RU2812977C1 - Beta-hairpin peptide with antimicrobial activity against multidrug-resistant bacteria - Google Patents
Beta-hairpin peptide with antimicrobial activity against multidrug-resistant bacteria Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812977C1 RU2812977C1 RU2023102673A RU2023102673A RU2812977C1 RU 2812977 C1 RU2812977 C1 RU 2812977C1 RU 2023102673 A RU2023102673 A RU 2023102673A RU 2023102673 A RU2023102673 A RU 2023102673A RU 2812977 C1 RU2812977 C1 RU 2812977C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- beta
- abarenicin
- activity against
- amps
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 12
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 title claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 19
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 11
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 claims description 8
- 241000588626 Acinetobacter baumannii Species 0.000 claims description 4
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 claims description 3
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 claims description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 abstract description 29
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 abstract description 29
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 abstract description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 10
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 abstract description 7
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 abstract description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 241000438247 Abarenicola pacifica Species 0.000 abstract description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 206010061126 Escherichia infection Diseases 0.000 abstract 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 12
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 12
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 5
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 229940041153 polymyxins Drugs 0.000 description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 101100361281 Caenorhabditis elegans rpm-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 241001360526 Escherichia coli ATCC 25922 Species 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 4
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 4
- SOVUOXKZCCAWOJ-HJYUBDRYSA-N (4s,4as,5ar,12ar)-9-[[2-(tert-butylamino)acetyl]amino]-4,7-bis(dimethylamino)-1,10,11,12a-tetrahydroxy-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1C2=C(N(C)C)C=C(NC(=O)CNC(C)(C)C)C(O)=C2C(O)=C2[C@@H]1C[C@H]1[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]1(O)C2=O SOVUOXKZCCAWOJ-HJYUBDRYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010078777 Colistin Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 3
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 3
- 229960003346 colistin Drugs 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(3s,6s,9s,12s,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1r)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-h Chemical compound CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O.CCC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N polymyxin E1 Natural products CCC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N polymyxin E2 Natural products CC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 229960004089 tigecycline Drugs 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241001240958 Pseudomonas aeruginosa PAO1 Species 0.000 description 2
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940041011 carbapenems Drugs 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 2
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 229940124307 fluoroquinolone Drugs 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 2
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- -1 β-cyanoethyldiisopropylamino Chemical group 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- NBWRJAOOMGASJP-UHFFFAOYSA-N 2-(3,5-diphenyl-1h-tetrazol-1-ium-2-yl)-4,5-dimethyl-1,3-thiazole;bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1N1N(C=2C=CC=CC=2)N=C(C=2C=CC=CC=2)[NH2+]1 NBWRJAOOMGASJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000983381 Adenium Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010050820 Antimicrobial Cationic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000014133 Antimicrobial Cationic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 description 1
- NONSEUUPKITYQT-BQBZGAKWSA-N Arg-Asn-Gly Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)NCC(=O)O)N)CN=C(N)N NONSEUUPKITYQT-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HCIUUZGFTDTEGM-NAKRPEOUSA-N Arg-Ile-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N HCIUUZGFTDTEGM-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 102220571098 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 7_M37L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AMRLSQGGERHDHJ-FXQIFTODSA-N Cys-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AMRLSQGGERHDHJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108010002069 Defensins Proteins 0.000 description 1
- 102000000541 Defensins Human genes 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- WRFOZIJRODPLIA-QWRGUYRKSA-N Gly-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN)O WRFOZIJRODPLIA-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- GMWNQSGWWGKTSF-LFSVMHDDSA-N Phe-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GMWNQSGWWGKTSF-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- 241000243820 Polychaeta Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010070741 Tachypleus tridentatus tachyplesin peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229940042052 antibiotic for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229960000308 fosfomycin Drugs 0.000 description 1
- YMDXZJFXQJVXBF-STHAYSLISA-N fosfomycin Chemical compound C[C@@H]1O[C@@H]1P(O)(O)=O YMDXZJFXQJVXBF-STHAYSLISA-N 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 244000000058 gram-negative pathogen Species 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010060845 lactose permease Proteins 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001869 matrix assisted laser desorption--ionisation mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108060004734 metallo-beta-lactamase Proteins 0.000 description 1
- 102000020235 metallo-beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 235000013324 preserved food Nutrition 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- XZNXVSDNACTASG-RZNNTOFGSA-M sodium;3,5-diacetamido-2,4,6-triiodobenzoate;3,5-diacetamido-2,4,6-triiodobenzoic acid;(2r,3r,4r,5s)-6-(methylamino)hexane-1,2,3,4,5-pentol Chemical compound [Na+].CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(O)=O)=C1I.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I XZNXVSDNACTASG-RZNNTOFGSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине и ветеринарии. Пептид абареницин, обладающий антимикробным действием в отношении бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, имеет следующую аминокислотную последовательность: Gly1-Tyr2-Cys3-Phe4-Thr5-Ala6-Cys7-Ala8-Arg9-Arg10-Asn11-Gly12-Val13-Arg14-Ile15-Cys16-Tyr17-Arg18-Arg19-Cys20-Asn21 (SEQ ID No: 1).The invention relates to the field of biotechnology and can be used in medicine and veterinary medicine. The peptide abarenitsin, which has an antimicrobial effect against multidrug-resistant bacteria, has the following amino acid sequence: Gly 1 -Tyr 2 -Cys 3 -Phe 4 -Thr 5 -Ala 6 -Cys 7 -Ala 8 -Arg 9 -Arg 10 -Asn 11 -Gly 12 -Val 13 -Arg 14 -Ile 15 -Cys 16 -Tyr 17 -Arg 18 -Arg 19 -Cys 20 -Asn 21 (SEQ ID No: 1).
