RU2809772C2

RU2809772C2 - Пищевая добавка

Info

Publication number: RU2809772C2
Application number: RU2021127553A
Authority: RU
Inventors: Реми ПРАДЕЛЬ; Антуан ДЕЛЬБРЮ
Original assignee: Микрофит
Priority date: 2019-02-22
Filing date: 2020-02-21
Publication date: 2023-12-18

Abstract

Изобретение относится к пищевой композиции для предотвращения появления когнитивных расстройств. Пищевая добавка содержит от 50 до 170 мг/г смеси стеаридоновой кислоты (SDA), альфа-линоленовой кислоты (ALA), эйкозапентаеновой кислоты (EPA) и докозагексаеновой кислоты (DHA), от 10 до 25 мг/г фукоксантина, от 1 до 6 мг/г стеринов, от 2 до 40 мкг/г фикопростана и кокосовое масло. Для приготовления пищевой добавки используют микроводоросли, выбранные из Pinguiophyceae, Chrysophyceae, Bacillariophyceae, Mamiellophyceae, Prymnesiophyceae, Haptophyceae, Coccolithophyceae, Isochrysidaceae и Phaeodactylaceae. Пищевую добавку применяют для предотвращения появления возрастных когнитивных расстройств, определяемых как непатологическое снижение когнитивных функций, или когнитивных расстройств у детей или молодых людей, подвергшихся пренатальному стрессу, вызывающему непатологические расстройства. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 17 ил., 2 табл., 4 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к композиции, а также пищевой добавке на основе жирных кислот и ксантофиллов и их применению, в частности для предотвращения появления когнитивных расстройств у людей или животных.

Когнитивные процессы определяются как все церебральные функции, позволяющие получать, обрабатывать, запоминать и использовать информацию, происходящую из окружающей среды, чтобы максимизировать преимущества и минимизировать недостатки внешних ограничений. Таким образом, когнитивные процессы реализуются в аспектах, включающих рассуждение (приводящее к планированию, организации, суждению), восприятие, узнавание, язык, эмоции, память и обучение.

Легкие когнитивные расстройства или когнитивная хрупкость определяются как изменения когнитивных функций без деменции. С клинической точки зрения, эти расстройства связаны с оценкой 0,5 балла в тесте CDR (компьютерная система оценки когнитивных исследований лекарственных средств).

Среди этих когнитивных расстройств снижение когнитивных функций, связанное со старением, и когнитивные изменения, вызванные пренатальным стрессом, представляют собой два явления, которые могут появляться в течение жизни человека.

Возрастное снижение когнитивных функций определяется как непатологическое снижение когнитивных функций, таких как скорость обработки информации, объем внимания и особенно так называемая рабочая (или кратковременная) память. Эти процессы являются результатом нормальных физиологических изменений, напрямую связанных с возрастом. Возраст начала этого снижения до сих пор остается предметом споров, но, учитывая ускорение старения населения мира, при котором более 20 % мирового населения имеет возраст более 60 лет, и эта доля будет составлять более 30 % в 2050 году, возрастное снижение когнитивных функций является одной из основных проблем предстоящих десятилетий на глобальном уровне и особенно в развитых странах, где оно окажет значительное влияние на экономику (меньшая автономия для пожилых людей) и государственную политику.

С другой стороны пирамиды возрастного состава когнитивные расстройства могут поражать младенцев и детей раннего возраста вследствие пренатального стресса. Действительно, вот уже несколько лет влияние стресса в течение определенного периода беременности на когнитивное развитие еще не родившегося человека изучается как на людях, так и на животных. Так, у животных, в основном у крыс, было продемонстрировано, что пренатальный стресс у матери вызывает у потомства измененную долговременную память.

Оказывается, что интенсивные негативные стимулы, стресс могут вызвать непатологические изменения или снижение когнитивных функций у маленьких детей, что проявляется в гиперактивности, дефиците внимания и памяти, речевой отсталости, более сложных темпераментах и, в более общем плане, поведенческих изменениях, таких как тревожное поведение, выявляющее отставание в развитии нервной системы и снижение когнитивных способностей.

Один из предполагаемых механизмов проявления пренатального стресса в когнитивных расстройствах основан на контакте плода с большими дозами так называемых гормонов стресса, принадлежащих к семейству кортикостероидов, таких как кортизол. Тем не менее, кортизол проникает через плацентарный барьер, и, начиная с определенной концентрации, защитные механизмы плода против кортикоидов, секретируемых матерью, насыщаются, что приводит к контакту плода со слишком значительными дозами кортизола, которые, по-видимому, оказывают негативное влияние на когнитивное развитие. Были разработаны и другие дополнительные предположения, объясняющие связь между пренатальным стрессом и когнитивными расстройствами ребенка.

Концепция стресса может быть определена в соответствии с различными точками зрения, такими как биологический подход: стресс - это серия метаболических реакций, следующих за одним или несколькими экзогенными факторами, вызывающих физиологические или психологические изменения (страх, тревогу) в организме. Однако концепция стресса и его последствия в значительной степени индивидуальны, и реакция человека на стресс также определяется с психологической точки зрения. Ввиду этого, имея в виду, что событие является стрессовым только ретроспективно, из-за реакции, специфичной для каждого человека, или из-за того, что оно может быть объективно стрессовым, трудно воздействовать на источники пренатального стресса. К этому следует добавить тот факт, что беременность вызывает гормональные и психологические изменения, повышающие чувствительность будущей матери к каждому событию, которое может повлиять на благополучие будущего ребенка.

Строго терапевтический подход к стрессу или тревоге в виде назначения лекарств опасен в случае беременной женщины: многочисленные психотропные препараты для лечения психологических расстройств или тревоги оказывают тератогенные эффекты с прямым неблагоприятным воздействием на плод. Требуется оценка в каждом конкретном случае, и этот подход используется только в случае клинических психологических расстройств у беременной женщины, а не в случае так называемых субъективных стрессов.

Таким образом, существует серьезная проблема, связанная с поиском решений против влияния пренатального стресса на развитие когнитивных расстройств у детей или молодых людей.

Различные исследования показали интерес к дополнению пищевого рациона так называемыми незаменимыми жирными кислотами, но также каротинами и, в частности, ксантофиллами, и даже комбинацией указанных жирных кислот и указанных каротинов для предотвращения или по меньшей мере ограничения снижения когнитивных функций. Были разработаны пищевые добавки или лекарства, дающие положительные результаты.

Так, согласно документу WO2013/032333A1 известна композиция на основе жирных кислот типа омега-3, в частности эйкозапентаеновой кислоты (EPA) и докозагексаеновой кислоты (DHA), астаксантина и глицерофосфолипидов, которая рекомендуется для профилактики или лечения различных расстройств и, в частности, когнитивных расстройств. Указанные ингредиенты присутствуют в этой композиции в виде экстрактов микроводорослей; в предпочтительном варианте их получают путем смешения двух экстрактов, происходящих из двух разных водорослей. Природное происхождение компонентов композиции - огромное преимущество. Тем не менее, потребность в более эффективных композициях все еще существует, в частности в связи с вышеупомянутыми проблемами. Кроме того, важно предоставить способы получения таких композиций, которые были бы простыми и воспроизводимыми.

Изобретение предлагает решение указанных задач с помощью композиции, содержащей одну или несколько жирных кислот типа омега-3 и один или несколько ксантофиллов, а также одно или несколько соединений из семейства стеринов и один или несколько фикопростанов. Оказалось, что комбинация по меньшей мере одного стерина и по меньшей мере одного фикопростана с по меньшей мере одной жирной кислотой типа омега-3 и по меньшей мере одним ксантофиллом значительно увеличивает эффективность композиции в предотвращении появления возрастных когнитивных расстройств, а также против тех расстройств, которые связаны с пренатальным стрессом.

Композиция по изобретению включает:

не менее 50 мг/г одной или нескольких жирных кислот типа омега-3,

не менее 10 мг/г одного или нескольких ксантофиллов,

не менее 1 мг/г одного или нескольких стеринов, и

не менее 2 мкг/г одного или нескольких фикопростанов.

В первую очередь композицию по настоящему изобретению можно использовать в качестве пищевой добавки. Также изобретение касается пищевой добавки, которая содержит по меньшей мере 50 мг/г одной или нескольких жирных кислот типа омега-3, по меньшей мере 10 мг/г одного или нескольких ксантофиллов, по меньшей мере 1 мг/г одного или нескольких стеринов и по меньшей мере 2 мкг/г одного или нескольких фикопростанов.

Изобретение имеет существенное преимущество в том, что все компоненты или ингредиенты, указанные выше, могут быть получены из природного источника и, в частности, они могут быть экстрагированы из одной или нескольких микроводорослей и предпочтительно из одной единственной микроводоросли. Конечно, компонент(ы) или ингредиент(ы) композиции или пищевой добавки по изобретению могут иметь неприродное происхождение и быть предоставлены в форме химически синтезированных продуктов.

Перед более подробным описанием изобретения дается определение некоторых терминов, используемых в настоящем тексте.

Термин «содержит» в выражении «композиция содержит» или «пищевая добавка содержит» означает, что композиция или добавка может включать любой дополнительный компонент или компоненты, которые специально не упомянуты, в любой форме и любого происхождения. Этим термином также охватывается композиция или добавка, которые будут содержать только перечисленные компоненты, и, следовательно, композиция или добавка будут состоять из указанных компонентов.

