RU2810298C2

RU2810298C2 - Spray dried 3-fucosyllactose

Info

Publication number: RU2810298C2
Application number: RU2020119944A
Authority: RU
Inventors: Штефан ЙЕННЕВАЙН
Original assignee: Хр. Ханзен ХМО ГмбХ
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2023-12-26

Abstract

FIELD: food industry.

SUBSTANCE: proposed nutritional composition contains a spray-dried powder that contains at least 80 wt.%. 3-fucosyllactose obtained by microbial fermentation. The spray-dried powder contains 15 wt.%. water or less. The nutritional composition contains at least one additional human milk oligosaccharide (HMO), wherein the said one additional HMO is a sialylated HMO. A method of producing a spray-dried powder for a nutritional composition is also provided.

EFFECT: invention is aimed at producing a powder with low hygroscopicity, in which 3-fucosyllactose is in an amorphous form and has the same particle size.

15 cl, 6 dwg, 5 tbl, 6 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИTECHNICAL FIELD

Настоящее изобретение относится к препаратам олигосахарида женского (человеческого) молока. В частности, настоящее изобретение относится к твердым препаратам олигосахаридов женского молока и к способам получения твердых препаратов олигосахаридов женского молока.The present invention relates to preparations of human (human) milk oligosaccharide. In particular, the present invention relates to solid preparations of human milk oligosaccharides and to methods for producing solid preparations of human milk oligosaccharides.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND ART

Женское грудное молоко содержит значительное количество углеводов. Эти углеводы включают такие моносахариды, как L-фукоза и N-ацетилнейраминовая кислот (Neu5Ac). В женском грудном молоке также присутствует такой дисахарид, как лактоза. Кроме лактозы один литр женского грудного молока содержит до 20 г/л олигосахаридов, так называемых "олигосахаридов женского (человеческого) молока (англ. human milk oligosaccharides, сокращенно HMO)". HMO представляют собой третью по количеству составляющую женского грудного молока. Предположительно, в женском молоке содержится более 150 структурно различных олигосахаридов. Обычно женское молоко содержит от 10 до 13 основных НМО, которые присутствуют в концентрации, составляющей от нескольких граммов до нескольких сотен миллиграммов на литр (Thurl с соавт., (2017), Nutrition Reviews 75(11) 920-933). НМО включают нейтральные НМО, а также кислотные НМО, которые содержат один или более фрагментов сиаловой кислоты. Наиболее важные НМО представлены в Таблице 1. Сложные структуры и содержание этих олигосахаридов в женском молоке уникальны, и эти олигосахариды не были обнаружены в молоке других млекопитающих, таких как, например, одомашненные молочные животные.Human breast milk contains a significant amount of carbohydrates. These carbohydrates include monosaccharides such as L-fucose and N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac). Human breast milk also contains the disaccharide lactose. In addition to lactose, one liter of human breast milk contains up to 20 g/l of oligosaccharides, the so-called “human milk oligosaccharides (HMO).” HMOs represent the third largest constituent of human breast milk. Human milk is thought to contain more than 150 structurally distinct oligosaccharides. Typically, human milk contains 10 to 13 major HMOs, which are present in concentrations ranging from a few grams to several hundred milligrams per liter (Thurl et al., (2017), Nutrition Reviews 75(11) 920-933). HMOs include neutral HMOs as well as acidic HMOs that contain one or more sialic acid moieties. The most important HMOs are presented in Table 1. The complex structures and contents of these oligosaccharides in human milk are unique, and these oligosaccharides have not been found in the milk of other mammals, such as domesticated dairy animals.

Поскольку НМО не перевариваются человеком, физиологическую роль этих сахаридов изучали в течение нескольких десятилетий. Пребиотический эффект НМО был открыт более 100 лет назад. НМО способны регулировать кишечную флору человека посредством доставки в кишечник полезных бактерий. В последнее время исследовали некоторые другие функции НМО, в частности, их влияние на развитие новорожденных. Известно, что НМО действуют как средства отвлечения, что приводит к снижению риска инфицирования бактериальными и вирусными патогенами, которые прикрепляются к человеческим клеткам, связываясь с гликопротеинами клеточной поверхности. Дополнительно, различные НМО оказывают противовоспалительное действие и действуют как иммуномодуляторы. Таким образом, было предположено, что НМО снижают риск развития пищевых аллергий. Широко обсуждается полезное воздействие сиалилированных НМО на развитие мозга у новорожденных (обзор в публикации: "Prebiotics and Probiotics in Human Milk, Origins and functions of milk-borne oligosaccharides and bacteria (Пребиотики и пробиотики в женском молоке, происхождение и функции содержащихся в молоке олигосахаридов и бактерий)", Academic Press (2017), редакторы: McGuire М., McGuire М. и Bode L).Because HMOs are not digested by humans, the physiological role of these saccharides has been studied for several decades. The prebiotic effect of NMOs was discovered more than 100 years ago. NMOs are able to regulate human intestinal flora by delivering beneficial bacteria to the intestines. Recently, several other functions of CME have been investigated, in particular their impact on neonatal development. CMEs are known to act as a means of distraction, resulting in a reduced risk of infection by bacterial and viral pathogens that attach to human cells by binding to cell surface glycoproteins. Additionally, various NMOs have anti-inflammatory effects and act as immunomodulators. Thus, CMEs have been hypothesized to reduce the risk of developing food allergies. The beneficial effects of sialylated HMOs on brain development in newborns have been widely discussed (reviewed in Prebiotics and Probiotics in Human Milk, Origins and functions of milk-borne oligosaccharides and bacteria). bacteria)", Academic Press (2017), editors: McGuire M., McGuire M. and Bode L).

Одним из НМО является 3-фукозиллактоза (Gal(β1-4)[Fuc(β1-3)]Glc)). Впервые 3-фукозиллактоза (3-FL) была выделена из молока в 1958 году, и впервые она была выделена из мочи женщины с группой крови О, несекретора, в период беременности и кормления грудью в 1977 году. 3-Фукозиллактоза устойчива к ферментативному гидролизу в желудочно-кишечном тракте младенца. Предполагается, что 3-фукозиллактоза достигает толстого кишечника, где она усваивается и перерабатывается бактериями.One of the HMOs is 3-fucosyllactose (Gal(β1-4)[Fuc(β1-3)]Glc)). 3-fucosyllactose (3-FL) was first isolated from milk in 1958, and it was first isolated from the urine of a woman with blood type O, a nonsecretor, during pregnancy and lactation in 1977. 3-Fucosyllactose is resistant to enzymatic hydrolysis in the gastrointestinal tract of the infant. It is assumed that 3-fucosyllactose reaches the large intestine, where it is absorbed and processed by bacteria.

Первым этапом использования полезных свойств НМО в искусственном вскармливании младенцев является добавление отдельных НМО в детскую питательную смесь. Однако лучшим решением было бы добавление в детскую питательную смесь комбинации структурно различных НМО, поскольку комбинация структурно различных НМО будет действовать образом, более схожим с первоначальным источником НМО, т.е. с женским молоком, и этот эффект не может быть достигнут при добавлении одного конкретного НМО.The first step in using the beneficial properties of NMOs in artificial feeding of infants is to add individual NMOs to the infant formula. However, a better solution would be to add a combination of structurally different HMOs to the infant formula, since the combination of structurally different HMOs will act in a manner more similar to the original source of HMOs, i.e. with human milk, and this effect cannot be achieved by adding one specific HMO.

На начальном этапе ограниченный доступ к отдельным НМО для добавления в детские питательные смеси привел к разработке химических способов синтеза НМО, которые затем были заменены биокаталитическими способами с применением очищенных ферментов. В настоящее время для получения различных НМО в коммерческих масштабах применяют ферментацию генетически модифицированных бактериальных клеток (WO 2015/150328 А1, WO 2017/043382 А1, WO 2010/070104 А1, WO 2012/097950 А1). НМО, синтезированные бактериальными клетками, могут быть очищены от из ферментационного бульона или клеточного лизата в виде по существу чистых препаратов НМО, которые могут быть добавлены в пищу человека, в частности, в питание для младенцев.Initially, limited access to individual HMOs for addition to infant formulas led to the development of chemical routes for the synthesis of HMOs, which were then replaced by biocatalytic routes using purified enzymes. Currently, fermentation of genetically modified bacterial cells is used to produce various HMOs on a commercial scale (WO 2015/150328 A1, WO 2017/043382 A1, WO 2010/070104 A1, WO 2012/097950 A1). HMOs synthesized by bacterial cells can be purified from the fermentation broth or cell lysate into substantially pure HMO preparations that can be added to human foods, particularly infant foods.

Во время очистки 3-фукозиллактозы этот сахарид обычно находится в жидком технологическом потоке. При проведении очистки концентрация 3-фукозиллактозы в технологическом потоке повышается. Однако водный раствор 3-фукозиллактозы очень чувствителен к бактериальному или грибковому загрязнению. Таким образом, 3-фукозиллактозу предпочтительно получать в виде сухого продукта, имеющего низкое содержание воды, делающее невозможным рост микробов.During the purification of 3-fucosyllactose, this saccharide is typically present in the liquid process stream. During cleaning, the concentration of 3-fucosyllactose in the process stream increases. However, an aqueous solution of 3-fucosyllactose is very sensitive to bacterial or fungal contamination. Thus, 3-fucosyllactose is preferably produced as a dry product having a low water content to prevent microbial growth.

Обычно твердые сахариды получают кристаллизацией. Была описана кристаллизация следующих отдельно взятых НМО: 3-фукозиллактозы (WO 2014/075680 А), 2'-фукозиллактозы (WO 2011/150939 А), ди-фукозиллактозы (WO 2016/086947 А), лакто-N-тетраозы (WO 2017/101953 А), лакто-N-неотетраозы (WO 2014/094783 А). Кристаллизация НМО включает применение органических растворителей, таких как спирты, в основном этанол или метанол, или органических кислот, таких как ледяная уксусная кислота. Однако, если НМО намереваются использовать в качестве пищевых ингредиентов, то применение органических растворителей для кристаллизации НМО в последнем этапе способа получения готового продукта в твердой форме нежелательно. Кроме того, органические растворители наносят вред окружающей среде и вредят здоровью работающих с ними людей. Таким образом, применение органических растворителей требует определенных мер охраны труда и подходящей утилизации, что делает применение органических растворителей дорогостоящим. Таким образом, кристаллизацию НМО с целью получения НМО в твердой форме можно рассматривать как недостаток способа получения НМО в промышленном масштабе.Typically, solid saccharides are obtained by crystallization. The crystallization of the following individual HMOs has been described: 3-fucosyllactose (WO 2014/075680 A), 2'-fucosyllactose (WO 2011/150939 A), di-fucosyllactose (WO 2016/086947 A), lacto-N-tetraose (WO 2017 /101953 A), lacto-N-neotetraose (WO 2014/094783 A). Crystallization of HMO involves the use of organic solvents such as alcohols, mainly ethanol or methanol, or organic acids such as glacial acetic acid. However, if the HMOs are intended to be used as food ingredients, then the use of organic solvents to crystallize the HMOs in the last step of the process for obtaining the finished product in solid form is undesirable. In addition, organic solvents are harmful to the environment and harm the health of people working with them. Thus, the use of organic solvents requires certain occupational safety measures and suitable disposal, which makes the use of organic solvents expensive. Thus, crystallization of HMO to obtain HMO in solid form can be considered as a disadvantage of the process for producing HMO on an industrial scale.

Таким образом, имеется необходимость создания способа получения НМО, в частности, 3-фукозиллактозы, в твердой форме, где способ может быть применен в промышленном масштабе для получения НМО и не включает применения органического растворителя для завершения очистки с целью получения твердого препарата НМО.Thus, there is a need for a process for producing HMO, particularly 3-fucosyllactose, in solid form, where the process can be used on an industrial scale to produce HMO and does not involve the use of an organic solvent to complete the purification to obtain a solid HMO preparation.

Поставленная задача может быть решена посредством применения способа получения порошка, по существу состоящего из очищенного НМО, где способ включает распылительную сушку водного раствора, который содержит НМО.This problem can be solved by using a method for producing a powder essentially consisting of purified HMO, where the method includes spray drying an aqueous solution that contains HMO.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Первый аспект изобретения относится к способу получения высушенного распылением (т.е. высушенного распылительной сушкой) порошка, по существу состоящего из 3-фукозиллактозы.The first aspect of the invention relates to a method for producing a spray-dried (ie spray-dried) powder essentially consisting of 3-fucosyllactose.

