RU2811136C1 - Immunobiological agent to enhance cellular response against hepatitis c virus - Google Patents
Immunobiological agent to enhance cellular response against hepatitis c virus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2811136C1 RU2811136C1 RU2023106121A RU2023106121A RU2811136C1 RU 2811136 C1 RU2811136 C1 RU 2811136C1 RU 2023106121 A RU2023106121 A RU 2023106121A RU 2023106121 A RU2023106121 A RU 2023106121A RU 2811136 C1 RU2811136 C1 RU 2811136C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- virus
- hcv
- hepatitis
- mscs
- Prior art date
Links
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 title claims abstract description 52
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 title claims description 10
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- 101800001014 Non-structural protein 5A Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 8
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 abstract description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 19
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 16
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 15
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 15
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 15
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 14
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- 210000004985 myeloid-derived suppressor cell Anatomy 0.000 description 11
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 10
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 10
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 7
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 238000001565 modulated differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 5
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 5
- 208000006154 Chronic hepatitis C Diseases 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 5
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 5
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 5
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 5
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 4
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 4
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 4
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 4
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 4
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 4
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 206010065051 Acute hepatitis C Diseases 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 3
- 101000622137 Homo sapiens P-selectin Proteins 0.000 description 3
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 3
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 3
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 3
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 3
- 101800001554 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 208000037621 acute hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 3
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 3
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 2
- 101100025201 Mus musculus Msc gene Proteins 0.000 description 2
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 210000004262 dental pulp cavity Anatomy 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 101150007653 Arsa gene Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 1
- 201000011442 Metachromatic leukodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 1
- 101710144121 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 231100000354 acute hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000009815 adipogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 1
- 230000007416 antiviral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009816 chondrogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 231100000749 chronicity Toxicity 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 210000001968 dental pulp cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- VRTWBAAJJOHBQU-KMWAZVGDSA-N ledipasvir Chemical compound COC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N([C@@H](C1)C=2NC(=CN=2)C=2C=C3C(F)(F)C4=CC(=CC=C4C3=CC=2)C=2C=C3NC(=NC3=CC=2)[C@H]2N([C@@H]3CC[C@H]2C3)C(=O)[C@@H](NC(=O)OC)C(C)C)CC21CC2 VRTWBAAJJOHBQU-KMWAZVGDSA-N 0.000 description 1
- 229960002461 ledipasvir Drugs 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- VJYSBPDEJWLKKJ-NLIMODCCSA-N methyl n-[(2s,3r)-1-[(2s)-2-[6-[(2r,5r)-1-[3,5-difluoro-4-[4-(4-fluorophenyl)piperidin-1-yl]phenyl]-5-[6-fluoro-2-[(2s)-1-[(2s,3r)-3-methoxy-2-(methoxycarbonylamino)butanoyl]pyrrolidin-2-yl]-3h-benzimidazol-5-yl]pyrrolidin-2-yl]-5-fluoro-1h-benzimidazol-2 Chemical compound COC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)OC)C(=O)N1CCC[C@H]1C1=NC2=CC(F)=C([C@@H]3N([C@H](CC3)C=3C(=CC=4N=C(NC=4C=3)[C@H]3N(CCC3)C(=O)[C@@H](NC(=O)OC)[C@@H](C)OC)F)C=3C=C(F)C(N4CCC(CC4)C=4C=CC(F)=CC=4)=C(F)C=3)C=C2N1 VJYSBPDEJWLKKJ-NLIMODCCSA-N 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229950007513 pibrentasvir Drugs 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007363 regulatory process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 1
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- FHCUMDQMBHQXKK-CDIODLITSA-N velpatasvir Chemical compound C1([C@@H](NC(=O)OC)C(=O)N2[C@@H](C[C@@H](C2)COC)C=2NC(=CN=2)C=2C=C3C(C4=CC5=CC=C6NC(=NC6=C5C=C4OC3)[C@H]3N([C@@H](C)CC3)C(=O)[C@@H](NC(=O)OC)C(C)C)=CC=2)=CC=CC=C1 FHCUMDQMBHQXKK-CDIODLITSA-N 0.000 description 1
- 229960000863 velpatasvir Drugs 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000009447 viral pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии и иммунологии. Предложенное иммунобиологическое средство может применяться в качестве одного из компонентов для профилактики и лечения заболевания, вызванного вирусом гепатита С.The invention relates to virology, biotechnology and immunology. The proposed immunobiological agent can be used as one of the components for the prevention and treatment of disease caused by the hepatitis C virus.
Далее приведены использованные в настоящей разработке сокращения и их расшифровка.The following are the abbreviations used in this development and their interpretation.
ДНКHCV
DNA
дезоксирибонуклеиновая кислотаhepatitis C virus
Deoxyribonucleic acid
мМСКMSK
mMSC
генетически модифицированные МСКmesenchymal stem cells
genetically modified MSCs
ХГС
ЭТСf/r
CHC
ETS
хронический гепатит С
эмбриональная телячья сывороткаsaline
chronic hepatitis C
fetal bovine serum
CTL
DC
Е1, Е2
ELISpot
IFN
IL
GFP
MDSCCD
CTL
DC
E1, E2
ELISpot
IFN
IL
GFP
MDSC
цитотоксические лимфоциты CD8
дендритные клетки
поверхностные белки ВГС
метод иммуноферментных пятен
интерферон
интерлейкин
зеленый флуоресцентный белок
супрессорные клетки миелоидного происхожденияlymphocyte differentiation cluster
CD8 cytotoxic lymphocytes
dendritic cells
HCV surface proteins
immunostain stain method
interferon
interleukin
green fluorescent protein
myeloid-derived suppressor cells
PBS
SDN.S.
PBS
SD
0,1 М фосфатно-солевой буфер, рН 7,4
стандартное отклонениеnon-structural proteins
0.1 M phosphate buffered saline, pH 7.4
standard deviation
TNF-α
VEGFTh
TNF-α
VEGF
фактор некроза опухолей альфа
фактор роста эндотелия сосудовT helper cells
tumor necrosis factor alpha
vascular endothelial growth factor
Уровень техникиState of the art
Гепатит С, вызываемый вирусом гепатита С (ВГС), признан одной из главных причин хронических заболеваний печени. В мире насчитывается более 71 млн инфицированных, ежегодно 3-4 млн заражаются, около 400 000 больных каждый год умирают от терминальных стадий хронического гепатита С (ХГС) - цирроза печени и гепатокарциномы. До 80% случаев острого гепатита С переходят в хроническую форму, что объясняется повышенной частотой мутаций ВГС, интерференцией вирусных белков с факторами врожденного и адаптивного иммунитета хозяина, образованием «эскейп»-вариантов ВГС, ускользающих от иммунного ответа [1]. Терапия гепатита С, основанная на сочетании пегилированного рекомбинантного IFN-α и рибавирина, позволяла элиминировать вирус не более чем у 50% пациентов [2]. Современная терапия с применением новых препаратов прямого противовирусного действия на основе ингибиторов ферментов ВГС - неструктурных белков NS3 и NS5B, а также блокаторов белка NS5A, позволяет добиться успеха в лечении большинства пациентов, но ее крайне высокая стоимость делает лечение малодоступным. Кроме того, недостаточно изучены отдаленные последствия блокирования вирусных ферментов, так как ВГС может оставаться в клетках печени после исчезновения вирусной РНК в периферической крови. Уже известно о некоторых побочных эффектах лечения этими препаратами, таких, как мутации ВГС, рецидивы и реинфекция [3, 4].Hepatitis C, caused by the hepatitis C virus (HCV), is recognized as one of the leading causes of chronic liver disease. There are more than 71 million infected people in the world, 3-4 million become infected every year, about 400,000 patients die every year from the terminal stages of chronic hepatitis C (CHC) - liver cirrhosis and hepatocarcinoma. Up to 80% of cases of acute hepatitis C become chronic, which is explained by the increased frequency of HCV mutations, the interference of viral proteins with factors of the host’s innate and adaptive immunity, and the formation of “escape” variants of HCV that evade the immune response [1]. Hepatitis C therapy, based on a combination of pegylated recombinant IFN-α and ribavirin, eliminated the virus in no more than 50% of patients [2]. Modern therapy using new direct antiviral drugs based on inhibitors of HCV enzymes - non-structural proteins NS3 and NS5B, as well as blockers of the NS5A protein, allows success in the treatment of most patients, but its extremely high cost makes treatment inaccessible. In addition, the long-term consequences of blocking viral enzymes have not been sufficiently studied, since HCV can remain in liver cells after the disappearance of viral RNA in the peripheral blood. Some side effects of treatment with these drugs are already known, such as HCV mutations, relapses and reinfection [3, 4].
Отсутствие вакцины - главное препятствие в контроле за гепатитом С. Доказано, что эффективная вакцина должна стимулировать мощный мультиэпитопный и функциональный клеточный иммунный ответ к относительно консервативным неструктурным белкам NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B, а также индуцировать вируснейтрализующие антитела к вариабельным поверхностным белкам Е1 и Е2 [5].The lack of a vaccine is the main obstacle in the control of hepatitis C. It has been proven that an effective vaccine should stimulate a powerful multi-epitope and functional cellular immune response to the relatively conserved non-structural proteins NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B, as well as induce virus-neutralizing antibodies to variable surface proteins E1 and E2 [5].
В связи с отсутствием клеточных линий для эффективного размножения вируса in vitro основой для разработки вакцин служат генно-инженерные продукты, имитирующие последовательности ВГС: рекомбинантные белки, пептиды, представляющие В- и Т-клеточные эпитопы, ДНК в составе плазмид и вирусных векторов [6].Due to the lack of cell lines for effective propagation of the virus in vitro, the basis for the development of vaccines is genetically engineered products that mimic HCV sequences: recombinant proteins, peptides representing B- and T-cell epitopes, DNA in plasmids and viral vectors [6] .
