RU2810162C2 - Crystal form of 1,4-bis[1,2-benzisoselenazol-3(2h)-oh]-butane, method of its preparation and use - Google Patents
Crystal form of 1,4-bis[1,2-benzisoselenazol-3(2h)-oh]-butane, method of its preparation and use Download PDFInfo
- Publication number
- RU2810162C2 RU2810162C2 RU2021134890A RU2021134890A RU2810162C2 RU 2810162 C2 RU2810162 C2 RU 2810162C2 RU 2021134890 A RU2021134890 A RU 2021134890A RU 2021134890 A RU2021134890 A RU 2021134890A RU 2810162 C2 RU2810162 C2 RU 2810162C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- crystalline form
- solvent
- butane
- bis
- benzisoselenazol
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 239000001273 butane Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 239000013078 crystal Substances 0.000 title claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 22
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 32
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- UELHWVKBVJWUPY-UHFFFAOYSA-N 1,2-benzoselenazol-3-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)N[se]C2=C1 UELHWVKBVJWUPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 238000000634 powder X-ray diffraction Methods 0.000 claims abstract description 15
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000012296 anti-solvent Substances 0.000 claims abstract description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 6
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- JMMWKPVZQRWMSS-UHFFFAOYSA-N isopropanol acetate Natural products CC(C)OC(C)=O JMMWKPVZQRWMSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229940011051 isopropyl acetate Drugs 0.000 claims abstract description 3
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N isovaleric acid Chemical compound CC(C)CC(O)=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 28
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 abstract description 12
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 7
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 24
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 8
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 6
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 4
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical class CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 4
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N thionyl chloride Chemical compound ClS(Cl)=O FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DRUYRXYUOIXCBT-UHFFFAOYSA-N (2-carbonochloridoylphenyl) selenohypochlorite Chemical compound Cl[Se]C1=CC=CC=C1C(Cl)=O DRUYRXYUOIXCBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 2-[6-(diethylamino)-3-(diethyliminiumyl)-3h-xanthen-9-yl]-5-sulfobenzene-1-sulfonate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O IOOMXAQUNPWDLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IKCLCGXPQILATA-UHFFFAOYSA-M 2-chlorobenzoate Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1Cl IKCLCGXPQILATA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 3
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000012954 diazonium Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-O diazynium Chemical compound [NH+]#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 230000001875 tumorinhibitory effect Effects 0.000 description 3
- MQUNPMBEKMVOHA-UHFFFAOYSA-N (sodiodiselanyl)sodium Chemical compound [Na][Se][Se][Na] MQUNPMBEKMVOHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- -1 HBV nucleic acid Chemical class 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 206010028594 Myocardial fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 2
- 206010031023 Oral submucosal fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 206010034464 Periarthritis Diseases 0.000 description 2
- 206010050207 Skin fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 2
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229960000980 entecavir Drugs 0.000 description 2
- YXPVEXCTPGULBZ-WQYNNSOESA-N entecavir hydrate Chemical compound O.C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)C1=C YXPVEXCTPGULBZ-WQYNNSOESA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 206010028537 myelofibrosis Diseases 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 208000005207 oral submucous fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 201000001245 periodontitis Diseases 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 201000002793 renal fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001757 thermogravimetry curve Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 101710189683 Alkaline protease 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710154562 Alkaline proteinase Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 101710170876 Antileukoproteinase Proteins 0.000 description 1
- 101710142885 Arginine N-succinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000486634 Bena Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101710112538 C-C motif chemokine 27 Proteins 0.000 description 1
- 101100371033 Caenorhabditis elegans trxr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101100371034 Drosophila melanogaster Trxr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710105284 Sialin Proteins 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000003510 anti-fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 210000001099 axilla Anatomy 0.000 description 1
- 239000012490 blank solution Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- PCHPORCSPXIHLZ-UHFFFAOYSA-N diphenhydramine hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=1C=CC=CC=1C(OCC[NH+](C)C)C1=CC=CC=C1 PCHPORCSPXIHLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- RDYMFSUJUZBWLH-UHFFFAOYSA-N endosulfan Chemical compound C12COS(=O)OCC2C2(Cl)C(Cl)=C(Cl)C1(Cl)C2(Cl)Cl RDYMFSUJUZBWLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000009454 functional inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- PGXWDLGWMQIXDT-UHFFFAOYSA-N methylsulfinylmethane;hydrate Chemical compound O.CS(C)=O PGXWDLGWMQIXDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940079827 sodium hydrogen sulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000000352 storage cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003746 surface roughness Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент Китая №201910550238.4 «КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ ФОРМА 1,4-БИС[1,2-БЕНЗИЗОСЕЛЕНАЗОЛА-3(2Н)-ОН]-БУТАНА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ», поданной 24 июня 2019 г. в Национальное Управление Интеллектуальной Собственности Китая, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. This application claims priority based on Chinese Patent Application No. 201910550238.4 “CRYSTAL FORM OF 1,4-BIS[1,2-BENZISOSELENAZOLE-3(2H)-OH]-BUTANE, METHOD FOR ITS PREPARATION AND USE,” filed on June 24, 2019. to the National Intellectual Property Administration of China, which is incorporated herein by reference in its entirety.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИTECHNICAL FIELD
Настоящее изобретение относится к области получения кристаллической формы и, в частности, к кристаллической форме 1,4-бис[1,2-бензизоселеназол-3(2H)-он]-бутана, способу ее получения и применения.The present invention relates to the field of obtaining a crystalline form and, in particular, to a crystalline form of 1,4-bis[1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one]-butane, a method for its preparation and use.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART
Структура 1,4-бис[1,2-бензизоселеназол-3(2H)-он]-бутана показана ниже:The structure of 1,4-bis[1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one]-butane is shown below:
Данное соединение широко применяют, например: 1) при изготовлении лекарственных средств для предварительного лечения различных фиброзных заболеваний, таких как фиброз печени, фиброз легких, фиброз почек, миелофиброз, фиброз кожи, муковисцидоз, подслизистый фиброз полости рта или фиброз миокарда; 2) при изготовлении косметических средств для лечения фиброза кожи; 3) при изготовлении лекарственных средств для профилактики и лечения артрита, таких как лекарственных средств для профилактики и лечения ревматического артрита, ревматоидного артрита и т.д.; 4) при изготовлении лекарственных средств для профилактики и лечения воспалений, таких как лекарственных средств для профилактики и лечения пародонтита, плечелопаточного периартрита или миокардита; 5) при изготовлении лекарственных средств для лечения различных воспалительных заболеваний с фиброзом; 6) при изготовлении лекарственных средств для профилактики и лечения метастазов опухолей.This compound is widely used, for example: 1) in the manufacture of drugs for the pre-treatment of various fibrotic diseases, such as liver fibrosis, pulmonary fibrosis, renal fibrosis, myelofibrosis, skin fibrosis, cystic fibrosis, oral submucosal fibrosis or myocardial fibrosis; 2) in the manufacture of cosmetics for the treatment of skin fibrosis; 3) in the manufacture of medicines for the prevention and treatment of arthritis, such as medicines for the prevention and treatment of rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, etc.; 4) in the manufacture of medicines for the prevention and treatment of inflammation, such as medicines for the prevention and treatment of periodontitis, glenohumeral periarthritis or myocarditis; 5) in the manufacture of medicines for the treatment of various inflammatory diseases with fibrosis; 6) in the manufacture of medicines for the prevention and treatment of tumor metastases.
В ходе исследований и разработок лекарственных средств исследование кристаллических форм играет жизненно важную роль. Твердые формы лекарственного средства могут иметь значительные различия по внешнему виду, растворимости, температуре плавления, скорости растворения, биодоступности и т.п., что влияет на стабильность, биодоступность и эффективность лекарственного средства. Полиморфизм лекарственного средства является важным фактором, влияющим на качество и клиническую эффективность такого лекарственного средства. Следовательно, разработка чистой стабильной кристаллической формы имеет решающее значение и необходима для производства и применения лекарственного средства.In drug research and development, the study of crystalline forms plays a vital role. Solid forms of a drug may have significant differences in appearance, solubility, melting point, dissolution rate, bioavailability, etc., which affect the stability, bioavailability and effectiveness of the drug. Polymorphism of a drug is an important factor affecting the quality and clinical effectiveness of such a drug. Therefore, the development of a pure, stable crystalline form is critical and necessary for drug production and application.
РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯDISCLOSURE OF THE INVENTION
Для решения технических задач, описанных выше, настоящее изобретение, во-первых, обеспечивает кристаллическую форму I 1,4-бис[1,2-бензизоселеназол-3(2Н)-он]-бутана, имеющую характеристические пики при углах 2θ, составляющих 6,15±0,20°, 12,28±0,20°, 18,44±0,20°, 25,92±0,20° и 30,95±0,20°, при проведении рентгеновской порошковой дифракции с использованием излучения Cu-Kα.To solve the technical problems described above, the present invention firstly provides crystalline Form I of 1,4-bis[1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one]-butane having characteristic peaks at 2θ angles of 6 ,15±0.20°, 12.28±0.20°, 18.44±0.20°, 25.92±0.20° and 30.95±0.20°, when performing X-ray powder diffraction with using Cu-Kα radiation.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения кристаллическая форма I имеет характеристические пики при углах 2θ, составляющих 6,15±0,20°, 12,28±0,20°, 18,44±0,20°, 19,09±0,20°, 22,20±0,20°, 23,68±0,20°, 25,92±0,20°, 30,95±0,20° и 32,45±0,20°, при проведении рентгеновской порошковой дифракции с использованием излучения Cu-Kα.According to one embodiment of the present invention, crystalline Form I has characteristic peaks at 2θ angles of 6.15±0.20°, 12.28±0.20°, 18.44±0.20°, 19.09±0, 20°, 22.20±0.20°, 23.68±0.20°, 25.92±0.20°, 30.95±0.20° and 32.45±0.20°, during X-ray powder diffraction using Cu-Kα radiation.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения кристаллическая форма I имеет характеристические пики при углах 2θ, составляющих 6,15±0,20°, 12,28±0,20°, 18,44±0,20°, 19,09±0,20°, 21,89±0,20°, 22,20±0,20°, 23,68±0,20°, 25,92±0,20°, 27,50±0,20°, 30,95±0,20°, 32,45±0,20°, 35,79±0,20°, 37,37±0,20° и 37,72±0,20°, при проведении рентгеновской порошковой дифракции с использованием излучения Cu-Kα.According to one embodiment of the present invention, crystalline Form I has characteristic peaks at 2θ angles of 6.15±0.20°, 12.28±0.20°, 18.44±0.20°, 19.09±0, 20°, 21.89±0.20°, 22.20±0.20°, 23.68±0.20°, 25.92±0.20°, 27.50±0.20°, 30, 95±0.20°, 32.45±0.20°, 35.79±0.20°, 37.37±0.20° and 37.72±0.20°, when performing X-ray powder diffraction using Cu-Kα radiation.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения кристаллическая форма I имеет следующие характеристические пики при углах 2θ и относительные интенсивности при проведении рентгеновской порошковой дифракции с использованием излучения Cu-Kα:According to one embodiment of the present invention, crystalline Form I has the following characteristic peaks at 2θ angles and relative intensities when performed by X-ray powder diffraction using Cu-Kα radiation:
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения дифрактограмма рентгеновской порошковой дифракции кристаллической формы I по существу показана на Фиг. 1.According to one embodiment of the present invention, an X-ray powder diffraction pattern of crystalline Form I is shown substantially in FIG. 1.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения диаграмма ДСК-ТГА кристаллической формы I по существу показана на Фиг. 2.In one embodiment of the present invention, the DSC-TGA diagram of crystalline Form I is substantially shown in FIG. 2.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения кристаллическая форма I представляет собой монокристалл, имеющий следующие монокристаллические свойства:According to one embodiment of the present invention, crystalline Form I is a single crystal having the following single crystal properties:
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ получения кристаллической формы I, как она описана выше, включающий:The present invention further provides a method for preparing crystalline Form I as described above, comprising:
растворение 1,4-бис[1,2-бензизоселеназол-3(2Н)-он]-бутана в растворителе S1 и добавление антирастворителя S2 с получением кристаллической формы I;dissolving 1,4-bis[1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one]-butane in solvent S1 and adding antisolvent S2 to obtain crystalline form I;
где растворитель S1 выбран из ДМСО и смеси, состоящей из ДМСО и 1-10% ацетона или тетрагидрофурана (об./об.);where the solvent S1 is selected from DMSO and a mixture consisting of DMSO and 1-10% acetone or tetrahydrofuran (v/v);
растворитель S2 выбран из воды, ацетонитрила, МТБЭ, изо про пил ацетата, метанола и этилацетата при условии, что, когда растворителем S1 является ДМСО, растворитель S2 не является этилацетатом.solvent S2 is selected from water, acetonitrile, MTBE, isopropyl acetate, methanol and ethyl acetate with the proviso that when solvent S1 is DMSO, solvent S2 is not ethyl acetate.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения объемное соотношение растворителя S1 и растворителя S2 составляет от 1:0,5 до 1:2, предпочтительно 1:2 или 2:1.According to one embodiment of the present invention, the volume ratio of solvent S1 to solvent S2 is from 1:0.5 to 1:2, preferably 1:2 or 2:1.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения процедуру кристаллизации предпочтительно проводят при 30-70°С, и более предпочтительно при 40-60°С.According to one embodiment of the present invention, the crystallization procedure is preferably carried out at 30-70°C, and more preferably at 40-60°C.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает применение кристаллической формы I, как она описана выше, при изготовлении лекарственного средства или косметического средства для ингибирования активности желатиназы-2 и желатиназы-9, или при приготовлении лекарственного средства для лечения повреждающего иммунную систему заболевания или зависящего от функции иммунной регуляции или вызываемого функцией иммунной регуляции релевантного заболеванияThe present invention further provides the use of crystalline Form I as described above in the manufacture of a medicament or cosmetic for inhibiting the activity of gelatinase-2 and gelatinase-9, or in the preparation of a medicament for the treatment of a disease damaging the immune system or dependent on immune regulation function or caused by the immune regulation function of the relevant disease
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения повреждающее иммунную систему заболевание и зависящее от функции иммунной регуляции или вызываемое функцией иммунной регуляции релевантное заболевание выбраны из инфекции, вирусного гепатита, аллергических заболеваний, аутоиммунных заболеваний и синдрома приобретенного иммунодефицита.According to one embodiment of the present invention, the immune system-damaging disease and the immune regulation function-dependent or immune regulation function-induced relevant disease are selected from infection, viral hepatitis, allergic diseases, autoimmune diseases, and acquired immunodeficiency syndrome.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения лекарственное средство для ингибирования активности желатиназы-2 и желатиназы-9 выбрано из лекарственных средств для профилактики и лечения заболеваний, связанных с фиброзом, для лечения заболеваний, связанных с воспалением, для лечения связанных с фиброзом осложнений с воспалением или для лечения метастазов опухолей.According to one embodiment of the present invention, the drug for inhibiting the activity of gelatinase-2 and gelatinase-9 is selected from drugs for the prevention and treatment of diseases associated with fibrosis, for the treatment of diseases associated with inflammation, for the treatment of fibrosis-related complications with inflammation, or for treatment of tumor metastases.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения фиброзное заболевание выбрано из фиброза печени, фиброза легких, фиброза почек, миелофиброза, фиброза кожи, муковисцидоза, подслизистого фиброза полости рта и фиброза миокарда.According to a preferred embodiment of the present invention, the fibrotic disease is selected from liver fibrosis, pulmonary fibrosis, renal fibrosis, myelofibrosis, cutaneous fibrosis, cystic fibrosis, oral submucosal fibrosis and myocardial fibrosis.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения заболевание, связанное с воспалением, выбрано из гепатита В, пародонтита, ревматического артрита, ревматоидного артрита, плечелопаточного периартрита и миокардита.According to a preferred embodiment of the present invention, the inflammatory disease is selected from hepatitis B, periodontitis, rheumatoid arthritis, rheumatoid arthritis, glenohumeral periarthritis and myocarditis.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения кристаллическую форму I применяют для изготовления лекарственного средства для лечения гепатита В или рака печени.According to a preferred embodiment of the present invention, crystalline Form I is used for the manufacture of a medicament for the treatment of hepatitis B or liver cancer.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гепатит В представляет собой хронический гепатит В у взрослых с активной репликацией вируса, стойким повышенным уровнем аланинаминотрансферазы (ALT) в сыворотке крови или гистологически активными поражениями в печени, или хроническое инфекционно-компенсированное заболевание печени, вызываемое вирусом гепатита В (HBV) у детей.In one embodiment of the present invention, hepatitis B is chronic hepatitis B in adults with active viral replication, persistently elevated serum alanine aminotransferase (ALT) levels, or histologically active liver lesions, or chronic infection-compensated liver disease caused by hepatitis B virus ( HBV) in children.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения рак печени представляет собой ассоциированный с HBV рак печени или, в частности, рак печени с HBV.According to a preferred embodiment of the present invention, the liver cancer is HBV-associated liver cancer or, in particular, HBV-associated liver cancer.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей кристаллическую форму I, как она описана выше.The present invention also relates to a pharmaceutical composition containing crystalline Form I as described above.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, как она описана выше, для ингибирования активности желатиназы-2 и желатиназы-9 или для лечения вызывающего иммунное повреждение заболевания и зависящего от функции иммунной регуляции или вызываемое функцией иммунной регуляции релевантного заболевания.The present invention also relates to a pharmaceutical composition as described above for inhibiting the activity of gelatinase-2 and gelatinase-9 or for treating a disease causing immune damage and dependent on or caused by the immune regulatory function of the relevant disease.
ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫPOSITIVE EFFECTS
Настоящее изобретение относится к кристаллической форме I 1,4-бис[1,2-бензизоселеназол-3(2Н)-он]-бутана. Кристаллическая форма I имеет хорошую стабильность, она не подвержена полиморфному переходу, пригодна для изготовления фармацевтических композиций и препаратов, их применения, транспортировки и хранения, и полностью обеспечивает безопасность и качество лекарственных средств.The present invention relates to crystalline Form I of 1,4-bis[1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one]-butane. Crystalline form I has good stability, it is not subject to polymorphic transition, is suitable for the manufacture of pharmaceutical compositions and preparations, their use, transportation and storage, and fully ensures the safety and quality of medicines.
Кроме того, указанная кристаллическая форма отличается высокой растворимостью, подходящей биодоступностью, низкой токсичностью и отличной ингибирующей активностью в отношении опухолей. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что кристаллическая форма I обладает хорошей ингибирующей активностью в отношении рака печени, особенно рака печени, ассоциированного с HBV. Поскольку 80% пациентов с раком печени в Китае являются носителями HBV, применение кристаллической формы I указанного соединения при лечении рака печени имеет очевидную актуальность.In addition, this crystalline form is characterized by high solubility, suitable bioavailability, low toxicity and excellent tumor inhibitory activity. The inventors of the present invention have surprisingly found that crystalline Form I has good inhibitory activity against liver cancer, especially HBV-associated liver cancer. Since 80% of liver cancer patients in China are carriers of HBV, the use of crystalline form I of this compound in the treatment of liver cancer is of obvious relevance.
Наконец, способ получения кристаллической формы I отличается простотой, хорошей воспроизводимостью, высоким выходом и пригодностью для промышленного производства, поэтому он имеет большую прикладную ценность.Finally, the method for obtaining crystalline form I is characterized by simplicity, good reproducibility, high yield and suitability for industrial production, so it has great application value.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
На Фиг. 1 показана дифрактограмма рентгеновской порошковой дифракции (XRD) кристаллической формы I (На фиг.1 показаны результаты для двух партий кристаллической формы I).In FIG. 1 shows an X-ray powder diffraction (XRD) pattern of crystalline Form I (Figure 1 shows results for two batches of crystalline Form I).
На Фиг. 2 показана термограмма ДСК-ТГА кристаллической формы I.In FIG. Figure 2 shows a DSC-TGA thermogram of crystalline form I.
На Фиг. 3 показаны дифрактограммы XRD кристаллической формы l-a и кристаллической формы I.In FIG. Figure 3 shows XRD patterns of crystal form l-a and crystal form I.
На Фиг. 4 показаны дифрактограммы XRD кристаллической формы I после выдерживания в различных условиях.In FIG. 4 shows XRD patterns of crystalline form I after aging under various conditions.
На Фиг. 5 показана монокристаллическая структура кристаллической формы I.In FIG. Figure 5 shows the single crystal structure of crystalline Form I.
На Фиг. 6 показана схема экспериментальной модели на животных, описанной в испытательном примере 4.In FIG. 6 shows a diagram of the animal experimental model described in Test Example 4.
На Фиг. 7 показано ингибирование роста клеток HSC (%) при различных концентрациях кристаллической формы I.In FIG. Figure 7 shows the inhibition of HSC cell growth (%) at different concentrations of crystalline form I.
На Фиг. 8 показано влияние различных концентраций кристаллической формы I на массу тела (А), биохимические показатели печени (Е, F и G), активность TR (С и D) и уровни TGF (В) в моделях фиброза печени у животных.In FIG. Figure 8 shows the effects of various concentrations of crystalline form I on body weight (A), liver biochemical parameters (E, F, and G), TR activity (C and D), and TGF levels (B) in animal models of liver fibrosis.
На Фиг. 9 показана шероховатость поверхности печени (А), окрашивание гематоксилином и эозином (НЕ) (В) и окрашивание по Массону (Masson) (С) для различных концентраций кристаллической формы I в моделях фиброза печени у животных.In FIG. 9 shows liver surface roughness (A), hematoxylin and eosin (HE) staining (B), and Masson staining (C) for various concentrations of crystalline form I in animal models of liver fibrosis.
На Фиг. 10 показана экспрессия (A) α-SMA и (В) Коллагена 1А1 в печени у различных групп мышей в конце эксперимента с использованием модели фиброза печени при различных концентрациях кристаллической формы I.In FIG. 10 shows the expression of (A) α-SMA and (B) Collagen 1A1 in the liver of different groups of mice at the end of an experiment using a liver fibrosis model at various concentrations of crystalline form I.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Техническая схема настоящего изобретения будет далее подробно проиллюстрирована со ссылкой на следующие конкретные примеры. Следует понимать, что нижеследующие примеры представляют собой просто иллюстративные примеры и объясняют суть настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как ограничение объема охраны настоящего изобретения. Все методы, реализованные на основе вышеупомянутого содержания настоящего изобретения, входят в объем охраны настоящего изобретения.The technical outline of the present invention will now be illustrated in detail with reference to the following specific examples. It should be understood that the following examples are merely illustrative examples and explain the essence of the present invention, and should not be construed as limiting the scope of protection of the present invention. All methods implemented based on the above content of the present invention are included in the scope of protection of the present invention.
Если не указано иное, исходные материалы и реагенты, используемые в следующих примерах, являются коммерчески доступными продуктами или могут быть получены известными способами.Unless otherwise indicated, the starting materials and reagents used in the following examples are commercially available products or can be prepared by known methods.
Рентгеновскую порошковую дифракцию (XRD) проводили с помощью рентгеновского порошкового дифрактометра D8 Advance (Bruker) и рентгеновского порошкового дифрактометра D2 Phaser (Bruker). Платформы были оснащены детектором LynxEye. С помощью рентгеновского порошкового дифрактометра (Bruker) тестировали образцы при углах сканирования 20 от 3° до 40° с шагом 0,02°. Напряжение и ток рентгеновской трубки при тестировании составляли 40 кВ и 40 мА, соответственно.X-ray powder diffraction (XRD) was performed using a D8 Advance X-ray powder diffractometer (Bruker) and a D2 Phaser X-ray powder diffractometer (Bruker). The platforms were equipped with a LynxEye detector. Using an X-ray powder diffractometer (Bruker), samples were tested at scanning angles 20 from 3° to 40° in increments of 0.02°. The X-ray tube voltage and current during testing were 40 kV and 40 mA, respectively.
В качестве термогравиметрического анализатора использовали TGA Q500 или Discovery TGA 55 (ТА, США). Образцы помещали в находящийся в равновесии открытый алюминиевый лоток для образцов, и массу автоматически измеряли в печи ТГА. Образцы нагревали со скоростью 10°С/мин до конечной температуры.TGA Q500 or Discovery TGA 55 (TA, USA) was used as a thermogravimetric analyzer. The samples were placed in an equilibrated open aluminum sample tray and the mass was automatically measured in a TGA oven. The samples were heated at a rate of 10°C/min to the final temperature.
В качестве дифференциального сканирующего калориметра использовали DSC Q200 или Discovery DSC 250 (ТА, США). Образцы точно взвешивали и помещали в лоток для образцов для ДСК с точечным отверстием, и записывали точную массу образцов. Образцы нагревали со скоростью 10°С/мин до конечной температуры.A DSC Q200 or Discovery DSC 250 (TA, USA) was used as a differential scanning calorimeter. The samples were accurately weighed and placed in a pinhole DSC sample tray, and the exact mass of the samples was recorded. The samples were heated at a rate of 10°C/min to the final temperature.
Пример получения 1. Получение 1,4-бис[1,2-бензизоселеназол-3(2Н)-он]-бутанаPreparation example 1. Preparation of 1,4-bis[1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one]-butane
1.1 Получение 2,2'-диселенибис(бензойной кислоты)1.1 Preparation of 2,2'-diselenibis(benzoic acid)
(1) Получение диазония 2-хлорбензоата(1) Preparation of diazonium 2-chlorobenzoate
4,0 г антраниловой кислоты смешали с 40 мл соляной кислоты в объемном соотношении 1:1. Систему перемешивали на ледяной бане, поддерживая температуру ниже 5°С, затем медленно и по каплям добавили к раствору нитрита натрия (25 г) в воде (20 мл) и выдерживали в течение 2 часов с получением диазония 2-хлорбензоата. Продукт использовали непосредственно на следующей стадии без очистки.4.0 g of anthranilic acid was mixed with 40 ml of hydrochloric acid in a volume ratio of 1:1. The system was stirred in an ice bath, maintaining the temperature below 5°C, then slowly and dropwise added to a solution of sodium nitrite (25 g) in water (20 ml) and kept for 2 hours to obtain diazonium 2-chlorobenzoate. The product was used directly in the next step without purification.