Второй аспект относится к способу получения высушенного распылением порошка, по существу состоящего из 3-фукозиллактозы.The second aspect relates to a process for producing a spray-dried powder essentially consisting of 3-fucosyllactose.

Третий аспект относится к применению высушенного распылением порошка, по существу состоящего из 3-фукозиллактозы, для получения питательной композиции.The third aspect relates to the use of a spray-dried powder essentially consisting of 3-fucosyllactose to prepare a nutritional composition.

Четвертый аспект относится к питательной композиции, содержащей высушенный распылением порошок, по существу состоящий из 3-фукозиллактозы.A fourth aspect relates to a nutritional composition comprising a spray-dried powder substantially consisting of 3-fucosyllactose.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHIC MATERIALS

На Фиг. 1 графически представлены результаты порошкового рентгеноструктурного анализа высушенной распылением 3-фукозиллактозы.In FIG. Figure 1 graphically presents the results of powder X-ray diffraction analysis of spray-dried 3-fucosyllactose.

На Фиг. 2 графически представлены результаты порошкового рентгеноструктурного анализа высушенной распылением лакто-N-тетраозы.In FIG. Figure 2 graphically presents the results of powder X-ray diffraction analysis of spray-dried lacto-N-tetraose.

На Фиг. 3 графически представлены результаты порошкового рентгеноструктурного анализа высушенной распылением 6'-сиалиллактозы.In FIG. Figure 3 graphically presents the results of powder X-ray diffraction analysis of spray-dried 6'-sialyllactose.

На Фиг. 4 графически представлены результаты порошкового рентгеноструктурного анализа высушенной распылением 3'-сиалиллактозы.In FIG. Figure 4 graphically presents the results of powder X-ray diffraction analysis of spray-dried 3'-sialyllactose.

На Фиг. 5 графически представлены результаты порошкового рентгеноструктурного анализа высушенной распылением смеси 2'-фукозиллактозы и лакто-N-тетраозы.In FIG. Figure 5 graphically presents the results of X-ray powder diffraction analysis of a spray-dried mixture of 2'-fucosyllactose and lacto-N-tetraose.

На Фиг. 6 графически представлены результаты порошкового рентгеноструктурного анализа высушенной распылением смеси 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, лакто-N-тетраозы, 3'-сиалиллактозы и 6'-сиалиллактозы.In FIG. 6 graphically presents the results of X-ray powder diffraction analysis of a spray-dried mixture of 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, lacto-N-tetraose, 3'-sialyllactose and 6'-sialyllactose.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯINFORMATION CONFIRMING THE POSSIBILITY OF IMPLEMENTING THE INVENTION

Первый аспект изобретения относится к высушенному распылением порошку, по существу состоящему из 3-фукозиллактозы, получаемой способом микробной ферментации.The first aspect of the invention relates to a spray-dried powder essentially consisting of 3-fucosyllactose produced by a microbial fermentation process.

3-Фукозиллактозу получают способом микробной ферментации, рассмотренным ниже в настоящей работе. Употребляемый в настоящей работе термин "по существу состоящий из" означает, что высушенный распылением порошок состоит из 3-фукозиллактозы и необязательно побочных продуктов, образующихся в результате микробной ферментации при получении 3-фукозиллактозы, которые не могут быть удалены из технологического потока, получаемого при микробной ферментации. Термин "по существу состоящий из" включает высушенные распылением порошки, состоящие из по меньшей мере 80% масс, по меньшей мере 85% масс, по меньшей мере 90% масс, по меньшей мере 93% масс, по меньшей мере 95% масс, или по меньшей мере 98% масс.3-фукозиллактозы.3-Fucosyllactose is produced by the microbial fermentation method discussed below in this work. As used herein, the term "substantially consisting of" means that the spray-dried powder consists of 3-fucosyllactose and optionally by-products resulting from microbial fermentation to produce 3-fucosyllactose, which cannot be removed from the microbial fermentation process stream. fermentation. The term "substantially consisting of" includes spray-dried powders consisting of at least 80% by weight, at least 85% by weight, at least 90% by weight, at least 93% by weight, at least 95% by weight, or at least 98% by weight 3-fucosyllactose.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления 3-фукозиллактоза находится в высушенном распылением порошке в аморфной форме.In a further and/or alternative embodiment, the 3-fucosyllactose is present in the spray-dried powder in amorphous form.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления высушенный распылением порошок содержит ≤15% масс. воды, предпочтительно ≤10% масс. воды, более предпочтительно ≤7% масс. воды, наиболее предпочтительно ≤5% масс. воды.In an additional and/or alternative embodiment, the spray-dried powder contains ≤15% by weight. water, preferably ≤10% wt. water, more preferably ≤7% wt. water, most preferably ≤5% wt. water.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления высушенный распылением порошок не содержит генетически модифицированных микроорганизмов и молекул нуклеиновых кислот, полученных из генетически модифицированных микроорганизмов.In a further and/or alternative embodiment, the spray-dried powder does not contain genetically modified microorganisms and nucleic acid molecules derived from genetically modified microorganisms.

Второй аспект относится к способу получения высушенного распылением порошка, по существу состоящего из 3-фукозиллактозы, который получен способом микробной ферментации. Способ включает следующие этапы:The second aspect relates to a method for producing a spray-dried powder essentially consisting of 3-fucosyllactose, which is obtained by a microbial fermentation method. The method includes the following steps:

a) очистка 3-фукозиллактозы от ферментационного бульона;a) purification of 3-fucosyllactose from the fermentation broth;

b) предоставление водного раствора 3-фукозиллактозы стадии а), иb) providing the aqueous 3-fucosyllactose solution of step a), and

c) подвергание раствора стадии b) распылительной сушке.c) subjecting the solution to step b) to spray drying.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления очистка 3-фукозиллактозы от ферментационного бульона включает одну или более из следующих стадий:In a further and/or alternative embodiment, purification of 3-fucosyllactose from a fermentation broth includes one or more of the following steps:

i) удаление микробных клеток из ферментационного бульона с получением осветленного технологического потока;i) removing microbial cells from the fermentation broth to obtain a clarified process stream;

ii) подвергание осветленного технологического потока по меньшей мере одной ультрафильтрации;ii) subjecting the clarified process stream to at least one ultrafiltration;

iii) по меньшей мере однократная обработка осветленного технологического потока катионообменной смолой и/или по меньшей мере однократная обработка анионообменной смолой;iii) at least once treating the clarified process stream with a cation exchange resin and/or at least once treating with an anion exchange resin;

iv) подвергание осветленного технологического потока по меньшей мере одной нанофильтрации;iv) subjecting the clarified process stream to at least one nanofiltration;

v) подвергание осветленного технологического потока по меньшей мере одному электродиализу;v) subjecting the clarified process stream to at least one electrodialysis;

vi) по меньшей мере однократная обработка осветленного технологического потока активированным углем; и/илиvi) treating the clarified process stream at least once with activated carbon; and/or

vii) подвергание осветленного технологического потока по меньшей мере одной кристаллизации и/или осаждению.vii) subjecting the clarified process stream to at least one crystallization and/or precipitation.

3-Фукозиллактоза может быть получена способом микробной ферментации, в котором генетически модифицированный микроорганизм, способный синтезировать 3-фукозиллактозу, культивируют в культуральной среде (ферментационном бульоне) в условиях, позволяющих генетически модифицированному микроорганизму синтезировать 3-фукозиллактозу. Очистка 3-фукозиллактозы, получаемой способом микробной ферментации, включает стадию отделения микробных клеток от ферментационного бульона, в результате чего получают осветленный технологический поток, который по существу не содержит клеток и который содержит 3-фукозиллактозу. Данная стадия представляет собой первую стадию способа очистки целевых олигосахаридов.3-Fucosyllactose can be produced by a microbial fermentation method in which a genetically modified microorganism capable of synthesizing 3-fucosyllactose is cultivated in a culture medium (fermentation broth) under conditions that allow the genetically modified microorganism to synthesize 3-fucosyllactose. Purification of 3-fucosyllactose produced by a microbial fermentation process involves the step of separating microbial cells from the fermentation broth, resulting in a clarified process stream that is substantially cell-free and which contains 3-fucosyllactose. This step represents the first step of the process for purifying the target oligosaccharides.

Подходящие способы отделения микробных клеток от ферментационного бульона включают центрифугирование, где микробные клетки получают в виде гранул, а ферментационный бульон - в виде супернатанта. В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления микробные клетки отделяют от ферментационного бульона с помощью фильтрации. Подходящие способы фильтрации для отделения клеток от ферментационного бульона включают микрофильтрацию и ультрафильтрацию.Suitable methods for separating microbial cells from the fermentation broth include centrifugation, where the microbial cells are obtained as pellets and the fermentation broth as the supernatant. In a further and/or alternative embodiment, microbial cells are separated from the fermentation broth by filtration. Suitable filtration methods for separating cells from the fermentation broth include microfiltration and ultrafiltration.

Микрофильтрация как таковая представляет собой способ физического фильтрования, в котором жидкость, содержащую частицы, пропускают через мембрану с определенным размером пор для отделения частиц от жидкости. Употребляемый в настоящей работе термин "микрофильтрация" относится к способу физического фильтрования, в котором клетки отделяют от ферментационного бульона.Microfiltration itself is a physical filtration technique in which a liquid containing particles is passed through a membrane of a specific pore size to separate the particles from the liquid. As used herein, the term microfiltration refers to a physical filtration method in which cells are separated from the fermentation broth.

Ультрафильтрация представляет собой вариант фильтрования через мембрану и кардинально от него не отличается. При проведении ультрафильтрации такие силы, как давление или градиенты концентрации становятся причиной разделения на полупроницаемой мембране. Клетки, суспендированные твердые вещества и высокомолекулярные растворенные вещества удерживаются в так называемом ретентате, в то время как вода и низкомолекулярные растворенные вещества, такие как целевые сиалилированные олигосахариды, проходят через мембрану, попадая в пермеат (фильтрат).Ultrafiltration is a variant of membrane filtration and is not fundamentally different from it. During ultrafiltration, forces such as pressure or concentration gradients cause separation at the semipermeable membrane. Cells, suspended solids, and high molecular weight solutes are retained in what is called the retentate, while water and low molecular weight solutes, such as the target sialylated oligosaccharides, pass through the membrane into the permeate (filtrate).

Ультрафильтрационные мембраны характеризуются величиной номинального отсечения по молекулярной массе (англ. molecular weight cut-off, сокращенно MWCO) применяемой мембраны. Ультрафильтрацию выполняют в режиме перекрестного потока или в тупиковом режиме.Ultrafiltration membranes are characterized by the value of the nominal molecular weight cut-off (abbreviated as MWCO) of the membrane used. Ultrafiltration is performed in cross-flow mode or dead-end mode.

Обычно микробные клетки синтезируют 3-фукозиллактозу внутриклеточно и секретирут ее в ферментационный бульон. Полученная таким образом 3-фукозиллактоза оказывается в ферментационном бульоне, который затем подвергают дальнейшей обработке, рассмотренной в настоящей работе ниже, с целью очистки 3-фукозиллактозы.Typically, microbial cells synthesize 3-fucosyllactose intracellularly and secrete it into the fermentation broth. The 3-fucosyllactose thus obtained ends up in the fermentation broth, which is then subjected to further processing, discussed below in this work, to purify the 3-fucosyllactose.

Независимо от того, какой способ применяют для очистки 3-фукозиллактозы, полученной способом микробной ферментации, этот способ также может быть применен для очистки 3-фукозиллактозы, полученной ферментативным катализом in vitro. 3-Фукозиллактоза может быть очищена от реакционной смеси по окончании биокаталитической реакции. Реакционную смесь подвергают очистке в виде осветленного технологического потока.Regardless of which method is used to purify 3-fucosyllactose obtained by microbial fermentation, this method can also be used to purify 3-fucosyllactose obtained by in vitro enzymatic catalysis. 3-Fucosyllactose can be purified from the reaction mixture after the completion of the biocatalytic reaction. The reaction mixture is purified in the form of a clarified process stream.

Осветленный технологический поток содержит 3-фукозиллактозу, а также побочные продукты и нежелательные примеси, такие как, например, моносахариды, дисахариды, нежелательные побочные продукты олигосахаридов, ионы, аминокислоты, полипептиды, белки и/или нуклеиновые кислоты.The clarified process stream contains 3-fucosyllactose as well as by-products and unwanted impurities such as, for example, monosaccharides, disaccharides, unwanted oligosaccharide by-products, ions, amino acids, polypeptides, proteins and/or nucleic acids.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает этап по меньшей мере одной катионообменной обработки для удаления положительно заряженных соединений из осветленного технологического потока.In a further and/or alternative embodiment, a method for purifying 3-fucosyllactose includes the step of at least one cation exchange treatment to remove positively charged compounds from the clarified process stream.