Пищевая добавка определяется как один или несколько пищевых продуктов, назначение которых - дополнить нормальный рацион человека или животного и которые представляют собой концентрированный источник питательных веществ или других веществ, обладающих питательным или физиологическим эффектом отдельно или в сочетании; они обычно доступны в дозированной форме, а именно в таких упакованных формах, как гелевые капсулы, пастилки, таблетки, пилюли и другие подобные формы, а также порошковые упаковки, ампулы с жидкостью, флаконы с капельницей и другие подобные формы жидких или порошковых препаратов, предназначенных для приема в небольших дозированных количествах.

Жирные кислоты типа омега-3 представляют собой семейство ненасыщенных жирных кислот, углеводородная цепь которых содержит от 4 до 36 атомов углерода, обычно от 14 до 36 атомов углерода, и чья двойная связь или первая двойная связь, если считать, начиная с концевой метильной группы цепи, является третьей углерод-углеродной связью. Ненасыщенность(и) может быть цис- или транс-типа независимо друг от друга. Наиболее типичными из этих кислот являются альфа-линоленовая кислота (ALA), эйкозапентаеновая кислота (EPA) и докозагексаеновая кислота (DHA), но обозначение «жирные кислоты типа омега-3» этим не ограничивается. Кроме того, и в частности, когда жирная кислота (кислоты) имеет природное происхождение, они могут быть экстрагированы из водорослей и быть в форме свободных молекул, но также в форме производного, такого как этерифицированная форма, например в моно-, ди- или триэтерифицированной форме, или в виде смесей этих форм.

Под ксантофиллами понимаются молекулы, принадлежащие к каротиноидам, включающим один или несколько атомов кислорода, таких как астаксантин, кантаксантин, ваухериаксантин, лютеин, зеаксантин, диадиноксантин, неоксантин, лороксантин, сифонатоксантин, диатоксантин, виолаксантин, диноксантин, флавоксантин, α-криптоксантин, β-криптоксантин и фукоксантин. В частности, когда ксантофилл(ы) имеют природное происхождение, они могут быть экстрагированы из водорослей и быть в форме свободных молекул, но также они могут иметь производную форму, такую как этерифицированная форма моно- или мультиэфиров, или присутствовать в виде смеси этих форм.

Стерины представляют собой семейство хорошо известных липидов, имеющих стерановое ядро, в котором углерод в 3-м положении несет гидроксильную группу; последняя может быть модифицирована, например ацетильной группой. К ним относятся натуральные стерины или фитостерины, которые в настоящем тексте сгруппированы под термином «фикостерины». Без ограничения в качестве примеров фитостеринов можно упомянуть 24-метиленхолестерин, β-ситостерин, фукостерин, изофукостерин, сарингостерин, оксохолестеринацетат, криностерин и, более конкретно, брассикастерин, стигмастерин и кампестерин.

Под фикопростанами следует понимать семейство липидов, которые по своей структуре относятся к простагландиновому типу, природного происхождения, образующихся в результате непрямого ферментативного окисления жирных кислот, естественным образом присутствующих в биомассах микроводорослей. В частности, эти соединения выбирают из фитопростанов, изопростанов и нейропростанов, в зависимости от жирной кислоты, которая подверглась окислению (окислениям). Таким образом, эти соединения могут происходить из жирных кислот, таких как α-линоленовая кислота (ALA), арахидоновая кислота (ARA), эйкозапентаеновая кислота (EPA) или докозагексаеновая кислота (DHA). Фитопростаны в основном являются производными ALA и могут быть выбраны из 9-epi-9F1t-PhytoP, ent-16-epi-16-F1t-PhytoP, 9-F1t-PhytoP, ent-16B1t-PhytoP, ent-9L1t-PhytoP, 16(RS)-16-A1t-PhytoP. Изопростаны в основном являются производными ARA и EPA и могут быть выбраны из 15-E2t-IsoP, 15-F2t-IsoP, 15-epi-15-F2t-IsoP, 5-F2t-IsoP, 8(RS)-8-F3t-IsoP. Нейропростаны в основном являются производными DHA и могут быть выбраны из 4-F3t-NeuroP, 10-F4t-NeuroP, 10-epi-10-F4t-NeuroP, 4(RS)-4-F4t-NeuroP, 14(RS)-14-F4t-NeuroP, 20(R)-20-F4t-NeuroP.

Под триглицеридами со средней длиной цепи (МСТ) следует понимать сложные эфиры глицерина и насыщенных жирных кислот, углеводородная цепь которых имеет от 6 до 12 атомов углерода. Они естественным образом присутствуют в масле кокосовой пальмы, таком как кокосовое масло, пальмоядровом масле и пальмовом масле, но их можно получить из других жиров или масел.

Далее настоящее изобретение описано более подробно и раскрыты его варианты.

Композиция или пищевая добавка по изобретению предпочтительно характеризуется следующими признаками, рассматриваемыми отдельно или в любой комбинации.

Она содержит от 50 до 250 мг/г одной или нескольких жирных кислот типа омега-3, от 10 до 50 мг/г одного или нескольких ксантофиллов, от 1 до 20 мг/г одного или нескольких стеринов и от 2 до 100 мкг/г одного или нескольких фикопростанов.

Она содержит от 50 до 200 мг/г одной или нескольких жирных кислот типа омега-3, от 10 до 30 мг/г одного или нескольких ксантофиллов, от 1 до 8 мг/г одного или нескольких стеринов и от 2 до 50 мкг/г одного или нескольких фикопростанов.

Она содержит от 50 до 170 мг/г одной или нескольких жирных кислот типа омега-3, от 10 до 25 мг/г одного или нескольких ксантофиллов, от 1 до 6 мг/г одного или нескольких стеринов и от 2 до 40 мкг/г одного или нескольких фикопростанов.

Предпочтительно, композиция или пищевая добавка по изобретению дополнительно содержит по меньшей мере одно масло в качестве носителя или основы для облегчения проявления действия активных ингредиентов. Неожиданно было обнаружено, что изготовление композиции или пищевой добавки облегчается, если это масло выбрано из триглицеридов со средней длиной цепи (MCT). В частности, когда активные ингредиенты получены из одного и того же экстракта микроводорослей, в таком масле наблюдается оптимальная гомогенизация. Согласно одному варианту, триглицериды со средней длиной цепи (MCT) имеют природное происхождение и обеспечиваются маслом, выбранным из масла кокосовой пальмы, пальмоядрового масла и пальмового масла; они также могут быть получены или выделены из такого масла.

Далее представлены предпочтительные составы композиции или пищевой добавки по изобретению; эти воплощения, конечно, могут быть объединены:

указанная жирная кислота типа омега-3 или по меньшей мере одна из жирных кислот типа омега-3 выбрана из стеаридоновой кислоты (SDA), эйкозапентаеновой кислоты (EPA), докозагексаеновой кислоты (DHA) и их смесей;

ксантофилл или по меньшей мере один из ксантофиллов представляет собой фукоксантин;

стерин или по меньшей мере один из стеринов выбран из фитостеринов;

фикопростан или по меньшей мере один из фикопростанов выбран из фитопростанов, изопростанов и нейропростанов.

Композиция или пищевая добавка по настоящему изобретению может содержать любую добавку, позволяющую улучшить, в частности, сохранность, внешний вид, вкус и рецептуру. Таким образом, в нее могут быть включены одна или несколько добавок, выбранных из консервантов, красителей, ароматизаторов, дезинтегрирующих агентов, смазывающих агентов, покрывающих или инкапсулирующих агентов.

Основное применение композиции по изобретению - нутрицевтическое, таким образом, такая композиция или пищевая добавка, как определено выше, предпочтительно находится в форме желатиновых капсул, капсул, таблеток, пастилок или рассыпчатого порошка. Предпочтительно, она упакована в виде доз, имеющих массу одной единицы от 1 мг до 1 г. В общем, галеновый состав композиции или добавки будет адаптирован для рассматриваемого индивидуума и, в частности, в зависимости от того, предназначены ли они для ребенка или взрослого.

Композицию или пищевую добавку по изобретению можно использовать для предотвращения появления непатологических возрастных когнитивных расстройств или непатологических когнитивных расстройств у детей или молодых людей, подвергшихся пренатальному стрессу. Для профилактики возрастных когнитивных расстройств суточная доза может составлять от 2 до 5 мг/кг массы тела. Для предотвращения когнитивных расстройств у детей или молодых людей, подвергшихся пренатальному стрессу, суточная доза может составлять от 0,05 до 0,1 мг/кг массы тела. Было замечено, что эффект наблюдается даже при очень небольших ежедневных дозах, при условии, что продолжительность лечения пропорционально увеличивается.

Изобретение также касается применения микроводоросли для получения пищевой добавки, как определено ранее. Одна или несколько предпочтительных микроводорослей выбраны из любого из следующих таксонов: Pinguiophyceae, Chrysophyceae, Bacillariophyceae, Mamiellophyceae, Prymnesiophyceae, Haptophyceae, Coccolithophyceae, Isochrysidaceae и Phaeodactylaceae. Предпочтительно микроводоросль представляет собой Tisochrysis lutea или Phaeodactylum tricornutum. Такие микроводоросли будут выбраны, потому что подходящая экстракция приводит к экстракту, состав которого соответствует определению композиции по изобретению. Например, такой экстракт может содержать следующую фракцию жирных кислот: жирные кислоты, при выражении в массовых процентах по отношению к общему экстракту, присутствуют в форме свободных жирных кислот в количестве от 4 до 55 %, в форме моноацилглицерина - от 0,5 до 10 %, в форме диацилглицерина - от 0,4 до 15 % и в форме триацилглицерина - от 2 до 55 %. Эти жирные кислоты составляют от 5 до 20 % (мас./мас.) жирных кислот из ряда омега-3 и от 0,5 до 5 % жирных кислот из ряда омега-6. Более конкретно, в частности, жирными кислотами являются ALA (α-линоленовая кислота) в количестве от 0,5 до 10 %, SDA (стеаридоновая кислота) в количестве от 0,5 до 10 %, EPA (эйкозапентаеновая кислота) в количестве от 0,05 до 20 %, DHA (докозагексаеновая кислота) в количестве от 0,1 до 10 %.