(2) К 120 мл воды добавили 12 г порошка селена и гидроксида натрия, медленно добавили 10 г гидросульфита натрия при перемешивании и выдерживали в течение 2 часов с получением раствора диселенида натрия. Раствор использовали непосредственно на следующей стадии без очистки.(2) Add 12 g of selenium and sodium hydroxide powder to 120 ml of water, slowly add 10 g of sodium hydrogen sulfite while stirring, and keep for 2 hours to obtain sodium diselenide solution. The solution was used directly in the next step without purification.
(3) Раствор диазония 2-хлорбензоата, полученный на стадии (1), по каплям добавили к раствору диселенида натрия, полученному на стадии (2), при перемешивании, и смесь непрерывно перемешивали в течение 4 часов, пока полностью не прекратилось выделение азота. Реакционную смесь подкислили соляной кислотой, отфильтровали полученный осадок, промыли его водой и сушили в эксикаторе с получением 2,2'-диселенибис(бензойной кислоты). Температура плавления продукта после перекристаллизации составляла 294°С.(3) The diazonium 2-chlorobenzoate solution obtained in step (1) was added dropwise to the sodium diselenide solution obtained in step (2) while stirring, and the mixture was stirred continuously for 4 hours until the evolution of nitrogen completely ceased. The reaction mixture was acidified with hydrochloric acid, the resulting precipitate was filtered, washed with water and dried in a desiccator to obtain 2,2'-diselenibis(benzoic acid). The melting point of the product after recrystallization was 294°C.
1Н-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d6) δ: 7,33-8,04 (м, 4Н, Ph-H), 13,6 (шир., СООН); 1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 7.33-8.04 (m, 4H, Ph-H), 13.6 (br, COOH);
ИК (КВr) см-1: (О-Н) 3005, (СО2) 1672, (C-N) 1264, С=С (фенильное кольцо) 1560, 1460, 1417;IR (KBr) cm -1 : (O-H) 3005, (CO 2 ) 1672, (CN) 1264, C=C (phenyl ring) 1560, 1460, 1417;
MS-FAB (масс-спектрометрия с бомбардировкой ускоренными атомами) (m/z): 201 [1/2М+].MS-FAB (Fasted Atom Bombardment Mass Spectrometry) (m/z): 201 [1/2M + ].
1.2 Получение 2-(хлорселено)бензоилхлорида1.2 Preparation of 2-(chloroseleno)benzoyl chloride
2,2'-диселенибис(бензойную кислоту) (40,0 г), 200 мл тионилхлорида и ДМФА перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 3 часов, и затем избыток тионилхлорида отогнали на роторном испарителе. Остаток перекристаллизовали из н-гексана с получением 2-(хлорселено)бензоилхлорида с температурой плавления 66°С.2,2'-Diselenibis(benzoic acid) (40.0 g), 200 ml of thionyl chloride and DMF were stirred at reflux for 3 hours, and then the excess thionyl chloride was rotary evaporated. The residue was recrystallized from n-hexane to obtain 2-(chloroseleno)benzoyl chloride with a melting point of 66°C.
1Н-ЯМР (300 МГц, ДМСО-d6) δ: 7,33-8,16 (м, 4Н, Ph-H). 1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 7.33-8.16 (m, 4H, Ph-H).
1.3 Получение 1,4-бис[1,2-бензизоселеназол-3(2Н)-он]-бутана1.3 Preparation of 1,4-bis[1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one]-butane
3 мл 1,4-бутандиамина растворили в 50 мл ТГФ и добавили триэтиламин на ледяной бане и в атмосфере N2. 2,9 г2-(хлорселено)бензоилхлорида растворили в 60 мл ТГФ и медленно и по каплям добавили раствор 1,4-бутандиамина с получением твердого вещества желтого цвета. После добавления раствор нагрели до комнатной температуры и оставили реагировать в течение 2 часов. Твердое вещество отфильтровали и несколько раз промыли растворителем, этанолом и диэтиловым эфиром. Продукт перекристаллизовали из смеси ДМСО-вода, получив 2 г бледно-желтого твердого вещества с т.пл. 243-248°С.3 ml of 1,4-butanediamine was dissolved in 50 ml of THF and triethylamine was added in an ice bath and under N 2 atmosphere. 2.9 g of 2-(chloroseleno)benzoyl chloride were dissolved in 60 ml of THF and a solution of 1,4-butanediamine was added slowly and dropwise to obtain a yellow solid. After addition, the solution was warmed to room temperature and left to react for 2 hours. The solid was filtered and washed several times with solvent, ethanol and diethyl ether. The product was recrystallized from DMSO-water to give 2 g of a pale yellow solid, m.p. 243-248°C.
1Н-ЯМР: (300 МГц, ДМСО-d6) δ: 7,37-8,04 (м, 4Н, Ph-H), 3,75 (с, 2Н, СН2), 1,64 (с, 2Н, СН2); 1H -NMR: (300 MHz, DMSO-d6) δ: 7.37-8.04 (m, 4H, Ph-H), 3.75 (s, 2H, CH2 ), 1.64 (s, 2H, CH 2 );
MS-FAB (m/z): 451 [М]+.MS-FAB (m/z): 451 [M] + .
Пример 2. Получение кристаллической формы IExample 2 Preparation of Crystalline Form I
1,4-Бис[1,2-бензизоселеназол-3(2Н)-он]-бутан, полученный в примере получения 1, растворили в растворителе и добавили антирастворитель для получения кристаллической формы I. Объемы использованных растворителя и антирастворителя показаны в следующей таблице:1,4-Bis[1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one]-butane obtained in Preparation Example 1 was dissolved in a solvent and an antisolvent was added to obtain crystalline Form I. The volumes of solvent and antisolvent used are shown in the following table:
Дифрактограмма XRD кристаллической формы I показана на Фиг. 1. Термограмма ДСК-ТГА показана на Фиг. 2.The XRD diffraction pattern of crystalline Form I is shown in FIG. 1. The DSC-TGA thermogram is shown in Fig. 2.
Дальнейшие испытания показали, что кристаллическая форма I представляет собой монокристалл, как показано на Фиг. 5, и свойства монокристалла являются следующими:Further testing showed that crystalline form I is a single crystal, as shown in FIG. 5, and the properties of the single crystal are as follows:
Сравнительный пример 1Comparative example 1
1,4-Бис[1,2-бензизоселеназол-3(2Н)-он]-бутан, полученный в примере получения 1, растворили в ДМСО, и растворитель выпарили с получением кристаллической формы I-a, дифрактограмма XRD которой показана на Фиг. 3.1,4-Bis[1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one]-butane obtained in Preparation Example 1 was dissolved in DMSO, and the solvent was evaporated to obtain crystalline Form I-a, the XRD pattern of which is shown in FIG. 3.
Сравнительный пример 2Comparative example 2
1,4-Бис[1,2-бензизоселеназол-3(2Н)-он]-бутан, полученный в примере получения 1, растворили в хорошем растворителе ДМСО и добавили антирастворитель бутанон, этанол или этилацетат (объемное соотношение хороший растворитель:антирастворитель составляло 1:2). Из всех антирастворителей образовалась кристаллическая форма I-a.1,4-Bis[1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one]-butane obtained in Preparation Example 1 was dissolved in good solvent DMSO and antisolvent butanone, ethanol or ethyl acetate was added (good solvent:antisolvent volume ratio was 1 :2). From all antisolvents, crystalline form I-a was formed.
Сравнительный пример 3Comparative example 3
1,4-Бис[1,2-бензизоселеназол-3(2Н)-он]-бутан, полученный в примере получения 1, растворили в хорошем растворителе (10% ацетон/ДМСО или 10% тетра гидрофуран/ДМ СО) и добавили антирастворитель, этанол (объемное соотношение хорошего растворителя и антирастворителя составляло 1: 2). В обоих хороших растворителях образовалась кристаллическая форма I-a.1,4-Bis[1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one]-butane obtained in Preparation Example 1 was dissolved in a good solvent (10% acetone/DMSO or 10% tetrahydrofuran/DM CO) and antisolvent was added , ethanol (volume ratio of good solvent to antisolvent was 1:2). In both good solvents, crystalline form I-a was formed.