Подходящие катионообменные смолы для удаления положительно заряженных соединений включают Lewatit S2568 (Н+) (Lanxess AG, Cologne, DE).Suitable cation exchange resins for removing positively charged compounds include Lewatit S2568 (H+) (Lanxess AG, Cologne, DE).

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает стадию анионообменной обработки для удаления нежелательных отрицательно заряженных соединений из осветленного технологического потока.In a further and/or alternative embodiment, a method for purifying 3-fucosyllactose includes an anion exchange treatment step to remove unwanted negatively charged compounds from the clarified process stream.

Подходящие анионообменные смолы включают Lewatit S6368 A, Lewatit S4268, Lewatit S5528, Lewatit S6368A (Lanxess AG. Cologne, DE), Dowex AG 1×2 (Mesh 200-400), Dowex 1×8 (Mesh 100-200), Purolite Chromalite CGA100×4 (Purolite GmbH, Ratingen, DE), DowAmberlite FPA51 (Dow Chemicals, Ml, USA).Suitable anion exchange resins include Lewatit S6368 A, Lewatit S4268, Lewatit S5528, Lewatit S6368A (Lanxess AG. Cologne, DE), Dowex AG 1x2 (Mesh 200-400), Dowex 1x8 (Mesh 100-200), Purolite Chromalite CGA100×4 (Purolite GmbH, Ratingen, DE), DowAmberlite FPA51 (Dow Chemicals, Ml, USA).

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает стадию нанофильтрации и/или диафильтрации для удаления примесей с более низкой молекулярной массой и для концентрирования целевых олигосахаридов.In a further and/or alternative embodiment, the method for purifying 3-fucosyllactose includes a nanofiltration and/or diafiltration step to remove lower molecular weight impurities and to concentrate the target oligosaccharides.

Диафильтрация включает добавление к раствору свежей (пресной, англ. fresh) воды для удаления (вымывания) проходящих через мембрану компонентов. Диафильтрация может быть применена для разделения компонентов в соответствии с размерами и зарядом их молекул с помощью подходящих мембран; при диафильтрации один или более видов частиц эффективно задерживается мембраной, и другой вид частиц проходит через мембрану. В частности, диафильтрация с применением нанофильтрационной мембраны подходит для разделения низкомолекулярных соединений, таких как небольшие молекулы и соли. Нанофильтрационные мембраны обычно имеют номинальное отсечение по молекулярной массе, составляющее от 150 до 1000 Дальтон. Нанофильтрацию широко применяют в молочной промышленности для концентрирования и деминерализации молочной сыворотки.Diafiltration involves adding fresh water to a solution to remove (wash out) components passing through the membrane. Diafiltration can be used to separate components according to the size and charge of their molecules using suitable membranes; In diafiltration, one or more types of particles are effectively retained by the membrane, and another type of particles passes through the membrane. In particular, diafiltration using a nanofiltration membrane is suitable for the separation of low molecular weight compounds such as small molecules and salts. Nanofiltration membranes typically have a nominal molecular weight cutoff ranging from 150 to 1000 Daltons. Nanofiltration is widely used in the dairy industry for the concentration and demineralization of whey.

Подходящие для нанофильтрации и/или диафильтрации мембраны включают Dow Filmtec NF270-4040, Trisep 4040-XN45-TSF (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, DE), GE4040F30 и GH4040F50 (GE Water & Process Technologies, Ratingen, DE).Suitable membranes for nanofiltration and/or diafiltration include Dow Filmtec NF270-4040, Trisep 4040-XN45-TSF (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, DE), GE4040F30 and GH4040F50 (GE Water & Process Technologies, Ratingen, DE).

Было обнаружено, что диафильтрация с помощью нанофильтрационных мембран является эффективной предварительной обработкой с целью удаления значительных количеств загрязняющих веществ перед обработкой электродиализом раствора, содержащего олигосахарид. Применение нанофильтрационных мембран для концентрирования и диафильтрации в целях очистки НМО приводит снижению расхода энергии и технологических затрат, а также к повышению качества продукта из-за снижения термических воздействий, что приводит к снижению вероятности протекания реакции Майяра и альдольной конденсации.Diafiltration using nanofiltration membranes has been found to be an effective pre-treatment to remove significant amounts of contaminants prior to electrodialysis treatment of the oligosaccharide containing solution. The use of nanofiltration membranes for concentration and diafiltration for the purification of HMO leads to a reduction in energy consumption and technological costs, as well as an increase in product quality due to a decrease in thermal effects, which leads to a decrease in the likelihood of the Maillard reaction and aldol condensation.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает по меньшей мере одну стадию электродиализа.In a further and/or alternative embodiment, the method for purifying 3-fucosyllactose includes at least one electrodialysis step.

Электродиализ (ЭД) является комбинацией диализа и электролиза и может быть применен для разделения или концентрация ионов в растворах на основании их селективной миграции через полупроницаемые мембраны под действием электрического тока.Electrodialysis (ED) is a combination of dialysis and electrolysis and can be used to separate or concentrate ions in solutions based on their selective migration across semipermeable membranes under the influence of an electric current.

В принципе, устройство для электродиализа состоит из электролитической ячейки, включающей пару электродов, погруженных в электролит для транспортировки ионов, соединенных с генератором постоянного тока. Электрод, соединенный с положительным полюсом генератора постоянного тока, называется анодом, а электрод, соединенный с отрицательным полюсом, называется катодом. Электрический ток протекает через раствор электролита, что приводит к перемещению отрицательно и положительно заряженных ионов по направлению к аноду и катоду соответственно. Применяемые для электродиализа мембраны по существу представляют собой листы пористой ионообменной смолы, содержащие отрицательно или положительно заряженные группы, и, таким образом, их соответственно называют катионными или анионными мембранами. Ионообменные мембраны обычно изготавливают из включающего подходящую функциональную группу (такую как сульфоновая кислота в катионных мембранах или четвертичную аммонийную группу в анионных мембранах) полистирола, образующего поперечные связи с дивинилбензолом. Электролит может представлять собой, например, хлорид натрия, ацетат натрия, пропионат натрия или сульфаминовую кислоту. Установку для электродиализа собирают таким образом, чтобы анионные и катионные мембраны располагались параллельно, как в фильтр-прессе, между двумя электродными блоками, в результате чего поток, из которого извлекаются ионы, успешно отделяется от потока, который обогащается ионами (эти два раствора также называются разбавленными раствором (обедняемым ионами) и концентратом (обогащаемым ионами)). Основной частью способа электродиализа является установленный между двумя электродами мембранный пакет, который состоит из нескольких анионообменных мембран и катионообменных мембран, разделенных разделителями. При подаче постоянного электрического тока анионы и катионы начинают мигрировать через мембраны по направлению к электродам.In principle, an electrodialysis device consists of an electrolytic cell comprising a pair of electrodes immersed in an electrolyte to transport ions, connected to a direct current generator. The electrode connected to the positive pole of the DC generator is called anode, and the electrode connected to the negative pole is called cathode. Electric current flows through the electrolyte solution, causing negatively and positively charged ions to move toward the anode and cathode, respectively. The membranes used for electrodialysis are essentially sheets of porous ion exchange resin containing negatively or positively charged groups, and are thus respectively called cationic or anionic membranes. Ion exchange membranes are typically made from a suitable functional group (such as a sulfonic acid in cationic membranes or a quaternary ammonium group in anionic membranes) polystyrene cross-linked with divinylbenzene. The electrolyte may be, for example, sodium chloride, sodium acetate, sodium propionate or sulfamic acid. The electrodialysis unit is assembled in such a way that the anion and cation membranes are arranged in parallel, as in a filter press, between two electrode blocks, as a result of which the stream from which ions are extracted is successfully separated from the stream that is enriched with ions (these two solutions are also called dilute solution (depleted in ions) and concentrate (enriched in ions)). The main part of the electrodialysis method is a membrane package installed between two electrodes, which consists of several anion exchange membranes and cation exchange membranes separated by separators. When a constant electric current is applied, anions and cations begin to migrate through the membranes towards the electrodes.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы дополнительно включает стадию непрерывной хроматографии, такой как хроматография с псевдодвижущимся слоем (ПДС-хроматография).In a further and/or alternative embodiment, the method for purifying 3-fucosyllactose further includes a continuous chromatography step, such as pseudo moving bed chromatography (PSC chromatography).

Хроматография с псевдодвижущимся слоем (ПДС) была изобретена в нефтехимической и горнодобывающей отрасли. В настоящее время ПДС-хроматографию применяют в фармацевтической промышленности для выделения энантиомеров из рацемических смесей. Крупномасштабная ПДС-хроматография уже применялась для выделения моносахарида фруктозы из растворов, содержащих фруктозу и глюкозу, и для выделения дисахарида сахарозы из сиропов, содержащих свекловичный сахар или тростниковый сахар.Pseudo moving bed chromatography (PMB) was invented in the petrochemical and mining industries. Currently, PDS chromatography is used in the pharmaceutical industry to isolate enantiomers from racemic mixtures. Large-scale PDS chromatography has already been used to isolate the monosaccharide fructose from solutions containing fructose and glucose, and to isolate the disaccharide sucrose from syrups containing beet sugar or cane sugar.

В способах с ПДС, применяемых для разделения сахаридов, применяют, например, содержащие кальций, сшитые поперечными связями полистирольные смолы, анионные смолы в бисульфитной форме (Bechthold М., с соавт., Chemie Ingenieur Technik, 2010, 82, 65-75) или сильнокислую катионную смолу на основе полистирольного геля в водородной форме (Purolite PCR833H) (Purolite, Bala Cynwyd, USA).In PDS processes used for the separation of saccharides, for example, calcium-containing, cross-linked polystyrene resins, anionic resins in bisulfite form are used (Bechthold M., et al., Chemie Ingenieur Technik, 2010, 82, 65-75) or strongly acidic cationic resin based on polystyrene gel in hydrogen form (Purolite PCR833H) (Purolite, Bala Cynwyd, USA).

При непрерывном режиме работы, рециркуляции подвижной фазы, а также при возможности применения колонок больших размеров, системы с ПДС, в принципе, могут быть увеличены до достижения объемов продукции, составляющих сотни тонн.With continuous operation, recirculation of the mobile phase, and the possibility of using larger columns, PDS systems can, in principle, be scaled up to achieve production volumes of hundreds of tons.