В настоящее время мезенхимальные стволовые клетки (МСК) успешно применяются в разных областях регенеративной медицины [7]. МСК - иммунопривилегированные клетки, т.е. их введение не приводит к воспалительному иммунному ответу. МСК могут быть получены почти из всех тканей, в том числе из костного мозга, жировой ткани, пуповины, дентальной пульпы. Клеточная терапия основана на способности МСК к направленной миграции к очагам патологии. Получение генетически модифицированных МСК (мМСК), экспрессирующих введенные гены, существенно расширяет возможности как клеточной, так и генной терапии, обеспечивая доставку терапевтических молекул к местам повреждения и воспаления [8, 9]. мМСК, содержащие вирусные гены, можно использовать для создания противовирусных вакцин. Такой подход имеет ряд преимуществ перед традиционными технологиями создания вакцин. мМСК потенциально способны экспрессировать одновременно десятки белков, тем самым формируя широкий спектр эпитопов с правильной посттрансляционной конформацией, имитируя естественную инфекцию, а также способны доставлять, экспрессировать и депонировать антиген в течение длительного времени. Таким образом, создание МСК-вакцин на основе генных и клеточных технологий может быть одним из наиболее перспективных достижений биотехнологии для иммунопрофилактики инфекционных заболеваний.Currently, mesenchymal stem cells (MSCs) are successfully used in various areas of regenerative medicine [7]. MSCs are immunoprivileged cells, i.e. their administration does not lead to an inflammatory immune response. MSCs can be obtained from almost all tissues, including bone marrow, adipose tissue, umbilical cord, and dental pulp. Cell therapy is based on the ability of MSCs to migrate towards pathological sites. The production of genetically modified MSCs (mMSCs) expressing introduced genes significantly expands the possibilities of both cell and gene therapy, ensuring the delivery of therapeutic molecules to sites of damage and inflammation [8, 9]. mMSCs containing viral genes can be used to create antiviral vaccines. This approach has a number of advantages over traditional technologies for creating vaccines. mMSCs are potentially capable of simultaneously expressing dozens of proteins, thereby forming a wide range of epitopes with the correct post-translational conformation, simulating a natural infection, and are also capable of delivering, expressing and depositing antigen for a long time. Thus, the creation of MSC vaccines based on gene and cell technologies may be one of the most promising achievements of biotechnology for the immunoprevention of infectious diseases.
Проведенный анализ существующего уровня техники по научной и патентной информации в области разработки вакцины против ВГС показал, что на дату представления заявочных материалов наиболее широко апробированы рекомбинантные белки, синтетические пептиды, вирусоподобные частицы, ДНК вакцины и живые вирусные векторы. Однако оптимальный состав генов ВГС (или их участков) для включения в вакцину не определен. Неструктурные белки репликативного комплекса ВГС (NS2-NS5B) играют критическую роль в клеточном противовирусном иммунном ответе. Так, у спонтанно выздоровевших больных острым гепатитом С обнаружены Т-клетки фенотипов CD4+ (T-хелперные лимфоциты, Th) и CD8+ (цитотоксические лимфоциты, CTL), реагирующие на эпитопы белков NS3, NS4 и NS5, которые не выявляются у больных ХГС. К тому же, неструктурные белки, в отличие от вариабельных поверхностных белков, содержат высоко консервативные области, в которых локализован ряд Т-клеточных эпитопов [10 - 12]. Таким образом, высокий ВГС-специфический клеточный ответ к CD4+ и CD8+ Т-клеточным эпитопам неструктурных белков может ограничить инфекцию, элиминировать ВГС-инфицированные клетки и предотвратить хронизацию острого гепатита. В связи с этим гены неструктурных белков, по нашему мнению, являются наиболее перспективными кандидатами для включения в вакцину. Известно, что неструктурный белок NS5A - мультифункциональный фосфопротеин. Он играет важную роль в вирусном патогенезе и в индукции иммунных реакций, а также выполняет ряд важных функций в жизненном цикле вируса. Этот белок может быть активатором транскрипции и участвует во многих клеточных регуляторных процессах. NS5A, кроме непосредственного участия в репликации вируса, играет ключевую роль на ранних стадиях сборки и созревания вирусных частиц [13, 14]. NS5A участвует в модуляции ответа на лечение интерфероном (IFN); в частности, устойчивость ВГС к IFN-α коррелирует с числом мутаций в NS5A [15]. Ряд современных пангенотипных препаратов прямого противовирусного действия (Ledipasvir, Pibrentasvir, Velpatasvir и др.) нацелены на блокирование функций NS5A, и ведется активный поиск новых ингибиторов этого белка [16].An analysis of the existing level of technology on scientific and patent information in the field of development of a vaccine against HCV showed that as of the date of submission of application materials, recombinant proteins, synthetic peptides, virus-like particles, DNA vaccines and live viral vectors were most widely tested. However, the optimal composition of HCV genes (or their regions) for inclusion in a vaccine has not been determined. Nonstructural proteins of the HCV replication complex (NS2-NS5B) play a critical role in the cellular antiviral immune response. Thus, in spontaneously recovered patients with acute hepatitis C, T cells of the CD4 + (T-helper lymphocytes, Th) and CD8 + (cytotoxic lymphocytes, CTL) phenotypes were detected, reacting to epitopes of the NS3, NS4 and NS5 proteins, which are not detected in patients with CHC . In addition, non-structural proteins, unlike variable surface proteins, contain highly conserved regions in which a number of T-cell epitopes are localized [10 - 12]. Thus, a high HCV-specific cellular response to CD4 + and CD8 + T-cell epitopes of non-structural proteins can limit infection, eliminate HCV-infected cells and prevent chronicity of acute hepatitis. In this regard, genes of non-structural proteins, in our opinion, are the most promising candidates for inclusion in a vaccine. It is known that the nonstructural protein NS5A is a multifunctional phosphoprotein. It plays an important role in viral pathogenesis and in the induction of immune responses, and also performs a number of important functions in the life cycle of the virus. This protein can be a transcription activator and is involved in many cellular regulatory processes. NS5A, in addition to its direct participation in viral replication, plays a key role in the early stages of assembly and maturation of viral particles [13, 14]. NS5A is involved in modulating the response to interferon (IFN) treatment; in particular, HCV resistance to IFN-α correlates with the number of mutations in NS5A [15]. A number of modern pangenotypic drugs with direct antiviral action (Ledipasvir, Pibrentasvir, Velpatasvir, etc.) are aimed at blocking the functions of NS5A, and an active search for new inhibitors of this protein is underway [16].
Несмотря на положительные результаты, полученные с вакцинами, основанными на белковых субъединицах ВГС, индуцированный ими иммунный ответ является, главным образом, гуморальным, кратковременным и изолят-специфичным, который не защищает от инфицирования вирусами другого генотипа.Despite the positive results obtained with vaccines based on HCV protein subunits, the immune response they induced is mainly humoral, short-lived and isolate-specific, which does not protect against infection with viruses of a different genotype.
Вакцины на основе ДНК-конструкций могут стимулировать клеточный иммунный ответ, нетоксичны, однако для увеличения клеточного ответа необходимо применение высокоэффективных адъювантов. ДНК-иммунизация практически не индуцирует гуморальный ответ. Проблема состоит также в способе введения.Vaccines based on DNA constructs can stimulate the cellular immune response and are non-toxic; however, to increase the cellular response, the use of highly effective adjuvants is necessary. DNA immunization practically does not induce a humoral response. The problem also lies in the method of administration.
Известно решение [17], в котором в качестве вакцины против ВГС предлагается полинуклеотид, кодирующий полипептидные последовательности либо индивидуальных белков ВГС core, NS3, NS4B и NS5B, либо их сочетание в одной открытой рамке считывания. Предлагается способ вакцинации, при котором полинуклеотид наносят на золотые гранулы и вводят подкожно.A solution is known [17], in which a polynucleotide encoding the polypeptide sequences of either the individual HCV core, NS3, NS4B and NS5B proteins, or their combination in one open reading frame, is proposed as a vaccine against HCV. A vaccination method is proposed in which a polynucleotide is applied to gold granules and injected subcutaneously.
Известно изобретение [18], в котором для генерирования ВГС-специфического клеточного иммунного ответа используется ДНК, кодирующая полипротеин NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B ВГС, встроенная в аденовирусный вектор Ad6. Вакцины на основе вирусных векторов повышают иммуногенность кодируемых последовательностей ВГС, однако могут быть потенциально канцерогенными, а при использовании аденовирусов предсуществующий иммунный ответ может снижать иммунитет к ВГС.An invention is known [18], in which DNA encoding the HCV polyprotein NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B, embedded in the adenoviral vector Ad6, is used to generate an HCV-specific cellular immune response. Viral vector-based vaccines enhance the immunogenicity of HCV encoded sequences but may be potentially carcinogenic, and when using adenoviruses, a pre-existing immune response may reduce immunity to HCV.
Ни одна из кандидатных вакцин пока не способна обеспечить полноценный профилактический и терапевтический эффекты против ВГС [19].None of the candidate vaccines is yet capable of providing full preventive and therapeutic effects against HCV [19].
Проведенный анализ выявленного уровня техники по научной и патентной информации в области применения МСК показал, что обнаруженная патентная документация описывает терапевтические свойства МСК человека.The analysis of the identified level of technology on scientific and patent information in the field of MSC application showed that the discovered patent documentation describes the therapeutic properties of human MSCs.
Из исследованного уровня техники выявлено изобретение, в котором предлагается препарат для лечения метахроматической лейкодистрофии, состоящий из МСК человека, генетически модифицированных рекомбинантным аденоассоциированным вирусом 9 серотипа, содержащим кодон-оптимизированную последовательность гена ARSA, представленную в SEQ ID NO: 1 (патент RU 2769577 [20]).From the researched level of technology, an invention was identified that proposes a drug for the treatment of metachromatic leukodystrophy, consisting of human MSCs genetically modified with a recombinant adeno-associated virus serotype 9 containing a codon-optimized sequence of the ARSA gene, presented in SEQ ID NO: 1 (patent RU 2769577 [20 ]).