Мультирезистентные внутрибольничные бактериальные инфекции (ВБИ) все чаще становятся причиной смерти пациентов, подвергающихся инвазивным процедурам при лечении в стационарах. В условиях глобальной пандемии (например, COVID-19) критически возрастает нагрузка на систему здравоохранения, что может привести к резкому росту смертности от вторичных ВБИ, в первую очередь, вызванных патогенами группы «ESKAPE» (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacter spp.). В сложившейся ситуации снижения эффективности антибиотиков критически важной задачей для системы здравоохранения является создание резервных антимикробных препаратов, для которых минимален риск развития бактериальной резистентности. В последние годы значительное внимание ведущих мировых научных групп и фармацевтических компаний уделяется исследованию катионных антимикробных пептидов (АМП) - ключевых молекулярных факторов врожденного иммунитета живых организмов [Lazzaro, B.P.; Zasloff, M.; Rolff, J. Antimicrobial Peptides: Application Informed by Evolution. Science 2020, 368, eaau5480, doi:10.1126/science.aau5480.]. Принципиальными преимуществами коротких (16-22 а.о.) бета-шпилечных АМП являются сочетание быстрого бактерицидного эффекта за счет действия на мембрану патогена и, как следствие, низкая вероятность возникновения антибиотикорезистентности, а также высокой устойчивости к протеолизу [Panteleev, P.V.; Balandin, S.V.; Ivanov, V.T.; Ovchinnikova, T.V. A Therapeutic Potential of Animal β-Hairpin Antimicrobial Peptides. Curr Med Chem 2017, 24, 1724-1746, doi:10.2174/0929867324666170424124416]. Эти качества позволяют рассматривать бета-шпилечные АМП как прототипы индивидуальных антибиотиков для системного применения. Меньшие размеры молекулы и более простая пространственная организация, чем у большинства других цистеинсодержащих АМП (таких как дефенсины), упрощают задачу биотехнологического получения этих пептидов. Однако сравнительно высокая цитотоксичность (в т.ч. гемолитическая активность) многих природных пептидов ограничивает их применение в медицине. Недостатки АМП могут быть устранены, полностью или частично, путем модификации структуры природных соединений [Panteleev, P.V.; Bolosov, I.A.; Balandin, S.V.; Ovchinnikova, T.V. Design of Antimicrobial Peptide Arenicin Analogs with Improved Therapeutic Indices. J Pept Sci 2015, 21, 105-113, doi:10.1002/psc.2732].Multidrug-resistant hospital-acquired bacterial infections (HABIs) are increasingly becoming the cause of death in patients undergoing invasive procedures while being treated in hospitals. In the context of a global pandemic (for example, COVID-19), the burden on the healthcare system increases critically, which can lead to a sharp increase in mortality from secondary nosocomial infections, primarily caused by pathogens of the ESKAPE group ( Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Enterobacter spp.). In the current situation of reducing the effectiveness of antibiotics, a critical task for the healthcare system is the creation of reserve antimicrobial drugs for which the risk of developing bacterial resistance is minimal. In recent years, significant attention from the world's leading scientific groups and pharmaceutical companies has been paid to the study of cationic antimicrobial peptides (AMPs) - key molecular factors of the innate immunity of living organisms [Lazzaro, BP; Zasloff, M.; Rolff, J. Antimicrobial Peptides: Application Informed by Evolution. Science 2020 , 368 , eaau5480, doi:10.1126/science.aau5480.]. The principal advantages of short (16-22 aa) beta-hairpin AMPs are the combination of a rapid bactericidal effect due to the action on the pathogen membrane and, as a consequence, a low probability of antibiotic resistance, as well as high resistance to proteolysis [Panteleev, PV; Balandin, S. V.; Ivanov, V.T.; Ovchinnikova, TV A Therapeutic Potential of Animal β-Hairpin Antimicrobial Peptides. Curr Med Chem 2017 , 24 , 1724-1746, doi:10.2174/0929867324666170424124416]. These qualities allow us to consider beta-hairpin AMPs as prototypes of individual antibiotics for systemic use. The smaller molecular size and simpler spatial organization than most other cysteine-containing AMPs (such as defensins) simplify the biotechnological production of these peptides. However, the relatively high cytotoxicity (including hemolytic activity) of many natural peptides limits their use in medicine. The disadvantages of AMPs can be eliminated, completely or partially, by modifying the structure of natural compounds [Panteleev, PV; Bolosov, I.A.; Balandin, S. V.; Ovchinnikova, TV Design of Antimicrobial Peptide Arenicin Analogs with Improved Therapeutic Indices. J Pept Sci 2015 , 21 , 105-113, doi:10.1002/psc.2732].
Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения являются ранее открытые представители семейства бета-шпилечных АМП ареницинов, а также их модифицированные аналоги, например, АА139 (Фиг. 1) - пептид с доказанной высокой эффективностью антибактериального действия на мышиных моделях инфекции, разработкой и клиническими испытаниями которого занимается компания Adenium Biotech Pty Ltd. [Elliott, A.G.; Huang, J.X.; Neve, S.; Zuegg, J.; Edwards, I.A.; Cain, A.K.; Boinett, C.J.; Barquist, L.; Lundberg, C.V.; Steen, J.; et al. An Amphipathic Peptide with Antibiotic Activity against Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacteria. Nat Commun 2020, 11, 3184, doi:10.1038/s41467-020-16950-x]. Заявляемый пептид аналогично препарату АА139 действует на мембраны бактериальных клеток-мишеней и не проявляет существенных цитотоксических эффектов в отношении клеток человека в диапазоне концентраций до 64-128 мкМ, при этом обладает сравнительно более высокой антибактериальной активностью в отношении грамотрицательных микроорганизмов: среднее геометрическое значений минимальных ингибирующих концентраций (МИК) для абареницина составило 0,29 мкМ против 0,5 мкМ для АА139. Таким образом, в большинстве случаев ингибирующий антибактериальный эффект достигается при действии в субмикромолярных концентрациях, что указывает на высокую селективность действия заявляемого пептида. Техническим результатом изобретения является высокая антибактериальная активность заявляемого пептида в отношении грамотрицательных бактерий, в том числе в отношении штаммов с множественной лекарственной устойчивостью, а также при лечении инфицированных животных. Заявляемый пептид абареницин имеет катионную природу, состоит из 21 аминокислотного остатка, содержит две дисульфидные связи и не требуют осуществления ферментативных посттрансляционных модификаций, что делает предпочтительным его биотехнологическое получение в бактериальной системе. Заявляемый пептид может быть получен путем гетерологической экспрессии в бактериальной системе на основе Еscherichia coli, а также с помощью химического синтеза.The closest analogue of the claimed invention are previously discovered representatives of the family of beta-hairpin AMPs arenicins, as well as their modified analogues, for example, AA139 (Fig. 1) - a peptide with proven high antibacterial efficiency in mouse models of infection, the development and clinical trials of which are being carried out by the company Adenium Biotech Pty Ltd. [Elliott, A.G.; Huang, J. X.; Neve, S.; Zuegg, J.; Edwards, I.A.; Cain, A. K.; Boinett, C.J.; Barquist, L.; Lundberg, C. V.; Steen, J.; et al. An Amphipathic Peptide with Antibiotic Activity against Multidrug-Resistant Gram-Negative Bacteria. Nat Commun 2020 , 11 , 3184, doi:10.1038/s41467-020-16950-x]. The claimed peptide, similar to the drug AA139, acts on the membranes of bacterial target cells and does not exhibit significant cytotoxic effects against human cells in the concentration range up to 64-128 μM, while it has a relatively higher antibacterial activity against gram-negative microorganisms: the geometric mean of the minimum inhibitory concentrations (MIC) for abarenicin was 0.29 µM versus 0.5 µM for AA139. Thus, in most cases, the inhibitory antibacterial effect is achieved when acting in submicromolar concentrations, which indicates the high selectivity of the claimed peptide. The technical result of the invention is the high antibacterial activity of the claimed peptide against gram-negative bacteria, including strains with multidrug resistance, as well as in the treatment of infected animals. The claimed peptide abarenicin is of a cationic nature, consists of 21 amino acid residues, contains two disulfide bonds and does not require enzymatic post-translational modifications, which makes its biotechnological production in a bacterial system preferable. The inventive peptide can be obtained by heterologous expression in a bacterial system based on Escherichia coli , as well as by chemical synthesis.
Изобретение иллюстрируют графические материалыThe invention is illustrated by graphic materials
Фиг. 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей АМП. Квадратными скобками отмечен характер замыкания дисульфидных мостиков.Fig. 1. Alignment of amino acid sequences of AMPs. Square brackets indicate the nature of the closure of disulfide bridges.
Фиг. 2. Физическая карта плазмидного вектора для экспрессии бета-шпилечных полипептидов: pBR322 origin - участок инициации репликации плазмиды; AmpR - ген устойчивости к β-лактамным антибиотикам; T7 promoter - промотор транскрипции; T7 terminator - терминатор транскрипции; RBS - сайт связывания рибосомы; TrxA M37L - последовательность, кодирующая модифицированный тиоредоксин; His8 - последовательность, кодирующая восемь остатков гистидина; Aba - последовательность, кодирующая заявляемый пептид.Fig. 2. Physical map of the plasmid vector for the expression of beta-hairpin polypeptides: pBR322 origin - the site of initiation of plasmid replication; Amp R - resistance gene to β-lactam antibiotics; T7 promoter - transcription promoter; T7 terminator - transcription terminator; RBS - ribosome binding site; TrxA M37L - sequence encoding modified thioredoxin; His8 is a sequence encoding eight histidine residues; Aba is the sequence encoding the claimed peptide.
