RU2815450C1 - Method for clonal micropropagation of coast redwoods (sequoia sempervirens linnaeus) - Google Patents
Method for clonal micropropagation of coast redwoods (sequoia sempervirens linnaeus) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815450C1 RU2815450C1 RU2023123304A RU2023123304A RU2815450C1 RU 2815450 C1 RU2815450 C1 RU 2815450C1 RU 2023123304 A RU2023123304 A RU 2023123304A RU 2023123304 A RU2023123304 A RU 2023123304A RU 2815450 C1 RU2815450 C1 RU 2815450C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sequoia
- vitro
- cuttings
- evergreen
- redwoods
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 241001138418 Sequoia sempervirens Species 0.000 title claims abstract description 18
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 25
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 11
- 241001116459 Sequoia Species 0.000 claims description 28
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 24
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 3
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 3
- OVSKIKFHRZPJSS-DOMIDYPGSA-N 2-(2,4-dichlorophenoxy)acetic acid Chemical compound OC(=O)[14CH2]OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-DOMIDYPGSA-N 0.000 claims 2
- 239000005971 1-naphthylacetic acid Substances 0.000 claims 1
- IIDAJRNSZSFFCB-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-methoxy-2-methylbenzenesulfonamide Chemical compound COC1=CC(S(N)(=O)=O)=C(C)C=C1N IIDAJRNSZSFFCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims 1
- JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N indole-3-butyric acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCCC(=O)O)=CNC2=C1 JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 12
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 abstract description 12
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 abstract description 11
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 235000003499 redwood Nutrition 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002523 mercuric chloride Drugs 0.000 description 4
- LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L mercury dichloride Chemical compound Cl[Hg]Cl LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 3
- 241000422847 Sequoiadendron Species 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 2
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 2
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 2
- 239000012286 potassium permanganate Substances 0.000 description 2
- 230000024053 secondary metabolic process Effects 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 240000002924 Platycladus orientalis Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004111 Potassium silicate Substances 0.000 description 1
- 241000422846 Sequoiadendron giganteum Species 0.000 description 1
- 241000202349 Taxus brevifolia Species 0.000 description 1
- 241001330449 Taxus wallichiana Species 0.000 description 1
- 241001149649 Taxus wallichiana var. chinensis Species 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000036531 allelopathy Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003471 anti-radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002930 anti-sclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 229940093797 bioflavonoids Drugs 0.000 description 1
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N hypochlorite Chemical compound Cl[O-] WQYVRQLZKVEZGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000001002 morphogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 208000013435 necrotic lesion Diseases 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 230000000888 organogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- NNHHDJVEYQHLHG-UHFFFAOYSA-N potassium silicate Chemical compound [K+].[K+].[O-][Si]([O-])=O NNHHDJVEYQHLHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052913 potassium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019353 potassium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к способам размножения редких и реликтовых хвойных растений, и может быть использовано для массового получения качественного посадочного материала секвойи вечнозеленой (Sequoia sempervirens L.), трудно размножаемой вегетативным способом. Полученные микроклоны могут быть использованы для реинтродукции секвойи вечнозеленой в естественные места произрастания для расширения коллекции ботанических садов и природные зоны РФ, в качестве ценной, реликтовой древесной хвойной породы устойчивой к пожарам.The invention relates to the field of plant biotechnology, in particular to methods for propagating rare and relict coniferous plants, and can be used for the mass production of high-quality planting material for evergreen sequoia (Sequoia sempervirens L.), which is difficult to propagate vegetatively. The resulting microclones can be used for the reintroduction of evergreen sequoia into natural habitats to expand the collection of botanical gardens and natural areas of the Russian Federation, as a valuable, relict tree coniferous species resistant to fires.
Sequoia sempervirens (L.) - самые высокие реликтовые растения - тысячелетние долгожители, характеризующиеся ограниченным ареалом произрастания. Ценная древесина секвойи способна накапливать уникальные вторичные метаболиты, не имеющие синтетических аналогов. Фенольные соединения являются одними из наиболее распространенных в растениях представителями вторичного метаболизма, образование которых свойственно практически всем их клеткам. В настоящее время установлено участие этих веществ в формировании клеточных стенок, фотосинтезе, дыхании, аллелопатии, сверхчувствительности и некротизации, а также защите растений от ряда стрессовых воздействий. Полифенолы имеют и важное практическое значение. На их окислительных превращениях основаны технологические процессы в пищевой и легкой промышленности. В медицине широко применяются лекарственные препараты, изготовленные на основе фенольных соединений, получившие тривиальное название -биофлавоноиды. Они обладают капилляроукрепляющим, противовоспалительным, антисклеротическим, противолучевым и противоопухолевым действием. Интерес к секвойи вечнозеленой обусловлен способностью клеток и тканей растений к синтезу соединений фенольной природы, природных антиоксидантов, которые могут успешно использоваться в терапии онкологических заболеваний.Sequoia sempervirens (L.) - the tallest relict plants - millennial centenarians, characterized by a limited growing area. Valuable sequoia wood is capable of accumulating unique secondary metabolites that have no synthetic analogues. Phenolic compounds are among the most common representatives of secondary metabolism in plants, the formation of which is characteristic of almost all of their cells. The participation of these substances in the formation of cell walls, photosynthesis, respiration, allelopathy, hypersensitivity and necrotization, as well as the protection of plants from a number of stress influences has now been established. Polyphenols also have important practical significance. Technological processes in the food and light industries are based on their oxidative transformations. Medicines based on phenolic compounds, which have received the trivial name bioflavonoids, are widely used in medicine. They have capillary-strengthening, anti-inflammatory, anti-sclerotic, anti-radiation and anti-tumor effects. Interest in evergreen sequoia is due to the ability of plant cells and tissues to synthesize phenolic compounds, natural antioxidants, which can be successfully used in the treatment of cancer.