Проведенный анализ выявленного уровня техники по научной и патентной информации в области разработки иммунобиологического средства на основе мМСК человека, экспрессирующих неструктурный белок ВГС, для повышения клеточного ответа против ВГС показал, что сведения о получении и использовании мМСК в качестве профилактических и терапевтических вакцин против инфекционных заболеваний единичны. В настоящее время известна одна работа, в которой получены мМСК человека, экспрессирующие гены вируса SARS-CoV-2, и показана индукция вирусспецифических антител у мышей, иммунизированных мМСК. Авторы сообщили, что подали заявку на патент PCT, относящийся к МСК-вакцине против COVID-19 [21].The analysis of the identified level of technology based on scientific and patent information in the field of development of an immunobiological agent based on human mMSCs expressing the non-structural protein of HCV to increase the cellular response against HCV showed that information on the production and use of mMSCs as preventive and therapeutic vaccines against infectious diseases is rare . Currently, one work is known in which human mMSCs were obtained expressing the genes of the SARS-CoV-2 virus, and the induction of virus-specific antibodies in mice immunized with mMSCs was shown. The authors reported that they have applied for a PCT patent related to an MSC vaccine against COVID-19 [21].
Известна возможность использования мМСК мыши в качестве инновационных вакцин, усиливающих иммунные реакции против ВИЧ [22], против гепатита С [23, 24] и против вируса простого герпеса 1 типа [25], которые можно принять за аналоги. Результаты, опубликованные в 2020 г., выбраны авторами настоящего изобретения в качестве наиболее близкого аналога заявляемому составу иммунобиологического средства и способу его использования [24]. В данном исследовании МСК для иммунизации мышей получали из костного мозга сингенных мышей, МСК предварительно трансфицировали плазмидой, кодирующей комплекс неструктурных белков NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B. Показано существенное повышение иммунного ответа на мМСК по сравнению с плазмидой, несущей те же гены. Недостатком прототипа является то, что мМСК были получены на основе мышиных МСК, трансфицированных вирусными генами. Однако положительные результаты, полученные с мышиными МСК, при переходе к экспериментам с МСК человека не всегда подтверждаются, что может быть вызвано различиями в иммунных реакциях [26].It is known that mouse mMSCs can be used as innovative vaccines that enhance immune responses against HIV [22], against hepatitis C [23, 24], and against herpes simplex virus type 1 [25], which can be taken as analogues. The results published in 2020 were chosen by the authors of the present invention as the closest analogue to the claimed composition of the immunobiological agent and the method of its use [24]. In this study, MSCs for immunization of mice were obtained from the bone marrow of syngeneic mice; MSCs were pre-transfected with a plasmid encoding the complex of non-structural proteins NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B. A significant increase in the immune response to mMSCs was shown compared to a plasmid carrying the same genes. The disadvantage of the prototype is that mMSCs were obtained from mouse MSCs transfected with viral genes. However, the positive results obtained with mouse MSCs are not always confirmed when moving to experiments with human MSCs, which may be caused by differences in immune responses [26].
Раскрытие настоящего изобретенияDisclosure of the present invention
Технической задачей данного изобретения является разработка иммунобиологического средства для повышения клеточного ответа против ВГС на основе мМСК человека, экспрессирующих неструктурный белок ВГС.The technical objective of this invention is to develop an immunobiological agent for increasing the cellular response against HCV based on human mMSCs expressing the non-structural protein of HCV.
Технический результат заключается в повышении клеточного иммунного ответа, характеризующегося усилением антиген-специфической пролиферации лимфоцитов, продукции интерферона-гамма и формированием Т-клеток памяти.The technical result is to increase the cellular immune response, characterized by increased antigen-specific proliferation of lymphocytes, production of interferon-gamma and the formation of memory T cells.
Указанный технический результат достигается за счет того, что создано иммунобиологическое средство для повышения клеточного ответа против вируса гепатита С, состоящее из генетически модифицированных мезенхимальных стволовых клеток человека, экспрессирующих неструктурный белок NS5A вируса гепатита С.This technical result is achieved due to the fact that an immunobiological agent has been created to increase the cellular response against the hepatitis C virus, consisting of genetically modified human mesenchymal stem cells expressing the non-structural protein NS5A of the hepatitis C virus.
Заявленное изобретение можно применять как в качестве профилактического средства, нацеленного на предотвращение перехода острого гепатита С в хронический за счет быстрой активации клеток памяти, индуцированных вакциной, так и в качестве терапевтического средства, используемого совместно с противовирусными лечебными препаратами, для усиления адаптивного иммунитета к ВГС. В заявленном изобретении могут быть использованы МСК, полученные самостоятельно по любому известному из уровня техники способу (например, из липоаспирата, хирургических биопсий и др.), так и в виде коммерческих препаратов МСК, имеющих сертификат качества.The claimed invention can be used both as a prophylactic agent aimed at preventing the transition of acute hepatitis C to chronic due to the rapid activation of memory cells induced by the vaccine, and as a therapeutic agent used in conjunction with antiviral drugs to enhance adaptive immunity to HCV. The claimed invention can use MSCs obtained independently using any method known from the prior art (for example, from lipoaspirate, surgical biopsies, etc.), or in the form of commercial MSC preparations that have a quality certificate.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
На Фиг. 1 приведена характеристика МСК, полученных из дентальной пульпы. На фиг. 1А - Морфология первичной культуры МСК, световая микроскопия, увеличение 200 X; фиг 1Б - Фенотипирование поверхностных рецепторов МСК методом проточной цитометрии. По вертикали - количество клеток, по горизонтали - относительная интенсивность флуоресценции. Светло-серые гистограммы - распределение МСК, окрашенных указанными антителами, темно-серые - контрольными изотипическими антителами; фиг. 1В - Морфология МСК и характерная окраска клеток после направленной дифференцировки, трансмиссионная микроскопия, увеличение 200 X.In FIG. Table 1 shows the characteristics of MSCs obtained from dental pulp. In fig. 1A - Morphology of primary MSC culture, light microscopy, magnification 200 X; Fig 1B - Phenotyping of MSC surface receptors using flow cytometry. Vertical - number of cells, horizontal - relative fluorescence intensity. Light gray histograms - distribution of MSCs stained with the indicated antibodies, dark gray - control isotype antibodies; fig. 1B - Morphology of MSCs and characteristic coloring of cells after directed differentiation, transmission microscopy, magnification 200 X.
На Фиг. 2 продемонстрирована визуализация флуоресцирующих клеток при трансфекции МСК химерной плазмидой pcNS5A-GFP. На фиг. 2А - флуоресценция через 48 ч после трансфекции; на фиг 2Б - динамика экспрессии гена NS5A-GFP.In FIG. Figure 2 demonstrates the visualization of fluorescent cells upon transfection of MSCs with the chimeric plasmid pcNS5A-GFP. In fig. 2A - fluorescence 48 hours after transfection; Fig. 2B shows the dynamics of NS5A-GFP gene expression.
На Фиг. 3 показаны изменения концентрации цитокинов, секретируемых трансфицированными мезенхимальными клетками, выделенными из дентальной пульпы. Данные представлены как средние + стандартное отклонение (SD); * p<0,05.In FIG. Figure 3 shows changes in the concentration of cytokines secreted by transfected mesenchymal cells isolated from dental pulp. Data are presented as means + standard deviation (SD); *p<0.05.
На Фиг. 4 приведена пролиферативная активность лимфоцитов иммунизированных мышей в ответ на стимуляцию антигенами in vitro. Данные представлены как средние + стандартное отклонение (SD); * p < 0,05 по сравнению с контрольной группой; ** p < 0,05 по сравнению с указанными группами.In FIG. Figure 4 shows the proliferative activity of lymphocytes from immunized mice in response to stimulation with antigens in vitro. Data are presented as means + standard deviation (SD); * p < 0.05 compared with the control group; ** p < 0.05 compared with the indicated groups.
На Фиг. 5 показана сравнительная частота индукции лимфоцитами IFN-γ-синтезирующих клеток в ответ на антигены из состава белка NS5A, определенная методом ELISpot. Данные представлены как средние + стандартное отклонение (SD); * p < 0,05 по сравнению с контрольной группой; ** p < 0,05 по сравнению с указанными группами.In FIG. Figure 5 shows the comparative frequency of induction of IFN-γ-synthesizing cells by lymphocytes in response to antigens from the NS5A protein, determined by the ELISpot method. Data are presented as means + standard deviation (SD); * p < 0.05 compared to the control group; ** p < 0.05 compared with the indicated groups.
На Фиг. 6 продемонстрированы изменения относительного содержания клеточных популяций в селезенках мышей, иммунизированных МСК, мМСК и плазмидой. Данные представлены как средние + стандартное отклонение (SD); * p < 0,05 по сравнению с контрольной группой.In FIG. Figure 6 demonstrates changes in the relative content of cell populations in the spleens of mice immunized with MSCs, mMSCs, and the plasmid. Data are presented as means + standard deviation (SD); * p < 0.05 compared to the control group.
Осуществление изобретенияCarrying out the invention
Поставленная цель и заявленный технический результат достигаются путем трехкратного внутривенного введения иммунобиологического средства, представляющего собой мМСК человека, экспрессирующие неструктурный белок NS5A ВГС.The stated goal and the stated technical result are achieved by three times intravenous administration of an immunobiological agent, which is human mMSC expressing the non-structural protein NS5A of HCV.
Практическая реализация заявленного изобретения осуществляется в 3 этапа в нижеприведённой последовательности, а именно:The practical implementation of the claimed invention is carried out in 3 stages in the following sequence, namely:
1 этап: получение МСК человека;Stage 1: obtaining human MSCs;
2 этап: получение плазмидной конструкции; трансфекция МСК человека плазмидой и получение мМСК, экспрессирующих неструктурный белок ВГС;Stage 2: obtaining a plasmid construct; transfection of human MSCs with a plasmid and production of mMSCs expressing HCV non-structural protein;
3 этап: анализ эффективности заявленного способа увеличения ВГС-специфического клеточного иммунного ответа на лабораторных мышах.Stage 3: analysis of the effectiveness of the claimed method of increasing the HCV-specific cellular immune response in laboratory mice.