Испытательный пример 1. Испытание на стабильность кристаллической формы ITest Example 1: Stability Test of Crystal Form I
(1) Испытание на стабильность проводили в отношении полученной в примере 1 кристаллической формы I. Процедуры: образцы кристаллической формы I поместили в камеру для испытания на стабильность на 3-7 дней при 40°С/относительной влажности 75% и 60°С. Результаты показаны на Фиг. 4. Как видно из Фиг. 4, дифрактограмма XRD кристаллической формы I не изменилась после хранения кристаллической формы I в различных условиях, что демонстрирует, что кристаллическая форма I стабильна в условиях высокой температуры и высокой влажности и имеет хорошую стабильность.(1) Stability testing was performed on the crystalline Form I obtained in Example 1. Procedures: Samples of crystalline Form I were placed in a stability test chamber for 3 to 7 days at 40°C/75% relative humidity and 60°C. The results are shown in Fig. 4. As can be seen from FIG. 4, the XRD pattern of crystalline form I did not change after storing crystalline form I under different conditions, which demonstrates that crystalline form I is stable under high temperature and high humidity conditions and has good stability.
(2) Кристаллическую форму I-a, полученную в сравнительных примерах 1-3, измельчили. С помощью рентгеновского порошкового дифракционного анализа было определено, что порошок представлял собой кристаллическую форму I. Таким образом, кристаллическая форма I, как было подтверждено, является стабильной кристаллической формой 1,4-бис[1,2-бензизоселеназол-3(2Н)-он]-бутана.(2) The crystalline Form I-a obtained in Comparative Examples 1 to 3 was crushed. Using X-ray powder diffraction analysis, the powder was determined to be crystalline form I. Thus, crystalline form I was confirmed to be the stable crystalline form of 1,4-bis[1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one ]-butane.
Таким образом, кристаллическая форма I имеет хорошую стабильность, не подвержена полиморфному переходу, пригодна для изготовления фармацевтических композиций и препаратов, их применения, транспортировки и хранения, и полностью обеспечивает безопасность и качество лекарственных средств.Thus, crystalline form I has good stability, is not subject to polymorphic transition, is suitable for the manufacture of pharmaceutical compositions and preparations, their use, transportation and storage, and fully ensures the safety and quality of drugs.
Испытательный пример 2. Анализ ингибирующей активности кристаллической формы I в отношении опухоли у мышей с использованием клеток Н22Test Example 2: Analysis of the Tumor Inhibitory Activity of Crystal Form I in Mice Using H22 Cells
Кристаллическую форму I вводили в дозе 180 мг/кг: 180 мг кристаллической формы I растворили в 5 мл 5%о раствора КМЦ-Na с получением суспензии, которую вводили в дозе 5 мл/кг.Crystalline Form I was administered at a dose of 180 mg/kg: 180 mg of crystalline Form I was dissolved in 5 ml of 5% CMC-Na solution to obtain a suspension, which was administered at a dose of 5 ml/kg.
Процедуры: Выбрали контрольную группу, которой вводили холостой раствор (5%о раствор КМЦ-Na один раз в день через желудочный зонд), и группу, получающую кристаллическую форму I (180 мг/кг один раз в день через желудочный зонд). После 2 дней акклиматизации подготовленных животных случайным образом разделили на 4 группы по 10 животных в каждой. В день О клетки Н22 прививали подкожно в количестве 1×104/мышь в правую подмышечную впадину. Лечение начали через 24 ч после прививки. Ежедневно регистрировали длинный и короткий диаметры опухоли и рассчитывали размер опухоли по формуле: длинный диаметр × короткий диаметр2 × 0,5236. Массу тела измеряли каждые 2 дня. Через 21 день от начала лечения взяли кровь из глазных яблок после анестезии хлоралгидратом. Мышей умерщвляли и опухоли быстро собирали. В конце эксперимента опухоли взвесили для обобщения с соответствующими статистическими данными, приведенными в следующей таблице:Procedures: A control group was selected to receive a blank solution (5% CMC-Na solution once daily by gavage) and a group receiving crystalline Form I (180 mg/kg once daily by gavage). After 2 days of acclimatization, the prepared animals were randomly divided into 4 groups of 10 animals each. On day O, H22 cells were inoculated subcutaneously at 1×10 4 /mouse into the right axilla. Treatment began 24 hours after vaccination. The long and short diameters of the tumor were recorded daily and the tumor size was calculated using the formula: long diameter × short diameter 2 × 0.5236. Body weight was measured every 2 days. 21 days after the start of treatment, blood was taken from the eyeballs after anesthesia with chloral hydrate. Mice were sacrificed and tumors were rapidly collected. At the end of the experiment, the tumors were weighed for summarization with the corresponding statistics shown in the following table:
Ингибирование роста опухоли кристаллической формой I у мышей с использованием клеток Н22 (n=10)Inhibition of tumor growth by crystalline form I in mice using H22 cells (n=10)
Из приведенных выше результатов видно, что ингибирование роста опухоли кристаллической формой I, полученной согласно настоящему изобретению, составляет до 88,7%. Предполагают, что конкретная кристаллическая форма дополнительно улучшает терапевтическую активность указанного соединения. Предположительно, причина может заключаться в том, что в кристаллической форме I значительно снижено количество примесей, которые неблагоприятны для активности или являются вредными, и кристаллическая форма I также обладает хорошей совместимостью с растворителями при введении, в результате чего облегчается абсорбция препарата.From the above results, it can be seen that the tumor growth inhibition of the crystalline Form I obtained according to the present invention is up to 88.7%. The particular crystalline form is believed to further improve the therapeutic activity of the compound. Presumably, the reason may be that the crystalline form I has significantly reduced the amount of impurities that are unfavorable to activity or are harmful, and the crystalline form I also has good compatibility with solvents upon administration, resulting in easier absorption of the drug.
Испытательный пример 3. Ингибирование HBV кристаллической формой ITest Example 3: HBV Inhibition by Crystalline Form I
Посев клеток: клетки HepAD38 высевали в 24-луночные планшеты с плотностью клеток, составляющей 8×104 на лунку, при этом каждая лунка содержала 500 мкл культуральной среды. Обработка: через 9 ч после посева производили наблюдение за клетками. Когда клетки прилипли к стенке, добавили лекарственные препараты (кристаллическую форму I или ETV (энтекавир)) с получением конечных концентраций 0,5, 1, 5, 20 и 50 мкМ. Клетки культивировали в течение 48 часов, дважды промыли PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), добавили вышеуказанные препараты и культивировали еще 48 часов. Через 48 часов супернатант собрали и определяли ДНК HBV, HBsAg и НВеАд в супернатанте. Предпочтительно определяли ДНК HBV.Cell seeding: HepAD38 cells were seeded in 24-well plates at a cell density of 8×10 4 per well, with each well containing 500 μl of culture medium. Treatment: 9 hours after seeding, the cells were observed. Once the cells were adherent to the wall, drugs (crystalline form I or ETV (entecavir)) were added to produce final concentrations of 0.5, 1, 5, 20, and 50 μM. The cells were cultured for 48 hours, washed twice with PBS (phosphate-buffered saline), the above drugs were added and cultured for another 48 hours. After 48 hours, the supernatant was collected and HBV DNA, HBsAg and HBeAd in the supernatant were determined. Preferably, HBV DNA was determined.
Анализ ДНК HBV в супернатанте клеточной культуры: согласно набору для экстракции вирусных нуклеиновых кислот от компании TransGen (TransGen's Viral Nucleic Acid Extraction kit), нуклеиновую кислоту экстрагировали и определяли количество вирусной ДНК с помощью способа SYBR green qPCR (Получение флуоресцирующего зеленым цветом комплекса ДНК с цианиновым красителем SYBR green для визуализации ДНК).Analysis of HBV DNA in cell culture supernatant: According to TransGen's Viral Nucleic Acid Extraction kit, nucleic acid was extracted and the amount of viral DNA was determined using the SYBR green qPCR method. SYBR green dye for DNA visualization).
Анализ HBsAg и HBeAg в супернатанте клеточной культуры: анализ представлял собой иммунофлуоресцентный метод исследования с временным разрешением (ELISA) в соответствии с наборами для анализа HBsAg и HBeAg от компании РЕ Corporation.Analysis of HBsAg and HBeAg in Cell Culture Supernatant: The assay was a time resolved immunofluorescence assay (ELISA) according to the HBsAg and HBeAg Assay Kits from PE Corporation.
