RU2808817C2 - Methods for producing enriched populations of tumor-reactive t-cells from a tumor - Google Patents
Methods for producing enriched populations of tumor-reactive t-cells from a tumor Download PDFInfo
- Publication number
- RU2808817C2 RU2808817C2 RU2018136226A RU2018136226A RU2808817C2 RU 2808817 C2 RU2808817 C2 RU 2808817C2 RU 2018136226 A RU2018136226 A RU 2018136226A RU 2018136226 A RU2018136226 A RU 2018136226A RU 2808817 C2 RU2808817 C2 RU 2808817C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- tumor
- tim
- lag
- reactive
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 189
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 137
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 86
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 313
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims abstract description 168
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 168
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 229940126547 T-cell immunoglobulin mucin-3 Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 101710083479 Hepatitis A virus cellular receptor 2 homolog Proteins 0.000 claims abstract 4
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 claims abstract 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 46
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 27
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 9
- -1 IL -21 Proteins 0.000 claims description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 6
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 229940126638 Akt inhibitor Drugs 0.000 claims description 4
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 4
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 4
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 claims description 4
- 239000003197 protein kinase B inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- VPVLEBIVXZSOMQ-UHFFFAOYSA-N 3-[[6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]oxy]phenol Chemical compound NC1=CC=CC(C=2NC3=NC=NC(OC=4C=C(O)C=CC=4)=C3C=2)=C1 VPVLEBIVXZSOMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 claims description 3
- 108091033773 MiR-155 Proteins 0.000 claims description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims description 2
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 abstract description 159
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 abstract description 159
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 138
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 32
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 31
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 29
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 18
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 15
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 15
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 13
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 13
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 13
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 13
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 13
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 12
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 11
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 10
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 10
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 9
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 7
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 6
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 6
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 5
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 description 4
- 230000000690 anti-lymphoma Effects 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 206010061424 Anal cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000007860 Anus Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 description 2
- 101100510617 Caenorhabditis elegans sel-8 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001466804 Carnivora Species 0.000 description 2
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 2
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 2
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 2
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 2
- 201000011165 anus cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000001400 myeloablative effect Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N (4S)-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[(2S)-2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101150059217 CDK12 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 206010007279 Carcinoid tumour of the gastrointestinal tract Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 208000002699 Digestive System Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010088729 HLA-A*02:01 antigen Proteins 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100382122 Homo sapiens CIITA gene Proteins 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000733249 Homo sapiens Tumor suppressor ARF Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102100020862 Lymphocyte activation gene 3 protein Human genes 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102100026371 MHC class II transactivator Human genes 0.000 description 1
- 108700002010 MHC class II transactivator Proteins 0.000 description 1
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 description 1
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 description 1
- 102000007295 Mucin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010008701 Mucin-3 Proteins 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000010505 Nose Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000009565 Pharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034811 Pharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000008156 Ringer's lactate solution Substances 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000032383 Soft tissue cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241001493546 Suina Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010079351 Tumor Suppressor Protein p14ARF Proteins 0.000 description 1
- 208000023915 Ureteral Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010046392 Ureteric cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010046799 Uterine leiomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010047741 Vulval cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000004354 Vulvar Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 206010065867 alveolar rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- ZEWYCNBZMPELPF-UHFFFAOYSA-J calcium;potassium;sodium;2-hydroxypropanoic acid;sodium;tetrachloride Chemical compound [Na].[Na+].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].CC(O)C(O)=O ZEWYCNBZMPELPF-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000000959 ear middle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024519 eye neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014899 intrahepatic bile duct cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010023841 laryngeal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000004962 larynx cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- FVVLHONNBARESJ-NTOWJWGLSA-H magnesium;potassium;trisodium;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoate;acetate;tetrachloride;nonahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[Mg+2].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[K+].CC([O-])=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O FVVLHONNBARESJ-NTOWJWGLSA-H 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000006178 malignant mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000026037 malignant tumor of neck Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000713 mesentery Anatomy 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037830 nasal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 201000008106 ocular cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002747 omentum Anatomy 0.000 description 1
- 201000005443 oral cavity cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000003437 pleural cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000005102 vulva cancer Diseases 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Перекрестная ссылка на родственную заявкуCross reference to related application
Настоящая заявка на патент испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США No. 61/771247, поданной 1 марта 2013, содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.This patent application claims priority under U.S. Provisional Patent Application No. 61/771247, filed March 1, 2013, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.
Настоящее изобретение было создано при поддержке Правительства с №проекта ZIABC 010984 Национальным институтом здоровья, Национальным институтом онкологии. Правительство имеет определенные права на данное изобретение.The present invention was made with Government support under Project No. ZIABC 010984 by the National Institutes of Health, National Cancer Institute. The government has certain rights to this invention.
Предшествующий уровень техникиPrior Art
Адоптивная клеточная терапия (англ. ACT) с использованием реактивных в отношении опухоли Т-клеток позволяет получать положительные клинические ответы у некоторых онкологических больных. Однако при этом сохраняются некоторые проблемы, препятствующие успешному применению ACT для лечения онкологических и других заболеваний. Например, Т-клетки, выделенные из опухоли, могут не обладать достаточной специфической реактивностью в отношении опухоли. Таким образом, существует потребность в улучшенных способах получения из опухоли популяции реактивных в отношении опухоли Т-клеток.Adoptive cell therapy (ACT), using tumor-reactive T cells, has produced positive clinical responses in some cancer patients. However, some problems remain that hinder the successful use of ACT for the treatment of cancer and other diseases. For example, T cells isolated from a tumor may not have sufficient tumor specific reactivity. Thus, there is a need for improved methods of obtaining a population of tumor-reactive T cells from a tumor.
Краткое описание сущности изобретенияBrief description of the invention
Вариант осуществления изобретения представляет способ получения популяции клеток, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, при этом способ включает в себя: (а) получение общей популяции Т-клеток из образца опухоли; (b) специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, экспрессирующих один или более из TIM-3, LAG-3, 4-1ВВ и PD-1, из общей популяции; и (с) отделение селектированных на стадии (b) клеток от неселектированных с получением клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками.An embodiment of the invention provides a method of obtaining a cell population enriched for tumor-reactive T cells, the method comprising: (a) obtaining a total population of T cells from a tumor sample; (b) specifically selecting CD8 + T cells expressing one or more of TIM-3, LAG-3, 4-1BB and PD-1 from the general population; and (c) separating the cells selected in step (b) from the unselected cells to obtain a cell population enriched in tumor-reactive T cells.
Другой вариант осуществления изобретения представляет способ введения клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, млекопитающему, при этом способ включает в себя: (а) получение общей популяции Т-клеток из образца опухоли; (b) специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, экспрессирующих один или более из TIM-3, LAG-3, 4-1ВВ и PD-1, из общей популяции; (с) отделение селектированных на стадии (b) клеток от неселектированных с получением клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками; и (d) введение клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, млекопитающему.Another embodiment of the invention provides a method of administering a cell population enriched for tumor-reactive T cells to a mammal, the method comprising: (a) obtaining a total population of T cells from a tumor sample; (b) specifically selecting CD8 + T cells expressing one or more of TIM-3, LAG-3, 4-1BB and PD-1 from the general population; (c) separating the cells selected in step (b) from the unselected cells to obtain a cell population enriched in tumor-reactive T cells; and (d) administering a cell population enriched in tumor-reactive T cells to a mammal.
Еще один вариант осуществления изобретения представляет способ получения фармацевтической композиции, содержащей клеточную популяцию, обогащенную реактивными в отношении опухоли Т-клетками, при этом способ включает в себя: (а) получение общей популяции Т-клеток из образца опухоли; (b) специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, экспрессирующих один или более из TIM-3, LAG-3, 4-1ВВ и PD-1, из общей популяции; (с) отделение селектированных на стадии (b) клеток от неселектированных с получением клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками; и (d) объединение клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, с фармацевтически приемлемым носителем с получением фармацевтической композиции, содержащей клеточную популяцию, обогащенную реактивными в отношении опухоли Т-клетками.Another embodiment of the invention provides a method for producing a pharmaceutical composition containing a cell population enriched in tumor reactive T cells, the method comprising: (a) obtaining a total population of T cells from a tumor sample; (b) specifically selecting CD8 + T cells expressing one or more of TIM-3, LAG-3, 4-1BB and PD-1 from the general population; (c) separating the cells selected in step (b) from the unselected cells to obtain a cell population enriched in tumor-reactive T cells; and (d) combining a cell population enriched for tumor-reactive T cells with a pharmaceutically acceptable carrier to produce a pharmaceutical composition comprising a cell population enriched for tumor-reactive T cells.
Другой вариант осуществления изобретения представляет клеточную популяцию, обогащенную реактивными в отношении опухоли Т-клеткам, полученную при помощи способа, включающего в себя: (а) получение общей популяции Т-клеток из образца опухоли; (b) специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, экспрессирующих один или более из TIM-3, LAG-3, 4-1ВВ и PD-1, из общей популяции; и (с) отделение селектированных на стадии (b) клеток от неселектированных с получением клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, для использования при введении клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, млекопитающему.Another embodiment of the invention provides a cell population enriched for tumor reactive T cells obtained by a method comprising: (a) obtaining a total population of T cells from a tumor sample; (b) specifically selecting CD8 + T cells expressing one or more of TIM-3, LAG-3, 4-1BB and PD-1 from the general population; and (c) separating the cells selected in step (b) from the unselected cells to obtain a cell population enriched for tumor-reactive T cells for use in administering the cell population enriched for tumor-reactive T cells to a mammal.
Дополнительные варианты осуществления изобретения представляют соответствующие популяции клеток и способы лечения или предупреждения онкологических заболеваний.Additional embodiments of the invention provide appropriate cell populations and methods for treating or preventing cancer.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
Фиг. 1А представляет собой график, отображающий процент CD3+/CD8+ клеток, изолированных из свежих образцов опухолей меланомы, экспрессирующих PD-1, TIM-3, LAG-3, 4-1ВВ, ОХ40, CD25, CD28, CD27 или CD70. Каждая точка соответствует одной опухоли.Fig. 1A is a graph depicting the percentage of CD3 + /CD8 + cells isolated from fresh melanoma tumor samples expressing PD-1, TIM-3, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD25, CD28, CD27, or CD70. Each point corresponds to one tumor.
Фиг. 1В представляет собой график, отображающий кратность роста числа CD8+ клеток, изолированных из свежего образца опухоли меланомы (FrTu#1913), отсортированных на предмет наличия у них экспрессии CD8, PD-1, LAG-3, TIM-3 или 4-1ВВ или недостаточной экспрессии PD-1, LAG-3, TIM-3 или 4-1ВВ, после роста in vitro (REP) в течение 14 дней.Fig. 1B is a graph depicting fold growth of CD8 + cells isolated from a fresh melanoma tumor sample (FrTu#1913) sorted for expression of CD8, PD-1, LAG-3, TIM-3 or 4-1BB or insufficient expression of PD-1, LAG-3, TIM-3 or 4-1BB, after in vitro growth (REP) for 14 days.
На Фиг. 2А-2Е показана секреция гамма-интерферона (IFN) (пг/мл) (черные столбики) или процент эффекторных Т-клеток (Teff), экспрессирующих CD3, CD8 и 4-1ВВ (серые столбцы), при помощи клеток CD8+, изолированных из одного из пяти разных образцов опухоли меланомы (FrTu#1913 (A), FrTu#3550 (В), FrTu#3289 (С), FrTu#2448 (D) или FrTu#3713 (Е)). Клетки отсортировывали на предмет наличия экспрессии CD8, PD-1, LAG-3, TIM-3 или 4-1BB или недостаточной экспрессии PD-1, LAG-3, TIM-3 или 4-1BB, и выращивали in vitro в течение 14 дней. Секрецию гамма-интерферона (IFN) и экспрессию 4-1BB анализировали при совместном культивировании с аутологичными опухолевыми клеточными линиями.In FIG. 2A-2E show the secretion of gamma interferon (IFN) (pg/ml) (black bars) or the percentage of effector T cells ( Teff ) expressing CD3, CD8 and 4-1BB (gray bars) by CD8 + cells. isolated from one of five different melanoma tumor samples (FrTu#1913 (A), FrTu#3550 (B), FrTu#3289 (C), FrTu#2448 (D) or FrTu#3713 (E)). Cells were screened for expression of CD8, PD-1, LAG-3, TIM-3, or 4-1BB or lack of expression of PD-1, LAG-3, TIM-3, or 4-1BB, and grown in vitro for 14 days . Interferon gamma (IFN) secretion and 4-1BB expression were analyzed during co-culture with autologous tumor cell lines.
