RU2809156C1 - Radioligand method of quantitative assessment of beta-adrenergic receptor activity on surface of human lymphocytes - Google Patents
Radioligand method of quantitative assessment of beta-adrenergic receptor activity on surface of human lymphocytes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2809156C1 RU2809156C1 RU2022133133A RU2022133133A RU2809156C1 RU 2809156 C1 RU2809156 C1 RU 2809156C1 RU 2022133133 A RU2022133133 A RU 2022133133A RU 2022133133 A RU2022133133 A RU 2022133133A RU 2809156 C1 RU2809156 C1 RU 2809156C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lymphocytes
- centrifugation
- analysis
- sediment
- minutes
- Prior art date
Links
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 title abstract description 18
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 title description 9
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 title description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 62
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 38
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims abstract description 27
- QXIUMMLTJVHILT-UHFFFAOYSA-N 4-[3-(tert-butylamino)-2-hydroxypropoxy]-1H-indole-2-carbonitrile Chemical compound CC(C)(C)NCC(O)COC1=CC=CC2=C1C=C(C#N)N2 QXIUMMLTJVHILT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims abstract description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- GKJZEKSHCJELPL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-5-[2-[[2-hydroxy-3-[4-[1-methyl-4-(trifluoromethyl)-2-imidazolyl]phenoxy]propyl]amino]ethoxy]benzamide Chemical compound CN1C=C(C(F)(F)F)N=C1C(C=C1)=CC=C1OCC(O)CNCCOC1=CC=C(O)C(C(N)=O)=C1 GKJZEKSHCJELPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- VFIDUCMKNJIJTO-BBRMVZONSA-N ICI 118551 Chemical compound CC(C)N[C@@H](C)[C@@H](O)COC1=CC=C(C)C2=C1CCC2 VFIDUCMKNJIJTO-BBRMVZONSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 102000016966 beta-2 Adrenergic Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010014499 beta-2 Adrenergic Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 230000016507 interphase Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 32
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 18
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 18
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 12
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 2-butanol Substances CCC(C)O BTANRVKWQNVYAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 2-propanol Substances CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 125000000031 ethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])N([H])[*] 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 2
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N (+-)-Isoprenaline Chemical compound CC(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000884 Airway Obstruction Diseases 0.000 description 1
- 208000009079 Bronchial Spasm Diseases 0.000 description 1
- 208000014181 Bronchial disease Diseases 0.000 description 1
- 206010006440 Bronchial obstruction Diseases 0.000 description 1
- 208000027775 Bronchopulmonary disease Diseases 0.000 description 1
- 206010006482 Bronchospasm Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000034286 G proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- JWZZKOKVBUJMES-NSHDSACASA-N L-isoprenaline Chemical compound CC(C)NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 JWZZKOKVBUJMES-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000068 Th17 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 239000000332 adrenergic beta-1 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000000971 adrenergic beta-2 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000000808 adrenergic beta-agonist Substances 0.000 description 1
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940125388 beta agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000002876 beta blocker Substances 0.000 description 1
- 102000016967 beta-1 Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010014494 beta-1 Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940125425 inverse agonist Drugs 0.000 description 1
- WGSPBWSPJOBKNT-UHFFFAOYSA-N iodocyanopindolol Chemical compound CC(C)NCC(O)COC1=CC=CC2=C1C(I)=C(C#N)N2 WGSPBWSPJOBKNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940039009 isoproterenol Drugs 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000002433 mononuclear leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Изобретение относится к области медицины. Более конкретно, изобретение обеспечивает модифицированный радиолигандный способ количественной оценки активности связывания β-адренорецепторов (β-АР) на поверхности лимфоцитов человека, позволяющий достоверно определять специфическое связывание с β1-адренорецепторами (β1-AP) и β2-адренорецепторами (β2-АР) при их малых концентрациях, на основе которого возможно выполнение анализов в рамках клинических исследований.The invention relates to the field of medicine. More specifically, the invention provides a modified radioligand method for quantitatively assessing β-adrenergic receptor (β-AR) binding activity on the surface of human lymphocytes, allowing specific binding to β1-adrenergic receptors (β1-AP) and β2-adrenergic receptors (β2-AR) to be reliably determined when low concentrations, on the basis of which it is possible to perform analyzes in clinical studies.
Уровень техникиState of the art
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и бронхиальная астма (БА) и являются широко распространенными заболеваниями, которые представляют собой серьезную медицинскую и социальную проблему: по данным Всемирной организации здравооохранинения (ВОЗ) в 2019 году число больных ХОБЛ в возрасте 30-79 лет во всем мире оценено 391,9 млн., из которых 315,5 млн. (80,5%) проживают в странах с низким и средним доходом населения. ХОБЛ стала третьей по значимости (3,23 млн. случаев) причиной смертности после онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний (примерно по 18 млн.) (Adeloye D., Song P., Zhu Y., Campbell H., Sheikh A., Rudan I. Global, regional, and national prevalence of, and risk factors for, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) in 2019: a systematic review and modeling analysis. II Lancet Respir. Med. - 2022. - V.10, Iss.5. - P.447-458).Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and bronchial asthma (BA) are widespread diseases that represent a serious medical and social problem: according to the World Health Organization (WHO), in 2019 the number of COPD patients aged 30-79 years throughout the world is estimated at 391.9 million, of which 315.5 million (80.5%) live in countries with low and middle income. COPD has become the third leading cause of death (3.23 million cases) after cancer and cardiovascular diseases (approximately 18 million each) (Adeloye D., Song P., Zhu Y., Campbell H., Sheikh A., Rudan I. Global, regional, and national prevalence of, and risk factors for, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) in 2019: a systematic review and modeling analysis. II Lancet Respir. Med. - 2022. - V.10, Iss. 5. - P.447-458).
В том же году ВОЗ зарегистрировано 262 млн. больных БА и 455 тыс.смертельных исходов этого заболевания (Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. // Lancet. - 2020. - V.396, Iss. 10258. - P. 1204-1222). Особую обеспокоенность вызывает высокая распространенность БА среди детей по сравнению с остальными возрастными группами.In the same year, WHO registered 262 million patients with asthma and 455 thousand deaths from this disease (Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. / / Lancet. - 2020. - V.396, Iss. 10258. - P. 1204-1222). Of particular concern is the high prevalence of asthma among children compared to other age groups.
Ключевой особенностью этих заболеваний является развитие обструкции дыхательных путей. Развитие морфофункциональных изменений при ХОБЛ и БА связаны с формированием локального и системного хронического воспаления в дыхательных путях (Barnes P.J. Cellular and molecular mechanisms of asthma and COPD. // Clinical science. - 2017. -V.131 (13). - P. 1541-1558; Eliseeva T.I., Tush E.V., Krasilnikova S.V., Kuznetsova S.V., Larin R.A., Kubysheva, N.I., Khaletskay O.V., Potemina Т.Е., Ryazantsev S.V., Ignatov S.K. Metabolism of the Extracellular Matrix in Bronchial Asthma.// Sovremennye Tehnologii v Medicine. - 2018. - V. 10 (4).- P. 220).A key feature of these diseases is the development of airway obstruction. The development of morphofunctional changes in COPD and asthma are associated with the formation of local and systemic chronic inflammation in the respiratory tract (Barnes P.J. Cellular and molecular mechanisms of asthma and COPD. // Clinical science. - 2017. -V.131 (13). - P. 1541 -1558; Eliseeva T.I., Tush E.V., Krasilnikova S.V., Kuznetsova S.V., Larin R.A., Kubysheva, N.I., Khaletskay O.V., Potemina T.E., Ryazantsev S.V., Ignatov S.K. Metabolism of the Extracellular Matrix in Bronchial Asthma.// Sovremennye Tehnologii v Medicine. - 2018. - V. 10 (4). - P. 220).