Как указывалось ранее, одно из преимуществ композиции или пищевой добавки заключается в способе ее получения и, в частности, в природном происхождении ее компонентов, все из которых могут быть получены из одной единственной микроводоросли. В зависимости от используемой микроводоросли необходимый состав композиции может быть достигнут уже в экстракте. В ином случае экстракт разбавляют для получения требуемых концентраций согласно изобретению. Тем не менее, изобретение не ограничивается этой реализацией; так, можно считать, что только одна часть компонентов имеет естественное происхождение, а другие получены путем химического синтеза, и/или что компоненты природного происхождения не происходят из одного источника, например, их не получают из одной и той же водоросли.

Измерение и доведение концентраций активных ингредиентов в экстракте и в композиции или полученной пищевой добавке осуществляют с использованием аналитических методов, которые входят в общие знания специалистов в данной области.

Далее более подробно описывается способ получения композиции или пищевой добавки из культуры микроводорослей.

Согласно варианту изобретения указанные организмы представляют собой микроводоросли, например принадлежащие к таксонам Pinguiophyceae, Chrysophyceae, Bacillariophyceae, Mamiellophyceae, Prymnesiophyceae, Haptophyceae, Coccolithophyceae, Isochrysidaceae, Phaeodactylaceae. Эти способные к фотосинтезу микроорганизмы могут быть строго автотрофными, миксотрофными или временно гетеротрофными. Эти организмы можно получить в естественной или, предпочтительно, культивируемой среде.

Под экстрактом понимается фракция биомассы, полученной из организмов, способных к фотосинтезу, полученной способом, позволяющим прямо или косвенно получить композицию по настоящему изобретению. В составе этих экстрактов содержится, при выражении в массовых процентах по отношению к общему экстракту, от 5 до 30 % белков, от 20 до 80 % липидов, от 0,1 до 2 % стеринов, от 0,1 до 20 % хлорофилла.

Более конкретно, в составе липофильной части, составляющей экстракт, при выражении в массовых процентах по отношению к общему экстракту, от 15 до 45 % насыщенных жирных кислот, от 5 до 20 % полиненасыщенных кислот, от 1 до 20 % ксантофиллов и от 0,0002 до 0,007 % фикопростана.

При получении экстракта согласно изобретению клетки предпочтительно представляют собой клетки микроводорослей вида Tisochrysis lutea семейства Isochrysidaceae или клетки микроводорослей вида Phaedactylum tricornutum семейства Phaeodactylaceae, полученные путем автотрофного роста по отношению к углероду.

Способ получения микроводорослей

В идеале микроводоросли выращивают контролируемым образом в адаптированных системах, таких как каналы, открытые пруды или, предпочтительно, в закрытых системах, таких как фотобиореакторы. Используемые фотобиореакторы могут быть любого существующего типа, такие как горизонтальные трубчатые фотобиореакторы, вертикальные, такие как системы так называемых «вертикальных садов», фотобиореакторы планарного или колонного типа. Предпочтительно получение биомассы осуществляется в закрытой системе культивирования путем автотрофии с нулевым воздействием на пахотные земли.

Получение биомассы осуществляется в соответствии с методами управления культивированием периодического, периодического с подпиткой, непрерывного, полунепрерывного, турбидостатного или хемостатного типа.

Получение экстрактов указанных микроводорослей

Экстракты, полученные из указанных микроорганизмов, предпочтительно получают после концентрирования биомассы путем удаления всей или части воды с использованием химических или физических процессов, таких как центрифугирование, фильтрация, флокуляция, седиментация, по отдельности или в комбинации, на стадиях сушки путем сублимационной сушки, вакуумной сушки, барабанной сушки, распыления или с помощью любого другого процесса, позволяющего снизить содержание воды в биомассе. В дополнение к этим этапам могут быть осуществлены процессы клеточного лизиса, например с помощью приложения давления, электрических токов, сил сдвига, применения ферментов, или любые другие процессы, позволяющие разрушить ткани, органы, клетки или органеллы.

Представляющие интерес соединения биомассы экстрагируют в соответствии с процессом твердожидкостной экстракции, в котором могут применяться сверхкритические жидкости или субкритические жидкости, при этом может проводиться, параллельно или последовательно, совместная обработка, например, с помощью микроволн, ультразвука, давления, ферментов. Используемые растворители, чистые или в смеси, могут состоять из ацетона, гексана, этилацетата, метилтетрагидрофурана, гептана, метанола, природных или разветвленных масел, этанола или любого другого растворителя, позволяющего полностью или частично экстрагировать гидрофобные и амфифильные соединения.

Растворитель или смесь растворителей отделяют от остаточной биомассы после экстракции центрифугированием, процессами фильтрационного типа и затем может быть сконцентрирован, или растворитель удаляют такими методами, как испарение в вакууме или любыми другими методами, позволяющими селективно испарить рассматриваемый растворитель. Полученный таким образом экстракт имеет липофильную природу, но включает амфифильные молекулы.

Композиция в качестве пищевой добавки

Получение композиции из экстракта выполняют с помощью совместимых матриц, позволяющих растворить его для получения гомогенного раствора с желаемой концентрацией экстракта, таких как, например, растительные масла, такие как оливковое масло, рапсовое масло, льняное масло, подсолнечное масло, масло семян винограда, пальмовое масло и предпочтительно масла MCT, и состоит примерно на 70 мас.% из смеси каприловой кислоты и каприновой кислоты, и предпочтительно выбрано из кокосового масла или пальмового масла, причем все это дополняют молекулами, позволяющими повысить стабильность, такими как синтетические или природные антиоксиданты. Массовые доли вводимых матриц/добавок для получения пищевой добавки могут достигать 95 мас.% от массы пищевой добавки, обычно они составляют от 15 до 80 %, предпочтительно от 35 до 45 %.

Экстракту, но предпочтительно полученной из него композиции или полученной пищевой добавке, может быть придана форма мягких капсул или порошка с помощью любой методики, позволяющей микрокапсулировать водный раствор с использованием или без использования носителя или матрицы, обеспечивающих или не обеспечивающих его гомогенную диспергируемость в полярном пригодном для питья растворе.

Экстракт или пищевую добавку можно использовать отдельно или в качестве ингредиента дополнительного питания.

Ниже проиллюстрированы различные объекты изобретения, а их преимущества изложены в следующих примерах со ссылкой на следующие фигуры:

[Фиг. 1] показывает влияние добавки по изобретению на двигательную активность, при этом диаграмма слева показывает влияние на дефицит спонтанного чередования, а диаграмма справа показывает влияние на двигательную активность.

[Фиг. 2] показывает влияние на дефицит способности к обучению, вызванный D-галактозой, в соответствии с тестом MWM.

[Фиг. 3] показывает влияние пищевой добавки и DHA на дефицит способности к обучению, вызванный D-галактозой.

[Фиг. 4] показывает влияние на дефицит пассивного избегания, вызванный D-галактозой у мышей, с влиянием на задержку (время) перехода ("step-down"), показанную на диаграмме слева, и на задержку (время) выхода ("escape"), показанную на диаграмме справа, измеренные в течение периода запоминания.

[Фиг. 5] показывает влияние пищевой добавки и DHA на перекисное окисление липидов, вызванное D-галактозой.

[Фиг. 6] показывает влияние пищевой добавки и DHA на индуцированную D-галактозой экспрессию TNF-α в коре головного мозга и плазме, где эффект на кору головного мозга показан на левой диаграмме, а эффект на плазму - на правой диаграмме.

[Фиг. 7] показывает влияние пищевой добавки и DHA на индуцированную D-галактозой экспрессию IL-6 в коре головного мозга (левая диаграмма) и плазме (правая диаграмма).

[Фиг. 8] показывает влияние пищевой добавки на тревожность в тесте на двигательную активность в центре тестового пространства, день PPD46.

[Фиг. 9] показывает влияние пищевой добавки на опознающую память в тесте распознавания объекта, день PPD47.

[Фиг. 10] показывает влияние пищевой добавки на опознающую память в тесте распознавания нового объекта.

[Фиг. 11] показывает влияние добавки по изобретению на двигательную активность, при этом диаграмма слева показывает влияние на дефицит спонтанного чередования, а диаграмма справа показывает влияние на двигательную активность.

[Фиг. 12] показывает влияние на дефицит способности к обучению, вызванный D-галактозой в соответствии с тестом MWM.

[Фиг. 13] показывает влияние пищевой добавки на дефицит способности к обучению, вызванный D-галактозой.

[Фиг. 14] показывает влияние на дефицит пассивного избегания, вызванный D-галактозой у мышей, с влиянием на задержку перехода, показанную на диаграмме слева, и на задержку выхода, показанную на диаграмме справа, измеренные в течение периода запоминания.

[Фиг. 15] показывает влияние пищевой добавки на перекисное окисление липидов, вызванное D-галактозой.

[Фиг. 16] показывает влияние пищевой добавки на индуцированную D-галактозой экспрессию TNF-α в коре головного мозга и плазме, где эффект на кору головного мозга показан на левой диаграмме, а эффект на плазму - на правой диаграмме.

