RU2810576C1 - Kit of synthetic oligonucleotide sequences for identification and detection of qnrs and qnrb genes, providing resistance to fluoroquinolones of bacteria of enterobacteriaceae family, by pcr method with detection in "real time" mode and method of their use - Google Patents
Kit of synthetic oligonucleotide sequences for identification and detection of qnrs and qnrb genes, providing resistance to fluoroquinolones of bacteria of enterobacteriaceae family, by pcr method with detection in "real time" mode and method of their use Download PDFInfo
- Publication number
- RU2810576C1 RU2810576C1 RU2022120606A RU2022120606A RU2810576C1 RU 2810576 C1 RU2810576 C1 RU 2810576C1 RU 2022120606 A RU2022120606 A RU 2022120606A RU 2022120606 A RU2022120606 A RU 2022120606A RU 2810576 C1 RU2810576 C1 RU 2810576C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- qnrb
- detection
- qnrs
- insdseq
- insdqualifier
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 229940124307 fluoroquinolone Drugs 0.000 title claims abstract description 49
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 title claims abstract description 19
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 101150114988 invA gene Proteins 0.000 claims description 35
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 30
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 claims description 23
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 19
- 101150021607 rppH gene Proteins 0.000 claims description 18
- 101150082821 sacA gene Proteins 0.000 claims description 18
- 101150070603 yadA gene Proteins 0.000 claims description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 5
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 5
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 62
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 17
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 101150070420 gyrA gene Proteins 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 5
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 3
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 3
- 108010041052 DNA Topoisomerase IV Proteins 0.000 description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 241000607128 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Infantis Species 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 108010054814 DNA Gyrase Proteins 0.000 description 2
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 2
- 241000607361 Salmonella enterica subsp. enterica Species 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 2
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- VCOPTHOUUNAYKQ-WBTCAYNUSA-N (3s)-3,6-diamino-n-[[(2s,5s,8e,11s,15s)-15-amino-11-[(6r)-2-amino-1,4,5,6-tetrahydropyrimidin-6-yl]-8-[(carbamoylamino)methylidene]-2-(hydroxymethyl)-3,6,9,12,16-pentaoxo-1,4,7,10,13-pentazacyclohexadec-5-yl]methyl]hexanamide;(3s)-3,6-diamino-n-[[(2s,5s,8 Chemical compound N1C(=O)\C(=C/NC(N)=O)NC(=O)[C@H](CNC(=O)C[C@@H](N)CCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CNC(=O)[C@@H]1[C@@H]1NC(N)=NCC1.N1C(=O)\C(=C/NC(N)=O)NC(=O)[C@H](CNC(=O)C[C@@H](N)CCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CNC(=O)[C@@H]1[C@@H]1NC(N)=NCC1 VCOPTHOUUNAYKQ-WBTCAYNUSA-N 0.000 description 1
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108020004256 Beta-lactamase Proteins 0.000 description 1
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 description 1
- 108010065839 Capreomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 241000943303 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Species 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241001240954 Escherichia albertii Species 0.000 description 1
- 241001360526 Escherichia coli ATCC 25922 Species 0.000 description 1
- 241000422170 Escherichia marmotae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 241000204045 Mycoplasma hyopneumoniae Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010031252 Osteomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 208000005141 Otitis Diseases 0.000 description 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 1
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 1
- 102000017033 Porins Human genes 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 208000006311 Pyoderma Diseases 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 241000607766 Shigella boydii Species 0.000 description 1
- 241000607764 Shigella dysenteriae Species 0.000 description 1
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 1
- 241000607760 Shigella sonnei Species 0.000 description 1
- 206010062255 Soft tissue infection Diseases 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 206010046793 Uterine inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960004602 capreomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940072185 drug for treatment of tuberculosis Drugs 0.000 description 1
- 208000019258 ear infection Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 201000007094 prostatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 150000007660 quinolones Chemical class 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009102 step therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 229940040944 tetracyclines Drugs 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии и генетической инженерии и может быть использовано для идентификации и детекции генов qnrS и qnrB, обеспечивающих устойчивость к фторхинолонам бактерий семейства Enterobacteriaceae (вид Escherichia coli и Shigella spp. - детекция гена csrB, и Salmonella enterica - детекция гена гена invA) методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» и способу их применения.The invention relates to the field of biotechnology, veterinary microbiology and genetic engineering and can be used for identification and detection of genesqnrS AndqnrB, providing resistance to fluoroquinolones in bacteria of the familyEnterobacteriaceae(viewEscherichia coli and Shigella spp. - csrB gene detection, and Salmonella enterica - invA gene detection) using the polymerase chain reaction method with hybridization-fluorescent detection in “real time” and the method of their use.
Фторхинолоны - препараты широкого спектра действия, наиболее выраженной активностью обладают в отношении грамотрицательных бактерий, главным образом семейства Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Proteus spp., Klebsiella spp., Shigella spp., Salmonella spp., Enterobacter spp., Serratia marcescens, Citrobacter spp.). Fluoroquinolones are broad-spectrum drugs with the most pronounced activity against gram-negative bacteria, mainly the Enterobacteriaceae family (Escherichia coli, Proteus spp., Klebsiella spp., Shigella spp., Salmonella spp., Enterobacter spp., Serratia marcescens, Citrobacter spp. ).
Фторированные хинолоны отличаются широким спектром антимикробного действия, высокой бактерицидной активностью и хорошей фармакокинетикой, что позволяет применять их для лечения инфекций различной локализации. Наличие у ряда препаратов лекарственных форм для внутривенного введения и приема внутрь в сочетании с высокой биодоступностью последних позволяет проводить ступенчатую терапию препаратом однородной группы.Fluorinated quinolones are distinguished by a wide spectrum of antimicrobial action, high bactericidal activity and good pharmacokinetics, which allows them to be used to treat infections of various localizations. The presence of dosage forms for intravenous administration and oral administration in a number of drugs, combined with the high bioavailability of the latter, allows for step-by-step therapy with a drug of a homogeneous group.
В ветеринарии применение фторхинолонов возможно у разных видов животных при широком диапазоне патологий: у жвачных - при острых заболеваниях дыхательных путей, инфекциях, вызываемые кишечной палочкой, сальмонеллой, микоплазмами, мастит, метрит, конъюнктивит.У свиней - при лечении инфекций, вызываемых Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli и Pasteurella multocida. У лошадей - для инфекций, устойчивых к препаратам первой линии, не рекомендуется для молодняка (может приводить к эрозии хрящей). У собак и кошек - при простатите, мастите, рините, пиодермии, отите, инфекциях ран, перитоните, остеомиелите, инфекции мягких тканей. Не рекомендуется для животных моложе 8 месяцев (или 18 месяцев для крупных собак) во избежание повреждения суставов.In veterinary medicine, the use of fluoroquinolones is possible in different types of animals with a wide range of pathologies: in ruminants - for acute diseases of the respiratory tract, infections caused by E. coli, salmonella, mycoplasmas, mastitis, metritis, conjunctivitis. In pigs - in the treatment of infections caused by Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli and Pasteurella multocida. In horses - for infections resistant to first-line drugs, not recommended for young animals (may lead to cartilage erosion). In dogs and cats - for prostatitis, mastitis, rhinitis, pyoderma, otitis, wound infections, peritonitis, osteomyelitis, soft tissue infections. Not recommended for animals younger than 8 months (or 18 months for large dogs) to avoid joint damage.
Учитывая широкий спектр использования фторхинолонов у разных видов животных и для лечения бактериальных болезней человека, идентификация устойчивых штаммов является важным критерием как в реализации лечебного процесса, так и осуществления эпизоотического мониторинга.Considering the wide range of use of fluoroquinolones in different animal species and for the treatment of human bacterial diseases, the identification of resistant strains is an important criterion both in the implementation of the treatment process and in the implementation of epizootic monitoring.