Растения рода секвойя произрастают в специализированных микроэкологических нишах, ограничивающих их природный ареал распространения. Известно, что биотический стресс является одними из основных факторов окружающей среды, ограничивающих интродукцию ценных видов растений - возможных источников производства уникальных метаболитов. Ограничивающие факторы окружающей среды оказывают прямое влияние на рост, развитие и продуктивность вторичного метаболизма растений. Создать стрессоустойчивые и высокопродуктивные растения можно с использованием методов клеточной биотехнологии. Поэтому необходимо разрабатывать технологии in vitro быстрого получения хорошо развивающихся, устойчивых к биотическим стрессорам и продуктивных микроклонов Sequoia sempervirens (L.). К таким технологиям относится метод клонального микроразмножения, позволяющий проводить работы в лабораторных условиях круглогодично, получать генетически стабильный, «здоровый» посадочный материал с высоким коэффициентом размножения.Plants of the sequoia genus grow in specialized microecological niches that limit their natural distribution area. It is known that biotic stress is one of the main environmental factors limiting the introduction of valuable plant species - possible sources of production of unique metabolites. Limiting environmental factors have a direct impact on the growth, development and productivity of plant secondary metabolism. It is possible to create stress-resistant and highly productive plants using cell biotechnology methods. Therefore, it is necessary to develop in vitro technologies for the rapid production of well-developing, resistant to biotic stressors and productive microclones of Sequoia sempervirens (L.). These technologies include the method of clonal micropropagation, which makes it possible to carry out work in laboratory conditions year-round and obtain genetically stable, “healthy” planting material with a high reproduction rate.
В мире проводятся исследования по размножению в культуре in vitro некоторых редких и реликтовых хвойных растений, таких как Taxus chinensis, Т. brevifolia, Т. wallichiana, Sequoiadendron и др. [A. Sârbu, G,Cogalniceanu, D. Smarandache, G. Pascale Morpho-anatomical studies on vegetative organs of Sequoia sempervirens, in vitro culture on carbon microstructure substrates // Acta Horti Bot. 2008. 35:51-59]. Что касается секвойи вечнозеленой (Sequoia sempervirens), то исследования, как правило, направлены на изучение отдельных минеральных солей питательной среды на морфгенетический потенциал культивируемых экспланто in vitro или на разработку технологии укоренение микропобегов in vitro. Следует отметить, что технология клонального микроразмножения, включающая все этапы размножения in vitro секвойи вечнозеленой от введения изолированных эксплантов в культуру in vitro и до адаптации микроклонов к условиям ех vitro в научной литературе обнаружены не были.Research is being conducted around the world on the in vitro propagation of some rare and relict coniferous plants, such as Taxus chinensis, T. brevifolia, T. wallichiana, Sequoiadendron, etc. [A. Sârbu, G, Cogalniceanu, D. Smarandache, G. Pascale Morpho-anatomical studies on vegetative organs of Sequoia sempervirens, in vitro culture on carbon microstructure substrates // Acta Horti Bot. 2008. 35:51-59]. As for evergreen sequoia (Sequoia sempervirens), research is usually aimed at studying individual mineral salts of the nutrient medium on the morphogenetic potential of cultivated explants in vitro or at developing technology for rooting microshoots in vitro. It should be noted that the technology of clonal micropropagation, including all stages of in vitro propagation of evergreen sequoia from the introduction of isolated explants into in vitro culture and to the adaptation of microclones to ex vitro conditions, has not been found in the scientific literature.