Фиг. 3. (А) Хроматограмма первичной очистки рекомбинантного пептида абареницина (SEQ ID No.1) методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (* - пик, соответствующий целевому пептиду). (Б) Хроматограмма повторной очистки рекомбинантного пептида абареницина (SEQ ID No.1) методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.Fig. 3. (A) Chromatogram of the primary purification of the recombinant abarenicin peptide (SEQ ID No.1) by reverse-phase HPLC (* - peak corresponding to the target peptide). (B) Repurification chromatogram of recombinant abarenicin peptide (SEQ ID No. 1) by reverse phase HPLC.
Фиг. 4. МАЛДИ масс-спектр рекомбинантного пептида абареницина (SEQ ID No.1), полученного генно-инженерным способом.Fig. 4. MALDI mass spectrum of the recombinant abarenicin peptide (SEQ ID No.1), obtained by genetic engineering.
Фиг. 5. Цитотоксическое действие АМП на человеческие эритроциты.Fig. 5. Cytotoxic effect of AMPs on human erythrocytes.
Фиг. 6. Цитотоксическое действие АМП на адгезионные клетки человека HEK293T.Fig. 6. Cytotoxic effect of AMPs on human HEK293T adhesion cells.
Фиг. 7. Фотометрическая оценка повышения проницаемости цитоплазматической мембраны бактерий E. coli ML-35p, вызванной АМП.Fig. 7. Photometric assessment of the increase in permeability of the cytoplasmic membrane of E. coli ML-35p bacteria caused by AMPs.
Фиг. 8. Эффективность антибиотического действия новых рекомбинантных АМП на мышиных моделях эшерихиозного перитонита. (А) Среднее количество бактерий E. coli 3421 E/19 в крови и промывных водах брюшной полости мышей линии BALB/c через 6 ч после заражения и через 5 ч после однократного внутривенного введения АМП и полимиксина B. Данные приведены в виде средних значений с учетом стандартного отклонения (**** достоверные различия с контролем без лечения, p ≤ 0,0001). (Б) Выживаемость мышей линии BALB/c при лечении летальной инфекции, вызываемой E. coli ATCC 25922, с использованием АМП или полимиксина B в присутствии муцина.Fig. 8. Efficiency of the antibiotic action of new recombinant AMPs in mouse models of Escherichia peritonitis. (A) The average number of E. coli 3421 E/19 bacteria in the blood and abdominal washings of BALB/c mice 6 hours after infection and 5 hours after a single intravenous administration of AMP and polymyxin B. Data are presented as average values with taking into account the standard deviation (**** significant differences with the control without treatment, p ≤ 0.0001). (B) Survival of BALB/c mice when treated with lethal E. coli ATCC 25922 infection using AMPs or polymyxin B in the presence of mucin.
Осуществление изобретенияCarrying out the invention
Задача изобретения заключается в расширении спектра пептидных антибиотиков, обладающих антибактериальным действием, в том числе против бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, при низком уровне цитотоксического и гемолитического действия, то есть обладающих высокой антибактериальной селективностью. Для ее достижения был проведен рациональный дизайн модифицированных аналогов природного β-шпилечного пептида Ab-1, который был обнаружен по результатам биоинформатического анализа транскриптома морской полихеты Abarenicola pacifica [Safronova, V.N.; Bolosov, I.A.; Kruglikov, R.N.; Korobova, O.V.; Pereskokova, E.S.; Borzilov, A.I.; Panteleev, P.V.; Ovchinnikova, T.V. Novel β-Hairpin Peptide from Marine Polychaeta with a High Efficacy against Gram-Negative Pathogens. Marine Drugs 2022, 20, 517, doi:10.3390/md20080517]. Пептид Ab-1 обладает высокой антибактериальной активностью и широким спектром антимикробного действия, однако, вместе с тем, обладает умеренным гемолитическим действием в отношении эритроцитов человека. Ранее было показано, что аминокислотные замены гидрофобных остатков на аланин, аргинин или серин в области β-поворота схожих по структуре АМП зачастую приводят к повышению селективности антибактериального действия за счет снижения цитотоксических свойств молекулы [anteleev, P.V.; Bolosov, I.A.; Balandin, S.V.; Ovchinnikova, T.V. Design of Antimicrobial Peptide Arenicin Analogs with Improved Therapeutic Indices. J Pept Sci 2015, 21, 105-113, doi:10.1002/psc.2732; Panteleev, P.V.; Myshkin, M.Y.; Shenkarev, Z.O.; Ovchinnikova, T.V. Dimerization of the Antimicrobial Peptide Arenicin Plays a Key Role in the Cytotoxicity but Not in the Antibacterial Activity. Biochem Biophys Res Commun 2017, 482, 1320-1326, doi:10.1016/j.bbrc.2016.12.035; Panteleev, P.V.; Ovchinnikova, T.V. Improved Strategy for Recombinant Production and Purification of Antimicrobial Peptide Tachyplesin I and Its Analogs with High Cell Selectivity. Biotechnol Appl Biochem 2017, 64, 35-42, doi:10.1002/bab.1456]. Аналогичный подход был использован при введении аминокислотных замен в одном, двух или трех положениях полипептидной цепи Ab-1. Остатки цистеина, участвующие в образовании дисульфидных связей, не подвергались мутациям, чтобы сохранить целостность пептидного остова и вторичную структуру, необходимые для проявления антимикробной активности. Результаты испытаний биологической активности панели аналогов показали, что вариант с заменами двух аминокислотных остатков (Фиг. 1, выделены жирным шрифтом), названный абареницином (SEQ ID No: 1), по сравнению с пептидом дикого типа обладает как увеличенной антибактериальной активностью в отношении целого ряда грамотрицательных бактерий, так и сниженной цитотоксичностью в отношении нормальных клеток млекопитающих.The objective of the invention is to expand the spectrum of peptide antibiotics that have an antibacterial effect, including against multidrug-resistant bacteria, with a low level of cytotoxic and hemolytic action, that is, with high antibacterial selectivity. To achieve this, a rational design of modified analogs of the natural β-hairpin peptide Ab-1 was carried out, which was discovered based on the results of a bioinformatics analysis of the transcriptome of the marine polychaete Abarenicola pacifica [Safronova, VN; Bolosov, I.A.; Kruglikov, R.N.; Korobova, O.V.; Pereskokova, E.S.; Borzilov, AI; Panteleev, P.V.; Ovchinnikova, TV Novel β-Hairpin Peptide from Marine Polychaeta with a High Efficacy against Gram-Negative Pathogens. Marine Drugs 2022 , 20 , 517, doi:10.3390/md20080517]. Peptide Ab-1 has high antibacterial activity and a wide spectrum of antimicrobial action, however, at the same time, it has a moderate hemolytic effect against human erythrocytes. It was previously shown that amino acid substitutions of hydrophobic residues with alanine, arginine or serine in the β-turn region of structurally similar AMPs often lead to increased selectivity of antibacterial action by reducing the cytotoxic properties of the molecule [anteleev, PV; Bolosov, I.A.; Balandin, S. V.; Ovchinnikova, TV Design of Antimicrobial Peptide Arenicin Analogs with Improved Therapeutic Indices. J Pept Sci 2015 , 21 , 105-113, doi:10.1002/psc.2732; Panteleev, P.V.; Myshkin, M.Y.; Shenkarev, ZO; Ovchinnikova, TV Dimerization of the Antimicrobial Peptide Arenicin Plays a Key Role in the Cytotoxicity but Not in the Antibacterial Activity. Biochem Biophys Res Commun 2017, 482, 1320-1326, doi:10.1016/j.bbrc.2016.12.035; Panteleev, P.V.; Ovchinnikova, TV Improved Strategy for Recombinant Production and Purification of Antimicrobial Peptide Tachyplesin I and Its Analogs with High Cell Selectivity. Biotechnol Appl Biochem 2017, 64, 35-42, doi:10.1002/bab.1456]. A similar approach was used when introducing amino acid substitutions in one, two or three positions of the Ab-1 polypeptide chain. The cysteine residues involved in the formation of disulfide bonds were not mutated to maintain the integrity of the peptide backbone and secondary structure necessary for antimicrobial activity. The results of tests of the biological activity of a panel of analogues showed that the variant with substitutions of two amino acid residues (Fig. 1, highlighted in bold), called abarenicin (SEQ ID No: 1), compared with the wild type peptide, has both increased antibacterial activity against a number of gram-negative bacteria and reduced cytotoxicity towards normal mammalian cells.