Процедуры определения ДНК HBV, РНК HBV, HBsAg и HBeAg в супернатанте клеточной культуры были следующими:The procedures for determining HBV DNA, HBV RNA, HBsAg and HBeAg in cell culture supernatant were as follows:
1) Необходимое количество клеток высевали в 12-луночный планшет. Через 24 ч среду заменяли свежей средой, не содержащей двойных антител или ФБС (FBS). Плазмиды HBV трансфицировали с помощью Lipo2000. Через 6 часов среду заменяли средой, содержащей двойные антитела и 10% FBS, для получения непрерывной культуры.1) The required number of cells was seeded into a 12-well plate. After 24 h, the medium was replaced with fresh medium containing no double antibodies or FBS. HBV plasmids were transfected with Lipo2000. After 6 hours, the medium was replaced with medium containing double antibodies and 10% FBS to establish a continuous culture.
Через 48 ч отобрали 1 мл супернатанта клеточной культуры для обнаружения HBsAg и HBeAg. Указанные клетки промыли по меньшей мере 5 раз с помощью PBS. Отобрали 1 мл промывочного раствора после последней промывки с помощью PBS и использовали его в качестве базового уровня для определения степени вымывания плазмид. Примечание: при промывании клеток PBS медленно добавляли в чашку вдоль стенки чашки без ресуспендирования клеток. Затем чашку осторожно встряхивали для промывания клеток, и оставшийся PBS удаляли после каждой промывки, чтобы минимизировать количество оставшихся плазмид.After 48 h, 1 ml of cell culture supernatant was collected to detect HBsAg and HBeAg. The indicated cells were washed at least 5 times with PBS. 1 ml of the wash solution from the last wash with PBS was collected and used as a baseline to determine the extent of plasmid washout. Note: When washing the cells, PBS was slowly added to the dish along the wall of the dish without resuspending the cells. The dish was then gently shaken to wash the cells, and the remaining PBS was removed after each wash to minimize the amount of remaining plasmids.
Клетки перенесли в большую чашку для культивирования и культивировали в культуральной среде в течение 3 дней. Для обнаружения ДНК HBV и РНК HBV отобрали 1 мл супернатанта клеточной культуры. Если обнаружение не производили сразу, то образцы хранили при -20°С.The cells were transferred to a large culture dish and cultured in culture medium for 3 days. To detect HBV DNA and HBV RNA, 1 ml of cell culture supernatant was collected. If detection was not made immediately, the samples were stored at -20°C.
1 мл отобранного супернатанта клеточной культуры и последний промывочный раствор PBS, которые были отобраны через 48 часов, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 минут. 200 мкл супернатанта после центрифугирования добавили к 5 мкл ДНКазы I (дезоксирибонуклеаза I) + 5 мкл буфера для ДНКазы I, хорошо перемешали и подвергли кратковременному центрифугированию. Супернатант инкубировали в течение 1 ч при 37°С, перемешивали каждые 30 мин и подвергли кратковременному центрифугированию.1 ml of the collected cell culture supernatant and the last PBS wash solution, which were collected after 48 hours, were centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes. 200 μl of the supernatant after centrifugation was added to 5 μl of DNase I (deoxyribonuclease I) + 5 μl of DNase I buffer, mixed well and subjected to brief centrifugation. The supernatant was incubated for 1 hour at 37°C, mixed every 30 minutes and subjected to short-term centrifugation.
Через 1 час добавили 5 мкл ЭДТА и систему инкубировали при 65°С в течение 10 минут, прежде чем реакция с дезоксирибонуклеазой I была остановлена.After 1 hour, 5 μl of EDTA was added and the system was incubated at 65°C for 10 minutes before the reaction with deoxyribonuclease I was stopped.
200 мкл нуклеиновой кислоты HBV в супернатанте клеточной культуры сконцентрировали до системы объемом 20 мкл с использованием набора для экстракции нуклеиновых кислот HBV от компании TransGene.200 μl of HBV nucleic acid in the cell culture supernatant was concentrated to a 20 μl system using the HBV nucleic acid extraction kit from TransGene.
Уровень ДНК HBV в супернатанте и базовый уровень плазмид в PBS после обработки ДНКазой измеряли с помощью теста ПЦР в режиме реального времени. После обратной транскрипции РНК HBV в кДНК провели тест ПЦР в режиме реального времени для определения указанного уровня.The level of HBV DNA in the supernatant and the basal level of plasmids in PBS after DNase treatment were measured using a real-time PCR test. After reverse transcription of HBV RNA into cDNA, a real-time PCR test was performed to determine the indicated level.
(1) Количественная система ДНК HBV:(1) HBV DNA quantitative system:
Всего 27 мкл (аккуратное перемешивание, кратковременное центрифугирование)Total 27 µl (gently mixing, brief centrifugation)
Положение праймера было 386-476 в S-области.The primer position was 386-476 in the S region.
(2) количественная система кДНК после обратной транскрипции РНК HBV:(2) quantitative cDNA system after reverse transcription of HBV RNA:
Всего 27 мкл (аккуратное перемешивание, кратковременное центрифугирование)Total 27 µl (gently mixing, brief centrifugation)
Количественная последовательность праймера была создана перед С-доменом/в С-домене (2297-2287).A quantitative primer sequence was designed upstream of/at the C domain (2297–2287).
Кристаллическая форма I обладает хорошим ингибирующим действием на ДНК HBV и супернатантный HBeAg. Таким образом, с помощью кристаллической формы I можно более эффективно лечить рак печени, вызванный HBV.Crystalline form I has a good inhibitory effect on HBV DNA and supernatant HBeAg. Thus, liver cancer caused by HBV can be more effectively treated with crystalline form I.
Испытательный пример 4Test case 4
Исследуемый препарат: кристаллическая форма, полученная в примере 1.Study drug: crystalline form obtained in example 1.
Животные: инбредные мыши-самцы Balb/c, в возрасте шести недель, были приобретены в Пекинском Университете, Научный центр здравоохранения, Департамент лабораторных исследований животных, номер лицензии SCXK (Jing) 2016-0010. Среда для размножения была чистой. Температура в помещении составляла 25±2°С. Мышей разводили в 12-часовом цикле свет/темнота, при этом они получали достаточное количество пищи и воды.Animals: Inbred male Balb/c mice, six weeks old, were purchased from Peking University, Health Science Center, Laboratory Animal Research Department, license number SCXK (Jing) 2016-0010. The breeding medium was clean. The room temperature was 25±2°C. Mice were bred on a 12-hour light/dark cycle while receiving adequate food and water.
Приготовление раствора для исследования на животных:Preparation of solution for animal research:
Приготовление раствора КМЦ-NaPreparation of CMC-Na solution
Смесь перемешивали с высокой скоростью мешалки. КМЦ-Na первоначально находился в виде твердого вещества, напоминающего хлопок, и постепенно растворился после перемешивания с образованием раствора, используемого в качестве растворителя.The mixture was stirred with a high speed mixer. CMC-Na was initially present as a cotton-like solid and gradually dissolved after stirring to form a solution used as a solvent.
Приготовление раствора кристаллической формы I (BS)Preparation of a solution of crystalline form I (BS)
После приготовления раствора или суспензии соединение вводили мышам в дозе 5 мл/кг.After preparing a solution or suspension, the compound was administered to mice at a dose of 5 ml/kg.
Приготовление 25% раствора ССЦPreparation of 25% SSC solution
Смесь перемешивали с высокой скоростью мешалки и после хорошего перемешивания хранили при комнатной температуре.The mixture was stirred with a high speed mixer and after good mixing, stored at room temperature.
Материалы:Materials:
BS1801 (Peking University, School of Pharmaceutical Sciences), линия клеток mHSC (Коллекция культур BeNa, Хэбэй, Китай), линия клеток AML12, фетальная бычья сыворотка (Gibco), среда DMEM (М&С), среда F12, TGF-(31 (Novoprotein), смесь культурного фактора клеток (Sigma), дексаметазон (Solarbio), четыреххлористый углерод (Beijing Ouhe Technology Co., Ltd.), оливковое масло (Macklin), сульфородамин В (Sigma), параформальдегид (Yuanye), Трис (Ameresco), натрий-карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ-Na) и фиксатор тканей животных.BS1801 (Peking University, School of Pharmaceutical Sciences), mHSC cell line (BeNa Culture Collection, Hebei, China), AML12 cell line, fetal bovine serum (Gibco), DMEM medium (M&C), F12 medium, TGF-(31 (Novoprotein ), cell culture factor mixture (Sigma), dexamethasone (Solarbio), carbon tetrachloride (Beijing Ouhe Technology Co., Ltd.), olive oil (Macklin), sulforhodamine B (Sigma), paraformaldehyde (Yuanye), Tris (Ameresco), sodium carboxymethylcellulose (CMC-Na) and animal tissue fixative.