Преимущество этапа способа, представляющего собой хроматографию с псевдодвижущимся слоем, состоит в том, что этот этап способа позволяет дополнительно удалять олигосахариды, структурно близкие к целевому олигосахариду.An advantage of the pseudo-moving bed chromatography step of the process is that this process step allows for the additional removal of oligosaccharides that are structurally similar to the target oligosaccharide.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает обработку технологического потока активированным углем для удаления из технологического потока загрязняющих веществ, таких как красители.In a further and/or alternative embodiment, a method for purifying 3-fucosyllactose includes treating the process stream with activated carbon to remove contaminants, such as dyes, from the process stream.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает по меньшей мере один этап кристаллизации или осаждения 3-фукозиллактозы из осветленного технологического потока. Кристаллизацию или осаждение 3-фукозиллактозы из технологического потока можно осуществить добавлением подходящего количества органического растворителя, способного смешиваться с водой технологического потока, содержащего 3-фукозиллактозу. Органический растворитель может быть выбран из группы, состоящей из С₁-С₆-спиртов и С₁-С₄-карбоновых кислот.In a further and/or alternative embodiment, a method for purifying 3-fucosyllactose includes at least one step of crystallizing or precipitating 3-fucosyllactose from the clarified process stream. Crystallization or precipitation of 3-fucosyllactose from the process stream can be accomplished by adding a suitable amount of an organic solvent miscible with the water of the process stream containing 3-fucosyllactose. The organic solvent may be selected from the group consisting of C ₁ -C ₆ alcohols and C ₁ -C ₄ carboxylic acids.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает стадию стерильного фильтрования и/или удаления эндотоксина, предпочтительно фильтрованием технологического потока через фильтр с отсечением по молекулярной массе 3 кДа или фильтр с отсечением по молекулярной массе 6 кДа.In a further and/or alternative embodiment, the method for purifying 3-fucosyllactose includes the step of sterile filtration and/or endotoxin removal, preferably by filtering the process stream through a 3 kDa molecular weight cutoff filter or a 6 kDa molecular weight cutoff filter.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления способ очистки 3-фукозиллактозы включает стадию повышения концентрации 3-фукозиллактозы в технологическом потоке. Концентрация 3-фукозиллактозы в технологическом потоке может быть повышена посредством испарения технологического потока в вакууме, обратного осмоса технологического потока или нанофильтрации технологического потока (например, нанофильтрации через нанофильтрационную мембрану с отсечением по размеру ≤20 ). В альтернативном варианте кристаллизованную или осажденную 3-фукозиллактозу растворяют в воде, получая раствор 3-фукозиллактозы, имеющий целевую концентрацию 3-фукозиллактозы.In an additional and/or alternative embodiment, a method for purifying 3-fucosyllactose includes the step of increasing the concentration of 3-fucosyllactose in the process stream. The concentration of 3-fucosyllactose in the process stream can be increased by vacuum evaporation of the process stream, reverse osmosis of the process stream, or nanofiltration of the process stream (e.g., nanofiltration through a nanofiltration membrane with a cutoff size of ≤20 ). Alternatively, the crystallized or precipitated 3-fucosyllactose is dissolved in water to produce a 3-fucosyllactose solution having the target concentration of 3-fucosyllactose.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления полученный технологический поток представляет собой водный раствор, который содержит 3-фукозиллактозу в концентрации, составляющей ≥20 г/л, ≥25 г/л, ≥30 г/л, ≥40 г/л, ≥60 г/л, ≥100 г/л, ≥200 г/л или даже ≥300 г/л.In a further and/or alternative embodiment, the resulting process stream is an aqueous solution that contains 3-fucosyllactose at a concentration of ≥20 g/L, ≥25 g/L, ≥30 g/L, ≥40 g/L, ≥ 60 g/l, ≥100 g/l, ≥200 g/l or even ≥300 g/l.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления водный раствор содержит 3-фукозиллактозу с чистотой, составляющей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% в пересчете на массу сухого вещества/растворенных веществ, находящихся в растворе.In a further and/or alternative embodiment, the aqueous solution contains 3-fucosyllactose with a purity of at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 93%, at least 95%, or at least at least 98% based on the weight of dry matter/solutes in solution.

Полученный концентрат, содержащий очищенную 3-фукозиллактозу, может храниться в подходящих условиях.The resulting concentrate containing purified 3-fucosyllactose can be stored under suitable conditions.

Способ очистки 3-фукозиллактозы экономичен и легко поддается адаптации для больших масштабов, что делает его подходящим в качестве основы для многотоннажного производства.The method for purifying 3-fucosyllactose is economical and easily adaptable to large scale, making it suitable as a basis for large-scale production.

Другим преимуществом способа очистки 3-фукозиллактозы является то, что водный раствор не содержит генетически модифицированных микроорганизмов и молекул нуклеиновых кислот, полученных из генетически модифицированных микроорганизмов. Кроме того, водный раствор не содержит белков. Полное удаление белков устраняет риск развития аллергий у потенциального потребителя.Another advantage of the 3-fucosyllactose purification method is that the aqueous solution does not contain genetically modified microorganisms and nucleic acid molecules derived from genetically modified microorganisms. In addition, the aqueous solution does not contain proteins. Complete removal of proteins eliminates the risk of developing allergies in the potential consumer.

Способ получения высушенного распылением порошка включает стадию предоставления водного раствора, содержащего 3-фукозиллактозу.A method for producing a spray-dried powder includes the step of providing an aqueous solution containing 3-fucosyllactose.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления водный раствор содержит 3-фукозиллактозу в количестве, составляющем по меньшей мере 20% (масс./об.), 30% (масс./об.), 35% (масс./об.) и до 45% (масс./об.), 50% (масс./об.), 60% (масс./об.).In a further and/or alternative embodiment, the aqueous solution contains 3-fucosyllactose in an amount of at least 20% (w/v), 30% (w/v), 35% (w/v) and up to 45% (w/v), 50% (w/v), 60% (w/v).

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления водный раствор не содержит генетически модифицированных микроорганизмов, молекул нуклеиновых кислот, полученных из генетически модифицированных микроорганизмов, и белков.In a further and/or alternative embodiment, the aqueous solution does not contain genetically modified microorganisms, nucleic acid molecules derived from genetically modified microorganisms, and proteins.

В способе получения высушенного распылением порошка водный раствор, содержащий 3-фукозиллактозу, подвергают распылительной сушке.In a method for producing a spray-dried powder, an aqueous solution containing 3-fucosyllactose is spray-dried.

Распылительная сушка представляет собой способ получения сухих порошков, в котором раствор, содержащий интересующее вещество (т.е. 3-фукозиллактозу), сначала распыляют на капли, которые быстро высушиваются горячим воздухом. Распылительная сушка протекает очень быстро, и воздействие на высушиваемое вещество высоких температур весьма кратковременно.Spray drying is a method of producing dry powders in which a solution containing the substance of interest (i.e., 3-fucosyllactose) is first sprayed into droplets, which are quickly dried with hot air. Spray drying is very fast, and the exposure of the substance being dried to high temperatures is very short-lived.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления водный раствор, содержащий 3-фукозиллактозу, который был очищен от ферментационного бульона или выделен из технологического потока, сушат распылением при температуре сопла, составляющей по меньшей мере 110°С, предпочтительно по меньшей мере 120°С, более предпочтительно по меньшей мере 125°С, и менее 150°С, предпочтительно менее 140°С и более предпочтительно менее 135°С.In a further and/or alternative embodiment, the aqueous solution containing 3-fucosyllactose, which has been purified from the fermentation broth or separated from the process stream, is spray dried at a nozzle temperature of at least 110°C, preferably at least 120°C, more preferably at least 125°C, and less than 150°C, preferably less than 140°C, and more preferably less than 135°C.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления водный раствор, содержащий 3-фукозиллактозу, который был очищен от ферментационного бульона или выделен из технологического потока, сушат распылением при выходной температуре, составляющей по меньшей мере 60°С, предпочтительно по меньшей мере 65°С, и менее 80°С, предпочтительно менее 70°С. В особенно предпочтительном примере осуществления водный раствор, содержащий 3-фукозиллактозу, сушат распылением при температуре сопла, составляющей от приблизительно 68°С до приблизительно 70°С.In a further and/or alternative embodiment, the aqueous solution containing 3-fucosyllactose, which has been purified from the fermentation broth or separated from the process stream, is spray dried at an outlet temperature of at least 60°C, preferably at least 65°C, and less than 80°C, preferably less than 70°C. In a particularly preferred embodiment, the aqueous solution containing 3-fucosyllactose is spray dried at a nozzle temperature of from about 68°C to about 70°C.

Распылительная сушка водного раствора, содержащего 3-фукозиллактозу, позволяет получать порошок, имеющий низкую гигроскопичность, в котором 3-фукозиллактоза находится в аморфной форме и имеет одинаковый размер частиц.Spray drying of an aqueous solution containing 3-fucosyllactose produces a powder having low hygroscopicity, in which 3-fucosyllactose is in amorphous form and has a uniform particle size.

Третий аспект относится к применению высушенного распылением порошка, содержащего 3-фукозиллактозу, который был выделен из технологического потока, для приготовления питательной композиции. Высушенный распылением порошок, по существу состоящий из 3-фукозиллактозы, подходит для потребления человеком и, таким образом, может быть включен в препараты для потребления человеком, такие как медицинские композиции, детские питательные смеси, молочные напитки или пищевые добавки.The third aspect relates to the use of spray-dried powder containing 3-fucosyllactose, which has been isolated from the process stream, for the preparation of a nutritional composition. The spray-dried powder essentially consisting of 3-fucosyllactose is suitable for human consumption and thus can be included in preparations for human consumption such as medical compositions, infant formulas, milk drinks or dietary supplements.

Четвертый аспект относится к питательным композициям, которые содержат высушенный распылением порошок, раскрытый в первом аспекте и получаемый согласно второму аспекту.The fourth aspect relates to nutritional compositions that contain the spray-dried powder disclosed in the first aspect and prepared according to the second aspect.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления питательная композиция содержит по меньшей мере один дополнительный НМО, который не является 3-фукозиллактозой. По меньшей мере один дополнительный НМО может представлять собой нейтральный НМО, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы (2'-FL), лакто-N-тетраозы (LNT), лакто-N-неотетраозы (LNnT) и лакто-N-фукопентаозы I (LNFPI). В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления по меньшей мере один дополнительный НМО может представлять собой сиалилированный НМО, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из 3'-сиалиллактозы (3'-SL), 6'-сиалиллактозы (6'-SL), сиалиллакто-N-тетраозы (LST)-a, LST-b, LST-c и дисиалиллакто-N-тетраозы (DSLNT).In a further and/or alternative embodiment, the nutritional composition contains at least one additional HMO that is not 3-fucosyllactose. The at least one additional HMO may be a neutral HMO, preferably selected from the group consisting of 2'-fucosyllactose (2'-FL), lacto-N-tetraose (LNT), lacto-N-neotetraose (LNnT) and lacto-N-tetraose (LNT). N-fucopentaose I (LNFPI). In a further and/or alternative embodiment, the at least one additional HMO may be a sialylated HMO, preferably selected from the group consisting of 3'-sialyllactose (3'-SL), 6'-sialyllactose (6'-SL), sialyllactose -N-tetraose (LST)-a, LST-b, LST-c and disialyl lacto-N-tetraose (DSLNT).

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления питательная композиция включает смесь, по существу состоящую из Neu5Ac, 2'-FL, 3-FL, L/VT, L/VnT, L/VFPI, 3'-SL, 6'-SL, сиаловой кислоты и L-фукозы. Питательная композиция, включающая предпочтительные количества каждого из указанных соединений, представлена в Таблице 1.In an additional and/or alternative embodiment, the nutritional composition includes a mixture essentially consisting of Neu5Ac, 2'-FL, 3-FL, L/VT, L/VnT, L/VFPI, 3'-SL, 6'-SL, sialic acid and L-fucose. A nutritional composition comprising preferred amounts of each of these compounds is presented in Table 1.

Композиция, состав которой приведен во второй колонке Таблицы 1, особенно предпочтительна для добавления в детскую питательную смесь, чтобы готовая детская питательная смесь для непосредственного потребления могла содержать соединения в концентрациях, указанных в третьей колонке Таблицы 1.The composition set forth in the second column of Table 1 is particularly preferred for addition to infant formula so that the finished infant formula for direct consumption may contain the compounds in the concentrations indicated in the third column of Table 1.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления питательная композиция содержит один или более дополнительных ингредиентов. Один или более дополнительных ингредиентов выбраны из группы, состоящей из масла, жира и жирных кислот (таких как оливковое масло, подсолнечное масло, кокосовое масло, ореховое масло, рапсовое масло, пальмовое масло, льняное масло, рыбий жир, линоленовая кислота, соевое масло и т.д.), углеводов (таких как глюкоза, фруктоза, лактоза, мальтодекстрин, крахмал, сахароза, инозит и т.д.), белков (снятого молока, молочной сыворотки, казеина (полученных от любого из одомашненных молочных животных) или сои), витаминов (А, В1, В2, В5, В6, В12, С, D, Е, K, биотина, фолиевой кислоты, ниацина, холина) минералов и редких элементов (натрия, калия, хлорида, кальция, фосфора, магния, железа, цинка, марганца, фторида, селена, йода, меди).In an additional and/or alternative embodiment, the nutritional composition contains one or more additional ingredients. One or more additional ingredients are selected from the group consisting of oil, fat and fatty acids (such as olive oil, sunflower oil, coconut oil, nut oil, canola oil, palm oil, flaxseed oil, fish oil, linolenic acid, soybean oil and etc.), carbohydrates (such as glucose, fructose, lactose, maltodextrin, starch, sucrose, inositol, etc.), proteins (skim milk, whey, casein (derived from any domesticated dairy animal) or soy ), vitamins (A, B1, B2, B5, B6, B12, C, D, E, K, biotin, folic acid, niacin, choline), minerals and rare elements (sodium, potassium, chloride, calcium, phosphorus, magnesium, iron, zinc, manganese, fluoride, selenium, iodine, copper).