В современной клинической практике можно выделить несколько механизмов резистентности, приводящих к крайне серьезным социально-экономическим последствиям. К таким механизмам относятся устойчивость к β-лактамам среди грамположительных и грамотрицательных бактерий, связанная с продукцией β-лактамаз; устойчивость к гликопептидам среди Enterococcus spp.; устойчивость к фторхинолонам среди грамположительных и грамотрицательных бактерий; устойчивость к макролидам среди Streptococcus spp.[1].In modern clinical practice, several mechanisms of resistance can be identified, leading to extremely serious socio-economic consequences. Such mechanisms include resistance to β-lactams among gram-positive and gram-negative bacteria associated with the production of β-lactamases; resistance to glycopeptides among Enterococcus spp.; resistance to fluoroquinolones among gram-positive and gram-negative bacteria; macrolide resistance among Streptococcus spp.[1].
Мишени фторхинолонов - ДНК-гираза, топоизомераза IV - находятся внутри клеток, поэтому для того, чтобы связаться с мишенями грамнегативных бактерий, фторхинолоны должны транспортироваться через две мембраны - цитоплазматическую и наружную. Если транслокация фторхинолонов через цитоплазматическую мембрану не вызывает затруднений, то проникновение через наружную мембрану, содержащую плотно расположенные липополисахариды (ЛПС), возможно только через специфические порины. Для того чтобы понизить эффективность фторхинолонов, бактерии используют относительно простые эффлюкс-помпы, локализованные исключительно в цитоплазматической мембране и обеспечивающие откачку антибиотика из цитоплазмы в периплазму со скоростью, превышающей диффузию фторхинолона в обратном направлении. Такой механизм характерен для большинства грамнегативных бактерий в отношении антибиотиков, мишени которых находятся в цитоплазматическом пространстве (фторхинолоны, макролиды, тетрациклины, хлорамфеникол) [2,3].The targets of fluoroquinolones - DNA gyrase, topoisomerase IV - are located inside cells, therefore, in order to contact the targets of gram-negative bacteria, fluoroquinolones must be transported through two membranes - the cytoplasmic and the outer. If the translocation of fluoroquinolones through the cytoplasmic membrane does not cause difficulties, then penetration through the outer membrane containing densely located lipopolysaccharides (LPS) is possible only through specific porins. In order to reduce the effectiveness of fluoroquinolones, bacteria use relatively simple efflux pumps, localized exclusively in the cytoplasmic membrane and pumping the antibiotic from the cytoplasm into the periplasm at a rate exceeding the diffusion of fluoroquinolone in the opposite direction. This mechanism is typical for most gram-negative bacteria in relation to antibiotics whose targets are located in the cytoplasmic space (fluoroquinolones, macrolides, tetracyclines, chloramphenicol) [2,3].
Гены семейства qnr кодируют белки, способные связываться с комплексом ДНК/ДНК-гираза или ДНК/топоизомераза IV и препятствовать взаимодействию фторхинолонов с данным ферментом. Таким образом, обеспечивается резистентность энтеробактерий к этому классу антибактериальных средств по механизму «защита мишени». Локализация qnrS и qnrB на плазмидах способствует их горизонтальному переносу между микроорганизмами, в том числе таксономически и экологически отдаленными. Наиболее распространенными вариантами qnr-белков среди бактерий семейства Enterobacteriaceae являются qnrS и qnrB. В качестве дополнительного внутреннего контроля в разработанных методиках предусмотрена идентификация бактерий, часто представленных в анализируемых микробиологических пробах: E.coli и S.enterica. В качестве генетических маркеров для идентификации E.coli и S.enterica выбраны фрагменты хромосомных генов csrB и invA соответственно. Подобраны последовательности гена invA для 26 сероваров Salmonella enterica subsp.Enterica (Agona, Anatum, Blockley. Bovismorbificans, Brandenburg, Bredeney, Corvallis, Derby, Enteritidis, Hadar, Heidelberg, Indiana, Infantis, Kentucky, Manhattan, Mbandaka, Minnesota, Montevideo, Muenchen, Newport, ParatyphiB, Schwarzengrund, Stanley, Thompson. Typhimurium, Virchow), контаминацию которыми выявляли в пищевых продуктах. В силу высокой консервативности гена csrB разработанная методика позволяет выявлять с той же эффективностью ДНК бактерий рода Shigella (S.sonnei, S.dysenteriae, S.boydii, S.flexneri), и с чуть меньшей эффективностью - ДНК бактерий из рода Escherichia (E.marmotae и E.albertii).Genes of the familyqnr encode proteins that can bind to the DNA/DNA gyrase or DNA/topoisomerase IV complex and prevent the interaction of fluoroquinolones with this enzyme. Thus, resistance of enterobacteria to this class of antibacterial agents is ensured by the “target protection” mechanism. LocalizationqnrS AndqnrB on plasmids promotes their horizontal transfer between microorganisms, including taxonomically and ecologically distant ones. The most common variants of qnr proteins among bacteria of the familyEnterobacteriaceae are qnrS and qnrB. As an additional internal control, the developed methods provide for the identification of bacteria often present in the analyzed microbiological samples:E.coli AndS.enterica. As genetic markers for identificationE.coli AndS.entericafragments of chromosomal csrB genes were selected AndinvA respectively. Gene sequences selectedinvA for 26 serovarsSalmonella enterica subsp.Enterica (Agona, Anatum, Blockley. Bovismorbificans, Brandenburg, Bredeney, Corvallis, Derby, Enteritidis, Hadar, Heidelberg, Indiana, Infantis, Kentucky, Manhattan, Mbandaka, Minnesota, Montevideo, Muenchen, Newport, ParatyphiB, Schwarzengrund, Stanley, Thompson. Typhimurium, Virchow), contamination with which was detected in food products. Due to the high conservation of the csrB gene, the developed method makes it possible to detect DNA of bacteria of the genus with the same efficiencyShigella (S.sonnei, S.dysenteriae, S.boydii, S.flexneri), and with slightly less efficiency - the DNA of bacteria from the genusEscherichia(E.marmotae and E.albertii).
Существуют различные методы идентификации и детекции генетических детерминант резистентности, основная часть которых основана на применении технологии ДНК-чипов RU 2636457 C2, RU 2562866 C1, RU 2685188 C2, в свою очередь использование ПЦР в режиме «реального времени» в разработке такого рода методик используют все чаще.There are various methods for identifying and detecting genetic determinants of resistance, the main part of which is based on the use of DNA chip technology RU 2636457 C2, RU 2562866 C1, RU 2685188 C2, in turn, the use of real-time PCR in the development of such methods is used by everyone more often.
Наиболее близкое по существу к заявленному изобретению является WO 2017095271 A1, предусматривающий способ молекулярно-генетической детекции устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам второго ряда (фторхинолонам, аминогликозидам и капреомицину), используемый в медицине. Заявленное изобретение относится к области ветеринарии и предусматривает применение предлагаемых олигонуклеотидных последовательностей для молекулярно-генетической идентификации и детекции генов qnrS и qnrB, обеспечивающих устойчивость к фторхинолонам бактерий семейства Enterobacteriaceae (вид Escherichia coli,и Shigella spp.- детекция гена csrB, и Salmonella enterica - детекция гена гена invA) методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» и способу их применения. Изобретение не предназначено для выявления генов кластеров qnrA, qnrC, qnrD, qnrVC, qnrE. The closest in essence to the claimed invention is WO 2017095271 A1, which provides a method for molecular genetic detection of resistance of Mycobacterium tuberculosis to second-line anti-tuberculosis drugs (fluoroquinolones, aminoglycosides and capreomycin), used in medicine. The claimed invention relates to the field of veterinary medicine and involves the use of the proposed oligonucleotide sequences for the molecular genetic identification and detection of the qnrS and qnrB genes, which provide resistance to fluoroquinolones in bacteria of the Enterobacteriaceae family (Escherichia coli species, and Shigella spp. - detection of the csrB gene , and Salmonella enterica - detection invA gene) by the polymerase chain reaction method with hybridization-fluorescence detection in “real time” and the method of their use. The invention is not intended to identify genes of the qnrA, qnrC, qnrD, qnrVC, qnrE clusters.