При этом воспаление дыхательных путей при БА и ХОБЛ заметно различается. Астма характеризуется активацией тучных клеток и Т-хелперов 2-го типа, эозинофильной инфильтрацией в дыхательных путях. При ХОБЛ, как правило, в дыхательных путях наблюдается инфильтрация нейтрофилов и макрофагов, которая вызывается Т-хелперами, клетками типа 1 и 17 и Т-клетками CD8 (Lane N., Robins R. A., Corne J., Fairclough L. Regulation in chronic obstructive pulmonary disease: the role of regulatory T-cells and Th17 cells. // Clin. Sci. - 2010. - V. l 19(2). - P. 75-86).However, airway inflammation in asthma and COPD differs markedly. Asthma is characterized by activation of mast cells and type 2 T-helper cells, eosinophilic infiltration in the airways. In COPD, as a rule, infiltration of neutrophils and macrophages is observed in the airways, which is caused by T helper cells,
На молекулярном уровне в патологию БА и ХОБЛ вовлечены АР, которые по структуре относятся к группе рецепторов, соединенных с гуанин-нуклеотид связывающими белками (G-белок). На тканевом уровне в легких присутствуют преимущественно Р2-АР (Sano М., Yoshimasa Т., Yagura Т., Yamamoto I. Non-homogeneous distribution of beta 1- and beta 2-adrenoceptors in various human tissues. // Life Sci. - 1993. - Vol.52(12). - P. 1063-1070), которые также имеются и на поверхности лимфоцитов. Поэтому для диагностики и лечения Б А и ХОБЛ большое значение имеют характеристики β2-АР, такие как их плотность на поверхности клеток и активность.At the molecular level, the pathology of asthma and COPD involves ARs, which structurally belong to the group of receptors connected to guanine-nucleotide binding proteins (G-protein). At the tissue level, predominantly P2-ARs are present in the lungs (Sano M., Yoshimasa T., Yagura T., Yamamoto I. Non-homogeneous distribution of beta 1- and beta 2-adrenoceptors in various human tissues. // Life Sci. - 1993. - Vol.52(12). - P. 1063-1070), which are also present on the surface of lymphocytes. Therefore, for the diagnosis and treatment of asthma and COPD, the characteristics of β2-AR, such as their density on the cell surface and activity, are of great importance.
Отмечено, что при заболеваниях бронхо-легочной системы у пациентов уже имеется исходно измененный фон активности АР. В основе терапии таких заболеваний часто лежат β-адреномиметики, которые для соответствующих рецепторов являются лигандами. Изменения экспрессии и аффинности рецепторов, происходящие под воздействием соответствующих препаратов, часто приводят к снижению эффективности назначенной терапии, а в ряде случаев - к развитию серьезных побочных эффектов, таких как бронхоспазм.It is noted that in diseases of the bronchopulmonary system, patients already have an initially altered background of AR activity. The treatment of such diseases is often based on β-adrenergic agonists, which are ligands for the corresponding receptors. Changes in the expression and affinity of receptors that occur under the influence of corresponding drugs often lead to a decrease in the effectiveness of prescribed therapy, and in some cases to the development of serious side effects, such as bronchospasm.
Взаимодействие «лиганд-рецептор» зависит от типа лиганда (агонист или обратный агонист) и проявляется в изменении клеточной активности. Агонисты, связываясь с рецептором, активируют G-белок и увеличивают внутриклеточное содержание циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). Одновременно с возникновением клинического эффекта данные изменения в клетке также вызывают изменение активности рецептора. Зачастую назначение агонистов приводит к снижению чувствительности рецепторов к лиганду и их десенситизации (Mickey J., Tate R., Lefkowitz J. Subsensitivity of adenylate cyclase and decreased beta-adrenergic receptor binding after chronic exposure to (-)isoproterenol in vitro. II J. biol. С hem. - 1975. - V.250. - P. 5727-5729), что в ряде случаев вызывает неблагоприятное изменение клинического течения заболевания в виде утяжеляющейся бронхиальной обструкции и отсутствии ответа на проводимую терапию.The ligand-receptor interaction depends on the type of ligand (agonist or inverse agonist) and is manifested in changes in cellular activity. Agonists, by binding to the receptor, activate the G protein and increase the intracellular content of cyclic adenosine monophosphate (cAMP). At the same time as the clinical effect occurs, these changes in the cell also cause a change in receptor activity. Often, the administration of agonists leads to a decrease in the sensitivity of receptors to the ligand and their desensitization (Mickey J., Tate R., Lefkowitz J. Subsensitivity of adenylate cyclase and decreased beta-adrenergic receptor binding after chronic exposure to (-)isoproterenol in vitro. II J. biol. C hem. - 1975. - V.250. - P. 5727-5729), which in some cases causes an unfavorable change in the clinical course of the disease in the form of worsening bronchial obstruction and lack of response to therapy.
Применение антагонистов, напротив, приводит к повышению плотности β-АР на поверхности клеток и может повлиять на их аффинность (Парфенова Е.Ф., Красникова Т.Л., Арипова Н.А. и др. II Гер. Архив. - 1993. - Т. 65(4). - С. 49-52).The use of antagonists, on the contrary, leads to an increase in the density of β-AR on the cell surface and can affect their affinity (Parfenova E.F., Krasnikova T.L., Aripova N.A. et al. II Ger. Archives - 1993. - T. 65(4). - P. 49-52).
В результате исследований, описанных в статье Bishopric N., Cohen Н., Lefkowitz R. Beta adrenergic receptors in lymphocyte subpopulations. // J. Allergy and Clin. Immun. - 1980. V.65(1). - P. 29-33, было установлено, что периферические В- и Т-лимфоциты имеют приблизительно равную плотность бета-адренорецепторов и показывают сопоставимо сильные ответы на изопротеренол, стимулирующий внутриклеточное накопление цАМФ, уменьшающее иммунный цитолиз.As a result of the studies described in the article Bishopric N., Cohen N., Lefkowitz R. Beta adrenergic receptors in lymphocyte subpopulations. // J. Allergy and Clin. Immun. - 1980. V.65(1). - P. 29-33, it was found that peripheral B and T lymphocytes have approximately equal densities of beta-adrenergic receptors and show comparable strong responses to isoproterenol, which stimulates the intracellular accumulation of cAMP, which reduces immune cytolysis.
Для специфического связывания популяций лимфоцитов, обогащенных В- или Т-клетками, с (-)-[3Н]-дигидроалпренололом ([3H]DHA, специфичный бета-антагонист с высоким сродством), а также для исходной смеси без разделения при насыщении были определены следующие характеристики:For specific binding of B- or T-cell-enriched lymphocyte populations to (-)-[ 3H ]-dihydroalprenolol ([ 3H ]DHA, a specific high-affinity beta-antagonist), as well as for the starting mixture without separation at saturation The following characteristics were determined:
В заключение авторы отмечают, что различия в содержании рецепторов, отмечаемые в популяциях лимфоцитов при различных заболеваниях не могут быть отнесены к различиям в соотношении В- и Т-субпопуляций, но могут отражать изменения, характерные именно для патологического состояния.In conclusion, the authors note that differences in receptor content observed in lymphocyte populations in various diseases cannot be attributed to differences in the ratio of B and T subpopulations, but may reflect changes specific to the pathological condition.
В статье Landmann R.M.A., Burgisser Е., Wesp М., Buhler F.R. Beta-Adrenergic Receptors are Different in Subpopulations of Human Circulating Lymphocytes. // J. Receptor. Res. - 1984. - V.4. - P. 37-50 приведены результаты исследований зависимостей специфического и неспецифического связывания В-клеток и Т-клеток с (±)125I-цианопиндололом ([125I]CYP) от его концентрации (пМ), представленные на Фиг. 1. Для специфического связывания (сплошные линии) зависимости имеют вид кривых насыщения, и связывание В-клеток с лигандом примерно в 2,5 раза выше, чем для Т-клеток. Для неспецифического связывания (пунктирные линии) зависимости являются линейными, а указанное различие менее выражено.In the article Landmann RMA, Burgisser E, Wesp M, Buhler FR Beta-Adrenergic Receptors are Different in Subpopulations of Human Circulating Lymphocytes. // J. Receptor. Res. - 1984. - V.4. - P. 37-50 shows the results of studies of the dependence of specific and nonspecific binding of B cells and T cells with (±) 125 I-cyanopindolol ([ 125 I]CYP) on its concentration (pM), presented in Fig. 1. For specific binding (solid lines), the dependences look like saturation curves, and the binding of B cells to the ligand is approximately 2.5 times higher than for T cells. For nonspecific binding (dashed lines), the dependences are linear, and the indicated difference is less pronounced.