[Фиг. 17] показывает влияние пищевой добавки на индуцированную D-галактозой экспрессию IL-6 в коре головного мозга (левая диаграмма) и плазме (правая диаграмма).

Пример 1: Получение экстракта, содержащего компоненты композиции по настоящему изобретению.

Экстракт получают из микроводоросли Phaeodactylum tricornutum любым из описанных выше способов.

Он нерастворим в воде и очень вязок, что не позволяет использовать его при комнатной температуре.

Экстракт и пальмовое масло перед приготовлением выдерживают при комнатной температуре (25±1 °C) в течение 24 ч. Экстракт переносят в центрифужную пробирку, содержащую масло, так, чтобы конечная масса нетто смеси составляла около 5 г, а массовая доля была такой, что экстракт составлял 25 % от общей массы нетто смеси. Смесь перемешивают в течение одной минуты с помощью так называемого вихревого смесительного устройства ("vortex"). Перемешивание повторяют трижды для каждой смеси. Получают однородную смесь.

Пример 2: Испытание натурального экстракта микроводоросли Tisochrysis lutea в контексте модели in vivo на ослабление дефицита, вызванного возрастным когнитивным снижением

Пищевую добавку по настоящему изобретению приготовили из экстракта Tisochrysis lutea, который содержит в мг/г:

Жирные кислоты типа омега-3 (ALA, SDA, EPA, DHA): 152,6 ± 14,4;

Фукоксантин: 20,0 ± 4,0;

Стерины: 4,9 ± 0,8;

Фикопростан: 0,035 ± 0,007.

Пищевую добавку получали путем добавления кокосового масла в пропорции 360 мг±10 мг/г к указанному экстракту.

Добавке придавали форму гранул в соответствии с 3 различными рецептурами, так что конечные концентрации DHA в этих партиях гранул равны 0,5, 1,5 и 3,0 % (мас.:мас.).

Также испытывали коммерческий масляный экстракт микроводорослей, содержащий в качестве жировой фракции только жирные кислоты DHA 77 % (мас.:мас.) и EPA 3 % (мас.:мас.); его также включали в партию гранул таким образом, чтобы конечная концентрация DHA в этой партии гранул равнялась 3,1 % (мас.:мас.).

Дополнительную партию гранул получали только с кокосовым маслом, так что концентрация носителя эквивалентна концентрации других партий, а именно 0,01 % (мас.:мас.).

Полученные таким образом пять партий гранул обозначали, как указано в Таблице 1 ниже.

[Таблица 1]
Полученные гранулы	Обозначение	[DHA] в % (мас.:мас.)
Кокосовое масло	А1	0
Пищевая добавка	A2	0,5
Пищевая добавка	A3	1,5
Пищевая добавка	A4	3,0
Коммерческий масляный экстракт	A5	3,1

Рассматриваемая модель in vivo представляет собой D-галактозную модель, применяемую к мышам, которая подходит для изучения возрастного когнитивного снижения. Действительно, эта модель имитирует многочисленные поведенческие и молекулярные характеристики старения мозга на моделях грызунов.

D-галактозу вводили подкожно в суточной дозе 150 мг/кг сырой массы мышей, а пищевую добавку, указанную выше, включали в гранулы в соответствии со следующей схемой:

Между -14-м и 51-м днем добавку вводили путем включения в кормовые гранулы;

В период с 1-го по 51-й день D-галактозу вводили подкожно пять дней в неделю;

Между 43-м и 51-м днями использовали три различных поведенческих теста для мониторинга эффектов тестируемых соединений.

Эффективность добавки оценивали по следующим параметрам: улучшение в отношении дефицита способности к обучению (пространственная рабочая память: спонтанное чередование в Y-лабиринте в соответствии с тестом с Y-лабиринтом; пространственная память в так называемом «водном лабиринте Морриса» и долговременная контекстуальная память в тесте пассивного избегания), уровень перекисного окисления липидов (LPO) в гиппокампе и влияние на нейровоспалительные маркеры IL6 и TNF-α.

Улучшение в отношении дефицита способности к обучению

На 43-й день всех животных тестировали на способность к спонтанному чередованию в тесте с Y-лабиринтом (YM) с помощью индекса пространственной рабочей памяти;

С 44-го по 49-й день всех животных проверили на пространственную память в тесте с водным лабиринтом Морриса (MWM) с помощью индекса пространственной памяти;

С 44-го по 49-й день всех животных тестировали с помощью теста MWM для оценки пространственной рабочей памяти;

На 50-й и 51-й дни долговременную контекстуальную память животных оценивали с использованием пошагового процесса пассивного избегания (STPA) посредством сеансов с упражнениями и сеансов запоминания, соответственно;

На 50-й и 51-й день всех животных проверяли на выполнение STPA.

Уровень перекисного окисления липидов (LPO) в гиппокампе и влияние на нейровоспалительные маркеры IL6 и TNF-α

На 51-й день после поведенческих тестов животных умерщвляли.

У всех животных собирали кровь из туловища и центрифугировали для извлечения плазмы, а также быстро собирали мозг. Гиппокамп и кору головного мозга вырезали, затем гиппокамп использовали для определения уровня перекисного окисления липидов колориметрическим методом; гемифронтальную кору и плазму использовали для определения уровня воспалительных биомаркеров интерлейкина-6 (IL-6) и фактора некроза опухоли альфа (TNF-α).

Количественную оценку уровня перекисного окисления липидов (LPO) проводили в соответствии с модифицированной и адаптированной процедурой согласно Hermes-Lima et al. Этот метод измеряет способность перекисных липидов мозга окислять комплекс оксида железа и ксиленолового оранжевого, что проявляется в присутствии гидропероксида кумола (HPC). Уровень перекисного окисления липидов определяют в HPC-эквиваленте по формуле:

HPCE = A5801/A5802 × [HPC (нмоль)]

и выражают в HPC-эквиваленте на массу влажной ткани и в процентах по отношению к данным, полученным для контрольной группы (D-галактоза + носитель).

Содержание IL6 и TNF-α количественно определяли с помощью тестов ELISA (иммуноферментный анализ) со следующими наборами:

Для количественного определения IL6: ThermoScientifique, EM2IL6

Для количественного определения TNF-α: ThermoScientifique, EMTNFA

Для всех тестов кору головного мозга гомогенизировали после размораживания в буфере, содержащем 50 мМ Трис-150 мМ NaCl, pH 7,5, и обрабатывали ультразвуком в течение 20 с. После центрифугирования (16 100 g в течение 15 мин, 4 °C) супернатант или плазму использовали для тестов ELISA в соответствии с инструкциями производителя тестов ELISA. Для каждого теста оптическую плотность считывали при 450 нм, а концентрацию образца рассчитывали с использованием стандартной кривой. Результаты выражали в пг маркера на мг влажной ткани.

Все значения, за исключением задержек пассивного избегания, выражаются как среднее плюс-минус стандартное отклонение измерения. Статистические анализы выполняли отдельно для каждого соединения с использованием однонаправленного ANOVA (дисперсионного анализа) (значение F) с последующим апостериорным множественным сравнительным тестом Даннета. Задержки пассивного избегания не подчиняются гауссовскому распределению, поскольку верхний предел времени фиксирован. Следовательно, их анализируют с использованием непараметрического ANOVA Краскела-Уоллиса (значение H), за которым следует критерий множественного сравнения Данна. Статистически значимыми считаются значения с р < 0,05.

Испытания проводятся на 60 самцах мышей, разделенных на 6 групп по 10 мышей, среди которых группа 1 является группой отрицательного контроля, а группы 2-6 - группами положительного контроля:

группа 1 - это группа, в которой вводят подкожно физраствор вместо D-галактозы и гранул A1;

группа 2 - это группа, в которой вводят D-галактозу и гранулы A1;

группа 3 - это группа, в которой вводят D-галактозу и гранулы A2;

группа 4 - это группа, в которой вводят D-галактозу и гранулы A3; и

группа 5 - это группа, в которой вводят D-галактозу и гранулы A4; и

группа 6 - это группа, в которой вводят D-галактозу и гранулы A5.

Расчет эквивалентной суточной дозы для человека из суточной дозы, испытанной на мышах, определяется FDA (Руководство, 2005) следующим образом: суточная доза для человека, выраженная в мг/кг массы тела (HED Человека), равна суточной дозе для животного, выраженной в мг/кг массы тела (HED Животного), умноженной на отношение коэффициента безопасности (Km Животного) для рассматриваемого животного и коэффициента безопасности для человека (Km Человека). Km Человека равно 37, а Km Мыши равно 3.

Влияние на пространственную память в тесте спонтанного чередования в Y-лабиринте:

Результаты представлены на Фиг. 1, где первая диаграмма (слева) иллюстрирует влияние пищевой добавки по изобретению на дефицит спонтанного чередования, а вторая диаграмма (справа) иллюстрирует влияние пищевой добавки по изобретению на двигательную активность.

На Фиг. 1: LOW - низкая доза добавки (A2); MED - средняя доза добавки (A3); HI - высокая доза добавки (A4); N составляет от 9 до 10 в зависимости от групп; * p < 0,05, *** p < 0,0001 по сравнению с физраствором/группа Носитель, # p<0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,0001 по сравнению с группой D-галактоза 150/группа Носитель; Тест Даннета.

Обнаружено, что введение D-галактозы значимо изменило пространственную рабочую память по сравнению с мышами, получавшими физраствор.