Целью настоящего изобретения является разработка синтетических олигонуклеотидных последовательностей для ПЦР в «реальном времени», используемой с целью выявления фрагментов генов устойчивости к фторхинолонам qnrS и qnrB из образцов продовольственного сырья, пищевых продуктов, от животных (фекалии), из объектов окружающей среды (смывы с клеток, стен, оборудования; образцы фекалий, подстилка и др.), без этапа выделения бактериальных изолятов, а также из чистых бактериальных культур с детекцией бактерий семейства Enterobacteriaceae (вид Escherichia coli,и Shigella spp.- детекция гена csrB, и Salmonella enterica - детекция гена гена invA).The purpose of the present invention is to develop synthetic oligonucleotide sequences for real-time PCR used to identify fragments of the fluoroquinolone resistance genes qnrS and qnrB from samples of food raw materials, food products, from animals (feces), from environmental objects (washings from cells , walls, equipment; fecal samples, bedding, etc.), without the stage of isolating bacterial isolates, as well as from pure bacterial cultures with detection of bacteria of the Enterobacteriaceae family (Escherichia coli species, and Shigella spp. - detection of the csrB gene , and Salmonella enterica - detection invA gene gene).
Заявленный технический результат достигается конструированием набора специфичных олигонуклеотидных последовательностей для идентификации генетических детерминант резистентности к фторхинолонам qnrS и qnrB и бактерий семейства Enterobacteriaceae (вид Escherichia coli,и Shigella spp.- идентификация гена csrB, и Salmonella enterica -идентификация гена гена invA) в биологических образцах методом ПЦР в режиме реального времени. Аналитическая чувствительность методики с использованием набора олигонуклеотидов для идентификации и детекции генетической детерминанты резистентности к фторхинолонам qnrB- 1,75×104 копий/мл, qnrS, invA и csrB 1×104 коп/мл. Специфичность набора олигонуклеотидов для идентификации и детекции генетических детерминант резистентности к фторхинолонам qnrS и qnrB и бактерий семейства Enterobacteriaceae (вид Escherichia coli,и Shigella spp.- идентификация гена csrB, и Salmonella enterica -идентификация гена гена invA) при исследовании бактериальных культур контрольной панели составляет 100%.The claimed technical result is achieved by constructing a set of specific oligonucleotide sequences for identifying the genetic determinants of resistance to fluoroquinolones qnrS and qnrB and bacteria of the Enterobacteriaceae family (Escherichia coli species, and Shigella spp. - identification of the csrB gene , and Salmonella enterica - identification of the invA gene gene) in biological samples by the method Real-time PCR. Analytical sensitivity of the technique using a set of oligonucleotides for the identification and detection of the genetic determinant of resistance to fluoroquinolones qnrB- 1.75×10 4 copies/ml, qnrS, invA and csrB 1×10 4 copies/ml. The specificity of a set of oligonucleotides for the identification and detection of genetic determinants of resistance to fluoroquinolones qnrS and qnrB and bacteria of the Enterobacteriaceae family (Escherichia coli species, and Shigella spp. - identification of the csrB gene , and Salmonella enterica - identification of the invA gene gene) when studying bacterial cultures of the control panel is 100 %.
Используют реакционную смесь следующего состава: смесь 1 (qnrS+invA): 10 мм3 ДНК-матрицы, 10 мм3 ПЦР-смеси-1 (6 пмоль каждого из праймеров qnrS-F, qnrS-R, invA-F, invA-R, 3 пмоль каждого зонда qnrS-Z и invA-Z, 2,5 мм3 раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 1,76 ммоль/дм3, деионизованная вода), 0,5 мм3 Taq ДНК полимеразы, 5 мм3 ПЦР-буфера с магнием; а так же детектирование флуоресцентного сигнала непосредственно в процессе реакции амплификации на канале Orange/Yellow ПЦР в режиме реального времени проводится с использованием следующей программы амплификации: 15 мин при 95°С; 15 с при 95°С, 45 с при 62°С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала), смесь 2 (qnrB+csrB): 10 мм3 ДНК-матрицы, 10 мм3 ПЦР-смеси-1 (6 пмоль каждого из праймеров qnrB-F, qnrB-R, csrB-F, csrB -R, 3 пмоль каждого зонда qnrB-Z и csrB -Z, 2,5 мм3 раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 1,76 ммоль/дм3, деионизованная вода), 0,5 мм3 Taq ДНК полимеразы, 5 мм3 ПЦР-буфера с магнием; а так же детектирование флуоресцентного сигнала непосредственно в процессе реакции амплификации на канале Red / Yellow ПЦР в режиме «реального времени» проводится с использованием следующей программы амплификации: 15 мин при 95°С; 15 с при 95°С, 45 с при 62°С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала). Результаты амплификации в режиме реального времени оценивают с помощью программного обеспечения, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линии.Use a reaction mixture of the following composition: mixture 1 (qnrS+invA) : 10 mm 3 DNA template, 10 mm 3 PCR mixture-1 (6 pmol each of the primers qnrS-F, qnrS-R, invA-F, invA-R , 3 pmol of each probe qnrS-Z and invA-Z, 2.5 mm 3 dNTP solution with a concentration of each nucleotide of 1.76 mmol/dm 3 , deionized water), 0.5 mm 3 Taq DNA polymerase, 5 mm 3 PCR- buffers with magnesium; as well as detection of the fluorescent signal directly during the amplification reaction on the Orange/Yellow PCR channel in real time is carried out using the following amplification program: 15 min at 95°C; 15 s at 95°C, 45 s at 62°C (35 cycles with fluorescent signal detection), mixture 2 ( qnrB+csrB): 10 mm3 DNA templates, 10 mm3 PCR mixture-1 (6 pmol each primers qnrB-F, qnrB-R, csrB-F, csrB -R , 3 pmol of each probe qnrB-Z and csrB -Z, 2.5 mm 3 dNTP solution with a concentration of each nucleotide 1.76 mmol/dm 3 , deionized water ), 0.5 mM 3 Taq DNA polymerase, 5 mM 3 PCR buffer with magnesium; as well as detection of the fluorescent signal directly during the amplification reaction on the Red / Yellow PCR channel in “real time” mode is carried out using the following amplification program: 15 min at 95°C; 15 s at 95°C, 45 s at 62°C (35 cycles with fluorescent signal detection) . Real-time amplification results are assessed by software and the results are interpreted based on the presence (or absence) of the fluorescence curve crossing a threshold line set at 0.05.
Используют специальный оригинальный набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для выявления фрагментов генов устойчивости к фторхинолонам qnrS и qnrB, а также идентификацию и детекцию микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae (вид Escherichia coli,и Shigella spp.- детекция гена csrB, и Salmonella enterica - детекция гена гена invA, имеющий следующий нуклеотидный состав: qnrS (qnrS-F-GCCTACAGGGTGCCAATTTA, qnrS-R-CAATACCCAGTGCTTCGAGAAT, qnrS-Z ROX-CACGCCGAACTCGACGGTTTAGAT-BHQ2) и qnrB (qnrB-F-CGTTCAGTGGTTCAGATCTCTC, qnrB-R-CTAAGTCACCCAACTCCGAAT, qnrB-Z-Cy5-AATGTGTGAAGTTTGCTGCTCGCC-BHQ2), а так же гена csrB для выявления ДНК Escherichia coli: csrB-F-GGTGTGAGCAGGAAGCAATA; csrB-R-CGCAGCATTCCAGCTACTT; csrB-Z; R6G-TCAAGGATGAGCAGGGAGCAACAA-BHQ1) и гена invA для выявления ДНК Salmonella enterica: (invA-F-GCACATAAAGATCTTGTCCTCCT; invA-R-CACTGACTTGCTATCTGCTATCTC; invA-Z-R6G-ACGTCTGTCGATGTCCGTCGATTT- BHQ1).A special original set of oligonucleotide primers and probes is used to identify fragments of the fluoroquinolone resistance genes qnrS and qnrB, as well as identification and detection of microorganisms of the Enterobacteriaceae family (Escherichia coli species, and Shigella spp. - detection of the csrB gene, and Salmonella enterica - detection of the invA gene gene, having the following nucleotide composition: qnrS (qnrS-F-GCCTACAGGGTGCCAATTTA, qnrS-R-CAATACCCAGTGCTTCGAGAAT, qnrS-Z ROX-CACGCCGAACTCGACGGTTTAGAT-BHQ2) and qnrB (qnrB - F-CGTTCAGTGGTTCAGATCTCTC, qnrB - R-CTAAGTCACCCAACTCC GAAT, qnrB - Z-Cy5-AATGTGTGAAGTTTGCTGCTCGCC -BHQ2), as well as the csrB gene to detect Escherichia coli DNA: csrB-F-GGTGTGAGCAGGAAGCAATA; csrB-R-CGCAGCATTCCAGCTACTT; csrB-Z; R6G-TCAAGGATGAGCAGGGAGCAACAA-BHQ1) and the invA gene to detect Salmonella enterica DNA: (invA-F -GCACATAAAGATCTTGTCCTCCT; invA-R-CACTGACTTGCTATCTGCTATCTC; invA-Z-R6G - ACGTCTGTCGATGTCCGTCGATTT - BHQ1).