Далее приведены примеры каждого из этапов осуществления заявленного технического решения.The following are examples of each stage of implementation of the claimed technical solution.
Пример 1. Получение и характеристика МСК из дентальной пульпыExample 1. Preparation and characterization of MSCs from dental pulp
Первичные клетки дентальной пульпы получены из содержимого пульповой камеры удаленных по ортодонтическим показаниям здоровых зубов. Вскрытую в стерильных условиях пульповую камеру промывали в клеточной культуральной среде DMEM/F-12 (Gibco, США) с двухкратным раствором антибиотика-антимикотика (Gibco, США). Дентальную пульпу извлекали тонким шпателем, измельчали, инкубировали в растворе коллагеназы I (Gibco, США) в концентрации 1,0 мг/мл в течение 3 ч при 37°С, затем центрифугировали (400g). Выделенные клетки культивировали в среде DMEM/F-12 с 10% ЭТС (Gibco, США), 100,0 Ед/мл пенициллина и 100,0 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия), при достижении 90% конфлюэнтности клетки пассировали в соотношении 1:3.Primary dental pulp cells are obtained from the contents of the pulp chamber of healthy teeth removed for orthodontic reasons. The pulp chamber, opened under sterile conditions, was washed in cell culture medium DMEM/F-12 (Gibco, USA) with a two-fold solution of antibiotic-antimycotic (Gibco, USA). The dental pulp was removed with a thin spatula, crushed, incubated in a solution of collagenase I (Gibco, USA) at a concentration of 1.0 mg/ml for 3 hours at 37°C, then centrifuged (400g). Isolated cells were cultured in DMEM/F-12 medium with 10% FBS (Gibco, USA), 100.0 U/ml penicillin and 100.0 μg/ml streptomycin (PanEco, Russia); when 90% confluency was reached, the cells were passaged in the ratio 1:3.
Полученные МСК характеризовали по морфологическим свойствам, по экспрессии поверхностных рецепторов и способности к направленной дифференцировке. Как показано на Фиг. 1А, клетки были адгезионные и имели характерную для МСК веретенообразную форму.The resulting MSCs were characterized by morphological properties, expression of surface receptors, and ability for directed differentiation. As shown in FIG. 1A, the cells were adhesive and had a spindle-shaped shape characteristic of MSCs.
С помощью проточной цитофлюориметрии в культуре МСК исследовали экспрессию маркеров МСК: CD29, CD44, CD73, CD90 и CD105 и отсутствие экспрессии маркеров CD34 и CD45. Первичные антитела, меченные флуорохромами FITC или PE, получены из Miltenyi Biotec (Германия). В этом эксперименте показано, что полученные МСК экспрессировали базовые маркеры, характерные для МСК, и не экспрессировали маркеры гемопоэтических клеток (Фиг. 1Б).Using flow cytofluorimetry in MSC culture, we examined the expression of MSC markers: CD29, CD44, CD73, CD90 and CD105 and the absence of expression of CD34 and CD45 markers. Primary antibodies labeled with FITC or PE fluorochromes were obtained from Miltenyi Biotec (Germany). This experiment showed that the resulting MSCs expressed basal markers characteristic of MSCs and did not express markers of hematopoietic cells (Fig. 1B).
Культуру МСК (5 пассаж) дифференцировали в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлении с помощью остеогенной среды (среда Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) с добавлением 10−8 M дексаметазона (Sigma, США), 10,0 мМ b-глицерофосфата (Sigma), и 50,0 мкг/мл аскорбиновой кислоты), адипогенной среды (DMEM с 10,0 мМ 3-изобутил-1-метилксантин (Sigma), 0,1 мМ индометацин (Sigma), 10,0 мкг/мл инсулин (Sigma), 10−6 М дексаметазон) и хондрогенной среды (Stempro, Invitrogen, Life Technologies Ltd Paisley, Великобритания), соответственно. Для проявления остеогенной, адипогенной и хондрогенной дифференцировки культуры МСК, выдержанные в течение недели в дифференцировочных средах, окрашивали с помощью Alizarin red (Sigma), Oil Red O (Sigma), и Alcian blue (Sigma), соответственно, с последующей микроскопией в просвечивающем режиме на микроскопе Nikon Eclipse Ci microscope (Nikon Instruments Inc.). Как показано на Фиг. 1В, после воздействия вышеописанных реагентов и процедур первичные МСК дифференцировались в трех основных направлениях: остеогенном, адипогенном и хондрогенном.The MSC culture (passage 5) was differentiated in the osteogenic, adipogenic and chondrogenic directions using an osteogenic medium (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) with the addition of 10−8 M dexamethasone (Sigma, USA), 10.0 mM b-glycerophosphate (Sigma) , and 50.0 μg/ml ascorbic acid), adipogenic medium (DMEM with 10.0 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (Sigma), 0.1 mM indomethacin (Sigma), 10.0 μg/ml insulin (Sigma ), 10−6 M dexamethasone) and chondrogenic medium (Stempro, Invitrogen, Life Technologies Ltd Paisley, UK), respectively. To demonstrate osteogenic, adipogenic, and chondrogenic differentiation, MSC cultures maintained for a week in differentiation media were stained with Alizarin red (Sigma), Oil Red O (Sigma), and Alcian blue (Sigma), respectively, followed by transmission microscopy on a Nikon Eclipse Ci microscope (Nikon Instruments Inc.). As shown in FIG. 1B, after exposure to the above reagents and procedures, primary MSCs differentiated in three main directions: osteogenic, adipogenic and chondrogenic.
Таким образом, в Примере 1 показано, что по адгезивной способности, поверхностным маркерам и дифференцировочному потенциалу полученные клетки соответствуют критериям определения МСК Международного общества клеточной терапии (The International Society for Cellular Therapy) [27].Thus, Example 1 shows that in terms of adhesive ability, surface markers and differentiation potential, the resulting cells meet the criteria for defining MSCs of the International Society for Cellular Therapy [27].
Пример 2. Характеристика плазмиды и получение мМСКExample 2. Characterization of the plasmid and production of mMSCs
В качестве кандидатной ДНК-вакцины использовали химерную плазмиду pcNS5A-GFP, кодирующую полноразмерный неструктурный белок NS5A ВГС (1973-2419 а.о.) в комплексе с зеленым флуоресцирующим белком GFP, как описано ранее [28]. Образование химерного комплекса GFP-NS5A позволяет визуально оценивать число трансфицированных клеток с помощью флуоресцентного микроскопа, не используя иммуноцитохимическое окрашивание продуктов экспрессии генов ВГС. Плазмиду конструировали на основе вектора pcDNA-3.1(+) (Invitrogen, США). Плазмидную ДНК получали, трансформируя компетентные клетки Escherichia coli (штамм XL-1 blue). Для препаративного выделения и очистки плазмид из культуры бактерий использовали щелочной метод, для аналитического - набор Qiagen Inc. (США) в соответствии с инструкцией. Концентрацию очищенной ДНК измеряли на спектрофотометре при длине волны 260/280 нм.As a candidate DNA vaccine, we used the chimeric plasmid pcNS5A-GFP, encoding the full-length non-structural protein NS5A of HCV (aa 1973-2419) in complex with the green fluorescent protein GFP, as described previously [28]. The formation of the GFP-NS5A chimeric complex allows visual assessment of the number of transfected cells using a fluorescence microscope, without using immunocytochemical staining of HCV gene expression products. The plasmid was constructed based on the pcDNA-3.1(+) vector (Invitrogen, USA). Plasmid DNA was obtained by transforming competent Escherichia coli cells (strain XL-1 blue). For preparative isolation and purification of plasmids from bacterial cultures, the alkaline method was used; for analytical purposes, a Qiagen Inc. kit was used. (USA) in accordance with the instructions. The concentration of purified DNA was measured using a spectrophotometer at a wavelength of 260/280 nm.
Генетически модифицированные клетки человека получали путем трансфекции. За 24 ч до трансфекции вносили 1,5×105 МСК в 24-луночные культуральные панели или 2,5×106 клеток в культуральные чашки Петри с ростовой площадью 60,1 см2, после достижения субконфлюэнтного монослоя (около 80%) на МСК наносили комплексы плазмиды pcNS5A-GFP со сливающим агентом GenJect™-39 (Molecta, Россия) в соотношении 1:2 (5,0 мкг плазмиды плюс 10,0 мкл сливающего агента). Через 18 ч для снижения токсичности данный комплекс удаляли путем смены среды. Все манипуляции с трансфекцией МСК выполняли стерильно в полной ростовой среде в отсутствии антибиотиков. Анализ трансфицированных клеток проводили с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Primovert A1. Zeiss с камерой AxioCam MRc5 (Германия). Эффективность трансфекции оценивали по доли флуоресцирующих клеток в общем количестве клеток (в %), учитывая не менее семи полей зрения.Genetically modified human cells were obtained by transfection. 24 hours before transfection, 1.5 × 10 5 MSCs were introduced into 24-well culture panels or 2.5 × 10 6 cells into Petri culture dishes with a growth area of 60.1 cm 2 , after achieving a subconfluent monolayer (about 80%) on MSCs were applied with complexes of the pcNS5A-GFP plasmid with the fusion agent GenJect™-39 (Molecta, Russia) in a 1:2 ratio (5.0 μg of plasmid plus 10.0 μl of fusion agent). After 18 h, to reduce toxicity, this complex was removed by changing the medium. All manipulations with MSC transfection were performed sterilely in complete growth medium in the absence of antibiotics. Transfected cells were analyzed using a Primovert A1 inverted fluorescence microscope. Zeiss with AxioCam MRc5 camera (Germany). The efficiency of transfection was assessed by the proportion of fluorescent cells in the total number of cells (in%), taking into account at least seven fields of view.