Для популяций лимфоцитов, отсортированных непосредственно цитофлуорографически (В-клетки) и после иммунофлуоресцентного мечения моноклональными антителами против фенотипов Т-, Т-хелперных (Th) и Т-суппрессорных (Ts) клеток, по результатам инкубации с [125I]CYP были определены параметры связывания и соотношения рецепторов в клетках, имеющие следующие значения:For populations of lymphocytes sorted directly cytofluorographically (B cells) and after immunofluorescent labeling with monoclonal antibodies against T-, T-helper (Th) and T-suppressor (Ts) cell phenotypes, parameters were determined based on the results of incubation with [ 125 I]CYP binding and ratio of receptors in cells, having the following meanings:
Для В-лимфоцитов число сайтов связывания в 2,6 раза больше, а константа диссоциации в 1,5…3 раза выше по сравнению с Т-лимфоцитами. Таким образом, возможность оценки характеристик Т-лимфоцитов по показателям суммарных лимфоцитов не является очевидной.For B lymphocytes, the number of binding sites is 2.6 times greater, and the dissociation constant is 1.5...3 times higher compared to T lymphocytes. Thus, the possibility of assessing the characteristics of T-lymphocytes based on total lymphocytes is not obvious.
Кроме того, следует отметить, что способ, раскрытый в рассматриваемой статье, позволяет оценивать только экспрессию АР, но не активность связывания, под которой понимают способность рецептора связывать регистрируемое количество меченого лиганда в строго определенных условиях, выраженное в имп/(мин ⋅ 106) клеток. Данный параметр является интегральным, то есть зависящим от изменения экспрессии и аффинности рецепторного аппарата и функциональным, поскольку измеряемое изменение активности связывания отражает реакцию рецепторной системы на воздействие специфических лигандов или лекарственных средств.In addition, it should be noted that the method disclosed in the article in question allows one to evaluate only AR expression, but not binding activity, which is understood as the ability of the receptor to bind a recorded amount of labeled ligand under strictly defined conditions, expressed in imp/(min ⋅ 10 6 ) cells. This parameter is integral, that is, dependent on changes in the expression and affinity of the receptor apparatus and functional, since the measured change in binding activity reflects the response of the receptor system to the effects of specific ligands or drugs.
Из уровня техники известен способ селективной количественной оценки активности связывания β1-АР на поверхности лимфоцитов человека, раскрытый в патентной публикации ЕА 026837 (опубл. 31.05.2017), при осуществлении которого для оценки активности связывания β-AP по специфическому связыванию [125I]CYP клетками, определяют разность связывания [125I]CYP клетками в присутствии 1,5-2,0 мкМ нерадиоактивного цианопиндолола и связывания [125I]CYP клетками в присутствии 0,20-0,28 мкМ β1-специфического лиганда CGP-20712 (химическое название - дигидрохлорид [2-((3-карбамоил-4-гидрокси)фенокси)этиламино]-3-[4-(1-метил-4-трифторметил-2-имидазолил)фенокси]-2-пропанола), для чего реакционную смесь, содержащую водный раствор [125I]CYP, фосфатный буферный раствор (PBS), раствор немеченого лиганда (цианопиндолола или CGP-20712) и суспензию клеток инкубируют в течение 45-60 мин при 37°С при осторожном перемешивании, процесс останавливают добавлением ледяной воды (холодная вода со льдом), клетки центрифугируют при 1800-2000 g в течение 10-12 мин, супернатант отбрасывают, осадок осторожно суспендируют в холодном (+4°С) PBS и вновь центрифугируют в тех же условиях, супернатант отбрасывают и осадок осторожно суспендируют в холодном PBS и центрифугируют при 10000-12000 g в течение 2-3 мин, супернатант отбрасывают, а осадок просчитывают на γ-счетчике, измеряя количество радиоактивного материала в каждой пробе, после чего вычисляют активность связывания β1-АР по разности общего связывания и β-специфического связывания цианопиндолола, отнесенное на 1 млн клеток.The prior art knows a method for selective quantitative assessment of β1-AP binding activity on the surface of human lymphocytes, disclosed in patent publication EA 026837 (published on May 31, 2017), in which the assessment of β-AP binding activity by specific binding of [ 125 I]CYP cells, determine the difference between [ 125 I]CYP binding to cells in the presence of 1.5-2.0 µM non-radioactive cyanopindolol and [ 125 I]CYP binding to cells in the presence of 0.20-0.28 µM β1-specific ligand CGP-20712 (chemical name - dihydrochloride [2-((3-carbamoyl-4-hydroxy)phenoxy)ethylamino]-3-[4-(1-methyl-4-trifluoromethyl-2-imidazolyl)phenoxy]-2-propanol), for which the reaction a mixture containing an aqueous solution of [ 125 I]CYP, phosphate buffer solution (PBS), a solution of unlabeled ligand (cyanopindolol or CGP-20712) and a cell suspension is incubated for 45-60 min at 37°C with gentle stirring, the process is stopped by adding ice water (cold water with ice), the cells are centrifuged at 1800-2000 g for 10-12 minutes, the supernatant is discarded, the sediment is carefully suspended in cold (+4°C) PBS and centrifuged again under the same conditions, the supernatant is discarded and the sediment is carefully suspended in cold PBS and centrifuged at 10,000-12,000 g for 2-3 minutes, the supernatant is discarded, and the sediment is counted on a γ-counter, measuring the amount of radioactive material in each sample, after which the β1-AR binding activity is calculated from the difference in total binding and β-specific binding of cyanopindolol per 1 million cells.
Для количественной селективной оценки активности связывания β2-АР определяют разность связывания [125I]CYP клетками в присутствии 1,5-2,0 мкМ нерадиоактивного цианопиндолола и связывания [125I]CYP клетками в присутствии 0,14-0,18 мкМ β2-специфического лиганда ICI 118551 (химическое наименование гидрохлорид (±)-эритро-(S*,S*)-1-[2,3-(дигидро-7-метил-1Н-инден-4-ил)окси]-3-[(1-метилэтил)амино]-2-бутанола), для чего реакционную смесь, содержащую водный раствор [125I]CYP, PBS, раствор немеченого лиганда (цианопиндолола или ICI 118551) и суспензию клеток, инкубируют в течение 45-60 мин при 37°С при осторожном перемешивании, процесс останавливают добавлением ледяной воды (холодная вода со льдом), клетки центрифугируют при 1800-2000 g в течение 10-12 мин, супернатант отбрасывают, осадок осторожно суспендируют в холодном (+4°С) PBS и вновь центрифугируют в тех же условиях, супернатант отбрасывают и осадок осторожно суспендируют в холодном PBS и центрифугируют при 10000-12000 g в течение 2-3 мин, супернатант отбрасывают, а осадок просчитывают на γ-счетчике, измеряя количество радиоактивного материала в каждой пробе, после чего вычисляют активность связывания β2-АР по разности общего связывания и β-специфического связывания цианопиндолола, отнесенного на 1 млн клеток. Недостатком данного технического решения является низкая чувствительность в отношении β1-AP.To quantitatively selectively assess β2-AR binding activity, determine the difference between [ 125 I]CYP binding by cells in the presence of 1.5-2.0 μM non-radioactive cyanopindolol and [ 125 I]CYP binding by cells in the presence of 0.14-0.18 μM β2- specific ligand ICI 118551 (chemical name hydrochloride (±)-erythro-(S*,S*)-1-[2,3-(dihydro-7-methyl-1H-inden-4-yl)oxy]-3-[ (1-methylethyl)amino]-2-butanol), for which the reaction mixture containing an aqueous solution of [ 125 I]CYP, PBS, a solution of an unlabeled ligand (cyanopindolol or ICI 118551) and a cell suspension is incubated for 45-60 min at 37°C with gentle stirring, the process is stopped by adding ice water (cold water with ice), the cells are centrifuged at 1800-2000 g for 10-12 minutes, the supernatant is discarded, the sediment is carefully suspended in cold (+4°C) PBS and again centrifuged under the same conditions, the supernatant is discarded and the sediment is carefully suspended in cold PBS and centrifuged at 10000-12000 g for 2-3 minutes, the supernatant is discarded and the sediment is counted on a γ-counter, measuring the amount of radioactive material in each sample, after which β2-AR binding activity is calculated from the difference between total binding and β-specific binding of cyanopindolol per 1 million cells. The disadvantage of this technical solution is the low sensitivity towards β1-AP.