Получение плазмидной конструкции для гетерологической экспрессии абареницина в составе гибридного белкаPreparation of a plasmid construct for heterologous expression of abarenicin as part of a hybrid protein
Нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2, кодирующую целевой пептид (включающий N-концевой остаток метионина - сайт расщепления бромцианом), получают химико-ферментативным синтезом с помощью ПЦР и праймеров, несущих на 5’-концах сайты узнавания рестриктаз BglII и EcoRI. Олигонуклеотиды, используемые в ПЦР, синтезируют твердофазным фосфорамидитным методом с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3’-конца к 5’-концу с помощью защищенных фосфорамидитов - 5’-диметокситритил-N-ацил-2’-дезоксинуклеозид-3’-O-(β-цианэтилдиизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Продукт амплификации гидролизуют указанными рестриктазами, очищают электрофорезом в 1,5% агарозном геле, целевую полосу ДНК выделяют из геля с помощью колонки с силикагелем и лигируют в экспрессионный вектор серии pET для дальнейшего биосинтеза целевого пептида в составе гибридного белка с модифицированным тиоредоксином А. С целью осуществления металлохелатной очистки гибридного белка от других компонентов клеточного лизата в его структуре был предусмотрен N-концевой фрагмент из восьми остатков гистидина. В результате лигазной реакции получают кольцевую ковалентно замкнутую ДНК размером 4067 п.н. (Фиг. 2). Продуктами лигазной реакции трансформируют компетентные клетки E. coli DH10B, приготовленные с помощью 0,1 М хлорида кальция. После трансформации суспензию бактерий смешивают с питательной средой LB, растят 60 мин при 37°C и высевают на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина.Nucleotide sequence SEQ ID No. 2, encoding the target peptide (including an N-terminal methionine residue - a cyanogen bromide cleavage site), is obtained by chemical-enzymatic synthesis using PCR and primers carrying restriction enzyme recognition sites BglII and EcoRI at the 5' ends. Oligonucleotides used in PCR are synthesized by the solid-phase phosphoramidite method with the extension of the oligonucleotide chain in the direction from the 3'-end to the 5'-end using protected phosphoramidites - 5'-dimethoxytrityl-N-acyl-2'-deoxynucleoside-3'-O- (β-cyanoethyldiisopropylamino)-phosphites activated by tetrazole. The amplification product is hydrolyzed with the indicated restriction enzymes, purified by electrophoresis in a 1.5% agarose gel, the target DNA band is isolated from the gel using a silica gel column and ligated into an expression vector of the pET series for further biosynthesis of the target peptide as part of a hybrid protein with modified thioredoxin A. For the purpose to carry out metal chelate purification of the hybrid protein from other components of the cell lysate, an N-terminal fragment of eight histidine residues was provided in its structure. As a result of the ligase reaction, a circular covalently closed DNA of 4067 bp in size is obtained. (Fig. 2). The products of the ligase reaction transform competent E. coli DH10B cells prepared with 0.1 M calcium chloride. After transformation, the bacterial suspension is mixed with LB nutrient medium, grown for 60 min at 37°C and sown on Petri dishes with LB agar containing 100 μg/ml ampicillin.
Первичный отбор клонов, содержащих нужную плазмиду, осуществляют методом «ПЦР с клонов». Отобранные клоны подращивают в жидкой питательной среде и выделяют плазмидную ДНК, которую анализируют на наличие вставки с помощью секвенирования по Сэнгеру. По данным секвенирования отбирают плазмиду со вставкой, нуклеотидная последовательность которой полностью соответствует запланированной (SEQ ID No. 2).The primary selection of clones containing the desired plasmid is carried out using the “PCR from clones” method. Selected clones are grown in a liquid nutrient medium and plasmid DNA is isolated, which is analyzed for the presence of the insert using Sanger sequencing. According to the sequencing data, a plasmid with an insert is selected, the nucleotide sequence of which fully corresponds to the planned one (SEQ ID No. 2).
Получение рекомбинантного абареницинаPreparation of recombinant abarenicin
Проводят трансформацию компетентных клеток E. coli ClearColi® BL21(DE3), приготовленных с помощью 0,1 М хлорида кальция, плазмидным вектором, сборка которого описана в примере 1. Использование данного штамма сводит к минимуму риск контаминации препарата бактериальным эндотоксином, что позволяет использовать рекомбинантный пептид в биологических испытаниях на животных. После трансформации суспензию бактерий смешивают с питательной средой LB, растят 1 ч при 37°C и высевают на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина и 0,02 М глюкозы. Чашки инкубируют при 37°C в течение 18 ч.Competent cells of E. coli ClearColi® BL21(DE3), prepared with 0.1 M calcium chloride, are transformed with a plasmid vector, the assembly of which is described in example 1. The use of this strain minimizes the risk of contamination of the drug with bacterial endotoxin, which allows the use of recombinant peptide in biological tests on animals. After transformation, the bacterial suspension is mixed with LB nutrient medium, grown for 1 hour at 37°C and sown on Petri dishes with LB agar containing 100 μg/ml ampicillin and 0.02 M glucose. The dishes are incubated at 37°C for 18 hours.
