RU2815452C2

RU2815452C2 - Polypeptide comprising antigen-binding domain and transport segment

Info

Publication number: RU2815452C2
Application number: RU2020120552A
Authority: RU
Inventors: Томоюки ИГАВА; Хироюки ИСИКАВА; Наока ХИРОНИВА; Тацуя КАВА
Original assignee: Чугаи Сейяку Кабусики Кайся
Priority date: 2017-11-28
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2024-03-15

Abstract

FIELD: biotechnology; chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to biochemistry, in particular to a polypeptide specific for target tissue and comprising an antigen-binding domain and a transporting fragment, in which the transporting fragment has an inhibiting domain, inhibiting antigen-binding activity of an antigen-binding domain, in which the antigen-binding domain has a shorter half-life in blood than the transporting fragment. Disclosed is a pharmaceutical composition containing said polypeptide. Also disclosed is a method of producing said polypeptide.

EFFECT: invention enables to efficiently obtain said polypeptides.

14 cl, 23 tbl, 31 dwg, 16 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates

Настоящее изобретение относится к полипептиду, содержащему антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент, который имеет ингибирующий домен, ингибирующий антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена, и обладающему более длительным временем полужизни, чем время полужизни антигенсвязывающего домена, в том случае, если он присутствует индивидуально, к способам получения и скрининга полипептидов, фармацевтическим композициям, которые содержат полипептид, способам получения и скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем его ассоциации с конкретным VL-, VH- или VHH-доменом, и к библиотекам слитых полипептидов, каждый из которых содержит однодоменное антитело, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем его ассоциации с конкретным VL, VH или VHH.The present invention relates to a polypeptide containing an antigen binding domain and a transport fragment, which has an inhibitory domain that inhibits the antigen binding activity of the antigen binding domain, and having a half-life longer than the half-life of the antigen binding domain, when present individually, methods for producing and polypeptide screening, pharmaceutical compositions that contain a polypeptide, methods for producing and screening a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited by its association with a particular VL, VH or VHH domain, and libraries of fusion polypeptides each containing a single domain antibody, whose antigen-binding activity can be inhibited by its association with a specific VL, VH or VHH.

Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for creating the invention

Антитела привлекли внимание в качестве лекарственных средств, поскольку они обладают высокой стабильностью в плазме и вызывают небольшое количество побочных действий. В частности, большое количество лекарственных средств на основе антител IgG-типа находится в продаже, и большое количество лекарственных средств на основе антител находится настоящее время в разработке (непатентные документы 1 и 2).Antibodies have attracted attention as drugs because they are highly stable in plasma and cause few side effects. In particular, a large number of IgG-type antibody drugs are commercially available, and a large number of antibody drugs are currently under development (Non-Patent Documents 1 and 2).

Антитела привлекают внимание в качестве лекарственных средств благодаря их высокой стабильности в плазме и небольшому количеству побочных действий. Среди них большое количество лекарственных средства на основе антител IgG-типа поступают в продажу, и в настоящее время много лекарственных средств на основе антител находится в разработке (NPL 1 и 2).Antibodies have attracted attention as drugs due to their high stability in plasma and few side effects. Among them, a large number of IgG-type antibody drugs are commercialized, and many antibody drugs are currently in development (NPL 1 and 2).

Ритуксан против CD20, цетуксимаб против EGFR, герцептин против HER2, и т.п. к настоящему времени одобрены в качестве терапевтических лекарственных средств в виде лекарственных средств на основе антител против рака (NPL 3). Указанные молекулы антител связываются с их антигенами, которые экспрессируются на раковых клетках, и в результате проявляют цитотоксическую активность в отношении раковых клеток посредством ADCC, ингибирования сигнала и т.д. Известно, что указанная цитотоксическая активность, основанная на ADCC-активности и т.д., зависит от количества антигенов, экспрессируемых на клетках, которые являются мишенями терапевтических антител (NPL 4). Кроме того, высокие уровни экспрессии таргетных антигенов являются предпочтительными с точки зрения воздействий терапевтических антител. Однако, если антиген, хотя и имеющий высокий уровень экспрессии, экспрессируется в здоровых тканях, то цитотоксическая активность, основанная на ADCC-активности и т.д., оказывает воздействие на здоровые клетки. В результате побочные действия становятся серьезной проблемой. В связи с этим, предпочтительно, чтобы антигены, таргетируемые терапевтическими антителами, которые применяют в качестве терапевтических лекарственных средств при раке, экспрессировались специфически на раковых клетках. Например, молекула антитела против ЕрСАМ (молекула клеточной адгезии эпителия), которая известна в качестве ракового антигена, рассматривалась в качестве перспективной в качестве терапевтического лекарственного средства при раке. Однако известно, что ЕрСАМ экспрессируется также в поджелудочной железе. Так, описано, что по результатам клинических испытаний введение антитела к ЕрСАМ вызывает панкреатит в качестве нежелательной реакции из-за цитотоксической активности в отношении поджелудочной железы (NPL 5).Rituxan against CD20, cetuximab against EGFR, Herceptin against HER2, etc. have now been approved as therapeutic drugs in the form of antibody drugs against cancer (NPL 3). These antibody molecules bind to their antigens, which are expressed on cancer cells, and as a result exhibit cytotoxic activity against cancer cells through ADCC, signal inhibition, etc. It is known that said cytotoxic activity, based on ADCC activity, etc., depends on the amount of antigens expressed on cells that are targets of therapeutic antibodies (NPL 4). In addition, high levels of expression of target antigens are advantageous in terms of the effects of therapeutic antibodies. However, if the antigen, although highly expressed, is expressed in healthy tissues, then cytotoxic activity based on ADCC activity, etc., affects healthy cells. As a result, side effects become a serious problem. In this regard, it is preferable that antigens targeted by therapeutic antibodies that are used as therapeutic drugs for cancer are expressed specifically on cancer cells. For example, an antibody molecule against EpCAM (epithelial cell adhesion molecule), which is known as a cancer antigen, has been considered promising as a therapeutic drug for cancer. However, it is known that EpCAM is also expressed in the pancreas. Thus, it is described that, according to the results of clinical trials, the administration of an antibody to EpCAM causes pancreatitis as an undesirable reaction due to cytotoxic activity against the pancreas (NPL 5).

После успехов, достигнутых в отношении лекарственных средств на основе антител, обладающих цитотоксической активностью, основанной на ADCC-активности, опубликованы данные о втором поколении улучшенных молекул антител, обладающих сильной цитотоксической активностью, обусловленной, например, повышением ADCC-активности путем удаления фукозы из N-связанного олигосахарида в нативной Fc-области человеческого IgG1 (NPL 6) или повышением ADCC-активности путем усиления связывания с FcγRIIIa посредством аминокислотной замены в нативной Fc-области человеческого IgG1 (непатентный документ 7). Улучшенные молекулы антител, обладающие более сильной цитотоксической активностью, такие как конъюгат антитела и лекарственного средства (ADC), содержащий антитело, конъюгированное с лекарственным средством, которое обладает сильной цитотоксической активностью (NPL 8), и низкомолекулярное антитело, обладающее цитотоксической активностью в отношении раковых клеток в результате рекрутинга Т-клеток к раковым клеткам (NPL 9), описаны также в качестве лекарственных средств на основе антител, обладающих цитотоксической активностью в отношении раковых клеток, с использованием механизма, отличного от упомянутой выше опосредуемой NK-клетками ADCC-активности.Following the advances made with antibody drugs having cytotoxic activity based on ADCC activity, a second generation of improved antibody molecules having potent cytotoxic activity due, for example, to increasing ADCC activity by removing fucose from N- bound oligosaccharide in the native Fc region of human IgG1 (NPL 6) or increasing ADCC activity by enhancing binding to FcγRIIIa through amino acid substitution in the native Fc region of human IgG1 (Non-Patent Document 7). Improved antibody molecules that have stronger cytotoxic activity, such as an antibody-drug conjugate (ADC) containing an antibody conjugated to a drug that has potent cytotoxic activity (NPL 8) and a small molecule antibody that has cytotoxic activity against cancer cells as a result of T cell recruitment to cancer cells (NPL 9), are also described as antibody-based drugs with cytotoxic activity against cancer cells, using a mechanism different from the above-mentioned NK cell-mediated ADCC activity.

Указанные молекулы антител, обладающие более сильной цитотоксической активностью, могут проявлять цитотоксическую активность даже в отношении раковых клеток, которые экспрессирует невысокие уровни антигена, но также проявлять цитотоксическую активность в отношении здоровых тканей, в которых экспрессируются низкие уровни антигена, аналогичного антигену раковых клеток. Так, EGFR-BiTE, биспецифическое антитело против CD3 и EGFR, может проявлять сильную цитотоксическую активность в отношении раковых клеток и обладать противоопухолевым действием путем рекрутинга Т-клеток к раковым клеткам, сравнимым с действием цетуксимаба, нативного человеческого IgG1 против EGFR. С другой стороны, установлено также, что серьезные побочные действия проявляются при введении EGFR-BiTE обезьянам циномолгус, поскольку EGFR экспрессируется также в здоровых тканях (NPL 10). Кроме того, в клинических условиях обнаружено, что ADC биватузумаба с мертансином, который содержит мертансин, конъюгированный с антителом против CD44v6, отличающегося высоким уровнем экспрессии на раковых клетках, вызывает серьезную кожную токсичность и гепатотоксичность, поскольку CD44v6 экспрессируется также в здоровых тканях (NPL 11).These antibody molecules having stronger cytotoxic activity may exhibit cytotoxic activity even against cancer cells that express low levels of antigen, but also exhibit cytotoxic activity against healthy tissues that express low levels of antigen similar to cancer cell antigen. Thus, EGFR-BiTE, a bispecific antibody against CD3 and EGFR, can exhibit potent cytotoxic activity against cancer cells and have antitumor effects by recruiting T cells to cancer cells, comparable to the effects of cetuximab, a native human IgG1 against EGFR. On the other hand, it has also been established that serious side effects occur when EGFR-BiTE is administered to cynomolgus monkeys, since EGFR is also expressed in healthy tissues (NPL 10). Additionally, the bivatuzumab mertansine ADC, which contains mertansine conjugated to an anti-CD44v6 antibody highly expressed on cancer cells, has been found to cause severe skin and hepatotoxicity in clinical settings because CD44v6 is also expressed in healthy tissues (NPL 11) .

Как отмечалось выше, применение антитела, которое может обладать сильной цитотоксической активностью даже в отношении раковых клеток, экспрессирующих низкие уровни антигена, требует, чтобы антиген-мишень экспрессировался исключительно специфическим для рака образом. Однако с учетом того, что антиген-мишень HER2 герцептина или антиген-мишень EGFR цетуксимаба экспрессируется также в здоровых тканях, лишь ограниченное количество раковых антигенов может экспрессироваться исключительно специфическим для рака образом. Поэтому побочные действия, опосредуемые цитотоксическим действием на здоровые ткани, могут становиться проблемой, хотя цитотоксическая активность в отношении раковых клеток может повышаться.As noted above, the use of an antibody, which can have potent cytotoxic activity even against cancer cells expressing low levels of antigen, requires that the target antigen be expressed exclusively in a cancer-specific manner. However, given that the HER2 target antigen of Herceptin or the EGFR target antigen of cetuximab are also expressed in healthy tissues, only a limited number of cancer antigens may be expressed in a purely cancer-specific manner. Therefore, side effects mediated by cytotoxicity to healthy tissue may become a problem, although cytotoxicity to cancer cells may be enhanced.

В настоящее время установлено, что ипилимумаб, который повышает опухолевый иммунитет путем ингибирования CTLA4, участвующего в иммуносупрессии при раке, удлиняет общую выживаемость при метастатической меланоме (NPL 12). Однако ипилимумаб системно ингибирует CTLA4 и поэтому вызывает напоминающие аутоиммунитет серьезные побочные действия из-за системной активации иммунитета, хотя повышает опухолевый иммунитет (NPL 13).Ipilimumab, which enhances tumor immunity by inhibiting CTLA4, which is involved in cancer immunosuppression, has now been shown to prolong overall survival in metastatic melanoma (NPL 12). However, ipilimumab inhibits CTLA4 systemically and therefore causes autoimmunity-like severe side effects due to systemic immune activation, although it enhances tumor immunity (NPL 13).

При этом лекарственные средства на основе антител, обладающие терапевтическим действием путем ингибирования воспалительных цитокинов при воспалительных и аутоиммунных заболеваниях, известны в качестве лекарственных средств на основе антител, предназначенных для лечения болезней, отличных от рака (NPL 14). Известно, что, например, ремикад или хумира, таргетирующие TNF, и актемра, таргетирующая IL-6R, обладают высоким терапевтическим действием в отношении ревматоидного артрита, при этом инфекционное заболевание проявляется в качестве побочного действия, связанного с системной нейтрализацией этих цитокинов (NPL15).Meanwhile, antibody drugs having therapeutic effects by inhibiting inflammatory cytokines in inflammatory and autoimmune diseases are known as antibody drugs for treating diseases other than cancer (NPL 14). It is known that, for example, Remicade or Humira, which targets TNF, and Actemra, which targets IL-6R, have a high therapeutic effect against rheumatoid arthritis, while the infectious disease manifests itself as a side effect associated with the systemic neutralization of these cytokines (NPL15).

В качестве методов, пригодных для второго поколения лекарственных средств на основе антител, разработаны различные методы. Например, опубликованы данные о методах, повышающих эффекторные функции, способность связывать антиген, фармакокинетические параметры или стабильность, или снижающих риск иммуногенности (NPL 16). Однако к настоящему времени известно лишь небольшое количество сведений о методах, которые позволяют лекарственным средствам на основе антител действовать специфически на ткань-мишень для разрешения проблемы, обусловленной побочными действиями, указанными выше. Описанные методы включают метод, в котором соединяют антитело с маскирующим пептидом через линкер, который расщепляется протеазой, которая экспрессируется в пораженной области, такой как раковая ткань или воспалительная ткань, маскируя тем самым антигенсвязывающий сайт антитела с помощью маскирующего пептида и ингибируя антигенсвязывающую активность антитела; и отделяют от него в результате диссоциации маскирующий пептид с помощью расщепления протеазой этого линкера так, что антитело сохраняет свою антигенсвязывающую активность и приобретает способность связываться с антигеном в патологической ткани-мишени (NPL 17 и 18 и PTL 1).Various methods have been developed as methods suitable for the second generation of antibody-based drugs. For example, methods have been published that enhance effector functions, antigen binding capacity, pharmacokinetic parameters or stability, or reduce the risk of immunogenicity (NPL 16). However, to date, only a small amount of information is known about methods that allow antibody-based drugs to act specifically on the target tissue to solve the problem caused by the side effects mentioned above. Described methods include a method in which the antibody is coupled to a masking peptide through a linker that is cleaved by a protease that is expressed in the affected area, such as cancer tissue or inflammatory tissue, thereby masking the antigen-binding site of the antibody with the masking peptide and inhibiting the antigen-binding activity of the antibody; and the masking peptide is dissociated from it by protease cleavage of this linker so that the antibody retains its antigen-binding activity and acquires the ability to bind the antigen in the pathological target tissue (NPL 17 and 18 and PTL 1).

Перечень процитированных документовList of cited documents

[Патентные документы][Patent documents]

[PTL 1] WO 2010/081173.[PTL 1] WO 2010/081173.

[Непатентные документы][Non-patent documents]

[NPL 1] Janice М. Reichert, Clark J. Rosensweig, Laura В. Faden и Matthew С. Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic. Nat. Biotechnol. 23, 2005, cc. 1073-1078.[NPL 1] Janice M. Reichert, Clark J. Rosensweig, Laura B. Faden and Matthew S. Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic. Nat. Biotechnol. 23, 2005, cc. 1073-1078.

[NPL 2] Pavlou A.K., Belsey M.J., The therapeutic antibodies market to 2008. Eur. J. Pharm. Biopharm. 59 (3), 2005, cc. 389-396.[NPL 2] Pavlou A.K., Belsey M.J., The therapeutic antibodies market to 2008. Eur. J. Pharm. Biopharm. 59 (3), 2005, cc. 389-396.

[NPL 3] Weiner L.M., Surana R., Wang S., Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat. Rev. Immunol. 10 (5), 2010, cc. 317-327.[NPL 3] Weiner L.M., Surana R., Wang S., Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat. Rev. Immunol. 10 (5), 2010, cc. 317-327.

[NPL 4] Lewis G.D, Figari I., Fendly В., Wong W.L., Carter P., Gorman C., Shepard H.M., Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol. Immunotherapy 37, 1993, cc. 255-263.[NPL 4] Lewis G.D., Figari I., Fendly V., Wong W.L., Carter P., Gorman C., Shepard H.M., Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol. Immunotherapeutics 37, 1993, cc. 255-263.

[NPL 5] de Bono J.S., Tolcher A.W., Forero A., Vanhove G.F., Takimoto C., Bauer R.J., Hammond L. A., Patnaik A., White M.L., Shen S., Khazaeli M.B., Rowinsky E.K., LoBuglio A.F., ING-1, a monoclonal antibody targeting Ep-CAM in patients with advanced adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 10 (22), 2004, cc. 7555-7565.[NPL 5] de Bono J.S., Tolcher A.W., Forero A., Vanhove G.F., Takimoto C., Bauer R.J., Hammond L.A., Patnaik A., White M.L., Shen S., Khazaeli M.B., Rowinsky E.K., LoBuglio A.F., ING- 1, a monoclonal antibody targeting Ep-CAM in patients with advanced adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 10 (22), 2004, cc. 7555-7565.

[NPL 6] Satoh M., Iida S., Shitara K., Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies. Expert Opin. Biol. Ther. 6 (11), 2006, cc. 1161-1173.[NPL 6] Satoh M., Iida S., Shitara K., Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies. Expert Opin. Biol. Ther. 6 (11), 2006, cc. 1161-1173.

[NPL 7] Desjarlais J.R., Lazar G.A., Zhukovsky E.A., Chu S.Y., Optimizing engagement of the immune system by anti-tumor antibodies: an engineer's perspective. Drug Discov. Today 12 (21-22), 2007, cc. 898-910.[NPL 7] Desjarlais J.R., Lazar G.A., Zhukovsky E.A., Chu S.Y., Optimizing engagement of the immune system by anti-tumor antibodies: an engineer's perspective. Drug Discov. Today 12 (21-22), 2007, cc. 898-910.

[NPL 8] Alley S.C., Okeley N.M., Senter P.D., Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Curr. Opin. Chem. Biol. 14 (4), 2010, cc. 529-537.[NPL 8] Alley S.C., Okeley N.M., Senter P.D., Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Curr. Opin. Chem. Biol. 14 (4), 2010, cc. 529-537.

[NPL 9] BiTE: Teaching antibodies to engage T-cells for cancer therapy. Baeuerle P.A., Kufer P., Bargou R., Curr. Opin. Mol. Ther. 11 (1), 2009, cc. 22-30.[NPL 9] BiTE: Teaching antibodies to engage T-cells for cancer therapy. Baeuerle P. A., Kufer P., Bargou R., Curr. Opin. Mol. Ther. 11 (1), 2009, cc. 22-30.

[NPL 10] Lutterbuese R., Raum T., Kischel R., Hoffmann P., Mangold S., Rattel B., Friedrich M., Thomas O., Lorenczewski G., Rau D., Schaller E., Herrmann I., Wolf A., Urbig T., Baeuerle P.A., Kufer P., T cell-engaging BiTE antibodies specific for EGFR potently eliminate KRAS- and BRAF-mutated colorectal cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (28), 2010, cc. 12605-12610.[NPL 10] Lutterbuese R., Raum T., Kischel R., Hoffmann P., Mangold S., Rattel B., Friedrich M., Thomas O., Lorenczewski G., Rau D., Schaller E., Herrmann I ., Wolf A., Urbig T., Baeuerle P.A., Kufer P., T cell-engaging BiTE antibodies specific for EGFR potently eliminate KRAS- and BRAF-mutated colorectal cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (28), 2010, cc. 12605-12610.

[NPL 11] Riechelmann H., Sauter A., Golze W., Hanft G., Schroen C., Hoermann K., Erhardt T., Gronau S., Phase I trial with the CD44v6-targeting immunoconjugate bivatuzumab mertansine in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 44 (9), 2008, cc. 823-829.[NPL 11] Riechelmann H., Sauter A., Golze W., Hanft G., Schroen C., Hoermann K., Erhardt T., Gronau S., Phase I trial with the CD44v6-targeting immunoconjugate bivatuzumab mertansine in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 44 (9), 2008, cc. 823-829.

[NPL 12] Trinh V.A., Hwu W. J., Ipilimumab in the treatment of melanoma. Expert Opin. Biol. Ther., 14 апреля 2012 г. (doi: 10.1517/14712598.2012.675325).[NPL 12] Trinh V.A., Hwu W.J., Ipilimumab in the treatment of melanoma. Expert Opin. Biol. Ther., April 14, 2012 (doi: 10.1517/14712598.2012.675325).

[NPL 13] Juszczak A., Gupta A., Karavitaki N., Middleton M.R., Grossman A., IPILIMUMAB - A NOVEL IMMUNOMODULATING THERAPY CAUSING AUTOIMMUNE HYPOPHYSITIS: A CASE REPORT AND REVIEW. Eur. J. Endocrinol. 10 апреля 2012 г. (doi: 10.1530/EJE-12-0167).[NPL 13] Juszczak A., Gupta A., Karavitaki N., Middleton M.R., Grossman A., IPILIMUMAB - A NOVEL IMMUNOMODULATING THERAPY CAUSING AUTOIMMUNE HYPOPHYSITIS: A CASE REPORT AND REVIEW. Eur. J. Endocrinol. April 10, 2012 (doi: 10.1530/EJE-12-0167).

[NPL 14] Takeuchi T., Kameda H., The Japanese experience with biologic therapies for rheumatoid arthritis. Nat. Rev. Rheumatol. 6 (11), 2010, cc. 644-652.[NPL 14] Takeuchi T., Kameda H., The Japanese experience with biological therapies for rheumatoid arthritis. Nat. Rev. Rheumatol. 6 (11), 2010, cc. 644-652.

[NPL 15] Nam J.L., Winthrop K.L., van Vollenhoven R.F., Pavelka K., Valesini G., Hensor E.M., Worthy G., Landewe R., Smolen J.S., Emery P., Buch M.H., Current evidence for the management of rheumatoid arthritis with biological disease-modifying antirheumatic drugs: a systematic literature review informing the EULAR recommendations for the management of RA. Ann. Rheum. Dis. 69 (6), 2010, cc. 976-986.[NPL 15] Nam J.L., Winthrop K.L., van Vollenhoven R.F., Pavelka K., Valesini G., Hensor E.M., Worthy G., Landewe R., Smolen J.S., Emery P., Buch M.H., Current evidence for the management of rheumatoid arthritis with biological disease-modifying antirheumatic drugs: a systematic literature review informing the EULAR recommendations for the management of RA. Ann. Rheum. Dis. 69 (6), 2010, cc. 976-986.

[NPL 16] Kim S.J., Park Y., Hong H.J., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies. Mol. Cells. 20 (1), 2005, cc. 17-29.[NPL 16] Kim S.J., Park Y., Hong H.J., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies. Mol. Cells. 20 (1), 2005, cc. 17-29.

[NPL 17] Desnoyers L.R., Vasiljeva O., Richardson J.H., Yang A., Menendez E.E., Liang T.W., Wong C, Bessette P.H., Kamath K., Moore S. J., Sagert J.G., Hostetter D.R., Han F., Gee J., Flandez J., Markham K., Nguyen M., Krimm M., Wong K.R., Liu S., Daugherty P.S., West J.W., Lowman H.B., Tumor-specific activation of an EGFR-targeting probody enhances therapeutic index. Sci Transl Med. 5(207), 16 октября 2013 г„ 207ra144.[NPL 17] Desnoyers L.R., Vasiljeva O., Richardson J.H., Yang A., Menendez E.E., Liang T.W., Wong C, Bessette P.H., Kamath K., Moore S.J., Sagert J.G., Hostetter D.R., Han F., Gee J. , Flandez J., Markham K., Nguyen M., Krimm M., Wong K.R., Liu S., Daugherty P.S., West J.W., Lowman H.B., Tumor-specific activation of an EGFR-targeting probody enhances therapeutic index. Sci Transl Med. 5(207), October 16, 2013„ 207ra144.

[NPL 18] Polu K.R., Lowman H.B., Probody therapeutics for targeting antibodies to diseased tissue. Expert Opin Biol Ther. 14(8), август 2014 г., cc. 1049-1053.[NPL 18] Polu K.R., Lowman H.B., Probody therapeutics for targeting antibodies to diseased tissue. Expert Opin Biol Ther. 14(8), August 2014, cc. 1049-1053.

Краткое изложение сущности изобретенияSummary of the invention

Задача, положенная в основу изобретенияThe problem underlying the invention

При создании настоящего изобретения высказано предположение о том, что описанные выше методики диссоциации путем расщепления протеазой маскирующего пептида, который ингибирует антигенсвязывающую активность антитела так, что антитело сохраняет свою антигенсвязывающую активность, могут вызывать побочные действия, поскольку антитело, расщепленное в пораженной области, может попадать в здоровые ткани с кровотоком, поскольку расщепление протеазой является необратимым.In making the present invention, it is believed that the above-described dissociation techniques by protease cleavage of a masking peptide that inhibits the antigen-binding activity of an antibody so that the antibody retains its antigen-binding activity may cause side effects since the antibody cleaved in the affected area may enter the healthy tissues with blood flow, since protease breakdown is irreversible.

Настоящее изобретение создано на основе указанной идеи. Объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, которую можно применять для лечения заболевания, снижая при этом побочные действия, и ее действующее вещество. Другим объектом настоящего изобретения являются способы скрининга и получения фармацевтической композиции и действующего вещества.The present invention is based on the above idea. The object of the present invention is a pharmaceutical composition that can be used to treat a disease, while reducing side effects, and its active substance. Another object of the present invention is methods for screening and obtaining a pharmaceutical composition and active substance.

Решение указанной задачиSolution of the specified problem

При создании настоящего изобретения проведены широкие исследования и в результате были разработаны полипептиды, содержащие антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент, который имеет ингибирующий домен, ингибирующий связывающую активность антигенсвязывающего домена, и обладающий более длительными временем полужизни, чем время полужизни антигенсвязывающего домена в том случае, когда он присутствует индивидуально. Предполагается, что применение полипептида может обеспечивать восстановление у антигенсвязывающего домена его антигенсвязывающей активности в пораженной(ых) болезнью ткани(ях) и проявление антигенсвязывающей активности в пораженной(ых) болезнью ткани(ях). Кроме того, системное распределение активированной формы антигенсвязывающего домена может подавляться благодаря различию во временах полужизни между полипептидом, содержащим антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого ингибируется, и полипептидом, содержащим антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая активность которого восстанавливается. Кроме того, при создании настоящего изобретения установлено, что полипептиды или фармацевтические композиции, содержащие полипептид, можно применять для лечения заболевания, и установлено также, что полипептиды или фармацевтические композиции можно применять для лечения заболевания, где применение включает введение полипептида; и что полипептиды можно применять для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания. И, наконец, при создании настоящего изобретения разработаны также способы скрининга и получения полипептида, способы получения и скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем его ассоциации с конкретным VL, VH или VHH, и библиотека, включающая однодоменное антитело, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем ассоциации с конкретным VL, VH или VHH.In making the present invention, extensive research has been carried out and, as a result, polypeptides have been developed comprising an antigen binding domain and a transport moiety that has an inhibitory domain that inhibits the binding activity of the antigen binding domain and has a half-life longer than that of the antigen binding domain when it is present individually. It is believed that the use of a polypeptide can restore the antigen-binding domain to its antigen-binding activity in diseased tissue(s) and exhibit antigen-binding activity in diseased tissue(s). In addition, the systemic distribution of the activated form of the antigen binding domain can be suppressed due to the difference in half-life between an antigen binding domain-containing polypeptide whose antigen binding activity is inhibited and an antigen binding domain-containing polypeptide whose antigen binding activity is restored. In addition, the present invention has found that polypeptides or pharmaceutical compositions containing a polypeptide can be used to treat a disease, and it has also been found that polypeptides or pharmaceutical compositions can be used to treat a disease, where the use includes administering a polypeptide; and that the polypeptides can be used to prepare a medicament for treating a disease. Finally, the present invention also provides methods for screening and producing a polypeptide, methods for producing and screening a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited by association with a particular VL, VH or VHH, and a library including a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited. inhibit by association with a specific VL, VH or VHH.

Настоящее изобретение базируется на указанных данных, и оно конкретно включает представленные ниже варианты осуществления изобретения.The present invention is based on the above data, and it specifically includes the following embodiments of the invention.

(1) Полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент, где транспортирующий фрагмент имеет ингибирующий домен, который ингибирует антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена, и антигенсвязывающий домен, который имеет более короткое время полужизни в крови, чем транспортирующий фрагмент.(1) A polypeptide comprising an antigen binding domain and a transport fragment, wherein the transport fragment has an inhibitory domain that inhibits the antigen binding activity of the antigen binding domain, and an antigen binding domain that has a shorter half-life in blood than the transport fragment.

(2) Полипептид по п. (1), в котором молекулярная масса антигенсвязывающего домена меньше, чем молекулярная масса транспортирующего фрагмента.(2) The polypeptide according to claim (1), in which the molecular weight of the antigen-binding domain is less than the molecular weight of the transport fragment.

(3) Полипептид по п. (1) или п. (2), в котором молекулярная масса антигенсвязывающего домена составляет 60 кДа или менее.(3) The polypeptide of claim (1) or claim (2), wherein the molecular weight of the antigen binding domain is 60 kDa or less.

(4) Полипептид по одному из п.п. (1)-(3), в котором транспортирующий фрагмент обладает FcRn-связывающей активностью, а антигенсвязывающий домен не обладает FcRn-связывающей активностью или имеет более слабую FcRn-связывающую активность, чем активность транспортирующего фрагмента.(4) Polypeptide according to one of paragraphs. (1)-(3), in which the transport fragment has FcRn-binding activity, and the antigen-binding domain does not have FcRn-binding activity or has a weaker FcRn-binding activity than the activity of the transport fragment.

(5) Полипептид по одному из п.п. (1)-(4), в котором антигенсвязывающий домен обладает способностью высвобождаться из полипептида, и антигенсвязывающий домен, высвободившийся из полипептида, имеет более высокую антигенсвязывающую активность, чем его активность до высвобождения.(5) Polypeptide according to one of paragraphs. (1) to (4), wherein the antigen binding domain is capable of being released from the polypeptide, and the antigen binding domain released from the polypeptide has a higher antigen binding activity than its activity before release.

(6) Полипептид по одному из п.п. (1)-(5), в котором ингибирующий домен транспортирующего фрагмента находится в ассоциации с антигенсвязывающим доменом и тем самым ингибирует антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена.(6) Polypeptide according to one of paragraphs. (1) to (5), wherein the inhibitory domain of the transport moiety is in association with the antigen binding domain and thereby inhibits the antigen binding activity of the antigen binding domain.

(7) Полипептид по п. (5), где полипептид содержит сайт расщепления, где сайт расщепления расщепляется таким образом, что антигенсвязывающий домен приобретает способность высвобождаться из полипептида.(7) The polypeptide of claim (5), wherein the polypeptide comprises a cleavage site, wherein the cleavage site is cleaved such that the antigen binding domain is capable of being released from the polypeptide.

(8) Полипептид по п. (6), где полипептид содержит сайт расщепления, где сайт расщепления расщепляется таким образом, что аннулируется ассоциация ингибирующего домена транспортирующего фрагмента с антигенсвязывающим доменом.(8) The polypeptide of claim (6), wherein the polypeptide comprises a cleavage site, wherein the cleavage site is cleaved such that the association of the inhibitory domain of the transport moiety with the antigen binding domain is abolished.

(9) Полипептид по п. (7) или п. (8), в котором сайт расщепления содержит расщепляемую протеазой последовательность.(9) The polypeptide of claim (7) or claim (8), wherein the cleavage site contains a protease-cleavable sequence.

(10) Полипептид по п. (9), где протеаза представляет собой протеазу, специфическую для ткани-мишени.(10) The polypeptide according to claim (9), wherein the protease is a protease specific for the target tissue.

(11) Полипептид по п. (10), где ткань-мишень представляет собой раковую ткань или воспалительную ткань.(11) The polypeptide according to claim (10), wherein the target tissue is a cancerous tissue or an inflammatory tissue.

(12) Полипептид по п. (9), где протеаза представляет собой по меньшей мере одну протеазу, выбранную из матриптазы, урокиназы (uPA) и металлопротеиназы.(12) The polypeptide according to claim (9), wherein the protease is at least one selected from matriptase, urokinase (uPA) and metalloproteinase.

(13) Полипептид по п. (12), где протеаза представляет собой по меньшей мере одну протеазу, выбранную из MT-SP1, uPA, ММР-2, ММР-9, ADAMTS5, ММР-7 и ММР-13.(13) The polypeptide according to claim (12), wherein the protease is at least one protease selected from MT-SP1, uPA, MMP-2, MMP-9, ADAMTS5, MMP-7 and MMP-13.

(14) Полипептид по п. (9), в котором расщепляемая протеазой последовательность содержит одну или несколько последовательностей, выбранных из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 12, 25, 26, 78-81, 83, 84, 91, 168-178, 193-195, 833-852 и 1062-1081, и последовательностей, представленных в таблице 1.(14) The polypeptide according to claim (9), wherein the protease-cleavable sequence contains one or more sequences selected from the sequences presented in SEQ ID NO: 12, 25, 26, 78-81, 83, 84, 91, 168- 178, 193-195, 833-852 and 1062-1081, and the sequences presented in Table 1.

(15) Полипептид по одному из п.п. (9)-(14), в котором к одному концу расщепляемой протеазой последовательности дополнительно присоединен первый гибкий линкер.(15) Polypeptide according to one of paragraphs. (9)-(14), in which a first flexible linker is additionally attached to one end of the protease-cleavable sequence.

(16) Полипептид по п. (15), в котором к другому концу расщепляемой протеазой последовательности дополнительно присоединен второй гибкий линкер.(16) The polypeptide according to claim (15), in which a second flexible linker is additionally attached to the other end of the protease-cleavable sequence.

(17) Полипептид по п. (15), в котором первый гибкий линкер представляет собой гибкий линкер, состоящий из глицин-серинового полимера.(17) The polypeptide according to claim (15), wherein the first flexible linker is a flexible linker consisting of a glycine-serine polymer.

(18) Полипептид по п. (16), в котором второй гибкий линкер представляет собой гибкий линкер, состоящий из глицин-серинового полимера.(18) The polypeptide of claim (16), wherein the second flexible linker is a flexible linker consisting of a glycine-serine polymer.

(19) Полипептид по одному из п.п. (1)-(18), в котором антигенсвязывающий домен содержит однодоменное антитело или представляет собой однодоменное антитело, в котором ингибирующий домен транспортирующего фрагмента ингибирует антигенсвязывающую активность однодоменного антитела.(19) Polypeptide according to one of paragraphs. (1) to (18), wherein the antigen binding domain comprises a single domain antibody or is a single domain antibody in which the inhibitory domain of the transport moiety inhibits the antigen binding activity of the single domain antibody.

(20) Полипептид по п. (19), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, VH, который сам обладает антигенсвязывающей активностью, или VL, который сам обладает антигенсвязывающей активностью.(20) The polypeptide of claim (19), wherein the single domain antibody is VHH, a VH that itself has antigen binding activity, or a VL that itself has antigen binding activity.

(21) Полипептид по одному из п.п. (1)-(20), в котором антигенсвязывающий домен содержит однодоменное антитело, и ингибирующий домен транспортирующего фрагмента представляет собой VHH, VH антитела или VL антитела, в котором антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется VHH, VH антитела или VL антитела.(21) Polypeptide according to one of paragraphs. (1) to (20), wherein the antigen binding domain comprises a single domain antibody, and the inhibitory domain of the transport fragment is a VHH, VH antibody or VL antibody, wherein the antigen binding activity of the single domain antibody is inhibited by a VHH, VH antibody or VL antibody.

(22) Полипептид по одному из п.п. (1)-(21), в котором антигенсвязывающий домен содержит однодоменное антитело, и ингибирующий домен транспортирующего фрагмента представляет собой VHH, VH антитела или VL антитела, в котором антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется путем его ассоциации с VHH, VH антитела или VL антитела.(22) Polypeptide according to one of paragraphs. (1) to (21), wherein the antigen binding domain comprises a single domain antibody, and the inhibitory domain of the transport fragment is a VHH, VH antibody or VL antibody, wherein the antigen binding activity of the single domain antibody is inhibited by its association with a VHH, VH antibody or VL antibody.

(23) Полипептид по одному из п.п. (19)-(22), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH или VH, который сам обладает антигенсвязывающей активностью, и ингибирующий домен транспортирующего фрагмента представляет собой VL антитела, в котором антигенсвязывающая активность VHH или VH, который сам обладает антигенсвязывающей активностью, ингибирует путем его ассоциации с VL антитела.(23) Polypeptide according to one of paragraphs. (19)-(22), in which the single-domain antibody is a VHH or a VH that itself has antigen-binding activity, and the inhibitory domain of the transport fragment is a VL of an antibody, in which the antigen-binding activity of VHH or a VH that itself has antigen-binding activity is inhibited by its association with VL antibodies.

(24) Полипептид по одному из п.п. (19)-(23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, где VHH имеет аминокислотную замену по меньшей мере в одном положении, выбранном из аминокислотных положений 37, 44, 45 и 47 (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).(24) Polypeptide according to one of paragraphs. (19)-(23), wherein the single domain antibody is VHH, wherein VHH has an amino acid substitution at at least one position selected from amino acid positions 37, 44, 45 and 47 (all numbered according to Cabot numbering).

(25) Полипептид по одному из п.п. (19)-(23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, где VHH содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из аминокислот 37V, 44G, 45L и 47W (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).(25) Polypeptide according to one of paragraphs. (19)-(23), wherein the single domain antibody is VHH, wherein VHH contains at least one amino acid selected from amino acids 37V, 44G, 45L and 47W (all numbered according to Cabot numbering).

(26) Полипептид по одному из п.п. (19)-(23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, где VHH содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из аминокислотных замен F37V, Y37V, E44G, Q44G, R45L, H45L, G47W, F47W, L47W, T47W и S47W (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).(26) Polypeptide according to one of paragraphs. (19)-(23), wherein the single domain antibody is VHH, wherein VHH contains at least one amino acid substitution selected from amino acid substitutions F37V, Y37V, E44G, Q44G, R45L, H45L, G47W, F47W, L47W, T47W and S47W (all numbered according to Cabot numbering).

(27) Полипептид по одному из п.п. (19)-(23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, где VHH имеет аминокислотные замены по меньшей мере в одном наборе положений, выбранном из положений 37/44, положений 37/45, положений 37/47, положений 44/45, положений 44/47, положений 45/47, положений 37/44/45, положений 37/44/47, положений 37/45/47, положений 44/45/47 и положений 37/44/45/47 (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).(27) Polypeptide according to one of paragraphs. (19)-(23), wherein the single domain antibody is VHH, wherein VHH has amino acid substitutions at at least one set of positions selected from positions 37/44, positions 37/45, positions 37/47, positions 44/45 , Regulations 44/47, Regulations 45/47, Regulations 37/44/45, Regulations 37/44/47, Regulations 37/45/47, Regulations 44/45/47 and Regulations 37/44/45/47 (all numbered according to Cabot's numbering).

(28) Полипептид по одному из п.п. (19)-(23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, где VHH содержит по меньшей мере один набор аминокислот, выбранный из 37V/44G, 37V/45L, 37V/47W, 44G/45L, 44G/47W, 45L/47W, 37V/44G/45L, 37V/44G/47W, 37V/45L/47W, 44G/45L/47W и 37V/44G/45L/47W (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).(28) Polypeptide according to one of paragraphs. (19)-(23), in which the single domain antibody is VHH, wherein VHH contains at least one set of amino acids selected from 37V/44G, 37V/45L, 37V/47W, 44G/45L, 44G/47W, 45L/ 47W, 37V/44G/45L, 37V/44G/47W, 37V/45L/47W, 44G/45L/47W and 37V/44G/45L/47W (all numbered according to Cabot numbering).

(29) Полипептид по одному из п.п. (19)-(23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, где VHH содержит по меньшей мере один набор аминокислотных замен, выбранный из F37V/R45L, F37V/G47W, R45L/G47W и F37V/R45L/G47W (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).(29) Polypeptide according to one of paragraphs. (19)-(23), wherein the single domain antibody is VHH, wherein VHH contains at least one set of amino acid substitutions selected from F37V/R45L, F37V/G47W, R45L/G47W and F37V/R45L/G47W (all numbered according to Cabot numbering).

(30) Полипептид по одному из п.п. (19)-(22), в котором однодоменное антитело представляет собой VL, который сам обладает антигенсвязывающей активностью, а ингибирующий домен транспортирующего фрагмента представляет собой VH антитела, в котором антигенсвязывающая активность VL, который сам обладает антигенсвязывающей активностью, ингибируется путем его ассоциации с VH антитела.(30) Polypeptide according to one of paragraphs. (19)-(22), in which the single domain antibody is a VL, which itself has antigen binding activity, and the inhibitory domain of the transport fragment is a VH of the antibody, in which the antigen binding activity of the VL, which itself has antigen binding activity, is inhibited by its association with the VH antibodies.

(31) Полипептид по одному из п.п. (1)-(30), в котором транспортирующий фрагмент имеет FcRn-связывающую область.(31) Polypeptide according to one of paragraphs. (1)-(30), in which the transport fragment has an FcRn-binding region.

(32) Полипептид по одному из п.п. (1)-(31), в котором транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела.(32) Polypeptide according to one of paragraphs. (1)-(31), in which the transport fragment contains the constant region of the antibody.

(33) Полипептид по п. (32), в котором константная область антитела транспортирующего фрагмента и антигенсвязывающий домен слиты через линкер или без линкера.(33) The polypeptide according to claim (32), in which the antibody constant region of the transport fragment and the antigen binding domain are fused through a linker or without a linker.

(34) Полипептид по п. (32), в котором транспортирующий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи антитела, в котором константная область тяжелой цепи антитела и антигенсвязывающий домен слиты через линкер или без линкера.(34) The polypeptide of claim (32), wherein the transport moiety comprises an antibody heavy chain constant region, wherein the antibody heavy chain constant region and the antigen binding domain are fused through a linker or without a linker.

(35) Полипептид по п. (32), в котором транспортирующий фрагмент содержит константную область легкой цепи антитела, в котором константная область легкой цепи антитела и антигенсвязывающий домен слиты через линкер или без линкера.(35) The polypeptide of claim (32), wherein the transport moiety comprises an antibody light chain constant region, wherein the antibody light chain constant region and the antigen binding domain are fused through a linker or without a linker.

(36) Полипептид по п. (34), где в полипептиде N-конец константной области тяжелой цепи антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера, и полипептид дополнительно имеет расщепляемую протеазой последовательность, в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована в последовательности антигенсвязывающего домена или в константной области тяжелой цепи антитела на стороне, примыкающей к антигенсвязывающему домену за аминокислотой в положении 122 (EU-нумерация).(36) The polypeptide according to claim (34), wherein in the polypeptide, the N-terminus of the heavy chain constant region of the antibody transport fragment and the C-terminus of the antigen binding domain are fused through a linker or without a linker, and the polypeptide further has a protease-cleavable sequence, in which the protease-cleavable sequence is localized in the antigen binding domain sequence or in the constant region of the antibody heavy chain on the side adjacent to the antigen binding domain after amino acid position 122 (EU numbering).

(37) Полипептид по п. (35), где в полипептиде N-конец константной области легкой цепи антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера, и полипептид дополнительно имеет расщепляемую протеазой последовательность, в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована в последовательности антигенсвязывающего домена или в константной области легкой цепи антитела на стороне, примыкающей к антигенсвязывающему домену за аминокислотой в положении 113 (EU-нумерация) (положение 113 согласно нумерации Кэбота).(37) The polypeptide according to claim (35), wherein in the polypeptide, the N-terminus of the antibody light chain constant region of the transport fragment and the C-terminus of the antigen binding domain are fused through a linker or without a linker, and the polypeptide further has a protease-cleavable sequence, in which the protease-cleavable sequence is located in the antigen binding domain sequence or in the constant region of the antibody light chain on the side adjacent to the antigen binding domain after amino acid position 113 (EU numbering) (position 113 according to Cabot numbering).

(38) Полипептид по одному из п.п. (33)-(35), где в полипептиде N-конец константной области антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера, антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH или VHH, и полипептид дополнительно имеет расщепляемую протеазой последовательность, в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована в последовательности константной области антитела или в однодоменном антителе антигенсвязывающего домена на стороне, примыкающей к константной области антитела за аминокислотным положением 109 (нумерация Кэбота).(38) Polypeptide according to one of paragraphs. (33)-(35), where in the polypeptide, the N-terminus of the antibody constant region of the transport fragment and the C-terminus of the antigen binding domain are fused through a linker or without a linker, the antigen binding domain is a single domain antibody derived from VH or VHH, and the polypeptide additionally has a cleavable a protease sequence in which the protease-cleavable sequence is located in the antibody constant region sequence or in a single-domain antibody antigen-binding domain on the side adjacent to the antibody constant region after amino acid position 109 (Cabot numbering).

(39) Полипептид по п. (33), где в полипептиде N-конец константной области антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера, и полипептид дополнительно имеет расщепляемую протеазой последовательность, в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью антитела.(39) The polypeptide according to claim (33), where in the polypeptide, the N-terminus of the antibody constant region of the transport fragment and the C-terminus of the antigen-binding domain are fused through a linker or without a linker, and the polypeptide additionally has a protease-cleavable sequence, in which the protease-cleavable sequence is localized near boundaries between the antigen binding domain and the constant region of an antibody.

(40) Полипептид по (34), где в полипептиде N-конец константной области тяжелой цепи антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера, и полипептид дополнительно имеет расщепляемую протеазой последовательность, в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью тяжелой цепи антитела.(40) The polypeptide according to (34), where in the polypeptide the N-terminus of the constant region of the antibody heavy chain of the transport fragment and the C-terminus of the antigen-binding domain are fused through a linker or without a linker, and the polypeptide additionally has a protease-cleavable sequence, in which the protease-cleavable sequence is localized near boundaries between the antigen binding domain and the constant region of the antibody heavy chain.

(41) Полипептид по (35), где в полипептиде N-конец константной области легкой цепи антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера, и полипептид дополнительно имеет расщепляемую протеазой последовательность, в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью легкой цепи антитела.(41) The polypeptide according to (35), where in the polypeptide the N-terminus of the constant region of the antibody light chain of the transport fragment and the C-terminus of the antigen-binding domain are fused through a linker or without a linker, and the polypeptide additionally has a protease-cleavable sequence, in which the protease-cleavable sequence is localized near boundaries between the antigen binding domain and the constant region of the light chain of an antibody.

(42) Полипептид по п. (40), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH, или VHH, и расщепляемая протеазой последовательность локализована в любом положении между аминокислотным положением 109 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела антигенсвязывающего домена и аминокислотой в положении 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела.(42) The polypeptide of claim (40), wherein the antigen binding domain is a single domain antibody derived from VH, or VHH, and the protease cleavable sequence is located at any position between amino acid position 109 (Cabot numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain and an amino acid in position 122 (EU numbering) of the constant region of the antibody heavy chain.

(43) Полипептид по п. (41), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH, или VHH, и расщепляемая протеазой последовательность локализована в любом положении между аминокислотой в положении 109 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела антигенсвязывающего домена и аминокислотой в положении 113 (EU-нумерация) (положение 113 согласно нумерации Кэбота) константной области легкой цепи антитела.(43) The polypeptide of claim (41), wherein the antigen binding domain is a single domain antibody derived from VH, or VHH, and the protease cleavable sequence is located at any position between the amino acid at position 109 (Cabot numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain and the amino acid at position 113 (EU numbering) (position 113 according to Cabot numbering) of the antibody light chain constant region.

(44) Полипептид по п. (40), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VL, и расщепляемая протеазой последовательность локализована в любом положении между аминокислотой в положении 104 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела антигенсвязывающего домена и аминокислотой в положении 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела.(44) The polypeptide of claim (40), wherein the antigen binding domain is a single domain antibody derived from VL and the protease cleavable sequence is located at any position between the amino acid at position 104 (Cabot numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain and the amino acid at position 122 (EU numbering) constant region of the antibody heavy chain.

(45) Полипептид по п. (41), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VL, и расщепляемая протеазой последовательность локализована в любом положении между аминокислотой в положении 109 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела антигенсвязывающего домена и аминокислотой в положении 113 (EU-нумерация) (положение 113 согласно нумерации Кэбота) константной области легкой цепи антитела.(45) The polypeptide of claim (41), wherein the antigen binding domain is a single domain antibody derived from VL and the protease cleavable sequence is located at any position between the amino acid at position 109 (Cabot numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain and the amino acid at position 113 (EU numbering) (position 113 according to Cabot numbering) of the antibody light chain constant region.

(46) Полипептид по одному из п.п. (32)-(45), в котором константная область антитела полипептида представляет собой константную область антитела IgG-типа.(46) Polypeptide according to one of paragraphs. (32)-(45), in which the antibody constant region of the polypeptide is an IgG-type antibody constant region.

(47) Полипептид по одному из п.п. (1)-(46), где полипептид представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа.(47) Polypeptide according to one of paragraphs. (1)-(46), where the polypeptide is an IgG-type antibody-like molecule.

(48) Полипептид по одному из п.п. (1)-(47), в котором при анализе антигенсвязывающего домена в нерасщепленном состоянии с использованием BLI (интерферометрия биослоя) (система Octet) связывание антигенсвязывающего домена с антигеном не выявляется.(48) Polypeptide according to one of paragraphs. (1)-(47), in which when analyzing the antigen binding domain in an uncleaved state using BLI (Biolayer Interferometry) (Octet system), the binding of the antigen binding domain to the antigen is not detected.

(49) Полипептид по одному из п.п. (1)-(48), в котором второй антигенсвязывающий домен дополнительно связан с антигенсвязывающим доменом.(49) Polypeptide according to one of paragraphs. (1)-(48), wherein the second antigen binding domain is further linked to the antigen binding domain.

(50) Полипептид по п. (49), в котором второй антигенсвязывающий домен имеет антигенсвязывающую специфичность, отличную от специфичности антигенсвязывающего домена.(50) The polypeptide of claim (49), wherein the second antigen binding domain has an antigen binding specificity different from that of the antigen binding domain.

(51) Полипептид по п. (49) или п. (50), в котором второй антигенсвязывающий домен содержит второе однодоменное антитело.(51) The polypeptide of claim (49) or claim (50), wherein the second antigen-binding domain comprises a second single-domain antibody.

(52) Полипептид по п. (51), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, второй антигенсвязывающий домен представляет собой второе однодоменное антитело, и антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен обладают способностью высвобождаться из полипептида, в котором однодоменное антитело и второе однодоменное антитело образуют биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, когда антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен находятся в высвободившихся состояниях.(52) The polypeptide of claim (51), wherein the antigen binding domain is a single domain antibody, the second antigen binding domain is a second single domain antibody, and the antigen binding domain and the second antigen binding domain are releasable from the polypeptide, wherein the single domain antibody and the second single domain antibody form a bispecific antigen-binding molecule when the antigen-binding domain and the second antigen-binding domain are in released states.

(53) Полипептид по одному из п.п. (49)-(52), в котором второй антигенсвязывающий домен направлен против HER2 или GPC3 в качестве антигена-мишени.(53) Polypeptide according to one of paragraphs. (49)-(52), in which the second antigen binding domain is directed against HER2 or GPC3 as the target antigen.

(54) Полипептид по одному из п.п. (1)-(53), где полипептид имеет также дополнительный антигенсвязывающий домен, отличный от антигенсвязывающего домена, при этом антигенсвязывающая активность дополнительного антигенсвязывающего домена также ингибируется при его связывании с транспортирующим фрагментом полипептида.(54) Polypeptide according to one of paragraphs. (1)-(53), wherein the polypeptide also has an additional antigen-binding domain, different from the antigen-binding domain, and the antigen-binding activity of the additional antigen-binding domain is also inhibited when it binds to the transport fragment of the polypeptide.

(55) Полипептид по п. (54), в котором дополнительный антигенсвязывающий домен и антигенсвязывающий домен отличаются по антигенсвязывающей специфичности.(55) The polypeptide of claim (54), wherein the additional antigen binding domain and the antigen binding domain differ in antigen binding specificity.

(56)Полипептид по одному из п.п. (1)-(55), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, направленный против плексина A1, IL-6R или CD3 в качестве антигена-мишени.(56) Polypeptide according to one of paragraphs. (1) to (55), wherein the antigen binding domain is an antigen binding domain directed against plexin A1, IL-6R or CD3 as a target antigen.

(57) Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по одному из п.п. (1)-(56).(57) A pharmaceutical composition containing a polypeptide according to one of paragraphs. (1)-(56).

(58) Способ получения полипептида по одному из п.п. (1)-(56).(58) Method for producing a polypeptide according to one of claims. (1)-(56).

(59) Способ получения по п. (58), включающий следующие стадии:(59) The production method according to item (58), including the following steps:

(а) получение однодоменного антитела, связывающегося с антигеном-мишенью;(a) obtaining a single domain antibody that binds to a target antigen;

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с транспортирующим фрагментом таким образом, что антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется ингибирующим доменом транспортирующего фрагмента, с образованием полипептида-предшественника; и(b) linking the single domain antibody obtained in step (a) to the transport fragment such that the antigen binding activity of the single domain antibody is inhibited by the inhibitory domain of the transport fragment to form a precursor polypeptide; And

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности в полипептид-предшественник.(c) introduction of a protease-cleavable sequence into the precursor polypeptide.

(60) Способ получения по п. (58), включающий следующие стадии:(60) The production method according to item (58), including the following steps:

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между однодоменным антителом и транспортирующим фрагментом.(c) introduction of a protease-cleavable sequence near the interface between the single-domain antibody and the transport fragment.

(61) Способ получения по п. (58), включающий следующие стадии:(61) The production method according to item (58), including the following steps:

(а) получение однодоменного антитела, связывающегося с антигеном-мишенью; и(a) obtaining a single domain antibody that binds to a target antigen; And

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с транспортирующим фрагментом через расщепляемую протеазой последовательность таким образом, что антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется ингибирующим доменом транспортирующего фрагмента, с образованием полипептида.(b) linking the single domain antibody obtained in step (a) to the transport moiety via a protease cleavable sequence such that the antigen binding activity of the single domain antibody is inhibited by the inhibitory domain of the transport moiety to form a polypeptide.

(62) Способ получения по одному из п.п. (59)-(61), дополнительно включающий следующую стадию:(62) Method of production according to one of claims. (59)-(61), further comprising the following step:

(г) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, включенного в полипептид или полипептид-предшественник, в отношении антигена-мишени ослабляется или утрачивается.(d) confirming that the binding activity of the single domain antibody included in the polypeptide or precursor polypeptide to the target antigen is weakened or lost.

(63) Способ получение по одному из п.п. (59)-(62), дополнительно включающий следующую стадию:(63) Method of production according to one of claims. (59)-(62), further comprising the following step:

(д) высвобождение однодоменного антитела посредством расщепления протеазой расщепляемой протеазой последовательности и подтверждение того, что высвободившееся однодоменное антитело связывается с антигеном.(e) releasing the single-domain antibody by protease cleavage of the protease-cleavable sequence and confirming that the released single-domain antibody binds the antigen.

(64) Способ получения по п. (58), в котором полипептид представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа.(64) The production method according to claim (58), wherein the polypeptide is an IgG-type antibody-like molecule.

(65) Способ получения по п. (64), включающий следующие стадии:(65) The production method according to item (64), including the following steps:

(б) обеспечение осуществления ассоциации однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с VL в качестве замены VH антитела IgG-типа, или обеспечение осуществления ассоциации однодоменного антитела с VH в качестве замены VL антитела IgG-типа, в результате чего антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется, с образованием подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет однодоменное антитело; и(b) causing the single-domain antibody obtained in step (a) to associate with VL as a replacement for the VH of an IgG-type antibody, or causing the single-domain antibody to associate with the VH as a replacement for the VL of an IgG-type antibody, resulting in the antigen-binding activity of the single-domain antibody the antibody is inhibited to form an IgG-type antibody-like precursor molecule that carries a single domain antibody; And

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника, которая несет однодоменное антитело.(c) introducing a protease-cleavable sequence into an IgG-type antibody-like precursor molecule that carries the single domain antibody.

(66) Способ получения по п. (64), включающий следующие стадии:(66) The production method according to item (64), including the following steps:

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между однодоменным антителом и константной областью антитела в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника.(c) introducing a protease-cleavable sequence near the interface between the single-domain antibody and the antibody constant region into an IgG-type antibody-like precursor molecule.

(67) Способ получения по п. (64), включающий следующие стадии:(67) The production method according to item (64), including the following steps:

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), в качестве замены VH или VL антитела IgG-типа с константной областью тяжелой цепи или константной областью легкой цепи антитела IgG-типа через расщепляемую протеазой последовательность, в результате чего антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется, с образованием подобной антителу IgG-типа молекулы, которая несет однодоменное антитело.(b) linking the single-domain antibody obtained in step (a) as a replacement for the VH or VL of an IgG-type antibody to the heavy chain constant region or light chain constant region of an IgG-type antibody through a protease-cleavable sequence, resulting in antigen-binding activity of the single-domain antibody is inhibited to form an IgG-type antibody-like molecule that carries a single-domain antibody.

(68) Способ получения по одному из п.п. (65)-(67), дополнительно включающий следующую стадию:(68) Method of production according to one of paragraphs. (65)-(67), further comprising the following step:

(г) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, находящегося в подобной антителу IgG-типа молекуле или подобной антителу IgG-типа молекуле-предшественнике, в отношении антигена-мишени ослабляется или утрачивается.(d) confirming that the binding activity of a single domain antibody contained in an IgG antibody-like molecule or an IgG antibody-like precursor molecule to the target antigen is weakened or lost.

(69) Способ получения по одному из п.п. (65)-(68), дополнительно включающий следующую стадию:(69) Method of production according to one of paragraphs. (65)-(68), further comprising the following step:

(д) высвобождение однодоменного антитела посредством расщепления протеазой расщепляемой протеазой последовательности и подтверждение того, что высвободившееся однодоменное антитело связывается с антигеном-мишенью.(e) releasing the single-domain antibody by protease cleavage of the protease-cleavable sequence and confirming that the released single-domain antibody binds to the target antigen.

(70) Способ получения по п. (64), включающий следующие стадии:(70) The production method according to item (64), including the following steps:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации однодоменного антитела с VH антитела, или замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации однодоменного антитела с VL антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени;(a) replacing an amino acid residue in a single-domain antibody that is involved in the association of the single-domain antibody with the VH of the antibody, or replacing an amino acid residue in a single-domain antibody that is involved in the association of the single-domain antibody with the VL of the antibody, to produce a variant single-domain antibody that retains the binding activity of the single-domain antibody in relation to the target antigen;

(б) обеспечение осуществления ассоциации варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с VH антитела или обеспечение осуществления ассоциации варианта однодоменного антитела с VL антитела, в результате чего антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела ингибируется, с образованием подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет вариант однодоменного антитела; и(b) causing the single-domain antibody variant obtained in step (a) to associate with the VH of the antibody or causing the single-domain antibody variant to associate with the VL of the antibody, whereby the antigen-binding activity of the single-domain antibody variant is inhibited to form an IgG-type antibody-like molecule; a precursor that carries a single domain antibody variant; And

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника, которая несет вариант однодоменного антитела.(c) introducing a protease-cleavable sequence into an IgG-type antibody-like precursor molecule that carries a single-domain antibody variant.

(71) Способ получения по п. (64), включающий следующие стадии:(71) The production method according to item (64), including the following steps:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VH антитела, или замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VL антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени;(a) replacing an amino acid residue in a single-domain antibody that is involved in association with the VH of the antibody, or replacing an amino acid residue in a single-domain antibody that is involved in association with the VL of the antibody, to produce a variant single-domain antibody that retains the binding activity of the single-domain antibody to an antigen- targets;

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между вариантом однодоменного антитела и константной областью в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника.(c) introducing a protease-cleavable sequence near the interface between the single-domain antibody variant and the constant region into an IgG-type antibody-like precursor molecule.

(72) Способ получения по п. (64), включающий следующие стадии:(72) The production method according to item (64), including the following steps:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VH антитела, или замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VL антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени; и(a) replacing an amino acid residue in a single-domain antibody that is involved in association with the VH of the antibody, or replacing an amino acid residue in a single-domain antibody that is involved in association with the VL of the antibody, to produce a variant single-domain antibody that retains the binding activity of the single-domain antibody to an antigen- targets; And

(б) сцепление варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с константной областью тяжелой цепи антитела IgG-типа через расщепляемую протеазой последовательность или сцепление варианта однодоменного антитела с константной областью легкой цепи антитела IgG-типа через расщепляемую протеазой последовательность, в результате чего антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела ингибируется, с образованием подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет вариант однодоменного антитела.(b) linking the single-domain antibody variant obtained in step (a) to the heavy chain constant region of an IgG-type antibody through a protease-cleavable sequence, or linking the single-domain antibody variant to the light chain constant region of an IgG-type antibody through a protease-cleavable sequence, thereby the antigen-binding activity of the single-domain antibody variant is inhibited, producing an IgG-type antibody-like precursor molecule that carries the single-domain antibody variant.

(73) Способ получения по одному из п.п. (70)-(72), дополнительно включающий следующую стадию:(73) Method of production according to one of paragraphs. (70)-(72), further comprising the following step:

(г) подтверждение того, что связывающая активность варианта однодоменного антитела, находящегося в подобной антителу IgG-типа молекуле, или связывающая активность варианта однодоменного антитела, находящегося в подобной антителу IgG-типа молекуле-предшественнике, в отношении антигена-мишени ослабляется или утрачивается.(d) confirming that the binding activity of the single-domain antibody variant found on an IgG antibody-like molecule or the binding activity of the single-domain antibody variant found on an IgG antibody-like precursor molecule to the target antigen is attenuated or lost.

(74) Способ получения по одному из п.п. (70)-(73), дополнительно включающий следующую стадию:(74) Method of production according to one of paragraphs. (70)-(73), further comprising the following step:

(д) высвобождение варианта однодоменного антитела посредством расщепления протеазой расщепляемой протеазой последовательности и подтверждение того, что высвободившийся вариант однодоменного антитела связывается с антигеном-мишенью.(e) releasing the single-domain antibody variant by protease cleavage of the protease-cleavable sequence and confirming that the released single-domain antibody variant binds to the target antigen.

(75) Полинуклеотид, кодирующий полипептид по одному из п.п. (1)-(56).(75) A polynucleotide encoding a polypeptide according to one of the paragraphs. (1)-(56).

(76) Вектор, содержащий полинуклеотид по п. (75).(76) A vector containing the polynucleotide according to claim (75).

(77) Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п. (75) или вектор по п. (76).(77) A host cell containing the polynucleotide of claim (75) or the vector of claim (76).

(78) Способ получения полипептида по одному из п.п. (1)-(56), включающий стадию культивирования клетки-хозяина по п. (77).(78) Method for producing a polypeptide according to one of claims. (1) to (56), comprising the step of culturing a host cell according to claim (77).

(79) Способ скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем его ассоциации с конкретным VL, путем его ассоциации с конкретным VH или путем его ассоциации с конкретным VHH.(79) A method for screening a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited by its association with a specific VL, by its association with a specific VH, or by its association with a specific VHH.

(80) Способ скрининга по п. (79), где способ представляет способ скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем его ассоциации с конкретным VL.(80) The screening method according to claim (79), wherein the method is a method for screening a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited by its association with a specific VL.

(81) Способ скрининга по п. (80), включающий следующие стадии:(81) The screening method according to claim (80), including the following steps:

(а) получение однодоменного антитела, имеющего целевую антигенсвязывающую активность (активность в отношении антигена-мишени);(a) obtaining a single-domain antibody having a target antigen-binding activity (activity against a target antigen);

(б) обеспечение осуществления ассоциации однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VL; и(b) causing the single domain antibody obtained in step (a) to associate with a particular VL; And

(в) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, ассоциированного с конкретным VL на стадии (б), в отношении антигена ослабляется по сравнению с активностью до ассоциации или утрачивается.(c) confirmation that the binding activity of the single domain antibody associated with a particular VL in step (b) to the antigen is weakened compared to the activity before association or is lost.

(82) Способ скрининга по п. (80), включающий следующие стадии:(82) The screening method according to claim (80), including the following steps:

(а) обеспечение осуществления ассоциации однодоменного антитела с конкретным VL;(a) allowing association of the single domain antibody with a particular VL;

(б) выбор продукта(ов) ассоциации, образованного(ых) VL и однодоменным антителом, на основе того, что однодоменное антитело, ассоциированное с конкретным VL на стадии (а), не обладает связывающей активностью в отношении антигена или его связывающая активность соответствует предварительно установленному уровню или ниже его; и(b) selecting the association product(s) formed by the VL and the single domain antibody based on the fact that the single domain antibody associated with the particular VL in step (a) does not have antigen binding activity or its binding activity is pre-matched the established level or below it; And

(в) подтверждение того, что однодоменное антитело в продукте(ах) ассоциации, выбранном(ых) на стадии (б), имеет более сильную связывающую активность в отношении антигена в неассоциированном с конкретным VL состоянии, чем в ассоциированном с ним состоянии.(c) confirming that the single domain antibody in the association product(s) selected in step (b) has stronger antigen binding activity in the non-specific VL state than in the associated state.

(83) Способ скрининга по п. (79), где способ представляет собой способ скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем его ассоциации с конкретным VH.(83) The screening method according to claim (79), wherein the method is a method for screening a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited by its association with a specific VH.

(84) Способ скрининга по п. (83), включающий следующие стадии:(84) The screening method according to claim (83), including the following steps:

(а) получение однодоменного антитела, имеющего целевую антигенсвязывающую активность;(a) obtaining a single domain antibody having the target antigen binding activity;

(б) обеспечение осуществления ассоциации однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VH; и(b) causing the single domain antibody obtained in step (a) to associate with a specific VH; And

(в) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, ассоциированного с конкретным VH на стадии (б), в отношении антигена ослабляется по сравнению с активностью до ассоциации или утрачивается.(c) confirmation that the binding activity of the single domain antibody associated with a particular VH in step (b) to the antigen is reduced compared to the activity before association or is lost.

(85) Способ скрининга по п. (83), включающий следующие стадии:(85) The screening method according to claim (83), including the following steps:

(а) обеспечение осуществления ассоциации однодоменного антитела с конкретным VH;(a) causing the single domain antibody to associate with a particular VH;

(б) выбор продукта(ов) ассоциации, образованного(ых) VH и однодоменным антителом, на основе того, что однодоменное антитело, ассоциированное с конкретным VH на стадии (а), не обладает связывающей активностью в отношении антигена или его связывающая активность соответствует предварительно установленному уровню или ниже его; и(b) selecting the association product(s) formed by the VH and the single domain antibody based on the fact that the single domain antibody associated with the particular VH in step (a) does not have antigen binding activity or its binding activity is pre-matched the established level or below it; And

(в) подтверждение того, что однодоменное антитело в продукте(ах) ассоциации, выбранном(ых) на стадии (б), имеет более сильную связывающую активность в отношении антигена в неассоциированном с конкретным VH состоянии, чем в ассоциированном с ним состоянии.(c) confirming that the single domain antibody in the association product(s) selected in step (b) has stronger antigen binding activity in the non-specific VH state than in the associated state.

(86) Способ скрининга по п. (79), где способ представляет собой способ скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем его ассоциации с конкретным VHH.(86) The screening method according to claim (79), wherein the method is a method for screening a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited by its association with a specific VHH.

(87) Способ скрининга по п. (86), включающий следующие стадии:(87) The screening method according to claim (86), including the following steps:

(б) обеспечение осуществления ассоциации однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VHH; и(b) causing the single domain antibody obtained in step (a) to associate with a specific VHH; And

(в) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, ассоциированного с конкретным VHH на стадии (б), в отношении антигена ослабляется по сравнению с активностью до ассоциации или утрачивается.(c) confirmation that the binding activity of the single-domain antibody associated with a particular VHH in step (b) to the antigen is weakened compared to the activity before association or is lost.

(88) Способ скрининга по п. (86), включающий следующие стадии:(88) The screening method according to claim (86), including the following steps:

(а) обеспечение осуществления ассоциации однодоменного антитела с конкретным VHH;(a) allowing the single domain antibody to associate with a particular VHH;

(б) выбор продукта(ов) ассоциации, образованного(ых) VHH и однодоменным антителом, на основе того, что однодоменное антитело, ассоциированное с конкретным VHH на стадии (а), не обладает связывающей активностью в отношении антигена или его связывающая активность соответствует предварительно установленному уровню или ниже его; и(b) selecting the association product(s) formed by the VHH and the single-domain antibody based on the fact that the single-domain antibody associated with the particular VHH in step (a) does not have antigen binding activity or its binding activity is previously consistent the established level or below it; And

(в) подтверждение того, что однодоменное антитело в продукте(ах) ассоциации, выбранном(ых) на стадии (б), имеет более сильную связывающую активность в отношении антигена в неассоциированном с конкретным VHH состоянии, чем в ассоциированном с ним состоянии.(c) confirming that the single domain antibody in the association product(s) selected in step (b) has stronger antigen binding activity in the non-specific VHH state than in the associated state.

(89) Способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем его ассоциации с конкретным VL, путем его ассоциации с конкретным VH или путем его ассоциации с конкретным VHH.(89) A method for producing a single-domain antibody whose antigen-binding activity can be inhibited by its association with a particular VL, by its association with a particular VH, or by its association with a particular VHH.

(90) Способ получения по п. (89), где способ представляет собой способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем его ассоциации с конкретным VL.(90) The production method according to claim (89), wherein the method is a method for producing a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited by its association with a specific VL.

(91) Способ получения по п. (90), включающий следующую стадию:(91) The production method according to item (90), including the following step:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VL антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени.(a) replacing an amino acid residue in a single domain antibody that is involved in association with the VL of the antibody to produce a variant single domain antibody that retains the binding activity of the single domain antibody to a target antigen.

(92) Способ получения по п. (91), дополнительно включающий следующие стадии:(92) The production method according to item (91), further comprising the following steps:

(б) обеспечение осуществления ассоциации варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с VL; и(b) causing the single domain antibody variant obtained in step (a) to associate with the VL; And

(в) подтверждение того, что антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела, ассоциированного с VL, ослабляется по сравнению с активностью до ассоциации или утрачивается.(c) confirmation that the antigen-binding activity of the VL-associated single domain antibody variant is reduced compared to pre-association activity or is lost.

(93) Способ получения по п. (89), где способ представляет собой способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем его ассоциации с конкретным VH.(93) The production method according to claim (89), wherein the method is a method for producing a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited by its association with a specific VH.

(94) Способ получения по п. (93), включающий следующую стадию:(94) The production method according to item (93), including the following step:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VH антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени.(a) replacing an amino acid residue in a single-domain antibody that is involved in association with the VH of the antibody to produce a variant single-domain antibody that retains the binding activity of the single-domain antibody to a target antigen.

(95) Способ получения по п. (94), дополнительно включающий следующие стадии:(95) The production method according to claim (94), further comprising the following steps:

(б) обеспечение осуществления ассоциации варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с VH; и(b) causing the single domain antibody variant obtained in step (a) to associate with VH; And

(в) подтверждение того, что антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела, ассоциированного с VH, ослабляется по сравнению с активностью до ассоциации или утрачивается.(c) confirmation that the antigen-binding activity of the VH-associated single-domain antibody variant is attenuated compared to pre-association activity or is lost.

(96) Способ получения по п. (89), где способ представляет собой способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем его ассоциации с конкретным VHH.(96) The production method according to claim (89), wherein the method is a method for producing a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited by its association with a specific VHH.

(97) Способ получения по п. (96), включающий следующую стадию:(97) The production method according to item (96), including the following step:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VHH, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени.(a) replacing an amino acid residue in a single-domain antibody that is involved in association with VHH to produce a variant single-domain antibody that retains the binding activity of the single-domain antibody to a target antigen.

(98) Способ получения по п. (97), дополнительно включающий следующие стадии:(98) The production method according to claim (97), further comprising the following steps:

(б) обеспечение осуществления ассоциации варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с VHH; и(b) causing the single domain antibody variant obtained in step (a) to associate with VHH; And

(в) подтверждение того, что антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела, ассоциированного с VHH, ослабляется по сравнению с активностью до ассоциации или утрачивается.(c) confirmation that the antigen-binding activity of the VHH-associated single-domain antibody variant is attenuated compared to pre-association activity or is lost.

(99) Библиотека, содержащая множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом, где однодоменные антитела включают однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при его ассоциации с конкретным VL, однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при его ассоциации с конкретным VH, или однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при его ассоциации с конкретным VHH.(99) A library containing a plurality of single-domain antibody fusion polypeptides, each linked to a first association-supporting domain, wherein the single-domain antibodies include a single-domain antibody whose antigen-binding activity may be inhibited or lost upon association with a particular VL, a single-domain antibody whose antigen-binding activity may inhibited or lost upon association with a particular VH, or a single domain antibody whose antigen binding activity may be inhibited or lost upon association with a particular VHH.

(100) Библиотека по п. (99), где фрагмент, представляющий собой однодоменное антитело, в каждом слитом полипептиде в библиотеке включает однодоменное антитело, полученное из животного семейства верблюдовых (Camelidae) или трансгенного животного, несущего ген, который может кодировать однодоменное антитело или гуманизированное антитело, однодоменное антитело, полученное иммунизацией животного семейства Camelidae или трансгенного животного, несущего ген, который может кодировать однодоменное антитело или гуманизированное антитело, или искусственно созданное однодоменное антитело, полученное из VH или VL человеческого антитела.(100) The library of claim (99), wherein the single-domain antibody fragment in each fusion polypeptide in the library comprises a single-domain antibody derived from an animal of the camelid family (Camelidae) or a transgenic animal carrying a gene that may encode a single-domain antibody or a humanized antibody, a single domain antibody produced by immunization of an animal of the Camelidae family or a transgenic animal carrying a gene that may encode a single domain antibody or a humanized antibody, or an artificially generated single domain antibody derived from a VH or VL human antibody.

(101) Библиотека по п. (99) или п. (100), представляющая собой библиотеку, которая содержит множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом, где однодоменные антитела включают однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при его ассоциации с конкретным VL.(101) The library of claim (99) or claim (100), which is a library that contains a plurality of single-domain antibody fusion polypeptides, each of which is linked to a first association-supporting domain, wherein the single-domain antibodies include a single-domain antibody whose antigen-binding activity can inhibited or lost upon its association with a specific VL.

(102) Библиотека по п. (99) или п. (100), представляющая собой библиотеку, которая содержит множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом, где однодоменное антитело включает однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при его ассоциации с конкретным VH.(102) The library of claim (99) or claim (100), which is a library that contains a plurality of single-domain antibody fusion polypeptides, each of which is linked to a first association supporting domain, wherein the single-domain antibody includes a single-domain antibody whose antigen-binding activity can inhibited or lost upon its association with a specific VH.

(103) Библиотека по п. (99) или п. (100), представляющая собой библиотеку, которая содержит множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом, где однодоменное антитело включает однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при его ассоциации с конкретным VHH.(103) The library of claim (99) or claim (100), which is a library that contains a plurality of single-domain antibody fusion polypeptides, each of which is linked to a first association-supporting domain, wherein the single-domain antibody includes a single-domain antibody whose antigen-binding activity can inhibited or lost upon its association with a specific VHH.

(104) Способ скрининга библиотеки по п. (99) или п. (100) в отношении слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться при его ассоциации с конкретным VL, однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при его ассоциации с конкретным VH, или однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при его ассоциации с конкретным VHH.(104) The method of screening a library according to claim (99) or claim (100) against a fusion polypeptide containing a single domain antibody, the antigen binding activity of which can be inhibited or may be lost upon association with a particular VL, a single domain antibody, the antigen binding activity of which can be inhibited or lost upon association with a particular VH, or a single domain antibody whose antigen binding activity may be inhibited or lost upon association with a particular VHH.

(105) Способ скрининга библиотеки по п. (101) в отношении слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться при его ассоциации с конкретным VL.(105) The method of screening a library according to claim (101) against a fusion polypeptide containing a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited or lost upon association with a particular VL.

(106) Способ скрининга по п. (105), включающий следующие стадии(106) The screening method according to claim (105), including the following steps

(а) обеспечение осуществления экспонирования in vitro слитых полипептидов библиотеки;(a) allowing for in vitro display of the library fusion polypeptides;

(б) получение партнера по ассоциации второго поддерживающего ассоциацию домена, слитого с конкретным VL;(b) obtaining an association partner of a second association-supporting domain fused to a particular VL;

(в) обеспечение осуществления ассоциации каждого из слитых полипептидов, экспонированных на стадии (а), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого(ых) полипептида(ов), который(ые) не связывается(ются) с антигеном или имеет(ют) антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его, в состоянии, в котором однодоменное антитело находится в ассоциации с VL; и(c) causing each of the fusion polypeptides exposed in step (a) to associate with the association partner obtained in step (b) and selecting the fusion polypeptide(s) that do not bind. with an antigen or has antigen binding activity that is at or below a predetermined level, in a state in which the single domain antibody is in association with the VL; And

(г) выбор из слитого(ых) полипептида(ов), отобранного(ых) на стадии (в), слитого полипептида, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, соответствующую предварительно установленному уровню или выше его в состоянии, в котором однодоменное антитело, входящее в него, не находится в ассоциации с VL.(d) selecting from the fusion polypeptide(s) selected in step (c), a fusion polypeptide that binds to an antigen or has antigen-binding activity at or above a predetermined level in the state in which the single domain antibody , included in it, is not in association with VL.

(107) Способ скрининга по п. (106), в котором партнер по ассоциации, полученный на стадии (б), дополнительно содержит расщепляемую протеазой последовательность, и стадия (г) включает расщепление партнера по ассоциации обработкой протеазой таким образом, что ассоциация однодоменного антитела с VL аннулируется.(107) The screening method according to claim (106), wherein the association partner obtained in step (b) further comprises a protease-cleavable sequence, and step (d) includes cleaving the association partner by protease treatment such that the association of the single-domain antibody with VL is cancelled.

(108) Способ скрининга по п. (107), в котором расщепляемая протеазой последовательность партнера по ассоциации, полученного на стадии (б), локализована вблизи границы между конкретным VL и вторым поддерживающим ассоциацию доменом.(108) The screening method of claim (107), wherein the protease-cleavable sequence of the association partner obtained in step (b) is located near the boundary between the particular VL and the second association-supporting domain.

(109) Способ скрининга по п. (106), в котором слитые полипептиды библиотеки дополнительно содержат расщепляемую протеазой последовательность, и стадия (г) включает расщепление слитого(ых) полипептида(ов) обработкой протеазой таким образом, что ассоциация однодоменного антитела с VL аннулируется.(109) The screening method of claim (106), wherein the library fusion polypeptides further comprise a protease cleavable sequence, and step (d) comprises cleaving the fusion polypeptide(s) by protease treatment such that the association of the single domain antibody with the VL is abolished .

(110) Способ скрининга по п. (109), в котором расщепляемая протеазой последовательность, входящая в каждый слитый полипептид, локализована вблизи границы между однодоменным антителом и первым поддерживающим ассоциацию доменом.(110) The screening method of claim (109), wherein the protease cleavable sequence included in each fusion polypeptide is located near the boundary between the single domain antibody and the first association supporting domain.

(111) Способ скрининга по п. (106), в котором стадия (г) включает обеспечение осуществления повторного экспонирования in vitro полноразмерого(ых) слитого(ых) полипептида(ов), отобранного(ых) на стадии (в), или их фрагментов, содержащих однодоменные антитела.(111) The screening method of claim (106), wherein step (d) comprises allowing for in vitro reexposure of the full-length fusion polypeptide(s) selected in step (c), or fragments containing single-domain antibodies.

(112) Способ скрининга по п. (106), в котором стадия (г) включает обеспечение осуществления повторного экспонирования in vitro полноразмерого(ых) слитого(ых) полипептида(ов), отобранного(ых) на стадии (в), и отбор слитого полипептида, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его в состоянии ассоциации только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом.(112) The screening method of claim (106), wherein step (d) comprises allowing for in vitro reexposure of the full-length fusion polypeptide(s) selected in step (c) and selecting a fusion polypeptide that binds to an antigen or has antigen-binding activity that is at or above a predetermined level when in association with only the second association-supporting domain.

(113) Способ скрининга библиотеки по п. (102) в отношении слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться при его ассоциации с конкретным VH.(113) The method of screening a library according to claim (102) against a fusion polypeptide containing a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited or lost upon association with a particular VH.

(114) Способ скрининга по п. (113), включающий следующие стадии(114) The screening method according to claim (113), comprising the following steps

(б) получение партнера по ассоциации второго поддерживающего ассоциацию домена, слитого с конкретным VH;(b) obtaining an association partner of a second association-supporting domain fused to a particular VH;

(в) обеспечение осуществления ассоциации каждого из слитых полипептидов, экспонированных на стадии (а), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого(ых) полипептида(ов), который(ые) не связывается(ются) с антигеном или имеет(ют) антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его в состоянии, в котором однодоменное антитело находится в ассоциации с VH; и (г) выбор из слитого(ых) полипептида(ов), отобранного(ых) на стадии (в), слитого полипептида, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, соответствующую предварительно установленному уровню или выше его в состоянии, в котором однодоменное антитело, входящее в него, не находится в ассоциации с VH.(c) causing each of the fusion polypeptides exposed in step (a) to associate with the association partner obtained in step (b) and selecting the fusion polypeptide(s) that do not bind. with an antigen or has antigen binding activity that is at or below a predetermined level in a state in which the single domain antibody is in association with VH; and (d) selecting, from the fusion polypeptide(s) selected in step (c), a fusion polypeptide that binds to an antigen or has antigen-binding activity at or above a predetermined level in a state in which the single domain the antibody included in it is not in association with VH.

(115) Способ скрининга по п. (114), в котором партнер по ассоциации, полученный на стадии (б), дополнительно содержит расщепляемую протеазой последовательность, и стадия (г) включает расщепление партнера по ассоциации обработкой протеазой таким образом, что ассоциация однодоменного антитела с VH аннулируется.(115) The screening method according to claim (114), wherein the association partner obtained in step (b) further comprises a protease-cleavable sequence, and step (d) includes cleaving the association partner by protease treatment such that the association of the single-domain antibody with VH is cancelled.

(116) Способ скрининга по п. (115), в котором расщепляемая протеазой последовательность партнера по ассоциации, полученного на стадии (б), локализована вблизи границы между конкретным VH и вторым поддерживающим ассоциацию доменом.(116) The screening method of claim (115), wherein the protease-cleavable sequence of the association partner obtained in step (b) is located near the boundary between the particular VH and the second association-supporting domain.

(117) Способ скрининга по п. (114), в котором слитые полипептиды библиотеки дополнительно содержат расщепляемую протеазой последовательность, и стадия (г) включает расщепление слитого(ых) полипептида(ов) обработкой протеазой таким образом, что ассоциация однодоменного антитела с VH аннулируется.(117) The screening method of claim (114), wherein the library fusion polypeptides further comprise a protease cleavable sequence, and step (d) comprises cleaving the fusion polypeptide(s) by protease treatment such that the association of the single domain antibody with the VH is abolished .

(118) Способ скрининга по п. (117), в котором расщепляемая протеазой последовательность, входящая в каждый слитый полипептид, локализована вблизи границы между однодоменным антителом и первым поддерживающим ассоциацию доменом.(118) The screening method of claim (117), wherein the protease cleavable sequence included in each fusion polypeptide is located near the boundary between the single domain antibody and the first association supporting domain.

(119) Способ скрининга по п. (114), в котором стадия (г) включает обеспечение осуществления повторного экспонирования in vitro полноразмерого(ых) слитого(ых) полипептида(ов), отобранного(ых) на стадии (в), или их фрагментов, содержащих однодоменные антитела.(119) The screening method of claim (114), wherein step (d) comprises allowing for in vitro reexposure of the full-length fusion polypeptide(s) selected in step (c), or fragments containing single-domain antibodies.

(120) Способ скрининга по п. (114), в котором стадия (г) включает обеспечение осуществления повторного экспонирования in vitro полноразмерого(ых) слитого(ых) полипептида(ов), отобранного(ых) на стадии (в), и отбор слитого полипептида, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его в состоянии ассоциации только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом.(120) The screening method of claim (114), wherein step (d) comprises allowing for in vitro reexposure of the full-length fusion polypeptide(s) selected in step (c) and selecting a fusion polypeptide that binds to an antigen or has antigen-binding activity that is at or above a predetermined level when in association with only the second association-supporting domain.

(121) Способ скрининга библиотеки по п. (103) в отношении слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться при его ассоциации с конкретным VHH.(121) The method of screening a library according to claim (103) against a fusion polypeptide containing a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited or lost upon association with a particular VHH.

(122) Способ скрининга по п. (121), включающий следующие стадии(122) The screening method according to claim (121), including the following steps

(б) получение партнера по ассоциации второго поддерживающего ассоциацию домена, слитого с конкретным VHH;(b) obtaining an association partner of a second association-supporting domain fused to a particular VHH;

(в) обеспечение осуществления ассоциации слитых полипептидов, экспонированных на стадии (а), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого(ых) полипептида(ов), который(ые) не связывается(ются) с антигеном или имеет(ют) антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его в состоянии, в котором однодоменное антитело находится в ассоциации с конкретным VHH; и(c) allowing the fusion polypeptides exposed in step (a) to associate with the association partner obtained in step (b) and selecting fusion polypeptide(s) that do not bind to the antigen or has(s) antigen binding activity that is at or below a predetermined level in a state in which the single domain antibody is in association with a particular VHH; And

(г) выбор из слитого(ых) полипептида(ов), отобранного(ых) на стадии (в), слитого полипептида, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, соответствующую предварительно установленному уровню или выше его в состоянии, в котором однодоменное антитело, входящее в него, не находится в ассоциации с VHH.(d) selecting from the fusion polypeptide(s) selected in step (c), a fusion polypeptide that binds to an antigen or has antigen-binding activity at or above a predetermined level in the state in which the single domain antibody , included in it, is not in association with VHH.

(123) Способ скрининга по п. (122), в котором партнер по ассоциации, полученный на стадии (б), дополнительно содержит расщепляемую протеазой последовательность, и стадия (г) включает расщепление партнера по ассоциации посредством обработки протеазой таким образом, что ассоциация однодоменного антитела с VHH аннулируется.(123) The screening method according to claim (122), wherein the association partner obtained in step (b) further comprises a protease-cleavable sequence, and step (d) includes cleaving the association partner by protease treatment such that the single-domain association antibodies with VHH are cancelled.

(124) Способ скрининга по п. (123), в котором расщепляемая протеазой последовательность партнера по ассоциации, полученного на стадии (б), локализована вблизи границы между конкретным VHH и вторым поддерживающим ассоциацию доменом.(124) The screening method of claim (123), wherein the protease-cleavable sequence of the association partner obtained in step (b) is located near the boundary between the particular VHH and the second association-supporting domain.

(125) Способ скрининга по п. (122), в котором слитые полипептиды библиотеки дополнительно содержат расщепляемую протеазой последовательность, и стадия (г) включает расщепление слитого(ых) полипептида(ов) обработкой протеазой таким образом, что ассоциация однодоменного антитела с VHH аннулируется.(125) The screening method of claim (122), wherein the library fusion polypeptides further comprise a protease cleavable sequence, and step (d) comprises cleaving the fusion polypeptide(s) by protease treatment such that the association of the single domain antibody with VHH is abolished .

(126) Способ скрининга по п. (125), в котором расщепляемая протеазой последовательность, входящая в каждый слитый полипептид, локализована вблизи границы между однодоменным антителом и первым поддерживающим ассоциацию доменом.(126) The screening method of claim (125), wherein the protease cleavable sequence included in each fusion polypeptide is located near the boundary between the single domain antibody and the first association supporting domain.

(127) Способ скрининга по п. (122), в котором стадия (г) включает обеспечение осуществления повторного экспонирования in vitro полноразмерого(ых) слитого(ых) полипептида(ов), отобранного(ых) на стадии (в), или их фрагментов, содержащих однодоменные антитела.(127) The screening method according to claim (122), wherein step (d) includes allowing for in vitro reexposure of the full-length fusion polypeptide(s) selected in step (c), or fragments containing single-domain antibodies.

(128) Способ скрининга по п. (122), в котором стадия (г) включает обеспечение осуществления повторного экспонирования in vitro полноразмерого(ых) слитого(ых) полипептида(ов), отобранного(ых) на стадии (в), и отбор слитого полипептида, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его в состоянии ассоциации только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом.(128) The screening method of claim (122), wherein step (d) comprises allowing for in vitro reexposure of the full-length fusion polypeptide(s) selected in step (c) and selecting a fusion polypeptide that binds to an antigen or has antigen-binding activity that is at or above a predetermined level when in association with only the second association-supporting domain.

(129) Способ скрининга по одному из п.п. (106)-(112), (114)-(120) и (122)-(128), в котором стадия получения партнера по ассоциации, указанная на стадии (б), представляет собой стадию обеспечения осуществления совместного экспонирования партнера по ассоциации и слитых полипептидов.(129) Screening method according to one of claims. (106)-(112), (114)-(120) and (122)-(128), in which the step of obtaining the association partner specified in step (b) is a step of ensuring the joint exposure of the association partner and fusion polypeptides.

(130) Библиотека по одному из п.п. (99)-(103), в которой первый поддерживающий ассоциацию домен содержит СН1-домен антитела IgG-типа или константную область легкой цепи антитела.(130) Library according to one of paragraphs. (99)-(103), wherein the first association supporting domain comprises the CH1 domain of an IgG-type antibody or an antibody light chain constant region.

(131) Способ скрининга по одному из п.п. (106)-(112), (114)-(120) и (122)-(128), в котором первый поддерживающий ассоциацию домен содержит CHI-домен антитела IgG-типа, а второй поддерживающий ассоциацию домен содержит константную область легкой цепи антитела.(131) Screening method according to one of claims. (106)-(112), (114)-(120) and (122)-(128), in which the first association-supporting domain contains the CHI domain of an IgG-type antibody, and the second association-supporting domain contains the light chain constant region of the antibody .

(132) Способ скрининга по одному из п.п. (106)-(112), (114)-(120) и (122)-(128), в котором первый поддерживающий ассоциацию домен содержит константную область легкой цепи антитела, а второй поддерживающий ассоциацию домен содержит CH1-домен антитела IgG-типа.(132) Screening method according to one of claims. (106)-(112), (114)-(120) and (122)-(128), in which the first association-supporting domain contains the constant region of an antibody light chain, and the second association-supporting domain contains the CH1 domain of an IgG-type antibody .

(133) Способ скрининга по п. (105), включающий следующие стадии:(133) The screening method according to claim (105), including the following steps:

(в) отбор слитого(ых) полипептида(ов), содержащего(их) однодоменное антитело, которое связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его; и(c) selecting fusion polypeptide(s) containing a single domain antibody that binds to an antigen or has antigen binding activity that is at or above a predetermined level; And

(г) обеспечение осуществления ассоциации слитого(ых) полипептида(ов), отобранного(ых) на стадии (в), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого полипептида, который не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его в состоянии, в котором однодоменное антитело находится в ассоциации с VL.(d) causing the fusion polypeptide(s) selected in step (c) to associate with the association partner obtained in step (b), and selecting a fusion polypeptide that does not bind an antigen or has antigen-binding properties activity that is at or below a predetermined level in the state in which the single domain antibody is in association with the VL.

(134) Способ скрининга по п. (129), в котором стадия (г) включает обеспечение осуществления повторного экспонирования in vitro слитых полипептидов, отобранных на стадии (в).(134) The screening method according to claim (129), wherein step (d) includes allowing for in vitro reexposure of the fusion polypeptides selected in step (c).

(135) Способ скрининга по п. (133), в котором стадия (в) включает обеспечение осуществления ассоциации слитого(ых) полипептида(ов) только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом или подтверждение связывания антигена однодоменным антителом, входящим в слитый полипептид, которое находится в ассоциации только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом.(135) The screening method according to claim (133), wherein step (c) includes ensuring that the fusion polypeptide(s) associate only with a second association-supporting domain or confirming the binding of an antigen by a single-domain antibody included in the fusion polypeptide that is located in association only with the second association-supporting domain.

(136) Способ скрининга по п. (113), включающий следующие стадии:(136) The screening method according to claim (113), including the following steps:

(г) обеспечение осуществления ассоциации слитого(ых) полипептида(ов), отобранного(ых) на стадии (в), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого полипептида, который не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его в состоянии, в котором однодоменное антитело находится в ассоциации с VH.(d) causing the fusion polypeptide(s) selected in step (c) to associate with the association partner obtained in step (b), and selecting a fusion polypeptide that does not bind an antigen or has antigen-binding properties activity that is at or below a predetermined level in the state in which the single domain antibody is in association with VH.

(137) Способ скрининга по п. (136), в котором стадия (г) включает обеспечение осуществления повторного экспонирования in vitro слитых полипептидов, отобранных на стадии (в).(137) The screening method according to claim (136), wherein step (d) includes allowing for in vitro reexposure of the fusion polypeptides selected in step (c).

(138) Способ скрининга по п. (136), в котором стадия (в) включает обеспечение осуществления ассоциации слитого полипептида только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом или подтверждение связывания антигена однодоменным антителом, входящим в слитый полипептид, которое находится в ассоциации только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом.(138) The screening method of claim (136), wherein step (c) comprises ensuring that the fusion polypeptide associates only with a second association-supporting domain or confirming antigen binding by a single-domain antibody included in the fusion polypeptide that is in association only with a second association-supporting domain. domain association.

(139) Способ скрининга по п. (121), включающий следующие стадии:(139) The screening method according to claim (121), including the following steps:

(г) обеспечение осуществления ассоциации слитого(ых) полипептида(ов), отобранного(ых) на стадии (в), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого полипептида, который не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его в состоянии, в котором однодоменное антитело находится в ассоциации с VHH.(d) causing the fusion polypeptide(s) selected in step (c) to associate with the association partner obtained in step (b), and selecting a fusion polypeptide that does not bind an antigen or has antigen-binding properties activity that is at or below a predetermined level in the state in which the single domain antibody is in association with VHH.

(140) Способ скрининга по п. (139), в котором стадия (г) включает обеспечение осуществления повторного экспонирования in vitro слитых полипептидов, отобранных на стадии (в).(140) The screening method according to claim (139), wherein step (d) includes allowing for in vitro reexposure of the fusion polypeptides selected in step (c).

(141) Способ скрининга по п. (139), в котором стадия (в) включает обеспечение осуществления ассоциации слитого(ых) полипептида(ов) только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом или подтверждение связывания антигена однодоменным антителом, входящим в слитый полипептид, которое находится в ассоциации только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом.(141) The screening method according to claim (139), wherein step (c) comprises ensuring that the fusion polypeptide(s) associate only with a second association-supporting domain or confirming the binding of an antigen by a single domain antibody included in the fusion polypeptide that is located in association only with the second association-supporting domain.

(142) Способ скрининга по одному из п.п. (133)-(141), в котором стадия обеспечения осуществления ассоциации слитого(ых) полипептида(ов) с партнером по ассоциации, указанная на стадии (г), представляет собой стадию обеспечения осуществления совместного экспонирования партнера по ассоциации и слитых полипептидов.(142) Screening method according to one of claims. (133)-(141), wherein the step of causing the association of the fusion polypeptide(s) with the association partner specified in step (d) is the step of causing the association partner and the fusion polypeptides to be exposed together.

(143) Способ скрининга по одному из п.п. (133)-(142), в котором первый поддерживающий ассоциацию домен содержит СН1-домен антитела IgG-типа, а второй поддерживающий ассоциацию домен содержит константную область легкой цепи антитела.(143) Screening method according to one of claims. (133)-(142), in which the first association-supporting domain contains the CH1 domain of an IgG-type antibody, and the second association-supporting domain contains the light chain constant region of the antibody.

(144) Способ скрининга по одному из п.п. (133)-(142), в котором первый поддерживающий ассоциацию домен содержит константную область легкой цепи антитела, а второй поддерживающий ассоциацию домен содержит СН1-домен антитела IgG-типа.(144) Screening method according to one of claims. (133)-(142), in which the first association-supporting domain contains the constant region of an antibody light chain, and the second association-supporting domain contains the CH1 domain of an IgG-type antibody.

В частности, настоящее изобретение может включать также конкретные варианты осуществления изобретения, примеры которых представлены ниже.In particular, the present invention may also include specific embodiments of the invention, examples of which are presented below.

(Б1) Полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент, где транспортирующий фрагмент имеет ингибирующий домен, который ингибирует антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена, и где полипептид имеет расщепляемую протеазой последовательность, содержащую одну или несколько последовательностей, выбранных из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 833-852 и SEQ ID NO: 1062-1081, и последовательностей, представленных в таблице 1.(B1) A polypeptide comprising an antigen binding domain and a transport fragment, wherein the transport fragment has an inhibitory domain that inhibits the antigen binding activity of the antigen binding domain, and where the polypeptide has a protease cleavable sequence comprising one or more sequences selected from the sequences set forth in SEQ ID NO: 833-852 and SEQ ID NO: 1062-1081, and the sequences presented in table 1.

(Б2) Полипептид по п. (Б1), в котором ингибирование антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена с помощью ингибирующего домена в состоянии, в котором расщепляемая протеазой последовательность является расщепленной протеазой, слабее, чем ингибирование антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена с помощью ингибирующего домена в условиях, в которых расщепляемая протеазой последовательность является нерасщепленной.(B2) The polypeptide of (B1), wherein the inhibition of the antigen-binding activity of the antigen-binding domain by the inhibitory domain in a condition in which the protease-cleavable sequence is a protease-cleaved sequence is weaker than the inhibition of the antigen-binding activity of the antigen-binding domain by the inhibitory domain in the condition in which in which the sequence cleaved by the protease is uncleaved.

(Б3) Полипептид по п. (Б1) или п. (Б2), в котором антигенсвязывающий домен имеет более короткое время полужизни в крови, чем транспортирующий фрагмент.(B3) A polypeptide according to item (B1) or item (B2), in which the antigen-binding domain has a shorter half-life in the blood than the transport fragment.

(Б4) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б3), в котором молекулярная масса антигенсвязывающего домена меньше, чем молекулярная масса транспортирующего фрагмента.(B4) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B3), in which the molecular weight of the antigen-binding domain is less than the molecular weight of the transport fragment.

(Б5) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б4), в котором молекулярная масса антигенсвязывающего домена составляет 60 кДа или менее.(B5) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1) to (B4), in which the molecular weight of the antigen binding domain is 60 kDa or less.

(Б6) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б5), в котором транспортирующий фрагмент обладает FcRn-связывающей активностью, а антигенсвязывающий домен не обладает FcRn-связывающей активностью или имеет более слабую FcRn-связывающую активность, чем транспортирующий фрагмент.(B6) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B5), in which the transport fragment has FcRn-binding activity, and the antigen-binding domain does not have FcRn-binding activity or has weaker FcRn-binding activity than the transport fragment.

(Б7) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б6), в котором антигенсвязывающий домен обладает способностью высвобождаться из полипептида, и антигенсвязывающий домен имеет более высокую антигенсвязывающую активность в высвободившемся из полипептида состоянии, чем антигенсвязывающая активность в невысвободившемся из полипептида состоянии.(B7) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1) to (B6), in which the antigen binding domain has the ability to be released from the polypeptide, and the antigen binding domain has higher antigen binding activity in the state released from the polypeptide than the antigen binding activity in the state not released from the polypeptide.

(Б8) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б7), в котором антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена ингибируется в результате ассоциации ингибирующего домена транспортирующего фрагмента с антигенсвязывающим доменом.(B8) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B7), in which the antigen-binding activity of the antigen-binding domain is inhibited as a result of the association of the inhibitory domain of the transport fragment with the antigen-binding domain.

(Б9) Полипептид по п. (Б7), в котором расщепляемая протеазой последовательность расщепляется протеазой таким образом, что антигенсвязывающий домен приобретает способность высвобождаться из полипептида.(B9) The polypeptide of (B7), wherein the protease-cleavable sequence is cleaved by the protease such that the antigen-binding domain becomes releasable from the polypeptide.

(Б10) Полипептид по п. (Б8), в котором расщепляемая протеазой последовательность расщепляется протеазой таким образом, что ассоциация ингибирующего домена транспортирующего фрагмента с антигенсвязывающим доменом аннулируется.(B10) The polypeptide of claim (B8), wherein the protease-cleavable sequence is cleaved by the protease in such a way that the association of the inhibitory domain of the transport fragment with the antigen-binding domain is abolished.

(Б11) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б 10), где протеаза представляет собой протеазу, специфическую для ткани-мишени.(B11) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B 10), where the protease is a protease specific for the target tissue.

(Б12) Полипептид по п. (Б 11), где ткань-мишень представляет собой раковую ткань или воспалительную ткань, и протеаза представляет собой специфическую для раковой ткани протеазу или специфическую для воспалительной ткани протеазу.(B12) The polypeptide of (B 11), wherein the target tissue is a cancer tissue or an inflammatory tissue, and the protease is a cancer tissue-specific protease or an inflammatory tissue-specific protease.

(Б13) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б12), где протеаза представляет собой по меньшей мере одну протеазу, выбранную из матриптазы, урокиназы (иРА) и металлопротеиназы.(B13) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B12), where the protease is at least one protease selected from matriptase, urokinase (uPA) and metalloproteinase.

(Б14) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б12), где протеаза представляет собой по меньшей мере одну протеазу, выбранную из MT-SP1, uPA, ММР-2, ММР-9, ADAMTS5, ММР-7 и ММР-13.(B14) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B12), where the protease is at least one protease selected from MT-SP1, uPA, MMP-2, MMP-9, ADAMTS5, MMP-7 and MMP-13.