Для выбора и анализа ДНК последовательностей генов резистентности были использованы базы данных ResFinder, Arg-ANNOT, CARD и NCBI BARRGD, а также последовательности геномов различных грамположительных и грамотрицательных бактерий, которые были ранее получены в ФГБУ «ВГНКИ» методом полногеномного секвенирования. Подбор праймеров производили на онлайн-ресурсе «PrimerQuest Tool» (IDT), анализировалось не менее пяти наборов олигонуклеотидов для выявления каждого целевого гена. Для анализа множественного выравнивания последовательностей использовали программу Ugene и алгоритм Clustal omega. Для выбора оптимальных параметров структурных характеристик наборов праймеров использовали программы PCR Primer Stats и Oligo Analysis Tool, оценивали оптимальную температуру отжига, возможность образования димеров и «шпилек». Критерии для выбора праймеров были следующие: средняя длина - 16-25 нуклеотидов; GC состав 35-60%; температура отжига от 50°C до 72°C, разница в температуре отжига в паре праймеров не должна превышать 6°C; вторичная структура (образование шпилек): по минимуму; димеры: нежелательны, необходимо избегать само- и взаимокомплементарности между 3’-концами; минимум G/C на 3’-конце праймеров (не более трех из пяти последних нуклеотидов). Специфичность праймеров оценивали при помощи онлайн-ресурса «Primer-Blast», расположенном на сайте NCBI.To select and analyze DNA sequences of resistance genes, the ResFinder, Arg-ANNOT, CARD and NCBI BARRGD databases were used, as well as genome sequences of various gram-positive and gram-negative bacteria, which were previously obtained at the Federal State Budgetary Institution "VGNKI" using the method of whole-genome sequencing. Primers were selected using the PrimerQuest Tool (IDT) online resource, and at least five sets of oligonucleotides were analyzed to identify each target gene. The Ugene program and the Clustal omega algorithm were used to analyze multiple sequence alignments. To select the optimal parameters for the structural characteristics of the primer sets, the PCR Primer Stats and Oligo Analysis Tool programs were used, and the optimal annealing temperature and the possibility of the formation of dimers and hairpins were assessed. The criteria for selecting primers were the following: average length - 16-25 nucleotides; GC composition 35-60%; annealing temperature from 50°C to 72°C, the difference in annealing temperature in a pair of primers should not exceed 6°C; secondary structure (formation of hairpins): to a minimum; dimers: undesirable, self- and mutual complementarity between 3' ends must be avoided; minimum G/C at the 3' end of the primers (no more than three of the last five nucleotides). The specificity of the primers was assessed using the Primer-Blast online resource located on the NCBI website.
Преимуществом данного изобретения является экспресс-выявление генов резистентности, к антибиотикам, наиболее часто применяемых в ветеринарной практике и являющихся критически важным для клинической медицины.The advantage of this invention is the rapid detection of resistance genes to antibiotics, which are most often used in veterinary practice and are critically important for clinical medicine.
Сущность изобретения заключается в том, что при проведении полимеразной цепной реакции в «режиме реального времени», используют специальный оригинальный набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для идентификации и детекции фрагментов генов устойчивости к фторхинолонам qnrS, qnrB и бактерий семейства Enterobacteriaceae (вид Escherichia coli,и Shigella spp.- детекция гена csrB, и Salmonella enterica - детекция гена гена invA.The essence of the invention is that when carrying out a polymerase chain reaction in “real time”, a special original set of oligonucleotide primers and probes is used to identify and detect fragments of fluoroquinolone resistance genes qnrS, qnrB and bacteria of the Enterobacteriaceae family (Escherichia coli, and Shigella species spp. - detection of the csrB gene, and Salmonella enterica - detection of the invA gene.
В ПЦР используют специфичные праймеры и зонды, меченые флуоресцентными красителями, спектральные характеристики зондов позволяют разбить четыре ПЦР на 2 группы, каждая из которых проводится в отдельных пробирках.PCR uses specific primers and probes labeled with fluorescent dyes, The spectral characteristics of the probes allow the four PCR tests to be divided into 2 groups, each of which is carried out in separate tubes.
Способ идентификации и детекции генетических детерминант резистентности qnrS и qnrB и бактерий (вид Escherichia coli, и Shigella spp.- детекция гена csrB, и Salmonella enterica - детекция гена гена invA, включает выделение ДНК из биологических образцов и чистых культур, проведение ПЦР-РТ с синтетическими олигонуклеотидными праймерами, при этом используют предложенный набор олигонуклеотидных праймеров и зондов.A method for identifying and detecting genetic determinants of resistance qnrS and qnrB and bacteria (Escherichia coli species, and Shigella spp. - detection of the csrB gene , and Salmonella enterica - detection of the invA gene gene , includes DNA extraction from biological samples and pure cultures, carrying out RT-PCR with synthetic oligonucleotide primers, using the proposed set of oligonucleotide primers and probes.
Олигонуклеотиды, входящие в набор, отличаются от известных из уровня техники тем, что имеют оригинальные олигонуклеотидные последовательности и позволяют специфическим образом детектировать и выявлять гены qnrS и qnrB, по которым осуществляется определение устойчивости анализируемого образца к фторхинолонам т.е. набор олигонуклеотидов является видоспецифичным. В качестве дополнительного внутреннего контроля предусмотрено выявление бактерий, часто представленных в анализируемых пробах: вид Escherichia coli,и Shigella spp.- детекция гена csrB, и Salmonella enterica - детекция гена гена invA.The oligonucleotides included in the kit differ from those known from the prior art in that they have original oligonucleotide sequences and allow the specific detection and identification of the qnrS and qnrB genes, which are used to determine the resistance of the analyzed sample to fluoroquinolones, i.e. the set of oligonucleotides is species specific. As an additional internal control, the detection of bacteria often present in the analyzed samples is provided: Escherichia coli species, and Shigella spp. - detection of the csrB gene , and Salmonella enterica - detection of the invA gene .
В качестве генетических маркеров для выявления E.coli, Shigella spp.и S.enterica выбраны фрагменты хромосомных генов csrB и invA соответственно. Ген csrB кодирует малую некодирующую РНК, которая связываясь с белком CsrA, образует рибопротеин, регулирующий синтез гликогена. Продукт гена invA относится к факторам вирулентности сальмонелл, он необходим для инвазии бактерий через эпителиальные клетки кишечника.As genetic markers for identifyingE. coli, Shigella spp.AndS. entericafragments of chromosomal csrB genes were selected AndinvA respectively. The csrB gene encodes a small non-coding RNA, which binds to the CsrA protein to form a riboprotein that regulates glycogen synthesis. Gene productinvArefers to the virulence factors of Salmonella, it is necessary for the invasion of bacteria through intestinal epithelial cells.
Материалом для исследования могут быть образцы биологического материала, полученные из продовольственного сырья, пищевых продуктов, от животных (фекалии), из объектов окружающей среды (смывы с клеток, стен, оборудования; образцы фекалий, подстилка и др.), без этапа выделения бактериальных изолятов, а также чистые бактериальные культуры.The material for research can be samples of biological material obtained from food raw materials, food products, from animals (feces), from environmental objects (washes from cages, walls, equipment; fecal samples, bedding, etc.), without the stage of isolating bacterial isolates , as well as pure bacterial cultures.