Бактериологической петлей переносят выросшие колонии в 10 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, растят в течение 18 ч на термостатируемой качалке со скоростью вращения 220 об•мин-1 при температуре 37°C. Полученную культуру засевают в жидкую забуференную питательную среду LB, содержащую 0,02 М глюкозы, 100 мкг/мл ампициллина, 1 мМ MgSO4 и 0,1 мМ CaCl2. При этом начальная OD600 составляет 0,05. Индукцию биосинтеза гибридного белка осуществляют путем добавления изопропилтио-β-D-галактопиранозида (IPTG) к культуре клеток с оптической плотностью 1,0 до конечной концентрации 0,3 мМ. Культуру растят в течение 16 ч при температуре 30°С на термостатируемой качалке со скоростью вращения 220 об•мин-1. После экспрессии клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в фосфатном буфере (pH 7,8) с добавлением 6М гуанидина гидрохлорида и 20 мМ имидазола при помощи стеклянного гомогенизатора Поттера и разрушают путем ультразвуковой обработки. Лизат клеток центрифугируют при 25000 g в течение 40 мин. Все работы по получению осветленного лизата проводят при температуре 4°С. Очистку гибридного белка, содержащего в качестве аффинной метки октагистидиновую последовательность, осуществляют с помощью металлохелатной хроматографии на препаративной колонке с Ni-NTA агарозой в денатурирующих условиях. Элюцию проводят повышением концентрации имидазола в буфере до 0,5 М. Собранную после очистки с помощью металлохелатной хроматографии фракцию, содержащую гибридный белок, титруют концентрированной соляной кислотой до значения pH 1,0, после чего добавляют бромциан (1 г бромциана на 1 г белка) и выдерживают при температуре 25°С в защищенном от света месте в течение 20 ч. Реакцию останавливают добавлением пятикратного объема деионизированной воды, после чего упаривают образцы на вакуумной центрифуге до исходного объема раствора и титруют до нейтральных значений pH. Финальную стадию очистки пептида проводят методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ) на колонке Reprosil-Pur C18-AQ в системе водных буферов, содержащих ацетонитрил и 0,1% ТФУ. Разделение происходит в линейном градиенте ацетонитрила от 5% до 80% за 60 мин. Выход полипептидов детектируют по изменению оптического поглощения при двух длинах волн: 214 и 280 нм (Фиг. 3А). Далее проводят повторную очистку с помощью ОФ-ВЭЖХ в аналогичной системе (Фиг. 3Б). Концентрацию водного раствора очищенного рекомбинантного абареницина определяют методом спектрофотометрии по поглощению при 280 нм на основе расчетного коэффициента экстинкции.A bacteriological loop is used to transfer the grown colonies into 10 ml of liquid LB medium containing 100 µg/ml ampicillin and grow for 18 hours on a thermostatic shaker with a rotation speed of 220 rpm -1 at a temperature of 37°C. The resulting culture is sown in a liquid buffered nutrient medium LB containing 0.02 M glucose, 100 μg/ml ampicillin, 1 mM MgSO 4 and 0.1 mM CaCl 2. The initial OD600 is 0.05. Induction of fusion protein biosynthesis is accomplished by adding isopropylthio-β-D-galactopyranoside (IPTG) to the cell culture at an optical density of 1.0 to a final concentration of 0.3 mM. The culture is grown for 16 hours at a temperature of 30°C on a thermostatic shaker with a rotation speed of 220 rpm -1 . After expression, cells are pelleted by centrifugation, resuspended in phosphate buffer (pH 7.8) supplemented with 6 M guanidine hydrochloride and 20 mM imidazole using a Potter glass homogenizer and disrupted by sonication. The cell lysate is centrifuged at 25,000 g for 40 minutes. All work to obtain clarified lysate is carried out at a temperature of 4°C. Purification of a hybrid protein containing an octahistidine sequence as an affinity tag is carried out using metal chelate chromatography on a preparative column with Ni-NTA agarose under denaturing conditions. Elution is carried out by increasing the concentration of imidazole in the buffer to 0.5 M. The fraction containing the hybrid protein collected after purification using metal chelate chromatography is titrated with concentrated hydrochloric acid to a pH of 1.0, after which cyanogen bromide is added (1 g cyanogen bromide per 1 g protein) and kept at a temperature of 25°C in a place protected from light for 20 hours. The reaction is stopped by adding a fivefold volume of deionized water, after which the samples are evaporated in a vacuum centrifuge to the original volume of the solution and titrated to neutral pH values. The final stage of peptide purification is carried out by reverse-phase HPLC (RP-HPLC) on a Reprosil-Pur C18-AQ column in a system of aqueous buffers containing acetonitrile and 0.1% TFA. Separation occurs in a linear gradient of acetonitrile from 5% to 80% in 60 min. The yield of polypeptides is detected by changes in optical absorption at two wavelengths: 214 and 280 nm (Fig. 3A). Next, purification is carried out again using RP-HPLC in a similar system (Fig. 3B). The concentration of an aqueous solution of purified recombinant abarenicin is determined by spectrophotometry by absorbance at 280 nm based on the calculated extinction coefficient.
Определение молекулярной массы рекомбинантного пептидаDetermination of the molecular weight of the recombinant peptide
Соответствие относительной молекулярной массы полученного рекомбинантного полипептида расчетному значению, а также индивидуальность очищенного вещества подтверждают с помощью масс-спектрометрического анализа на приборе Reflex III (Bruker Daltonics), оснащенном УФ-лазером с длиной волны 336 нм, с регистрацией положительных ионов в рефлекторном режиме. В качестве матрицы используют 2,5-дигидроксибензойную кислоту в смеси, содержащей 20% ацетонитрил и 0,1% трифторуксусную кислоту. Пик с m/z 2478,147 (Фиг. 4) соответствует молекулярному иону абареницина (расчетная молекулярная масса 2478,15), что свидетельствует об образовании двух дисульфидных связей.The correspondence of the relative molecular weight of the obtained recombinant polypeptide to the calculated value, as well as the identity of the purified substance, is confirmed using mass spectrometric analysis on a Reflex III device (Bruker Daltonics), equipped with a UV laser with a wavelength of 336 nm, with registration of positive ions in reflective mode. 2,5-dihydroxybenzoic acid is used as a matrix in a mixture containing 20% acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid. The peak at m/z 2478.147 (Figure 4) corresponds to the molecular ion of abarenicin (calculated molecular weight 2478.15), indicating the formation of two disulfide bonds.
Установление антибактериальных свойствEstablishment of antibacterial properties
Антибактериальную активность АМП определяют методом двукратных серийных разведений в 96-луночных планшетах в жидкой питательной среде Мюллера-Хинтона с добавлением 0,9% NaCl (далее - среда МНВ) и инкубации с грамположительными или грамотрицательными бактериальными тестовыми культурами. Характеристика тест-штаммов приводят в Таблице 1.The antibacterial activity of AMPs is determined by the method of two-fold serial dilutions in 96-well plates in liquid Mueller-Hinton nutrient medium with the addition of 0.9% NaCl (hereinafter referred to as MNV medium) and incubation with gram-positive or gram-negative bacterial test cultures. Characteristics of the test strains are given in Table 1.