Добавка A2 не продемонстрировала никакого влияния на поведение чередования. Добавка A3 довольно значимо, но частично уменьшила дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой. Добавка A4 довольно значимо и полностью уменьшила дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Лечение только DHA (согласно A5) довольно значимо, но частично облегчило дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Неожиданно оказалось, что профилактическое лечение пищевой добавкой по изобретению имеет более существенный положительный эффект (довольно значимое и полное уменьшение дефицита) по сравнению с лечением только DHA (довольно значимое и частичное уменьшение дефицита), при той же дозе DHA.

Влияние на дефицит обучения, вызванный D-галактозой в соответствии с тестом MWM:

Результаты представлены на Фиг. 2.

На Фиг. 2: LOW - низкая доза добавки (A2); MED - средняя доза добавки (A3); HI - высокая доза добавки (A4); N составляет от 9 до 10 в зависимости от групп; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,0001 по сравнению с физраствором/группа Носитель, ## p < 0,01, ### p < 0,0001 по сравнению с группой D-галактоза 150/группа Носитель; Тест множественного сравнения Бонферрони после двунаправленного ANOVA.

Хроническая интоксикация D-галактозой значимо изменила пространственное обучение по сравнению с группой отрицательного контроля (Физраствор/Носитель).

Добавка A2 не продемонстрировала никакого влияния на поведение чередования.

Добавка A3 довольно значимо, но частично уменьшила дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Добавка A4 довольно значимо и полностью уменьшила дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Лечение только DHA согласно A5 довольно значимо, но частично облегчило дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Неожиданно оказалось, что профилактическое лечение пищевой добавкой согласно изобретению в дозе A4 имеет более существенный положительный эффект (довольно значимое и полное уменьшение дефицита) по сравнению с лечением только DHA (довольно значимое и частичное уменьшение дефицита), при той же дозе DHA.

Влияние пищевой добавки и DHA на дефицит обучения, вызванный D-галактозой

Результаты представлены на Фиг. 3.

На Фиг. 3: LOW - низкая доза добавки (A2); MED - средняя доза добавки (A3); HI - высокая доза добавки (A4); N составляет от 9 до 10 в зависимости от группы; *** p < 0,0001 по сравнению с Физраствором/группа Носитель, /Носитель; ### p<0,0001 по сравнению с группой D-галактоза 150/Носитель; Тест множественного сравнения Бонферрони после двунаправленного ANOVA.

Добавка A4 довольно значимо и полностью облегчила дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Неожиданно оказалось, что профилактическое лечение пищевой добавкой согласно изобретению в дозе A4 имеет более существенный положительный эффект (довольно значимое и полное уменьшение дефицита) по сравнению с лечением только DHA (довольно значимое и частичное уменьшение дефицита), при той же дозе DHA. Кроме того, профилактическое лечение добавкой в дозе A3 имеет эффект (довольно значимое и частичное ослабление дефицита), который идентичен лечению только DHA, когда в последнем случае концентрация DHA в два раза больше.

Влияние на дефицит пассивного избегания, вызванный D-галактозой у мышей

Результаты представлены на Фиг. 4, при этом влияние пищевой добавки по изобретению на задержку перехода показано на диаграмме слева, и на задержку выхода - на диаграмме справа, которые измерены в течение периода запоминания.

На Фиг. 4: LOW - низкая доза добавки (A2); MED - средняя доза добавки (A3); HI - высокая доза добавки (A4). N составляет от 9 до 10 в зависимости от групп; *** p < 0,0001 по сравнению с Физраствором/группа Носитель, ### p < 0,0001 по сравнению с группой D-галактоза 150/группа Носитель; Тест Даннета.

Хроническая интоксикация D-галактозой значимо изменила долговременную контекстуальную рабочую память по сравнению с группой отрицательного контроля (Физраствор/Носитель).

Добавка A2 не продемонстрировала никакого влияния на долговременную контекстуальную память.

Добавка A3 позволила незначительно ослабить дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Лечение только DHA (согласно A5) позволило незначительно уменьшить дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Неожиданно оказалось, что профилактическое лечение пищевой добавкой согласно изобретению в дозе A4 имеет более существенный положительный эффект (довольно значимое и полное уменьшение дефицита) по сравнению с лечением только DHA (незначительное уменьшение дефицита), при той же дозе DHA. Кроме того, профилактическое лечение добавкой в дозе A3 имеет эффект (незначительное ослабление дефицита), который идентичен лечению только DHA, когда в последнем случае концентрация DHA в два раза больше.

Влияние пищевой добавки и DHA на перекисное окисление липидов, вызванное D-галактозой

Результаты представлены на Фиг. 5.

На Фиг. 5: LOW - низкая доза добавки (A2); MED - средняя доза добавки (A3); HI - высокая доза добавки (A4). N составляет от 9 до 10 в зависимости от групп; ** p < 0,01, *** p < 0,0001 по сравнению с Физраствором/группа Носитель, ## p < 0,01, ### p < 0,0001 по сравнению с группой D-галактоза 150/группа Носитель; Тест Даннета.

Хроническая интоксикация D-галактозой значимо увеличила окислительный стресс по сравнению с группой отрицательного контроля (Физраствор/Носитель).

Добавка A2 не продемонстрировала никакого эффекта на перекисное окисление липидов, вызванное хронической интоксикацией D-галактозой.

Добавка A3 довольно значимо, но частично снизила окислительный стресс, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Добавка A4 довольно значимо и полностью снизила окислительный стресс, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Лечение только DHA в соответствии с A5 не продемонстрировало какого-либо эффекта на окислительный стресс, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Неожиданно оказалось, что профилактическое лечение добавкой по изобретению в дозе A4 имеет более существенный положительный эффект (довольно значимое и полное ослабление окислительного стресса) по сравнению с лечением только DHA, при той же дозе DHA.

Влияние пищевой добавки и DHA на индуцированную D-галактозой экспрессию TNF-α в коре головного мозга и плазме

Результаты представлены на Фиг. 6, где влияние на кору показано на левой диаграмме, а влияние на плазму - на правой.

На Фиг. 6: LOW - низкая доза добавки (A2); MED - средняя доза добавки (A3); HI - высокая доза добавки (A4); N составляет от 9 до 10 в зависимости от групп; *** p < 0,0001 по сравнению с Физраствором/группа Носитель, ### p < 0,0001 по сравнению с группой D-галактоза 150/группа Носитель; Тест Даннета.

Хроническая интоксикация D-галактозой значимо увеличила уровень TNF-α в коре головного мозга и плазме по сравнению с группой отрицательного контроля (Физраствор/Носитель).

Добавки A2 и A3 довольно значимо, но частично снизили увеличение уровня TNF-α, вызванное хронической интоксикацией D-галактозой, в коре и плазме.

Добавка A4 довольно значимо и полностью снизила уровень TNF-α в коре и плазме.

Лечение только DHA в соответствии с A5 довольно значимо, но частично снизило увеличение уровня TNF-α, вызванное хронической интоксикацией D-галактозой, в коре головного мозга и плазме.

Неожиданно оказалось, что профилактическое лечение добавкой HI (A4) имеет более существенный положительный эффект (довольно значимое и полное ослабление увеличения уровня TNF-α в коре и плазме) по сравнению с лечением с помощью только DHA, при той же дозе DHA. Кроме того, профилактическое лечение добавкой в дозах А2 и А3 оказывает эффекты в отношении коры головного мозга и плазмы (довольно значимое ослабление увеличения), которые идентичны лечению только DHA, когда в последнем случае концентрация DHA в шесть и в два раза больше, соответственно, по сравнению с профилактическим лечением добавкой в дозах А2 и А3, соответственно.

Влияние пищевой добавки и DHA на индуцированную D-галактозой экспрессию IL-6 в коре головного мозга и плазме

Результаты представлены на Фиг. 7, где влияние на кору показано на левой диаграмме, а влияние на плазму - на правой.

На Фиг. 7: LOW - низкая доза добавки (A2); MED - средняя доза добавки (A3); HI - высокая доза добавки (A4); N составляет от 9 до 10 в зависимости от групп; *** p < 0,0001 по сравнению с Физраствором/группа Носитель, ### p < 0,0001 по сравнению с группой D-галактоза 150/группа Носитель; Тест Даннета.

Хроническая интоксикация D-галактозой значимо и значительно увеличила уровень IL-6 в коре головного мозга и плазме по сравнению с группой отрицательного контроля (Физраствор/Носитель).

Добавка с низкой дозой (A2) не продемонстрировала какого-либо влияния на концентрацию IL-6, вызванную интоксикацией D-галактозой.

Добавка средней дозы (A3) довольно значимо, но частично снизила увеличение содержания IL-6, вызванное хронической интоксикацией D-галактозой, в коре и плазме.

Добавка с высокой дозой (A4) довольно значимо и полностью снизила содержание IL-6 в коре и плазме, вызванное хронической интоксикацией D-галактозой, в коре и плазме.

Лечение только DHA в соответствии с A5 довольно значимо, но частично снизило увеличение уровня IL-6, вызванное хронической интоксикацией D-галактозой, в коре головного мозга и плазме.

Неожиданно оказалось, что профилактическое лечение добавкой HI в соответствии с A4 имеет более существенный положительный эффект (довольно значимое и полное ослабление увеличения уровня IL-6 в коре и плазме) по сравнению с лечением с помощью только DHA (довольно значимое и частичное ослабление увеличения уровня IL-6 в коре и плазме), при той же дозе DHA. Кроме того, профилактическое лечение добавкой в дозе A3 имеет эффект в случае коры головного мозга (незначимое уменьшение дефицита), который идентичен лечению только DHA, когда в последнем случае концентрация DHA в два раза больше.