На Фиг. 2А показан пример визуализации трансфицированных клеток с помощью флуоресценции GFP. Изучение динамики экспрессии гена NS5A-GFP показало, что наибольшая эффективность трансфекции МСК наблюдалась через 48 ч (Фиг. 2Б).In FIG. Figure 2A shows an example of visualization of transfected cells using GFP fluorescence. A study of the dynamics of NS5A-GFP gene expression showed that the highest efficiency of MSC transfection was observed after 48 hours (Fig. 2B).
Таким образом, в этом эксперименте показано, что белок NS5A ВГС экспрессируется в МСК, трансфицированных плазмидой pcNS5A-GFP, при этом эффективность трансфекции (около 50%) максимальна через 48 ч после трансфекции.Thus, this experiment showed that the HCV NS5A protein is expressed in MSCs transfected with the pcNS5A-GFP plasmid, and the transfection efficiency (about 50%) is maximum 48 h after transfection.
Пример 3. Секреция цитокинов нативными МСК и мМСКExample 3. Secretion of cytokines by native MSCs and mMSCs
Известно, что МСК - источник целого спектра цитокинов и ростовых факторов, играющих регуляторную роль в гемопоэзе, пролиферации, апоптозе, ангиогенезе, иммунном ответе и других важных физиологических процессах. Концентрации восьми цитокинов, секретируемых МСК, определяли в культуральных жидкостях, отобранных:It is known that MSCs are a source of a whole spectrum of cytokines and growth factors that play a regulatory role in hematopoiesis, proliferation, apoptosis, angiogenesis, immune response and other important physiological processes. The concentrations of eight cytokines secreted by MSCs were determined in culture fluids collected from:
а) при культивировании МСК,a) when cultivating MSCs,
б) после трансфекции клеток.b) after cell transfection.
Для этого эксперимента использовали ИФА-наборы производства Вектор-Бест (г. Новосибирск, Россия) для следующих цитокинов: IFN-α, IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 и VEGF (фактор роста эндотелия сосудов). Концентрацию цитокинов определяли по калибровочным кривым стандартных образцов. Обнаружено, что экспрессия NS5A ВГС в результате трансфекции МСК оказала существенное влияние на профиль секретируемых цитокинов. Через 24 - 48 ч после трансфекции плазмидой pcNS5A-GFP МСК, выделенных из дентальной пульпы, концентрации шести цитокинов изменялись. Статистически значимо снижалась секреция IL-2, IL-6, TNF-α, IL-4 и IL-10, повышалась - VEGF (Фиг. 3). Данные изменения принципиальны: показано, что МСК могут поляризоваться в фенотип МСК 2, который супрессирует иммунный ответ, или в фенотип МСК 1, который индуцирует иммунный ответ. Направленность иммуномодуляции зависит от концентрации про- и противовоспалительных цитокинов и других растворимых факторов в среде. Показано, что высокая концентрация ряда цитокинов, в первую очередь, IFN-γ и TNF-α, связана с супрессией иммунного ответа [29]. Поэтому снижение уровня TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6 и IL-10, секретируемых мМСК, способствует активации различных звеньев врожденного и адаптивного иммунного ответа.For this experiment, ELISA kits produced by Vector-Best (Novosibirsk, Russia) were used for the following cytokines: IFN-α, IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 and VEGF (vascular endothelial growth factor). Cytokine concentrations were determined using calibration curves of standard samples. It was found that the expression of HCV NS5A as a result of transfection of MSCs had a significant effect on the profile of secreted cytokines. 24 - 48 hours after transfection of MSCs isolated from dental pulp with the pcNS5A-GFP plasmid, the concentrations of six cytokines changed. The secretion of IL-2, IL-6, TNF-α, IL-4 and IL-10 decreased statistically significantly, and the secretion of VEGF increased (Fig. 3). These changes are fundamental: it has been shown that MSCs can polarize into the MSC 2 phenotype, which suppresses the immune response, or into the MSC 1 phenotype, which induces an immune response. The direction of immunomodulation depends on the concentration of pro- and anti-inflammatory cytokines and other soluble factors in the environment. It has been shown that high concentrations of a number of cytokines, primarily IFN-γ and TNF-α, are associated with suppression of the immune response [29]. Therefore, a decrease in the level of TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6 and IL-10 secreted by mMSCs promotes the activation of various parts of the innate and adaptive immune response.
Таким образом, данный эксперимент показывает, что снижение секреции мМСК провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-2, IL-6 и противовоспалительных IL-4 и IL-10 - один из факторов, направляющих иммунный ответ в сторону активации.Thus, this experiment shows that a decrease in the secretion of pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-2, IL-6 and anti-inflammatory IL-4 and IL-10 by mMSCs is one of the factors directing the immune response towards activation.
Пример 4. Оценка эффективности иммунного ответа мышей на введение мМСКExample 4. Evaluation of the effectiveness of the immune response of mice to the introduction of mMSCs
Для экспериментов in vivo использовали самок мышей инбредной линии C57BL/6 (Н-2b) в возрасте 6-8 недель (средний вес 20±3 г), полученных из питомника лабораторных животных «Столбовая». Было сформировано 4 группы мышей по 6 - 8 животных в группе:For in vivo experiments, we used female mice of the inbred line C57BL/6 (H-2b) aged 6-8 weeks (average weight 20±3 g), obtained from the Stolbovaya laboratory animal nursery. 4 groups of mice were formed, 6 to 8 animals per group:
группу 1 иммунизировали нативными (немодифицированными) МСК (МСК) (контроль 1); group 1 was immunized with native (unmodified) MSCs (MSCs) (control 1);
группу 2 иммунизировали мМСК, трансфицированными плазмидой pcNS5A-GFP;group 2 was immunized with mMSCs transfected with the pcNS5A-GFP plasmid;
группу 3 иммунизировали плазмидой pcNS5A-GFP;group 3 was immunized with pcNS5A-GFP plasmid;
группу 4 иммунизировали ф/р (контроль 2).group 4 was immunized with f/r (control 2).
Клетки вводили в/в в дозе 5,0×105/мышь, плазмиду - 100,0 мкг/мышь в/м в четырехглавую мышцу бедра задних лап. Иммунизации проводили трехкратно с интервалом 2 недели, через 8 сут после последней инъекции учитывали иммунный ответ.Cells were injected intravenously at a dose of 5.0×10 5 /mouse, plasmid - 100.0 μg/mouse intramuscularly into the quadriceps femoris muscle of the hind legs. Immunizations were carried out three times with an interval of 2 weeks; the immune response was taken into account 8 days after the last injection.
При проведении экспериментов in vivo не зарегистрировано ни падежа иммунизированных мышей, ни потери ими массы тела. Поведенческие реакции у животных контрольных и опытных групп не различались, что, по нашему мнению, свидетельствует о безопасности введенных препаратов.During in vivo experiments, no death of immunized mice or loss of body weight was recorded. Behavioral reactions in animals of the control and experimental groups did not differ, which, in our opinion, indicates the safety of the administered drugs.
Для оценки гуморального и клеточного ответа использовали рекомбинантные белки и пептиды, имитирующие последовательности белка NS5A ВГС (Таблица 1).To assess the humoral and cellular response, recombinant proteins and peptides that mimic the sequences of the HCV NS5A protein were used (Table 1).
Синтезированы в Институте биоорганической химии РАН.CTL epitopes corresponding to genotype 1b.
Synthesized at the Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences.
Гуморальный иммунный ответ на белки NS5A определяли в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА), в лунки сорбировали рекомбинантные белки NS5A ВГС в концентрации 1,0 мкг/мл. В сыворотках крови мышей контрольных групп 1 и 4 антитела к NS5A отсутствовали (титр < 1:10). В группах 2 и 3 титр антител к NS5A составлял 1:10 - 1:20.The humoral immune response to NS5A proteins was determined in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); recombinant HCV NS5A proteins were adsorbed into the wells at a concentration of 1.0 μg/ml. There were no antibodies to NS5A in the blood sera of mice of control groups 1 and 4 (titer < 1:10). In groups 2 and 3, the titer of antibodies to NS5A was 1:10 - 1:20.
Важной характеристикой клеточного иммунного ответа служит пролиферация лимфоцитов в ответ на рестимуляцию in vitro антигенами из состава белка NS5A. Анализ пролиферации лимфоцитов иммунизированных мышей проводили in vitro по включению в лимфоциты [3H]-тимидина. Для получения спленоцитов селезенки диспергировали, клеточные суспензии процеживали через ситечки с размером пор 100 мкм (BD Falcon Cell srtainers), дважды отмывали в среде RPMI-1640 (ПАНЭКО, Россия). Спленоциты помещали в 96-луночные культуральные панели по 5×106 клеток в лунку в среде RPMI-1640, содержащую 20% ЭТС (Invitrogen, США), 2,0 мМ глутамина, 4,5 г/л глюкозы, 50,0 мкг/мл гентамицина, 0,2 ед/мл инсулина. К клеткам добавляли стимуляторы - смесь трех рекомбинантных белков NS5A и смесь пептидов в конечной концентрации 1,0 мкг/мл каждого компонента и культивировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 4 сут, затем добавляли свежую среду с [3H]-тимидином (1,0 мкКи/лунка) (получен из ФГБУ Институт молекулярной генетики НИЦ «Курчатовский институт» РАН). Через 18 ч радиоактивность в клетках измеряли с помощью β-счетчика MicroBeta2 (PerkinElmer, США). Рассчитывали индекс стимуляции пролиферации (ИСП) как отношение радиоактивности (в имп/мин) в лунках со стимуляторами к радиоактивности в лунках со средой.An important characteristic of the cellular immune response is the proliferation of lymphocytes in response to restimulation in vitro by antigens from the NS5A protein. Analysis of the proliferation of lymphocytes of immunized mice was carried out in vitro by the incorporation of [ 3 H]-thymidine into lymphocytes. To obtain splenocytes, spleens were dispersed, cell suspensions were filtered through strainers with a pore size of 100 μm (BD Falcon Cell strainers), and washed twice in RPMI-1640 medium (PANEKO, Russia). Splenocytes were placed in 96-well culture panels of 5×10 6 cells per well in RPMI-1640 medium containing 20% FBS (Invitrogen, USA), 2.0 mM glutamine, 4.5 g/l glucose, 50.0 μg /ml gentamicin, 0.2 units/ml insulin. Stimulators were added to the cells - a mixture of three recombinant NS5A proteins and a mixture of peptides at a final concentration of 1.0 μg/ml of each component and cultured at 37°C in an atmosphere of 5% CO 2 for 4 days, then fresh medium with [ 3 H] was added. -thymidine (1.0 µCi/well) (obtained from the Federal State Budgetary Institution Institute of Molecular Genetics, National Research Center "Kurchatov Institute" RAS). After 18 h, radioactivity in the cells was measured using a MicroBeta2 β-counter (PerkinElmer, USA). The proliferation stimulation index (PSI) was calculated as the ratio of radioactivity (in counts/min) in wells with stimulators to radioactivity in wells with medium.