Отбор проб, выделение, идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae и получение чистой бульонной культуры изолятов проводят по стандартным методикам в соответствии с утвержденными нормативными документами. Отбор проб смывов с тушек, клеток, стен, оборудования и др. проводят с использованием велюр-тампонов eSwab-system. Фекалии и образцы подстилки собирают в пластиковые контейнеры для сбора биоматериала с завинчивающейся крышкой.Sampling, isolation, identification of bacteria of the family Enterobacteriaceae and obtaining a pure broth culture of isolates are carried out according to standard methods in accordance with approved regulatory documents. Sampling of swabs from carcasses, cages, walls, equipment, etc. is carried out using eSwab-system velor swabs. Feces and litter samples are collected in plastic collection containers with a screw cap.
Для подготовки анализируемой пробы бактериального изолята отбирают дозатором 1,0 см3 жидкой бульонной культуры бактерий семейства Enterobacteriaceae в предварительно промаркированную одноразовую полипропиленовую пробирку вместимостью 1,5 см3. Центрифугируют на микроцентрифуге в течение 5 мин при 8000 об/мин. Затем удаляют надосадочную жидкость. К полученному осадку добавляют 1,0 см3 той же бульонной культуры и центрифугируют в течение 5 мин при 8000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. Полученный осадок анализируемой пробы в закрытых промаркированных пробирках передают на выделение ДНК.To prepare the analyzed sample of the bacterial isolate, 1.0 cm 3 of a liquid broth culture of bacteria of the family Enterobacteriaceae is taken into a pre-labeled disposable polypropylene tube with a capacity of 1.5 cm 3 using a dispenser. Centrifuge in a microcentrifuge for 5 minutes at 8000 rpm. The supernatant is then removed. 1.0 cm 3 of the same broth culture is added to the resulting sediment and centrifuged for 5 minutes at 8000 rpm. The supernatant is removed. The resulting sediment of the analyzed sample in closed, labeled tubes is transferred for DNA extraction.
Для подготовки анализируемой пробы смывов с тушек, клеток, стен, оборудования и др. велюр-тампон eSwab-системы с биоматериалом помещают в одноразовую полипропиленовую пробирку вместимостью 1,5 см3 с изотоническим 0,9% раствором хлорида натрия (600 мм3). Тщательно перемешивают на вортексе. Для выделения ДНК использовали 100 мм3 полученного раствора.To prepare an analyzed sample of swabs from carcasses, cages, walls, equipment, etc., a velor swab of the eSwab system with biomaterial is placed in a disposable polypropylene tube with a capacity of 1.5 cm 3 with an isotonic 0.9% sodium chloride solution (600 mm 3 ). Mix thoroughly using a vortex. To isolate DNA, 100 mm 3 of the resulting solution was used.
Анализируемые пробы фекалий или пробы подстилки, отобранные в пластиковые контейнеры, готовят в виде суспензии в стерильном изотоническом 0,9% растворе хлорида натрия. В промаркированную одноразовую полипропиленовую пробирку вместимостью 1,5 см3 шпателем помещают пробу фекалий или подстилки до нижней риски, затем вносят 600 мм3 раствора натрия хлорида. Тщательно перемешивают встряхиванием. Суспензию центрифугируют при 400g в течение 2 мин. Для выделения ДНК используют 100 мм3 верхней фракции суспензии, отобранной при помощи дозатора с наконечником с фильтром.Analyzed fecal samples or litter samples collected in plastic containers are prepared as a suspension in a sterile isotonic 0.9% sodium chloride solution. In a marked disposable polypropylene tube with a capacity of 1.5 cm 3, place a sample of feces or litter with a spatula to the bottom line, then add 600 mm 3 of sodium chloride solution. Mix thoroughly by shaking. The suspension is centrifuged at 400g for 2 minutes. To isolate DNA, use 100 mm 3 of the upper fraction of the suspension, selected using a dispenser with a filter tip.
Выделение ДНК из анализируемой пробы, осуществляют с помощью набора реагентов «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ФБУН ЦНИИЭ) или «PureLink Genomic DNA» (Invitrogen), или «QIAamp DNA Mini Kit» (Qiagen) в соответствии с инструкцией производителя. В качестве отрицательного контроля выделения (Kв) используют 100 мм3 воды деионизованной.Isolation of DNA from the analyzed sample is carried out using the reagent kit “AmpliPrime DNA-sorb-B” (FBUN Central Research Institute of Experimental Physics) or “PureLink Genomic DNA” (Invitrogen), or “QIAamp DNA Mini Kit” (Qiagen) in accordance with the manufacturer’s instructions. As a negative release control (Kv), 100 mm 3 of deionized water is used.
Для приготовления мастермикса «ПЦР-смесь-1» в отдельных пробирках смешивают из расчета на одну реакцию следующие реагенты: растворы прямых и обратных ПЦР-праймеров и зондов в необходимой концентрации, 0,2 мм3 смеси дНТФ (25 ммоль/дм3) и воды деионизованной до 5 мм3. Смесь с полимеразой для выявления целевых генов готовили в отдельной пробирке (из расчета на каждую реакцию с учетом контролей выделения и ПЦР), вносят по 10 мм3 «ПЦР-смеси-1», 0,5 мм3 ДНК-полимеразы, 5 мм3 ПЦР-буфера с магнием. Затем вносят по 15 мм3 приготовленной смеси с полимеразой в тонкостенные пробирки и по 10 мм3 исследуемых или контрольных проб. Запускают на амплификаторе RotorGene соответствующую программу термоциклирования (табл.1-2).To prepare the “PCR-mixture-1” mastermix, the following reagents are mixed in separate test tubes for one reaction: solutions of forward and reverse PCR primers and probes in the required concentration, 0.2 mm 3 dNTP mixture (25 mmol/dm 3 ) and deionized water up to 5 mm 3 . A mixture with polymerase to identify target genes was prepared in a separate tube (based on each reaction, taking into account isolation and PCR controls), add 10 mm 3 “PCR-mixture-1”, 0.5 mm 3 DNA polymerase, 5 mm 3 PCR buffers with magnesium. Then add 15 mm3 of the prepared mixture with polymerase into thin-walled test tubes and 10 mm3 of test or control samples. Run the appropriate thermal cycling program on the RotorGene cycler (Tables 1 - 2).
При идентификации генов устойчивости к фторхинолонам qnrS и qnrB и генов-маркеров бактерий E.coli, Shigella spp.и S.enterica результаты интерпретируются в качественном формате на основании значения Ct. В образце обнаружен ген устойчивости к фторхинолонам из кластера qnrB (qnrS), если по каналу Red (Orange) определено среднее значение порогового цикла C ≤ 32, в образце обнаружена ДНК E.coli, Shigella spp.(ДНК S.enterica), если по каналу Yellow определено среднее значение порогового цикла Ct ≤ 30. Для отрицательных контролей выделения ДНК (Кв) и/или для отрицательных контролей ПЦР (К-) на любом из каналов появление любого значения Ct недопустимо. Для положительного контроля амплификации контрольное значение правильности реакции Ct≤27.When identifying fluoroquinolone resistance genes qnrS and qnrB and marker genes of bacteria E.coli, Shigella spp. and S. enterica results are interpreted in a qualitative format based on the Ct value. The fluoroquinolone resistance gene from the qnrB (qnrS) cluster was detected in the sample; if the average value of the threshold cycle C ≤ 32 was determined using the Red (Orange) channel, DNA of E. coli, Shigella spp. was detected in the sample. (DNA of S.enterica) , if the average value of the threshold cycle Ct ≤ 30 is determined from the Yellow channel. For negative DNA isolation controls (Kv) and/or for negative PCR controls (K - ) on any of the channels, the appearance of any Ct value is unacceptable. For positive amplification control, the control value for correct reaction is Ct ≤27.