* Штаммы, продуцирующие металло-бета-лактамазы (МβЛ)* Strains producing metallo-beta-lactamases (MβL)
В качестве антибактериальных соединений сравнения используют бета-шпилечные антимикробные пептиды Ab-1 и АА139, а также липопептидный антибиотик полимиксин В. Тест-культуры высевают из консерва в 10 мл среды МНВ без антибиотика и растят в течение 18 ч при 37°С и 220 об⋅мин-1. После этого аликвоту культуры объемом 300 мкл добавляют к 6 мл среды МНВ и инкубируют в термостатируемой качалке при 37°С до достижения культурой оптической плотности OD600 1,0. Далее методом последовательных разведений в 2× питательной среде МНВ доводят тестовые культуры до концентрации 106 КОЕ/мл. Аликвоты тест-культуры объемом 50 мкл добавляют к 50 мкл растворов пептидов, предварительно разведенных 0,1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) от 64 до 0,031 мкМ в пересчете на конечную концентрацию в лунке. После добавления культуры планшет инкубируют в течение 24 ч при 37°С и интенсивном перемешивании (1000 об⋅мин-1). Значения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) определяются визуально и спектрофотометрически как минимальные концентрации пептидов, при которых отсутствует рост культуры. Эксперименты проводятся трижды в трехкратной повторности, причем итоговый МИК рассчитывается как медиана девяти полученных значений. Результаты, представленные в Таблице 2, показывают, что абареницин (SEQ ID No. 1) проявлял более высокую антибактериальную активность в отношении грамотрицательных микроорганизмов по сравнению с другими АМП и была сопоставима с таковой для полимиксина В: среднее геометрическое значений МИК для абареницина - 0,29 мкМ против 0,5 мкМ для АА139 и 0,52 мкМ для Ab-1. Среднее геометрическое значений МИК для полимиксина В составило 0,31 мкМ.Beta-hairpin antimicrobial peptides Ab-1 and AA139, as well as the lipopeptide antibiotic polymyxin B are used as antibacterial compounds for comparison. Test cultures are sown from canned food in 10 ml of MNV medium without antibiotic and grown for 18 hours at 37°C and 220 rpm ⋅min -1 . After this, a 300 μl aliquot of the culture is added to 6 ml of MNV medium and incubated in a thermostated shaker at 37°C until the culture reaches an optical density OD 600 of 1.0. Next, using the method of serial dilutions in 2× MNV nutrient medium, the test cultures are brought to a concentration of 10 6 CFU/ml. Aliquots of the test culture with a volume of 50 μl are added to 50 μl of peptide solutions, previously diluted with a 0.1% solution of bovine serum albumin (BSA) from 64 to 0.031 μM in terms of the final concentration in the well. After adding the culture, the plate is incubated for 24 hours at 37°C and vigorous stirring (1000 rpm -1 ). Minimum inhibitory concentration (MIC) values are determined visually and spectrophotometrically as the minimum concentrations of peptides at which there is no growth of the culture. Experiments were performed three times in triplicate, with the final MIC calculated as the median of the nine values obtained. The results presented in Table 2 show that abarenicin (SEQ ID No. 1) exhibited higher antibacterial activity against gram-negative microorganisms compared to other AMPs and was comparable to that of polymyxin B: the geometric mean MIC for abarenicin was 0. 29 µM versus 0.5 µM for AA139 and 0.52 µM for Ab-1. The geometric mean MIC for polymyxin B was 0.31 μM.
* - абареницин (SEQ ID No. 1)* - abarenicin (SEQ ID No. 1)
** - полимиксин В** - polymyxin B
*** - среднее геометрическое значений МИК в отношении грамотрицательных штаммов*** - geometric mean of MIC values for gram-negative strains
Тестирование гемолитической активностиHemolytic activity testing
Для тестирования гемолитической активности пептида используют свежевыделенные человеческие эритроциты. Для предотвращения свертывания к цельной крови добавляют цитратный буфер (pH 5,6). Кровь центрифугируют в растворе фиколла и урографина плотностью 1,077 г/мл в течение 15 мин при 1500 об•мин-1. Фракцию эритроцитов отбирают со дна и трижды промывают двадцатью объемами изотонического натрий-фосфатного буфера (pH 7,4), последовательно осаждая эритроциты путем центрифугирования при 2000 об•мин-1 в течение 10 мин. После отмывки готовят 8% суспензию эритроцитов в изотоническом натрий-фосфатном буфере.Freshly isolated human red blood cells are used to test the hemolytic activity of the peptide. To prevent clotting, citrate buffer (pH 5.6) is added to whole blood. The blood is centrifuged in a solution of Ficoll and urografin with a density of 1.077 g/ml for 15 minutes at 1500 rpm-1. The erythrocyte fraction is taken from the bottom and washed three times with twenty volumes of isotonic sodium phosphate buffer (pH 7.4), sequentially precipitating erythrocytes by centrifugation at 2000 rpm-1 for 10 minutes. After washing, an 8% suspension of erythrocytes is prepared in isotonic sodium phosphate buffer.
Для теста в 96-луночном планшете готовят серии двойных разведений исследуемого пептида от 64 до 0,25 мкМ (в пересчете на конечную концентрацию) объемом 50 мкл. После этого к раствору пептида добавляют по 50 мкл 8% суспензии эритроцитов. Планшет инкубируют в течение 1,5 ч при 37°С и перемешивании при 1000 об•мин-1. После инкубации планшеты центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об•мин-1 для осаждения интактных эритроцитов. Далее аликвоты супернатанта переносят в другой планшет для измерения количества свободного гемоглобина. Определение количества гемоглобина в растворе осуществляют по поглощению раствора при 405 нм. В качестве отрицательного контроля (K-) используют супернатант, полученный после центрифугирования эритроцитов, инкубировавшихся в растворе натрий-фосфатного буфера без добавления пептидов. В качестве положительного контроля (K+) используют супернатант, полученный после центрифугирования эритроцитов, инкубировавшихся в 0,1% водном растворе неионогенного детергента Triton X-100, вызывающего их полный лизис. В качестве препарата сравнения используют α-спиральный известный цитолитический пептид мелиттин из яда медоносной пчелы Apis mellifera. Эксперименты проводят дважды с кровью одного и того же человека в трехкратной повторности. Процент гемолиза рассчитывают по формуле: Гемолиз (%) = (OD405 пробы - OD405 «K-»)×100%/(OD405 «K+» - OD405 «K-»). Результаты, представленные на Фиг. 5, показывают, что абареницин (SEQ ID No. 1) не обладает гемолитичекой активностью при концентрациях до 64 мкМ, а пептид дикого типа Ab-1 вызывал лизис около 20% эритроцитов при данной концентрации.For the test, a series of double dilutions of the test peptide from 64 to 0.25 μM (in terms of final concentration) with a volume of 50 μl are prepared in a 96-well plate. After this, 50 μl of an 8% red blood cell suspension is added to the peptide solution. The plate is incubated for 1.5 hours at 37°C and stirring at 1000 rpm-1. After incubation, the plates are centrifuged for 15 minutes at 3000 rpm-1 to sediment intact erythrocytes. Next, aliquots of the supernatant are transferred to another plate to measure the amount of free hemoglobin. The amount of hemoglobin in a solution is determined by the absorption of the solution at 405 nm. The supernatant obtained after centrifugation of erythrocytes incubated in a sodium phosphate buffer solution without the addition of peptides is used as a negative control (K-). As a positive control (K+), the supernatant obtained after centrifugation of erythrocytes incubated in a 0.1% aqueous solution of the nonionic detergent Triton X-100, which causes their complete lysis, is used. The α-helical known cytolytic peptide melittin from the venom of the honey bee Apis mellifera is used as a reference drug. Experiments are carried out twice with the blood of the same person in triplicate. The percentage of hemolysis is calculated using the formula: Hemolysis (%) = (OD405 sample - OD405 “K-”) × 100%/(OD405 “K+” - OD405 “K-”). The results presented in Fig. 5 show that abarenicin (SEQ ID No. 1) has no hemolytic activity at concentrations up to 64 μM, and the wild type Ab-1 peptide caused the lysis of about 20% of red blood cells at this concentration.