Выводы:

Хроническая интоксикация D-галактозой значимо вызывала изменение пространственной рабочей памяти, долговременной контекстуальной памяти и оказала негативное влияние на пространственное обучение. Поведенческие изменения также связаны с биохимическими изменениями, проявляющимися в усилении окислительного стресса и индукции нейровоспалительных процессов.

Профилактическое лечение пищевой добавкой по изобретению является дозозависимым и в случае самой высокой испытанной дозы (добавка D4) значимо и полностью ослабило дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой, проявляющейся в изменении поведения, усилении окислительного стресса и активации нейровоспалительных процессов.

Лечение только DHA (A5) и при эквивалентной дозе DHA по сравнению с лечением добавкой HI довольно значимо, но частично уменьшило дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой, проявляющейся в изменении поведения, усилении окислительного стресса и активации нейровоспалительных процессов.

Удивительно, но профилактическое лечение добавкой значимо более эффективно при эквивалентной дозе DHA, чем профилактическое лечение только DHA, в отношении ослабления возрастного когнитивного снижения на мышиной модели, вызванного хронической интоксикацией D-галактозой. Кроме того, профилактическое лечение пищевой добавкой в случае доз DHA, которые в два раза ниже, имеет положительные эффекты, которые идентичны лечению только DHA, когда в последнем случае концентрация DHA в два раза больше, в отношении уменьшения окислительного стресса, измеренного в коре головного мозга (IL-6 и TNF-α), в плазме (TNF-α), в отношении долговременной контекстуальной памяти и в отношении пространственного обучения. Кроме того, профилактическое лечение пищевой добавкой имеет положительные эффекты, которые идентичны лечению только DHA, когда в последнем случае концентрация DHA в шесть раз больше, в отношении снижения окислительного стресса, измеряемого в коре головного мозга (IL-6 и TNF-α) и плазме (TNF-α).

Таким образом, применяя формулу для расчета человеческой эквивалентной суточной дозы, профилактическое лечение возрастного когнитивного снижения может осуществляться с ежедневным приемом от 2 до 5 мг пищевой добавки на килограмм массы тела.

Пример 3: Испытание экстракта микроводоросли Tisochrysis lutea на молодых самках крыс, страдающих пренатальным стрессом

В этом примере изучается устранение когнитивного дефицита, тревожного поведения и изменение памяти распознавания, вызванных у молодых самок крыс после пренатального стресса их предков, посредством введения добавки на основе экстракта микроводоросли Tisochrysis lutea, соответствующей той, которая использована в Примере 2.

Оборудование и методы

Модель, использованная в этом примере, является общепризнанной моделью для индукции пренатального стресса у крыс путем иммобилизации беременной самки в цилиндре при резком освещении.

Беременных крыс-самок случайным образом распределяли в группу пренатального стресса (SP) или в контрольные группы (NS), индивидуально помещали в пластиковые клетки для разведения, и они имели неограниченный доступ к пище и воде, за исключением времени проведения поведенческих тестов. Условия в клетках были следующими: цикл фотопериода 12 часов света / 12 часов темноты (свет включается в 7 часов утра), в комнате при постоянной температуре (21 °C) и постоянной влажности (50 %).

Процедуру пренатального стресса выполняли, как описано у Meunier et al. (2004). Иммобилизация самок крыс была объектом полуслучайной процедуры ограничения свободы. Животных помещали и удерживали в прозрачных цилиндрах-фиксаторах из оргстекла (длина 20 см, диаметр 7 см) при ярком свете в течение периода 90 минут в день в течение 4 дней подряд. Чтобы стресс был как можно более непредсказуемым, 90-минутный период принудительной иммобилизации проводился следующим образом: одна фаза по 90 минут, две фазы по 45 минут с интервалом 4 часа, две фазы по 60 и 30 минут с интервалом 4 часа, или три 30-минутные фазы с интервалом 4 и 1 час в разное время дня.

Контрольными матерями также манипулировали, но их никогда не помещали в цилиндры-фиксаторы.

Обработанным самкам крыс позволяли естественным образом освободиться от цилиндров-фиксаторов на 1-й день после рождения (PPD1).

Пометы выведены на PPD21. Крысы были отделены от матерей, их пол был идентифицирован, они были взвешены, и крысы одного пола были распределены по клеткам (по 3 крысы на клетку). Молодые крысы в одной клетке происходили из разных пометов, чтобы избежать любого возможного эффекта, связанного с пометом.

Условия в клетках были следующими: фотопериод 12 часов света / 12 часов темноты (свет включается в 7 часов утра), в помещении с постоянной температурой (21 °C) и постоянной влажностью (50 %), с неограниченным доступом к еде и воде, за исключением времени проведения поведенческих тестов.

В каждой клетке животные получали одинаковое лечение. Животные были протестированы случайным образом и двойным слепым методом.

Использовали сорок восемь (48) самок крыс, которых сгруппировали в четыре группы животных, составленные следующим образом:

Группа 1 состоит из 12 наивных самок крыс, то есть чьи предки не подвергались пренатальному стрессу, получавших только 200 мкл раствора носителя в день (обозначение: NS/Носитель). Следовательно, эта группа является контрольной группой;

Группа 2 состоит из 12 наивных самок крыс, то есть чьи предки не подвергались пренатальному стрессу, получавших 200 мкл добавки в день (обозначение: NS/Добавка);

Группа 3 состоит из 12 самок крыс, предки которых подвергались пренатальному стрессу, получавших 200 мкл раствора носителя в день (обозначение: SP/Носитель);

Группа 4 состоит из 12 самок крыс, предки которых подвергались пренатальному стрессу, получавших 200 мкл добавки в день (обозначение: SP/Добавка).

Эффективность добавки оценивали через 6 недель после рождения.

Добавку (одна доза) вводили через желудочный зонд один раз в день 5 дней в неделю. Введения начались после отлучения от груди, а именно после послеродового дня (PPD) 25, и продолжалось до PPD46.

Суточная доза составляла 25,7 мг добавки на килограмм массы тела крысы.

Животных подвергали поведенческим тестам в период между днями PPD46 и PPD48, а именно вне периода лечения носителем или добавкой. Следовательно, эффекты, которые наблюдаются во время поведенческих тестов, будут связаны с лечением, которое носит профилактический характер.

Поведенческие тесты делятся на один сеанс оценки тревожности и два сеанса распознавания объектов. Сеансы определены следующим образом:

Сеанс 1, PPD 46: крыс по отдельности помещали в квадратное открытое пространство (50 см × 50 см × 50 см × 50 см), сделанное из голубого оргстекла, с полом, снабженным инфракрасными светодиодами. Крысы были приучены к испытательному пространству в течение 10-минутного сеанса, их перемещения фиксировались инфракрасной камерой и анализировались с помощью программного обеспечения Ethovision® (Noldus). Активность анализировалась в соответствии с общим пройденным расстоянием (м) и в соответствии с процентом присутствия в центральной области 25 см × 25 см, определенной программным обеспечением / эти данные отражают интенсивность тревожного поведения (38).

Сеанс 2, PPD 47: два идентичных объекта (пластиковая пробирка Eppendorf объемом 50 мл) были размещены в определенных местах (на двух противоположных краях центральной области). Каждую крысу поместили в тестовое пространство, и исследовательскую активность записали в течение 10-минутного сеанса. Активность была проанализирована с точки зрения количества контактов с объектами и продолжительности контактов.

Сеанс 3, PPD 48: объект сеанса 2 был заменен новым объектом (пластиковой крышкой от бутылки), форма, текстура и цвет которого отличаются от таковых у знакомого объекта. Каждую крысу помещали обратно в тестовое пространство, и исследовательскую активность регистрировали в течение 10-минутного сеанса. Эта активность была предметом анализа, аналогичного описанному для сеанса 2.

Индекс преимущественного изучения был рассчитан как отношение количества (или продолжительности) контактов с объектом сеанса 2 к общему количеству (или продолжительности) контактов с обоими объектами.

Все значения выражены как среднее значение плюс-минус стандартное отклонение измерения. Статистические анализы выполняли отдельно для каждого соединения с использованием однонаправленного ANOVA (значение F) с последующим апостериорным множественным сравнительным тестом Даннета.

Расчет эквивалентной человеческой суточной дозы из суточной дозы, испытанной на крысах, определяется FDA (Руководство, 2005) следующим образом: суточная доза для человека, выраженная в мг/кг массы тела (HED Человека), равна суточной дозе для животного, выраженной в мг/кг массы тела (HED Животного), умноженной на отношение коэффициента безопасности (Km Животного) для рассматриваемого животного и коэффициента безопасности для человека (Km Человека). Km Человека равно 37, а Km Крысы равно 3.

Результаты представлены ниже.

Передвижение в центре тестового пространства, день PPD46; влияние добавки на тревожность

Результаты представлены на Фиг. 8.

На Фиг. 8: влияние лечения на тревожность. N = 12; *** p < 0,0001 по отношению к группе, получавшей лечение NS/носитель; #### p < 0,0001 по отношению к группе, получавшей лечение SP/носитель; Тест Даннета.

Группа SP/Носитель, соответствующая особям, подвергшимся пренатальному стрессу и прошедшим профилактическое лечение одним носителем, имеет процент перемещений, который значимо выше в периферийной области открытого тестового пространства по сравнению с группой NS/Носитель (группа, не подвергавшаяся пренатальному стрессу).