В качестве ближайшего аналога заявляемого изобретения его авторы рассматривают способ радиолигандного определения активности связывания β1-AP Т-лимфоцитов человека, предложенный в патентной публикации ЕА 036081 (опубл. 23.09.2020), для осуществления которого проводят:As the closest analogue of the claimed invention, its authors consider a method for radioligand determination of the binding activity of human β1-AP T-lymphocytes, proposed in patent publication EA 036081 (published on September 23, 2020), for the implementation of which the following is carried out:
а) забор у объекта крови из периферической вены;a) taking the subject’s blood from a peripheral vein;
б) выделение Т-лимфоцитов общепринятым способом;b) isolation of T-lymphocytes in a generally accepted way;
в) постановку четырех параллельных анализов, при этом в первом из них к среде, содержащей Т-лимфоциты, добавляют воду, во втором в избытке добавляют «холодный» цианопиндолол, в третьем добавляют β1-АР лиганд CGP 20712, в четвертом добавляют β2-АР лиганд ICI 118551;c) setting up four parallel tests, in which in the first of them water is added to the medium containing T-lymphocytes, in the second “cold” cyanopindolol is added in excess, in the third the β1-AR ligand CGP 20712 is added, in the fourth the β2-AR is added ligand ICI 118551;
г) инкубацию в течение 25-30 мин при 37°С и скорости движения шейкера 100 об/мин;d) incubation for 25-30 minutes at 37°C and a shaker speed of 100 rpm;
д) добавление ко всем четырем предварительно инкубированным реакционным смесям по 100 мкл [125I]CYP;e) adding 100 μl of [ 125 I]CYP to all four pre-incubated reaction mixtures;
е) остановку реакции добавлением холодной воды;f) stopping the reaction by adding cold water;
ж) центрифугирование реакционной массы при 2000 g в течение 10-12 мин с отбрасыванием супернатанта;g) centrifugation of the reaction mass at 2000 g for 10-12 minutes with discarding the supernatant;
з) суспендирование осадка в холодном (+4°С) PBS с последующим центрифугированием в тех же условиях с отбрасыванием супернатанта;h) suspending the sediment in cold (+4°C) PBS, followed by centrifugation under the same conditions and discarding the supernatant;
и) суспендирование осадка в холодном (+4°С) PBS с последующим центрифугированием при 10000-12000 g в течение 2-3 мин с отбрасыванием супернатанта;i) suspending the sediment in cold (+4°C) PBS, followed by centrifugation at 10,000-12,000 g for 2-3 minutes, discarding the supernatant;
к) просчитывание осадка на γ-счетчике для измерения количества радиоактивного материала в каждой пробе;j) counting the sediment on a γ-counter to measure the amount of radioactive material in each sample;
л) вычисление активности связывания β1-АР по разности общего связывания и β-специфического связывания цианопиндолола, отнесенного на 1 млн клеток.k) calculation of β1-AR binding activity from the difference between total binding and β-specific binding of cyanopindolol per 1 million cells.
Исследования перспектив клинического применения способа, раскрытого в ЕА 036081, выявили его основной недостаток, заключающийся в существенных затратах времени на стадии пробоподготовки. В частности, стадия выделения слоя мононуклеарных клеток (суммарных лимфоцитов) занимает 85 минут. Дальнейшее выделение Т-лимфоцитов предполагает инкубацию ранее полученного и ресуспендированного центрифугата лимфоцитов со смесью антител Pan Т Cell Biotin Antibody Cocktail в течение 7 минут, последующую инкубацию смеси с магнитными частицами Pan Т Cell MicroBeard Cocktail в течение 15 минут, пропускание полученной суспензии через магнитные колонки и магнитную сепарацию, что требует времени, сопоставимого с предыдущей стадией. Последующие стадии прединкубации со специфическими лигандами и радиолигандного анализа занимают 45 минут и 90 минут соответственно. Таким образом, на долю подготовительных стадий приходится 60% общего времени выполнения анализа: осаждение эритроцитов и выделение Т-лимфоцитов занимают по 30% всего времени, что является существенным недостатком.Studies of the prospects for clinical application of the method disclosed in EA 036081 have revealed its main drawback, which consists in a significant investment of time at the sample preparation stage. In particular, the stage of isolating the layer of mononuclear cells (total lymphocytes) takes 85 minutes. Further isolation of T-lymphocytes involves incubating the previously obtained and resuspended lymphocyte centrifugate with a mixture of Pan T Cell Biotin Antibody Cocktail antibodies for 7 minutes, subsequent incubation of the mixture with Pan T Cell MicroBeard Cocktail magnetic particles for 15 minutes, passing the resulting suspension through magnetic columns and magnetic separation, which requires time comparable to the previous stage. The subsequent steps of preincubation with specific ligands and radioligand analysis take 45 minutes and 90 minutes, respectively. Thus, the preparatory stages account for 60% of the total analysis time: erythrocyte sedimentation and T-lymphocyte isolation each take 30% of the total time, which is a significant drawback.
Специалисту в области клинического анализа очевидно, что при идентичных аналитических областях и сопоставимых оценках специфичности, пределов обнаружения и определения, правильности, прецизионности и устойчивости предпочтителен наиболее экспрессный метод анализа. Исходя из этого, следует разработать радиолигандный способ количественной оценки активности β-АР на поверхности лимфоцитов человека, лишенный указанного недостатка известного технического решения, который будет иметь перспективы клинического применения.It is clear to the clinical analyst that, given identical analytical domains and comparable assessments of specificity, limits of detection and determination, accuracy, precision and robustness, the most rapid method of analysis is preferred. Based on this, it is necessary to develop a radioligand method for quantitative assessment of β-AR activity on the surface of human lymphocytes, devoid of the indicated disadvantage of the known technical solution, which will have prospects for clinical application.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
На Фиг. 1 представлены зависимости специфического и неспецифического связывания В-клеток и Т-клеток с [125I] от его концентрации (пМ), приведенные в публикации Landmann R.M.A., Btirgisser Е., Wesp М., Btihler F.R. Beta-Adrenergic Receptors are Different in Subpopulations of Human Circulating Lymphocytes. // J. Receptor. Res. - 1984. - V.4. - P. 37-50)In FIG. Figure 1 shows the dependence of specific and nonspecific binding of B cells and T cells with [ 125 I] on its concentration (pM), given in the publication Landmann RMA, Btirgisser E., Wesp M., Btihler FR Beta-Adrenergic Receptors are Different in Subpopulations of Human Circulating Lymphocytes. // J. Receptor. Res. - 1984. - V.4. - P. 37-50)
На Фиг. 2 представлена корреляция количественной оценки (процент связывания) активности β2-АР на поверхности Т-лимфоцитов человека с активностью β2-АР на поверхности суммарных лимфоцитов для выборки здоровых добровольцев.In FIG. Figure 2 shows the correlation of the quantitative assessment (percentage of binding) of β2-AR activity on the surface of human T-lymphocytes with the activity of β2-AR on the surface of total lymphocytes for a sample of healthy volunteers.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the invention
Целью заявляемого изобретения является разработка радиолигандного способа количественной оценки активности β2-АР на поверхности лимфоцитов человека с улучшенной экспрессностью.The purpose of the claimed invention is to develop a radioligand method for quantitative assessment of β2-AR activity on the surface of human lymphocytes with improved expressivity.
Первым техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для количественной оценки активности β2-АР на поверхности лимфоцитов человека.The first technical result of the invention is the expansion of the arsenal of tools for quantitative assessment of β2-AR activity on the surface of human lymphocytes.