Тестирование цитотоксического действияCytotoxicity testing
Тестирование проводят с помощью МТТ-метода, который основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2H-тетразолий бромид (МТТ-реагент) до нерастворимого в воде фиолетового кристаллического формазана. Для оценки цитотоксического эффекта АМП используют клеточную линию почек эмбриона человека (HEK293T). Клеточную линию высаживают в 96-луночные планшеты (по 10000 клеток в каждую лунку) и растят в среде DMEM/F-12 в течение 24 ч при 37°С в CO2-инкубаторе (5% CO2 в воздухе). Далее культуральную жидкость заменяют свежей средой, в которой предварительно растворяют тестируемый пептид. После инкубации в течение 24 ч в приведенных выше условиях в каждую лунку добавляют по 20 мкл раствора МТТ в ЗФР (5 г/л), после чего продолжают инкубацию в течение 4 ч. Аккуратно удаляют среду, добавляют в лунки по 100 мкл смеси диметилсульфоксида и этилового спирта (1:1) для растворения кристаллов формазана и измеряют оптическую плотность растворов при 570 нм с помощью планшетного спектрофотометра. Долю живых клеток определяют по формуле:Testing is carried out using the MTT method, which is based on the ability of living cell dehydrogenases to reduce 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT reagent) to a water-insoluble purple crystalline formazan. To evaluate the cytotoxic effect of AMPs, a human embryonic kidney cell line (HEK293T) is used. The cell line is seeded into 96-well plates (10,000 cells per well) and grown in DMEM/F-12 medium for 24 hours at 37°C in a CO 2 incubator (5% CO 2 in air). Next, the culture liquid is replaced with fresh medium in which the test peptide is previously dissolved. After incubation for 24 hours under the above conditions, add 20 μl of MTT solution in PBS (5 g/l) to each well, after which incubation is continued for 4 hours. Carefully remove the medium, add 100 μl of a mixture of dimethyl sulfoxide and ethyl alcohol (1:1) to dissolve formazan crystals and measure the optical density of the solutions at 570 nm using a plate spectrophotometer. The proportion of living cells is determined by the formula:
Выживаемость (%) = [(OD570 пробы - OD570 «K-»)×100%/(OD570 клетки без пептида - OD570 «K- »)],Survival (%) = [(OD 570 sample - OD 570 "K-")×100%/(OD 570 cells without peptide - OD 570 "K-")],
где «K-» - фоновое поглощение лунки с растворителем. Эксперименты проводят дважды в трехкратной повторности. В отличие от контрольного пептида мелиттина, который является сильным цитолитиком, исследуемые АМП, включая абареницин (SEQ ID No. 1), не проявляли существенных цитотоксических эффектов в исследуемом диапазоне концентрации до 128 мкМ (Фиг. 6).where “K-” is the background absorption of the well with the solvent. Experiments are carried out twice in triplicate. In contrast to the control peptide melittin, which is a potent cytolytic, the studied AMPs, including abarenicin (SEQ ID No. 1), did not exhibit significant cytotoxic effects in the tested concentration range up to 128 μM (Fig. 6).
Измерение проницаемости цитоплазматической мембраны E. coli в реальном времениReal-time measurement of E. coli cytoplasmic membrane permeability
Используемый в данном методе штамм E. coli ML-35p отличается отсутствием пермеазы лактозы и конститутивным синтезом β-галактозидазы в цитоплазме. О состоянии цитоплазматической мембраны бактерий судили по ее проницаемости в присутствии АМП для хромогенного маркера - о-нитрофенил-β-D-галактопиранозида (ONPG). Состав смеси в каждой лунке (200 мкл) планшета был следующим: 2,5 мМ ONPG, забуференный физиологический раствор (ЗФР, рН 7,4), 2,5×107 КОЕ/мл отмытых в ЗФР бактерий, АМП (4 мкМ). Контрольные пробы содержали вместо препаратов равные объемы воды. Для снижения неспецифической сорбции пептидов на низких концентрациях в лунки планшета предварительно добавляли по 200 мкл 0,1% БСА, инкубировали 60 мин и удаляли перед внесением тестируемых смесей. Пробы вносили в лунки 96-луночного планшета, инкубировали в течение 180 мин при 37°С и перемешивании. Оптическую плотность раствора измеряли с помощью планшетного спектрофотометра. Результаты, представленные на Фиг. 7, показывают, что абареницин (SEQ ID No. 1) обладает схожим с пептидом дикого типа Ab-1, а также АА139 механизмом антибактериального действия: все АМП в течение 100-150 мин нарушали целостность цитоплазматической мембраны клеток-мишеней. Полученные данные наряду с результатами, приведенными в Примере 5, также свидетельствуют о высокой селективности действия абареницина в отношении бактериальных мембран.The E. coli ML-35p strain used in this method is characterized by the absence of lactose permease and the constitutive synthesis of β-galactosidase in the cytoplasm. The state of the cytoplasmic membrane of bacteria was judged by its permeability in the presence of AMP for a chromogenic marker - o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG). The composition of the mixture in each well (200 μl) of the plate was as follows: 2.5 mM ONPG, buffered physiological solution (PBS, pH 7.4), 2.5 × 10 7 CFU/ml bacteria washed in PBS, AMP (4 μM) . Control samples contained equal volumes of water instead of drugs. To reduce the nonspecific sorption of peptides at low concentrations, 200 μl of 0.1% BSA was first added to the wells of the plate, incubated for 60 min and removed before adding the test mixtures. Samples were added to the wells of a 96-well plate and incubated for 180 min at 37°C with stirring. The optical density of the solution was measured using a plate spectrophotometer. The results presented in Fig. 7 show that abarenitsin (SEQ ID No. 1) has a mechanism of antibacterial action similar to the wild-type Ab-1 peptide, as well as AA139: all AMPs disrupted the integrity of the cytoplasmic membrane of target cells within 100-150 min. The data obtained, along with the results given in Example 5, also indicate the high selectivity of the action of abarenicin in relation to bacterial membranes.
Изучение эффективности препаратов на инфицированных мышиных моделяхStudying the effectiveness of drugs in infected mouse models
Изучение антибактериальной активности АМП в условиях in vivo проводили с помощью двух моделей острого эшерихиозного перитонита у мышей. В качестве модельных животных использовались мыши линии BALB/c (самки/самцы, 6-8 недель, вес 22-24 г). Первая модель была использована для выявления бактерицидного эффекта АМП (анализ снижения обсемененности тканей) при лечении инфекционного заболевания, вызванного внутрибрюшинным (в/бр) введением культуры штамма E. coli 3421 E/19, в сравнении с эффектом полимиксина В. Вирулентный штамм 3421 E/19 является клиническим изолятом и обладает гемолитической активностью. С целью повышения восприимчивости животных к инфекции у них вызывали индуцированный иммунодефицит. Для этого внутрибрюшинно в «-4-й» день животным вводили циклофосфамид в дозе 200 мг/кг, а в «-1-й» день - в дозе 100 мг/кг. Схема эксперимента приведена в таблице 3. The antibacterial activity of AMPs was studied in vivo using two models of acute Escherichia peritonitis in mice. BALB/c mice (females/males, 6-8 weeks, weight 22-24 g) were used as model animals. The first model was used to identify the bactericidal effect of AMPs (analysis of the reduction of tissue contamination) in the treatment of an infectious disease caused by intraperitoneal (i.p.) administration of a culture of the E. coli strain 3421 E/19, in comparison with the effect of polymyxin B. Virulent strain 3421 E/ 19 is a clinical isolate and has hemolytic activity. In order to increase the susceptibility of animals to infection, induced immunodeficiency was caused in them. To do this, animals were administered intraperitoneal cyclophosphamide at a dose of 200 mg/kg on day -4, and at a dose of 100 mg/kg on day -1. The experimental design is shown in Table 3.
Животных подвергали эвтаназии методом декапитации. Для получения промывных вод брюшной полости мышам внутрибрюшинно вводили 2 мл стерильного физиологического раствора. Кровь на бактериологический анализ брали у мышей посмертно после декапитации. После этого готовили последовательные десятикратные разведения отобранных образцов и высевали по 0,1 мл на плотную питательную среду - агар «Эндо-ГРМ» - для определения концентрации бактериальных клеток.Animals were euthanized by decapitation. To obtain abdominal lavages, mice were injected intraperitoneally with 2 ml of sterile saline. Blood for bacteriological analysis was taken from mice postmortem after decapitation. After this, serial tenfold dilutions of the selected samples were prepared and 0.1 ml were sown on a solid nutrient medium - Endo-GRM agar - to determine the concentration of bacterial cells.