Известен способ культивирования секвойи вечнозеленой (Sequoia sempervirens) in vitro [A. Sârbu, G,Cogalniceanu, D. Smarandache, G. Pascale Morpho-anatomical studies on vegetative organs of Sequoia sempervirens, in vitro culture on carbon microstructure substrates // Acta Horti Bot. 2008. 35:51-59]. Способ заключается в размножении растений in vitro через изолированные вегетативные побеги, изолированные со взрослых растений секвойи и культивирование их на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга (МС), а также кинетин 0,2 мг/л в сочетании с ИУК 0,5 мг/л. Способ предполагает размножение растений через индукцию образования адвентивных почек, формирование микропобегов с последующим переносом их на питательную среду для укоренения, содержащую ИМК 1 мг/л. Недостатком данного способа является низкий коэффициент размножения, который составил 3,7 на один первичный эксплант.There is a known method for cultivating evergreen sequoia (Sequoia sempervirens) in vitro [A. Sârbu, G, Cogalniceanu, D. Smarandache, G. Pascale Morpho-anatomical studies on vegetative organs of Sequoia sempervirens, in vitro culture on carbon microstructure substrates // Acta Horti Bot. 2008. 35:51-59]. The method consists of propagating plants in vitro through isolated vegetative shoots isolated from adult sequoia plants and cultivating them on a nutrient medium containing mineral salts according to the Murashiga and Skoog recipe (MS), as well as kinetin 0.2 mg/l in combination with IAA 0 .5 mg/l. The method involves the propagation of plants through the induction of the formation of adventitious buds, the formation of microshoots, followed by their transfer to a nutrient medium for rooting containing IBA 1 mg/l. The disadvantage of this method is the low reproduction coefficient, which was 3.7 per primary explant.
Известен другой способ размножения in vitro секвойидендрона гигантского (Sequoiadendron giganteum) [Султонова М.С.Особенности микроклонального размножения и органогенез некоторых представителей хвойных пород (Sequoiadendron qiqanteum Lindl, и Biota orientalis h.). Автореферат на соискание диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук, 2016, Санкт-Петербург, 26 с.] включающий культиврование черенков, изолированных со взрослых деревьев, на питательной среде Мурасиге Скуга с добавлением кинетина 0,1 мг/л и НУК 2 мг/л, а также ПВП 1 г/л. Недостатком предлагаемого способа является получение растений-регенерантов из каллусной ткани, что приводит к проявлению сомаклоной вариабельности и не обеспечивает получение генетически стабильного посадочного материала.Another method of in vitro propagation of giant sequoiadendron (Sequoiadendron giganteum) is known [Sultonova M.S. Peculiarities of microclonal propagation and organogenesis of some representatives of coniferous species (Sequoiadendron qiqanteum Lindl, and Biota orientalis h.). Abstract for a dissertation for the degree of Candidate of Agricultural Sciences, 2016, St. Petersburg, 26 p.] including the cultivation of cuttings isolated from mature trees on Murashige Skoog nutrient medium with the addition of kinetin 0.1 mg/l and NAA 2 mg/l l, as well as PVP 1 g/l. The disadvantage of the proposed method is the production of regenerated plants from callus tissue, which leads to the manifestation of somaclonal variability and does not ensure the production of genetically stable planting material.
Известен другой способ размножения секвойи в условиях in vitro [Marie-Claude Bon, Frederique Riccardi, Olivier Monteuuis Influence of phase change within a 90-year-old Sequoiasempervirens on its in vitro organogenic capacity and protein patterns // Trees, 1994, 8:283-287] включающий культивирование 2-х см побегов, изолированных с 90-летних растений секвойи на питательной среде, содержащей минеральных солей по прописи Мурасига и Скуга (МС) и 1 г/л активированного угля, обеспечивающей удлинение побегов. В дальнейшем сформировавшиеся в пробирках побеги переносят на среду МС для укоренения, содержащую НУК в концентрации 2 мг/л. Недостатком предлагаемого способа является разработка технологии только по укоренению побегов in vitro. Полной технологии клонального микроразмножения не приводится.Another method of propagating sequoia in vitro is known [Marie-Claude Bon, Frederique Riccardi, Olivier Monteuis Influence of phase change within a 90-year-old Sequoiasempervirens on its in vitro organogenic capacity and protein patterns // Trees, 1994, 8:283 -287] involving the cultivation of 2 cm shoots isolated from 90-year-old sequoia plants on a nutrient medium containing mineral salts according to the recipe of Murashiga and Skoog (MS) and 1 g/l of activated carbon, which ensures shoot elongation. Subsequently, the shoots formed in the test tubes are transferred to MS medium for rooting, containing NAA at a concentration of 2 mg/l. The disadvantage of the proposed method is the development of technology only for rooting shoots in vitro. The complete technology of clonal micropropagation is not given.