Пример 1 Проверка специфичности набора синтетических олигонуклеотидных последовательностей для идентификации и детекции генов qnrS и qnrB, обеспечивающих устойчивость к фторхинолонам бактерий семейства Enterobacteriaceae, методом ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» и способа их примененияExample 1 Testing the specificity of a set of synthetic oligonucleotide sequences for the identification and detection of the qnrS and qnrB genes, which provide resistance to fluoroquinolones in bacteria of the Enterobacteriaceae family, by PCR with real-time detection and the method of their use
Для подтверждения специфичности методики готовят контрольную панель, содержащую ДНК, выделенную из различных чистых бактериальных культур коллекции ФГБУ «ВГНКИ». В качестве контрольных используют изоляты, которые охарактеризованы полногеномно, с указанием на присутствие или отсутствие каких-либо из таргетных генов: qnrS1 (или любой ген из субкластера qnrS), qnrB2 (или любой ген из субкластера qnrB), а также отсутствие или присутствие других qnr-подобных генов, результаты представлены в таблице 1.To confirm the specificity of the method, a control panel is prepared containing DNA isolated from various pure bacterial cultures from the collection of the Federal State Budgetary Institution "VGNKI". Isolates that are characterized genome-wide are used as controls, indicating the presence or absence of any of the target genes: qnrS1 (or any gene from the qnrS subcluster), qnrB2 (or any gene from the qnrB subcluster), as well as the absence or presence of other qnr -like genes, the results are presented in Table 1.
ппNo.
pp
амплификации фрагмента генаResult
gene fragment amplification
с геном qnrB19Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium, resistant to fluoroquinolones,
with the qnrB19 gene
с геном qnrB19E.coli, resistant to fluoroquinolones,
with the qnrB19 gene
с геном qnrS1E.coli, resistant to fluoroquinolones,
with the qnrS1 gene
в gyrA/parCEnterococcus faecium, resistant to fluoroquinolones, without mutation
in gyrA/parC
к фторхинолонамCampylobacter jejuni, sensitive
to fluoroquinolones
к фторхинолонамCampylobacter coli, sensitive
to fluoroquinolones
В рамках предложенной панели система детекции генов резистентности показала 100% специфичность: наблюдается амплификация только фрагментов генов qnrS, qnrB, а также генов внутреннего контроля invA, csrB. Предлагаемый способ полностью удовлетворяют критерию специфичности.Within the proposed panel, the resistance gene detection system showed 100% specificity: amplification of only fragments of the qnrS, qnrB genes, as well as the internal control genes invA, csrB, was observed . The proposed method fully satisfies the specificity criterion.
Пример 2 Оценка аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов синтетических олигонуклеотидных последовательностей для идентификации и детекции генов qnrS и qnrB, обеспечивающих устойчивость к фторхинолонам бактерий семейства Enterobacteriaceae (вид Escherichia coli,и Shigella spp.- детекция участка гена csrB, и Salmonella enterica - детекция участка гена invA), методом ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» и способа их применения. Для определения аналитической чувствительности ПЦР использовали растворы плазмидной ДНК c известной концентрацией, содержащие соответствующие клонированные фрагменты генов qnrB и qnrS. Приготовили серии десятикратных разведений плазмидной ДНК в ТЕ буфере для каждого гена в отдельности. Расчет числа копий плазмид (N) в растворе проводили с использованием формулы (1):Example 2 Evaluation of the analytical sensitivity of a set of oligonucleotides of synthetic oligonucleotide sequences for the identification and detection of the qnrS and qnrB genes that provide resistance to fluoroquinolones in bacteria of the Enterobacteriaceae family (Escherichia coli species, and Shigella spp. - detection of the csrB gene region , and Salmonella enterica - detection of the invA gene region) , PCR method with real-time detection and method of their application. To determine the analytical sensitivity of PCR, solutions of plasmid DNA with a known concentration containing the corresponding cloned fragments of the qnrB and qnrS genes were used. We prepared a series of tenfold dilutions of plasmid DNA in TE buffer for each gene separately . The number of plasmid copies (N) in solution was calculated using formula (1):
Результаты амплификации фрагментов генов qnrB и qnrS представлены на рисунке 1. Определение чувствительности ПЦР для детекции qnrB и qnrS (плазмидная ДНК). Результаты амплификации фрагментов генов csrB и invA представлены на рисунке 3.The results of amplification of qnrB and qnrS gene fragments are presented in Figure 1. Determination of PCR sensitivity for detection of qnrB and qnrS (plasmid DNA). The results of amplification of csrB and invA gene fragments are presented in Figure 3.
Также для оценки аналитической чувствительности ПЦР используют серийные десятикратные разведения геномной ДНК в ТЕ-буфере, выделенной из чистых культур изолятов бактерий контрольной панели S.enterica, E.coli, Shigella spp.которые охарактеризованы полногеномно и имели гены qnrB, qnrS. Количество геномных копий рассчитывали, исходя из размера генома S.enterica - 4,80 млн.п.н., E.coli - 5,12 млн.п.н. Для каждого разведения проводили ПЦР в двух повторах. Начальная концентрация геномной ДНК S.enterica составляла ~8,3*106 копий в ПЦР, а E.coli - ~9,9*106 копий в ПЦР (при внесении 10 мкл раствора ДНК на реакцию объемом 25 мкл).Also, to assess the analytical sensitivity of PCR, serial tenfold dilutions of genomic DNA in TE buffer isolated from pure cultures of bacterial isolates of the control panel S.enterica, E.coli , Shigella spp are used. which were characterized genome-wide and had the qnrB, qnrS genes. The number of genomic copies was calculated based on the genome size of S.enterica - 4.80 million bp, E.coli - 5.12 million bp. For each dilution, PCR was performed in duplicate. The initial concentration of S.enterica genomic DNA was ~8.3*10 6 copies in PCR, and E.coli - ~9.9*10 6 copies in PCR (when adding 10 μl of DNA solution to a 25 μl reaction).
Результаты амплификации фрагментов генов qnrB и qnrS в ПЦР с геномной ДНК представлены на рисунке 2. Определение аналитической чувствительности ПЦР для детекции генов qnrB и qnrS в геномной ДНК бактерий семейства Enterobacteriaceae. Результаты амплификации фрагментов генов csrB и invA в ПЦР с геномной ДНК представлены на рисунке 4.The results of amplification of fragments of the qnrB and qnrS genes in PCR with genomic DNA are presented in Figure 2. Determination of the analytical sensitivity of PCR for detection of the qnrB and qnrS genes in the genomic DNA of bacteria of the family Enterobacteriaceae. The results of amplification of csrB and invA gene fragments in PCR with genomic DNA are presented in Figure 4.
С целью достоверного установления порога чувствительности методик проводят определение вариабельности результатов определения количества копий целевой ДНК на пределе чувствительности.In order to reliably establish the sensitivity threshold of the methods, the variability of the results of determining the number of copies of the target DNA at the sensitivity limit is determined.
Для этого проводят расчет относительного стандартного отклонения RSD. Используют растворы плазмидной ДНК, содержащие клонированные фрагменты генов qnrS, qnrB, csrB и invA. Для каждого гена в отдельности готовят серии десятикратных разведений плазмидной ДНК в ТЕ буфере. Ставят по 10 ПЦР реакций, в которых присутствует от 50 до 200 копий ДНК соответствующих генов в ПЦР. Полученные результаты используют для расчета RSD по формуле [2]. В качестве предела чувствительности выбирают то количество копий, при которой RSD не превышает 25%.To do this, calculate the relative standard deviation RSD . Plasmid DNA solutions containing cloned fragments of the qnrS, qnrB, csrB and invA genes are used. For each gene separately, a series of tenfold dilutions of plasmid DNA are prepared in TE buffer. 10 PCR reactions are performed, in which from 50 to 200 copies of DNA of the corresponding genes in the PCR are present. The results obtained are used to calculate RSD using the formula [2]. The number of copies at which the RSD does not exceed 25% is chosen as the sensitivity limit.
где SD - стандартное отклонение.where SD is standard deviation.
Предел аналитической чувствительности ПЦР с учетом вариабельности (RSD) менее 25% составляет для детекции гена qnrB 175 копий/реакцию или 1,75*104 копий/мл, для детекции генов qnrS - 100 копий/реакцию или 104 копий/мл. Разработанный способ соответствует принятым параметрам чувствительности ПЦР.The limit of analytical sensitivity of PCR taking into account variability ( RSD ) less than 25% is 175 copies/reaction or 1.75*10 4 copies/ml for detection of the qnrB gene , 100 copies/reaction or 10 4 copies/ml for detection of qnrS genes. The developed method corresponds to the accepted parameters of PCR sensitivity.