На Фиг. 3А-3С показан специфический лизис (в процентах) опухолевых клеточных линий-мишеней ТС1913 (аутологичных) (А), ТС3289 (аллогенных) (В) или ТС2448 (сингенных по HLA-А0201-антигенам) (С) с помощью эффекторных CD8+ Т-клеток, изолированных из образца FrTu#1913 опухоли меланомы и отсортированных на предмет наличия в них экспрессии CD8 (незакрашенные кружки), PD-1 (черные кружки), TIM-3 (черные ромбики), LAG-3 (черные треугольники) или 4-1BB (черные квадраты) либо наличия недостаточной экспрессии PD-1 (серые кружки), TIM-3 (серые ромбики), LAG-3 (серые треугольники) или 4-1BB (серые квадраты), при указанных соотношениях эффектор:мишень.In FIG. 3A-3C show the specific lysis (in percentage) of target tumor cell lines TC1913 (autologous) (A), TC3289 (allogeneic) (B) or TC2448 (syngeneic for HLA-A0201 antigens) (C) using effector CD8 + T -cells isolated from melanoma tumor sample FrTu#1913 and sorted for expression of CD8 (open circles), PD-1 (black circles), TIM-3 (black diamonds), LAG-3 (black triangles), or 4 -1BB (black squares) or the presence of insufficient expression of PD-1 (gray circles), TIM-3 (gray diamonds), LAG-3 (gray triangles) or 4-1BB (gray squares), at the indicated effector:target ratios.
На Фиг. 3D-3F показан специфический лизис (в процентах) опухолевых клеточных линий-мишеней ТС3713 (аутологичных) (D), ТС3550 (аллогенных) (Е) или ТС1379 (аллогенных) (F) с помощью эффекторных CD8+ Т-клеток, изолированных из образца опухоли меланомы FrTu#3713 (D-F) и отсортированных на предмет наличия в них экспрессии CD8 (незакрашенные кружки), PD-1 (черные кружки), TIM-3 (черные ромбики) или 4-1BB (черные квадраты) или наличия недостаточной экспрессии PD-1 (серые кружки), TIM-3 (серые ромбики) или 4-1BB (серые квадраты), при указанных соотношениях эффектор:мишень.In FIG. 3D-3F shows the specific lysis (percentage) of target tumor cell lines TC3713 (autologous) (D), TC3550 (allogeneic) (E), or TC1379 (allogeneic) (F) by effector CD8 + T cells isolated from the sample melanoma tumors FrTu#3713 (DF) and sorted for expression of CD8 (open circles), PD-1 (black circles), TIM-3 (black diamonds) or 4-1BB (black squares) or lack of PD expression -1 (gray circles), TIM-3 (gray diamonds), or 4-1BB (gray squares), at the effector:target ratios indicated.
На Фиг. 4А показано распознавание аутологичной опухоли клеток, выделенных из опухоли меланомы (FrTu#3713), отсортированных в отношении CD8+, PD-1+, PD-1-, 4-1BB+, 4-1BB-, 4-1BB+/PD-1-, 4-1BB+/PD-1+, 4-1BB+/PD-1+ или 4-1BB+/PD-1- и выращенных in vitro в течение 14 дней. Показан процент CD3+ CD8+ клеток, экспрессирующих 4-1BB, после совместного культивирования с аутологичными опухолевыми клеточными линиями.In FIG. 4A shows autologous tumor recognition of cells isolated from a melanoma tumor (FrTu#3713), sorted for CD8 + , PD-1 + , PD-1 - , 4-1BB + , 4-1BB - , 4-1BB + /PD- 1 - , 4-1BB + /PD-1 + , 4-1BB + /PD-1 + or 4-1BB + /PD-1 - and grown in vitro for 14 days. The percentage of CD3 + CD8 + cells expressing 4-1BB after coculture with autologous tumor cell lines is shown.
Фиг. 4В представляет собой график, показывающий процент CD3+ CD8+ клеток, экспрессирующих 4-1BB (серые столбцы) или секретирующих гамма-IFN (черные столбики), будучи изолированными из опухоли меланомы (FrTu#3612). Клетки отсортировывали на предмет наличия в них CD8+, PD-1+, PD-1-, 4-1BB+/PD-1-, 4-1BB+/PD-1+, 4-1BB-/PD-1+ или 4-1BB-/PD-1- популяций, выращивали in vitro в течение 14 дней, и на рисунке показана секреция гамма-IFN и усиление экспрессии 4-1BB после совместного культивирования с аутологичными опухолевыми клеточными линиями.Fig. 4B is a graph showing the percentage of CD3 + CD8 + cells expressing 4-1BB (gray bars) or secreting IFN gamma (black bars) when isolated from a melanoma tumor (FrTu#3612). Cells were sorted for the presence of CD8 + , PD-1 + , PD-1 - , 4-1BB + /PD-1 - , 4-1BB + /PD-1 + , 4-1BB - /PD-1 + or 4-1BB - /PD-1 - populations were grown in vitro for 14 days, and the figure shows IFN-gamma secretion and increased expression of 4-1BB after co-culture with autologous tumor cell lines.
На Фиг. 5А-5С изображен специфический лизис в процентах опухолевых клеточных линий-мишеней ТС3713 (аутологичных) (А), ТС3550 (аллогенных) (В) и ТС1379 (аллогенных) (С) с помощью эффекторных CD8+ клеток, выделенных из опухоли меланомы (FrTu#3713) и отсортированных на предмет наличия в них популяций 4-1BB+/PD-1- (кружки), 4-1BB+/PD-1+ (квадраты), 4-1BB-/PD-1+ (ромбики) или 4-1BB-/PD-1- , при соотношениях эффектор-мишень, показанных при измерении с помощью цитотоксического теста с радиоактивным 51Cr.In FIG. 5A-5C depict the percentage of specific lysis of target tumor cell lines TC3713 (autologous) (A), TC3550 (allogeneic) (B), and TC1379 (allogeneic) (C) by CD8 + effector cells isolated from a melanoma tumor (FrTu# 3713) and sorted for the presence of populations 4-1BB + /PD-1 - (circles), 4-1BB + /PD-1 + (squares), 4-1BB - /PD-1 + (diamonds) or 4 -1BB - /PD-1 - , at the effector-target ratios shown when measured using a cytotoxic test with radioactive 51 Cr.
Фиг. 6 представляет собой график, отображающий процент CD8+ клеток, экспрессирующих 4-1BB (серые столбцы) или секретирующих гамма-IFN (черные столбики), выделенных из опухоли желудочно-кишечного тракта (FrTu#3446b), отсортированных на предмет наличия в них популяций CD8+, PD-1+, PD-1-, TIM-3+, TIM3-, 4-1BB+ или 4-1BB- и выращенных в течение 21 дня в культуре. Показаны гамма-IFN и усиление экспрессии 4-1BB после совместного культивирования с аутологичными опухолевыми клеточными линиями.Fig. 6 is a graph depicting the percentage of CD8 + cells expressing 4-1BB (gray bars) or secreting IFN gamma (black bars) isolated from a gastrointestinal tumor (
Фиг. 7А и 7В представляют собой графики, показывающие частоту встречаемости (%) уникальных аминокислотных последовательностей CDR3 (complementary determining region - комплементарно-определяемая область) области бета-цепи TCR (англ. Т Cell Receptor - Т-клеточные рецепторы) отсортированных PD-1- клеток (2985 TCR клонотипы) (А) или отсортированных PD-1+ клеток (805 TCR клонотипы) (В) после роста в течение 14 дней in vitro.Fig. 7A and 7B are graphs showing the frequency (%) of unique amino acid sequences of the CDR3 (complementary determining region) region of the TCR (T Cell Receptor) beta chain of sorted PD- 1 cells (2985 TCR clonotypes) (A) or sorted PD-1 + cells (805 TCR clonotypes) (B) after growth for 14 days in vitro.
Фиг. 7С представляет собой график, показывающий частоту встречаемости (%) уникальных аминокислотных последовательностей CDR3 области бета-цепи TCR отсортированных PD-1- клеток (черные кружки) или отсортированных PD-1+ клеток (серые кружки).Fig. 7C is a graph showing the frequency (%) of unique amino acid sequences of the TCR beta chain region CDR3 of sorted PD-1 − cells (black circles) or sorted PD-1 + cells (gray circles).
Фиг. 8 представляет собой график, отображающий частоту встречаемости (%) клонотипов β-цепи TCR в PD-1- популяции или в PD-1+ популяции, распознающих мутированные эпитопы p14ARF/p16INK4a (черные кружки) или HLA-A11mut (серые кружки), специфически экспрессируемые аутологичными опухолевыми клеточными линиями, и клонотипов с неизвестной реактивностью (незакрашенные кружки).Fig. 8 is a graph depicting the frequency (%) of TCR β-chain clonotypes in the PD-1 − population or in the PD-1 + population recognizing mutated p14ARF/p16INK4a (black circles) or HLA-A11mut (gray circles) epitopes specifically expressed by autologous tumor cell lines, and clonotypes with unknown reactivity (open circles).
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
Было установлено, что селектирование CD8+ клеток, также экспрессирующих один или более из биомаркеров TIM-3 (Т клетки, содержащей домены lg и муцина 3), LAG-3 (гена активации лимфоцитов 3; CD223), 4-1BB (CD137) и PD-1 (CD279), обогащает реактивные в отношении опухоли Т-клетки, изолированные из свежих опухолевых образцов. Селектирование CD8+ клеток, также экспрессирующих один или более из PD-1, 4-1BB, TIM-3 и LAG-3, предпочтительно обогащает большее число реактивных в отношении опухоли Т-клеток по сравнению с CD8+ клетками, не экспрессирующими такие маркеры.It was found that selecting for CD8 + cells also expressing one or more of the biomarkers TIM-3 (T cell containing Ig and
В этом смысле вариант осуществления изобретения представляет способ получения популяции клеток, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, при этом способ включает в себя: (а) получение общей популяции Т-клеток из образца опухоли; (b) специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, экспрессирующих один или более из TIM-3, LAG-3, 4-1BB и PD-1, из общей популяции; и (с) отделение селектированных на стадии (b) клеток от неселектированных с получением клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками. Способы согласно изобретению предпочтительно позволяют сократить время культивирования клеток in vitro перед введением их пациенту. Кроме того, способы согласно изобретению предпочтительно позволяют получать клеточную популяцию, обогащенную реактивными в отношении опухоли Т-клетками, которая может быть введена пациенту без необходимости проведения обследования для распознавания аутологичной опухоли.In this sense, an embodiment of the invention provides a method for obtaining a population of cells enriched in tumor-reactive T cells, the method comprising: (a) obtaining a total population of T cells from a tumor sample; (b) specifically selecting CD8 + T cells expressing one or more of TIM-3, LAG-3, 4-1BB and PD-1 from the general population; and (c) separating the cells selected in step (b) from the unselected cells to obtain a cell population enriched in tumor-reactive T cells. The methods of the invention advantageously reduce the time required to culture cells in vitro before administering them to a patient. In addition, the methods of the invention preferably produce a cell population enriched in tumor-reactive T cells that can be administered to a patient without the need for testing to identify an autologous tumor.