Группа SP/добавка, соответствующая особям, подвергшимся пренатальному стрессу и прошедшим профилактическую терапию добавкой, имеет процент перемещений, который значимо ниже в периферийной области открытого тестового пространства по сравнению с группой SP/Носитель (группа, которая подверглась пренатальному стрессу, но не принимала добавку). Кроме того, процент перемещений группы SP/добавка эквивалентен таковому у контрольной группы NS/носитель.

Скорость перемещений особей в периферийной области открытого тестового пространства, превышающая контрольную модальность, является демонстрацией тревожного поведения [63] посредством механизма защиты, основанного на поиске границ, ограничивающих открытые области, и подлежит мониторингу.

Таким образом, пренатальный стресс (PS) вызвал очень сильное тревожное поведение.

Удивительно, но оказалось, что добавка довольно значимо и полностью ослабила тревожное поведение, вызванное пренатальным стрессом.

Тест на узнавание, день PPD47; влияние пищевой добавки на память распознавания при распознавании объекта

Результаты представлены на Фиг. 9.

Во время этого сеанса один и тот же объект демонстрируется особям дважды.

Статистический эффект между группами по этому параметру не измерялся.

Таким образом, особи из всех групп взаимодействовали одинаково при контакте с идентичными объектами, и их взаимодействия, как по частоте, так и по продолжительности, одинаково распределяются между двумя объектами (50 %).

Тест на распознавание, день PPD48 (новый объект); влияние пищевой добавки на память распознавания в тесте распознавания нового объекта

Результаты представлены на Фиг. 10.

На Фиг. 10: N = 12; *** p < 0,0001 по отношению к группе, получавшей лечение, NS/носитель; ### p < 0,0001 по отношению к группе, получавшей лечение, SP/носитель; Тест Даннета.

Во время этого сеанса каждой особи по разу демонстрируются два разных объекта: один из объектов соответствует объекту, продемонстрированному во время сеанса 2, а другой объект является новым объектом.

Группа SP/носитель, соответствующая особям, подвергшимся пренатальному стрессу и прошедшим профилактическое лечение одним носителем, имеет такой процент взаимодействий с продемонстрированным новым объектом, как с точки зрения частоты, так и продолжительности, который значимо ниже по сравнение с группой NS/носитель (группа, не подвергавшаяся пренатальному стрессу). И этот процент равен проценту сеанса 2, полученному для всех групп. Таким образом, особи группы SP/носитель имеют столько же взаимодействий со старым объектом, сколько и с новым объектом, и поэтому особи этой группы не узнают старый объект, продемонстрированный во время сеанса 2.

Напротив, группа SP/добавка, соответствующая особям, подвергшимся пренатальному стрессу и прошедшим профилактическое лечение добавкой, имеет такой процент взаимодействий с продемонстрированным новым объектом, как с точки зрения частоты, так и продолжительности, который значимо выше по сравнению с группой PS/носитель (группа отрицательного контроля). И этот процент выше, чем таковой в сеансе 2, полученный для всех групп. Таким образом, особи группы SP/добавка имеют меньше взаимодействий со старым объектом, чем с новым, и поэтому особи этой группы узнают старый объект, продемонстрированный во время сеанса 2. Кроме того, особи группы SP/добавка имеют процент взаимодействий с продемонстрированным новым объектом, как с точки зрения частоты, так и продолжительности, который эквивалентен таковым из групп NS/носитель и NS/добавка.

Таким образом, пренатальный стресс (PS) вызвал очень значительный дефицит памяти распознавания в случае нового объекта.

Удивительно, но оказалось, что добавка позволила довольно значимо и полностью ослабить дефицит памяти распознавания, вызванный пренатальным стрессом.

Выводы

Лечение пищевой добавкой значимо и полностью ослабило тревожное поведение, а также дефицит памяти распознавания, вызванный пренатальным стрессом.

Пренатальный стресс, практикуемый в этом эксперименте, в значительной степени вызывает тревожное поведение и довольно значительно изменяет память распознавания у молодых самок крыс.

Таким образом, применяя формулу для расчета эквивалентной суточной дозы для человека, профилактическое лечение, ослабляющее когнитивные расстройства, вызванные пренатальным стрессом, может осуществляться с ежедневным приемом 0,05-0,1 мг добавки на килограмм массы тела.

Пример 4: Испытание природного экстракта микроводоросли Phaeodactylum tricornutum в контексте модели in vivo на ослабление дефицита, вызванного возрастным когнитивным снижением

Пищевую добавку по настоящему изобретению получали из экстракта Phaeodactylum tricornutum, который содержит в мг/г:

Жирные кислоты типа омега-3 (ALA, SDA, EPA, DHA): 66,6 ± 11,5;

Фукоксантин: 20,0 ± 4,0;

Стерины: 3,0 ± 0,6;

Фикопростан: 0,0025 ± 0,0005.

Пищевую добавку получали путем добавления кокосового масла в пропорции 410 мг ± 20 мг/г к указанному экстракту.

Добавку включали в гранулы в соответствии с 4 различными рецептурами таким образом, чтобы введенные количества добавки в разных партиях гранул соответствовали эквивалентным суточным дозам для человека, как описано в Таблице 2, и чтобы путем разбавления композиции, описанной ниже, в кокосовом масле, для всех составов соблюдалась одинаковая конечная масса.

Полученные таким образом пять партий гранул обозначали, как указано в Таблице 2 ниже.

[Таблица 2]
Полученные гранулы	Эквивалентная доза для человека (мг добавки / кг массы тела / сутки)	Обозначение
Кокосовое масло (носитель)	0	Носитель
Пищевая добавка	1,7	D1
Пищевая добавка	3,3	D2
Пищевая добавка	4,2	D3
Пищевая добавка	5,3	D4

Между -28-м и 51-м днем добавку вводили путем включения в кормовые гранулы;

Эффективность добавки оцениваются по следующим параметрам: улучшение в отношение дефицита способности к обучению (пространственная рабочая память: спонтанное чередование в Y-лабиринте в соответствии с тестом с Y-лабиринтом; пространственная память в так называемом «водном лабиринте Морриса» и долговременная контекстуальная память в тесте пассивного избегания), уровень перекисного окисления липидов (LPO) в гиппокампе и влияние на нейровоспалительные маркеры IL6 и TNF-α.

На 50-й и 51-й дни долговременную контекстуальную память животных оценивали с использованием пошагового процесса пассивного избегания (STPA) посредством сеансов с упражнениями и сеансов запоминания, соответственно.

HPCE = A5801 / A5802 × [HPC (нмоль)]

Содержание IL6 и TNF-α количественно определяли с помощью тестов ELISA со следующими наборами:

Испытания проводили на 72 самцах мышей, разделенных на 6 групп по 12 мышей, среди которых группа 1 является группой отрицательного контроля, а группы 2-6 - группами положительного контроля:

группа 1 - это группа, в которой вводят подкожно физраствор вместо D-галактозы и гранул B1;

группа 2 - это группа, в которой вводят D-галактозу и гранулы B1;

группа 3 - это группа, в которой вводят D-галактозу и гранулы B2;

группа 4 - это группа, в которой вводят D-галактозу и гранулы B3; и

группа 5 - это группа, в которой вводят D-галактозу и гранулы B4; и

группа 6 - это группа, в которой вводят D-галактозу и гранулы B5.

Результаты представлены на Фиг. 11, где первая диаграмма (слева) иллюстрирует влияние пищевой добавки по изобретению на дефицит спонтанного чередования, а вторая диаграмма (справа) иллюстрирует влияние пищевой добавки по изобретению на двигательную активность.

На Фиг. 11: Физраствор/Носитель соответствует отрицательному контролю (группа, в которой не вводили D-галактозу и кормили гранулами, приготовленными с носителем - кокосовым маслом); D-галактоза 150/Носитель соответствует положительному контролю (группа, в которой вводили D-галактозой и кормили гранулами, приготовленными с носителем - кокосовым маслом); D1, D2, D3 и D4 - увеличивающиеся дозы добавки; N составляет от 11 до 12 в зависимости от групп; * p < 0,05, *** p < 0,0001 по сравнению с Физраствором/группа Носитель, # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,0001 по сравнению с группой D-галактоза 150/группа Носитель; Тест Даннета.

Добавка D1 довольно значимо, но частично уменьшила дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой. Добавки D2, D3 и D4 значимо и полностью уменьшили дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Результаты представлены на Фиг. 12.

На Фиг. 12: Физраствор/Носитель соответствует отрицательному контролю (группа, в которой не вводили D-галактозу и кормили гранулами, приготовленными с носителем - кокосовым маслом); D-галактоза 150/Носитель соответствует положительному контролю (группа, в которой вводили D-галактозу и кормили гранулами, приготовленными с носителем - кокосовым маслом); D1, D2, D3 и D4 - увеличивающиеся дозы добавки; N составляет от 11 до 12 в зависимости от групп; * p < 0,05, ** p < 0,01 *** p < 0,0001 по сравнению с Физраствором/группа Носитель, ## p < 0,01, ### p < 0,0001 по сравнению с группой D-галактоза 150/группа Носитель; Тест множественного сравнения Бонферрони после двунаправленного ANOVA.

Добавка D1 довольно значимо, но частично уменьшила дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Добавки D2, D3 и D4 значимо и полностью уменьшили дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Влияние пищевой добавки на дефицит обучения, вызванный D-галактозой

Результаты представлены на Фиг. 13.