Вторым техническим результатом изобретения является способ количественной оценки активности 02-АР на поверхности Т-лимфоцитов человека по корреляции с активностью β2-АР на поверхности суммарных лимфоцитов.The second technical result of the invention is a method for quantitative assessment of 02-AR activity on the surface of human T-lymphocytes by correlation with β2-AR activity on the surface of total lymphocytes.
В результате проведения обширных исследований авторы настоящего изобретения адаптировали способ радиолигандного определения активности связывания β1-АР Т-лимфоцитов человека, раскрытый в ЕА 036081, для определения активности связывания β2-АР суммарных лимфоцитов человека.As a result of extensive research, the present inventors have adapted the radioligand method for determining the β1-AR binding activity of human T lymphocytes, disclosed in EA 036081, to determine the β2-AR binding activity of total human lymphocytes.
Также на образцах крови здоровых добровольцев авторы изобретения неожиданно выявили статистически достоверную корреляцию активности связывания β2-АР на поверхности Т-лимфоцитов человека с активностью связывания β2-АР на поверхности суммарных лимфоцитов, что позволило упростить стадию пробоподготовки и ускорить ее проведение. Данный факт улучшает перспективы клинического применения заявляемого способа после его апробации на образцах крови пациентов, страдающих БА, ХОБЛ и другими бронхо-легочными заболеваниями, и последующей валидации.Also, using blood samples from healthy volunteers, the authors unexpectedly revealed a statistically significant correlation between the β2-AR binding activity on the surface of human T-lymphocytes and the β2-AR binding activity on the surface of total lymphocytes, which made it possible to simplify the sample preparation stage and speed up its implementation. This fact improves the prospects for the clinical application of the proposed method after its testing on blood samples from patients suffering from asthma, COPD and other bronchopulmonary diseases, and subsequent validation.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предложен способ радиолигандного определения активности связывания β2-адренорецепторов (β2-АР) лимфоцитов человека, для осуществления которого проводят:Thus, in accordance with the present invention, a method for radioligand determination of the binding activity of β2-adrenergic receptors (β2-AR) of human lymphocytes is proposed, for which the following is carried out:
а) забор у объекта крови из периферической вены;a) taking the subject’s blood from a peripheral vein;
б) центрифугирование крови при 500 об/мин в течение 5-10 мин при комнатной температуре до осаждения эритроцитов с получением плазмы, обогащенной лейкоцитами и лимфоцитами;b) centrifugation of blood at 500 rpm for 5-10 minutes at room temperature until red blood cells sediment to obtain plasma enriched with leukocytes and lymphocytes;
в) наслаивание полученной плазмы на Histopaque-1077 и центрифугирование при 400 g при комнатной температуре в течение 25 мин с получением интерфазного кольца, содержащего пул суммарных лимфоцитов;c) layering the resulting plasma onto Histopaque-1077 and centrifugation at 400 g at room temperature for 25 minutes to obtain an interphase ring containing a pool of total lymphocytes;
г) постановку четырех параллельных анализов с добавлением в каждом из них [125I]цианопиндолола ([125I]CYP) к среде, содержащей пул суммарных лимфоцитов:d) performing four parallel analyzes with the addition of [ 125 I]cyanopindolol ([ 125 I]CYP) to the medium containing a pool of total lymphocytes in each of them:
в первом анализе добавляют воду, во втором анализе в избытке добавляют «холодный» цианопиндолол, в третьем анализе добавляют β1-АР лиганд CGP 20712, в четвертом анализе добавляют β2-АР лиганд ICI 118551 и проводят инкубацию каждого анализируемого образца в течении 25-30 минут при 37°С и скорости движения шейкера 100 об/мин;in the first analysis, water is added, in the second analysis, “cold” cyanopindolol is added in excess, in the third analysis, β1-AR ligand CGP 20712 is added, in the fourth analysis, β2-AR ligand ICI 118551 is added and each analyzed sample is incubated for 25-30 minutes at 37°C and
д) остановку реакции добавлением холодной воды;e) stopping the reaction by adding cold water;
е) центрифугирование реакционной массы при 2000 g в течение 10-12 минут с отбрасыванием супернатанта;f) centrifugation of the reaction mass at 2000 g for 10-12 minutes with discarding the supernatant;
ж) суспендирование осадка в холодном (+4°С) физиологическом растворе с последующим центрифугированием в тех же условиях с отбрасыванием супернатанта;g) suspending the sediment in cold (+4°C) physiological solution, followed by centrifugation under the same conditions and discarding the supernatant;
з) суспендирование осадка в холодном (+4°С) физиологическом растворе с последующим центрифугированием при 10000-12000 g в течение 2-3 минут с отбрасыванием супернатанта;h) suspending the sediment in cold (+4°C) physiological solution, followed by centrifugation at 10,000-12,000 g for 2-3 minutes, discarding the supernatant;
и) просчитывание осадка на γ-счетчике для измерения количества радиоактивного материала в каждой пробе иi) counting the sediment on a γ-counter to measure the amount of radioactive material in each sample and
к) вычисление активности связывания β2-АР по результатам четвертого анализа по разности общего связывания и бета-специфического связывания цианопиндолола, отнесенного на 1 млн клеток.j) calculation of β2-AR binding activity based on the results of the fourth analysis based on the difference in total binding and beta-specific binding of cyanopindolol per 1 million cells.
В соответствии с изобретением осуществляют способ радиолигандного определения активности связывания β2-адренорецепторов (β2-АР) суммарных лимфоцитов человека. В качестве способа сравнения выбирают адаптированный способ радиолигандного определения активности связывания β1-АР Т-лимфоцитов человека, раскрытый в описании изобретения к патенту ЕА 036081, путем замены фосфатного буферного раствора (PBS) на натрия хлорида 0,9% раствор в воде очищенной стерилизованный (физиологический раствор, ФР). Авторы установили, что указанная замена не влияет на аналитические характеристики способа. Не ограничиваясь данным объяснением, авторы полагают, что стабилизация рН буферным раствором не имеет принципиального значения вследствие низких концентраций компонентов анализируемых растворов и их достаточной химической стабильности в среде, близкой к нейтральной.In accordance with the invention, a method for radioligand determination of the binding activity of β2-adrenergic receptors (β2-AR) of total human lymphocytes is carried out. As a comparison method, select an adapted method for radioligand determination of human β1-AR T-lymphocyte binding activity, disclosed in the description of the invention to patent EA 036081, by replacing the phosphate buffer solution (PBS) with sodium chloride 0.9% solution in purified sterilized water (physiological solution, FR). The authors found that this replacement does not affect the analytical characteristics of the method. Without limiting ourselves to this explanation, the authors believe that pH stabilization with a buffer solution is not of fundamental importance due to the low concentrations of the components of the analyzed solutions and their sufficient chemical stability in an environment close to neutral.
В результате осуществления способа в соответствии с заявляемым изобретением и способа сравнения установлена корреляция с коэффициентом корреляции R = 0,598 (Фиг. 2) активности связывания β2-АР на поверхности Т-лимфоцитов человека с активностью связывания β2-АР на поверхности суммарных лимфоцитов человека, наличие которой неочевидно для среднего специалиста в данной области, ознакомленного с уровнем техники.As a result of the implementation of the method in accordance with the claimed invention and the comparison method, a correlation was established with a correlation coefficient R = 0.598 (Fig. 2) of β2-AR binding activity on the surface of human T-lymphocytes with β2-AR binding activity on the surface of total human lymphocytes, the presence of which not obvious to the average specialist in the field familiar with the state of the art.
Существенный разброс значений активности связывания обусловлен сложным совместным влиянием факторов индивидуальных особенностей организма каждого добровольца, которое не может быть заранее оценено и учтено. Тем не менее, при назначении препаратов, влияющих на β2-АР, и корректировке режимов их введения клиническое значение имеют не абсолютные показатели активности связывания, а динамические изменения полученных значений при проведении терапии.The significant scatter in the values of binding activity is due to the complex combined influence of factors of the individual characteristics of the body of each volunteer, which cannot be assessed and taken into account in advance. However, when prescribing drugs that affect β2-AR and adjusting their administration regimens, it is not the absolute indicators of binding activity that are clinically important, but the dynamic changes in the obtained values during therapy.