(Б15) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б14), в котором первый гибкий линкер дополнительно присоединен к одному концу расщепляемой протеазой последовательности.(B15) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B14), in which the first flexible linker is further attached to one end of the protease-cleavable sequence.

(Б16) Полипептид по п. (Б15), в котором первый гибкий линкер представляет собой гибкий линкер, состоящий из глицин-серинового полимера.(B16) The polypeptide of claim (B15), wherein the first flexible linker is a flexible linker consisting of a glycine-serine polymer.

(Б17) Полипептид по п. (Б 15) или п. (Б16), в котором второй гибкий линкер дополнительно присоединен к другому концу расщепляемой протеазой последовательности.(B17) The polypeptide according to item (B 15) or item (B16), in which the second flexible linker is additionally attached to the other end of the protease-cleavable sequence.

(Б18) Полипептид по п. (Б17), в котором второй гибкий линкер представляет собой гибкий линкер, состоящий из глицин-серинового полимера.(B18) The polypeptide of claim (B17), wherein the second flexible linker is a flexible linker consisting of a glycine-serine polymer.

(Б19) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б 18), в котором антигенсвязывающий домен содержит однодоменное антитело или представляет собой однодоменное антитело, в котором ингибирующий домен транспортирующего фрагмента ингибирует антигенсвязывающую активность однодоменного антитела.(B19) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B 18), in which the antigen binding domain contains a single domain antibody or is a single domain antibody in which the inhibitory domain of the transport fragment inhibits the antigen binding activity of the single domain antibody.

(Б20) Полипептид по п. (Б 19), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, VH, который сам обладает антигенсвязывающей активностью, или VL, который сам обладает антигенсвязывающей активностью.(B20) The polypeptide of claim (B 19), wherein the single domain antibody is a VHH, a VH that itself has antigen-binding activity, or a VL that itself has antigen-binding activity.

(Б21) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б20), в котором антигенсвязывающий домен содержит однодоменное антитело, в котором ингибирующий домен транспортирующего фрагмента представляет собой VHH, VH антитела или VL антитела и в котором антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется VHH, VH антитела или VL антитела.(B21) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1) to (B20), wherein the antigen binding domain comprises a single domain antibody, wherein the inhibitory domain of the transport moiety is a VHH, VH antibody or VL antibody, and wherein the antigen binding activity of the single domain antibody is inhibited by a VHH, VH antibody or VL antibody.

(Б22) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б21), в котором антигенсвязывающий домен содержит однодоменное антитело, в котором ингибирующий домен транспортирующего фрагмента представляет собой VHH, VH антитела или VL антитела и в котором антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется путем его ассоциации с VHH, VH антитела или VL антитела.(B22) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B21), wherein the antigen binding domain comprises a single domain antibody, wherein the inhibitory domain of the transport moiety is a VHH, VH antibody or VL antibody and wherein the antigen binding activity of the single domain antibody is inhibited by its association with a VHH, VH antibody or VL antibody .

(Б23) Полипептид по одному из п.п. (Б19)-(Б22), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH или VH, который сам обладает антигенсвязывающей активностью, в котором ингибирующий домен транспортирующего фрагмента представляет собой VL антитела и в котором антигенсвязывающая активность VHH или VH, который сам обладает антигенсвязывающей активностью, ингибирует путем его ассоциации с VL антитела.(B23) Polypeptide according to one of paragraphs. (B19)-(B22), in which the single domain antibody is a VHH or a VH that itself has antigen-binding activity, in which the inhibitory domain of the transport fragment is a VL of the antibody, and in which the antigen-binding activity of VHH or a VH that itself has antigen-binding activity inhibits by its association with VL antibodies.

(Б24) Полипептид по одному из п.п. (Б19)-(Б23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH, где VHH имеет аминокислотную замену по меньшей мере в одном положении, выбранном из аминокислот в положениях 37, 44, 45 и 47 (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).(B24) Polypeptide according to one of paragraphs. (B19)-(B23), wherein the single domain antibody is VHH, wherein VHH has an amino acid substitution at at least one position selected from amino acids at positions 37, 44, 45 and 47 (all numbered according to Cabot numbering).

(Б25) Полипептид по одному из п.п. (Б19)-(Б23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH и в котором VHH содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из аминокислот 37V, 44G, 45L и 47W (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).(B25) Polypeptide according to one of paragraphs. (B19)-(B23), wherein the single domain antibody is VHH and wherein VHH contains at least one amino acid selected from amino acids 37V, 44G, 45L and 47W (all numbered according to Cabot numbering).

(Б26) Полипептид по одному из п.п. (Б19)-(Б23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH и в котором VHH содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из аминокислотных замен F37V, Y37V, E44G, Q44G, R45L, H45L, G47W, F47W, L47W, T47W и S47W (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).(B26) Polypeptide according to one of paragraphs. (B19)-(B23), in which the single domain antibody is VHH and in which VHH contains at least one amino acid substitution selected from amino acid substitutions F37V, Y37V, E44G, Q44G, R45L, H45L, G47W, F47W, L47W, T47W and S47W (all numbered according to Cabot's numbering).

(Б27) Полипептид по одному из п.п. (Б19)-(Б23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH и в котором VHH имеет аминокислотные замены по меньшей мере в одном наборе положений, выбранном из положений 37/44, положений 37/45, положений 37/47, положений 44/45, положений 44/47, положений 45/47, положений 37/44/45, положений 37/44/47, положений 37/45/47, положений 44/45/47 и положений 37/44/45/47 (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).(B27) Polypeptide according to one of paragraphs. (B19)-(B23), wherein the single domain antibody is VHH and wherein VHH has amino acid substitutions at at least one set of positions selected from positions 37/44, positions 37/45, positions 37/47, positions 44/ 45, Regulations 44/47, Regulations 45/47, Regulations 37/44/45, Regulations 37/44/47, Regulations 37/45/47, Regulations 44/45/47 and Regulations 37/44/45/47 (all numbered according to Cabot's numbering).

(Б28) Полипептид по одному из п.п. (Б19)-(Б23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH и в котором VHH содержит по меньшей мере один набор аминокислот, выбранный из 37V/44G, 37V/45L, 37V/47W, 44G/45L, 44G/47W, 45L/47W, 37V/44G/45L, 37V/44G/47W, 37V/45L/47W, 44G/45L/47W и 37V/44G/45L/47W (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).(B28) Polypeptide according to one of paragraphs. (B19)-(B23), in which the single domain antibody is VHH and in which VHH contains at least one set of amino acids selected from 37V/44G, 37V/45L, 37V/47W, 44G/45L, 44G/47W, 45L /47W, 37V/44G/45L, 37V/44G/47W, 37V/45L/47W, 44G/45L/47W and 37V/44G/45L/47W (all numbered according to Cabot numbering).

(Б29) Полипептид по одному из п.п. (Б19)-(Б23), в котором однодоменное антитело представляет собой VHH и в котором VHH содержит по меньшей мере один набор аминокислотных замен, выбранный из F37V/R45L, F37V/G47W, R45L/G47W и F37V/R45L/G47W (все пронумерованы согласно нумерации Кэбота).(B29) Polypeptide according to one of paragraphs. (B19)-(B23), wherein the single domain antibody is VHH and wherein VHH contains at least one set of amino acid substitutions selected from F37V/R45L, F37V/G47W, R45L/G47W and F37V/R45L/G47W (all numbered according to Cabot's numbering).

(Б30) Полипептид по одному из п.п. (Б19)-(Б22), в котором однодоменное антитело представляет собой VL, который сам обладает антигенсвязывающей активностью, в котором ингибирующий домен транспортирующего фрагмента представляет собой VH антитела и в котором антигенсвязывающая активность VL, который сам обладает антигенсвязывающей активностью, ингибируется путем его ассоциации с VH антитела.(B30) Polypeptide according to one of paragraphs. (B19)-(B22), in which the single domain antibody is a VL, which itself has antigen-binding activity, in which the inhibitory domain of the transport fragment is a VH of the antibody, and in which the antigen-binding activity of the VL, which itself has antigen-binding activity, is inhibited by its association with VH antibodies.

(Б31) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б30), в котором транспортирующий фрагмент имеет FcRn-связывающую область.(B31) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B30), in which the transporting fragment has an FcRn-binding region.

(Б32) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б31), в котором транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела.(B32) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B31), in which the transporting fragment contains the constant region of the antibody.

(Б33) Полипептид по п. (Б32), в котором константная область антитела транспортирующего фрагмента и антигенсвязывающий домен слиты через линкер или без линкера.(B33) The polypeptide according to item (B32), in which the constant region of the antibody transport fragment and the antigen-binding domain are fused through a linker or without a linker.

(Б34) Полипептид по п. (Б32), в котором транспортирующий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи антитела и в котором константная область тяжелой цепи антитела и антигенсвязывающий домен слиты через линкер или без линкера.(B34) The polypeptide of claim (B32), in which the transport moiety comprises an antibody heavy chain constant region, and in which the antibody heavy chain constant region and the antigen binding domain are fused through a linker or without a linker.

(Б35) Полипептид по п. (Б32), в котором транспортирующий фрагмент содержит константную область легкой цепи антитела и в котором константная область легкой цепи антитела и антигенсвязывающий домен слиты через линкер или без линкера.(B35) The polypeptide of claim (B32), in which the transport moiety comprises an antibody light chain constant region, and in which the antibody light chain constant region and the antigen binding domain are fused through a linker or without a linker.

(Б36) Полипептид по п. (Б34), в котором N-конец константной области тяжелой цепи антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера и в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована в последовательности антигенсвязывающего домена или в константной области тяжелой цепи антитела на стороне, примыкающей к антигенсвязывающему домену за аминокислотой в положении 122 (EU-нумерация).(B36) The polypeptide according to claim (B34), in which the N-terminus of the constant region of the heavy chain of the antibody transport fragment and the C-terminus of the antigen-binding domain are fused through a linker or without a linker, and in which the protease-cleavable sequence is localized in the sequence of the antigen-binding domain or in the constant region the antibody heavy chain on the side adjacent to the antigen-binding domain after amino acid position 122 (EU numbering).

(Б37) Полипептид по п. (Б35), в котором N-конец константной области легкой цепи антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера и в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована в последовательности антигенсвязывающего домена или в константной области легкой цепи антитела на стороне, примыкающей к антигенсвязывающему домену за аминокислотой в положении 113 (EU-нумерация) (положение 113 согласно нумерации Кэбота).(B37) The polypeptide according to claim (B35), in which the N-terminus of the constant region of the antibody light chain of the transport fragment and the C-terminus of the antigen-binding domain are fused through a linker or without a linker, and in which the protease-cleavable sequence is localized in the sequence of the antigen-binding domain or in the constant region the antibody light chain on the side adjacent to the antigen binding domain after amino acid position 113 (EU numbering) (position 113 according to Cabot numbering).

(Б38) Полипептид по одному из п.п. (Б33)-(Б36), в котором N-конец константной области антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера, в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH, или представляет собой VHH и в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована в последовательности константной области антитела или в однодоменном антителе антигенсвязывающего домена на стороне, примыкающей к константной области антитела за аминокислотой в положении 109 (нумерация Кэбота).(B38) Polypeptide according to one of paragraphs. (B33)-(B36), in which the N-terminus of the antibody constant region of the transport fragment and the C-terminus of the antigen-binding domain are fused through a linker or without a linker, in which the antigen-binding domain is a single-domain antibody derived from VH, or is VHH and in in which the protease-cleavable sequence is located in the antibody constant region sequence or in a single-domain antibody antigen-binding domain on the side adjacent to the antibody constant region after amino acid position 109 (Cabot numbering).

(Б39) Полипептид по п. (БЗЗ), в котором N-конец константной области антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера и в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью антитела.(B39) A polypeptide according to claim (B33), in which the N-terminus of the antibody constant region of the transport fragment and the C-terminus of the antigen-binding domain are fused through a linker or without a linker, and in which the protease-cleavable sequence is localized near the boundary between the antigen-binding domain and the antibody constant region.

(Б40) Полипептид по п. (Б34), в котором N-конец константной области тяжелой цепи антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера и в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью тяжелой цепи антитела.(B40) The polypeptide according to claim (B34), in which the N-terminus of the constant region of the heavy chain of the antibody transport fragment and the C-terminus of the antigen-binding domain are fused through a linker or without a linker, and in which the protease-cleavable sequence is localized near the boundary between the antigen-binding domain and the constant region antibody heavy chain.

(Б41) Полипептид по п. (Б35), в котором N-конец константной области легкой цепи антитела транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера и в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью легкой цепи антитела.(B41) The polypeptide according to claim (B35), in which the N-terminus of the constant region of the antibody light chain of the transport fragment and the C-terminus of the antigen-binding domain are fused through a linker or without a linker, and in which the protease-cleavable sequence is localized near the boundary between the antigen-binding domain and the constant region light chain of an antibody.

(Б42) Полипептид по п. (Б40), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH, или представляет собой VHH и в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована между аминокислотой в положении 109 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела антигенсвязывающего домена и аминокислотой в положении 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела.(B42) The polypeptide of claim (B40) wherein the antigen binding domain is a single domain antibody derived from VH or is VHH and wherein the protease cleavable sequence is located between the amino acid at position 109 (Cabot numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain and the amino acid at position 122 (EU numbering) of the constant region of the antibody heavy chain.

(Б43) Полипептид по п. (Б41), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH, или представляет собой VHH и в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована между аминокислотой в положении 109 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела антигенсвязывающего домена и аминокислотой в положении 113 (EU-нумерация) (положение 113 согласно нумерации Кэбота) константной области легкой цепи антитела.(B43) The polypeptide of claim (B41), wherein the antigen binding domain is a single domain antibody derived from VH or is VHH and wherein the protease cleavable sequence is located between the amino acid at position 109 (Cabot numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain and the amino acid at position 113 (EU numbering) (position 113 according to Cabot numbering) of the antibody light chain constant region.

(Б44) Полипептид по п. (Б40), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VL, и в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована между аминокислотой в положении 104 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела антигенсвязывающего домена и аминокислотой в положении 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела.(B44) The polypeptide of claim (B40), wherein the antigen binding domain is a single domain antibody derived from VL, and wherein the protease cleavable sequence is located between the amino acid at position 104 (Cabot numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain and the amino acid at position 122 ( EU numbering) of the constant region of the antibody heavy chain.

(Б45) Полипептид по п. (Б41), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VL, и в котором расщепляемая протеазой последовательность локализована между аминокислотой в положении 109 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела антигенсвязывающего домена и аминокислотой в положении 113 (EU-нумерация) (положение 113 согласно нумерации Кэбота) константной области легкой цепи антитела.(B45) The polypeptide of claim (B41), wherein the antigen binding domain is a single domain antibody derived from VL, and wherein the protease cleavable sequence is located between the amino acid at position 109 (Cabot numbering) of the single domain antibody of the antigen binding domain and the amino acid at position 113 ( EU numbering) (position 113 according to Cabot numbering) of the antibody light chain constant region.

(Б46) Полипептид по одному из п.п. (Б32)-(Б45), в котором константная область антитела полипептида представляет собой константную область антитела IgG-типа.(B46) Polypeptide according to one of paragraphs. (B32) to (B45), in which the antibody constant region of the polypeptide is an IgG-type antibody constant region.

(Б47) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б46), где полипептид представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа.(B47) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B46), where the polypeptide is an IgG-type antibody-like molecule.

(Б48) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б47), в котором при анализе антигенсвязывающего домена в нерасщепленном состоянии с использованием интерферометрии биослоя (ВЫ) (система Octet) связывание антигенсвязывающего домена с антигеном не выявляется.(B48) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B47), in which when analyzing the antigen-binding domain in an uncleaved state using biolayer interferometry (BL) (Octet system), the binding of the antigen-binding domain to the antigen is not detected.

(Б49) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(4Б8), в котором второй антигенсвязывающий домен дополнительно сцеплен с антигенсвязывающим доменом.(B49) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(4B8), in which the second antigen-binding domain is additionally linked to the antigen-binding domain.

(Б50) Полипептид по п. (Б49), в котором второй антигенсвязывающий домен имеет антигенсвязывающую специфичность, отличную от специфичности антигенсвязывающего домена.(B50) The polypeptide of claim (B49), wherein the second antigen binding domain has an antigen binding specificity different from that of the antigen binding domain.

(Б52) Полипептид по п. (Б51), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, в котором второй антигенсвязывающий домен представляет собой второе однодоменное антитело, в котором антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен обладают способностью высвобождаться из полипептида и в котором однодоменное антитело и второе однодоменное антитело образуют биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, когда антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен находятся в высвободившемся состоянии.(B52) The polypeptide of claim (B51), wherein the antigen binding domain is a single domain antibody, wherein the second antigen binding domain is a second single domain antibody, wherein the antigen binding domain and the second antigen binding domain are releasable from the polypeptide, and wherein the single domain antibody and the second single domain antibody forms a bispecific antigen binding molecule when the antigen binding domain and the second antigen binding domain are in a released state.

(Б53) Полипептид по одному из п.п. (Б49)-(Б52), в котором второй антигенсвязывающий домен направлен против HER2 или GPC3 в качестве антигена-мишени.(B53) Polypeptide according to one of paragraphs. (B49)-(B52), in which the second antigen binding domain is directed against HER2 or GPC3 as a target antigen.

(Б54) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б53), где полипептид имеет также дополнительный антигенсвязывающий домен, отличный от антигенсвязывающего домена, и где антигенсвязывающая активность дополнительного антигенсвязывающего домена также ингибируется при его сцеплении с транспортирующим фрагментом полипептида.(B54) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B53), where the polypeptide also has an additional antigen-binding domain, different from the antigen-binding domain, and where the antigen-binding activity of the additional antigen-binding domain is also inhibited when it binds to the transport fragment of the polypeptide.

(Б55) Полипептид по п. (Б54), в котором дополнительный антигенсвязывающий домен и антигенсвязывающий домен имеют различные антигенсвязывающие специфичности.(B55) The polypeptide of (B54), wherein the additional antigen binding domain and the antigen binding domain have different antigen binding specificities.

(Б56) Полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б55), в котором антигенсвязывающий домен представляет собой антигенсвязывающий домен, направленный против плексина A1, IL-6R или CD3 в качестве антигена-мишени.(B56) Polypeptide according to one of paragraphs. (B1) to (B55), wherein the antigen binding domain is an antigen binding domain directed against plexin A1, IL-6R or CD3 as a target antigen.

(Б57) Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б56).(B57) Pharmaceutical composition containing a polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B56).

(Б58) Способ получения полипептида по одному из п.п. (Б1)-(Б56).(B58) Method for producing a polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B56).

(Б59) Способ получения по п. (Б58), включающий следующие стадии:(B59) The production method according to item (B58), including the following steps:

(Б60) Способ получения по п. (Б58), включающий следующие стадии:(B60) The production method according to item (B58), including the following steps:

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между однодоменным антителом и транспортирующим фрагментом,(c) introduction of a protease-cleavable sequence near the boundary between the single-domain antibody and the transport fragment,

где расщепляемая протеазой последовательность содержит одну или несколько последовательностей, выбранных из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 833-852 и SEQ ID NO: 1062-1081, и последовательностей, представленных в таблице 1.wherein the protease-cleavable sequence comprises one or more sequences selected from the sequences presented in SEQ ID NO: 833-852 and SEQ ID NO: 1062-1081, and the sequences presented in table 1.

(Б61) Способ получения по п. (Б58), включающий следующие стадии:(B61) The production method according to item (B58), including the following steps:

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с транспортирующим фрагментом через расщепляемую протеазой последовательность таким образом, что антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется ингибирующим доменом транспортирующего фрагмента, с образованием полипептида,(b) linking the single-domain antibody obtained in step (a) to the transport fragment through a protease-cleavable sequence such that the antigen-binding activity of the single-domain antibody is inhibited by the inhibitory domain of the transport fragment to form a polypeptide,

(Б62) Способ получения по одному из п.п. (Б59)-(Б61), дополнительно включающий следующую стадию:(B62) Method of production according to one of paragraphs. (B59)-(B61), additionally including the following stage:

(Б63) Способ получение по одному из п.п. (Б59)-(Б62), дополнительно включающий следующую стадию:(B63) Method of production according to one of paragraphs. (B59)-(B62), additionally including the following stage:

(Б64) Способ получения по п. (Б58), в котором полипептид представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа.(B64) The production method according to claim (B58), wherein the polypeptide is an IgG-type antibody-like molecule.

(Б65) Способ получения по п. (Б64), включающий следующие стадии:(B65) The production method according to item (B64), including the following steps:

(б) обеспечение осуществления ассоциации однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с VL в качестве замены VH антитела IgG-типа или обеспечение осуществления ассоциации однодоменного антитела с VH в качестве замены VL антитела IgG-типа, в результате чего антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется, с образованием подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет однодоменное антитело;и(b) causing the single-domain antibody obtained in step (a) to associate with VL as a replacement for the VH of an IgG-type antibody, or causing the single-domain antibody to associate with the VH as a replacement for the VL of an IgG-type antibody, resulting in antigen-binding activity of the single-domain antibody is inhibited to form an IgG-type antibody-like precursor molecule that carries a single domain antibody; and

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника, которая несет однодоменное антитело, где расщепляемая протеазой последовательность содержит одну или несколько последовательностей, выбранных из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 833-852 и SEQ ID NO: 1062-1081, и последовательностей, представленных в таблице 1.(c) introducing a protease-cleavable sequence into an IgG-type antibody-like precursor molecule that carries the single-domain antibody, wherein the protease-cleavable sequence comprises one or more sequences selected from the sequences set forth in SEQ ID NO: 833-852 and SEQ ID NO: 1062-1081, and the sequences presented in Table 1.

(Б66) Способ получения по п. (Б64), включающий следующие стадии:(B66) The production method according to item (B64), including the following steps:

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между однодоменным антителом и константной областью антитела в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника, где расщепляемая протеазой последовательность содержит одну или несколько последовательностей, выбранных из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 833-852 и SEQ ID NO: 1062-1081, и последовательностей, представленных в таблице 1.(c) introducing a protease-cleavable sequence near the boundary between the single-domain antibody and the antibody constant region into an IgG-type antibody-like precursor molecule, wherein the protease-cleavable sequence comprises one or more sequences selected from the sequences set forth in SEQ ID NOs: 833-852 and SEQ ID NO: 1062-1081, and the sequences presented in table 1.

(Б67) Способ получения по п. (Б64), включающий следующие стадии:(B67) The production method according to item (B64), including the following steps:

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), в качестве замены VH или VL антитела IgG-типа с константной областью тяжелой цепи или константной областью легкой цепи антитела IgG-типа через расщепляемую протеазой последовательность, в результате чего антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется, с образованием подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет однодоменное антитело, где расщепляемая протеазой последовательность содержит одну или несколько последовательностей, выбранных из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 833-852 и SEQ ID NO: 1062-1081, и последовательностей, представленных в таблице 1.(b) linking the single-domain antibody obtained in step (a) as a replacement for the VH or VL of an IgG-type antibody to the heavy chain constant region or light chain constant region of an IgG-type antibody through a protease-cleavable sequence, resulting in antigen-binding activity of the single-domain antibody is inhibited to form an IgG-type antibody-like precursor molecule that carries a single domain antibody, wherein the protease-cleavable sequence comprises one or more sequences selected from the sequences set forth in SEQ ID NOs: 833-852 and SEQ ID NOs: 1062-1081, and sequences presented in Table 1.

(Б68) Способ получения по одному из п.п. (Б65)-(Б67), дополнительно включающий следующую стадию:(B68) Method of production according to one of paragraphs. (B65)-(B67), additionally including the following stage:

(г) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, интродуцированного в подобную антителу IgG-типа молекулу или подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника, в отношении антигена-мишени ослабляется или утрачивается.(d) confirming that the binding activity of the single domain antibody introduced into the IgG antibody-like molecule or the IgG antibody-like precursor molecule to the target antigen is attenuated or lost.

(Б69) Способ получения по одному из п.п. (Б65)-(Б68), дополнительно включающий следующую стадию:(B69) Method of production according to one of paragraphs. (B65)-(B68), additionally including the following stage:

(Б70) Способ получения по п. (Б64), включающий следующие стадии:(B70) The production method according to item (B64), including the following steps:

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника, которая несет вариант однодоменного антитела, где расщепляемая протеазой последовательность содержит одну или несколько последовательностей, выбранных из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 833-852 и SEQ ID NO: 1062-1081, и последовательностей, представленных в таблице 1.(c) introducing a protease-cleavable sequence into an IgG-type antibody-like precursor molecule that carries a single-domain antibody variant, wherein the protease-cleavable sequence comprises one or more sequences selected from the sequences set forth in SEQ ID NO: 833-852 and SEQ ID NO: : 1062-1081, and the sequences presented in Table 1.

(Б71) Способ получения по п. (Б64), включающий следующие стадии:(B71) The production method according to item (B64), including the following steps:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VH антитела, или замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации однодоменного антитела с VL антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени;(a) replacing an amino acid residue in a single-domain antibody that is involved in association with the VH of the antibody, or replacing an amino acid residue in a single-domain antibody that is involved in association of the single-domain antibody with the VL of the antibody, to produce a variant single-domain antibody that retains the binding activity of the single-domain antibody for target antigen;

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между вариантом однодоменного антитела и константной областью в подобной антителу IgG-типа молекуле-предшественнике, где расщепляемая протеазой последовательность содержит одну или несколько последовательностей, выбранных из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 833-852 и SEQ ID NO: 1062-1081, и последовательностей, представленных в таблице 1.(c) introducing a protease-cleavable sequence near the boundary between the single-domain antibody variant and the constant region in the IgG-type antibody-like precursor molecule, wherein the protease-cleavable sequence comprises one or more sequences selected from the sequences set forth in SEQ ID NOs: 833-852 and SEQ ID NO: 1062-1081, and the sequences presented in table 1.

(Б72) Способ получения по п. (Б64), включающий следующие стадии: (а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VH антитела, или замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VL антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени; и(B72) The production method according to item (B64), including the following steps: (a) replacing an amino acid residue in a single-domain antibody that is involved in association with the VH of an antibody, or replacing an amino acid residue in a single-domain antibody that is involved in association with the VL of an antibody, producing a single-domain antibody variant that retains the binding activity of the single-domain antibody to a target antigen; And

(б) сцепление варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с константной областью тяжелой цепи антитела IgG-типа через расщепляемую протеазой последовательность или сцепление варианта однодоменного антитела с константной областью легкой цепи антитела IgG-типа через расщепляемую протеазой последовательность, в результате чего антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела ингибируется, с образованием подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет вариант однодоменного антитела, где расщепляемая протеазой последовательность содержит одну или несколько последовательностей, выбранных из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 833-852 и SEQ ID NO: 1062-1081, и последовательностей, представленных в таблице 1.(b) linking the single-domain antibody variant obtained in step (a) to the heavy chain constant region of an IgG-type antibody through a protease-cleavable sequence, or linking the single-domain antibody variant to the light chain constant region of an IgG-type antibody through a protease-cleavable sequence, thereby the antigen-binding activity of the single-domain antibody variant is inhibited to form an IgG-type antibody-like precursor molecule that carries the single-domain antibody variant, wherein the protease-cleavable sequence comprises one or more sequences selected from those set forth in SEQ ID NOs: 833-852 and SEQ ID NO: 1062-1081, and the sequences presented in Table 1.

(Б73) Способ получения по одному из п.п. (Б70)-(Б72), дополнительно включающий следующую стадию:(B73) Method of production according to one of paragraphs. (B70)-(B72), additionally including the following stage:

(г) подтверждение того, что связывающая активность варианта однодоменного антитела, интродуцированного в подобную антителу IgG-типа молекулу или интродуцированного в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника, в отношении антигена-мишени ослабляется или утрачивается.(d) confirming that the binding activity of the single domain antibody variant introduced into an IgG antibody-like molecule or introduced into an IgG antibody-like precursor molecule towards the target antigen is attenuated or lost.

(Б74) Способ получения по одному из п.п. (Б70)-(Б73), дополнительно включающий следующую стадию:(B74) Method of production according to one of paragraphs. (B70)-(B73), additionally including the following stage:

(Б75) Полинуклеотид, кодирующий полипептид по одному из п.п. (Б1)-(Б56).(B75) Polynucleotide encoding a polypeptide according to one of the paragraphs. (B1)-(B56).

(Б76) Вектор, содержащий полинуклеотид по п. (Б75).(B76) A vector containing a polynucleotide according to item (B75).

(Б77) Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п. (Б75) или вектор по п. (Б76).(B77) A host cell containing a polynucleotide according to item (B75) or a vector according to item (B76).

(Б78) Способ получения полипептида по одному из п.п. (Б1)-(Б56), включающий стадию культивирования клетки-хозяина по п. (Б77).(B78) Method for producing a polypeptide according to one of paragraphs. (B1)-(B56), including the stage of culturing the host cell according to item (B77).

Краткое описание чертежейBrief description of drawings

На чертежах показано:The drawings show:

на фиг. 1 диаграмма, демонстрирующая концепцию технологии Probody™. Probody представляет собой молекулу антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем сцепления антитела с пептидом, маскирующим антигенсвязывающий сайт антитела, через линкер, который расщепляется протеазой, экспрессируемой в области повреждения;in fig. 1 diagram demonstrating the concept of Probody™ technology. Probody is an antibody molecule whose antigen-binding activity is inhibited by linking the antibody to a peptide masking the antigen-binding site of the antibody through a linker that is cleaved by a protease expressed at the site of injury;

на фиг. 2 диаграмма, демонстрирующая причину побочных действий, которые могут обусловливаться Probody. Активированное Probody при накоплении в крови может вызывать побочные действия при связывании с антигеном, который экспрессируется в здоровой ткани;in fig. 2 diagram showing the cause of side effects that may be caused by Probody. Activated Probody, when accumulated in the blood, can cause side effects when binding to an antigen that is expressed in healthy tissue;

на фиг. 3 - диаграмма, демонстрирующая причину побочных действий, которые могут обусловливаться Probody. Probody находится в равновесии между состоянием, в котором маскирующий пептид, сцепленный через линкер, связан с антигенсвязывающим сайтом, и состоянием, в котором маскирующий пептид диссоциирован. Молекула в диссоциированном состоянии может связываться с антигеном;in fig. 3 is a diagram showing the cause of side effects that may be caused by Probody. The Probody is in equilibrium between a state in which the masking peptide linked through a linker is associated with the antigen-binding site, and a state in which the masking peptide is dissociated. A molecule in a dissociated state can bind to an antigen;

на фиг. 4 - диаграмма, демонстрирующая причину побочных действий, которые могут обусловливаться Probody. Антитело к лекарственному средству против маскирующего пептида (антитело к маскирующему пептиду) может связываться с маскирующим пептидом Probody до активации и тем самым активировать Probody без расщепления протеазой;in fig. 4 is a diagram showing the cause of side effects that may be caused by Probody. An anti-masking peptide drug antibody (anti-masking peptide antibody) can bind to the Probody masking peptide prior to activation and thereby activate the Probody without protease cleavage;

на фиг. 5 - диаграмма, демонстрирующая концепцию, касающуюся полипептида, который содержит антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент.(А) Полипептид с антигенсвязывающим доменом, сцепленным с транспортирующим фрагментом, имеет продолжительное время полужизни и не связывается с антигеном. (Б) Антигенсвязывающий домен высвобождает, например, в результате расщепления в сайте расщепления, для связывания с антигеном, и высвободившийся таким образом домен имеет короткое время полужизни;in fig. 5 is a diagram illustrating the concept of a polypeptide that contains an antigen binding domain and a transport moiety. (A) A polypeptide with an antigen binding domain linked to a transport moiety has a long half-life and does not bind to antigen. (B) The antigen binding domain is released, for example by cleavage at a cleavage site, to bind an antigen, and the domain thus released has a short half-life;

на фиг. 6 - диаграмма, демонстрирующая один из вариантов способа получения полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении. В настоящем варианте осуществления изобретения представляющий интерес полипептид представляет собой подобную антителу IgG-типа молекулу. (А) Получают однодоменное антитело, связывающееся с антигеном-мишенью. (Б) Давали осуществляться ассоциации однодоменного антитела с VL в качестве заместителя VH антитела IgG-типа, в результате чего антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется. (В) Расщепляемую протеазой последовательность интродуцируют в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника, которая несет однодоменное антитело;in fig. 6 is a diagram showing one embodiment of the method for producing the polypeptide of the present invention. In the present embodiment, the polypeptide of interest is an IgG-type antibody-like molecule. (A) A single domain antibody is produced that binds to the target antigen. (B) The single-domain antibody is allowed to associate with VL as a substitute for the VH of an IgG-type antibody, whereby the antigen-binding activity of the single-domain antibody is inhibited. (B) The protease-cleavable sequence is introduced into an IgG-type antibody-like precursor molecule that carries the single domain antibody;

на фиг. 7 - диаграмма, демонстрирующая один из вариантов полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении. В настоящем варианте осуществления изобретения полипептид представляет собой подобную антителу IgG-типа молекулу, а антигенсвязывающие домены создают соответственно на фрагментах, которые соответствуют двум вариабельным областям антитела IgG-типа. Два антигенсвязывающих домена могут иметь одинаковую антигенсвязывающую специфичность или могут отличаться их антигенсвязывающей специфичностью;in fig. 7 is a diagram showing one embodiment of the polypeptide of the present invention. In the present embodiment, the polypeptide is an IgG antibody-like molecule, and the antigen binding domains are respectively created on fragments that correspond to two variable regions of the IgG antibody. The two antigen binding domains may have the same antigen binding specificity or their antigen binding specificity may differ;

на фиг. 8 - диаграмма, демонстрирующая вариант осуществления изобретения, в котором второй антигенсвязывающий домен дополнительно сцеплен с антигенсвязывающий доменом, предлагаемым в настоящем изобретении. В этом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен образуют после высвобождения биспецифическую антигенсвязывающую молекулу. На фиг. 8(A) показана диаграмма, демонстрирующая полипептид в невысвободившемся состоянии. Антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена ингибируется. На фиг. 8(Б) показана диаграмма высвобождения биспецифической антигенсвязывающей молекулы, образованной антигенсвязывающий доменом и вторым антигенсвязывающий доменом. На фиг. 8(B) показана диаграмма, демонстрирующая биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, направленную, например, против поверхностного антигена Т-клеток и поверхностного антигена раковых клеток, в качестве примера биспецифической антигенсвязывающей молекулы после высвобождения;in fig. 8 is a diagram showing an embodiment of the invention in which a second antigen binding domain is further linked to an antigen binding domain of the present invention. In this embodiment, the antigen binding domain and the second antigen binding domain form a bispecific antigen binding molecule upon release. In fig. 8(A) is a diagram showing the polypeptide in an unreleased state. The antigen binding activity of the antigen binding domain is inhibited. In fig. 8(B) shows a release diagram of a bispecific antigen binding molecule formed by an antigen binding domain and a second antigen binding domain. In fig. 8(B) is a diagram showing a bispecific antigen binding molecule directed against, for example, T cell surface antigen and cancer cell surface antigen as an example of the bispecific antigen binding molecule after release;

на фиг. 9А - диаграмма, демонстрирующая один пример способа скрининга слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться в результате его ассоциации с конкретным ингибирующим доменом, из библиотеки, которая содержит множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом. На фиг. 9А(1) показана диаграмма, на которой продемонстрирована библиотека, содержащая множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом. На фиг. 9А(2) показана диаграмма, демонстрирующая, что антигенсвязывающая активность каждого однодоменного антитела подтверждена в состоянии, в котором слитый полипептид находится в ассоциации с партером по ассоциации. Отобран слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое не связывается с антигеном-мишенью или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его, в указанном состоянии ассоциации. На фиг. 9А(3) показана диаграмма, демонстрирующая, что ассоциация однодоменного антитела в слитом полипептиде, отобранном на фиг. 9А(2), с ингибирующим доменом в партнере по ассоциации аннулирована, и антигенсвязывающая активность однодоменного антитела подтверждена. Отобран слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое связывается с антигеном-мишенью или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, в указанном состоянии отсутствия ассоциации. На фиг. 9А(2') показана диаграмма, на которой продемонстрировано подтверждение антигенсвязывающей активности однодоменного антитела в каждом слитом полипептиде. Отобран слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое связывается с антигеном-мишенью или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, в указанном состоянии его индивидуального существования. На фиг. 9А(3') показана диаграмма, демонстрирующая, что антигенсвязывающая активность однодоменного антитела подтверждена в состоянии, в котором слитый полипептид, отобранный на фиг. 9А(2'), находится в ассоциации с партнером по ассоциации. Отобран слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое не связывается с антигеном-мишенью или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его, в указанном состоянии ассоциации;in fig. 9A is a diagram showing one example of a method for screening a fusion polypeptide containing a single-domain antibody whose antigen-binding activity can be inhibited or lost as a result of its association with a particular inhibitory domain, from a library that contains a plurality of single-domain antibody fusion polypeptides, each of which is linked to a first domain supporting the association. In fig. 9A(1) is a diagram illustrating a library containing a plurality of single domain antibody fusion polypeptides, each linked to a first association supporting domain. In fig. 9A(2) is a graph showing that the antigen binding activity of each single domain antibody is confirmed in a state in which the fusion polypeptide is in association with an association partner. A fusion polypeptide is selected that contains a single domain antibody that does not bind to a target antigen or has antigen binding activity that is at or below a predetermined level in a specified association state. In fig. 9A(3) is a graph showing that the association of a single domain antibody in the fusion polypeptide selected in FIG. 9A(2), with the inhibitory domain in the association partner cancelled, and the antigen binding activity of the single domain antibody confirmed. A fusion polypeptide is selected containing a single domain antibody that binds to a target antigen or has antigen binding activity that is at or above a predetermined level in a specified non-association state. In fig. 9A(2') is a graph showing confirmation of single domain antibody antigen binding activity in each fusion polypeptide. A fusion polypeptide is selected containing a single domain antibody that binds to a target antigen or has antigen binding activity that is at or above a predetermined level in a specified state of its individual existence. In fig. 9A(3') is a graph showing that the antigen binding activity of a single domain antibody is confirmed in a state in which the fusion polypeptide selected in FIG. 9A(2'), is in association with an association partner. A fusion polypeptide is selected containing a single domain antibody that does not bind to a target antigen or has antigen binding activity that is at or below a predetermined level in a specified association state;

на фиг. 9Б - диаграмма, демонстрирующая один более конкретный пример способа скрининга слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться в результате его ассоциации с конкретным ингибирующим доменом, из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом. (1) Слитые полипептиды, каждый из которых содержит однодоменное антитело и первый поддерживающий ассоциацию домен, и партнера по ассоциации, который несет расщепляемую протеазой последовательность между ингибирующим доменом и вторым поддерживающим ассоциацию доменом, экспонировали совместно в форме Fab-подобной структуры; (2) отбирали из экспонированных таким образом Fab-подобных структур структуру, которая не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его; и (3) расщепляли партнера по ассоциации протеазой и отбирали фрагмент, содержащий однодоменное антитело, которое связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его;in fig. 9B is a diagram showing one more specific example of a method for screening a fusion polypeptide containing a single domain antibody, the antigen binding activity of which can be inhibited or lost as a result of its association with a particular inhibitory domain, from a library containing a plurality of single domain antibody fusion polypeptides, each of which is linked to the first domain to support the association. (1) Fusion polypeptides, each containing a single domain antibody and a first association supporting domain, and an association partner that carries a protease cleavable sequence between the inhibitory domain and the second association supporting domain, were exhibited together in the form of a Fab-like structure; (2) selecting from the Fab-like structures thus exposed a structure that does not bind antigen or has antigen binding activity that is at or below a predetermined level; and (3) cleaving the association partner with a protease and selecting a fragment containing a single domain antibody that binds to an antigen or has antigen binding activity that is at or above a predetermined level;

на фиг. 9В - диаграмма, демонстрирующая другой более конкретный пример способа скрининга слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться в результате его ассоциации с конкретным ингибирующим доменом, из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом. (1) Слитые полипептиды, каждый из которых содержит расщепляемую протеазой последовательность между однодоменным антителом и первым поддерживающим ассоциацию доменом, и партнера по ассоциации ингибирующего домена, сцепленного со вторым поддерживающим ассоциацию доменом, экспонировали совместно в форме Fab-подобной структуры; (2) отбирали из экспонированных таким образом Fab-подобных структур структуру, которая не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его; и (3) расщепляли слитый полипептид протеазой и отбирали фрагмент, содержащий однодоменное антитело, которое связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его;in fig. 9B is a diagram showing another more specific example of a method for screening a fusion polypeptide containing a single domain antibody, the antigen binding activity of which can be inhibited or lost as a result of its association with a particular inhibitory domain, from a library containing a plurality of single domain antibody fusion polypeptides, each of which is linked to the first domain to support the association. (1) Fusion polypeptides, each containing a protease-cleavable sequence between a single domain antibody and a first association-supporting domain, and an association partner inhibitory domain linked to a second association-supporting domain, were exhibited together in the form of a Fab-like structure; (2) selecting from the Fab-like structures thus exposed a structure that does not bind antigen or has antigen binding activity that is at or below a predetermined level; and (3) digesting the fusion polypeptide with a protease and selecting a fragment containing a single domain antibody that binds to an antigen or has antigen binding activity that is at or above a predetermined level;

на фиг. 9Г - диаграмма, демонстрирующая альтернативный пример способа скрининга слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться в результате его ассоциации с конкретным ингибирующим доменом, из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом. (1) Слитые полипептиды, каждый из которых содержит однодоменное антитело и первый поддерживающий ассоциацию домен, и партнера по ассоциации ингибирующего домена, сцепленного со вторым поддерживающим ассоциацию доменом, экспонировали совместно в форме Fab-подобной структуры, и отбирали из экспонированных таким образом Fab-подобных структур структуру, которая не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его; и (2) отобранные таким образом, указанные на фиг. 9Г(1) фрагменты, содержащие однодоменные антитела в виде Fab-подобный структур, экспонировали вновь так, чтобы в это же время не происходила экспрессия ингибирующего домена, и отбирали фрагмент, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его. На каждой из фиг. 9Г(2') и 9Г(2") показана диаграмма, демонстрирующая альтернативный вариант, в котором фрагменты, содержащие однодоменные антитела, которые указаны на фиг. 9Г(2), экспонировали вновь так, чтобы вместе с ними не происходила экспрессия ингибирующего домена. Порядок осуществления (1) и (2), (2') или (2'') может представлять собой осуществление (2), (2') или (2'') до осуществления (1). В частности, фрагменты, содержащие однодоменные антитела, экспонируют таким образом, чтобы вместе с ними не происходила экспрессия ингибирующего домена, и отбирают фрагмент, имеющий антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его. Далее слитые полипептиды, каждый из которых содержит однодоменное антитело, содержащее фрагмент, имеющий связывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, и первый поддерживающий ассоциацию домен, и партнера по ассоциации ингибирующего домена, сцепленного со вторым поддерживающим ассоциацию доменом, экспонируют совместно с получением Fab-подобной структуры, и отбирают из экспонированных таким образом Fab-подобных структур структуру, которая не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его;in fig. 9D is a diagram showing an alternative example of a method for screening a fusion polypeptide containing a single domain antibody, the antigen binding activity of which may be inhibited or may be lost as a result of its association with a particular inhibitory domain, from a library containing a plurality of single domain antibody fusion polypeptides, each of which is linked to a first supporting domain. domain association. (1) Fusion polypeptides, each containing a single-domain antibody and a first association-supporting domain, and an association partner inhibitory domain linked to a second association-supporting domain, were coexposed in the form of a Fab-like structure, and selected from the Fab-likes thus exposed structures a structure that does not bind to an antigen or has an antigen-binding activity that is at or below a predetermined level; and (2) those so selected, indicated in FIG. 9D(1) fragments containing single-domain antibodies in the form of Fab-like structures were again exposed so that expression of the inhibitory domain did not occur at the same time, and a fragment was selected that binds to the antigen or has antigen-binding activity that corresponds to a predetermined level or above him. In each of FIG. 9D(2') and 9D(2") are diagrams showing an alternative embodiment in which fragments containing single domain antibodies as indicated in FIG. 9D(2) were reexposed so that expression of the inhibitory domain did not occur with them. The order of doing (1) and (2), (2') or (2'') may be doing (2), (2') or (2'') before doing (1). In particular, fragments containing single-domain antibodies are exposed in such a way that expression of the inhibitory domain does not occur with them, and a fragment having antigen-binding activity that corresponds to or above a predetermined level is selected.Next, fusion polypeptides, each of which contains a single-domain antibody containing a fragment having a binding activity that is at or above a predetermined level, and both the first association-supporting domain and the association partner of the inhibitory domain linked to the second association-supporting domain are coexposed to produce a Fab-like structure, and are selected from the Fab-like structures so exposed a structure that does not bind to an antigen or has an antigen-binding activity that is at or below a predetermined level;

на фиг. 10 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки связывания с человеческим IL-6R подобных антителу молекул, которые получали, давая осуществляться ассоциации различных легких цепей с конструкцией IL6R90-G1m, содержащей VHH к человеческому IL-6R (IL6R90), слитый с константной областью человеческого IgG1 (СН1-шарнир-СН2-СН3). Время начала действия подобных антителу молекул на сенсоры с иммобилизованным антигеном обозначено как исходная точка на оси абсцисс;in fig. 10 is a diagram showing the results of binding to human IL-6R antibody-like molecules that were prepared by allowing association of various light chains with an IL6R90-G1m construct containing VHH to human IL-6R (IL6R90) fused to the human constant region IgG1 (CH1-hinge-CH2-CH3). The time of onset of action of antibody-like molecules on sensors with immobilized antigen is indicated as the starting point on the x-axis;

на фиг. 11 (А) - диаграмма, на которой продемонстрирована модель подобной антителу молекулы, полученная путем встраивания расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между VHH и константной областью в IL6R90-G1m. На фиг. 11(Б) показана диаграмма, на которой представлены обозначения каждой полученной тяжелой цепи антитела, сайт инсерции аминокислотной последовательности и встроенная аминокислотная последовательность. Сайт инсерции обозначен как [вставка];in fig. 11(A) is a diagram showing a model of an antibody-like molecule obtained by inserting a protease-cleavable sequence near the boundary between the VHH and the constant region in IL6R90-G1m. In fig. 11(B) is a diagram showing the designation of each resulting antibody heavy chain, the amino acid sequence insertion site, and the inserted amino acid sequence. The insertion site is indicated as [insert];

на фиг. 12-1 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки степени расщепления, полученные с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях после обработки протеазой (MT-SP1) IL6R90-G1m или подобной антителу молекулы, полученной путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между VHH и константной областью в IL6R90-G1m. Из двух новых полос, образовавшихся в результате обработки протеазой, полоса, соответствующая 25 кДа или менее, представляет собой полосу, полученную из VHH, а полоса, соответствующая 25-50 кДа, представляет собой полосу, полученную из константной области;in fig. 12-1 is a graph showing cleavage results obtained by SDS-PAGE under reducing conditions following treatment with protease (MT-SP1) IL6R90-G1m or an antibody-like molecule obtained by insertion of a protease-cleavable sequence near the interface between VHH and constant region in IL6R90-G1m. Of the two new bands generated by protease treatment, the band corresponding to 25 kDa or less is the band derived from VHH, and the band corresponding to 25-50 kDa is the band derived from the constant region;

на фиг. 12-2 - диаграмма, на которой представлено продолжение фиг. 12-1;in fig. 12-2 is a diagram showing a continuation of FIG. 12-1;

на фиг. 13 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки связывания с человеческим IL-6R конструкции IL-6R90-G1m или подобных антителу молекул, полученных путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между VHH и константной областью в IL-6R90-G1m, или результаты оценки этих образцов после обработки протеазой (MT-SP1). На сенсограммах, обозначенных как протеаза-, представлены результаты оценки связывания с антигеном не обработанных протеазой подобных антителу молекул, а на сенсограммах, обозначенных как протеаза+, представлены результаты оценки связывания с антигеном обработанных протеазой подобных антителу молекул. Момент времени, соответствующий 30 с до начала действия подобных антителу молекул на сенсоры с иммобилизованным антигеном, обозначен как исходная точка на оси абсцисс;in fig. 13 is a diagram showing the results of evaluating the binding to human IL-6R of the IL-6R90-G1m construct or antibody-like molecules obtained by inserting a protease-cleavable sequence near the boundary between VHH and the constant region in IL-6R90-G1m, or the results of evaluating these samples after protease treatment (MT-SP1). The sensograms designated protease- show the antigen binding results of non-protease-treated antibody-like molecules, and the protease+ sensograms show the antigen binding results of protease-treated antibody-like molecules. The time point corresponding to 30 s before the onset of action of antibody-like molecules on sensors with immobilized antigen is designated as the starting point on the x-axis;

на фиг. 14 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки связывания с человеческим IL-6R подобных антителу молекул, полученных путем обеспечения осуществления ассоциации различных легких цепей с конструкцией 20A11-G1m, содержащей VHH к человеческому IL-6R (20А11), слитый с константной областью человеческого IgG1 (СН1-шарнир-СН2-СН3). Момент времени, соответствующий 30 с до начала действия подобных антителу молекул на сенсоры с иммобилизованным антигеном, обозначен как исходная точка на оси абсцисс;in fig. 14 is a graph showing the results of an assessment of binding to human IL-6R of antibody-like molecules obtained by allowing association of various light chains with a 20A11-G1m construct containing VHH to human IL-6R (20A11) fused to the constant region of human IgG1 (CH1-hinge-CH2-CH3). The time point corresponding to 30 s before the onset of action of antibody-like molecules on sensors with immobilized antigen is designated as the starting point on the x-axis;

на фиг. 15 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки связывания с человеческим IL-6R конструкции 20A11-G1m или подобных антителу молекул, полученных путем интродукции мутаций в аминокислоты, присутствующие на поверхности раздела между 20А11 и VL, и давая осуществляться ассоциации различных легких цепей с конструкцией 20Allhu-G1m, содержащей полученную таким образом конструкцию 20A11hu, слитую с константной областью человеческого IgG1 (СН1-шарнир-СН2-СН3). Момент времени, соответствующий 60 с до начала действия подобных антителу молекул на сенсоры с иммобилизованным антигеном, обозначен как исходная точка на оси абсцисс;in fig. 15 is a diagram showing the results of assessing the binding to human IL-6R of the 20A11-G1m construct or antibody-like molecules obtained by introducing mutations into the amino acids present at the interface between 20A11 and VL and allowing association of various light chains with the 20Allhu construct -G1m containing the thus obtained 20A11hu construct fused to the constant region of human IgG1 (CH1-hinge-CH2-CH3). The time point corresponding to 60 s before the onset of action of antibody-like molecules on sensors with immobilized antigen is designated as the starting point on the x-axis;

на фиг. 16 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки степени расщепления, полученные с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях после обработки протеазой (MT-SP1) 20A11-G1m или 4 типов подобных антителу молекул, полученных путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между 20A11hu и константной областью в 20A11hu-G1m. Из двух новых полос, образовавшихся в результате обработки протеазой, полоса, соответствующая 25 кДа или менее, представляет собой полосу, полученную из VHH, а полоса, соответствующая 25-50 кДа, представляет собой полосу, полученную из константной области;in fig. 16 is a graph showing the cleavage results obtained by SDS-PAGE under reducing conditions after treatment with protease (MT-SP1) 20A11-G1m or 4 types of antibody-like molecules obtained by insertion of a protease-cleavable sequence near the boundary between 20A11hu and constant region in 20A11hu-G1m. Of the two new bands generated by protease treatment, the band corresponding to 25 kDa or less is the band derived from VHH, and the band corresponding to 25-50 kDa is the band derived from the constant region;

на фиг. 17 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки связывания с человеческим IL-6R конструкции 20A11-G1m или подобных антителу молекул, полученных путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между VHH и константной областью в 20A11hu-G1m, или результаты оценки этих образцов после обработки протеазой (MT-SP1). На сенсограммах, обозначенных как протеаза-, представлены результаты оценки связывания с антигеном не обработанных протеазой подобных антителу молекул, а на сенсограммах, обозначенных как протеаза+, представлены результаты оценки связывания с антигеном обработанных протеазой подобных антителу молекул. Момент времени, соответствующий 60 с до начала действия подобных антителу молекул на сенсоры с иммобилизованным антигеном, обозначен как исходная точка на оси абсцисс.Образец, обозначенный как «не изучен», соответствует образцу, который не анализировали;in fig. 17 is a graph showing the results of evaluating the binding to human IL-6R of construct 20A11-G1m or antibody-like molecules obtained by inserting a protease-cleavable sequence near the boundary between VHH and the constant region in 20A11hu-G1m, or the results of evaluating these samples after protease treatment (MT-SP1). The sensograms designated protease- show the antigen binding results of non-protease-treated antibody-like molecules, and the protease+ sensograms show the antigen binding results of protease-treated antibody-like molecules. The time point corresponding to 60 s before the onset of action of antibody-like molecules on antigen-immobilized sensors is designated as the origin on the x-axis. A sample designated “not studied” corresponds to a sample that was not analyzed;

на фиг. 18 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки степени расщепления, полученные с помощью электрофореза ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях и детекции с помощью СВВ (кумасси бриллиантовый голубой), после обработки протеазой (MT-SP1) подобных антителу молекул, которые имели VHH к человеческому CD3 в вариабельных областях их тяжелых цепей и которые получали путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между VHH и константной областью тяжелой цепи. Из двух новых полос, образовавшихся в результате обработки протеазой, полоса, соответствующая 10-15 кДа, представляет собой полосу, полученную из VHH, а полоса, соответствующая примерно 37 кДа, представляет собой полосу, полученную из константной области тяжелой цепи;in fig. 18 is a graph showing the degradation results obtained by reducing SDS-PAGE and Coomassie Brilliant Blue detection after protease (MT-SP1) treatment of antibody-like molecules that had VHH to human CD3 in the variable regions of their heavy chains and which were obtained by inserting a protease-cleavable sequence near the boundary between the VHH and the heavy chain constant region. Of the two new bands generated by protease treatment, the band corresponding to 10-15 kDa is a band derived from VHH, and the band corresponding to approximately 37 kDa is a band derived from the heavy chain constant region;

на фиг. 19 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки связывания с человеческим CD3ed-Fc образцов после обработки протеазой (МТ-SP1) подобных антителу молекул, которые имели VHH к человеческому CD3 в вариабельных областях их тяжелых цепей и которые получали путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между VHH и константной областью тяжелой цепи. На сенсограммах, обозначенных как протеаза-, представлены результаты оценки связывания с антигеном не обработанных протеазой подобных антителу молекул, а на сенсограммах, обозначенных как протеаза+, представлены результаты оценки связывания с антигеном обработанных протеазой подобных антителу молекул. Момент времени, соответствующий 30 с до начала действия подобных антителу молекул на сенсоры с иммобилизованным антигеном, обозначен как исходная точка на оси абсцисс. При оценке связывания ответ до начала связывания антигена принимали за 0, а ответ перед началом действия антител принимали за 100. Время указано от момента, соответствующего 30 с до начала действия антител;in fig. 19 is a graph showing the results of assessing the binding to human CD3ed-Fc of samples after protease treatment (MT-SP1) of antibody-like molecules that had VHH to human CD3 in the variable regions of their heavy chains and which were obtained by inserting a protease-cleavable sequence near the border between VHH and the heavy chain constant region. The sensograms designated protease- show the antigen binding results of non-protease-treated antibody-like molecules, and the protease+ sensograms show the antigen binding results of protease-treated antibody-like molecules. The time point corresponding to 30 s before the onset of action of antibody-like molecules on sensors with immobilized antigen is designated as the starting point on the x-axis. When assessing binding, the response before the onset of antigen binding was taken as 0, and the response before the onset of antibody action was taken as 100. The time is indicated from the moment corresponding to 30 s before the onset of antibody action;

на фиг. 20 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки степени расщепления, полученные с помощью электрофореза ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях и детекции с помощью СВВ после обработки протеазой (MT-SP1) молекулы, которая имеет IL-6R90-G1m в качестве тяжелой цепи и Vk1-39-k0MT в качестве легкой цепи, или подобных антителу молекул, полученных путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между вариабельной областью легкой цепи и константной областью легкой цепи молекулы, которая имеет IL-6R90-G1m в качестве тяжелой цепи и Vk1-39-k0MT в качестве легкой цепи. Две полосы, происходящие из легкой цепи, образовались в результате обработки протеазой, и легкая цепь расщеплялась протеазой;in fig. 20 is a graph showing the cleavage evaluation results obtained by SDS-PAGE under reducing conditions and detection by UBS after treatment with protease (MT-SP1) of a molecule that has IL-6R90-G1m as the heavy chain and Vk1 -39-k0MT as a light chain, or antibody-like molecules obtained by inserting a protease-cleavable sequence near the boundary between the light chain variable region and the light chain constant region of a molecule that has IL-6R90-G1m as the heavy chain and Vk1-39- k0MT as light chain. Two bands originating from the light chain were generated by protease treatment, and the light chain was cleaved by the protease;

на фиг. 21 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки связывания с человеческим IL-6R образцов после обработки протеазой (MT-SP1) молекулы, имеющей IL-6R90-G1m в качестве тяжелой цепи и Vk1-39-k0MT в качестве легкой цепи, или подобных антителу молекул, полученных путем инсерции расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между вариабельной областью легкой цепи и константной областью легкой цепи молекулы, которая имеет IL-6R90-G1m в качестве тяжелой цепи и Vk1-39-k0MT в качестве легкой цепи. На сенсограммах, обозначенных как протеаза-, представлены результаты оценки связывания с антигеном не обработанных протеазой подобных антителу молекул, а на сенсограммах, обозначенных как протеаза+, представлены результаты оценки связывания с антигеном обработанных протеазой подобных антителу молекул. Антитело (MRA), для которого подтверждено связывание с IL-6R, применяли в качестве положительного контроля. Момент времени, соответствующий началу действия подобных антителу молекул на сенсоры с иммобилизованным антигеном, представляет собой исходную точку на оси абсцисс;in fig. 21 is a graph showing the results of binding to human IL-6R samples after treatment with protease (MT-SP1) of a molecule having IL-6R90-G1m as the heavy chain and Vk1-39-k0MT as the light chain, or the like antibody molecules obtained by inserting a protease-cleavable sequence near the boundary between the light chain variable region and the light chain constant region of a molecule that has IL-6R90-G1m as the heavy chain and Vk1-39-k0MT as the light chain. The sensograms designated protease- show the antigen binding results of non-protease-treated antibody-like molecules, and the protease+ sensograms show the antigen binding results of protease-treated antibody-like molecules. An antibody (MRA) confirmed to bind to IL-6R was used as a positive control. The time point corresponding to the onset of action of antibody-like molecules on sensors with immobilized antigen represents the starting point on the x-axis;

на фиг. 22 - диаграмма, на которой продемонстрированы полученные с помощью ДСН-ПААГ результаты оценки расщепления протеазой подобных антителу IgG-типа молекул с включенным VHH, который связывается с человеческим плексином А1. Дорожка, обозначенная как протеаза (+), соответствует обработанным протеазой образцам, а дорожка, обозначенная как протеаза (-), соответствует не обработанным протеазой образцам, которые используют в качестве отрицательного контроля;in fig. 22 is a graph showing SDS-PAGE results of protease cleavage of VHH-incorporated IgG antibody-like molecules that bind to human plexin A1. The lane labeled protease (+) corresponds to protease-treated samples, and the lane labeled protease (-) corresponds to non-protease-treated samples, which are used as a negative control;

на фиг. 23 - диаграмма, на которой продемонстрированы полученные с помощью системы Octet сенсограммы оценки связывания с человеческим плексином A1 VHH, который высвободился в результате расщепления протеазой подобных антителу IgG-типа молекул с включенным VHH, который связывается с человеческим плексином А1. Сенсограмма, обозначенная как протеаза (+), соответствует обработанным протеазой образцам, а сенсограмма, обозначенная как протеаза (-), соответствует не обработанным протеазой образцам. Концентрации, в которых применяли подобные антителу IgG-типа молекулы, указаны на левой стороне диаграммы;in fig. 23 is a graph showing Octet sensorgrams assessing binding to human plexin A1 VHH that is released by protease cleavage of VHH-embedded IgG antibody-like molecules that binds to human plexin A1. The sensogram designated as protease (+) corresponds to protease-treated samples, and the sensogram designated as protease (-) corresponds to non-protease-treated samples. The concentrations at which the IgG antibody-like molecules were used are indicated on the left side of the diagram;

на фиг. 24 - диаграмма, на которой продемонстрированы полученные с помощью ДСН-ПААГ результаты оценки расщепления протеазой полипептидов, содержащих биспецифические VHH-VHH;in fig. 24 is a diagram showing SDS-PAGE results for assessing protease cleavage of polypeptides containing bispecific VHH-VHH;

на фиг. 25 - диаграмма, на которой продемонстрированы данные о люциферазной активности до и после расщепления протеазой. Пунктирной линией обозначены образцы, не обработанные протеазой, а сплошной линией обозначены образцы, обработанные протеазой;in fig. 25 is a graph showing luciferase activity data before and after protease digestion. The dotted line indicates samples not treated with protease, and the solid line indicates samples treated with protease;

на фиг. 26 диаграмма, на которой продемонстрированы данные о люциферазной активности до и после расщепления протеазой. Пунктирной линией обозначены образцы, не обработанные протеазой, а сплошной линией обозначены образцы, обработанные протеазой;in fig. 26 is a diagram showing luciferase activity data before and after protease digestion. The dotted line indicates samples not treated with protease, and the solid line indicates samples treated with protease;

на фиг. 27 - диаграмма, на которой продемонстрированы полученные с помощью ДСН-ПААГ результаты оценки расщепления протеазой подобной антителу IgG-типа молекулы, содержащей VHH к человеческому IL-6R;in fig. 27 is a graph showing SDS-PAGE results of protease cleavage of an IgG-type antibody-like molecule containing VHH to human IL-6R;

на фиг. 28 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки расщепления протеазой подобных антителу IgG-типа молекул, несущих расщепляемую протеазой последовательность в их легких цепях;in fig. 28 is a diagram showing the results of evaluating protease cleavage of IgG-type antibody-like molecules carrying a protease-cleavable sequence in their light chains;

на фиг. 29 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки степени активации в зависимости от присутствия или отсутствия обработки протеазой подобных антителу IgG-типа молекул, несущих расщепляемую протеазой последовательность в их легких цепях;in fig. 29 is a diagram showing the results of evaluating the degree of activation depending on the presence or absence of protease treatment of IgG-type antibody-like molecules carrying a protease-cleavable sequence in their light chains;

на фиг. 30А - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки расщепления протеазой подобных антителу IgG-типа молекул, несущих расщепляемую протеазой последовательность в их тяжелых цепях;in fig. 30A is a diagram showing the results of protease cleavage evaluation of IgG-type antibody-like molecules carrying a protease-cleavable sequence in their heavy chains;

на фиг. 30Б - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки расщепления протеазой подобных антителу IgG-типа молекул, несущих расщепляемую протеазой последовательность в их тяжелых цепях. Расщепление протеазой осуществляли, используя буфер для анализа (набор для анализа активности ММР (флуорометрический - зеленый) (ab112146), компонент С: буфер для анализа);in fig. 30B is a graph showing the results of an evaluation of protease cleavage of IgG-type antibody-like molecules carrying a protease-cleavable sequence in their heavy chains. Protease digestion was performed using assay buffer (MMP Activity Assay Kit (Fluorometric - Green) (ab112146), component C: assay buffer);

на фиг. 31 - диаграмма, на которой продемонстрированы результаты оценки эффективности расщепления in vivo, полученные при введении мышам молекулы антитела со встроенной расщепляемой протеазой последовательностью.in fig. 31 is a diagram showing in vivo cleavage efficiency results obtained by administering an antibody molecule with an integrated protease-cleavable sequence to mice.

Описание вариантов осуществления изобретенияDescription of Embodiments of the Invention

Согласно настоящему изобретению полипептид, как правило, представляет собой пептид, имеющий длину порядка 4 аминокислот или более, и белок. Кроме того, согласно настоящему изобретению полипептид, как правило, состоит из искусственно созданной последовательности (но он конкретно не ограничен только ею). Например, можно применять полученный из организма полипептид. Альтернативному этому, полипептид согласно настоящему изобретению может представлять собой любой встречающийся в естественных условиях полипептид, синтетический полипептид, рекомбинантный полипептид и т.п.Кроме того, согласно настоящему изобретению фрагменты указанных полипептидов также подпадают под понятие полипептид.According to the present invention, the polypeptide is generally a peptide having a length of about 4 amino acids or more, and a protein. In addition, according to the present invention, the polypeptide generally consists of (but is not specifically limited to) an artificially created sequence. For example, a polypeptide derived from an organism may be used. Alternatively, the polypeptide of the present invention may be any naturally occurring polypeptide, synthetic polypeptide, recombinant polypeptide, or the like. Moreover, fragments of these polypeptides are also included within the term polypeptide of the present invention.

В настоящем описании каждую аминокислоту обозначают однобуквенным или трехбуквенным кодом или ими обоими, например, следующим образом: Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I или Val/V. Для обозначения аминокислоты, локализованной в конкретном положении, можно применять соответственно обозначение с использованием номера, соответствующего конкретному положению, в сочетании с однобуквенным кодом или трехбуквенным кодом аминокислоты. Например, аминокислота 37V, которая представляет собой аминокислоту, содержащуюся в однодоменном антителе, представляет собой Val, локализованный в положении 37 согласно нумерации Кэбота.In the present description, each amino acid is designated by a one-letter code, a three-letter code, or both, for example, as follows: Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F , Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I or Val/V. To designate an amino acid located at a specific position, an appropriate designation can be used using a number corresponding to a specific position in combination with a one-letter code or a three-letter amino acid code. For example, amino acid 37V, which is an amino acid contained in a single domain antibody, is Val located at position 37 according to Cabot numbering.

Для изменения аминокислоты в аминокислотной последовательности полипептида можно соответствующим образом адаптировать известный в данной области метод, такой как сайтнаправленный мутагенез (Kunkel и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, cc. 488-492) или ПЦР с удлинением перекрытий. Множество методов, известных в данной области, можно также адаптировать в качестве альтернативных методов замены аминокислот на аминокислоты, отличные от встречающихся в естественных условиях аминокислот (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 2006, cc. 225-249; и Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(11), 2003, cc. 6353-6357). Можно применять, например, бесклеточную систему трансляции, содержащую тРНК, в которой не встречающаяся в естественных условиях аминокислота слита с супрессорной тРНК, подавляющей амбер-мутацию, комплементарной UAG-кодону (амбер-кодон), который представляет собой стоп-кодон (фирма Clover Direct (Protein Express)). В настоящем описании примеры изменения включают (но, не ограничиваясь только ими) замену.To change an amino acid in the amino acid sequence of a polypeptide, a method known in the art, such as site-directed mutagenesis (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, pp. 488-492) or extension PCR, can be appropriately adapted floors. Many methods known in the art can also be adapted as alternative methods for replacing amino acids with amino acids other than naturally occurring amino acids (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 2006, pp. 225-249; and Proc Natl Acad Sci USA 100(11), 2003, pp. 6353-6357). For example, a cell-free translation system containing a tRNA in which a non-naturally occurring amino acid is fused to an amber mutation suppressor tRNA complementary to a UAG codon (amber codon), which is a stop codon, can be used (Clover Direct (Protein Express)). As used herein, examples of modification include, but are not limited to, substitution.

В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие «и/или», применяемое для обозначения сайтов аминокислотных изменений, включает каждую комбинацию, к которой применимо «и» и «или». В частности, например, фраза «аминокислоты в положениях 37, 45 и/или 47 заменены» включает следующие вариации аминокислотных изменений:As used herein, the term “and/or” as used to refer to amino acid change sites is intended to include every combination to which “and” and “or” apply. In particular, for example, the phrase “amino acids at positions 37, 45 and/or 47 are replaced” includes the following variations of amino acid changes:

(а) положение 37, (б) положение 45, (в) положение 47, (г) положения 37 и 45, (д) положения 37 и 47, (е) положения 45 и 47 и (ж) положения 37, 45 и 47.(a) provision 37, (b) provision 45, (c) provision 47, (d) provisions 37 and 45, (e) provisions 37 and 47, (f) provisions 45 and 47 and (g) provisions 37, 45 and 47.

В настоящем описании выражение, в котором однобуквенные коды или трехбуквенные коды аминокислот до и после изменения указаны перед или после номера, обозначающего конкретное положение, можно применять соответственно для обозначения аминокислотного изменения. Например, изменение F37V или Phe37Val, применяемое для обозначения замены аминокислоты, содержащейся в вариабельной области антитела или однодоменном антителе, обозначает замену Phe в положении 37 согласно нумерации Кэбота на Val. В частности, номер обозначает аминокислотное положение согласно нумерации Кэбота; однобуквенный или трехбуквенный код аминокислоты, предшествующий номеру, означает аминокислоту до замены; а однобуквенный код или трехбуквенный код аминокислоты после номера означает аминокислоту после замены. Аналогично этому, изменение Р238А или Pro238Ala, применяемое для обозначения замены аминокислоты в Fc-области, содержащейся в константной области антитела, означает замену Pro в положении 238 согласно EU-нумерации на Ala. В частности, номер обозначает аминокислотное положение согласно EU-нумерации; однобуквенный или трехбуквенный код аминокислоты, предшествующий номеру, означает аминокислоту до замены; а однобуквенный код или трехбуквенный код аминокислоты после номера означает аминокислоту после замены.In the present specification, an expression in which one-letter codes or three-letter codes of amino acids before and after the change are indicated before or after the number indicating a specific position can be used, respectively, to indicate an amino acid change. For example, the change F37V or Phe37Val, used to denote the replacement of an amino acid contained in the variable region of an antibody or single domain antibody, denotes the replacement of Phe at position 37 according to Cabot numbering to Val. In particular, the number denotes the amino acid position according to Cabot numbering; the one- or three-letter amino acid code preceding the number indicates the amino acid before the substitution; and a one-letter code or a three-letter amino acid code after the number indicates the amino acid after the substitution. Similarly, the change P238A or Pro238Ala, used to indicate the replacement of an amino acid in the Fc region contained in the constant region of an antibody, means the replacement of Pro at position 238 according to EU numbering to Ala. In particular, the number indicates the amino acid position according to EU numbering; the one- or three-letter amino acid code preceding the number indicates the amino acid before the substitution; and a one-letter code or a three-letter amino acid code after the number indicates the amino acid after the substitution.

В настоящем описании понятие «антитело» используется в его наиболее широком смысле и относится к различным структурам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) моноклональное антитело, поликлональное антитело, мультиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело), однодоменное антитело и фрагменты антител, при условии, что они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью.As used herein, the term “antibody” is used in its broadest sense and refers to a variety of antibody structures, including (but not limited to) monoclonal antibody, polyclonal antibody, multispecific antibody (e.g., bispecific antibody), single domain antibody, and antibody fragments. provided that they have the required antigen-binding activity.

Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, включающей часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, димерные антитела (диабоди), линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.The term "antibody fragment" refers to a molecule, other than an intact antibody, comprising a portion of the intact antibody that binds to an antigen to which the intact antibody binds. Examples of antibody fragments include, but are not limited to, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab') ₂ , dimeric antibodies (diabody), linear antibodies, single chain antibody molecules (eg, scFv) and multispecific antibodies formed from antibody fragments.

Понятия «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, практически сходную со структурой нативного антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат представленную в настоящем описании Fc-область.The terms “full-length antibody,” “intact antibody,” and “whole antibody” are used interchangeably as used herein to refer to an antibody having a structure substantially similar to that of a native antibody or having heavy chains that contain an Fc region as defined herein.

Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с его антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (CDR) (см., например, Kindt и др., Kuby Immunology, 6-ое изд., изд-во W.H. Freeman and Co., 2007, с. 91). Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена.The term "variable region" or "variable domain" refers to the heavy or light chain domain of an antibody that is involved in the binding of the antibody to its antigen. The heavy chain and light chain variable domains (VH and VL, respectively) of a native antibody generally have similar structures, with each domain containing four conserved framework regions (FR) and three hypervariable regions (CDR) (see, for example, Kindt and al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 2007, p. 91). A single VH or VL domain may be sufficient to provide antigen binding specificity.

Понятие «гипервариабельный участок» или «CDR» в контексте настоящего описания относится к участку, последовательность которого является гипервариабельной и/или формирует петли определенной структуры («гипервариабельные петли»), и/или относится к контактирующим с антигеном остаткам («контакты с антигеном») или к каждому из участков вариабельного домена антитела. Как правило, антитела содержат шесть CDR: три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). Согласно настоящему описанию примеры CDR включают:The term "hypervariable region" or "CDR" as used herein refers to a region whose sequence is hypervariable and/or forms loops of a particular structure ("hypervariable loops"), and/or refers to residues that contact an antigen ("antigen contacts" ) or to each of the regions of the antibody variable domain. Typically, antibodies contain six CDRs: three in VH (H1, H2, H3) and three in VL (L1, L2, L3). As used herein, examples of CDRs include:

(а) гипервариабельные петли, включающие аминокислотные остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917);(a) hypervariable loops including amino acid residues 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) and 96-101 (H3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917);

(б) CDR, включающие аминокислотные остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, публикация NIH 91-3242);(b) CDRs including amino acid residues 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) and 95-102 (H3) ( Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, NIH publication 91-3242);

(в) области контактов с антигеном, включающие аминокислотные остатки 27 с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (Н2) и 93-101 (Н3) (MacCallum и др., J. Mol. Biol. 262, 1996, сс. 732-745); и(c) areas of contact with the antigen, including amino acid residues 27 c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) and 93-101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262, 1996, pp. 732-745); And

(г) комбинации остатков, указанных в подпунктах (а), (б) и/или (в), включающие аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (Н2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).(d) combinations of residues specified in subparagraphs (a), (b) and/or (c), including amino acid residues HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49- 56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) and 94-102 (H3).

Как правило, однодоменное антитело содержит три CDR: CDR1, CDR2 и CDR3. Когда однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело, полученное из VHH или VH антитела, то приведенные в качестве примеров CDR однодоменного антитела включают:Typically, a single domain antibody contains three CDRs: CDR1, CDR2 and CDR3. When the single domain antibody is a single domain antibody derived from a VHH antibody or a VH antibody, exemplified CDRs of the single domain antibody include:

(а) гипервариабельные петли, включающие аминокислотные остатки 26-32 (CDR1), 53-55 (CDR2) и 96-101 (CDR3) (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, сс. 901-917);(a) hypervariable loops comprising amino acid residues 26-32 (CDR1), 53-55 (CDR2) and 96-101 (CDR3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, pp. 901-917) ;

(б) CDR, включающие аминокислотные остатки 31-35b (CDR1), 50-65 (CDR2) и 95-102 (CDR3) (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991);(b) CDRs comprising amino acid residues 31-35b (CDR1), 50-65 (CDR2) and 95-102 (CDR3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991);

(в) области контактов с антигеном, включающие аминокислотные остатки 30-35b (CDR1), 47-58 (CDR2) и 93-101 (CDR3) (MacCallum и др., J. Mol. Biol. 262, 1996, сс. 732-745); и(c) antigen contact regions, including amino acid residues 30-35b (CDR1), 47-58 (CDR2) and 93-101 (CDR3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262, 1996, pp. 732 -745); And

(г) комбинации остатков, указанных в подпунктах (а), (б) и/или (в), включающие аминокислотные остатки CDR 26-35 (CDR1), 26-35b (CDR1), 49-65 (CDR2), 93-102 (CDR3) или 94-102 (CDR3).(d) combinations of residues specified in subparagraphs (a), (b) and/or (c), including amino acid residues CDR 26-35 (CDR1), 26-35b (CDR1), 49-65 (CDR2), 93- 102 (CDR3) or 94-102 (CDR3).

Когда однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело, полученное из VL антитела, то приведенные в качестве примеров CDR однодоменного антитела включают:When the single domain antibody is a single domain antibody derived from a VL antibody, exemplified CDRs of the single domain antibody include:

(а) гипервариабельные петли, включающие аминокислотные остатки 26-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) и 91-96 (CDR3) (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, сс. 901-917);(a) hypervariable loops comprising amino acid residues 26-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) and 91-96 (CDR3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, pp. 901-917) ;

(б) CDR, включающие аминокислотные остатки 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) и 89-97 (CDR3) (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991);(b) CDRs comprising amino acid residues 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) and 89-97 (CDR3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991);

(в) области контактов с антигеном, включающие аминокислотные остатки 27 с-36 (CDR1), 46-55 (CDR2) и 89-96 (CDR3) (MacCallum и др., J. Mol. Biol. 262, 1996, сс.732-745); и(c) antigen contact regions, including amino acid residues 27 c-36 (CDR1), 46-55 (CDR2) and 89-96 (CDR3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262, 1996, pp. 732-745); And

(г) комбинации остатков, указанных в подпунктах (а), (б) и/или (в), включающие аминокислотные остатки CDR 46-56 (CDR2), 47-56 (CDR2), 48-56 (CDR2) или 49-56 (CDR2).(d) combinations of residues specified in subparagraphs (a), (b) and/or (c), including amino acid residues CDR 46-56 (CDR2), 47-56 (CDR2), 48-56 (CDR2) or 49- 56 (CDR2).

Если специально не указано иное, то в настоящем описании остатки в CDR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки в FR) нумеруют согласно Kabat и др., выше.Unless specifically stated otherwise, herein, residues in the CDR and other residues in the variable domain (eg, residues in FR) are numbered according to Kabat et al., supra.

Понятие «каркасный участок» или «FR» относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельного участка (CDR). FR вариабельного домена, как правило, состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности CDR и FR, как правило, имеют следующее расположение в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. В однодоменном антителе последовательности CDR и FR, как правило, расположены в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.The term "framework region" or "FR" refers to variable domain residues other than the hypervariable region residues (CDR). The FR variable domain generally consists of four FR domains: FR1, FR2, FR3 and FR4. Thus, the CDR and FR sequences typically have the following arrangement in the VH (or VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. In a single domain antibody, the CDR and FR sequences are typically arranged in the following order: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

Как правило, однодоменное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, может представлять собой полипептид, который содержит:Typically, a single domain antibody of the present invention may be a polypeptide that contains:

а) аминокислотную последовательность, состоящую из четырех каркасных участков/последовательностей, которая имеет три гипервариабельных участка/последовательности, встроенные между ними (аминокислотный остаток в положении 11 согласно нумерации Кэбота выбирают из группы, состоящей из L, М, S, V и W, и предпочтительно он представляет собой L); и/илиa) an amino acid sequence consisting of four framework regions/sequences, which has three hypervariable regions/sequences inserted between them (the amino acid residue at position 11 according to Cabot numbering is selected from the group consisting of L, M, S, V and W, and preferably it is L); and/or

б) аминокислотную последовательность, состоящую из четырех каркасных участков/последовательностей, которая имеет три гипервариабельных участка/последовательности, встроенные между ними (аминокислотный остаток в положении 37 согласно нумерации Кэбота выбирают из группы, состоящей из F, Y, Н, I, L и V, и предпочтительно он представляет собой F или Y); и/или в) аминокислотную последовательность, состоящую из четырех каркасных участков/последовательностей, которая имеет три гипервариабельных участка/последовательности, встроенные между ними (аминокислотный остаток в положении 44 согласно нумерации Кэбота выбирают из группы, состоящей из G, Е, A, D, Q, R, S и L, предпочтительно он представляет собой G, Е или Q и более предпочтительно G или Е); и/илиb) an amino acid sequence consisting of four framework regions/sequences, which has three hypervariable regions/sequences inserted between them (the amino acid residue at position 37 according to Cabot numbering is selected from the group consisting of F, Y, H, I, L and V , and preferably it is F or Y); and/or c) an amino acid sequence consisting of four framework regions/sequences, which has three hypervariable regions/sequences inserted between them (the amino acid residue at position 44 according to Cabot numbering is selected from the group consisting of G, E, A, D, Q, R, S and L, preferably it is G, E or Q and more preferably G or E); and/or

г) аминокислотную последовательность, состоящую из четырех каркасных участков/последовательностей, которая имеет три гипервариабельных участка/последовательности, встроенные между ними (аминокислотный остаток в положении 45 согласно нумерации Кэбота выбирают из группы, состоящей из L, R, С, I, L, Р, Q и V, и предпочтительно он представляет собой L или R); и/илиd) an amino acid sequence consisting of four framework regions/sequences, which has three hypervariable regions/sequences inserted between them (the amino acid residue at position 45 according to Cabot numbering is selected from the group consisting of L, R, C, I, L, P , Q and V, and preferably it is L or R); and/or

д) аминокислотную последовательность, состоящую из четырех каркасных участков/последовательностей, которая имеет три гипервариабельных участка/последовательности, встроенные между ними (аминокислотный остаток в положении 47 согласно нумерации Кэбота выбирают из группы, состоящей из W, L, F, A, G, I, М, R, S, V и Y, и предпочтительно он представляет собой W, L, F или R); и/илиe) an amino acid sequence consisting of four framework regions/sequences, which has three hypervariable regions/sequences inserted between them (the amino acid residue at position 47 according to Cabot numbering is selected from the group consisting of W, L, F, A, G, I , M, R, S, V and Y, and preferably it is W, L, F or R); and/or

е) аминокислотную последовательность, состоящую из четырех каркасных участков/последовательностей, которая имеет три гипервариабельных участка/последовательности, встроенные между ними (аминокислотный остаток в положении 83 согласно нумерации Кэбота выбирают из группы, состоящей R, K, N, Е, G, I, М, Q и Т, предпочтительно он представляет собой K или R и более предпочтительно K); и/илиf) an amino acid sequence consisting of four framework regions/sequences, which has three hypervariable regions/sequences inserted between them (the amino acid residue at position 83 according to Cabot numbering is selected from the group consisting of R, K, N, E, G, I, M, Q and T, preferably it is K or R and more preferably K); and/or

ж) аминокислотную последовательность, состоящую из четырех каркасных участков/последовательностей, которая имеет три гипервариабельных участка/последовательности, встроенные между ними (аминокислотный остаток в положении 84 согласно нумерации Кэбота выбирают из группы, состоящей из Р, A, L, R, S, Т, D и V, и предпочтительно он представляет собой Р); и/илиg) an amino acid sequence consisting of four framework regions/sequences, which has three hypervariable regions/sequences inserted between them (the amino acid residue at position 84 according to Cabot numbering is selected from the group consisting of P, A, L, R, S, T , D and V, and preferably it is P); and/or

з) аминокислотную последовательность, состоящую из четырех каркасных участков/последовательностей, которая имеет три гипервариабельных участка/последовательности, встроенные между ними (аминокислотный остаток в положении 103 согласно нумерации Кэбота выбирают из группы, состоящей из W, Р, R и S, и предпочтительно он представляет собой W); и/илиh) an amino acid sequence consisting of four framework regions/sequences, which has three hypervariable regions/sequences inserted between them (the amino acid residue at position 103 according to Cabot numbering is selected from the group consisting of W, P, R and S, and is preferably represents W); and/or

и) аминокислотную последовательность, состоящую из четырех каркасных участков/последовательностей, которая имеет три гипервариабельных участка/последовательности, встроенные между ними (аминокислотный остаток в положении 104 согласно нумерации Кэбота представляет собой G или D, и предпочтительно он представляет собой G); и/илиi) an amino acid sequence consisting of four framework regions/sequences, which has three hypervariable regions/sequences inserted between them (the amino acid residue at position 104 according to Cabot numbering is G or D, and preferably it is G); and/or

к) аминокислотную последовательность, состоящую из четырех каркасных участков/последовательностей, которая имеет три гипервариабельных участка/последовательности, встроенные между ними (аминокислотный остаток в положении 108 согласно нумерации Кэбота выбирают из группы, состоящей из Q, L и R, и предпочтительно он представляет собой Q или L).k) an amino acid sequence consisting of four framework regions/sequences, which has three hypervariable regions/sequences inserted between them (the amino acid residue at position 108 according to Cabot numbering is selected from the group consisting of Q, L and R, and is preferably Q or L).

Более конкретно (но, не ограничиваясь только указанным) однодоменное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, может представлять собой полипептид, содержащий одну из аминокислотных последовательностей, состоящих из четырех каркасных участков/последовательностей, которые имеют три гипервариабельных участка/последовательности, встроенные между ними:More specifically, but not limited to, the single domain antibody of the present invention may be a polypeptide comprising one of an amino acid sequence consisting of four framework regions/sequences that have three hypervariable regions/sequences embedded between them:

л) аминокислотная последовательность, в которой аминокислотные остатки в положениях 43-46 согласно нумерации Кэбота представляют собой KERE или KQRE;k) an amino acid sequence in which the amino acid residues at positions 43-46 according to Cabot numbering are KERE or KQRE;

м) аминокислотная последовательность, в которой аминокислотные остатки в положениях 44-47 согласно нумерации Кэбота представляют собой GLEW; иl) an amino acid sequence in which the amino acid residues at positions 44-47 according to Cabot numbering represent GLEW; And

н) аминокислотная последовательность, в которой аминокислотные остатки в положениях 83-84 согласно нумерации Кэбота представляют собой KP или ЕР.m) an amino acid sequence in which the amino acid residues at positions 83-84 according to Cabot numbering are KP or EP.

В настоящем описании понятие «константная область» или «константный домен» относится к области или домену, отличному от вариабельных областей антитела. Например, антитело IgG-типа представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящий из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидными мостиками. В направлении от N-конца к С-концу, каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), которую называют также вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой следует три константных домена (CH1, СН2 и СН3). Аналогично этому, в направлении от N-конца к С-концу, каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), которую называют также вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой следует константный домен легкой цепи (CL). Легкие цепи нативных антител в зависимости от аминокислотной последовательности их константных доменов могут принадлежать к одному из двух типов, которые обозначают каппа (κ) и лямбда (λ).As used herein, the term “constant region” or “constant domain” refers to a region or domain other than the variable regions of an antibody. For example, an IgG-type antibody is a heterotetrameric glycoprotein with a molecular weight of approximately 150,000 Da, consisting of two identical light chains and two identical heavy chains linked by disulfide bridges. From the N-terminus to the C-terminus, each heavy chain has a variable region (VH), also called a variable heavy domain or heavy chain variable domain, followed by three constant domains (CH1, CH2 and CH3). Likewise, in the direction from the N-terminus to the C-terminus, each light chain has a variable region (VL), also called a variable light domain or a light chain variable domain, followed by a light chain constant domain (CL). The light chains of native antibodies, depending on the amino acid sequence of their constant domains, can belong to one of two types, designated kappa (κ) and lambda (λ).

В настоящем описании понятие «Fc-область» применяют для обозначения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Это понятие включает Fc-области, имеющие нативные последовательности, и вариант Fc-областей. В одном из объектов изобретения Fc-область человеческого IgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) или глицин-лизин (Gly446-Lys447) Fc-области может присутствовать или может отсутствовать. Если специально не указано иное, то в настоящем описании нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU, которую обозначают также как EU-индекс, описанной у Kabat и др., ., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.As used herein, the term "Fc region" is used to refer to the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain that contains at least part of a constant region. This concept includes Fc regions having native sequences and variant Fc regions. In one aspect of the invention, the Fc region of a human IgG extends from Cys226 or Pro230 to the carboxyl terminus of the heavy chain. However, the C-terminal lysine (Lys447) or glycine-lysine (Gly446-Lys447) Fc region may or may not be present. Unless specifically stated otherwise, herein the numbering of amino acid residues in the Fc region or constant region follows the EU numbering system, also referred to as the EU index, described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 1st ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

Понятие «класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, который/которая входит в его тяжелую цепь. Известно пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно подразделять дополнительно на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, обозначают как α, δ, ε, y и μ соответственно.The term "class" of an antibody refers to the type of constant domain or constant region that is included in its heavy chain. There are five main classes of antibodies: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, and some of them can be further divided into subclasses (isotypes), for example, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2. The heavy chain constant domains that correspond to different classes of immunoglobulins are designated α, δ, ε, y and μ, respectively.

В настоящем описании «антигенсвязывающий домен» ограничен только способностью связываться с представляющим интерес антигеном. Антигенсвязывающий домен может представлять собой домен, имеющий любую структуру, если применяемый домен связывается с представляющим интерес антигеном. Примеры указанного домена включают (но, не ограничиваясь только ими), вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH), вариабельную область легкой цепи антитела (VL), однодоменное антитело (scIAt), модуль, состоящий примерно из 35 аминокислот, обозначенный как А-домен, который входит в авимер (Avimer), белок клеточной мембраны, присутствующий in vivo (WO 2004/044011 и WO 2005/040229), аднектин (Adnectin), содержащий 10Fn3-домен, служащий в качестве связывающего белок домена, полученного из гликопротеина фибронектина, экспрессируемого на клеточных мембранах (WO 2002/032925), аффибоди (Affibody), имеющий каркас IgG-связывающего домена, состоящий из трехспирального пучка, включающего 58 аминокислот белка А (WO 1995/001937), DARPin (сконструированные белки с анкириновыми повторами), которые представляют собой области анкириновых повторов (AR), экспонируемые на молекулярной поверхности, каждый из которых имеет структуру, в которой повторно уложена субъединица с изгибом, содержащая 33 аминокислотных остатка, две антипараллельные спирали и петлю (WO 2002/020565), антикалин (Anticalin), который имеет состоящие из четырех петель области, поддерживающие одну сторону центрально закрученной бочкообразной структуры, состоящей из восьми антипараллельных цепей, которые являются высоко консервативными среди молекул липокаинов, таких как липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (NGAL) (WO 2003/029462), и вогнутую область, образованную структурой в виде параллельных тяжей внутри подковообразной структуры, образованной уложенными повторами, которые состоят из богатых лейцином повторяющихся (LRR) модулей вариабельного рецептора лимфоцитов (VLR), который не имеет иммуноглобулиновой структуры и применяется в системе приобретенной устойчивости у бесчелюстных позвоночных, таких как миноги или миксины (WO 2008/016854).As used herein, an “antigen binding domain” is limited only to the ability to bind to the antigen of interest. The antigen binding domain can be a domain having any structure as long as the domain used binds to the antigen of interest. Examples of this domain include, but are not limited to, the antibody heavy chain variable region (VH), the antibody light chain variable region (VL), the single domain antibody (scIAt), a module of about 35 amino acids referred to as the A domain , which is part of Avimer, a cell membrane protein present in vivo (WO 2004/044011 and WO 2005/040229), Adnectin, containing a 10Fn3 domain serving as a protein binding domain derived from the glycoprotein fibronectin, expressed on cell membranes (WO 2002/032925), Affibody, having an IgG-binding domain framework consisting of a three-stranded bundle comprising 58 amino acids of protein A (WO 1995/001937), DARPin (designed ankyrin repeat proteins), which are regions of ankyrin repeats (AR) exposed on the molecular surface, each of which has a structure in which a folded subunit with a bend containing 33 amino acid residues, two antiparallel helices and a loop (WO 2002/020565), anticalin (Anticalin), which has four-loop regions supporting one side of a centrally coiled barrel-shaped structure consisting of eight antiparallel chains that are highly conserved among lipocaine molecules such as neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) (WO 2003/029462) and a concave a region formed by a parallel strand structure within a horseshoe-shaped structure formed by stacked repeats that consist of leucine-rich repeat (LRR) variable lymphocyte receptor (VLR) modules, which does not have an immunoglobulin structure and is used in the acquired resistance system in jawless vertebrates such as lampreys or hagfishes (WO 2008/016854).

Предпочтительные примеры антигенсвязывающего домена, предлагаемого в настоящем изобретении, включают антигенсвязывающий домен, который может проявлять антигенсвязывающую функцию посредством молекулы, состоящей только из антигенсвязывающего домена, и антигенсвязывающий домен, который сам может проявлять антигенсвязывающую функцию после освобождения от дополнительного пептида, сцепленного с ним. Примеры такого антигенсвязывающего домена включают (но, не ограничиваясь только ими) однодоменные антитела, scFv, Fv, Fab, Fab' и F(ab')₂.Preferable examples of the antigen binding domain provided by the present invention include an antigen binding domain that can exhibit an antigen binding function through a molecule consisting of only an antigen binding domain, and an antigen binding domain that itself can exhibit an antigen binding function after being released from an additional peptide linked to it. Examples of such an antigen binding domain include, but are not limited to, single domain antibodies, scFv, Fv, Fab, Fab' and F(ab') ₂ .

Одним из предпочтительных примеров антигенсвязывающего домена, предлагаемого в настоящем изобретении, является антигенсвязывающий домен с молекулярной массой 60 кДа или менее. Примеры такого антигенсвязывающего домена включают (но, не ограничиваясь только ими) однодоменные антитела, scFv, Fab и Fab'. По-видимому, антигенсвязывающий домен с молекулярной массой 60 кДа или менее, как правило, должен подвергаться почечному клиренсу, когда присутствует в виде мономера в крови (см. J Biol Chem. 263 (29), 15 октября 1988 г., сс.15064-15070).One preferred example of an antigen binding domain provided by the present invention is an antigen binding domain having a molecular weight of 60 kDa or less. Examples of such an antigen binding domain include, but are not limited to, single domain antibodies, scFv, Fab and Fab'. It appears that an antigen binding domain with a molecular mass of 60 kDa or less should generally undergo renal clearance when present as a monomer in the blood (see J Biol Chem. 263 (29), October 15, 1988, pp. 15064 -15070).

С другой точки зрения, один из предпочтительных примеров антигенсвязывающего домена, предлагаемого в настоящем изобретении, включает антигенсвязывающий домен, который имеет время полужизни в крови 12 ч или менее. Примеры такого антигенсвязывающего домена включают (но, не ограничиваясь только ими) однодоменные антитела, scFv, Fab и Fab'.From another point of view, one of the preferred examples of the antigen binding domain proposed in the present invention includes an antigen binding domain that has a half-life in the blood of 12 hours or less. Examples of such an antigen binding domain include, but are not limited to, single domain antibodies, scFv, Fab and Fab'.

Один из предпочтительных примеров антигенсвязывающего домена, предлагаемого в настоящем изобретении, включает однодоменное антитело (sdAт).One preferred example of an antigen binding domain of the present invention includes a single domain antibody (sdAb).

В настоящем описании понятие «однодоменное антитело» не ограничено его структурой, если домен может сам обладать антигенсвязывающей активностью. Известно, что обычное (каноническое) антитело, например, антитело IgG-типа, обладает антигенсвязывающей активностью в состоянии, в котором вариабельная область образуется путем спаривания VH и VL, в то время как собственная структура домена однодоменного антитела сама может обладать антигенсвязывающей активностью без спаривания с другим доменом. Как правило, однодоменное антитело имеет относительно низкую молекулярную массу и присутствует в форме мономера.As used herein, the term “single domain antibody” is not limited to its structure as long as the domain itself may have antigen binding activity. It is known that a conventional (canonical) antibody, for example an IgG-type antibody, has antigen-binding activity in a state in which the variable region is formed by pairing of VH and VL, while the own domain structure of a single-domain antibody can itself have antigen-binding activity without pairing with another domain. Typically, a single domain antibody has a relatively low molecular weight and is present in monomer form.

Примеры однодоменного антитела включают (но, не ограничиваясь только ими) антигенсвязывающие молекулы, в которых исходно отсутствует легкая цепь, такие как VHH животного семейства Camelidae и акульи V_NAR, и фрагменты антител, которые содержат полный VH-домен антитела или его часть или полный VL-домен антитела или его часть. Примеры однодоменного антитела, которое представляет собой фрагмент антитела, содержащий полный VH-домен или VL-домен антитела или его часть, включают (но, не ограничиваясь только ими) искусственно созданные однодоменные антитела, происходящие из VH человеческого антитела или VL человеческого антитела, которые описании в US №6248516 В1 и др. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения одно однодоменное антитело имеет три CDR (CDR1, CDR2 и CDR3).Examples of a single-domain antibody include, but are not limited to, antigen-binding molecules that initially lack a light chain, such as Camelidae VHH and shark V _NAR , and antibody fragments that contain all or part of the antibody VH domain or the entire VL -antibody domain or part thereof. Examples of a single-domain antibody that is an antibody fragment containing the entire VH domain or the VL domain of an antibody or a portion thereof include, but are not limited to, engineered single-domain antibodies derived from a human VH antibody or a human antibody VL, which are described in US No. 6248516 B1, etc. In some embodiments of the present invention, one single domain antibody has three CDRs (CDR1, CDR2 and CDR3).

Однодоменное антитело можно получать из животного, в организме которого может продуцироваться однодоменное антитело, или путем иммунизации животного, в организме которого может продуцироваться однодоменное антитело. Примеры животного, в организме которого может продуцироваться однодоменное антитело, включают (но, не ограничиваясь только ими) животных семейства Camelidae и трансгенных животных, несущих ген, который может кодировать однодоменное антитело. Животные семейства Camelidae включают верблюдов, лам, альпак, одногорбых верблюдов и гуанако и др. Примеры трансгенных животных, несущих ген, который может кодировать однодоменное антитело, включают (но, не ограничиваясь только ими) трансгенных животных, которые описаны в WO 2015/143414 и публикации патента США US2011/0123527 А1. Каркасные последовательности однодоменного антитела, полученного из животного, можно превращать в последовательности человеческих зародышевых линий или в сходные с ними последовательности с получением гуманизированного однодоменного антитела. Гуманизированное однодоменное антитело (например, гуманизированный VHH) также является одним из вариантов однодоменного антитела, предлагаемого в настоящем изобретении. Понятие «гуманизированное однодоменное антитело» относится к химерному однодоменному антителу, которое содержит аминокислотные остатки из нечеловеческих CDR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых вариантах осуществления изобретения в гуманизированном однодоменном антителе все или практически все CDR соответствуют участкам нечеловеческого антитела, а все или практически все FR соответствуют участкам человеческого антитела. В гуманизированном антителе, даже, если часть остатков в FR не соответствует остаткам человеческого антитела, практически все FR рассматриваются в качестве примера, соответствующего остаткам человеческого антитела. Например, при гуманизации VHH, который является вариантом однодоменного антитела, необходимо, чтобы часть остатков FR представляла собой остатки, которые не соответствуют остаткам человеческого антитела (С.Vincke и др., The Journal of Biological Chemistry 284, cc. 3273-3284).A single-domain antibody can be obtained from an animal that can produce a single-domain antibody, or by immunizing an animal that can produce a single-domain antibody. Examples of an animal that can produce a single-domain antibody include, but are not limited to, animals of the family Camelidae and transgenic animals carrying a gene that can encode a single-domain antibody. Animals of the family Camelidae include camels, llamas, alpacas, dromedary camels and guanacos, etc. Examples of transgenic animals carrying a gene that may encode a single domain antibody include, but are not limited to, transgenic animals as described in WO 2015/143414 and US patent publication US2011/0123527 A1. The framework sequences of a single domain antibody derived from an animal can be converted to human germline sequences or similar sequences to produce a humanized single domain antibody. A humanized single domain antibody (eg, humanized VHH) is also one variant of the single domain antibody provided by the present invention. The term “humanized single domain antibody” refers to a chimeric single domain antibody that contains amino acid residues from non-human CDRs and amino acid residues from human FRs. In some embodiments, in a humanized single domain antibody, all or substantially all of the CDRs correspond to regions of a non-human antibody, and all or substantially all of the FRs correspond to regions of a human antibody. In a humanized antibody, even if some of the residues in the FR do not correspond to the residues of the human antibody, substantially all of the FRs are considered as an example corresponding to the residues of the human antibody. For example, when humanizing VHH, which is a variant of a single domain antibody, it is necessary that a portion of the FR residues be residues that do not correspond to residues of the human antibody (C. Vincke et al., The Journal of Biological Chemistry 284, pp. 3273-3284).

Альтернативно этому, однодоменное антитело можно получать с помощью ELISA, пэннинга или т.п. из полипептидной библиотеки, содержащей однодоменные антитела. Примеры полипептидных библиотек, содержащих однодоменные антитела, включают (но, не ограничиваясь только ими) библиотеки наивных антител, полученных из различных животных или людей (см., например, Methods in Molecular Biology 911, 2012, cc. 65-78; и Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 1764: 8, 2006, 1307-1319), библиотеки антител, полученных путем иммунизации различных животных (см., например, Journal of Applied Microbiology 117: 2, 2014, cc. 528-536), и библиотеки синтетических антител, полученных из генов антител различных животных или людей (см., например, Journal of Biomolecular Screening 21: 1, 2016, cc. 35-43; Journal of Biological Chemistry 291:24, 2016, cc. 12641-12657; и AIDS 30: 11, 2016, cc. 1691-1701).Alternatively, a single domain antibody can be produced by ELISA, panning or the like. from a polypeptide library containing single domain antibodies. Examples of polypeptide libraries containing single domain antibodies include, but are not limited to, libraries of naïve antibodies derived from various animals or humans (see, for example, Methods in Molecular Biology 911, 2012, pp. 65-78; and Biochimica et al. Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 1764: 8, 2006, 1307-1319), libraries of antibodies obtained by immunization of various animals (see, for example, Journal of Applied Microbiology 117: 2, 2014, pp. 528-536), and libraries synthetic antibodies derived from antibody genes of various animals or humans (see, for example, Journal of Biomolecular Screening 21: 1, 2016, pp. 35-43; Journal of Biological Chemistry 291:24, 2016, pp. 12641-12657; and AIDS 30: 11, 2016, pp. 1691-1701).

В настоящем описании «антиген» ограничен только наличием эпитопа, с которым связывается антигенсвязывающий домен. Предпочтительные примеры антигена включают (но, не ограничиваясь только ими) пептиды, полипептиды и белки животного или человеческого происхождения. Предпочтительные примеры антигена, предназначенного для применения для лечения заболевания, вызываемого тканью-мишенью, включают (но, не ограничиваясь только ими) молекулы, экспрессируемые на поверхности клеток-мишеней (например, раковых клеток и воспалительных клеток), молекулы, экспрессируемые на поверхности других клеток в тканях, содержащих клетки-мишени, молекулы, экспрессируемые на поверхности клеток, которые имеют иммунологическую роль в отношении клеток-мишеней и тканей, содержащих клетки-мишени, и макромолекулы, присутствующие в строме тканей, содержащих клетки-мишени.As used herein, “antigen” is limited only to the presence of an epitope to which the antigen binding domain binds. Preferred examples of antigen include, but are not limited to, peptides, polypeptides and proteins of animal or human origin. Preferred examples of an antigen for use in treating a disease caused by a target tissue include, but are not limited to, molecules expressed on the surface of target cells (eg, cancer cells and inflammatory cells), molecules expressed on the surface of other cells in tissues containing target cells, molecules expressed on the surface of cells that have an immunological role in relation to target cells and tissues containing target cells, and macromolecules present in the stroma of tissues containing target cells.