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу, взятом за прототип, относится способ клонального микроразмножения секвой вечнозеленой [Lobna S. Tahal, Walaa Н. Salama2, Azza A.M. Mazharl, Kh. I. Hashish 1, Iman M. El-Sayed A comparative study of biochemical changes on micropropagated Sequoia sempervirens using potassium silicate and silica nanoparticles // Journal of Pharmaceutical Negative Results, 2022, Volume 13, Special Issue 8, p.2592-2601] с использованием в качестве объекта исследований побегов, изолированных со взрослых растений, которые после поверхностной стерилизации 0,1% раствором хлорида ртути (HgCl2) в течение 5 минут и последующей стерилизации 15% раствором гипохлорида калия в течение 7 минут культивировали на питательной среде МС, содержащей БАП 0,2 мг/л и наночастицы оксида кремния в различных концентрациях (0-10 мг/л) для изучения их влияния на рост и укоренение микропобегов in vitro, образование фотосинтетических пигментов, фенольных соединений в тканях и активность специфических антиоксидантных ферментов. Недостатком способа является применение ступенчатой стерилизации растительного материала и использование высоких концентраций и временных экспозиций разносоставных стерилизующих веществ, а также применение наночастиц, которые трудно получить самостоятельно в лаборатории.The closest in technical essence to the proposed method, taken as a prototype, is the method of clonal micropropagation of evergreen sequoia [Lobna S. Tahal, Walaa N. Salama2, Azza AM Mazharl, Kh. I. Hashish 1, Iman M. El-Sayed A comparative study of biochemical changes on micropropagated Sequoia sempervirens using potassium silicate and silica nanoparticles // Journal of Pharmaceutical Negative Results, 2022, Volume 13, Special Issue 8, p.2592-2601] using as an object of research shoots isolated from adult plants, which, after surface sterilization with a 0.1% solution of mercuric chloride (HgCl 2 ) for 5 minutes and subsequent sterilization with a 15% solution of potassium hypochloride for 7 minutes, were cultivated on the MS nutrient medium, containing BAP 0.2 mg/l and silicon oxide nanoparticles in various concentrations (0-10 mg/l) to study their effect on the growth and rooting of microshoots in vitro, the formation of photosynthetic pigments, phenolic compounds in tissues and the activity of specific antioxidant enzymes. The disadvantage of this method is the use of stepwise sterilization of plant material and the use of high concentrations and temporary exposures of various sterilizing substances, as well as the use of nanoparticles that are difficult to obtain independently in the laboratory.
В результате анализа литературных данных и патентного поиска установлено, что исследования, направленные на разработку способа размножения in vitro секвойи вечнозеленой с использованием вегетативных органов растений начиная от получения асептической культуры и заканчивая адаптацией микроклонов секвойи к условиям ex vitro - отсутствуют. Использование вегетативных органов растений позволяет получать высококачественный, генетически однородный посадочный материал.As a result of an analysis of literature data and a patent search, it was established that there are no studies aimed at developing a method for in vitro propagation of evergreen sequoia using vegetative organs of plants, from obtaining an aseptic culture to the adaptation of sequoia microclones to ex vitro conditions. The use of vegetative organs of plants makes it possible to obtain high-quality, genetically homogeneous planting material.
Задача предполагаемого изобретения - разработать способ клонального микроразмножения секвойи вечнозеленой (Sequoia sempervirens) за счет использования вегетативных частей растения.The objective of the proposed invention is to develop a method for clonal micropropagation of evergreen sequoia (Sequoia sempervirens) through the use of vegetative parts of the plant.
Технический результат изобретения - обеспечение ускоренного получения высококачественного, генетически однородного посадочного материала.The technical result of the invention is to ensure accelerated production of high-quality, genetically homogeneous planting material.
Поставленная задача достигается за счет того, что в качестве первичного экспланта используют побеги, изолированные со взрослых растений секвойи, которые первоначально выдерживают в 0,2%-ном растворе ИМК в течение 2 часов, затем проводят поверхностную стерилизацию и потом культивируют в течение 20-30 суток на безгормонольной питательной среде Мурасига и Скуга (МС) [Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - vol. 5, 95 - P. 473-497] с добавлением поливинил пиролидона (ПВП) 1 г/л. Для роста побеги переносят на питательную среду, содержащую 2 мг/л 2,4-Д, 2 мг/л БАП и 1 г/л ПВП. После двух циклов культивирования (по 35-40 суток) микропобеги переносят на питательную среду МС, дополненную 2 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л БАЛ, 0,5 мг/л НУК и 1 г/л ПВП для индукции образования адвентивных побегов и корней. Сформированные в условиях in vitro микроклоны в дальнейшем переносят для адаптации в почвенные условия ex vitro.This task is achieved due to the fact that shoots isolated from adult sequoia plants are used as a primary explant, which are initially kept in a 0.2% IBA solution for 2 hours, then surface sterilized and then cultivated for 20-30 days on the hormone-free nutrient medium of Murashige and Skoog (MS) [Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - vol. 5, 95 - P. 473-497] with the addition of polyvinyl pyrolidone (PVP) 1 g/l. For growth, shoots are transferred to a nutrient medium containing 2 mg/l 2,4-D, 2 mg/l BAP and 1 g/l PVP. After two cultivation cycles (35-40 days each), microshoots are transferred to MS nutrient medium supplemented with 2 mg/l 2,4-D, 0.5 mg/l BAL, 0.5 mg/l NAA and 1 g/l PVP to induce the formation of adventitious shoots and roots. Microclones formed under in vitro conditions are subsequently transferred to ex vitro soil conditions for adaptation.