Способ может включать в себя получение общей популяции Т-клеток из образца опухоли при помощи любого подходящего способа, известного в данной области техники. Например, общая популяция Т-клеток может быть получена из образца опухоли путем диссоциации образца опухоли с образованием клеточной суспензии, из которой могут быть селектированы специфические популяции клеток. Подходящие способы получения общей популяции Т-клеток могут включать, не ограничиваясь перечнем, любой один или более из механической диссоциации (например, измельчения) опухоли, ферментативной диссоциации (например, дигерирования) опухоли и аспирации (такой как, например, с помощью иглы).The method may include obtaining a total population of T cells from a tumor sample using any suitable method known in the art. For example, a general population of T cells can be obtained from a tumor sample by dissociating the tumor sample to form a cell suspension from which specific cell populations can be selected. Suitable methods for obtaining a total population of T cells may include, but are not limited to, any one or more of mechanical dissociation (eg, crushing) of the tumor, enzymatic dissociation (eg, digestion) of the tumor, and aspiration (such as, for example, with a needle).
Общая популяция Т-клеток, полученная из образца опухоли, может включать в себя любой подходящий тип Т-клеток. Предпочтительно, общая популяция Т-клеток, полученная из образца опухоли, включает в себя проникающие в опухоль лимфоциты (англ. TILs).The total population of T cells obtained from a tumor sample may include any suitable type of T cells. Preferably, the total population of T cells obtained from the tumor sample includes tumor infiltrating lymphocytes (TILs).
Образец опухоли может быть получен от любого млекопитающего. Если не указано иное, при использовании в данном контексте термин "млекопитающее" относится к любому млекопитающему, включая, но не ограничиваясь перечнем, млекопитающие отряда зайцеобразных (Logomorpha), такие как кролики; отряда хищных (Carnivora), включая кошачьих (Felines) (кошки) и псовых (Canines) (собаки); отряда парнокопытных (Artiodactyla), включая бычьих (Bovines) (коровы) и свинообразных (Swines) (свиньи); или отряда непарнокопытных (Perssodactyla), включая лошадиных (Equines) (лошади). Предпочтительно, чтобы млекопитающие были приматами, кроме человека, например, представителями отряда приматов (Primates), широконосых обезьян (Ceboids) или обезьяноподобных (Simoids) (обезьяны) или отряда высших приматов (Anthropoids) (люди и человекообразные обезьяны). Согласно некоторым вариантам осуществления, млекопитающее может быть млекопитающим отряда грызунов (Rodentia), таким как мыши и хомяки. Предпочтительно, млекопитающее является любым приматом, кроме человека, или человеком. Особенно предпочтительно, млекопитающее является человеком.The tumor sample can be obtained from any mammal. Unless otherwise specified, when used in this context, the term "mammal" refers to any mammal, including, but not limited to, mammals of the order Logomorpha, such as rabbits; order of carnivores (Carnivora), including Felines (cats) and Canines (dogs); order Artiodactyla, including Bovines (cows) and Swines (pigs); or the order of equids (Perssodactyla), including equidae (Equines) (horses). Preferably, the mammals are non-human primates, for example members of the order Primates, Ceboids or Simoids (monkeys) or the order Anthropoids (humans and apes). In some embodiments, the mammal may be a mammal of the order Rodentia, such as mice and hamsters. Preferably, the mammal is any non-human primate or human. Particularly preferably, the mammal is human.
Способ может включать в себя специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, экспрессирующих один или более из TIM-3, LAG-3, 4-1BB и PD-1, из общей популяции. Согласно предпочтительному варианту осуществления, способ включает в себя селектирование клеток, также экспрессирующих CD3. Способ может включать в себя специфическое селектирование клеток любым подходящим способом. Предпочтительно, селектирование осуществляют с помощью проточной цитометрии. Проточную цитометрию можно выполнять при помощи любого подходящего способа, известного в данной области. При проточной цитометрии могут использоваться любые подходящие антитела и красители. Например, специфическое селектирование CD3, CD8, TIM-3, LAG-3, 4-1BB или PD-1 можно осуществляться с помощью антител анти-CD3, анти-CD8, анти-TIM-3, анти-LAG-3, анти-4-1BB или анти-PD1, соответственно. Предпочтительно, антитело выбирают так, чтобы оно специфически распознавало и связывалось с конкретным выбранным биомаркером. Антитело или антитела могут быть присоединены к грануле (например, к магнитной грануле) или к флуорохрому. Предпочтительно, проточная цитометрия представляет собой сортировку флуоресцентно-активированных клеток (англ. FACS).The method may include specifically selecting CD8+ T cells expressing one or more of TIM-3, LAG-3, 4-1BB and PD-1 from the general population. According to a preferred embodiment, the method includes selecting cells that also express CD3. The method may include specifically selecting cells by any suitable method. Preferably, selection is carried out using flow cytometry. Flow cytometry can be performed using any suitable method known in the art. Flow cytometry can use any suitable antibodies and dyes. For example, specific selection of CD3, CD8, TIM-3, LAG-3, 4-1BB or PD-1 can be achieved using anti-CD3, anti-CD8, anti-TIM-3, anti-LAG-3, anti- 4-1BB or anti-PD1, respectively. Preferably, the antibody is selected to specifically recognize and bind to the particular biomarker selected. The antibody or antibodies may be attached to a bead (eg, a magnetic bead) or to a fluorochrome. Preferably, flow cytometry is fluorescence-activated cell sorting (FACS).
Согласно варианту осуществления изобретения, специфическое селектирование может включать в себя специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, являющихся положительными на предмет наличия в них экспрессии любого из TIM-3, LAG-3, 4-1BB или PD-1, любой комбинации двух или трех из TIM-3, LAG-3, 4-1BB и PD-1 или всех четырех TIM-3, LAG-3, 4-1BB и PD-1. В этом отношении специфическое селектирование может включать в себя специфическое селектирование Т-клеток, являющихся моноположительными в плане наличия в них экспрессии любого из TIM-3, LAG-3, 4-1BB и PD-1, или специфическое селектирование Т-клеток, являющихся дважды, трижды или четырежды положительными в плане одновременной коэкспрессии любых двух, трех или четырех из TIM-3, LAG-3, 4-1BB и PD-1. Согласно варианту осуществления изобретения, способ включает в себя специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, экспрессирующих TIM-3, из общей популяции. Согласно другому варианту осуществления, способ включает в себя специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, экспрессирующих LAG-3, из общей популяции. Согласно еще одному варианту осуществления, способ включает в себя специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, экспрессирующих 4-1BB, из общей популяции. Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, способ включает в себя специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, экспрессирующих PD-1, из общей популяции. Дополнительный вариант осуществления изобретения представляет способ, включающий в себя специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, которые являются (i) 4-1BB+/PD-1+, (ii) 4-1BB-/PD-1+ и/или (iii) 4-1BB+/PD-1- из общей популяции. Другой вариант осуществления изобретения представляет способ, включающий в себя специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, которые являются (i) LAG-3+/PD-1+, (ii) LAG-3-/PD-1+ и/или (iii) LAG-3+/PD-1-, из общей популяции. Еще один вариант осуществления изобретения представляет способ, включающий в себя специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, которые являются (i) TIM-3+/PD-1+, (ii) TIM-3-/PD-1+ или (iii) TIM-3+/PD-1- из общей популяции. Еще один вариант осуществления изобретения представляет способ, включающий в себя специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, которые являются (i) TIM-3+/LAG-3+, (ii) TIM-3-/LAG-3+ или (iii) TIM-3+/LAG-3-, из общей популяции. Другой вариант осуществления изобретения представляет способ, включающий в себя специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, которые являются (i) 4-1BB+/LAG-3+, (ii) 4-1BB-/LAG-3+ или (iii) 4-1BB+/LAG-3-, из общей популяции. Еще один вариант осуществления изобретения представляет способ, включающий в себя специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, которые являются (i) 4-1BB+/TIM-3+, (ii) 4-1BB-/TIM-3+ или (iii) 4-1BB+/TIM-3-, из общей популяции. Согласно другому варианту осуществления изобретения, любой из способов, описанных в данном контексте, может также включать в себя селектирование клеток, также экспрессирующих CD3+.According to an embodiment of the invention, specific selection may include specifically selecting CD8+ T cells that are positive for expression of any of TIM-3, LAG-3, 4-1BB or PD-1, any combination of two or three of TIM-3, LAG-3, 4-1BB and PD-1 or all four TIM-3, LAG-3, 4-1BB and PD-1. In this regard, specific selection may include specific selection of T cells that are monopositive for expression of any of TIM-3, LAG-3, 4-1BB, and PD-1, or specific selection of T cells that are double positive. , triple or quadruple positive for the simultaneous coexpression of any two, three or four of TIM-3, LAG-3, 4-1BB and PD-1. According to an embodiment of the invention, the method includes specifically selecting CD8+ T cells expressing TIM-3 from the general population. According to another embodiment, the method includes specifically selecting CD8+ T cells expressing LAG-3 from the general population. In another embodiment, the method includes specifically selecting CD8+ T cells expressing 4-1BB from the general population. According to another embodiment of the invention, the method includes specifically selecting CD8+ T cells expressing PD-1 from the general population. A further embodiment of the invention provides a method comprising specifically selecting CD8+ T cells that are (i) 4-1BB + /PD-1 + , (ii) 4-1BB - /PD-1 + and/or (iii) 4-1BB + /PD-1 - from the general population. Another embodiment of the invention provides a method comprising specifically selecting CD8+ T cells that are (i) LAG-3 + /PD-1 + , (ii) LAG-3 - /PD-1 + and/or (iii) LAG-3 + /PD-1 - , from the general population. Another embodiment of the invention provides a method comprising specifically selecting CD8+ T cells that are (i) TIM-3 + /PD-1 + , (ii) TIM-3 - /PD-1 + or (iii) TIM -3 + /PD-1 - from the general population. Another embodiment of the invention provides a method comprising specifically selecting CD8 + T cells that are (i) TIM-3 + /LAG-3 + , (ii) TIM-3 - /LAG-3 + or (iii) TIM-3 + /LAG-3 - , from the general population. Another embodiment of the invention provides a method comprising specifically selecting CD8+ T cells that are (i) 4-1BB + /LAG-3 + , (ii) 4-1BB - /LAG-3 + or (iii) 4- 1BB + /LAG-3 - , from the general population. Another embodiment of the invention provides a method comprising specifically selecting CD8 + T cells that are (i) 4-1BB + /TIM-3 + , (ii) 4-1BB - /TIM-3 + or (iii) 4-1BB + /TIM-3 - , from the general population. According to another embodiment of the invention, any of the methods described in this context may also include selecting cells that also express CD3 + .