Предел аналитической чувствительности ПЦР с учетом вариабельности (RSD) менее 25% составляет для детекции участка гена csrB и invA - 100 копий/реакцию или 104 копий/мл. Разработанный способ соответствует принятым параметрам чувствительности ПЦР.The limit of analytical sensitivity of PCR taking into account variability ( RSD ) is less than 25% for detection of the csrB and invA gene region - 100 copies/reaction or 10 4 copies/ml. The developed method corresponds to the accepted parameters of PCR sensitivity.
Литературные источникиLiterary sources
1. Сидоренко С. В. и соавт.Молекулярные механизмы устойчивости грамотрицательных бактерий семейства Enterobacteriaceae к цефалоспориновым антибиотикам. Антибиотики и химиотерапия 2011; 49(3):6-161. Sidorenko S. V. et al. Molecular mechanisms of resistance of gram-negative bacteria of the Enterobacteriaceae family to cephalosporin antibiotics. Antibiotics and Chemotherapy 2011; 49(3):6-16
2. А.С. Павлова, Ю.А. Бочарова, К.В. Кулешов, А.Т. Подколзин, И.В. Чеботарь, Молекулярные детерминанты резистентности Salmonella enterica к антибиотикам, Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, Том 98, №6 (2021) doi.org/10.36233/0372-9311-1402. A.S. Pavlova, Yu.A. Bocharova, K.V. Kuleshov, A.T. Podkolzin, I.V. Chebotar, Molecular determinants of Salmonella enterica resistance to antibiotics, Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, Vol. 98, No. 6 (2021) doi.org/10.36233/0372-9311-140
3. Doma AO, Popescu R, Mituletu M, Muntean D, Dégi J, Boldea MV, Radulov I, Dumitrescu E, Muselin F, Puvača N, Cristina RT. Comparative Evaluation of qnrA, qnrB, and qnrS Genes in Enterobacteriaceae Ciprofloxacin-Resistant Cases, in Swine Units and a Hospital from Western Romania. Antibiotics (Basel). 2020 Oct 14;9(10):698. doi: 10.3390/antibiotics9100698. PMID: 33066610; PMCID: PMC7602382.3. Doma AO, Popescu R, Mituletu M, Muntean D, Dégi J, Boldea MV, Radulov I, Dumitrescu E, Muselin F, Puvača N, Cristina RT. Comparative Evaluation of qnrA , qnrB , and qnrS Genes in Enterobacteriaceae Ciprofloxacin-Resistant Cases, in Swine Units and a Hospital from Western Romania. Antibiotics (Basel). 2020 Oct 14;9(10):698. doi: 10.3390/antibiotics9100698. PMID: 33066610; PMCID: PMC7602382.
--->--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Набор<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Set
синтетических олигонуклеотидных последовательностей для идентификацииsynthetic oligonucleotide sequences for identification
и детекции генов qnrS и qnrB.xml" softwareName="WIPO Sequence"and detection of the qnrS and qnrB genes.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.1.2" productionDate="2022-10-18">softwareVersion="2.1.2" productionDate="2022-10-18">
<ApplicationIdentification><ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode><IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2022120606</ApplicationNumberText><ApplicationNumberText>2022120606</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-07-27</FilingDate><FilingDate>2022-07-27</FilingDate>
</ApplicationIdentification></ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>12345</ApplicantFileReference><ApplicantFileReference>12345</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification><EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode><IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2022120606</ApplicationNumberText><ApplicationNumberText>2022120606</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-07-27</FilingDate><FilingDate>2022-07-27</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification></EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное<ApplicantName languageCode="ru">Federal state
бюджетное учреждение "Всероссийский государственный центрbudgetary institution "All-Russian State Center"
качества и стандартизации лекарственных средств для животных иquality and standardization of medicines for animals and
кормов" ФГБУ "ВГНКИ", Federal state budgetaryfeed" FSBI "VGNKI", Federal state budgetary
institution "The russian state center for animal feed and druginstitution "The Russian state center for animal feed and drug
standardization and quality" (FGBUstandardization and quality" (FGBU
"VGNKI")</ApplicantName>"VGNKI")</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>FGBU "VGNKI"</ApplicantNameLatin><ApplicantNameLatin>FGBU "VGNKI"</ApplicantNameLatin>
<InventorName languageCode="ru">Киш Леонид Карольевич</InventorName><InventorName languageCode="ru">Kish Leonid Karolievich</InventorName>
<InventorNameLatin>Kish Leonid Karolievich</InventorNameLatin><InventorNameLatin>Kish Leonid Karolievich</InventorNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Набор синтетических<InventionTitle languageCode="en">Set of synthetic
олигонуклеидных последовательностей для идентификации и детекцииoligonucleotide sequences for identification and detection
генов qnrS и qnrB, обеспечивающих устойчивость к фторхинолонамqnrS and qnrB genes, which provide resistance to fluoroquinolones
бактерий семейства Enterobacteriaceae, методом ПЦР с детекцией вbacteria of the Enterobacteriaceae family, using PCR with detection in
режиме "реального времени" и способ их"real time" mode and their way
применения</InventionTitle>applications</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>12</SequenceTotalQuantity><SequenceTotalQuantity>12</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1"><SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length><INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14"><INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcctacagggtgccaattta</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>gcctacaggtgccaattta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2"><SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length><INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2"><INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caatacccagtgcttcgagaat</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>caatacccagtgcttcgagaat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3"><SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length><INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q3"><INSDQualifier id="q3">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cacgccgaactcgacggtttagat</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>cacgccgaactcgacggtttagat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4"><SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length><INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4"><INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgttcagtggttcagatctctc</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>cgttcagtggttcagatctctc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5"><SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length><INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q5"><INSDQualifier id="q5">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctaagtcacccaactccgaat</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>ctaagtcacccaactccgaat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6"><SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length><INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6"><INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>aatgtgtgaagtttgctgctcgcc</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>aatgtgtgaagtttgctgctcgcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7"><SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length><INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q7"><INSDQualifier id="q7">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtgtgagcaggaagcaata</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>ggtgtgagcaggaagcaata</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8"><SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length><INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q9"><INSDQualifier id="q9">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgcagcattccagctactt</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>cgcagcattccagctactt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9"><SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length><INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10"><INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tcaaggatgagcagggagcaacaa</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>tcaaggatgagcagggagcaacaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10"><SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length><INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q11"><INSDQualifier id="q11">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Salmonella enterica</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Salmonella enterica</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcacataaagatcttgtcctcct</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>gcacataaagatcttgtcctcct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11"><SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length><INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12"><INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Salmonella enterica</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Salmonella enterica</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cactgacttgctatctgctatctc</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>cactgacttgctatctgctatctc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12"><SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq><INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length><INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype><INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division><INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table><INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature><INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key><INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location><INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals><INSDFeature_quals>
<INSDQualifier><INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q13"><INSDQualifier id="q13">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name><INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Salmonella enterica</INSDQualifier_value><INSDQualifier_value>Salmonella enterica</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier></INSDQualifier>
</INSDFeature_quals></INSDFeature_quals>
</INSDFeature></INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table></INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acgtctgtcgatgtccgtcgattt</INSDSeq_sequence><INSDSeq_sequence>acgtctgtcgatgtccgtcgattt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq></INSDSeq>
</SequenceData></SequenceData>
</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>
<---<---
аналитической чувствительности ПЦР использовали растворы плазмидной ДНК c известной концентрацией, содержащие соответствующие клонированные фрагменты генов qnrB и qnrS. Приготовили серии десятикратных разведений плазмидной ДНК в ТЕ буфере для каждого гена в отдельности. Расчет числа копий плазмид (N) в растворе проводили с использованием формулы (1):For the analytical sensitivity of PCR, solutions of plasmid DNA with a known concentration were used, containing the corresponding cloned fragments of the qnrB and qnrS genes. We prepared a series of tenfold dilutions of plasmid DNA in TE buffer for each gene separately . The number of plasmid copies (N) in solution was calculated using formula (1):
Результаты амплификации фрагментов генов qnrB и qnrS представлены на Фиг 1. Определение чувствительности ПЦР для детекции qnrB и qnrS (плазмидная ДНК). Результаты амплификации фрагментов генов csrB и invA представлены на Фиг 3.The results of amplification of qnrB and qnrS gene fragments are presented in Figure 1. Determination of PCR sensitivity for detection of qnrB and qnrS (plasmid DNA). The results of amplification of csrB and invA gene fragments are presented in Fig. 3.