Существование установленной корреляции позволяет связать результаты, полученные для суммарных лимфоцитах, с динамикой изменения в Т-лимфоцитах периферической крови и экстраполировать количественные характеристики β-АР лимфоцитарного звена на легкие. Ранее было продемонстрировано снижение β-АР в легких под действием β-агонистов, что соответствует изменениям, происходящим в циркулирующих мононуклеарных лейкоцитах.The existence of an established correlation makes it possible to connect the results obtained for total lymphocytes with the dynamics of changes in peripheral blood T-lymphocytes and to extrapolate the quantitative characteristics of the β-AR lymphocyte link to the lungs. Previous studies have demonstrated a decrease in β-AR in the lungs by β-agonists, consistent with changes occurring in circulating mononuclear leukocytes.
Осуществление изобретенияCarrying out the invention
A. МатериалыA. Materials
Для анализа применяют специфические лиганды: CGP-20712 (β1-адреноблокатор), ICI 118551 (β2-адреноблокатор) и цианопиндолол, полученные от фирмы Sigma (США). Радиоактивный изотоп [125I] в виде иодида натрия с молярной активностью более 2000 Ки/ммоль получен от фирмы В/О «Изотоп» (РФ). Остальные реактивы, использованные в исследованиях, были квалификации не ниже ч.д.а.Specific ligands are used for the analysis: CGP-20712 (β1-blocker), ICI 118551 (β2-blocker) and cyanopindolol, obtained from Sigma (USA). The radioactive isotope [ 125 I] in the form of sodium iodide with a molar activity of more than 2000 Ci/mmol was obtained from the company V/O “Isotope” (RF). The remaining reagents used in the studies were of at least analytical grade.
Б. ДобровольцыB. Volunteers
Все добровольцы перед включением в исследование подписывают информированное согласие в соответствии со всеми правилами этического положения Хельсинской декларации и Национальным стандартом Российской Федерации «Надлежащая клиническая практика» по ГОСТ Р 52379-2005.All volunteers, before inclusion in the study, sign informed consent in accordance with all the ethical rules of the Declaration of Helsinki and the National Standard of the Russian Federation “Good Clinical Practice” in accordance with GOST R 52379-2005.
В исследование включены 15 здоровых добровольцев старше 18 лет и не принимавшие препараты, воздействующие на β-адренорецепторы. Все участвующие проходят врачебный осмотр и обследование с помощью стандартных методик оценки состояния бронхо-легочной системы перед забором крови.The study included 15 healthy volunteers over 18 years of age and not taking drugs that act on β-adrenergic receptors. All participants undergo a medical examination and examination using standard methods for assessing the condition of the bronchopulmonary system before blood sampling.
B. Получение [125I]-цианопиндололаB. Preparation of [ 125 I]-cyanopindolol
Введение радиоактивного изотопа 125I в молекулу цианопиндолола проводят модифицированным способом, описанным в статье Greenwood F. С, Hunter W. М. The preparation of labelled human growth hormone of high specific radioactivity. // Biochem. J. - 1963.-V.89(1). - P. 114-123.The introduction of the radioactive isotope 125 I into the cyanopindolol molecule is carried out using a modified method described in the article by Greenwood F. S., Hunter W. M. The preparation of labeled human growth hormone of high specific radioactivity. // Biochem. J. - 1963.-V.89(1). - P. 114-123.
Реакционная смесь для радиоиодирования содержит 1 мкг цианопиндолола, 0,2М калий-фосфатный буфер (рН 7,0), 1 мКи Na125I в объеме 50 мкл. Реакцию инициируют добавлением 10 мл раствора хлорамина Т (10 мг/мл). Длительность инкубации при комнатной температуре составляет 1 мин. Реакцию останавливают добавлением 10 мкл тиосульфата натрия (20 мг/мл) и после 5 мин инкубации при комнатной температуре добавляют 1 мкл раствора «холодного» йодида натрия (6 мг/мл).The reaction mixture for radioiodination contains 1 μg of cyanopindolol, 0.2 M potassium phosphate buffer (pH 7.0), 1 mCi of Na 125 I in a volume of 50 μl. The reaction is initiated by adding 10 ml of chloramine T solution (10 mg/ml). The duration of incubation at room temperature is 1 min. The reaction is stopped by adding 10 μl of sodium thiosulfate (20 mg/ml) and after 5 min of incubation at room temperature, 1 μl of a solution of “cold” sodium iodide (6 mg/ml) is added.
Целевой продукт выделяют ВЭЖХ (хроматограф производства фирмы Gilson, Франция) на колонке Nucleosil 100 С-18 (5 мкм, 150 мм) в ион-парном режиме. Буфер А: 10% уксусная кислота, буфер Б: 100% ацетонитрил. Элюирование осуществляют градиентом концентрации ацетонитрила от 0 до 100% за 20 минут с расходом 0,5 мл/мин. Детектирование элюата производят по УФ-поглощению при 280 нм и по проточному детектору радиоактивности. Фракции, содержащие [125I]цианопиндолол, объединяют, выпаривают досуха, растворяют в 70% этаноле и хранят при -20°С.The target product is isolated by HPLC (chromatograph manufactured by Gilson, France) on a Nucleosil 100 C-18 column (5 μm, 150 mm) in ion-pair mode. Buffer A: 10% acetic acid, buffer B: 100% acetonitrile. Elution is carried out with a concentration gradient of acetonitrile from 0 to 100% in 20 minutes at a flow rate of 0.5 ml/min. The eluate is detected by UV absorption at 280 nm and by a flow-through radioactivity detector. Fractions containing [ 125 I]cyanopindolol are combined, evaporated to dryness, dissolved in 70% ethanol and stored at -20°C.
Г. Забор крови и выделение мононуклеарных клетокD. Blood collection and isolation of mononuclear cells
У добровольца из периферической вены забирают кровь в 2 вакуумные пробирки S-Monovette К3ЭДТА (Sarstedt, Германия) объемом 9 мл. Кровь центрифугируют при 500 об/мин в течение 5-10 мин при комнатной температуре до осаждения эритроцитов и получают плазму, обогащенную лейкоцитами и лимфоцитами.Blood is taken from a peripheral vein from a volunteer into 2 S-Monovette K3EDTA vacuum tubes (Sarstedt, Germany) with a volume of 9 ml. The blood is centrifuged at 500 rpm for 5-10 minutes at room temperature until red blood cells sediment and plasma enriched with leukocytes and lymphocytes is obtained.
Плазму из двух пробирок (18 мл) отбирают и аккуратно наслаивают на 15 мл Histopaque-1077 (Sigma, США; кат. № Н8889), содержащегося в пробирке объемом 50 мл. Для работы используют стерильные пробирки, стерильные пипетки или пипетки с дозатором. Проводят центрифугирование при комнатной температуре в течение 25 минут на центрифуге с горизонтальным ротором при 400 g. После центрифугирования собирают интерфазное кольцо, содержащее мононуклеарные клетки (лимфоциты) в чистые пробирки объемом 50 мл.Plasma from two tubes (18 ml) is collected and carefully layered onto 15 ml of Histopaque-1077 (Sigma, USA; cat. no. H8889) contained in a 50 ml tube. For work, use sterile test tubes, sterile pipettes or pipettes with a dispenser. Centrifugation is carried out at room temperature for 25 minutes in a centrifuge with a horizontal rotor at 400 g. After centrifugation, collect the interphase ring containing mononuclear cells (lymphocytes) into clean 50 ml tubes.