Примеры антигена могут включать следующие молекулы: 17-IA, 4-1ВВ, 4Dc, 6-кето-PGF1a, 8-изо-PGF2a, 8-оксо-dG, А1 аденозиновый рецептор, А33, АСЕ, АСЕ-2, активин, активин А, активин АВ, активин В, активин С, активин RIA, активин RIA ALK-2, активин RIB ALK-4, активин RIIA, активин RIIB, ADAM, ADAM 10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, адрессин, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, альфа-1-антитрипсин, антагонист альфа-V/бета-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, артемин, анти-Id, ASPARTIC, предсердный натрийуретический фактор, интегрин av/b3, Axl, b2M, В7-1, В7-2, В7-Н, стимулятор В-лимфоцитов (BlyS), ВАСЕ, ВАСЕ-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Вах, ВСА-1, ВСАМ, Bel, ВСМА, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 остеогенин, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, бомбезин, нейтротрофический фактор костного мозга, BPDE, BPDE-DNA, ВТС, фактор системы комплемента 3 (С3), С3а, С4, С5, С5а, С10, СА125, CAD-8, кальцитонин, цАМФ, карциноэмбриональный антиген (СЕА), ассоциированные с раком антигены, катепсин А, катепсин В, катепсин C/DPPI, катепсин D, катепсин Е, катепсин Н, катепсин L, катепсин О, катепсин S, катепсин V, катепсин X/Z/P, CBL, CC1, ССК2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (белок р67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (В7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, цГМФ, CINC, ботулинический токсин, токсин Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG3, TIM3, галектин-9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, антигены, ассоциированные с цитокератином опухоли, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, регулирующий комплемент фактор (фактор ускорения диссоциации), des(1-3)-IGF-I (IGF-1 головного мозга), Dhh, дигоксин, DNAM-1, ДНКаза, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, эндотелиновый рецептор, энкефалиназа, eNOS, Eot, эотаксин 1, EpCAM, эфрин B2/EphB4, EPO, ERCC, Е-селектин, ET-1, фактор IIa, фактор VII, фактор VIIIc, фактор IX, фибробласт-активирующий белок (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ферритин, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, фибрин, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, фолликулостимулирующий гормон, фракталкин, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (миостатин), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-альфа 1, GFR-альфа 2, GFR-альфа 3, GITR, глюкагон, Glut4, гликопротеин IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, релизин-фактор ростового гормона, гаптен (NP-кэп или NIP-кэп), HB-EGF, НСС, оболочечный гликопротеин HCMV gB, оболочечный гликопротеин HCMV gH, HCMV UL, гематопоэтический фактор роста (HGF), Hep В gp120, гепараназа, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), гликопротеин вируса герпеса простого (HSV) gB, гликопротеин HSV gDn, HGF А, высокомолекулярный ассоциированный с меланомой антиген (HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 loop, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG РЕМ, HRG, Hrk, человеческий сердечный миозин, человеческий цитомегаловирус (HCMV), человеческий гормон роста (HGH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA-рецептор, IgE, IGF, IGF-связывающий белок, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-21, IL-23, IL-27, интерферон (INF)-альфа, INF-бета, INF-гамма, ингибин, iNOS, А-цепь инсулина, В-цепь инсулина, инсулиноподобный фактор роста 1, интегрин альфа 2, интегрин альфа 3, интегрин альфа 4, интегрин альфа 4/бета 1, интегрин альфа 4/бета 7, интегрин альфа 5 (альфа V), интегрин альфа 5/бета 1, интегрин альфа 5/бета 3, интегрин альфа 6, интегрин бета 1, интегрин бета 2, интерферон гамма, IP-10, I-TAC, JE, калликреин 2, калликреин 5, калликреин 6, калликреин 11, калликреин 12, калликреин 14, калликреин 15, калликреин L1, калликреин L2, калликреин L3, калликреин L4, KC, KDR, фактор роста кератиноцитов (KGF), ламинин 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), латентный TGF-1, латентный TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, фактор Lefty, антиген Льюис-Y, антиген, ассоциированный с системой Льюис, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, липопротеин, LIX, LKN, Lptn, L-селектин, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, антиген поверхности легкого, лютеинизирующий гормон, рецептор лимфотоксина бета, Мас-1, MAdCAM, MAG, МАР2, MARC, МСАМ, МСК-2, МСР, M-CSF, MDC, Mer, металлопротеазы, MGDF-рецептор, MGMT, МНС (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-альфа, MK, ММАС1, ММР, ММР-1, ММР-10, ММР-11, ММР-12, ММР-13, ММР-14, ММР-15, ММР-2, ММР-24, ММР-3, ММР-7, ММР-8, ММР-9, MPIF, Мро, MSK, MSP, муцин (Muc1), MUC18, ингибирующее вещество Мюллера, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-кадхерин, NCA 90, NCAM, неприлизин, нейротрофин-3, -4 или -6, нейротурин, фактор роста нерва (NGF), NGFR, NGF-бета, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, pi50, p95, PADPr, паратиреоидный гормон, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, Р-кадхерин, PCNA, PDGF, PDK-1, PECAM, РЕМ, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, плацентарная щелочная фосфатаза (PLAP), PIGF, PLP, PP14, проинсулин, прорелаксин, белок С, PS, PSA, PSCA, простатспецифический мембранный антиген (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, цепь А релаксина, цепь В релаксина, ренин, респираторно-синцитиальный вирус (RSV) F, RSV Fgp, Ret, ревматоидный фактор, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, сывороточный альбумин, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (ассоциированный с опухолью гликопротеин-72), TARC, ТСА-3, Т-клеточный рецептор (например, Т-клеточный рецептор альфа/бета), TdT, ТЕСК, ТЕМ1, ТЕМ5, ТЕМ7, ТЕМ8, TERT, PLAP-подобная щелочная фосфатаза яичек, TfR, TGF, TGF-альфа, TGF-бета, TGF-бета Pan-специфический, TGF-бeтaRI (ALK-5), TGF-бетаRII, TGF-бетаRIIb, TGF-бетаRIII, TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, TGF-бета4, TGF-бета5, тромбин, Ck-1 тимуса, тиреотропный гормон, Tie, TIMP, TIQ, тканевый фактор, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-альфа, TNF-альфа,бета, TNF-бета2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Аро-1, АРТ1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD 137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (TRAIL Аро-2-лиганд, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK-лиганд ODF, OPG-лиганд), TNFSF12 (TWEAK Аро-3-лиганд, DR3-лиганд), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM-лиганд, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR-лиганд AITR-лиганд, TL6), TNFSF1A (TNF-a конектин, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (ОХ40-лиганд gp34, TXGP1), TNFSF5 (CD40-лиганд CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Fas-лиганд Аро-1-лиганд, APT1-лиганд), TNFSF7 (CD27-лиганд CD70), TNFSF8 (CD30-лиганд CD153), TNFSF9 (4-1ВВ-лиганд CD137-лиганд), TP-1, t-PA, Тро, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, рецептор трансферрина, TRF, Trk, TROP-2, TLR (Toll-подобный рецептор) 1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TSG, TSLP, ассоциированный с опухолью антиген СА125, ассоциированный с опухолью антиген, экспрессирующий ассоциированные с антигеном Льюис-Y углеводы, TWEAK, ТХВ2, Ung, uPAR, uPAR-1, урокиназа, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-кадхерин, УЕ-кадхерин-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, вирусный антиген, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR интегрин, фактор фон Виллебранда, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, А бета, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, окисленный LDL, PCSK9, прекалликреин, RON, TMEM16F, SOD1, хромогранин А, хромогранин В, tau, VAP1, высокомолекулярный кининоген, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, С3, С3а, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, фактор В, фактор D, фактор H, пропердин, склеростин, фибриноген, фибрин, протромбин, тромбин, тканевый фактор, фактор V, фактор Va, фактор VII, фактор VIIa, фактор VIII, фактор VIIIa, фактор IX, фактор ТХа, фактор X, фактор Ха, фактор XI, фактор XIa, фактор XII, фактор XIIa, фактор XIII, фактор XIIIa, TFPI, антитромбин III, EPCR, тромбомодулин, TAPI, tPA, плазминоген, плазмин, PAI-1, PAI-2, GPC3, синдекан-1, синдекан-2, синдекан-3, синдекан-4, LPA и S1P; и рецепторы для гормонов и факторов роста.Examples of antigen may include the following molecules: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-keto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, A1 adenosine receptor, A33, ACE, ACE-2, activin, activin A, activin AB, activin B, activin C, activin RIA, activin RIA ALK-2, activin RIB ALK-4, activin RIIA, activin RIIB, ADAM, ADAM 10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS , ADAMTS4, ADAMTS5, addressin, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alpha-1-antitrypsin, alpha-V/beta-1 antagonist, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, artemin, anti-Id, ASPARTIC, atrial natriuretic factor, av/b3 integrin, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-lymphocyte stimulator (BlyS), BACE , BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BSA-1, BCAM, Bel, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM , BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 osteogenin, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP- 8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, bombesin, bone marrow neutrotrophic factor, BPDE, BPDE-DNA, BTC, complement factor 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, calcitonin, cAMP, carcinoembryonic antigen (CEA) , cancer-associated antigens, cathepsin A, cathepsin B, cathepsin C/DPPI, cathepsin D, cathepsin E, cathepsin H, cathepsin L, cathepsin O, cathepsin S, cathepsin V, cathepsin X/Z/P, CBL, CC1, CCK2 , CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6 , CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8 , CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (p67 protein), CD34 , CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, botulinum toxin, Clostridium perfringens toxin, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG- 2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG3, TIM3, galectin-9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, tumor cytokeratin-associated antigens, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, regulatory complement factor (dissociation accelerating factor), des(1-3)-IGF-I (brain IGF-1), Dhh, digoxin, DNAM-1, DNase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA- A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, endothelin receptor, enkephalinase, eNOS, Eot, eotaxin 1, EpCAM, ephrin B2/EphB4, EPO, ERCC, E-selectin, ET-1, factor IIa, factor VII, factor VIIIc, factor IX, fibroblast activating protein (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ferritin, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrin, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, follicle-stimulating hormone, fractalkine, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP -2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (myostatin), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alpha 1, GFR- alpha 2, GFR-alpha 3, GITR, glucagon, Glut4, glycoprotein IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, growth hormone releasing factor, hapten (NP-cap or NIP-cap) , HB-EGF, HCC, HCMV gB envelope glycoprotein, HCMV gH envelope glycoprotein, HCMV UL, hematopoietic growth factor (HGF), Hep B gp120, heparanase, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3) , Her4 (ErbB-4), herpes simplex virus (HSV) gB glycoprotein, HSV gDn glycoprotein, HGF A, high molecular weight melanoma-associated antigen (HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 loop, HLA, HLA-DR , HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, human cardiac myosin, human cytomegalovirus (HCMV), human growth hormone (HGH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS , IFNg, Ig, IgA receptor, IgE, IGF, IGF-binding protein, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL- 18, IL-18R, IL-21, IL-23, IL-27, interferon (INF)-alpha, INF-beta, INF-gamma, inhibin, iNOS, insulin A chain, insulin B chain, insulin-like growth factor 1, integrin alpha 2, integrin alpha 3, integrin alpha 4, integrin alpha 4/beta 1, integrin alpha 4/beta 7, integrin alpha 5 (alpha V), integrin alpha 5/beta 1, integrin alpha 5/beta 3, integrin alpha 6, integrin beta 1, integrin beta 2, interferon gamma, IP-10, I-TAC, JE, kallikrein 2, kallikrein 5, kallikrein 6, kallikrein 11, kallikrein 12, kallikrein 14, kallikrein 15, kallikrein L1, kallikrein L2, kallikrein L3, kallikrein L4, KC, KDR, keratinocyte growth factor (KGF), laminin 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), latent TGF-1, latent TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty factor, Lewis-Y antigen, antigen associated with the Lewis system, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoprotein, LIX, LKN, Lptn, L-selectin, LT-a, LT-b, LTB4 , LTBP-1, lung surface antigen, luteinizing hormone, lymphotoxin beta receptor, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MSAM, MSC-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, metalloprotease, MGDF receptor, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alpha, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14 , MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucin (Muc1), MUC18, Mullerian inhibitory substance, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-cadherin, NCA 90, NCAM, neprilysin, neurotrophin-3, -4 or -6, neuroturin, nerve growth factor (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, pi50, p95, PADPr, parathyroid hormone, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-cadherin, PCNA, PDGF , PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, placental alkaline phosphatase (PLAP), PIGF, PLP, PP14, proinsulin, prorelaxin, protein C, PS, PSA, PSCA, prostate-specific membrane antigen (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, relaxin A chain, relaxin B chain, renin, respiratory syncytial virus (RSV) F, RSV Fgp, Ret, rheumatoid factor, RLIP76 , RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, serum albumin, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (tumor associated glycoprotein-72), TARC, TCA-3, T cell receptor (e.g. T cell receptor alpha/beta), TdT, TESC, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, PLAP-like testicular alkaline phosphatase, TfR, TGF, TGF-alpha, TGF-beta, TGF-beta Pan-specific, TGF-betaRI (ALK-5), TGF-betaRII, TGF-betaRIIb, TGF -betaRIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, thrombin, thymic Ck-1, thyroid-stimulating hormone, Tie, TIMP, TIQ, tissue factor, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alpha, TNF-alpha, beta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B ), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI ), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT) , TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, ART1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD 137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (TRAIL Apo-2-ligand, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK ODF-ligand, OPG-ligand), TNFSF12 (TWEAK Apo-3-ligand, DR3-ligand), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM-ligand, LTg) , TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR ligand AITR ligand, TL6), TNFSF1A (TNF-a connectin, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (OX40 ligand gp34, TXGP1), TNFSF5 (CD40 ligand CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Fas ligand Apo-1 ligand, APT1 ligand), TNFSF7 (CD27 ligand CD70), TNFSF8 (CD30 ligand CD153), TNFSF9 (4-1BB ligand CD137 ligand), TP-1, t-PA, Tro, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, transferrin receptor, TRF, Trk, TROP-2, TLR (Toll-like receptor) 1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TSG, TSLP, tumor associated antigen CA125, tumor associated antigen, expressing associated with Lewis-Y antigen carbohydrates, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, urokinase, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-cadherin, UE-cadherin-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, viral antigen, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR integrin, von Willebrand factor, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A , WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, A beta, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, oxidized LDL, PCSK9, prekallikrein, RON, TMEM16F, SOD1, chromogranin A, chromogranin B, tau , VAP1, high molecular weight kininogen, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H , properdin, sclerostin, fibrinogen, fibrin, prothrombin, thrombin, tissue factor, factor V, factor Va, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor TXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor XIa, factor XII, factor XIIa, factor XIII, factor XIIIa, TFPI, antithrombin III, EPCR, thrombomodulin, TAPI, tPA, plasminogen, plasmin, PAI-1, PAI-2, GPC3, syndecan-1, syndecan-2, syndecan -3, syndecan-4, LPA and S1P; and receptors for hormones and growth factors.

Хотя перечисленные выше примеры антигенов включают также рецепторы, указанные рецепторы, даже присутствующие в растворимой форме в общей воде организма, можно применять в качестве антигена, с которым связывается антигенсвязывающий домен, предлагаемый в настоящем изобретении. Один из примеров (но, не ограничиваясь только им) растворимой формы такого рецептора может являться белок, представленный в SEQ ID NO: 35, который представляет собой растворимый IL-6R, описанный у Mullberg и др., J. Immunol. 152 (10), 1994, сс.4958-4968.Although the above examples of antigens also include receptors, these receptors, even those present in a soluble form in body water, can be used as the antigen to which the antigen binding domain of the present invention binds. One example, but not limited to, of a soluble form of such a receptor may be the protein shown in SEQ ID NO: 35, which is the soluble IL-6R described in Mullberg et al., J. Immunol. 152 (10), 1994, pp. 4958-4968.

Перечисленные выше примеры антигенов включают мембранные молекулы, которые экспрессируются на клеточных мембранах, и растворимые молекулы, которые секретируются из клеток наружу от клеток. Когда антигенсвязывающий домен, предлагаемый в настоящем изобретении, связывается с растворимой молекулой, секретируемой из клеток, то антигенсвязывающий домен предпочтительно обладает нейтрализующей активностью.Examples of antigens listed above include membrane molecules, which are expressed on cell membranes, and soluble molecules, which are secreted from cells to the outside of cells. When the antigen binding domain of the present invention binds to a soluble molecule secreted from cells, the antigen binding domain preferably has neutralizing activity.

Раствор, в котором содержится растворимая молекула, не ограничен, и указанная растворимая молекула может присутствовать в общей воде организма, т.е. в любой жидкости сосудов или любой жидкости, заполняющей пространство между тканями и клетками в живых организмах. Растворимая молекула, с которой антигенсвязывающий домен, предлагаемый в настоящем изобретении, связывается, может присутствовать во внеклеточной жидкости (но, не ограничиваясь только указанным). Внеклеточная жидкость является общим названием плазмы, межклеточной жидкости, лимфы, плотных соединительных тканей, спинномозговой жидкости, спинальной жидкости, аспиратов, синовиальной жидкости или таких компонентов в кости и хряще, альвеолярной жидкости (жидкость бронхоальвеолярного лаважа), асцитной жидкости, плеврального выпота, сердечного выпота, цистной жидкости, внутриглазной жидкости (гидатоид) или указанных трансклеточных жидкостей (различные жидкости в гранулярных полостях, образовавшиеся в результате активного транспорта или секреторной активности клеток, и жидкости в полости кишечника и других полостей в организме) у позвоночных животных.The solution in which the soluble molecule is contained is not limited, and said soluble molecule may be present in the general body water, i.e. in any vascular fluid or any fluid that fills the space between tissues and cells in living organisms. The soluble molecule to which the antigen binding domain of the present invention binds may (but is not limited to) be present in extracellular fluid. Extracellular fluid is the general name for plasma, extracellular fluid, lymph, dense connective tissue, cerebrospinal fluid, spinal fluid, aspirates, synovial fluid or such components in bone and cartilage, alveolar fluid (bronchoalveolar lavage fluid), ascites fluid, pleural effusion, cardiac effusion , cystic fluid, intraocular fluid (hydatoid) or the indicated transcellular fluids (various fluids in granular cavities formed as a result of active transport or secretory activity of cells, and fluid in the intestinal cavity and other cavities in the body) in vertebrates.

Эпитоп, который означает антигенную детерминанту, присутствующую в антигене, представляет собой область с которой связывается антигенсвязывающий домен, указанный в настоящем описании. Так, например, эпитоп можно характеризовать на основе его структуры. Альтернативно этому, эпитоп можно характеризовать на основе антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена, который распознает эпитоп. Когда антиген представляет собой пептид или полипептид, то эпитоп можно определять по аминокислотным остаткам, образующим эпитоп. Когда эпитоп представляет собой сахарную цепь, то эпитоп можно определять по специфической для него структуре сахарной цепи.An epitope, which refers to an antigenic determinant present in an antigen, is the region to which the antigen binding domain referred to herein binds. For example, an epitope can be characterized based on its structure. Alternatively, an epitope can be characterized based on the antigen binding activity of the antigen binding domain that recognizes the epitope. When the antigen is a peptide or polypeptide, the epitope can be determined by the amino acid residues that form the epitope. When the epitope is a sugar chain, the epitope can be determined by its specific sugar chain structure.

Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, который содержит эпитоп, который распознается по его первичной последовательности аминокислот. Указанный линейный эпитоп, как правило, содержит по меньшей мере 3 и наиболее часто по меньшей мере 5, например, примерно от 8 до 10 или от 6 до 20 аминокислотных остатков в его уникальной последовательности.A linear epitope is an epitope that contains an epitope that is recognized by its primary amino acid sequence. Said linear epitope typically contains at least 3 and most often at least 5, for example about 8 to 10 or 6 to 20 amino acid residues in its unique sequence.

В отличие от линейного эпитопа конформационный эпитоп представляет собой эпитоп, в котором первичная последовательность аминокислот содержит компонент, который не является единственной детерминантой распознаваемого эпитопа (например, эпитоп, первичная последовательность аминокислот которого может не распознаваться специфическим в отношении эпитопа антителом). Конформационный эпитоп может содержать увеличенное по сравнению с линейными эпитопами количество аминокислот. Для распознавания конформационного эпитопа антигенсвязывающий домен распознает трехмерную структуру пептида или белка. Например, когда белковая молекула уложена и образует трехмерную структуру, то некоторые аминокислоты и/или основная цепь полипептида, которые образуют конформационный эпитоп, располагаются параллельно, что обеспечивает распознавание эпитопа. Примеры методов определения конформации эпитопа включают (но, не ограничиваясь только ими) рентгеновскую кристаллографию, двухмерный ядерный магнитный резонанс и сайтспецифическое спиновое мечение, и электронный парамагнитный резонанс (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, под ред. Morris, т.66, 1996).In contrast to a linear epitope, a conformational epitope is an epitope in which the primary amino acid sequence contains a component that is not the sole determinant of the epitope being recognized (eg, an epitope whose primary amino acid sequence may not be recognized by an epitope-specific antibody). A conformational epitope may contain an increased number of amino acids compared to linear epitopes. To recognize a conformational epitope, the antigen binding domain recognizes the three-dimensional structure of the peptide or protein. For example, when a protein molecule is folded into a three-dimensional structure, certain amino acids and/or the polypeptide backbone that form a conformational epitope are arranged in parallel, allowing epitope recognition. Examples of methods for determining epitope conformation include, but are not limited to, x-ray crystallography, two-dimensional nuclear magnetic resonance and site-specific spin labeling, and electron paramagnetic resonance (see, for example, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, ed. Morris, vol.66, 1996).

Структуру антигенсвязывающего домена, связывающегося с эпитопом, называют паратопом. Паратоп стабильно связывается с эпитопом посредством водородной связи, электростатической силы, Ван-дер-ваальсовой силы, гидрофобной связи или т.п., действующей между эпитопом и паратопом. Указанную силу связывания между эпитопом и паратопом называют аффинностью. Общую силу связывания, когда множество антигенсвязывающих доменов связывается с множеством антигенов, называют авидностью. Аффинность действует синергетически, когда, например, антитело, содержащее множество антигенсвязывающих доменов (т.е. многовалентное антитело), связывается с множеством эпитопов. Таким образом, авидность превышает аффинность.The structure of the antigen-binding domain that binds to an epitope is called a paratope. The paratope binds stably to the epitope through hydrogen bonding, electrostatic force, van der Waals force, hydrophobic bonding or the like acting between the epitope and the paratope. The specified binding strength between an epitope and a paratope is called affinity. The overall binding strength when multiple antigen binding domains bind to multiple antigens is called avidity. Affinity acts synergistically when, for example, an antibody containing multiple antigen-binding domains (ie, a multivalent antibody) binds to multiple epitopes. Thus, avidity exceeds affinity.

В конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий домен, представленный в настоящем описании, характеризуется константой диссоциации (Kd)≤1 мкМ, ≤100нМ, ≤10нМ, ≤1нМ, ≤0,1нМ, ≤0,01нМ или ≤0,001нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9М до 10^-13М).In a specific embodiment, the antigen binding domain provided herein has a dissociation constant (Kd) of ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, or ≤0.001 nM (e.g., 10 ^{- 8} M or less, for example from 10 ^-8 M to 10 ^-13 M, for example from 10 ^-9 M to 10 ^-13 M).

Ниже в настоящем описании представлены примеры методов подтверждения связывания с эпитопом антигенсвязывающего домена против IL-6R, или полипептида, содержащего антигенсвязывающий домен. Однако метод подтверждения связывания с эпитопом антигенсвязывающего домена против антигена, отличного от IL-6R, или полипептида, содержащего антигенсвязывающий домен, можно осуществлять также соответственно согласно описанному ниже примеру.Provided below are examples of methods for confirming binding to an anti-IL-6R antigen binding domain epitope, or a polypeptide containing an antigen binding domain. However, a method for confirming binding to an antigen binding domain epitope against an antigen other than IL-6R or a polypeptide containing an antigen binding domain can also be carried out according to the example described below.

Например, для подтверждения того, что антигенсвязывающий домен против IL-6R распознает линейный эпитоп в молекуле IL-6R, можно применять описанный ниже метод: синтезируют для указанной выше цели линейный пептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая содержит внеклеточный домен IL-6R. Пептид можно синтезировать химически. Альтернативно этому, пептид получают с помощью методов генной инженерии, используя область в кДНК IL-6R, которая кодирует аминокислотную последовательность, соответствующую внеклеточному домену. Затем оценивают антигенсвязывающий домен против IL-6R в отношении связывающей активности с линейным пептидом, который содержит аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен. Например, иммобилизованный линейный пептид можно применять в качестве антигена при осуществлении ELISA для оценки связывающей активности антигенсвязывающей домена в отношении пептида. Альтернативно этому, связывающую активность в отношении линейного пептида можно оценивать по уровню ингибирования линейным пептидом связывания антигенсвязывающего домена с экспрессирующими IL-6R клетками. С помощью этих анализов можно определять связывающую активность антигенсвязывающего домена в отношении линейного пептида.For example, to confirm that the anti-IL-6R antigen binding domain recognizes a linear epitope in the IL-6R molecule, the method described below can be used: a linear peptide containing an amino acid sequence that contains the extracellular domain of IL-6R is synthesized for the above purpose. The peptide can be synthesized chemically. Alternatively, the peptide is produced by genetic engineering techniques using a region in the IL-6R cDNA that encodes an amino acid sequence corresponding to the extracellular domain. The anti-IL-6R antigen binding domain is then evaluated for binding activity to a linear peptide that contains the amino acid sequence forming the extracellular domain. For example, an immobilized linear peptide can be used as an antigen in an ELISA to evaluate the binding activity of the antigen binding domain to the peptide. Alternatively, binding activity to a linear peptide can be assessed by the level of inhibition by the linear peptide of binding of the antigen binding domain to IL-6R expressing cells. Using these assays, the binding activity of the antigen binding domain to a linear peptide can be determined.

Кроме того, способность антигенсвязывающего домена против IL-6R распознавать конформационный эпитоп можно подтверждать следующим методом: для описанной выше цели получали экспрессирующие IL-6R клетки. Считается, например, что антигенсвязывающий домен против IL-6R распознает конформационный эпитоп, если он при контакте отличается сильным связыванием с экспрессирующими IL-6R клетками, но при этом антигенсвязывающий домен в незначительной степени связывается с иммобилизованным линейным пептидом, который содержит аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен IL-6R, или с денатурированным (с помощью обычного денатурирующего агента, такого как гуанидин) линейным пептидом, который содержит аминокислотную последовательность, образующую внеклеточный домен IL-6R. В этом контексте понятие «связывается в незначительной степени» означает, что активность связывания составляет 80% или менее, как правило, 50% или менее, предпочтительно 30% или менее и наиболее предпочтительно 15% или менее по сравнению с активностью связывания с клетками, экспрессирующими человеческий IL-6R.In addition, the ability of the anti-IL-6R antigen binding domain to recognize a conformational epitope can be confirmed by the following method: IL-6R expressing cells were prepared for the purpose described above. For example, the anti-IL-6R antigen-binding domain is thought to recognize a conformational epitope if it binds strongly to IL-6R-expressing cells upon contact, but the antigen-binding domain binds little to an immobilized linear peptide that contains an amino acid sequence that forms an extracellular IL-6R domain, or with a denatured (using a conventional denaturing agent such as guanidine) linear peptide that contains the amino acid sequence forming the extracellular domain of IL-6R. In this context, the term “slightly bound” means that the binding activity is 80% or less, typically 50% or less, preferably 30% or less, and most preferably 15% or less compared to the binding activity to cells expressing human IL-6R.

Методы подтверждения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена включают также методы измерения величины Kd, например, с помощью анализа связывания несущего радиоактивную метку антигена (РИА). В одном из вариантов осуществления изобретения РИА осуществляют с использованием представляющего интерес антигенсвязывающего домена и его антигена. Например, измеряют в растворе аффинность связывания антигенсвязывающего домена и его антигена путем уравновешивания антигенсвязывающего домена минимальной концентрацией меченного ¹²⁵I антигена в присутствии полученных титрованием серийных разведений немеченого антигена, и осуществляя затем «захват» связанного антигена с помощью планшета, сенсибилизированного антигенсвязывающим доменом (см., например, Chen и др., J. Mol Biol 293, 1999, сс.865-881).Methods for confirming the antigen-binding activity of an antigen-binding domain also include methods for measuring the Kd value, for example, using a radiolabeled antigen binding assay (RIA). In one embodiment of the invention, RIA is performed using the antigen binding domain of interest and its antigen. For example, the binding affinity of an antigen-binding domain and its antigen is measured in solution by equilibrating the antigen-binding domain with a minimal concentration of ¹²⁵ I-labeled antigen in the presence of titrated serial dilutions of unlabeled antigen, and then “capturing” the bound antigen using a plate sensitized with the antigen-binding domain (see, for example, Chen et al., J. Mol Biol 293, 1999, pp. 865-881).

В альтернативном варианте осуществления изобретения Kd измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса с помощью устройства BIACORE®. Например, анализ осуществляют с помощью устройства BIACORE^®-2000 или BIACORE^®-3000 (фирма BIAcore Inc., Пискатавей, шт. Нью-Джерси) при 25°С с использованием антигена, иммобилизованного на СМ5-чипах с уровнем иммобилизации, соответствующим примерно 10 единицам ответа (RU). В одном из вариантов осуществления изобретения биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (СМ5, фирма BIAcore Inc.) активируют с помощью гидрохлорида N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разводят 10мМ ацетатом натрия, рН 4,8 до концентрации 5 мкг/мл (примерно 0,2 мкМ) перед инъекцией со скоростью потока 5 мкл/мин для достижения связывания белка, соответствующего примерно 10 единицам ответа (RU). После инъекции антигена инъецируют 1М этаноламин для блокады непрореагировавших групп. Для кинетических измерений инъецируют двукратные серийные разведения (от 0,78 до 500нМ) антигенсвязывающего домена в ЗФР, дополненном 0,05% полисорбата 20 (TWEEN-20™) в качестве сурфактанта (ЗФР-Т), при 25°С со скоростью потока примерно 25 мкл/мин. Скорость реакции ассоциации (k_on) и реакции диссоциации (k_off) рассчитывают с использованием простой модели связывания Ленгмюра 1:1 (программное обеспечение Evaluation, версия 3.2, BIACORE®) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия реакции диссоциации (Kd) рассчитывают как соотношение k_off/k_on. Кроме того, кажущуюся константу диссоциации (Kd) можно определять с помощью анализа равновесия. Для осуществления этой процедуры можно применять протокол, прилагаемый к BIACORE® (см., например, Chen и др., J Mol Biol 293, 1999, сс.865-881 и Methods Enzymol. 323, 2000, сс.325-340). При осуществлении анализа методом поверхностного плазмонного резонанса специалисты в данной области могут в значительной степени изменять количество иммобилизованного белка, количество применяемого в реакции белка, температуру и состав раствора.In an alternative embodiment of the invention, Kd is measured by surface plasmon resonance using a BIACORE® device. For example, the assay is performed using a BIACORE ^® -2000 or BIACORE ^® -3000 device (BIAcore Inc., Piscataway, NJ) at 25° C. using antigen immobilized on CM5 chips with an immobilization level of approximately 10 response units (RU). In one embodiment, carboxymethylated dextran biosensor chips (CM5, BIAcore Inc.) are activated with N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) according to the supplier's instructions. The antigen is diluted with 10 mM sodium acetate, pH 4.8 to a concentration of 5 μg/ml (approximately 0.2 μM) before injection at a flow rate of 5 μl/min to achieve protein binding corresponding to approximately 10 response units (RU). After injection of the antigen, 1 M ethanolamine is injected to block unreacted groups. For kinetic measurements, two-fold serial dilutions (from 0.78 to 500 nM) of the antigen-binding domain in PBS supplemented with 0.05% polysorbate 20 (TWEEN-20™) as a surfactant (PBS-T) are injected at 25°C at a flow rate of approx. 25 µl/min. The rates of the association reaction (k _on ) and dissociation reaction (k _off ) are calculated using a simple 1:1 Langmuir binding model (Evaluation software, version 3.2, BIACORE®) by simultaneously fitting the association and dissociation sensorgrams. The equilibrium constant of the dissociation reaction (Kd) is calculated as the ratio k _off /k _on . In addition, the apparent dissociation constant (Kd) can be determined using equilibrium analysis. To carry out this procedure, the protocol provided with BIACORE® can be used (see, for example, Chen et al., J Mol Biol 293, 1999, pp. 865-881 and Methods Enzymol. 323, 2000, pp. 325-340). When performing surface plasmon resonance analysis, those skilled in the art can vary greatly the amount of protein immobilized, the amount of protein used in the reaction, the temperature, and the composition of the solution.

Если скорость реакции ассоциации превышает 10⁶ М^-1 с^-1 при оценке с помощью описанного выше метода поверхностного плазмонного резонанса, то скорость реакции ассоциации можно определять с помощью метода гашения флуоресценции, который позволяет измерять повышение или снижение интенсивности излучения флуоресценции (длина волны возбуждения 295 нм; длина волны испускания 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С, применяя в концентрации 20нМ антигенсвязывающий домен в ЗФР, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, осуществляя измерения с помощью спектрометра (например, спектрофотометра, снабженного блоком для остановки потока (фирма Aviv Instruments), или спектрофотометра SLM-AMINCO™ серии 8000 (фирма ThermoSpectronic/ Thermo Fisher Scientific Inc.) при перемешивании содержимого кюветы).If the association reaction rate is greater than 10 ⁶ M ^-1 s ^-1 as assessed by the surface plasmon resonance method described above, then the association reaction rate can be determined using the fluorescence quenching method, which measures the increase or decrease in fluorescence emission intensity (excitation wavelength 295 nm; emission wavelength 340 nm, bandwidth 16 nm) at 25°C, using a concentration of 20 nM antigen binding domain in PBS, pH 7.2, in the presence of increasing concentrations of antigen, measuring using a spectrometer (for example, a spectrophotometer equipped with a to stop the flow (Aviv Instruments), or SLM-AMINCO™ 8000 series spectrophotometer (ThermoSpectronic/Thermo Fisher Scientific Inc.) while mixing the contents of the cuvette).

Кроме того, антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена можно измерять с помощью известного метода измерения взаимодействия типа молекула-молекула, такого как электрогенерированная хемилюминесценция.In addition, the antigen binding activity of an antigen binding domain can be measured using a known molecule-molecule interaction measurement method such as electrogenerated chemiluminescence.

Примеры метода измерения связывающей активности антигенсвязывающего домена с IL-6R в отношении экспрессирующих IL-6R клеток включают методы, описанные в: Antibodies: A Laboratory Manual, под ред. Harlow, David Lane, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, cc. 359-420. В частности, оценку связывающей активности можно осуществлять на основе принципа ELIS А или метода FACS (разделение клеток на основе возбуждения флуоресценции), используя экспрессирующие IL-6R клетки в качестве антигена.Examples of a method for measuring the binding activity of the antigen binding domain to IL-6R on IL-6R expressing cells include the methods described in: Antibodies: A Laboratory Manual, ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, cc. 359-420. In particular, the assessment of binding activity can be carried out based on the ELIS A principle or the FACS method (fluorescence excitation-based cell separation) using IL-6R expressing cells as the antigen.

В формате ELISA связывающую активность антигенсвязывающего домена с IL-6R в отношении экспрессирующих IL-6R клеток, можно оценивать количественно путем сравнения уровней сигналов, возникающих в процессе ферментативной реакции. В частности, тестируемый антигенсвязывающий домен добавляют в планшет для ELIS А, на котором иммобилизованы экспрессирующие IL-6R клетки. Затем тестируемый антигенсвязывающий домен, связанный с клетками, выявляют с помощью меченного ферментом антитела, которое распознает тестируемый антигенсвязывающий домен. Альтернативно этому, когда применяют FACS, приготавливают серийные разведения тестируемого антигенсвязывающего домена, и титр антитела, связывающегося с экспрессирующими IL-6R клетками, можно определять путем сравнения активности тестируемого антигенсвязывающего домена с экспрессирующими IL-6R клетками.In the ELISA format, the binding activity of the antigen binding domain to IL-6R on IL-6R expressing cells can be quantified by comparing the levels of signals generated during the enzymatic reaction. Specifically, the antigen binding domain to be tested is added to an ELIS A plate on which IL-6R expressing cells are immobilized. The test antigen binding domain associated with the cells is then detected using an enzyme-labeled antibody that recognizes the test antigen binding domain. Alternatively, when FACS is used, serial dilutions of the test antigen binding domain are prepared and the titer of antibody binding to IL-6R expressing cells can be determined by comparing the activity of the test antigen binding domain to IL-6R expressing cells.

Связывание тестируемого антигенсвязывающего домена с антигеном, который экспрессируется на поверхности клеток, суспендированных в буферном растворе или аналогичной среде, можно выявлять с помощью проточного цитометра. Известными проточными цитометрами являются, например, следующие устройства:The binding of the test antigen binding domain to an antigen that is expressed on the surface of cells suspended in a buffer solution or similar medium can be detected using a flow cytometer. Known flow cytometers include, for example, the following devices:

FACSCanto™ II,FACS Canto™ II,

FACSAria™,FACSAria™

FACS Array™,FACS Array™

FACS Vantage™ SEFACS Vantage™ SE

FACSCalibur™ (все товарные знаки фирмы BD Biosciences),FACSCalibur™ (all trademarks of BD Biosciences),

EPICS ALTRA HyPerSort,EPICS ALTRA HyPerSort,

Cytomics FC 500,Cytomics FC 500,

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC,EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC,

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (все товарные знаки фирмы Beckman Coulter).Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (all trademarks of Beckman Coulter).

Одним из предпочтительных примеров метода измерения антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена в отношении IL-6R является следующий метод: сначала экспрессирующие IL-6R клетки, подвергнутые взаимодействию с тестируемым антигенсвязывающий доменом, окрашивают меченным с помощью ФИТЦ вторичным антителом, которое распознает тестируемый антигенсвязывающий домен. Тестируемый антигенсвязывающий домен соответствующим образом разводят приемлемым буферным раствором с получением антигенсвязывающего домена в требуемой для применения концентрации. Например, антигенсвязывающий домен можно применять в концентрации, составляющей от 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Затем определяют интенсивность флуоресценции и количество клеток с помощью FACSCalibur (фирма Becton, Dickinson and Company). Интенсивность флуоресценции, определенная с помощью анализов на основе программы CELL QUEST (фирма Becton, Dickinson and Company), а именно, выраженная в виде средних геометрических значений, отражает количество связанного тестируемого антигенсвязывающего домена. В целом, активность связывания антигенсвязывающего домена, выраженную в количестве связанного тестируемого антигенсвязывающего домена, можно оценивать, определяя среднее геометрическое значение.One preferred example of a method for measuring the antigen-binding activity of an antigen-binding domain for IL-6R is as follows: First, IL-6R-expressing cells that have been reacted with a test antigen-binding domain are stained with an FITC-labeled secondary antibody that recognizes the test antigen-binding domain. The antigen binding domain to be tested is appropriately diluted in a suitable buffer solution to obtain the antigen binding domain at the concentration required for use. For example, the antigen binding domain can be used at a concentration ranging from 10 μg/ml to 10 ng/ml. Fluorescence intensity and cell number are then determined using a FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Fluorescence intensity determined by CELL QUEST assays (Becton, Dickinson and Company), expressed as geometric means, reflects the amount of bound antigen binding domain tested. In general, the binding activity of an antigen binding domain, expressed as the amount of test antigen binding domain bound, can be assessed by determining the geometric mean.

Имеет ли антигенсвязывающий домен против IL-6R общий эпитоп с каким-либо антигенсвязывающим доменом, можно оценивать по конкуренции между этими антигенсвязывающими доменами за один и тот же эпитоп.Конкуренцию между антигенсвязывающими доменами определяют путем анализа перекрестной блокады или с помощью аналогичного анализа. Например, предпочтительным анализом перекрестной блокады является конкурентный ELISA-анализ.Whether an anti-IL-6R antigen-binding domain shares an epitope with any antigen-binding domain can be assessed by competition between these antigen-binding domains for the same epitope. Competition between antigen-binding domains is determined by a cross-blockade assay or similar assay. For example, a preferred cross-blockade assay is a competitive ELISA assay.

В частности, при осуществлении анализа перекрестной блокады белок IL-6R, иммобилизованный в лунках титрационного микропланшета, предварительно инкубируют в присутствии антигенсвязывающего домена, рассматриваемого в качестве конкурента-кандидата, или без него. Затем вносят тестируемый антигенсвязывающий домен. Количество связанного с белком IL-6R тестируемого антигенсвязывающего домена в лунках находится в обратной корреляции с активностью связывания антигенсвязывающего домена, рассматриваемого в качестве конкурента-кандидата, который конкурирует за связывание с этим же эпитопом. В целом, это означает, что чем выше аффинность антигенсвязывающего домена, рассматриваемого в качестве конкурента-кандидата, к одному и тому же эпитопу, тем ниже активность связывания тестируемого антигенсвязывающего домена с сенсибилизированными белком IL-6R лунками.In particular, in a cross-blockade assay, IL-6R protein immobilized in the wells of a microtiter plate is preincubated with or without a candidate antigen binding domain. The antigen binding domain to be tested is then added. The amount of IL-6R protein-bound test antigen binding domain in the wells is inversely correlated with the binding activity of the candidate antigen binding domain that competes for binding to the same epitope. In general, this means that the higher the affinity of a candidate antigen binding domain for the same epitope, the lower the binding activity of the tested antigen binding domain to IL-6R protein-coated wells.

Количество тестируемого антигенсвязывающего домена, связанного через белок IL-6R с лунками, легко определять путем предварительного мечения антигенсвязывающего домена. Например, меченный биотином антигенсвязывающий домен оценивают с использованием конъюгата авидин/пероксидаза и соответствующего субстрата. В частности, анализ перекрестной блокады, в котором применяют в качестве меток ферменты, такие как пероксидаза, называют «ELISA-анализом в конкурентных условиях (конкурентный анализ)». Антигенсвязывающий домен можно метить также с помощью альтернативных предназначенных для мечения субстанций, которые можно выявлять или оценивать. В частности, в данной области известны радиоактивные метки, флуоресцентные метки и т.п.The amount of test antigen binding domain bound via the IL-6R protein to the wells can be easily determined by pre-labeling the antigen binding domain. For example, a biotin-labeled antigen binding domain is assessed using an avidin/peroxidase conjugate and an appropriate substrate. In particular, a cross-blockade assay that uses enzymes such as peroxidase as labels is called a “competition ELISA.” The antigen binding domain can also be labeled using alternative labeling substances that can be detected or assessed. In particular, radioactive labels, fluorescent labels, and the like are known in the art.

Когда антигенсвязывающий домен, рассматриваемый в качестве конкурента-кандидата, может блокировать связывание антигенсвязывающего домена против IL-6R по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 20-50% и предпочтительно по меньшей мере на 50% по сравнению со связывающей активностью, установленной в контрольном эксперименте, который проводят в отсутствии антигенсвязывающего домена, рассматриваемого в качестве конкурента-кандидата, то считается, что для тестируемого антигенсвязывающего домена характерна выраженная способность к связыванию с тем же эпитопом, с которым связывается антигенсвязывающий домен, рассматриваемый в качестве конкурента, или он конкурирует за связывание с тем же самым эпитопом.When the antigen binding domain considered as a candidate competitor can block the binding of the antigen binding domain against IL-6R by at least 20%, preferably by at least 20-50%, and preferably by at least 50% of the binding activity, established in a control experiment, which is carried out in the absence of the antigen binding domain considered as a candidate competitor, then the antigen binding domain being tested is considered to have a pronounced ability to bind to the same epitope to which the antigen binding domain considered as a competitor binds, or it competes for binding to the same epitope.

Если структура эпитопа, с которым связывается антигенсвязывающий домен против IL-6R, уже идентифицирована, то для решения вопроса о том, имеют ли тестируемый антигенсвязывающий домен и контрольный антигенсвязывающий домен один и тот же эпитоп, можно сравнивать связывающие активности двух указанных антигенсвязывающих доменов с пептидом или полипептидом, полученным путем интродукции аминокислотной мутации в пептид, образующий эпитоп.If the structure of the epitope to which the anti-IL-6R antigen binding domain binds has already been identified, the binding activities of the two antigen binding domains can be compared to the peptide or to determine whether the test antigen binding domain and the control antigen binding domain share the same epitope. a polypeptide obtained by introducing an amino acid mutation into the peptide that forms the epitope.

При осуществлении указанного метода измерения связывающих активностей, например, можно сравнивать связывающие активности тестируемого антигенсвязывающего домена и контрольного антигенсвязывающего домена с линейным пептидом, в который интродуцирована мутация, с помощью описанного выше формата ELISA. Помимо метода ELISA связывающую активность в отношении мутантного пептида, связанного с колонкой, можно определять, пропуская через колонку тестируемый антигенсвязывающий домен и контрольный антигенсвязывающий домен и затем оценивая количество антигенсвязывающего домена, элюированное в раствор для элюции. Известны методы адсорбции мутантного пептида на колонке, например, в форме слитого с GST пептида.In this method of measuring binding activities, for example, it is possible to compare the binding activities of a test antigen binding domain and a control antigen binding domain to a linear peptide into which a mutation has been introduced using the ELISA format described above. In addition to the ELISA method, binding activity for a mutant peptide bound to a column can be determined by passing a test antigen binding domain and a control antigen binding domain through the column and then assessing the amount of antigen binding domain eluted into the elution solution. Methods are known for adsorbing a mutant peptide onto a column, for example in the form of a GST fusion peptide.

Когда идентифицированный эпитоп представляет собой конформационный эпитоп, то для решения вопроса о том, имеют ли тестируемый антигенсвязывающий домен и контрольный антигенсвязывающий домен общий эпитоп, можно применять следующий метод: сначала получают экспрессирующие IL-6R клетки и клетки, экспрессирующие IL-6R с мутацией, интродуцированной в эпитоп. Тестируемый антигенсвязывающий домен и контрольный антигенсвязывающий домен добавляют в клеточные суспензии, полученные путем суспендирования этих клеток в приемлемом буферном растворе, таком как ЗФР. Затем клеточные суспензии соответствующим образом промывают буферным раствором и добавляют меченное с помощью ФИТЦ антитело, которое распознает тестируемый антигенсвязывающий домен и контрольный антигенсвязывающий домен. Определяют интенсивность флуоресценции и количество клеток, окрашенных меченым антителом, используя FACSCalibur (фирма Becton, Dickinson and Company). Тестируемый антигенсвязывающий домен и контрольный антигенсвязывающий домен соответствующим образом разводят приемлемым буферным раствором и применяют в требуемой концентрации. Указанные антигенсвязывающие домены применяют, например, в любой из концентраций от 10 мкг/мл до 10 нг/мл. Интенсивность флуоресценции определяют с помощью анализа, для оценки результатов которого применяют программу CELL QUEST (фирма Becton, Dickinson and Company), а именно, определяют среднее геометрическое значение, которое отражает количество меченого антитела, связанного с клетками. В целом, это означает, что связывающую активность тестируемого антигенсвязывающего домена и контрольного антигенсвязывающего домена, которые характеризуются количеством связанного меченого антитела, можно определять, оценивая среднее геометрическое значение.When the identified epitope is a conformational epitope, the following method can be used to decide whether the test antigen-binding domain and the control antigen-binding domain share a common epitope: first, IL-6R-expressing cells and IL-6R-expressing cells with a mutation introduced into epitope. The test antigen binding domain and the control antigen binding domain are added to cell suspensions obtained by suspending the cells in a suitable buffer solution such as PBS. The cell suspensions are then suitably washed with buffer and an FITC-labeled antibody that recognizes the test antigen binding domain and a control antigen binding domain is added. The fluorescence intensity and number of cells stained with the labeled antibody were determined using FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). The test antigen binding domain and the control antigen binding domain are suitably diluted in a suitable buffer solution and used at the required concentration. These antigen binding domains are used, for example, at any concentration from 10 μg/ml to 10 ng/ml. Fluorescence intensity is determined by an assay using the CELL QUEST program (Becton, Dickinson and Company) to determine the geometric mean value, which reflects the amount of labeled antibody bound to the cells. In general, this means that the binding activity of a test antigen binding domain and a control antigen binding domain, which are characterized by the amount of labeled antibody bound, can be determined by assessing the geometric mean.

Конкуренцию антигенсвязывающего домена с другими антигенсвязывающим доменом за один и тот же эпитоп помимо описанных выше анализов ELISA или FACS можно определять также с помощью анализа связывания несущего радиоактивную метку антигена (РИА), анализа поверхностного плазмонного резонанса BIACORE®, электрогенерированной хемилюминесции или т.п.In addition to the ELISA or FACS assays described above, the competition of an antigen binding domain with other antigen binding domains for the same epitope can also be determined using a radiolabeled antigen binding assay (RIA), a BIACORE® surface plasmon resonance assay, electrogenerated chemiluminescence, or the like.

При осуществлении описанного выше метода для решения вопроса о том, имеет ли место «незначительное связывание с клетками, которые экспрессируют мутантный IL-6R», можно применять, например, следующий метод: сначала тестируемый антигенсвязывающий домен и контрольный антигенсвязывающий домен, связанные с клетками, которые экспрессируют мутантный IL-6R, окрашивают меченым антителом. Затем определяют интенсивность флуоресценции в клетках. Когда для оценки флуоресценции с помощью проточной цитометрии используют FACSCalibur, то полученную интенсивность флуоресценции можно анализировать с помощью программы CELL QUEST. На основе средних геометрических значений в присутствии полипептида, являющегося продуктом ассоциации, и без него можно рассчитывать согласно приведенной ниже формуле I используемое для сравнения значение (ΔGeo-Mean), характеризующее степень увеличения интенсивности флуоресценции в результате связывания с антигенсвязывающим доменом.When implementing the method described above to decide whether there is "negligible binding to cells that express mutant IL-6R", the following method can be used, for example: first test antigen binding domain and control antigen binding domain bound to cells that express mutant IL-6R, stained with labeled antibody. The fluorescence intensity in the cells is then determined. When FACSCalibur is used to evaluate fluorescence by flow cytometry, the resulting fluorescence intensity can be analyzed using the CELL QUEST program. Based on the geometric mean values with and without the association product polypeptide, a comparison value (ΔGeo-Mean), which characterizes the degree of increase in fluorescence intensity resulting from binding to the antigen binding domain, can be calculated according to Formula I below.

(Формула I)(Formula I)

ΔGeo-Mean=Geo-Mean (в присутствии полипептида, являющегося продуктом ассоциации)/Geo-Mean (в отсутствии полипептида, являющегося продуктом ассоциации)ΔGeo-Mean=Geo-Mean (in the presence of the polypeptide that is the product of the association)/Geo-Mean (in the absence of the polypeptide that is the product of the association)

Используемое для сравнения среднее геометрическое значение (значение AGeo-Mean для мутантной молекулы IL-6R), определенное с помощью описанного выше анализа, которое отражает количество тестируемого антигенсвязывающего домена, связанного с клетками, которые экспрессируют мутантный IL-6R, сравнивают с используемым для сравнения значением ΔGeo-Mean, которое отражает количество тестируемого антигенсвязывающего домена, связанного с экспрессирующими IL-6R клетками. В этом случае концентрации тестируемого антигенсвязывающего домена, применяемые для определения используемых для сравнения (относительных) значений ΔGeo-Mean для экспрессирующих IL-6R клеток и клеток, экспрессирующих мутантный IL-6R, наиболее предпочтительно регулируют таким образом, чтобы концентрации были одинаковыми или практически одинаковыми. Антигенсвязывающий домен, для которого уже подтверждена способность распознавать эпитоп в IL-6R, применяют в качестве контрольного антигенсвязывающего домена.The reference geometric mean value (AGeo-Mean value for the mutant IL-6R molecule) determined by the assay described above, which reflects the amount of test antigen binding domain associated with cells that express the mutant IL-6R, is compared with the reference value ΔGeo-Mean, which reflects the amount of test antigen-binding domain associated with IL-6R-expressing cells. In this case, the test antigen binding domain concentrations used to determine the comparative ΔGeo-Mean values for IL-6R expressing cells and mutant IL-6R expressing cells are most preferably adjusted such that the concentrations are the same or substantially the same. An antigen binding domain that has already been proven to recognize an epitope in IL-6R is used as a control antigen binding domain.

Если используемое для сравнения значение ΔGeo-Mean тестируемого антигенсвязывающего домена в отношении клеток, экспрессирующих мутантный IL-6R, ниже чем используемое для сравнения значение ΔGeo-Mean тестируемого антигенсвязывающего домена в отношении клеток, экспрессирующих IL-6R, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 50%, более предпочтительно на 30% и наиболее предпочтительно на 15%, то считают, что тестируемый антигенсвязывающий домен «незначительно связывается с клетками, которые экспрессируют мутантный IL-6R». Формула для определения значения Geo-Mean (среднее геометрическое значение) описана в руководстве по применению программы CELL QUEST (фирма BD biosciences). Эпитоп для тестируемого антигенсвязывающего домена и эпитоп для контрольного антигенсвязывающего домена можно рассматривать как одинаковые, когда путем сравнения установлено, что используемые для сравнения значения являются практически эквивалентными.If the ΔGeo-Mean value of the test antigen binding domain against cells expressing mutant IL-6R is lower than the ΔGeo-Mean value of the test antigen binding domain against cells expressing IL-6R by at least 80%, preferably 50%, more preferably 30%, and most preferably 15%, the antigen binding domain tested is considered to “bind little to cells that express the mutant IL-6R.” The formula for determining the Geo-Mean value is described in the CELL QUEST software manual (BD biosciences). An epitope for a test antigen binding domain and an epitope for a control antigen binding domain may be considered the same when the values used for comparison are determined to be substantially equivalent by comparison.

В настоящем описании понятие «транспортирующий фрагмент» относится к фрагменту, отличному от антигенсвязывающего домена в полипептиде. Транспортирующий фрагмент, предлагаемый в настоящем изобретении, как правило, представляет собой пептид или полипептид, состоящий из аминокислот. В конкретном варианте осуществления изобретения транспортирующий фрагмент представляет собой полипептид, сцепленный с антигенсвязывающим доменом через сайт расщепления. Транспортирующий фрагмент, предлагаемый в настоящем изобретении, может представлять собой серию пептидов или полипептидов, соединенных через амидную(ые) связь(и), или может представлять собой комплекс, образованный из множества пептидов или полипептидов с помощью ковалентной(ых) связи(ей), такой(их) как дисульфидная связь, или нековалентной(ых) связи(ей), такой(их) как водородная связь или гидрофобное взаимодействие.As used herein, the term “transport fragment” refers to a fragment other than the antigen binding domain of a polypeptide. The transport moiety of the present invention is typically a peptide or polypeptide composed of amino acids. In a particular embodiment of the invention, the transport fragment is a polypeptide linked to an antigen binding domain through a cleavage site. The transport moiety of the present invention may be a series of peptides or polypeptides linked via amide bond(s), or may be a complex formed from a plurality of peptides or polypeptides via covalent bond(s), such as a disulfide bond, or non-covalent bond(s), such as a hydrogen bond or a hydrophobic interaction.

Транспортирующий фрагмент, предлагаемый в настоящем изобретении, имеет ингибирующий домен, который ингибирует антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена. В настоящем описании понятие «ингибирующий домен» ограничено только ингибированием антигенсвязывающей активности антигенсвязывающего домена. Ингибирующий домен может представлять собой домен, имеющий любую структуру, если применяемый домен может ингибировать антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена. Примеры указанного ингибирующего домена включают (но, не ограничиваясь только ими) вариабельные области тяжелой цепи антитела (VH), вариабельные области легкой цепи антитела (VL), рецепторы пре-В-клеток и однодоменные антитела. Ингибирующий домен может полностью образовывать транспортирующий фрагмент или может образовывать часть транспортирующего фрагмента.The transport fragment of the present invention has an inhibitory domain that inhibits the antigen binding activity of the antigen binding domain. As used herein, the term “inhibitory domain” is limited to only inhibiting the antigen binding activity of the antigen binding domain. The inhibitory domain can be a domain having any structure as long as the domain used can inhibit the antigen binding activity of the antigen binding domain. Examples of said inhibitory domain include, but are not limited to, antibody heavy chain variable regions (VH), antibody light chain variable regions (VL), pre-B cell receptors, and single domain antibodies. The inhibitory domain may form the entire transport moiety or may form part of the transport moiety.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения высвободившийся из полипептида антигенсвязывающий домен имеет более высокую антигенсвязывающую активность по сравнению с активностью до высвобождения. Другими словами, антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена ингибируется с помощью ингибирующего домена в невысвободившемся из полипептида состоянии антигенсвязывающего домена. Решение вопроса о том, ингибируется ли антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена с помощью ингибирующего домена, осуществляют с помощью такого метода как FACS ((разделение клеток на основе возбуждения флуоресценции), ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), ECL (электрогенерированная хемилюминесция), метод SPR (поверхностный плазмонный резонанс) (система Biacore), BLI (интерферометрия биослоя) (система Octet). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена, высвободившегося из полипептида, имеет величину, равную или превышающую в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 или 3000 раз связывающую активность антигенсвязывающего домена, невысвободившегося из полипептида. В некоторых более конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения связывание антигенсвязывающего домена с антигеном до высвобождения не поддается обнаружению, когда антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена измеряют с помощью одного из методов, выбранного из перечисленных выше методов.In some embodiments of the present invention, the antigen binding domain released from the polypeptide has higher antigen binding activity compared to the activity before release. In other words, the antigen binding activity of the antigen binding domain is inhibited by the inhibitory domain in the non-released state of the antigen binding domain from the polypeptide. The question of whether the antigen binding activity of the antigen binding domain is inhibited by the inhibitory domain is carried out using a method such as FACS (fluorescence excitation-based cell separation), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), ECL (electrogenerated chemiluminescence), SPR (surface Plasmon Resonance (Biacore System), BLI (Biolayer Interferometry) (Octet System) In some embodiments of the present invention, the antigen binding activity of the antigen binding domain released from the polypeptide is equal to or greater than 2, 3, 4, 5, 6. 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 or 3000 times binding activity antigen binding domain not released from the polypeptide In some more specific embodiments of the present invention, binding of the antigen binding domain to an antigen prior to release is undetectable when the antigen binding activity of the antigen binding domain is measured using one of the methods selected from the methods listed above.

В некоторых объектах настоящего изобретения сайт расщепления расщепляется так, что антигенсвязывающий домен приобретает способность высвобождаться из полипептида. Таким образом, в указанных объектах изобретения антигенсвязывающую активность можно сравнивать до и после расщепления полипептида. В частности, антигенсвязывающая активность, измеренная при использовании расщепленного полипептида, имеет величину равную или превышающую в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 или 3000 раз антигенсвязывающую активность, измеренную с использованием нерасщепленного полипептида. В некоторых более конкретных вариантах осуществления изобретения связывание с антигеном антигенсвязывающего домена нерасщепленного полипептида не поддается обнаружению, когда антигенсвязывающую активность измеряют с помощью одного из методов, выбранного из перечисленных выше методов.In some aspects of the present invention, the cleavage site is cleaved such that the antigen binding domain becomes capable of being released from the polypeptide. Thus, in these aspects of the invention, antigen binding activity can be compared before and after cleavage of the polypeptide. Specifically, the antigen binding activity measured using the digested polypeptide is equal to or greater than 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80. 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 or 3000 times the antigen binding activity measured using the uncleaved polypeptide. In some more specific embodiments of the invention, binding to antigen of the antigen binding domain of the uncleaved polypeptide is not detectable when antigen binding activity is measured using one of the methods selected from the methods listed above.

В некоторых объектах настоящего изобретения сайт расщепления расщепляется протеазой. Таким образом, в указанных объектах изобретения антигенсвязывающую активность можно сравнивать до и после обработки полипептида протеазой. В частности, антигенсвязывающая активность, измеренная с использованием полипептида после обработки протеазой, имеет величину равную или превышающую в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 или 3000 раз антигенсвязывающую активность, измеренную с использованием полипептида, не обработанного протеазой. В некоторых более конкретных вариантах осуществления изобретения связывание с антигеном антигенсвязывающего домена необработанного протеазой полипептида не поддается обнаружению, когда антигенсвязывающую активность измеряют с помощью одного из методов, выбранного из перечисленных выше методов.In some aspects of the present invention, the cleavage site is cleaved by a protease. Thus, in these aspects of the invention, antigen binding activity can be compared before and after treatment of the polypeptide with a protease. Specifically, the antigen binding activity measured using the polypeptide after protease treatment is equal to or greater than 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70. 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000 or 3000 times the antigen binding activity measured using the non-protease treated polypeptide. In some more specific embodiments, binding to the antigen of the antigen binding domain of the non-protease-treated polypeptide is undetectable when antigen binding activity is measured using one of the methods selected from the methods listed above.

В настоящем изобретении полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент, имеет более продолжительное время полужизни в крови, чем антигенсвязывающий домен, присутствующий в индивидуальном виде. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения для удлинения времени полужизни полипептида транспортирующий фрагмент создают так, чтобы он имел более продолжительное время полужизни в крови. В указанных вариантах осуществления изобретения примеры подхода, удлиняющего время полужизни в крови транспортирующего фрагмента, включают (но, не ограничиваясь только ими) большую молекулярную массу транспортирующего фрагмента, FcRn-связывающую активность, которой наделен транспортирующий фрагмент, альбуминсвязывающую активность, которой наделен транспортирующий фрагмент, и ПЭГилирование транспортирующего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент имеет более продолжительное время полужизни в крови, чем антигенсвязывающий домен (другими словами, антигенсвязывающий домен имеет более короткое время полужизни в крови, чем транспортирующий фрагмент).In the present invention, the polypeptide containing an antigen binding domain and a transport fragment has a longer half-life in the blood than the antigen binding domain present alone. In some embodiments of the present invention, to prolong the half-life of the polypeptide, the transport moiety is designed to have a longer half-life in the blood. In these embodiments, examples of an approach to extend the blood half-life of the transport moiety include, but are not limited to, the large molecular weight of the transport moiety, the FcRn binding activity imparted to the transport moiety, the albumin binding activity conferred on the transport moiety, and PEGylation of the transporter moiety. In some embodiments of the present invention, the transport moiety has a longer blood half-life than the antigen binding domain (in other words, the antigen binding domain has a shorter blood half-life than the transport moiety).

В настоящем изобретения время полужизни антигенсвязывающего домена индивидуально и полипептида или время полужизни в кровиIn the present invention, the half-life of the antigen binding domain individually and the polypeptide or half-life in the blood

антигенсвязывающего домена и транспортирующего фрагмента предпочтительно сравнивают, как время их полужизни в крови людей. Если время полужизни в крови трудно измерять в организме человека, то его можно прогнозировать на основе времени их полужизни в крови мышей (например, обычных мышей, трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий антиген, и трансгенных мышей, экспрессирующий человеческий FcRn) или обезьян (например, обезьян циномолгус).The antigen binding domain and the transport fragment are preferably compared as their half-lives in human blood. If blood half-lives are difficult to measure in humans, they can be predicted based on their blood half-lives in mice (eg, normal mice, transgenic mice expressing human antigen, and transgenic mice expressing human FcRn) or monkeys (eg, monkeys cynomolgus).

В одном из вариантов осуществления изобретения подход, обеспечивающий удлинение времени полужизни в крови транспортирующего фрагмента, включает применение транспортирующего фрагмента, имеющего большую молекулярную массу. В одном из вариантов осуществления изобретения подход, обеспечивающий более длительное время полужизни транспортирующего фрагмента по сравнению с антигенсвязывающим доменом, включает создание транспортирующего фрагмента, имеющего большую молекулярную массу по сравнению с антигенсвязывающим доменом.In one embodiment of the invention, an approach to prolong the blood half-life of the transporter moiety involves using a transporter moiety having a higher molecular weight. In one embodiment, an approach to provide a longer half-life of the transport moiety compared to the antigen binding domain involves creating a transport moiety that has a higher molecular weight than the antigen binding domain.

В одном из вариантов осуществления изобретения подход, обеспечивающий удлинение времени полужизни в крови транспортирующего фрагмента, включает придание транспортирующему фрагменту FcRn-связывающей активности. Транспортирующий фрагмент можно, как правило, наделять FcRn-связывающей активностью с помощью метода создания FcRn-связывающей области в транспортирующем фрагменте. FcRn-связывающая область означает область, которая обладает связывающей активностью в отношении FcRn, и она может иметь любую структуру, если применяемая область обладает связывающей активностью в отношении FcRn.In one embodiment of the invention, an approach to extend the blood half-life of a transporter moiety involves imparting FcRn binding activity to the transporter moiety. The transport moiety can generally be provided with FcRn binding activity by a method of creating an FcRn binding region in the transport moiety. FcRn-binding region means a region that has binding activity for FcRn, and it can have any structure as long as the region used has binding activity for FcRn.

Транспортирующий фрагмент, содержащий FcRn-связывающую область, обладает способностью проникать в клетки и затем расщепляться в плазме через путь спасения FcRn. Например, молекула IgG имеет относительно продолжительное время циркуляции в плазме (медленно исчезновение), благодаря функции FcRn, известного в качестве рецептора спасения молекулы IgG. Молекула IgG, поглощенная эндосомой посредством пиноцитоза, связывается с FcRn, который экспрессируется в эндосоме в условиях кислой среды внутри эндосомы. Молекула IgG, которая не может связываться с FcRn, передвигается в лизосому и расщепляется в ней, в то время как молекула IgG, связанная с FcRn, переносится на клеточную поверхность, затем отщепляется в результате диссоциации от FcRn в нейтральных условиях в плазме и затем возвращается в плазму.The transport fragment containing the FcRn-binding region has the ability to enter cells and then be degraded in the plasma through the FcRn salvage pathway. For example, the IgG molecule has a relatively long circulation time in plasma (slow disappearance), due to the function of FcRn, known as the rescue receptor of the IgG molecule. The IgG molecule taken up by the endosome through pinocytosis binds to FcRn, which is expressed in the endosome under the acidic conditions within the endosome. An IgG molecule that cannot bind to FcRn moves to the lysosome and is cleaved there, while an IgG molecule bound to FcRn is transported to the cell surface, then dissociated from FcRn under neutral conditions in plasma and then returned to plasma.

FcRn-связывающая область предпочтительно представляет собой область, которая непосредственно связывается с FcRn. Предпочтительные примеры FcRn-связывающей области могут включать Fc-области антител. Однако область, обладающая способностью связываться с полипептидом, таким как альбумин, или IgG, который обладает способностью связываться с FcRn, может непосредственно связываться с FcRn через альбумин, IgG или т.п. Таким образом, FcRn-связывающая область, предлагаемая в настоящем изобретении, может представлять собой область, которая связывается с указанным полипептидом, обладающим FcRn-связывающей способностью.The FcRn-binding region is preferably a region that directly binds to FcRn. Preferred examples of the FcRn binding region may include Fc regions of antibodies. However, a region having the ability to bind to a polypeptide such as albumin or IgG that has the ability to bind to FcRn can directly bind to FcRn through albumin, IgG or the like. Thus, the FcRn-binding region proposed in the present invention may be a region that binds to the specified polypeptide having FcRn-binding ability.

Связывающую активность FcRn-связывающей области, предлагаемой в настоящем изобретении, в отношении FcRn, прежде всего человеческого FcRn, можно измерять с помощью метода, известного специалистам в данной области, который упомянут выше в разделе, в котором описана связывающая активность. Пригодные для этой цели условия могут определять соответственно специалисты в данной области. Связывающую активность в отношении человеческого FcRn можно оценивать в виде KD (константа диссоциации), кажущаяся KD (кажущаяся константа диссоциации), kd (скорость реакции диссоциации) или кажущаяся kd (кажущаяся скорость реакции диссоциации) и т.д. Указанные величины можно измерять методами, известными специалистам в данной области. Например, можно использовать Biacore (фирма GE Healthcare Japan Corp.), метод Скэтчарда, проточные цитометры и т.п.The binding activity of the FcRn binding region of the present invention towards FcRn, especially human FcRn, can be measured using a method known to those skilled in the art, which is mentioned above in the section describing the binding activity. Suitable conditions for this purpose can be determined accordingly by those skilled in the art. The binding activity toward human FcRn can be assessed as KD (dissociation constant), apparent KD (apparent dissociation constant), kd (dissociation reaction rate), or apparent kd (apparent dissociation reaction rate), etc. These quantities can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, Biacore (GE Healthcare Japan Corp.), Scatchard method, flow cytometers, etc. can be used.

Условия измерения связывающей активности FcRn-связывающей области в отношении FcRn не ограничены конкретно, и их могут выбирать соответственно специалисты в данной области. Связывающую активность можно измерять в условиях, включающих, например, MES-буфер при 37°С, как описано, например, в WO 2009/125825. Кроме того, связывающую активность FcRn-связывающей области, предлагаемой в настоящем изобретении, в отношении FcRn можно измерять методом, известным специалистам в данной области, и можно оценивать с использованием, например, Biacore (фирма GE Healthcare Japan Corp.). При измерении связывающей активности FcRn-связывающей области в отношении FcRn можно инъецировать в качестве аналита FcRn и FcRn-связывающую область или транспортирующий фрагмент, содержащий FcRn-связывающую область, на чипы, на которых иммобилизованы FcRn-связывающая область или транспортирующий фрагмент, содержащий FcRn-связывающую область, и FcRn соответственно, с последующей их оценкой.The conditions for measuring the binding activity of the FcRn binding region to FcRn are not particularly limited and can be selected accordingly by those skilled in the art. Binding activity can be measured under conditions including, for example, MES buffer at 37°C, as described, for example, in WO 2009/125825. In addition, the FcRn binding activity of the FcRn binding region of the present invention can be measured by a method known to those skilled in the art and can be assessed using, for example, Biacore (GE Healthcare Japan Corp.). When measuring the binding activity of an FcRn-binding region to FcRn, the FcRn and FcRn-binding region or a transport fragment containing an FcRn-binding region can be injected as an analyte onto chips on which the FcRn-binding region or a transport fragment containing an FcRn-binding region is immobilized. region, and FcRn, respectively, with their subsequent assessment.

Что касается значения рН, применяемого в условиях измерения, то связывающую активность FcRn-связывающей области с FcRn можно оценивать при любом рН от 4,0 до 6,5. Предпочтительно применяют значение рН от 5,8 до 6,0, близкое к рН в ранней эндосоме in vivo, для определения аффинности связывания FcRn-связывающей области с человеческим FcRn. Что касается температуры, применяемой в условиях измерения, то связывающую активность FcRn-связывающей области с FcRn можно оценивать при любой температуре от 10°С до 50°С. Для определения аффинности связывания FcRn-связывающей области с человеческим FcRn применяют предпочтительно температуру от 15°С до 40°С. Более предпочтительно для определения аффинности связывания FcRn-связывающей области с FcRn применяют также любую температуру от 20°С до 35°С, например, любую температуру 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 и 35°С. Согласно настоящему изобретению температура 25°С является одним из не ограничивающих объем изобретения примеров температуры.Regarding the pH value used in the measurement conditions, the binding activity of the FcRn-binding region to FcRn can be assessed at any pH from 4.0 to 6.5. Preferably, a pH value of 5.8 to 6.0, close to the pH of the early endosome in vivo, is used to determine the binding affinity of the FcRn binding region to human FcRn. Regarding the temperature used in the measurement conditions, the binding activity of the FcRn-binding region to FcRn can be assessed at any temperature from 10°C to 50°C. To determine the binding affinity of the FcRn-binding region to human FcRn, a temperature of 15°C to 40°C is preferably used. More preferably, any temperature from 20°C to 35°C is also used to determine the binding affinity of the FcRn binding region to FcRn, for example, any temperature 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34 and 35°C. According to the present invention, a temperature of 25°C is one of the non-limiting examples of temperature.

Один из примеров FcRn-связывающей области включает (но, не ограничиваясь только ею) Fc-область антитела IgG-типа. В случае применения Fc-области антитела IgG-типа, ее тип не ограничен только указанным и можно применять, например, Fc-область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Например, можно применять Fc-область, содержащую одну из последовательностей, выбранную из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 21, 22, 23, и 24.One example of an FcRn-binding region includes, but is not limited to, the Fc region of an IgG-type antibody. When the Fc region of an IgG type antibody is used, its type is not limited to that, and, for example, an IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 Fc region can be used. For example, an Fc region comprising one of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 21, 22, 23, and 24 may be used.

Можно применять нативную Fc-область антитела IgG-типа, а также вариант Fc-области, имеющий одну или несколько аминокислотных замен, если Fc-область обладает FcRn-связывающей активностью.The native Fc region of an IgG antibody can be used, as well as a variant Fc region having one or more amino acid substitutions if the Fc region has FcRn-binding activity.

Например, можно применять вариант Fc-области, который содержит аминокислотную последовательность, полученную из Fc-области антитела IgG-типа путем замены по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из аминокислоты, находящейся в следующих положениях согласно EU-нумерации: 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 и 436, на другую аминокислоту.For example, a variant Fc region can be used that contains an amino acid sequence derived from the Fc region of an IgG antibody by substituting at least one amino acid selected from the amino acid found at the following EU numbering positions: 237, 238, 239, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 270, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 325 , 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 and 436, to another amino acid.

Более конкретно, вариант Fc-области содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из следующих замен:More specifically, the Fc region variant contains at least one amino acid substitution selected from the following substitutions:

аминокислотная замена для замены Gly в положении 237 на Met,amino acid substitution to replace Gly at position 237 with Met,

аминокислотная замена для замены Pro в положении 238 на Ala,amino acid substitution to replace Pro at position 238 with Ala,

аминокислотная замена для замены Ser в положении 239 на Lys,amino acid substitution to replace Ser at position 239 with Lys,

аминокислотная замена для замены Lys в положении 248 на Ile,amino acid substitution to replace Lys at position 248 with Ile,

аминокислотная замена для замены Thr в положении 250 на Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp или Tyr,amino acid substitution to replace Thr at position 250 with Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp or Tyr,

аминокислотная замена для замены Met в положении 252 на Phe, Trp или Tyr,amino acid substitution to replace Met at position 252 with Phe, Trp or Tyr,

аминокислотная замена для замены Ser в положении 254 на Thr,amino acid substitution to replace Ser at position 254 with Thr,

аминокислотная замена для замены Arg в положении 255 на Glu,amino acid substitution to replace Arg at position 255 with Glu,

аминокислотная замена для замены Thr в положении 256 на Asp, Glu или Gln,amino acid substitution to replace Thr at position 256 with Asp, Glu or Gln,

аминокислотная замена для замены Pro в положении 257 на Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr или Val,amino acid substitution to replace Pro at position 257 with Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr or Val,

аминокислотная замена для замены Glu в положении 258 на His,amino acid substitution to replace Glu at position 258 with His,

аминокислотная замена для замены Asp в положении 265 на Ala,amino acid substitution to replace Asp at position 265 with Ala,

аминокислотная замена для замены Asp в положении 270 на Phe,amino acid substitution to replace Asp at position 270 with Phe,

аминокислотная замена для замены Asn в положении 286 на Ala или Glu,amino acid substitution to replace Asn at position 286 with Ala or Glu,

аминокислотная замена для замены Thr в положении 289 на His,amino acid substitution to replace Thr at position 289 with His,

аминокислотная замена для замены Asn в положении 297 на Ala,amino acid substitution to replace Asn at position 297 with Ala,

аминокислотная замена для замены Ser в положении 298 на Gly,amino acid substitution to replace Ser at position 298 with Gly,

аминокислотная замена для замены Val в положении 303 на Ala,amino acid substitution to replace Val at position 303 with Ala,

аминокислотная замена для замены Val в положении 305 на Ala,amino acid substitution to replace Val at position 305 with Ala,

аминокислотная замена для замены Thr в положении 307 на Ala, Asp, Phe,amino acid substitution to replace Thr at position 307 with Ala, Asp, Phe,

Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp или Tyr,Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp or Tyr,

аминокислотная замена для замены Val в положении 308 на Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln или Thr,amino acid substitution to replace Val at position 308 with Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln or Thr,

аминокислотная замена для замены Leu или Val в положении 309 на Ala, Asp, Glu, Pro или Arg,amino acid substitution to replace Leu or Val at position 309 with Ala, Asp, Glu, Pro or Arg,

аминокислотная замена для замены Gln в положении 311 на Ala, His или Ile,amino acid substitution to replace Gln at position 311 with Ala, His or Ile,

аминокислотная замена для замены Asp в положении 312 на Ala или His,amino acid substitution to replace Asp at position 312 with Ala or His,

аминокислотная замена для замены Leu в положении 314 на Lys или Arg,amino acid substitution to replace Leu at position 314 with Lys or Arg,

аминокислотная замена для замены Asn в положении 315 на Ala или His,amino acid substitution to replace Asn at position 315 with Ala or His,

аминокислотная замена для замены Lys в положении 317 на Ala,amino acid substitution to replace Lys at position 317 with Ala,

аминокислотная замена для замены Asn в положении 325 на Gly,amino acid substitution to replace Asn at position 325 with Gly,

аминокислотная замена для замены Не в положении 332 на Val,amino acid change to replace He at position 332 with Val,

аминокислотная замена для замены Lys в положении 334 на Leu,amino acid substitution to replace Lys at position 334 with Leu,

аминокислотная замена для замены Lys в положении 360 на His,amino acid substitution to replace Lys at position 360 with His,

аминокислотная замена для замены Asp в положении 376 на Ala,amino acid substitution to replace Asp at position 376 with Ala,

аминокислотная замена для замены Glu в положении 380 на Ala,amino acid substitution to replace Glu at position 380 with Ala,

аминокислотная замена для замены Glu в положении 382 на Ala,amino acid substitution to replace Glu at position 382 with Ala,

аминокислотная замена для замены Asn или Ser в положении 384 на Ala,amino acid substitution to replace Asn or Ser at position 384 with Ala,

аминокислотная замена для замены Gly в положении 385 на Asp или His,amino acid substitution to replace Gly at position 385 with Asp or His,

аминокислотная замена для замены Gln в положении 386 на Pro,amino acid substitution to replace Gln at position 386 with Pro,

аминокислотная замена для замены Pro в положении 387 на Glu,amino acid substitution to replace Pro at position 387 with Glu,

аминокислотная замена для замены Asn в положении 389 на Ala или Ser,amino acid substitution to replace Asn at position 389 with Ala or Ser,

аминокислотная замена для замены Ser в положении 424 на Ala,amino acid substitution to replace Ser at position 424 with Ala,

аминокислотная замена для замены Met в положении 428 на Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr,amino acid substitution to replace Met at position 428 with Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp or Tyr,

аминокислотная замена для замены His в положении 433 на Lys,amino acid substitution to replace His at position 433 with Lys,

аминокислотная замена для замены Asn в положении 434 на Ala, Phe, His, Ser, Trp или Tyr иamino acid substitution to replace Asn at position 434 with Ala, Phe, His, Ser, Trp or Tyr and

аминокислотная замена для замены Tyr или Phe в положении 436 на His (все согласно EU-нумерации) в Fc-области антитела IgG-типа.amino acid substitution to replace Tyr or Phe at position 436 with His (all according to EU numbering) in the Fc region of an IgG-type antibody.

С другой точки зрения, можно применять Fc-область, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную изFrom another point of view, you can use an Fc region containing at least one amino acid selected from

Met в качестве аминокислоты в положении 237,Met as amino acid at position 237,

Ala в качестве аминокислоты в положении 238,Ala as amino acid at position 238,

Lys в качестве аминокислоты в положении 239,Lys as amino acid at position 239,

Ile в качестве аминокислоты в положении 248,Ile as amino acid at position 248,

Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp или Tyr в качестве аминокислоты в положении 250,Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp or Tyr as amino acid at position 250,

Phe, Trp или Tyr в качестве аминокислоты в положении 252,Phe, Trp or Tyr as amino acid at position 252,

Thr в качестве аминокислоты в положении 254,Thr as amino acid at position 254,

Glu в качестве аминокислоты в положении 255,Glu as amino acid at position 255,

Asp, Glu или Gln в качестве аминокислоты в положении 256,Asp, Glu or Gln as amino acid at position 256,

Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr или Val в качестве аминокислоты в положении 257,Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr or Val as amino acid at position 257,

His в качестве аминокислоты в положении 258,His as amino acid at position 258,

Ala в качестве аминокислоты в положении 265,Ala as amino acid at position 265,

Phe в качестве аминокислоты в положении 270,Phe as amino acid at position 270,

Ala или Glu в качестве аминокислоты в положении 286,Ala or Glu as amino acid at position 286,

His в качестве аминокислоты в положении 289,His as amino acid at position 289,

Ala в качестве аминокислоты в положении 297,Ala as amino acid at position 297,

Gly в качестве аминокислоты в положении 298,Gly as amino acid at position 298,

Ala в качестве аминокислоты в положении 303,Ala as amino acid at position 303,

Ala в качестве аминокислоты в положении 305,Ala as amino acid at position 305,

Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp или Tyr в качестве аминокислоты в положении 307,Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp or Tyr as amino acid at position 307,

Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln или Thr в качестве аминокислоты в положении 308,Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln or Thr as amino acid at position 308,

Ala, Asp, Glu, Pro или Arg в качестве аминокислоты в положении 309,Ala, Asp, Glu, Pro or Arg as amino acid at position 309,

Ala, His или Ile в качестве аминокислоты в положении 311,Ala, His or Ile as amino acid at position 311,

Ala или His в качестве аминокислоты в положении 312,Ala or His as amino acid at position 312,

Lys или Arg в качестве аминокислоты в положении 314,Lys or Arg as amino acid at position 314,

Ala или His в качестве аминокислоты в положении 315,Ala or His as amino acid at position 315,

Ala в качестве аминокислоты в положении 317,Ala as amino acid at position 317,

Gly в качестве аминокислоты в положении 325,Gly as amino acid at position 325,

Val в качестве аминокислоты в положении 332,Val as amino acid at position 332,

Leu в качестве аминокислоты в положении 334,Leu as amino acid at position 334,

His в качестве аминокислоты в положении 360,His as an amino acid at position 360,

Ala в качестве аминокислоты в положении 376,Ala as amino acid at position 376,

Ala в качестве аминокислоты в положении 380,Ala as amino acid at position 380,

Ala в качестве аминокислоты в положении 382,Ala as amino acid at position 382,

Ala в качестве аминокислоты в положении 384,Ala as amino acid at position 384,

Asp или His в качестве аминокислоты в положении 385,Asp or His as amino acid at position 385,

Pro в качестве аминокислоты в положении 386,Pro as amino acid at position 386,

Glu в качестве аминокислоты в положении 387,Glu as amino acid at position 387,

Ala или Ser в качестве аминокислоты в положении 389,Ala or Ser as amino acid at position 389,

Ala в качестве аминокислоты в положении 424,Ala as amino acid at position 424,

Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gin, Ser, Thr, Val, Trp или Tyr в качестве аминокислоты в положении 428,Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gin, Ser, Thr, Val, Trp or Tyr as amino acid at position 428,

Lys в качестве аминокислоты в положении 433,Lys as amino acid at position 433,

Ala, Phe, His, Ser, Trp или Tyr в качестве аминокислоты в положении 434 и His в качестве аминокислоты в положении 436 (все согласно EU-нумерации),Ala, Phe, His, Ser, Trp or Tyr as amino acid at position 434 and His as amino acid at position 436 (all according to EU numbering),

в Fc-области антитела IgG-типа.in the Fc region, IgG-type antibodies.

Тот факт, что транспортирующий фрагмент обладает FcRn-связывающей активностью, не означает, что антигенсвязывающий домен не обладает FcRn-связывающей активностью. В вариантах осуществления изобретения, в которых транспортирующий фрагмент имеет более продолжительное время полужизни в крови, чем антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающий домен, как должно быть очевидно, может не обладать FcRn-связывающей активностью, или антигенсвязывающий домен может обладать FcRn-связывающей активностью, если FcRn-связывающая активность слабее, чем активность транспортирующего фрагмента.The fact that the transport fragment has FcRn-binding activity does not mean that the antigen-binding domain does not have FcRn-binding activity. In embodiments of the invention in which the transport moiety has a longer half-life in the blood than the antigen binding domain, the antigen binding domain may, as will be appreciated, not have FcRn binding activity, or the antigen binding domain may have FcRn binding activity if the FcRn- binding activity is weaker than that of the transport moiety.

В одном из вариантов осуществления изобретения метод удлинения времени полужизни в крови транспортирующего фрагмента включает связывание транспортирующего фрагмента с альбумином. Поскольку альбумин не поддается экскреции почками и обладает FcRn-связывающей способностью, его время полужизни в крови составляет от 17 дней до 19 дней (J Clin Invest. 32 (8), август 1953 г., сс. 746-768). Так, установлено, что белок, связанный с альбумином, становится более объемным и обладает способностью опосредованно связываться с FcRn и поэтому имеет удлиненное время полужизни в крови (Antibodies 4 (3), 2015, сс. 141-156.In one embodiment of the invention, a method for extending the blood half-life of a transport moiety involves binding the transport moiety to albumin. Since albumin is not excreted by the kidneys and has FcRn-binding ability, its half-life in the blood ranges from 17 days to 19 days (J Clin Invest. 32 (8), August 1953, pp. 746-768). Thus, it has been established that the protein associated with albumin becomes more voluminous and has the ability to indirectly bind to FcRn and therefore has an extended half-life in the blood (Antibodies 4 (3), 2015, pp. 141-156.

В одном из вариантов осуществления изобретения альтернативный метод удлинения времени полужизни в крови транспортирующего фрагмента включает ПЭГилирование транспортирующего фрагмента. Считается, что ПЭГилирование белка придает белку объем и подавляет также его расщепление протеазой в крови, тем самым удлиняя время полужизни белка в крови (J Pharm Sci. 97 (10), октябрь 2008 г., сс. 4167-4183).In one embodiment of the invention, an alternative method of extending the blood half-life of the transport moiety involves PEGylation of the transport moiety. PEGylation of a protein is thought to bulk the protein and also inhibit its breakdown by proteases in the blood, thereby extending the half-life of the protein in the blood (J Pharm Sci. 97(10), Oct. 2008, pp. 4167-4183).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент содержит Fc-область антитела. В конкретном варианте осуществления изобретения транспортирующий фрагмент содержит СН2-домен и СН3-домен человеческого антитела IgG-типа. В конкретном варианте осуществления изобретения транспортирующий фрагмент содержит фрагмент, простирающийся от Cys226 или Pro230 тяжелой цепи человеческого антитела IgG1-изотипа до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако C-концевой лизин (Lys447) или глицин-лизин (Gly446-Lys447) Fc-области может присутствовать или может отсутствовать.In some embodiments of the present invention, the transport fragment comprises the Fc region of the antibody. In a specific embodiment of the invention, the transport moiety comprises a CH2 domain and a CH3 domain of a human IgG antibody. In a specific embodiment of the invention, the transport fragment comprises a fragment extending from Cys226 or Pro230 of the heavy chain of a human IgG1 isotype antibody to the carboxyl terminus of the heavy chain. However, the C-terminal lysine (Lys447) or glycine-lysine (Gly446-Lys447) Fc region may or may not be present.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела IgG-типа. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения транспортирующий фрагмент содержит константную область человеческого антитела IgG-типа.In some embodiments of the present invention, the transport moiety comprises an antibody constant region. In a more preferred embodiment of the invention, the transport fragment comprises an IgG-type antibody constant region. In another preferred embodiment of the invention, the transport fragment comprises a constant region of a human IgG antibody.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент содержит: область, практически сходную по структуре с константной областью тяжелой цепи антитела; и область, практически сходную по структуре с легкой цепью антитела, соединенную с областью через ковалентную связь, такую как дисульфидная связь, или нековалентную связь, такую как водородная связь или гидрофобное взаимодействие.In some embodiments of the present invention, the transport moiety comprises: a region substantially similar in structure to the heavy chain constant region of an antibody; and a region substantially similar in structure to the light chain of the antibody, connected to the region through a covalent bond, such as a disulfide bond, or a non-covalent bond, such as a hydrogen bond or a hydrophobic interaction.

В настоящем описании «полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент», как правило, представляет собой серию полипептидов, соединенных через амидную(ые) связь(и), или белок, содержащий множество полипептидов, соединенных через амидную(ые) связи.As used herein, a “polypeptide comprising an antigen binding domain and a transport moiety” is typically a series of polypeptides linked via amide linkage(s), or a protein containing a plurality of polypeptides linked via amide linkage(s).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен обладает способностью высвобождаться из полипептида, и антигенсвязывающий домен, высвободившийся из полипептида, имеет более высокую антигенсвязывающую активность. В настоящем описании понятие «высвобождается» относится к взаимному разделению двух фрагментов полипептида. Высвобождение антигенсвязывающего домена из полипептида может быть связано с упразднением взаимодействия между антигенсвязывающий доменом и транспортирующим фрагментом. Антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена, включенного в полипептид, ингибируется. Следовательно, тот факт, что антигенсвязывающий домен высвободился из полипептида, можно подтверждать путем измерения антигенсвязывающей активности в организме индивидуума и сравнения ее с антигенсвязывающей активностью антигенсвязывающего домена, включенного в полипептид.In some embodiments of the present invention, the antigen binding domain is releasable from the polypeptide, and the antigen binding domain released from the polypeptide has greater antigen binding activity. As used herein, the term “released” refers to the mutual separation of two polypeptide fragments. The release of the antigen binding domain from the polypeptide may be due to the abolition of the interaction between the antigen binding domain and the transport moiety. The antigen binding activity of the antigen binding domain included in the polypeptide is inhibited. Therefore, the fact that the antigen binding domain has been released from the polypeptide can be confirmed by measuring the antigen binding activity in the individual and comparing it with the antigen binding activity of the antigen binding domain included in the polypeptide.

В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид содержит сайт расщепления, и сайт расщепления расщепляется так, чтоIn some embodiments, the polypeptide contains a cleavage site, and the cleavage site is cleaved such that

антигенсвязывающий домен высвобождается из полипептида. Сайт расщепления можно расщеплять, например, ферментом, можно восстанавливать восстановителем или можно подвергать фоторазложению. Сайт расщепления можно помещать в любое положение в полипептиде, если антигенсвязывающий домен может высвобождаться и не утрачивает свою антигенсвязывающую активность после высвобождения. Полипептид может содержать также дополнительный сайт расщепления, отличный от сайт расщепления, предназначенного для высвобождения антигенсвязывающего домена. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сайт расщепления содержит расщепляемую протеазой последовательность и может расщепляться протеазой(амии).the antigen binding domain is released from the polypeptide. The cleavage site can be cleaved, for example, by an enzyme, can be reduced with a reducing agent, or can be photodegraded. The cleavage site can be placed at any position in the polypeptide as long as the antigen binding domain can be released and does not lose its antigen binding activity once released. The polypeptide may also contain an additional cleavage site other than the cleavage site intended to release the antigen binding domain. In one embodiment of the present invention, the cleavage site contains a protease-cleavable sequence and can be cleaved by the protease(s).

В настоящем описании понятие «расщепленные» относится к состоянию, в котором антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент отделены друг от друга после изменения сайта расщепления протеазой, восстановления цистеин-цистеиновой дисульфидной связи в сайте расщепления и/или фотоактивации. В настоящем описании понятие «нерасщепленный» относится к состоянию антигенсвязывающего домена, в котором он сцеплен с транспортирующим фрагментом в отсутствии расщепления протеазой сайта расщепления, в отсутствии восстановления цистеин-цистеиновой дисульфидной связи в сайте расщепления и/или в отсутствии света.As used herein, the term “cleaved” refers to the state in which the antigen binding domain and the transport moiety are separated from each other following modification of the protease cleavage site, reduction of the cysteine-cysteine disulfide bond at the cleavage site, and/or photoactivation. As used herein, the term “uncleaved” refers to the state of the antigen binding domain in which it is linked to the transport moiety in the absence of protease cleavage of the cleavage site, in the absence of reduction of the cysteine-cysteine disulfide bond at the cleavage site, and/or in the absence of light.

Расщепление сайта расщепления можно определять, подвергая раствор, содержащий полипептид, имеющий сайт расщепления, ДСН-ПААГ (электрофорез в полиакриламидном геле) и измеряя молекулярные массы фрагментов или определяя изменения в молекулярной массе до и после расщепления.Cleavage site cleavage can be determined by subjecting a solution containing a polypeptide having a cleavage site to SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) and measuring the molecular weights of the fragments or detecting changes in molecular weight before and after cleavage.

Сайт расщепления может быть специфически модифицирован (расщеплен, восстановлен или расщеплен в результате воздействия света) агентом (т.е. протеазой, восстановителем или светом) со скоростью, составляющей примерно от 0,001 до 1500×10⁴ M^-1c^-1, или по меньшей мере 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250 или 1500×10⁴ M^-1c^-1.The cleavage site may be specifically modified (cleaved, reduced, or cleaved by light) by an agent (ie, protease, reducing agent, or light) at a rate of from about 0.001 to 1500×10 ⁴ M ^-1 s ^-1 , or at least 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250 or 1500×10 ⁴ M ^-1 s ^-1 .

Специфическое расщепление протеазой осуществляют путем контакта между протеазой и сайтом расщепления или молекулой, содержащей сайт расщепления. Сайт расщепления может расщепляться в присутствии достаточной ферментативной активности. Достаточная ферментативная активность может означать способность фермента осуществлять расщепление при контакте с сайтом расщепления.Specific cleavage by a protease is accomplished by contact between the protease and a cleavage site or a molecule containing a cleavage site. The cleavage site can be cleaved in the presence of sufficient enzymatic activity. Sufficient enzymatic activity may indicate the ability of the enzyme to carry out cleavage upon contact with the cleavage site.

В настоящем описании понятие «протеаза» относится к ферменту, такому как эндопептидаза или экзопептидаза, который гидролизует пептидную связь, как правило, эндопептидаза. Протеаза, применяемая в настоящем изобретении, ограничена только способностью расщеплять последовательность, расщепляемую протеазой, и практически не ограничена ее типом. В некоторых вариантах осуществления изобретения применяют специфическую для ткани-мишени протеазу. Специфическая для ткани-мишени протеаза может представлять собой, например, любую из следующих протеаз:As used herein, the term “protease” refers to an enzyme, such as endopeptidase or exopeptidase, that hydrolyzes a peptide bond, typically an endopeptidase. The protease used in the present invention is limited only by the ability to cleave the sequence cleaved by the protease, and is essentially not limited by its type. In some embodiments, a target tissue-specific protease is used. The target tissue-specific protease may be, for example, any of the following proteases:

(1) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в ткани-мишени, чем в здоровой ткани,(1) a protease, which has a higher level of expression in the target tissue than in healthy tissue,

(2) протеазу, которая обладает более высокой активностью в ткани-мишени, чем в здоровой ткани,(2) a protease, which has higher activity in the target tissue than in healthy tissue,

(3) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в клетках-мишенях, чем в здоровой клетке, и(3) a protease, which is expressed at a higher level in target cells than in a healthy cell, and

(4) протеазу, которая обладает более высокой активностью в клетках-мишенях, чем в здоровой клетке.(4) a protease, which has higher activity in target cells than in a healthy cell.

В более конкретном варианте осуществления изобретения применяют специфическую для раковой ткани протеазу или специфическую для воспалительной ткани протеазу.In a more specific embodiment of the invention, a cancer tissue-specific protease or an inflammatory tissue-specific protease is used.

В настоящем описании понятие «ткань-мишень» относится к ткани, содержащей по меньшей мере одну клетку-мишень. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ткань-мишень представляет собой раковую ткань. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ткань-мишень представляет собой воспалительную ткань.As used herein, the term “target tissue” refers to tissue containing at least one target cell. In some embodiments of the present invention, the target tissue is cancerous tissue. In some embodiments of the present invention, the target tissue is inflammatory tissue.

Понятие «раковая ткань» относится к ткани, содержащей по меньшей мере одну раковую клетку. Таким образом, с учетом того, что, например, раковая ткань содержит раковые клетки и кровеносные сосуды, каждый тип клеток, который принимает участие в формировании опухолевой массы, содержащей раковые клетки и эндотелиальные клетки, подпадает под объем настоящего изобретения. В настоящем описании опухолевая масса относится к очагу опухолевой ткани. Понятие «опухоль», как правило, применяют для обозначения доброкачественной неоплазмы или злокачественной неоплазмы.The term "cancer tissue" refers to tissue containing at least one cancer cell. Thus, given that, for example, cancer tissue contains cancer cells and blood vessels, each cell type that participates in the formation of a tumor mass containing cancer cells and endothelial cells falls within the scope of the present invention. As used herein, a tumor mass refers to a nidus of tumor tissue. The term “tumor” is usually used to refer to benign neoplasm or malignant neoplasm.

В настоящем описании примеры «воспалительной ткани» включают:As used herein, examples of “inflammatory tissue” include:

суставную ткань при ревматоидном артрите или остеоартрите,joint tissue in rheumatoid arthritis or osteoarthritis,

легкое (альвеолы) при бронхиальной астме или COPD,lung (alveoli) for bronchial asthma or COPD,

ткань органа пищеварительной системы при воспалительном заболевании кишечника, болезни Крона или неспецифическом язвенном колите,tissue of the digestive system organ with inflammatory bowel disease, Crohn's disease or ulcerative colitis,

фиброзную ткань при фиброзе печени, почки или легкого,fibrous tissue with fibrosis of the liver, kidney or lung,

ткань, образующуюся при отторжении трансплантата органа,tissue formed when an organ transplant is rejected

кровеносный сосуд или сердце (сердечная мышца) при артериосклерозе или сердечной недостаточности,blood vessel or heart (heart muscle) with arteriosclerosis or heart failure,

висцеральную жировую ткань при метаболическом синдроме,visceral adipose tissue in metabolic syndrome,

кожную ткань при атопическом дерматите и других дерматидах, иskin tissue for atopic dermatitis and other dermatids, and

спинномозговой нерв при грыже диска или хроническом люмбаго.spinal nerve with disc herniation or chronic lumbago.

В частности, специфически экспрессируемая или специфически активируемая протеаза или протеаза, которая рассматривается в качестве связанной с болезненным состоянием ткани-мишени (специфическая для ткани-мишени протеаза), известна для некоторых типов тканей-мишеней. Например, в WO 2013/128194, WO 2010/081173 и WO 2009/025846 описана протеаза, специфически экспрессируемая в раковой ткани. Кроме того, в J Inflamm (Lond). 7, 2010, с. 45, Nat Rev Immunol. 6 (7), июль 2006 г., cc. 541-550, Nat Rev Drug Discov. 13 (12), декабрь 2014 г., cc. 904-927, Respir Res. 17, 4 марта 2016 г., с. 23, Dis Model Mech. 7 (2), февраль 2014 г., cc. 193-203 и Biochim Biophys Acta. 1824 (1), январь 2012 г., cc. 133-145 описана протеаза, которая, как считается, связана с воспалением.In particular, a specifically expressed or specifically activated protease or a protease that is considered to be associated with a disease state of the target tissue (target tissue-specific protease) is known for certain types of target tissues. For example, WO 2013/128194, WO 2010/081173 and WO 2009/025846 describe a protease specifically expressed in cancer tissue. Also in J Inflamm (Lond). 7, 2010, p. 45, Nat Rev Immunol. 6(7), July 2006, cc. 541-550, Nat Rev Drug Discov. 13(12), December 2014, cc. 904-927, Respir Res. 17, March 4, 2016, p. 23, Dis Model Mech. 7(2), February 2014, cc. 193-203 and Biochim Biophys Acta. 1824(1), January 2012, cc. 133-145 describe a protease that is thought to be associated with inflammation.

Помимо протеазы, специфически экспрессируемой в ткани-мишени, существует также протеаза, специфически активируемая в ткани-мишени. Например, протеаза может экспрессироваться в неактивной форме и затем превращаться в активную форму. Многие ткани содержат субстанцию, ингибирующую активную протеазу и контролирующую активность в результате процесса активации и присутствия ингибитора (Nat Rev Cancer. 3 (7), июль 2003 г., cc. 489-501). В ткани-мишени активная протеаза может специфически активироваться, избегая ингибирования.In addition to the protease specifically expressed in the target tissue, there is also a protease that is specifically activated in the target tissue. For example, a protease may be expressed in an inactive form and then converted to an active form. Many tissues contain a substance that inhibits the active protease and controls the activity as a result of the activation process and the presence of the inhibitor (Nat Rev Cancer. 3 (7), July 2003, cc. 489-501). In the target tissue, the active protease can be specifically activated, avoiding inhibition.

Активную протеазу можно оценивать путем применения метода с использованием антитела, распознающего активную протеазу (PNAS 110 (1), 2 января 2013 г., сс. 93-98), или метода с использованием флуоресцентно меченного пептида, распознаваемого протеазой, флуоресцентность которого гасится перед расщеплением, но испускается после расщепления (Nat Rev Drug Discov. 9 (9), сентябрь 2010, сс. 690-701. doi: 10.1038/nrd3053).Active protease can be assessed using a method using an antibody that recognizes the active protease (PNAS 110 (1), 2 January 2013, pp. 93-98), or a method using a fluorescently labeled peptide recognized by the protease, the fluorescence of which is quenched before cleavage , but is emitted after cleavage (Nat Rev Drug Discov. 9 (9), September 2010, pp. 690-701. doi: 10.1038/nrd3053).

Согласно одной из точек зрения понятие «специфическая для ткани-мишени протеаза» может относиться к любой из следующих протеаз:According to one view, the term "target tissue-specific protease" can refer to any of the following proteases:

(I) протеаза, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в ткани-мишени, чем в здоровой ткани,(I) a protease that has a higher level of expression in the target tissue than in healthy tissue,

(II) протеаза, которая обладает более высокой активностью в ткани-мишени, чем в здоровой ткани,(ii) a protease that has higher activity in the target tissue than in healthy tissue,

(III) протеаза, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в клетке-мишени, чем в здоровой клетке, и(III) a protease that is expressed at a higher level in the target cell than in a healthy cell, and

(IV) протеаза, которая обладает более высокой активностью в клетке-мишени, чем в здоровой клетке.(IV) a protease that has higher activity in the target cell than in a healthy cell.