Также для оценки аналитической чувствительности ПЦР используют серийные десятикратные разведения геномной ДНК в ТЕ-буфере, выделенной из чистых культур изолятов бактерий контрольной панели S.enterica, E.coli, Shigella spp.которые охарактеризованы полногеномно и имели гены qnrB, qnrS. Количество геномных копий рассчитывали, исходя из размера генома S.enterica - 4,80 млн.п.н., E.coli - 5,12 млн.п.н. Для каждого разведения проводили ПЦР в двух повторах. Начальная концентрация геномной ДНК S.enterica составляла ~8,3*106 копий в ПЦР, а E.coli - ~9,9*106 копий в ПЦР (при внесении 10 мкл раствора ДНК на реакцию объемом 25 мкл).Also, to assess the analytical sensitivity of PCR, serial tenfold dilutions of genomic DNA in TE buffer isolated from pure cultures of bacterial isolates of the control panel S.enterica, E.coli , Shigella spp are used. which were characterized genome-wide and had the qnrB, qnrS genes. The number of genomic copies was calculated based on the genome size of S.enterica - 4.80 million bp, E.coli - 5.12 million bp. For each dilution, PCR was performed in duplicate. The initial concentration of S.enterica genomic DNA was ~8.3*10 6 copies in PCR, and E.coli - ~9.9*10 6 copies in PCR (when adding 10 μl of DNA solution to a 25 μl reaction).
Результаты амплификации фрагментов генов qnrB и qnrS в ПЦР с геномной ДНК представлены на Фиг 2. Определение аналитической чувствительности ПЦР для детекции генов qnrB и qnrS в геномной ДНК бактерий семейства Enterobacteriaceae. Результаты амплификации фрагментов генов csrB и invA в ПЦР с геномной ДНК представлены на Фиг.4.The results of amplification of fragments of the qnrB and qnrS genes in PCR with genomic DNA are presented in Figure 2. Determination of the analytical sensitivity of PCR for detection of the qnrB and qnrS genes in the genomic DNA of bacteria of the family Enterobacteriaceae. The results of amplification of csrB and invA gene fragments in PCR with genomic DNA are presented in Figure 4.
Claims (14)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2810576C1 true RU2810576C1 (en) | 2023-12-27 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102952875A (en) * | 2011-08-31 | 2013-03-06 | 宁波市第二医院 | Bacterium drug-resistant gene detection method, gene chip and kit |
| CN104560981A (en) * | 2015-01-23 | 2015-04-29 | 杭州迪安医学检验中心有限公司 | Primers and kit for detecting quinolone drug-resistance genes of bacteria |
| RU2633507C2 (en) * | 2015-12-01 | 2017-10-12 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Энджентикс" | Method for molecular-genetic detection of tuberculosis microbacteria resistance to antitubercular preparations of second series (fluoroquinolones, aminoglycosides and capreomicin) |
| CN110408712A (en) * | 2019-07-29 | 2019-11-05 | 上海市农业科学院 | The fast screening reagent kit and primer of quinolones drug resistant gene in bacterium |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102952875A (en) * | 2011-08-31 | 2013-03-06 | 宁波市第二医院 | Bacterium drug-resistant gene detection method, gene chip and kit |
| CN104560981A (en) * | 2015-01-23 | 2015-04-29 | 杭州迪安医学检验中心有限公司 | Primers and kit for detecting quinolone drug-resistance genes of bacteria |
| RU2633507C2 (en) * | 2015-12-01 | 2017-10-12 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Энджентикс" | Method for molecular-genetic detection of tuberculosis microbacteria resistance to antitubercular preparations of second series (fluoroquinolones, aminoglycosides and capreomicin) |
| CN110408712A (en) * | 2019-07-29 | 2019-11-05 | 上海市农业科学院 | The fast screening reagent kit and primer of quinolones drug resistant gene in bacterium |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| THOMAS GUILLARD et al., Rapid detection of qnr and qepA plasmid-mediated quinolone resistance genes using real-time PCR, Diagn Microbiol Infect Dis, 2011, Vol. 70, Issue 2, pp. 253-259. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lindstedt et al. | High frequency of hybrid Escherichia coli strains with combined Intestinal Pathogenic Escherichia coli (IPEC) and Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli (ExPEC) virulence factors isolated from human faecal samples | |
| O'Brien et al. | Comparative genomics of Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli | |
| Maynard et al. | Heterogeneity among virulence and antimicrobial resistance gene profiles of extraintestinal Escherichia coli isolates of animal and human origin | |
| Suardana | Analysis of nucleotide sequences of the 16S rRNA gene of novel Escherichia coli strains isolated from feces of human and Bali cattle | |
| Paton et al. | Direct detection of Shiga toxigenic Escherichia coli strains belonging to serogroups O111, O157, and O113 by multiplex PCR | |
| Rey et al. | Serotypes, phage types and virulence genes of Shiga-producing Escherichia coli isolated from sheep in Spain | |
| Kudinha et al. | Multiplex PCR-based reverse line blot assay for simultaneous detection of 22 virulence genes in uropathogenic Escherichia coli | |
| Strachan et al. | Whole genome sequencing demonstrates that geographic variation of Escherichia coli O157 genotypes dominates host association | |
| JP2008283895A (en) | Method for detecting diarrheagenic escherichia coli | |
| Urdahl et al. | Animal host associated differences in Shiga toxin‐producing Escherichia coli isolated from sheep and cattle on the same farm | |
| McCabe et al. | An investigation of shedding and super‐shedding of Shiga toxigenic Escherichia coli O157 and E. coli O26 in cattle presented for slaughter in the Republic of Ireland | |
| Girardeau et al. | Extended virulence genotype of pathogenic Escherichia coli isolates carrying the afa-8 operon: evidence of similarities between isolates from humans and animals with extraintestinal infections | |
| Frasao et al. | Molecular detection, typing, and quantification of Campylobacter spp. in foods of animal origin | |
| Lambrecht et al. | Characterization of cefotaxime-and ciprofloxacin-resistant commensal Escherichia coli originating from Belgian farm animals indicates high antibiotic resistance transfer rates | |
| Staji et al. | Distribution of antibiotic resistance genes among the phylogroups of Escherichia coli in diarrheic calves and chickens affected by colibacillosis in Tehran, Iran | |
| Watson et al. | Comparative genomics of atypical enteropathogenic Escherichia coli from kittens and children identifies bacterial factors associated with virulence in kittens | |
| Abd El-Baky et al. | Antibiotic susceptibility pattern and genotyping of Campylobacter species isolated from children suffering from gastroenteritis | |
| Lin et al. | First detection of conjugative plasmid-borne fosfomycin resistance gene fosA3 in Salmonella isolates of food origin | |
| McCoy et al. | Cytotoxic Escherichia coli strains encoding colibactin, cytotoxic necrotizing factor, and cytolethal distending toxin colonize laboratory common marmosets (Callithrix jacchus) | |
| RU2810576C1 (en) | Kit of synthetic oligonucleotide sequences for identification and detection of qnrs and qnrb genes, providing resistance to fluoroquinolones of bacteria of enterobacteriaceae family, by pcr method with detection in "real time" mode and method of their use | |
| Stromberg et al. | Culture-based quantification with molecular characterization of non-O157 and O157 enterohemorrhagic Escherichia coli isolates from rectoanal mucosal swabs of feedlot cattle | |
| Hemmatzadeh et al. | A novel quantitative polymerase chain reaction to monitor urinary tract mycoplasma infection in a dog | |
| Verwey et al. | Prevalence of subclinical bactibilia in apparently healthy shelter dogs | |
| US20060177824A1 (en) | Salmonella detection identification | |
| WO2013036152A1 (en) | Probes targeting the gene encoding the shiga toxin and use thereof for detection of enterohemorrhagic escherichia coli (ehec). |