Согласно варианту осуществления изобретения, специфическое селектирование может включать в себя специфическое селектирование комбинаций CD8+ клеток, экспрессирующих любой из маркеров, описанных в данной работе. В этом отношении способ позволяет получить клеточную популяцию, обогащенную реактивными в отношении опухоли клетками, включающую в себя смесь клеток, экспрессирующих любые два, три, четыре или более биомаркеров, описанных в данной работе. Согласно варианту осуществления изобретения, специфическое селектирование включает в себя специфическое селектирование любой из следующих комбинаций клеток: (a) PD-1+ клеток и 4-1BB+ клеток, (b) PD-1+ клеток и LAG-3+ клеток, (с) PD-1+ клеток и TIM-3+ клеток, (d) 4-1BB+ клеток и LAG-3+ клеток, (е) 4-1BB+ клеток и TIM-3+ клеток, (f) LAG-3+ клеток и TIM-3+ клеток, (g) PD-1+ клеток, 4-1BB+ клеток и LAG3+ According to an embodiment of the invention, specific selection may include specific selection of combinations of CD8 + cells expressing any of the markers described herein. In this regard, the method produces a cell population enriched in tumor-reactive cells, including a mixture of cells expressing any two, three, four or more of the biomarkers described herein. According to an embodiment of the invention, specific selection includes specific selection of any of the following combinations of cells: (a) PD-1 + cells and 4-1BB + cells, (b) PD-1 + cells and LAG-3 + cells, (c ) PD-1 + cells and TIM-3 + cells, (d) 4-1BB + cells and LAG-3 + cells, (e) 4-1BB + cells and TIM-3 + cells, (f) LAG-3 + cells and TIM-3 + cells, (g) PD-1 + cells, 4-1BB + cells and LAG3 +
клеток, (h) PD-1+ клеток, 4-1BB+ клеток и TIM-3+ клеток, (i) PD-1+ клеток, LAG-3+ клеток и TIM-3+ клеток, (j) 4-1BB+ клеток, LAG-3+ клеток и TIM-3+ клеток и/или (k) PD-1+ клеток, 4-1BB+ клеток, LAG-3+ клеток и TIM-3+ клеток. Согласно другому варианту осуществления изобретения, любой из способов, описанных в данном контексте, может также включать в себя селектирование клеток, также экспрессирующих CD8+ и/или CD3+.cells, (h) PD-1 + cells, 4-1BB + cells and TIM-3 + cells, (i) PD-1 + cells, LAG-3 + cells and TIM-3 + cells, (j) 4-1BB + cells, LAG-3 + cells and TIM-3 + cells and/or (k) PD-1 + cells, 4-1BB + cells, LAG-3 + cells and TIM-3 + cells. According to another embodiment of the invention, any of the methods described in this context may also include selecting cells that also express CD8 + and/or CD3 + .
Способ может включать в себя отделение селектированных клеток от неселектированных с получением клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками. В этом отношении селектированные клетки могут быть физически отделены от неселектированных клеток. Селектированные клетки могут быть отделены от неселектированных клеток при помощи любого подходящего способа, такого как, например, сортировка. Отделение селектированных клеток от неселектированных, предпочтительно, позволяет получить клеточную популяцию, обогащенную реактивными в отношении опухоли Т-клетками.The method may include separating selected cells from unselected cells to obtain a cell population enriched in tumor-reactive T cells. In this regard, selected cells can be physically separated from unselected cells. Selected cells can be separated from unselected cells using any suitable method, such as, for example, sorting. Separation of selected cells from unselected cells preferably produces a cell population enriched in tumor-reactive T cells.
Клеточные популяции, полученные при помощи способов согласно изобретению, предпочтительно обогащены реактивными в отношении опухоли Т-клетками. В этом отношении клеточные популяции, полученные при помощи способов согласно изобретению, могут включать в себя больший процент реактивных в отношении опухоли Т-клеток по сравнению с клеточными популяциями, полученными без использования сортировки на наличие в них экспрессии любого одного или более из TIM-3, LAG-3, 4-1BB и PD-1.Cell populations obtained using the methods of the invention are preferably enriched in tumor-reactive T cells. In this regard, cell populations obtained using the methods of the invention may include a greater percentage of tumor-reactive T cells compared to cell populations obtained without sorting for expression of any one or more of TIM-3, LAG-3, 4-1BB and PD-1.
Согласно варианту осуществления изобретения, способ включает в себя получение клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, без обследования для распознавания аутологичной опухоли. В этом отношении способы согласно изобретению предпочтительно обеспечивают клеточную популяцию, обогащенную клетками, обладающими реактивностью в отношении опухоли, без необходимости тестирования клеток для распознавания аутологичной опухоли.According to an embodiment of the invention, the method includes obtaining a cell population enriched for tumor-reactive T cells without testing for autologous tumor recognition. In this regard, the methods of the invention preferably provide a cell population enriched in tumor-reactive cells without the need to test the cells for autologous tumor recognition.
Согласно варианту осуществления изобретения, способ не включает в себя неспецифическое стимулирование общей популяции Т-клеток перед специфическим селектированием клеток. В этом отношении способы согласно изобретению предпочтительно позволяют получать клеточную популяцию, обогащенную реактивными в отношении опухоли Т-кклетками, без неспецифической стимуляции общей популяции Т-клеток (например, с помощью антител анти-4-1BB, антител анти-CD3, антител анти-CD28).According to an embodiment of the invention, the method does not include non-specific stimulation of the general population of T cells before specifically selecting cells. In this regard, the methods of the invention preferably produce a cell population enriched in tumor-reactive T cells without non-specific stimulation of the general T cell population (e.g. with anti-4-1BB antibodies, anti-CD3 antibodies, anti-CD28 antibodies ).
Согласно варианту осуществления изобретения, способ также включает в себя рост числа Т-клеток в обогащенной клеточной популяции, полученной при помощи способов согласно изобретению, in vitro. Численность Т-клеток может быть увеличена по меньшей мере 3-кратно (или 4-, 5-, 6-, 7-, 8- или 9-кратно), более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 10-кратно (или 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80- или 90-кратно), более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 100-кратно, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 1000-кратно или, наиболее предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 100000-кратно. Численность Т-клеток может возрастать при помощи любого подходящего способа, известного в данной области техники. Примеры способов роста численности клеток описаны в патентном документе США U.S. 8034334 и патентном документе США U.S. Patent Application Publication No. 2012/0244133, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки.According to an embodiment of the invention, the method also includes increasing the number of T cells in an enriched cell population obtained using the methods of the invention in vitro. The number of T cells can be increased by at least 3-fold (or 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, or 9-fold), more preferably at least about 10-fold (or 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, or 90-fold), more preferably at least about 100-fold, more preferably at least about 1000-fold, or most preferably at least about 100,000 times. The number of T cells can be increased using any suitable method known in the art. Examples of methods for increasing cell numbers are described in U.S. patent document U.S. 8034334 and US patent document U.S. Patent Application Publication No. 2012/0244133, each of which is incorporated herein by reference.
Согласно варианту осуществления изобретения, способ также включает в себя культивирование обогащенной клеточной популяции, полученной при помощи способов согласно изобретению, в присутствии любого одного или более из TWS119, интерлейкина (IL)-21, IL-12, IL-15, IL-7, трансформирующего ростового фактора (англ. TGF) бета и ингибитора AKT (AKTi). Не будучи ограниченными какой-либо конкретной теорией, можно полагать, что культивирование обогащенной клеточной популяции в присутствии TWS119, IL-21 и/или IL-12 может, предпочтительно, усиливать реактивность в отношении опухоли обогащенной клеточной популяции путем предупреждения или торможения дифференциации обогащенной клеточной популяции.According to an embodiment of the invention, the method also includes culturing the enriched cell population obtained using the methods of the invention in the presence of any one or more of TWS119, interleukin (IL)-21, IL-12, IL-15, IL-7, transforming growth factor (TGF) beta and AKT inhibitor (AKTi). Without being limited to any particular theory, it is believed that culturing the enriched cell population in the presence of TWS119, IL-21 and/or IL-12 may advantageously enhance the tumor reactivity of the enriched cell population by preventing or inhibiting differentiation of the enriched cell population .
Согласно варианту осуществления изобретения, способ также включает в себя трансдукцию или трансфекцию клеток обогащенной популяции, полученной при помощи любого из способов согласно изобретению, описанных в данном контексте, с помощью нуклеотидной последовательности, кодирующей любой один или более из IL-12, IL-7, IL-15, IL-2, IL-21, mir155 и анти-PD-1 миРНК.According to an embodiment of the invention, the method also includes transducing or transfecting cells from an enriched population obtained using any of the methods of the invention described herein with a nucleotide sequence encoding any one or more of IL-12, IL-7, IL-15, IL-2, IL-21, mir155 and anti-PD-1 siRNA.
Согласно варианту осуществления изобретения, способ также включает в себя стимуляцию обогащенной клеточной популяции, полученной при помощи способов согласно изобретению, с помощью ракового антигена и/или с помощью аутологичных опухолевых клеток. Стимуляция обогащенной клеточной популяции с помощью ракового антигена и/или с помощью аутологичных опухолевых клеток может осуществляться любым известным способом. Например, стимуляция обогащенной клеточной популяции может осуществляться путем физического контактирования обогащенной клеточной популяции с раковым антигеном и/или с аутологичными опухолевыми клетками. Не будучи ограниченными какой-либо конкретной теорией, можно полагать, что стимуляция обогащенной клеточной популяции с помощью ракового антигена и/или с помощью аутологичных опухолевых клеток может, предпочтительно, увеличивать реактивность в отношении опухоли обогащенной клеточной популяции.According to an embodiment of the invention, the method also includes stimulating the enriched cell population obtained using the methods of the invention with a cancer antigen and/or with autologous tumor cells. Stimulation of the enriched cell population with cancer antigen and/or with autologous tumor cells can be accomplished by any known method. For example, stimulation of the enriched cell population can be accomplished by physically contacting the enriched cell population with a cancer antigen and/or with autologous tumor cells. Without being limited to any particular theory, it is believed that stimulation of the enriched cell population with a cancer antigen and/or with autologous tumor cells may advantageously increase the tumor reactivity of the enriched cell population.
Термин "раковый антиген" при использовании в данном контексте относится к любой молекуле (например, белка, пептида, липида, углевода и так далее), исключительно или преимущественно экспрессируемой или сверхэкспрессируемой опухолевой клеткой или раковой клеткой, так что антиген связывается с опухолью или раком. Раковый антиген может дополнительно экспрессироваться нормальными, неопухолевыми или доброкачественными клетками. Однако в таких случаях экспрессия ракового антигена нормальными, неопухолевыми или доброкачественными клетками является не настолько эффективной, как экспрессия опухолевыми или раковыми клетками. В этом отношении опухолевые или раковые клетки могут сверхэкспрессировать антиген или экспрессировать антиген на значительно более высоком уровне по сравнению с экспрессией антигена нормальными, неопухолевыми или доброкачественными клетками. Кроме того, раковый антиген может дополнительно экспрессироваться клетками с разным уровнем развития или созревания. Например, раковый антиген может дополнительно экспрессироваться клетками на эмбриональной или фетальной стадии, каковые клетки при обычных условиях отсутствуют у взрослых. Или же, раковый антиген может дополнительно экспрессироваться стволовыми клетками или клетками-предшественниками, каковые клетки при обычных условиях отсутствуют у взрослых.The term “cancer antigen” as used herein refers to any molecule (eg, protein, peptide, lipid, carbohydrate, etc.) exclusively or predominantly expressed or overexpressed by a tumor cell or cancer cell such that the antigen binds to the tumor or cancer. Cancer antigen may additionally be expressed by normal, non-tumor or benign cells. However, in such cases, expression of cancer antigen by normal, non-tumor or benign cells is not as effective as expression by tumor or cancer cells. In this regard, tumor or cancer cells can overexpress an antigen or express an antigen at a significantly higher level compared to the antigen expression of normal, non-tumor or benign cells. In addition, a cancer antigen may be further expressed by cells at different levels of development or maturation. For example, a cancer antigen may be additionally expressed by cells at the embryonic or fetal stage, which cells are not normally found in adults. Alternatively, the cancer antigen may be additionally expressed by stem cells or progenitor cells that are not normally found in adults.
Раковый антиген может быть антигеном, экспрессируемым любой клеткой любого рака или опухоли, включая раки и опухоли, описанные в данном контексте. Раковый антиген может быть раковым антигеном только одного типа рака или опухоли, так что раковый антиген связан с или характерен для только одного типа рака или опухоли. Или же раковый антиген может быть раковым антигеном (например, может быть характерным) для более чем одного типа рака или опухоли. Например, раковый антиген может экспрессироваться клетками рака молочной железы и рака предстательной железы и вообще не экспрессироваться нормальными, неопухолевыми или доброкачественными клетками. Примеры раковых анттигенов могут включать в себя любой один или более из gp 100, MART-1, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-А3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, NY-ESO-1, рецептора 2 сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR-2), HER-2, мезотелина и рецептора эпидермального фактора роста варианта III (EGFR III).A cancer antigen can be an antigen expressed by any cell of any cancer or tumor, including cancers and tumors described in this context. A cancer antigen may be a cancer antigen of only one type of cancer or tumor, such that the cancer antigen is associated with or characteristic of only one type of cancer or tumor. Or a cancer antigen may be a cancer antigen (eg, may be characteristic of) more than one type of cancer or tumor. For example, a cancer antigen may be expressed by breast cancer and prostate cancer cells and not expressed at all by normal, non-tumor or benign cells. Examples of cancer antigens may include any one or more of gp 100, MART-1, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8 , MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, NY-ESO-1, vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2), HER-2, mesothelin and epidermal growth factor receptor variant III (EGFR III ).