На Фиг. 13: Физраствор/Носитель соответствует отрицательному контролю (группа, в которой не вводили D-галактозу и кормили гранулами, приготовленными с носителем - кокосовым маслом); DGal 150/Носитель соответствует положительному контролю (группа, в которой вводили D-галактозу и кормили гранулами, приготовленными с наполнителем - кокосовым маслом); D1, D2, D3 и D4 - увеличивающиеся дозы добавки; N составляет от 11 до 12 в зависимости от групп; Физраствор/Носитель соответствует отрицательному контролю (группа, в которой не вводили D-галактозу и кормили гранулами, приготовленными с носителем - кокосовым маслом); D-галактоза 150/ Носитель соответствует положительному контролю (группа, в которой вводили D-галактозой и кормили гранулами, приготовленными с носителем - кокосовым маслом); D1, D2, D3 и D4 - увеличивающиеся дозы добавки; N составляет от 11 до 12 в зависимости от групп; *** p < 0,0001 по сравнению с Физраствором/группа Носитель, /Носитель; ### p < 0,0001 по сравнению с группой D-галактоза 150/Носитель; Тест множественного сравнения Бонферрони после двунаправленного ANOVA. «Т» - время, проведенное в целевом квадранте; «О» - среднее время, проведенное в трех других квадрантах.

Добавки D1 и D2 довольно значимо, но частично уменьшили дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Добавки D3 и D4 значимо и полностью облегчили дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Результаты представлены на Фиг. 14, при этом влияние пищевой добавки по изобретению на задержку перехода показано на диаграмме слева, и на задержку выхода - на диаграмме справа, что измерен в течение периода запоминания.

На Фиг. 14: Физраствор/Носитель соответствует отрицательному контролю (группа, в которой не вводили D-галактозу и кормили гранулами, приготовленными с носителем - кокосовым маслом); D-галактоза 150/Носитель соответствует положительному контролю (группа, в которой вводили D-галактозу и кормили гранулами, приготовленными с носителем - кокосовым маслом); D1, D2, D3 и D4 - увеличивающиеся дозы добавки; N составляет от 11 до 12 в зависимости от групп; *** p < 0,0001 по сравнению с Физраствором/группа Носитель, ### p < 0,0001 по сравнению с группой D-галактоза 150/группа Носитель; Тест Даннета.

Добавка D1 не продемонстрировала никакого влияния на долговременную контекстуальную память.

Влияние пищевой добавки на перекисное окисление липидов, вызванное D-галактозой

Результаты представлены на Фиг. 15.

На Фиг. 15: Физраствор/Носитель соответствует отрицательному контролю (группа, в которой не вводили D-галактозу и кормили гранулами, приготовленными с носителем - кокосовым маслом); D-галактоза 150/Носитель соответствует положительному контролю (группа, в которой вводили D-галактозой и кормили гранулами, приготовленными с носителем - кокосовым маслом); D1, D2, D3 и D4 - увеличивающиеся дозы добавки; N составляет от 11 до 12 в зависимости от групп; ** p < 0,01, *** p < 0,0001 по сравнению с Физраствором/группа Носитель, ## p < 0,01, ### p < 0,0001 по сравнению с группой D-галактоза 150/группа Носитель; Тест Даннета.

Добавка D1 довольно значимо, но частично снизила окислительный стресс, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Добавки D2, D3 и D4 значимо и полностью снизили окислительный стресс, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой.

Влияние пищевой добавки на индуцированную D-галактозой экспрессию TNF-α в коре головного мозга и плазме

Результаты представлены на Фиг. 16, где влияние на кору показано на левой диаграмме, а влияние на плазму - на правой.

На Фиг. 16: Физраствор/Носитель соответствует отрицательному контролю (группа, в которой не вводили D-галактозу и кормили гранулами, приготовленными с носителем - кокосовым маслом); D-галактоза 150/Носитель соответствует положительному контролю (группа, в которой вводили D-галактозу и кормили гранулами, приготовленными с носителем - кокосовым маслом); D1, D2, D3 и D4 - увеличивающиеся дозы добавки; N составляет от 11 до 12 в зависимости от групп; *** p < 0,0001 по сравнению с Физраствором/группа Носитель, ### p < 0,0001 по сравнению с группой D-галактоза 150/группа Носитель; Тест Даннета.

Добавка D1 довольно значимо, но частично снизила увеличение уровня TNF-α, вызванное хронической интоксикацией D-галактозой, в головном мозге и плазме.

Добавка D2 довольно значимо и полностью снизила увеличение уровня TNF-α, вызванное хронической интоксикацией D-галактозой, в головном мозге, но только частично в плазме.

Добавка D3 довольно значимо, но частично снизила увеличение уровня TNF-α, вызванное хронической интоксикацией D-галактозой, в головном мозге и полностью - в плазме.

Добавка D4 довольно значимо и полностью снизила увеличение уровня TNF-α, вызванное хронической интоксикацией D-галактозой, в головном мозге и плазме.

Влияние пищевой добавки на индуцированную D-галактозой экспрессию IL-6 в коре головного мозга и плазме

Результаты представлены на Фиг. 17, где влияние на кору показано на левой диаграмме, а влияние на плазму - на правой.

На Фиг. 17: Физраствор/Носитель соответствует отрицательному контролю (группа, в которой не вводили D-галактозу и кормили гранулами, приготовленными с носителем - кокосовым маслом); D-галактоза 150/Носитель соответствует положительному контролю (группа, в которой вводили D-галактозу и кормили гранулами, приготовленными с носителем - кокосовым маслом); D1, D2, D3 и D4 - увеличивающиеся дозы добавки; N составляет от 11 до 12 в зависимости от групп; *** p < 0,0001 по сравнению с Физраствором/группа Носитель, ### p < 0,0001 по сравнению с группой D-галактоза 150/группа Носитель; Тест Даннета.

Хроническая интоксикация D-галактозой значимо и значимо увеличила уровень IL-6 в коре головного мозга и плазме по сравнению с группой отрицательного контроля (Физраствор/Носитель).

Добавки D1 и D2 довольно значимо, но частично снизили увеличение уровня IL-6, вызванное хронической интоксикацией D-галактозой, в головном мозге и плазме.

Добавки D3 и D4 значимо и полностью снизили увеличение уровня IL-6, вызванное хронической интоксикацией D-галактозой, в головном мозге и плазме.

Выводы:

Профилактическое лечение пищевой добавкой по изобретению является дозозависимым и в случае самой высокой испытанной дозы (добавка D4) значимо и полностью ослабило дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой, проявляющейся в изменении поведения, усилении окислительного стресса и активации нейровоспалительных процессов. А в случае более низких промежуточных доз (добавки D2 и D3) добавка по изобретению довольно значимо и полностью ослабила дефицит, вызванный хронической интоксикацией D-галактозой, проявляющийся в пространственной рабочей памяти, увеличении окислительного стресса и активации нервно-воспалительных процессов.

Таким образом, применяя формулу для расчета эквивалентной суточной дозы для человека, профилактическое лечение возрастного когнитивного снижения может осуществляться с ежедневным приемом от 1,7 до 5,3 мг пищевой добавки на килограмм массы тела.

Claims

1. Пищевая добавка, содержащая от 50 до 170 мг/г смеси стеаридоновой кислоты (SDA), альфа-линоленовой кислоты (ALA), эйкозапентаеновой кислоты (EPA) и докозагексаеновой кислоты (DHA), от 10 до 25 мг/г фукоксантина, от 1 до 6 мг/г стеринов, от 2 до 40 мкг/г фикопростана и кокосовое масло.

2. Пищевая добавка по п. 1, где стерины выбраны из фитостеринов.

3. Пищевая добавка по п. 1 или 2, где фикопростаны выбраны из фитопростанов, изопростанов и нейропростанов.

4. Пищевая добавка по любому из пп. 1-3, дополнительно содержащая по меньшей мере одну добавку, выбранную из консервантов, красителей, ароматизаторов, дезинтегрирующих агентов, смазывающих агентов, покрывающих или инкапсулирующих агентов.

5. Пищевая добавка по любому из пп. 1-4, которая имеет форму желатиновых капсул, капсул, таблеток, пастилок или рассыпчатого порошка.

6. Пищевая добавка по любому из пп. 1-5, которая упакована в виде доз, имеющих массу одной единицы от 10 мг до 1 г.

7. Применение микроводоросли, выбранной из любого из таксонов Pinguiophyceae, Chrysophyceae, Bacillariophyceae, Mamiellophyceae, Prymnesiophyceae, Haptophyceae, Coccolithophyceae, Isochrysidaceae и Phaeodactylaceae, для получения пищевой добавки по любому из пп. 1-6.

8. Применение по п. 7, в котором указанная микроводоросль представляет собой Tisochrysis lutea или Phaeodactylum tricornutum.

9. Применение пищевой добавки по любому из пп. 1-6 для предотвращения появления возрастных когнитивных расстройств, определяемых как непатологическое снижение когнитивных функций, или когнитивных расстройств у детей или молодых людей, подвергшихся пренатальному стрессу, вызывающему непатологические расстройства, такие как гиперактивность, дефицит внимания и памяти, задержка речи и тревожное поведение.

10. Применение пищевой добавки по п. 9 для предотвращения появления возрастных когнитивных расстройств, определяемых как непатологическое снижение когнитивных функций, характеризующееся тем, что суточная доза составляет от 2 до 5 мг пищевой добавки на килограмм массы тела.

11. Применение пищевой добавки по п. 9 для предотвращения появления когнитивных расстройств у детей или молодых людей, подвергшихся пренатальному стрессу, вызывающему непатологические расстройства, такие как гиперактивность, дефицит внимания и памяти, задержка речи и тревожное поведение, характеризующееся тем, что суточная доза составляет от 0,05 до 0,1 мг пищевой добавки на килограмм массы тела.