Процедуры:Procedures:
1. Культура клеток и анализ жизнеспособности клеток1. Cell culture and cell viability assay
Жиронакапливающие клетки печени мышей (mHSC) культивировали с использованием 20% FBS в термостате при 37°С, 5% СО2. В эксперименте по пролиферации клеток плотность клеток составляла 5000 клеток на лунку, обработку проводили после индукции с применением TGF-β1 с концентрацией 5 нг/мл в течение 24 часов, а ингибирование пролиферации клеток выявляли с помощью сульфородамина В (SRB).Mouse liver fat storage cells (mHSC) were cultured using 20% FBS in an incubator at 37°C, 5% CO 2 . In the cell proliferation experiment, the cell density was 5000 cells per well, treatment was performed after induction with TGF-β1 at a concentration of 5 ng/ml for 24 hours, and inhibition of cell proliferation was detected using sulforhodamine B (SRB).
2. Иммуноблоттинг2. Immunoblotting
Клетки mHSC перенесли в чашки из расчета 106 клеток на чашку и обрабатывали через 12 ч после адгезии. Через 48 ч клетки в супернатанте собрали и объединили с адгезивными клетками. Клетки подвергали лизису на льду в течение 30 минут с использованием лизата RIPA, содержащего ингибитор протеаз, и центрифугировали при 16000 об/мин в течение 15 минут, при этом супернатант сохранили. Концентрацию клеточного лизата определяли с помощью БСА (ВСА) и добавляли определенное количество загрузочного буфера для приготовления образца белка с концентрацией 2,5 мкг/мкл. Содержание a-SMA, коллагена I и коллагена III определяли с помощью ДСН-ПААГ (SDS-PAGE).mHSC cells were transferred to dishes at a rate of 10 6 cells per dish and processed 12 hours after adhesion. After 48 h, the cells in the supernatant were collected and combined with adherent cells. Cells were lysed on ice for 30 minutes using RIPA lysate containing protease inhibitor and centrifuged at 16,000 rpm for 15 minutes, retaining the supernatant. The concentration of the cell lysate was determined using BSA (BCA) and a certain amount of loading buffer was added to prepare a protein sample at a concentration of 2.5 μg/μl. The content of a-SMA, collagen I and collagen III was determined using SDS-PAGE.
3. Исследование на животных3. Animal study
20 мышей-самцов Balb/c в возрасте 6 недель были рандомизированы в 4 группы. После ступенчатой градиентной индукции с использованием 25% CCU в течение 4 недель (три раза в неделю) приступили к лечению группы BSL (90 мг/кг) и группы BSM (180 мг/кг) один раз в день, а также контрольной и модельной группам вводили 5%о раствор КМЦ-Na. После 8 недель индукции мышей умерщвляли, собирали кровь и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут, чтобы получить сыворотку для определения TGF-β1, TrxR1, AST, ALT, ALP, TP и экспрессии (модель фиброза печени у животных показана на Фиг. 6). Часть печени фиксировали 4% параформальдегидом и подвергли иммуногистохимическому окрашиванию гематоксилином и эозином (НЕ) и окрашиванию по Массону (Masson). Определяли экспрессию α-SMA и коллагена I в ткани печени иммуногистохимически. Часть печени консервировали в жидком азоте.20 male Balb/c mice, 6 weeks old, were randomized into 4 groups. After a stepwise gradient induction using 25% CCU for 4 weeks (three times a week), the BSL group (90 mg/kg) and the BSM group (180 mg/kg) were treated once daily, as well as the control and model groups. a 5% solution of CMC-Na was introduced. After 8 weeks of induction, mice were sacrificed, blood collected and centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes to obtain serum for TGF-β1, TrxR1, AST, ALT, ALP, TP and expression (animal liver fibrosis model is shown in Fig. 6). A portion of the liver was fixed with 4% paraformaldehyde and subjected to immunohistochemical staining with hematoxylin and eosin (HE) and Masson staining. The expression of α-SMA and collagen I in liver tissue was determined by immunohistochemistry. Part of the liver was preserved in liquid nitrogen.
На Фиг. 7 показаны измеренные значения IC50, и из результата на Фиг. 7 видно, что, поскольку TGF β1 играет очень важную патологическую роль в фиброзных поражениях, а клетки HSC состоят на 5% из нормальных клеток печени, повреждение печени обычно приводит к трансформации и активации клеток HSC, при этом TGF β1 является сильным фактором фиброза. Ингибирующий эффект кристаллической формы по настоящему изобретению на клетки HSC является одним из важных факторов противофиброзного эффекта.In FIG. 7 shows the measured values of IC 50 , and from the result in FIG. 7 shows that since TGF β1 plays a very important pathological role in fibrotic lesions, and HSC cells are composed of 5% normal liver cells, liver injury usually leads to the transformation and activation of HSC cells, with TGF β1 being a strong factor in fibrosis. The inhibitory effect of the crystalline form of the present invention on HSC cells is one of the important factors for the anti-fibrotic effect.
На Фиг. 8 показаны в сравнении различные биохимические показатели и важные белковые маркеры в сыворотке после введения мышам с модельным фиброзом препарата BS (соответствующие результаты показаны в следующей таблице). Как видно из Фиг. 8 и результатов, приведенных в нижеследующей таблице, средняя масса тела мышей в модельной группе и группах лечения была значительно снижена, особенно в модельной группе, по сравнению с таковой в контрольной группе. В конце исследования средняя масса тела в каждой из четырех групп составляла 24,76±4,84 г, 14,08±1,51 г, 17,00±0,68 г и 18,04±2,23 г, соответственно.In FIG. 8 shows a comparison of various biochemical parameters and important protein markers in serum after administration of BS to fibrosis model mice (the corresponding results are shown in the following table). As can be seen from FIG. 8 and the results shown in the following table, the average body weight of mice in the model group and treatment groups was significantly reduced, especially in the model group, compared with that in the control group. At the end of the study, the average body weight in each of the four groups was 24.76 ± 4.84 g, 14.08 ± 1.51 g, 17.00 ± 0.68 g, and 18.04 ± 2.23 g, respectively.
Таблица 1. Масса тела и биохимические показатели сыворотки крови мышей для всех групп по окончании исследованияTable 1. Body weight and biochemical parameters of blood serum of mice for all groups at the end of the study
На Фиг. 9 показаны результаты иммуногистохимического окрашивания печени и тканей после проведенных экспериментов над контрольной и модельной группами, а также группой, получающей препарат BS в низкой дозе (BSL), и группой, получающей препарат BS в средней дозе (BSM). Как видно из результатов группы (А), мыши в контрольной группе продемонстрировали гладкую, глянцевую, темно-красную, мягкую поверхность печени, что указывает на нормальное состояние печени. В конце исследования мыши в модельной группе показали снижение активности, потерю массы до 43,2%, матовую, светлую, твердую и зернистую поверхность печени и фиброзное состояние, что свидетельствует об успешном создании модели. Указанные симптомы в печени мышей в группах лечения улучшились, и зернистость на поверхности печени мышей уменьшилась.In FIG. Figure 9 shows the results of immunohistochemical staining of the liver and tissues after experiments on the control and model groups, as well as the group receiving the BS drug in a low dose (BSL), and the group receiving the BS drug in a medium dose (BSM). As can be seen from the results of group (A), mice in the control group showed a smooth, glossy, dark red, soft liver surface, indicating a normal liver condition. At the end of the study, mice in the model group showed decreased activity, weight loss of up to 43.2%, matte, light, hard and granular liver surface and fibrotic condition, indicating the successful creation of the model. These symptoms in the liver of mice in the treatment groups improved, and the granularity on the surface of the liver of mice decreased.
Результаты окрашивания с помощью гематоксилина и эозина (НЕ) показывают, что клетки печени демонстрировали сильный отек и сильное воспаление в модельной группе по сравнению с контрольной группой, и большая часть граничных пластин клеток печени была разрушена (>50%); напротив, в группах BSL и BSM симптомы некроза и воспаления гепатоцитов были значительно уменьшены по сравнению с модельной группой.The results of hematoxylin and eosin (HE) staining show that liver cells showed severe swelling and severe inflammation in the model group compared with the control group, and most of the border plates of liver cells were destroyed (>50%); in contrast, in the BSL and BSM groups, the symptoms of hepatocyte necrosis and inflammation were significantly reduced compared with the model group.
Результаты окрашивания по Массону показывают, что мыши в модельной группе продемонстрировали мостовидный фиброз между портальными областями, а также образовались фиброзные промежутки; в группах BSL и BSM симптомы постепенно уменьшились по сравнению с модельной группой; контрольная группа продемонстрировала только несколько волокон вокруг портальной области.Masson staining results show that mice in the model group showed bridging fibrosis between the portal areas, and fibrotic gaps were also formed; in the BSL and BSM groups, symptoms gradually decreased compared to the model group; the control group demonstrated only a few fibers around the portal area.