Конкретные примеры протеазы включают (но, не ограничиваясь только ими) цистеиновую протеазу (включая семейства катепсина В, L, S и т.д.), аспартилпротеазу (катепсины D, Е, K, О и т.д.), сериновую протеазу (включая матриптазу (в том числе MT-SP1), катепсины А и G, тромбин, плазмин, урокиназу (uPA), тканевый активатор плазминогена (tPA), эластазу, протеиназу 3, тромбин, калликреин, триптазу и химазу), металлопротеиназы (металлопротеиназы (ММР 1-28), включая как связанные с мембраной формы (ММР 14-17 и ММР 24-25), так и секретируемые формы (ММР 1-13, ММР 18-23 и ММР 26-28), дизинтегрин А и металлопротеиназы (ADAM), дизинтегрин А и металлопротеиназу с мотивами тромбоспондина (ADAMTS), меприн (меприн альфа и меприн бета), CD10 (CALLA), простатический антиген (PSA), легумаин, TMPRSS3, TMPRSS4, эластазу нейтрофилов (HNE), бета секретазу (ВАСЕ), фибробласт-активирующий белок альфа (FAP), гранзим В, гуанидинобензоатазу (GB), гепсин, неприлизин, NS3/4A, HCV-NS3/4, калпаин, ADAMDEC1, ренин, катепсин С, катепсин V/L2, катепсин X/Z/P, крузипаин, отубаин 2, родственные калликреину пептидазы (KLK) (KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK10, KLK11, KLK13 и KLK14)), белок, участвующий в остеогенезе 1 (ВМР-1), активированный белок С, связанные с коагуляцией крови протеазы (фактор VIIa, фактор IXa, фактор Ха, фактор XIa и фактор XIIa), HtrA1, лактоферрин, марапсин, РАСЕ4, DESC1, дипептидилпептидазу 4 (DPP-4), TMPRSS2, катепсин F, катепсин H, катепсин L2, катепсин О, катепсин S, гранзим А, гепсин, калпаин 2, глутаматкарбоксипептидазу 2, AMSH-подобные протеазы, AMSH, гамма секретазу, антиплазминрасщепляющий фермент (АРСЕ), децисин 1, фермент, подобный N-ацетилированной альфа-связанной кислой дипептидазе 1 (NAALADL1), и фурин.Specific examples of protease include, but are not limited to, cysteine protease (including cathepsin B, L, S, etc. families), aspartyl protease (cathepsins D, E, K, O, etc.), serine protease ( including matriptase (including MT-SP1), cathepsins A and G, thrombin, plasmin, urokinase (uPA), tissue plasminogen activator (tPA), elastase, proteinase 3, thrombin, kallikrein, tryptase and chymase), metalloproteinases (metalloproteinases ( MMP 1-28), including both membrane-bound forms (MMP 14-17 and MMP 24-25) and secreted forms (MMP 1-13, MMP 18-23 and MMP 26-28), disintegrin A and metalloproteinases ( ADAM), disintegrin A and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS), meprin (meprin alpha and meprin beta), CD10 (CALLA), prostate antigen (PSA), legumain, TMPRSS3, TMPRSS4, neutrophil elastase (HNE), beta secretase (BACE ), fibroblast-activating protein alpha (FAP), granzyme B, guanidinobenzoatase (GB), hepsin, neprilysin, NS3/4A, HCV-NS3/4, calpain, ADAMDEC1, renin, cathepsin C, cathepsin V/L2, cathepsin X/ Z/P, cruzipain, otubain 2, kallikrein-related peptidases (KLK) (KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK10, KLK11, KLK13 and KLK14)), osteogenesis protein 1 (BMP-1), activated protein C, blood coagulation-associated proteases (factor VIIa, factor IXa, factor Xa, factor XIa and factor XIIa), HtrA1, lactoferrin, marapsin, PACE4, DESC1, dipeptidyl peptidase 4 (DPP-4), TMPRSS2, cathepsin F, cathepsin H, cathepsin L2, cathepsin O, cathepsin S, granzyme A, hepsin, calpain 2, glutamate carboxypeptidase 2, AMSH-like proteases, AMSH, gamma secretase, antiplasmin cleaving enzyme (APCE), decisin 1, N-acetylated alpha-linked enzyme acid dipeptidase 1 (NAALADL1), and furin.

Согласно другой точке зрения понятие «специфическая для ткани-мишени протеаза» может относиться к специфической для раковой ткани протеазе или специфической для воспалительной ткани протеазе.According to another view, the term “target tissue-specific protease” may refer to a cancer tissue-specific protease or an inflammatory tissue-specific protease.

Примеры специфической для раковой ткани протеазы включают протеазу, которая специфически экспрессируется в раковой ткани, описанную в WO 2013/128194, WO 2010/081173 и WO 2009/025846.Examples of cancer tissue-specific protease include the protease that is specifically expressed in cancer tissue described in WO 2013/128194, WO 2010/081173 and WO 2009/025846.

Касательно типа специфической для раковой ткани протеазы обработка протеазой, которая обладает более высокой специфичностью экспрессии в раковой ткани, является более эффективной для снижения побочных действий. Предпочтительная специфическая для раковой ткани протеаза имеет концентрацию в раковой ткани, превышающую в 5 раз или более, более предпочтительно в 10 раз или более, еще более предпочтительно в 500 раз или более, наиболее предпочтительно в 1000 раз или более, ее концентрацию в здоровой ткани. Кроме того, предпочтительная специфическая для раковой ткани протеаза имеет активность в раковой ткани, превышающую в 2 раза или более, более предпочтительно в 3 раза или более, в 4 раза или более, в 5 раз или более или в 10 раз или более, еще более предпочтительно в 100 раз или более, особенно предпочтительно в 500 раз или более, наиболее предпочтительно в 1000 раз или более ее активность в здоровых тканях.Regarding the type of cancer tissue-specific protease, treatment with a protease that has higher specificity for expression in cancer tissue is more effective in reducing side effects. A preferred cancer tissue-specific protease has a concentration in cancer tissue that is 5 times or more, more preferably 10 times or more, even more preferably 500 times or more, most preferably 1000 times or more, its concentration in healthy tissue. In addition, the preferred cancer tissue-specific protease has activity in cancer tissue that is 2 times or more, more preferably 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, or 10 times or more, even more preferably 100 times or more, especially preferably 500 times or more, most preferably 1000 times or more its activity in healthy tissues.

Специфическая для раковой ткани протеаза может находиться в форме, связанной с мембраной раковой клетки, или может находиться в секретируемой внеклеточной форме, не связанной с клеточной мембраной. Когда специфическая для раковой ткани протеаза не связана с мембраной раковой клетки, то предпочтительной для опосредуемой иммуноцитами цитотоксичности является специфичность в отношении раковых клеток, поскольку специфическая для раковой ткани протеаза должна присутствовать в раковой ткани или в непосредственной близости от нее. В настоящем описании понятие «в непосредственной близости от раковой ткани» означает местоположение, в котором расщепляемая протеазой последовательность, специфическая для раковой ткани, расщепляется таким образом, чтобы антигенсвязывающий домен проявлял антигенсвязывающую активность. Однако предпочтительно, чтобы повреждение здоровых клеток в данном местоположении было минимизировано.The cancer tissue-specific protease may be in a form associated with the cancer cell membrane or may be in a secreted extracellular form not associated with the cell membrane. When the cancer tissue-specific protease is not bound to the cancer cell membrane, cancer cell specificity is preferred for immunocyte-mediated cytotoxicity because the cancer tissue-specific protease must be present in or in close proximity to the cancer tissue. As used herein, “in the vicinity of cancer tissue” means the location at which a protease-cleavable sequence specific for cancer tissue is cleaved such that the antigen binding domain exhibits antigen binding activity. However, it is preferable that damage to healthy cells in a given location be minimized.

Согласно альтернативной точки зрения специфическая для раковой ткани протеаза представляет собой любую из следующих протеаз:According to an alternative view, the cancer tissue-specific protease is any of the following proteases:

(I) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в раковой ткани, чем в здоровой ткани,(I) a protease, which is expressed at a higher level in cancer tissue than in healthy tissue,

(II) протеазу, которая обладает более высокой активностью в раковой ткани, чем в здоровых ткани,(ii) a protease, which has higher activity in cancerous tissue than in healthy tissue,

(III) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в раковой клетке, чем в здоровой клетке, и(iii) a protease, which is expressed at a higher level in a cancer cell than in a healthy cell, and

(IV) протеазу, которая обладает более высокой активностью в раковой клетке, чем в здоровой клетке.(IV) a protease, which has higher activity in a cancer cell than in a healthy cell.

Один тип специфической для раковой ткани протеазы можно применять индивидуально или можно объединять два или большее количество типов специфических для раковой ткани протеаз. Количество типов специфической для раковой ткани протеазы могут определять соответственно специалисты в данной области с учетом типа рака, подлежащего лечению.One type of cancer tissue-specific protease can be used individually, or two or more types of cancer tissue-specific proteases can be combined. The number of types of cancer tissue-specific protease can be determined accordingly by those skilled in the art based on the type of cancer to be treated.

Исходя из указанных точек зрения, специфическая для раковой ткани протеаза предпочтительно представляет собой сериновые протеазы или металлопротеиназы, более предпочтительно матриптазы (включая MT-SP1), урокиназу (uPA) или металлопротеиназы, предпочтительно также MT-SP1, uPA, ММР-2 или ММР-9, из перечисленных выше протеаз.From these points of view, the cancer tissue-specific protease is preferably a serine protease or metalloproteinase, more preferably matriptase (including MT-SP1), urokinase (uPA) or metalloproteinase, preferably also MT-SP1, uPA, MMP-2 or MMP-2. 9, from the proteases listed above.

Касательно типа специфической для воспалительной ткани протеазы обработка протеазой, которая обладает более высокой специфичностью экспрессии в воспалительной ткани, является более эффективной для снижения побочных действий. Предпочтительная специфическая для воспалительной ткани протеаза имеет концентрацию в воспалительной ткани, превышающую в 5 раз или более, более предпочтительно в 10 раз или более, еще более предпочтительно в 500 раз или более, наиболее предпочтительно в 1000 раз или более, ее концентрацию в здоровой ткани. Кроме того, предпочтительная специфическая для воспалительной ткани протеаза имеет активность в воспалительной ткани, превышающую в 2 раза или более, более предпочтительно в 3 раза или более, в 4 раза или более, в 5 раз или более или в 10 раз или более, еще более предпочтительно в 100 раз или более, особенно предпочтительно в 500 раз или более, наиболее предпочтительно в 1000 раз или более ее активность в здоровых тканях.Regarding the type of inflammatory tissue-specific protease, treatment with a protease that has a higher expression specificity in inflammatory tissue is more effective in reducing side effects. A preferred inflammatory tissue-specific protease has a concentration in inflammatory tissue that is 5 times or more, more preferably 10 times or more, even more preferably 500 times or more, most preferably 1000 times or more, its concentration in healthy tissue. In addition, the preferred inflammatory tissue-specific protease has an activity in inflammatory tissue of 2 times or more, more preferably 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, or 10 times or more, even more preferably 100 times or more, especially preferably 500 times or more, most preferably 1000 times or more its activity in healthy tissues.

Специфическая для воспалительной ткани протеаза может находиться в форме, связанной с мембраной воспалительной клетки, или может находиться в секретируемой внеклеточной форме, не связанной с клеточной мембраной. Когда специфическая для воспалительной ткани протеаза не связана с мембраной воспалительной клетки, то предпочтительной для опосредуемой иммуноцитами цитотоксичности является специфичность в отношении воспалительных клеток, поскольку специфическая для воспалительной ткани протеаза должна присутствовать в воспалительной ткани или в непосредственной близости от нее. В настоящем описании понятие «в непосредственной близости от воспалительной ткани» означает местоположение, в котором расщепляемая протеазой последовательность, специфическая для воспалительной ткани, расщепляется таким образом, чтобы антигенсвязывающий домен проявлял антигенсвязывающую активность. Однако предпочтительно, чтобы повреждение здоровых клеток в данном местоположении было минимизировано.The inflammatory tissue-specific protease may be in a form associated with the inflammatory cell membrane or may be in a secreted extracellular form not associated with the cell membrane. When the inflammatory tissue-specific protease is not bound to the inflammatory cell membrane, inflammatory cell specificity is preferred for immunocyte-mediated cytotoxicity because the inflammatory tissue-specific protease must be present in or in close proximity to the inflammatory tissue. As used herein, the term “in the vicinity of inflammatory tissue” means the location at which a protease-cleavable sequence specific for inflammatory tissue is cleaved such that the antigen binding domain exhibits antigen binding activity. However, it is preferable that damage to healthy cells in a given location be minimized.

Согласно альтернативной точки зрения специфическая для воспалительной ткани протеаза представляет собой любую из следующих протеаз:According to an alternative view, the inflammatory tissue-specific protease is any of the following proteases:

(I) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в воспалительной ткани, чем в здоровой ткани,(i) a protease, which is expressed at a higher level in inflammatory tissue than in healthy tissue,

(II) протеазу, которая обладает более высокой активностью в воспалительной ткани, чем в здоровых ткани,(ii) a protease, which has higher activity in inflammatory tissue than in healthy tissue,

(III) протеазу, которая отличается более высоким уровнем экспрессии в воспалительной клетке, чем в здоровой клетке, и(iii) a protease, which is expressed at a higher level in the inflammatory cell than in the healthy cell, and

(IV) протеазу, которая обладает более высокой активностью в воспалительной клетке, чем в здоровой клетке.(IV) a protease, which has higher activity in an inflammatory cell than in a healthy cell.

Один тип специфической для воспалительной ткани протеазы можно применять индивидуально или можно объединять два или большее количество типов специфических для воспалительной ткани протеаз. Количество типов специфической для воспалительной ткани протеазы могут определять соответственно специалисты в данной области с учетом патологического состояния, подлежащего лечению.One type of inflammatory tissue-specific protease may be used individually, or two or more types of inflammatory tissue-specific proteases may be combined. The number of types of inflammatory tissue-specific protease can be determined accordingly by those skilled in the art, taking into account the pathological condition to be treated.

Исходя из указанных точек зрения, специфическая для воспалительной ткани протеаза предпочтительно из перечисленных выше протеаз представляет собой металлопротеиназу. Металлопротеиназа более предпочтительно представляет собой ADAMTS5, ММР-2, ММР-7, ММР-9 или ММР-13.From these points of view, the inflammatory tissue-specific protease is preferably one of the above proteases and is a metalloproteinase. The metalloproteinase is more preferably ADAMTS5, MMP-2, MMP-7, MMP-9 or MMP-13.

Расщепляемая протеазой последовательность представляет собой конкретную аминокислотную последовательность, которая специфически распознается специфической для ткани-мишени протеазой, когда полипептид гидролизуется специфической для ткани-мишени протеазой в водном растворе.The protease cleavable sequence is a specific amino acid sequence that is specifically recognized by a target tissue-specific protease when the polypeptide is hydrolyzed by the target tissue-specific protease in an aqueous solution.

Расщепляемая протеазой последовательность предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность, которая гидролизуется с высокой специфичностью протеазой, специфической для ткани-мишени, более специфически экспресируемой в ткани-мишени или клетках-мишенях, подлежащих обработке, или более специфически активируемой в ткани/клетках-мишенях, подлежащих обработке, с точки зрения снижения побочных действий.The protease-cleavable sequence is preferably an amino acid sequence that is hydrolyzed with high specificity by a protease that is specific to the target tissue, more specifically expressed in the target tissue or cells to be treated, or more specifically activated in the target tissue/cells to be treated , from the point of view of reducing side effects.

Конкретные примеры расщепляемой протеазой последовательности включают последовательности-мишени, которые специфически гидролизуются с помощью указанной выше протеазы, специфически экспрессируемой в раковой ткани, которые описаны в WO 2013/128194, WO 2010/081173 и WO 2009/025846, специфической для воспалительной ткани протеазой и т.п. Можно применять также последовательность, искусственно измененную, например, путем соответствующей интродукции аминокислотной мутации в последовательность-мишень, которая специфически гидролизуется известной протеазой. Альтернативно этому, можно применять расщепляемую протеазой последовательность, идентифицированную с помощью метода, известного специалистам в данной области, который описан в Nature Biotechnology 19, 2001, сс. 661-667.Specific examples of protease-cleavable sequences include target sequences that are specifically hydrolyzed by the above protease specifically expressed in cancer tissue, which are described in WO 2013/128194, WO 2010/081173 and WO 2009/025846, an inflammatory tissue-specific protease, etc. .P. It is also possible to use a sequence that has been artificially altered, for example by appropriately introducing an amino acid mutation into the target sequence, which is specifically hydrolyzed by a known protease. Alternatively, a protease-cleavable sequence identified by a method known to those skilled in the art as described in Nature Biotechnology 19, 2001, pp. can be used. 661-667.

Кроме того, можно применять встречающуюся в естественных условиях расщепляемую протеазой последовательность. Например, TGFβ превращают в латентную форму путем расщепления протеазой. Аналогично этому, можно применять расщепляемую протеазой последовательность в белке, который изменяет молекулярную форму при расщеплении протеазой.In addition, a naturally occurring protease cleavable sequence may be used. For example, TGFβ is converted to a latent form by protease cleavage. Likewise, it is possible to employ a protease-cleavable sequence in a protein that changes molecular shape when cleaved by the protease.

Примеры расщепляемой протеазой последовательности, которую можно применять, включают (но, не ограничиваясь только ими) последовательности, описанные в WO 2015/116933, WO 2015/048329, WO 2016/118629, WO 2016/179257, WO 2016/179285, WO 2016/179335, WO 2016/179003, WO 2016/046778, WO 2016/014974, в публикациях патентов США US 2016/0289324, US 2016/0311903, в PNAS 97, 2000, сс. 7754-7759, Biochemical Journal 426, 2010, сс. 219-228 и Beilstein J Nanotechnol. 7, 2016, сс. 364-373.Examples of protease cleavable sequences that may be used include, but are not limited to, those described in WO 2015/116933, WO 2015/048329, WO 2016/118629, WO 2016/179257, WO 2016/179285, WO 2016/ 179335, WO 2016/179003, WO 2016/046778, WO 2016/014974, in US patent publications US 2016/0289324, US 2016/0311903, in PNAS 97, 2000, ss. 7754-7759, Biochemical Journal 426, 2010, pp. 219-228 and Beilstein J Nanotechnol. 7, 2016, ss. 364-373.

Расщепляемая протеазой последовательность более предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность, которая специфически гидролизуется с помощью приемлемой для ткани-мишени специфической протеазы, упомянутой выше. Аминокислотная последовательность, которая специфически гидролизуется с помощью специфической для ткани-мишени протеазы, предпочтительно представляет собой любую из следующих аминокислотных последовательностей:The protease-cleavable sequence is more preferably an amino acid sequence that is specifically hydrolyzed by the target tissue-acceptable specific protease mentioned above. The amino acid sequence that is specifically hydrolyzed by a target tissue-specific protease is preferably any of the following amino acid sequences:

LSGRSDNH (SEQ ID NO: 12, расщепляемая MT-SP1 или uPA),LSGRSDNH (SEQ ID NO: 12, cleavable MT-SP1 or uPA),

PLGLAG (SEQ ID NO: 25, расщепляемая ММР-2 или ММР-9) иPLGLAG (SEQ ID NO: 25, cleavable MMP-2 or MMP-9) and

VPLSLTMG (SEQ ID NO: 26, расщепляемая ММР-7).VPLSLTMG (SEQ ID NO: 26, MMP-7 cleavable).

Любую из приведенных ниже последовательностей можно применять также в качестве расщепляемой протеазой последовательности:Any of the following sequences can also be used as a protease cleavable sequence:

TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 74, расщепляемая MT-SP1 или uPA),TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 74, cleavable MT-SP1 or uPA),

ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 75, расщепляемая MT-SP1 или uPA),ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 75, cleavable MT-SP1 or uPA),

AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 76, расщепляемая MT-SP1 или uPA),AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 76, cleavable MT-SP1 or uPA),

GAGVPMSMRGGAG (SEQ ID NO: 77, расщепляемая MMP-1),GAGVPMSMRGGAG (SEQ ID NO: 77, MMP-1 cleavable),

GAGIPVSLRSGAG (SEQ ID NO: 78, расщепляемая MMP-2),GAGIPVSLRSGAG (SEQ ID NO: 78, MMP-2 cleavable),

GPLGIAGQ (SEQ ID NO: 79, расщепляемая MMP-2),GPLGIAGQ (SEQ ID NO: 79, MMP-2 cleavable),

GGPLGMLSQS (SEQ ID NO: 80, расщепляемая MMP-2),GGPLGMLSQS (SEQ ID NO: 80, MMP-2 cleavable),

PLGLWA (SEQ ID NO: 81, расщепляемая MMP-2),PLGLWA (SEQ ID NO: 81, MMP-2 cleavable),

GAGRPFSMIMGAG (SEQ ID NO: 82, расщепляемая MMP-3),GAGRPFSMIMGAG (SEQ ID NO: 82, MMP-3 cleavable),

GAGVPLSLTMGAG (SEQ ID NO: 83, расщепляемая MMP-7),GAGVPLSLTMGAG (SEQ ID NO: 83, MMP-7 cleavable),

GAGVPLSLYSGAG (SEQ ID NO: 84, расщепляемая MMP-9),GAGVPLSLYSGAG (SEQ ID NO: 84, MMP-9 cleavable),

AANLRN (SEQ ID NO: 85, расщепляемая MMP-11),AANLRN (SEQ ID NO: 85, MMP-11 cleavable),

AQAYVK (SEQ ID NO: 86, расщепляемая MMP-11),AQAYVK (SEQ ID NO: 86, MMP-11 cleavable),

AANYMR (SEQ ID NO: 87, расщепляемая MMP-11),AANYMR (SEQ ID NO: 87, MMP-11 cleavable),

AAALTR (SEQ ID NO: 88, расщепляемая MMP-11),AAALTR (SEQ ID NO: 88, MMP-11 cleavable),

AQNLMR (SEQ ID NO: 89, расщепляемая MMP-11),AQNLMR (SEQ ID NO: 89, MMP-11 cleavable),

AANYTK (SEQ ID NO: 90, расщепляемая MMP-11),AANYTK (SEQ ID NO: 90, MMP-11 cleavable),

GAGPQGLAGQRGIVAG (SEQ ID NO: 91, расщепляемая MMP-13),GAGPQGLAGQRGIVAG (SEQ ID NO: 91, MMP-13 cleavable),

PRFKIIGG (SEQ ID NO: 92, расщепляемая проурокиназой),PRFKIIGG (SEQ ID NO: 92, prourokinase cleavable),

PRFRIIGG (SEQ ID NO: 93, расщепляемая проурокиназой),PRFRIIGG (SEQ ID NO: 93, prourokinase cleavable),

GAGSGRSAG (SEQ ID NO: 94, расщепляемая uPA),GAGSGRSAG (SEQ ID NO: 94, uPA cleavable),

SGRSA (SEQ ID NO: 95, расщепляемая uPA),SGRSA (SEQ ID NO: 95, cleaved uPA),

GSGRSA (SEQ ID NO: 96, расщепляемая uPA),GSGRSA (SEQ ID NO: 96, uPA cleavable),

SGKSA (SEQ ID NO: 97, расщепляемая uPA),SGKSA (SEQ ID NO: 97, uPA cleavable),

SGRSS (SEQ ID NO: 98, расщепляемая uPA),SGRSS (SEQ ID NO: 98, uPA cleavable),

SGRRA (SEQ ID NO: 99, расщепляемая uPA),SGRRA (SEQ ID NO: 99, uPA cleavable),

SGRNA (SEQ ID NO: 100, расщепляемая uPA),SGRNA (SEQ ID NO: 100, uPA-cleavable),

SGRKA (SEQ ID NO: 101, расщепляемая uPA),SGRKA (SEQ ID NO: 101, cleaved uPA),

QRGRSA (SEQ ID NO: 102, расщепляемая tPA),QRGRSA (SEQ ID NO: 102, tPA cleavable),

GAGSLLKSRMVPNFNAG (SEQ ID NO: 103, расщепляемая катепсином В)GAGSLLKSRMVPNFNAG (SEQ ID NO: 103, cathepsin B cleavable)

TQGAAA (SEQ ID NO: 104, расщепляемая катепсином В),TQGAAA (SEQ ID NO: 104, cathepsin B cleavable),

GAAAAA (SEQ ID NO: 105, расщепляемая катепсином В),GAAAAA (SEQ ID NO: 105, cathepsin B cleavable),

GAGAAG (SEQ ID NO: 106, расщепляемая катепсином В),GAGAAG (SEQ ID NO: 106, cathepsin B cleavable),

AAAAAG (SEQ ID NO: 107, расщепляемая катепсином В),AAAAAG (SEQ ID NO: 107, cathepsin B cleavable),

LCGAAI (SEQ ID NO: 108, расщепляемая катепсином В),LCGAAI (SEQ ID NO: 108, cathepsin B cleavable),

FAQALG (SEQ ID NO: 109, расщепляемая катепсином В),FAQALG (SEQ ID NO: 109, cathepsin B cleavable),

LLQANP (SEQ ID NO: 110, расщепляемая катепсином В),LLQANP (SEQ ID NO: 110, cathepsin B cleavable),

LAAANP (SEQ ID NO: 111, расщепляемая катепсином В),LAAANP (SEQ ID NO: 111, cathepsin B cleavable),

LYGAQF (SEQ ID NO: 112, расщепляемая катепсином В),LYGAQF (SEQ ID NO: 112, cathepsin B cleavable),

LSQAQG (SEQ ID NO: 113, расщепляемая катепсином В),LSQAQG (SEQ ID NO: 113, cathepsin B cleavable),

ASAASG (SEQ ID NO: 114, расщепляемая катепсином В),ASAASG (SEQ ID NO: 114, cathepsin B cleavable),

FLGASL (SEQ ID NO: 115, расщепляемая катепсином В),FLGASL (SEQ ID NO: 115, cathepsin B cleavable),

AYGATG (SEQ ID NO: 116, расщепляемая катепсином В),AYGATG (SEQ ID NO: 116, cathepsin B cleavable),

LAQATG (SEQ ID NO: 117, расщепляемая катепсином В),LAQATG (SEQ ID NO: 117, cathepsin B cleavable),

GAGSGVVIATVIVITAG (SEQ ID NO: 118, расщепляемая катепсином L),GAGSGVVIATVIVITAG (SEQ ID NO: 118, cathepsin L cleavable),

APMAEGGG (SEQ ID NO: 119, расщепляемая меприном альфа или меприном бета),APMAEGGG (SEQ ID NO: 119, meprin alpha or meprin beta cleavable),

EAQGDKII (SEQ ID NO: 120, расщепляемая меприном альфа или меприном бета),EAQGDKII (SEQ ID NO: 120, meprin alpha or meprin beta cleavable),

LAFSDAGP (SEQ ID NO: 121, расщепляемая меприном альфа или меприном бета),LAFSDAGP (SEQ ID NO: 121, meprin alpha or meprin beta cleavable),

YVADAPK (SEQ ID NO: 122, расщепляемая меприном альфа или меприном бета),YVADAPK (SEQ ID NO: 122, meprin alpha or meprin beta cleavable),

RRRRR (SEQ ID NO: 123, расщепляемая фурином),RRRRR (SEQ ID NO: 123, furin cleavable),

RRRRRR (SEQ ID NO: 124, расщепляемая фурином),RRRRRR (SEQ ID NO: 124, furin cleavable),

GQSSRHRRAL (SEQ ID NO: 125, расщепляемая фурином),GQSSRHRRAL (SEQ ID NO: 125, furin cleavable),

SSRHRRALD (SEQ ID NO: 126),SSRHRRALD (SEQ ID NO: 126),

RKSSIIIRMRDVVL (SEQ ID NO: 127, расщепляемая плазминогеном),RKSSIIIRMRDVVL (SEQ ID NO: 127, plasminogen-cleavable),

SSSFDKGKYKKGDDA (SEQ ID NO: 128, расщепляемая стафилокиназой),SSSFDKGKYKKGDDA (SEQ ID NO: 128, staphylokinase cleavable),

SSSFDKGKYKRGDDA (SEQ ID NO: 129, расщепляемая стафилокиназой),SSSFDKGKYKRGDDA (SEQ ID NO: 129, staphylokinase-cleavable),

IEGR (SEQ ID NO: 130, расщепляемая фактором Xa),IEGR (SEQ ID NO: 130, factor Xa cleavable),

IDGR (SEQ ID NO: 131, расщепляемая фактором Xa),IDGR (SEQ ID NO: 131, cleaved by factor Xa),

GGSIDGR (SEQ ID NO: 132, расщепляемая фактором Xa),GGSIDGR (SEQ ID NO: 132, factor Xa cleavable),

GPQGIAGQ (SEQ ID NO: 133, расщепляемая коллагеназой),GPQGIAGQ (SEQ ID NO: 133, collagenase digestible),

GPQGLLGA (SEQ ID NO: 134, расщепляемая коллагеназой),GPQGLLGA (SEQ ID NO: 134, collagenase-cleavable),

GIAGQ (SEQ ID NO: 135, расщепляемая коллагеназой),GIAGQ (SEQ ID NO: 135, collagenase-cleavable),

GPLGIAG (SEQ ID NO: 136, расщепляемая коллагеназой),GPLGIAG (SEQ ID NO: 136, collagenase cleavable),

GPEGLRVG (SEQ ID NO: 137, расщепляемая коллагеназой),GPEGLRVG (SEQ ID NO: 137, collagenase-cleavable),

YGAGLGVV (SEQ ID NO: 138, расщепляемая коллагеназой),YGAGLGVV (SEQ ID NO: 138, collagenase-cleavable),

AGLGVVER (SEQ ID NO: 139, расщепляемая коллагеназой),AGLGVVER (SEQ ID NO: 139, collagenase-cleavable),

AGLGISST (SEQ ID NO: 140, расщепляемая коллагеназой),AGLGISST (SEQ ID NO: 140, collagenase digestible),

EPQALAMS (SEQ ID NO: 141, расщепляемая коллагеназой),EPQALAMS (SEQ ID NO: 141, collagenase digestible),

QALAMSAI (SEQ ID NO: 142, расщепляемая коллагеназой),QALAMSAI (SEQ ID NO: 142, collagenase-cleavable),

AAYHLVSQ (SEQ ID NO: 143, расщепляемая коллагеназой),AAYHLVSQ (SEQ ID NO: 143, collagenase digestible),

MDAFLESS (SEQ ID NO: 144, расщепляемая коллагеназой),MDAFLESS (SEQ ID NO: 144, collagenase digestible),

ESLPVVAV (SEQ ID NO: 145, расщепляемая коллагеназой),ESLPVVAV (SEQ ID NO: 145, collagenase-cleavable),

SAPAVESE (SEQ ID NO: 146, расщепляемая коллагеназой),SAPAVESE (SEQ ID NO: 146, collagenase-cleavable),

DVAQFVLT (SEQ ID NO: 147, расщепляемая коллагеназой),DVAQFVLT (SEQ ID NO: 147, collagenase-cleavable),

VAQFVLTE (SEQ ID NO: 148, расщепляемая коллагеназой),VAQFVLTE (SEQ ID NO: 148, collagenase cleavable),

AQFVLTEG (SEQ ID NO: 149, расщепляемая коллагеназой),AQFVLTEG (SEQ ID NO: 149, collagenase cleavable),

PVQPIGPQ (SEQ ID NO: 150, расщепляемая коллагеназой),PVQPIGPQ (SEQ ID NO: 150, collagenase digestible),

LVPRGS (SEQ ID NO: 151, расщепляемая тромбином),LVPRGS (SEQ ID NO: 151, thrombin-cleavable),

TSGSGRSANARG (SEQ ID NO: 168, расщепляемая uPA и MT-SP1),TSGSGRSANARG (SEQ ID NO: 168, cleaved by uPA and MT-SP1),

TSQSGRSANQRG (SEQ ID NO: 169, расщепляемая uPA и MT-SP1),TSQSGRSANQRG (SEQ ID NO: 169, cleavable uPA and MT-SP1),

TSPSGRSAYPRG (SEQ ID NO: 170, расщепляемая uPA и MT-SP1),TSPSGRSAYPRG (SEQ ID NO: 170, cleaved by uPA and MT-SP1),

TSGSGRSATPRG (SEQ ID NO: 171, расщепляемая uPA и MT-SP1),TSGSGRSATPRG (SEQ ID NO: 171, cleaved by uPA and MT-SP1),

TSQSGRSATPRG (SEQ ID NO: 172, расщепляемая uPA и MT-SP1),TSQSGRSATPRG (SEQ ID NO: 172, cleaved by uPA and MT-SP1),

TSASGRSATPRG (SEQ ID NO: 173, расщепляемая uPA и MT-SP1),TSASGRSATPRG (SEQ ID NO: 173, cleaved by uPA and MT-SP1),

TSYSGRSAVPRG (SEQ ID NO: 174, расщепляемая uPA и MT-SP1),TSYSGRSAVPRG (SEQ ID NO: 174, cleaved by uPA and MT-SP1),

TSYSGRSANFRG (SEQ ID NO: 175, расщепляемая uPA и MT-SP1),TSYSGRSANFRG (SEQ ID NO: 175, cleaved by uPA and MT-SP1),

TSSSGRSATPRG (SEQ ID NO: 176, расщепляемая uPA и MT-SP1),TSSSGRSATPRG (SEQ ID NO: 176, cleaved by uPA and MT-SP1),

TSTTGRSASPRG (SEQ ID NO: 177, расщепляемая uPA и MT-SP1) иTSTTGRSASPRG (SEQ ID NO: 177, cleaved by uPA and MT-SP1) and

TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 178, расщепляемая uPA и MT-SP1).TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 178, cleaved by uPA and MT-SP1).

В качестве расщепляемых протеазой последовательностей можно применять также расщепляемые протеазой последовательности, представленные в таблице 1.As protease-cleavable sequences, the protease-cleavable sequences shown in Table 1 can also be used.

Следующую последовательность можно применять также в качестве расщепляемой протеазой последовательности:The following sequence can also be used as a protease cleavable sequence:

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 833),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 833),

в которой X1-Х8 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, К, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, К, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; Х3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, К, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, К, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, К, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, К, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, К, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y.in which X1-X8 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 834),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 834),

в которой X1-Х8 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из А, Е, F, G, Н, K, М, N, Р, Q, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; Х3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, К, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, К, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, К, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, К, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, К, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y.in which X1-X8 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, E, F, G, H, K, M, N, P, Q, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 835),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 835),

в которой X1-Х8 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, F, L, М, Р, Q, V, W и Y; Х3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, T, V, W и Y; X4 обозначает R; X5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y.in which X1-X8 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, F, L, M, P, Q, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 836),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 836),

в которой X1-Х8 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; Х3 обозначает аминокислоту, выбранную из А, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y.in which X1-X8 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 837),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 837),

в которой X1-Х8 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; Х3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, G, Н, I, K, L, М, N, Q, R, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y.in which X1-X8 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 838),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 838),

в которой Х1-Х8 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; Х3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из Е, F, K, М, N, Р, Q, R, S и W; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y.in which X1-X8 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from E, F, K, M, N, P, Q, R, S and W; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 839),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 839),

в которой X1-Х8 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; Х3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, F, G, L, М, Р, Q, V и W; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y.in which X1-X8 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, F, G, L, M, P, Q, V and W; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 840),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 840),

в которой X1-Х8 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; Х3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, I, K, N, Т и W.in which X1-X8 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, I, K, N, T and W.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 841),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 841),

в которой X1-Х8 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, I, Р, Q, S и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из K или Т; Х3 обозначает G; Х4 обозначает R; Х5 обозначает S; Х6 обозначает А; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из Н, I и V; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из Н, V и Y.in which X1-X8 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, G, I, P, Q, S and Y; X2 is an amino acid selected from K or T; X3 stands for G; X4 stands for R; X5 stands for S; X6 stands for A; X7 is an amino acid selected from H, I and V; and X8 is an amino acid selected from H, V and Y.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 842),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 842),

в которой X1-Х8 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из S и Т; Х3 обозначает G; Х4 обозначает R; Х5 обозначает S; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из А и Е; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из N и V; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из Н, Р, V и Y.in which X1-X8 each denotes an individual amino acid, X1 denotes Y; X2 is an amino acid selected from S and T; X3 stands for G; X4 stands for R; X5 stands for S; X6 is an amino acid selected from A and E; X7 is an amino acid selected from N and V; and X8 is an amino acid selected from H, P, V and Y.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 843),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 843),

в которой X1-Х9 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; Х3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначаетin which X1-X9 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 stands for

аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, T, V, W и Y; X8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 844),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 844),

в которой X1-Х9 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из А, Е, F, G, Н, K, М, N, Р, Q, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; Х3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из А, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X9 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, E, F, G, H, K, M, N, P, Q, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 845),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 845),

в которой X1-Х9 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, F, L, М, Р, Q, V, W и Y; Х3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X9 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, F, L, M, P, Q, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 846),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 846),

в которой X1-X9 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; Х3 обозначает аминокислоту, выбранную из А, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из А, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X9 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 847),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 847),

в которой X1-Х9 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; Х3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, G, Н, I, K, L, М, N, Q, R, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из А, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X9 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 848),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 848),

в которой X1-Х9 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; Х3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из Е, F, K, М, N, Р, Q, R, S и W; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X9 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from E, F, K, M, N, P, Q, R, S and W; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 849),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 849),

в которой X1-Х9 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; Х3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, F, G, L, М, Р, Q, V и W; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X9 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, F, G, L, M, P, Q, V and W; X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 850),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 850),

в которой X1-Х9 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, I, K, N, T и W; и X9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X9 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, I, K, N, T and W; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 851),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 851),

в которой X1-Х9 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, I, Р, Q, S и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из K или Т; X3 обозначает G; Х4 обозначает R; Х5 обозначает S; Х6 обозначает А; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из Н, I и V; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из Н, V и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X9 each denotes an individual amino acid, X1 denotes an amino acid selected from A, G, I, P, Q, S and Y; X2 is an amino acid selected from K or T; X3 stands for G; X4 stands for R; X5 stands for S; X6 stands for A; X7 is an amino acid selected from H, I and V; X8 is an amino acid selected from H, V and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 852),X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 852),

в которой X1-Х9 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, X1 обозначает Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из S и Т; X3 обозначает G; Х4 обозначает R; Х5 обозначает S; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из А и Е; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из Н, Р, V и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X9 each denotes an individual amino acid, X1 denotes Y; X2 is an amino acid selected from S and T; X3 stands for G; X4 stands for R; X5 stands for S; X6 is an amino acid selected from A and E; X8 is an amino acid selected from H, P, V and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1062),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1062),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1063),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1063),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из А, Е, F, G, Н, K, М, N, Р, Q, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, E, F, G, H, K, M, N, P, Q, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1064),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1064),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, F, L, М, Р, Q, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, F, L, M, P, Q, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1065),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1065),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из А, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1066),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1066),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, G, Н, I, K, L, М, N, Q, R, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1067),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1067),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; X6 обозначает аминокислоту, выбранную из Е, F, K, М, N, Р, Q, R, S и W; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from E, F, K, M, N, P, Q, R, S and W; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1068),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1068),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, F, G, L, М, Р, Q, V и W; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, F, G, L, M, P, Q, V and W; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1069),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1069),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, I, K, N, Т и W.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, I, K, N, T and W.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1070),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1070),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, I, Р, Q, S и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из K или Т; X3 обозначает G; Х4 обозначает R; Х5 обозначает S; Х6 обозначает А; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из Н, I и V; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из Н, V и Y.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, G, I, P, Q, S and Y; X2 is an amino acid selected from K or T; X3 stands for G; X4 stands for R; X5 stands for S; X6 stands for A; X7 is an amino acid selected from H, I and V; and X8 is an amino acid selected from H, V and Y.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1071),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8 (SEQ ID NO: 1071),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из S и Т; X3 обозначает G; Х4 обозначает R; Х5 обозначает S; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из А и Е; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из N и V; и Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из Н, Р, V и Y.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 stands for Y; X2 is an amino acid selected from S and T; X3 stands for G; X4 stands for R; X5 stands for S; X6 is an amino acid selected from A and E; X7 is an amino acid selected from N and V; and X8 is an amino acid selected from H, P, V and Y.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1072),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1072),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1073),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1073),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из А, Е, F, G, Н, K, М, N, Р, Q, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из А, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, E, F, G, H, K, M, N, P, Q, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1074),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1074),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, F, L, М, Р, Q, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, F, L, M, P, Q, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1075),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1075),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из А, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из А, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1076),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1076),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, G, Н, I, K, L, М, N, Q, R, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из А, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1077),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1077),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; X2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из Е, F, K, М, N, Р, Q, R, S и W; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from E, F, K, M, N, P, Q, R, S and W; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X8 represents an amino acid selected from and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1078),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1078),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, F, G, L, М, Р, Q, V и W; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, F, G, L, M, P, Q, V and W; X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1079),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1079),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, М, N, Р, Q, S, Т, W и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, K, L, М, Р, Q, S, Т, V, W и Y; X3 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х4 обозначает R; Х5 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; X6 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, Н, I, K, L, М, N, Р, Q, R, S, Т, V, W и Y; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из A, D, Е, F, G, I, K, N, Т и W; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y; X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X4 stands for R; X5 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X6 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X7 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y; X8 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, I, K, N, T and W; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1080),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1080),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, I, Р, Q, S и Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из K или Т; X3 обозначает G; Х4 обозначает R; Х5 обозначает S; Х6 обозначает А; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из Н, I и V; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из Н, V и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 is an amino acid selected from A, G, I, P, Q, S and Y; X2 is an amino acid selected from K or T; X3 stands for G; X4 stands for R; X5 stands for S; X6 stands for A; X7 is an amino acid selected from H, I and V; X8 is an amino acid selected from H, V and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1081),Х10-Х11-Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7-Х8-Х9 (SEQ ID NO: 1081),

в которой X1-X11 каждый обозначает индивидуальную аминокислоту, Х10 обозначает аминокислоту, выбранную из I, Т и Y; X11 обозначает S; X1 обозначает Y; Х2 обозначает аминокислоту, выбранную из S и Т; X3 обозначает G; Х4 обозначает R; Х5 обозначает S; Х6 обозначает аминокислоту, выбранную из А и Е; Х7 обозначает аминокислоту, выбранную из N и V; Х8 обозначает аминокислоту, выбранную из Н, Р, V и Y; и Х9 обозначает аминокислоту, выбранную из A, G, Н, I, L и R.in which X1-X11 each denotes an individual amino acid, X10 denotes an amino acid selected from I, T and Y; X11 stands for S; X1 stands for Y; X2 is an amino acid selected from S and T; X3 stands for G; X4 stands for R; X5 stands for S; X6 is an amino acid selected from A and E; X7 is an amino acid selected from N and V; X8 is an amino acid selected from H, P, V and Y; and X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.

В дополнение к упомянутым выше последовательностям, расщепляемым протеазой, можно получать также новые расщепляемые протеазой последовательности путем скрининга. Например, основываясь на результате анализа кристаллической структуры известной расщепляемой протеазой последовательности, новые расщепляемые протеазой последовательности можно изучать путем изменения взаимодействия активных остатков/распознаваемых остатков расщепляемой последовательности и фермента. Новые расщепляемые протеазой последовательности можно изучать также на основе изменения аминокислот в известной расщепляемой протеазой последовательности и оценки взаимодействия между измененной последовательностью и протеазой. В качестве другого примера расщепляемые протеазой последовательности можно изучать путем оценки взаимодействия протеазы с библиотекой пептидов, экспонированной с использованием метода дисплея in vitro, такого как фаговый дисплей и рибосомный дисплей, или с помощью массива пептидов, иммобилизованных на чипе или гранулах.In addition to the above-mentioned protease-cleavable sequences, it is also possible to obtain new protease-cleavable sequences by screening. For example, based on the result of analysis of the crystal structure of a known protease cleavable sequence, new protease cleavable sequences can be studied by changing the interaction of the active residues/recognition residues of the cleavable sequence and the enzyme. New protease-cleavable sequences can also be studied based on changes in amino acids in a known protease-cleavable sequence and assessing the interaction between the changed sequence and the protease. As another example, protease-cleavable sequences can be studied by assessing the interaction of the protease with a library of peptides displayed using an in vitro display method, such as phage display and ribosomal display, or using an array of peptides immobilized on a chip or beads.

Взаимодействие между расщепляемой протеазой последовательностью и протеазой можно оценивать путем тестирования расщепления последовательности с помощью протеазы in vitro или in vivo.The interaction between the protease-cleavable sequence and the protease can be assessed by testing the cleavage of the sequence with the protease in vitro or in vivo.

Расщепленные фрагменты после обработки протеазой можно разделять с помощью электрофореза, такого как ДСН-ПААГ, и количественно оценивать для исследования расщепляемой протеазой последовательности, активности протеазы и степени расщепления молекулы, в которую интродуцирована расщепляемая протеазой последовательность. Пример метода (но, не ограничиваясь только им) оценки степени расщепления молекулы, в которую интродуцирована расщепляемая протеазой последовательность, включает следующий метод: например, когда степень расщепления варианта антитела, в который интродуцирована расщепляемая протеазой последовательность, оценивают с использованием рекомбинантного человеческого активатора и-плазминогена/урокиназы (человеческая uPA, huPA) (фирма R&D Systems; 1310-SE-010) или рекомбинантной человеческой матриптазы / каталитический домен ST14 (человеческая MT-SP1, hMT-SP1) (фирма R&D Systems; 3946-SE-010), то 100 мкг/мл варианта антитела подвергают взаимодействию с 40 нМ huPA или 3 нМ hMT-SP1 в ЗФР при 37°С в течение 1 ч, а затем подвергают иммуноанализу на основе капиллярного электрофореза. Иммуноанализ на основе капиллярного электрофореза можно осуществлять с использованием системы Wes (фирма Protein Simple), но применяемый в настоящем описании метод не ограничен указанным. В качестве альтернативы иммуноанализу на основе капиллярного электрофореза для разделения можно применять ДСН-ПААГ и т.д. с последующей детекцией Вестерн-блоттингом. Применяемый в настоящем описании метод не ограничен указанными методами. До и после расщепления легкую цепь можно выявлять с использованием антитела к человеческой лямбда-цепи, меченное HRP (фирма abeam; ab9007), но можно применять любое антитело, с помощью которого можно выявлять расщепленные фрагменты. Площадь каждого пика, полученного после обработки протеазой, определяют с помощью программного обеспечения для системы Wes (программное обеспечение Compass для систем SW; фирма Protein Simple), и степень расщепления (%) варианта антитела можно определять с использованием следующей формулы:Cleaved fragments after protease treatment can be separated by electrophoresis, such as SDS-PAGE, and quantified to examine the protease cleavable sequence, protease activity, and the degree of cleavage of the molecule into which the protease cleavable sequence is introduced. An example of, but not limited to, a method for assessing the degree of cleavage of a molecule into which a protease-cleavable sequence is introduced includes the following method: for example, where the degree of cleavage of an antibody variant into which a protease-cleavable sequence is introduced is assessed using recombinant human plasminogen activator /urokinase (human uPA, huPA) (R&D Systems; 1310-SE-010) or recombinant human matriptase / ST14 catalytic domain (human MT-SP1, hMT-SP1) (R&D Systems; 3946-SE-010), then 100 μg/ml of the antibody variant is reacted with 40 nM huPA or 3 nM hMT-SP1 in PBS at 37°C for 1 hour and then subjected to capillary electrophoresis immunoassay. Capillary electrophoresis immunoassays can be performed using the Wes system (Protein Simple), but the method used herein is not limited to that. As an alternative to capillary electrophoresis-based immunoassay, SDS-PAGE, etc. can be used for separation. followed by detection by Western blotting. The method used herein is not limited to these methods. Before and after cleavage, the light chain can be detected using an anti-human lambda chain antibody labeled HRP (abeam; ab9007), but any antibody that can detect cleavage fragments can be used. The area of each peak obtained after protease treatment is determined using Wes system software (Compass software for SW systems; Protein Simple), and the degree of cleavage (%) of the antibody variant can be determined using the following formula:

(площадь пика расщепленной легкой цепи) × 100 / (площадь пика расщепленной легкой цепи + площадь пика нерасщепленной легкой цепи).(cleaved light chain peak area) × 100/(cleaved light chain peak area + uncleaved light chain peak area).

Степени расщепления можно определять, если белковые фрагменты поддаются обнаружению до и после обработки протеазой. Степени расщепления можно определять не только для вариантов антител, но также и для различных белковых молекул, в которые интродуцирована расщепляемая протеазой последовательность.Degrees of cleavage can be determined if protein fragments are detectable before and after protease treatment. The degree of cleavage can be determined not only for antibody variants, but also for various protein molecules into which the protease-cleavable sequence is introduced.

Степень расщепления in vivo молекулы, в которую интродуцирована расщепляемая протеазой последовательность, можно определять путем введения молекулы животным и детекции введенной молекулы в образцах крови. Например, вариант антитела, в который интродуцирована расщепляемая протеазой последовательность, вводят мышам и из образцов их крови получают плазму. Антитело очищают из плазмы с помощью метода, известного специалистам в данной области, с использованием Dynabeads с белком А (фирма Thermo; 10001D), и затем подвергают иммуноанализу на основе капиллярного электрофореза для оценки степени расщепления протеазой варианта антитела. Иммуноанализ на основе капиллярного электрофореза можно осуществлять с использованием системы Wes (фирма Protein Simple), но применяемый в настоящем описании метод не ограничен указанным. В качестве альтернативы иммуноанализу на основе капиллярного электрофореза для разделения можно применять ДСН-ПААГ и т.д. с последующей детекцией Вестерн-блоттингом. Применяемый в настоящем описании метод не ограничен указанными методами. До и после расщепления легкую цепь можно выявлять с использованием антитела к человеческой лямбда-цепи, меченное HRP (фирма abeam; ab9007), но можно применять любое антитело, с помощью которого можно выявлять расщепленные фрагменты. Когда площадь каждого пика, полученного с помощью иммуноанализа на основе капиллярного электрофореза, определяют с помощью программного обеспечения для системы Wes (программное обеспечение Compass для систем SW; фирма Protein Simple), то долю оставшейся легкой цепи можно рассчитывать как [площадь пика легкой цепи] / [площадь пика тяжелой цепи], для определения доли полноразмерной легкой цепи, оставшейся нерасщепленной в организме мыши. Эффективность расщепления in vivo можно определять, если белковые фрагменты, полученные из живого организма, поддаются обнаружению. Степени расщепления можно определять не только для вариантов антител, но также и для различных белковых молекул, в которые интродуцирована расщепляемая протеазой последовательность. Расчет степеней расщепления с помощью указанных выше методов позволяет, например, сравнивать in vivo степени расщепления вариантов антител, в которые интродуцированы различные расщепляемые последовательности, и сравнивать степень расщепления одного варианта антитела на различных животных моделях, таких как модель, созданная с использованием здоровых мышей, и модель, созданная с использованием мышей с трансплантированными опухолями.The degree of in vivo cleavage of a molecule into which a protease-cleavable sequence is introduced can be determined by administering the molecule to animals and detecting the introduced molecule in blood samples. For example, a variant of an antibody into which a protease-cleavable sequence has been introduced is administered to mice and plasma is obtained from their blood samples. The antibody is purified from plasma using a method known to those skilled in the art using Protein A Dynabeads (Thermo; 10001D) and then subjected to a capillary electrophoresis immunoassay to assess the extent of protease cleavage of the antibody variant. Capillary electrophoresis immunoassays can be performed using the Wes system (Protein Simple), but the method used herein is not limited to that. As an alternative to capillary electrophoresis-based immunoassay, SDS-PAGE, etc. can be used for separation. followed by detection by Western blotting. The method used herein is not limited to these methods. Before and after cleavage, the light chain can be detected using an anti-human lambda chain antibody labeled HRP (abeam; ab9007), but any antibody that can detect cleavage fragments can be used. When the area of each peak obtained from a capillary electrophoresis immunoassay is determined using Wes system software (Compass software for SW systems; Protein Simple), the fraction of light chain remaining can be calculated as [light chain peak area]/ [heavy chain peak area], to determine the proportion of full-length light chain remaining uncleaved in the mouse. In vivo degradation efficiency can be determined if protein fragments obtained from a living organism are detectable. The degree of cleavage can be determined not only for antibody variants, but also for various protein molecules into which the protease-cleavable sequence is introduced. Calculation of cleavage rates using the above methods allows, for example, to compare in vivo cleavage rates of antibody variants into which different cleavage sequences have been introduced, and to compare the cleavage rates of a single antibody variant in different animal models, such as a model generated using healthy mice and model created using mice with transplanted tumors.

Например, все расщепляемые протеазой последовательности, представленные в таблице 1, впервые открыты при создании настоящего изобретения. Полипептиды, содержащие указанные расщепляемые протеазой последовательности, все можно применять в качестве субстратов протеаз, которые гидролизуются под действием протеаз. Таким образом, в настоящем изобретении предложены субстраты протеаз, которые содержат последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 833-852 и 1062-1081, и последовательностей, перечисленных в таблице 1. Субстраты протеаз, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в качестве, например, библиотеки, из которой субстрат, обладающий свойствами, пригодными для данной цели, можно выбирать для включения в полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении. В частности, для избирательного расщепления полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, протеазой, локализованной в повреждении, субстраты можно оценивать в отношении их чувствительности к указанной протеазе. Когда полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, вводят in vivo, то молекула может приходить в контакт с различными протеазами до достижения повреждения. Поэтому молекула предпочтительно должна обладать чувствительностью к протеазе, локализованной в повреждении, а также максимально высокой устойчивостью к другим протеазам. Для отбора требуемой расщепляемой протеазой последовательности в зависимости от поставленной цели каждый субстрат протеазы можно заранее всесторонне анализировать в отношении чувствительности к различным протеазам для определения его устойчивости к протеазам. На основе установленного спектра устойчивости к протеазам можно выявлять расщепляемую протеазой последовательность с необходимой чувствительностью и устойчивостью.For example, all protease-cleavable sequences presented in Table 1 were first discovered during the making of the present invention. Polypeptides containing these protease-cleavable sequences can all be used as protease substrates that are hydrolyzed by proteases. Thus, the present invention provides protease substrates that contain a sequence selected from SEQ ID NOs: 833-852 and 1062-1081, and the sequences listed in Table 1. The protease substrates proposed in the present invention can be used as, for example , a library from which a substrate having properties suitable for a given purpose can be selected for inclusion in the polypeptide of the present invention. In particular, for selective cleavage of a polypeptide of the present invention by a protease localized to a lesion, substrates can be assessed for their sensitivity to said protease. When the polypeptide of the present invention is administered in vivo, the molecule may come into contact with various proteases before damage is achieved. Therefore, the molecule should preferably have sensitivity to the protease localized in the lesion, as well as the highest possible resistance to other proteases. To select the desired protease cleavable sequence depending on the target, each protease substrate can be comprehensively analyzed in advance for sensitivity to various proteases to determine its protease resistance. Based on the established spectrum of protease resistance, a protease-cleavable sequence with the required sensitivity and resistance can be identified.

Альтернативно этому, полипептид, в который интродуцирована расщепляемая протеазой последовательность, до достижения повреждения подвергается не только ферментативным действиям, связанным с протеазами, но также и различным связанным с окружающей средой стрессам, таким как изменения рН, температурный и окислительно/восстановительный стресс.На основе сравнения информации об устойчивости субстратов протеаз к указанным внешним факторам можно отбирать расщепляемую протеазой последовательность с требуемыми свойствами.Alternatively, a polypeptide into which a protease-cleavable sequence is introduced is subject not only to protease-related enzymatic actions but also to various environmental stresses such as pH changes, temperature and redox stress before damage is achieved. Based on comparison Based on information about the resistance of protease substrates to these external factors, a protease-cleavable sequence with the required properties can be selected.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения к одному из концов или к обоим концам расщепляемой протеазой последовательности дополнительно присоединяют гибкий линкер. Гибкий линкер на одном конце расщепляемой протеазой последовательности можно обозначать как первый гибкий линкер, а гибкий линкер на другом конце можно обозначать как второй гибкий линкер. В конкретном варианте осуществления применяют одну из следующих комбинаций расщепляемой протеазой последовательности и гибкого линкера:In one embodiment of the present invention, a flexible linker is further attached to one or both ends of the protease-cleavable sequence. The flexible linker at one end of the protease cleavable sequence may be referred to as a first flexible linker, and the flexible linker at the other end may be referred to as a second flexible linker. In a specific embodiment, one of the following combinations of a protease cleavable sequence and flexible linker is used:

(расщепляемая протеазой последовательность),(protease-cleavable sequence),

(первый гибкий линкер)-(расщепляемая протеазой последовательность),(first flexible linker) - (protease cleavable sequence),

(расщепляемая протеазой последовательность)-(второй гибкий линкер), и(protease cleavable sequence)-(second flexible linker), and

(первый гибкий линкер)-(расщепляемая протеазой последовательность)-(второй гибкий линкер).(first flexible linker) - (protease cleavable sequence) - (second flexible linker).

Гибкий линкер, указанный в данном варианте осуществления изобретения, предпочтительно представляет собой пептидный линкер. Первый гибкий линкер и второй гибкий линкер каждый присутствует независимо и произвольно, и они представляют собой идентичные или различные гибкие линкеры, каждый из которых содержит по меньшей мере одну гибкую аминокислоту (Gly и т.д.). Гибкий линкер содержит, например, достаточное количество остатков (аминокислоты, произвольно выбранные из Arg, Ile, Gln, Glu, Cys, Tyr, Trp, Thr, Val, His, Phe, Pro, Met, Lys, Gly, Ser, Asp, Asn, Ala и т.д., прежде всего Gly, Ser, Asp, Asn и Ala, в частности, Gly и Ser, особенно предпочтительно Gly и т.д.) для расщепляемой протеазой последовательности для получения требуемой доступности протеазы.The flexible linker specified in this embodiment of the invention is preferably a peptide linker. The first flexible linker and the second flexible linker are each present independently and randomly, and they are identical or different flexible linkers, each containing at least one flexible amino acid (Gly, etc.). The flexible linker contains, for example, a sufficient number of residues (amino acids randomly selected from Arg, Ile, Gln, Glu, Cys, Tyr, Trp, Thr, Val, His, Phe, Pro, Met, Lys, Gly, Ser, Asp, Asn , Ala, etc., especially Gly, Ser, Asp, Asn and Ala, in particular Gly and Ser, especially preferably Gly, etc.) for the protease cleavable sequence to obtain the required protease accessibility.

Гибкий линкер, пригодный для применения на обоих концах расщепляемой протеазой последовательности, как правило, представляет собой гибкий линкер, который облегчает доступ протеазы к расщепляемой протеазой последовательности и повышает расщепляющую эффективность протеазы. Приемлемый гибкий линкер можно легко выбирать и его можно предпочтительно выбирать из линкеров различной длины, таких как имеющие длину от 1 аминокислоты (Gly и т.д.) до 20 аминокислот, от 2 аминокислот до 15 аминокислот или от 3 аминокислот до 12 аминокислот, в том числе от 4 аминокислот до 10 аминокислот, от 5 аминокислот до 9 аминокислот, от 6 аминокислот до 8 аминокислот или от 7 аминокислот до 8 аминокислот.В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения гибкий линкер представляет собой пептидный линкер, состоящий из 1-7 аминокислот.A flexible linker suitable for use at both ends of a protease-cleavable sequence is typically a flexible linker that facilitates access of the protease to the protease-cleavable sequence and increases the cleavage efficiency of the protease. A suitable flexible linker can be easily selected and may preferably be selected from linkers of various lengths, such as those having a length of from 1 amino acid (Gly, etc.) to 20 amino acids, from 2 amino acids to 15 amino acids, or from 3 amino acids to 12 amino acids, in including 4 amino acids to 10 amino acids, 5 amino acids to 9 amino acids, 6 amino acids to 8 amino acids, or 7 amino acids to 8 amino acids. In some embodiments of the present invention, the flexible linker is a peptide linker consisting of 1-7 amino acids.

Примеры гибкого линкера включают (но, не ограничиваясь только ими) глициновые полимеры (G)n, глицин-сериновые полимеры (включая, например, (GS)n, (GSGGS: SEQ ID NO: 27)n и (GGGS: SEQ ID NO: 28)n, в которых n обозначает целое число, равное по меньшей мере 1), глицин-аланиновые полимеры, аланин-сериновые полимеры и другие гибкие линкеры, широко применяемые в общепринятых методиках.Examples of the flexible linker include, but are not limited to, glycine polymers (G)n, glycine-serine polymers (including, for example, (GS)n, (GSGGS: SEQ ID NO: 27)n and (GGGS: SEQ ID NO : 28)n, in which n is an integer equal to at least 1), glycine-alanine polymers, alanine-serine polymers and other flexible linkers widely used in conventional techniques.

Среди них глициновые полимеры и глицин-сериновые полимеры заслуживают внимания в связи с тем, что эти аминокислоты являются относительно неструктурированными и способны функционировать в виде нейтральных связок между компонентами.Among them, glycine polymers and glycine-serine polymers deserve attention due to the fact that these amino acids are relatively unstructured and are able to function as neutral linkages between components.

Примеры гибкого линкера, состоящего из глицин-серинового полимера, могут включать (но, не ограничиваясь только ими)Examples of a flexible linker consisting of a glycine-serine polymer may include, but are not limited to:

В настоящем описании понятие «ассоциация» может относиться, например, к состоянию, в котором две или большие количество полипептидных областей взаимодействуют друг с другом. Как правило, гидрофобная связь, водородная связь, ионная связь или т.п. образуется между требуемыми пептидными областям с образованием продукта ассоциации. В качестве одного из примеров обычной ассоциации, известно, что антитело, представляющее собой нативное антитело, сохраняет спаренную структуру вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) благодаря нековалентной связи или т.п. между ними.As used herein, the term “association” may refer, for example, to a state in which two or more polypeptide regions interact with each other. Typically, a hydrophobic bond, a hydrogen bond, an ionic bond, or the like. formed between the required peptide regions to form an association product. As one example of a conventional association, it is known that an antibody that is a native antibody retains the paired structure of a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) due to a non-covalent bond or the like. between them.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ингибирующий домен транспортирующего фрагмента находится в ассоциации с антигенсвязывающим доменом. Ингибирующий домен может представлять собой часть транспортирующего фрагмента или может состоять полностью из транспортирующего фрагмента. С другой точки зрения, ингибирующий домен можно определять также как фрагмент, вступающий в ассоциацию с антигенсвязывающим доменом в транспортирующем фрагменте.In some embodiments of the present invention, the inhibitory domain of the transport moiety is in association with an antigen binding domain. The inhibitory domain may be part of the transport moiety or may consist entirely of the transport moiety. From another point of view, an inhibitory domain can also be defined as a fragment that associates with an antigen binding domain in a transport fragment.

В более конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий домен, который представляет собой однодоменное антитело, и ингибирующий домен, который представляет собой VL, VH или VHH, образуют такую же ассоциацию, как и ассоциация, присутствующая между VH антитела и VL антитела. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий домен, который представляет собой однодоменное антитело, и ингибирующий домен, который представляет собой VL, VH или VHH, образуют такую же ассоциацию, как и ассоциация, присутствующая между VH антитела и VL антитела, и в состоянии созданной таким образом ассоциации ингибирующий домен конформационно ингибирует связывание антигенсвязывающего домена с антигеном или конформационно изменяет антигенсвязывающий сайт антигенсвязывающего домена так, что антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется с помощью VL, VH или VHH. В варианте осуществления изобретения, в котором VHH применяют в качестве однодоменного антитела, считается, что связывание VHH с антигеном конформационно ингибируется с помощью ингибирующего домена, когда CDR3, основной антигенсвязывающий сайт VHH, или соседний к нему сайт присутствует на поверхности раздела ассоциации с ингибирующим доменом.In a more specific embodiment of the invention, the antigen binding domain, which is a single domain antibody, and the inhibitory domain, which is VL, VH or VHH, form the same association as that present between the VH of the antibody and the VL of the antibody. In another specific embodiment of the invention, the antigen binding domain, which is a single domain antibody, and the inhibitory domain, which is VL, VH or VHH, form the same association as that present between the VH of the antibody and the VL of the antibody, and in the state created thereby By association, the inhibitory domain conformationally inhibits binding of the antigen binding domain to an antigen or conformationally changes the antigen binding site of the antigen binding domain such that the antigen binding activity of the single domain antibody is inhibited by VL, VH or VHH. In an embodiment of the invention in which VHH is used as a single domain antibody, binding of VHH to antigen is considered to be conformationally inhibited by the inhibitory domain when CDR3, the major antigen binding site of VHH, or a site adjacent to it is present at the association interface with the inhibitory domain.

Ассоциацию антигенсвязывающего домена с ингибирующим доменом можно аннулировать, например, путем расщепления сайта расщепления. Аннулирование (упразднение) ассоциации можно применять взаимозаменяемо, например, с аннулированием состояния, в котором два или большее количество полипептидных областей взаимодействуют друг с другом. Взаимодействие между двумя или большим количеством полипептидных областей можно полностью аннулировать или взаимодействие между двумя или большим количеством полипептидных областей можно частично аннулировать.The association of the antigen binding domain with the inhibitory domain can be abolished, for example, by cleavage of the cleavage site. Association cancellation can be used interchangeably, for example, with cancellation of a condition in which two or more polypeptide regions interact with each other. The interaction between two or more polypeptide regions can be completely abrogated, or the interaction between two or more polypeptide regions can be partially abrogated.

В настоящем описании понятие «поверхность раздела», как правило, относится к границе, на которой происходит ассоциация или взаимодействие двух областей друг с другом. Аминокислотные остатки, формирующие поверхность раздела, представляют собой, как правило, один или множество аминокислотных остатков, которые содержатся в каждой полипептидной области, подвергаемой ассоциации, и более предпочтительно представляют собой аминокислотные остатки, которые соприкасаются друг с другом при ассоциации и участвуют в образовании взаимодействия. В частности, взаимодействие включает нековалентные связи, такие как водородная связь, электростатическое взаимодействие или образование соляного мостика между аминокислотными остатками, соприкасающимися друг с другом при ассоциации.As used herein, the term “interface” generally refers to the boundary at which association or interaction of two regions with each other occurs. The amino acid residues forming the interface are typically one or a plurality of amino acid residues that are contained in each polypeptide region subject to association, and more preferably are amino acid residues that come into contact with each other upon association and participate in the formation of the interaction. In particular, the interaction involves non-covalent bonds such as hydrogen bonding, electrostatic interaction or salt bridge formation between amino acid residues that come into contact with each other upon association.

В настоящем описании понятие «аминокислотные остатки, формирующие поверхность раздела» относится, в частности, к аминокислотным остаткам, содержащимся в полипептидных областях, образующих поверхность раздела. Например, полипептидные области, образующие поверхность раздела, означают полипептидные области, ответственные за внутримолекулярное или межмолекулярное избирательное связывание антител, лигандов, рецепторов, субстратов и т.д. Конкретные примеры таких полипептидных областей в антителах могут включать вариабельные области тяжелых цепей и вариабельные области легких цепей. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения примеры указанных полипептидных областей могут включать антигенсвязывающие домены и ингибирующие домены.As used herein, the term “interface-forming amino acid residues” refers, in particular, to amino acid residues contained in interface-forming polypeptide regions. For example, polypeptide regions forming an interface mean polypeptide regions responsible for the intramolecular or intermolecular selective binding of antibodies, ligands, receptors, substrates, etc. Specific examples of such polypeptide regions in antibodies may include heavy chain variable regions and light chain variable regions. In some embodiments of the present invention, examples of these polypeptide regions may include antigen binding domains and inhibitory domains.

Примеры аминокислотных остатков, формирующих поверхность раздела, включают (но, не ограничиваясь только ими) аминокислотные остатки, сближающиеся друг с другом при ассоциации. Аминокислотные остатки, сближающиеся друг с другом при ассоциации, можно выявлять, например, анализируя конформации полипептидов и изучая аминокислотные последовательности полипептидных областей, формирующих поверхность раздела при ассоциации полипептидов.Examples of amino acid residues forming an interface include, but are not limited to, amino acid residues that come close to each other by association. Amino acid residues that come close to each other during association can be identified, for example, by analyzing the conformations of polypeptides and studying the amino acid sequences of the polypeptide regions that form the interface during polypeptide association.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аминокислотный(ые) остаток(ки), участвующий(ие) в ассоциации в антигенсвязывающем домене, или аминокислотный(ые) остаток(ки), участвующий(ие) в ассоциации в ингибирующем домене, можно изменять для усиления ассоциации антигенсвязывающего домена с ингибирующим доменом. В другом конкретном варианте осуществления изобретения можно изменять аминокислотный(ые) остаток(ки), формирующий(ие) поверхность раздела с ингибирующим доменом в антигенсвязывающем домене, или аминокислотный(ые) остаток(ки), формирующий(ие) поверхность раздела с антигенсвязывающим доменом в ингибирующем домене. В предпочтительном варианте осуществления изобретения аминокислотный(ые) остаток(ки), формирующий(ие) поверхность раздела, можно изменять с помощью метода интродукции мутации(ий) в аминокислотный(ые) остаток(ки) на поверхности раздела, таким образом, чтобы два или большее количество аминокислотных остатков, формирующих поверхность раздела, приобретали различные заряды. Изменение аминокислотного(ых) остатка(ов), приводящее к различным зарядам, включает изменение положительно заряженного аминокислотного остатка на отрицательно заряженный(ые) аминокислотный(ые) остаток(ки) или незаряженный(ые) аминокислотный(ие) остаток(ки), изменение отрицательно заряженного аминокислотного остатка на положительно заряженный(ые) аминокислотный(ые) остаток(ки) или незаряженный(ые) аминокислотный(ые) остаток(ки), и изменение незаряженного(ых) аминокислотного(ых) остатка(ов) на положительно или отрицательно заряженный(ые) аминокислотный(ые) остаток(ки). Указанное аминокислотное изменение осуществляют с целью усиления ассоциации, и оно не ограничено положением аминокислотного изменения или типом аминокислоты, если при этом можно достигать цели, состоящей в усилении ассоциации. Примеры изменения включают (но, не ограничиваясь только указанным) замену.In some embodiments of the present invention, the amino acid residue(s) involved in association in the antigen binding domain or the amino acid residue(s) involved in association in the inhibitory domain can be modified to enhance the association antigen binding domain with an inhibitory domain. In another specific embodiment of the invention, it is possible to change the amino acid residue(s) forming the interface with the inhibitory domain in the antigen binding domain, or the amino acid residue(s) forming the interface with the antigen binding domain in inhibitory domain. In a preferred embodiment of the invention, the amino acid residue(s) forming the interface can be changed by a method of introducing mutation(s) into the amino acid residue(s) at the interface such that two or a greater number of amino acid residues forming the interface acquired different charges. A change in amino acid residue(s) resulting in different charges includes a change from a positively charged amino acid residue to a negatively charged amino acid residue(s) or uncharged amino acid residue(s), a change negatively charged amino acid residue(s) to positively charged amino acid residue(s) or uncharged amino acid residue(s), and changing the uncharged amino acid residue(s) to positive or negative charged amino acid residue(s). The amino acid change is carried out for the purpose of enhancing the association, and is not limited to the position of the amino acid change or the type of amino acid as long as the purpose of enhancing the association can be achieved. Examples of modification include, but are not limited to, substitution.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения имеет место ассоциация между VHH, служащим в качестве антигенсвязывающего домена, и VL, служащим в качестве ингибирующего домена. Аминокислотный остаток в VHH, участвующий в ассоциации с VL, можно обозначать, например, как аминокислотный остаток, формирующий поверхность раздела между VHH и VL. Примеры аминокислотного остатка в VHH, участвующего в ассоциации с VL, включают (но, не ограничиваясь только ими) аминокислотные остатки в положениях 37, 44, 45 и 47 (J. Mol. Biol. 350, 2005, сс. 112-125). Активность VHH ингибируется в результате усиления ассоциации между VHH и VL. Аналогично этому, аминокислотный остаток в VL, участвующий в ассоциации с VHH, можно обозначать, например, как аминокислотный остаток, формирующий поверхность раздела между VHH и VL.In some embodiments of the present invention, there is an association between VHH serving as an antigen binding domain and VL serving as an inhibitory domain. The amino acid residue in VHH involved in association with VL can be referred to, for example, as the amino acid residue that forms the interface between VHH and VL. Examples of an amino acid residue in VHH involved in association with VL include, but are not limited to, amino acid residues at positions 37, 44, 45 and 47 (J. Mol. Biol. 350, 2005, pp. 112-125). VHH activity is inhibited as a result of increased association between VHH and VL. Likewise, an amino acid residue in VL involved in association with VHH can be referred to, for example, as an amino acid residue forming an interface between VHH and VL.

Аминокислотный остаток в VHH, участвующий в ассоциации с VL, можно изменять для усиления ассоциации между VHH и VL. Примеры указанной аминокислотной замены включают (но, не ограничиваясь только ими) F37V, Y37V, E44G, Q44G, R45L, H45L, G47W, F47W, L47W, T47W или/и S47W. Вместо изменения указанного остатка в VHH, можно применять также VHH, в котором исходно присутствует аминокислотный остаток 37V, 44G, 45 L или/и 47W.The amino acid residue in VHH involved in association with VL can be changed to enhance the association between VHH and VL. Examples of said amino acid substitution include, but are not limited to, F37V, Y37V, E44G, Q44G, R45L, H45L, G47W, F47W, L47W, T47W, and/or S47W. Instead of changing the specified residue in VHH, it is also possible to use VHH in which the amino acid residue 37V, 44G, 45 L and/or 47W is initially present.

Вместо аминокислоты в VHH можно изменять аминокислотный остаток в VL, участвующий в ассоциации с VHH, и аминокислотные изменения можно интродуцировать также и в VHH, и в VL, если при этом можно достигать цели, состоящей в усилении ассоциации между VHH и VL.Instead of an amino acid in VHH, an amino acid residue in VL involved in association with VHH can be changed, and amino acid changes can also be introduced in both VHH and VL if the purpose of enhancing the association between VHH and VL can be achieved.

В некоторых альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения можно осуществлять ассоциацию антигенсвязывающего домена и ингибирующего домена друг с другом, используя VHH в качестве антигенсвязывающего домена и используя VH или VHH в качестве ингибирующего домена. Аминокислотный остаток, участвующий в ассоциации с VH или VHH, служащим в качестве ингибирующего домена, в VHH, служащим в качестве антигенсвязывающего домена, можно идентифицировать и изменять для усиления ассоциации антигенсвязывающего домена VHH с ингибирующим доменом VH или VHH. Кроме того, можно идентифицировать и изменять аминокислотные остатки, участвующие в ассоциации с VHH, служащим в качестве антигенсвязывающего домена, в VH или VHH, служащих в качестве ингибирующего домена.In some alternative embodiments of the present invention, it is possible to associate an antigen binding domain and an inhibitory domain with each other using VHH as the antigen binding domain and using VH or VHH as the inhibitory domain. An amino acid residue involved in association with VH or VHH serving as an inhibitory domain in VHH serving as an antigen binding domain can be identified and modified to enhance the association of the VHH antigen binding domain with the VH or VHH inhibitory domain. In addition, amino acid residues involved in association with VHH serving as an antigen binding domain in VH or VHH serving as an inhibitory domain can be identified and modified.

В случае применения однодоменного антитела, отличного от VHH, в качестве антигенсвязывающего домена, аминокислотные остатки, участвующие в ассоциации, в антигенсвязывающем домене или в ингибирующем домене, можно также идентифицировать и изменять аналогично описанному выше.In the case of using a single domain antibody other than VHH as the antigen binding domain, amino acid residues involved in association in the antigen binding domain or in the inhibitory domain can also be identified and modified in the same manner as described above.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент и антигенсвязывающий домен сливают через линкер. В более конкретном варианте осуществления изобретения транспортирующий фрагмент и антигенсвязывающий домен сливают через линкер, содержащий сайт расщепления. В альтернативном конкретном варианте осуществления изобретения транспортирующий фрагмент и антигенсвязывающий домен сливают через линкер, полученный таким образом слитый белок содержит сайт расщепления.In some embodiments of the present invention, the transport moiety and the antigen binding domain are fused through a linker. In a more specific embodiment of the invention, the transport fragment and the antigen binding domain are fused through a linker containing a cleavage site. In an alternative specific embodiment of the invention, the transport fragment and the antigen binding domain are fused through a linker, the resulting fusion protein containing a cleavage site.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент и антигенсвязывающий домен сливают без линкера. В более конкретном варианте осуществления изобретения формируют аминную связь между N-концевой аминокислотой транспортирующего фрагмента и С-концевой аминокислотой антигенсвязывающего домена, получая слитый белок. Образовавшийся слитый белок содержит сайт расщепления. В конкретном варианте осуществления изобретения от одной до нескольких N-концевых аминокислот транспортирующего фрагмента или/и от одной до нескольких С-концевых аминокислот антигенсвязывающего домена изменяют, и N-конец транспортирующего фрагмента и С-конец антигенсвязывающего домена сливают с получением сайта расщепления вблизи положения слияния. Более конкретно, сайт расщепления можно формировать, например, путем превращения четырех С-концевых аминокислот антигенсвязывающего домена в последовательность LSGR и превращения четырех N-концевых аминокислот транспортирующего фрагмента в последовательность SDNH.In another embodiment of the present invention, the transport fragment and the antigen binding domain are fused without a linker. In a more specific embodiment of the invention, an amine bond is formed between the N-terminal amino acid of the transport moiety and the C-terminal amino acid of the antigen binding domain, producing a fusion protein. The resulting fusion protein contains a cleavage site. In a specific embodiment, one to more N-terminal amino acids of the transport fragment and/and one to more C-terminal amino acids of the antigen binding domain are altered, and the N-terminus of the transport fragment and the C terminus of the antigen binding domain are fused to produce a cleavage site near the fusion position . More specifically, the cleavage site can be formed, for example, by converting the four C-terminal amino acids of the antigen binding domain to the sequence LSGR and converting the four N-terminal amino acids of the transport fragment to the sequence SDNH.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сайт расщепления полипептида, содержащего транспортирующий фрагмент и антигенсвязывающий домен, содержит расщепляемую протеазой последовательность. Расщепляемую протеазой последовательность можно помещать в любое положение в полипептиде, если антигенсвязывающий домен высвобождается расщеплением протеазой и не утрачивает свою антигенсвязывающую активность после высвобождения.In some embodiments of the present invention, the cleavage site of the polypeptide containing the transport fragment and the antigen binding domain contains a protease cleavable sequence. The protease cleavable sequence can be placed at any position in the polypeptide as long as the antigen binding domain is released by protease cleavage and does not lose its antigen binding activity upon release.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела, и N-конец константной области антитела и С-конец антигенсвязывающего домена слиты через линкер или без линкера.In some embodiments of the present invention, the transport moiety comprises an antibody constant region, and the N-terminus of the antibody constant region and the C-terminus of the antigen binding domain are fused through a linker or without a linker.

В конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована в константной области антитела, входящей в транспортирующий фрагмент. В этом случае расщепляемая протеазой последовательность может быть локализована в константной области антитела так, чтобы антигенсвязывающий домен высвобождался расщеплением протеазой. В конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована в константной области тяжелой цепи антитела, входящей в транспортирующий фрагмент, и более конкретно локализована в константной области тяжелой цепи антитела на стороне, примыкающей к антигенсвязывающему домену, за аминокислотой в положении 140 (EU-нумерация), предпочтительно в константной области тяжелой цепи антитела на стороне, примыкающей к антигенсвязывающему домену, за аминокислотой в положении 122 (EU-нумерация). В альтернативном конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована в константной области легкой цепи антитела, входящей в транспортирующий фрагмент, и более конкретно локализована в константной области легкой цепи антитела на стороне, примыкающей к антигенсвязывающему домену, за аминокислотой в положении 130 (EU-нумерация) (нумерация положения 130 по Кэботу), предпочтительно в константной области легкой цепи антитела на стороне, примыкающей к антигенсвязывающему домену, за аминокислотой в положении 113 (EU-нумерация) (нумерация положения 113 по Кэботу).In a specific embodiment of the invention, the protease-cleavable sequence is located in the constant region of the antibody included in the transport fragment. In this case, the protease-cleavable sequence may be located in the constant region of the antibody such that the antigen-binding domain is released by protease cleavage. In a specific embodiment of the invention, the protease-cleavable sequence is located in the heavy chain constant region of the antibody included in the transport fragment, and more specifically is localized in the heavy chain constant region of the antibody on the side adjacent to the antigen binding domain, after the amino acid at position 140 (EU numbering), preferably in the constant region of the antibody heavy chain on the side adjacent to the antigen binding domain, after amino acid position 122 (EU numbering). In an alternative specific embodiment of the invention, the protease-cleavable sequence is located in the antibody light chain constant region of the transport fragment, and more specifically is located in the antibody light chain constant region on the side adjacent to the antigen binding domain, after the amino acid at position 130 (EU numbering) (Cabot position numbering 130), preferably in the constant region of the antibody light chain on the side adjacent to the antigen binding domain, following the amino acid at position 113 (EU numbering) (Cabot position numbering 113).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, и С-конец однодоменного антитела и N-конец транспортирующего фрагмента слиты через линкер или без линкера.In some embodiments of the present invention, the antigen binding domain is a single domain antibody, and the C terminus of the single domain antibody and the N terminus of the transport moiety are fused through a linker or without a linker.

В конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована в однодоменном антителе. В более конкретном варианте осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH или VHH, и расщепляемая протеазой последовательность локализована в однодоменном антителе на стороне, примыкающей к транспортирующему фрагменту, за аминокислотой в положении 35b (нумерация Кэбота), предпочтительно в однодоменном антителе на стороне, примыкающей к транспортирующему фрагменту, за аминокислотой в положении 95 (нумерация Кэбота), более предпочтительно в однодоменном антителе на стороне, примыкающей к транспортирующему фрагменту, за аминокислотой в положении 109 (нумерация Кэбота). В альтернативном конкретном варианте осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело, полученное из VL, и расщепляемая протеазой последовательность локализована в однодоменном антителе на стороне, примыкающей к транспортирующему фрагменту, за аминокислотой в положении 32 (нумерация Кэбота), предпочтительно в однодоменном антителе на стороне, примыкающей к транспортирующему фрагменту, за аминокислотой в положении 91 (нумерация Кэбота), более предпочтительно в однодоменном антителе на стороне, примыкающей к транспортирующему фрагменту, за аминокислотой в положении 104 (нумерация Кэбота).In a specific embodiment of the invention, the protease-cleavable sequence is located in a single-domain antibody. In a more specific embodiment of the invention, the single domain antibody is a single domain antibody derived from VH or VHH, and the protease cleavable sequence is located in the single domain antibody on the side adjacent to the transport moiety, after the amino acid at position 35b (Cabot numbering), preferably in the single domain antibody at the side adjacent to the transport moiety after the amino acid at position 95 (Cabot numbering), more preferably in a single domain antibody on the side adjacent to the transport moiety after the amino acid at position 109 (Cabot numbering). In an alternative specific embodiment of the invention, the single-domain antibody is a single-domain antibody derived from VL, and the protease-cleavable sequence is located in the single-domain antibody on the side adjacent to the transport moiety, after the amino acid at position 32 (Cabot numbering), preferably in the single-domain antibody on the side adjacent to the transport moiety, after amino acid position 91 (Cabot numbering), more preferably in a single domain antibody on the side adjacent to the transport moiety, after amino acid position 104 (Cabot numbering).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела, антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, и константная область антитела и однодоменное антитело слиты через линкер или без линкера. В более конкретном варианте осуществления изобретения N-конец константной области антитела и С-конец однодоменного антитела слиты через линкер или без линкера. В альтернативном конкретном варианте осуществления изобретения С-конец константной области антитела и N-конец однодоменного антитела слиты через линкер или без линкера.In some embodiments of the present invention, the transport moiety comprises an antibody constant region, the antigen binding domain is a single domain antibody, and the antibody constant region and the single domain antibody are fused through a linker or without a linker. In a more specific embodiment of the invention, the N-terminus of the antibody constant region and the C-terminus of the single domain antibody are fused through a linker or without a linker. In an alternative specific embodiment of the invention, the C-terminus of the antibody constant region and the N-terminus of the single domain antibody are fused through a linker or without a linker.

В конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована в константной области антитела, входящей в транспортирующий фрагмент. В более конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована в константной области тяжелой цепи антитела на стороне, примыкающей к однодоменному антителу, за аминокислотой в положении 140 (EU-нумерация), предпочтительно в константной области тяжелой цепи антитела на стороне, примыкающей к однодоменному антителу, за аминокислотой в положении 122 (EU-нумерация). В альтернативном конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована в константной области легкой цепи антитела на стороне, примыкающей к однодоменному антителу, за аминокислотой в положении 130 (EU-нумерация) (нумерация положения 130 по Кэботу), предпочтительно в константной области легкой цепи антитела на стороне, примыкающей к антигенсвязывающему домену, за аминокислотой в положении 113 (EU-нумерация) (нумерация положения 113 по Кэботу).In a particular embodiment of the invention, the protease-cleavable sequence is located in the constant region of the antibody included in the transport fragment. In a more specific embodiment of the invention, the protease-cleavable sequence is located in the constant region of the antibody heavy chain on the side adjacent to the single-domain antibody, after the amino acid at position 140 (EU numbering), preferably in the constant region of the heavy chain of the antibody on the side adjacent to the single-domain antibody, after the amino acid at position 122 (EU numbering). In an alternative specific embodiment of the invention, the protease-cleavable sequence is located in the antibody light chain constant region on the side adjacent to the single domain antibody, following the amino acid at position 130 (EU numbering) (Cabot position 130 numbering), preferably in the antibody light chain constant region on the side adjacent to the antigen-binding domain, after the amino acid at position 113 (EU numbering) (Cabot numbering of position 113).

В конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована в однодоменном антителе. В более конкретном варианте осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH или VHH, и расщепляемая протеазой последовательность локализована в однодоменном антителе на стороне, примыкающей к константной области антитела, за аминокислотой в положении 35b (нумерация Кэбота), предпочтительно в однодоменном антителе на стороне, примыкающей к константной области антитела, за аминокислотой в положении 95 (нумерация Кэбота), более предпочтительно в однодоменном антителе на стороне, примыкающей к константной области антитела, за аминокислотой в положении 109 (нумерация Кэбота). В альтернативном конкретном варианте осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело, полученное из VL, и расщепляемая протеазой последовательность локализована в однодоменном антителе на стороне, примыкающей к константной области антитела, за аминокислотой в положении 32 (нумерация Кэбота), предпочтительно в однодоменном антителе на стороне, примыкающей к константной области антитела, за аминокислотой в положении 91 (нумерация Кэбота), более предпочтительно в однодоменном антителе на стороне, примыкающей к константной области антитела, за аминокислотой в положении 104 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела.In a specific embodiment of the invention, the protease-cleavable sequence is located in a single-domain antibody. In a more specific embodiment of the invention, the single domain antibody is a single domain antibody derived from VH or VHH, and the protease cleavable sequence is located in the single domain antibody on the side adjacent to the antibody constant region after the amino acid at position 35b (Cabot numbering), preferably in the single domain antibody on the side adjacent to the antibody constant region after amino acid position 95 (Cabot numbering), more preferably in a single domain antibody on the side adjacent to the antibody constant region after amino acid position 109 (Cabot numbering). In an alternative specific embodiment of the invention, the single domain antibody is a single domain antibody derived from VL, and the protease cleavable sequence is located in the single domain antibody on the side adjacent to the antibody constant region, after the amino acid at position 32 (Cabot numbering), preferably in the single domain antibody on the side adjacent to the antibody constant region, after amino acid position 91 (Cabot numbering), more preferably in a single domain antibody on the side adjacent to the antibody constant region, after amino acid position 104 (Cabot numbering) of the single domain antibody.

В конкретном варианте осуществления изобретения расщепляемая протеазой последовательность локализована вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и транспортирующим фрагментом. Фраза «вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и транспортирующим фрагментом» относится к фрагменту, расположенному в прямом направлении или в обратном направлении от сайта сцепления между антигенсвязывающим доменом и транспортирующим фрагментом, и который не влияет существенно на вторичную структуру антигенсвязывающего домена.In a particular embodiment of the invention, the protease-cleavable sequence is located near the boundary between the antigen binding domain and the transport fragment. The phrase “proximal to the boundary between the antigen binding domain and the transport fragment” refers to a fragment located in the forward direction or in the reverse direction of the site of adhesion between the antigen binding domain and the transport fragment, and which does not significantly affect the secondary structure of the antigen binding domain.

В более конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий домен сцеплен с константной областью антитела, входящей в транспортирующий фрагмент, и расщепляемая протеазой последовательность локализована вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью антитела. Фраза «вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью антитела» может относиться к положению вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью тяжелой цепи антитела или вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью легкой цепи антитела. Когда антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH или VHH, и он соединен с константной областью тяжелой цепи антитела, то фраза «вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью антитела» может относиться к положению между аминокислотой в положении 101 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела и аминокислотой в положении 140 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела и может предпочтительно относиться к положению между аминокислотой в положении 109 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела и аминокислотой в положении 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела. Когда антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VH или VHH, и оно соединено с константной областью легкой цепи антитела, то фраза «вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью легкой цепи антитела» может относиться к положению между аминокислотой в положении 101 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела и аминокислотой в положении 130 (EU-нумерация) (нумерация положения 130 по Кэботу) константной области легкой цепи антитела и может предпочтительно относиться к положению между аминокислотой в положении 109 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела и аминокислотой в положении 113 (EU-нумерация) (нумерация положения 113 по Кэботу) константной области легкой цепи антитела. Когда антигенсвязывающий домен представляет собой однодоменное антитело, полученное из VL, то фраза «вблизи границы между антигенсвязывающим доменом и константной областью антитела» относится к положению между аминокислотой в положении 96 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела и предписанным положением в константной области антитела, предпочтительно между аминокислотой в положении 104 (нумерация Кэбота) однодоменного антитела и предписанным положением в константной области антитела.In a more specific embodiment of the invention, the antigen binding domain is linked to an antibody constant region included in the transport fragment, and the protease cleavable sequence is located near the boundary between the antigen binding domain and the antibody constant region. The phrase “proximate the boundary between the antigen binding domain and the antibody constant region” may refer to a position proximate the boundary between the antigen binding domain and the antibody heavy chain constant region or proximate the boundary between the antigen binding domain and the antibody light chain constant region. When the antigen binding domain is a single domain antibody derived from VH or VHH, and it is linked to the heavy chain constant region of the antibody, then the phrase "near the boundary between the antigen binding domain and the antibody constant region" may refer to the position between the amino acid at position 101 (Cabot numbering) of a single domain antibody and the amino acid at position 140 (EU numbering) of the antibody heavy chain constant region and may preferably refer to the position between the amino acid at position 109 (Cabot numbering) of the single domain antibody and the amino acid at position 122 (EU numbering) of the heavy chain constant region of the antibody. When the antigen binding domain is a single domain antibody derived from VH or VHH, and it is coupled to the light chain constant region of the antibody, the phrase "near the boundary between the antigen binding domain and the antibody light chain constant region" may refer to the position between the amino acid at position 101 (numbering Cabot) of a single domain antibody and the amino acid at position 130 (EU numbering) (Cabot numbering of position 130) of the antibody light chain constant region and may preferably refer to the position between the amino acid at position 109 (Cabot numbering) of the single domain antibody and the amino acid at position 113 (EU -numbering) (Cabot position numbering 113) of the antibody light chain constant region. When the antigen binding domain is a single domain antibody derived from a VL, the phrase "near the boundary between the antigen binding domain and the antibody constant region" refers to the position between the amino acid at position 96 (Cabot numbering) of the single domain antibody and a prescribed position in the antibody constant region, preferably between the amino acid at position 104 (Cabot numbering) of a single domain antibody and a prescribed position in the constant region of the antibody.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полипептид представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа. Примеры таких вариантов осуществления изобретения включают (но, не ограничиваясь только ими): вариант осуществления изобретения, в котором транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела IgG-типа, однодоменное антитело, служащее в качестве антигенсвязывающего домена, занимает место VH антитела IgG-типа, и антигенсвязывающая активность ингибируется VL; вариант осуществления изобретения, в котором транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела IgG-типа, однодоменное антитело, служащее в качестве антигенсвязывающего домена, занимает место VL антитела IgG-типа, и антигенсвязывающая активность ингибируется VH; и вариант осуществления изобретения, в котором транспортирующий фрагмент содержит константную область антитела IgG-типа, однодоменное антитело, служащее в качестве антигенсвязывающего домена, занимает место одного из VH и VL антитела IgG-типа, и дополнительное однодоменное антитело, ингибирующее антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена, занимает место другого домена антитела IgG-типа.In some embodiments of the present invention, the polypeptide is an IgG antibody-like molecule. Examples of such embodiments include, but are not limited to: an embodiment wherein the transport moiety comprises a constant region of an IgG antibody, a single domain antibody serving as an antigen binding domain that takes the place of the VH of an IgG antibody, and an antigen binding activity inhibited by VL; an embodiment of the invention wherein the transport fragment comprises a constant region of an IgG-type antibody, a single-domain antibody serving as an antigen-binding domain takes the place of the VL of an IgG-type antibody, and the antigen-binding activity is inhibited by the VH; and an embodiment of the invention wherein the transport moiety comprises a constant region of an IgG antibody, a single domain antibody serving as an antigen binding domain occupies the place of one of the VH and VL of an IgG type antibody, and an additional single domain antibody that inhibits the antigen binding activity of the antigen binding domain occupies the site of another domain of an IgG antibody.

Понятие «молекула, подобная антителу IgG-типа», применяемое в настоящем описании, используют для обозначения молекулы, которая имеет фрагменты, практически сходные по структуре с константными доменами или константными областями в антителе IgG-типа, и фрагменты, практически сходные по структуре с вариабельными доменами или вариабельными областями в антителе IgG-типа, и которая конформационно имеет практическое сходство с антителом IgG-типа. В молекуле, подобной антителу IgG-типа, домен, сходный с СН1 антитела, и домен, сходный с CL антитела, можно применять взаимозаменяемо; это означает, что, если взаимодействие является сходным с взаимодействием между СН1 и CL антитела IgG-типа, имеющим место между доменами, то домены, сцепленные с участком, сходным с шарнирной область антитела, могут представлять собой СН1-домен антитела или CL-домен антитела. Однако в настоящем описании «молекула, подобная антителу IgG-типа» может проявлять или может не проявлять антигенсвязывающую активность, сохраняя при этом структуры, сходные со структурами антитела IgG-типа.The term "IgG antibody-like molecule" as used herein is used to refer to a molecule that has fragments substantially similar in structure to the constant domains or constant regions in an IgG antibody, and fragments substantially similar in structure to the variable domains or variable regions in an IgG-type antibody and which is conformationally substantially similar to the IgG-type antibody. In an IgG antibody-like molecule, the antibody CH1-like domain and the antibody CL-like domain can be used interchangeably; this means that if the interaction is similar to the interaction between CH1 and CL of an IgG antibody that occurs between domains, then the domains linked to a region similar to the hinge region of the antibody may be the CH1 domain of the antibody or the CL domain of the antibody . However, as used herein, an “IgG-type antibody-like molecule” may or may not exhibit antigen-binding activity while retaining structures similar to those of an IgG-type antibody.

Полипептид может содержать один или множество антигенсвязывающих доменов. Один или множество ингибирующих доменов может(гут) ингибировать антигенсвязывающую активность множества антигенсвязывающих доменов. Каждый из множества антигенсвязывающих доменов может быть ассоциирован с ингибирующим доменом. Каждый из множества антигенсвязывающих доменов может быть слит с транспортирующим фрагментом. Каждый из множества антигенсвязывающих доменов может обладать способностью высвобождаться из полипептидов. Сайт(ы) расщепления для высвобождения множества антигенсвязывающих доменов может(ут) представлять собой множество сайтов расщепления, соответствующих количеству антигенсвязывающих доменов.The polypeptide may contain one or multiple antigen binding domains. One or more inhibitory domains may inhibit the antigen binding activity of a plurality of antigen binding domains. Each of a variety of antigen binding domains may be associated with an inhibitory domain. Each of a variety of antigen binding domains can be fused to a transport moiety. Each of the plurality of antigen binding domains may have the ability to be released from polypeptides. The cleavage site(s) for releasing the plurality of antigen binding domains may be a plurality of cleavage sites corresponding to the number of antigen binding domains.

Когда полипептид представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа, антигенсвязывающие домены можно создавать соответственно на фрагментах, которые соответствуют двум вариабельным областям антитела IgG-типа, как продемонстрировано на фиг. 7. Указанный вариант осуществления изобретения должен быть очевиден специалистам в данной области после ознакомления с настоящим изобретением. Антигенсвязывающие домены, включенные в оба плеча, могут иметь одинаковую антигенсвязывающую специфичность или могут отличаться по антигенсвязывающей специфичности. Указанный вариант осуществления изобретения должен быть очевиден специалистам в данной области после ознакомления с настоящим изобретением. Очевидно, что указанные варианты осуществления изобретения включены в объем настоящего изобретения.When the polypeptide is an IgG antibody-like molecule, antigen binding domains can be respectively created on fragments that correspond to two variable regions of the IgG antibody, as shown in FIG. 7. This embodiment of the invention should be obvious to those skilled in the art after reading the present invention. The antigen binding domains included in both arms may have the same antigen binding specificity or may differ in antigen binding specificity. This embodiment of the invention should be obvious to those skilled in the art after reading the present invention. It is clear that these embodiments are included within the scope of the present invention.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий домен дополнительно сцеплен со вторым антигенсвязывающим доменом. Примеры второго антигенсвязывающего домена включают (но, не ограничиваясь только ими) однодоменные антитела, фрагменты антител, модуль, состоящий примерно из 35 аминокислот, обозначенный как А-домен, который входит в авимер (Avimer), белок клеточной мембраны, присутствующий in vivo (WO 2004/044011 и WO 2005/040229), аднектин (Adnectin), содержащий 10Fn3-домен, служащий в качестве связывающего белок домена, полученного из гликопротеина фибронектина, экспрессируемого на клеточных мембранах (WO 2002/032925), аффибоди (Affibody), имеющий каркас IgG-связывающего домена, состоящий из трехспирального пучка, включающего 58 аминокислот белка A (WO 1995/001937), DARPin (сконструированные белки с анкириновыми повторами), которые представляют собой области, экспонируемые на молекулярной поверхности анкириновых повторов (AR), каждый из которых имеет структуру, в которой повторно уложена субъединица с изгибом, содержащая 33 аминокислотных остатка, две антипараллельной спирали и петлю (WO 2002/020565), антикалины (Anticalin), которые имеют состоящие из четырех петель области, поддерживающие одну сторону центрально закрученной бочкообразной структуры, состоящей из восьми антипараллельных цепей, которые являются высоко консервативными среди молекул липокалинов, таких как липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (NGAL) (WO 2003/029462), и вогнутую область, образованную структурой в виде параллельных тяжей внутри подковообразной структуры, образованной уложенными повторами, которые состоят из богатых лейцином повторяющихся (LRR) модулей вариабельного рецептора лимфоцитов (VLR), который не имеет иммуноглобулиновой структуры и применяется в системе приобретенной устойчивости у бесчелюстных позвоночных, таких как миноги или миксины (WO 2008/016854). В предпочтительном варианте осуществления изобретения второй антигенсвязывающий домен имеет антигенсвязывающую специфичность, отличную от специфичности антигенсвязывающего домена. В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулярная масса антигенсвязывающего домена и второго сцепленного антигенсвязывающего домена составляет 60 кДа или менее.In some embodiments of the present invention, the antigen binding domain is further linked to a second antigen binding domain. Examples of the second antigen binding domain include, but are not limited to, single domain antibodies, antibody fragments, a module of approximately 35 amino acids designated the A domain, which is included in the Avimer, a cell membrane protein present in vivo (WO 2004/044011 and WO 2005/040229), Adnectin containing a 10Fn3 domain serving as a protein binding domain derived from the fibronectin glycoprotein expressed on cell membranes (WO 2002/032925), Affibody having a framework An IgG binding domain consisting of a three-stranded bundle comprising the 58 amino acids of protein A (WO 1995/001937), DARPins (designed ankyrin repeat proteins), which are regions exposed on the molecular surface of ankyrin repeats (ARs), each of which has structure in which a folded subunit with a bend containing 33 amino acid residues, two antiparallel helices and a loop (WO 2002/020565), Anticalins, which have four-loop regions supporting one side of a centrally twisted barrel-shaped structure consisting of eight antiparallel chains that are highly conserved among lipocalin molecules such as neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) (WO 2003/029462), and a concave region formed by a parallel strand structure within a horseshoe-shaped structure formed by stacked repeats that consist of the leucine-rich repeat (LRR) modules of the variable lymphocyte receptor (VLR), which does not have an immunoglobulin structure and is used in the acquired resistance system in jawless vertebrates such as lampreys or hagfish (WO 2008/016854). In a preferred embodiment of the invention, the second antigen binding domain has an antigen binding specificity that is different from that of the antigen binding domain. In a preferred embodiment of the invention, the molecular weight of the antigen binding domain and the second linked antigen binding domain is 60 kDa or less.

В некоторых более конкретных вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен представляют собой однодоменные антитела, отличающиеся по антигенсвязывающим специфичностям, антигенсвязывающий домен и второй сцепленный антигенсвязывающий домен обладают способностью высвобождаться из полипептида, и антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен образуют биспецифическую антигенсвязывающую молекулу после высвобождения. Примеры такой биспецифической антигенсвязывающей молекулы включают (но не ограничиваясь только ими) биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, которая имеет антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с поверхностным антигеном клетки-мишени, и второй антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с поверхностным антигеном иммуноцита, биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, которая имеет антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, связывающийся с другими субъединицами одного и того же антигена, и биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, которая имеет антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен, которые связываются с различными эпитопами одного и того же антигена. Указанная биспецифическая антигенсвязывающая молекула может обеспечивать рекрутинг иммуноцитов в окрестность клеток-мишеней, и поэтому считается, что является ценным для лечения заболевания, вызываемого клетками-мишенями.In some more specific embodiments, the antigen binding domain and the second antigen binding domain are single domain antibodies that differ in antigen binding specificities, the antigen binding domain and the second linked antigen binding domain are releasable from a polypeptide, and the antigen binding domain and the second antigen binding domain form a bispecific antigen binding molecule upon release. Examples of such a bispecific antigen binding molecule include, but are not limited to, a bispecific antigen binding molecule that has an antigen binding domain that specifically binds to a surface antigen of a target cell, and a second antigen binding domain that specifically binds to a surface antigen of an immunocyte, a bispecific antigen binding molecule that has an antigen binding a domain and a second antigen binding domain that binds to other subunits of the same antigen, and a bispecific antigen binding molecule that has an antigen binding domain and a second antigen binding domain that bind to different epitopes of the same antigen. This bispecific antigen binding molecule can recruit immunocytes into the vicinity of target cells and is therefore believed to be valuable for the treatment of disease caused by target cells.