Вторая модель была использована для изучения выживаемости животных при курсовом лечении с помощью АМП (2 введения) перитонита у мышей, вызванного внутрибрюшинным введением культуры штамма E. coli АТСС 25922 в присутствии 2,5% муцина в сравнении с ципрофлоксацином. В ходе эксперимента наблюдали за самочувствием животных и регистрировали их гибель. Умершие мыши были исследованы на наличие специфического возбудителя. На 7-й день всех выживших мышей эвтаназировали, вскрывали, высевали гомогенаты селезенки на плотную среду «Эндо-ГРМ» методом мазков-отпечатков для подтверждения эрадикации клеток патогена. Схема эксперимента приведена в таблице 4.The second model was used to study the survival of animals during a course of treatment with AMP (2 injections) of peritonitis in mice caused by intraperitoneal injection of a culture of E. coli strain ATCC 25922 in the presence of 2.5% mucin in comparison with ciprofloxacin. During the experiment, the well-being of the animals was monitored and their death was recorded. The deceased mice were examined for the presence of a specific pathogen. On the 7th day, all surviving mice were euthanized, dissected, and spleen homogenates were seeded onto solid Endo-GRM medium using the fingerprint smear method to confirm eradication of pathogen cells. The experimental design is shown in Table 4.
Полученные результаты по сравнительной эффективности пептидов абареницина и АА139 приведены на рисунке 8. Была показана высокая эффективность абареницина на обоих моделях: пептид в дозе 10 мг/кг вызывал достоверное снижение обсемененности крови и промывных вод брюшной полости в 105 раз, а также способствовал выживаемости 100% мышей. Лечение препаратом АА139 способствовало выживанию 7 из 8 животных в группе. Бактериологическое исследование выживших животных показало отсутствие у них возбудителя инфекции - бактерий E. coli. Таким образом, эффективность заявляемого пептида абареницина (SEQ ID No. 1) сопоставима с таковой для референсного пептида АА139, а также известных антибиотиков полимиксина В и ципрофлоксацина.The results obtained on the comparative effectiveness of the peptides abarenicin and AA139 are shown in Figure 8. The high effectiveness of abarenicin was shown in both models: the peptide at a dose of 10 mg/kg caused a significant reduction in the contamination of blood and lavage water of the abdominal cavity by 10 5 times, and also contributed to survival 100 % mice. Treatment with AA139 contributed to the survival of 7 out of 8 animals in the group. A bacteriological study of the surviving animals showed the absence of the infectious agent - E. coli bacteria. Thus, the effectiveness of the claimed abarenicin peptide (SEQ ID No. 1) is comparable to that of the reference peptide AA139, as well as the known antibiotics polymyxin B and ciprofloxacin.
--->--->
Перечень последовательностейList of sequences
<110> ИБХ РАН<110> IBCh RAS
<120> БЕТА-ШПИЛЕЧНЫЙ ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В<120> BETA-HAIRPAIN PEPTIDE WITH ANTIMICROBIAL ACTIVITY IN
ОТНОШЕНИИ БАКТЕРИЙ С МНОЖЕСТВННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ IN RELATIONSHIP TO MULTIDRUG-RESISTANT BACTERIA
<130> (Reference Number)<130> (Reference Number)
<160> 2<160> 2
<170> PatentIn version 3.5<170> Patent In version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 21<211> 21
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Artificial Sequence<223> Artificial Sequence
<400> 1<400> 1
Gly Tyr Cys Phe Thr Ala Cys Ala Arg Arg Asn Gly Val Arg Ile CysGly Tyr Cys Phe Thr Ala Cys Ala Arg Arg Asn Gly Val Arg Ile Cys
1 5 10 151 5 10 15
Tyr Arg Arg Cys AsnTyr Arg Arg Cys Asn
20 20
<210> 2<210> 2
<211> 81<211> 81
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Artificial Sequence<223> Artificial Sequence
<400> 2<400> 2
AGATCTATGG GGTACTGCTT TACGGCATGT GCTCGTCGTA ATGGAGTCCG CATTTGCTAT 60AGATCTATGG GGTACTGCTT TACGGCATGT GCTCGTCGTA ATGGAGTCCG CATTTGCTAT 60
CGCCGCTGCA ATTAAGAATT C 81CGCCGCTGCA ATTAAGAATT C 81
<---<---
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2812977C1 true RU2812977C1 (en) | 2024-02-06 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SAFRONOVA V. N. et al., Novel β-Hairpin Peptide from Marine Polychaeta with a High Efficacy against Gram-Negative Pathogens, Mar Drugs, 2022, vol. 20, N. 8, 517. ORLOV D. S. et al., Redesigning Arenicin-1, an Antimicrobial Peptide from the Marine Polychaeta Arenicola marina, by Strand Rearrangement or Branching, Substitution of Specific Residues, and Backbone Linearization or Cyclization, Mar Drugs, 2019, vol. 17, N. 6, 376. САФРОНОВА В. Н. и др., Новые β-шпилечные антимикробные пептиды из морских полихет, Биотехнология: состояние и перспективы развития : Материалы международного форума, Москва, 28-30 октября 2020 года, Вып. 18, - М.: OOO "Экспо-биохим-технологии", 2020, cc. 209-210. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chou et al. | Design and synthesis of cationic antimicrobial peptides with improved activity and selectivity against Vibrio spp. | |
| US8686113B2 (en) | Antibiotic peptides | |
| JP6355792B2 (en) | Antibacterial phage, phage peptide, and methods of use thereof | |
| US5294605A (en) | Amphiphilic peptide compositions and analogues thereof | |
| US10428126B2 (en) | Dermaseptin-type and piscidin-type antimicrobial peptides | |
| Lai et al. | Functional and structural characterization of recombinant dermcidin-1L, a human antimicrobial peptide | |
| US9580472B2 (en) | Anti-microbial peptides and methods of use thereof | |
| JP5753077B2 (en) | Antibacterial peptide multimer | |
| KR102441211B1 (en) | Acinetobacter lysins | |
| Santos-Filho et al. | Synthesis and characterization of an antibacterial and non-toxic dimeric peptide derived from the C-terminal region of Bothropstoxin-I | |
| Ben Hur et al. | Antimicrobial peptides against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa biofilm from cystic fibrosis patients | |
| US6172185B1 (en) | Antimicrobial cationic peptide derivatives of bactenecin | |
| EP1040120B1 (en) | Antifungal and antibacterial peptides | |
| CN115397994A (en) | Novel polypeptide, fusion polypeptide and antibiotic against gram-negative bacteria comprising the same | |
| RU2812977C1 (en) | Beta-hairpin peptide with antimicrobial activity against multidrug-resistant bacteria | |
| CN101448851B (en) | Improved antimicrobial peptides | |
| RU2658781C1 (en) | Peptide with antitumor activity | |
| US9220264B2 (en) | Multimeric forms of antimicrobial peptides | |
| EP4289949A1 (en) | Bacteriophage lysine, chimera thereof and application thereof | |
| Shen et al. | Triintsin, a human pathogenic fungus-derived defensin with broad-spectrum antimicrobial activity | |
| RU2778856C1 (en) | Cationic peptide exhibiting antibacterial properties | |
| CN112625106A (en) | Antibacterial polypeptide compound, synthesis method and application thereof | |
| RU2702661C1 (en) | Peptide exhibiting antibacterial and antitumour properties | |
| WO2008104777A2 (en) | Peptide | |
| RU2624020C2 (en) | Beta-hairpin polypeptide with antimicrobial activity |