В одном из предпочтительных примеров осуществления питательная композиция, содержащая высушенные распылением олигосахариды женского молока или смесь олигосахаридов женского молока или смесь олигосахаридов женского молока с функциональными моносахаридами или смесь олигосахаридов женского молока с другими волокнами, представляет собой детскую питательную смесь, которая соответствует требованиям к составу, установленным Регламентом (ЕС) 2016/127 и/или Сводом федеральных постановлений США (Code of Federal Regulations, USA), Заголовок 21 107.100 (характеристики питательных веществ). Репрезентативные композиции детских питательных смесей представлены в Таблицах 2 и 3.In one preferred embodiment, the nutritional composition comprising spray-dried human milk oligosaccharides or a mixture of human milk oligosaccharides or a mixture of human milk oligosaccharides with functional monosaccharides or a mixture of human milk oligosaccharides with other fibers is an infant formula that meets the composition requirements established by Regulation (EU) 2016/127 and/or Code of Federal Regulations (USA), Title 21 107.100 (nutrient characteristics). Representative infant formula compositions are presented in Tables 2 and 3.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления питательная композиция также содержит микроорганизмы, предпочтительно пробиотические микроорганизмы. Для получения пищевых продуктов для младенцев предпочтительные микроорганизмы получены из или могут находиться в кишечной флоре здорового человека. Предпочтительно, без ограничений, микроорганизмы выбраны из следующих видов: Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus, Leuconostoc, Clostridium, Eubacterium, Veilonella, Fusobacterium, Bacterioides, Prevotella, Escherichia, Propionibacterium и Saccharomyces. В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления микроорганизм выбран из группы, состоящей из Bifidobacterium adolescentis, В. animalis, В. bifidum, В. breve, В. infantis, В. lactis, В. longum; Enterococcus faecium; Escherichia coli; Klyveromyces marxianus; Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. casei, L. crispatus, L. fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. johnsonii, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L. salivarius, L. sakei; Lactococcus lactis (включая, без ограничений, подвиды lactis, cremoris и diacetylactis); Leuconostoc mesenteroides (включая, без ограничений, подвид mesenteroides); Pedicoccus acidilactici, P. pentosaceus; Propionibacterium acidipropionici, P. freudenreichii ssp.shermanii; Staphylococcus carnosus; и Streptococcus thermophilus.In a further and/or alternative embodiment, the nutritional composition also contains microorganisms, preferably probiotic microorganisms. For infant nutrition, preferred microorganisms are derived from or can be found in the intestinal flora of a healthy person. Preferably, without limitation, the microorganisms are selected from the following species: Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus, Leuconostoc, Clostridium, Eubacterium, Veilonella, Fusobacterium, Bacterioides, Prevotella, Escherichia, Propionibacterium and Saccharomyces. In an additional and/or alternative embodiment, the microorganism is selected from the group consisting of Bifidobacterium adolescentis, B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum; Enterococcus faecium; Escherichia coli; Klyveromyces marxianus; Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. casei, L. crispatus, L. fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. johnsonii, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L. salivarius , L. sakei; Lactococcus lactis (including, without limitation, subspecies lactis, cremoris and diacetylactis); Leuconostoc mesenteroides (including, without limitation, mesenteroides subspecies); Pedicoccus acidilactici, P. pentosaceus; Propionibacterium acidipropionici, P. freudenreichii ssp.shermanii; Staphylococcus carnosus; and Streptococcus thermophilus.

Кроме комбинации живых организмов, питательная композиция также может включать культуры мертвых клеток. В области техники пробиотических веществ иногда применяют культуры убитых клеток (например, тиндализованных бактерий). Убитые культуры могут служить источником белков, пептидов, олигосахаридов, фрагментов наружной стенки клеток и натуральных продуктов, которые вызывают кратковременную стимуляцию иммунной системы.In addition to the combination of living organisms, the nutritional composition may also include cultures of dead cells. In the field of probiotic substance technology, cultures of killed cells (eg, tindalized bacteria) are sometimes used. Killed crops can serve as a source of proteins, peptides, oligosaccharides, outer cell wall fragments and natural products that cause short-term stimulation of the immune system.

Включение пробиотических микроорганизмов в питательную композицию, в частности, в присутствии НМО, особенно предпочтительно тем, что это также способствует установлению здоровой флоры кишечника.The inclusion of probiotic microorganisms in the nutritional composition, particularly in the presence of HMO, is particularly advantageous in that it also promotes the establishment of healthy intestinal flora.

В дополнительном и/или альтернативном примере осуществления питательная композиция также включает пребиотические вещества, такие как галакто-олигосахариды (ГОС), фрукто-олигосахариды (ФОС), инулин или их комбинации.In an additional and/or alternative embodiment, the nutritional composition also includes prebiotic substances such as galacto-oligosaccharides (GOS), fructo-oligosaccharides (FOS), inulin, or combinations thereof.

Питательная композиция находится в твердой форме, примеры которой включают, без ограничений, порошки, гранулы, хлопья, неоднородные гранулы или их комбинации.The nutritional composition is in solid form, examples of which include, but are not limited to, powders, granules, flakes, particulate granules, or combinations thereof.

В одном из дополнительных примеров осуществления питательная композиция выбрана из группы, состоящей из медицинских композиций, детских питательных смесей, молочных напитков и пищевых добавок.In one additional embodiment, the nutritional composition is selected from the group consisting of medical compositions, infant formulas, milk drinks and dietary supplements.

В качестве медицинской композиции питательная композиция может быть применена для улучшения когнитивной деятельности, в частности, для повышения внимания и для улучшения обучения и/или памяти.As a medical composition, the nutritional composition can be used to improve cognitive performance, in particular to increase attention and to improve learning and/or memory.

Далее настоящее изобретение дополнительно раскрыто с помощью конкретных примеров осуществления, сопровождаемых графическими материалами, однако, изобретение не ограничено рассмотренными примерами; напротив, изобретение ограничено лишь объемом пунктов формулы изобретения. Кроме того, термины "первый", "второй" и подобные термины, упоминаемые в описании и пунктах формулы изобретения, употребляются для распознавания схожих элементов и необязательны для описания последовательности, как временной, так и пространственной, для описания главенства или любого другого свойства. Следует понимать, что применяемые таким образом термины в подходящих обстоятельствах взаимозаменяемы и что примеры осуществления изобретения, рассмотренные в настоящей работе, могут функционировать в последовательности, отличной от описанной или показанной в настоящей работе.Next, the present invention is further disclosed with the help of specific embodiments accompanied by drawings, however, the invention is not limited to the examples discussed; on the contrary, the invention is limited only by the scope of the claims. In addition, the terms "first", "second" and similar terms mentioned in the description and claims are used to recognize similar elements and are not necessary to describe sequence, either temporal or spatial, to describe dominance or any other property. It should be understood that the terms so used are interchangeable under appropriate circumstances and that the embodiments of the invention discussed herein may operate in a different sequence than those described or shown herein.

Следует отметить, что употребляемый в формуле изобретения термин "включающий" не должен рассматриваться как ограниченный перечисленными после него объектами; напротив, он не исключает наличия других элементов или этапов. Таким образом, он указывает на наличие перечисленных после его особенностей, целых чисел, этапов или компонентов, но не исключает наличия или добавления одного или более других особенностей, целых чисел, этапов или компонентов или их групп. Таким образом, объем определения "устройство, включающее средства А и В" не ограничен устройствами, состоящими из только из компонентов А и В. Согласно настоящему изобретению это означает, что единственными относящимися к изобретению компонентами устройства являются А и В.It should be noted that the term “including” used in the claims should not be considered as limited to the objects listed after it; on the contrary, it does not exclude the presence of other elements or stages. Thus, it indicates the presence of the features, integers, steps or components listed after it, but does not exclude the presence or addition of one or more other features, integers, steps or components or groups thereof. Thus, the scope of the definition of "device comprising means A and B" is not limited to devices consisting only of components A and B. According to the present invention, this means that the only relevant components of the device are A and B.

Упоминание в настоящей работе "одного примера осуществления" или "примера осуществления" означает, что конкретный признак, структура или характеристика, рассмотренная при раскрытии примера осуществления, включена в по меньшей мере один пример осуществления настоящего изобретения. Таким образом, упоминаемые в различных частях настоящей работы фразы "в одном из примеров осуществления" или "в примере осуществления" не обязательно относятся к одному и тому же примеру осуществления. Кроме того, специалисту в данной области техники после прочтения настоящего описания должно быть понятно, что конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть скомбинированы любым подходящим образом с получением одного или более примеров осуществления.Reference herein to “one embodiment” or “exemplary embodiment” means that the particular feature, structure, or characteristic discussed in the disclosure of the exemplary embodiment is included in at least one embodiment of the present invention. Thus, the phrases “in one embodiment” or “in an example embodiment” mentioned in various parts of this work do not necessarily refer to the same embodiment. In addition, one skilled in the art will appreciate from reading the present disclosure that specific features, structures, or characteristics may be combined in any suitable manner to form one or more exemplary embodiments.

Аналогично, следует понимать, что при описании репрезентативных примеров осуществления изобретения различные признаки изобретения в некоторых случаях сгруппированы вместе в один пример осуществления, фигуру или их описание для упрощения понимания сущности изобретения и облегчения понимания одного или более различных аспектов изобретения. Однако такой способ раскрытия изобретения не должен рассматриваться как то, что заявляемое изобретение требует больше признаков, чем те признаки, которые ясно указаны в каждом пункте формулы изобретения. Напротив, как следует из приведенных пунктов формулы изобретения, аспекты изобретения определяются не всеми перечисленными признаками каждого из описанных выше примеров осуществления. Таким образом, пункты формулы изобретения, приведенные после подробного рассмотрения изобретения, полностью включены в подробное рассмотрение изобретения, и каждый пункт формулы изобретения должен рассматриваться как отдельный пример осуществления настоящего изобретения.Likewise, it should be understood that in describing representative embodiments of the invention, various features of the invention are in some cases grouped together into a single embodiment, figure, or description thereof to facilitate understanding of the spirit of the invention and to facilitate understanding of one or more different aspects of the invention. However, this method of disclosure of the invention should not be construed as meaning that the claimed invention requires more features than those features that are clearly indicated in each claim. On the contrary, as follows from the above claims, aspects of the invention are not determined by all of the listed features of each of the embodiments described above. Thus, the claims given after the detailed discussion of the invention are fully included in the detailed discussion of the invention, and each claim is to be considered as a separate example of the present invention.

Кроме того, как должно быть понятно специалистам в данной области техники, в то время как некоторые примеры осуществления, рассмотренные в настоящей работе, включают одни, но не другие признаки, включенные в другие примеры осуществления, в объем изобретения включены комбинации признаков различных примеров осуществления, и они образуют другие примеры осуществления. Например, любой из заявленных в приведенных ниже пунктах формулы изобретения примеров осуществления может быть воплощен в любой комбинации.Moreover, as will be appreciated by those skilled in the art, while some embodiments discussed herein include some and not other features included in other embodiments, combinations of features of various embodiments are included within the scope of the invention. and these form other embodiments. For example, any of the embodiments stated in the claims below can be embodied in any combination.

Кроме того, некоторые из примеров осуществления рассмотрены в настоящей работе в виде способа или комбинации элементов способа, которые могут быть выполнены процессором компьютерной системы или другими средствами осуществления функций. Таким образом, процессор с инструкциями, необходимыми для выполнения способа или элемента способа, представляет собой средства осуществления способа или элемента способа. Так, рассмотренный в настоящей работе элемент примера осуществления установки является примером средств осуществления функции, выполняемой элементом для воплощения изобретения.In addition, some of the embodiments are discussed herein as a method or combination of method elements that may be executed by a computer system processor or other means of performing functions. Thus, a processor with the instructions necessary to carry out the method or method element constitutes means for implementing the method or method element. Thus, the element of the installation example discussed in this work is an example of the means for implementing the function performed by the element for implementing the invention.

В описании и графических материалах, представленных в настоящей работе, показаны различные конкретные детали. Однако следует понимать, что примеры осуществления изобретения могут быть воплощены без использования этих конкретных деталей. В других примерах для облегчения понимания описания и графических материалов хорошо известные способы, структуры и методики подробно не рассмотрены.Various specific details are shown in the description and graphics provided in this work. However, it should be understood that embodiments of the invention may be implemented without the use of these specific details. In other examples, to facilitate understanding of the descriptions and drawings, well-known methods, structures and techniques are not discussed in detail.