На Фиг. 10 показаны экспрессия (A) α-SMA и (В) коллагена 1А1 в печени для различных групп мышей в конце эксперимента на модели фиброза печени при различных концентрациях кристаллической формы I. На Фиг. 10 по результатам окрашивания α-SMA и окрашивания коллагена 1 видно, что уровень экспрессии соответствующих белков в печени мышей в модельной группе был значительно больше по сравнению с контрольной группой, в то время как данные симптомы в группах BSL и BSM были значительно снижены, что явно значительно отличает их от модельной и контрольной групп.In FIG. 10 shows the expression of (A) α-SMA and (B) collagen 1A1 in the liver for different groups of mice at the end of the experiment in a model of liver fibrosis at various concentrations of crystalline form I. FIG. 10, based on the results of α-SMA staining and collagen 1 staining, it can be seen that the expression level of the corresponding proteins in the liver of mice in the model group was significantly higher compared with the control group, while these symptoms in the BSL and BSM groups were significantly reduced, which is clearly significantly distinguishes them from the model and control groups.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает кристаллическую форму I 1,4-бис[1,2-бензизоселеназол-3(2Н)-он]-бутана. Кристаллическая форма I имеет хорошую стабильность, пригодна для изготовления фармацевтических композиций и препаратов, их применения, транспортировки и хранения, и полностью обеспечивает безопасность и качество лекарственных средств.Thus, the present invention provides crystalline Form I of 1,4-bis[1,2-benzisoselenazol-3(2H)-one]-butane. Crystalline form I has good stability, is suitable for the manufacture of pharmaceutical compositions and preparations, their use, transportation and storage, and fully ensures the safety and quality of medicines.
Кроме того, указанная кристаллическая форма отличается высокой растворимостью, подходящей биодоступностью, низкой токсичностью и отличной ингибирующей активностью в отношении опухолей, в частности, отличается общим ингибированием у пациентов с раком печени, имеющих вирус HBV, а также эффектами функционального ингибирования в процессах фиброза печени и фиброза сердца, онкогенеза и роста опухоли. Таким образом, указанная кристаллическая форма выполняет защитную функцию в отношении всего процесса от заражения вирусом HBV до рака печени.In addition, this crystalline form is characterized by high solubility, suitable bioavailability, low toxicity and excellent tumor inhibitory activity, in particular, general inhibition in liver cancer patients with HBV virus, as well as functional inhibition effects in the processes of liver fibrosis and fibrosis heart, oncogenesis and tumor growth. Thus, said crystalline form has a protective function against the entire process from HBV infection to liver cancer.
Наконец, способ получения кристаллической формы I, раскрытый в данном документе, отличается простотой, хорошей воспроизводимостью, высоким выходом и пригодностью для промышленного производства, поэтому он имеет большую прикладную ценность.Finally, the method for obtaining crystalline Form I disclosed herein is simple, highly reproducible, high in yield, and suitable for industrial production, so it has great application value.
Примеры согласно настоящему изобретению были описаны выше. Однако настоящее изобретение не ограничивается приведенными выше примерами. Любая модификация, эквивалент, усовершенствование и т.п., сделанные без отклонения от сущности и принципов настоящего изобретения, подпадают под объем охраны настоящего изобретения.Examples according to the present invention have been described above. However, the present invention is not limited to the above examples. Any modification, equivalent, improvement, etc. made without departing from the spirit and principles of the present invention falls within the scope of protection of the present invention.
Claims (9)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910550238.4 | 2019-06-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021134890A RU2021134890A (en) | 2023-07-24 |
| RU2810162C2 true RU2810162C2 (en) | 2023-12-22 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1511834A (en) * | 2002-12-27 | 2004-07-14 | 北京大学药学院 | Immune regulation and biological therapeutic function of benzo-isoselenazole derivatives |
| CN1704409A (en) * | 2004-05-27 | 2005-12-07 | 武汉科艾硒医药科技发展有限公司 | Compound with functions of anti-fibrosis and inhibition of gelatingase activity and use thereof |
| RU2324688C2 (en) * | 2001-06-08 | 2008-05-20 | Пекинь Юниверсити | Bis-benzizo selenium zolonyl derivatives with antitumor, antiinflammatory and antithrombotic activity and their application |
| CN101781283A (en) * | 2009-01-16 | 2010-07-21 | 曾慧慧 | Thioredoxin reductase inhibiter compounds and preparation method and application thereof |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2324688C2 (en) * | 2001-06-08 | 2008-05-20 | Пекинь Юниверсити | Bis-benzizo selenium zolonyl derivatives with antitumor, antiinflammatory and antithrombotic activity and their application |
| CN1511834A (en) * | 2002-12-27 | 2004-07-14 | 北京大学药学院 | Immune regulation and biological therapeutic function of benzo-isoselenazole derivatives |
| CN1704409A (en) * | 2004-05-27 | 2005-12-07 | 武汉科艾硒医药科技发展有限公司 | Compound with functions of anti-fibrosis and inhibition of gelatingase activity and use thereof |
| CN101781283A (en) * | 2009-01-16 | 2010-07-21 | 曾慧慧 | Thioredoxin reductase inhibiter compounds and preparation method and application thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Jie He; Dongdong Li et al. "Inhibition of thioredoxin reductase by a novel series of bis-1,2-benzisoselenazol-3(2H)-ones: Organoselenium compounds for cancer therapy", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY, 2012, vol. 20(12), pp. 3816-3827. * |
| Xiaoqing Zheng, Weiwei Ma et al. "Butaselen prevents hepatocarcinogenesis and progression through inhibiting thioredoxin reductase activity", Redox Biology, 2018, vo. 14, p. 237-249. MINO R.CAIRA, Crystalline polymorphism of organic compounds, TOPICS IN CURRENT CHEMISTRY, Springer Verlag Berlin Heidelberg, 1998, V. 198, p. 163-208. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2020030143A1 (en) | Ketoamide compound and preparation method, pharmaceutical composition, and use thereof | |
| JP4698681B2 (en) | Preparation method of aminopyrimidines and salts thereof and use of drugs | |
| CN107082770A (en) | The alpha inhibitors of IRE 1 | |
| EA029781B1 (en) | 1,2,5-oxadiazoles as inhibitors of indoleamine-2,3-dioxygenase | |
| BR112015003778B1 (en) | PROPHARMACO DE TENOFOVIR, PHARMACEUTICAL COMPOSITION, AND ITS USES | |
| CN107151250B (en) | Pyrimidine seven-membered ring compound, preparation method thereof, medicinal composition and application thereof | |
| UA121161C2 (en) | Tlr7 agonist crystalline form a, preparation method and use thereof | |
| TW201010990A (en) | New combination-408 | |
| WO2020224364A1 (en) | Application of mcl1 protein inhibitor in preparation of drug for treating inflammation and neurodegenerative disease | |
| EP3680232A1 (en) | NOVEL ANTHRANILIC ACID-BASED COMPOUND, AND Pin1 INHIBITOR, THERAPEUTIC AGENT FOR INFLAMMATORY DISEASES AND THERAPEUTIC AGENT FOR CANCER THAT USE THE SAME | |
| CN112656795A (en) | Action mechanism and application of fangchinoline in resisting tuberculosis membrane melanoma | |
| RU2810162C2 (en) | Crystal form of 1,4-bis[1,2-benzisoselenazol-3(2h)-oh]-butane, method of its preparation and use | |
| EP3974418A1 (en) | Crystal form of 1,4-[bis(1,2-benzisoselenazol-3(2h)-one)]butane, preparation method therefor, and application thereof | |
| CN107488146B (en) | Isocorydine derivative and preparation method and application thereof | |
| BRPI0906248B1 (en) | compound, pharmaceutical composition to inhibit microtubule formation and method for preparing a compound | |
| WO2012075957A1 (en) | Use of phenethyl caffeate derivatives in the preparation of a medicament against tumor angiogenesis | |
| KR101934197B1 (en) | New compound having PPARα/γ dual activity and pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic disease comprising the same | |
| RU2666727C1 (en) | Hepatitis b (hbv) inhibitor | |
| WO2004026298A1 (en) | Derivatives of triptolide having high immunosuppressive effect and high water solubility, and uses thereof | |
| BR112019015394A2 (en) | SCRATCH MODULATORS AND USES OF THE SAME | |
| US20180022734A1 (en) | Sunitinib prodrug and pharmaceutical composition | |
| EP4118069A1 (en) | 2,5- or 2,6-disubstituted hydroquinone derivatives with at least one carboxy, sulfo or amido group useful as medicaments | |
| CN112778156A (en) | Bishydrazide structure compound, preparation method and application thereof | |
| BR112021009770A2 (en) | crystalline form of hepatitis b surface antigen inhibitor | |
| WO2020257982A1 (en) | 1,4-[bis(1,2-benzisoselenazole-3(2h)-one)]butane crystal form and preparation method and application therefor |