Антигенсвязывающая активность второго антигенсвязывающего домена может ингибироваться или может не ингибироваться транспортирующим фрагментом. Второй антигенсвязывающий домен может находиться в ассоциации или может не находиться в ассоциации со структурой, являющейся частью транспортирующего фрагмента. В частности, когда антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен отличаются по антигенсвязывающим специфичностям, то антигенсвязывающий домен в невысвободившемся состоянии не может проявлять антигенсвязывающую активность, что продемонстрировано, например, на фиг. 8, даже, если антигенсвязывающая активность второго антигенсвязывающего домена не ингибируется, и даже, если второй антигенсвязывающий домен не находится в ассоциации со структурой, являющейся частью транспортирующего фрагмента. Указанная биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий домен, сцепленный со вторым антигенсвязывающим доменом, не может проявлять функцию, состоящую в биспецифическом связывании с двумя типами антигенов.The antigen binding activity of the second antigen binding domain may or may not be inhibited by the transport fragment. The second antigen binding domain may or may not be in association with a structure that is part of the transport moiety. In particular, when the antigen binding domain and the second antigen binding domain differ in antigen binding specificities, the antigen binding domain in the unreleased state cannot exhibit antigen binding activity, as demonstrated, for example, in FIG. 8, even if the antigen binding activity of the second antigen binding domain is not inhibited, and even if the second antigen binding domain is not in association with a structure that is part of the transport moiety. Said bispecific antigen binding molecule comprising an antigen binding domain linked to a second antigen binding domain cannot exhibit the function of bispecific binding to two types of antigens.

На фиг. 8 продемонстрирована одна приведенная в качестве примера форма, в которой антигенсвязывающий домен дополнительно сцеплен со вторым антигенсвязывающим доменом.In fig. 8 shows one exemplary form in which the antigen binding domain is further linked to a second antigen binding domain.

В настоящем описании понятие «специфичность» относится к способности, с помощью которой одна из специфически связывающихся молекул не может связываться в значительной степени с молекулой, отличной от одной или нескольких молекул, которые являются ее партнерами по связыванию. Это понятие используют также, когда антигенсвязывающий домен обладает специфичностью в отношении эпитопа, входящего в конкретный антиген. Это понятие используют также, когда антигенсвязывающий домен обладает специфичностью в отношении конкретного эпитопа среди множества эпитопов, входящих в антиген. В этом контексте понятие «не связывается специфически» при определении с помощью метода, описанного в разделе, касающемся активности связывания, означает, что связывающая активность специфически связывающейся молекулы в отношении молекулы, отличной от ее партнера(ов) по связыванию, составляет 80% или менее, как правило, 50% или менее, предпочтительно 30% или менее, особенно предпочтительно 15% или менее, от ее связывающей активности в отношении молекул, которые являются ее партнером(ами) по связыванию.As used herein, the term “specificity” refers to the ability by which one of the specifically binding molecules is unable to bind significantly to a molecule other than one or more molecules that are its binding partners. This concept is also used when the antigen binding domain has specificity for an epitope included in a particular antigen. This concept is also used when the antigen binding domain has specificity for a particular epitope among the many epitopes included in the antigen. In this context, the term “does not specifically bind,” when determined by the method described in the binding activity section, means that the binding activity of a specifically binding molecule to a molecule other than its binding partner(s) is 80% or less typically 50% or less, preferably 30% or less, particularly preferably 15% or less, of its binding activity to molecules that are its binding partner(s).

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям (лекарственным средствам), которые содержат полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель.The present invention also relates to pharmaceutical compositions (medicines) that contain the polypeptide proposed in the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

Применяемое в настоящем описании понятие «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «процесс лечения») относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения болезни у индивидуума, подлежащего лечению, и его можно осуществлять либо для профилактики, либо в процессе развития клинического патологического состояния. Требуемыми действиями лечения являются (но, не ограничиваясь только ими) предупреждение возникновения или рецидива болезни, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий болезни, предупреждение метастазов, снижение скорости развития болезни, облегчение или временное ослабление болезненного состояния и ремиссия или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, применяют для замедления возникновения заболевания(ий) или замедления развития заболевай ия(ий).As used herein, the term “treatment” (and its grammatical variations such as “to treat” or “the process of treatment”) refers to a clinical intervention with the purpose of changing the natural history of a disease in the individual being treated, and can be carried out either for prevention or during the development of a clinical pathological condition. The desired treatment actions include, but are not limited to, prevention of onset or recurrence of the disease, relief of symptoms, reduction of any direct or indirect pathological consequences of the disease, prevention of metastases, reduction in the rate of disease progression, alleviation or temporary relief of the disease state, and remission or improvement of prognosis. In some embodiments, a polypeptide of the present invention is used to slow the onset of a disease(s) or slow the progression of a disease(s).

В настоящем изобретении понятие «фармацевтическая композиция» относится, как правило, к лекарственному средству, предназначенному для лечения или предупреждения заболевания или для обследования или постановки диагноза. В настоящем изобретении понятие «фармацевтическая композиция, содержащая полипептид» можно применять взаимозаменяемо с понятием «способ лечения заболевания, включающий введение полипептида индивидууму, подлежащему лечению» и можно применять взаимозаменяемо с понятием «применение полипептида для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания». Кроме того, понятие «фармацевтическая композиция, содержащая полипептид» можно применять взаимозаменяемо с понятием «применение полипептида для лечения заболевания».In the present invention, the term "pharmaceutical composition" generally refers to a medicinal product intended for the treatment or prevention of a disease or for examination or diagnosis. In the present invention, the term “pharmaceutical composition containing a polypeptide” can be used interchangeably with the term “a method of treating a disease comprising administering the polypeptide to an individual to be treated” and can be used interchangeably with the term “using the polypeptide to produce a medicament for treating a disease.” In addition, the term “pharmaceutical composition containing a polypeptide” can be used interchangeably with the term “use of a polypeptide to treat a disease.”

Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно приготавливать для применения методом, известным специалистам в данной области. Например, фармацевтические композиции можно применять парентерально, например, в форме стерильного раствора или суспензии для инъекции в воде или любых других фармацевтически приемлемых жидкостях. Фармацевтические композиции можно приготавливать, например, путем объединения соответственно полипептида с фармакологически приемлемым носителем или средой, в частности, стерильной водой или физиологическим соляным раствором, растительным маслом, эмульгатором, суспендирующим агентом, поверхностно-активным веществом, стабилизатором, корригентом, эксципиентом, наполнителем, антисептиком, связывающим агентом и т.д., и смешивать их с получением стандартной дозы лекарственного средства, требуемой для общепринятой фармацевтической практики. Количество действующего вещества в указанных композициях регулируют так, чтобы получать приемлемый объем в предварительно определенном диапазоне.The pharmaceutical compositions of the present invention can be prepared for use in a manner known to those skilled in the art. For example, the pharmaceutical compositions can be administered parenterally, for example, in the form of a sterile solution or suspension for injection in water or any other pharmaceutically acceptable liquid. Pharmaceutical compositions can be prepared, for example, by combining the polypeptide with a pharmacologically acceptable carrier or vehicle, in particular sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, excipient, antiseptic , binding agent, etc., and mix them to obtain the unit dosage of the drug required by standard pharmaceutical practice. The amount of active substance in these compositions is adjusted so as to obtain an acceptable volume within a predetermined range.

Стерильную композицию для инъекции можно приготавливать согласно общепринятой фармацевтической практике с использованием такого наполнителя, как дистиллированная вода, пригодная для инъекций. Примеры пригодного для инъекций водного раствора включают изотонические растворы, которые содержат физиологический соляной раствор, глюкозу или другие адъюванты (например, D-сорбит, D-маннозу, D-маннит и хлорид натрия). Водный раствор можно применять в комбинации с соответствующим солюбилизатором, например, спиртом (этанол и т.д.), многоатомным спиртом (пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.д.) или неионогенным поверхностно-активным веществом (Polysorbate 80™, НСО-50 и т.д.).A sterile injectable composition can be prepared according to standard pharmaceutical practice using an excipient such as distilled water suitable for injection. Examples of an injectable aqueous solution include isotonic solutions that contain physiological saline, glucose, or other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride). The aqueous solution can be used in combination with an appropriate solubilizer, such as an alcohol (ethanol, etc.), a polyhydric alcohol (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.) or a nonionic surfactant (Polysorbate 80™, HCO-50, etc. .d.).

Примеры масляного раствора включают кунжутное масло и соевое масло. Масляный раствор можно применять также в комбинации с бензилбензоатом и/или бензиловым спиртом в качестве солюбилизатора. Масляный раствор можно дополнять буфером (например, раствором фосфатного буфера и раствором натрий-ацетатного буфера), смягчающим агентом (например, гидрохлоридом прокаина), стабилизатором (например, бензиловым спиртом и фенолом) и антиоксидантом. Полученным раствором для инъекции, как правило, заполняют соответствующую ампулу.Examples of the oil solution include sesame oil and soybean oil. The oil solution can also be used in combination with benzyl benzoate and/or benzyl alcohol as a solubilizer. The oil solution may be supplemented with a buffer (eg, phosphate buffer solution and sodium acetate buffer solution), an emollient (eg, procaine hydrochloride), a stabilizer (eg, benzyl alcohol and phenol), and an antioxidant. The resulting injection solution is usually filled into the appropriate ampoule.

Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, предпочтительно вводят парентеральным путем. Например, вводят композицию в лекарственной форме, пригодной для инъекции, трансназального, транспульмонального или чрескожного введения. Фармацевтическую композицию можно вводить системно или применять место, например, путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции или подкожной инъекции.The pharmaceutical composition proposed in the present invention is preferably administered by the parenteral route. For example, the composition is administered in a dosage form suitable for injection, transnasal, transpulmonary or transdermal administration. The pharmaceutical composition can be administered systemically or applied locally, for example, by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection or subcutaneous injection.

Метод введения можно выбирать соответственно в зависимости от возраста и симптомов у пациента. Дозу фармацевтической композиции, содержащей полипептид, можно выбирать из диапазона, составляющего, например, от 0,0001 до 1000 мг на кг веса тела на дозу. Альтернативно этому, дозу фармацевтической композиции, содержащей полипептид, можно выбирать из дозы, составляющей, например, от 0,001 до 100000 мг на пациента. Однако настоящее изобретение не обязательно ограничено указанными численными величинам. Хотя доза и метод введения варьируются в зависимости от веса тела, возраста, симптомов и т.д. пациента, специалисты в данной области могут определять соответствующую дозу и метод введения с учетом указанных обстоятельств.The method of administration can be selected accordingly depending on the age and symptoms of the patient. The dose of the pharmaceutical composition containing the polypeptide can be selected from a range of, for example, 0.0001 to 1000 mg per kg body weight per dose. Alternatively, the dose of the pharmaceutical composition containing the polypeptide can be selected from, for example, 0.001 to 100,000 mg per patient. However, the present invention is not necessarily limited to these numerical values. Although the dose and method of administration vary depending on body weight, age, symptoms, etc. patient, those skilled in the art can determine the appropriate dosage and method of administration based on the circumstances.

Настоящее изобретение относится также к способам получения полипептида, содержащего транспортирующий фрагмент, который имеет ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен.The present invention also relates to methods for producing a polypeptide containing a transport moiety that has an inhibitory domain and an antigen binding domain.

Один из способов получения полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, является способ, который включает: получение антигенсвязывающего домена, обладающего антигенсвязывающей активностью; сцепление антигенсвязывающего домена с транспортирующим фрагментом так, чтобы антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена ингибировалась ингибирующим доменом, с получением полипептида-предшественника; и дополнительная инсерция сайта расщепления в полипептид-предшественник или замена части полипептида-предшественника на сайт расщепления. Метод интродукции сайта расщепления может представлять собой любую инсерцию сайта расщепления и изменение части полипептида-предшественника так, чтобы сайт расщепление мог быть интродуцирован в полипептид-предшественник. Альтернативно этому, сайт изменения можно интродуцировать в полипептид-предшественник путем объединения обоих подходов. Указанный вариант осуществления изобретения должен быть очевиден специалистам в данной области после ознакомления с настоящим описанием и включен в объем настоящего изобретения.One method for producing the polypeptide of the present invention is a method that includes: obtaining an antigen binding domain having antigen binding activity; linking the antigen binding domain to the transport moiety such that the antigen binding activity of the antigen binding domain is inhibited by the inhibitory domain to produce a precursor polypeptide; and further inserting a cleavage site into the precursor polypeptide or replacing a portion of the precursor polypeptide with a cleavage site. The cleavage site introduction method may be any insertion of a cleavage site and alteration of a portion of a precursor polypeptide so that a cleavage site can be introduced into the precursor polypeptide. Alternatively, the change site can be introduced into the precursor polypeptide by combining both approaches. This embodiment will be apparent to those skilled in the art upon reading the present description and is included within the scope of the present invention.

Другой способ получения полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, представляет собой способ, который включает: получение антигенсвязывающего домена, обладающего антигенсвязывающей активность; и сцепление антигенсвязывающего домена с транспортирующим фрагментом через сайт расщепления так, чтобы антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена ингибировалась ингибирующим доменом, с получением полипептида. Когда антигенсвязывающий домен сцеплен с транспортирующим фрагментом через сайт расщепления, то сайт расщепления может представлять собой «прослойку» между антигенсвязывающим доменом и транспортирующим фрагментом, или часть антигенсвязывающего домена или/и часть транспортирующего фрагмента может быть изменена и может применяться в качестве части сайта расщепления.Another method for producing the polypeptide of the present invention is a method that includes: obtaining an antigen binding domain having antigen binding activity; and linking the antigen binding domain to the transport moiety through a cleavage site such that the antigen binding activity of the antigen binding domain is inhibited by the inhibitory domain to produce a polypeptide. When the antigen binding domain is linked to the transport moiety via a cleavage site, the cleavage site may be a "gap" between the antigen binding domain and the transport moiety, or a portion of the antigen binding domain and/or a portion of the transport moiety may be modified and used as part of the cleavage site.

«Встраивание, инсерция» аминокислотной последовательности А в аминокислотную последовательность Б означает расщепление аминокислотной последовательности Б на две части без делеции и сцепление двух частей с аминокислотной последовательностью А (т.е. получение такой аминокислотной последовательности, как «первая половина аминокислотной последовательности Б - аминокислотная последовательность А вторая половина аминокислотной последовательности Б»). «Интродукция» аминокислотной последовательности А в аминокислотную последовательность Б означает расщепление аминокислотной последовательности Б на две части и связывание двух частей с аминокислотной последовательностью А. Это включает не только указанное выше «встраивание» аминокислотной последовательности А в аминокислотную последовательность Б, но также сцепление двух частей с аминокислотной последовательностью А после делеции одного или нескольких аминокислотных остатков аминокислотной последовательности Б, включая остатки, примыкающие к аминокислотной последовательности А (т.е. замену части аминокислотной последовательности Б на аминокислотную последовательность А).“Integration, insertion” of amino acid sequence A into amino acid sequence B means splitting amino acid sequence B into two parts without deletion and linking the two parts with amino acid sequence A (i.e., obtaining an amino acid sequence such as “the first half of amino acid sequence B - amino acid sequence And the second half of the amino acid sequence B"). "Introduction" of amino acid sequence A into amino acid sequence B means the cleavage of amino acid sequence B into two parts and the linkage of the two parts to amino acid sequence A. This includes not only the above "incorporation" of amino acid sequence A into amino acid sequence B, but also the linkage of the two parts to amino acid sequence A after deletion of one or more amino acid residues of amino acid sequence B, including residues adjacent to amino acid sequence A (i.e., replacement of part of amino acid sequence B with amino acid sequence A).

Одним из вариантов осуществления изобретения являются способы получения полипептида, в которых используют однодоменное антитело в качестве антигенсвязывающего домена и используют расщепляемую протеазой последовательность в качестве сайта расщепления, которые будут описаны ниже.One embodiment of the invention is methods for producing a polypeptide that use a single domain antibody as the antigen binding domain and use a protease cleavable sequence as the cleavage site, which will be described below.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, который содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий следующие стадии:In one embodiment of the present invention, a method for producing a polypeptide that contains a transport moiety having an inhibitory domain and an antigen binding domain is a production method comprising the following steps:

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с транспортирующим фрагментом так, чтобы антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибировалась с помощью ингибирующего домена транспортирующего фрагмента, с образованием полипептида-предшественника; и(b) linking the single-domain antibody obtained in step (a) to the transport moiety so that the antigen-binding activity of the single-domain antibody is inhibited by the inhibitory domain of the transport moiety to form a precursor polypeptide; And

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности в полипептид-предщественник.(c) introduction of a protease-cleavable sequence into the precursor polypeptide.

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с транспортирующим фрагментом через расщепляемую протеазой последовательность так, чтобы антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибировалась с помощью ингибирующего домена транспортирующего фрагмента, с образованием полипептида.(b) linking the single domain antibody obtained in step (a) to the transport moiety via a protease cleavable sequence such that the antigen binding activity of the single domain antibody is inhibited by the inhibitory domain of the transport moiety to form a polypeptide.

В конкретном варианте осуществления изобретения способ получения полипептида, который содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий дополнительно следующую стадию:In a specific embodiment of the invention, a method for producing a polypeptide that contains a transport moiety having an inhibitory domain and an antigen binding domain is a production method further comprising the following step:

В настоящем изобретении фраза «связывающая активность ослабляется» означает, что связывающая активность в отношении антигена-мишени снижается по сравнению с активностью до сцепления, и уровень указанного снижения не ограничен.In the present invention, the phrase “binding activity is reduced” means that the binding activity to the target antigen is reduced compared to the pre-binding activity, and the level of the reduction is not limited.

(д) высвобождение однодоменного антитела посредством расщепления протеазой расщепляемой протеазой последовательности и подтверждение того, что высвободившееся однодоменное антитело связывается с антигеном- мишенью.(e) releasing the single domain antibody by protease cleavage of the protease cleavable sequence and confirming that the released single domain antibody binds the target antigen.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, который представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий следующие стадии:In one embodiment of the present invention, a method for producing a polypeptide that is an IgG-type antibody-like molecule that contains a transport moiety having an inhibitory domain and an antigen binding domain is a production method comprising the following steps:

(б) обеспечение осуществления ассоциации однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с VL в качестве замены VH антитела IgG-типа или обеспечение осуществления ассоциации однодоменного антитела с VH в качестве замены VL антитела IgG-типа, в результате чего антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибируется, с образованием подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет однодоменное антитело; и(b) causing the single-domain antibody obtained in step (a) to associate with VL as a replacement for the VH of an IgG-type antibody, or causing the single-domain antibody to associate with the VH as a replacement for the VL of an IgG-type antibody, resulting in antigen-binding activity of the single-domain antibody is inhibited to form an IgG-type antibody-like precursor molecule that carries a single domain antibody; And

(в) интродукция расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между однодоменным антителом и константной областью антитела в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника.(c) introducing a protease-cleavable sequence near the interface between the single domain antibody and the antibody constant region into an IgG-type antibody-like precursor molecule.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ получения полипептида, который представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий следующие стадии:In one embodiment of the invention, a method for producing a polypeptide that is an IgG antibody-like molecule that contains a transport moiety having an inhibitory domain and an antigen binding domain is a production method comprising the following steps:

(б) сцепление однодоменного антитела, полученного на стадии (а), в качестве замены VH или VL антитела IgG-типа с константной областью тяжелой цепи или с константной областью легкой цепи антитела IgG-типа через расщепляемую протеазой последовательность так, чтобы антигенсвязывающая активность однодоменного антитела ингибировалась, с образованием подобной антителу IgG-типа молекулы, которая несет однодоменное антитело.(b) linking the single domain antibody obtained in step (a) as a replacement for the VH or VL of an IgG antibody to the heavy chain constant region or light chain constant region of an IgG antibody through a protease cleavable sequence so that the antigen binding activity of the single domain antibody inhibited, producing an IgG-type antibody-like molecule that carries a single-domain antibody.

В конкретном варианте осуществления изобретения способ получения полипептида, который представляет собой молекулу, подобную антителу IgG-типа, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий дополнительно следующую стадию:In a specific embodiment of the invention, a method for producing a polypeptide that is an IgG-type antibody-like molecule that contains a transport moiety having an inhibitory domain and an antigen binding domain is a production method further comprising the following step:

(г) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, интродуцированного в подобную антителу IgG-типа молекулу или в подобную антителу IgG-типа молекулу-предшественника, в отношении антигена-мишени ослабляется или утрачивается.(d) confirming that the binding activity of the single domain antibody introduced into the IgG antibody-like molecule or into the IgG antibody-like precursor molecule towards the target antigen is attenuated or lost.

В настоящем изобретении фраза «связывающая активность ослабляется» означает, что связывающая активность в отношении антигена-мишени снижается по сравнению с активностью до ассоциации или сцепления, и уровень указанного снижения не ограничен.In the present invention, the phrase “binding activity is reduced” means that the binding activity to the target antigen is reduced compared to the activity before association or binding, and the level of the reduction is not limited.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, представляющего собой подобную антителу IgG-типа молекулу, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий дополнительно следующую стадию:In a specific embodiment of the present invention, a method for producing a polypeptide that is an IgG antibody-like molecule that contains a transport moiety having an inhibitory domain and an antigen binding domain is a production method further comprising the following step:

В случае применения VH, VL или VHH в качестве ингибирующего домена способ ингибирования антигенсвязывающей активности однодоменного антитела с помощью ингибирующего домена транспортирующего фрагмента включает способ обеспечения осуществления ассоциации однодоменного антитела с VH, VL или VHH. VH, VL или VHH, который ингибирует антигенсвязывающую активность полученного однодоменного антитела, можно отбирать с помощью скрининга, обеспечивая осуществление ассоциации известного VH, VL или VHH с однодоменным антителом и сравнивая антигенсвязывающую активность однодоменного антитела до и после ассоциации.When using VH, VL or VHH as the inhibitory domain, a method of inhibiting the antigen binding activity of a single domain antibody using a transport moiety inhibitory domain includes a method of causing the single domain antibody to associate with VH, VL or VHH. A VH, VL or VHH that inhibits the antigen binding activity of a resulting single domain antibody can be selected by screening by associating a known VH, VL or VHH with the single domain antibody and comparing the antigen binding activity of the single domain antibody before and after association.

В другом способе для ингибирования антигенсвязывающей активности однодоменного антитела с помощью конкретного VH, VL или VHH аминокислотный остаток, участвующий в ассоциации с VH, VL или VHH в однодоменном антителе, можно заменять для усиления ассоциации, или пару однодоменное антитело/ингибирующий домен, обладающую требуемым уровнем различия в антигенсвязывающей активности до и после ассоциации, можно получать также, используя однодоменное антитело, которое в исходном состоянии имеет в качестве аминокислотного остатка остаток, который может усиливать ассоциацию.In another method for inhibiting the antigen binding activity of a single domain antibody with a particular VH, VL or VHH, the amino acid residue involved in association with VH, VL or VHH in the single domain antibody can be replaced to enhance the association, or the single domain antibody/inhibitory domain pair having the desired level differences in antigen-binding activity before and after association can also be obtained using a single-domain antibody, which in its original state has as an amino acid residue a residue that can enhance the association.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ получения полипептида, представляющего собой подобную антителу IgG-типа молекулу, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий следующие стадии:In one embodiment of the present invention, a method for producing a polypeptide that is an IgG antibody-like molecule that contains a transport moiety having an inhibitory domain and an antigen binding domain is a production method comprising the following steps:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VH антитела, или замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VL антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена- мишени;(a) replacing an amino acid residue in a single-domain antibody that is involved in association with the VH of the antibody, or replacing an amino acid residue in a single-domain antibody that is involved in association with the VL of the antibody, to produce a variant single-domain antibody that retains the binding activity of the single-domain antibody to an antigen- targets;

(б) обеспечение осуществления ассоциации варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с VH антитела или обеспечение осуществления ассоциации варианта однодоменного антитела с VL антитела так, чтобы антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела ингибировалась, с образованием подобной антителу IgG-типа молекулы-предшественника, которая несет вариант однодоменного антитела; и(b) causing the single-domain antibody variant obtained in step (a) to associate with the VH of the antibody, or causing the single-domain antibody variant to associate with the VL of the antibody such that the antigen-binding activity of the single-domain antibody variant is inhibited to form an IgG-type antibody-like precursor molecule , which carries a single-domain antibody variant; And

(б) сцепление варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с константной областью тяжелой цепи антитела IgG-типа через расщепляемую протеазой последовательность или сцепление варианта однодоменного антитела с константной областью легкой цепи антитела IgG-типа через расщепляемую протеазой последовательность так, чтобы антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела ингибировалась, с образованием подобной антителу IgG-типа молекулы, которая несет вариант однодоменного антитела.(b) linking the single-domain antibody variant obtained in step (a) to the heavy chain constant region of an IgG-type antibody through a protease-cleavable sequence, or linking the single-domain antibody variant to the light chain constant region of an IgG-type antibody through a protease-cleavable sequence so that the antigen-binding the activity of the single-domain antibody variant is inhibited, producing an IgG-type antibody-like molecule that carries the single-domain antibody variant.

В конкретном варианте осуществления изобретения способ получения полипептида, представляющего собой подобную антителу IgG-типа молекулу, которая содержит транспортирующий фрагмент, имеющий ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен, представляет собой способ получения, включающий дополнительно следующую стадию:In a specific embodiment of the invention, a method for producing a polypeptide that is an IgG-type antibody-like molecule that contains a transport moiety having an inhibitory domain and an antigen binding domain is a production method further comprising the following step:

(г) подтверждение того, что связывающая активность варианта однодоменного антитела, находящегося в подобной антителу IgG-типа молекуле или подобной антителу IgG-типа молекуле-предшественнике, в отношении антигена-мишени ослабляется или утрачивается.(d) confirming that the binding activity of the single domain antibody variant found in an IgG antibody-like molecule or an IgG antibody-like precursor molecule to the target antigen is attenuated or lost.

Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, каждый из которых кодирует полипептид, содержащий транспортирующий фрагмент, который имеет ингибирующий домен, и антигенсвязывающий домен.The present invention also relates to polynucleotides, each of which encodes a polypeptide containing a transport moiety that has an inhibitory domain and an antigen binding domain.

Полинуклеотид, предлагаемый в настоящем изобретении, как правило, присутствует в (или встроен в) соответствующем векторе и им трансфектируют клетки-хозяева. Вектор не ограничен конкретным вектором, если он стабильно сохраняет встроенную нуклеиновую кислоту. Например, когда в качестве хозяина применяют Е. coli, то вектор pBluescript (производства фирмы Stratagene Corp.) или подобные векторы являются предпочтительными в качестве вектора для клонирования. Можно применять различные поступающие в продажу векторы. В случае применения вектора для получения полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, наиболее ценным является экспрессионный вектор. Экспрессионный вектор не ограничен конкретным вектором, если он сохраняет способность обеспечивать экспрессию полипептида in vitro, в Е. coli, в культивируемых клетках или организме индивидуумов. Например, предпочтительно можно применять экспрессионный вектор, такой как вектор pBEST (производства фирмы Promega Corp.) для экспрессии in vitro; вектор рЕТ (производства фирмы Invitrogen Corp.) для экспрессии в Е. coli; вектор pME18S-FL3 (GenBank, код доступа № АВ009864) для экспрессии в культуре клеток и вектор pME18S (Takebe и др., Mol. Cell Biol. 8, 1988, сс. 466-472) для экспрессии в организме индивидуумов. Встраивание ДНК, предлагаемой в настоящем изобретении, в вектор можно осуществлять общепринятым методом, например, с помощью реакции в присутствии лигазы с использованием сайтов, распознаваемых рестриктазами (Current protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel и др., изд-во Publish. John Wiley & Sons, раздел 11.4-11.11, 1987).The polynucleotide of the present invention is typically present in (or inserted into) a suitable vector and is transfected into host cells. The vector is not limited to a particular vector as long as it stably retains the integrated nucleic acid. For example, when E. coli is used as the host, the pBluescript vector (manufactured by Stratagene Corp.) or the like is preferred as the cloning vector. Various commercially available vectors can be used. When using a vector to produce the polypeptide of the present invention, the most valuable is the expression vector. The expression vector is not limited to a particular vector as long as it retains the ability to express the polypeptide in vitro, in E. coli, in cultured cells or in individuals. For example, it is preferable to use an expression vector such as the pBEST vector (manufactured by Promega Corp.) for in vitro expression; vector pET (manufactured by Invitrogen Corp.) for expression in E. coli; vector pME18S-FL3 (GenBank accession no. AB009864) for expression in cell culture; and vector pME18S (Takebe et al., Mol. Cell Biol. 8, 1988, pp. 466-472) for expression in individuals. Incorporation of the DNA of the present invention into a vector can be accomplished by conventional methods, for example, by a ligase reaction using restriction enzyme sites (Current protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Publish. John Wiley & Sons, section 11.4-11.11, 1987).

Клетки-хозяева не ограничены конкретными клетками и различные клетки-хозяева можно применять в зависимости от поставленной цели. Примеры клеток для экспрессии полипептида могут включать бактериальные клетки (например, Streptococcus, Staphylococcus, Е. coli, Streptomyces и Bacillus subtilis), грибные клетки (например, дрожжей и Aspergillus), клетки насекомых (например, Drosophila S2 и Spodoptera SF9), клетки животных (например,СНО, COS, HeLa, С127, 3Т3, ВНК, НЕК293 и клетки бычьей меланомы) и клетки растений. Трансфекцию вектором клеток-хозяев можно осуществлять с помощью метода, известного в данной области, например, метода осаждения фосфатом кальция, метода электропорации (Current protocols in Molecular Biology под ред. Ausubel и др., изд-во Publish. John Wiley & Sons, раздел 9.1-9.9, 1987), метода с использованием липофектамина (производства фирмы GIBCO-BRL) или метода микроинъекции.Host cells are not limited to specific cells, and different host cells can be used depending on the purpose. Examples of cells for expression of the polypeptide may include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces and Bacillus subtilis), fungal cells (eg, yeast and Aspergillus), insect cells (eg, Drosophila S2 and Spodoptera SF9), animal cells (eg CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293 and bovine melanoma cells) and plant cells. Transfection of the vector into host cells can be accomplished using a method known in the art, for example, the calcium phosphate precipitation method, the electroporation method (Current protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel et al., Publish. John Wiley & Sons, section 9.1-9.9, 1987), the method using lipofectamine (manufactured by GIBCO-BRL) or the microinjection method.

Соответствующий секреторный сигнал можно включать в представляющий интерес полипептид для того, чтобы секретировать полипептид, экспрессируемый в клетках-хозяевах, в полость эндоплазматического ретикулума, периплазматическое пространство или внеклеточное окружение. Сигнал может быть эндогенным для представляющего интерес полипептида или может представлять собой чужеродный сигнал.An appropriate secretory signal can be included in the polypeptide of interest in order to secrete the polypeptide expressed in host cells into the endoplasmic reticulum lumen, periplasmic space or extracellular environment. The signal may be endogenous to the polypeptide of interest or may be a foreign signal.

Когда полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, секретируется в среду, то выделение полипептида в процессе производства осуществляют путем выделения среды. Когда полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, получают в клетках, то клетки сначала лизируют, а затем выделяют полипептид.When the polypeptide of the present invention is secreted into a medium, the release of the polypeptide during production is accomplished by isolating the medium. When the polypeptide of the present invention is produced in cells, the cells are first lysed and then the polypeptide is isolated.

Методы, известные в данный области, включающие осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию гидрофобных взаимодействий, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиаппатите и хроматографию лектинов можно применять для выделения и очистки полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, из культуры рекомбинантных клеток.Methods known in the art, including ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography can be used to isolate and purify the polypeptide provided in the present invention, from a culture of recombinant cells.

Примеры антигенсвязывающего домена, применяемого в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, включают однодоменное антитело. В указанных вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающую активность однодоменного антитела можно ингибировать путем его ассоциации с конкретным VL, путем его ассоциации с конкретным VH или путем его ассоциации с конкретным VHH. Настоящее изобретение относится также к способам скрининга указанных однодоменных антител. VL, VH или VHH, имеющий известную последовательность, например, VL, VH или VHH, имеющий последовательность, которая зарегистрирована в IMGT или базе данных Кэбота, можно применять в качестве VL, VH или VHH, который ингибирует антигенсвязывающую активность однодоменного антитела. Кроме того, можно примерять последовательность VL, VH или VHH, впервые идентифицированную в библиотеке человеческих антител или т.п. VL, VH или VHH, который ингибирует связывающую активность однодоменного антитела, можно отбирать, получая белок путем комбинации этих последовательностей и измеряя связывающую активность с помощью описанного выше метода.Examples of an antigen binding domain used in some embodiments of the present invention include a single domain antibody. In these embodiments, the antigen binding activity of a single domain antibody can be inhibited by its association with a particular VL, by its association with a particular VH, or by its association with a particular VHH. The present invention also relates to methods for screening these single domain antibodies. A VL, VH or VHH having a known sequence, for example, a VL, VH or VHH having a sequence that is registered in the IMGT or the Cabot database, can be used as a VL, VH or VHH that inhibits the antigen binding activity of a single domain antibody. In addition, a VL, VH or VHH sequence first identified in a human antibody library or the like can be sampled. A VL, VH or VHH that inhibits the binding activity of a single domain antibody can be selected by preparing the protein by combining these sequences and measuring the binding activity using the method described above.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно применять VL, VH или VHH, имеющий последовательность человеческой зародышевой линии, в качестве VL, VH или VHH, который ингибирует антигенсвязывающую активность однодоменного антитела. Например, в случае применения VL в качестве ингибирующего домена, можно применять VL, имеющий каркасные последовательности каппа-цепи, или VL, имеющий каркасные последовательности лямбда-цепи. Кроме того, можно применять VL, имеющий модифицированные каркасные последовательности, такие как объединенные каркасные последовательности каппа-цепи и лямбда-цепи.In some embodiments of the present invention, a VL, VH, or VHH having a human germline sequence may be used as a VL, VH, or VHH that inhibits the antigen binding activity of a single domain antibody. For example, when using a VL as an inhibitory domain, a VL having kappa chain framework sequences or a VL having lambda chain framework sequences can be used. In addition, VL having modified framework sequences, such as combined kappa chain and lambda chain framework sequences, can be used.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем его ассоциации с конкретным VL, включающий следующие стадии:In one embodiment, the present invention provides a method for screening a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited by association with a specific VL, comprising the following steps:

(а) получение однодоменного антитела, обладающего связывающей активностью в отношении антигена-мишени;(a) obtaining a single domain antibody having binding activity against a target antigen;

(в) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, ассоциированного с конкретным VL на стадии (б), в отношении антигена ослабляется или утрачивается.(c) confirming that the binding activity of the single domain antibody associated with a particular VL in step (b) to the antigen is weakened or lost.

В настоящем изобретении фраза «связывающая активность ослабляется» означает, что связывающая активность в отношении антигена-мишени снижается по сравнению с активностью до ассоциации, и уровень указанного снижения не ограничен.In the present invention, the phrase “binding activity is reduced” means that the binding activity to the target antigen is reduced compared to the activity before association, and the level of the reduction is not limited.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем его ассоциации с конкретным VH, включающий следующие стадии:In one embodiment, the present invention provides a method for screening a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited by association with a specific VH, comprising the following steps:

(в) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, ассоциированного с конкретным VH на стадии (б), в отношении антигена ослабляется или утрачивается.(c) confirming that the binding activity of the single domain antibody associated with the particular VH in step (b) to the antigen is weakened or lost.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ скрининга однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать путем его ассоциации с конкретным VHH, включающий следующие стадии:In one embodiment, the present invention provides a method for screening a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited by association with a specific VHH, comprising the following steps:

(б) обеспечение осуществления ассоциации однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VHH; и(b) causing the single domain antibody obtained in step (a) to associate with a particular VHH; And

(в) подтверждение того, что связывающая активность однодоменного антитела, ассоциированного с конкретным VHH на стадии (б), в отношении антигена ослабляется или утрачивается.(c) confirming that the binding activity of the single domain antibody associated with the particular VHH in step (b) to the antigen is weakened or lost.

Примеры способа (обеспечения) осуществления ассоциации однодоменного антитела с конкретным VL, VH или VHH включают способ создания молекулы, которая имеет последовательность однодоменного антитела в качестве замены последовательности одного из VH и VL в антителе или фрагменте антитела, который содержит и VH, и VL, таком как интактное антитело, Fab, Fab' или (Fab)₂, и экспрессирует полипептид, имеющий указанную последовательность.Examples of a method for causing association of a single-domain antibody with a particular VL, VH, or VHH include a method of creating a molecule that has a single-domain antibody sequence as a replacement for the sequence of one of the VH and VL in an antibody or antibody fragment that contains both a VH and a VL, such as an intact antibody, Fab, Fab' or (Fab) ₂ , and expresses a polypeptide having the specified sequence.

Настоящее изобретение относится также к способу получения однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем усиления ассоциации однодоменного антитела с конкретным VL, путем усиления ассоциации однодоменного антитела с конкретным VH или путем усиления ассоциации однодоменного антитела с конкретным VHH, в дополнение к скринингу однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем его ассоциации с конкретным VL, путем его ассоциации с конкретным VH или путем его ассоциации с конкретным VHH.The present invention also provides a method for producing a single-domain antibody whose antigen-binding activity is inhibited by enhancing the association of the single-domain antibody with a particular VL, by enhancing the association of a single-domain antibody with a particular VH, or by enhancing the association of a single-domain antibody with a particular VHH, in addition to screening the single-domain antibody for antigen-binding activity which is inhibited by its association with a particular VL, by its association with a particular VH, or by its association with a particular VHH.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем его ассоциации с конкретным VL, включающий следующую стадию:In one embodiment, the present invention provides a method for producing a single domain antibody, the antigen binding activity of which is inhibited by its association with a specific VL, comprising the following step:

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем его ассоциации с конкретным VL, дополнительно включающий следующие стадии:In a specific embodiment, the present invention provides a method for producing a single domain antibody whose antigen binding activity is inhibited by its association with a specific VL, further comprising the following steps:

(б) обеспечение осуществления ассоциации варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VL; и(b) causing the single domain antibody variant obtained in step (a) to be associated with a particular VL; And

(в) подтверждение того, что антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела, ассоциированного с VL, ослабляется или утрачивается.(c) confirmation that the antigen binding activity of the VL associated single domain antibody variant is attenuated or lost.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем его ассоциации с конкретным VH, включающий следующую стадию:In one embodiment, the present invention provides a method for producing a single domain antibody, the antigen binding activity of which is inhibited by its association with a specific VH, comprising the following step:

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем его ассоциации с конкретным VH, дополнительно включающий следующие стадии:In a specific embodiment, the present invention provides a method for producing a single domain antibody whose antigen binding activity is inhibited by its association with a specific VH, further comprising the following steps:

(б) обеспечение осуществления ассоциации варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VH; и(b) causing the single domain antibody variant obtained in step (a) to associate with a particular VH; And

(в) подтверждение того, что антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела, ассоциированного с VH, ослабляется или утрачивается.(c) confirmation that the antigen binding activity of the VH associated single domain antibody variant is attenuated or lost.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем его ассоциации с конкретным VHH, включающий следующую стадию:In one embodiment, the present invention provides a method for producing a single domain antibody, the antigen binding activity of which is inhibited by its association with a specific VHH, comprising the following step:

(а) замена аминокислотного остатка в однодоменном антителе, который участвует в ассоциации с VHH антитела, с получением варианта однодоменного антитела, который сохраняет связывающую активность однодоменного антитела в отношении антигена-мишени.(a) replacing an amino acid residue in a single-domain antibody that is involved in association with the VHH of the antibody to produce a variant single-domain antibody that retains the binding activity of the single-domain antibody to a target antigen.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ получения однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем его ассоциации с конкретным VHH, дополнительно включающий следующие стадии:In a specific embodiment, the present invention provides a method for producing a single domain antibody whose antigen binding activity is inhibited by its association with a specific VHH, further comprising the following steps:

(б) обеспечение осуществления ассоциации варианта однодоменного антитела, полученного на стадии (а), с конкретным VHH; и(b) causing the single domain antibody variant obtained in step (a) to associate with a particular VHH; And

(в) подтверждение того, что антигенсвязывающая активность варианта однодоменного антитела, ассоциированного с VHH, ослабляется или утрачивается.(c) confirmation that the antigen binding activity of the VHH associated single domain antibody variant is attenuated or lost.

Стадию обеспечения осуществления ассоциации однодоменного антитела с конкретным VL, VH или VHH осуществляют с помощью способа создания молекулы, которая имеет последовательность однодоменного антитела в качестве замены последовательности одного из VH и VL в антителе или фрагменте антитела, который содержит и VH, и VL, таком как интактное антитело, Fab, Fab' или (Fab)₂, и экспрессирует полипептид, имеющий указанную последовательность.The step of causing a single-domain antibody to associate with a particular VL, VH, or VHH is accomplished by a method of creating a molecule that has a single-domain antibody sequence as a replacement for the sequence of one of the VH and VL in an antibody or antibody fragment that contains both a VH and a VL, such as an intact antibody, Fab, Fab' or (Fab) ₂ , and expresses a polypeptide having the specified sequence.

Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения однодоменное антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, антигенсвязывающая активность которого ингибируется или утрачивается при его ассоциации с конкретным VL, VH или VHH, можно получать из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом.In a specific embodiment of the present invention, a single domain antibody of the present invention, the antigen binding activity of which is inhibited or lost upon association with a particular VL, VH, or VHH, can be obtained from a library containing a plurality of single domain antibody fusion polypeptides, each of which is linked to a first supporting domain association.

Согласно настоящему описанию вариант «библиотеки» может представлять собой библиотеку, обеспечивающую эффективное получение однодоменного антитела, антигенсвязывающая активность которого ингибируется или утрачивается при его ассоциации с конкретным VL, VH или VHH.As used herein, an embodiment of a “library” may be a library that efficiently produces a single domain antibody whose antigen binding activity is inhibited or lost upon association with a particular VL, VH, or VHH.

В настоящем описании понятие «библиотека» относится к набору множества слитых полипептидов, имеющих различные последовательности, или набору нуклеиновых кислот или полинуклеотидов, кодирующих эти слитые полипептиды. Множество слитых полипептидов, находящихся в библиотеке, представляют собой слитые полипептиды, отличающиеся по последовательности друг от друга, не имеющие сигнальной последовательности.As used herein, the term “library” refers to a collection of multiple fusion polypeptides having different sequences, or a collection of nucleic acids or polynucleotides encoding these fusion polypeptides. The plurality of fusion polypeptides found in the library are fusion polypeptides that differ in sequence from each other and do not have a signal sequence.

В настоящем описании понятие «отличающиеся по последовательности друг от друга» касательно слитых полипептидов, отличающихся по последовательности друг от друга, означает, что индивидуальные слитые полипептиды в библиотеке имеют различные последовательности. Более предпочтительно, понятие означает, что фрагменты однодоменных антител в индивидуальных слитых полипептидах в библиотеке имеют различные последовательности. В частности, количество различных последовательностей в библиотеке отражает количество независимых клонов, отличающихся по последовательности, в библиотеке, и это обозначают также как «размер библиотеки». Размер библиотеки обычной фаговой дисплейной библиотеки составляет от 10⁶ до 10¹² и может быть увеличен до 10¹⁴ с помощью методики, известной в данной области, такой как метод рибосомного дисплея. Однако фактическое количество фаговых частиц для применения в селекции с помощью пэннинга фаговой библиотеки, как правило, в 10-10000 раз превышает размер библиотеки. Указанная чрезмерная кратность, которую обозначают также как «количество эквивалентов библиотеки», означает, что от 10 до 10000 индивидуальных клонов могут иметь одинаковую аминокислотную последовательность. Таким образом, понятие «отличающиеся по последовательности друг от друга» согласно настоящему изобретению означает, что индивидуальные полипептиды в библиотеке, исключая количество эквивалентов библиотеки, имеют различные последовательности, и более конкретно означает, что библиотека имеет от 10⁶ до 10¹⁴ молекул, предпочтительно от 10⁷ до 10¹² молекул полипептидов, отличающихся по последовательности друг от друга.As used herein, the term “different in sequence from each other” with respect to fusion polypeptides different in sequence from each other means that the individual fusion polypeptides in the library have different sequences. More preferably, the term means that the single domain antibody fragments in the individual fusion polypeptides in the library have different sequences. In particular, the number of different sequences in the library reflects the number of independent clones differing in sequence in the library, and this is also referred to as “library size”. The library size of a typical phage display library is from 10 ⁶ to 10 ¹² and can be increased to 10 ¹⁴ using a technique known in the art, such as the ribosome display method. However, the actual number of phage particles to be used in selection by panning a phage library is typically 10-10,000 times the size of the library. This excess fold, also referred to as “number of library equivalents,” means that 10 to 10,000 individual clones may have the same amino acid sequence. Thus, the term “different in sequence from each other” according to the present invention means that the individual polypeptides in the library, excluding the number of library equivalents, have different sequences, and more specifically means that the library has from 10 ⁶ to 10 ¹⁴ molecules, preferably from 10 ⁷ to 10 ¹² polypeptide molecules that differ in sequence from each other.

Понятие «множество» применительно к библиотеке, состоящей в основном из множества слитых полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, относится к набору из двух или большего типов субстанций, таких, например, как полипептид, полинуклеотидная молекула, вектор или вирус, предлагаемые в настоящем изобретении. При условии, что, например, две или большее количество субстанций отличаются друг от друга конкретным признаком, это означает, что субстанции относятся к двум или большему количеству типов. Их примеры могут включать мутантную аминокислоту, обнаруженную в конкретном аминокислотном положении в аминокислотной последовательности. Например, два или большее количество полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, которые имеют практически одинаковые, предпочтительно идентичные последовательности, за исключением конкретных мутантных аминокислот, экспонируемых на поверхности, в совершенно различных аминокислотных положениях, рассматриваются в качестве множества полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении. В другом примере две или большее количество молекул полинуклеотидов, предлагаемых в настоящем изобретении, которые имеют практически одинаковые, предпочтительно идентичные последовательности, за исключением оснований, кодирующих конкретные мутантные аминокислоты, экспонируемые на поверхности, в совершенно различных аминокислотных положениях, рассматриваются в качестве множества молекул полинуклеотидов, предлагаемых в настоящем изобретении.The term “multiple,” as applied to a library of substantially multiple fusion polypeptides of the present invention, refers to a set of two or more types of substances, such as a polypeptide, polynucleotide molecule, vector, or virus of the present invention. Provided that, for example, two or more substances differ from each other in a particular characteristic, this means that the substances belong to two or more types. Examples thereof may include a mutant amino acid found at a particular amino acid position in an amino acid sequence. For example, two or more polypeptides of the present invention that have substantially the same, preferably identical, sequences, except for specific mutant amino acids exposed on the surface, at completely different amino acid positions, are considered a plurality of polypeptides of the present invention. In another example, two or more polynucleotide molecules of the present invention that have substantially the same, preferably identical, sequences, except for bases encoding specific mutant amino acids exposed on the surface, at completely different amino acid positions, are considered to be a plurality of polynucleotide molecules, proposed in the present invention.

Методы пэннинга, которые применяют для фаговых векторов, предпочтительно применяют также в качестве метода скрининга слитых полипептидов с применением с качестве показателя связывающей активности. Ген, кодирующий каждое однодоменное антитело, и ген, кодирующий CH1-домен или константную область легкой цепи антитела IgG-типа, можно соединять в соответствующей форме с получением слитого полипептида. Гены, кодирующие полученные таким образом слитые полипептиды, можно встраивать в фаговые векторы с получением фагов, которые экспрессируют на поверхности слитые полипептиды. После контакта фагов с требуемым антигеном фаги, связанные с антигеном, можно выделять, выделяя ДНК, кодирующие слитые полипептиды, которые имеют представляющую интерес связывающую активность. Эту операцию можно при необходимости повторять для обогащения слитыми полипептидами, которые имеют требуемую связывающую активность.Panning methods that are used for phage vectors are preferably also used as a method for screening fusion polypeptides using as an indicator of binding activity. The gene encoding each single-domain antibody and the gene encoding the CH1 domain or light chain constant region of an IgG-type antibody can be combined in an appropriate form to produce a fusion polypeptide. The genes encoding the fusion polypeptides thus obtained can be inserted into phage vectors to produce phages that express the fusion polypeptides on their surface. Once the phages have been contacted with the desired antigen, the phages bound to the antigen can be isolated by isolating DNA encoding fusion polypeptides that have the binding activity of interest. This operation can be repeated as necessary to enrich for fusion polypeptides that have the desired binding activity.

В дополнение к методу фагового дисплея методика, основанная на применении бесклеточной системы трансляции, методика презентации слитых полипептидов на поверхности клетки или вируса, методика, основанная на применении эмульсии, и т.п., известны в качестве методик получения слитых полипептидов путем пэннинга с применением библиотеки. Например, метод рибосомного дисплея, включающий формирование комплекса мРНК и транслируемого белка с участием рибосомы путем удаления стоп-кодона и т.д., метод дисплея кДНК или мРНК, включающий ковалентное связывание генной последовательности с транслируемым белком с использованием такого соединения, как пуромицин, или метод CIS-дисплея, включающий формирование комплекса гена и транслируемого белка с использованием связывающей белок нуклеиновой кислоты, можно применять в качестве методики, основанной на применении бесклеточной системы трансляции. Например, можно применять метод фагового дисплея, а также метод дисплея на Е. coli, метод дисплея на грамположительных бактериях, метод дрожжевого дисплея, метод дисплея на клетках млекопитающих или метод вирусного дисплея, в качестве методики презентации слитых полипептидов на поверхности клетки или вируса. Например, метод вирусного дисплея in vitro с использованием эмульсии, содержащей ген и связанную с трансляцией молекулу, можно применять в качестве методики, основанной на применении эмульсии. Эти методы уже известные в данной области (Nat Biotechnol. 18(12), декабрь 2000 г., сс. 1287-1292, Nucleic Acids Res. 34(19), 2006, е127, Proc Natl Acad Sci USA. 101(9), 2 марта 2004 г., сс. 2806-2810, Proc Natl Acad Sci USA. 101(25), 22 июня 2004 г., сс. 9193-9198, Protein Eng Des Sel. 21(4), апреля 2008 г., сс. 247-255, Proc Natl Acad Sci USA. 97(20), 26 сентября 2000 г., сс. 10701-10705, MAbs. 2(5), сентябрь-октябрь 2010 г., сс. 508-518, Methods Mol Biol. 911, 2012, сс. 183-198).In addition to the phage display method, a cell-free translation system-based technique, a fusion polypeptide presentation technique on the surface of a cell or virus, an emulsion-based technique, etc. are known as library panning techniques for producing fusion polypeptides . For example, a ribosomal display method involving the formation of a complex of mRNA and a translated protein with the participation of a ribosome by removing a stop codon, etc., a cDNA or mRNA display method involving the covalent linking of a gene sequence to a translated protein using a compound such as puromycin, or The CIS display method, which involves the formation of a gene-translated protein complex using a protein-binding nucleic acid, can be used as a technique based on the use of a cell-free translation system. For example, a phage display method, as well as an E. coli display method, a Gram-positive bacteria display method, a yeast display method, a mammalian cell display method, or a viral display method, can be used as a technique for presenting fusion polypeptides on the surface of a cell or virus. For example, an in vitro viral display method using an emulsion containing a gene and a translation-associated molecule can be used as an emulsion-based technique. These methods are already known in the field (Nat Biotechnol. 18(12), December 2000, pp. 1287-1292, Nucleic Acids Res. 34(19), 2006, e127, Proc Natl Acad Sci USA. 101(9) , March 2, 2004, pp. 2806-2810, Proc Natl Acad Sci USA. 101(25), June 22, 2004, pp. 9193-9198, Protein Eng Des Sel. 21(4), April 2008. , pp. 247-255, Proc Natl Acad Sci USA. 97(20), September 26, 2000, pp. 10701-10705, MAbs. 2(5), September-October 2010, pp. 508-518, Methods Mol Biol 911, 2012, pp. 183-198).

Партнера по ассоциации ингибирующего домена, сцепленного со вторым поддерживающим ассоциацию доменом, можно применять в способе получения представляющего интерес однодоменного антитела из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом.An association partner of an inhibitory domain linked to a second association-supporting domain can be used in a method for producing a single-domain antibody of interest from a library containing a plurality of single-domain antibody fusion polypeptides, each linked to a first association-supporting domain.

В настоящем описании понятие «первый поддерживающий ассоциацию домен» и «второй поддерживающий ассоциацию домен» относится к доменам, которые могут взаимодействовать друг с другом через связь, такую как гидрофобная связь, водородная связь или ионная связь, с образованием продукта ассоциации. Предпочтительные примеры первого поддерживающего ассоциацию домена и второго поддерживающего ассоциацию домена включают (но, не ограничиваясь только ими) константные области легкой цепи (CL) и СН1-домены константных областей тяжелой цепи антитела.As used herein, the terms “first association-supporting domain” and “second association-supporting domain” refer to domains that can interact with each other through a bond, such as a hydrophobic bond, hydrogen bond, or ionic bond, to form an association product. Preferred examples of the first association-supporting domain and the second association-supporting domain include, but are not limited to, light chain constant regions (CL) and CH1 domains of antibody heavy chain constant regions.

Первый поддерживающий ассоциацию домен и второй поддерживающий ассоциацию домен могут взаимодействовать друг с другом и образовывать ассоциацию слитого полипептида с партнером по ассоциации, вне зависимости от степени способности к ассоциации (степени сочетательности) между однодоменным антителом и ингибирующий доменом.The first association-supporting domain and the second association-supporting domain can interact with each other and form an association of the fusion polypeptide with an association partner, regardless of the degree of association ability (degree of coexistence) between the single-domain antibody and the inhibitory domain.

В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения предложена библиотека, содержащая множество слитых полипептидов однодоменных антител, сцепленных с константной областью легкой цепи антитела IgG-типа, в которой однодоменные антитела включают однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого ингибируется или утрачивается при его ассоциации с конкретным VL, VH или VHH, и способ скрининга библиотеки в отношении однодоменного антитела, антигенсвязывающую активность которого можно ингибировать, или она может утрачиваться при ассоциации с конкретным VL, VH или VHH.In an alternative embodiment, the present invention provides a library containing a plurality of single-domain antibody fusion polypeptides linked to the light chain constant region of an IgG-type antibody, wherein the single-domain antibodies include a single-domain antibody whose antigen-binding activity is inhibited or lost upon association with a particular VL, VH, or VHH, and a method of screening a library for a single domain antibody whose antigen binding activity can be inhibited or lost upon association with a particular VL, VH or VHH.

В конкретном варианте осуществления изобретения, который представлен на фиг. 9А(1), 9А(2), 9А(3), 9Б и 9В,In a specific embodiment of the invention, which is shown in FIG. 9A(1), 9A(2), 9A(3), 9B and 9B,

(1) слитые полипептиды однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом, экспонируют на поверхности фагов или т.п. с использованием метода дисплея, такого как фаговый дисплей.(1) single-domain antibody fusion polypeptides, each linked to a first association-supporting domain, are displayed on the surface of phages or the like. using a display method such as phage display.

(2) Получают партнера по ассоциации ингибирующего домена, сцепленного со вторым поддерживающим ассоциацию доменом, и осуществляют ассоциацию слитых полипептидов с партнером по ассоциации. Отбирают слитый полипептид, который не связывается с антигеном-мишенью или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его, в указанном состоянии слитого полипептида, ассоциированного с партнером по ассоциации.(2) An association partner of an inhibitory domain linked to a second association supporting domain is obtained, and the fusion polypeptides are associated with the association partner. A fusion polypeptide is selected that does not bind to the target antigen or has antigen binding activity that is at or below a predetermined level in the specified state of the fusion polypeptide associated with the association partner.

(3) Ассоциацию однодоменного антитела в слитом полипептиде, отобранном в подпункте (2), с ингибирующий доменом в партнере по ассоциации аннулируют. Отбирают слитый полипептид, который связывается с антигеном-мишенью или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, в состоянии, в котором однодоменное антитело не находится в ассоциации с ингибирующим доменом.(3) The association of the single domain antibody in the fusion polypeptide selected in subparagraph (2) with the inhibitory domain in the association partner is abrogated. A fusion polypeptide is selected that binds to a target antigen or has antigen binding activity that is at or above a predetermined level in a state in which the single domain antibody is not in association with an inhibitory domain.

В этом контексте, например, способ расщепления партнера по ассоциации вблизи границы между ингибирующим доменом и вторым поддерживающим ассоциацию доменом, который проиллюстрирован на фиг. 9Б, или способ расщепления слитого полипептида вблизи границы между однодоменным антителом и первым поддерживающим ассоциацию доменом, который проиллюстрирован на фиг. 9В, можно применять в качестве способа аннулирования ассоциации однодоменного антитела с ингибирующим доменом.In this context, for example, a method for cleaving an association partner near the boundary between an inhibitory domain and a second association-supporting domain, which is illustrated in FIG. 9B, or a method for cleaving a fusion polypeptide near the interface between a single domain antibody and a first association supporting domain, which is illustrated in FIG. 9B can be used as a method of abrogating the association of a single domain antibody with an inhibitory domain.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ, включающий, как продемонстрировано на фиг. 9Г, сравнение различия в связывающей активности однодоменного антитела в случае, когда однодоменное антитело и ингибирующий домен экспрессируют совместно, и в случае, когда однодоменное антитело экспрессируют таким образом, чтобы не имела место его совместная экспрессия с ингибирующий доменом, вместо сравнения различия в связывающей активности однодоменного антитела в случае аннулированной ассоциации и неаннулированной ассоциации однодоменного антитела с ингибирующим доменом, как продемонстрировано на фиг. 9А-9В.Another embodiment of the present invention is a method comprising, as shown in FIG. 9D, comparing the difference in binding activity of a single-domain antibody in the case where the single-domain antibody and the inhibitory domain are co-expressed and in the case where the single-domain antibody is expressed in such a way that it is not co-expressed with the inhibitory domain, instead of comparing the difference in binding activity of the single-domain antibodies in the case of abrogated association and non-abrogated association of a single domain antibody with an inhibitory domain, as demonstrated in FIG. 9A-9B.

Как продемонстрировано на фиг. 9Г(1), однодоменное антитело и ингибирующий домен экспрессируют совместно таким образом, чтобы происходила ассоциация. Отбирают слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его, в указанном состоянии. Как продемонстрировано на фиг. 9Г(2), 9Г(2') и 9Г(2''), однодоменное антитело экспрессируют так, чтобы вместе с ним не экспрессировался ингибирующий домен. Отбирают слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, в указанном состоянии. Таким образом, в результате скрининга можно отбирать однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого ингибируется или утрачивается при его ассоциации с конкретным ингибирующим доменом, например, VH, VL или VHH, из библиотеки, которая содержит множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом. Альтернативно этому, однодоменное антитело экспрессируют так, чтобы вместе с ним не экспрессировался ингибирующий домен. Отбирают полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, в указанном состоянии. Затем однодоменное антитело и ингибирующий домен экспрессируют совместно таким образом, чтобы происходила ассоциации. Отбирают полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его, в указанном состоянии. С помощью этого способа можно также отбирать в результате скрининга однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого ингибируется или утрачивается при его ассоциации с конкретным ингибирующим доменом, например, VH, VL или VHH, из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом. Альтернативно этому, как продемонстрировано на фиг. 9Г(2), 9Г(2') и 9Г(2''), однодоменное антитело экспрессируют так, чтобы вместе с ним не экспрессировался ингибирующий домен (экспрессируют только однодоменное антитело; экспрессируют только слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело и первый поддерживающий ассоциацию домен; или слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело и первый поддерживающий ассоциацию домен, объединяют путем ассоциации только со вторым поддерживающим ассоциацию доменом), и отбирают слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, в указанном состоянии. Затем, как продемонстрировано на фиг. 9Г(1), экспрессируют совместно однодоменное антитело в отобранном слитом полипептиде и ингибирующий домен с образованием ассоциации. Отбирают слитый полипептид, содержащий однодоменное антитело, которое не связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его, в указанном состоянии. В результате можно также отбирать с помощью скрининга однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого ингибируется или утрачивается при его ассоциации с конкретным ингибирующим доменом, например, VH, VL или VHH, из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с первым поддерживающим ассоциацию доменом.As shown in FIG. 9G(1), a single domain antibody and an inhibitory domain are co-expressed so that association occurs. A fusion polypeptide containing a single domain antibody that does not bind to an antigen or has an antigen binding activity that is at or below a predetermined level in a specified state is selected. As shown in FIG. 9G(2), 9G(2') and 9G(2''), a single-domain antibody is expressed so that the inhibitory domain is not expressed along with it. A fusion polypeptide containing a single-domain antibody that binds to an antigen or has an antigen-binding activity that is at or above a predetermined level in a specified state is selected. Thus, a screen can select a single-domain antibody whose antigen-binding activity is inhibited or lost upon association with a particular inhibitory domain, such as VH, VL, or VHH, from a library that contains a plurality of single-domain antibody fusion polypeptides, each linked to the first domain supporting the association. Alternatively, a single domain antibody is expressed such that the inhibitory domain is not expressed with it. A polypeptide is selected containing a single domain antibody that binds to an antigen or has antigen binding activity that is at or above a predetermined level in a specified state. The single domain antibody and the inhibitory domain are then co-expressed so that association occurs. A polypeptide containing a single-domain antibody that does not bind to an antigen or has an antigen-binding activity that is at or below a predetermined level in a specified state is selected. This method can also screen for a single-domain antibody whose antigen-binding activity is inhibited or lost upon association with a particular inhibitory domain, such as VH, VL, or VHH, from a library containing a plurality of single-domain antibody fusion polypeptides, each linked to the first domain to support the association. Alternatively, as shown in FIG. 9G(2), 9G(2') and 9G(2''), a single-domain antibody is expressed so that the inhibitory domain is not expressed along with it (only a single-domain antibody is expressed; only a fusion polypeptide containing a single-domain antibody and the first association-supporting domain is expressed ; or a fusion polypeptide containing a single-domain antibody and a first association-supporting domain is combined by association with only a second association-supporting domain), and a fusion polypeptide containing a single-domain antibody that binds to an antigen or has an antigen-binding activity that is at or above a predetermined level is selected it, in the stated condition. Then, as shown in FIG. 9G(1), co-express a single-domain antibody in a selected fusion polypeptide and an inhibitory domain to form an association. A fusion polypeptide containing a single domain antibody that does not bind to an antigen or has an antigen binding activity that is at or below a predetermined level in a specified state is selected. As a result, it is also possible to screen a single-domain antibody whose antigen-binding activity is inhibited or lost upon association with a particular inhibitory domain, e.g., VH, VL, or VHH, from a library containing a plurality of single-domain antibody fusion polypeptides, each linked to a first supporting domain association.

«Антигенсвязывающий активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его» может означать, например, антигенсвязывающую активность, которая снижается ниже предварительно установленного референс-уровня, когда антигенсвязывающую активность измеряют с помощью метода, указанного в настоящем описании. Аналогично этому, «антигенсвязывающий активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его» может означать, например, антигенсвязывающую активность, которая превышает предварительно установленный референс-уровень, когда антигенсвязывающую активность измеряют с помощью метода, указанного в настоящем описании. Слитый полипептид, имеющий антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его, связывается сильнее с антигеном, чем слитый полипептид, имеющий антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его.“Antigen binding activity that is at or below a predetermined level” may mean, for example, antigen binding activity that decreases below a predetermined reference level when the antigen binding activity is measured using the method specified herein. Likewise, “antigen binding activity that is at or above a predetermined level” may mean, for example, antigen binding activity that exceeds a predetermined reference level when the antigen binding activity is measured using the method specified herein. A fusion polypeptide having an antigen binding activity that is at or above a predetermined level binds more strongly to an antigen than a fusion polypeptide having an antigen binding activity that is at or below a predetermined level.

Слитый полипептид, отобранный в описанном выше подпункте (3), содержит однодоменное антитело, которое не обладает или обладает слабой антигенсвязывающей активностью в состоянии ассоциации с ингибирующим доменом и имеет (или имеет сильную) антигенсвязывающую активность в состоянии отсутствия ассоциации с ингибирующим доменом. Последовательность слитого полипептида, отобранного указанным способом, можно анализировать для дополнительного получения данных о последовательности однодоменного антитела, содержащегося в нем. Таким образом можно получать однодоменное антитело.The fusion polypeptide selected in (3) above comprises a single domain antibody that has no or weak antigen binding activity when associated with an inhibitory domain and has (or has strong) antigen binding activity when not associated with an inhibitory domain. The sequence of a fusion polypeptide selected by this method can be analyzed to further obtain sequence information about the single domain antibody contained therein. In this way, a single domain antibody can be produced.

Для способов скрининга в отношении слитого полипептида, содержащего представляющее интерес однодоменное антитело, путем использования слитых полипептидов и партнера по ассоциации, важно сравнивать антигенсвязывающую активность однодоменного антитела в состоянии ассоциации и в состоянии отсутствия ассоциации с ингибирующим доменом. Как продемонстрировано на фиг. 9А(2') и 9А(3'), сначала подтверждают антигенсвязывающую активность экспонированных слитых полипептидов и отбирают слитые полипептиды, которые связываются с антигеном или имеют антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или выше его. Затем дают осуществляться ассоциации отобранных таким образом слитых полипептидов с партнером по ассоциации. Отбирают слитые полипептиды, которые не связываются с антигеном или имеют антигенсвязывающую активность, которая соответствует предварительно установленному уровню или ниже его в указанном состоянии. С помощью указанного способа можно получать также слитый полипептид, содержащий представляющее интерес однодоменное антитело.For methods of screening for a fusion polypeptide containing a single domain antibody of interest using the fusion polypeptides and an association partner, it is important to compare the antigen binding activity of a single domain antibody in a state of association and in a state of no association with an inhibitory domain. As shown in FIG. 9A(2') and 9A(3'), first confirm the antigen binding activity of the exposed fusion polypeptides and select fusion polypeptides that bind to an antigen or have an antigen binding activity that is at or above a predetermined level. The thus selected fusion polypeptides are then allowed to associate with an association partner. Fusion polypeptides are selected that do not bind antigen or have antigen binding activity that is at or below a predetermined level in the specified state. Using this method, it is also possible to obtain a fusion polypeptide containing a single domain antibody of interest.

Ниже в настоящем описании представлено несколько вариантов осуществления изобретения, в которых использовали СН1-домен антитела IgG-типа в качестве первого поддерживающего ассоциацию домена и использовали CL антитела IgG-типа в качестве второго поддерживающего ассоциацию домена.Presented below are several embodiments of the invention that use the CH1 domain of an IgG antibody as the first association-supporting domain and use the CL of an IgG-type antibody as the second association-supporting domain.

Слитый полипептид, содержащий представляющее интерес однодоменное антитело, можно подвергать скринингу, используя библиотеку, содержащую множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с СН1-доменом антитела IgG-типа.A fusion polypeptide containing a single-domain antibody of interest can be screened using a library containing a plurality of single-domain antibody fusion polypeptides, each linked to the CH1 domain of an IgG-type antibody.

Некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения является библиотека, содержащая множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с СН1-доменом антитела IgG-типа, где однодоменные антитела включают однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого ингибируется или утрачивается при его ассоциации с конкретным VL, VH или VHH, и способ скрининга библиотеки в отношении слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или утрачиваться при его ассоциации с конкретным VL, VH или VHH.Some embodiments of the present invention is a library containing a plurality of single-domain antibody fusion polypeptides, each linked to the CH1 domain of an IgG-type antibody, wherein the single-domain antibodies include a single-domain antibody whose antigen-binding activity is inhibited or lost upon association with a particular VL, VH, or VHH, and a method of screening a library for a fusion polypeptide containing a single domain antibody whose antigen binding activity may be inhibited or lost upon association with a particular VL, VH or VHH.

Конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения является способ скрининга в отношении слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться при его ассоциации с конкретным VL, из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с СН1-доменом антитела IgG-типа. В частности, в настоящем изобретении предложен способ скрининга в отношении однодоменного антитела, включающий следующие стадии:A specific embodiment of the present invention is a method of screening for a fusion polypeptide containing a single domain antibody, the antigen binding activity of which can be inhibited or lost upon association with a particular VL, from a library containing a plurality of single domain antibody fusion polypeptides, each of which is linked to a CH1 domain. IgG-type antibodies. In particular, the present invention provides a method for screening for a single domain antibody, comprising the following steps:

(а) обеспечение осуществления экспонирования in vitro слитых полипептидов из библиотеки, предлагаемой в настоящем изобретении;(a) allowing for in vitro display of fusion polypeptides from the library of the present invention;

(б) получение партнера по ассоциации, включающего константную область легкой цепи антитела IgG-типа, слитую с конкретным VL;(b) obtaining an association partner comprising an IgG-type antibody light chain constant region fused to a specific VL;

(в) обеспечение осуществления ассоциации каждого из слитых полипептидов, экспонированных на стадии (а), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого(ых) полипептида(ов), который(ые) не связывается(ются) с антигеном или имеет(ют) антигенсвязывающую активность, соответствующую предварительно установленному уровню или ниже его в состоянии, в котором однодоменное антитело ассоциировано с VL; и(c) causing each of the fusion polypeptides exposed in step (a) to associate with the association partner obtained in step (b) and selecting the fusion polypeptide(s) that do not bind. with an antigen or has antigen binding activity at or below a predetermined level in the state in which the single domain antibody is associated with the VL; And

(г) выбор из слитого(ых) полипептида(ов), отобранного(ых) на стадии (в), слитого полипептида, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, соответствующую предварительно установленному уровню или выше его в состоянии, в котором содержащееся в нем однодоменное антитело не находится в ассоциации с VL.(d) selecting from the fusion polypeptide(s) selected in step (c), a fusion polypeptide that binds to an antigen or has antigen-binding activity at or above a predetermined level in the state in which it is contained in In this case, the single domain antibody is not in association with VL.

Партнер по ассоциации, полученный на стадии (б), дополнительно содержит расщепляемую протеазой последовательность. В этом случае на стадии (г) ассоциация однодоменного антитела с VL аннулируется обработкой протеазой, и антигенсвязывающую активность однодоменного антитела можно подтверждать в состоянии, в котором однодоменное антитело не находится в ассоциации с VL. Расщепляемая протеазой последовательность в партнере по ассоциации не ограничена ее положением, если ассоциация однодоменного антитела с VL аннулируется расщеплением. В качестве примера положения расщепляемая протеазой последовательность может быть локализована, например, вблизи границы между VL и константной областью легкой цепи антитела IgG-типа в партнере по ассоциации, предпочтительно в любом положении между аминокислотой в положении 96 (нумерация Кэбота) VL и аминокислотой в положении 130 (EU-нумерация) (нумерация положения 130 по Кэботу) константной области легкой цепи антитела, более предпочтительно в любом положении между аминокислотой в положении 104 (нумерация Кэбота) VL и аминокислотой в положении 113 (EU-нумерация) (нумерация положения 113 по Кэботу) константной области легкой цепи антитела.The association partner obtained in step (b) further contains a protease-cleavable sequence. In this case, in step (d), the association of the single domain antibody with the VL is abolished by protease treatment, and the antigen binding activity of the single domain antibody can be confirmed in a state in which the single domain antibody is not in association with the VL. The protease-cleavable sequence in the association partner is not limited by its position if the association of the single-domain antibody with the VL is abrogated by cleavage. As an example of a position, the protease-cleavable sequence may be located, for example, near the boundary between VL and the light chain constant region of an IgG-type antibody in an association partner, preferably at any position between the amino acid at position 96 (Cabot numbering) of VL and the amino acid at position 130 (EU numbering) (Cabot numbering position 130) of an antibody light chain constant region, more preferably at any position between the amino acid at position 104 (Cabot numbering) of VL and the amino acid at position 113 (EU numbering) (Cabot numbering position 113) constant region of the antibody light chain.

Вместо применения партнера по ассоциации, содержащего расщепляемую протеазой последовательность, расщепляемую протеазой последовательность можно интродуцировать в слитые полипептиды в библиотеке, и слитые полипептиды можно расщеплять протеазой так, чтобы аннулировать ассоциацию однодоменного антитела с VL. Положение расщепляемой протеазой последовательности в каждом слитом полипептиде не ограничено ее положением, если ассоциация однодоменного антитела с VL аннулируется расщеплением, и однодоменное антитело сохраняет свою антигенсвязывающую активность после расщепления. В качестве примера положения расщепляемая протеазой последовательность может быть локализована, например, вблизи границы между однодоменным антителом и СН1-доменом антитела IgG-типа в слитом полипептиде.Instead of using an association partner containing a protease-cleavable sequence, the protease-cleavable sequence can be introduced into fusion polypeptides in the library, and the fusion polypeptides can be protease-cleaved so as to abrogate the association of the single-domain antibody with the VL. The position of the protease-cleavable sequence in each fusion polypeptide is not limited by its position as long as the association of the single-domain antibody with the VL is abolished by cleavage and the single-domain antibody retains its antigen-binding activity after cleavage. As an example of a position, the protease-cleavable sequence may be located, for example, near the boundary between a single-domain antibody and the CH1 domain of an IgG-type antibody in a fusion polypeptide.

На стадии (г) полноразмерный(ые) слитый(ые) полипептид(ы), отобранный(ые) на стадии (в), или их фрагменты, содержащие однодоменные антитела, можно вновь экспонировать и антигенсвязывающую активность однодоменного антитела можно подтверждать в состоянии, в котором однодоменное антитело не находится в ассоциации с VL.In step (d), the full-length fusion polypeptide(s) selected in step (c) or fragments thereof containing single-domain antibodies can be redisplayed and the antigen-binding activity of the single-domain antibody can be confirmed in the state in which in which the single domain antibody is not in association with VL.

Конкретным вариантом осуществления изобретения является способ скрининга в отношении слитого полипептида, содержащего однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого может ингибироваться или может утрачиваться при его ассоциации с конкретным VH, из библиотеки, содержащей множество слитых полипептидов однодоменных антител, каждое из которых сцеплено с константной областью легкой цепи антитела IgG-типа. В частности, в настоящем изобретении предложен способ скрининга в отношении однодоменного антитела, включающий следующие стадии:A specific embodiment of the invention is a method of screening for a fusion polypeptide containing a single domain antibody, the antigen binding activity of which can be inhibited or lost upon association with a particular VH, from a library containing a plurality of single domain antibody fusion polypeptides, each of which is linked to a light chain constant region IgG-type antibodies. In particular, the present invention provides a method for screening for a single domain antibody, comprising the following steps:

(б) получение партнера по ассоциации, включающего CHI-домен антитела IgG-типа, слитый с конкретным VH;(b) obtaining an association partner comprising the CHI domain of an IgG antibody fused to a specific VH;

(в) обеспечение осуществления ассоциации слитых полипептидов, экспонированных на стадии (а), с партнером по ассоциации, полученным на стадии (б), и отбор слитого(ых) полипептида(ов), который(ые) не связывается(ются) с антигеном или имеет(ют) антигенсвязывающую активность, соответствующую предварительно установленному уровню или ниже его в состоянии, в котором однодоменное антитело ассоциировано с VH; и(c) allowing the fusion polypeptides exposed in step (a) to associate with the association partner obtained in step (b) and selecting fusion polypeptide(s) that do not bind to the antigen or has(s) antigen binding activity at or below a predetermined level in a state in which the single domain antibody is associated with VH; And

(г) выбор из слитого(ых) полипептида(ов), отобранного(ых) на стадии (в), слитого полипептида, который связывается с антигеном или имеет антигенсвязывающую активность, соответствующую предварительно установленному уровню или выше его в состоянии, в котором содержащееся в нем однодоменное антитело не находится в ассоциации с VH.(d) selecting from the fusion polypeptide(s) selected in step (c), a fusion polypeptide that binds to an antigen or has antigen-binding activity at or above a predetermined level in the state in which it is contained in In this case, the single-domain antibody is not in association with VH.

Партнер по ассоциации, полученный на стадии (б), дополнительно содержит расщепляемую протеазой последовательность. В этом случае на стадии (г) ассоциация однодоменного антитела с VH аннулируется обработкой протеазой, и антигенсвязывающую активность однодоменного антитела можно подтверждать в состоянии, в котором однодоменное антитело не находится в ассоциации с VH. Расщепляемая протеазой последовательность в партнере по ассоциации не ограничена ее положением, если ассоциация однодоменного антитела с VH аннулируется расщеплением. В качестве примера положения расщепляемая протеазой последовательность может быть локализована, например, вблизи границы между VH и СН1-доменом антитела IgG-типа в партнере по ассоциации, предпочтительно в любом положении между аминокислотой в положении 101 (нумерация Кэбота) VH и аминокислотой в положении 140 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела, более предпочтительно в любом положении между аминокислотой в положении 109 (нумерация Кэбота) VH и аминокислотой в положении 122 (EU-нумерация) константной области тяжелой цепи антитела.The association partner obtained in step (b) further contains a protease-cleavable sequence. In this case, in step (d), the association of the single domain antibody with the VH is abolished by protease treatment, and the antigen binding activity of the single domain antibody can be confirmed in a state in which the single domain antibody is not in association with the VH. The protease-cleavable sequence in the association partner is not limited by its position if the association of the single-domain antibody with the VH is abrogated by cleavage. As an example of a position, the protease-cleavable sequence may be located, for example, near the boundary between the VH and CH1 domain of an IgG-type antibody in an association partner, preferably at any position between the amino acid at position 101 (Cabot numbering) of VH and the amino acid at position 140 ( EU numbering) of the antibody heavy chain constant region, more preferably at any position between the amino acid at position 109 (Cabot numbering) of VH and the amino acid at position 122 (EU numbering) of the antibody heavy chain constant region.

Вместо применения партнера по ассоциации, содержащего расщепляемую протеазой последовательность, расщепляемую протеазой последовательность можно интродуцировать в слитые полипептиды в библиотеке, и слитые полипептиды можно расщеплять протеазой так, чтобы аннулировать ассоциацию однодоменного антитела с VH. Положение расщепляемой протеазой последовательности в каждом слитом полипептиде не ограничено ее положением, если ассоциация однодоменного антитела с VH аннулируется расщеплением, и однодоменное антитело сохраняет свою антигенсвязывающую активность после расщепления. В качестве примера положения расщепляемая протеазой последовательность может быть локализована, например, вблизи границы между однодоменным антителом и константной областью легкой цепи антитела IgG-типа в слитом полипептиде.Instead of using an association partner containing a protease-cleavable sequence, the protease-cleavable sequence can be introduced into fusion polypeptides in the library, and the fusion polypeptides can be protease-cleaved so as to abrogate the association of the single-domain antibody with the VH. The position of the protease-cleavable sequence in each fusion polypeptide is not limited by its position as long as the association of the single-domain antibody with VH is abolished by cleavage and the single-domain antibody retains its antigen-binding activity after cleavage. As an example of a position, the protease-cleavable sequence may be located, for example, near the interface between a single domain antibody and the light chain constant region of an IgG-type antibody in a fusion polypeptide.

На стадии (г) полноразмерный(ые) слитый(ые) полипептид(ы), отобранный(ые) на стадии (в), или их фрагменты, содержащие однодоменные антитела, можно вновь экспонировать и антигенсвязывающую активность однодоменного антитела можно подтверждать в состоянии, в котором однодоменное антитело не находится в ассоциации с VH.In step (d), the full-length fusion polypeptide(s) selected in step (c) or fragments thereof containing single-domain antibodies can be redisplayed and the antigen-binding activity of the single-domain antibody can be confirmed in the state in which in which the single domain antibody is not in association with VH.

Аминокислоты, содержащиеся в каждой аминокислотной последовательности, указанной в настоящем описании, можно подвергать посттрансляционной модификации (например, модификация N-концевого глутамина в пироглутаминовую кислоту путем пироглутамилирования представляет собой модификацию, хорошо известную специалистам в данной области). Как должно быть очевидно, указанная аминокислотная последовательность, содержащая подвергнутую пост-трансляционной модификации аминокислоту, также относится к аминокислотной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении.The amino acids contained in each amino acid sequence specified herein may be subject to post-translational modification (eg, modification of N-terminal glutamine to pyroglutamic acid by pyroglutamylation is a modification well known to those skilled in the art). As should be obvious, the specified amino acid sequence containing subjected to post-translational modification of the amino acid also refers to the amino acid sequence proposed in the present invention.

Специалистам в данной области должно быть очевидно, что произвольные комбинации одного или нескольких вариантов осуществления изобретения, представленных в настоящем описании, можно включать также в настоящее изобретение, если это технически не противоречит основам, известным специалистам в данной области техники.It will be apparent to those skilled in the art that arbitrary combinations of one or more embodiments of the invention presented herein may also be included in the present invention as long as they are technically consistent with principles known to those skilled in the art.

ПримерыExamples

Ниже представлены примеры способа и композиций, предлагаемых в настоящем изобретении. Должно быть очевидно, что можно осуществлять различные другие варианты в свете упомянутого выше общего описания изобретения.Below are examples of the method and compositions proposed in the present invention. It should be obvious that various other embodiments can be carried out in light of the above general description of the invention.

Пример 1. Проблема, связанная с известными активируемыми протеазой антителамиExample 1 Problem with Known Protease Activated Antibodies

Описан способ получения антитела, которое проявляет антигенсвязывающую активность только после расщепления протеазой, которая экспрессируется в области повреждения, такой как раковая ткань или воспалительная ткань. Указанное антитело, называемое Probody, представляет собой молекулу антитела, представленную на фиг. 1, антигенсвязывающая активность которого ингибируется путем соединения антитела с пептидом, маскирующим антигенсвязывающий сайт антитела, через линкер, который расщепляется протеазой, экспрессируемой в области повреждения (NPL 18). Маскирующий пептид отделяется от Probody в результате расщепления компонента линкера с помощью протеазы, которая экспрессируется в патологически измененной области-мишени, так, что полученная в результате молекула антитела восстанавливает свою антигенсвязывающую активность и приобретает способность связываться с антигеном в патологически измененной ткани-мишени.A method is described for producing an antibody that exhibits antigen-binding activity only after cleavage by a protease that is expressed in an area of damage, such as cancerous tissue or inflammatory tissue. This antibody, called Probody, is the antibody molecule shown in FIG. 1, the antigen-binding activity of which is inhibited by connecting the antibody to a peptide that masks the antigen-binding site of the antibody through a linker that is cleaved by a protease expressed at the site of the lesion (NPL 18). The masking peptide is released from the Probody by cleavage of the linker component by a protease that is expressed in the diseased target region such that the resulting antibody molecule regains its antigen-binding activity and becomes capable of binding to the antigen in the diseased target tissue.

Предполагается, что Probody может связываться с антигеном избирательно в патологически измененной области-мишени с помощью описанного выше механизма и поэтому имеет расширенное терапевтическое окно. Однако, поскольку расщепление антитела протеазой является необратимым в случае Probody, то существует вероятность того, что антитело, расщепленное в патологически измененной области, может возвращаться в кровь из патологически измененной области и связываться с антигеном, который экспрессируется в здоровой ткани, в результате попадания антитела в здоровые ткани через кровоток. Probody, активированное протеазой, сохраняет Fc-область, такую же как у Probody до активации, и поэтому обладает длительным временем удержания в крови. Поэтому антитело, активированное протеазой, которая экспрессируется в патологически измененной области, может длительное время циркулировать в крови. Протеаза, даже если она характеризуется повышенным уровнем экспрессии в патологически измененной области, экспрессируется также и в здоровых тканях, и свободная протеаза, продуцируемая в патологически измененной области, может проникать в кровь (The Chinese-German Journal of Clinical Oncology т. 3, №. 2, июнь 2004 г., cc. 78-80). Таким образом, Probody может активироваться указанной свободной протеазой. Следовательно, существует вероятность того, что Probody будет активироваться в области, отличенной от патологически измененной области. Активированное таким образом Probody также циркулирует в крови в течение длительного времени. Таким образом, существует возможность того, что происходит постоянная активация Probody в патологически измененной области, в здоровых тканях и в крови, и активированное Probody, если имеет продолжительное время удержания в крови, накапливается в крови. Активированное Probody, накопленное в крови, может вызывать побочные действия путем связывания с антигеном который экспрессируется в здоровых тканях (фиг. 2).It is believed that Probody can bind to antigen selectively in the diseased target region through the mechanism described above and therefore has an extended therapeutic window. However, since protease cleavage of an antibody is irreversible in the case of Probody, there is a possibility that antibody cleaved in the diseased area may return to the blood from the diseased area and bind to an antigen that is expressed in healthy tissue, resulting in the antibody entering the bloodstream. healthy tissue through the bloodstream. Probody activated by protease retains the same Fc region as Probody before activation and therefore has a long retention time in the blood. Therefore, an antibody activated by a protease that is expressed in a pathologically changed area can circulate in the blood for a long time. A protease, even if it is overexpressed in the diseased area, is also expressed in healthy tissues, and free protease produced in the diseased area can enter the blood (The Chinese-German Journal of Clinical Oncology vol. 3, no. 2, June 2004, pp. 78-80). Thus, Probody can be activated by said free protease. Therefore, there is a possibility that Probody will be activated in an area different from the pathologically altered area. Probody activated in this way also circulates in the blood for a long time. Thus, there is the possibility that there is constant activation of Probody in the pathologically changed area, in healthy tissues and in the blood, and the activated Probody, if it has a long retention time in the blood, accumulates in the blood. Activated Probody accumulated in the blood can cause side effects by binding to an antigen that is expressed in healthy tissues (Fig. 2).

Антигенсвязывающая активность Probody ингибируется маскирующим пептидом, сцепленным с антителом через линкер, однако антигенсвязывающая активность не полностью ингибируется. Probody находится в равновесии между состоянием, в котором маскирующий пептид, сцепленный через линкер, связан с антигенсвязывающим сайтом, и состоянием, в котором маскирующий пептид отделен от него в результате диссоциации. Молекула в диссоциированном состоянии может связываться с антигеном (фиг. 3). Фактически, Probody, представляющее собой антитело к EGFR, описанное в NPL 17, обладает связывающей активностью в отношении EGFR даже до расщепления протеазой линкера. Хотя антигенсвязывающая активность повышается в 30-100 раз в результате расщепления линкера протеазой, Probody, которое присутствует в высокой концентрации до активации, может вызывать побочные действия при связывании с антигеном, который экспрессируется в здоровых тканях, поскольку связывающая активность Probody до активации составляет от 1/30 до 1/100 от связывающей активности активированного Probody.The antigen binding activity of Probody is inhibited by a masking peptide linked to the antibody via a linker, but the antigen binding activity is not completely inhibited. The Probody is in equilibrium between a state in which the masking peptide linked through a linker is associated with the antigen-binding site, and a state in which the masking peptide is separated from it by dissociation. The molecule in a dissociated state can bind to the antigen (Fig. 3). In fact, Probody, an anti-EGFR antibody described in NPL 17, has EGFR binding activity even before protease cleavage of the linker. Although antigen-binding activity is increased 30- to 100-fold by protease cleavage of the linker, Probody, which is present at high concentrations prior to activation, may cause side effects when binding to antigen that is expressed in healthy tissues, since the binding activity of Probody prior to activation is 1/1/2. 30 to 1/100 of the binding activity of activated Probody.

В Probody применяют искусственный пептид для маскировки антигенсвязывающего сайта антитела. Искусственный пептид имеет последовательность, которая отсутствует в нативных человеческих белках, и поэтому может обладать иммуногенностью для людей. Известно, что указанная иммуногенность снижает воздействия лекарственных средств на основе антител путем индукции антител к лекарственным средствам (Blood. 127 (13), 31 марта 2016 г., сс. 1633-1641).Probody uses an artificial peptide to mask the antigen-binding site of an antibody. The artificial peptide has a sequence that is not found in native human proteins and may therefore be immunogenic in humans. This immunogenicity is known to reduce the effects of antibody-based drugs by inducing antibodies to the drugs (Blood. 127 (13), March 31, 2016, pp. 1633-1641).

Возможные антитела к Probody в виде антител к лекарственным средствам представляют собой антитело к лекарственному средству против комплекса антитела и маскирующего пептида (Probody до активации), антитело к лекарственному средству против антитела, отделившегося в результате диссоциации от маскирующего пептида (активированное Probody), антитело к лекарственному средству против маскирующего пептида (маскирующий пептид, отделившийся в результате диссоциации от активированного Probody) и т.п. Среди них антитело к лекарственному средству против маскирующего пептида (антитело к маскирующему пептиду) может связываться с маскирующим пептидом Probody до активации и тем самым активировать Probody даже без расщепления протеазой (фиг. 4). Probody, активированное антителом к маскирующему пептиду, может вызывать побочные действия при связывании с антигеном, который экспрессируется в здоровых тканях.Possible anti-Probody antibodies in the form of anti-drug antibodies are anti-drug antibody against the antibody-masking peptide complex (Probody before activation), anti-drug antibody against the antibody dissociated from the masking peptide (activated Probody), anti-drug antibody anti-masking peptide agent (masking peptide separated as a result of dissociation from the activated Probody), etc. Among them, the drug antibody against the masking peptide (anti-masking peptide antibody) can bind to the Probody masking peptide before activation and thereby activate the Probody even without protease cleavage (Fig. 4). Probody activated by masking peptide antibody may cause side effects when bound to an antigen that is expressed in healthy tissues.

Пример 2. Концепция, касающаяся активируемого протеазой полипептида, содержащего однодоменное антителоExample 2 Concept Concerning a Protease Activated Polypeptide Containing a Single Domain Antibody

Как продемонстрировано в примере 1, с технологией Probody связаны следующие проблемы:As demonstrated in Case Study 1, the challenges associated with Probody technology are:

1. Probody, активированное расщеплением протеазой, имеет длительное время удержания в крови1. Probody, activated by protease cleavage, has a long retention time in the blood

2. Даже до расщепления протеазой Probody имеет связывающую активность в отношении антигена.2. Even before protease cleavage, Probody has antigen binding activity.

3. Маскирующий пептид представляет собой искусственную нечеловеческую последовательность и может индуцировать антитела против маскирующего пептида.3. Masking peptide is an artificial non-human sequence and can induce antibodies against the masking peptide.

При создании изобретения высказано предположение о том, что путь, который можно применять для решения указанных проблем и создания лекарственного средства на основе антитела, обладающего активностью в патологически измененных областей, должен удовлетворять следующим условиям:In making the invention, it was suggested that a route that can be used to solve these problems and create an antibody-based drug that has activity in pathologically altered areas must satisfy the following conditions:

1. Антигенсвязывающий домен, активированный расщеплением протеазой, имеет короткое время полужизни в крови.1. The antigen binding domain activated by protease cleavage has a short half-life in the blood.

2. Антигенсвязывающая активность молекулы до расщепления протеазой является минимизированной.2. Antigen-binding activity of the molecule before cleavage by protease is minimized.

3. Маскирующий пептид, имеющий искусственную нечеловеческую последовательность, не применяется.3. Masking peptide having an artificial non-human sequence is not used.

При создании настоящего изобретения создана молекула, представленная на фиг. 5, в качестве одного примера полипептида, который удовлетворяет описанным выше условиям. Полипептид с антигенсвязывающим доменом, сцепленным с транспортирующим фрагментом, имеет длительное время полужизни и не связывается с антигеном, поскольку антигенсвязывающая активность антигенсвязывающего домена заингибирована (А). Антигенсвязывающий домен высвобождается и высвободившийся таким образом антигенсвязывающий домен восстанавливает свою антигенсвязывающую активность и кроме того, имеет короткое время полужизни (Б). Полипептид, представленный на фиг. 5, имеет различные варианты. В случае применения подобной антителу IgG-типа молекулы, полипептид можно получать с помощью способа получения, проиллюстрированного на фиг. 6. Сначала получают однодоменное антитело (например, VH или VHH), связывающееся с антигеном-мишенью (А). Дают осуществляться ассоциации однодоменного антитела в качестве замены одного из доменов VH и VL в антителе IgG-типа, которое имеет последовательность зародышевой линии, с одним другим доменом (VL или VH) с получением подобной антителу IgG-типа молекулы (Б). Расщепляемую протеазой последовательность интродуцируют в подобную антителу IgG-типа молекулу (В). Примеры положения, в которое осуществляют интродукцию, включают положение вблизи границы между включенным однодоменным антителом (VH или VHH) и константной областью (СН1 или CL).The present invention has created the molecule shown in FIG. 5 as one example of a polypeptide that satisfies the conditions described above. A polypeptide with an antigen binding domain linked to a transport moiety has a long half-life and does not bind to antigen because the antigen binding activity of the antigen binding domain is inhibited (A). The antigen binding domain is released and the thus released antigen binding domain regains its antigen binding activity and also has a short half-life (B). The polypeptide shown in FIG. 5, has various options. In the case of using an IgG-type antibody-like molecule, the polypeptide can be produced using the production method illustrated in FIG. 6. First, a single domain antibody (eg VH or VHH) is prepared that binds to the target antigen (A). A single domain antibody, as a replacement for one of the VH and VL domains in an IgG antibody that has a germline sequence, is allowed to associate with one other domain (VL or VH) to produce an IgG antibody-like molecule (B). The protease-cleavable sequence is introduced into an IgG-type antibody-like molecule (B). Examples of the position at which introduction occurs include a position near the boundary between the included single domain antibody (VH or VHH) and the constant region (CH1 or CL).

Однодоменное антитело имеет антигенсвязывающую активность в индивидуальном состоянии, но утрачивает свою антигенсвязывающую активность после формирования вариабельной области с использованием VL, VH, VHH или т.п. VL или VH имеет последовательность нативного антитела, имеющего последовательность зародышевой линии, и поэтому имеет низкий риск иммуногенности и с низкой долей вероятности может индуцировать антитело к лекарственному средству, распознающее указанный домен VL или VH. В случае формирования вариабельной области однодоменного антитела с использованием VHH, гуманизация VHH снижает риск иммуногенности и снижает вероятность индукции антитела к лекарственному средству, распознающего гуманизированный VHH. Расщепляемая протеазой последовательность, встроенная в подобную антителу IgG-типа молекулу, расщепляется протеазой таким образом, чтобы высвобождалось однодоменное антитело. Высвободившееся однодоменное антитело обладает антигенсвязывающей активностью. Подобная антителу IgG-типа молекула до расщепления структурно схожа с каноническими молекулами IgG и поэтому имеет продолжительное время удержания в крови, в то время как однодоменное антитело, высвободившееся в результате расщепления протеазой, имеет молекулярную массу примерно 13 кДа, у него не сохраняется Fc-область и поэтому оно быстро выводится посредством почечной экскреции. Фактически время полужизни полноразмерного IgG составляет порядка 2-3 недель (Blood. 127 (13), 31 марта 2016 г., 1633-1641), в то время как время полужизни однодоменного антитела составляет примерно 2 ч (Antibodies 4 (3), 2015, сс. 141-156). Поэтому антигенсвязывающая молекула, активированная протеазой, имеет короткое время полужизни в крови и с низкой долей вероятности может связываться с антигенами в здоровых тканях.A single domain antibody has antigen binding activity in the individual state, but loses its antigen binding activity after formation of a variable region using VL, VH, VHH or the like. VL or VH has a native antibody sequence having a germline sequence and therefore has a low risk of immunogenicity and is low likely to induce an anti-drug antibody recognizing said VL or VH domain. In the case of forming a single domain antibody variable region using VHH, humanizing the VHH reduces the risk of immunogenicity and reduces the likelihood of inducing an anti-drug antibody recognizing the humanized VHH. A protease-cleavable sequence inserted into an IgG antibody-like molecule is cleaved by the protease so that a single-domain antibody is released. The released single-domain antibody has antigen-binding activity. The IgG-type antibody-like molecule before cleavage is structurally similar to canonical IgG molecules and therefore has a long retention time in the blood, while the single-domain antibody released by protease cleavage has a molecular weight of approximately 13 kDa and does not retain the Fc region and therefore it is rapidly eliminated by renal excretion. In fact, the half-life of a full-length IgG is on the order of 2-3 weeks (Blood. 127 (13), March 31, 2016, 1633-1641), while the half-life of a single-domain antibody is approximately 2 hours (Antibodies 4 (3), 2015 , pp. 141-156). Therefore, a protease-activated antigen-binding molecule has a short half-life in the blood and is less likely to bind to antigens in healthy tissues.

Когда однодоменное антитело представляет собой VL, то можно применять описанную выше концепцию, например, интродуцируя расщепляемую протеазой последовательность вблизи границы между VL и CL.When the single domain antibody is a VL, the concept described above can be applied, for example by introducing a protease cleavable sequence near the boundary between the VL and CL.

Пример 3. Получение активируемого протеазой полипептида с использованием VHH, связывающегося с IL-6RExample 3: Production of Protease Activated Polypeptide Using VHH Binds to IL-6R

3-1 Получение полипептида с включенным VHH, который связывается с IL-6R.3-1 Preparation of a VHH-incorporated polypeptide that binds to IL-6R.

Экспрессионный вектор, кодирующий конструкцию IL6R90-G1m (SEQ ID NO: 2), которая содержит IL6R90 (SEQ ID NO: 1), VHH, который обладает связывающей и нейтрализующей активностью в отношении человеческого IL-6R, описанный в WO 2010/115998, слитый с константной областью человеческого IgGI (СН1-шарнир-СН2-СН3), получали с помощью метода, известного специалистам в данной области.An expression vector encoding the IL6R90-G1m construct (SEQ ID NO: 2), which contains IL6R90 (SEQ ID NO: 1), a VHH that has binding and neutralizing activity against human IL-6R, described in WO 2010/115998, fused with the constant region of human IgGI (CH1-hinge-CH2-CH3) were prepared using a method known to those skilled in the art.

Экспрессионные векторы, кодирующие VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3), VK2-28-k0MT (SEQ ID NO: 4), VK3-20-k0MT (SEQ ID NO: 5), VL1-40-lamL (SEQ ID NO: 6), VL1-44-lamL (SEQ ID NO: 7), VL2-14-lamL (SEQ ID NO: 8), VL3-21-lamL (SEQ ID NO: 9), k0 (SEQ ID NO: 10) и lamL (SEQ ID NO: 11) в качестве легких цепей (вариабельная область - константная область) различных подклассов, имеющих последовательность человеческой зародышевой линии, получали с помощью метода, известного специалистам в данной области.Expression vectors encoding VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3), VK2-28-k0MT (SEQ ID NO: 4), VK3-20-k0MT (SEQ ID NO: 5), VL1-40-lamL (SEQ ID NO: 6), VL1-44-lamL (SEQ ID NO: 7), VL2-14-lamL (SEQ ID NO: 8), VL3-21-lamL (SEQ ID NO: 9), k0 (SEQ ID NO : 10) and lamL (SEQ ID NO: 11) as light chains (variable region - constant region) of various subclasses having human germline sequence were obtained using a method known to those skilled in the art.

Подобные антителу IgG-типа молекулы IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 4), IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 5), IL6R90-G1m/VL1-40-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 6), IL6R90-G1m/VL1-44-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 7), IL6R90-G1m/VL2-14-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 8), IL6R90-G1m/VL3-21-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 9), IL6R90-G1m/k0 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 10) и IL6R90-G1m/lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 11) экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.IgG antibody-like molecules IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 2, light chain: SEQ ID NO: 3), IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 2, light chain: SEQ ID NO: 4), IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 2, light chain: SEQ ID NO: 5), IL6R90-G1m/VL1-40 -lamL (heavy chain: SEQ ID NO: 2, light chain: SEQ ID NO: 6), IL6R90-G1m/VL1-44-lamL (heavy chain: SEQ ID NO: 2, light chain: SEQ ID NO: 7) , IL6R90-G1m/VL2-14-lamL (heavy chain: SEQ ID NO: 2, light chain: SEQ ID NO: 8), IL6R90-G1m/VL3-21-lamL (heavy chain: SEQ ID NO: 2, light chain: SEQ ID NO: 9), IL6R90-G1m/k0 (heavy chain: SEQ ID NO: 2, light chain: SEQ ID NO: 10) and IL6R90-G1m/lamL (heavy chain: SEQ ID NO: 2, light chain: SEQ ID NO: 11) was expressed by transient expression using FreeStyle 293 cells (Invitrogen Corp.) using a method known to those skilled in the art, and purified using a method known to those skilled in the art using protein A.

3-2 Оценка связывания с IL-6R полипептида, в который включен VHH, связывающийся с человеческим IL-6R3-2 Evaluation of IL-6R Binding of a Polypeptide Incorporating VHH Binding to Human IL-6R

Связывающую активность IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT, IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT, IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT, IL6R90-G1m/VL1-40-lamL, IL6R90-G1m/VL1-44-lamL, IL6R90-G1m/VL2-14-lamL, IL6R90-G1m/VL3-21-lamL, IL6R90-G1m/k0 и IL6R90-G1m/lamL в отношении IL-6R оценивали следующим методом.Binding activity of IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT, IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT, IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT, IL6R90-G1m/VL1-40-lamL, IL6R90-G1m/VL1-44- lamL, IL6R90-G1m/VL2-14-lamL, IL6R90-G1m/VL3-21-lamL, IL6R90-G1m/k0 and IL6R90-G1m/lamL for IL-6R were assessed by the following method.