Ниже изобретение раскрыто посредством подробного рассмотрения нескольких примеров осуществления изобретения. Специалисты в данной области техники, на основании имеющихся у них знаний, могут создать другие примеры осуществления изобретения, не выходящие за пределы объема или технической сущности изобретения, которое ограничено лишь объемом прилагаемых пунктов формулы изобретения.Below, the invention is disclosed through a detailed discussion of several examples of embodiments of the invention. Those skilled in the art, based on the knowledge available to them, may create other embodiments of the invention without departing from the scope or technical essence of the invention, which is limited only by the scope of the appended claims.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯDESCRIPTION OF EXAMPLES OF IMPLEMENTATION OF THE INVENTION

Пример 1Example 1

Очистка 2'-фукозиллактозы от ферментационного бульонаPurification of 2'-fucosyllactose from fermentation broth

Получение 2'-фукозиллактозы ферментацией с применением генетически модифицированного штамма Е. coli выполняли как описано в Европейской патентной заявке No. 16196486.1. 2'-Фукозиллактозу выделяли из ферментационного бульона фильтрованием, ионообменной хроматографией, нанофильтрацией, диафильтрацией или электродиализом и обработкой углем как описано в патентной заявке WO 2015/106943 А1. Полученный раствор, содержащий 2'-фукозиллактозу, подвергали распылительной сушке, получая стабильный твердый продукт.The production of 2'-fucosyllactose by fermentation using a genetically modified E. coli strain was carried out as described in European Patent Application No. 16196486.1. 2'-Fucosyllactose was isolated from the fermentation broth by filtration, ion exchange chromatography, nanofiltration, diafiltration or electrodialysis and carbon treatment as described in patent application WO 2015/106943 A1. The resulting solution containing 2'-fucosyllactose was spray dried to obtain a stable solid product.

Пример 2Example 2

Очистка 3-фукозиллактозы от ферментационного бульонаPurification of 3-fucosyllactose from fermentation broth

3-Фукозиллактозу получали ферментацией с применением генетически модифицированного штамма Е. coli как описано в Европейской патентной заявке No. 16196486.1.3-Fucosyllactose was produced by fermentation using a genetically modified E. coli strain as described in European Patent Application No. 16196486.1.

Клетки отделяли от культуральной среды ультрафильтрацией (отсечение по размеру 0,05 мкм) (CUT membrane technology, Erkrath, Germany) после чего подвергали фильтрации в тангенциальном потоке с MWCO, составляющим 150 кДа (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany). Не содержащую клеток ферментативную среду, содержащую приблизительно 30 г/л 3-фукозиллактозы, пропускали через сильную катионообменную смолу (Lewatit S 2568 (Lanxess, Cologne, Germany)), находящуюся в Н⁺-форме, для удаления положительно заряженных загрязняющих веществ. Затем раствор доводили до рН 7,0 добавлением гидроксида натрия и наносили на анионообменную смолу (Lewatit S6368 A, Lanxess), находящуюся в хлоридной форме. В обоих случаях применяли ионообменные устройства объемом 200 л. После второго фильтрования (150 кДа; Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany) раствор, не содержащий частиц, концентрировали в 5 раз нанофильтрацией с помощью мембраны Filmtech NF270 (Dow, Midland, USA) и в 2,5 испарением в вакууме. Концентрированный раствор с проводимостью приблизительно 15 мС см фильтровали (10 кДа; Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany), осветляли активированным углем (CAS:7440-44-0, Carl Roth, Karlsruhe, Germany) и подвергали деионизации электродиализом. Для этого применяли устройство для электродиализа PC-Cell BED 1-3 (PC-Cell, Heusweiler, Germany), снабженное мембранным пакетом PC-Cell Е200, содержащим следующие мембраны: катионообменную мембрану СЕМ:РС SK и анионообменную мембрану AEM:PCAcid60. В качестве электролита в способе применяли 0,25 М сульфаминовую кислоту. Для осветления коричневатого окрашивания, создаваемого продуктами реакции Майяра и альдольной конденсации, получаемыми из продуктов ферментации, проводили повторную ионообменную хроматографию на том же ионообменном материале в вышеуказанных Na⁺ и Cl^- формах, но в объеме 50 л. После концентрации раствора сахара испарением проводимость снова снижали с 4 мС⋅см^-1 до 0,4 мС⋅см^-1 или менее электродиализом с помощью устройства PC-Cell BED 1-3, указанного выше. Для дополнительного обесцвечивания раствор смешивали с активированным углем (CAS:7440-44-0, Carl Roth, Karlsruhe, Germany), и после фильтрования получали практически бесцветный раствор.Cells were separated from the culture medium by ultrafiltration (0.05 μm cutoff) (CUT membrane technology, Erkrath, Germany) and then subjected to tangential flow filtration with a MWCO of 150 kDa (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany). Cell-free fermentation medium containing approximately 30 g/L 3-fucosyllactose was passed through a strong cation exchange resin (Lewatit S 2568 (Lanxess, Cologne, Germany)) in H ⁺ form to remove positively charged contaminants. The solution was then adjusted to pH 7.0 by adding sodium hydroxide and applied to an anion exchange resin (Lewatit S6368 A, Lanxess) in chloride form. In both cases, 200 L ion exchange devices were used. After a second filtration (150 kDa; Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany), the particle-free solution was concentrated 5-fold by nanofiltration using a Filmtech NF270 membrane (Dow, Midland, USA) and 2.5-fold by vacuum evaporation. The concentrated solution, with a conductivity of approximately 15 mS cm, was filtered (10 kDa; Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany), clarified with activated carbon (CAS:7440-44-0, Carl Roth, Karlsruhe, Germany) and deionized by electrodialysis. For this purpose, a PC-Cell BED 1-3 electrodialysis device (PC-Cell, Heusweiler, Germany) was used, equipped with a PC-Cell E200 membrane package containing the following membranes: a CEM:PC SK cation exchange membrane and an AEM:PCAcid60 anion exchange membrane. 0.25 M sulfamic acid was used as an electrolyte in the method. To lighten the brownish color created by the Maillard reaction and aldol condensation products obtained from the fermentation products, repeated ion exchange chromatography was carried out on the same ion exchange material in the above Na ⁺ and Cl ^- forms, but in a volume of 50 l. After concentrating the sugar solution by evaporation, the conductivity was again reduced from 4 mS⋅cm ^-1 to 0.4 mS⋅cm ^-1 or less by electrodialysis using the PC-Cell BED 1-3 device mentioned above. For additional decolorization, the solution was mixed with activated carbon (CAS:7440-44-0, Carl Roth, Karlsruhe, Germany), and after filtration, an almost colorless solution was obtained.

Пример 3Example 3

Очистка лакто-N-тетраозы от ферментационного бульонаPurification of lacto-N-tetraose from fermentation broth

Лакто-N-тетраозу получали ферментацией в присутствии генетически модифицированного штамма Е. coli BL21 (DE3) ΔlacZ, в геном которого были встроены гены, необходимые для синтеза лакто-N-тетраозы in vivo, а именно: N-ацетилглюкозамин-гликозилтрансферазы (IgtA от Neisseria meningitidis МС58), β-1,3-галактозилтрансферазы (wbdO от Salmonella enterica subsp. salamae serovar Greenside), lacY от E.coli K12, а также UDP-глюкозо-4-эпимеразы galE и UTP-глюкозо-1-фосфатуридил-трансферазы galU от E.coli K12. Кроме того, был сврхэкспрессирован ген galS, кодирующий глюкозамин-6-фосфатсинтазу. Для ферментативного синтеза лакто-N-тетраозы штамм выращивали в определенной среде, содержащей минеральные соли и включающей в качестве источника углерода 2% глюкозы. При необходимости добавляли антивспениватель. Величину рН регулировали добавлением 25% раствора аммиака. Лактозу добавляли поэтапно до достижения концентрации 15 мМ из резервуара лактозы с концентрацией 216 г/л; концентрацию лактозы в культуральной среде поддерживали постоянной способом ферментации с вытеснением (throw-out). Остаточную лактозу и лакто-N-триозу II, накапливаемые в способе в качестве побочных продуктов, подвергали гидролизу под действием второго штамма Е. coli, который добавляли в биологический реактор (ферментатор). Этот штамм экспрессировал функциональную бета-лактамазу, бета-N-ацетилгексозамидидазу (bbhl от Bifidobacterium bifidum JCM1254) и функциональный gal-оперон, подходящие для разложения моносахаридов (ЕР 2845905 А).Lacto-N-tetraose was obtained by fermentation in the presence of a genetically modified strain of E. coli BL21 (DE3) ΔlacZ, into the genome of which the genes necessary for the synthesis of lacto-N-tetraose in vivo were inserted, namely: N-acetylglucosamine glycosyltransferase (IgtA from Neisseria meningitidis MC58), β-1,3-galactosyltransferase (wbdO from Salmonella enterica subsp. salamae serovar Greenside), lacY from E. coli K12, as well as UDP-glucose-4-epimerase galE and UTP-glucose-1-phosphateuridyl- galU transferase from E. coli K12. In addition, the galS gene encoding glucosamine-6-phosphate synthase was overexpressed. For the enzymatic synthesis of lacto-N-tetraose, the strain was grown in a specific medium containing mineral salts and 2% glucose as a carbon source. Antifoam was added if necessary. The pH value was adjusted by adding a 25% ammonia solution. Lactose was added in stages until a concentration of 15 mM was reached from a lactose reservoir with a concentration of 216 g/L; The lactose concentration in the culture medium was maintained constant using the throw-out fermentation method. Residual lactose and lacto-N-triose II, accumulated in the method as by-products, were subjected to hydrolysis under the influence of a second E. coli strain, which was added to a biological reactor (fermenter). This strain expressed a functional beta-lactamase, beta-N-acetylhexosamidase (bbhl from Bifidobacterium bifidum JCM1254) and a functional gal operon suitable for monosaccharide degradation (EP 2845905 A).

Клетки отделяли от ферментационного бульона, и жидкость, содержащую лакто-N-тетраозу, очищали до чистоты 75-80%, определяемой по массовому балансу, в соответствии с процедурой, описанной в Примере 2.The cells were separated from the fermentation broth and the liquid containing lacto-N-tetraose was purified to 75-80% purity, determined by mass balance, according to the procedure described in Example 2.

Загрязняющие углеводные побочные продукты, получаемые при неэффективном ферментативном разрушении и переработке, удаляют хроматографией с псевдодвижущимся слоем (ПДС) как указано в публикации WO 2015/049331. В альтернативном варианте лакто-N-тетраозу очищали кристаллизацией из изопропанола. Для кристаллизации раствор, содержащий лакто-N-тетраозу, концентрировали испарением до достижения 20% концентрации и высушивали распылением. В устройстве для распылительной сушки NUBILOSA LTC-GMP (NUBILOSA, Konstanz, Germany) раствор пропускали в токе азота через сопла устройства для распылительной сушки, температура впускных отверстий которых составляла 130°С, причем поток продукта регулировали для поддержания выходной температуры, составляющей от 67°С до 68°С.Contaminating carbohydrate by-products resulting from inefficient enzymatic degradation and processing are removed by pseudo-moving bed chromatography (PMBC) as described in WO 2015/049331. Alternatively, lacto-N-tetraose was purified by crystallization from isopropanol. For crystallization, the solution containing lacto-N-tetraose was concentrated by evaporation to a 20% concentration and spray dried. In the NUBILOSA LTC-GMP spray dryer (NUBILOSA, Konstanz, Germany), the solution was passed under a stream of nitrogen through the spray dryer nozzles, the inlet temperature of which was 130°C, and the product flow was controlled to maintain an outlet temperature of 67°C From up to 68°C.

В смесь изопропанола и воды добавляли твердое вещество (3:1 (об./об.)) в отношении 1 кг порошка на 12 л изопропанола/воды. Суспензии энергично перемешивали, нерастворимую лакто-N-тетраозу отфильтровывали и сушили при 40°С. Из вещества чистотой 73-89% кристаллизованную лакто-N-тетраозу очищали до приблизительно 95% с выходом 85%. Сахар растворяли в воде до достижения концентрации 25% и последовательно пропускали через фильтр с порогом пропускания 6 кДа (ультрафильтрационный модуль Pall Microza SIP-2013, Pall Corporation, Dreieich, Germany) и стерилизующий фильтр с порогом пропускания 0,2 мкм. Твердое вещество получали распылительной сушкой стерильного вещества в условиях, описанных выше.The solid (3:1 (v/v)) was added to a mixture of isopropanol and water at a ratio of 1 kg of powder per 12 L of isopropanol/water. The suspensions were vigorously stirred, and insoluble lacto-N-tetraose was filtered off and dried at 40°C. From a 73-89% pure material, crystallized lacto-N-tetraose was purified to approximately 95% with a yield of 85%. Sugar was dissolved in water to achieve a concentration of 25% and sequentially passed through a filter with a transmission threshold of 6 kDa (Pall Microza SIP-2013 ultrafiltration module, Pall Corporation, Dreieich, Germany) and a sterilizing filter with a transmission threshold of 0.2 μm. The solid was prepared by spray drying the sterile material under the conditions described above.