Выявлено, что ИСП в ответ на антигены ВГС в группах 2 и 3 статистически значимо превышали значения ИСП в контрольных группах 1 и 4, при этом ИСП в ответ на пептиды был более чем в 3 раза больше в группе мышей, иммунизированных мМСК, по сравнению с группой, которой вводили плазмиду (Фиг. 4).It was revealed that the IPI in response to HCV antigens in groups 2 and 3 was statistically significantly higher than the IPI values in control groups 1 and 4, while the IPI in response to peptides was more than 3 times higher in the group of mice immunized with mMSCs compared to group that received the plasmid (Fig. 4).
Таким образом, в данном эксперименте показано, что иммунизация мышей мМСК, экспрессирующими ген NS5A, усиливает антиген-специфическую пролиферацию спленоцитов in vitro.Thus, this experiment shows that immunization of mice with mMSCs expressing the NS5A gene enhances antigen-specific proliferation of splenocytes in vitro.
Пример 5. Иммунизация мМСК повышает количество IFN-γ-синтезирующих клетокExample 5. Immunization of mMSCs increases the number of IFN-γ-synthesizing cells
Наиболее информативный метод, рекомендуемый для валидации Т-клеточного ответа к новым вакцинам против ВГС - определение количества IFN-γ-синтезирующих клеток методом ELISpot [30]. Данный тест проводили c помощью набора Mouse IFN-γ ELISpotPLUS kit (HRP) (Mabtech, Швеция). Изолированные спленоциты (4х105 клеток в лунке) инкубировали с иммобилизованными на 96-луночных планшетах антителами к IFN-γ мыши течение 2,5 сут при 37°С в атмосфере 5% СО2 в присутствии стимуляторов - смесей рекомбинантных белков NS5A и пептидов. Окрашивание клеток проводили в соответствии с инструкцией производителя. Окрашенные пятна (spots, споты) детектировали визуально с помощью стереоскопического микроскопа МБС-10 (ОАО «ЛЗОС», Россия). Результаты выражали как разницу в количестве спотов на 106 клеток в лунках в присутствии стимуляторов и в контрольных лунках со средой.The most informative method recommended for validating the T-cell response to new HCV vaccines is to determine the number of IFN-γ-synthesizing cells by ELISpot method [30]. This test was performed using the Mouse IFN-γ ELISpotPLUS kit (HRP) (Mabtech, Sweden). Isolated splenocytes (4x105 cells per well) were incubated with antibodies to mouse IFN-γ immobilized on 96-well plates for 2.5 days at 37°C in an atmosphere of 5% CO2 in the presence of stimulants - mixtures of recombinant NS5A proteins and peptides. Cell staining was carried out in accordance with the manufacturer's instructions. Colored spots (spots) were detected visually using a stereoscopic microscope MBS-10 (JSC LZOS, Russia). The results were expressed as the difference in the number of spots per 106 cells in wells in the presence of stimulants and in control wells with medium.
На Фиг. 5 показано, что число спотов в группах 2 и 3 превышало таковое в контрольных группах 1 и 4, соответственно. При сравнении групп 2 и 3 между собой установлено, что спотов образовалось в 2 - 2,5 раза больше в группе 2.In FIG. Figure 5 shows that the number of spots in groups 2 and 3 exceeded that in control groups 1 and 4, respectively. When comparing groups 2 and 3 with each other, it was found that 2 - 2.5 times more spots were formed in group 2.
Таким образом, в данном опыте показано, что иммунизация мышей мМСК, экспрессирующими ген NS5A, усиливает образование клеток, синтезирующих IFN-γ, в ответ на стимуляцию пептидами и рекомбинантными белками из состава последовательностей белка NS5A. Это свидетельствует об активации антивирусного ответа. Важно, что клеточный ответ на мМСК (группа 2) превосходил ответ на плазмиду (группа 3) несмотря на то, что доза введенной плазмиды в 100 раз превышала дозу той же плазмиды, трансфицированной в МСК (100,0 мкг и 1,0 мкг, соответственно).Thus, this experiment showed that immunization of mice with mMSCs expressing the NS5A gene enhances the formation of cells synthesizing IFN-γ in response to stimulation with peptides and recombinant proteins from the NS5A protein sequences. This indicates the activation of the antiviral response. It is important that the cellular response to mMSCs (group 2) was superior to the response to the plasmid (group 3) despite the fact that the dose of the introduced plasmid was 100 times higher than the dose of the same plasmid transfected into MSCs (100.0 μg and 1.0 μg, respectively).
Пример 6. Анализ клеточных популяций в селезенках иммунизированных животныхExample 6: Analysis of Cell Populations in the Spleens of Immunized Animals
Анализ клеточных популяций в селезенках мышей, иммунизированных МСК, мМСК и плазмидой, проводили методом проточной цитометрии. Использовали меченные флуорохромами антитела к кластерам дифференцировки: CD4, CD8, CD25, CD11b, CD11c и Gr1 (BD Biosciences, США). Содержание различных популяций Т-клеток - наивных, эффекторных и памяти, определяли с помощью набора Mouse Naïve/Memory T Cell Panel (BD Pharmingen, BD Biosciences, США). Характеристика антител и определяемых клеточных популяций представлена в таблице 2. Окрашивание клеток (106 клеток/пробу) проводили по стандартной методике, рекомендованной производителем. Измерения выполняли на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto™ II (США), результаты анализировали с помощью программы BD FACSDiva v.6.1.3 (BD Biosciences, США).Analysis of cell populations in the spleens of mice immunized with MSCs, mMSCs and plasmid was performed by flow cytometry. We used fluorochrome-labeled antibodies to the clusters of differentiation: CD4, CD8, CD25, CD11b, CD11c and Gr1 (BD Biosciences, USA). The content of various populations of T cells - naïve, effector and memory - was determined using the Mouse Naïve/Memory T Cell Panel kit (BD Pharmingen, BD Biosciences, USA). Characteristics of antibodies and determined cell populations are presented in Table 2. Cell staining (10 6 cells/sample) was carried out according to the standard method recommended by the manufacturer. Measurements were performed on a BD FACSCanto™ II flow cytometer (USA), the results were analyzed using the BD FACSDiva v.6.1.3 program (BD Biosciences, USA).
CD11b - APCGr1 - FITC
CD11b - APC
CD4 - PerCP-Cy5.5
CD62L - APC
CD44 - PECD3 - APC
CD4 - PerCP-Cy5.5
CD62L - APC
CD44 - PE
Как показано на Фиг. 6, не было обнаружено различий в относительном количестве лимфоцитов CD8+ (CTL) и CD4+ (Th), однако содержание некоторых субпопуляций CD4+ отличалось. Так, в группе 1 (МСК) статистически значимо снижалась доля активированных лимфоцитов CD4+/CD25+ по сравнению с контролем и другими группами. В селезенках мышей, получивших МСК и мМСК, статистически значимо увеличивалось относительное количество Т-клеток памяти (T-memory). Содержание наивных Т-клеток (T-naïve) самым низким было в контрольной группе, тогда как эффекторных Т-клеток (T-effector) - сходным во всех группах.As shown in FIG. 6, no differences were found in the relative abundance of CD8 + lymphocytes (CTL) and CD4 + lymphocytes (Th), but the content of some CD4 + subpopulations differed. Thus, in group 1 (MSCs), the proportion of activated CD4 + /CD25 + lymphocytes decreased statistically significantly compared to the control and other groups. In the spleens of mice that received MSCs and mMSCs, the relative number of memory T cells (T-memory) increased statistically significantly. The content of naïve T cells (T-naïve) was lowest in the control group, while the content of effector T cells (T-effector) was similar in all groups.
Что касается клеток миелоидного ряда, то содержание дендритных клеток (DC), гранулоцитов и макрофагов было сходным (Фиг. 6). Важно, что в группе 2 (мМСК) статистически значимо снижалось количество супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC). MDSC - гетерогенная популяция незрелых миелоидных клеток с мощным супрессорным потенциалом. Роль MDSC в вирусных инфекциях изучена недостаточно. У пациентов, инфицированных ВГС, наблюдается повышение популяции MDSC; эти клетки подавляют пролиферацию CD4+ и CD8+ лимфоцитов, NK-клеток и продукцию ИФН-γ [31, 32]. Стимуляции адаптивного иммунного ответа на модифицированные МСК, показанная в примерах 4 и 5, может быть результатом подавления MDSC.Regarding myeloid cells, the content of dendritic cells (DC), granulocytes and macrophages was similar (Fig. 6). It is important that in group 2 (mMSCs) there was a statistically significant decrease in the number of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs). MDSC are a heterogeneous population of immature myeloid cells with powerful suppressive potential. The role of MDSCs in viral infections is not well understood. In HCV-infected patients, there is an increase in the MDSC population; these cells suppress the proliferation of CD4 + and CD8 + lymphocytes, NK cells and the production of IFN-γ [31, 32]. The stimulation of the adaptive immune response to the modified MSCs shown in Examples 4 and 5 may be a result of MDSC suppression.