Известных в научно-технической и патентной литературе способов клонального микроразмножения секвойи вечнозеленой с использованием вегетативных побегов и аналогичным составом питательной среды не обнаружено. Результат, полученный у данного решения и обусловленный применением питательной среды для размножения и укоренения in vitro и почвенного субстрата для адаптации ex vitro секвойи вечнозеленой не достигался в известных решениях.No methods of clonal micropropagation of evergreen sequoia using vegetative shoots and a similar composition of the nutrient medium known in the scientific, technical and patent literature have been found. The result obtained with this solution and due to the use of a nutrient medium for propagation and rooting in vitro and a soil substrate for ex vitro adaptation of evergreen sequoia was not achieved in known solutions.
Конкретный пример осуществления предполагаемого способа.A specific example of the proposed method.
В качестве первичного экспланта использовали черенки, заготовленные с побегов первого года вегетации со взрослых деревьев секвойи вечнозеленой в период с сентября по декабрь. Перед введением в культуру in vitro черенки выдерживали в 0,2%-ном растворе ИМК в течение 2 часов, после чего проводят ступенчатую стерилизацию. Для этого первоначально черенки промывают мыльным раствором в течение 10 минут, затем споласкивают проточной водой 2 минуты, выдерживают в слабом растворе марганцовки 10 мин. После этого в условиях ламинар-бокса черенки стерилизуют 0,1% раствором хлорида ртути (HgCl2) 18 минут и трижды промывают стерильной дистиллированной водой. Затем черенки разрезают скальпелем на сегменты длиной 1,5-2 см с сохранением хвои в количестве 7-10 шт. и помещают в биологические пробирки диаметром 20 мм на безгормональную питательную модифицированную МС с добавлением поливинил пиролидона (ПВП) 1 г/л. рН питательной среды МС доводят до 5,8 перед автоклавированием. В этих условиях микрочеренки культивируют 20-30 суток до формирования из верхушечных и боковых почек побегов, которые в дальнейшем отделяют от материнского экспланта и самостоятельно культивируют на питательной среде МС дополненной 2 мг/л 2,4-Д, 2 мг/л БАП и ПВП 1 г/л. После двух циклов культивирования (по 35-40 суток) вновь образованные множественные микропобеги (длиной не более 3 см) переносят для дальнейшего роста и укоренения на питательную среду МС, дополненную 2 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л БАП, 0,5 мг/л НУК и 1 г/л ПВП. В этих условиях наблюдается активное образование адвентивных побегов в базальной части главного побега, которые в процессе культивирования через каллусную «подушку» формируют корни. Сформированные в условиях in vitro микроклоны в дальнейшем переносят для адаптации в почвенные условия ex vitro.Cuttings taken from shoots of the first year of vegetation from mature evergreen sequoia trees from September to December were used as the primary explant. Before being introduced into in vitro culture, the cuttings were kept in a 0.2% IBA solution for 2 hours, after which stepwise sterilization was carried out. To do this, the cuttings are initially washed with soapy water for 10 minutes, then rinsed with running water for 2 minutes, and kept in a weak solution of potassium permanganate for 10 minutes. After this, in a laminar box, the cuttings are sterilized with a 0.1% solution of mercuric chloride (HgCl 2 ) for 18 minutes and washed three times with sterile distilled water. Then the cuttings are cut with a scalpel into segments 1.5-2 cm long, leaving 7-10 needles. and placed in biological tubes with a diameter of 20 mm on a hormone-free nutrient modified MS with the addition of polyvinyl pyrrolidone (PVP) 1 g/l. The pH of the MS culture medium is adjusted to 5.8 before autoclaving. Under these conditions, microcuttings are cultivated for 20-30 days until shoots are formed from apical and lateral buds, which are subsequently separated from the mother explant and independently cultivated on MS nutrient medium supplemented with 2 mg/l 2,4-D, 2 mg/l BAP and PVP 1 g/l. After two cultivation cycles (35-40 days each), newly formed multiple microshoots (no more than 3 cm long) are transferred for further growth and rooting to MS nutrient medium supplemented with 2 mg/l 2,4-D, 0.5 mg/l BAP, 0.5 mg/l NAA and 1 g/l PVP. Under these conditions, active formation of adventitious shoots is observed in the basal part of the main shoot, which, during cultivation, form roots through the callus “cushion”. Microclones formed under in vitro conditions are subsequently transferred to ex vitro soil conditions for adaptation.
Изобретение проиллюстрировано на рисунках.The invention is illustrated in the drawings.
На фиг.1 Молодые побеги, изолированные со взрослых деревьев секвойи, перед введением в культуру in vitroFigure 1: Young shoots isolated from mature sequoia trees before introduction into in vitro culture
На фиг.2 Асептическая культура Sequoia sempervirens и рост верхушечной почки после стерилизации 0,1% HgCl2 в течение 18 минутFigure 2 Aseptic culture of Sequoia sempervirens and growth of the apical bud after sterilization with 0.1% HgCl 2 for 18 minutes
На фиг.3 Формирование адвентивных побегов в базальной части главного побегаFigure 3 Formation of adventitious shoots in the basal part of the main shoot
На фиг.4 Формирование микропобегов, готовых к укоренениюFigure 4 Formation of microshoots ready for rooting
На фиг.5 Образование корневой системы на этапе укорененияFigure 5 Formation of the root system at the rooting stage
На фиг.6 Адаптация микроклонов Sequoia sempervirens к условиям ех vitro.Figure 6 Adaptation of Sequoia sempervirens microclones to ex vitro conditions.