Пример 4Example 4

Очистка 3'- и 6'-сиалиллактозы от ферментационного бульонаPurification of 3'- and 6'-sialyllactose from fermentation broth

Для получения 3'-сиалиллактозы и 6'-сиалиллактозы применяли рекомбинантные штаммы Е. coli BL21 (DE3) ΔlacZ. Штаммы имели общие генетические модификации: хромосомную конститутивную экспрессию глюкозамин-6-фосфатсинтазы GlmS от Е. coli, N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы SIM975 от Synechocystis sp., глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазы Gna1 от Saccharomyces cerevisiae, фосфоенолпируватсинтазы PpsA от Е. coli, а также N-ацетилнейраминатсинтазы NeuB и синтетазы СМР-сиаловой кислоты NeuA от Campylobacter jejuni. Дополнительно, в геном штамма BL21 были интегрированы гены, кодирующие лактозопермеазу LacY от Е. coli, cscB (сахарозопермеазу), cscK (фруктокиназу), cscA (сахарозогидролазу) и cscR (регулятор транскрипции) от Е. coli W, и функциональный да/-оперон, состоящий из генов galE (UDP-глюкозо-4-эпимеразы), galT (галактозо-1-фосфатуридилилтрансферазы), galK (галактокиназы) и galM (галактозо-1-эпимеразы) от Е. coli K12, которые были конститутивно экспрессированы.To obtain 3'-sialyllactose and 6'-sialyllactose, recombinant E. coli strains BL21 (DE3) ΔlacZ were used. The strains had common genetic modifications: chromosomal constitutive expression of glucosamine-6-phosphate synthase GlmS from E. coli, N-acetylglucosamine-2-epimerase SIM975 from Synechocystis sp., glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase Gna1 from Saccharomyces cerevisiae, phosphoenolpyruvate synthase PpsA from E. coli, as well as N-acetylneuraminate synthase NeuB and CMP-sialic acid synthetase NeuA from Campylobacter jejuni. Additionally, genes encoding lactose permease LacY from E. coli, cscB (sucrose permease), cscK (fructokinase), cscA (sucrose hydrolase) and cscR (transcription regulator) from E. coli W, and a functional da/-operon were integrated into the genome of strain BL21 , consisting of the galE (UDP-glucose-4-epimerase), galT (galactose-1-phosphate uridylyltransferase), galK (galactokinase) and galM (galactose-1-epimerase) genes from E. coli K12, which were constitutively expressed.

Штамм, синтезирующий 3'-сиалиллактозу, содержит ген альфа-2,3-сиалилтрансферазы от Vibrio sp. JT-FAJ-16, а штамм, продуцирующий 6'-сиалиллактозу, содержит ген альфа-2,6-сиалилтрансфераз plsT6 от Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-119.The strain synthesizing 3'-sialyllactose contains the alpha-2,3-sialyltransferase gene from Vibrio sp. JT-FAJ-16, and the 6'-sialyllactose-producing strain contains the alpha-2,6-sialyltransferase gene plsT6 from Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-119.

Штаммы, продуцирующие сиалиллактозу, выращивали в определенной среде, содержащей минеральные соли и включающей в качестве источника углерода 2% сахарозы. Загружаемый раствор сахарозы (500 г/л), подаваемый в этапе загрузки периодического способа, был дополнен 8 мМ MgSO₄, 0,1 мМ CaCl₂, редкими элементами и 5 г/л NH₄Cl.Strains producing sialyllactose were grown in a specific medium containing mineral salts and 2% sucrose as a carbon source. The sucrose feed solution (500 g/L), supplied in the loading step of the batch process, was supplemented with 8 mM MgSO ₄ , 0.1 mM CaCl ₂ , trace elements and 5 g/L NH ₄ Cl.

Для получения сиалиллактозы использовали сырье, содержащее лактозу в концентрации 216 г/л. Величину рН регулировали добавлением раствора аммиака (25% об./об.). Ферментацию партии сырья проводили при 30°С при постоянной аэрации и перемешивании. Для удаления остаточной лактозы по окончании ферментации в реактор ферментации добавляли р-галактозидазу. Полученные моносахариды усваивались продуцирующим штаммом.To obtain sialyllactose, we used raw materials containing lactose at a concentration of 216 g/l. The pH value was adjusted by adding ammonia solution (25% v/v). Fermentation of a batch of raw materials was carried out at 30°C with constant aeration and stirring. To remove residual lactose at the end of fermentation, p-galactosidase was added to the fermentation reactor. The resulting monosaccharides were absorbed by the producing strain.

Не содержащую клеток жидкость затем подвергали деионизации способом ионообменной хроматографии. Сначала на сильной катионообменной смоле, находящейся в Н+-форме (Lewatit S 2568 (Lanxess, Cologne, Germany), в объеме 200 л удаляли катионные загрязняющие вещества. Полученный раствор доводили до рН 7,0 добавлением NaOH. На втором этапе из раствора с помощью сильной анионообменной смолы Lewatit S 6368 S (Lanxess, Cologne, Germany), находящейся в хпоридной форме, удаляли анионы и нежелательные окрашивающие вещества. Объем слоя ионообменного устройства составлял 200 л. Во втором этапе фильтрования с помощью фильтра для фильтрования в тангенциальном потоке (отсечение по молекулярной массе 150 кДа) (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany) удаляли осадки, полученные при подкислении раствора. Для концентрирования сахара раствор подвергали нанофильтрации на устройстве Dow FILMTECH NF270-4040 (Inaqua, Monchengladbach, Germany) или в альтернативном варианте с помощью мембраны Trisep 4040-XN45-TSF (отсечение по молекулярной массе 0,5 кДа) (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany). С помощью последней от продукта отделяли моносахарид N-ацетилглюкозамин, получаемый при ферментации и загрязняющий раствор сиалиллактозы. Концентрированный раствор сиалиллактозы затем обрабатывали активированным углем (CAS:7440-44-0, Carl Roth, Karlsruhe, Germany) для удаления окрашивающих веществ, таких как продукты реакции Майяра и альдольной конденсации. Для отделения сиалиллактозы от побочных продуктов, образующихся при ферментации, таких как сиаловая кислота и N-ацетилглюкозамин, раствор фильтровали с помощью мембраны с отсечением по молекулярной массе 1 кДа GE4040F30 (GE water & process technologies, Ratingen, Germany) и затем подвергали диафильтрации до достижения проводимости от 0,6 до 0,8 мС⋅м^-1. Разбавленный раствор концентрировали на роторном испарителе до концентрации приблизительно 300 г/л. В итоговом хроматографическом разделении отделяли другие загрязняющие сахара, такие как дисиалиллактоза. Сконцентрированный таким образом раствор наносили на слабую анионообменную смолу, находящуюся в ацетатной форме (Amberlite FPA51, Dow Chemical, Michigan, USA). Несмотря на то, что сиалиллактоза редко связывается со смолой, дисиалиллактоза адсорбируется на смоле. Таким образом, сиалиллактозу элюируют 10 мМ ацетатом аммония, в то время как дисиалиллактозу элюируют 1 М ацетатом аммония. Для удаления ацетата аммония сиалиллактозу осаждают 10-кратным избытком этанола. Твердую фракцию отфильтровывали и сушили.The cell-free liquid was then deionized by ion exchange chromatography. First, cationic pollutants were removed using a strong cation exchange resin in the H+ form (Lewatit S 2568 (Lanxess, Cologne, Germany) in a volume of 200 l. The resulting solution was adjusted to pH 7.0 by adding NaOH. In the second stage, from the solution with Anions and unwanted colorants were removed using a strong anion exchange resin Lewatit S 6368 S (Lanxess, Cologne, Germany), in chloride form. molecular weight 150 kDa) (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany) the precipitates obtained by acidifying the solution were removed.To concentrate the sugar, the solution was subjected to nanofiltration using a Dow FILMTECH NF270-4040 device (Inaqua, Monchengladbach, Germany) or alternatively using a membrane Trisep 4040-XN45-TSF (molecular weight cut-off 0.5 kDa) (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany) The latter was used to separate the fermentation monosaccharide N-acetylglucosamine and the contaminating sialyllactose solution from the product. The concentrated sialyllactose solution was then treated with activated carbon (CAS:7440-44-0, Carl Roth, Karlsruhe, Germany) to remove coloring substances such as Maillard reaction products and aldol condensation. To separate sialyllactose from fermentation by-products such as sialic acid and N-acetylglucosamine, the solution was filtered using a 1 kDa molecular weight cutoff membrane GE4040F30 (GE water & process technologies, Ratingen, Germany) and then diafiltered until conductivity from 0.6 to 0.8 mS⋅m ^-1 . The diluted solution was concentrated on a rotary evaporator to a concentration of approximately 300 g/L. The final chromatographic separation separated out other contaminating sugars such as disialyl lactose. The solution thus concentrated was applied to a weak anion exchange resin in acetate form (Amberlite FPA51, Dow Chemical, Michigan, USA). Although sialyllactose rarely binds to the resin, disialyl lactose is adsorbed to the resin. Thus, sialyllactose is eluted with 10 mM ammonium acetate, while disialyl lactose is eluted with 1 M ammonium acetate. To remove ammonium acetate, sialyllactose is precipitated with a 10-fold excess of ethanol. The solid fraction was filtered and dried.

Окончательную обработку продукта производили пропусканием 20% раствора сиалиллактозы последовательно через фильтр с отсечением по массе 6 кДа (ультрафильтрационный модуль Pall Microza SIP-2013, Pall Corporation, Dreieich, Germany) и стерилизующий фильтр с размером пор 0,2 мкм.The final processing of the product was carried out by passing a 20% sialyllactose solution sequentially through a 6 kDa filter (Pall Microza SIP-2013 ultrafiltration module, Pall Corporation, Dreieich, Germany) and a sterilizing filter with a pore size of 0.2 μm.

Часть раствора сушили распылением с помощью устройства для распылительной сушки Buchi (Buchi Mini Spray Dryer B-290) (Buchi, Essen, Germany) при следующих параметрах: температура впускного отверстия: 130°С, выходная температура 67°С-71°С, поток газа 670 л/час, аспиратор 100%.A portion of the solution was spray dried using a Buchi spray dryer (Buchi Mini Spray Dryer B-290) (Buchi, Essen, Germany) with the following parameters: inlet temperature: 130°C, outlet temperature 67°C-71°C, flow gas 670 l/hour, aspirator 100%.

Чистота высушенной распылением 6'-сиалиллактозы составила 91%, в то время как чистота материала, содержащего 3'-сиалиллактозу, составила 93%.The purity of the spray-dried 6'-sialyllactose was 91%, while the purity of the material containing 3'-sialyllactose was 93%.

Пример 5Example 5

Препараты смесей НМОNMO mixture preparations

Смеси НМО были получены из твердых продуктов. Для этого единичные НМО сушили распылительной сушкой и смешивали полученные порошки. Смесь НМО I содержала 2'-фукозиллактозу и лакто-N-тетраозу в отношении 70% к 30%; смесь НМО II содержала 2'-фукозиллактозу (52%), 3-фукозиллактозу (13%), лакто-N-тетраозу (26%), 3'-сиалиллактозу (4%) и 6'-сиалиллактозу (5%). Смешанные порошки растворяли в воде, получая 20% раствор сахара, и вновь сушили распылительной сушкой в устройстве Buchi для распылительной сушки как описано в Примере 4.HMO mixtures were obtained from solid products. For this purpose, single NMOs were spray dried and the resulting powders were mixed. The HMO I mixture contained 2'-fucosyllactose and lacto-N-tetraose in a ratio of 70% to 30%; HMO II mixture contained 2'-fucosyllactose (52%), 3-fucosyllactose (13%), lacto-N-tetraose (26%), 3'-sialyllactose (4%) and 6'-sialyllactose (5%). The mixed powders were dissolved in water to form a 20% sugar solution and again spray dried in a Buchi spray dryer as described in Example 4.