Суспензию лимфоцитов однократно отмывают 30 мл буфера PBS (фосфатно-солевой буфер, рН 7,2, 2 мМ ЭДТА; autoMACS Rinsing solurion, Miltenyi Biotec, Германия, кат. №130-091-222) и центрифугируют 10 минут при 400 g. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 500 мкл буфера PBS и переносят в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки эппендорф, используя автоматическую пипетку и наконечники с фильтром. Центрифугируют 10 мин при 400 g при комнатной температуре. Надосадочную жидкость аккуратно удаляют и получают интерфазное кольцо, содержащее пул суммарных лимфоцитов.The lymphocyte suspension is washed once with 30 ml of PBS buffer (phosphate-buffered saline, pH 7.2, 2 mM EDTA; autoMACS Rinsing solurion, Miltenyi Biotec, Germany, cat. No. 130-091-222) and centrifuged for 10 minutes at 400 g. The supernatant was removed and the pellet was resuspended in 500 μl PBS buffer and transferred to 1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tubes using an automatic pipette and filter tips. Centrifuge for 10 min at 400 g at room temperature. The supernatant is carefully removed and an interphase ring containing a pool of total lymphocytes is obtained.
Д. Выделение Т-лимфоцитов для примера сравненияD. Isolation of T lymphocytes for comparison example
Интерфазное кольцо, полученное как раскрыто в разделе Г., используют для выделения Т-лимфоцитов с помощью набора Pan Т cell isolation kit (human) (Miltenyi Biotec, Германия, кат. №130-096-535), согласно инструкции к набору. Для этого осадок в пробирке ресуспендируют в 40 мкл буфера PBS-BSA и добавляют 10 мкл смеси антител (Pan Т Cell Biotin Antibody Cocktail), хорошо перемешивают и инкубируют 7 мин в холодильнике при температуре 2-8°С. В пробирку к полученной смеси добавляют 30 мкл буфера PBS-BSA и 20 мкл магнитных частиц (Pan Т Cell MicroBeard Cocktail), аккуратно перемешивают и инкубируют 15 мин в холодильнике при температуре 2-8°С. Далее в пробирку добавляют 500 мкл буфера PBS-BSA, перемешивают и пропускают полученные суспензии через магнитные колонки, заранее промытые буфером PBS-BSA. Магнитную сеперацию проводят с применением сепаратора OctoMACS (Miltenyi Biotec, Германия, кат. №130-042-201) согласно инструкции производителя. Проходящий раствор (Т-клетки) собирают в пробирку.The interphase ring, obtained as described in section G., is used to isolate T lymphocytes using the Pan T cell isolation kit (human) (Miltenyi Biotec, Germany, cat. No. 130-096-535), according to the instructions for the kit. To do this, the sediment in the test tube is resuspended in 40 μl of PBS-BSA buffer and 10 μl of an antibody mixture (Pan T Cell Biotin Antibody Cocktail) is added, mixed well and incubated for 7 minutes in the refrigerator at a temperature of 2-8°
Раствор из пробирки (500 мкл) переносят в эппендорф, добавляют 500 мкл питательной среды 199, хорошо перемешивают. Из полученного объема (1 мл) отбирают 10 мкл в отдельный эппендорф для подсчета клеток (приблизительно 106 клеток/мл). Полученные клетки хранят в холодильнике при 4°С в течение не более 24 часов до использования в радиолигандном анализе.The solution from the test tube (500 μl) is transferred to an Eppendorf, 500 μl of nutrient medium 199 is added, and mixed well. From the resulting volume (1 ml), 10 μl is taken into a separate Eppendorf for cell counting (approximately 106 cells/ml). The resulting cells are stored in the refrigerator at 4°C for no more than 24 hours before use in radioligand analysis.
E. Предынкубация со специфическими лигандамиE. Preincubation with specific ligands
В примере в соответствии с заявляемым изобретением суспензия клеток содержит полный пул суммарных лимфоцитов, полученный как раскрыто в разделе Г. В примере сравнения суспензия клеток содержит Т-лимфоциты, полученные как раскрыто в разделе Д.In the example in accordance with the claimed invention, the cell suspension contains the full pool of total lymphocytes obtained as disclosed in section D. In the comparative example, the cell suspension contains T lymphocytes obtained as disclosed in section E.
В четыре отдельно взятых эппендорфа помещают:The following are placed in four separate Eppendorfs:
(1) 10 мкл воды,(1) 10 µl water,
(2) 10 мкл водного раствора «холодного» цианопиндолола с концентрацией в интервале 10-6⋅10-8 М, содержащего избыток «холодного» цианопиндолола,(2) 10 μl of an aqueous solution of “cold” cyanopindolol with a concentration in the range of 10 -6 ⋅ 10 -8 M, containing an excess of “cold” cyanopindolol,
(3) 10 мкл 0,20-0,28 мкМ β1-специфического лиганда CGP-20712 (химическое название - дигидрохлорид [2-((3-карбамоил-4-гидрокси)фенокси)этиламино]-3-[4-(1-метил-4-трифторметил-2-имидазолил)фенокси]-2-пропанола) и(3) 10 µl 0.20-0.28 µM β1-specific ligand CGP-20712 (chemical name - dihydrochloride [2-((3-carbamoyl-4-hydroxy)phenoxy)ethylamino]-3-[4-(1 -methyl-4-trifluoromethyl-2-imidazolyl)phenoxy]-2-propanol) and
(4) 10 мкл 0,14-0,18 мкМ β2-специфического лиганда ICI 118551 (химическое название - гидрохлорид (±)-эритро-(8*,8*)-1-[2,3-(дигидро-7-метил-1Н-инден-4-ил)окси]-3-[(1-метилэтил)амино]-2-бутанола).(4) 10 µl 0.14-0.18 µM β2-specific ligand ICI 118551 (chemical name - hydrochloride (±)-erythro-(8*,8*)-1-[2,3-(dihydro-7- methyl-1H-inden-4-yl)oxy]-3-[(1-methylethyl)amino]-2-butanol).
В каждый эпендорф вносят 100 мкл ФР (ООО «Гротекс», РФ) и 100 мкл суспензии клеток с концентрацией 5-10 млн/мл.100 μl of FR (Grotex LLC, Russian Federation) and 100 μl of cell suspension with a concentration of 5-10 million/ml are added to each ependorf.
Смеси инкубируют в течение 25-30 минут при 37°С и осторожном перемешивании на шейкере со скоростью 100 об/мин. Процесс останавливают добавлением холодной воды со льдом (+4°С), клетки центрифугируют при 1800-2000 g в течение 10-12 минут, супернатант отбрасывают, осадок осторожно суспендируют в холодном (+4°С) ФР и вновь центрифугируют в тех же условиях.The mixtures are incubated for 25-30 minutes at 37°C and gently mixed on a shaker at 100 rpm. The process is stopped by adding cold water with ice (+4°C), the cells are centrifuged at 1800-2000 g for 10-12 minutes, the supernatant is discarded, the sediment is carefully suspended in cold (+4°C) FR and centrifuged again under the same conditions .
Супернатант отбрасывают и осадок осторожно суспендируют в холодном ФР и центрифугируют при 10000-12000 g в течение 2-3 минут и отбрасывают супернатант.The supernatant is discarded and the sediment is carefully suspended in cold FR and centrifuged at 10,000-12,000 g for 2-3 minutes and the supernatant is discarded.
Ж. Радиолигандный анализ активности связывания β-адренорецепторовG. Radioligand analysis of β-adrenergic receptor binding activity
В примере в соответствии с изобретением и в сравнительном примере каждый из осадков (1)-(4) после центрифугирования разбавляют ФР до концентрации 10 млн/мл и 100 мкл клеточной суспензии и осторожно перемешивают на шейкере со скоростью 100 об/мин. Затем в реакционную смесь добавляют 100 мкл раствора [125I]CYP с концентрацией 1000 имп/(мин-мкл) и инкубируют 25-30 минут. Процесс останавливают добавлением в каждую пробу по 400 мкл холодной воды со льдом (+4 С). Для отмывки от не связавшейся радиоактивности клетки центрифугируют при 2000 g в течение 10 минут, осадок трижды промывают суспендированием в 200 мкл холодного ФР и центрифугированием в тех же условиях, после чего просчитывают на γ-счетчике Wallac Wizard 1470 (PerkinElmer, США).In the example according to the invention and in the comparative example, each of the precipitates (1)-(4) after centrifugation is diluted with FR to a concentration of 10 million/ml and 100 μl of cell suspension and gently mixed on a shaker at 100 rpm. Then 100 μl of a [ 125 I]CYP solution with a concentration of 1000 cpm/(min-μl) is added to the reaction mixture and incubated for 25-30 minutes. The process is stopped by adding 400 μl of cold water with ice (+4 C) to each sample. To wash off unbound radioactivity, the cells are centrifuged at 2000 g for 10 minutes, the sediment is washed three times by suspending in 200 μl of cold PBS and centrifugation under the same conditions, after which it is counted on a Wallac Wizard 1470 γ-counter (PerkinElmer, USA).