Пример 1. Для получения стерильной культуры черенков применяли ступенчатую стерилизацию. Перед введением в культуру in vi tro че ренки секвойи разрезают и выдерживают в 0,2%-ном растворе ИМК в течение 2 часов. Затем их промывают мыльным раствором в течение 10 минут, споласкивают проточной водой 2 минуты, выдерживают в слабом растворе марганцовки 10 мин. Последующие действия проводят в условиях ламинар-бокса. Черенки помещают в мешочки из марли и переносят в ламинар-бокс, где проводят поверхностную стерилизацию 0,1% раствором хлорида ртути (HgCl2). Временная экспозиция хлорида ртути была от 15 до 20 минут. В качестве контроля черенки обрабатывали гипохлоритом натрия (7%) в течение 15 минуты. После этого черенки промывают стерильной дистиллированной водой 3 раза, разрезают скальпелем на сегменты длиной 1,5-2 см с сохранением хвои в количестве 7-10 шт. и помещают в биологические пробирки диаметром 20 мм на безгормональную питательную среду МС. Оценивали количество стерильных и зараженных черенков. Основные результаты приведены в таблице 1 и рисунках 1 и 2.Example 1. To obtain a sterile culture of cuttings, stepwise sterilization was used. Before introducing into in vitro culture, sequoia cuttings are cut and kept in a 0.2% IBA solution for 2 hours. Then they are washed with soapy water for 10 minutes, rinsed with running water for 2 minutes, and kept in a weak solution of potassium permanganate for 10 minutes. Subsequent actions are carried out in a laminar flow hood. The cuttings are placed in gauze bags and transferred to a laminar box, where surface sterilization is carried out with a 0.1% solution of mercuric chloride (HgCl 2 ). Temporary exposure to mercuric chloride was from 15 to 20 minutes. As a control, cuttings were treated with sodium hypochlorite (7%) for 15 minutes. After this, the cuttings are washed with sterile distilled water 3 times, cut with a scalpel into segments 1.5-2 cm long, leaving 7-10 needles. and placed in biological tubes with a diameter of 20 mm on a hormone-free MS nutrient medium. The number of sterile and infected cuttings was assessed. The main results are shown in Table 1 and Figures 1 and 2.
На основании проведенных исследований установлено, что наибольший выход стерильных эксплантов (80%) был получен при временной экспозиции воздействия хлорида ртути на черенки секвойи вечнозеленой 18 минут. В этом варианте на 20-30 сутки культивирования отмечалось формирование побегов из спящих почек, которые характеризовались активным ростом и имели ярко-зеленую хвою. Использование гипохлорита натрия, в качестве стерилизатора, было не эффективно из-за низкой жизнеспособности эксплантов и повсеместных некротических очагов.Based on the studies conducted, it was established that the highest yield of sterile explants (80%) was obtained with a temporary exposure of evergreen sequoia cuttings to mercury chloride for 18 minutes. In this variant, on the 20-30th day of cultivation, the formation of shoots from dormant buds was observed, which were characterized by active growth and had bright green needles. The use of sodium hypochlorite as a sterilizer was not effective due to the low viability of explants and widespread necrotic lesions.
Пример 2. Стерилизацию черенков проводили по методике, описанной в примере 1. После поверхностной стерилизации, черенки разделяли на сегменты длиной 1,5-2 см с сохранением хвои в количестве 7-10 шт. и культивировали на безгормональной питательной среде, содержащей различные минеральные соли и антиоксиданты. Исследовали влияние минеральных солей по прописи Мурасига и Скуга и минеральные соли по прописи Woody Plant Medium (WPM) на биометрические показатели побегов и коэффициент размножения. Результаты приведены в таблице 2 и на рисунках 3 и 4.Example 2. Sterilization of cuttings was carried out according to the method described in example 1. After surface sterilization, the cuttings were divided into segments 1.5-2 cm long, retaining needles in the amount of 7-10 pieces. and cultured on a hormone-free nutrient medium containing various mineral salts and antioxidants. The influence of mineral salts according to the Murashiga and Skoog recipe and mineral salts according to the Woody Plant Medium (WPM) recipe on the biometric parameters of shoots and the reproduction rate were studied. The results are shown in Table 2 and Figures 3 and 4.
На основании проведенных экспериментов установлено, что исследуемые питательные среды, отличающиеся по минеральному составу, оказывают различное влияние на рост верхушечных и пазушных почек. Причем, действие минеральных солей по прописи МС превышало действие солей по WPM. В варианте с МС наблюдали активный рост верхушечных и пазушных почек и формирование побегов высотой более 12 см. Побеги имели ярко-зеленый цвет стеблей и хвои.Based on the experiments conducted, it was established that the studied nutrient media, which differ in mineral composition, have different effects on the growth of apical and axillary buds. Moreover, the effect of mineral salts according to MS prescription exceeded the effect of salts according to WPM. In the variant with MS, active growth of apical and axillary buds and the formation of shoots more than 12 cm high were observed. The shoots had a bright green color of stems and needles.