Пример 6Example 6

Получение характеристик высушенных распылением олигосахаридов женскогоCharacterization of spray-dried female oligosaccharides

молокаmilk

6.1 Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)6.1 Differential scanning calorimetry (DSC)

Термические изменения высушенных распылением олигосахаридов женского молока, а именно: 3-фукозиллактозы, 6'-сиалиллактозы, 3'-сиалиллактозы, лакто-N-тетраозы, и высушенных распылением смесей олигосахаридов женского молока, смеси (смесь НМО I) 2'-фукозиллактозу и лакто-N-тетраозы и смеси (смесь НМО II) 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, лакто-N-тетраозы, 6'-сиалиллактозы, 3'-сиалиллактозы, соответственно, регистрировали способом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) с помощью калориметра Mettler Toledo 821е (Mettler Toledo, Giessen, Germany).Thermal changes of spray-dried human milk oligosaccharides, namely: 3-fucosyllactose, 6'-sialyllactose, 3'-sialyllactose, lacto-N-tetraose, and spray-dried mixtures of human milk oligosaccharides, mixture (HMO mixture I) 2'-fucosyllactose and lacto-N-tetraose and mixtures (HMO II mixture) of 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose, lacto-N-tetraose, 6'-sialyllactose, 3'-sialyllactose, respectively, were recorded by differential scanning calorimetry (DSC) using a calorimeter Mettler Toledo 821е (Mettler Toledo, Giessen, Germany).

Калориметр Mettler Toledo 821e (Mettler Toledo, Giessen, Germany) применяли для определения термических изменений высушенных распылением продуктов (температуры стеклования (Tg), а также экзо- и эндотермических превращений).A Mettler Toledo 821e calorimeter (Mettler Toledo, Giessen, Germany) was used to determine thermal changes in spray-dried products (glass transition temperature (Tg) and exothermic and endothermic transformations).

Приблизительно 25 мг высушенных распылением олигосахаридов женского молока анализировали в гофрированных тиглях из Al (Mettler Toledo, Giessen, Germany). Образец охлаждали до 0°С со скоростью 10 К/мин и повторно нагревали до 100°С при скорости развертки, составляющей 10 К/мин. После охлаждения образцов до 0°С во втором цикле нагревания образцы повторно нагревали до 150°С. За температуру стеклования (Tg) принимали среднюю величину эндотермического сдвига базовой линии сканирования во время нагревания. Экзотермические и эндотермические пики обозначали в виде пиковых температур и нормализованной энергии изменения.Approximately 25 mg of spray-dried human milk oligosaccharides were analyzed in Al corrugated crucibles (Mettler Toledo, Giessen, Germany). The sample was cooled to 0°C at a rate of 10 K/min and reheated to 100°C at a sweep rate of 10 K/min. After cooling the samples to 0°C in the second heating cycle, the samples were reheated to 150°C. The glass transition temperature (Tg) was taken to be the average value of the endothermic shift of the scanning baseline during heating. Exothermic and endothermic peaks were denoted as peak temperatures and normalized energy of change.

В первом цикле нагревания во всех образцах наблюдали основной переход в стеклообразное состояние в полном тепловом потоке, что было показано основной ступенью перехода на отрезке приблизительно 48-58°С; в большинстве образцов основной переход в стеклообразное состояние, наблюдаемый в первом цикле нагревания, повторялся во втором цикле нагревания. Результаты анализа ДСК представлены в Таблице 4.In the first heating cycle, a main transition to the glassy state was observed in all samples at full heat flow, which was shown by the main transition stage at approximately 48-58°C; In most samples, the major glass transition observed in the first heating cycle was repeated in the second heating cycle. The results of the DSC analysis are presented in Table 4.

В первом цикле нагревания был обнаружен пик эндотермической релаксации 3-фукозиллактозы после достижения Tg. Tg лакто-N-тетраозы, обнаруженная во втором цикле нагревания и составляющая приблизительно 79°С, была гораздо выше Tg других образцов. Это может быть вызвано эндотермическим изменением во время первого цикла нагревания, происходящим при приблизительно 89°С (-6,04 Дж/г). Как и у 3-фукозиллактозы, пик эндотермической релаксации 6'-сиалиллактозы был обнаружен после достижения Tg, однако в этом образце при 77°С (-0,22 Дж/г) происходило дополнительное эндотермическое изменение. В 3'-сиалиллактозе и смеси НМО I эндотермические изменения не были обнаружены, и в смеси НМО II эндотермическое изменение происходило в течение первого цикла нагревания при 79°С (0,34 Дж/г).In the first heating cycle, a peak of endothermic relaxation of 3-fucosyllactose was detected after reaching Tg. The Tg of lacto-N-tetraose found in the second heating cycle to be approximately 79°C was much higher than the Tg of the other samples. This may be caused by an endothermic change during the first heating cycle, occurring at approximately 89°C (-6.04 J/g). Like 3-fucosyllactose, the peak endothermic relaxation of 6'-sialyllactose was detected after reaching the Tg, but in this sample an additional endothermic change occurred at 77°C (−0.22 J/g). In 3'-sialyllactose and the HMO I mixture, no endothermic change was detected, and in the HMO II mixture, an endothermic change occurred during the first heating cycle at 79°C (0.34 J/g).

6.2 Порошковый рентгеноструктурный анализ6.2 Powder X-ray diffraction analysis

Для исследования морфологии лиофилизированных продуктов применяли широкоугольный порошковый рентгеноструктурный анализ (англ. X-ray powder diffraction, сокращенно XRD). Для анализа применяли рентгеновский дифрактометр Empyrean (Panalytical, Almelo, The Netherlands), снабженный медным анодом (45 кВ, 40 мА, эмиссия K_α1 при длине волны 0,154 нм) и детектор PIXcel3D. Приблизительно 100 мг высушенных распылением образцов анализировали в отраженном свете в диапазоне углов 2θ от 5 до 45° с шагом 2θ, составляющим 0,04°, и при времени подсчета 100 секунд за шаг.Wide-angle X-ray powder diffraction (XRD) was used to study the morphology of lyophilized products. An Empyrean X-ray diffractometer (Panalytical, Almelo, The Netherlands) equipped with a copper anode (45 kV, 40 mA, K _α1 emission at 0.154 nm) and a PIXcel3D detector were used for analysis. Approximately 100 mg of spray-dried samples were analyzed by reflected light over a 2θ angle range of 5 to 45° with a 2θ step of 0.04° and a counting time of 100 seconds per step.

Все отдельно взятые олигосахариды, а также смеси НМО I и II имели полностью аморфное состояние (Фиг. 1-6). Для лакто-N-тетраозы второй (аморфный) сигнал был обнаружен в диапазоне приблизительно 9-10°.All individual oligosaccharides, as well as mixtures of HMOs I and II, were completely amorphous (Fig. 1-6). For lacto-N-tetraose, a second (amorphous) signal was detected in the range of approximately 9-10°.

6.3 Лазерная дифракция6.3 Laser diffraction

Размер частиц порошка оценивали способами лазерной дифракции. Система обнаруживает рассеянный и отраженный свет с помощью массива концентрически расположенных сенсорных элементов. Затем алгоритм программного обеспечения аппроксимирует импульсы частиц, вычисляя величины z интенсивности света, который попадает на различные сенсорные элементы. Анализ выполняли с помощью устройства для определения размера агрегатов SALD-7500 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) системы лазерной дифракции (qLD) для количественных определений.The particle size of the powder was assessed by laser diffraction methods. The system detects diffuse and reflected light using an array of concentrically arranged sensor elements. The software algorithm then approximates the particle momenta by calculating z-values of the intensity of light that hits the various sensor elements. The analysis was performed using a SALD-7500 Aggregate Sizer (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) laser diffraction (qLD) system for quantitative determinations.

Небольшое количество (на кончике шпателя) каждого образца диспергировали в 2 мл изооктана и гомогенизировали обработкой ультразвуком в течение пяти минут.Дисперсию переносили в электролизер периодического действия, заполненный изооктаном, и анализировали в ручном режиме.A small amount (at the tip of a spatula) of each sample was dispersed in 2 ml of isooctane and homogenized by sonication for five minutes. The dispersion was transferred to a batch electrolyzer filled with isooctane and analyzed manually.

Сбор данных выполняли при следующих параметрах: усреднение сигнала за измерение по импульсам: 128, импульсы для накопления сигнала: 3, и интервал: 2 секунды.Data collection was performed with the following parameters: signal averaging per pulse measurement: 128, signal accumulation pulses: 3, and interval: 2 seconds.

Перед измерениями систему заполняли изооктаном. На каждом образце дисперсии измерения проводили 3 раза, вычисляя средние значения и стандартное отклонение. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения WING SALD II, версия V3.1. Поскольку показатель преломления образца был неизвестен, для определения профилей распределения размера использовали показатель преломления частиц сахара (дисахарида) (1,530). Получали значения среднего и срединного диаметра.Before measurements, the system was filled with isooctane. For each sample of variance, measurements were carried out 3 times, calculating the average values and standard deviation. Data were processed using WING SALD II software, version V3.1. Since the refractive index of the sample was unknown, the refractive index of the sugar (disaccharide) particles (1.530) was used to determine the size distribution profiles. The values of the average and median diameter were obtained.

Средние размеры частиц во всех образцах были очень близки, лишь для смеси НМО II были получены несколько более низкие значения. Характеристики размеров частиц представлены в Таблице 5. Кроме того, из распределения размера частиц следует наличие одной популяции частиц основного размера во всех образцах.The average particle sizes in all samples were very close, only slightly lower values were obtained for the HMO II mixture. Particle size characteristics are presented in Table 5. In addition, the particle size distribution implies the presence of one population of particles of the main size in all samples.

Claims

1. A nutritional composition comprising a spray-dried powder that contains at least 80% by weight. 3-fucosyllactose obtained by microbial fermentation, where the spray-dried powder contains 15% wt. water or less, and wherein the nutritional composition contains at least one additional human milk oligosaccharide (HMO), wherein said one additional HMO is a sialylated HMO.

2. The nutritional composition according to claim 1, containing at least one additional HMO, wherein said at least one additional HMO is a neutral HMO.

3. The nutritional composition according to claim 2, wherein at least one neutral HMO is selected from the group consisting of 2'-fucosyllactose, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose and lacto-N-fucopentaose I.

4. Nutritional composition according to any one of paragraphs. 1-3, wherein the at least one sialylated HMO is selected from the group consisting of 3'-sialyllactose, 6'-sialyllactose, sialyllacto-N-tetraose LST-a, LST-b, LST-c and disialyllacto-N-tetraose .

5. Nutritional composition according to any one of paragraphs. 1-4, characterized in that said nutritional composition contains at least one probiotic microorganism.

6. Nutritional composition according to any one of paragraphs. 1-5, characterized in that said spray-dried powder contains at least 85 wt.%, at least 90 wt.%, at least 93 wt.%, at least 95 wt.%. or at least 98% by weight of 3-fucosyllactose.

7. Nutritional composition according to any one of paragraphs. 1-6, in which 3-fucosyllactose is present in amorphous form.

8. Nutritional composition according to any one of paragraphs. 1-7, characterized in that the spray-dried powder contains 10 wt.%. water or less, preferably 7% wt. water or less, more preferably 5% wt. water or less.

9. Nutritional composition according to any one of paragraphs. 1-8, characterized in that said spray-dried powder does not contain genetically modified microorganisms and nucleic acid molecules derived from genetically modified microorganisms.

10. Nutritional composition according to any one of paragraphs. 1-9, which is an infant formula.

11. A method for producing a spray-dried powder for a nutritional composition according to any one of claims. 1-10, where the method includes the following steps:

a) purification of 3-fucosyllactose from the fermentation broth;

b) providing an aqueous solution containing the 3-fucosyllactose of step a); And

c) subjecting said solution to step b) to spray drying.

12. The method according to claim 11, in which stage a), which is the purification of 3-fucosyllactose from the fermentation broth, includes as a first stage:

i) removing microbial cells from the fermentation broth to obtain a clarified process stream;

and step a) further includes optionally one or more of the following steps:

ii) subjecting said clarified process stream to at least one ultrafiltration;

iii) at least once treating said clarified process stream with a cation exchange resin and/or at least once treating with an anion exchange resin;

iv) subjecting said clarified process stream to at least one nanofiltration and/or diafiltration;

v) subjecting said clarified process stream to at least one electrodialysis;

vi) treating said clarified process stream with activated carbon at least once; and/or

vii) subjecting said clarified process stream at least once to crystallization and/or precipitation.

13. The method according to claim 11 or 12, in which the aqueous solution contains 3-fucosyllactose in an amount of at least 20% w/v, 30% w/v, 35% w/v. and up to 45% w/v, 50% w/v, 60% w/v.

14. Method according to any one of paragraphs. 11-13, wherein the aqueous solution containing 3-fucosyllactose is spray dried at a nozzle temperature of at least 110°C, preferably at least 120°C, more preferably at least 125°C and less than 150°C, preferably less than 140°C and more preferably less than 135°C.

15. Method according to any one of paragraphs. 11-14, in which the aqueous solution containing 3-fucosyllactose is spray-dried at an outlet temperature of at least 60°C, preferably at least 65°C and less than 80°C, preferably less than 70°C.