Способы согласно изобретению предпочтительно позволяют получать клеточные популяции, обогащенные реактивными в отношении опухоли Т-клетками. Т-клетки могут быть реактивными в отношении опухоли, вследствие чего они специфически распознают, лизируют и/или уничтожают опухолевые клетки. В этом отношении вариант осуществления изобретения представляет изолированную или очищенную клеточную популяцию, обогащенную реактивными в отношении опухоли Т-клетками, полученную при помощи любого из способов согласно изобретению, описанных в данном контексте. Согласно варианту осуществления, изолированная или очищенная клеточная популяция включает в себя любой один или более из (a) CD8+/4-1BB+/PD-1+ Т-клеток, (b) CD8+/4-1BB-/PD-1+ Т-клеток, (с) CD8+/4-1BB+/PD-1- Т-клеток, (d) CD8+/LAG-3-/PD-1+ Т-клеток, (е) CD8+/LAG-3-/PD-1+ Т-клеток, (f) CD8+/LAG-3+/PD-1- Т-клеток, (g) CD8+/TIM-3+/PD-1+ Т-клеток, (h) CD8+/TIM-3-/PD-1+ Т-клеток, (i) CD8+/TIM-3+/PD-1- Т-клеток, (j) CD8+/TIM-3+/LAG-3+ Т-клеток, (k) CD8+/TIM-3-/LAG-3+ Т-клеток, (l) CD8+/TIM-3+/LAG-3- Т-клеток, (m) CD8+/4-1BB+/LAG-3+ Т-клеток, (n) CD8+/4-1BB-/LAG-3+ Т-клеток, (о) CD8+/4-1BB+/LAG-3- Т-клеток, (р) CD8+/4-1BB+/TIM-3+ Т-клеток, (q) CD8+/4-1BB-/TIM-3+ Т-клеток и (r) CD8+/4-1BB+/TIM-3- Т-клеток, где клеточная популяция обогащена реактивными в отношении опухоли Т-клетками. Согласно другому варианту осуществления изобретения, изолированная или очищенная клеточная популяция включает в себя (a) CD8+/4-1BB+/PD-1+ Т-клетки, (b) CD8+/4-1BB-/PD-1+ Т-клетки, (с) CD8+/4-1BB+/PD-1- Т-клетки, (d) CD8+/LAG-3+/PD-1+ Т-клетки, (е) CD8+/LAG-3-/PD-1+ Т-клетки, (f) CD8+/LAG-3+/PD-1- Т-клетки, (g) CD8+/TIM-3+/PD-1+ Т-клетки, (h) CD8+/TIM-3-/PD-1+ Т-клетки, (i) CD8+/TIM-3+/PD-1- Т-клетки, (j) CD8+/TIM-3+/LAG-3+ Т-клетки, (k) CD8+/TIM-3-/LAG-3+ Т-клетки, (l) CD8+/TIM-3+/LAG-3- Т-клетки, (m) CD8+/4-1BB+/LAG-3+ T-клетки, (n) CD8+/4-1BB-/LAG-3+ Т-клетки, (о) CD8+/4-1BB+/LAG-3- Т-клетки, (p) CD8+/4-1BB+/TIM-3+ Т-клетки, (q) CD8+/4-1BB-/TIM-3+ Т-клетки или (r) CD8+/4-1BB+/TIM-3- T-клетки. Согласно другому варианту осуществления изобретения, любая из клеточных популяций, описанных в данном контексте, также может быть CD3+.The methods of the invention preferably produce cell populations enriched in tumor-reactive T cells. T cells can be tumor reactive, whereby they specifically recognize, lyse and/or destroy tumor cells. In this regard, an embodiment of the invention provides an isolated or purified cell population enriched for tumor-reactive T cells obtained using any of the methods of the invention described herein. In an embodiment, the isolated or purified cell population includes any one or more of (a) CD8 + /4-1BB + /PD-1 + T cells, (b) CD8 + /4-1BB - /PD-1 + T cells, (c) CD8 + /4-1BB + /PD-1 - T cells, (d) CD8 + /LAG-3 - /PD-1 + T cells, (f) CD8 + /LAG -3 - /PD-1 + T cells, (f) CD8 + /LAG-3 + /PD-1 - T cells, (g) CD8 + /TIM-3 + /PD-1 + T cells, (h) CD8 + /TIM-3 - /PD-1 + T cells, (i) CD8 + /TIM-3 + /PD-1 - T cells, (j) CD8 + /TIM-3 + /LAG -3 + T cells, (k) CD8 + /TIM-3 - /LAG-3 + T cells, (l) CD8 + /TIM-3 + /LAG-3 - T cells, (m) CD8 + /4-1BB + /LAG-3 + T cells, (n) CD8 + /4-1BB - /LAG-3 + T cells, (o) CD8 + /4-1BB + /LAG-3 - T- cells, (p) CD8 + /4-1BB + /TIM-3 + T cells, (q) CD8 + /4-1BB - /TIM-3 + T cells and (r) CD8 + /4-1BB + /TIM-3 - T cells, where the cell population is enriched with tumor-reactive T cells. According to another embodiment of the invention, the isolated or purified cell population includes (a) CD8 + /4-1BB + /PD-1 + T cells, (b) CD8 + /4-1BB - /PD-1 + T- cells cells, (c) CD8 + /4-1BB + /PD-1 - T cells, (d) CD8 + /LAG-3 + /PD-1 + T cells, (e) CD8 + /LAG-3 - /PD-1 + T cells, (f) CD8 + /LAG-3 + /PD-1 - T cells, (g) CD8 + /TIM-3 + /PD-1 + T cells, (h) CD8 + /TIM-3 - /PD-1 + T cells, (i) CD8 + /TIM-3 + /PD-1 - T cells, (j) CD8 + /TIM-3 + /LAG-3 + T cells, (k) CD8 + /TIM-3 - /LAG-3 + T cells, (l) CD8 + /TIM-3 + /LAG-3 - T cells, (m) CD8 + /4- 1BB + /LAG-3 + T cells, (n) CD8 + /4-1BB - /LAG-3 + T cells, (o) CD8 + /4-1BB + /LAG-3 - T cells, ( p) CD8 + /4-1BB + /TIM-3 + T cells, (q) CD8 + /4-1BB - /TIM-3 + T cells or (r) CD8 + /4-1BB + /TIM- 3 - T cells. According to another embodiment of the invention, any of the cell populations described in this context may also be CD3 + .
Согласно варианту осуществления изобретения, изолированная или очищенная клеточная популяция включает в себя смесь клеток, экспрессирующих любой из биомаркеров, описанных в данном контексте. Например, изолированная или очищенная клеточная популяция может включать в себя комбинацию (a) PD-1+ клеток и 4-1BB+ клеток, (b) PD-1+ клеток и LAG-3+ клеток, (с) PD-1+ клеток и TIM-3+ клеток, (d) 4-1BB+ клеток и LAG-3+ клеток, (е) 4-1BB+ клеток и TIM-3+ клеток, (f) LAG-3+ клеток и TIM-3+ клеток, (g) PD-1+ клеток, 4-1BB+ клеток и LAG-3+ клеток, (h) PD-1+ клеток, 4-1BB+ клеток и TIM-3+ клеток, (i) PD-1+ клеток, LAG-3+ клеток и TIM-3+ клеток, (j) 4-1BB+ клеток, LAG-3+ клеток и TIM-3+ клеток и/или (k) PD-1+ клеток, 4-1BB+ клеток, LAG-3+ клеток и TIM-3+ клеток. Согласно другому варианту осуществления изобретения, любая из клеточных популяций, описанных в данном контексте, также может быть CD8+ и/или CD3+.According to an embodiment of the invention, the isolated or purified cell population includes a mixture of cells expressing any of the biomarkers described in this context. For example, the isolated or purified cell population may include a combination of (a) PD-1 + cells and 4-1BB + cells, (b) PD-1 + cells and LAG-3 + cells, (c) PD-1 + cells and TIM-3 + cells, (d) 4-1BB + cells and LAG-3 + cells, (e) 4-1BB + cells and TIM-3 + cells, (f) LAG-3 + cells and TIM-3 + cells, (g) PD-1 + cells, 4-1BB + cells and LAG-3 + cells, (h) PD-1 + cells, 4-1BB + cells and TIM-3 + cells, (i) PD-1 + cells, LAG-3 + cells and TIM-3 + cells, (j) 4-1BB + cells, LAG-3 + cells and TIM-3 + cells and/or (k) PD-1 + cells, 4-1BB + cells, LAG-3 + cells and TIM-3 + cells. According to another embodiment of the invention, any of the cell populations described in this context may also be CD8 + and/or CD3 + .
Термин "изолированный" при использовании в данном контексте означает удаление из его естественной среды. Термин "очищенный" при использовании в данном контексте означает повышение чистоты, где "чистота" является относительным понятием и ее не следует рассматривать как абсолютную чистоту. Например, чистота может составлять по меньшей мере приблизительно 50%, может превышать 60%, 70% или 80%, 90% или может составлять 100%.The term "isolated" when used in this context means removal from its natural environment. The term "purified" when used in this context means increased purity, where "purity" is a relative concept and should not be considered as absolute purity. For example, the purity may be at least about 50%, may be greater than 60%, 70% or 80%, 90%, or may be 100%.
Другой вариант осуществления изобретения представляет способ введения клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, млекопитающему, при этом способ включает в себя: (а) получение общей популяции Т-клеток из образца опухоли; (b) специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, экспрессирующих один или более из TIM-3, LAG-3, 4-1BB и PD-1, из общей популяции; (с) отделение селектированных на стадии (b) клеток от неселектированных с получением клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками; и (d) введение клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, млекопитающему. Получение общей популяции Т-клеток из образца опухоли, специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, экспрессирующих один или более из TIM-3, LAG-3, 4-1BB и PD-1, из общей популяции и отделение селектированных клеток от неселектированных с получением клеточной популяции может осуществляться как описано в данном контексте в отношении других аспектов изобретения.Another embodiment of the invention provides a method of administering a cell population enriched for tumor-reactive T cells to a mammal, the method comprising: (a) obtaining a total population of T cells from a tumor sample; (b) specifically selecting CD8+ T cells expressing one or more of TIM-3, LAG-3, 4-1BB and PD-1 from the general population; (c) separating the cells selected in step (b) from the unselected cells to obtain a cell population enriched in tumor-reactive T cells; and (d) administering a cell population enriched in tumor-reactive T cells to a mammal. Obtaining a general population of T cells from a tumor sample, specifically selecting CD8+ T cells expressing one or more of TIM-3, LAG-3, 4-1BB, and PD-1 from the general population, and separating selected cells from unselected cells to obtain a cell populations may be carried out as described herein with respect to other aspects of the invention.
Способ может также включать в себя введение клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, млекопитающему. Клеточную популяцию, обогащенную реактивными в отношении опухоли Т-клетками, можно вводить любым подходящим способом. Предпочтительно, клеточную популяцию, обогащенную реактивными в отношении опухоли Т-клетками, вводят путем инъекции, например, внутривенно.The method may also include administering a cell population enriched in tumor-reactive T cells to a mammal. The cell population enriched for tumor-reactive T cells can be administered by any suitable route. Preferably, the cell population enriched in tumor reactive T cells is administered by injection, for example intravenously.