Пример 3. Получение микропобегов проводили по методике, описанной в примере 2. Изучали влияние гормонального состава питательной среды на микроразмножение и укоренение микропобегов. Для этого в состав питательной среды добавляли различные регуляторы роста (ауксины и цитокиины) в различных концентрациях и сочетаниях. В качестве цитокининов исследовали БАП и НУК в концентраци 2 мг/л и 0,5 мг/л соответственно, а в качестве ауксинов - 2 мг/л 2,4-Д. Во все питательные среды добавляли 1 г/л ПВП. Результаты приведены в таблице 3 и на рисунке 4 и 5.Example 3. The production of microshoots was carried out according to the method described in example 2. The influence of the hormonal composition of the nutrient medium on micropropagation and rooting of microshoots was studied. For this purpose, various growth regulators (auxins and cytokiins) were added to the nutrient medium in various concentrations and combinations. BAP and NAA were studied as cytokinins at a concentration of 2 mg/l and 0.5 mg/l, respectively, and 2,4-D as auxins. All culture media were supplemented with 1 g/L PVP. The results are shown in Table 3 and Figures 4 and 5.
На основании проведенных исследований установлено, что наилучшие результаты по размножению и укоренению микропобегов секвой вечнозеленой были получены на питательной среде МС, содержащей 2 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л БАП, 0,5 мг/л НУК. В этих условиях формировались побеги высотой 12. см, коэффициент размножения составил 9,4 а укореняемость - более 70%. В остальных вариантах питательных сред, учитываемые показатели были существенно ниже.Based on the studies conducted, it was established that the best results for the propagation and rooting of evergreen sequoia microshoots were obtained on the MS nutrient medium containing 2 mg/l 2,4-D, 0.5 mg/l BAP, 0.5 mg/l NAA. Under these conditions, shoots with a height of 12 cm were formed, the reproduction coefficient was 9.4 and the rooting rate was more than 70%. In other variants of nutrient media, the taken into account indicators were significantly lower.
В результате проведения цикла исследований был разработан способ клонального микроразмножения секвойи вечнозеленой (Sequoia sempervirens L.), включающий предварительную обработку черенков 0,2%-ным раствором ИМК, проведение ступенчатой стерилизации, культивирование сегментов черенков на безгормональной питательной среде МС, с последующим культивированием на среде, содержащей минеральные соли по прописи МС, дополненной 2 мг/л 2,4-Д, 2 мг/л БАП на этапе размножения и содержащей 2 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л БАП, 0,5 мг/л НУК на этапе укоренения.As a result of a series of studies, a method of clonal micropropagation of evergreen sequoia (Sequoia sempervirens L.) was developed, including pre-treatment of cuttings with a 0.2% IBA solution, stepwise sterilization, cultivation of segments of cuttings on a hormone-free MS nutrient medium, followed by cultivation on the medium , containing mineral salts according to the MS prescription, supplemented with 2 mg/l 2,4-D, 2 mg/l BAP at the reproduction stage and containing 2 mg/l 2,4-D, 0.5 mg/l BAP, 0.5 mg/l NAA at the rooting stage.
Предлагаемый способ микроразмножения секвойи вечнозеленой in vitro сочетает ряд положительных свойств, которые позволяют использовать его в практической работе и для получения высококачественного, генетически однородного посадочного материала реликтовых хвойных растений:The proposed method of micropropagation of evergreen sequoia in vitro combines a number of positive properties that allow it to be used in practical work and to obtain high-quality, genetically homogeneous planting material of relict coniferous plants:
1. Технология предполагает получение генетически однородный материал за счет образования побегов непосредственно на первичном экспланте, минуя образование каллусной ткани.1. The technology involves obtaining genetically homogeneous material through the formation of shoots directly on the primary explant, bypassing the formation of callus tissue.
2. Технология предполагает проведение работ по размножению и получению ценного посадочного материала в лабораторных условиях не зависимо от сезона и негативных факторов окружающей среды.2. The technology involves carrying out work on propagation and obtaining valuable planting material in laboratory conditions, regardless of the season and negative environmental factors.
3. Предлагаемая технология легка в исполнении и не требует привлечения дорогостоящего оборудования и специфических питательных сред.3. The proposed technology is easy to implement and does not require the use of expensive equipment and specific nutrient media.
4. Предлагаемый способ размножения предполагает ускоренное получение высококачественного, генетически однородного посадочного материала, за счет отсутствия третьего этапа клонального микрорамзножения - укоренения.4. The proposed method of propagation involves the accelerated production of high-quality, genetically homogeneous planting material, due to the absence of the third stage of clonal micropropagation - rooting.