Применяемый в качестве антигена рекомбинантный человеческий IL-6R получали следующим образом: линию СНО, стабильно экспрессирующую растворимый человеческий IL-6R (ниже в настоящем описании обозначен также как hsIL-6R, IL-6R или IL-6R), состоящий из аминокислотной последовательности, простирающейся от положения 1 до 357, начиная с N-конца, который описан в J. Immunol. 152, 1994, сс. 4958-4968, конструировали с помощью метода, известного специалистам в данной области, культивировали и давали осуществляться экспрессии hsIL-6R. hsIL-6R очищали из полученного супернатанта культуры с помощью 2 стадий, таких как хроматография на колонке Blue Сефароза 6 FF и гель-фильтрация. Фракцию, элюированную в качестве основного пика на финальной стадии, применяли в качестве конечного очищенного продукта.Recombinant human IL-6R used as an antigen was prepared as follows: a CHO line stably expressing soluble human IL-6R (hereinafter referred to as hsIL-6R, IL-6R or IL-6R), consisting of an amino acid sequence extending from position 1 to 357, starting from the N-terminus, which is described in J. Immunol. 152, 1994, pp. 4958-4968 were constructed using a method known to those skilled in the art, cultured and hsIL-6R expressed. hsIL-6R was purified from the resulting culture supernatant using 2 steps, such as Blue Sepharose 6 FF column chromatography and gel filtration. The fraction eluted as the main peak in the final step was used as the final purified product.

Оценку связывания с hsIL-6R каждой молекулы осуществляли с помощью системы Octet HTX (фирма Pall ForteBio Corp.). В частности, каждой молекуле давали связываться с биосенсором/белком А (ProA) (фирма Pall ForteBio Corp., 18-5013) и давали осуществляться взаимодействию hsIL-6R с ней, после чего оценивали связывание при 30°С. Сенсограммы, на которых продемонстрированы ответы, характеризующие связывание в реальном времени, полученные с помощью Octet HTX, представлены на фиг. 10. Установлено, что IL6R90-G1m/k0 и IL6R90-G1m/lamL, у которых отсутствовал VL, связывались с hsIL-6R, в то время как IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT, IL6R90-G1m/VK2-28-k0MT, IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT, IL6R90-G1m/VL1-40-lamL, IL6R90-G1m/VL1-44-lamL и IL6R90-G1m/VL2-14-lamL содержащие вариабельную область, сформированную с использованием VL, не обладали способностью связываться с hsIL-6R. Исходя из этого, установлено, что VHH, обладающий связывающей активностью в отношении человеческого IL-6R, может утрачивать свою IL-6R-связывающую активность при формировании вариабельной области посредством ассоциации с VL.Binding to hsIL-6R of each molecule was assessed using the Octet HTX system (Pall ForteBio Corp.). Specifically, each molecule was allowed to bind to biosensor/protein A (ProA) (Pall ForteBio Corp., 18-5013) and allowed to interact with hsIL-6R, after which binding was assessed at 30°C. Sensorgrams demonstrating real-time binding responses obtained with Octet HTX are shown in FIG. 10. It was found that IL6R90-G1m/k0 and IL6R90-G1m/lamL, which lacked VL, bound to hsIL-6R, while IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT, IL6R90-G1m/VK2-28- k0MT, IL6R90-G1m/VK3-20-k0MT, IL6R90-G1m/VL1-40-lamL, IL6R90-G1m/VL1-44-lamL and IL6R90-G1m/VL2-14-lamL containing a variable region formed using VL, did not have the ability to bind to hsIL-6R. Based on this, it has been found that VHH, which has binding activity for human IL-6R, can lose its IL-6R binding activity upon formation of the variable region through association with VL.

3-3 Интродукция расщепляемой протеазой последовательности в полипептид с включенным VHH, связывающимся с IL-6R3-3 Introduction of a protease-cleavable sequence into a VHH-incorporated polypeptide that binds to IL-6R

Проводили исследование, в котором осуществляли инсерцию расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между антителом к человеческому IL-6R VHH IL6R90 и СН1. Создавали шесть типов тяжелых цепей, которые продемонстрированы на фиг. 11, при этом последовательность пептида A (SEQ ID NO: 12), описанную последовательность, расщепляемую специфически экспрессируемой при раке урокиназой (uPA) и MT-SP1, встраивали в 3 сайта вблизи границы между IL6R90 и СН1 с помощью глицин-серинового линкера или без него. Экспрессионные векторы, кодирующие IL6R90H1001 (SEQ ID NO: 13), IL6R90H1002 (SEQ ID NO: 14), IL6R90H1003 (SEQ ID NO: 15), IL6R90H1004 (SEQ ID NO: 16), IL6R90H1005 (SEQ ID NO: 17) и IL6R90H1006 (SEQ ID NO: 18), получали с помощью метода, известного специалистам в данной области.A study was conducted in which a protease-cleavable sequence was inserted near the interface between the anti-human IL-6R VHH IL6R90 antibody and CH1. Six types of heavy chains were created and are shown in FIG. 11, wherein the peptide A sequence (SEQ ID NO: 12), the described sequence cleaved by cancer-specific urokinase (uPA) and MT-SP1, was inserted into 3 sites near the border between IL6R90 and CH1 with or without a glycine-serine linker him. Expression vectors encoding IL6R90H1001 (SEQ ID NO: 13), IL6R90H1002 (SEQ ID NO: 14), IL6R90H1003 (SEQ ID NO: 15), IL6R90H1004 (SEQ ID NO: 16), IL6R90H1005 (SEQ ID NO: 17) and IL6R90H1006 (SEQ ID NO: 18) was obtained using a method known to those skilled in the art.

Подобные антителу IgG-типа молекулы IL6R90H1001/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 13, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), IL6R90H1002/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 14, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), IL6R90H1003/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 15, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), IL6R90H1004/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 16, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), IL6R90H1005/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 17, легкая цепь: SEQ ID NO: 3) и IL6R90H1006/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 18, легкая цепь: SEQ ID NO: 3) экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием указанных тяжелых цепей и VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3) в качестве легкой цепи, применяя клетки FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.), с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.IgG-type antibody-like molecules IL6R90H1001/VK1-39-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 13, light chain: SEQ ID NO: 3), IL6R90H1002/VK1-39-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 14, light chain: SEQ ID NO: 3), IL6R90H1003/VK1-39-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 15, light chain: SEQ ID NO: 3), IL6R90H1004/VK1-39-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 16, light chain: SEQ ID NO: 3), IL6R90H1005/VK1-39-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 17, light chain: SEQ ID NO: 3) and IL6R90H1006/VK1-39-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 18, light chain: SEQ ID NO: 3) was expressed by transient expression using the indicated heavy chains and VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3) as the light chain using FreeStyle 293 cells (company Invitrogen Corp.), using a method known to those skilled in the art, and purified using a method known to those skilled in the art using Protein A.

3-4 Активация полипептида. несущего расщепляемую протеазой последовательность, с помощью расщепления протеазой3-4 Activation of the polypeptide. carrying a protease-cleavable sequence, by protease cleavage

Проверяли, будет ли происходить высвобождение VHH из конструкций IL6R90H1001/VK1-39-k0MT, IL6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL6R90H1003/VK1-39-k0MT, IL6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL6R90H1005/VK1-39-k0MT и IL6R90H1006/VK1-39-k0MT, обладающих связывающей активностью в отношении IL-6R, при расщеплении протеазой.We tested whether VHH release would occur from the IL6R90H1001/VK1-39-k0MT, IL6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL6R90H1003/VK1-39-k0MT, IL6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL6R90H1005/VK1-39-k0MT, and IL6R90H1006 /VK1-39-k0MT, which has binding activity against IL-6R, when cleaved by protease.

Растворимый человеческий IL-6R получали с помощью метода, известного специалистам в данной области. Полученный растворимый человеческий IL-6R биотинилировали с помощью метода, известного специалистам в данной области.Soluble human IL-6R was prepared using a method known to those skilled in the art. The resulting soluble human IL-6R was biotinylated using a method known to those skilled in the art.

Для присоединения биотина к С-концу растворимого человеческого IL-6R (который обозначают также как hsIL-6R или растворимый человеческий IL-6R; SEQ ID NO: 35) генный фрагмент, кодирующий специфическую последовательность (последовательность AviTag (Avi-метка); SEQ ID NO: 36), подлежащую биотинилированию с помощью биотинлигазы, связывали через генной фрагмент, кодирующий линкер, в прямом направлении относительно генного фрагмента, кодирующего hsIL-6R. Генный фрагмент, кодирующий белок, который содержит hsIL-6R, сцепленный с последовательностью Avi-метки (hsIL-6R-Avitag; SEQ ID NO: 37), встраивали в вектор для экспрессии в клетках животных. Сконструированным плазмидным вектором трансфектировали клетки FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.), используя 293Fectin (фирма Invitrogen Corp.). При осуществлении этой операции клетки совместно трансфектировали геном для экспрессии EBNA1 (SEQ ID NO: 57) и геном для экспрессии биотинлигазы (BirA; SEQ ID NO: 58), и к ним дополнительно добавляли биотин для мечения с помощью биотина hsIL-6R-Avitag. Клетки, трансфектированные с использованием описанных выше процедур, культивировали при 37°С в атмосфере с 8% СО₂; и давали представляющему интерес белку (hsIL-6R-ВАР1) секретироваться в супернатант культуры. Раствор указанной клеточной культуры фильтровали, используя емкость с 0,22-микрометровым верхним фильтром, для получения супернатанта культуры.To attach biotin to the C-terminus of soluble human IL-6R (also referred to as hsIL-6R or soluble human IL-6R; SEQ ID NO: 35) a gene fragment encoding a specific sequence (AviTag sequence; SEQ ID NO: 36), subject to biotinylation by biotin ligase, was linked through a gene fragment encoding a linker in the downstream direction of the gene fragment encoding hsIL-6R. A gene fragment encoding a protein that contains hsIL-6R linked to an Avi tag sequence (hsIL-6R-Avitag; SEQ ID NO: 37) was inserted into a vector for expression in animal cells. The constructed plasmid vector was transfected into FreeStyle 293 cells (Invitrogen Corp.) using 293Fectin (Invitrogen Corp.). In this operation, cells were co-transfected with an EBNA1 expression gene (SEQ ID NO: 57) and a biotin ligase expression gene (BirA; SEQ ID NO: 58) and further added with biotin for hsIL-6R-Avitag biotin labeling. Cells transfected using the procedures described above were cultured at 37°C in an atmosphere of 8% CO ₂ ; and allowed the protein of interest (hsIL-6R-BAP1) to be secreted into the culture supernatant. The said cell culture solution was filtered using a 0.22 micrometer overhead filter to obtain the culture supernatant.

Антитело к человеческому IL-6R иммобилизовывали на HiTrap NHS-активированной HP (фирма GE Healthcare Japan Corp.) согласно протоколу производителя для получения колонки (колонка с антителом к человеческому IL-6R). Супернатант культуры вносили на колонку с антителом к человеческому IL-6R, уравновешенную TBS, с последующей элюцией связанного hsIL-6R с помощью 2М аргинина (pH 4,0). Затем элюат из колонки с антителом к человеческому IL-6R разводили TBS и затем вносили на авидиновую колонку SoftLink (фирма Promega Corp.), уравновешенную TBS, с последующей элюцией hsIL-6R-BAP1 с помощью 5 мМ биотина, 50 мМ Трис-НС1 (рН 8,0) и 2М аргинина (рН 4,0). Из этого элюата удаляли агрегаты hsIL-6R-BAP1 с помощью гель-фильтрации, используя Супердекс 200 (фирма GE Healthcare Japan Corp.) для получения очищенного hsIL-6R-BAP1, осуществляя замену буфера на D-ЗФР и 0,05% CHAPS.Anti-human IL-6R antibody was immobilized onto HiTrap NHS-activated HP (GE Healthcare Japan Corp.) according to the manufacturer's protocol to prepare a column (anti-human IL-6R antibody column). The culture supernatant was applied to an anti-human IL-6R antibody column equilibrated with TBS, followed by elution of bound hsIL-6R with 2 M arginine (pH 4.0). The eluate from the anti-human IL-6R column was then diluted with TBS and then applied to a SoftLink avidin column (Promega Corp.) equilibrated with TBS, followed by elution of hsIL-6R-BAP1 with 5 mM biotin, 50 mM Tris-HC1 ( pH 8.0) and 2M arginine (pH 4.0). From this eluate, hsIL-6R-BAP1 aggregates were removed by gel filtration using Superdex 200 (GE Healthcare Japan Corp.) to obtain purified hsIL-6R-BAP1, buffer exchanging with D-PBS and 0.05% CHAPS.

В качестве протеазы использовали рекомбинантную человеческую матриптазу/каталитический домен ST14 (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). 12,5нМ протеазу и 100 мкг/мл каждой подобной антителу IgG-типа молекулы инкубировали в ЗФР при 37°С в течение 20 ч. Затем расщепление протеазой оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 12. В результате для конструкций IL6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL6R90H1005/VK1-39-k0MT и IL6R90H1006/VK1-39-k0MT подтверждено расщепление протеазой расщепляемой протеазой последовательности вблизи границы между VHH и константной областью тяжелой цепи.The protease used was recombinant human matriptase/catalytic domain ST14 (R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). 12.5 nM protease and 100 μg/ml of each IgG-type antibody-like molecule were incubated in PBS at 37°C for 20 hours. Protease cleavage was then assessed by SDS-PAGE under reducing conditions. The results are presented in Fig. 12. As a result, for the constructs IL6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL6R90H1005/VK1-39-k0MT and IL6R90H1006/VK1-39-k0MT, protease cleavage of the sequence near the boundary between VHH and con was confirmed. state area heavy chain.

Затем осуществляли оценку связывания с IL-6R VHH, который высвобождался после обработки протеазой, с использованием Octet HTX (фирма Pall ForteBio Corp.). В частности, hsIL-6R-BAPl давали связываться со стрептавидиновым сенсором (фирма Pall ForteBio Corp., 18-5021) и каждой расщепленной подобной антителу IgG-типа молекуле давали взаимодействовать с ним, после чего оценивали связывание при 30°С. Сенсограммы, на которых продемонстрированы ответы, характеризующие связывание в реальном времени, полученные с помощью Octet HTX, представлены на фиг. 13. В результате связывание было подтверждено для IL6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL6R90H1005/VK1-39-k0MT и IL6R90H1006/VK1-39-k0MT. Для IL6R90-G1m/k0 и IL6R90-G1m/lamL установлено двухвалентное связывание на основе авидности, в то время как высвободившийся VHH связывается на основе аффинности. Таким образом, для обработанных протеазой IL6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL6R90H1005/VK1-39-k0MT и IL6R90H1006/VK1-39-k0MT характерна более высокая скорость диссоциации от IL-6R, чем для IL6R90-G1m/k0 и IL6R90-G1m/lamL. Кроме того, VHH имеет меньшую молекулярную массу по сравнению с IL6R90-G1m/k0 и IL6R90-G1m/lamL. Поэтому его ответ в виде уровня связывания был более низким.Binding to IL-6R VHH, which is released after protease treatment, was then assessed using Octet HTX (Pall ForteBio Corp.). Specifically, hsIL-6R-BAPl was allowed to bind to a streptavidin sensor (Pall ForteBio Corp., 18-5021) and each digested IgG-type antibody-like molecule was allowed to react with it and binding was assessed at 30°C. Sensorgrams demonstrating real-time binding responses obtained with Octet HTX are shown in FIG. 13. As a result, binding was confirmed for IL6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL6R90H1005/VK1-39-k0MT and IL6R90H1006/VK1-39-k0MT. IL6R90-G1m/k0 and IL6R90-G1m/lamL exhibit bivalent binding based on avidity, while released VHH binds based on affinity. Thus, protease-treated IL6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL6R90H1005/VK1-39-k0MT and IL6R90H1006/VK1-39-k0MT are characterized by a higher rate of dissociation from IL-6R than IL6R90 -G1m/k0 and IL6R90-G1m/lamL. In addition, VHH has a lower molecular weight compared to IL6R90-G1m/k0 and IL6R90-G1m/lamL. Therefore, its response in terms of binding level was lower.

Эти результаты продемонстрировали, что IL6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL6R90H1005/VK1-39-k0MT или IL6R90H1006/VK1-39-k0MT не обладают связывающей активностью в отношении IL-6R, в отличие от варианта, в котором последовательность пептида А, встроенная вблизи границы между VHH и константной областью тяжелой цепи, расщеплялась при обработке протеазой, в результате чего VHH-домен высвобождается, и высвободившийся VHH может связываться с IL-6R. Исходя из указанного, можно заключить, что фактически удалось получить молекулу, подтверждающую концепцию, описанную в примере 2.These results demonstrated that IL6R90H1002/VK1-39-k0MT, IL6R90H1004/VK1-39-k0MT, IL6R90H1005/VK1-39-k0MT, or IL6R90H1006/VK1-39-k0MT do not have IL-6R binding activity, unlike the variant , in which a peptide A sequence inserted near the interface between VHH and the heavy chain constant region is cleaved by protease treatment, resulting in the release of the VHH domain, and the released VHH can bind to IL-6R. Based on the above, we can conclude that it was actually possible to obtain a molecule that confirms the concept described in example 2.

Пример 4. Получение активируемого протеазой полипептида путем изменения с использованием VHH, связывающегося с IL-6RExample 4: Production of Protease Activated Polypeptide by VHH Bind to IL-6R Modification

4-1 Оценка связывания с IL-6R полипептида с включенным VHH. который связывается с IL-6R4-1 Assessment of binding to IL-6R of a VHH-incorporated polypeptide. which binds to IL-6R

Получали экспрессионный вектор, кодирующий конструкцию 20A11-G1m (SEQ ID NO: 38), которая содержит 20А11 (SEQ ID NO: 19), VHH, который обладает связывающей и нейтрализующей активностью в отношении IL-6R, описанный в WO 2010/115998, слитый с константной областью человеческого IgGI (СН1-шарнир-СН2-СН3), аналогично методу, описанному в примере 3, с использованием методики, известной специалистам в данной области.An expression vector encoding the construct 20A11-G1m (SEQ ID NO: 38), which contains 20A11 (SEQ ID NO: 19), VHH, which has binding and neutralizing activity against IL-6R, described in WO 2010/115998, fused with the human IgGI constant region (CH1-hinge-CH2-CH3), similar to the method described in example 3, using techniques known to those skilled in the art.

Полипептиды 20A11-G1m/VK1-39-k0MT, 20A11-G1m/VK2-28-k0MT, 20А11-G1m/VK3-20-k0MT, 20A11-G1m/VL1-40-lamL, 20A11-G1m/VL1-44-lamL, 20A11-G1m/VL2-14-lamL и 20 A11-G1m/VL3-21-lamL экспрессировали и очищали аналогично методу, описанному в примере 3, используя указанную тяжелую цепь и конструкции VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3), VK2-28-k0MT (SEQ ID NO: 4), VK3-20-k0MT (SEQ ID NO: 5), VL1-40-lamL (SEQ ID NO: 6), VL1-44-lamL (SEQ ID NO: 7), VL2-14-lamL (SEQ ID NO: 8) и VL3-21-lamL (SEQ ID NO: 9) в качестве легких цепей.Polypeptides 20A11-G1m/VK1-39-k0MT, 20A11-G1m/VK2-28-k0MT, 20A11-G1m/VK3-20-k0MT, 20A11-G1m/VL1-40-lamL, 20A11-G1m/VL1-44-lamL , 20A11-G1m/VL2-14-lamL and 20 A11-G1m/VL3-21-lamL were expressed and purified similar to the method described in Example 3 using the indicated heavy chain and VK1-39-k0MT constructs (SEQ ID NO: 3) , VK2-28-k0MT (SEQ ID NO: 4), VK3-20-k0MT (SEQ ID NO: 5), VL1-40-lamL (SEQ ID NO: 6), VL1-44-lamL (SEQ ID NO: 7), VL2-14-lamL (SEQ ID NO: 8) and VL3-21-lamL (SEQ ID NO: 9) as light chains.

Оценивали полученные конструкции 20A11-G1m/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 38, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), 20A11-G1m/VK2-28-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 38, легкая цепь: SEQ ID NO: 4), 20A11-G1m/VK3-20-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 38, легкая цепь: SEQ ID NO: 5), 20A11-G1m/VL1-40-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 38, легкая цепь: SEQ ID NO: 6), 20A11-G1m/VL1-44-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 38, легкая цепь: SEQ ID NO: 7), 20A11-G1m/VL2-14-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 38, легкая цепь: SEQ ID NO: 8) и 20A11-G1m/VL3-21-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 38, легкая цепь: SEQ ID NO: 9) в отношении их связывания с IL-6R аналогично методу, описанному в примере 3. Результаты представлены на фиг. 14. В результате установлено, что ни одна из легких цепей, примененных в этом примере, не ингибировала IL-6R-связывающую активность 20А11 при ассоциации с тяжелой цепью, содержащей 20А11, слитый с константной областью IgGI человеческой зародышевой линии (СН1-шарнир-СН2-СН3).The resulting constructs 20A11-G1m/VK1-39-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 38, light chain: SEQ ID NO: 3), 20A11-G1m/VK2-28-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 38) were evaluated , light chain: SEQ ID NO: 4), 20A11-G1m/VK3-20-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 38, light chain: SEQ ID NO: 5), 20A11-G1m/VL1-40-lamL ( heavy chain: SEQ ID NO: 38, light chain: SEQ ID NO: 6), 20A11-G1m/VL1-44-lamL (heavy chain: SEQ ID NO: 38, light chain: SEQ ID NO: 7), 20A11- G1m/VL2-14-lamL (heavy chain: SEQ ID NO: 38, light chain: SEQ ID NO: 8) and 20A11-G1m/VL3-21-lamL (heavy chain: SEQ ID NO: 38, light chain: SEQ ID NO: 9) with respect to their binding to IL-6R is similar to the method described in example 3. The results are presented in Fig. 14. As a result, none of the light chains used in this example inhibited the IL-6R binding activity of 20A11 when associated with a heavy chain containing 20A11 fused to the human germline IgGI constant region (CH1 hinge-CH2 -CH3).

Это, вероятно, является следствием того, что 20А11 не образовывал стабильную вариабельную область с VL, применяемыми в этом примере.This is likely a consequence of the fact that 20A11 did not form a stable variable region with the VLs used in this example.

4-2 Интродукция аминокислотного изменения в сайт поверхности раздела между VHH и VL в полипептиде с включенным VHH без утраты антигенсвязывающей способности4-2 Introduction of an amino acid change into the interface between VHH and VL in a VHH-incorporated polypeptide without loss of antigen-binding capacity

Для формирования стабильной вариабельной области между 20А11 и VL интродуцировали мутации в аминокислоты, присутствующие на поверхности раздела между 20А11 и VL. Получали экспрессионный вектор, кодирующий конструкцию 20A11hu-G1m (SEQ ID NO: 39), содержащую 20A11hu (получен из 20А11 путем интродукции мутаций, приводящих к замене F в положении 37 на V (F37V), R в положении 45 на L и G в положении 47 на W (вся нумерация Кэбота)) (SEQ ID NO: 20), слитый с константной областью человеческого IgGI (СН1-шарнир-СН2-СН3), аналогично методу, описанному в примере 3, с помощью методики, известной специалистам в данной области.To form a stable variable region between 20A11 and VL, mutations were introduced into the amino acids present at the interface between 20A11 and VL. An expression vector encoding the 20A11hu-G1m construct (SEQ ID NO: 39) containing 20A11hu (derived from 20A11 by introducing mutations leading to the replacement of F at position 37 with V (F37V), R at position 45 with L and G at position 47 to W (all Cabot numbering)) (SEQ ID NO: 20), fused to the human IgGI constant region (CH1-hinge-CH2-CH3), similar to the method described in Example 3, using techniques known to those skilled in the art .

Полипептиды 20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), 20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 4), 20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 5), 20A11hu-G1m/VL1-40-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 6), 20A11hu-G1m/VL1-44-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 7), 20A11hu-G1m/VL2-14-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 8) и 20A11hu-G1m/VL3-21-lamL (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 9) экспрессировали и очищали аналогично методу, описанному в примере 3, используя указанную тяжелую цепь и VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3), VK2-28-k0MT (SEQ ID NO: 4), VK3-20-k0MT (SEQ ID NO: 5), VL1-40-lamL (SEQ ID NO: 6), VL1-44-lamL (SEQ ID NO: 7), VL2-14-lamL (SEQ ID NO: 8) и VL3-21-lamL (SEQ ID NO: 9) в качестве легких цепей.Polypeptides 20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 39, light chain: SEQ ID NO: 3), 20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 39, light chain: SEQ ID NO: 4), 20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 39, light chain: SEQ ID NO: 5), 20A11hu-G1m/VL1-40-lamL (heavy chain : SEQ ID NO: 39, light chain: SEQ ID NO: 6), 20A11hu-G1m/VL1-44-lamL (heavy chain: SEQ ID NO: 39, light chain: SEQ ID NO: 7), 20A11hu-G1m/ VL2-14-lamL (heavy chain: SEQ ID NO: 39, light chain: SEQ ID NO: 8) and 20A11hu-G1m/VL3-21-lamL (heavy chain: SEQ ID NO: 39, light chain: SEQ ID NO : 9) was expressed and purified similar to the method described in example 3, using the indicated heavy chain and VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3), VK2-28-k0MT (SEQ ID NO: 4), VK3-20-k0MT (SEQ ID NO: 5), VL1-40-lamL (SEQ ID NO: 6), VL1-44-lamL (SEQ ID NO: 7), VL2-14-lamL (SEQ ID NO: 8) and VL3-21 -lamL (SEQ ID NO: 9) as light chains.

4-3 Оценка связывания с IL-6R полипептида с включенным VHH, который содержит аминокислотное изменение в сайте поверхности раздела между VHH и VL4-3 Evaluation of IL-6R binding of a VHH-incorporated polypeptide that contains an amino acid change at the interface between VHH and VL

Полученные конструкции 20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT, 20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT, 20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT, 20A11hu-G1m/VL1-40-lamL, 20A11hu-G1m/VL1-44-lamL, 20A11hu-G1m/VL2-14-lamL и 20A11hu-G1m/VL3-21-lamL оценивали в отношении их связывания с IL-6R при 30°С или 25°С, аналогично методу, описанному в примере 3. Результаты представлены на фиг. 15.The resulting designs 20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT, 20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT, 20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT, 20A11hu-G1m/VL1-40-lamL, 20A11hu-G1m/VL1-44- lamL, 20A11hu-G1m/VL2-14-lamL and 20A11hu-G1m/VL3-21-lamL were assessed for their binding to IL-6R at 30°C or 25°C, similar to the method described in example 3. The results are presented in fig. 15.

В результате установлено, что 20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT, 20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT, 20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT, 20A11hu-G1m/VL1-40-lamL, 20A11hu-G1m/VL1-44-lamL и 20A11hu-G1m/VL2-14-lamL не обладали способностью связываться с IL-6R.As a result, it was established that 20A11hu-G1m/VK1-39-k0MT, 20A11hu-G1m/VK2-28-k0MT, 20A11hu-G1m/VK3-20-k0MT, 20A11hu-G1m/VL1-40-lamL, 20A11hu-G1m/VL1 -44-lamL and 20A11hu-G1m/VL2-14-lamL did not have the ability to bind to IL-6R.

Указанные результаты продемонстрировали, что VHH 20A11, который не утрачивал свою IL-6R-связывающую активность при ассоциации с VL, применяемым в примере 3, может формировать стабильную вариабельную область с VL и может утрачивать свою IL-6R-связывающую активность при изменении аминокислот, присутствующих в сайте поверхности раздела между VHH и VL, на 37V, 45L и 47W (нумерация Кэбота) и, тем самым, изменяясь с 20A11 на 20A11hu.These results demonstrated that VHH 20A11, which did not lose its IL-6R binding activity when associated with VL used in Example 3, can form a stable variable region with VL and can lose its IL-6R binding activity when the amino acids present are changed at the interface site between VHH and VL, at 37V, 45L and 47W (Cabot numbering) and thereby changing from 20A11 to 20A11hu.

4-4 Интродукция расщепляемой протеазой последовательности в полипептид с включенным VHH, который содержит аминокислотное изменение в сайте поверхности раздела между VHH и VL4-4 Introduction of a protease-cleavable sequence into a VHH-incorporated polypeptide that contains an amino acid change at the interface between VHH and VL

Тяжелые цепи 20A11huH1001 (SEQ ID NO: 40), 20A11huH1002 (SEQ ID NO: 41), 20A11huH1004 (SEQ ID NO: 42) и 20A11huH1006 (SEQ ID NO: 43) получали аналогично методу, описанному в примере 3, встраивая расщепляемую протеазой последовательность (SEQ ID NO: 12) или расщепляемую протеазой последовательность, сцепленную с гибким линкером (SEQ ID NO: 44), вблизи границы между 20A11hu и СН1.Heavy chains 20A11huH1001 (SEQ ID NO: 40), 20A11huH1002 (SEQ ID NO: 41), 20A11huH1004 (SEQ ID NO: 42) and 20A11huH1006 (SEQ ID NO: 43) were prepared similarly to the method described in example 3, inserting a protease cleavable sequence (SEQ ID NO: 12) or a protease cleavable sequence linked to a flexible linker (SEQ ID NO: 44) near the boundary between 20A11hu and CH1.

Полипептиды 20A11huH1001/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 40, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), 20A11huH1002/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 41, легкая цепь: SEQ ID NO: 3), 20A11huH1004/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 42, легкая цепь: SEQ ID NO: 3) и 20A11huH1006/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 43, легкая цепь: SEQ ID NO: 3) экспрессировали и очищали аналогично методу, описанному в примере 3, применяя эти тяжелые цепи и VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3) в качестве легкой цепи.Polypeptides 20A11huH1001/VK1-39-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 40, light chain: SEQ ID NO: 3), 20A11huH1002/VK1-39-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 41, light chain: SEQ ID NO: 3), 20A11huH1004/VK1-39-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 42, light chain: SEQ ID NO: 3) and 20A11huH1006/VK1-39-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 43, light chain: SEQ ID NO: 3) was expressed and purified similar to the method described in example 3, using these heavy chains and VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3) as the light chain.

4-5 Активация полипептида. несущего расщепляемую протеазой последовательность, путем расщепления протеазой4-5 Activation of the polypeptide. carrying a protease-cleavable sequence by protease cleavage

20A11huH1001/VK1-39-k0MT, 20A11huH1002/VK1-39-k0MT, 20A11huH1004/VK1-39-k0MT и 20A11huH1006/VK1-39-k0MT расщепляли протеазой аналогично методу, описанному в примере 3, и степень расщепления оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 16.20A11huH1001/VK1-39-k0MT, 20A11huH1002/VK1-39-k0MT, 20A11huH1004/VK1-39-k0MT and 20A11huH1006/VK1-39-k0MT were digested with protease similar to the method described in example 3, and the degree of cleavage was assessed with using SDS-PAGE under reducing conditions. The results are presented in Fig. 16.

В результате подтверждено, что 20A11huH1002/VK1-39-k0MT, 20A11huH1004/VK1-39-k0MT и 20A11huH1006/VK1-39-k0MT подвергались расщеплению протеазой вблизи границы между VHH и СН1.The results confirmed that 20A11huH1002/VK1-39-k0MT, 20A11huH1004/VK1-39-k0MT, and 20A11huH1006/VK1-39-k0MT were subject to protease cleavage near the interface between VHH and CH1.

Затем оценку связывания с IL-6R VHH, высвободившегося в результате обработки протеазой, проводили при 30°С или 25°С аналогично методу, описанному в примере 3. Полученные с помощью Octet сенсограммы представлены на фиг. 17.Binding to IL-6R of VHH released by protease treatment was then assessed at 30°C or 25°C in a manner similar to the method described in Example 3. The Octet-derived sensorgrams are shown in FIG. 17.

В результате связывание с IL-6R продемонстрировано для 20A11huH1002/VK1-39-k0MT, 20A11huH1004/VK1-39-k0MT и 20A11huH1006/VK1-39-k0MT, для которых подтверждено расщепление вблизи границы между VHH и СН1 при обработке протеазой.As a result, binding to IL-6R was demonstrated for 20A11huH1002/VK1-39-k0MT, 20A11huH1004/VK1-39-k0MT and 20A11huH1006/VK1-39-k0MT, which were confirmed to cleave near the interface between VHH and CH1 upon protease treatment.

Эти результаты продемонстрировали, что, даже, если VHH, включенный в полипептид, не утрачивает свою антигенсвязывающую активность немедленно после ассоциации с конкретным VL, антигенсвязывающая активность может утрачиваться путем интродукции усиливающей ассоциацию мутации в аминокислоту, присутствующую на поверхности раздела между VHH и VL.These results demonstrated that, even if a VHH incorporated into a polypeptide does not lose its antigen-binding activity immediately upon association with a particular VL, antigen-binding activity can be lost by introducing an association-enhancing mutation into an amino acid present at the interface between the VHH and the VL.

Исходя из указанных результатов, можно заключить, что молекулу, удовлетворяющую концепции, которая описана в примере 2, можно получать также методом объединения легкой цепи с VHH, который содержит замененную аминокислоту, участвующую в ассоциации с легкой цепью, в дополнение к методу объединения легкой цепи с VHH, получение которого описано выше в примере 3.Based on these results, it can be concluded that a molecule satisfying the concept as described in Example 2 can also be prepared by the method of combining the light chain with a VHH that contains a substituted amino acid involved in association with the light chain, in addition to the method of combining the light chain with VHH, the preparation of which is described above in example 3.

Пример 5. Создание активируемого протеазой полипептида с использованием VHH, полученного из иммунизированных альпакExample 5 Generation of a Protease Activated Polypeptide Using VHH Derived from Immunized Alpacas

5-1 Получение VHH из иммунизированных альпак5-1 Production of VHH from immunized alpacas

Альпак иммунизировали IL-6R, CD3 или плексином А1 с помощью метода, известного специалистам в данной области. Через 4 и 8 недель собирали РВМС. Из собранных РВМС ген VHH амплифицировали аналогично методу, описанному в J. Immunol. Methods 324, 2007, с. 13. Амплифицированный фрагмент гена VHH соединяли с геном 3 и встраивали в фагмидный вектор. Фагмидным вектором, имеющим вставку в виде VHH-фрагмента, трансфектировали Е. coli с помощью метода электропорации, и фаги, презентирующие VHH, получали методом, уже известным специалистам в данной области. Полученные фаги оценивали в отношении их связывания с IL-6R, CD3 или плексином А1 с помощью ELISA. Последовательность связанного клона анализировали с помощью метода, известного специалистам в данной области для идентификации VHH, связывающегося с антигеном.Alpacas were immunized with IL-6R, CD3 or plexin A1 using a method known to those skilled in the art. PBMCs were collected after 4 and 8 weeks. From collected PBMCs, the VHH gene was amplified similar to the method described in J. Immunol. Methods 324, 2007, p. 13. The amplified fragment of the VHH gene was combined with gene 3 and inserted into the phagemid vector. The phagemid vector having the VHH fragment insert was transfected into E. coli using the electroporation method, and VHH-presenting phages were obtained by a method already known to those skilled in the art. The resulting phages were assessed for their binding to IL-6R, CD3 or plexin A1 using ELISA. The sequence of the linked clone was analyzed using a method known to those skilled in the art to identify VHH binding to an antigen.

5-2 Увеличение количества (обогащение) VHH, связывающегося с CD35-2 Increased amount (enrichment) of VHH binding to CD3

VHH, связывающийся с человеческим CD3, идентифицировали из библиотеки VHH, конструирование которой описано в примере 5-1. Клоны VHH, обладающие способностью связываться с человеческим CD3, обогащали, используя меченный биотином белок, содержащий ε-цепь человеческого CD3 (CD3ε) и δ-цепь человеческого CD3 (CD3δ), сцепленные с константной областью человеческого антитела (человеческий CD3ed-Fc), в качестве антигена. Человеческий CD3ed-Fc получали следующими образом: экспрессионным вектором для клеток животных, имеющим ген, который кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59, ген, который кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 60, и ген, который кодирует BirA (SEQ ID NO: 58), трансфектировали клетки FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.). После трансфекции к ним добавляли L-биотин и биотинилирование осуществляли в культуральном растворе. Клетки культивировали в виде встряхиваемой культуры при 37°С согласно протоколу. Через 4-5 дней собирали супернатант. Из супернатанта получали белок, слитый с константной областью антитела, с помощью колонки с белком A (Eshmuno А (фирма Merck KGaA)). Для дополнительного получения только гетеродимера CD3εδ фракцию гетеродимера CD3εδ, слитого с константной областью антитела (обозначенную как CD3ed-Fc), отделяли с помощью колонки с антителом к FLAG M2. Затем осуществляли гель-фильтрацию (Супердекс 200, фирма GE Healthcare Japan Corp.) с получением представляющей интерес фракции гетеродимера CD3εδ (обозначен как человеческий CD3ed-Fc).VHH binding to human CD3 was identified from the VHH library, the construction of which is described in Example 5-1. VHH clones with the ability to bind to human CD3 were enriched using a biotin-tagged protein containing the human CD3 ε chain (CD3ε) and the human CD3 δ chain (CD3δ) linked to a human antibody constant region (human CD3ed-Fc), in as an antigen. Human CD3ed-Fc was prepared as follows: an animal cell expression vector having a gene that encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 59, a gene that encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 60, and a gene that encodes BirA (SEQ ID NO: 58) was transfected into FreeStyle 293 cells (Invitrogen Corp.). After transfection, L-biotin was added to them and biotinylation was carried out in the culture solution. Cells were cultured as a shake culture at 37°C according to the protocol. After 4-5 days, the supernatant was collected. From the supernatant, a protein fused to the antibody constant region was obtained using a protein A column (Eshmuno A (Merck KGaA)). To further obtain only the CD3εδ heterodimer, a fraction of the CD3εδ heterodimer fused to the antibody constant region (designated CD3ed-Fc) was separated using an anti-FLAG M2 antibody column. Gel filtration (Superdex 200, GE Healthcare Japan Corp.) was then performed to obtain the CD3εδ heterodimer fraction of interest (designated human CD3ed-Fc).

Производство фага осуществляли из Е. coli, сохраняя сконструированные фагмиды для фагового дисплея. Популяцию фага осаждали, добавляя 2,5М NaCl/10% ПЭГ к культуральному раствору Е. coli после производства фага, а затем разводили TBS с получением раствора, содержащего фагововую библиотеку. Затем добавляли БСА в раствор, содержащий фаговую библиотеку, с получением конечной концентрация БСА 4%. Пэннинг осуществляли согласно принятому методу пэннинга, используя антиген, иммобилизованный на магнитных гранулах (J. Immunol. Methods. 332 (1-2), 2008, сс. 2-9; J. Immunol. Methods. 247 (1-2), 2001, сс. 191-203; Biotechnol. Prog. 18 (2), 2002, сс. 212-220; и Mol. Cell Proteomics 2 (2), 2003, сс. 61-69). Применяемые магнитные гранулы представляли собой покрытые нейтравидином (NeutrAvidin) гранулы (FG bead NeutrAvidin) или покрытые стрептавидином гранулы (Dynabeads MyOne Streptavidin T1).Phage production was performed from E. coli, maintaining engineered phagemids for phage display. The phage population was precipitated by adding 2.5 M NaCl/10% PEG to the E. coli culture solution after phage production and then diluted with TBS to obtain a solution containing the phage library. BSA was then added to the solution containing the phage library to obtain a final BSA concentration of 4%. Panning was carried out according to the accepted panning method using antigen immobilized on magnetic beads (J. Immunol. Methods. 332 (1-2), 2008, pp. 2-9; J. Immunol. Methods. 247 (1-2), 2001 , pp. 191-203; Biotechnol. Prog. 18 (2), 2002, pp. 212-220; and Mol. Cell Proteomics 2 (2), 2003, pp. 61-69). The magnetic beads used were NeutrAvidin-coated beads (FG bead NeutrAvidin) or streptavidin-coated beads (Dynabeads MyOne Streptavidin T1).

В частности, 100 пмолей меченного биотином антигена добавляли в полученный раствор фаговой библиотеки, и раствор фаговой библиотеки приводили в контакт с антигеном при комнатной температуре в течение 60 мин. К ним добавляли магнитные гранулы, блокированные БСА, и комплексам антигена и фагов давали связываться с магнитными гранулами при комнатной температуре в течение 15 мин. Гранулы промывали дважды 0,5 мл TBST (TBS, содержащий 0,1% Твин 20; TBS производства фирмы Takara Bio Inc.) и затем дополнительно промывали однократно 0,5 мл TBS. Затем к ним добавляли 0,5 мл трипсина в концентрации 1 мг/мл и гранулы суспендировали при комнатной температуре в течение 15 мин и после этого немедленно разделяли, используя магнитный стенд для выделения раствора фагов. Восстановленный раствора фагов добавляли к 20 мл штамма E. coli ER2738 на экспоненциальной стадии роста (ОП₆₀₀: 0,4-0,5). Е. coli культивировали при слабом перемешивании при 37°С в течение 1 ч, осуществляя тем самым заражение фагами. Зараженными E. coli инокулировали планшет размером 225 мм × 225 мм. Затем фаги выделяли из культурального раствора инокулированных Е. coli с получением раствора фаговой библиотеки. Указанный цикл, называемый пэннингом, повторяли в целом дважды. Во втором цикле пэннинга гранулы промывали три раза TBST и затем дважды TBS. Кроме того, в случае пэннинга в отношении человеческого CD3ed-Fc добавляли 4 нмоля человеческой Fc-области.Specifically, 100 pmol of biotin-labeled antigen was added to the resulting phage library solution, and the phage library solution was brought into contact with the antigen at room temperature for 60 minutes. BSA-blocked magnetic beads were added, and the antigen-phage complexes were allowed to bind to the magnetic beads at room temperature for 15 min. The beads were washed twice with 0.5 ml TBST (TBS containing 0.1% Tween 20; TBS from Takara Bio Inc.) and then washed once additionally with 0.5 ml TBS. Then 0.5 ml of trypsin at a concentration of 1 mg/ml was added to them and the granules were suspended at room temperature for 15 minutes and then immediately separated using a magnetic stand to isolate the phage solution. The reconstituted phage solution was added to 20 ml of E. coli strain ER2738 at the exponential growth stage (OD ₆₀₀ : 0.4-0.5). E. coli was cultured with gentle stirring at 37°C for 1 hour, thereby infecting the phages. A 225 mm × 225 mm plate was inoculated with infected E. coli. Phages were then isolated from the culture solution of inoculated E. coli to obtain a phage library solution. This cycle, called panning, was repeated a total of twice. In the second panning cycle, the beads were washed three times with TBST and then twice with TBS. In addition, in case of panning against human CD3ed-Fc, 4 nmol of human Fc region was added.

5-3 Получение активируемой протеазой подобной антителу IgG-типа молекулы с включенным VHH. который связывается CD35-3 Preparation of a protease-activated VHH-incorporated IgG antibody-like molecule. which binds CD3

Нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность VHH (таблица 2) каждого связывающегося с человеческим CD3 клона, полученного согласно методу, описанному в примере 5-1 или 5-2, соединяли с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сайт расщепления протеазой и константную область, с помощью метода, описанного в примере 3, и встраивали в экспрессионный вектор для клеток животных. Полученный продукт применяли в качестве тяжелой цепи подобной антителу IgG-типа молекуле.The nucleotide sequence encoding the VHH sequence (Table 2) of each human CD3 binding clone obtained according to the method described in Example 5-1 or 5-2 was combined with the nucleotide sequence encoding the protease cleavage site and constant region using the method described in example 3, and inserted into an expression vector for animal cells. The resulting product was used as the heavy chain of an IgG-type antibody-like molecule.

Активируемые протеазой подобные антителу IgG-типа молекулы, которые представлены ниже в таблице 3, экспрессировали путем кратковременной экспрессии, используя клетки Free Style 293 (фирма Invitrogen Corp.), с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.The protease-activated IgG antibody-like molecules, which are presented in Table 3 below, were transiently expressed using Free Style 293 cells (Invitrogen Corp.) using a method known to those skilled in the art, and purified using a method known to those skilled in the art using protein A.

5-4 Активация активируемых протеазой подобных антителу IgG-типа молекул путем расщепления протеазой5-4 Activation of protease-activated IgG antibody-like molecules by protease cleavage

Подобные антителу IgG-типа молекулы, полученные согласно методу, описанному в примере 5-3, расщепляли протеазой аналогично методу, описанному в примере 3, и степень расщепления оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 18. Концентрацию протеазы доводили до 25нМ, и в этом анализе применяли Octet RED (фирма Pall ForteBio Corp.).The IgG antibody-like molecules prepared according to the method described in Example 5-3 were protease digested in the same manner as in Example 3, and the degree of digestion was assessed by SDS-PAGE under reducing conditions. The results are presented in Fig. 18. The protease concentration was adjusted to 25 nM and Octet RED (Pall ForteBio Corp.) was used in this assay.

В результате подтверждено, что подобные антителу IgG-типа молекулы подвергались расщеплению протеазой в расщепляемой протеазой последовательности.As a result, it was confirmed that the IgG-type antibody-like molecules were subject to protease cleavage at the protease-cleavable sequence.

Затем осуществляли оценку CD3-связываю щей способности VHH, высвободившегося в результате обработки протеазой, аналогично методу, описанному в примере 3. Полученные с помощью Octet сенсограммы представлены на фиг. 19.The CD3 binding capacity of VHH released by protease treatment was then assessed in a manner similar to the method described in Example 3. The Octet sensorgrams are shown in FIG. 19.

В результате установлено, что подобные антителу IgG-типа молекулы bC3edL1R1N160H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT, bC3edL1R1N161H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT и bC3edL1R1N164H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT не обладали способностью связывать антиген до обработки протеазой, при этом их способность связывать антиген подтверждена после обработки протеазой. Множество молекул VHH, связывающихся с CD3, полученных таким же образом, что и VHH, представленные в таблице 2, применяли также для получения подобной антителу IgG-типа молекулы, содержащей такой же сайт расщепления протеазой, что и подобные антителу IgG-типа молекулы, представленные в таблице 3. В результате способность связывать антиген была подтверждена после обработки протеазой. Эти результаты продемонстрировали, что помимо полипептидов, описанных в примерах 3 и 4, подобная антителу IgG-типа молекула, несущая расщепляемую протеазой последовательность, может подвергаться расщеплению в расщепляемой протеазой последовательности при обработке протеазой и тем самым высвобождать антигенсвязывающий домен, а высвободившийся антигенсвязывающий домен может связываться с антигеном.As a result, it was established that the IgG-type antibody-like molecules bC3edL1R1N160H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT, bC3edL1R1N161H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT and bC3edL1R1N164H01-G1mISHI01/VK1-39-k0MT did not have the ability to bind antigen before protease treatment, with their ability to bind antigen was confirmed after treatment with protease. A variety of CD3 binding VHH molecules prepared in the same manner as the VHH presented in Table 2 were also used to prepare an IgG antibody-like molecule containing the same protease cleavage site as the IgG antibody-like molecules presented in Table 3. As a result, the antigen binding ability was confirmed after protease treatment. These results demonstrated that, in addition to the polypeptides described in Examples 3 and 4, an IgG antibody-like molecule carrying a protease-cleavable sequence can be cleaved at the protease-cleavable sequence upon treatment with the protease and thereby release an antigen-binding domain, and the released antigen-binding domain can bind with antigen.

Пример 6. Полипептид, несущий расщепляемую протеазой последовательность в легкой цепиExample 6 Polypeptide Carrying a Protease-Cleavable Sequence in the Light Chain

Легкие цепи VK1-39P-2-Pk0MT (SEQ ID NO: 67), VK1-39P-1-Pk0MT (SEQ ID NO: 68), VK1-39P-Pk0MT (SEQ ID NO: 69), VK1-39P+2-Pk0MT (SEQ ID NO: 70), VK1-39P+3-Pk0MT (SEQ ID NO: 71), VK1-39P+4-Pk0MT (SEQ ID NO: 72) и VK1-39P+5-Pk0MT (SEQ ID NO: 73), несущие расщепляемую протеазой последовательность в любом положении, получали аналогично методу, описанному в примере 3.Light chains VK1-39P-2-Pk0MT (SEQ ID NO: 67), VK1-39P-1-Pk0MT (SEQ ID NO: 68), VK1-39P-Pk0MT (SEQ ID NO: 69), VK1-39P+2 -Pk0MT (SEQ ID NO: 70), VK1-39P+3-Pk0MT (SEQ ID NO: 71), VK1-39P+4-Pk0MT (SEQ ID NO: 72) and VK1-39P+5-Pk0MT (SEQ ID NO: 73), carrying a protease-cleavable sequence at any position, were prepared similarly to the method described in example 3.

Подобные антителу IgG-типа молекулы экспрессировали и очищали аналогично методу, описанному в примере 3, используя указанные легкие цепи и IL6R90-G1m (SEQ ID NO: 2) в качестве тяжелой цепи. Концентрацию протеазы доводили до 25нМ. IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 3) применяли в качестве подобной антителу IgG-типа молекулы, не имеющей расщепляемой последовательности.IgG antibody-like molecules were expressed and purified similar to the method described in Example 3 using the indicated light chains and IL6R90-G1m (SEQ ID NO: 2) as the heavy chain. The protease concentration was adjusted to 25 nM. IL6R90-G1m/VK1-39-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 2, light chain: SEQ ID NO: 3) was used as an IgG-type antibody-like molecule having no cleavable sequence.

Затем полученные подобные антителу IgG-типа молекулы расщепляли протеазой аналогично методу, описанному в примере 3, и степень расщепления оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 20. В результате подтверждено, что VK1-39P+2-Pk0MT (SEQ ID NO: 70), VK1-39P+3-Pk0MT (SEQ ID NO: 71), VK1-39P+4-Pk0MT (SEQ ID NO: 72) и VK1-39P+5-Pk0MT (SEQ ID NO: 73) подвергались расщеплению протеазой в расщепляемой протеазой последовательности. Дополнительно проводили оценку способности связывать IL-6R для VHH, обработанного протеазой, аналогично методу, описанному в примере 3. Полученные с помощью Octet сенсограммы представлены на фиг. 21. В результате связывание подтверждено также при обработке протеазой, когда расщепляемую последовательность интродуцировали в легкую цепь, демонстрируя, что активируемый протеазой полипептид, несущий расщепляемую протеазой последовательность в его легкой цепи, можно получать так, чтобы антигенсвязывающий домен экспонировался, проявляя антигенсвязывающую способность при расщеплении протеазой легкой цепи.The resulting IgG antibody-like molecules were then digested with protease in a manner similar to the method described in Example 3, and the degree of digestion was assessed by SDS-PAGE under reducing conditions. The results are presented in Fig. 20. As a result, it is confirmed that VK1-39P+2-Pk0MT (SEQ ID NO: 70), VK1-39P+3-Pk0MT (SEQ ID NO: 71), VK1-39P+4-Pk0MT (SEQ ID NO: 72 ) and VK1-39P+5-Pk0MT (SEQ ID NO: 73) were subject to protease cleavage at the protease cleavable sequence. Additionally, the IL-6R binding ability of protease-treated VHH was assessed in a manner similar to the method described in Example 3. Octet-derived sensorgrams are shown in FIG. 21. As a result, binding was also confirmed by protease treatment when the cleavable sequence was introduced into the light chain, demonstrating that a protease-activated polypeptide carrying a protease-cleavable sequence in its light chain can be produced such that the antigen binding domain is exposed to exhibit antigen binding ability upon protease cleavage light chain.

Пример 7. Библиотека, содержащая тяжелую цепь. которая имеет антигенсвязывающий домен, и легкую цепь, несущую расщепляемую протеазой последовательность, и получение активируемого протеазой полипептида методом фагового дисплея с использованием библиотекиExample 7: Library containing heavy chain. which has an antigen-binding domain, and a light chain carrying a protease-cleavable sequence, and obtaining a protease-activated polypeptide by phage display using a library

Как установлено в примере 6, даже, когда расщепляемую протеазой последовательность интродуцировали в легкую цепь активируемого протеазой полипептида, антигенсвязывающий домен экспонировался после расщепления легкой цепи, связываясь с антигеном.As established in Example 6, even when a protease-cleavable sequence was introduced into the light chain of a protease-activated polypeptide, the antigen binding domain was exposed after light chain cleavage to bind the antigen.

Соответственно тяжелую цепь, содержащую антигенсвязывающий домен, такой как однодоменное антитело, легкую цепь, несущую расщепляемую протеазой последовательность, включали в фагмиду и давали презентоваться с помощью фага. Конструировали множество фагмид для фагового дисплея, содержащих различные типы антигенсвязывающих доменов, с последующим получением фагов из Е. coli, в которых сохранялись эти фагмиды. Популяцию фага осаждали, добавляя 2,5М NaCl/10% ПЭГ к культуральному раствору E. coli после производства фага, а затем разводили TBS с получением раствора фаговой библиотеки. Затем добавляли БСА в раствор фаговой библиотеки с получением конечной концентрации БСА 4%.Accordingly, a heavy chain containing an antigen binding domain, such as a single domain antibody, a light chain carrying a protease cleavable sequence is included in a phagemid and allowed to be presented by the phage. A variety of phage midds were constructed for phage display containing different types of antigen-binding domains, followed by the production of phages from E. coli that retained these phagemids. The phage population was precipitated by adding 2.5 M NaCl/10% PEG to the E. coli culture solution after phage production and then diluted with TBS to obtain a phage library solution. BSA was then added to the phage library solution to obtain a final BSA concentration of 4%.

Таким образом получали активируемый протеазой полипептид путем пэннинга из созданной фаговой библиотеки. Пэннинг осуществляли согласно принятому метода пэннинга, используя антиген, иммобилизованный на магнитных гранулах (J. Immunol. Methods. 332 (1-2), 2008, cc. 2-9; J. Immunol. Methods. 247 (1-2), 2001, cc. 191-203; Biotechnol. Prog. 18 (2), 2002, cc. 212-220; и Mol. Cell Proteomics 2 (2), 2003, cc. 61-69). Фаги, несвязанные с иммобилизованными антигеном магнитными гранулами, извлекали до добавления протеазы, а фаги, связанные с иммобилизованными антигеном магнитными гранулами, извлекали после добавления протеазы. Применяемые магнитные гранулы представляли собой покрытые нейтравидином гранулы (Sera-Mag SpeedBead NeutrAvidin-coated FG bead NeutrAvidin) или покрытые стрептавидином гранулы (Dynabeads M-280 Streptavidin). Антигенсвязывающий клон можно отбирать из извлеченных фагов с помощью ELISA для фагов, который описан в предыдущем разделе, или можно ген антитела субклонировать в векторе для экспрессии в животных и экспрессировать с использованием клеток животных и связывающую активность сравнивать до и после обработки протеазой для селекции связывающихся клонов.In this way, a protease-activated polypeptide was obtained by panning from the generated phage library. Panning was carried out according to the accepted panning method, using antigen immobilized on magnetic beads (J. Immunol. Methods. 332 (1-2), 2008, pp. 2-9; J. Immunol. Methods. 247 (1-2), 2001 , pp. 191-203; Biotechnol. Prog. 18 (2), 2002, pp. 212-220; and Mol. Cell Proteomics 2 (2), 2003, pp. 61-69). Phages unbound to antigen-immobilized magnetic beads were recovered before protease addition, and phages bound to antigen-immobilized magnetic beads were recovered after protease addition. The magnetic beads used were neutravidin-coated beads (Sera-Mag SpeedBead NeutrAvidin-coated FG bead NeutrAvidin) or streptavidin-coated beads (Dynabeads M-280 Streptavidin). An antigen binding clone can be selected from recovered phages using the phage ELISA described in the previous section, or the antibody gene can be subcloned into an animal expression vector and expressed using animal cells and binding activity compared before and after protease treatment to select for binding clones.

Пример 8. Библиотека, содержащая тяжелую цепь, которая имеет антигенсвязывающий домен, и легкую цепь, и получение тяжелой цепи, антигенсвязывающая способность которой контролируется легкой цепью, методом фагового дисплея из библиотекиExample 8 A library containing a heavy chain that has an antigen-binding domain and a light chain, and obtaining a heavy chain whose antigen-binding ability is controlled by the light chain by phage display from the library

Как установлено в примере 3, антигенсвязывающая способность тяжелой цепи, содержащей антигенсвязывающий домен, контролируется путем ассоциации с легкой цепью. Таким образом, методом фагового дисплея получали тяжелую цепь, которая утрачивала свою антигенсвязывающую способность при ассоциации с легкой цепью и проявляла антигенсвязывающую способность при презентации индивидуально или в комбинации с константной областью легкой цепи.As established in Example 3, the antigen-binding ability of the heavy chain containing the antigen-binding domain is controlled by association with the light chain. Thus, the phage display method produced a heavy chain that lost its antigen-binding ability when associated with a light chain and exhibited antigen-binding ability when presented alone or in combination with a light chain constant region.

Тяжелую цепь, содержащую антигенсвязывающий домен, такой как однодоменное антитело, включали в фагмиду и презентовали с помощью фага. Конструировали множество фагмид для фагового дисплея, содержащих различные типы антигенсвязывающих доменов, с последующим получением фагов из Е. coli, в которых сохранялись эти фагмиды. Популяцию фага осаждали, добавляя 2,5М NaCl/10% ПЭГ к культуральному раствору Е. coli после производства фага, а затем разводили TBS с получением раствора фаговой библиотеки. Затем добавляли БСА в раствор, содержащий фаговую библиотеку, с получением конечной концентрации БСА 4%.A heavy chain containing an antigen binding domain, such as a single domain antibody, is incorporated into a phagemid and presented to the phage. A variety of phage midds were constructed for phage display containing different types of antigen-binding domains, followed by the production of phages from E. coli that retained these phagemids. The phage population was precipitated by adding 2.5 M NaCl/10% PEG to the E. coli culture solution after phage production and then diluted with TBS to obtain a phage library solution. BSA was then added to the solution containing the phage library to obtain a final BSA concentration of 4%.

Тяжелую цепь, которая проявляет антигенсвязывающую способность, когда презентируется индивидуально или в комбинации с константной областью легкой цепи и утрачивает свою антигенсвязывающую способность при ассоциации с вариабельной областью легкой цепи, получали с помощью пэннинга из созданной таким образом фаговой библиотеки. Пэннинг осуществляли в соответствии с методом пэннинга, используя антиген, иммобилизованный на магнитных гранулах, согласно методу, описанному в примере 5. Фаги, связанные с иммобилизованными антигеном магнитными гранулами, извлекали из фаговой библиотеки, презентирующей тяжелые цепи или тяжелые цепи с константными областями легких цепей. Указанным извлеченным фагам давали инфицировать Е. coli, и фаги, презентирующие тяжелые и легкие цепи, получали с использованием хелперного фага, экспрессирующего легкую цепь. Фаги, презентирующие тяжелую цепь, которая содержит антигенсвязывающий домен, и легкую цепь, получали описанным выше методом из культурального раствора Е. coli после производства фага. Фаги, несвязанные с иммобилизованными антигеном магнитными гранулами, извлекали из популяции фагов, презентирующих тяжелые и легкие цепи.The heavy chain, which exhibits antigen-binding ability when presented alone or in combination with a light chain constant region and loses its antigen-binding ability when associated with a light chain variable region, was obtained by panning from a phage library thus generated. Panning was carried out in accordance with the panning method using antigen immobilized on magnetic beads according to the method described in Example 5. Phages bound to antigen immobilized magnetic beads were recovered from a phage library presenting heavy chains or heavy chains with light chain constant regions. These recovered phages were allowed to infect E. coli, and heavy and light chain presenting phages were produced using a light chain expressing helper phage. Phages presenting a heavy chain, which contains an antigen-binding domain, and a light chain were obtained by the method described above from the E. coli culture solution after phage production. Phages unbound to antigen-immobilized magnetic beads were isolated from the population of phages presenting heavy and light chains.

Как продемонстрировано на фиг. 9Г, пэннинг можно осуществлять путем изменения порядка извлечения популяции фага, презентирующего тяжелую цепь, либо индивидуально, либо в комбинации с константной областью легкой цепи, связывающегося с иммобилизованными антигеном магнитными гранулами, и извлечения популяции фага, презентирующего тяжелые и легкие цепи, несвязывающегося с иммобилизованными антигеном магнитными гранулами. В дополнение в методу экспрессии легкой цепи с использованием хелперного фага, область, кодирующую легкую цепь, и область, кодирующую тяжелую цепь, можно включать, как обычно, в одну и ту же фагмиду, и можно включать ген, кодирующий только константную область легкой цепи или полноразмерную легкую цепь, и применять в каждом цикле пэннинга.As shown in FIG. 9D, panning can be accomplished by changing the order of retrieving a population of heavy chain presenting phage, either alone or in combination with a light chain constant region, binding to antigen immobilized magnetic beads, and retrieving a population of heavy and light chain presenting phage not binding to antigen immobilized magnetic granules. In addition, in the light chain expression method using a helper phage, the light chain coding region and the heavy chain coding region can be included in the same phagemid as usual, and a gene encoding only the light chain constant region or full length light chain and apply to each panning cycle.

Антигенсвязывающий клон можно отбирать из извлеченных фагов с помощью ELISA для фагов, который описан в предыдущем разделе, или можно ген антитела субклонировать в векторе для экспрессии в животных и экспрессировать с использованием клеток животных и связывающую активность сравнивать до и после обработки протеазой для селекции связывающихся клонов.An antigen binding clone can be selected from recovered phages using the phage ELISA described in the previous section, or the antibody gene can be subcloned into an animal expression vector and expressed using animal cells and binding activity compared before and after protease treatment to select for binding clones.

Пример 9. Получение VHH, антигенсвязывающая способность которого контролируется легкой цепью, путем применения метода фагового дисплея, и получение подобной антителу IgG-типа молекулы, содержащей VHHExample 9 Preparation of VHH, the antigen-binding ability of which is controlled by the light chain, by using the phage display method, and preparation of an IgG-type antibody-like molecule containing VHH

В примере 3 установлено, что антигенсвязывающая способность VHH, который входит в качестве заместителя VH в тяжелую цепь, контролируется путем ассоциации с легкой цепью. Соответственно VHH, который утрачивал свою антигенсвязывающую способность при ассоциации с конкретной легкой цепью, и проявлял антигенсвязывающую способность при презентации тяжелой цепи индивидуально или в комбинации с константной областью легкой цепи, т.е. без ассоциации с вариабельной областью легкой цепи, получали из фаговой библиотеки, презентирующей СН1, сцепленный с VHH, полученным из РВМС иммунизированных альпак. Получали подобную антителу IgG-типа молекулу, содержащую VHH.In Example 3, it was established that the antigen-binding ability of VHH, which is included as a VH substituent in the heavy chain, is controlled by association with the light chain. Accordingly, VHH, which lost its antigen-binding ability when associated with a particular light chain, and exhibited antigen-binding ability when presented with a heavy chain alone or in combination with a light chain constant region, i.e. without association with the variable light chain region, were obtained from a phage library presenting CH1 linked to VHH obtained from PBMCs of immunized alpacas. An IgG antibody-like molecule containing VHH was prepared.

9-1 Конструирование экспрессирующих легкую цепь хелперных фагов с интегрированной экспрессионной единицей легкой цепи9-1 Construction of light chain-expressing helper phages with an integrated light chain expression unit

На основе метода, описанного в WO 2015/046554, промотор, сигнальную последовательность, гены вариабельной области легкой цепи и константной области легкой цепи антитела или ген константной области легкой цепи и т.д. интегрировали в геном хелперного фага, создавая экспрессирующий легкую цепь хелперный фаг. Е. coli, инфицированные указанным хелперным фагом, могли экспрессировать вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи антитела или только константную область легкой цепи.Based on the method described in WO 2015/046554, the promoter, signal sequence, light chain variable region and light chain constant region genes of an antibody or light chain constant region gene, etc. integrated into the helper phage genome, creating a light chain-expressing helper phage. E. coli infected with said helper phage could express the light chain variable region and the light chain constant region of the antibody or only the light chain constant region.

В частности, геном получали из хелперного фага M13KO7TC, сконструированного согласно методу, описанному в WO 2015/046554, и интродуцировали в геном экспрессионную единицу легкой цепи. Ген, кодирующий вариабельную область легкой цепи и константную область легкой цепи (VK1-39-k0MTdC; SEQ ID NO: 152), или ген. кодирующий константную область легкой цепи (k0MTdC; SEQ ID NO: 153), применяли в качестве гена легкой цепи, подлежащего интродукции. Конструкцию lac промотор-pelB сигнальная последовательность-ген легкой цепи встраивали в M13KO7TC/SacI с помощью описанного выше метода и трансфектировали штамм Е. coli ER2738 методом электропорации.Specifically, the genome was prepared from helper phage M13KO7TC constructed according to the method described in WO 2015/046554, and a light chain expression unit was introduced into the genome. The gene encoding a light chain variable region and a light chain constant region (VK1-39-k0MTdC; SEQ ID NO: 152), or gene. encoding a light chain constant region (k0MTdC; SEQ ID NO: 153) was used as a light chain gene to be introduced. The lac promoter-pelB signal sequence-light chain gene construct was inserted into M13KO7TC/SacI using the method described above, and E. coli strain ER2738 was transfected by electroporation.

Полученные Е. coli культивировали и в супернатант культуры добавляли 2,5М NaCl/10% ПЭГ для очистки хелперных фагов методом осаждения с помощью ПЭГ. Титры полученных хелперных фагов M13KO7TC-Vk1-39-k0MTdC и M13KO7TC-k0MTdC определяли с помощью общепринятого метода бляшкообразования.The resulting E. coli were cultured and 2.5 M NaCl/10% PEG was added to the culture supernatant to purify helper phages by PEG precipitation. The titers of the resulting helper phages M13KO7TC-Vk1-39-k0MTdC and M13KO7TC-k0MTdC were determined using the conventional plaque assay method.

9-2 Получение библиотеки, содержащей множество молекул VHH-CH19-2 Preparation of a library containing many VHH-CH1 molecules

Альпак иммунизировали методом, известным специалистам в данной области, используя 4 типа иммуногенов: внеклеточный домен человеческого IL-6R, гетеродимер человеческого CD3εγ, гетеродимер обезьяньего CD3εγ и клеточный домен человеческого плексина А1. Через 4 недели собирали РВМС. Гетеродимеры CD3εγ получали согласно методу, описанному в Journal of Molecular Biology 302, 2000, сс. 899-916. Из собранных РВМС ген VHH амплифицировали согласно методу, описанному в J. Immunol. Methods 324, 2007, с. 13. Амплифицированный фрагмент гена VHH соединяли с геном 3 CH1-гена и встраивали с фагмидые векторы с получением библиотеки, содержащей множество молекул VHH-CH1, содержащих VHH, сцепленный с СН1.Alpacas were immunized using a method known to those skilled in the art using 4 types of immunogens: human IL-6R extracellular domain, human CD3εγ heterodimer, simian CD3εγ heterodimer, and human plexin A1 cellular domain. After 4 weeks, PBMCs were collected. CD3εγ heterodimers were prepared according to the method described in Journal of Molecular Biology 302, 2000, pp. 899-916. From collected PBMCs, the VHH gene was amplified according to the method described in J. Immunol. Methods 324, 2007, p. 13. The amplified fragment of the VHH gene was fused to gene 3 of the CH1 gene and inserted into phagemid vectors to produce a library containing multiple VHH-CH1 molecules containing VHH linked to CH1.

9-3 Метод получения популяции фага, презентирующего конструкцию VHH-CH1/полноразмерная легкая цепь или VHH-CH1/константная область легкой цепи9-3 Method for obtaining a population of phage presenting the VHH-CH1/full-length light chain or VHH-CH1/light chain constant region construct

Фагмидным вектором, имеющим вставку в виде гена, кодирующего VHH-CH1, трансфектировали Е. coli методом электропорации. Полученных Е. coli можно культивировать и инфицировать хелперным фагом M13KO7TC-Vk1-39-k0MTdC, полученным согласно методу, описанному в примере 9-1, в результате чего конструкция VHH-CH1, экспрессированная фагмидным вектором, и полноразмерная легкая цепь, экспрессированная хелперным фагом, формировали Fab-структуру, для получения популяции фага, презентирующего VHH-CH1/полноразмерная легкая цепь (VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC) на поверхности фагмид, содержащих ген, кодирующий VHH-CH1. Кроме того, Е. coli, несущих фагмидный вектор, который имеет вставку в виде гена, кодирующего VHH-CH1, можно культивировать и инфицировать хелперным фагом M13KO7TC-k0MTdC, полученным согласно методу, описанному в примере 9-1, в результате чего конструкция VHH-CH1, экспрессированная фагмидным вектором, и константная область легкой цепь, экспрессированная хелперным фагом, формировали структуру в виде VHH-CH1, ассоциированных с CL, для получения популяции фага, презентирующего VHH-CH1/константная область легкой цепи (VHH-CH1/k0MTdC). Можно добавлять в супернатант культуры 2,5М NaCl/10% ПЭГ для очистки фагов методом осаждения ПЭГ. Титры полученных фагов можно определять с помощью общепринятого метода бляшкообразования.A phagemid vector containing an insert in the form of a gene encoding VHH-CH1 was transfected into E. coli by electroporation. The resulting E. coli can be cultured and infected with the helper phage M13KO7TC-Vk1-39-k0MTdC obtained according to the method described in Example 9-1, resulting in the VHH-CH1 construct expressed by the phagemid vector and the full-length light chain expressed by the helper phage formed a Fab structure to obtain a population of phage presenting VHH-CH1/full-length light chain (VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC) on the surface of phagemids containing the gene encoding VHH-CH1. In addition, E. coli carrying a phagemid vector that has an insertion of the gene encoding VHH-CH1 can be cultured and infected with the helper phage M13KO7TC-k0MTdC obtained according to the method described in Example 9-1, resulting in a VHH- CH1 expressed by the phagemid vector and the light chain constant region expressed by the helper phage were structured as VHH-CH1 associated with CL to obtain a phage population presenting VHH-CH1/light chain constant region (VHH-CH1/k0MTdC). 2.5 M NaCl/10% PEG can be added to the culture supernatant to purify phages using the PEG precipitation method. The titers of the resulting phages can be determined using the conventional plaque formation method.

9-4 Получение конструкции VHH-CH1. содержащей связывающийся с плексином A1 VHH, антигенсвязывающая способность которого ингибируется при ассоциации с вариабельной областью легкой цепи, и который обладает антигенсвязывающей способностью в отсутствии вариабельной области легкой цепи. из фаговой библиотеки VHH-CH19-4 Preparation of the VHH-CH1 design. containing a plexin A1-binding VHH, the antigen-binding ability of which is inhibited by association with the light chain variable region, and which has antigen-binding ability in the absence of the light chain variable region. from the VHH-CH1 phage library

Получали конструкцию VHH-CH1, содержащую VHH, антигенсвязывающая способность которого ингибируется при ассоциации с вариабельной областью легкой цепи, и который обладает антигенсвязывающей способностью в отсутствии вариабельной области легкой цепи, путем пэннинга из библиотеки VHH-CH1, полученной согласно методу, описанному в примере 9-2.A VHH-CH1 construct containing a VHH whose antigen-binding ability is inhibited by association with a light chain variable region, and which has antigen-binding ability in the absence of a light chain variable region, was prepared by panning from a VHH-CH1 library prepared according to the method described in Example 9- 2.

Применяемый антиген представлял собой меченный биотином человеческий плексин A1, получение которого описано в приведенном для справки примере (референс-пример).The antigen used was biotin-labeled human plexin A1, the preparation of which is described in the example provided for reference (reference example).

Метод пэннинга осуществляли с использованием следующих стадий:The panning method was carried out using the following steps:

(1) Популяцию фага, презентирующего VHH-CH1/константная область легкой цепи (VHH-CH1/k0MTdC), получали согласно методу, описанному в примере 9-3, из фаговой библиотеки VHH-CH1, полученной согласно методу, описанному в примере 9-2, и из популяции извлекали фаги, связанные с магнитными гранулами с иммобилизованным антигеном.(1) A population of phage presenting VHH-CH1/light chain constant region (VHH-CH1/k0MTdC) was obtained according to the method described in Example 9-3 from the VHH-CH1 phage library obtained according to the method described in Example 9- 2, and phages bound to magnetic antigen-immobilized beads were recovered from the population.

(2) Популяцию фага, презентирующего VHH-CH1/полноразмерная легкая цепь (VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC), получали согласно методу, описанному в примере 9-3, из извлеченных фагов, и из популяции извлекали фаги, несвязанные с магнитными гранулами с иммобилизованным антигеном.(2) A population of phage presenting VHH-CH1/full-length light chain (VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC) was prepared according to the method described in Example 9-3 from recovered phages, and phages not associated with magnetic granules with immobilized antigen.

(3) Извлеченные фаги повторно подвергали стадиям (1) и (2) для извлечения требуемого фага.(3) The recovered phages were repeatedly subjected to steps (1) and (2) to recover the desired phage.

С помощью пэннинга можно отбирать множество молекул VHH-CH1, связывание которых с плексином А1 ингибировалось в результате ассоциации с легкой цепью Vk1-39-k0MTdC, и которые обладали связывающей способностью в отношении плексина А1 в отсутствии вариабельной области легкой цепи.By panning, it is possible to select a variety of VHH-CH1 molecules whose binding to plexin A1 was inhibited by association with the Vk1-39-k0MTdC light chain and which had binding capacity for plexin A1 in the absence of the light chain variable region.

Другой метод пэннинга осуществляли с использованием следующих стадий:Another panning method was carried out using the following steps:

(2) Популяцию фага, презентирующего VHH-CH1/полноразмерная легкая цепь (VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC), получали согласно методу, описанному в примере 9-3, из извлеченных фагов, и из популяции извлекали фаги, несвязанные с иммобилизованными антигеном магнитными гранулами. Дополнительно из извлеченных фагов выделяли фаги, связывающиеся с магнитными гранулами с иммобилизованным антителом к легкой цепи (фирма EY Laboratories, Inc., Cat. BAT-2107-2).(2) A population of phage presenting VHH-CH1/full-length light chain (VHH-CH1/Vk1-39-k0MTdC) was prepared according to the method described in Example 9-3 from recovered phages, and phages not bound to immobilized antigen magnetic beads. Additionally, phages that bind to magnetic beads with immobilized light chain antibody (EY Laboratories, Inc., Cat. BAT-2107-2) were isolated from the extracted phages.

VHH в VHH-CH1, отобранный с помощью пэннинга, можно применять для получения подобных антителу IgG-типа молекул.The VHH in VHH-CH1 selected by panning can be used to produce IgG-type antibody-like molecules.

9-5 Получение активируемых протеазой подобных антителу IgG-типа молекул с включенным VHH. который связывается с плексином А19-5 Preparation of protease-activated VHH-incorporated IgG antibody-like molecules. which binds to plexin A1

Нуклеотидную последовательность, кодирующую VHH, который содержится в каждой молекуле VHH-CH1, отобранной согласно методу, описанному в примере 9-4, соединяли с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сайт расщепления протеазой и константную область тяжелой цепи, согласно методу, описанному в примере 3. Образовавшуюся конструкцию применяли в качестве тяжелой цепи подобной антителу IgG-типа молекулы и объединяли с полноразмерной легкой цепью VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3). Подобные антителу IgG-типа молекулы экспрессировали путем кратковременной экспрессии, используя клетки FreeStyle 293 (фирма Invitrog en Corp.), с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.The nucleotide sequence encoding VHH, which is contained in each VHH-CH1 molecule selected according to the method described in Example 9-4, was combined with the nucleotide sequence encoding the protease cleavage site and heavy chain constant region according to the method described in Example 3. The resulting the construct was used as the heavy chain of an IgG-type antibody-like molecule and combined with the full-length light chain of VK1-39-k0MT (SEQ ID NO: 3). IgG antibody-like molecules were expressed by transient expression using FreeStyle 293 cells (Invitrog en Corp.) using a method known to those skilled in the art, and purified using a method known to those skilled in the art using protein A.

Полученные подобные антителу IgG-типа молекулы представлены в таблице 4.The resulting IgG antibody-like molecules are presented in Table 4.

9-6 Активация активируемой протеазой подобной антителу IgG-типа молекулы путем расщепления протеазой9-6 Activation of a protease-activated IgG antibody-like molecule by protease cleavage

Подобные антителу IgG-типа молекулы, полученные согласно методу, описанному в примере 9-4, расщепляли протеазой, аналогично методу, описанному в примере 3, и степень расщепления оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 22. Концентрацию протеазы доводили до 25нМ.The IgG antibody-like molecules prepared according to the method described in Example 9-4 were protease digested in a manner similar to the method described in Example 3, and the degree of digestion was assessed by SDS-PAGE under reducing conditions. The results are presented in Fig. 22. The protease concentration was adjusted to 25 nM.

В результате установлено, что каждая из полученных подобных антителу IgG-типа молекул подвергалась расщеплению протеазой в расщепляемой протеазой последовательности.As a result, it was found that each of the resulting IgG-type antibody-like molecules was subjected to protease cleavage at the protease-cleavable sequence.

Далее оценивали связывание с человеческим плексином A1 VHH, высвободившегося в результате обработки протеазой, аналогично методу, описанному в примере 3. Полученные с помощью Octet сенсограммы представлены на фиг. 23.Next, the binding of VHH released by protease treatment to human plexin A1 was assessed in a manner similar to the method described in Example 3. Octet-derived sensograms are shown in FIG. 23.

В результате установлено, что каждая из полученных подобных антителу IgG-типа молекул не проявляла антигенсвязывающую способность до обработки протеазой, однако подтверждена антигенсвязывающая способность высвободившегося VHH после обработки протеазой.As a result, it was found that each of the resulting IgG-type antibody-like molecules did not exhibit antigen-binding ability before protease treatment, but the antigen-binding ability of the released VHH after protease treatment was confirmed.

Пример 10. Полипептиды, содержащие биспецифическую молекулу VHH-VHHExample 10 Polypeptides containing a bispecific VHH-VHH molecule

10-1 Биспецифическая конструкция VHH-VHH, связывающаяся с раковым антигеном и CD3, и получение полипептида, содержащего биспецифическую молекулу VHH-VHH10-1 Bispecific VHH-VHH construct binding to cancer antigen and CD3 and production of a polypeptide containing the bispecific VHH-VHH molecule

Как продемонстрировано на фиг. 8, активируемый протеазой антигенсвязывающий домен может образовывать биспецифическую антигенсвязывающую молекулу со вторым антигенсвязывающим доменом.As shown in FIG. 8, the protease-activated antigen binding domain can form a bispecific antigen binding molecule with a second antigen binding domain.

VHH HN3 (SEQ ID NO: 159), распознающий человеческий глипикан 3, и VHH G03 (SEQ ID NO: 160), распознающий CD3, соединяли через линкер, состоящий из глицина и серина, с получением биспецифической конструкции VHH-VHH HN3G03. Константную область тяжелой цепи антитела, представленную в SEQ ID NO: 161, дополнительно соединяли с ней через расщепляемую протеазой последовательность, и образовавшуюся тяжелую цепь HN3G03-cF760mnHIF (SEQ ID NO: 162), содержащую биспецифическую конструкцию VHH-VHH, встраивали в вектор для экспрессии в животных.VHH HN3 (SEQ ID NO: 159), recognizing human glypican 3, and VHH G03 (SEQ ID NO: 160), recognizing CD3, were connected through a glycine-serine linker to obtain the bispecific construct VHH-VHH HN3G03. The constant region of the antibody heavy chain shown in SEQ ID NO: 161 was further linked thereto through a protease cleavable sequence, and the resulting heavy chain HN3G03-cF760mnHIF (SEQ ID NO: 162) containing the bispecific construct VHH-VHH was inserted into an expression vector in animals.

VHH HerF07 (SEQ ID NO: 163), распознающий Her2, и VHH G03 (SEQ ID NO: 160), распознающий CD3, соединяли через линкер, состоящий из глицина и серина, с получением биспецифической конструкции VHH-VHH HerF07G03. Константную область тяжелой цепи антитела, представленную в SEQ ID NO: 161, дополнительно соединяли с ней через расщепляемую протеазой последовательность, и образовавшуюся тяжелую цепь HerF07G03-cF760mnHIF (SEQ ID NO: 164), содержащую биспецифическую конструкцию VHH-VHH, встраивали в вектор для экспрессии в животных.VHH HerF07 (SEQ ID NO: 163), recognizing Her2, and VHH G03 (SEQ ID NO: 160), recognizing CD3, were connected through a glycine-serine linker to obtain the bispecific construct VHH-VHH HerF07G03. The constant region of the antibody heavy chain shown in SEQ ID NO: 161 was further linked thereto through a protease cleavable sequence, and the resulting heavy chain HerF07G03-cF760mnHIF (SEQ ID NO: 164) containing the bispecific construct VHH-VHH was inserted into an expression vector in animals.

Клетки Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) совместно трансфектировали каждой тяжелой цепью, содержащей биспецифическую конструкцию VHH-VHH, и векторами для экспрессии в животных соответственно, которые имели вставки в виде легкой цепи VK1.39-k0MT (SEQ ID NO: 3), человеческой последовательностью константной области VHn-Kn010dGK (SEQ ID NO: 166), простирающейся от шарнирной области до С-конца, для экспрессии полипептида, содержащего биспецифическую конструкцию VHH-VHH. Затем, полипептид, содержащий биспецифическую конструкцию VHH-VHH, очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя 96-луночный планшет типа MonoSpin ProA (фирма GL Sciences Inc., каталожный №7510-11312). Полипептид, содержащий биспецифическую конструкцию VHH-VHH HN3G03, представлял собой HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT, а полипептид, содержащий биспецифическую конструкцию VHH-VHH HerF07G03, представлял собой HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT.Expi293 cells (Life Technologies Corp.) were co-transfected with each heavy chain containing the VHH-VHH bispecific construct and animal expression vectors, respectively, which had the VK1.39-k0MT light chain inserts (SEQ ID NO: 3), human constant region sequence VHn-Kn010dGK (SEQ ID NO: 166), extending from the hinge region to the C-terminus, to express a polypeptide containing the bispecific construct VHH-VHH. The polypeptide containing the VHH-VHH bispecific construct was then purified by a method known to those skilled in the art using a 96-well MonoSpin ProA plate (GL Sciences Inc., catalog no. 7510-11312). The polypeptide containing the bispecific construct VHH-VHH HN3G03 was HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT, and the polypeptide containing the bispecific construct VHH-VHH HerF07G03 was HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/ VK1.39 -k0MT.

Для обработки протеазой uPA (рекомбинантный активатор человеческого и-плазминогена, фирма R&D Systems, Inc.) (конечная концентрация: 25нМ) добавляли к 40 мкг каждого очищенного полипептида, содержащего биспецифическую конструкцию VHH-VHH, и инкубировали при 37°С в течение 20 ч или более. Необработанные протеазой образцы инкубировали после добавления ЗФР вместо протеазы в таком же количестве, что и протеаза. Подвергается ли расщепляемый протеазой полипептид, содержащий биспецифическую конструкцию VHH-VHH, требуемому расщеплению, определяли с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 24. Как продемонстрировано на фиг. 24, можно предположить, что биспецифическая конструкция VHH-VHH отделялась от цельной молекулы путем расщепления протеазой.For protease treatment, uPA (recombinant human plasminogen activator, R&D Systems, Inc.) (final concentration: 25 nM) was added to 40 μg of each purified polypeptide containing the VHH-VHH bispecific construct and incubated at 37°C for 20 h. or more. Samples not treated with protease were incubated after adding PBS instead of protease in the same amount as protease. Whether a protease-cleavable polypeptide containing the VHH-VHH bispecific construct undergoes the required cleavage was determined by SDS-PAGE under reducing conditions. The results are presented in Fig. 24. As shown in FIG. 24, it can be assumed that the bispecific VHH-VHH construct was separated from the whole molecule by protease cleavage.

10-2 Оценка активации CD3 полипептидом, содержащим биспецифическую конструкцию VHH-VHH, направленную против GPC3 и CD3, путем расщепления протеазой10-2 Assessment of CD3 activation by a polypeptide containing the VHH-VHH bispecific construct directed against GPC3 and CD3 by protease cleavage

Агонистическую активность в отношении CD3 оценивали с использованием репортерных клеток Jurkat-NFAT (клетки линии NFAT luc2_jurkat). Репортерные клетки Jurkat-NFAT представляют собой клеточную линию экспрессирующих CD3 полученных из человеческого острого Т-клеточного лейкоза клеток, слитую с респондерным элементом NFAT и люциферазой (luc2P), и экспрессирующую люциферазу при активации сигнала, действующего в прямом направлении относительно CD3. Клетки-мишени, применяемые для антител к GPC3, представляли собой клетки линии SK-рса60, созданные путем усиления способности экспрессировать человеческий GPC3 в полученной из клеток человеческого рака печени линии SK-HEP-1. Клетки-мишени и эффекторные клетки добавляли из расчета 1,25Е+04 клеток/лунку и 7.50Е+04 клеток/лунку соответственно в каждую лунку 96-луночного планшета для анализа с белым дном (фирма Costar, 3917). Конструкцию HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT, обработанную или необработанную протеазой, добавляли в лунки в конечной концентрации 1нМ, 10нМ или 100нМ. После 24-часовой инкубации при 37°С в присутствии 5% СО₂; активность фермента люциферазы измеряли по интенсивности люминисценции, используя систему для анализа люциферазы Bio-Glo (фирма Promega Corp., G7940) согласно прилагаемому протоколу. Для детекции использовали устройство 2104 En Vision. Результаты представлены на фиг. 25. Никакого повышения люциферазной активности не обнаружено в образце, необработанном протеазой, в то время как повышение люциферазной активности выявлено при использовании конструкции HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT, обработанной протеазой. В частности, для обработанной протеазой конструкции HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT, удалось подтвердить наличие агонистической активности в отношении CD3, в то время как биспецифическая конструкция VHH-VHH, направленная против GPC3 и CD3, высвобождалась из HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT при расщеплении протеазой и проявляла CD3-связывающую активность, заингибированную в отсутствии расщепления.CD3 agonist activity was assessed using Jurkat-NFAT reporter cells (NFAT luc2_jurkat cell line). Jurkat-NFAT reporter cells are a human acute T-cell leukemia-derived CD3-expressing cell line fused to the NFAT responder element and luciferase (luc2P), and express luciferase upon activation of a signal acting downstream of CD3. The target cells used for anti-GPC3 antibodies were the SK-pca60 cell line, created by enhancing the ability to express human GPC3 in the human liver cancer cell line SK-HEP-1. Target and effector cells were added at 1.25E+04 cells/well and 7.50E+04 cells/well, respectively, to each well of a 96-well white bottom assay plate (Costar, 3917). The HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT construct, treated or untreated with protease, was added to the wells at a final concentration of 1nM, 10nM, or 100nM. After 24 hours of incubation at 37°C in the presence of 5% CO ₂ ; Luciferase enzyme activity was measured by luminescence intensity using the Bio-Glo Luciferase Assay System (Promega Corp., G7940) according to the accompanying protocol. A 2104 En Vision device was used for detection. The results are presented in Fig. 25. No increase in luciferase activity was detected in the protease-untreated sample, while an increase in luciferase activity was detected using the protease-treated HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT construct. In particular, the protease-treated construct HN3G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT was confirmed to have CD3 agonist activity, while the bispecific construct VHH-VHH, directed against GPC3 and CD3, was released from HN3G03- cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT upon protease cleavage and exhibited CD3-binding activity that was inhibited in the absence of cleavage.

10-3 Оценка активации CD3 полипептидом, содержащим биспецифическую конструкцию VHH-VHH, направленную против Her2 и CD3, путем расщепления протеазой10-3 Assessment of CD3 activation by a polypeptide containing the bispecific VHH-VHH construct directed against Her2 and CD3 by protease cleavage

Агонистическую активность в отношении CD3 оценивали с использованием репортерных клеток Jurkat-NFAT (клетки линии NFAT luc2_jurkat). Репортерные клетки Jurkat-NFAT (эффекторные клетки) представляют собой клеточную линию экспрессирующих CD3 полученных из человеческого острого Т-клеточного лейкоза клеток, слитую с респондерным элементом NFAT и люциферазой (luc2P), и экспрессирующую люциферазу при активации сигнала, действующего в прямом направлении относительно CD3. Применяемые клетки-мишени представляли собой клеточную линию LS1034. Клетки-мишени и эффекторные клетки добавляли из расчета 2.50Е+04 клеток/лунку и 7,50Е+04 клеток/лунку соответственно в каждую лунку 96-луночного планшета для анализа с белым дном (фирма Costar, 3917). Конструкцию HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT, обработанную или необработанную протеазой, добавляли в лунки в конечной концентрации 0,01нМ, 0,1нМ и 1нМ. После 24-часовой инкубации при 37°С в присутствии 5% СО₂; активность фермента люциферазы измеряли по интенсивности люминисценции, используя систему для анализа люциферазы Bio-Glo (фирма Promega Corp., G7940) согласно прилагаемому протоколу. Для детекции использовали устройство 2104 EnVision. Результаты представлены на фиг. 26. Никакого повышения люциферазной активности не обнаружено в образце, необработанном протеазой, в то время как повышение люциферазной активности выявлено при использовании конструкции HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT, обработанной протеазой. В частности, для обработанной протеазой конструкции HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT, удалось подтвердить наличие агонистической активности в отношении CD3, в то время как биспецифическая конструкция VHH-VHH, направленная против Her2 и CD3, высвобождалась из HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT при расщеплении протеазой и проявляла CD3-связывающую активность, заингибированную в отсутствии расщепления.CD3 agonist activity was assessed using Jurkat-NFAT reporter cells (NFAT luc2_jurkat cell line). Jurkat-NFAT reporter cells (effector cells) are a human acute T-cell leukemia-derived CD3-expressing cell line fused to the NFAT responder element and luciferase (luc2P), and express luciferase upon activation of a signal acting downstream of CD3. The target cells used were the LS1034 cell line. Target and effector cells were added at 2.50E+04 cells/well and 7.50E+04 cells/well, respectively, to each well of a 96-well white bottom assay plate (Costar, 3917). The HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT construct, treated or untreated with protease, was added to the wells at final concentrations of 0.01 nM, 0.1 nM, and 1 nM. After 24 hours of incubation at 37°C in the presence of 5% CO ₂ ; Luciferase enzyme activity was measured by luminescence intensity using the Bio-Glo Luciferase Assay System (Promega Corp., G7940) according to the accompanying protocol. A 2104 EnVision device was used for detection. The results are presented in Fig. 26. No increase in luciferase activity was detected in the sample not treated with protease, while an increase in luciferase activity was detected using the HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT construct treated with protease. In particular, the protease-treated construct HerF07G03-cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT was confirmed to have CD3 agonist activity, while the bispecific construct VHH-VHH, directed against Her2 and CD3, was released from HerF07G03- cF760mnHIF/VHn-Kn010dGK/VK1.39-k0MT upon protease cleavage and exhibited CD3-binding activity that was inhibited in the absence of cleavage.

Пример 11. Интродукция различных сайтов расщепления протеазой в полипептид с включенным VHHExample 11: Introduction of Various Protease Cleavage Sites into a VHH-Incorporated Polypeptide

11-1 Интродукция различных расщепляемых протеазой последовательностей в полипептид с включенным VHH, который связывается с IL-6R11-1 Introduction of various protease-cleavable sequences into a VHH-incorporated polypeptide that binds IL-6R

Получали экспрессионный вектор, кодирующий конструкцию IL6R90-G1T4 (SEQ ID NO: 167), которая содержит IL6R90 (SEQ ID NO: 1), т.е. VHH, который обладает связывающей и нейтрализующей активностью в отношении человеческого IL-6R, описанный в WO 2010/115998, слитый с константной областью человеческого IgGI (СН1-шарнир-СН2-СН3), с использованием метода, известного специалистам в данной области. Подобную антителу IgG-типа молекулу IL6R90-G1T4/VK1-39-k0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 167, легкая цепь: SEQ ID NO: 3) экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.) или клеток Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.An expression vector encoding the IL6R90-G1T4 construct (SEQ ID NO: 167), which contains IL6R90 (SEQ ID NO: 1), was obtained, i.e. VHH, which has binding and neutralizing activity against human IL-6R, described in WO 2010/115998, fused to the constant region of human IgGI (CH1-hinge-CH2-CH3), using a method known to those skilled in the art. The IgG antibody-like molecule IL6R90-G1T4/VK1-39-k0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 167, light chain: SEQ ID NO: 3) was expressed by transient expression using FreeStyle 293 cells (Invitrogen Corp.) or Expi293 cells (Life Technologies Corp.) using a method known to those skilled in the art, and purified using a method known to those skilled in the art using protein A.

Различные расщепляемые протеазой последовательности встраивали вблизи границы между VHH и СН1 в тяжелую цепь IL6R90-G1T4/VK1-39-k0MT. Экспрессионные векторы, в которые расщепляемую протеазой последовательность, представленную в таблице 5, встраивали вблизи границы между VHH и СН1, получали с помощью методов, известных специалистам в данной области. Последовательности содержащих VHH тяжелых цепей, несущих расщепляемую протеазой последовательность, представлены в таблице 6.Various protease-cleavable sequences were inserted near the boundary between VHH and CH1 into the heavy chain of IL6R90-G1T4/VK1-39-k0MT. Expression vectors into which the protease-cleavable sequence shown in Table 5 were inserted near the boundary between VHH and CH1 were prepared using methods known to those skilled in the art. The sequences of VHH-containing heavy chains carrying the protease-cleavable sequence are presented in Table 6.

Эти тяжелые цепи объединяли с легкой цепью. Подобные антителу IgG1-изотипа молекулы, представленные в таблице 7, которые несут расщепляемую протеазой последовательность вблизи границы между VHH и СН1, кратковременно экспрессировали с использованием клеток FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.) или клеток Expi293 cells (фирма Life Technologies Corp.) согласно методу, известному специалистам в данной области, и очищали согласно методу, известному специалистам в данной области, используя белок А.These heavy chains were combined with a light chain. The IgG1 isotype antibody-like molecules shown in Table 7, which carry a protease-cleavable sequence near the interface between VHH and CH1, were transiently expressed using FreeStyle 293 cells (Invitrogen Corp.) or Expi293 cells (Life Technologies Corp.) according to the method , known to those skilled in the art, and purified according to a method known to those skilled in the art using Protein A.

11-2 Оценка расщепления протеазой множества подобных антителу IgG-типа молекул, содержащих VHH к человеческому IL-6R. которые несут расщепляемую протеазой последовательность в области тяжелой цепи11-2 Evaluation of protease cleavage of multiple IgG-type antibody-like molecules containing VHH to human IL-6R. which carry a protease-cleavable sequence in the heavy chain region

Изучали, могут ли подобные антителу IgG-типа молекулы, полученные согласно методу, описанному в примере 11-1, расщепляться протеазой. В качестве протеазы применяли рекомбинантную человеческую матриптазу/каталитический домен ST14 (MT-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). Подвергали взаимодействию 10нМ протеазу и 50 мкг/мл антитела в ЗФР при 37°С в течение 20 ч, после чего осуществляли ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 27. Установлено, что обработка протеазой подобных антителу IgG-типа молекул, несущих любую из расщепляемых протеазой последовательностей, приводила к созданию новой полосы, соответствующей молекулярной массе порядка 37 кДа. Таким образом, подтверждено, что подобные антителу IgG-типа молекулы подвергались расщеплению протеазой в расщепляемых протеазой последовательностях, которые представлены в таблице 5, встроенных вблизи границы между VHH и СН1. Кроме того, с использованием аналогичного метода подтверждено, что расщепляемые протеазой последовательности, представленные в таблице 5, могли расщепляться человеческой uPA и мышиной uPA, при их встраивании в антитело IgG-типа.It was studied whether IgG-type antibody-like molecules obtained according to the method described in Example 11-1 could be cleaved by protease. The protease used was recombinant human matriptase/catalytic domain ST14 (MT-SP1) (R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). 10 nM protease and 50 μg/ml antibody were reacted in PBS at 37°C for 20 hours, after which SDS-PAGE was performed under reducing conditions. The results are presented in Fig. 27. It was found that protease treatment of IgG-type antibody-like molecules carrying any of the protease-cleavable sequences resulted in the creation of a new band corresponding to a molecular mass of about 37 kDa. Thus, it was confirmed that the IgG-type antibody-like molecules were subject to protease cleavage in the protease cleavable sequences that are presented in Table 5, embedded near the boundary between VHH and CH1. In addition, using a similar method, it was confirmed that the protease-cleavable sequences presented in Table 5 could be cleaved by human uPA and mouse uPA when incorporated into an IgG-type antibody.

Пример 12. Оценка уровня активации в результате расщепления протеазой подобной антителу IgG-типа молекулы, несущей расщепляемую протеазой последовательность в ее легкой цепиExample 12: Evaluation of the level of activation resulting from protease cleavage of an IgG-type antibody-like molecule carrying a protease-cleavable sequence in its light chain

Получали экспрессионный вектор, кодирующий конструкцию IL6R75-G1m (SEQ ID NO: 191), которая содержит IL6R75 (SEQ ID NO: 190), т.е. VHH, который обладает связывающей и нейтрализующей активностью в отношении человеческого IL-6R, описанный в WO 2010/115998, слитый с константной областью человеческого IgG1 (СН1-шарнир-СН2-СН3), с использованием метода, известного специалистам в данной области. IL6R75hu-G1m (SEQ ID NO: 192) получали путем интродукции аминокислотных изменений в сайте на поверхности раздела между VHH и VL, аналогично методу, описанному в примере 4-2. Подобные антителу IgG-типа молекулы IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 2, легкая цепь: SEQ ID NO: 72), 20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 39, легкая цепь: SEQ ID NO: 72) и IL6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 192, легкая цепь: SEQ ID NO: 72) экспрессировали и очищали, аналогично методу, описанному в примере 3, используя легкую цепь с включенной расщепляемой протеазой последовательностью VK1-39P+4-Pk0MT (SEQ ID NO: 72), и IL6R90-G1m (SEQ ID NO: 2), 20A11hu-G1m (SEQ ID NO: 39) и IL6R75hu-G1m (SEQ ID NO: 192) в качестве тяжелых цепей.An expression vector was prepared encoding the IL6R75-G1m construct (SEQ ID NO: 191), which contains IL6R75 (SEQ ID NO: 190), i.e. VHH, which has binding and neutralizing activity against human IL-6R, described in WO 2010/115998, fused to the human IgG1 constant region (CH1-hinge-CH2-CH3), using a method known to those skilled in the art. IL6R75hu-G1m (SEQ ID NO: 192) was prepared by introducing amino acid changes at the interface site between VHH and VL, similar to the method described in Example 4-2. IgG-type antibody-like molecules IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 2, light chain: SEQ ID NO: 72), 20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 39, light chain: SEQ ID NO: 72) and IL6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT (heavy chain: SEQ ID NO: 192, light chain: SEQ ID NO: 72) were expressed and purified in a manner similar to that described in Example 3 using the light chain incorporating the protease cleavable sequence VK1-39P+4-Pk0MT (SEQ ID NO: 72), and IL6R90-G1m (SEQ ID NO: 2), 20A11hu-G1m (SEQ ID NO: 39) and IL6R75hu-G1m (SEQ ID NO: 192) as heavy chains.

IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT, 20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT и IL-6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT расщепляли протеазой, аналогично методу, описанному в примере 3, и оценивали степень расщепления. Результаты представлены на фиг. 28. В частности, в качестве протеазы применяли рекомбинантную человеческую матриптазу/каталитический домен ST14 (МТ-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). Подвергали взаимодействию 50 нМ протеазу и 50 мкг/мл каждой из подобных антителу IgG-типа молекул в ЗФР при 37°С в течение 20 ч. Затем расщепление протеазой оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. В результате подтверждено, что IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT, 20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT и IL-6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT подвергались расщеплению протеазой вблизи границы между VL и CL.IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT, 20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT and IL-6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT were digested with protease, similar to the method described in example 3, and evaluated degree of splitting. The results are presented in Fig. 28. Specifically, recombinant human matriptase/catalytic domain ST14 (MT-SP1) (R&D Systems, Inc., 3946-SE-010) was used as the protease. The protease was reacted with 50 nM protease and 50 μg/ml of each IgG antibody-like molecule in PBS at 37° C. for 20 hours. Protease cleavage was then assessed by SDS-PAGE under reducing conditions. The results confirmed that IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT, 20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT and IL-6R75hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT were subject to protease cleavage near the interface between VL and C.L.

Затем способность VHH, высвободившегося в результате обработки протеазой, связываться с IL-6R оценивали с помощью ELISA. В частности, конструкцию hsIL-6R-BAP1, применяемую в примере 3, иммобилизовывали на покрытом стрептавидином 384-луночном планшете (фирма Greiner Bio-One GmbH, 781990) и каждой расщепленной подобной антителу IgG-типа молекуле давали связываться с ним при комнатной температуре. После осуществления реакции в течение 30 мин конструкции давали взаимодействовать с меченным HRP антителом к человеческому IgG (фирма Sigma-Aldrich Co. LLC, SAB3701362-2MG) при комнатной температуре в течение 10 мин и добавляли для взаимодействия хромогенный раствор ТМВ (фирма Life Technologies Corp., 002023). После осуществления реакции при комнатной температуре в течение 30 мин реакцию прекращали с помощью серной кислоты, а затем измеряли абсорбцию при 450 нм с помощью мультимодального ридера Synergy НТХ (фирма BioTek Instruments, Inc.). Рассчитывали соотношение для иммобилизованных антителом лунок и неиммобилизованных лунок и применяли в качестве отношения S/N. Строили график зависимости отношения S/N (среднее), установленного с помощью ELISA, отложенного на оси ординат, от концентрации каждой подобной антителу IgG-типа молекулы, отложенной на оси абсцисс. Результаты представлены на фиг. 29. Эти результаты продемонстрировали, что обработанная протеазой подобная антителу IgG-типа молекула 20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT, несущая расщепляемую последовательность в ее легкой цепи, в 10 или более раз превышала по IL-6R-связывающей активности необработанную протеазой подобную антителу IgG-типа молекулу, а обработанная протеазой подобная антителу IgG-типа молекула IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT в 1000 или более раз превышала по IL-6R-связывающей активности необработанную протеазой молекулу.The ability of VHH released by protease treatment to bind to IL-6R was then assessed by ELISA. Specifically, the hsIL-6R-BAP1 construct used in Example 3 was immobilized onto a streptavidin-coated 384-well plate (Greiner Bio-One GmbH, 781990) and each digested IgG-type antibody-like molecule was allowed to bind thereto at room temperature. After reacting for 30 minutes, the constructs were reacted with HRP-labeled anti-human IgG antibody (Sigma-Aldrich Co. LLC, SAB3701362-2MG) at room temperature for 10 minutes, and TMB chromogenic solution (Life Technologies Corp.) was added for reaction. , 002023). After reacting at room temperature for 30 min, the reaction was quenched with sulfuric acid and then absorbance was measured at 450 nm using a Synergy HTX multimodal reader (BioTek Instruments, Inc.). The ratio for antibody-immobilized wells and non-immobilized wells was calculated and used as the S/N ratio. The S/N ratio (average) determined by ELISA, plotted on the y-axis, was plotted against the concentration of each IgG-type antibody-like molecule, plotted on the abscissa. The results are presented in Fig. 29. These results demonstrated that the protease-treated IgG antibody-like molecule 20A11hu-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT, carrying a cleavable sequence in its light chain, had 10-fold or more greater IL-6R binding activity than the non-protease-treated molecule. an IgG antibody-like molecule, and the protease-treated IgG antibody-like molecule IL6R90-G1m/VK1-39P+4-Pk0MT had 1000 or more times the IL-6R binding activity of the non-protease-treated molecule.