Клеточная популяция согласно изобретению, обогащенная реактивными в отношении опухоли Т-клетками, может быть включена в состав композиции, такой как фармацевтическая композиция. В этом отношении изобретение представляет фармацевтическую композицию, содержащую любую из клеточных популяций, описанных в данном контексте, и фармацевтически приемлемый носитель.The cell population of the invention, enriched in tumor-reactive T cells, can be included in a composition, such as a pharmaceutical composition. In this regard, the invention provides a pharmaceutical composition containing any of the cell populations described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.
Другой вариант осуществления изобретения представляет способ получения фармацевтической композиции, содержащей клеточную популяцию, обогащенную реактивными в отношении опухоли Т-клетками, при этом способ включает в себя: (а) получение общей популяции Т-клеток из образца опухоли; (b) специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, экспрессирующих один или более из TIM-3, LAG-3, 4-1BB и PD-1, из общей популяции; (с) отделение селектированных на стадии (b) клеток от неселектированных с получением клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками; и (d) объединение клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, с фармацевтически приемлемым носителем с получением фармацевтической композиции, содержащей клеточную популяцию, обогащенную реактивными в отношении опухоли Т-клетками. Получение общей популяции Т-клеток из образца опухоли, специфическое селектирование CD8+ Т-клеток, экспрессирующих один или более из TIM-3, LAG-3, 4-1BB и PD-1, из общей популяции и отделение селектированных клеток от неселектированных с получением клеточной популяции может осуществляться как описано в данном контексте в отношении других аспектов изобретения.Another embodiment of the invention provides a method for producing a pharmaceutical composition containing a cell population enriched in tumor reactive T cells, the method comprising: (a) obtaining a total population of T cells from a tumor sample; (b) specifically selecting CD8+ T cells expressing one or more of TIM-3, LAG-3, 4-1BB and PD-1 from the general population; (c) separating the cells selected in step (b) from the unselected cells to obtain a cell population enriched in tumor-reactive T cells; and (d) combining a cell population enriched for tumor-reactive T cells with a pharmaceutically acceptable carrier to produce a pharmaceutical composition comprising a cell population enriched for tumor-reactive T cells. Obtaining a general population of T cells from a tumor sample, specifically selecting CD8+ T cells expressing one or more of TIM-3, LAG-3, 4-1BB, and PD-1 from the general population, and separating selected cells from unselected cells to obtain a cell populations may be carried out as described herein with respect to other aspects of the invention.
Способ может включать в себя объединение клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, с фармацевтически приемлемым носителем с получением фармацевтической композиции, содержащей клеточную популяцию, обогащенную реактивными в отношении опухоли Т-клетками. Предпочтительно, носитель является фармацевтически приемлемым носителем. В том, что касается фармацевтических композиций, носитель может быть любым носителем, обычно используемым для введения клеток. Такие фармацевтически приемлемые носители хорошо известны специалистам в данной области техники и легко доступны неограниченному кругу лиц. Предпочтительно, чтобы фармацевтически приемлемый носитель не имел вредных побочных эффектов или был нетоксичным в условиях применения. Подходящий фармацевтически приемлемый носитель для инъекции клеток может включать в себя любой изотонический носитель, такой как, например, физиологический раствор (приблизительно 0,90 масс./об. % NaCl в воде, приблизительно 300 мОсм/л NaCl в воде или приблизительно 9,0 г NaCl на л воды), раствор электролита NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), приблизительно 5% раствор декстрозы в воде или лактат Рингера. Согласно варианту осуществления, фармацевтически приемлемый носитель добавляют с человеческим сывороточным альбумином.The method may include combining a cell population enriched for tumor-reactive T cells with a pharmaceutically acceptable carrier to produce a pharmaceutical composition containing a cell population enriched for tumor-reactive T cells. Preferably, the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier. With regard to pharmaceutical compositions, the carrier may be any carrier commonly used for administering cells. Such pharmaceutically acceptable carriers are well known to those skilled in the art and are readily available to the general public. Preferably, the pharmaceutically acceptable carrier does not have harmful side effects or is non-toxic under conditions of use. A suitable pharmaceutically acceptable vehicle for cell injection may include any isotonic vehicle, such as, for example, saline (about 0.90% w/v NaCl in water, about 300 mOsm/L NaCl in water, or about 9.0 g NaCl per L water), NORMOSOL R electrolyte solution (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), approximately 5% dextrose in water, or Ringer's lactate. In an embodiment, a pharmaceutically acceptable carrier is added with human serum albumin.
Применительно к изобретению, вводимая доза, например, количество клеток в клеточной популяции согласно изобретению, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, должна быть достаточной для оказания воздействия, например, вызывания терапевтического или профилактического ответа, у млекопитающего в течение объективно необходимого времени. Например, количество клеток должно быть достаточным для связывания с раковым антигеном или выявления, лечения или предупреждения рака в течение приблизительно от 2 часов или больше, например, от 12 до 24 или больше часов, от момента введения. Согласно некоторым вариантам осуществления, временной промежуток может быть еще большим. Число клеток будет определено в зависимости от, например, эффективности конкретных клеток и состояния млекопитающего (например, человека), а также массы тела млекопитающего (например, человека), подлежащего лечению.In connection with the invention, the administered dose, for example, the number of cells in the cell population of the invention enriched in tumor-reactive T cells, must be sufficient to produce an effect, for example, induce a therapeutic or prophylactic response, in a mammal for an objectively necessary time. For example, the number of cells must be sufficient to bind to a cancer antigen or detect, treat, or prevent cancer within about 2 hours or more, such as 12 to 24 hours or more, from the time of administration. In some embodiments, the time period may be even longer. The number of cells will be determined depending on, for example, the effectiveness of the particular cells and the condition of the mammal (eg, human), as well as the body weight of the mammal (eg, human) to be treated.
В данной области техники известно множество методов анализа, позволяющих определять вводимое число клеток из клеточной популяции согласно изобретению, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками. Применительно к изобретению, для определения начального вводимого млекопитающему числа клеток может быть использован анализ, основанный на сравнении того, насколько лизированы клетки-мишени или секретирован один или более цитокин, такой как, например, IFN-γ и IL-2, при введении данного числа таких клеток млекопитающему из группы млекопитающих, каждому из которых вводили разное число клеток. Степень, до которой лизированы клетки-мишени или секретированы цитокины, такие как, например, IFN-γ и IL-2, при введении определенного числа клеток, может быть оценена с помощью известных способов. Секреция цитокинов, таких как, например, IL-2, также может давать представление относительно качества (например, фенотипа и/или эффективности) клеточного препарата.A variety of assays are known in the art to determine the input number of cells from the cell population of the invention enriched in tumor-reactive T cells. In connection with the invention, an assay based on comparing how much target cells are lysed or one or more cytokines, such as, for example, IFN-γ and IL-2, is secreted when a given number is administered can be used to determine the initial number of cells administered to a mammal. of such cells to a mammal from a group of mammals, each of which was injected with a different number of cells. The extent to which target cells are lysed or cytokines, such as, for example, IFN-γ and IL-2, are secreted when a given number of cells are administered can be assessed using known methods. The secretion of cytokines, such as, for example, IL-2, can also provide insight into the quality (eg, phenotype and/or potency) of the cell preparation.
Число клеток в клеточной популяции согласно изобретению, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, также может быть определено по наличию, природе и продолжительности каких-либо вредных побочных действий, которые могут сопровождать введение конкретной клеточной популяции. Как правило, решение относительно числа клеток, необходимых для лечения конкретного пациента, будет принимать лечащий врач с учетом целого ряда факторов, таких как возраст, масса тела, общее состояние здоровья, питание, пол, способ введения и серьезность заболевания, подлежащего лечению. В качестве примера и без намерения ограничивать изобретение, число клеток может составлять приблизительно от 10×106 до 10×1011 клеток на инфузию, приблизительно от 10×109 клеток до 10×1011 клеток на инфузию или от 10×107 приблизительно до 10×109 клеток на инфузию. Клеточные популяции, полученные при помощи способов согласно изобретению, предпочтительно, могут позволять осуществлять эффективное лечение или предупреждение рака.The number of cells in a cell population of the invention enriched for tumor-reactive T cells can also be determined by the presence, nature and duration of any harmful side effects that may accompany administration of a particular cell population. Typically, the decision regarding the number of cells needed to treat a particular patient will be made by the attending physician, taking into account a number of factors such as age, body weight, general health, nutrition, gender, route of administration and the severity of the disease being treated. By way of example, and without intending to limit the invention, the number of cells may be from about 10x10 6 to 10x10 11 cells per infusion, from about 10x10 9 cells to 10x10 11 cells per infusion, or from about 10x10 7 up to 10×10 9 cells per infusion. Cell populations obtained using the methods of the invention may advantageously allow for effective treatment or prevention of cancer.
Предполагается, что клеточные популяции, полученные при помощи способов согласно изобретению, могут быть использованы в способах лечения или предупреждения онкологических заболеваний. В этом отношении изобретение представляет способ лечения или предупреждения рака у млекопитающего, включающий в себя введение млекопитающему фармацевтических композиций или клеточных популяций, полученных при помощи любого из способов согласно изобретению, описанных в данном контексте, в количестве, эффективном для лечения или предупреждения возникновения рака у млекопитающего. Другой вариант осуществления изобретения представляет способ лечения или предупреждения рака у млекопитающего, включающий в себя введение клеточной популяции, обогащенной реактивными в отношении опухоли Т-клетками, млекопитающему при помощи любого из способов согласно изобретению, описанных в данном контексте, в количестве, эффективном для лечения или предупреждения возникновения рака у млекопитающего.It is contemplated that cell populations obtained using the methods of the invention may be used in methods of treating or preventing cancer. In this regard, the invention provides a method of treating or preventing cancer in a mammal, comprising administering to the mammal pharmaceutical compositions or cell populations obtained by any of the methods of the invention described herein in an amount effective to treat or prevent the occurrence of cancer in the mammal . Another embodiment of the invention provides a method of treating or preventing cancer in a mammal, comprising administering a cell population enriched in tumor-reactive T cells to the mammal using any of the methods of the invention described herein in an amount effective to treat or preventing cancer in mammals.
Термины "лечить" и "предупреждать", а также однокоренные с ними слова при использовании в данном контексте не следует понимать как 100% или полное излечение или предупреждение. Скорее, имеют место различные степени лечения или предупреждения, которые средний специалист в данной области расценит как имеющие потенциальный положительный или терапевтический эффект. В этом отношении, способы согласно изобретению могут обеспечивать любую степень или любой уровень лечения или предупреждения рака у млекопитающего. Кроме того, лечение или предупреждение, достигнутые при помощи способа согласно изобретению, могут включать в себя лечение или предупреждение одного или более состояний или симптомов заболевания, например, рака, подлежащих лечению или предупреждению. Кроме того, в рамках данного изобретения "предупреждение" может охватывать замедление наступления заболевания или симптома или его состояния.The terms “cure” and “prevent”, as well as words with the same root, when used in this context, should not be understood as 100% or complete cure or prevention. Rather, there are varying degrees of treatment or prevention that would be judged by the average person skilled in the art to have a potential beneficial or therapeutic effect. In this regard, the methods of the invention may provide any degree or level of treatment or prevention of cancer in a mammal. In addition, treatment or prevention achieved by the method of the invention may include treatment or prevention of one or more disease conditions or symptoms, such as cancer, to be treated or prevented. Moreover, within the scope of this invention, “prevention” may include delaying the onset of a disease or symptom or condition thereof.
Применительно к способам изобретения, согласно которым вводят популяции клеток, клетки могут быть клетками, аллогенными или аутологичными млекопитающему. Предпочтительно, клетки являются аутологичными млекопитающему.For methods of the invention in which populations of cells are administered, the cells may be cells that are allogeneic or autologous to the mammal. Preferably, the cells are autologous to the mammal.