Таким образом, пример 6 демонстрирует, что мМСК, экспрессирующие белок NS5A ВГС, стимулируют формирование CD4+ Т-клеток памяти и снижение содержания клеток-супрессоров MDSC, что способствует эффективному клеточному ответу против ВГС.In summary, Example 6 demonstrates that mMSCs expressing the HCV NS5A protein stimulate the formation of memory CD4 + T cells and the reduction of MDSC suppressor cells, which promotes an effective cellular response against HCV.
Библиография: Bibliography :
1. Dustin LB. Innate and Adaptive Immune Responses in Chronic HCV Infection. Curr Drug Targets. 2017;18(7):826-843. doi: 10.2174/1389450116666150825110532.1. Dustin LB. Innate and Adaptive Immune Responses in Chronic HCV Infection. Curr Drug Targets. 2017;18(7):826-843. doi: 10.2174/1389450116666150825110532.
2. Pawlotsky JM. Treatment of hepatitis C: how will we use viral kinetics, response-guided therapy? Curr Gastroenterol Rep. 2013 Feb;15(2):309. doi: 10.1007/s11894-012-0309-x.2. Pawlotsky JM. Treatment of hepatitis C: how will we use viral kinetics, response-guided therapy? Curr Gastroenterol Rep. 2013 Feb;15(2):309. doi:10.1007/s11894-012-0309-x.
3. Wang Y., Rao H., Chi X. et al. Detection of residual HCV-RNA in patients who have achieved sustained virological response is associated with persistent histological abnormality. EBioMedicine 2019, 46, 227-235.3. Wang Y., Rao H., Chi X. et al. Detection of residual HCV-RNA in patients who have achieved sustained virological response is associated with persistent histological abnormality. EBioMedicine 2019, 46, 227-235.
4. Huang C.F., Yu M.L. Unmet needs of chronic Hepatitis C in the era of direct-acting antiviral therapy. Clin. Mol. Hepatol. 2020, 26, 251-260.4. Huang C.F., Yu M.L. Unmet needs of chronic Hepatitis C in the era of direct-acting antiviral therapy. Clin. Mol. Hepatol. 2020, 26, 251-260.
5. Todryk S.M., Bassendine M.F., Bridge S.H. Revisiting the elusive Hepatitis C vaccine. Vaccines 2021, 9, 114.5. Todryk S.M., Bassendine M.F., Bridge S.H. Revisiting the elusive Hepatitis C vaccine. Vaccines 2021, 9, 114.
6. Andrianov A.K., Fuerst T.R. Immunopotentiating and Delivery Systems for HCV Vaccines. Viruses 2021, 13, 981.6. Andrianov A.K., Fuerst T.R. Immunopotentiating and Delivery Systems for HCV Vaccines. Viruses 2021, 13, 981.
7. Yuan X., Logan T.M., Ma T. Metabolism in human mesenchymal stromal cells: A missing link between hMSC biomanufacturing and therapy? Front. Immunol. 2019, 10, 977.7. Yuan X., Logan T.M., Ma T. Metabolism in human mesenchymal stromal cells: A missing link between hMSC biomanufacturing and therapy? Front. Immunol. 2019, 10, 977.
8. Cobo M.; Anderson, P.; Benabdellah, K. et al. Mesenchymal stem cells expressing vasoactive intestinal peptide ameliorate symptoms in a model of chronic multiple sclerosis. Cell Transp. 2013, 22, 839-854.8. Cobo M.; Anderson, P.; Benabdellah, K. et al. Mesenchymal stem cells expressing vasoactive intestinal peptide ameliorate symptoms in a model of chronic multiple sclerosis. Cell Transp. 2013, 22, 839-854.
9. Wyse R.D.; Dunbar G.L.; Rossignol J. Use of genetically modified mesenchymal stem cells to treat neurodegenerative diseases. Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 1719-1745.9. Wyse R.D.; Dunbar G. L.; Rossignol J. Use of genetically modified mesenchymal stem cells to treat neurodegenerative diseases. Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 1719-1745.
10. Neumann-Haefelin C, Thimme R. Success and failure of virus-specific T cell responses in hepatitis C virus infection. Dig Dis. 2011;29(4):416-22. doi: 10.1159/000329807.10. Neumann-Haefelin C, Thimme R. Success and failure of virus-specific T cell responses in hepatitis C virus infection. Dig Dis. 2011;29(4):416-22. doi: 10.1159/000329807.
11. Folgori A, Spada E, Pezzanera M et al. Acute Hepatitis C Italian Study Group. Early impairment of hepatitis C virus specific T cell proliferation during acute infection leads to failure of viral clearance. Gut. 2006 Jul;55(7):1012-9. doi: 10.1136/gut.2005.080077.11. Folgori A, Spada E, Pezzanera M et al. Acute Hepatitis C Italian Study Group. Early impairment of hepatitis C virus specific T cell proliferation during acute infection leads to failure of viral clearance. Gut. 2006 Jul;55(7):1012-9. doi: 10.1136/gut.2005.080077.
12. Chigbu DI, Loonawat R, Sehgal M et al. Hepatitis C Virus Infection: Host-Virus Interaction and Mechanisms of Viral Persistence. Cells. 2019 Apr 25;8(4):376. doi: 10.3390/cells8040376.12. Chigbu DI, Loonawat R, Sehgal M et al. Hepatitis C Virus Infection: Host-Virus Interaction and Mechanisms of Viral Persistence. Cells. 2019 Apr 25;8(4):376. doi: 10.3390/cells8040376.
13. Kandangwa M, Liu Q. HCV NS5A hyperphosphorylation is involved in viral translation modulation. Biochem Biophys Res Commun. 2019 Nov 26;520(1):192-197. doi: 10.1016/j.bbrc.2019.09.105.13. Kandangwa M, Liu Q. HCV NS5A hyperphosphorylation is involved in viral translation modulation. Biochem Biophys Res Commun. 2019 Nov 26;520(1):192-197. doi: 10.1016/j.bbrc.2019.09.105.
14. Shanmugam S, Nichols AK, Saravanabalaji D et al. HCV NS5A dimer interface residues regulate HCV replication by controlling its self-interaction, hyperphosphorylation, subcellular localization and interaction with cyclophilin A. PLoS Pathog. 2018 Jul 23;14(7):e1007177. doi: 10.1371/journal.ppat.1007177.14. Shanmugam S, Nichols AK, Saravanabalaji D et al. HCV NS5A dimer interface residues regulate HCV replication by controlling its self-interaction, hyperphosphorylation, subcellular localization and interaction with cyclophilin A. PLoS Pathog. 2018 Jul 23;14(7):e1007177. doi: 10.1371/journal.ppat.1007177.
15. Muñoz de Rueda P, Fuentes Rodríguez JM, Quiles Pérez R et al. Hepatitis C virus NS5A region mutation in chronic hepatitis C genotype 1 patients who are non-responders to two or more treatments and its relationship with response to a new treatment. World J Gastroenterol. 2017 Jul 7;23(25):4538-4547. doi: 10.3748/wjg.v23.i25.4538.15. Muñoz de Rueda P, Fuentes Rodríguez JM, Quiles Pérez R et al. Hepatitis C virus NS5A region mutation in chronic hepatitis C genotype 1 patients who are non-responders to two or more treatments and its relationship with response to a new treatment. World J Gastroenterol. 2017 Jul 7;23(25):4538-4547. doi: 10.3748/wjg.v23.i25.4538.
16. Hamdy J, Emadeldin N, Hamed MM et al. Design and Synthesis of Novel Bis-Imidazolyl Phenyl Butadiyne Derivatives as HCV NS5A Inhibitors. Pharmaceuticals (Basel). 2022 May 20;15(5):632. doi: 10.3390/ph15050632.16. Hamdy J, Emadeldin N, Hamed MM et al. Design and Synthesis of Novel Bis-Imidazolyl Phenyl Butadiyne Derivatives as HCV NS5A Inhibitors. Pharmaceuticals (Basel). 2022 May 20;15(5):632. doi: 10.3390/ph15050632.
17. Brett S., Hamblin P. A., Ogilvie L. Vaccine against HCV. Патент WO 2004046176, 13.11.2003.17. Brett S., Hamblin P. A., Ogilvie L. Vaccine against HCV. Patent WO 2004046176, 11/13/2003.
18. Armin L., Stefano C., Shiver J.W. et al. Hepatitis C virus vaccine, CN 101988071 (A), 23.03.2011.18. Armin L., Stefano C., Shiver J.W. et al. Hepatitis C virus vaccine, CN 101988071 (A), 03/23/2011.
19. Bailey, J.R.; Barnes, E.; Cox, A.L. Approaches, Progress, and Challenges to Hepatitis C Vaccine Development. Gastroenterology 2019, 156, 418-430.19. Bailey, J.R.; Barnes, E.; Cox, A.L. Approaches, Progress, and Challenges to Hepatitis C Vaccine Development. Gastroenterology 2019, 156, 418-430.
20. Муллагулова А.И., Шаймарданова А.А., Чулпанова Д.С. и др. Препарат для лечения метахроматической лейкодистрофии и способ ее лечения. Патент RU 2769577 (заявка № 2021115696, 01.06.2001).20. Mullagulova A.I., Shaimardanova A.A., Chulpanova D.S. and others. A drug for the treatment of metachromatic leukodystrophy and a method for its treatment. Patent RU 2769577 (application No. 2021115696, 06/01/2001).
21. Junhua Liu, Huping Jiao, Xiushan Yin. Engineered human mesenchymal stem cells as new vaccine platform for COVID-19. bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.20.163030.21. Junhua Liu, Huping Jiao, Xiushan Yin. Engineered human mesenchymal stem cells as a new vaccine platform for COVID-19. bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.20.163030.
22. Tomchuck S.L., Norton E.B., Garry R.F. et al. (2012) Mesenchymal stem cells as a novel vaccine platform. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 140.22. Tomchuck S.L., Norton E.B., Garry R.F. et al. (2012) Mesenchymal stem cells as a novel vaccine platform. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 140.