5. Предлагаемый способ является универсальным для клонирования реликтовых хвойных растений с высоким содержанием биологически активных веществ.5. The proposed method is universal for cloning relict coniferous plants with a high content of biologically active substances.
Заявляемое изобретение обеспечит ускоренное получение высококачественного, генетически однородного посадочного материала секвойи вечнозеленой.The claimed invention will provide accelerated production of high-quality, genetically homogeneous planting material for evergreen sequoia.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2815450C1 true RU2815450C1 (en) | 2024-03-15 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2759451C1 (en) * | 2020-09-29 | 2021-11-15 | Общество с ограниченной ответственностью "СИББИОТЕХ" | Method for increasing the efficiency of clonal micro-propagation of evergreen varieties of rhododendron |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2759451C1 (en) * | 2020-09-29 | 2021-11-15 | Общество с ограниченной ответственностью "СИББИОТЕХ" | Method for increasing the efficiency of clonal micro-propagation of evergreen varieties of rhododendron |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LOBNA S. et al. A comparative study of biochemical changes on micropropagated Sequoia sempervirens using potassium silicate and silica nanoparticles, Journal of Pharmaceutical Negative Results, 2022, Volume 13, Special Issue 8, p.2592-2601. SARBU, G. et al. Morpho-anatomical studies on vegetative organs of Sequoia sempervirens, in vitro culture on carbon microstructure substrates, Acta Horti Bot. 2008. 35:51-59. MARIE-CLAUDE Bon, Influence of phase change within a 90-year-old Sequoiasempervirens on its in vitro organogenic capacity and protein patterns, Trees, 1994, 8:283-287. MURASHIGE Т. et al. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant. - 1962. - vol. 5, 95 - P. 473-497. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Batukaev et al. | Use of growth regulators in grapes grinding by in vitro method | |
| Nongdam et al. | Establishment of an efficient in vitro regeneration protocol for rapid and mass propagation of Dendrobium chrysotoxum Lindl. using seed culture | |
| Lodha et al. | A high-frequency in vitro multiplication, micromorphological studies and ex vitro rooting of Cadaba fruticosa (L.) Druce (Bahuguni): a multipurpose endangered medicinal shrub | |
| Batukayev et al. | In vitro reproduction and ex vitro adaptation of complex resistant grape varieties | |
| KR20140040513A (en) | Production of virus free plants from in vitro shoot tips through in vitro meristem culture | |
| KR102200064B1 (en) | Method of producing virus free M.9 and M.26 dwarf apple tree rootstock using apical meristem culture | |
| CA3195270A1 (en) | Methods and compositions for axillary shoot micropropagation of cannabis and related plants | |
| Erst et al. | In vitro propagation of rare species Rhodiola rosea from Altai Mountains | |
| RU2757318C1 (en) | Method for obtaining microplants of medicinal plant stephania glabra (roxb.) miers | |
| Orazov et al. | Callus induction with 6-BAP and IBA as a way to preserve Prunus ledebouriana (Rosaceae), and endemic plant of Altai and Tarbagatai, East Kazakhstan | |
| RU2815450C1 (en) | Method for clonal micropropagation of coast redwoods (sequoia sempervirens linnaeus) | |
| Singh et al. | Plant regeneration from alginate-encapsulated somatic embryos of Dalbergia sissoo Roxb. | |
| Kumar | Somatic embryogenesis and high frequency plantlet regeneration in callus cultures of Thevetia peruviana | |
| Buntsevich et al. | Improvement of the efficiency of sanitation and primary propagation technology of garden straw-berry in in vitro culture | |
| KR100257991B1 (en) | Propagation of eleutherococcus senticosus max. by embryo | |
| Samanta et al. | In vitro clonal propagation, organogenesis and somatic embryogenesis in Bacopa monnieri (L.) Wettst | |
| Malaeva et al. | Regeneration peculiarities of in vitro berry cultures | |
| Sanago et al. | Morphoregulatory role of thidiazuron: morphogenesis of root outgrowths in thidiazuron-treated geranium (Pelargonium x hortorum Bailey) | |
| Pehwal et al. | Augmented shelf-life and regeneration competence of activated charcoal (AC) supplemented synthetic seeds in Cymbidium pendulum (Roxb.) Sw. | |
| Kanungo et al. | Development of a simplified protocol for in vitro propagation of a valuable medicinal plant Plumbago zeylanica Linn. through nodal explants found in Odisha, India | |
| RU2735622C2 (en) | Method of reducing vitrification of walnut microplants in culture in vitro | |
| Yadav et al. | Influence of explanting season on in vitro multiplication of Celastrus paniculatus Willd.–An endangered medicinal herb | |
| Chandimali et al. | Seaweed callus culture: A comprehensive review of current circumstances and future perspectives | |
| RU2479992C1 (en) | Method of microclonal propagation of siberian flag-leaf (i.sibirica i.) | |
| Antwi et al. | Influence of growth regulators on microclonal propagation of Scrophularia umbrosa Dumort under in vitro conditions |