Вариант осуществления изобретения также включает в себя противолимфомную терапию млекопитающего перед введением любых обогащенных клеточных популяций, полученных при помощи любого из способов согласно изобретению, описанных в данном контексте. Примеры противолимфомной терапии включают, но могут не ограничиваться перечнем, немиелоаблативную противолимфомную химиотерапию, миелоаблативную противолимфомную химиотерапию, общее облучение всего организма и так далееAn embodiment of the invention also includes administering anti-lymphoma therapy to a mammal prior to administration of any enriched cell populations obtained using any of the methods of the invention described herein. Examples of anti-lymphoma therapy include, but may not be limited to, non-myeloablative anti-lymphoma chemotherapy, myeloablative anti-lymphoma chemotherapy, total body irradiation, etc.
Применительно к способам изобретения, рак может быть любой злокачественной опухолью, включая любые саркомы (например, синовиальная саркома, остеосаркома, лейомиосаркома матки и альвеолярная рабдомиосаркома), лимфомы (например, лимфома Ходжкина и енходжкинская лимфома), гепатоклеточную карциному, глиому, рак головы и шеи, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелолейкоз, рак костей, рак мозга, рак молочной железы, рак ануса, анального канала или колоректальный рак, рак глаза, рак внутрипеченочных желчных протоков, рак суставов, рак шеи, желчного пузыря или плевры, рак носа, носовой полости или среднего уха, рак полости рта, рак вульвы, хронический лимфолейкоз, хронический миелоидный лейкоз, рак толстой кишки (например, карцинома толстой кишки), рак пищевода, рак шейки матки, рак желудочно-кишечного тракта (например, карциноидная опухоль желудочно-кишечного тракта), рак гортаноглотки, рак гортани, рак печени, рак легких, злокачественную мезотелиому, меланому, множественную миелому, рак носоглотки, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак брюшной полости, опухоли сальника и брыжейки, рак глотки, рак предстательной железы, рак прямой кишки, рак почки, рак тонкой кишки, рак мягких тканей, рак желудка, рак яичка, рак щитовидной железы, рак мочеточника и рак мочевого пузыря.In connection with the methods of the invention, the cancer can be any malignancy, including any sarcoma (for example, synovial sarcoma, osteosarcoma, uterine leiomyosarcoma and alveolar rhabdomyosarcoma), lymphomas (for example, Hodgkin's lymphoma and Hodgkin's lymphoma), hepatocellular carcinoma, glioma, head and neck cancer , acute lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia, bone cancer, brain cancer, breast cancer, anal, anal or colorectal cancer, eye cancer, intrahepatic bile duct cancer, joint cancer, neck, gall bladder or pleural cancer, nasal cancer, nasal cavity or middle ear, oral cavity cancer, vulvar cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia, colon cancer (eg, colon carcinoma), esophageal cancer, cervical cancer, gastrointestinal cancer (eg, gastrointestinal carcinoid tumor tract), laryngopharyngeal cancer, larynx cancer, liver cancer, lung cancer, malignant mesothelioma, melanoma, multiple myeloma, nasopharyngeal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, abdominal cancer, tumors of the omentum and mesentery, pharyngeal cancer, prostate cancer, cancer rectal cancer, kidney cancer, small bowel cancer, soft tissue cancer, stomach cancer, testicular cancer, thyroid cancer, ureteral cancer and bladder cancer.
Следующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, однако их, разумеется, не следует рассматривать как каким бы то ни было образом ограничивающие его объем.The following examples further illustrate the invention, but they should, of course, not be construed as limiting its scope in any way.
Описание примеров осуществления изобретенияDescription of embodiments of the invention
Пример 1Example 1
Этот пример демонстрирует частоту встречаемости CD3+/CD8+ клеток в свежем образце гидролизата опухоли меланомы, экспрессирующих PD-1, TIM-3, LAG-3 или 4-1BB. Этот пример также показывает коэкспрессию 1) TIM-3 и PD-1, 2) LAG-3 и PD-1 и 3) LAG-3 и TIM-3 CD8+ Т-клетками, изолированными из свежего образца опухоли меланомы. Кроме того, этот пример демонстрирует экспрессию PD-1, TIM-3 или LAG-3 реактивными MART-127-35 летками.This example demonstrates the frequency of CD3 + /CD8 + cells in a fresh melanoma tumor digest sample expressing PD-1, TIM-3, LAG-3, or 4-1BB. This example also shows the coexpression of 1) TIM-3 and PD-1, 2) LAG-3 and PD-1, and 3) LAG-3 and TIM-3 by CD8 + T cells isolated from a fresh melanoma tumor sample. Additionally, this example demonstrates expression of PD-1, TIM-3, or LAG-3 by MART-1 reactive 27-35 year olds.
Суспензии отдельных клеток, полученные механическим и ферментативным гидролизом свежего образца опухоли меланомы, размораживали и выстаивали в течение ночи при 1×106 клеток/мл в отсутствии цитокинов. Клетки окрашивали и измеряли процент CD3+CD8+ клеток, экспрессирующих PD-1, TIM-3, LAG-3, 4-1BB, ОХ40, CD25, CD28, CD27 или CD70 при помощи проточной цитометрии. Результаты представлены на Фиг. 1А. Как показано на Фиг. 1А, CD3+/CD8+ клетки из свежего образца гидролизита опухоли могут экспрессировать PD-1, TIM-3, LAG-3 или 4-1BB.Single cell suspensions obtained by mechanical and enzymatic hydrolysis of a fresh melanoma tumor sample were thawed and kept overnight at 1×10 6 cells/ml in the absence of cytokines. Cells were stained and the percentage of CD3 + CD8 + cells expressing PD-1, TIM-3, LAG-3, 4-1BB, OX40, CD25, CD28, CD27, or CD70 was measured by flow cytometry. The results are presented in Fig. 1A. As shown in FIG. 1A, CD3 + /CD8 + cells from a fresh tumor digest sample may express PD-1, TIM-3, LAG-3 or 4-1BB.
В отдельном опыте клетки получали из свежих образцов двух разных меланомных опухолей и измеряли коэкспрессию TIM-3 и PD-1, коэкспрессию LAG-3 и PD-1 и коэкспрессию LAG-3 и TIM-3 с помощью проточной цитометрии на живых клетках и CD3+CD8+ клетках. Результаты показали, что субпопуляции CD8+ Т-клеток, проникающие в меланомные опухоли, коэкспрессируют 1) TIM-3 и PD-1, 2) LAG-3 и PD-1 и 3) LAG-3 и TIM-3.In a separate experiment, cells were obtained from fresh samples of two different melanoma tumors and coexpression of TIM-3 and PD-1, coexpression of LAG-3 and PD-1, and coexpression of LAG-3 and TIM-3 were measured by flow cytometry on live cells and CD3 + CD8 + cells. The results showed that CD8 + T cell subsets infiltrating melanoma tumors coexpress 1) TIM-3 and PD-1, 2) LAG-3 and PD-1, and 3) LAG-3 and TIM-3.
В отдельном опыте измеряли экспрессию PD-1, TIM-3 или LAG-3 на MART-127-35 реактивных Т-клетках с помощью проточной цитометрии на живых клетках и CD3+CD8+ клетках и сравнивали с экспрессией CD3+CD8+ Т-клеток, которые не были MART-127-35 реактивными. Результаты показали, что MART-127-35 реактивные клетки, проникающие в меланомные опухоли, экспрессируют более высокие уровни PD-1, TIM-3 и LAG-3 по сравнению с CD3+CD8+ Т-клетками, которые были нереактивными в отношении MART-127-35.In a separate experiment, the expression of PD-1, TIM-3, or LAG-3 on MART-1 27-35 reactive T cells was measured by flow cytometry on live cells and CD3 + CD8 + cells and compared with the expression of CD3 + CD8 + T − cells that were not MART-1 27-35 reactive. Results showed that MART-1 27-35 reactive cells infiltrating melanoma tumors expressed higher levels of PD-1, TIM-3 and LAG-3 compared to CD3 + CD8 + T cells that were MART non-reactive -1 27-35 .
Пример 2Example 2
Этот пример демонстрируют способ специфического селектирования CD3+CD8+ клеток, также экспрессирующих один из PD-1, TIM-3, LAG-3 и 4-1BB, и рост числа селектированных клеток.This example demonstrates a method for specifically selecting CD3 + CD8 + cells also expressing one of PD-1, TIM-3, LAG-3 and 4-1BB, and increasing the number of selected cells.
Суспензию отдельных клеток, полученных из свежего образца опухоли меланомы (FrTu#1913), размораживали и выстаивали в течение ночи в отсутствии цитокинов, после чего окрашивали. Клетки сортировали в следующие CD3+ популяции, используя антитела анти-CD3, анти-CD8, анти-PD-l, TIM-3, LAG-3 и 4-1BB: CD8+, CD8+/PD-1+, CD8+/LAG3+, CD8+/TIM-3+, CD8+/4-1BB+, CD8+/PD-1-, CD8+/LAG3-, CD8+/TIM-3- или CD8+/4-1BB- путем сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS). Затем численность клеток увеличивали, используя протокол быстрого расширения (200-кратно избыточно облученные фидеры, 30 нг/мл анти-CD3 и 500 CU/мл IL-2), и измеряли кратность роста изолированных популяций. Результаты представлены на Фиг. 1В. Как показано на Фиг. 1В, число CD8+ клеток, также экспрессирующих один из PD-1, TIM-3, LAG-3 и 4-1BB, также возросло.A suspension of single cells obtained from a fresh melanoma tumor sample (FrTu#1913) was thawed and kept overnight in the absence of cytokines and then stained. Cells were sorted into the following CD3 + populations using anti-CD3, anti-CD8, anti-PD-l, TIM-3, LAG-3 and 4-1BB antibodies: CD8 + , CD8 + /PD-1 + , CD8 + / LAG3 + , CD8 + /TIM-3 + , CD8 + /4-1BB + , CD8 + /PD-1 - , CD8 + /LAG3 - , CD8 + /TIM-3 - or CD8 + /4-1BB - by sorting fluorescence-activated cells (FACS). Cell numbers were then expanded using a rapid expansion protocol (200-fold over-irradiated feeders, 30 ng/ml anti-CD3, and 500 CU/ml IL-2), and the fold growth of isolated populations was measured. The results are presented in Fig. 1B. As shown in FIG. 1B, the number of CD8 + cells also expressing one of PD-1, TIM-3, LAG-3 and 4-1BB also increased.
Пример 3Example 3
Этот пример демонстрирует реактивность in vitro Т-клеток, изолированнных из свежего образца опухоли меланомы и отсортированных на предмет наличия экспрессии CD8 и одного из PD-1, LAG-3, TIM-3 и 4-1BB.This example demonstrates the in vitro reactivity of T cells isolated from a fresh melanoma tumor sample and sorted for expression of CD8 and one of PD-1, LAG-3, TIM-3 and 4-1BB.
Усиление экспрессии 4-1BB является показателем стимуляции TCR. Было установлено, что после возрастания числа Т-клеток и в отсутствии TCR стимуляции экспрессия 4-1BB утрачивается. Кроме того, наблюдалось, что после роста числа клеток и совместного культивирования с аутологичной опухолевой клеточной линией Т-клетки, ранее утратившие экспрессию 4-1BB и стимулированные при помощи опухолевой клеточной линии, будут реэкспрессировать 4-1BB. Соответственно, экспрессию 4-1BB измеряют через 24 часа после совместного культивирования с аутологичной опухолью в качестве маркера TCR стимуляции в сравнении с аутологичной опухолевой клеточной линией.Increased expression of 4-1BB is an indicator of TCR stimulation. It was found that after an increase in the number of T cells and in the absence of TCR stimulation, the expression of 4-1BB is lost. In addition, it was observed that after cell expansion and co-culture with an autologous tumor cell line, T cells that had previously lost 4-1BB expression and were stimulated with the tumor cell line would re-express 4-1BB. Accordingly, 4-1BB expression is measured 24 hours after co-culture with the autologous tumor as a marker of TCR stimulation in comparison with the autologous tumor cell line.