Пример 13. Получение и оценка подобных антителу IgG-типа молекул, несущих различные расщепляемые протеазой последовательностиExample 13: Preparation and Evaluation of IgG Antibody-Like Molecules Carrying Various Protease-Cleavable Sequences

13-1 Получение полипептидов, несущих различные расщепляемые протеазой последовательности13-1 Preparation of polypeptides carrying various protease-cleavable sequences

Подобные антителу IgG-типа молекулы получали аналогично методу, описанному в примере 3, используя последовательности, распознаваемые протеазами, отличными отурокиназы или матриптазы. Каждую из различных пептидных последовательностей, для которой известно, что она расщепляется ММР-2, ММР-7, ММР-9 или ММР-13, встраивали вблизи границы между вариабельной и константной областями IL6R90-G1m, и пептидную последовательность, которая содержит гибкий линкер, состоящий из глицин-серинового полимера, встраивали в непосредственной близости от указанных расщепляемых последовательностей. Встроенные последовательности представлены в таблице 8.IgG antibody-like molecules were prepared similarly to the method described in Example 3, using sequences recognized by proteases other than urokinase or matriptase. Each of the different peptide sequences known to be cleaved by MMP-2, MMP-7, MMP-9 or MMP-13 was inserted near the boundary between the variable and constant regions of IL6R90-G1m, and a peptide sequence that contains a flexible linker, consisting of a glycine-serine polymer, was inserted in close proximity to the indicated cleavable sequences. The inserted sequences are presented in Table 8.

Тяжелые цепи создавали так, чтобы эти последовательности были встроены вблизи границы между вариабельными и константными областями IL6R90-G1m. Экспрессионные векторы, кодирующие варианты тяжелых цепей 6R90EIVHEMP2.1-6R90EICHEMP2.1G1m (SEQ ID NO: 165), 6R90EIVHEMP2.2-6R90EICHEMP2.2G1m (SEQ ID NO: 202), 6R90EIVHEMP2.3-6R90EICHEMP2.3G1m (SEQ ID NO: 203), 6R90EIVHEMP2.4-6R90EICHEMP2.4G1m (SEQ ID NO: 204), 6R90EIVHEMP7.1-6R90EICHEMP7.1G1m (SEQ ID NO: 205), 6R90EIVHEMP7.2-6R90EICHEMP7.2G1m (SEQ ID NO: 206), 6R90EIVHEMP13-6R90EICHEMP13G1m (SEQ ID NO: 207), 6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m (SEQ ID NO: 196), 6R90EIVHEG4SMP2.2G4S-6R90EIVHEG4SMP2.2G4SG1m (SEQ ID NO: 197) и 6R90EIVHEG4SMP9G4S-6R90EIVHEG4SMP9G4SG1m (SEQ ID NO: 198), получали с помощью метода, известного специалистам в данной области.The heavy chains were designed so that these sequences were inserted near the boundary between the variable and constant regions of IL6R90-G1m. Expression vectors encoding heavy chain variants 6R90EIVHEMP2.1-6R90EICHEMP2.1G1m (SEQ ID NO: 165), 6R90EIVHEMP2.2-6R90EICHEMP2.2G1m (SEQ ID NO: 202), 6R90EIVHEMP2.3-6R90EICHEMP2.3G1m (SEQ ID NO: 203 ), 6R90EIVHEMP2.4-6R90EICHEMP2.4G1m (SEQ ID NO: 204), 6R90EIVHEMP7.1-6R90EICHEMP7.1G1m (SEQ ID NO: 205), 6R90EIVHEMP7.2-6R90EICHEMP7.2G1m (SEQ ID NO: 206), 6R90EIVHEMP 13-6R90EICHEMP13G1m (SEQ ID NO: 207), 6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m (SEQ ID NO: 196), 6R90EIVHEG4SMP2.2G4S-6R90EIVHEG4SMP2.2G4SG1m (SEQ ID NO: 197) and 6R90EIVHEG4SMP9G 4S-6R90EIVHEG4SMP9G4SG1m (SEQ ID NO: 198), was obtained using the method known to those skilled in the art.

В таблице 9 представлены подобные антителу IgG-типа молекулы, в которых объединены указанные варианты тяжелых цепей с легкой цепью и которые несут расщепляемую протеазой последовательность вблизи границы между вариабельной и константной областями тяжелой цепи. Указанные подобные антителу IgG-типа молекулы экспрессировали путем кратковременной экспрессии с использованием клеток FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.) или клеток Expi293 (фирма Life Technologies Corp.) с помощью метода, известного специалистам в данной области, и очищали с помощью метода, известного специалистам в данной области, используя белок А.Table 9 shows IgG antibody-like molecules that combine these heavy chain variants with a light chain and that carry a protease-cleavable sequence near the interface between the variable and constant regions of the heavy chain. These IgG antibody-like molecules were expressed by transient expression using FreeStyle 293 cells (Invitrogen Corp.) or Expi293 cells (Life Technologies Corp.) using a method known to those skilled in the art, and purified using a method known to those skilled in the art. in this area using protein A.

13-2 Оценка расщепления протеазой подобных антителу IgG-типа молекул, несущих различные расщепляемые протеазой последовательности13-2 Evaluation of protease cleavage of IgG-type antibody-like molecules carrying different protease-cleavable sequences

Изучали, могут ли подобные антителу IgG-типа молекулы, полученные согласно методу, описанному в примере 13-1, расщепляться протеазой. В качестве протеазы применяли рекомбинантную человеческую ММР-2 (фирма R&D Systems, Inc., 902-МР-010), рекомбинантную человеческую ММР-7 (фирма R&D Systems, Inc., 907-МР-010), рекомбинантную человеческую ММР-9 (фирма R&D Systems, Inc., 911-МР-010) или рекомбинантную человеческую ММР-13 (фирма R&D Systems, Inc., 511-MM-010). Каждую из MMP-2, MMP-7, ММР-9 и ММР-13 применяли после смешения с 1 мМ ацетатом пара-аминофенилртути (АРМА; фирма Abeam PLC, ab112146) и активировали при 37°С в течение 1 ч или 24 ч. Повергали взаимодействию протеазу в концентрации 50, 100 или 500 нМ и каждую подобную антителу IgG-типа молекулу в концентрации 50 мкг/мл или 100 мкг/мл в ЗФР или 20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl и 5 мМ CaCl₂ (рН 7,2) (ниже в контексте настоящего описания обозначен как Трис), при 37°С в течение 20 ч. Затем расщепление протеазой оценивали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты представлены на фиг. 30А и 30Б. На 30Б представлены результаты, полученные при осуществлении расщепления протеазой в буфере для анализа (набор для оценки активности ММР-(флуорометрический - зеленый) (ab112146), компонент С: буфер для анализа).It was studied whether IgG-type antibody-like molecules obtained according to the method described in Example 13-1 could be cleaved by protease. Recombinant human MMP-2 (R&D Systems, Inc., 902-MP-010), recombinant human MMP-7 (R&D Systems, Inc., 907-MP-010), recombinant human MMP-9 ( R&D Systems, Inc., 911-MP-010) or recombinant human MMP-13 (R&D Systems, Inc., 511-MM-010). MMP-2, MMP-7, MMP-9 and MMP-13 were each used after mixing with 1 mM para-aminophenylmercuric acetate (APMA; Abeam PLC, ab112146) and activated at 37°C for 1 h or 24 h. The protease was reacted at a concentration of 50, 100 or 500 nM and each IgG-type antibody-like molecule at a concentration of 50 μg/ml or 100 μg/ml in PBS or 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl and 5 mM CaCl ₂ (pH 7 ,2) (hereinafter referred to as Tris in the context of this description), at 37°C for 20 hours. Protease digestion was then assessed using SDS-PAGE under reducing conditions. The results are presented in Fig. 30A and 30B. 30B shows the results obtained by performing protease digestion in assay buffer (MMP-(fluorometric - green) activity assay kit (ab112146), component C: assay buffer).

В результате установлено, что 6R90EIVHEMP2.1-6R90EICHEMP2.1G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.2-6R90EICHEMP2.2G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.3-6R90EICHEMP2.3G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.4-6R90EICHEMP2.4G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m/VK1-39-k0MT и 6R90EIVHEG4SMP2.2G4S-6R90EICHEG4SMP2.2G4SG1m/VK1-39-k0MT расщеплялись MMP-2. Установлено, что 6R90EIVHEMP7.1-6R90EICHEMP7.1G1m/VK1-39-k0MT и 6R90EIVHEMP7.2-6R90EICHEMP7.2G1m/VK1-39-k0MT расщеплялись ММР-7. Установлено, что 6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SGlm/VK1-39-k0MT и 6R90EIVHEG4SMP9G4S-6R90EICHEG4SMP9G4SG1m/VK1-39-k0MT расщеплялись ММР-9. Установлено, что конструкция 6R90EIVHEMP13-6R90EICHEMP13G1m/VK1-39-k0MT расщеплялась ММР-13.As a result, it was established that 6R90EIVHEMP2.1-6R90EICHEMP2.1G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.2-6R90EICHEMP2.2G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEMP2.3-6R90EICHEMP2.3G1m/VK1-39-k0MT, 6 R90EIVHEMP2.4 -6R90EICHEMP2.4G1m/VK1-39-k0MT, 6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SG1m/VK1-39-k0MT and 6R90EIVHEG4SMP2.2G4S-6R90EICHEG4SMP2.2G4SG1m/VK1-39-k 0MT were cleaved by MMP-2. It was found that 6R90EIVHEMP7.1-6R90EICHEMP7.1G1m/VK1-39-k0MT and 6R90EIVHEMP7.2-6R90EICHEMP7.2G1m/VK1-39-k0MT were cleaved by MMP-7. It was found that 6R90EIVHEG4SMP2MP9G4S-6R90EICHEG4SMP2MP9G4SGlm/VK1-39-k0MT and 6R90EIVHEG4SMP9G4S-6R90EICHEG4SMP9G4SG1m/VK1-39-k0MT were cleaved by MMP-9. It was established that the 6R90EIVHEMP13-6R90EICHEMP13G1m/VK1-39-k0MT construct was cleaved by MMP-13.

Пример 14. Оценка различных расщепляемых протеазой последовательностейExample 14 Evaluation of Various Protease Cleavable Sequences

14-1 Получение вариантов антител, несущих различные расщепляемые протеазой последовательности14-1 Generation of antibody variants carrying different protease-cleavable sequences

Расщепляемые протеазой последовательности, представленные в таблице 10, встраивали вблизи границы между вариабельной областью легкой цепи и константной областью антител, которые имели тяжелую цепь, представленную в SEQ ID NO: 831, и легкую цепь, представленную в SEQ ID NO: 832, с получением вариантов легкой цепи, несущих различные расщепляемые протеазой последовательности (таблица 11).The protease cleavable sequences shown in Table 10 were inserted near the boundary between the light chain variable region and the constant region of antibodies that had the heavy chain set forth in SEQ ID NO: 831 and the light chain set forth in SEQ ID NO: 832 to produce variants light chain carrying various protease-cleavable sequences (Table 11).

Варианты легкой цепи, несущие расщепляемую протеазой последовательности, которые получали согласно описанному выше методу, объединяли с тяжелой цепью, имеющей SEQ ID NO: 831, и варианты антител, которые представлены в таблице 12, кратковременно экспрессировали с использованием клеток Expi293 (фирма Life technologies) согласно методу, известному специалисту в данной области, и очищали с использованием белка А согласно методу, известному специалисту в данной области.The light chain variants bearing protease cleavable sequences, which were prepared according to the method described above, were combined with the heavy chain having SEQ ID NO: 831, and the antibody variants, which are shown in Table 12, were transiently expressed using Expi293 cells (Life technologies) according to a method known to one skilled in the art, and purified using Protein A according to a method known to one skilled in the art.

14-2 Оценка расщепляемых протеазой вариантов антител, несущих расщепляемую протеазой последовательность14-2 Evaluation of protease-cleavable antibody variants carrying a protease-cleavable sequence

Варианты антител, полученные согласно методу, описанному в примере 14-1, тестировали для решения вопроса о том, будут ли они расщепляться обработкой протеазой. Применяемая протеаза представляла собой рекомбинантный человеческий активатора u-плазминогена/урокиназу (человеческая uPA, huPA) (фирма R&D Systems; 1310-SE-010). Антителам давали взаимодействовать в течение 1 ч в следующих условиях: 40 нМ протеаза, 100 мкг/мл варианта антитела, ЗФР и 37°С, и затем анализировали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты подтвердили, что все варианты антител, несущие расщепляемую протеазой последовательность, расщеплялись обработкой протеазой. Другими словами, установлено, что расщепляемые протеазой последовательности, представленные в таблице 10, могут расщепляться протеазой. Кроме того, варианты антител, отличные от G7L.106а.12аа, все расщеплялись более эффективно, чем G7L.106а.12аа.Antibody variants produced according to the method described in Example 14-1 were tested to determine whether they would be cleaved by protease treatment. The protease used was recombinant human u-plasminogen activator/urokinase (human uPA, huPA) (R&D Systems; 1310-SE-010). Antibodies were allowed to react for 1 hour under the following conditions: 40 nM protease, 100 μg/ml antibody variant, PBS and 37°C, and then analyzed by SDS-PAGE under reducing conditions. The results confirmed that all antibody variants carrying a protease-cleavable sequence were cleaved by protease treatment. In other words, it has been found that the protease-cleavable sequences shown in Table 10 can be cleaved by a protease. In addition, antibody variants other than G7L.106a.12aa were all cleaved more efficiently than G7L.106a.12aa.

Пример 15. Оценка различных расщепляемых протеазой последовательностейExample 15 Evaluation of Various Protease Cleavable Sequences

15-1 Получение вариантов антител, несущих расщепляемые протеазой последовательности15-1 Preparation of antibody variants carrying protease-cleavable sequences

Помимо расщепляемых протеазой последовательностей, описанных в примере 14, исследовали дополнительно расщепляемые протеазой последовательности для повышения эффективности расщепления и селективности протеаз. Расщепляемые протеазой последовательности, представленные в таблице 13, встраивали вблизи границы между вариабельной областью легкой цепи и константной областью антител, которые имели тяжелую цепь, представленную в SEQ ID NO: 831, и легкую цепь, представленную в SEQ ID NO: 832, с получением вариантов легкой цепи, несущих различные расщепляемые протеазой последовательности (таблицы 14 и 15).In addition to the protease-cleavable sequences described in Example 14, additional protease-cleavable sequences were examined to improve the cleavage efficiency and selectivity of the proteases. The protease cleavable sequences shown in Table 13 were inserted near the boundary between the light chain variable region and the constant region of antibodies that had the heavy chain set forth in SEQ ID NO: 831 and the light chain set forth in SEQ ID NO: 832 to produce variants light chain carrying various protease-cleavable sequences (Tables 14 and 15).

15-2 Оценка расщепляемых протеазой вариантов антител, несущих расщепляемую протеазой последовательность15-2 Evaluation of protease-cleavable antibody variants carrying a protease-cleavable sequence

Варианты антител, полученные согласно методу, описанному в примере 15-1, тестировали для решения вопроса о том, будут ли они расщепляться обработкой протеазой. Применяемые протеазы представляли собой рекомбинантный человеческий активатора u-плазминогена/урокиназу (человеческая uPA, huPA) (фирма R&D Systems; 1310-SE-010) или рекомбинантную человеческую матриптазу/каталитический домен ST14 (человеческая MT-SP1, hMT-SP1) (фирма R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). Вариантам антител давали взаимодействовать в течение 1 ч в следующих условиях: 40 нМ huPA или 3 нМ hMT-SP1, 100 мкг/мл варианта антитела, ЗФР и 37°С, и затем подвергали иммуноанализу на основе капиллярного электрофореза. Иммуноанализ на основе капиллярного электрофореза осуществляли с использованием системы Wes (фирма Protein Simple), и антитело к человеческой лямбда-цепи, меченное HRP (фирма abcam; ab9007), применяли для детекции легких цепей до и после расщепления. В результате установлено, что пик, соответствующий примерно 36 кДа, обнаруженный до обработки протеазой, исчезал и появлялся новый пик, соответствующий примерно 20 кДа. Это позволяет предположить, что пик с молекулярной массой примерно 36 кДа соответствовал нерасщепленной легкой цепи варианта антитела, а пик с молекулярной массой примерно 20 кДа соответствовал расщепленной легкой цепи. Площадь каждого пика, полученного после обработки протеазой, определяли с помощью программного обеспечения для системы Wes (программное обеспечение Compass для систем SW; фирма Protein Simple), и степень расщепления (%) варианта антитела определяли с использованием следующей формулы:Antibody variants produced according to the method described in Example 15-1 were tested to determine whether they would be cleaved by protease treatment. The proteases used were recombinant human u-plasminogen activator/urokinase (human uPA, huPA) (R&D Systems; 1310-SE-010) or recombinant human matriptase/ST14 catalytic domain (human MT-SP1, hMT-SP1) (R&D Systems, Inc., 3946-SE-010). The antibody variants were allowed to react for 1 hour under the following conditions: 40 nM huPA or 3 nM hMT-SP1, 100 μg/ml antibody variant, PBS and 37°C, and then subjected to capillary electrophoresis immunoassay. Capillary electrophoresis immunoassay was performed using a Wes system (Protein Simple), and HRP-labeled anti-human lambda chain antibody (abcam; ab9007) was used to detect light chains before and after cleavage. As a result, it was found that the peak corresponding to approximately 36 kDa, detected before treatment with protease, disappeared and a new peak corresponding to approximately 20 kDa appeared. This suggests that the peak at approximately 36 kDa corresponded to the uncleaved light chain of the antibody variant, and the peak at approximately 20 kDa corresponded to the cleaved light chain. The area of each peak obtained after protease treatment was determined using Wes system software (Compass software for SW systems; Protein Simple), and the degree of cleavage (%) of the antibody variant was determined using the following formula:

Степени расщепления (%) вариантов антител, обработанных huPA, представлены в таблице 16, а степени расщепления вариантов антител, обработанных hMT-SP1, представлены в таблице 17. Из тех вариантов антител, которые представлены в указанных выше таблицах 16 и 17, варианты с более высокой степенью расщепления huPA, но с более низкой степенью расщепления hMT-SP1, иными словами, варианты с более высокой селективностью в отношении huPA, чем G7L.106а.12аа (тяжелая цепь: G7H-G1T4 (SEQ ID NO: 831), легкая цепь: G7L.106а.12aa-LT0 (SEQ ID NO: 952)), представлены в таблице 18.The cleavage rates (%) of huPA-treated antibody variants are presented in Table 16, and the cleavage rates of hMT-SP1-treated antibody variants are presented in Table 17. Of those antibody variants that are presented in Tables 16 and 17 above, variants with more high degree of cleavage of huPA, but lower degree of cleavage of hMT-SP1, in other words, variants with higher selectivity for huPA than G7L.106a.12aa (heavy chain: G7H-G1T4 (SEQ ID NO: 831), light chain : G7L.106a.12aa-LT0 (SEQ ID NO: 952)), are presented in table 18.

Пример 16. Оценка in vivo расщепляемых протеазой вариантов антител, несущих различные расщепляемые протеазой последовательностиExample 16 In vivo evaluation of protease-cleavable antibody variants carrying different protease-cleavable sequences

16.1 Получение биспеиифических антител, несущих расщепляемую протеазой последовательность16.1 Preparation of bispecies antibodies carrying a protease-cleavable sequence

Расщепляемые протеазой последовательности, представленные в таблице 19, встраивали вблизи границы между вариабельной областью легкой цепи и константной областью антител (родительские антитела), содержащих тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 1051, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 832, с получением вариантов легкой цепи, несущих различные расщепляемые протеазой последовательности (таблица 20).The protease cleavable sequences shown in Table 19 were inserted near the boundary between the light chain variable region and the constant region of antibodies (parent antibodies) containing a heavy chain having SEQ ID NO: 1051 and a light chain having SEQ ID NO: 832, to obtain light chain variants carrying different protease-cleavable sequences (Table 20).

Варианты легкой цепи, несущие расщепляемые протеазой последовательности, полученные согласно описанному выше методу, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 832, объединяли с тяжелой цепью, имеющей SEQ ID NO: 1051, и варианты антител, представленные в таблице 21, кратковременно экспрессировали с использованием клеток Expi293 (фирма Life technologies) согласно методу, известному специалистам в данной области, и очищали с использованием белка А согласно методу, известному специалистам в данной области.Light chain variants carrying protease cleavable sequences obtained according to the method described above and the light chain having SEQ ID NO: 832 were combined with the heavy chain having SEQ ID NO: 1051, and the antibody variants shown in Table 21 were transiently expressed with using Expi293 cells (Life technologies) according to a method known to those skilled in the art, and purified using Protein A according to a method known to those skilled in the art.

Кроме того, антитело против гемоцианина лимфы улитки, MabKLHn (тяжелая цепь: IC17HdK-F760mnN17 (SEQ ID NO: 1390), легкая цепь: IC17L-k0 (SEQ ID NO: 1391)), также кратковременно экспрессировали с использованием клеток Expi293 (фирма Life technologies) согласно методу, известному специалистам в данной области, и очищали с использованием белка А согласно методу, известному специалистам в данной области.In addition, an anti-snail hemocyanin antibody, MabKLHn (heavy chain: IC17HdK-F760mnN17 (SEQ ID NO: 1390), light chain: IC17L-k0 (SEQ ID NO: 1391)), was also transiently expressed using Expi293 cells (Life technologies) according to a method known to those skilled in the art, and purified using Protein A according to a method known to those skilled in the art.

MabKLHn смешивали с вариантами антител, представленными в таблице 21, или с родительским антителом, содержащем тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 1051, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 832, с получением биспецифических антител, которые представлены в таблице 22, с использованием метода, описанного в WO 2015046467.MabKLHn was mixed with the antibody variants shown in Table 21, or with a parent antibody containing the heavy chain having SEQ ID NO: 1051 and the light chain having SEQ ID NO: 832, to obtain the bispecific antibodies, which are shown in Table 22, with using the method described in WO 2015046467.

16-2 Получение клеточной линии, стабильно экспрессирующей протеазу B16F10/chGPC3/muPA применяли в качестве стабильно экспрессирующей протеазу клеточной линии для трансплантации мышам. Эту клеточную линию получали путем интродукции гена модифицированного мышиного химерного глипикана 3 (chGPC3) и гена мышиной uPA (muPA: NM_008873) в клеточную линию мышиной меланомы B16F10, и создания и последующего клонирования стабильно экспрессирующей клеточной линии. Клетки B16F10/chGPC3/muPA культивировали в среде RPMI1640 (фирма Nacalai Tesque), содержащей 10% FBS (фирма SIGMA), 0,5 мг/мл генетицина (фирма Gibco) и 1,5 мкг/мл пуромицина (фирма Gibco).16-2 Preparation of a cell line stably expressing protease B16F10/chGPC3/muPA was used as a stably expressing protease cell line for transplantation into mice. This cell line was generated by introducing the modified mouse chimeric glypican 3 (chGPC3) gene and the mouse uPA gene (muPA: NM_008873) into the murine melanoma cell line B16F10, and generating and subsequently cloning a stably expressing cell line. B16F10/chGPC3/muPA cells were cultured in RPMI1640 medium (Nacalai Tesque) containing 10% FBS (SIGMA), 0.5 mg/ml geneticin (Gibco) and 1.5 μg/ml puromycin (Gibco).

16-3 Получение сингенной мышиной модели с трансплантированной опухолевой линией16-3 Generation of a syngeneic mouse model with a transplanted tumor line

Предназначенные для трансплантации мыши представляли собой мышей линии C57BL/6NCrl (возрастом 6 недель, самки), которых покупали у фирмы Charles River Laboratories. Клетки B16F10/chGPC3/muPA трансплантировали подкожно мышам линии C57BL/6NCrl (1Е6 клеток на животное). Когда средний объем трансплантированной опухоли достигал объема примерно от 200 до 300 мм³, мышам, которых использовали в качестве мышиной модели, вводили вариант антитела.Mice intended for transplantation were C57BL/6NCrl mice (6 weeks old, female) purchased from Charles River Laboratories. B16F10/chGPC3/muPA cells were transplanted subcutaneously into C57BL/6NCrl mice (1E6 cells per animal). When the average volume of the transplanted tumor reached a volume of approximately 200 to 300 mm ³ , the antibody variant was administered to mice used as a mouse model.

Объем трансплантата опухоли рассчитывали с помощью следующей формулы:Tumor graft volume was calculated using the following formula:

Объем опухоли = длинный диаметр × короткий диаметр × короткий диаметр/2.Tumor volume = long diameter × short diameter × short diameter/2.

16-4 Получение агентов, предназначенных для введения Варианты антител, несущие расщепляемые протеазой последовательности, которые представлены в таблице 22, полученные согласно методу, описанному в примере 16-1, применяли в качестве агентов для введения применяемым в качестве моделей мышам, которым трансплантировали клетки B16F10/chGPC3/muPA. Предназначенные для введения агенты получали с использованием ЗФРТ-буфера (буфер ЗФР+0,05% Твин20) так, чтобы концентрация варианта антитела составляла 0,1 мг/мл.16-4 Preparation of Administration Agents Antibody variants bearing the protease-cleavable sequences shown in Table 22, prepared according to the method described in Example 16-1, were used as administration agents in model mice transplanted with B16F10 cells. /chGPC3/muPA. The agents to be administered were prepared using PBS buffer (PBS buffer + 0.05% Tween20) so that the concentration of the antibody variant was 0.1 mg/ml.

16-5 Тест по введению вариантов антител для оценки расщепления пр отеазой16-5 Antibody variant injection test to assess protease cleavage

Через 11 дней после трансплантации мышам, трансплантированным клетками B16F10/chGPC3/muPA, вводили пять образцов вариантов антител, несущих различные расщепляемые протеазой последовательности, через хвостовую вену в дозе 1 мг/кг (мг вводимого антитела на кг веса тела мыши). Обозначения вариантов антител, дозы, методы введения и другие детали опыта по введению представлены в таблице 23.Eleven days after transplantation, mice transplanted with B16F10/chGPC3/muPA cells were administered five samples of antibody variants carrying different protease-cleavable sequences via the tail vein at a dose of 1 mg/kg (mg of antibody administered per kg of mouse body weight). Antibody variant designations, doses, methods of administration, and other details of the administration experiment are presented in Table 23.

16-6 Сбор крови из орбитального синуса у применяемых в качестве моделей мышей, транслантированных клетками B16F10/chGPC3/muPA16-6 Collection of blood from the orbital sinus in mouse models transplanted with B16F10/chGPC3/muPA cells

В дни 1 и 3 после введения варианта антитела кровь получали из глазницы применяемых в качестве моделей мышей, трансплантированных клеткамиOn days 1 and 3 after administration of the antibody variant, blood was obtained from the orbit of cell-transplanted mouse models

B16F10/chGPC3/muPA. Сбор крови осуществляли под анестезией изофлурананом. Собранную кровь центрифугировали при 1900×g, 4°С в течение 10 мин. После центрифугирования из компонентов плазмы получали супернатант и хранили при -30°С.B16F10/chGPC3/muPA. Blood collection was performed under isoflurane anesthesia. The collected blood was centrifuged at 1900×g, 4°C for 10 minutes. After centrifugation, the supernatant was obtained from the plasma components and stored at -30°C.

16-7 Оценка расщепления введенных антител, полученных из организма мышей16-7 Assessment of the cleavage of administered antibodies obtained from mice

Антитела очищали из плазмы, собранной согласно методу, описанному в примере 16-6, используя Dynabeads с белком А (фирма Thermo; 10001D) согласно методу, известному специалистам в данной области, и затем подвергали иммуноанализу на основе капиллярного электрофореза для оценки эффективности расщепления протеазой вариантов антител. Систему Wes (фирма Protein Simple) применяли для осуществления иммуноанализа на основе капиллярного электрофореза. Для детекции легкой цепи антитела применяли антитело к человеческой лямбда-цепи, меченное HRP (фирма abeam; ab9007). Для детекции тяжелой цепи антитела применяли антитело к человеческой тяжелой цепи, меченное HRP (фирма Protein Simple; 043-491). В результате установлено, что пик, соответствующий нерасщепленной полноразмерной легкой цепи, обнаруженный с помощью антитела к человеческой лямбда-цепи, соответствовал примерно 36 кДа, а пик полноразмерной тяжелой цепи, обнаруженный с помощью антитела к человеческой тяжелой цепи, соответствовал примерно 56 кДа. Легкая цепь MabKLHn представляет собой каппа-цепь, которая не поддавалась обнаружению при использовании антитела к человеческой лямбда-цепи. Таким образом, антитело к человеческой лямбда-цепи можно применять для оценки эффективности расщепления легкой цепи, несущей расщепляемую протеазой последовательность. Площадь каждого пика, полученного с помощью иммуноанализа на основе капиллярного электрофореза, определяли с использованием программного обеспечения для системы Wes (программное обеспечение Compass для систем SW; фирма Protein Simple), и долю оставшейся легкой цепи рассчитывали как [площадь пика легкой цепи]/[площадь пика тяжелой цепи], для определения доли полноразмерной легкой цепи, оставшейся нерасщепленной в организме мышей.Antibodies were purified from plasma collected according to the method described in Example 16-6 using Protein A Dynabeads (Thermo; 10001D) according to a method known to those skilled in the art, and then subjected to capillary electrophoresis immunoassay to assess the efficiency of protease cleavage of variants antibodies. The Wes system (Protein Simple) was used to perform the capillary electrophoresis immunoassay. Anti-human lambda chain antibody labeled with HRP (Abeam; ab9007) was used to detect the light chain of the antibody. HRP-labeled anti-human heavy chain antibody (Protein Simple; 043-491) was used to detect the antibody heavy chain. As a result, the peak corresponding to the uncleaved full-length light chain detected by the anti-human lambda chain antibody was approximately 36 kDa, and the full-length heavy chain peak detected by the anti-human heavy chain antibody was approximately 56 kDa. The MabKLHn light chain is a kappa chain that was undetectable using anti-human lambda chain antibody. Thus, an anti-human lambda chain antibody can be used to assess the efficiency of cleavage of a light chain carrying a protease-cleavable sequence. The area of each peak obtained from the capillary electrophoresis immunoassay was determined using Wes system software (Compass software for SW systems; Protein Simple), and the fraction of light chain remaining was calculated as [light chain peak area]/[area heavy chain peak] to determine the proportion of full-length light chain remaining undigested in mice.

Данные о долях оставшихся легких цепей антител, полученных из организма мышей через один день и три дня после введения мышам, представлены на фиг. 31. В результате установлено, что варианты антител, несущие расщепляемую протеазой последовательность, которые представлены в таблице 21, имели меньшую долю оставшихся легких цепей по сравнению с родительским антителом, содержащим тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 1051, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 832, в организме мышей с трансплантированными опухолями. Таким образом, установлено, что легкие цепи, несущие расщепляемую протеазой последовательность, эффективно расщеплялись in vivo в организме мышей с трансплантированными опухолями. Референс-пример 1. Получение биотинилированного плексина А1 Биотинилированный плексин А1 (обозначенный также как меченный биотином человеческий плексин А1) получали с помощью метода, известного специалистам в данной области. В частности, генный фрагмент, кодирующий конкретную последовательность (последовательность Avi-метки последовательность; SEQ ID NO: 36), подлежащую биотинилированию с помощью биотинлигазы, и генный фрагмент, кодирующий последовательность FLAG-метки (SEQ ID NO: 199; DYKDDDDK), соединяли через генный фрагмент, кодирующий линкер, состоящий из глицина и серина, в прямом направлении относительно генного фрагмента, кодирующего внеклеточную область плексина А1. Генный фрагмент, кодирующий белок, который содержит плексин А1, сцепленный с последовательностью Avi-метки и последовательностью FLAG-метки (SEQ ID NO: 200), встраивали в вектор для экспрессии в клетках животных. Сконструированным плазмидным вектором трансфектировали клетки FreeStyle 293 (фирма Invitrogen Corp.), используя 293Fectin (фирма Invitrogen Corp.). При осуществлении указанной операции клетки совместно трансфектировали геном для экспрессии EBNA1 (SEQ ID NO: 57), геном для экспрессии биотинлигазы (BirA; SEQ ID NO: 58) и к ним дополнительно добавляли биотин для мечения с помощью биотина плексина А1. Клетки, трансфектированные с помощью упомянутых выше процедур, культивировали при 37°С в атмосфере с 8% СО₂ и в результате происходила секреция представляющего интерес белка (биотинилированный плексин А1) в супернатант культуры. Этот раствор клеточной культуры фильтровали, используя емкость с 0,22-микрометровым верхним фильтром, для получения супернатанта культуры.Data on the proportions of remaining light chains of antibodies obtained from mice one day and three days after administration to mice are presented in Fig. 31. As a result, it was found that the antibody variants carrying the protease cleavable sequence, which are presented in Table 21, had a lower proportion of remaining light chains compared to the parent antibody containing the heavy chain having SEQ ID NO: 1051 and the light chain having SEQ ID NO: 1051 and the light chain having SEQ ID NO: 1051 ID NO: 832, in mice with transplanted tumors. Thus, it was established that light chains carrying a protease-cleavable sequence were effectively cleaved in vivo in mice with transplanted tumors. Reference Example 1 Preparation of Biotinylated Plexin A1 Biotinylated Plexin A1 (also referred to as biotin-labeled human plexin A1) was prepared using a method known to those skilled in the art. Specifically, a gene fragment encoding a specific sequence (Avi tag sequence; SEQ ID NO: 36) to be biotinylated by a biotin ligase and a gene fragment encoding a FLAG tag sequence (SEQ ID NO: 199; DYKDDDDK) were connected through a gene fragment encoding a linker consisting of glycine and serine, in the direct direction of a gene fragment encoding the extracellular region of plexin A1. A gene fragment encoding a protein that contains plexin A1 linked to an Avi tag sequence and a FLAG tag sequence (SEQ ID NO: 200) was inserted into a vector for expression in animal cells. The constructed plasmid vector was transfected into FreeStyle 293 cells (Invitrogen Corp.) using 293Fectin (Invitrogen Corp.). In this operation, the cells were co-transfected with a gene for the expression of EBNA1 (SEQ ID NO: 57), a gene for the expression of a biotin ligase (BirA; SEQ ID NO: 58) and were further added with biotin for labeling with biotin plexin A1. Cells transfected using the above procedures were cultured at 37°C in an atmosphere of 8% CO ₂ and resulted in the secretion of the protein of interest (biotinylated plexin A1) into the culture supernatant. This cell culture solution was filtered using a 0.22 micrometer top filter to obtain the culture supernatant.

Колонку упаковывали агарозой с антителом к FLAG М2 (Анти FLAG М2) (фирма Sigma-Aldrich Co. LLC, №A2220) с получением колонки для FLAG. Колонку для FLAG уравновешивали предварительно D-ЗФР(-). В нее вносили супернатант культуры для связывания биотинилированного плексина А1 с колонкой. Затем биотинилированный плексин А1 элюировали, используя пептид FLAG, растворенный в D-ЗФР(-). Агрегаты удаляли из этого элюата с помощью гель-фильтрации, используя HiLoad 26/600 Супердекс 200 пг, 320 мл (фирма GE Healthcare Japan Corp., 28-9893-36), с получением очищенного биотинилированного плексина А1.The column was packed with anti-FLAG M2 agarose (Anti-FLAG M2) (Sigma-Aldrich Co. LLC, #A2220) to form a FLAG column. The FLAG column was pre-equilibrated with D-PBS(-). The culture supernatant was added to it to bind biotinylated plexin A1 to the column. Biotinylated plexin A1 was then eluted using FLAG peptide dissolved in D-PBS(-). Aggregates were removed from this eluate by gel filtration using HiLoad 26/600 Superdex 200 pg, 320 ml (GE Healthcare Japan Corp., 28-9893-36) to obtain purified biotinylated plexin A1.

С целью лучшего понимания упомянутые выше варианты осуществления изобретения описаны подробно со ссылкой на фактические примеры и иллюстративные примеры. Однако описание и иллюстрации, представленные в настоящем описании, не следует интерпретировать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Содержание всей патентной литературы и научной литературы, процитированной в настоящем описании, специально полностью включено в него в качестве ссылки.For the purpose of better understanding, the above-mentioned embodiments of the invention are described in detail with reference to actual examples and illustrative examples. However, the description and illustrations presented herein should not be interpreted as limiting the scope of the present invention. The contents of all patent literature and scientific literature cited herein are expressly incorporated by reference in their entirety.

Промышленная применимостьIndustrial applicability

Полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, которые содержат антигенсвязывающий домен и транспортирующий фрагмент, обладающий более длительным временем полужини в крови по сравнению с антигенсвязывающим доменом, и имеющие ингибирующий домен, который ингибирует связывающую активность антигенсвязывающего домена, и фармацевтические композиции, содержащие полипептид, могут транспортировать антигенсвязывающий домен в кровь, ингибируя при этом антигенсвязывающую активность антигенсвязывающего домена. Кроме того, применение полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, может позволять антигенсвязывающему домену проявлять свою антигенсвязывающую активность конкретно в пораженных болезнью областях. Кроме того, поскольку антигенсвязывающий домен имеет более короткое время полужизни в момент проявления свой антигенсвязывающей активности по сравнению со временем транспортировки, то снижается риск системного действия. Таким образом, полипептиды и фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, являются очень ценными для лечения заболеваний.The polypeptides of the present invention that contain an antigen binding domain and a transport moiety having a longer blood half-life than the antigen binding domain, and having an inhibitory domain that inhibits the binding activity of the antigen binding domain, and pharmaceutical compositions containing the polypeptide can transport the antigen binding domain. domain into the blood, thereby inhibiting the antigen-binding activity of the antigen-binding domain. In addition, the use of a polypeptide of the present invention may allow the antigen binding domain to exert its antigen binding activity specifically in diseased areas. In addition, since the antigen-binding domain has a shorter half-life at the time of manifestation of its antigen-binding activity compared to the time of transport, the risk of systemic action is reduced. Thus, the polypeptides and pharmaceutical compositions provided by the present invention are very valuable for the treatment of diseases.

Однодоменное антитело, антигеневязывающая активность которого ингибируется при ассоциации с конкретным VL, VH или VHH, можно подвергать скринингу или получать в качестве одного из примеров антигенсвязывающего домена, предназначенного для эффективного получения полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении. Кроме того, необходимые антигенсвязывающие домены можно эффективно создавать, когда полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, получают с использованием библиотеки, включающей однодоменное антитело, антигенсвязывающая активность которого ингибируется при ассоциации с конкретным VL, VH или VHH, в качестве одного из примеров антигенсвязывающего домена, который можно применять в полипептидах, предлагаемых в настоящем изобретении.A single domain antibody whose antigen binding activity is inhibited by association with a particular VL, VH or VHH can be screened for or produced as one example of an antigen binding domain to efficiently produce the polypeptide of the present invention. In addition, the required antigen binding domains can be efficiently generated when the polypeptide of the present invention is prepared using a library comprising a single domain antibody whose antigen binding activity is inhibited upon association with a particular VL, VH or VHH, as one example of an antigen binding domain that can be used in the polypeptides proposed in the present invention.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ LIST OF SEQUENCES

<110> ЧУГАИ СЕЙЯКУ КАБУСИКИ КАЙСЯ<110> CHUGAI SEYAKU KABUSHIKI REPENT

<120> ПОЛИПЕПТИД, ВКЛЮЧАЮЩИЙ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН И<120> POLYPEPTIDE CONTAINING AN ANTIGENE BINDING DOMAIN AND

ТРАНСПОРТИРУЮЩИЙ СЕГМЕНТ TRANSPORTATION SEGMENT

<130> C1-A1724P<130> C1-A1724P

<150> JP 2017-227650<150>JP 2017-227650

<151> 2017-11-28<151> 2017-11-28

<150> JP 2018-103682<150>JP 2018-103682

<151> 2018-05-30<151> 2018-05-30

<160> 1061<160> 1061

<170> PatentIn version 3.5<170> Patent In version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 127<211> 127

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> an artificially synthesized sequence<223> an artificially synthesized sequence

<400> 1<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 151 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp ValGly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser MetSer Ala Ile Ser Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Thr Glu Ser Met

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Val Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro AspVal Lys Gly Ser Thr Ala Ile Val Gly Val Pro Pro Thr Tyr Pro Asp

100 105 110 100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGlu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125 115 120 125

<210> 2<210> 2

<211> 455<211> 455

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 2<400> 2

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser AlaGlu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125 115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys SerSer Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

130 135 140 130 135 140

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr PheThr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser GlyPro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175 165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser LeuVal His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190 180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr TyrSer Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

195 200 205 195 200 205

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys LysIle Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

210 215 220 210 215 220

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys ProVal Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 235 240225 230 235 240

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro LysAla Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

245 250 255 245 250 255

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys ValPro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

260 265 270 260 265 270

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp TyrVal Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

275 280 285 275 280 285

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu GluVal Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

290 295 300 290 295 300

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu HisGln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

305 310 315 320305 310 315 320

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn LysGln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

325 330 335 325 330 335

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly GlnAla Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

340 345 350 340 345 350

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu MetPro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

355 360 365 355 360 365

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr ProThr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

370 375 380 370 375 380

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn AsnSer Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

385 390 395 400385 390 395 400

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe LeuTyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

405 410 415 405 410 415

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn ValTyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

420 425 430 420 425 430

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr GlnPhe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

435 440 445 435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProLys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 450 455

<210> 3<210> 3

<211> 214<211> 214

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 3<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 151 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser TyrAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleLeu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 8065 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Asp Ser Tyr Pro LeuGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Asp Ser Tyr Pro Leu

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala AlaThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser GlyPro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu AlaThr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140 130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser GlnLys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu SerGlu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val TyrSer Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys SerAla Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu CysPhe Asn Arg Gly Glu Cys

210 210

<210> 4<210> 4

<211> 219<211> 219

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 4<400> 4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyAsp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 151 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His SerGlu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30 20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln SerAsn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45 35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val ProPro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys IleAsp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 8065 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln ArgSer Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Arg

85 90 95 85 90 95

Leu His Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysLeu His Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110 100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp GluArg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125 115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn PheGln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu GlnTyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp SerSer Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr GluThr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190 180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser SerLys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205 195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu CysPro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 210 215

<210> 5<210> 5

<211> 215<211> 215

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 5<400> 5

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro GlyGlu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 151 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser SerGlu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu LeuTyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe SerIle Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu GluGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 8065 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser ProPro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro

85 90 95 85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val AlaLeu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110 100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys SerAla Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125 115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg GluGly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140 130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn SerAla Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser LeuGln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175 165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys ValSer Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190 180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr LysTyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205 195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu CysSer Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 210 215

<210> 6<210> 6

<211> 217<211> 217

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 6<400> 6

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly GlnGln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 151 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala GlyArg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30 20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys LeuTyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45 35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg PheLeu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly LeuSer Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 8065 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn SerGln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Asn Ser

85 90 95 85 90 95

Leu Asn Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu GlyLeu Asn Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110 100 105 110

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser GluGln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125 115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp PheGlu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140 130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro ValTyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

145 150 155 160145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn LysLys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175 165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys SerTyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190 180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val GluHis Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205 195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys SerLys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215 210 215

<210> 7<210> 7

<211> 216<211> 216

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 7<400> 7

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly GlnGln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 151 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser AsnArg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30 20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu LeuThr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45 35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe SerIle Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu GlnGly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 8065 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Gly Gly ValSer Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Gly Gly Val

85 90 95 85 90 95

Thr Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly GlnThr Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110 100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu GluPro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125 115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe TyrLeu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140 130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val LysPro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys TyrAla Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175 165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser HisAla Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190 180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu LysArg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205 195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys SerThr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215 210 215

<210> 8<210> 8

<211> 217<211> 217

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 8<400> 8

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly GlnGln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 151 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly TyrSer Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30 20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys LeuAsn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45 35 40 45

Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg PheMet Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly LeuSer Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 8065 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Arg Ser GlyGln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Arg Ser Gly

85 90 95 85 90 95

Tyr Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu GlyTyr Thr Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys SerLys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215 210 215

<210> 9<210> 9

<211> 213<211> 213

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 9<400> 9

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly LysSer Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 151 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser ValThr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30 20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile TyrHis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45 35 40 45

Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly SerTyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala GlyAsn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 8065 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Asp ValAsp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Asp Val

85 90 95 85 90 95

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys AlaVal Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala

100 105 110 100 105 110

Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln AlaAla Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala

115 120 125 115 120 125

Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly AlaAsn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala

130 135 140 130 135 140

Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly ValVal Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val

145 150 155 160145 150 155 160

Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala SerGlu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser

165 170 175 165 170 175

Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser TyrSer Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr

180 185 190 180 185 190

Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val AlaSer Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala

195 200 205 195 200 205

Pro Thr Glu Cys SerPro Thr Glu Cys Ser

210 210

<210> 10<210> 10

<211> 107<211> 107

<212> PRT<212>PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 10<400> 10

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 11<210> 11

<211> 106<211> 106

<212> PRT<212>PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 11<400> 11

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser SerGly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 151 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser AspGlu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30 20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser ProPhe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45 35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn AsnVal Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60 50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp LysLys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 8065 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr ValSer His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95 85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys SerGlu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105 100 105

<210> 12<210> 12

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 12<400> 12

Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn HisLeu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His

1 515

<210> 13<210> 13

<211> 463<211> 463

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 13<400> 13

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Ser Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Thr Lys Gly Pro Ser Val PheSer Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140 130 135 140

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala LeuPro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

145 150 155 160145 150 155 160

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser TrpGly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

165 170 175 165 170 175

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val LeuAsn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

180 185 190 180 185 190

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro SerGln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

195 200 205 195 200 205

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys ProSer Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

210 215 220 210 215 220

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp LysSer Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

225 230 235 240225 230 235 240

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly ProThr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

245 250 255 245 250 255

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile SerSer Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

260 265 270 260 265 270

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu AspArg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

275 280 285 275 280 285

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His AsnPro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

290 295 300 290 295 300

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg ValAla Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

305 310 315 320305 310 315 320

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys GluVal Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

325 330 335 325 330 335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu LysTyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

340 345 350 340 345 350

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr ThrThr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

355 360 365 355 360 365

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu ThrLeu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

370 375 380 370 375 380

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp GluCys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

385 390 395 400385 390 395 400

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val LeuSer Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

405 410 415 405 410 415

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp LysAsp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

420 425 430 420 425 430

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His GluSer Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440 445 435 440 445

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProAla Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460 450 455 460

<210> 14<210> 14

<211> 473<211> 473

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 14<400> 14

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Ser Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly SerSer Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser

130 135 140 130 135 140

Ser Gly Gly Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser SerSer Gly Gly Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

145 150 155 160145 150 155 160

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys AspLys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

165 170 175 165 170 175

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu ThrTyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

180 185 190 180 185 190

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu TyrSer Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

195 200 205 195 200 205

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr GlnSer Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

210 215 220 210 215 220

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val AspThr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

225 230 235 240225 230 235 240

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro ProLys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

245 250 255 245 250 255

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe ProCys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

260 265 270 260 265 270

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val ThrPro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

275 280 285 275 280 285

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe AsnCys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

290 295 300 290 295 300

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro ArgTrp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

305 310 315 320305 310 315 320

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr ValGlu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

325 330 335 325 330 335

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val SerLeu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

340 345 350 340 345 350

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala LysAsn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

355 360 365 355 360 365

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg GluGly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

370 375 380 370 375 380

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly PheGlu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

385 390 395 400385 390 395 400

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro GluTyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

405 410 415 405 410 415

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser PheAsn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

420 425 430 420 425 430

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln GlyPhe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

435 440 445 435 440 445

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His TyrAsn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

450 455 460 450 455 460

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProThr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470465 470

<210> 15<210> 15

<211> 464<211> 464

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 15<400> 15

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Leu Ser GlyGlu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Leu Ser Gly

115 120 125 115 120 125

Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser ValArg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140 130 135 140

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala AlaPhe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

145 150 155 160145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val SerLeu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

165 170 175 165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala ValTrp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190 180 185 190

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val ProLeu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

195 200 205 195 200 205

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His LysSer Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

210 215 220 210 215 220

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys AspPro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

225 230 235 240225 230 235 240

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly GlyLys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

245 250 255 245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met IlePro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270 260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His GluSer Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285 275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val HisAsp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300 290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr ArgAsn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly LysVal Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335 325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile GluGlu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350 340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val TyrLys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365 355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser LeuThr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380 370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu TrpThr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro ValGlu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415 405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val AspLeu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430 420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met HisLys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445 435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProGlu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460 450 455 460

<210> 16<210> 16

<211> 473<211> 473

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 16<400> 16

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly GlyGlu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly SerSer Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser

130 135 140 130 135 140

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser SerSer Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProThr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470465 470

<210> 17<210> 17

<211> 464<211> 464

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 17<400> 17

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Ser Thr Lys Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Pro Ser ValSer Thr Lys Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Gly Pro Ser Val

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

<210> 18<210> 18

<211> 473<211> 473

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 18<400> 18

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Ser Thr Lys Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn HisSer Thr Lys Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His

130 135 140 130 135 140

Gly Ser Ser Gly Gly Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser SerGly Ser Ser Gly Gly Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProThr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470465 470

<210> 19<210> 19

<211> 121<211> 121

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 19<400> 19

1 5 10 151 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile AsnSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn

20 25 30 20 25 30

Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu ValVal Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val

35 40 45 35 40 45

Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val LysAla Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr LeuGly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 8065 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys AlaGln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95 85 90 95

Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp GlyPhe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 20<210> 20

<211> 121<211> 121

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 20<400> 20

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValVal Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 21<210> 21

<211> 330<211> 330

<212> PRT<212>PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 21<400> 21

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser LysAla Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 151 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp TyrSer Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr SerPhe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr SerGly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln ThrLeu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 8065 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp LysTyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro CysLys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro ProPro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr CysLys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn TrpVal Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg GluTyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175 165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val LeuGlu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190 180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser AsnHis Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys GlyLys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220 210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp GluGln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe TyrLeu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255 245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu AsnPro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe PheAsn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly AsnLeu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr ThrVal Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly LysGln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330 325 330

<210> 22<210> 22

<211> 326<211> 326

<212> PRT<212>PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 22<400> 22

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser ArgAla Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 151 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp TyrSer Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln ThrLeu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 8065 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp LysTyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95 85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala ProThr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110 100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys AspPro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125 115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val AspThr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140 130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp GlyVal Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe AsnVal Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175 165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp TrpSer Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190 180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu ProLeu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205 195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg GluAla Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220 210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys AsnPro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp IleGln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255 245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys ThrAla Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270 260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser LysThr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285 275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser CysLeu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300 290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser LeuSer Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly LysSer Leu Ser Pro Gly Lys

325 325

<210> 23<210> 23

<211> 377<211> 377

<212> PRT<212>PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 23<400> 23

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp LysTyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95 85 90 95

Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys ProArg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro

100 105 110 100 105 110

Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro ArgArg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg

115 120 125 115 120 125

Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg CysCys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys

130 135 140 130 135 140

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys ProPro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp TyrVal Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu HisGln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly GlnAla Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn AsnSer Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn

305 310 315 320305 310 315 320

Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe LeuTyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

325 330 335 325 330 335

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn IleTyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile

340 345 350 340 345 350

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr GlnPhe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln

355 360 365 355 360 365

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly LysLys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 370 375

<210> 24<210> 24

<211> 327<211> 327

<212> PRT<212>PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 24<400> 24

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys ThrLeu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala ProArg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110 100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro LysGlu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125 115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val ValAsp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140 130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val AspAsp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln PheGly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175 165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln AspAsn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190 180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly LeuTrp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205 195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro ArgPro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220 210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr LysGlu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser AspAsn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255 245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr LysIle Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270 260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr SerThr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285 275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe SerArg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300 290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys SerCys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly LysLeu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325 325

<210> 25<210> 25

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 25<400> 25

Pro Leu Gly Leu Ala GlyPro Leu Gly Leu Ala Gly

1 515

<210> 26<210> 26

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 26<400> 26

Val Pro Leu Ser Leu Thr Met GlyVal Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly

1 515

<210> 27<210> 27

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 27<400> 27

Gly Ser Gly Gly SerGly Ser Gly Gly Ser

1 515

<210> 28<210> 28

<211> 4<211> 4

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 28<400> 28

Gly Gly Gly SerGly Gly Gly Ser

11

<210> 29<210> 29

<211> 4<211> 4

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 29<400> 29

Gly Gly Ser GlyGly Gly Ser Gly

11

<210> 30<210> 30

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 30<400> 30

Gly Gly Ser Gly GlyGly Gly Ser Gly Gly

1 515

<210> 31<210> 31

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 31<400> 31

Gly Ser Gly Ser GlyGly Ser Gly Ser Gly

1 515

<210> 32<210> 32

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 32<400> 32

Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly

1 515

<210> 33<210> 33

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 33<400> 33

Gly Gly Gly Ser GlyGly Gly Gly Ser Gly

1 515

<210> 34<210> 34

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 34<400> 34

Gly Ser Ser Ser GlyGly Ser Ser Ser Gly

1 515

<210> 35<210> 35

<211> 338<211> 338

<212> PRT<212>PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 35<400> 35

Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg Gly Val LeuLeu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg Gly Val Leu

1 5 10 151 5 10 15

Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro Gly Val GluThr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro Gly Val Glu

20 25 30 20 25 30

Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys Pro Ala AlaPro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys Pro Ala Ala

35 40 45 35 40 45

Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg Leu Leu LeuGly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg Leu Leu Leu

50 55 60 50 55 60

Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Tyr Arg AlaArg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Tyr Arg Ala

65 70 75 8065 70 75 80

Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val Pro Pro GluGly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val Pro Pro Glu

85 90 95 85 90 95

Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser Asn Val ValGlu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser Asn Val Val

100 105 110 100 105 110

Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr Lys Ala ValCys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr Lys Ala Val

115 120 125 115 120 125

Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp Phe Gln GluLeu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp Phe Gln Glu

130 135 140 130 135 140

Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys Gln Leu AlaPro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys Gln Leu Ala

145 150 155 160145 150 155 160

Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met Cys Val AlaVal Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met Cys Val Ala

165 170 175 165 170 175

Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe Gln Gly CysSer Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe Gln Gly Cys

180 185 190 180 185 190

Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val Thr Ala ValGly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val Thr Ala Val

195 200 205 195 200 205

Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp Pro His SerAla Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp Pro His Ser

210 215 220 210 215 220

Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg Tyr Arg AlaTrp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Ala

225 230 235 240225 230 235 240

Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp Leu Gln HisGlu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp Leu Gln His

245 250 255 245 250 255

His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His Val Val GlnHis Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His Val Val Gln

260 265 270 260 265 270

Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser Glu Trp SerLeu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser Glu Trp Ser

275 280 285 275 280 285

Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser Pro Pro AlaPro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser Pro Pro Ala

290 295 300 290 295 300

Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr Asn Lys AspGlu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr Asn Lys Asp

305 310 315 320305 310 315 320

Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr Ser Leu ProAsp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr Ser Leu Pro

325 330 335 325 330 335

Val GlnVal Gln

<210> 36<210> 36

<211> 15<211> 15

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 36<400> 36

Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His GluGly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

1 5 10 151 5 10 15

<210> 37<210> 37

<211> 358<211> 358

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 37<400> 37

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

Val Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala GlnVal Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln

340 345 350 340 345 350

Lys Ile Glu Trp His GluLys Ile Glu Trp His Glu

355 355

<210> 38<210> 38

<211> 449<211> 449

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 38<400> 38

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro SerGln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125 115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr AlaVal Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140 130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr ValAla Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro AlaSer Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175 165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr ValVal Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190 180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn HisPro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205 195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser CysLys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220 210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu GlyAsp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu MetGly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255 245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser HisIle Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270 260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu ValGlu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285 275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr TyrHis Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300 290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn GlyArg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro IleLys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335 325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln ValGlu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350 340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val SerTyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365 355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val GluLeu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380 370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro ProTrp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr ValVal Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415 405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val MetAsp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430 420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu SerHis Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445 435 440 445

ProPro

<210> 39<210> 39

<211> 449<211> 449

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 39<400> 39

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

ProPro

<210> 40<210> 40

<211> 457<211> 457

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 40<400> 40

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Leu Ser Gly Arg SerGln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Leu Ser Gly Arg Ser

115 120 125 115 120 125

Asp Asn His Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser SerAsp Asn His Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProThr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 450 455

<210> 41<210> 41

<211> 467<211> 467

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 41<400> 41

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ser Gly Gly Ser GlyGln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ser Gly Gly Ser Gly

115 120 125 115 120 125

Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Thr Lys GlyLeu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Thr Lys Gly

130 135 140 130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly GlyPro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro ValThr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175 165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr PheThr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190 180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val ValPro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205 195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn ValThr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

210 215 220 210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro LysAsn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

225 230 235 240225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu LeuSer Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

245 250 255 245 250 255

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp ThrLeu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270 260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp ValLeu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285 275 280 285

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly ValSer His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290 295 300 290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn SerGlu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

305 310 315 320305 310 315 320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp LeuThr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325 330 335 325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro AlaAsn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

340 345 350 340 345 350

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu ProPro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365 355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn GlnGln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

370 375 380 370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile AlaVal Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr ThrVal Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415 405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys LeuPro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

420 425 430 420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys SerThr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445 435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu SerVal Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460 450 455 460

Leu Ser ProLeu Ser Pro

465465

<210> 42<210> 42

<211> 467<211> 467

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 42<400> 42

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly ArgGln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg

115 120 125 115 120 125

Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys GlySer Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Leu Ser ProLeu Ser Pro

465465

<210> 43<210> 43

<211> 467<211> 467

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 43<400> 43

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Ser Gly GlyGln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Ser Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly GlySer Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Leu Ser ProLeu Ser Pro

465465

<210> 44<210> 44

<211> 18<211> 18

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 44<400> 44

Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser SerSer Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser

1 5 10 151 5 10 15

Gly GlyGly Gly

<210> 45<210> 45

<211> 9<211> 9

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 45<400> 45

Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His GlyLeu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly

1 515

<210> 46<210> 46

<211> 4<211> 4

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 46<400> 46

Gly Ser Gly GlyGly Ser Gly Gly

11

<210> 47<210> 47

<211> 4<211> 4

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 47<400> 47

Ser Gly Gly GlySer Gly Gly Gly

11

<210> 48<210> 48

<211> 4<211> 4

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 48<400> 48

Gly Ser Ser GlyGly Ser Ser Gly

11

<210> 49<210> 49

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 49<400> 49

Gly Gly Gly Gly SerGly Gly Gly Gly Ser

1 515

<210> 50<210> 50

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 50<400> 50

Gly Gly Gly Gly Gly SerGly Gly Gly Gly Gly Ser

1 515

<210> 51<210> 51

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 51<400> 51

Ser Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly

1 515

<210> 52<210> 52

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 52<400> 52

Gly Ser Ser Gly GlyGly Ser Ser Gly Gly

1 515

<210> 53<210> 53

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 53<400> 53

Ser Gly Gly Ser GlySer Gly Gly Ser Gly

1 515

<210> 54<210> 54

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 54<400> 54

Ser Gly Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Gly

1 515

<210> 55<210> 55

<211> 7<211> 7

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 55<400> 55

Gly Gly Gly Gly Gly Gly SerGly Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 515

<210> 56<210> 56

<211> 7<211> 7

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 56<400> 56

Ser Gly Gly Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 515

<210> 57<210> 57

<211> 641<211> 641

<212> PRT<212>PRT

<213> Epstein-Barr virus (EBV)<213> Epstein-Barr virus (EBV)

<400> 57<400> 57

Met Ser Asp Glu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly GluMet Ser Asp Glu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu

1 5 10 151 5 10 15

Lys Gly Asp Thr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro GlnLys Gly Asp Thr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Gln

20 25 30 20 25 30

Arg Arg Gly Gly Asp Asn His Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg GlyArg Arg Gly Gly Asp Asn His Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly

35 40 45 35 40 45

Arg Gly Gly Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ser Gly ProArg Gly Gly Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro

50 55 60 50 55 60

Arg His Arg Asp Gly Val Arg Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys IleArg His Arg Asp Gly Val Arg Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys Ile

65 70 75 8065 70 75 80

Gly Cys Lys Gly Thr His Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala GlyGly Cys Lys Gly Thr His Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly

85 90 95 85 90 95

Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala GlyGly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly

100 105 110 100 105 110

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly GlyGly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly AlaGly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala

130 135 140 130 135 140

Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala GlyGly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly

145 150 155 160145 150 155 160

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala GlyGly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly

165 170 175 165 170 175

Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly GlyAla Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly

180 185 190 180 185 190

Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala GlyAla Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly

195 200 205 195 200 205

Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly AlaGly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala

210 215 220 210 215 220

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly AlaGly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala

225 230 235 240225 230 235 240

Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala GlyGly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala GlyGly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly

275 280 285 275 280 285

Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala GlyAla Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly

290 295 300 290 295 300

Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala GlyAla Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly

305 310 315 320305 310 315 320

Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly GlyGly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly

325 330 335 325 330 335

Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly GlyArg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly

340 345 350 340 345 350

Arg Arg Gly Arg Gly Arg Glu Arg Ala Arg Gly Gly Ser Arg Glu ArgArg Arg Gly Arg Gly Arg Glu Arg Ala Arg Gly Gly Ser Arg Glu Arg

355 360 365 355 360 365

Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys Arg Pro Arg Ser ProAla Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys Arg Pro Arg Ser Pro

370 375 380 370 375 380

Ser Ser Gln Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg Pro Pro ProSer Ser Gln Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg Pro Pro Pro

385 390 395 400385 390 395 400

Gly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe GluGly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu

405 410 415 405 410 415

Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro GlyTyr His Gln Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly

420 425 430 420 425 430

Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser ThrAla Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr

435 440 445 435 440 445

Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gly TrpGly Pro Arg Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp

450 455 460 450 455 460

Phe Gly Lys His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu AsnPhe Gly Lys His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu Asn

465 470 475 480465 470 475 480

Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu ArgIle Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg

485 490 495 485 490 495

Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly GlyThr Thr Asp Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly

500 505 510 500 505 510

Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala IleSer Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile

515 520 525 515 520 525

Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met AlaPro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala

530 535 540 530 535 540

Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val CysPro Gly Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys

545 550 555 560545 550 555 560

Tyr Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu LysTyr Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys

565 570 575 565 570 575

Asp Ala Ile Lys Asp Leu Val Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Cys AsnAsp Ala Ile Lys Asp Leu Val Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Cys Asn

580 585 590 580 585 590

Ile Arg Val Thr Val Cys Ser Phe Asp Asp Gly Val Asp Leu Pro ProIle Arg Val Thr Val Cys Ser Phe Asp Asp Gly Val Asp Leu Pro Pro

595 600 605 595 600 605

Trp Phe Pro Pro Met Val Glu Gly Ala Ala Ala Glu Gly Asp Asp GlyTrp Phe Pro Pro Met Val Glu Gly Ala Ala Ala Glu Gly Asp Asp Gly

610 615 620 610 615 620

Asp Asp Gly Asp Glu Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gly Glu Glu Gly GlnAsp Asp Gly Asp Glu Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gly Glu Glu Gly Gln

625 630 635 640625 630 635 640

GluGlu

<210> 58<210> 58

<211> 321<211> 321

<212> PRT<212>PRT

<213> Escherichia coli<213> Escherichia coli

<400> 58<400> 58

Met Lys Asp Asn Thr Val Pro Leu Lys Leu Ile Ala Leu Leu Ala AsnMet Lys Asp Asn Thr Val Pro Leu Lys Leu Ile Ala Leu Leu Ala Asn

1 5 10 151 5 10 15

Gly Glu Phe His Ser Gly Glu Gln Leu Gly Glu Thr Leu Gly Met SerGly Glu Phe His Ser Gly Glu Gln Leu Gly Glu Thr Leu Gly Met Ser

20 25 30 20 25 30

Arg Ala Ala Ile Asn Lys His Ile Gln Thr Leu Arg Asp Trp Gly ValArg Ala Ala Ile Asn Lys His Ile Gln Thr Leu Arg Asp Trp Gly Val

35 40 45 35 40 45

Asp Val Phe Thr Val Pro Gly Lys Gly Tyr Ser Leu Pro Glu Pro IleAsp Val Phe Thr Val Pro Gly Lys Gly Tyr Ser Leu Pro Glu Pro Ile

50 55 60 50 55 60

Gln Leu Leu Asn Ala Lys Gln Ile Leu Gly Gln Leu Asp Gly Gly SerGln Leu Leu Asn Ala Lys Gln Ile Leu Gly Gln Leu Asp Gly Gly Ser

65 70 75 8065 70 75 80

Val Ala Val Leu Pro Val Ile Asp Ser Thr Asn Gln Tyr Leu Leu AspVal Ala Val Leu Pro Val Ile Asp Ser Thr Asn Gln Tyr Leu Leu Asp

85 90 95 85 90 95

Arg Ile Gly Glu Leu Lys Ser Gly Asp Ala Cys Ile Ala Glu Tyr GlnArg Ile Gly Glu Leu Lys Ser Gly Asp Ala Cys Ile Ala Glu Tyr Gln

100 105 110 100 105 110

Gln Ala Gly Arg Gly Arg Arg Gly Arg Lys Trp Phe Ser Pro Phe GlyGln Ala Gly Arg Gly Arg Arg Gly Arg Lys Trp Phe Ser Pro Phe Gly

115 120 125 115 120 125

Ala Asn Leu Tyr Leu Ser Met Phe Trp Arg Leu Glu Gln Gly Pro AlaAla Asn Leu Tyr Leu Ser Met Phe Trp Arg Leu Glu Gln Gly Pro Ala

130 135 140 130 135 140

Ala Ala Ile Gly Leu Ser Leu Val Ile Gly Ile Val Met Ala Glu ValAla Ala Ile Gly Leu Ser Leu Val Ile Gly Ile Val Met Ala Glu Val

145 150 155 160145 150 155 160

Leu Arg Lys Leu Gly Ala Asp Lys Val Arg Val Lys Trp Pro Asn AspLeu Arg Lys Leu Gly Ala Asp Lys Val Arg Val Lys Trp Pro Asn Asp

165 170 175 165 170 175

Leu Tyr Leu Gln Asp Arg Lys Leu Ala Gly Ile Leu Val Glu Leu ThrLeu Tyr Leu Gln Asp Arg Lys Leu Ala Gly Ile Leu Val Glu Leu Thr

180 185 190 180 185 190

Gly Lys Thr Gly Asp Ala Ala Gln Ile Val Ile Gly Ala Gly Ile AsnGly Lys Thr Gly Asp Ala Ala Gln Ile Val Ile Gly Ala Gly Ile Asn

195 200 205 195 200 205

Met Ala Met Arg Arg Val Glu Glu Ser Val Val Asn Gln Gly Trp IleMet Ala Met Arg Arg Val Glu Glu Ser Val Val Asn Gln Gly Trp Ile

210 215 220 210 215 220

Thr Leu Gln Glu Ala Gly Ile Asn Leu Asp Arg Asn Thr Leu Ala AlaThr Leu Gln Glu Ala Gly Ile Asn Leu Asp Arg Asn Thr Leu Ala Ala

225 230 235 240225 230 235 240

Met Leu Ile Arg Glu Leu Arg Ala Ala Leu Glu Leu Phe Glu Gln GluMet Leu Ile Arg Glu Leu Arg Ala Ala Leu Glu Leu Phe Glu Gln Glu

245 250 255 245 250 255

Gly Leu Ala Pro Tyr Leu Ser Arg Trp Glu Lys Leu Asp Asn Phe IleGly Leu Ala Pro Tyr Leu Ser Arg Trp Glu Lys Leu Asp Asn Phe Ile

260 265 270 260 265 270

Asn Arg Pro Val Lys Leu Ile Ile Gly Asp Lys Glu Ile Phe Gly IleAsn Arg Pro Val Lys Leu Ile Ile Gly Asp Lys Glu Ile Phe Gly Ile

275 280 285 275 280 285

Ser Arg Gly Ile Asp Lys Gln Gly Ala Leu Leu Leu Glu Gln Asp GlySer Arg Gly Ile Asp Lys Gln Gly Ala Leu Leu Leu Glu Gln Asp Gly

290 295 300 290 295 300

Ile Ile Lys Pro Trp Met Gly Gly Glu Ile Ser Leu Arg Ser Ala GluIle Ile Lys Pro Trp Met Gly Gly Glu Ile Ser Leu Arg Ser Ala Glu

305 310 315 320305 310 315 320

LysLys

<210> 59<210> 59

<211> 373<211> 373

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 59<400> 59

Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr LysGln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys

1 5 10 151 5 10 15

Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr ProVal Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro

20 25 30 20 25 30

Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly AspGly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp

35 40 45 35 40 45

Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu LysGlu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys

50 55 60 50 55 60

Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro ArgGlu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg

65 70 75 8065 70 75 80

Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala ArgGly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg

85 90 95 85 90 95

Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Asp Ile Glu Gly Arg Met AspVal Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp

100 105 110 100 105 110

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala ProPro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

115 120 125 115 120 125

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro LysGlu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val AspAsp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

165 170 175 165 170 175

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln TyrGly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala LeuTrp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

210 215 220 210 215 220

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro ArgPro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

225 230 235 240225 230 235 240

Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr LysGlu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

245 250 255 245 250 255

Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser AspAsn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe SerLys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Glu Asn Leu TyrLeu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Glu Asn Leu Tyr

340 345 350 340 345 350

Phe Gln Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln LysPhe Gln Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys

355 360 365 355 360 365

Ile Glu Trp His GluIle Glu Trp His Glu

370 370

<210> 60<210> 60

<211> 323<211> 323

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 60<400> 60

Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn CysPhe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys

1 5 10 151 5 10 15

Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu SerAsn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser

20 25 30 20 25 30

Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg GlyAsp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly

35 40 45 35 40 45

Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser ThrIle Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr

50 55 60 50 55 60

Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys Val Glu Leu Asp AspVal Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys Val Glu Leu Asp Asp

65 70 75 8065 70 75 80

Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr CysIle Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

85 90 95 85 90 95

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe LeuPro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

100 105 110 100 105 110

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro GluPhe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

115 120 125 115 120 125

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val LysVal Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

130 135 140 130 135 140

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr LysPhe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

145 150 155 160145 150 155 160

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val LeuPro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

165 170 175 165 170 175

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys LysThr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

180 185 190 180 185 190

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser LysVal Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

195 200 205 195 200 205

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro SerAla Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

210 215 220 210 215 220

Arg Cys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val LysArg Cys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys

225 230 235 240225 230 235 240

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly GlnGly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

245 250 255 245 250 255

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp GlyPro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

260 265 270 260 265 270

Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp GlnSer Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

275 280 285 275 280 285

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His AsnGln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

290 295 300 290 295 300

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Asp Tyr Lys Asp AspHis Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Asp Tyr Lys Asp Asp

305 310 315 320305 310 315 320

Asp Asp LysAsp Asp Lys

<210> 61<210> 61

<211> 123<211> 123

<212> PRT<212>PRT

<213> Vicugna pacos<213> Vicugna pacos

<400> 61<400> 61

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 151 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn His CysSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn His Cys

20 25 30 20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValTrp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ser Val Ile Asn Thr Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser ValSer Val Ile Asn Thr Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Asp Trp Ala Pro Leu Val Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp TyrAla Arg Asp Trp Ala Pro Leu Val Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr

100 105 110 100 105 110

Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser GlyTrp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly

115 120 115 120

<210> 62<210> 62

<211> 121<211> 121

<212> PRT<212>PRT

<213> Vicugna pacos<213> Vicugna pacos

<400> 62<400> 62

1 5 10 151 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Asp Asn TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Asp Asn Tyr

20 25 30 20 25 30

Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp IleVal Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser MetSer Ala Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Ala Lys Glu Pro Arg Val Tyr Tyr Ser Gly Ser Pro Asp Tyr Trp GlyAla Lys Glu Pro Arg Val Tyr Tyr Ser Gly Ser Pro Asp Tyr Trp Gly

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser GlyGln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Gly

115 120 115 120

<210> 63<210> 63

<211> 118<211> 118

<212> PRT<212>PRT

<213> Vicugna pacos<213> Vicugna pacos

<400> 63<400> 63

1 5 10 151 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Val TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Val Tyr

20 25 30 20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg His Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValGly Met Ser Trp Val Arg His Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ser Thr Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser MetSer Thr Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Met

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Lys Phe Ala Pro Trp Asp Gly Asp Met Glu Trp Gly Gln Gly ThrAla Lys Phe Ala Pro Trp Asp Gly Asp Met Glu Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110 100 105 110

Gln Val Thr Val Ser GlyGln Val Thr Val Ser Gly

115 115

<210> 64<210> 64

<211> 469<211> 469

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 64<400> 64

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu SerTrp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser

115 120 125 115 120 125

Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser ThrGly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr

130 135 140 130 135 140

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr SerLys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

145 150 155 160145 150 155 160

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro GluGly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

165 170 175 165 170 175

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val HisPro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

180 185 190 180 185 190

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser SerThr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205 195 200 205

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile CysVal Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

210 215 220 210 215 220

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val GluAsn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr LysGlu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Leu Ser Leu Ser ProLeu Ser Leu Ser Pro

465465

<210> 65<210> 65

<211> 467<211> 467

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 65<400> 65

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly ArgGln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Leu Ser ProLeu Ser Pro

465465

<210> 66<210> 66

<211> 464<211> 464

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 66<400> 66

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp AsnGln Val Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn

115 120 125 115 120 125

His Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser ValHis Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

<210> 67<210> 67

<211> 222<211> 222

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 67<400> 67

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Leu Ser Gly Arg Ser Asp AsnThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn

100 105 110 100 105 110

His Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro ProHis Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125 115 120 125

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu LeuSer Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

130 135 140 130 135 140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp AsnAsn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

145 150 155 160145 150 155 160

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp SerAla Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

165 170 175 165 170 175

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys AlaLys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

180 185 190 180 185 190

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln GlyAsp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

195 200 205 195 200 205

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu CysLeu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220 210 215 220

<210> 68<210> 68

<211> 222<211> 222

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 68<400> 68

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Leu Ser Gly Arg Ser AspThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Leu Ser Gly Arg Ser Asp

100 105 110 100 105 110

Asn His Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro ProAsn His Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

<210> 69<210> 69

<211> 222<211> 222

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 69<400> 69

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Leu Ser Gly Arg SerThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Leu Ser Gly Arg Ser

100 105 110 100 105 110

Asp Asn His Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro ProAsp Asn His Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

<210> 70<210> 70

<211> 222<211> 222

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 70<400> 70

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Leu Ser GlyThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Leu Ser Gly

100 105 110 100 105 110

Arg Ser Asp Asn His Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro ProArg Ser Asp Asn His Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

<210> 71<210> 71

<211> 222<211> 222

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 71<400> 71

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Leu SerThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Leu Ser

100 105 110 100 105 110

Gly Arg Ser Asp Asn His Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro ProGly Arg Ser Asp Asn His Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

<210> 72<210> 72

<211> 222<211> 222

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 72<400> 72

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala LeuThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Leu

100 105 110 100 105 110

Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro ProSer Gly Arg Ser Asp Asn His Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

<210> 73<210> 73

<211> 222<211> 222

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 73<400> 73

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro ProLeu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

<210> 74<210> 74

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 74<400> 74

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 75<210> 75

<211> 13<211> 13

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 75<400> 75

Ile Ser Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn HisIle Ser Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His

1 5 101 5 10

<210> 76<210> 76

<211> 18<211> 18

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 76<400> 76

Ala Val Gly Leu Leu Ala Pro Pro Gly Gly Leu Ser Gly Arg Ser AspAla Val Gly Leu Leu Ala Pro Pro Gly Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp

1 5 10 151 5 10 15

Asn HisAsn His

<210> 77<210> 77

<211> 13<211> 13

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 77<400> 77

Gly Ala Gly Val Pro Met Ser Met Arg Gly Gly Ala GlyGly Ala Gly Val Pro Met Ser Met Arg Gly Gly Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 78<210> 78

<211> 13<211> 13

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 78<400> 78

Gly Ala Gly Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly Ala GlyGly Ala Gly Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 79<210> 79

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 79<400> 79

Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly GlnGly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln

1 515

<210> 80<210> 80

<211> 10<211> 10

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 80<400> 80

Gly Gly Pro Leu Gly Met Leu Ser Gln SerGly Gly Pro Leu Gly Met Leu Ser Gln Ser

1 5 101 5 10

<210> 81<210> 81

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 81<400> 81

Pro Leu Gly Leu Trp AlaPro Leu Gly Leu Trp Ala

1 515

<210> 82<210> 82

<211> 13<211> 13

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 82<400> 82

Gly Ala Gly Arg Pro Phe Ser Met Ile Met Gly Ala GlyGly Ala Gly Arg Pro Phe Ser Met Ile Met Gly Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 83<210> 83

<211> 13<211> 13

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 83<400> 83

Gly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly Ala GlyGly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 84<210> 84

<211> 13<211> 13

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 84<400> 84

Gly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Ala GlyGly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 85<210> 85

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 85<400> 85

Ala Ala Asn Leu Arg AsnAla Ala Asn Leu Arg Asn

1 515

<210> 86<210> 86

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 86<400> 86

Ala Gln Ala Tyr Val LysAla Gln Ala Tyr Val Lys

1 515

<210> 87<210> 87

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 87<400> 87

Ala Ala Asn Tyr Met ArgAla Ala Asn Tyr Met Arg

1 515

<210> 88<210> 88

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 88<400> 88

Ala Ala Ala Leu Thr ArgAla Ala Ala Leu Thr Arg

1 515

<210> 89<210> 89

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 89<400> 89

Ala Gln Asn Leu Met ArgAla Gln Asn Leu Met Arg

1 515

<210> 90<210> 90

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 90<400> 90

Ala Ala Asn Tyr Thr LysAla Ala Asn Tyr Thr Lys

1 515

<210> 91<210> 91

<211> 16<211> 16

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 91<400> 91

Gly Ala Gly Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Arg Gly Ile Val Ala GlyGly Ala Gly Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Arg Gly Ile Val Ala Gly

1 5 10 151 5 10 15

<210> 92<210> 92

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 92<400> 92

Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly GlyPro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly

1 515

<210> 93<210> 93

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 93<400> 93

Pro Arg Phe Arg Ile Ile Gly GlyPro Arg Phe Arg Ile Ile Gly Gly

1 515

<210> 94<210> 94

<211> 9<211> 9

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 94<400> 94

Gly Ala Gly Ser Gly Arg Ser Ala GlyGly Ala Gly Ser Gly Arg Ser Ala Gly

1 515

<210> 95<210> 95

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 95<400> 95

Ser Gly Arg Ser AlaSer Gly Arg Ser Ala

1 515

<210> 96<210> 96

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 96<400> 96

Gly Ser Gly Arg Ser AlaGly Ser Gly Arg Ser Ala

1 515

<210> 97<210> 97

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 97<400> 97

Ser Gly Lys Ser AlaSer Gly Lys Ser Ala

1 515

<210> 98<210> 98

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 98<400> 98

Ser Gly Arg Ser SerSer Gly Arg Ser Ser

1 515

<210> 99<210> 99

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 99<400> 99

Ser Gly Arg Arg AlaSer Gly Arg Arg Ala

1 515

<210> 100<210> 100

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 100<400> 100

Ser Gly Arg Asn AlaSer Gly Arg Asn Ala

1 515

<210> 101<210> 101

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 101<400> 101

Ser Gly Arg Lys AlaSer Gly Arg Lys Ala

1 515

<210> 102<210> 102

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 102<400> 102

Gln Arg Gly Arg Ser AlaGln Arg Gly Arg Ser Ala

1 515

<210> 103<210> 103

<211> 17<211> 17

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 103<400> 103

Gly Ala Gly Ser Leu Leu Lys Ser Arg Met Val Pro Asn Phe Asn AlaGly Ala Gly Ser Leu Leu Lys Ser Arg Met Val Pro Asn Phe Asn Ala

1 5 10 151 5 10 15

GlyGly

<210> 104<210> 104

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 104<400> 104

Thr Gln Gly Ala Ala AlaThr Gln Gly Ala Ala Ala

1 515

<210> 105<210> 105

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 105<400> 105

Gly Ala Ala Ala Ala AlaGly Ala Ala Ala Ala Ala

1 515

<210> 106<210> 106

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 106<400> 106

Gly Ala Gly Ala Ala GlyGly Ala Gly Ala Ala Gly

1 515

<210> 107<210> 107

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 107<400> 107

Ala Ala Ala Ala Ala GlyAla Ala Ala Ala Ala Gly

1 515

<210> 108<210> 108

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 108<400> 108

Leu Cys Gly Ala Ala IleLeu Cys Gly Ala Ala Ile

1 515

<210> 109<210> 109

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 109<400> 109

Phe Ala Gln Ala Leu GlyPhe Ala Gln Ala Leu Gly

1 515

<210> 110<210> 110

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 110<400> 110

Leu Leu Gln Ala Asn ProLeu Leu Gln Ala Asn Pro

1 515

<210> 111<210> 111

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 111<400> 111

Leu Ala Ala Ala Asn ProLeu Ala Ala Ala Asn Pro

1 515

<210> 112<210> 112

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 112<400> 112

Leu Tyr Gly Ala Gln PheLeu Tyr Gly Ala Gln Phe

1 515

<210> 113<210> 113

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 113<400> 113

Leu Ser Gln Ala Gln GlyLeu Ser Gln Ala Gln Gly

1 515

<210> 114<210> 114

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 114<400> 114

Ala Ser Ala Ala Ser GlyAla Ser Ala Ala Ser Gly

1 515

<210> 115<210> 115

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 115<400> 115

Phe Leu Gly Ala Ser LeuPhe Leu Gly Ala Ser Leu

1 515

<210> 116<210> 116

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 116<400> 116

Ala Tyr Gly Ala Thr GlyAla Tyr Gly Ala Thr Gly

1 515

<210> 117<210> 117

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 117<400> 117

Leu Ala Gln Ala Thr GlyLeu Ala Gln Ala Thr Gly

1 515

<210> 118<210> 118

<211> 17<211> 17

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 118<400> 118

Gly Ala Gly Ser Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr AlaGly Ala Gly Ser Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Ala

1 5 10 151 5 10 15

GlyGly

<210> 119<210> 119

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 119<400> 119

Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly GlyAla Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly

1 515

<210> 120<210> 120

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 120<400> 120

Glu Ala Gln Gly Asp Lys Ile IleGlu Ala Gln Gly Asp Lys Ile Ile

1 515

<210> 121<210> 121

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 121<400> 121

Leu Ala Phe Ser Asp Ala Gly ProLeu Ala Phe Ser Asp Ala Gly Pro

1 515

<210> 122<210> 122

<211> 7<211> 7

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 122<400> 122

Tyr Val Ala Asp Ala Pro LysTyr Val Ala Asp Ala Pro Lys

1 515

<210> 123<210> 123

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 123<400> 123

Arg Arg Arg Arg ArgArg Arg Arg Arg Arg

1 515

<210> 124<210> 124

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 124<400> 124

Arg Arg Arg Arg Arg ArgArg Arg Arg Arg Arg Arg

1 515

<210> 125<210> 125

<211> 10<211> 10

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 125<400> 125

Gly Gln Ser Ser Arg His Arg Arg Ala LeuGly Gln Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu

1 5 101 5 10

<210> 126<210> 126

<211> 9<211> 9

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 126<400> 126

Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu AspSer Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp

1 515

<210> 127<210> 127

<211> 14<211> 14

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 127<400> 127

Arg Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val LeuArg Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu

1 5 101 5 10

<210> 128<210> 128

<211> 15<211> 15

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 128<400> 128

Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp AlaSer Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala

1 5 10 151 5 10 15

<210> 129<210> 129

<211> 15<211> 15

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 129<400> 129

Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Arg Gly Asp Asp AlaSer Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Arg Gly Asp Asp Ala

1 5 10 151 5 10 15

<210> 130<210> 130

<211> 4<211> 4

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 130<400> 130

Ile Glu Gly ArgIle Glu Gly Arg

11

<210> 131<210> 131

<211> 4<211> 4

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 131<400> 131

Ile Asp Gly ArgIle Asp Gly Arg

11

<210> 132<210> 132

<211> 7<211> 7

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 132<400> 132

Gly Gly Ser Ile Asp Gly ArgGly Gly Ser Ile Asp Gly Arg

1 515

<210> 133<210> 133

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 133<400> 133

Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly GlnGly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln

1 515

<210> 134<210> 134

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 134<400> 134

Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly AlaGly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala

1 515

<210> 135<210> 135

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 135<400> 135

Gly Ile Ala Gly GlnGly Ile Ala Gly Gln

1 515

<210> 136<210> 136

<211> 7<211> 7

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 136<400> 136

Gly Pro Leu Gly Ile Ala GlyGly Pro Leu Gly Ile Ala Gly

1 515

<210> 137<210> 137

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 137<400> 137

Gly Pro Glu Gly Leu Arg Val GlyGly Pro Glu Gly Leu Arg Val Gly

1 515

<210> 138<210> 138

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 138<400> 138

Tyr Gly Ala Gly Leu Gly Val ValTyr Gly Ala Gly Leu Gly Val Val

1 515

<210> 139<210> 139

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 139<400> 139

Ala Gly Leu Gly Val Val Glu ArgAla Gly Leu Gly Val Val Glu Arg

1 515

<210> 140<210> 140

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 140<400> 140

Ala Gly Leu Gly Ile Ser Ser ThrAla Gly Leu Gly Ile Ser Ser Thr

1 515

<210> 141<210> 141

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 141<400> 141

Glu Pro Gln Ala Leu Ala Met SerGlu Pro Gln Ala Leu Ala Met Ser

1 515

<210> 142<210> 142

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 142<400> 142

Gln Ala Leu Ala Met Ser Ala IleGln Ala Leu Ala Met Ser Ala Ile

1 515

<210> 143<210> 143

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 143<400> 143

Ala Ala Tyr His Leu Val Ser GlnAla Ala Tyr His Leu Val Ser Gln

1 515

<210> 144<210> 144

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 144<400> 144

Met Asp Ala Phe Leu Glu Ser SerMet Asp Ala Phe Leu Glu Ser Ser

1 515

<210> 145<210> 145

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 145<400> 145

Glu Ser Leu Pro Val Val Ala ValGlu Ser Leu Pro Val Val Ala Val

1 515

<210> 146<210> 146

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 146<400> 146

Ser Ala Pro Ala Val Glu Ser GluSer Ala Pro Ala Val Glu Ser Glu

1 515

<210> 147<210> 147

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 147<400> 147

Asp Val Ala Gln Phe Val Leu ThrAsp Val Ala Gln Phe Val Leu Thr

1 515

<210> 148<210> 148

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 148<400> 148

Val Ala Gln Phe Val Leu Thr GluVal Ala Gln Phe Val Leu Thr Glu

1 515

<210> 149<210> 149

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 149<400> 149

Ala Gln Phe Val Leu Thr Glu GlyAla Gln Phe Val Leu Thr Glu Gly

1 515

<210> 150<210> 150

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 150<400> 150

Pro Val Gln Pro Ile Gly Pro GlnPro Val Gln Pro Ile Gly Pro Gln

1 515

<210> 151<210> 151

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 151<400> 151

Leu Val Pro Arg Gly SerLeu Val Pro Arg Gly Ser

1 515

<210> 152<210> 152

<211> 214<211> 214

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 152<400> 152

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu AlaPhe Asn Arg Gly Glu Ala

210 210

<210> 153<210> 153

<211> 107<211> 107

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 153<400> 153

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu AlaPro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ala

100 105 100 105

<210> 154<210> 154

<211> 464<211> 464

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 154<400> 154

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 151 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ile Ser Phe Ser Ile SerSer Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ile Ser Phe Ser Ile Ser

20 25 30 20 25 30

Thr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu ValThr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45 35 40 45

Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asn Ser Met LysAla Thr Ile Thr Ser Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asn Ser Met Lys

50 55 60 50 55 60

Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr LeuAsp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 8065 70 75 80

Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys AsnGln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95 85 90 95

Thr Lys Phe Pro Trp Ser Thr Asp Trp Asp Ser Arg Gly Gln Gly ThrThr Lys Phe Pro Trp Ser Thr Asp Trp Asp Ser Arg Gly Gln Gly Thr

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

<210> 155<210> 155

<211> 464<211> 464

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 155<400> 155

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

<210> 156<210> 156

<211> 464<211> 464

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 156<400> 156

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Thr Lys Phe Pro Trp Ser Thr Asp Trp Asn Ala Arg Gly Gln Gly ThrThr Lys Phe Pro Trp Ser Thr Asp Trp Asn Ala Arg Gly Gln Gly Thr

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

<210> 157<210> 157

<211> 464<211> 464

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 157<400> 157

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Ala Thr Ile Ala Ser Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asn Ser Val LysAla Thr Ile Ala Ser Gly Gly Glu Ala Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Lys

50 55 60 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr LeuGly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

<210> 158<210> 158

<211> 464<211> 464

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 158<400> 158

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Tyr Ala Glu Asn Thr Val Phe LeuGly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Tyr Ala Glu Asn Thr Val Phe Leu

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

<210> 159<210> 159

<211> 116<211> 116

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 159<400> 159

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 151 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Phe Asp Phe Asp Ser TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Phe Asp Phe Asp Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp IleGlu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu LysGly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60 50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr LeuSer Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 8065 70 75 80

Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys AlaGln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95 85 90 95

Arg Val Asn Met Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu ValArg Val Asn Met Asp Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110 100 105 110

Thr Val Ser SerThr Val Ser Ser

115 115

<210> 160<210> 160

<211> 124<211> 124

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 160<400> 160

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 151 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Arg Gly TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Arg Gly Tyr

20 25 30 20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe ValSer Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45 35 40 45

Ala Ala Ile Val Trp Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser ValAla Ala Ile Val Trp Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr CysLeu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Ala Lys Ile Arg Pro Tyr Ile Phe Lys Ile Ala Gly Gln Tyr AspAla Ala Lys Ile Arg Pro Tyr Ile Phe Lys Ile Ala Gly Gln Tyr Asp

100 105 110 100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 161<210> 161

<211> 354<211> 354

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 161<400> 161

Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly GlyGly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser Ser Gly Gly

1 5 10 151 5 10 15

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro SerSer Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

20 25 30 20 25 30

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val LysSer Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

35 40 45 35 40 45

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala LeuAsp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

50 55 60 50 55 60

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly LeuThr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

65 70 75 8065 70 75 80

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly ThrTyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

85 90 95 85 90 95

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys ValGln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

100 105 110 100 105 110

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys ProAsp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

115 120 125 115 120 125

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu PhePro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe Leu Phe

130 135 140 130 135 140

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu ValPro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

145 150 155 160145 150 155 160

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys PheThr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

165 170 175 165 170 175

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys ProAsn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

180 185 190 180 185 190

Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu ThrArg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

195 200 205 195 200 205

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys ValVal Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

210 215 220 210 215 220

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys AlaSer Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

225 230 235 240225 230 235 240

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser ArgLys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

245 250 255 245 250 255

Cys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys GlyCys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly

260 265 270 260 265 270

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln ProPhe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

275 280 285 275 280 285

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly SerGlu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

290 295 300 290 295 300

Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln GlnPhe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

305 310 315 320305 310 315 320

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn HisGly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

325 330 335 325 330 335

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Asp Tyr Lys Asp Asp AspTyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp

340 345 350 340 345 350

Asp LysAsp Lys

<210> 162<210> 162

<211> 629<211> 629

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 162<400> 162

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly GlyThr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140 130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

145 150 155 160145 150 155 160

Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala SerGly Pro Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

165 170 175 165 170 175

Gly Arg Thr Tyr Arg Gly Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala ProGly Arg Thr Tyr Arg Gly Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro

180 185 190 180 185 190

Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Val Trp Ser Gly Gly AsnGly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Val Trp Ser Gly Gly Asn

195 200 205 195 200 205

Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg AspThr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

210 215 220 210 215 220

Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro GluAsn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu

225 230 235 240225 230 235 240

Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Ile Arg Pro Tyr Ile PheAsp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Ile Arg Pro Tyr Ile Phe

245 250 255 245 250 255

Lys Ile Ala Gly Gln Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val ThrLys Ile Ala Gly Gln Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

260 265 270 260 265 270

Val Ser Ser Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly SerVal Ser Ser Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His Gly Ser

275 280 285 275 280 285

Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro LeuSer Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

290 295 300 290 295 300

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly CysAla Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

305 310 315 320305 310 315 320

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn SerLeu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

325 330 335 325 330 335

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln SerGly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

340 345 350 340 345 350

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser SerSer Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

355 360 365 355 360 365

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser AsnLeu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

370 375 380 370 375 380

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr HisThr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

385 390 395 400385 390 395 400

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys ValThr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val

405 410 415 405 410 415

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg ThrPhe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

420 425 430 420 425 430

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro GluPro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

435 440 445 435 440 445

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala LysVal Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

450 455 460 450 455 460

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val SerThr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

465 470 475 480465 470 475 480

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr LysVal Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

485 490 495 485 490 495

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr IleCys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

500 505 510 500 505 510

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu ProSer Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

515 520 525 515 520 525

Pro Ser Arg Cys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys AlaPro Ser Arg Cys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

530 535 540 530 535 540

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser AsnVal Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

545 550 555 560545 550 555 560

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp SerGly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

565 570 575 565 570 575

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser ArgAsp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

580 585 590 580 585 590

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala LeuTrp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

595 600 605 595 600 605

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Asp Tyr LysHis Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Asp Tyr Lys

610 615 620 610 615 620

Asp Asp Asp Asp LysAsp Asp Asp Asp Lys

625625

<210> 163<210> 163

<211> 118<211> 118

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 163<400> 163

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 151 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile AsnSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Asn

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val LysAla Leu Ile Ser Ser Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr LeuGly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 8065 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys LysGln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys

85 90 95 85 90 95

Arg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly ThrArg Phe Arg Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110 100 105 110

Leu Val Thr Val Ser SerLeu Val Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 164<210> 164

<211> 631<211> 631

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 164<400> 164

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerLeu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125 115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser GlyGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140 130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu SerGly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

145 150 155 160145 150 155 160

Gly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys AlaGly Gly Gly Pro Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

165 170 175 165 170 175

Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Arg Gly Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg GlnAla Ser Gly Arg Thr Tyr Arg Gly Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln

180 185 190 180 185 190

Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Val Trp Ser GlyAla Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Val Trp Ser Gly

195 200 205 195 200 205

Gly Asn Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile SerGly Asn Thr Tyr Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

210 215 220 210 215 220

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu LysArg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys

225 230 235 240225 230 235 240

Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Ile Arg Pro TyrPro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Ile Arg Pro Tyr

245 250 255 245 250 255

Ile Phe Lys Ile Ala Gly Gln Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr LeuIle Phe Lys Ile Ala Gly Gln Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

260 265 270 260 265 270

Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn HisVal Thr Val Ser Ser Gly Ser Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His

275 280 285 275 280 285

Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val PheGly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly ProThr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro

405 410 415 405 410 415

Lys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile SerLys Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg ValAla Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val

465 470 475 480465 470 475 480

485 490 495 485 490 495

500 505 510 500 505 510

515 520 525 515 520 525

Leu Pro Pro Ser Arg Cys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu SerLeu Pro Pro Ser Arg Cys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

530 535 540 530 535 540

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp GluCys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

545 550 555 560545 550 555 560

565 570 575 565 570 575

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp LysAsp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

580 585 590 580 585 590

595 600 605 595 600 605

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro AspAla Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Asp

610 615 620 610 615 620

Tyr Lys Asp Asp Asp Asp LysTyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

625 630625 630

<210> 165<210> 165

<211> 468<211> 468

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 165<400> 165

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Gly Ala Gly Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly Ala Gly Ser Thr LysGly Ala Gly Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly Ala Gly Ser Thr Lys

130 135 140 130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser GlyGly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

145 150 155 160145 150 155 160

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu ProGly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175 165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His ThrVal Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190 180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser ValPhe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205 195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys AsnVal Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

210 215 220 210 215 220

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu ProVal Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

225 230 235 240225 230 235 240

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro GluLys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

245 250 255 245 250 255

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys AspLeu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp GlyVal Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

290 295 300 290 295 300

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr AsnVal Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

305 310 315 320305 310 315 320

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp TrpSer Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

325 330 335 325 330 335

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu ProLeu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

340 345 350 340 345 350

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg GluAla Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser LysThr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Ser Leu Ser ProSer Leu Ser Pro

465465

<210> 166<210> 166

<211> 230<211> 230

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 166<400> 166

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro AlaGlu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 151 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys ProPro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30 20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val ValLys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45 35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr ValVal Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60 50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu GlnAsp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 8065 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His GlnTyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95 85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys AlaAsp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110 100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln ProLeu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125 115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu ThrArg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140 130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro SerLys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn TyrAsp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175 165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu TyrLys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190 180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val PheSer Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205 195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln LysSer Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220 210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser ProSer Leu Ser Leu Ser Pro

225 230225 230

<210> 167<210> 167

<211> 455<211> 455

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 167<400> 167

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys ArgIle Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro LysAla Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly GlnGly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn ValTyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProLys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 450 455

<210> 168<210> 168

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 168<400> 168

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 169<210> 169

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 169<400> 169

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 170<210> 170

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 170<400> 170

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 171<210> 171

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 171<400> 171

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 172<210> 172

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 172<400> 172

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 173<210> 173

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 173<400> 173

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 174<210> 174

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 174<400> 174

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 175<210> 175

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 175<400> 175

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 176<210> 176

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 176<400> 176

Thr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg GlyThr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 177<210> 177

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 177<400> 177

Thr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg GlyThr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 178<210> 178

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 178<400> 178

1 5 101 5 10

<210> 179<210> 179

<211> 467<211> 467

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 179<400> 179

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser ThrGlu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg Gly Ala Ser Thr Lys GlySer Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg Gly Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro LysAsn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp ThrArg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro SerAsn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

340 345 350 340 345 350

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu ProSer Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys SerThr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Leu Ser ProLeu Ser Pro

465465

<210> 180<210> 180

<211> 467<211> 467

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 180<400> 180

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln Arg Gly Ala Ser Thr Lys GlySer Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln Arg Gly Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Leu Ser ProLeu Ser Pro

465465

<210> 181<210> 181

<211> 467<211> 467

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 181<400> 181

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys GlySer Pro Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Leu Ser ProLeu Ser Pro

465465

<210> 182<210> 182

<211> 467<211> 467

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 182<400> 182

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys GlySer Gly Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Leu Ser ProLeu Ser Pro

465465

<210> 183<210> 183

<211> 467<211> 467

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 183<400> 183

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys GlySer Gln Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Leu Ser ProLeu Ser Pro

465465

<210> 184<210> 184

<211> 467<211> 467

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 184<400> 184

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys GlySer Ala Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Leu Ser ProLeu Ser Pro

465465

<210> 185<210> 185

<211> 467<211> 467

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 185<400> 185

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys GlySer Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Leu Ser ProLeu Ser Pro

465465

<210> 186<210> 186

<211> 467<211> 467

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 186<400> 186

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg Gly Ala Ser Thr Lys GlySer Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg Gly Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Leu Ser ProLeu Ser Pro

465465

<210> 187<210> 187

<211> 467<211> 467

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 187<400> 187

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys GlySer Ser Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Leu Ser ProLeu Ser Pro

465465

<210> 188<210> 188

<211> 467<211> 467

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 188<400> 188

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys GlySer Thr Thr Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Leu Ser ProLeu Ser Pro

465465

<210> 189<210> 189

<211> 467<211> 467

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 189<400> 189

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys GlySer Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Leu Ser ProLeu Ser Pro

465465

<210> 190<210> 190

<211> 127<211> 127

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 190<400> 190

1 5 10 151 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly ValAsp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val

35 40 45 35 40 45

Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Ala Ala Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro GluAla Ala Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu

100 105 110 100 105 110

Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerPhe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125 115 120 125

<210> 191<210> 191

<211> 455<211> 455

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 191<400> 191

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser AlaPhe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProLys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 450 455

<210> 192<210> 192

<211> 455<211> 455

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 192<400> 192

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Asp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAsp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProLys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 450 455

<210> 193<210> 193

<211> 16<211> 16

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 193<400> 193

Gly Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Leu Ala Gly Gly Gly Gly Gly SerGly Gly Gly Gly Ser Pro Leu Gly Leu Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 151 5 10 15

<210> 194<210> 194

<211> 18<211> 18

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 194<400> 194

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln Gly Gly GlyGly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln Gly Gly Gly

1 5 10 151 5 10 15

Gly SerGly Ser

<210> 195<210> 195

<211> 23<211> 23

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 195<400> 195

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser GlyGly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly

1 5 10 151 5 10 15

Ala Gly Gly Gly Gly Gly SerAla Gly Gly Gly Gly Gly Ser

20 20

<210> 196<210> 196

<211> 471<211> 471

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 196<400> 196

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProLys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470465 470

<210> 197<210> 197

<211> 473<211> 473

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 197<400> 197

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

Gly Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser SerGly Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro ProLys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

245 250 255 245 250 255

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe ProCys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala LysAsn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu GlyPhe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProThr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470465 470

<210> 198<210> 198

<211> 478<211> 478

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 198<400> 198

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe ProAla Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

145 150 155 160145 150 155 160

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu GlyLeu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

165 170 175 165 170 175

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp AsnCys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

180 185 190 180 185 190

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu GlnSer Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

195 200 205 195 200 205

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser SerSer Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

210 215 220 210 215 220

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro SerSer Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

225 230 235 240225 230 235 240

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys ThrAsn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

245 250 255 245 250 255

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro SerHis Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

260 265 270 260 265 270

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser ArgVal Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

275 280 285 275 280 285

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp ProThr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

290 295 300 290 295 300

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn AlaGlu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

305 310 315 320305 310 315 320

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val ValLys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