23. Masoudi MR, Rafati A. Immunogenicity against hepatitis C virus with mesenchymal stem cells of inbreed BALB/c mice sub cloned with HCVcp protein gene. Transpl Immunol. 2022 Oct; 74:101651. doi: 10.1016/j.trim.2022.101651.23. Masoudi MR, Rafati A. Immunogenicity against hepatitis C virus with mesenchymal stem cells of inbreed BALB/c mice sub cloned with HCVcp protein gene. Transpl Immunol. Oct 2022; 74:101651. doi: 10.1016/j.trim.2022.101651.
24. Masalova OV, Lesnova EI, Klimova RR et al. Genetically Modified Mouse Mesenchymal Stem Cells Expressing Non-Structural Proteins of Hepatitis C Virus Induce Effective Immune Response. Vaccines (Basel). 2020 Feb 2;8(1):62. doi: 10.3390/vaccines8010062.24. Masalova OV, Lesnova EI, Klimova RR et al. Genetically Modified Mouse Mesenchymal Stem Cells Expressing Non-Structural Proteins of Hepatitis C Virus Induce Effective Immune Response. Vaccines (Basel). 2020 Feb 2;8(1):62. doi: 10.3390/vaccines8010062.
25. Климова Р.Р., Демидова Н.А., Масалова О.В., Кущ А.А. Профилактическая вакцинация мезенхимальными стволовыми клетками защищает мышей от летальной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 типа. Молекулярная биология, 2021, том 55, № 3, с. 478-490.25. Klimova R.R., Demidova N.A., Masalova O.V., Kushch A.A. Prophylactic vaccination with mesenchymal stem cells protects mice against lethal herpes simplex virus type 1 infection. Molecular Biology, 2021, Vol. 55, No. 3, p. 478-490.
26. Galipeau J, Sensébé L. Mesenchymal stromal cells: clinical challenges and therapeutic opportunities. Cell Stem Cell. 2018; 22(6): 824-833. doi: 10.1016/j.stem.2018.05.004.26. Galipeau J, Sensébé L. Mesenchymal stromal cells: clinical challenges and therapeutic opportunities. Cell Stem Cell. 2018; 22(6): 824-833. doi: 10.1016/j.stem.2018.05.004.
27. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006. 8(4), 315-317.27. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006. 8(4), 315-317.
28. Масалова О.В., Леснова Е.И., Грабовецкий В.В. и др. ДНК-иммунизация плазмидой, содержащей ген белка NS5A вируса гепатита C, индуцирует эффективный клеточный иммунный ответ. Молекулярная биология, 2010, т. 44, № 2, с. 275-283.28. Masalova O.V., Lesnova E.I., Grabovetsky V.V. and others. DNA immunization with a plasmid containing the NS5A protein gene of the hepatitis C virus induces an effective cellular immune response. Molecular Biology, 2010, v. 44, no. 2, p. 275-283.
23. Cagliani J, Grande D, Molmenti EP et al. Immunomodulation by Mesenchymal Stromal Cells and Their Clinical Applications. J Stem Cell Regen Biol. 2017;3(2):10.15436/2471-0598.17.022. doi: 10.15436/2471-0598.17.022.23. Cagliani J, Grande D, Molmenti EP et al. Immunomodulation by Mesenchymal Stromal Cells and Their Clinical Applications. J Stem Cell Regen Biol. 2017;3(2):10.15436/2471-0598.17.022. doi: 10.15436/2471-0598.17.022.
30. Ahlen G., Frelin L. Methods to Evaluate Novel Hepatitis C Virus Vaccines. Methods Mol. Biol. 2016, 1403, 221-244.30. Ahlen G., Frelin L. Methods to Evaluate Novel Hepatitis C Virus Vaccines. Methods Mol. Biol. 2016, 1403, 221-244.
31. Cai W., Qin A., Guo P. et al. Clinical significance and functional studies of myeloid-derived suppressor cells in chronic hepatitis C patients. J. Clin. Immunol. 2013, 33, 798-808.31. Cai W., Qin A., Guo P. et al. Clinical significance and functional studies of myeloid-derived suppressor cells in chronic hepatitis C patients. J. Clin. Immunol. 2013, 33, 798-808.
32. Goh C.C., Roggerson K.M., Lee H.C. et al. Hepatitis C virus-induced myeloid-derived suppressor cells suppress NK cell IFN-gamma production by altering cellular metabolism via arginase-1. J. Immunol. 2016, 196, 2283-2292.32. Goh C.C., Roggerson K.M., Lee H.C. et al. Hepatitis C virus-induced myeloid-derived suppressor cells suppress NK cell IFN-gamma production by altering cellular metabolism via arginase-1. J. Immunol. 2016, 196, 2283-2292.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2811136C1 true RU2811136C1 (en) | 2024-01-11 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU772617B2 (en) * | 1999-11-19 | 2004-05-06 | Csl Limited | Vaccine compositions |
| US20090186045A1 (en) * | 2005-01-31 | 2009-07-23 | Ray Stuart C | Use of consensus sequence as vaccine antigen to enhance recognition of virulent viral variants |
| RU2020113588A (en) * | 2017-10-10 | 2021-11-12 | Ямагути Университи | ENHANCER OF T-CELLS OR B-CELLS WITH A MEMORY FUNCTION, A MALIGNANT TUMOR INHIBITOR AND AN INDUCTOR FOR INDUCING MEMORY FUNCTIONS IN T-CELLS OR B-CELLS |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU772617B2 (en) * | 1999-11-19 | 2004-05-06 | Csl Limited | Vaccine compositions |
| US20090186045A1 (en) * | 2005-01-31 | 2009-07-23 | Ray Stuart C | Use of consensus sequence as vaccine antigen to enhance recognition of virulent viral variants |
| RU2020113588A (en) * | 2017-10-10 | 2021-11-12 | Ямагути Университи | ENHANCER OF T-CELLS OR B-CELLS WITH A MEMORY FUNCTION, A MALIGNANT TUMOR INHIBITOR AND AN INDUCTOR FOR INDUCING MEMORY FUNCTIONS IN T-CELLS OR B-CELLS |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Masalova OV, Lesnova EI, Klimova RR et al. Genetically Modified Mouse Mesenchymal Stem Cells Expressing Non-Structural Proteins of Hepatitis C Virus Induce Effective Immune Response. Vaccines (Basel). 2020 Feb 2;8(1):62. Масалова О.В., Леснова Е.И., Грабовецкий В.В. и др. ДНК-иммунизация плазмидой, содержащей ген белка NS5A вируса гепатита C, индуцирует эффективный клеточный иммунный ответ. Молекулярная биология, 2010, т. 44, n2, стр.275-283. * |
| формула. * |
| формула. Junhua Liu, Huping Jiao, Xiushan Yin. Engineered human mesenchymal stem cells as new vaccine platform for COVID-19, реферат, bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.20.163030, опубликовано 20.06.2020, найдено в интернет 27.07.2023. Suzanne L. Tomchuck, Elizabeth B. Norton et al., Mesenchymal stem cells as a novel vaccine platform, CELLULAR AND INFECTION MICROBIOLOGY, 16.11.2012, V.2, p. 1-8 (Д6), фигура 1. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106659742B (en) | Genetically modified mesenchymal stem cells expressing immune response-stimulating cytokines to attract and/or activate immune cells | |
| JP6755850B2 (en) | Use of mesenchymal stem cells | |
| JP4077876B2 (en) | Chemokine binding proteins and uses thereof | |
| Machhi et al. | A role for extracellular vesicles in SARS-CoV-2 therapeutics and prevention | |
| Kanodia et al. | Expression of LIGHT/TNFSF14 combined with vaccination against human papillomavirus Type 16 E7 induces significant tumor regression | |
| CN108546679B (en) | Method for amplifying human mature high-activity dendritic cells in large quantity in vitro and application thereof | |
| Díaz‐Valdés et al. | Improved dendritic cell‐based immunization against hepatitis C virus using peptide inhibitors of interleukin 10 | |
| CN112426526B (en) | Preparation method of NK (natural killer) cells and application of NK cells in treatment of cancers | |
| JP2021526842A (en) | Oncolytic virus or antigen-presenting cell-mediated cancer treatment with type I interferon and CD40-ligand | |
| Wang et al. | Mesenchymal stem cell carriers enhance antitumor efficacy induced by oncolytic reovirus in acute myeloid leukemia | |
| JP2021516957A (en) | Parapox viral vector | |
| JP5188400B2 (en) | Nonstructural fusion protein of hepatitis C virus | |
| RU2811136C1 (en) | Immunobiological agent to enhance cellular response against hepatitis c virus | |
| EA009782B1 (en) | Peptide originating in hepatitis c virus | |
| JP4485523B2 (en) | Adoptive immune cells for tumor vaccines | |
| WO2023005486A1 (en) | Ebv composite antigen, dendritic cell vaccine and use thereof | |
| Bahrami et al. | Assessment of a poly-epitope candidate vaccine against Hepatitis B, C, and poliovirus in interaction with monocyte-derived dendritic cells: An ex-vivo study | |
| CN110139875B (en) | COL14A 1-derived tumor antigen polypeptide and application thereof | |
| CN112755051B (en) | Preparation of NK (natural killer) cells and application of NK cells in treatment of cancers | |
| Rezaei et al. | Development of novel HPV therapeutic vaccine constructs based on engineered exosomes and tumor cell lysates | |
| CN114075290B (en) | CD40 targeting binding protein, its coding nucleic acid and use | |
| CN112538108B (en) | High affinity PVR mutants | |
| KR102297440B1 (en) | Chimeric antigens that specifically bind to target cells to enhance multiple immune function and uses thereof | |
| CN116948004B (en) | Tumor new antigen polypeptide aiming at CTNNB1 gene H36P mutation and application thereof | |
| US9315558B2 (en) | Use of interleukin 10 mRNA transfected macrophages in anti-inflammatory therapies |