pumilus по генам протеиназ на основе технологии CRISPR-Cas9. Международный научно-исследовательский журнал, 2018, N 11(77), часть 1, с. 136-142. doi: 10.23670/IRJ.2018.77.11.026. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Huang et al. | Development of a RecE/T‐assisted CRISPR–Cas9 toolbox for Lactobacillus | |
| CN107400677B (en) | Bacillus licheniformis genome editing vector based on CRISPR-Cas9 system and preparation method thereof | |
| CN107083392B (en) | CRISPR/Cpf1 gene editing system and application thereof in mycobacteria | |
| Dong et al. | Current development in genetic engineering strategies of Bacillus species | |
| Gu et al. | Highly efficient base editing in Staphylococcus aureus using an engineered CRISPR RNA-guided cytidine deaminase | |
| Yan et al. | Cre/lox system and PCR-based genome engineering in Bacillus subtilis | |
| Jiang et al. | CRISPR-assisted editing of bacterial genomes | |
| Bae et al. | Allelic replacement in Staphylococcus aureus with inducible counter-selection | |
| Bouillaut et al. | Genetic Manipulation of Clostridium difficile: Firmicutes (Low G+ C Gram Positive) | |
| Wolf et al. | Targeted genome editing in the rare actinomycete Actinoplanes sp. SE50/110 by using the CRISPR/Cas9 system | |
| CN108277231B (en) | CRISPR system for corynebacterium genome editing | |
| Carr et al. | Engineering the genome of Thermus thermophilus using a counterselectable marker | |
| WO2017045281A1 (en) | Vibrio universal suicide vector for gene knockout and use thereof | |
| EP2588615B1 (en) | Self-deleting plasmid | |
| Brans et al. | New integrative method to generate Bacillus subtilis recombinant strains free of selection markers | |
| Ishikawa et al. | A new simple method for introducing an unmarked mutation into a large gene of non-competent Gram-negative bacteria by FLP/FRT recombination | |
| Lim et al. | Programmed gRNA removal system for CRISPR-Cas9-mediated multi-round genome editing in Bacillus subtilis | |
| Xin et al. | Development of a counterselectable seamless mutagenesis system in lactic acid bacteria | |
| Plaut et al. | Improvements to a markerless allelic exchange system for Bacillus anthracis | |
| Jiang et al. | Highly efficient genome editing in Xanthomonas oryzae pv. oryzae through repurposing the endogenous type I‐C CRISPR‐Cas system | |
| Yan et al. | CRISPR/FnCas12a-mediated efficient multiplex and iterative genome editing in bacterial plant pathogens without donor DNA templates | |
| Wang et al. | Highly efficient CRISPR-mediated base editing in Sinorhizobium meliloti | |
| RU2815835C1 (en) | Plasmid for genome editing of bacteria of genus bacillus and method of modifying genome of bacteria of genus bacillus | |
| KR20180111680A (en) | Method of Preparing Corynebacterium Variant Based on CRISPR/Cas System, Recombinase, and ssODN | |
| Wang et al. | pheS* as a counter-selectable marker for marker-free genetic manipulations in Bacillus anthracis |