325 330 335 325 330 335

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu TyrSer Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

340 345 350 340 345 350

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys ThrLys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

355 360 365 355 360 365

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr LeuIle Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

370 375 380 370 375 380

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr CysPro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

385 390 395 400385 390 395 400

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu SerLeu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

405 410 415 405 410 415

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu AspAsn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

420 425 430 420 425 430

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys SerSer Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

435 440 445 435 440 445

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu AlaArg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

450 455 460 450 455 460

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProLeu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470 475465 470 475

<210> 199<210> 199

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 199<400> 199

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp LysAsp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 515

<210> 200<210> 200

<211> 1267<211> 1267

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 200<400> 200

Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu TrpMet Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 151 5 10 15

Pro Met Val Trp Ala Glu Ala Gly Leu Pro Arg Ala Gly Gly Gly SerPro Met Val Trp Ala Glu Ala Gly Leu Pro Arg Ala Gly Gly Gly Ser

20 25 30 20 25 30

Gln Pro Pro Phe Arg Thr Phe Ser Ala Ser Asp Trp Gly Leu Thr HisGln Pro Pro Phe Arg Thr Phe Ser Ala Ser Asp Trp Gly Leu Thr His

35 40 45 35 40 45

Leu Val Val His Glu Gln Thr Gly Glu Val Tyr Val Gly Ala Val AsnLeu Val Val His Glu Gln Thr Gly Glu Val Tyr Val Gly Ala Val Asn

50 55 60 50 55 60

Arg Ile Tyr Lys Leu Ser Gly Asn Leu Thr Leu Leu Arg Ala His ValArg Ile Tyr Lys Leu Ser Gly Asn Leu Thr Leu Leu Arg Ala His Val

65 70 75 8065 70 75 80

Thr Gly Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Cys Tyr Pro Pro Pro Ser ValThr Gly Pro Val Glu Asp Asn Glu Lys Cys Tyr Pro Pro Pro Ser Val

85 90 95 85 90 95

Gln Ser Cys Pro His Gly Leu Gly Ser Thr Asp Asn Val Asn Lys LeuGln Ser Cys Pro His Gly Leu Gly Ser Thr Asp Asn Val Asn Lys Leu

100 105 110 100 105 110

Leu Leu Leu Asp Tyr Ala Ala Asn Arg Leu Leu Ala Cys Gly Ser AlaLeu Leu Leu Asp Tyr Ala Ala Asn Arg Leu Leu Ala Cys Gly Ser Ala

115 120 125 115 120 125

Ser Gln Gly Ile Cys Gln Phe Leu Arg Leu Asp Asp Leu Phe Lys LeuSer Gln Gly Ile Cys Gln Phe Leu Arg Leu Asp Asp Leu Phe Lys Leu

130 135 140 130 135 140

Gly Glu Pro His His Arg Lys Glu His Tyr Leu Ser Ser Val Gln GluGly Glu Pro His His Arg Lys Glu His Tyr Leu Ser Ser Val Gln Glu

145 150 155 160145 150 155 160

Ala Gly Ser Met Ala Gly Val Leu Ile Ala Gly Pro Pro Gly Gln GlyAla Gly Ser Met Ala Gly Val Leu Ile Ala Gly Pro Pro Gly Gln Gly

165 170 175 165 170 175

Gln Ala Lys Leu Phe Val Gly Thr Pro Ile Asp Gly Lys Ser Glu TyrGln Ala Lys Leu Phe Val Gly Thr Pro Ile Asp Gly Lys Ser Glu Tyr

180 185 190 180 185 190

Phe Pro Thr Leu Ser Ser Arg Arg Leu Met Ala Asn Glu Glu Asp AlaPhe Pro Thr Leu Ser Ser Arg Arg Leu Met Ala Asn Glu Glu Asp Ala

195 200 205 195 200 205

Asp Met Phe Gly Phe Val Tyr Gln Asp Glu Phe Val Ser Ser Gln LeuAsp Met Phe Gly Phe Val Tyr Gln Asp Glu Phe Val Ser Ser Gln Leu

210 215 220 210 215 220

Lys Ile Pro Ser Asp Thr Leu Ser Lys Phe Pro Ala Phe Asp Ile TyrLys Ile Pro Ser Asp Thr Leu Ser Lys Phe Pro Ala Phe Asp Ile Tyr

225 230 235 240225 230 235 240

Tyr Val Tyr Ser Phe Arg Ser Glu Gln Phe Val Tyr Tyr Leu Thr LeuTyr Val Tyr Ser Phe Arg Ser Glu Gln Phe Val Tyr Tyr Leu Thr Leu

245 250 255 245 250 255

Gln Leu Asp Thr Gln Leu Thr Ser Pro Asp Ala Ala Gly Glu His PheGln Leu Asp Thr Gln Leu Thr Ser Pro Asp Ala Ala Gly Glu His Phe

260 265 270 260 265 270

Phe Thr Ser Lys Ile Val Arg Leu Cys Val Asp Asp Pro Lys Phe TyrPhe Thr Ser Lys Ile Val Arg Leu Cys Val Asp Asp Pro Lys Phe Tyr

275 280 285 275 280 285

Ser Tyr Val Glu Phe Pro Ile Gly Cys Glu Gln Ala Gly Val Glu TyrSer Tyr Val Glu Phe Pro Ile Gly Cys Glu Gln Ala Gly Val Glu Tyr

290 295 300 290 295 300

Arg Leu Val Gln Asp Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Gly Arg Ala Leu AlaArg Leu Val Gln Asp Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Gly Arg Ala Leu Ala

305 310 315 320305 310 315 320

His Gln Leu Gly Leu Ala Glu Asp Glu Asp Val Leu Phe Thr Val PheHis Gln Leu Gly Leu Ala Glu Asp Glu Asp Val Leu Phe Thr Val Phe

325 330 335 325 330 335

Ala Gln Gly Gln Lys Asn Arg Val Lys Pro Pro Lys Glu Ser Ala LeuAla Gln Gly Gln Lys Asn Arg Val Lys Pro Pro Lys Glu Ser Ala Leu

340 345 350 340 345 350

Cys Leu Phe Thr Leu Arg Ala Ile Lys Glu Lys Ile Lys Glu Arg IleCys Leu Phe Thr Leu Arg Ala Ile Lys Glu Lys Ile Lys Glu Arg Ile

355 360 365 355 360 365

Gln Ser Cys Tyr Arg Gly Glu Gly Lys Leu Ser Leu Pro Trp Leu LeuGln Ser Cys Tyr Arg Gly Glu Gly Lys Leu Ser Leu Pro Trp Leu Leu

370 375 380 370 375 380

Asn Lys Glu Leu Gly Cys Ile Asn Ser Pro Leu Gln Ile Asp Asp AspAsn Lys Glu Leu Gly Cys Ile Asn Ser Pro Leu Gln Ile Asp Asp Asp

385 390 395 400385 390 395 400

Phe Cys Gly Gln Asp Phe Asn Gln Pro Leu Gly Gly Thr Val Thr IlePhe Cys Gly Gln Asp Phe Asn Gln Pro Leu Gly Gly Thr Val Thr Ile

405 410 415 405 410 415

Glu Gly Thr Pro Leu Phe Val Asp Lys Asp Asp Gly Leu Thr Ala ValGlu Gly Thr Pro Leu Phe Val Asp Lys Asp Asp Gly Leu Thr Ala Val

420 425 430 420 425 430

Ala Ala Tyr Asp Tyr Arg Gly Arg Thr Val Val Phe Ala Gly Thr ArgAla Ala Tyr Asp Tyr Arg Gly Arg Thr Val Val Phe Ala Gly Thr Arg

435 440 445 435 440 445

Ser Gly Arg Ile Arg Lys Ile Leu Val Asp Leu Ser Asn Pro Gly GlySer Gly Arg Ile Arg Lys Ile Leu Val Asp Leu Ser Asn Pro Gly Gly

450 455 460 450 455 460

Arg Pro Ala Leu Ala Tyr Glu Ser Val Val Ala Gln Glu Gly Ser ProArg Pro Ala Leu Ala Tyr Glu Ser Val Val Ala Gln Glu Gly Ser Pro

465 470 475 480465 470 475 480

Ile Leu Arg Asp Leu Val Leu Ser Pro Asn His Gln Tyr Leu Tyr AlaIle Leu Arg Asp Leu Val Leu Ser Pro Asn His Gln Tyr Leu Tyr Ala

485 490 495 485 490 495

Met Thr Glu Lys Gln Val Thr Arg Val Pro Val Glu Ser Cys Val GlnMet Thr Glu Lys Gln Val Thr Arg Val Pro Val Glu Ser Cys Val Gln

500 505 510 500 505 510

Tyr Thr Ser Cys Glu Leu Cys Leu Gly Ser Arg Asp Pro His Cys GlyTyr Thr Ser Cys Glu Leu Cys Leu Gly Ser Arg Asp Pro His Cys Gly

515 520 525 515 520 525

Trp Cys Val Leu His Ser Ile Cys Ser Arg Arg Asp Ala Cys Glu ArgTrp Cys Val Leu His Ser Ile Cys Ser Arg Arg Asp Ala Cys Glu Arg

530 535 540 530 535 540

Ala Asp Glu Pro Gln Arg Phe Ala Ala Asp Leu Leu Gln Cys Val GlnAla Asp Glu Pro Gln Arg Phe Ala Ala Asp Leu Leu Gln Cys Val Gln

545 550 555 560545 550 555 560

Leu Thr Val Gln Pro Arg Asn Val Ser Val Thr Met Ser Gln Val ProLeu Thr Val Gln Pro Arg Asn Val Ser Val Thr Met Ser Gln Val Pro

565 570 575 565 570 575

Leu Val Leu Gln Ala Trp Asn Val Pro Asp Leu Ser Ala Gly Val AsnLeu Val Leu Gln Ala Trp Asn Val Pro Asp Leu Ser Ala Gly Val Asn

580 585 590 580 585 590

Cys Ser Phe Glu Asp Phe Thr Glu Ser Glu Ser Val Leu Glu Asp GlyCys Ser Phe Glu Asp Phe Thr Glu Ser Glu Ser Val Leu Glu Asp Gly

595 600 605 595 600 605

Arg Ile His Cys Arg Ser Pro Ser Ala Arg Glu Val Ala Pro Ile ThrArg Ile His Cys Arg Ser Pro Ser Ala Arg Glu Val Ala Pro Ile Thr

610 615 620 610 615 620

Arg Gly Gln Gly Asp Gln Arg Val Val Lys Leu Tyr Leu Lys Ser LysArg Gly Gln Gly Asp Gln Arg Val Val Lys Leu Tyr Leu Lys Ser Lys

625 630 635 640625 630 635 640

Glu Thr Gly Lys Lys Phe Ala Ser Val Asp Phe Val Phe Tyr Asn CysGlu Thr Gly Lys Lys Phe Ala Ser Val Asp Phe Val Phe Tyr Asn Cys

645 650 655 645 650 655

Ser Val His Gln Ser Cys Leu Ser Cys Val Asn Gly Ser Phe Pro CysSer Val His Gln Ser Cys Leu Ser Cys Val Asn Gly Ser Phe Pro Cys

660 665 670 660 665 670

His Trp Cys Lys Tyr Arg His Val Cys Thr His Asn Val Ala Asp CysHis Trp Cys Lys Tyr Arg His Val Cys Thr His Asn Val Ala Asp Cys

675 680 685 675 680 685

Ala Phe Leu Glu Gly Arg Val Asn Val Ser Glu Asp Cys Pro Gln IleAla Phe Leu Glu Gly Arg Val Asn Val Ser Glu Asp Cys Pro Gln Ile

690 695 700 690 695 700

Leu Pro Ser Thr Gln Ile Tyr Val Pro Val Gly Val Val Lys Pro IleLeu Pro Ser Thr Gln Ile Tyr Val Pro Val Gly Val Val Lys Pro Ile

705 710 715 720705 710 715 720

Thr Leu Ala Ala Arg Asn Leu Pro Gln Pro Gln Ser Gly Gln Arg GlyThr Leu Ala Ala Arg Asn Leu Pro Gln Pro Gln Ser Gly Gln Arg Gly

725 730 735 725 730 735

Tyr Glu Cys Leu Phe His Ile Pro Gly Ser Pro Ala Arg Val Thr AlaTyr Glu Cys Leu Phe His Ile Pro Gly Ser Pro Ala Arg Val Thr Ala

740 745 750 740 745 750

Leu Arg Phe Asn Ser Ser Ser Leu Gln Cys Gln Asn Ser Ser Tyr SerLeu Arg Phe Asn Ser Ser Ser Leu Gln Cys Gln Asn Ser Ser Tyr Ser

755 760 765 755 760 765

Tyr Glu Gly Asn Asp Val Ser Asp Leu Pro Val Asn Leu Ser Val ValTyr Glu Gly Asn Asp Val Ser Asp Leu Pro Val Asn Leu Ser Val Val

770 775 780 770 775 780

Trp Asn Gly Asn Phe Val Ile Asp Asn Pro Gln Asn Ile Gln Ala HisTrp Asn Gly Asn Phe Val Ile Asp Asn Pro Gln Asn Ile Gln Ala His

785 790 795 800785 790 795 800

Leu Tyr Lys Cys Pro Ala Leu Arg Glu Ser Cys Gly Leu Cys Leu LysLeu Tyr Lys Cys Pro Ala Leu Arg Glu Ser Cys Gly Leu Cys Leu Lys

805 810 815 805 810 815

Ala Asp Pro Arg Phe Glu Cys Gly Trp Cys Val Ala Glu Arg Arg CysAla Asp Pro Arg Phe Glu Cys Gly Trp Cys Val Ala Glu Arg Arg Cys

820 825 830 820 825 830

Ser Leu Arg His His Cys Ala Ala Asp Thr Pro Ala Ser Trp Met HisSer Leu Arg His His Cys Ala Ala Asp Thr Pro Ala Ser Trp Met His

835 840 845 835 840 845

Ala Arg His Gly Ser Ser Arg Cys Thr Asp Pro Lys Ile Leu Lys LeuAla Arg His Gly Ser Ser Arg Cys Thr Asp Pro Lys Ile Leu Lys Leu

850 855 860 850 855 860

Ser Pro Glu Thr Gly Pro Arg Gln Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile ThrSer Pro Glu Thr Gly Pro Arg Gln Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Thr

865 870 875 880865 870 875 880

Gly Glu Asn Leu Gly Leu Arg Phe Glu Asp Val Arg Leu Gly Val ArgGly Glu Asn Leu Gly Leu Arg Phe Glu Asp Val Arg Leu Gly Val Arg

885 890 895 885 890 895

Val Gly Lys Val Leu Cys Ser Pro Val Glu Ser Glu Tyr Ile Ser AlaVal Gly Lys Val Leu Cys Ser Pro Val Glu Ser Glu Tyr Ile Ser Ala

900 905 910 900 905 910

Glu Gln Ile Val Cys Glu Ile Gly Asp Ala Ser Ser Val Arg Ala HisGlu Gln Ile Val Cys Glu Ile Gly Asp Ala Ser Ser Val Arg Ala His

915 920 925 915 920 925

Asp Ala Leu Val Glu Val Cys Val Arg Asp Cys Ser Pro His Tyr ArgAsp Ala Leu Val Glu Val Cys Val Arg Asp Cys Ser Pro His Tyr Arg

930 935 940 930 935 940

Ala Leu Ser Pro Lys Arg Phe Thr Phe Val Thr Pro Thr Phe Tyr ArgAla Leu Ser Pro Lys Arg Phe Thr Phe Val Thr Pro Thr Phe Tyr Arg

945 950 955 960945 950 955 960

Val Ser Pro Ser Arg Gly Pro Leu Ser Gly Gly Thr Trp Ile Gly IleVal Ser Pro Ser Arg Gly Pro Leu Ser Gly Gly Thr Trp Ile Gly Ile

965 970 975 965 970 975

Glu Gly Ser His Leu Asn Ala Gly Ser Asp Val Ala Val Ser Val GlyGlu Gly Ser His Leu Asn Ala Gly Ser Asp Val Ala Val Ser Val Gly

980 985 990 980 985 990

Gly Arg Pro Cys Ser Phe Ser Trp Arg Asn Ser Arg Glu Ile Arg CysGly Arg Pro Cys Ser Phe Ser Trp Arg Asn Ser Arg Glu Ile Arg Cys

995 1000 1005 995 1000 1005

Leu Thr Pro Pro Gly Gln Ser Pro Gly Ser Ala Pro Ile Ile IleLeu Thr Pro Pro Gly Gln Ser Pro Gly Ser Ala Pro Ile Ile Ile

1010 1015 1020 1010 1015 1020

Asn Ile Asn Arg Ala Gln Leu Thr Asn Pro Glu Val Lys Tyr AsnAsn Ile Asn Arg Ala Gln Leu Thr Asn Pro Glu Val Lys Tyr Asn

1025 1030 1035 1025 1030 1035

Tyr Thr Glu Asp Pro Thr Ile Leu Arg Ile Asp Pro Glu Trp SerTyr Thr Glu Asp Pro Thr Ile Leu Arg Ile Asp Pro Glu Trp Ser

1040 1045 1050 1040 1045 1050

Ile Asn Ser Gly Gly Thr Leu Leu Thr Val Thr Gly Thr Asn LeuIle Asn Ser Gly Gly Thr Leu Leu Thr Val Thr Gly Thr Asn Leu

1055 1060 1065 1055 1060 1065

Ala Thr Val Arg Glu Pro Arg Ile Arg Ala Lys Tyr Gly Gly IleAla Thr Val Arg Glu Pro Arg Ile Arg Ala Lys Tyr Gly Gly Ile

1070 1075 1080 1070 1075 1080

Glu Arg Glu Asn Gly Cys Leu Val Tyr Asn Asp Thr Thr Met ValGlu Arg Glu Asn Gly Cys Leu Val Tyr Asn Asp Thr Thr Met Val

1085 1090 1095 1085 1090 1095

Cys Arg Ala Pro Ser Val Ala Asn Pro Val Arg Ser Pro Pro GluCys Arg Ala Pro Ser Val Ala Asn Pro Val Arg Ser Pro Pro Glu

1100 1105 1110 1100 1105 1110

Leu Gly Glu Arg Pro Asp Glu Leu Gly Phe Val Met Asp Asn ValLeu Gly Glu Arg Pro Asp Glu Leu Gly Phe Val Met Asp Asn Val

1115 1120 1125 1115 1120 1125

Arg Ser Leu Leu Val Leu Asn Ser Thr Ser Phe Leu Tyr Tyr ProArg Ser Leu Leu Val Leu Asn Ser Thr Ser Phe Leu Tyr Tyr Pro

1130 1135 1140 1130 1135 1140

Asp Pro Val Leu Glu Pro Leu Ser Pro Thr Gly Leu Leu Glu LeuAsp Pro Val Leu Glu Pro Leu Ser Pro Thr Gly Leu Leu Glu Leu

1145 1150 1155 1145 1150 1155

Lys Pro Ser Ser Pro Leu Ile Leu Lys Gly Arg Asn Leu Leu ProLys Pro Ser Ser Pro Leu Ile Leu Lys Gly Arg Asn Leu Leu Pro

1160 1165 1170 1160 1165 1170

Pro Ala Pro Gly Asn Ser Arg Leu Asn Tyr Thr Val Leu Ile GlyPro Ala Pro Gly Asn Ser Arg Leu Asn Tyr Thr Val Leu Ile Gly

1175 1180 1185 1175 1180 1185

Ser Thr Pro Cys Thr Leu Thr Val Ser Glu Thr Gln Leu Leu CysSer Thr Pro Cys Thr Leu Thr Val Ser Glu Thr Gln Leu Leu Cys

1190 1195 1200 1190 1195 1200

Glu Ala Pro Asn Leu Thr Gly Gln His Lys Val Thr Val Arg AlaGlu Ala Pro Asn Leu Thr Gly Gln His Lys Val Thr Val Arg Ala

1205 1210 1215 1205 1210 1215

Gly Gly Phe Glu Phe Ser Pro Gly Thr Leu Gln Val Tyr Ser AspGly Gly Phe Glu Phe Ser Pro Gly Thr Leu Gln Val Tyr Ser Asp

1220 1225 1230 1220 1225 1230

Ser Leu Leu Thr Leu Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys GlySer Leu Leu Thr Leu Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly

1235 1240 1245 1235 1240 1245

Gly Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys IleGly Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile

1250 1255 1260 1250 1255 1260

Glu Trp His GluGlu Trp His Glu

1265 1265

<210> 201<210> 201

<211> 347<211> 347

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 201<400> 201

Met Val Leu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Ile His Thr Met Leu Leu LeuMet Val Leu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Ile His Thr Met Leu Leu Leu

1 5 10 151 5 10 15

Leu Leu Met Leu Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Lys Asp Asn Thr ValLeu Leu Met Leu Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Lys Asp Asn Thr Val

20 25 30 20 25 30

Pro Leu Lys Leu Ile Ala Leu Leu Ala Asn Gly Glu Phe His Ser GlyPro Leu Lys Leu Ile Ala Leu Leu Ala Asn Gly Glu Phe His Ser Gly

35 40 45 35 40 45

Glu Gln Leu Gly Glu Thr Leu Gly Met Ser Arg Ala Ala Ile Asn LysGlu Gln Leu Gly Glu Thr Leu Gly Met Ser Arg Ala Ala Ile Asn Lys

50 55 60 50 55 60

His Ile Gln Thr Leu Arg Asp Trp Gly Val Asp Val Phe Thr Val ProHis Ile Gln Thr Leu Arg Asp Trp Gly Val Asp Val Phe Thr Val Pro

65 70 75 8065 70 75 80

Gly Lys Gly Tyr Ser Leu Pro Glu Pro Ile Gln Leu Leu Asn Ala LysGly Lys Gly Tyr Ser Leu Pro Glu Pro Ile Gln Leu Leu Asn Ala Lys

85 90 95 85 90 95

Gln Ile Leu Gly Gln Leu Asp Gly Gly Ser Val Ala Val Leu Pro ValGln Ile Leu Gly Gln Leu Asp Gly Gly Ser Val Ala Val Leu Pro Val

100 105 110 100 105 110

Ile Asp Ser Thr Asn Gln Tyr Leu Leu Asp Arg Ile Gly Glu Leu LysIle Asp Ser Thr Asn Gln Tyr Leu Leu Asp Arg Ile Gly Glu Leu Lys

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Asp Ala Cys Ile Ala Glu Tyr Gln Gln Ala Gly Arg Gly ArgSer Gly Asp Ala Cys Ile Ala Glu Tyr Gln Gln Ala Gly Arg Gly Arg

130 135 140 130 135 140

Arg Gly Arg Lys Trp Phe Ser Pro Phe Gly Ala Asn Leu Tyr Leu SerArg Gly Arg Lys Trp Phe Ser Pro Phe Gly Ala Asn Leu Tyr Leu Ser

145 150 155 160145 150 155 160

Met Phe Trp Arg Leu Glu Gln Gly Pro Ala Ala Ala Ile Gly Leu SerMet Phe Trp Arg Leu Glu Gln Gly Pro Ala Ala Ala Ile Gly Leu Ser

165 170 175 165 170 175

Leu Val Ile Gly Ile Val Met Ala Glu Val Leu Arg Lys Leu Gly AlaLeu Val Ile Gly Ile Val Met Ala Glu Val Leu Arg Lys Leu Gly Ala

180 185 190 180 185 190

Asp Lys Val Arg Val Lys Trp Pro Asn Asp Leu Tyr Leu Gln Asp ArgAsp Lys Val Arg Val Lys Trp Pro Asn Asp Leu Tyr Leu Gln Asp Arg

195 200 205 195 200 205

Lys Leu Ala Gly Ile Leu Val Glu Leu Thr Gly Lys Thr Gly Asp AlaLys Leu Ala Gly Ile Leu Val Glu Leu Thr Gly Lys Thr Gly Asp Ala

210 215 220 210 215 220

Ala Gln Ile Val Ile Gly Ala Gly Ile Asn Met Ala Met Arg Arg ValAla Gln Ile Val Ile Gly Ala Gly Ile Asn Met Ala Met Arg Arg Val

225 230 235 240225 230 235 240

Glu Glu Ser Val Val Asn Gln Gly Trp Ile Thr Leu Gln Glu Ala GlyGlu Glu Ser Val Val Asn Gln Gly Trp Ile Thr Leu Gln Glu Ala Gly

245 250 255 245 250 255

Ile Asn Leu Asp Arg Asn Thr Leu Ala Ala Met Leu Ile Arg Glu LeuIle Asn Leu Asp Arg Asn Thr Leu Ala Ala Met Leu Ile Arg Glu Leu

260 265 270 260 265 270

Arg Ala Ala Leu Glu Leu Phe Glu Gln Glu Gly Leu Ala Pro Tyr LeuArg Ala Ala Leu Glu Leu Phe Glu Gln Glu Gly Leu Ala Pro Tyr Leu

275 280 285 275 280 285

Ser Arg Trp Glu Lys Leu Asp Asn Phe Ile Asn Arg Pro Val Lys LeuSer Arg Trp Glu Lys Leu Asp Asn Phe Ile Asn Arg Pro Val Lys Leu

290 295 300 290 295 300

Ile Ile Gly Asp Lys Glu Ile Phe Gly Ile Ser Arg Gly Ile Asp LysIle Ile Gly Asp Lys Glu Ile Phe Gly Ile Ser Arg Gly Ile Asp Lys

305 310 315 320305 310 315 320

Gln Gly Ala Leu Leu Leu Glu Gln Asp Gly Ile Ile Lys Pro Trp MetGln Gly Ala Leu Leu Leu Glu Gln Asp Gly Ile Ile Lys Pro Trp Met

325 330 335 325 330 335

Gly Gly Glu Ile Ser Leu Arg Ser Ala Glu LysGly Gly Glu Ile Ser Leu Arg Ser Ala Glu Lys

340 345 340 345

<210> 202<210> 202

<211> 463<211> 463

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 202<400> 202

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val PheGly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

<210> 203<210> 203

<211> 465<211> 465

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 203<400> 203

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Gly Gly Pro Leu Gly Met Leu Ser Gln Ser Ser Thr Lys Gly Pro SerGly Gly Pro Leu Gly Met Leu Ser Gln Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

ProPro

465465

<210> 204<210> 204

<211> 461<211> 461

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 204<400> 204

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Pro Leu Gly Leu Trp Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro LeuPro Leu Gly Leu Trp Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser ValThr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val SerThr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys LeuPro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser ArgAsp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProHis Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460 450 455 460

<210> 205<210> 205

<211> 463<211> 463

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 205<400> 205

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val PheVal Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

<210> 206<210> 206

<211> 468<211> 468

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 206<400> 206

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Gly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly Ala Gly Ser Thr LysGly Ala Gly Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly Ala Gly Ser Thr Lys

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Ser Leu Ser ProSer Leu Ser Pro

465465

<210> 207<210> 207

<211> 471<211> 471

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 207<400> 207

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

Lys Ser Leu Ser Leu Ser ProLys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

465 470465 470

<210> 208<210> 208

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 208<400> 208

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 209<210> 209

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 209<400> 209

Thr Ser Glu Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Glu Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 210<210> 210

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 210<400> 210

Thr Ser Phe Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Phe Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 211<210> 211

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 211<400> 211

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 212<210> 212

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 212<400> 212

Thr Ser His Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser His Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 213<210> 213

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 213<400> 213

Thr Ser Lys Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Lys Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 214<210> 214

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 214<400> 214

Thr Ser Met Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Met Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 215<210> 215

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 215<400> 215

Thr Ser Asn Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Asn Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 216<210> 216

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 216<400> 216

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 217<210> 217

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 217<400> 217

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 218<210> 218

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 218<400> 218

Thr Ser Trp Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Trp Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 219<210> 219

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 219<400> 219

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 220<210> 220

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 220<400> 220

Thr Ser Thr Ala Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ala Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 221<210> 221

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 221<400> 221

Thr Ser Thr Asp Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Asp Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 222<210> 222

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 222<400> 222

Thr Ser Thr Glu Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Glu Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 223<210> 223

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 223<400> 223

Thr Ser Thr Phe Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Phe Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 224<210> 224

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 224<400> 224

Thr Ser Thr Leu Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Leu Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 225<210> 225

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 225<400> 225

Thr Ser Thr Met Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Met Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 226<210> 226

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 226<400> 226

Thr Ser Thr Pro Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Pro Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 227<210> 227

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 227<400> 227

Thr Ser Thr Gln Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Gln Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 228<210> 228

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 228<400> 228

Thr Ser Thr Val Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Val Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 229<210> 229

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 229<400> 229

Thr Ser Thr Trp Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Trp Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 230<210> 230

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 230<400> 230

Thr Ser Thr Ser Ala Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Ala Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 231<210> 231

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 231<400> 231

Thr Ser Thr Ser Glu Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Glu Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 232<210> 232

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 232<400> 232

Thr Ser Thr Ser Phe Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Phe Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 233<210> 233

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 233<400> 233

Thr Ser Thr Ser His Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser His Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 234<210> 234

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 234<400> 234

Thr Ser Thr Ser Ile Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Ile Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 235<210> 235

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 235<400> 235

Thr Ser Thr Ser Lys Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Lys Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 236<210> 236

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 236<400> 236

Thr Ser Thr Ser Leu Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Leu Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 237<210> 237

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 237<400> 237

Thr Ser Thr Ser Met Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Met Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 238<210> 238

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 238<400> 238

Thr Ser Thr Ser Asn Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Asn Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 239<210> 239

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 239<400> 239

Thr Ser Thr Ser Pro Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Pro Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 240<210> 240

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 240<400> 240

Thr Ser Thr Ser Gln Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gln Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 241<210> 241

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 241<400> 241

Thr Ser Thr Ser Arg Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Arg Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 242<210> 242

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 242<400> 242

Thr Ser Thr Ser Thr Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Thr Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 243<210> 243

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 243<400> 243

Thr Ser Thr Ser Val Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Val Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 244<210> 244

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 244<400> 244

Thr Ser Thr Ser Trp Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Trp Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 245<210> 245

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 245<400> 245

Thr Ser Thr Ser Tyr Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Tyr Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 246<210> 246

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 246<400> 246

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ala Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ala Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 247<210> 247

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 247<400> 247

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Asp Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Asp Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 248<210> 248

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 248<400> 248

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Glu Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Glu Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 249<210> 249

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 249<400> 249

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Gly Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Gly Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 250<210> 250

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 250<400> 250

Thr Ser Thr Ser Gly Arg His Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg His Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 251<210> 251

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 251<400> 251

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ile Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ile Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 252<210> 252

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 252<400> 252

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Lys Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Lys Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 253<210> 253

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 253<400> 253

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Leu Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Leu Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 254<210> 254

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 254<400> 254

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Met Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Met Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 255<210> 255

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 255<400> 255

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Asn Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Asn Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 256<210> 256

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 256<400> 256

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Pro Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Pro Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 257<210> 257

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 257<400> 257

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Gln Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Gln Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 258<210> 258

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 258<400> 258

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Arg Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Arg Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 259<210> 259

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 259<400> 259

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Thr Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Thr Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 260<210> 260

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 260<400> 260

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Val Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Val Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 261<210> 261

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 261<400> 261

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Trp Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Trp Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 262<210> 262

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 262<400> 262

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Tyr Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Tyr Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 263<210> 263

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 263<400> 263

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 264<210> 264

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 264<400> 264

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Phe Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Phe Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 265<210> 265

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 265<400> 265

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Lys Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Lys Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 266<210> 266

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 266<400> 266

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Met Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Met Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 267<210> 267

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 267<400> 267

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Asn Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Asn Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 268<210> 268

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 268<400> 268

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Pro Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Pro Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 269<210> 269

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 269<400> 269

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Gln Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Gln Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 270<210> 270

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 270<400> 270

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Arg Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Arg Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 271<210> 271

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 271<400> 271

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ser Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ser Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 272<210> 272

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 272<400> 272

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Trp Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Trp Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 273<210> 273

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 273<400> 273

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Tyr Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Tyr Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 274<210> 274

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 274<400> 274

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ala Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ala Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 275<210> 275

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 275<400> 275

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asp Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asp Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 276<210> 276

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 276<400> 276

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 277<210> 277

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 277<400> 277

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Phe Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Phe Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 278<210> 278

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 278<400> 278

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 279<210> 279

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 279<400> 279

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Lys Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Lys Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 280<210> 280

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 280<400> 280

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Leu Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Leu Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 281<210> 281

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 281<400> 281

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Met Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Met Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 282<210> 282

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 282<400> 282

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Pro Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Pro Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 283<210> 283

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 283<400> 283

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Gln Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Gln Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 284<210> 284

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 284<400> 284

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 285<210> 285

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 285<400> 285

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Trp Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Trp Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 286<210> 286

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 286<400> 286

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 287<210> 287

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 287<400> 287

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 288<210> 288

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 288<400> 288

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Asp Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Asp Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 289<210> 289

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 289<400> 289

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Glu Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Glu Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 290<210> 290

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 290<400> 290

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 291<210> 291

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 291<400> 291

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gly Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gly Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 292<210> 292

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 292<400> 292

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 293<210> 293

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 293<400> 293

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Lys Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Lys Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 294<210> 294

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 294<400> 294

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Asn Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Asn Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 295<210> 295

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 295<400> 295

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 296<210> 296

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 296<400> 296

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ser Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ser Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 297<210> 297

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 297<400> 297

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Thr Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Thr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 298<210> 298

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 298<400> 298

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Trp Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Trp Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 299<210> 299

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 299<400> 299

Thr Ser Asp Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Asp Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 300<210> 300

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 300<400> 300

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 301<210> 301

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 301<400> 301

Thr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 302<210> 302

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 302<400> 302

Thr Ser Thr His Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr His Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 303<210> 303

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 303<400> 303

Thr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 304<210> 304

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 304<400> 304

Thr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 305<210> 305

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 305<400> 305

Thr Ser Thr Tyr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Tyr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 306<210> 306

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 306<400> 306

Thr Ser Thr Ser Asp Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Asp Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 307<210> 307

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 307<400> 307

Thr Ser Thr Ser Ser Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Ser Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 308<210> 308

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 308<400> 308

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Phe Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Phe Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 309<210> 309

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 309<400> 309

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Asp Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Asp Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 310<210> 310

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 310<400> 310

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser His Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser His Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 311<210> 311

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 311<400> 311

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ile Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ile Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 312<210> 312

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 312<400> 312

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Leu Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Leu Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 313<210> 313

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 313<400> 313

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Thr Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Thr Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 314<210> 314

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 314<400> 314

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Val Asn Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Val Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 315<210> 315

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 315<400> 315

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 316<210> 316

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 316<400> 316

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 317<210> 317

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 317<400> 317

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Arg Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Arg Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 318<210> 318

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 318<400> 318

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 319<210> 319

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 319<400> 319

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 320<210> 320

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 320<400> 320

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 321<210> 321

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 321<400> 321

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Leu Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Leu Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 322<210> 322

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 322<400> 322

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Met Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Met Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 323<210> 323

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 323<400> 323

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Arg Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Arg Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 324<210> 324

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 324<400> 324

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 325<210> 325

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 325<400> 325

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 326<210> 326

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 326<400> 326

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 327<210> 327

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 327<400> 327

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 328<210> 328

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 328<400> 328

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 329<210> 329

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 329<400> 329

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 330<210> 330

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 330<400> 330

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 331<210> 331

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 331<400> 331

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ser Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ser Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 332<210> 332

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 332<400> 332

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 333<210> 333

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 333<400> 333

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 334<210> 334

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 334<400> 334

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 335<210> 335

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 335<400> 335

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 336<210> 336

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 336<400> 336

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 337<210> 337

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 337<400> 337

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ser Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ser Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 338<210> 338

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 338<400> 338

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 339<210> 339

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 339<400> 339

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 340<210> 340

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 340<400> 340

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 341<210> 341

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 341<400> 341

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 342<210> 342

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 342<400> 342

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 343<210> 343

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 343<400> 343

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ser Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ser Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 344<210> 344

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 344<400> 344

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 345<210> 345

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 345<400> 345

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 346<210> 346

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 346<400> 346

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 347<210> 347

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 347<400> 347

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 348<210> 348

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 348<400> 348

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 349<210> 349

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 349<400> 349

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 350<210> 350

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 350<400> 350

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ser Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ser Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 351<210> 351

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 351<400> 351

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 352<210> 352

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 352<400> 352

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 353<210> 353

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 353<400> 353

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 354<210> 354

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 354<400> 354

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 355<210> 355

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 355<400> 355

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 356<210> 356

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 356<400> 356

Thr Ser His Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro Arg GlyThr Ser His Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 357<210> 357

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 357<400> 357

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Gln Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Gln Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 358<210> 358

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 358<400> 358

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Ala Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Ala Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 359<210> 359

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 359<400> 359

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Ile Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Ile Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 360<210> 360

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 360<400> 360

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Phe Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Phe Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 361<210> 361

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 361<400> 361

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Ser Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Ser Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 362<210> 362

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 362<400> 362

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 363<210> 363

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 363<400> 363

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 364<210> 364

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 364<400> 364

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 365<210> 365

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 365<400> 365

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 366<210> 366

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 366<400> 366

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 367<210> 367

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 367<400> 367

Thr Ser His Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro Arg GlyThr Ser His Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 368<210> 368

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 368<400> 368

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Gln Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Gln Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 369<210> 369

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 369<400> 369

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Ala Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Ala Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 370<210> 370

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 370<400> 370

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Ile Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Ile Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 371<210> 371

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 371<400> 371

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Phe Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Phe Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 372<210> 372

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 372<400> 372

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Ser Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Ser Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 373<210> 373

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 373<400> 373

Thr Ser Gly Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Gly Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 374<210> 374

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 374<400> 374

Thr Ser Gly Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Gly Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 375<210> 375

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 375<400> 375

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 376<210> 376

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 376<400> 376

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 377<210> 377

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 377<400> 377

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 378<210> 378

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 378<400> 378

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 379<210> 379

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 379<400> 379

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 380<210> 380

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 380<400> 380

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 381<210> 381

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 381<400> 381

Thr Ser Gln Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Gln Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 382<210> 382

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 382<400> 382

Thr Ser Gln Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Gln Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 383<210> 383

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 383<400> 383

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 384<210> 384

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 384<400> 384

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 385<210> 385

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 385<400> 385

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 386<210> 386

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 386<400> 386

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 387<210> 387

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 387<400> 387

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 388<210> 388

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 388<400> 388

Thr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg GlyThr Ser Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 389<210> 389

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 389<400> 389

Thr Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 390<210> 390

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 390<400> 390

Thr Ser Pro Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Pro Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 391<210> 391

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 391<400> 391

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 392<210> 392

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 392<400> 392

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 393<210> 393

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 393<400> 393

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 394<210> 394

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 394<400> 394

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 395<210> 395

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 395<400> 395

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 396<210> 396

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 396<400> 396

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 397<210> 397

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 397<400> 397

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 398<210> 398

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 398<400> 398

Thr Ser Ala Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Ala Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 399<210> 399

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 399<400> 399

Thr Ser Ala Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Ala Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 400<210> 400

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 400<400> 400

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 401<210> 401

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 401<400> 401

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 402<210> 402

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 402<400> 402

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 403<210> 403

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 403<400> 403

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 404<210> 404

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 404<400> 404

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 405<210> 405

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 405<400> 405

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 406<210> 406

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 406<400> 406

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 407<210> 407

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 407<400> 407

Thr Ser Tyr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Tyr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 408<210> 408

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 408<400> 408

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 409<210> 409

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 409<400> 409

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 410<210> 410

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 410<400> 410

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 411<210> 411

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 411<400> 411

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 412<210> 412

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 412<400> 412

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 413<210> 413

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 413<400> 413

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 414<210> 414

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 414<400> 414

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 415<210> 415

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 415<400> 415

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 416<210> 416

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 416<400> 416

Thr Ser Ser Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Ser Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 417<210> 417

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 417<400> 417

Thr Ser Ser Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Ser Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 418<210> 418

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 418<400> 418

Thr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg GlyThr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 419<210> 419

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 419<400> 419

Thr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg GlyThr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 420<210> 420

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 420<400> 420

Thr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg GlyThr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 421<210> 421

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 421<400> 421

Thr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg GlyThr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 422<210> 422

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 422<400> 422

Thr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg GlyThr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 423<210> 423

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 423<400> 423

Thr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg GlyThr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 424<210> 424

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 424<400> 424

Thr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg GlyThr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 425<210> 425

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 425<400> 425

Thr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg GlyThr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 426<210> 426

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 426<400> 426

Thr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg GlyThr Ser Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 427<210> 427

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 427<400> 427

Thr Ser Ile Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Ile Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 428<210> 428

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 428<400> 428

Thr Ser Ile Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg GlyThr Ser Ile Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 429<210> 429

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 429<400> 429

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 430<210> 430

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 430<400> 430

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 431<210> 431

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 431<400> 431

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 432<210> 432

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 432<400> 432

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 433<210> 433

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 433<400> 433

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala His Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 434<210> 434

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 434<400> 434

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 435<210> 435

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 435<400> 435

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 436<210> 436

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 436<400> 436

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 437<210> 437

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 437<400> 437

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 438<210> 438

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 438<400> 438

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 439<210> 439

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 439<400> 439

Thr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg GlyThr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 440<210> 440

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 440<400> 440

Thr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg GlyThr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 441<210> 441

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 441<400> 441

Thr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg GlyThr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 442<210> 442

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 442<400> 442

Thr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala His Pro Arg GlyThr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala His Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 443<210> 443

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 443<400> 443

Thr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg GlyThr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 444<210> 444

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 444<400> 444

Thr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg GlyThr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 445<210> 445

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 445<400> 445

Thr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg GlyThr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 446<210> 446

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 446<400> 446

Thr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg GlyThr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 447<210> 447

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 447<400> 447

Thr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn His Arg GlyThr Ser Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 448<210> 448

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 448<400> 448

Thr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg GlyThr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 449<210> 449

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 449<400> 449

Thr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg GlyThr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Ile Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 450<210> 450

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 450<400> 450

Thr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg GlyThr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 451<210> 451

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 451<400> 451

Thr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg GlyThr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Ser Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 452<210> 452

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 452<400> 452

Thr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala His Pro Arg GlyThr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala His Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 453<210> 453

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 453<400> 453

Thr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg GlyThr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Ala Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 454<210> 454

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 454<400> 454

Thr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg GlyThr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Phe Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 455<210> 455

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 455<400> 455

Thr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg GlyThr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 456<210> 456

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 456<400> 456

Thr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg GlyThr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 457<210> 457

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 457<400> 457

Thr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn His Arg GlyThr Ser Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 458<210> 458

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 458<400> 458

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Val Tyr Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Val Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 459<210> 459

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 459<400> 459

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Val Val Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Val Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 460<210> 460

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 460<400> 460

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Val His Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Val His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 461<210> 461

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 461<400> 461

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Tyr Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 462<210> 462

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 462<400> 462

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Val Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 463<210> 463

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 463<400> 463

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ile His Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ile His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 464<210> 464

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 464<400> 464

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ser Tyr Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ser Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 465<210> 465

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 465<400> 465

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ser Val Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ser Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 466<210> 466

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 466<400> 466

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ser His Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ser His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 467<210> 467

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 467<400> 467

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala His Tyr Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala His Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 468<210> 468

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 468<400> 468

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala His Val Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala His Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 469<210> 469

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 469<400> 469

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala His His Arg GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala His His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 470<210> 470

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 470<400> 470

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Glu Val Pro Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Glu Val Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 471<210> 471

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 471<400> 471

1 5 101 5 10

<210> 472<210> 472

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 472<400> 472

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Arg GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 473<210> 473

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 473<400> 473

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Glu Asn Ala Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Glu Asn Ala Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 474<210> 474

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 474<400> 474

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Glu Ala Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Glu Ala Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 475<210> 475

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 475<400> 475

Thr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Gly Ala Arg GlyThr Ser Ala Ser Gly Arg Ser Ala Gly Ala Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 476<210> 476

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 476<400> 476

Thr Ser Gly Thr Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg GlyThr Ser Gly Thr Gly Arg Ser Ala Thr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 477<210> 477

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 477<400> 477

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Thr Tyr Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Thr Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 478<210> 478

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 478<400> 478

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Thr Val Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Thr Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 479<210> 479

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 479<400> 479

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Thr His Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Ala Thr His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 480<210> 480

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 480<400> 480

Thr Ser Gly Thr Gly Arg Ser Ala Thr Tyr Arg GlyThr Ser Gly Thr Gly Arg Ser Ala Thr Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 481<210> 481

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 481<400> 481

Thr Ser Gly Thr Gly Arg Ser Ala Thr Val Arg GlyThr Ser Gly Thr Gly Arg Ser Ala Thr Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 482<210> 482

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 482<400> 482

Thr Ser Gly Thr Gly Arg Ser Ala Thr His Arg GlyThr Ser Gly Thr Gly Arg Ser Ala Thr His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 483<210> 483

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 483<400> 483

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Glu Thr Pro Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Glu Thr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 484<210> 484

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 484<400> 484

Thr Ser Gly Thr Gly Arg Ser Glu Thr Pro Arg GlyThr Ser Gly Thr Gly Arg Ser Glu Thr Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 485<210> 485

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 485<400> 485

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Glu Thr Tyr Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Glu Thr Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 486<210> 486

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 486<400> 486

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Glu Thr Val Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Glu Thr Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 487<210> 487

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 487<400> 487

Thr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Glu Thr His Arg GlyThr Ser Gly Ser Gly Arg Ser Glu Thr His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 488<210> 488

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 488<400> 488

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 489<210> 489

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 489<400> 489

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Tyr Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 490<210> 490

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 490<400> 490

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Val Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 491<210> 491

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 491<400> 491

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val His Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 492<210> 492

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 492<400> 492

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Arg GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 493<210> 493

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 493<400> 493

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Arg GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 494<210> 494

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 494<400> 494

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Arg GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 495<210> 495

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 495<400> 495

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Glu Val Pro Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Glu Val Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 496<210> 496

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 496<400> 496

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Glu Val Pro Arg GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Glu Val Pro Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 497<210> 497

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 497<400> 497

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Glu Val Tyr Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Glu Val Tyr Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 498<210> 498

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 498<400> 498

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Glu Val Val Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Glu Val Val Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 499<210> 499

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 499<400> 499

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Glu Val His Arg GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Glu Val His Arg Gly

1 5 101 5 10

<210> 500<210> 500

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 500<400> 500

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Gly GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Gly Gly

1 5 101 5 10

<210> 501<210> 501

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 501<400> 501

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Tyr Gly GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Tyr Gly Gly

1 5 101 5 10

<210> 502<210> 502

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 502<400> 502

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Val Gly GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Val Gly Gly

1 5 101 5 10

<210> 503<210> 503

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 503<400> 503

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val His Gly GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val His Gly Gly

1 5 101 5 10

<210> 504<210> 504

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 504<400> 504

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Gly GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Gly Gly

1 5 101 5 10

<210> 505<210> 505

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 505<400> 505

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Gly GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Gly Gly

1 5 101 5 10

<210> 506<210> 506

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 506<400> 506

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Gly GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Gly Gly

1 5 101 5 10

<210> 507<210> 507

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 507<400> 507

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn ProAla Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 508<210> 508

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 508<400> 508

Glu Ser Gly Arg Ser Ala Asn ProGlu Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 509<210> 509

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 509<400> 509

Phe Ser Gly Arg Ser Ala Asn ProPhe Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 510<210> 510

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 510<400> 510

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn ProGly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 511<210> 511

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 511<400> 511

His Ser Gly Arg Ser Ala Asn ProHis Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 512<210> 512

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 512<400> 512

Lys Ser Gly Arg Ser Ala Asn ProLys Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 513<210> 513

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 513<400> 513

Met Ser Gly Arg Ser Ala Asn ProMet Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 514<210> 514

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 514<400> 514

Asn Ser Gly Arg Ser Ala Asn ProAsn Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 515<210> 515

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 515<400> 515

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn ProPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 516<210> 516

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 516<400> 516

Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn ProGln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 517<210> 517

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 517<400> 517

Trp Ser Gly Arg Ser Ala Asn ProTrp Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 518<210> 518

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 518<400> 518

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn ProTyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 519<210> 519

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 519<400> 519

Thr Ala Gly Arg Ser Ala Asn ProThr Ala Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 520<210> 520

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 520<400> 520

Thr Asp Gly Arg Ser Ala Asn ProThr Asp Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 521<210> 521

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 521<400> 521

Thr Glu Gly Arg Ser Ala Asn ProThr Glu Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 522<210> 522

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 522<400> 522

Thr Phe Gly Arg Ser Ala Asn ProThr Phe Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 523<210> 523

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 523<400> 523

Thr Leu Gly Arg Ser Ala Asn ProThr Leu Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 524<210> 524

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 524<400> 524

Thr Met Gly Arg Ser Ala Asn ProThr Met Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 525<210> 525

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 525<400> 525

Thr Pro Gly Arg Ser Ala Asn ProThr Pro Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 526<210> 526

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 526<400> 526

Thr Gln Gly Arg Ser Ala Asn ProThr Gln Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 527<210> 527

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 527<400> 527

Thr Val Gly Arg Ser Ala Asn ProThr Val Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 528<210> 528

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 528<400> 528

Thr Trp Gly Arg Ser Ala Asn ProThr Trp Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 529<210> 529

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 529<400> 529

Thr Ser Ala Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Ala Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 530<210> 530

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 530<400> 530

Thr Ser Glu Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Glu Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 531<210> 531

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 531<400> 531

Thr Ser Phe Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Phe Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 532<210> 532

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 532<400> 532

Thr Ser His Arg Ser Ala Asn ProThr Ser His Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 533<210> 533

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 533<400> 533

Thr Ser Ile Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Ile Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 534<210> 534

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 534<400> 534

Thr Ser Lys Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Lys Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 535<210> 535

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 535<400> 535

Thr Ser Leu Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Leu Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 536<210> 536

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 536<400> 536

Thr Ser Met Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Met Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 537<210> 537

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 537<400> 537

Thr Ser Asn Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Asn Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 538<210> 538

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 538<400> 538

Thr Ser Pro Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Pro Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 539<210> 539

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 539<400> 539

Thr Ser Gln Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Gln Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 540<210> 540

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 540<400> 540

Thr Ser Arg Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Arg Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 541<210> 541

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 541<400> 541

Thr Ser Thr Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Thr Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 542<210> 542

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 542<400> 542

Thr Ser Val Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Val Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 543<210> 543

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 543<400> 543

Thr Ser Trp Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Trp Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 544<210> 544

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 544<400> 544

Thr Ser Tyr Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Tyr Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 545<210> 545

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 545<400> 545

Thr Ser Gly Arg Ala Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Ala Ala Asn Pro

1 515

<210> 546<210> 546

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 546<400> 546

Thr Ser Gly Arg Asp Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Asp Ala Asn Pro

1 515

<210> 547<210> 547

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 547<400> 547

Thr Ser Gly Arg Glu Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Glu Ala Asn Pro

1 515

<210> 548<210> 548

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 548<400> 548

Thr Ser Gly Arg Gly Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Gly Ala Asn Pro

1 515

<210> 549<210> 549

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 549<400> 549

Thr Ser Gly Arg His Ala Asn ProThr Ser Gly Arg His Ala Asn Pro

1 515

<210> 550<210> 550

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 550<400> 550

Thr Ser Gly Arg Ile Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Ile Ala Asn Pro

1 515

<210> 551<210> 551

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 551<400> 551

Thr Ser Gly Arg Lys Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Lys Ala Asn Pro

1 515

<210> 552<210> 552

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 552<400> 552

Thr Ser Gly Arg Leu Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Leu Ala Asn Pro

1 515

<210> 553<210> 553

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 553<400> 553

Thr Ser Gly Arg Met Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Met Ala Asn Pro

1 515

<210> 554<210> 554

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 554<400> 554

Thr Ser Gly Arg Asn Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Asn Ala Asn Pro

1 515

<210> 555<210> 555

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 555<400> 555

Thr Ser Gly Arg Pro Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Pro Ala Asn Pro

1 515

<210> 556<210> 556

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 556<400> 556

Thr Ser Gly Arg Gln Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Gln Ala Asn Pro

1 515

<210> 557<210> 557

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 557<400> 557

Thr Ser Gly Arg Arg Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Arg Ala Asn Pro

1 515

<210> 558<210> 558

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 558<400> 558

Thr Ser Gly Arg Thr Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Thr Ala Asn Pro

1 515

<210> 559<210> 559

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 559<400> 559

Thr Ser Gly Arg Val Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Val Ala Asn Pro

1 515

<210> 560<210> 560

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 560<400> 560

Thr Ser Gly Arg Trp Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Trp Ala Asn Pro

1 515

<210> 561<210> 561

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 561<400> 561

Thr Ser Gly Arg Tyr Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Tyr Ala Asn Pro

1 515

<210> 562<210> 562

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 562<400> 562

Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro

1 515

<210> 563<210> 563

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 563<400> 563

Thr Ser Gly Arg Ser Phe Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Phe Asn Pro

1 515

<210> 564<210> 564

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 564<400> 564

Thr Ser Gly Arg Ser Lys Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Lys Asn Pro

1 515

<210> 565<210> 565

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 565<400> 565

Thr Ser Gly Arg Ser Met Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Met Asn Pro

1 515

<210> 566<210> 566

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 566<400> 566

Thr Ser Gly Arg Ser Asn Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Asn Asn Pro

1 515

<210> 567<210> 567

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 567<400> 567

Thr Ser Gly Arg Ser Pro Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Pro Asn Pro

1 515

<210> 568<210> 568

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 568<400> 568

Thr Ser Gly Arg Ser Gln Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Gln Asn Pro

1 515

<210> 569<210> 569

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 569<400> 569

Thr Ser Gly Arg Ser Arg Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Arg Asn Pro

1 515

<210> 570<210> 570

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 570<400> 570

Thr Ser Gly Arg Ser Ser Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Ser Asn Pro

1 515

<210> 571<210> 571

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 571<400> 571

Thr Ser Gly Arg Ser Trp Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Trp Asn Pro

1 515

<210> 572<210> 572

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 572<400> 572

Thr Ser Gly Arg Ser Tyr Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Tyr Asn Pro

1 515

<210> 573<210> 573

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 573<400> 573

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ala ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Ala Pro

1 515

<210> 574<210> 574

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 574<400> 574

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asp ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Asp Pro

1 515

<210> 575<210> 575

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 575<400> 575

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro

1 515

<210> 576<210> 576

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 576<400> 576

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Phe ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Phe Pro

1 515

<210> 577<210> 577

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 577<400> 577

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Gly ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro

1 515

<210> 578<210> 578

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 578<400> 578

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Lys ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Lys Pro

1 515

<210> 579<210> 579

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 579<400> 579

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Leu ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Leu Pro

1 515

<210> 580<210> 580

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 580<400> 580

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Met ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Met Pro

1 515

<210> 581<210> 581

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 581<400> 581

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Pro ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Pro Pro

1 515

<210> 582<210> 582

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 582<400> 582

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Gln ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Gln Pro

1 515

<210> 583<210> 583

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 583<400> 583

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Val ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro

1 515

<210> 584<210> 584

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 584<400> 584

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Trp ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Trp Pro

1 515

<210> 585<210> 585

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 585<400> 585

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Tyr ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro

1 515

<210> 586<210> 586

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 586<400> 586

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn AlaThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala

1 515

<210> 587<210> 587

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 587<400> 587

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn AspThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Asp

1 515

<210> 588<210> 588

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 588<400> 588

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn GluThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Glu

1 515

<210> 589<210> 589

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 589<400> 589

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn PheThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe

1 515

<210> 590<210> 590

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 590<400> 590

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn GlyThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gly

1 515

<210> 591<210> 591

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 591<400> 591

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn IleThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile

1 515

<210> 592<210> 592

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 592<400> 592

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn LysThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Lys

1 515

<210> 593<210> 593

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 593<400> 593

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn AsnThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Asn

1 515

<210> 594<210> 594

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 594<400> 594

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn GlnThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln

1 515

<210> 595<210> 595

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 595<400> 595

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn SerThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ser

1 515

<210> 596<210> 596

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 596<400> 596

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn ThrThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Thr

1 515

<210> 597<210> 597

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 597<400> 597

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn TrpThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Trp

1 515

<210> 598<210> 598

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 598<400> 598

Asp Ser Gly Arg Ser Ala Asn ProAsp Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 599<210> 599

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 599<400> 599

Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn ProIle Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 600<210> 600

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 600<400> 600

Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn ProSer Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 601<210> 601

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 601<400> 601

Thr His Gly Arg Ser Ala Asn ProThr His Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 602<210> 602

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 602<400> 602

Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn ProThr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 603<210> 603

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 603<400> 603

Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn ProThr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 604<210> 604

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 604<400> 604

Thr Tyr Gly Arg Ser Ala Asn ProThr Tyr Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 605<210> 605

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 605<400> 605

Thr Ser Asp Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Asp Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 606<210> 606

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 606<400> 606

Thr Ser Ser Arg Ser Ala Asn ProThr Ser Ser Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 607<210> 607

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 607<400> 607

Thr Ser Gly Arg Phe Ala Asn ProThr Ser Gly Arg Phe Ala Asn Pro

1 515

<210> 608<210> 608

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 608<400> 608

Thr Ser Gly Arg Ser Asp Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Asp Asn Pro

1 515

<210> 609<210> 609

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 609<400> 609

Thr Ser Gly Arg Ser His Asn ProThr Ser Gly Arg Ser His Asn Pro

1 515

<210> 610<210> 610

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 610<400> 610

Thr Ser Gly Arg Ser Ile Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Ile Asn Pro

1 515

<210> 611<210> 611

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 611<400> 611

Thr Ser Gly Arg Ser Leu Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Leu Asn Pro

1 515

<210> 612<210> 612

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 612<400> 612

Thr Ser Gly Arg Ser Thr Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Thr Asn Pro

1 515

<210> 613<210> 613

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 613<400> 613

Thr Ser Gly Arg Ser Val Asn ProThr Ser Gly Arg Ser Val Asn Pro

1 515

<210> 614<210> 614

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 614<400> 614

Thr Ser Gly Arg Ser Ala His ProThr Ser Gly Arg Ser Ala His Pro

1 515

<210> 615<210> 615

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 615<400> 615

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ile ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro

1 515

<210> 616<210> 616

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 616<400> 616

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Arg ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Arg Pro

1 515

<210> 617<210> 617

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 617<400> 617

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ser ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro

1 515

<210> 618<210> 618

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 618<400> 618

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Thr ProThr Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro

1 515

<210> 619<210> 619

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 619<400> 619

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn HisThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn His

1 515

<210> 620<210> 620

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 620<400> 620

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn LeuThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Leu

1 515

<210> 621<210> 621

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 621<400> 621

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn MetThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Met

1 515

<210> 622<210> 622

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 622<400> 622

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn ArgThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Arg

1 515

<210> 623<210> 623

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 623<400> 623

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn ValThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val

1 515

<210> 624<210> 624

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 624<400> 624

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn TyrThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr

1 515

<210> 625<210> 625

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 625<400> 625

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Val ProGly Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro

1 515

<210> 626<210> 626

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 626<400> 626

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Tyr ProGly Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro

1 515

<210> 627<210> 627

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 627<400> 627

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn GlnGly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln

1 515

<210> 628<210> 628

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 628<400> 628

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn AlaGly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala

1 515

<210> 629<210> 629

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 629<400> 629

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn IleGly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile

1 515

<210> 630<210> 630

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 630<400> 630

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn PheGly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe

1 515

<210> 631<210> 631

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 631<400> 631

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn SerGly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ser

1 515

<210> 632<210> 632

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 632<400> 632

Gln Ser Gly Arg Ser Ala Val ProGln Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro

1 515

<210> 633<210> 633

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 633<400> 633

Gln Ser Gly Arg Ser Ala Tyr ProGln Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro

1 515

<210> 634<210> 634

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 634<400> 634

Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn GlnGln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln

1 515

<210> 635<210> 635

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 635<400> 635

Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn AlaGln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala

1 515

<210> 636<210> 636

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 636<400> 636

Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn IleGln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile

1 515

<210> 637<210> 637

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 637<400> 637

Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn PheGln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe

1 515

<210> 638<210> 638

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 638<400> 638

Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn SerGln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ser

1 515

<210> 639<210> 639

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 639<400> 639

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Val ProPro Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro

1 515

<210> 640<210> 640

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 640<400> 640

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Tyr ProPro Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro

1 515

<210> 641<210> 641

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 641<400> 641

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn GlnPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln

1 515

<210> 642<210> 642

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 642<400> 642

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala

1 515

<210> 643<210> 643

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 643<400> 643

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn IlePro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile

1 515

<210> 644<210> 644

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 644<400> 644

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn PhePro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe

1 515

<210> 645<210> 645

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 645<400> 645

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn SerPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ser

1 515

<210> 646<210> 646

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 646<400> 646

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Val ProAla Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro

1 515

<210> 647<210> 647

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 647<400> 647

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Tyr ProAla Ser Gly Arg Ser Ala Tyr Pro

1 515

<210> 648<210> 648

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 648<400> 648

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn GlnAla Ser Gly Arg Ser Ala Asn Gln

1 515

<210> 649<210> 649

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 649<400> 649

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn AlaAla Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala

1 515

<210> 650<210> 650

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 650<400> 650

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn IleAla Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile

1 515

<210> 651<210> 651

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 651<400> 651

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn PheAla Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe

1 515

<210> 652<210> 652

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 652<400> 652

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn SerAla Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ser

1 515

<210> 653<210> 653

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 653<400> 653

Tyr Ser Gly Arg Ser Glu Asn ProTyr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro

1 515

<210> 654<210> 654

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 654<400> 654

Gly Ser Gly Arg Ser Glu Asn ProGly Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro

1 515

<210> 655<210> 655

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 655<400> 655

Gln Ser Gly Arg Ser Glu Asn ProGln Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro

1 515

<210> 656<210> 656

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 656<400> 656

Pro Ser Gly Arg Ser Glu Asn ProPro Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro

1 515

<210> 657<210> 657

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 657<400> 657

Ala Ser Gly Arg Ser Glu Asn ProAla Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro

1 515

<210> 658<210> 658

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 658<400> 658

His Ser Gly Arg Ser Glu Asn ProHis Ser Gly Arg Ser Glu Asn Pro

1 515

<210> 659<210> 659

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 659<400> 659

Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn GlnThr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Gln

1 515

<210> 660<210> 660

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 660<400> 660

Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn AlaThr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Ala

1 515

<210> 661<210> 661

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 661<400> 661

Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn IleThr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Ile

1 515

<210> 662<210> 662

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 662<400> 662

Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn PheThr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Phe

1 515

<210> 663<210> 663

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 663<400> 663

Thr Ser Gly Arg Ser Glu Asn SerThr Ser Gly Arg Ser Glu Asn Ser

1 515

<210> 664<210> 664

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 664<400> 664

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Glu ProTyr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro

1 515

<210> 665<210> 665

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 665<400> 665

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Glu ProGly Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro

1 515

<210> 666<210> 666

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 666<400> 666

Gln Ser Gly Arg Ser Ala Glu ProGln Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro

1 515

<210> 667<210> 667

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 667<400> 667

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Glu ProPro Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro

1 515

<210> 668<210> 668

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 668<400> 668

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Glu ProAla Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro

1 515

<210> 669<210> 669

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 669<400> 669

His Ser Gly Arg Ser Ala Glu ProHis Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro

1 515

<210> 670<210> 670

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 670<400> 670

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu GlnThr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Gln

1 515

<210> 671<210> 671

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 671<400> 671

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu AlaThr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Ala

1 515

<210> 672<210> 672

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 672<400> 672

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu IleThr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Ile

1 515

<210> 673<210> 673

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 673<400> 673

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu PheThr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Phe

1 515

<210> 674<210> 674

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 674<400> 674

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Glu SerThr Ser Gly Arg Ser Ala Glu Ser

1 515

<210> 675<210> 675

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 675<400> 675

Gly Thr Gly Arg Ser Ala Asn ProGly Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 676<210> 676

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 676<400> 676

Gly Lys Gly Arg Ser Ala Asn ProGly Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 677<210> 677

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 677<400> 677

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Ile ProGly Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro

1 515

<210> 678<210> 678

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 678<400> 678

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Thr ProGly Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro

1 515

<210> 679<210> 679

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 679<400> 679

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Ser ProGly Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro

1 515

<210> 680<210> 680

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 680<400> 680

Gly Ser Gly Arg Ser Ala His ProGly Ser Gly Arg Ser Ala His Pro

1 515

<210> 681<210> 681

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 681<400> 681

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn TyrGly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr

1 515

<210> 682<210> 682

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 682<400> 682

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn ValGly Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val

1 515

<210> 683<210> 683

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 683<400> 683

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Asn HisGly Ser Gly Arg Ser Ala Asn His

1 515

<210> 684<210> 684

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 684<400> 684

Gln Thr Gly Arg Ser Ala Asn ProGln Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 685<210> 685

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 685<400> 685

Gln Lys Gly Arg Ser Ala Asn ProGln Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 686<210> 686

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 686<400> 686

Gln Ser Gly Arg Ser Ala Ile ProGln Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro

1 515

<210> 687<210> 687

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 687<400> 687

Gln Ser Gly Arg Ser Ala Thr ProGln Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro

1 515

<210> 688<210> 688

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 688<400> 688

Gln Ser Gly Arg Ser Ala Ser ProGln Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro

1 515

<210> 689<210> 689

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 689<400> 689

Gln Ser Gly Arg Ser Ala His ProGln Ser Gly Arg Ser Ala His Pro

1 515

<210> 690<210> 690

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 690<400> 690

Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn TyrGln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr

1 515

<210> 691<210> 691

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 691<400> 691

Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn ValGln Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val

1 515

<210> 692<210> 692

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 692<400> 692

Gln Ser Gly Arg Ser Ala Asn HisGln Ser Gly Arg Ser Ala Asn His

1 515

<210> 693<210> 693

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 693<400> 693

Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn ProPro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 694<210> 694

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 694<400> 694

Pro Lys Gly Arg Ser Ala Asn ProPro Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 695<210> 695

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 695<400> 695

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile ProPro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro

1 515

<210> 696<210> 696

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 696<400> 696

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Thr ProPro Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro

1 515

<210> 697<210> 697

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 697<400> 697

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ser ProPro Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro

1 515

<210> 698<210> 698

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 698<400> 698

Pro Ser Gly Arg Ser Ala His ProPro Ser Gly Arg Ser Ala His Pro

1 515

<210> 699<210> 699

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 699<400> 699

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn TyrPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr

1 515

<210> 700<210> 700

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 700<400> 700

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn ValPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val

1 515

<210> 701<210> 701

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 701<400> 701

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn HisPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn His

1 515

<210> 702<210> 702

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 702<400> 702

Ala Thr Gly Arg Ser Ala Asn ProAla Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 703<210> 703

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 703<400> 703

Ala Lys Gly Arg Ser Ala Asn ProAla Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 704<210> 704

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 704<400> 704

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Ile ProAla Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro

1 515

<210> 705<210> 705

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 705<400> 705

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Thr ProAla Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro

1 515

<210> 706<210> 706

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 706<400> 706

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Ser ProAla Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro

1 515

<210> 707<210> 707

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 707<400> 707

Ala Ser Gly Arg Ser Ala His ProAla Ser Gly Arg Ser Ala His Pro

1 515

<210> 708<210> 708

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 708<400> 708

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn TyrAla Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr

1 515

<210> 709<210> 709

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 709<400> 709

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn ValAla Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val

1 515

<210> 710<210> 710

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 710<400> 710

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Asn HisAla Ser Gly Arg Ser Ala Asn His

1 515

<210> 711<210> 711

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 711<400> 711

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn ProTyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 712<210> 712

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 712<400> 712

Tyr Lys Gly Arg Ser Ala Asn ProTyr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 713<210> 713

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 713<400> 713

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val ProTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro

1 515

<210> 714<210> 714

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 714<400> 714

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile ProTyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro

1 515

<210> 715<210> 715

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 715<400> 715

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Thr ProTyr Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro

1 515

<210> 716<210> 716

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 716<400> 716

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ser ProTyr Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro

1 515

<210> 717<210> 717

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 717<400> 717

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala His ProTyr Ser Gly Arg Ser Ala His Pro

1 515

<210> 718<210> 718

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 718<400> 718

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala

1 515

<210> 719<210> 719

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 719<400> 719

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn PheTyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe

1 515

<210> 720<210> 720

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 720<400> 720

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn TyrTyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr

1 515

<210> 721<210> 721

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 721<400> 721

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn ValTyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val

1 515

<210> 722<210> 722

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 722<400> 722

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn HisTyr Ser Gly Arg Ser Ala Asn His

1 515

<210> 723<210> 723

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 723<400> 723

Ser Thr Gly Arg Ser Ala Asn ProSer Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 724<210> 724

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 724<400> 724

Ser Lys Gly Arg Ser Ala Asn ProSer Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 725<210> 725

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 725<400> 725

Ser Ser Gly Arg Ser Ala Val ProSer Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro

1 515

<210> 726<210> 726

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 726<400> 726

Ser Ser Gly Arg Ser Ala Ile ProSer Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro

1 515

<210> 727<210> 727

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 727<400> 727

Ser Ser Gly Arg Ser Ala Thr ProSer Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro

1 515

<210> 728<210> 728

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 728<400> 728

Ser Ser Gly Arg Ser Ala Ser ProSer Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro

1 515

<210> 729<210> 729

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 729<400> 729

Ser Ser Gly Arg Ser Ala His ProSer Ser Gly Arg Ser Ala His Pro

1 515

<210> 730<210> 730

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 730<400> 730

Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn AlaSer Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala

1 515

<210> 731<210> 731

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 731<400> 731

Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn PheSer Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe

1 515

<210> 732<210> 732

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 732<400> 732

Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn TyrSer Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr

1 515

<210> 733<210> 733

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 733<400> 733

Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn ValSer Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val

1 515

<210> 734<210> 734

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 734<400> 734

Ser Ser Gly Arg Ser Ala Asn HisSer Ser Gly Arg Ser Ala Asn His

1 515

<210> 735<210> 735

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 735<400> 735

Ile Thr Gly Arg Ser Ala Asn ProIle Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 736<210> 736

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 736<400> 736

Ile Lys Gly Arg Ser Ala Asn ProIle Lys Gly Arg Ser Ala Asn Pro

1 515

<210> 737<210> 737

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 737<400> 737

Ile Ser Gly Arg Ser Ala Val ProIle Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro

1 515

<210> 738<210> 738

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 738<400> 738

Ile Ser Gly Arg Ser Ala Ile ProIle Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro

1 515

<210> 739<210> 739

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 739<400> 739

Ile Ser Gly Arg Ser Ala Thr ProIle Ser Gly Arg Ser Ala Thr Pro

1 515

<210> 740<210> 740

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 740<400> 740

Ile Ser Gly Arg Ser Ala Ser ProIle Ser Gly Arg Ser Ala Ser Pro

1 515

<210> 741<210> 741

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 741<400> 741

Ile Ser Gly Arg Ser Ala His ProIle Ser Gly Arg Ser Ala His Pro

1 515

<210> 742<210> 742

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 742<400> 742

Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn AlaIle Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala

1 515

<210> 743<210> 743

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 743<400> 743

Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn PheIle Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe

1 515

<210> 744<210> 744

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 744<400> 744

Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn TyrIle Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr

1 515

<210> 745<210> 745

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 745<400> 745

Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn ValIle Ser Gly Arg Ser Ala Asn Val

1 515

<210> 746<210> 746

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 746<400> 746

Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn HisIle Ser Gly Arg Ser Ala Asn His

1 515

<210> 747<210> 747

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 747<400> 747

Thr Thr Gly Arg Ser Ala Val ProThr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro

1 515

<210> 748<210> 748

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 748<400> 748

Thr Thr Gly Arg Ser Ala Ile ProThr Thr Gly Arg Ser Ala Ile Pro

1 515

<210> 749<210> 749

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 749<400> 749

Thr Thr Gly Arg Ser Ala Thr ProThr Thr Gly Arg Ser Ala Thr Pro

1 515

<210> 750<210> 750

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 750<400> 750

Thr Thr Gly Arg Ser Ala Ser ProThr Thr Gly Arg Ser Ala Ser Pro

1 515

<210> 751<210> 751

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 751<400> 751

Thr Thr Gly Arg Ser Ala His ProThr Thr Gly Arg Ser Ala His Pro

1 515

<210> 752<210> 752

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 752<400> 752

Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn AlaThr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Ala

1 515

<210> 753<210> 753

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 753<400> 753

Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn PheThr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Phe

1 515

<210> 754<210> 754

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 754<400> 754

Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn TyrThr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Tyr

1 515

<210> 755<210> 755

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 755<400> 755

Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn ValThr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Val

1 515

<210> 756<210> 756

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 756<400> 756

Thr Thr Gly Arg Ser Ala Asn HisThr Thr Gly Arg Ser Ala Asn His

1 515

<210> 757<210> 757

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 757<400> 757

Thr Lys Gly Arg Ser Ala Val ProThr Lys Gly Arg Ser Ala Val Pro

1 515

<210> 758<210> 758

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 758<400> 758

Thr Lys Gly Arg Ser Ala Ile ProThr Lys Gly Arg Ser Ala Ile Pro

1 515

<210> 759<210> 759

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 759<400> 759

Thr Lys Gly Arg Ser Ala Thr ProThr Lys Gly Arg Ser Ala Thr Pro

1 515

<210> 760<210> 760

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 760<400> 760

Thr Lys Gly Arg Ser Ala Ser ProThr Lys Gly Arg Ser Ala Ser Pro

1 515

<210> 761<210> 761

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 761<400> 761

Thr Lys Gly Arg Ser Ala His ProThr Lys Gly Arg Ser Ala His Pro

1 515

<210> 762<210> 762

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 762<400> 762

Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn AlaThr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Ala

1 515

<210> 763<210> 763

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 763<400> 763

Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn PheThr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Phe

1 515

<210> 764<210> 764

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 764<400> 764

Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn TyrThr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Tyr

1 515

<210> 765<210> 765

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 765<400> 765

Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn ValThr Lys Gly Arg Ser Ala Asn Val

1 515

<210> 766<210> 766

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 766<400> 766

Thr Lys Gly Arg Ser Ala Asn HisThr Lys Gly Arg Ser Ala Asn His

1 515

<210> 767<210> 767

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 767<400> 767

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Val TyrThr Ser Gly Arg Ser Ala Val Tyr

1 515

<210> 768<210> 768

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 768<400> 768

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Val ValThr Ser Gly Arg Ser Ala Val Val

1 515

<210> 769<210> 769

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 769<400> 769

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Val HisThr Ser Gly Arg Ser Ala Val His

1 515

<210> 770<210> 770

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 770<400> 770

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ile TyrThr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Tyr

1 515

<210> 771<210> 771

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 771<400> 771

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ile ValThr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Val

1 515

<210> 772<210> 772

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 772<400> 772

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ile HisThr Ser Gly Arg Ser Ala Ile His

1 515

<210> 773<210> 773

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 773<400> 773

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ser TyrThr Ser Gly Arg Ser Ala Ser Tyr

1 515

<210> 774<210> 774

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 774<400> 774

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ser ValThr Ser Gly Arg Ser Ala Ser Val

1 515

<210> 775<210> 775

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 775<400> 775

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Ser HisThr Ser Gly Arg Ser Ala Ser His

1 515

<210> 776<210> 776

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 776<400> 776

Thr Ser Gly Arg Ser Ala His TyrThr Ser Gly Arg Ser Ala His Tyr

1 515

<210> 777<210> 777

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 777<400> 777

Thr Ser Gly Arg Ser Ala His ValThr Ser Gly Arg Ser Ala His Val

1 515

<210> 778<210> 778

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 778<400> 778

Thr Ser Gly Arg Ser Ala His HisThr Ser Gly Arg Ser Ala His His

1 515

<210> 779<210> 779

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 779<400> 779

Pro Ser Gly Arg Ser Glu Val ProPro Ser Gly Arg Ser Glu Val Pro

1 515

<210> 780<210> 780

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 780<400> 780

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Glu ProPro Ser Gly Arg Ser Ala Glu Pro

1 515

<210> 781<210> 781

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 781<400> 781

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly ProPro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro

1 515

<210> 782<210> 782

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 782<400> 782

Ala Ser Gly Arg Ser Glu Asn AlaAla Ser Gly Arg Ser Glu Asn Ala

1 515

<210> 783<210> 783

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 783<400> 783

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Glu AlaAla Ser Gly Arg Ser Ala Glu Ala

1 515

<210> 784<210> 784

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 784<400> 784

Ala Ser Gly Arg Ser Ala Gly AlaAla Ser Gly Arg Ser Ala Gly Ala

1 515

<210> 785<210> 785

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 785<400> 785

Gly Thr Gly Arg Ser Ala Thr ProGly Thr Gly Arg Ser Ala Thr Pro

1 515

<210> 786<210> 786

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 786<400> 786

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Thr TyrGly Ser Gly Arg Ser Ala Thr Tyr

1 515

<210> 787<210> 787

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 787<400> 787

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Thr ValGly Ser Gly Arg Ser Ala Thr Val

1 515

<210> 788<210> 788

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 788<400> 788

Gly Ser Gly Arg Ser Ala Thr HisGly Ser Gly Arg Ser Ala Thr His

1 515

<210> 789<210> 789

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 789<400> 789

Gly Thr Gly Arg Ser Ala Thr TyrGly Thr Gly Arg Ser Ala Thr Tyr

1 515

<210> 790<210> 790

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 790<400> 790

Gly Thr Gly Arg Ser Ala Thr ValGly Thr Gly Arg Ser Ala Thr Val

1 515

<210> 791<210> 791

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 791<400> 791

Gly Thr Gly Arg Ser Ala Thr HisGly Thr Gly Arg Ser Ala Thr His

1 515

<210> 792<210> 792

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 792<400> 792

Gly Ser Gly Arg Ser Glu Thr ProGly Ser Gly Arg Ser Glu Thr Pro

1 515

<210> 793<210> 793

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 793<400> 793

Gly Thr Gly Arg Ser Glu Thr ProGly Thr Gly Arg Ser Glu Thr Pro

1 515

<210> 794<210> 794

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 794<400> 794

Gly Ser Gly Arg Ser Glu Thr TyrGly Ser Gly Arg Ser Glu Thr Tyr

1 515

<210> 795<210> 795

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 795<400> 795

Gly Ser Gly Arg Ser Glu Thr ValGly Ser Gly Arg Ser Glu Thr Val

1 515

<210> 796<210> 796

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 796<400> 796

Gly Ser Gly Arg Ser Glu Thr HisGly Ser Gly Arg Ser Glu Thr His

1 515

<210> 797<210> 797

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 797<400> 797

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val ProTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro

1 515

<210> 798<210> 798

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 798<400> 798

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val TyrTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Tyr

1 515

<210> 799<210> 799

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 799<400> 799

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val ValTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Val

1 515

<210> 800<210> 800

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 800<400> 800

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val HisTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val His

1 515

<210> 801<210> 801

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 801<400> 801

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val TyrTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr

1 515

<210> 802<210> 802

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 802<400> 802

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val ValTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val

1 515

<210> 803<210> 803

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 803<400> 803

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val HisTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His

1 515

<210> 804<210> 804

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 804<400> 804

Tyr Ser Gly Arg Ser Glu Val ProTyr Ser Gly Arg Ser Glu Val Pro

1 515

<210> 805<210> 805

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 805<400> 805

Tyr Thr Gly Arg Ser Glu Val ProTyr Thr Gly Arg Ser Glu Val Pro

1 515

<210> 806<210> 806

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 806<400> 806

Tyr Ser Gly Arg Ser Glu Val TyrTyr Ser Gly Arg Ser Glu Val Tyr

1 515

<210> 807<210> 807

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 807<400> 807

Tyr Ser Gly Arg Ser Glu Val ValTyr Ser Gly Arg Ser Glu Val Val

1 515

<210> 808<210> 808

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 808<400> 808

Tyr Ser Gly Arg Ser Glu Val HisTyr Ser Gly Arg Ser Glu Val His

1 515

<210> 809<210> 809

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 809<400> 809

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val ProTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro

1 515

<210> 810<210> 810

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 810<400> 810

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val TyrTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Tyr

1 515

<210> 811<210> 811

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 811<400> 811

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val ValTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Val

1 515

<210> 812<210> 812

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 812<400> 812

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val HisTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val His

1 515

<210> 813<210> 813

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 813<400> 813

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val TyrTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr

1 515

<210> 814<210> 814

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 814<400> 814

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val ValTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val

1 515

<210> 815<210> 815

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 815<400> 815

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val HisTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His

1 515

<210> 816<210> 816

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 816<400> 816

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Arg Leu Pro Gly Ala Ala Pro Gln Leu LeuThr Val Asn Trp Tyr Gln Arg Leu Pro Gly Ala Ala Pro Gln Leu Leu

35 40 45 35 40 45

Ile Tyr Asn Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe SerIle Tyr Asn Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60 50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Gly Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu GlnGly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Gly Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 8065 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser LeuSer Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95 85 90 95

Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Thr SerAsn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Thr Ser

100 105 110 100 105 110

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala AsnPro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn

130 135 140 130 135 140

Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala ValLys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val

145 150 155 160145 150 155 160

Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val GluThr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu

165 170 175 165 170 175

Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser SerThr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser

180 185 190 180 185 190

Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr SerTyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser

195 200 205 195 200 205

Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala ProCys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 817<210> 817

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 817<400> 817

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 818<210> 818

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 818<400> 818

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Tyr Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Tyr Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 819<210> 819

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 819<400> 819

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Val Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Val Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 820<210> 820

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 820<400> 820

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val His Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val His Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 821<210> 821

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 821<400> 821

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 822<210> 822

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 822<400> 822

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 823<210> 823

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 823<400> 823

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Arg Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 824<210> 824

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 824<400> 824

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Gly Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Gly Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 825<210> 825

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 825<400> 825

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Tyr Gly Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Tyr Gly Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 826<210> 826

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 826<400> 826

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Val Gly Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Val Gly Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 827<210> 827

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 827<400> 827

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val His Gly Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val His Gly Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 828<210> 828

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 828<400> 828

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Gly Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Gly Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 829<210> 829

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 829<400> 829

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Gly Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Gly Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 830<210> 830

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 830<400> 830

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Gly Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Gly Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 831<210> 831

<211> 462<211> 462

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 831<400> 831

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly SerGln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 151 5 10 15

Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser PheSer Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30 20 25 30

Ser Ile Thr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp MetSer Ile Thr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Glu Ile Thr Pro Met Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys PheGly Glu Ile Thr Pro Met Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala TyrGln Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

Met Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr CysMet Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Asp Gly Arg Phe Asp Val Ser Asp Leu Leu Thr Asp Lys ProAla Arg Asp Gly Arg Phe Asp Val Ser Asp Leu Leu Thr Asp Lys Pro

100 105 110 100 105 110

Lys Val Thr Ile Asn Tyr Asn Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly ThrLys Val Thr Ile Asn Tyr Asn Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125 115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe ProLeu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys ThrAsn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

225 230 235 240225 230 235 240

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro SerHis Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Arg Gly Pro Ser

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys ThrLys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu AlaArg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

<210> 832<210> 832

<211> 216<211> 216

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 832<400> 832

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly GlnAsn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys SerThr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215 210 215

<210> 833<210> 833

<400> 833<400> 833

000000

<210> 834<210> 834

<400> 834<400> 834

000000

<210> 835<210> 835

<400> 835<400> 835

000000

<210> 836<210> 836

<400> 836<400> 836

000000

<210> 837<210> 837

<400> 837<400> 837

000000

<210> 838<210> 838

<400> 838<400> 838

000000

<210> 839<210> 839

<400> 839<400> 839

000000

<210> 840<210> 840

<400> 840<400> 840

000000

<210> 841<210> 841

<400> 841<400> 841

000000

<210> 842<210> 842

<400> 842<400> 842

000000

<210> 843<210> 843

<400> 843<400> 843

000000

<210> 844<210> 844

<400> 844<400> 844

000000

<210> 845<210> 845

<400> 845<400> 845

000000

<210> 846<210> 846

<400> 846<400> 846

000000

<210> 847<210> 847

<400> 847<400> 847

000000

<210> 848<210> 848

<400> 848<400> 848

000000

<210> 849<210> 849

<400> 849<400> 849

000000

<210> 850<210> 850

<400> 850<400> 850

000000

<210> 851<210> 851

<400> 851<400> 851

000000

<210> 852<210> 852

<400> 852<400> 852

000000

<210> 853<210> 853

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 853<400> 853

1 5 101 5 10

<210> 854<210> 854

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 854<400> 854

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ala GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 855<210> 855

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 855<400> 855

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro His GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro His Gly

1 5 101 5 10

<210> 856<210> 856

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 856<400> 856

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 857<210> 857

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 857<400> 857

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Leu GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Leu Gly

1 5 101 5 10

<210> 858<210> 858

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 858<400> 858

Thr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ser GlyThr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ser Gly

1 5 101 5 10

<210> 859<210> 859

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 859<400> 859

Ile Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile GlyIle Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 860<210> 860

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 860<400> 860

Tyr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile GlyTyr Ser Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 861<210> 861

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 861<400> 861

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ala GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 862<210> 862

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 862<400> 862

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ala GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 863<210> 863

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 863<400> 863

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ala GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 864<210> 864

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 864<400> 864

Thr Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ala GlyThr Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 865<210> 865

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 865<400> 865

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ala GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 866<210> 866

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 866<400> 866

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ala GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 867<210> 867

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 867<400> 867

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ala GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 868<210> 868

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 868<400> 868

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ala GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 869<210> 869

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 869<400> 869

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ala GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 870<210> 870

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 870<400> 870

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ala GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 871<210> 871

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 871<400> 871

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ala GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 872<210> 872

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 872<400> 872

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ala GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 873<210> 873

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 873<400> 873

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ala GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ala Gly

1 5 101 5 10

<210> 874<210> 874

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 874<400> 874

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro His GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro His Gly

1 5 101 5 10

<210> 875<210> 875

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 875<400> 875

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile His GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile His Gly

1 5 101 5 10

<210> 876<210> 876

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 876<400> 876

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe His GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe His Gly

1 5 101 5 10

<210> 877<210> 877

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 877<400> 877

Thr Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro His GlyThr Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro His Gly

1 5 101 5 10

<210> 878<210> 878

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 878<400> 878

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro His GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro His Gly

1 5 101 5 10

<210> 879<210> 879

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 879<400> 879

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro His GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro His Gly

1 5 101 5 10

<210> 880<210> 880

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 880<400> 880

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro His GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro His Gly

1 5 101 5 10

<210> 881<210> 881

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 881<400> 881

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr His GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr His Gly

1 5 101 5 10

<210> 882<210> 882

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 882<400> 882

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro His GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro His Gly

1 5 101 5 10

<210> 883<210> 883

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 883<400> 883

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro His GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro His Gly

1 5 101 5 10

<210> 884<210> 884

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 884<400> 884

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr His GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr His Gly

1 5 101 5 10

<210> 885<210> 885

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 885<400> 885

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val His GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val His Gly

1 5 101 5 10

<210> 886<210> 886

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 886<400> 886

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His His GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His His Gly

1 5 101 5 10

<210> 887<210> 887

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 887<400> 887

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 888<210> 888

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 888<400> 888

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ile GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 889<210> 889

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 889<400> 889

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ile GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 890<210> 890

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 890<400> 890

Thr Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile GlyThr Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 891<210> 891

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 891<400> 891

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 892<210> 892

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 892<400> 892

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 893<210> 893

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 893<400> 893

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 894<210> 894

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 894<400> 894

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ile GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 895<210> 895

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 895<400> 895

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ile GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 896<210> 896

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 896<400> 896

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 897<210> 897

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 897<400> 897

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ile GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 898<210> 898

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 898<400> 898

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ile GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 899<210> 899

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 899<400> 899

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ile GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 900<210> 900

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 900<400> 900

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Leu GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Leu Gly

1 5 101 5 10

<210> 901<210> 901

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 901<400> 901

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Leu GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Leu Gly

1 5 101 5 10

<210> 902<210> 902

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 902<400> 902

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Leu GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Leu Gly

1 5 101 5 10

<210> 903<210> 903

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 903<400> 903

Thr Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Leu GlyThr Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Leu Gly

1 5 101 5 10

<210> 904<210> 904

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 904<400> 904

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Leu GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Leu Gly

1 5 101 5 10

<210> 905<210> 905

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 905<400> 905

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Leu GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Leu Gly

1 5 101 5 10

<210> 906<210> 906

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 906<400> 906

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Leu GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Leu Gly

1 5 101 5 10

<210> 907<210> 907

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 907<400> 907

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Leu GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Leu Gly

1 5 101 5 10

<210> 908<210> 908

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 908<400> 908

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Leu GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Leu Gly

1 5 101 5 10

<210> 909<210> 909

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 909<400> 909

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Leu GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Leu Gly

1 5 101 5 10

<210> 910<210> 910

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 910<400> 910

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Leu GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Leu Gly

1 5 101 5 10

<210> 911<210> 911

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 911<400> 911

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Leu GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Leu Gly

1 5 101 5 10

<210> 912<210> 912

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 912<400> 912

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Leu GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Leu Gly

1 5 101 5 10

<210> 913<210> 913

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 913<400> 913

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ser GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ser Gly

1 5 101 5 10

<210> 914<210> 914

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 914<400> 914

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ser GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ser Gly

1 5 101 5 10

<210> 915<210> 915

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 915<400> 915

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ser GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ser Gly

1 5 101 5 10

<210> 916<210> 916

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 916<400> 916

Thr Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ser GlyThr Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ser Gly

1 5 101 5 10

<210> 917<210> 917

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 917<400> 917

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ser GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ser Gly

1 5 101 5 10

<210> 918<210> 918

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 918<400> 918

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ser GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ser Gly

1 5 101 5 10

<210> 919<210> 919

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 919<400> 919

Thr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ser GlyThr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ser Gly

1 5 101 5 10

<210> 920<210> 920

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 920<400> 920

Thr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ser GlyThr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ser Gly

1 5 101 5 10

<210> 921<210> 921

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 921<400> 921

Thr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ser GlyThr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ser Gly

1 5 101 5 10

<210> 922<210> 922

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 922<400> 922

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ser GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ser Gly

1 5 101 5 10

<210> 923<210> 923

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 923<400> 923

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ser GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ser Gly

1 5 101 5 10

<210> 924<210> 924

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 924<400> 924

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ser GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ser Gly

1 5 101 5 10

<210> 925<210> 925

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 925<400> 925

Thr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ser GlyThr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ser Gly

1 5 101 5 10

<210> 926<210> 926

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 926<400> 926

Ile Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile GlyIle Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 927<210> 927

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 927<400> 927

Ile Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ile GlyIle Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 928<210> 928

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 928<400> 928

Ile Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ile GlyIle Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 929<210> 929

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 929<400> 929

Ile Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile GlyIle Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 930<210> 930

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 930<400> 930

Ile Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile GlyIle Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 931<210> 931

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 931<400> 931

Ile Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile GlyIle Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 932<210> 932

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 932<400> 932

Ile Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile GlyIle Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 933<210> 933

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 933<400> 933

Ile Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ile GlyIle Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 934<210> 934

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 934<400> 934

Ile Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ile GlyIle Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 935<210> 935

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 935<400> 935

Ile Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile GlyIle Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 936<210> 936

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 936<400> 936

Ile Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ile GlyIle Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 937<210> 937

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 937<400> 937

Ile Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ile GlyIle Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 938<210> 938

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 938<400> 938

Ile Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ile GlyIle Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 939<210> 939

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 939<400> 939

Tyr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile GlyTyr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 940<210> 940

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 940<400> 940

Tyr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ile GlyTyr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 941<210> 941

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 941<400> 941

Tyr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ile GlyTyr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 942<210> 942

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 942<400> 942

Tyr Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile GlyTyr Ser Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 943<210> 943

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 943<400> 943

Tyr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile GlyTyr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 944<210> 944

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 944<400> 944

Tyr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile GlyTyr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 945<210> 945

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 945<400> 945

Tyr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile GlyTyr Ser Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 946<210> 946

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 946<400> 946

Tyr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ile GlyTyr Ser Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 947<210> 947

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 947<400> 947

Tyr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ile GlyTyr Ser Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 948<210> 948

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 948<400> 948

Tyr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile GlyTyr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 949<210> 949

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 949<400> 949

Tyr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ile GlyTyr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 950<210> 950

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 950<400> 950

Tyr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ile GlyTyr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 951<210> 951

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 951<400> 951

Tyr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ile GlyTyr Ser Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ile Gly

1 5 101 5 10

<210> 952<210> 952

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 952<400> 952

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 953<210> 953

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 953<400> 953

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 954<210> 954

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 954<400> 954

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 955<210> 955

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 955<400> 955

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 956<210> 956

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 956<400> 956

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 957<210> 957

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 957<400> 957

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Thr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaThr Ser Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 958<210> 958

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 958<400> 958

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ile SerAsn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ile Ser

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 959<210> 959

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 959<400> 959

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Tyr SerAsn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Tyr Ser

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 960<210> 960

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 960<400> 960

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 961<210> 961

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 961<400> 961

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 962<210> 962

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 962<400> 962

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 963<210> 963

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 963<400> 963

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 964<210> 964

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 964<400> 964

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 965<210> 965

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 965<400> 965

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 966<210> 966

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 966<400> 966

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 967<210> 967

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 967<400> 967

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaIle Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 968<210> 968

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 968<400> 968

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 969<210> 969

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 969<400> 969

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 970<210> 970

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 970<400> 970

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 971<210> 971

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 971<400> 971

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 972<210> 972

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 972<400> 972

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ala Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 973<210> 973

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 973<400> 973

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 974<210> 974

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 974<400> 974

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile His Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile His Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 975<210> 975

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 975<400> 975

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe His Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe His Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 976<210> 976

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 976<400> 976

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 977<210> 977

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 977<400> 977

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 978<210> 978

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 978<400> 978

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 979<210> 979

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 979<400> 979

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 980<210> 980

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 980<400> 980

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr His Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaIle Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr His Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 981<210> 981

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 981<400> 981

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 982<210> 982

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 982<400> 982

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro His Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 983<210> 983

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 983<400> 983

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr His Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr His Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 984<210> 984

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 984<400> 984

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val His Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val His Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 985<210> 985

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 985<400> 985

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His His Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His His Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 986<210> 986

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 986<400> 986

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 987<210> 987

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 987<400> 987

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 988<210> 988

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 988<400> 988

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 989<210> 989

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 989<400> 989

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 990<210> 990

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 990<400> 990

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 991<210> 991

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 991<400> 991

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 992<210> 992

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 992<400> 992

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 993<210> 993

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 993<400> 993

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaIle Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 994<210> 994

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 994<400> 994

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 995<210> 995

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 995<400> 995

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 996<210> 996

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 996<400> 996

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 997<210> 997

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 997<400> 997

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 998<210> 998

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 998<400> 998

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ile Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 999<210> 999

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 999<400> 999

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1000<210> 1000

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1000<400> 1000

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1001<210> 1001

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1001<400> 1001

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1002<210> 1002

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1002<400> 1002

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1003<210> 1003

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1003<400> 1003

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1004<210> 1004

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1004<400> 1004

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1005<210> 1005

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1005<400> 1005

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1006<210> 1006

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1006<400> 1006

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaIle Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1007<210> 1007

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1007<400> 1007

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1008<210> 1008

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1008<400> 1008

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1009<210> 1009

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1009<400> 1009

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1010<210> 1010

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1010<400> 1010

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1011<210> 1011

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1011<400> 1011

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Leu Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1012<210> 1012

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1012<400> 1012

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Val Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1013<210> 1013

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1013<400> 1013

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ile Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1014<210> 1014

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1014<400> 1014

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Asn Phe Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1015<210> 1015

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1015<400> 1015

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1016<210> 1016

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1016<400> 1016

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1017<210> 1017

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1017<400> 1017

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Asn Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1018<210> 1018

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1018<400> 1018

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Ser Gly Arg Ser Ala Ile Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1019<210> 1019

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1019<400> 1019

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Ile Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaIle Ser Gly Arg Ser Ala Asn Tyr Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1020<210> 1020

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1020<400> 1020

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Pro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaPro Ser Gly Arg Ser Ala Gly Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1021<210> 1021

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1021<400> 1021

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Pro Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1022<210> 1022

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1022<400> 1022

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Tyr Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1023<210> 1023

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1023<400> 1023

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val Val Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1024<210> 1024

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1024<400> 1024

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala AlaTyr Thr Gly Arg Ser Ala Val His Ser Gly Gly Gln Pro Lys Ala Ala

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1025<210> 1025

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1025<400> 1025

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1026<210> 1026

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1026<400> 1026

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1027<210> 1027

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1027<400> 1027

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1028<210> 1028

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1028<400> 1028

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1029<210> 1029

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1029<400> 1029

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1030<210> 1030

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1030<400> 1030

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1031<210> 1031

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1031<400> 1031

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1032<210> 1032

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1032<400> 1032

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1033<210> 1033

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1033<400> 1033

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1034<210> 1034

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1034<400> 1034

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1035<210> 1035

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1035<400> 1035

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1036<210> 1036

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1036<400> 1036

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1037<210> 1037

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1037<400> 1037

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1038<210> 1038

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1038<400> 1038

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1039<210> 1039

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1039<400> 1039

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1040<210> 1040

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1040<400> 1040

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1041<210> 1041

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1041<400> 1041

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1042<210> 1042

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1042<400> 1042

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1043<210> 1043

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1043<400> 1043

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1044<210> 1044

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1044<400> 1044

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1045<210> 1045

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1045<400> 1045

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1046<210> 1046

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1046<400> 1046

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1047<210> 1047

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1047<400> 1047

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1048<210> 1048

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1048<400> 1048

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1049<210> 1049

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1049<400> 1049

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1050<210> 1050

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1050<400> 1050

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1051<210> 1051

<211> 462<211> 462

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1051<400> 1051

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

225 230 235 240225 230 235 240

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro LysHis Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

275 280 285 275 280 285

290 295 300 290 295 300

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val ValLys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val

305 310 315 320305 310 315 320

325 330 335 325 330 335

340 345 350 340 345 350

355 360 365 355 360 365

Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr CysPro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

370 375 380 370 375 380

385 390 395 400385 390 395 400

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Tyr Leu AspAsn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Tyr Leu Asp

405 410 415 405 410 415

420 425 430 420 425 430

435 440 445 435 440 445

450 455 460 450 455 460

<210> 1052<210> 1052

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1052<400> 1052

1 5 101 5 10

<210> 1053<210> 1053

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1053<400> 1053

1 5 101 5 10

<210> 1054<210> 1054

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1054<400> 1054

1 5 101 5 10

<210> 1055<210> 1055

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1055<400> 1055

1 5 101 5 10

<210> 1056<210> 1056

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1056<400> 1056

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1057<210> 1057

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1057<400> 1057

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1058<210> 1058

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1058<400> 1058

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1059<210> 1059

<211> 228<211> 228

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1059<400> 1059

1 5 10 151 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 8065 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

Thr Glu Cys SerThr Glu Cys Ser

225225

<210> 1060<210> 1060

<211> 444<211> 444

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1060<400> 1060

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Arg Pro Gly AlaGln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 151 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser TyrSer Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Trp Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp IleTrp Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

Gly Met Ile Asp Pro Ser Tyr Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys PheGly Met Ile Asp Pro Ser Tyr Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60 50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala TyrLys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr CysMet Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Leu Tyr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr LeuAla Leu Tyr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110 100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu AlaThr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125 115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys LeuPro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140 130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser GlyVal Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser SerAla Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175 165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser LeuGly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190 180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn ThrGly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205 195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His ThrLys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220 210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val PheCys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe

225 230 235 240225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr ProLeu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255 245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu ValGlu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270 260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys ThrLys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285 275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser ValLys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300 290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys CysLeu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile SerLys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335 325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro ProLys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350 340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu ValSer Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365 355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn GlyLys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380 370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Tyr Leu Asp Ser AspGln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Tyr Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg TrpGly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415 405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu HisGln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430 420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser ProAsn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 435 440

<210> 1061<210> 1061

<211> 214<211> 214

<212> PRT<212>PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<400> 1061<400> 1061

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 151 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn ArgAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg

20 25 30 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu IleLeu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlySer Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln ThrSer Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr

65 70 75 8065 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro TyrGlu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Tyr

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala AlaThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu CysPhe Asn Arg Gly Glu Cys

210 210

<---<---

Claims

1. A target tissue-specific polypeptide comprising an antigen binding domain and a transport fragment, wherein the transport fragment has an inhibitory domain that inhibits the antigen binding activity of the antigen binding domain, wherein the antigen binding domain has a shorter half-life in the blood than the transport fragment, and wherein the polypeptide has a protease cleavable sequence that contains one or more sequences selected from SEQ ID NOs: 171, 168-170, 172-177 and 208-815.

2. The polypeptide of claim 1, wherein the inhibition of the antigen binding activity of the antigen binding domain by the inhibitory domain in the state in which the protease cleavable sequence is cleaved by the protease is weaker than the inhibition of the antigen binding activity of the antigen binding domain by the inhibitory domain in the state in which the protease cleavable sequence is not cleaved.

3. The polypeptide of claim 1 or 2, wherein the antigen binding domain is releasable from the polypeptide, and wherein the antigen binding domain has higher antigen binding activity when released from the polypeptide compared to antigen binding activity when not released from the polypeptide.

4. Polypeptide according to one of paragraphs. 1-3, wherein the antigen binding activity of the antigen binding domain is inhibited by association of the inhibitory domain of the transport moiety with the antigen binding domain.

5. The polypeptide of claim 3 or 4, wherein the protease-cleavable sequence is cleaved by the protease in such a way that the antigen-binding domain becomes capable of being released from the polypeptide and/or in such a way that the association of the inhibitory domain of the transport moiety with the antigen-binding domain is abolished.

6. Polypeptide according to one of paragraphs. 1-5, wherein the protease is a cancer tissue-specific protease or an inflammatory tissue-specific protease.

7. Polypeptide according to one of paragraphs. 1-6, wherein the antigen binding domain comprises or is a single domain antibody and wherein the inhibitory domain of the transport moiety inhibits the antigen binding activity of the single domain antibody.

8. Polypeptide according to one of paragraphs. 1-7, wherein the antigen binding domain comprises a single domain antibody, wherein the inhibitory domain of the transport moiety is a VHH, VH antibody or VL antibody and wherein the antigen binding activity of the single domain antibody is inhibited by a VHH, VH antibody or VL antibody.

9. Polypeptide according to one of paragraphs. 1-8, in which the transport fragment contains the constant region of the antibody.

10. The polypeptide according to claim 9, in which the N-terminus of the antibody constant region of the transport fragment and the C-terminus of the antigen binding domain are fused through a linker or without a linker, and in which the protease-cleavable sequence is localized near the boundary between the antigen binding domain and the antibody constant region.

11. The polypeptide of claim 9 or 10, wherein the antibody constant region of the polypeptide is an IgG-type antibody constant region.

12. Polypeptide according to one of paragraphs. 1-11, in which the polypeptide is an IgG-type antibody-like molecule.

13. Pharmaceutical composition for the treatment of a disease caused by a target tissue, containing an effective amount of a polypeptide according to one of paragraphs. 1-12 and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the disease is cancer or an inflammatory disease or disorder.

14. Method for producing a polypeptide according to one of claims. 1-12, including stages:

a) transformation of the host cell with an expression vector into which a polynucleotide encoding a polypeptide according to one of claims has been inserted. 1-12.

b) culturing the transformed cell, and

c) isolation of the target polypeptide.