Пример значений γ-радиоактивностей, полученных при считывании осадка представлен ниже:An example of γ-radioactivity values obtained from sediment readings is presented below:
активность связывания β2-адренорецепторов по разности общего связывания и β-специфического связывания цианопиндолола, отнесенное на 1 млн. клеток.β2-adrenergic receptor binding activity based on the difference between general binding and β-specific binding of cyanopindolol, per 1 million cells.
По разнице отсчетов Ni в пробирках i=1, 2, 3, 4 вычисляют общую специфическую активность связывания и активность связывания β1-AP и β2-АР:From the difference in Ni counts in tubes i=1, 2, 3, 4, the total specific binding activity and the binding activity of β1-AP and β2-AP are calculated:
Общая специфическая активность связывания рецепторов = N1-N2;Total specific receptor binding activity = N 1 -N 2 ;
Активность связывания β1-AP=N1-N3;Binding activity β 1 -AP=N 1 -N 3 ;
Активность связывания β2-АР=N1-N4.Binding activity β 2 -AP=N 1 -N 4 .
На суммарных лимфоцитах специфическая активность связывания рецепторов составляет 4831-2056=2775 имп/(мин⋅1 млн. клеток), активность связывания β1-AP составляет 4831-2979=1852 имп/(мин⋅1 млн. клеток) и активность связывания β2-АР составляет 4831-2874=1957 имп/(мин⋅1 млн. клеток).On total lymphocytes, the specific receptor binding activity is 4831-2056=2775 counts/(min⋅1 million cells), the β1-AP binding activity is 4831-2979=1852 counts/(min⋅1 million cells) and the β2-binding activity AR is 4831-2874=1957 imp/(min⋅1 million cells).
На Т-лимфоцитах специфическая активность связывания рецепторов составляет 3679-855=2824 имп/(мин⋅1 млн. клеток), активность связывания β1-АР составляет 3679-1152=2527 имп/(мин⋅1 млн. клеток) и активность связывания β2-АР составляет 3679-1107=2572 имп/(мин⋅1 млн. клеток).On T-lymphocytes, the specific receptor binding activity is 3679-855=2824 counts/(min⋅1 million cells), the β1-AR binding activity is 3679-1152=2527 counts/(min⋅1 million cells) and the β2 binding activity -AR is 3679-1107=2572 imp/(min⋅1 million cells).
Абсолютные значения активности связывания 0-АР имеют очень большой разброс в обоих случаях. Так, на суммарных лимфоцитах медиана специфической активности связывания и [25; 75] активности связывания рецепторов равны 2775 и [2318; 3339] имп/(мин⋅1 млн. клеток), медиана и [25; 75] активности связывания β1-АР равны и 1852 [1656; 2425] имп/(мин⋅1 млн. клеток), медиана и [25; 75] активности связывания β2-АР равны 1957 и [1723; 2218] имп/(мин⋅1 млн. клеток).The absolute values of 0-AP binding activity have a very large scatter in both cases. Thus, on total lymphocytes the median of specific binding activity and [25; 75] receptor binding activities are equal to 2775 and [2318; 3339] imp/(min⋅1 million cells), median and [25; 75] β1-AR binding activities are equal to 1852 [1656; 2425] imp/(min⋅1 million cells), median and [25; 75] β2-AR binding activities are equal to 1957 and [1723; 2218] imp/(min⋅1 million cells).
На Т-лимфоцитах медиана и [25; 75] специфической активности связывания рецепторов равны 1366 и [1007; 2128] имп/(мин⋅1 млн. клеток), медиана и [25; 75] активности связывания β1-АР на Т-лимфоцитах равны 1361 и [965; 1844] имп/(мин⋅1 млн. клеток), медиана и [25; 75] активности связывания β2-АР равны 1466 и [883; 1959] имп/(мин⋅1 млн. клеток).On T-lymphocytes the median and [25; 75] specific receptor binding activity are equal to 1366 and [1007; 2128] imp/(min⋅1 million cells), median and [25; 75] β1-AR binding activities on T lymphocytes are 1361 and [965; 1844] imp/(min⋅1 million cells), median and [25; 75] β2-AR binding activities are 1466 and [883; 1959] imp/(min⋅1 million cells).
Claims (11)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2809156C1 true RU2809156C1 (en) | 2023-12-07 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| АГАПОВА О.Ю. Характеристика активности β-адренорецепторов при применении специфических агонистов и антагонистов у пациентов с бронхиальной астмой с сочетанной сердечно-сосудистой патологией. Дисс. на соиск. уч.ст. к.м.н., Москва, 2016. АГАПОВА О.Ю. и др. Радиолигандный метод оценки рецепторной активности β-адренорецепторов Т-лимфоцитов человека. Биоорганическая химия, 2015, т.41, N5, с.592-598. СМОЛЯКОВА Е.В. и др. Специфичность и селективность модифицированного радиолигандного метода оценки связывающей активности β1-адренорецепторов Т-лимфоцитов человека. Биоорганическая химия, 2019, т.45, N3, с.295-301. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20100101109A (en) | Automated enumeration and characterization of circulating melanoma cells in blood | |
| US7413865B2 (en) | Diagnostic method for a transmissible spongiform encephalopathy or prion disease | |
| US6884591B2 (en) | Peripheral marker of blood brain barrier permeability | |
| Block et al. | 125I-8-L-arginine vasopressin binding to human mononuclear phagocytes. | |
| EP1509771A2 (en) | Systems and methods for identifying organ transplant risk | |
| EP3165926A1 (en) | Method for characterization of cell specific microvesicles | |
| US20210325405A1 (en) | Identification of platelet activating antibodies | |
| US20210231659A1 (en) | Detection and isolation of myeloid-derived suppressor cell subpopulations | |
| RU2809156C1 (en) | Radioligand method of quantitative assessment of beta-adrenergic receptor activity on surface of human lymphocytes | |
| US8609432B2 (en) | Method and kit for detection of autoimmune chronic urticaria | |
| Quagliata et al. | Impaired lymphocyte transformation and capping in autoimmune thrombocytopenic purpura | |
| AU2002210740A1 (en) | Method of diagnosing a transmissible spongiform encephalopathy | |
| Bessler et al. | Fc III receptors (FcRIII) on granulocytes: a specific and sensitive diagnostic test for paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) | |
| US6197532B1 (en) | Diagnosis and detection of breast cancer and other cancers | |
| EA036081B1 (en) | Modified radioligand method for quantitative assessment of beta-adrenoreceptor binding activity on human t-lymphocyte surface | |
| EP3467497B1 (en) | Method for analyzing expression of smn protein nuclear body | |
| RU2761468C1 (en) | Method for multiplex analysis of b cells for assessing the cellular link of the immune system of cattle | |
| EA026837B1 (en) | RADIOLIGAND METHOD FOR QUANTITATION OF RECEPTOR ACTIVITY OF β-ADRENORECEPTORS ON THE SURGACE OF HUMAN T-LYMPHOCYTES | |
| EP4321176A1 (en) | Pulmonary arterial hypertension patient selection method and biomarker | |
| Koskiniemi et al. | Fibronectin concentration in cerebrospinal fluid reflects early central nervous system involvement in children with acute lymphoblastic leukemia | |
| Agapova et al. | Radioligand method of assessment of human T-lymphocytes’ β-adrenoceptors activity | |
| JP3866582B2 (en) | Testing method for inflammatory diseases | |
| CA1335559C (en) | Biologic test for alcoholism | |
| AU2008260077B2 (en) | Methods and kits for diagnosing and treating acute joint injury | |
| WO2024031145A1 (en) | Methods for detecting post covid-19 condition |