Суспензию отдельных клеток из свежего образца гидролизата опухоли меланомы (FrTu#1913) выстаивали в течение ночи без цитокинов и сортировали на предмет наличия в них популяций: CD8+, CD8+/PD-1+, CD8+/LAG3+, CD8+/TIM-3+, CD8+/4-1BB+ CD8+/PD-1-, CD8+/LAG3-, CD8+/TIM-3- или CD8+/4-1BB- популяции при помощи FACS, как описано в Примере 3. Численность отсортированных клеток возрастала in vitro в течение 14 дней. На 14 день клетки промывали и совместно культивировали в сравнении с аутологичной опухолевой клеточной линией (1×105 эффекторы: 1×105 клетки-мишени). Реактивность количественно оценивали при помощи высвобождения гамма-IFN и процента CD8+ клеток, экспрессирующих 4-1BB, через 24 часа после совместного культивирования с аутологичной опухолевой клеточной линией (ТС1913) и аллогенными (Аллоген.) опухолевыми клеточными линиями. Процент CD8+ клеток, распознающих специфически мутированный эпитоп (CDKn2A), являющийся мишенью для Т-клеток, также оценивали количественно, сравнивая тетрамер с этим специфическим эпитопом. Результаты представлены в Таблицах 1 и 2 и на Фиг. 2А-2Е.A suspension of single cells from a fresh melanoma tumor hydrolyzate sample (FrTu#1913) was kept overnight without cytokines and sorted for the presence of populations: CD8 + , CD8 + /PD-1 + , CD8 + /LAG3 + , CD8 + /TIM -3 + , CD8 + /4-1BB + CD8 + /PD-1 - , CD8 + /LAG3 - , CD8 + /TIM-3 - or CD8 + /4-1BB - populations using FACS as described in Example 3 The number of sorted cells increased in vitro over 14 days. On day 14, cells were washed and cocultured against an autologous tumor cell line (1x10 5 effectors: 1x10 5 target cells). Reactivity was quantified using IFN-gamma release and the percentage of CD8 + cells expressing 4-1BB 24 hours after co-culture with an autologous tumor cell line (TC1913) and allogeneic (Allogeneic) tumor cell lines. The percentage of CD8 + cells recognizing a specifically mutated epitope (CDKn2A) targeted by T cells was also quantified by comparing the tetramer to that specific epitope. The results are presented in Tables 1 and 2 and Fig. 2A-2E.
Увеличенную in vitro численность эффекторных популяций, изолированных из свежего образца гидролизата опухоли и отсортированных в соответствии с экспрессией указанных маркеров клеточной поверхности, совместно культивировали в сравнении с аутологичными (Аут.) опухолевыми клеточными линиями (ТС1913) и аллогенными (Аллоген.) опухолевыми клеточными линиями. Показана реактивность гамма-IFN (пг/мл). Величины в скобках соответствуют проценту CD3+ CD8+ клеток, которые усиливали экспрессию CD137 (41ВВ) через 24 часа после совместного культивирования. Опухолевые клеточные линии (ТС) 624 CIITA, 2119, 2448 и 1865 распределяют HLA А*0201 аллель с TC1913, a TC1379 распределяет А*11 с TC1913. TC2301 представляет собой аллогенный контроль (не совпадающий для всех антигенов лейкоцитов человека HLA), используемый в качестве отрицательного контроля.In vitro-expanded effector populations, isolated from a fresh tumor digest sample and sorted according to the expression of specified cell surface markers, were co-cultured in comparison with autologous (Aut.) tumor cell lines (TC1913) and allogeneic (Allogene.) tumor cell lines. IFN gamma reactivity (pg/ml) is shown. Values in parentheses correspond to the percentage of CD3+ CD8+ cells that upregulated CD137 (41BB) expression 24 hours after coculture. Tumor cell lines (TCs) 624 CIITA, 2119, 2448 and 1865 share the HLA A*0201 allele with TC1913, and TC1379 shares the A*11 with TC1913. TC2301 is an allogeneic control (not matched for all human leukocyte HLA antigens) used as a negative control.
* Контрольный А*11 рестриктированный пептид из CRKRS гена, распознавание по RCTIL 3309.* Control A*11 restricted peptide from the CRKRS gene, recognition by RCTIL 3309.
Величины >200 пг/мл и более чем в два раза превышающие фон считали положительными, они выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.Values >200 pg/ml and more than twice the background were considered positive and are shown in bold and underlined.
Увеличенную in vitro численность эффекторных популяций, изолированных из свежего образца гидролизата опухоли и отсортированных в соответствии с экспрессией указанных маркеров клеточной поверхности, совместно культивировали в сравнении с аутологичными опухолевыми клеточными линиями (ТС1913) и аллогенной опухолевой клеточной линией (ТС2301) в качестве негативного контроля и COS А11 клетками, активированными нерелевантным (нерел.) пептидом или мутированным (мут.) пептидом. Показана реактивность при помощи IFN-гамма (пг/мл). Величины в скобках соответствуют проценту CD3+ CD8+ клеток, которые усиливали экспрессию CD137 (41ВВ) через 24 часа после совместного культивирования. Величины >200 пг/мл и более чем в два раза превышающие фон, считали положительными, они выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.In vitro-expanded effector populations, isolated from a fresh tumor digest sample and sorted according to the expression of the indicated cell surface markers, were co-cultured against autologous tumor cell lines (TC1913) and an allogeneic tumor cell line (TC2301) as a negative control and COS A11 cells activated by an irrelevant (irrelevant) peptide or a mutated (mutated) peptide. Reactivity with IFN-gamma (pg/ml) is shown. Values in parentheses correspond to the percentage of CD3 + CD8 + cells that upregulated CD137 (41BB) expression 24 hours after coculture. Values >200 pg/mL and more than twice background were considered positive and are shown in bold and underlined.
Как показано в Таблицах 1 и 2, Т-клетки, изолированные из свежего образца опухоли меланомы и отсортированные на предмет наличия экспрессии CD8 и одного из PD-1, LAG-3, TIM-3 и 4-1BB, обладают реактивностью в отношении аутологичных опухолевых клеточных линий, определяемой на основании секреции гамма-IFN, экспрессии 4-1BB и процента клеток, распознающих CDKn2A. Как показано на Фиг. 2А-2Е, Т-клетки, изолированные из каждого из пяти разных свежих образцов меланомной опухоли и отсортированные на предмет наличия экспрессии CD8 и одного из PD-1, LAG-3, TIM-3 и 4-1BB, обладают реактивностью в отношении аутологичных опухолевых клеточных линий, определяемой на основании секреции гамма-IFN и экспрессии 4-1BB.As shown in Tables 1 and 2, T cells isolated from a fresh melanoma tumor specimen and sorted for expression of CD8 and one of PD-1, LAG-3, TIM-3, and 4-1BB are reactive against autologous tumor cells. cell lines determined based on IFN-gamma secretion, 4-1BB expression, and percentage of cells recognizing CDKn2A. As shown in FIG. 2A-2E, T cells isolated from each of five different fresh melanoma tumor specimens and sorted for expression of CD8 and one of PD-1, LAG-3, TIM-3 and 4-1BB are reactive against autologous tumors cell lines, determined on the basis of IFN gamma secretion and 4-1BB expression.
В отдельном опыте клетки изолировали из двух независимых свежих образцов меланомной опухоли (FrTu#1913 and FrTu#3713) и сортировали на предмет наличия экспрессии CD8 и экспрессии PD-1, LAG-3, TIM-3 или 4-1BB, как описано в Примере 3. Численность отсортированных клеток возрастала в течение 14 дней in vitro. На 15 день клеточные линии-мишени (аутологичные и аллогенные) помечали изотопом 51Cr и совместно культивировали в течение 4 часов с эффекторными клетками в соотношениях, указанных на Фиг. 3A-3F. Высвобождение 51Cr определяли в трех параллельных опытах при помощи гамма-метрии и вычисляли специфический лизис в процентах по следующей формуле: [(экспериментальное число импульсов в минуту (англ. срт) (имп/мин) - спонтанное српл)/(максимальное срт - спонтанное cpm)] × 100. Результаты представлены на Фиг. 3A-3F. Как показано на Фиг. 3A-3F, клетки, отсортированные на предмет наличия в них экспрессии PD-1, LAG-3, TIM-3 или 4-1BB, были способны к лизису на аутологичных опухолевых клеточных линиях.In a separate experiment, cells were isolated from two independent fresh melanoma tumor samples (
Пример 4Example 4
Этот пример демонстрирует реактивность CD8+ клеток, изолированных из образца меланомной опухоли и отсортированных на предмет наличия экспрессии 4-1BB и/или PD-1.This example demonstrates the reactivity of CD8 + cells isolated from a melanoma tumor sample and sorted for 4-1BB and/or PD-1 expression.
Клетки изолировали из свежих образцов меланомных опухолей от 3 пациентов и сортировали на предмет наличия в них CD3+/CD8+/4-1BB+/PD-1-, CD3+/CD8+/4-1BB+/PD-1+, CD3+/CD8+/4-1BB-/PD-1+, CD3+/CD8+/4-1BB-PD-1-, CD3+/CD8+/PD-1+, CD3+/CD8+/4-1BB+, CD3+/CD8+/PD-1- или CD3+/CD8+/4-1BB- популяций при помощи FACS. Отсортированные клетки сокультивировали с аутологичными опухолевыми клетками и измеряли усиление экспрессии 4-1BB при помощи проточной цитометрии. Для всех трех образцов опухолей результаты показали, что Т-клетки, распознающие аутологичную опухоль (как было определено на основании усиления экспрессии 4-1BB), содержатся в однопозитивных клетках, экспрессирующих PD-1+ или 4-1BB+, однако самая высокая частота встречаемости реактивных в отношении опухоли клеток (определяемая на основании усиления экспрессии 4-1BB) была получена в случае популяции, коэкспрессирющей 4-1BB и PD-1 в свежем образце гидролизата опухоли меланомы.Cells were isolated from fresh melanoma tumor samples from 3 patients and sorted for the presence of CD3 + /CD8 + /4-1BB + /PD-1 - , CD3 + /CD8 + /4-1BB + /PD-1 + , CD3 + /CD8 + /4-1BB - /PD-1 + , CD3 + /CD8 + /4-1BB - PD-1 - , CD3 + /CD8 + /PD-1 + , CD3 + /CD8 + /4-1BB + , CD3 + /CD8 + /PD-1 - or CD3 + /CD8 + /4-1BB - populations using FACS. The sorted cells were cocultured with autologous tumor cells and the upregulation of 4-1BB expression was measured by flow cytometry. For all three tumor samples, the results showed that T cells recognizing autologous tumor (as determined by increased expression of 4-1BB) were contained in single-positive cells expressing PD-1 + or 4-1BB + , but had the highest frequency of occurrence tumor-reactive cells (defined by increased expression of 4-1BB) was obtained from a population coexpressing 4-1BB and PD-1 in a fresh melanoma tumor digestate sample.
В отдельном опыте клетки изолировали из свежего образца опухоли меланомы (FrTu#1913), отсортировывали на предмет наличия в них CD3+/CD8+/4-1BB+/PD-1+ CD3+/CD8+/4-1BB-PD-1+ и CD3+/CD8+/4-1BB-/PD-1- популяций при помощи FACS и из отсортированных клеток формировали клоны. Клоны сокультивировали с аутологичными опухолевыми клеточными линиями, определяли усиление экспрессии 4-1BB при помощи проточной цитометрии и измеряли секрецию гамма-IFN. Результаты показали, что самая высокая частота встречаемости реактивных в отношении опухоли клонов (определяемая на основании усиления экспрессии 4-1BB и измерения секреции гамма-IFN) была получена в случае популяции, коэкспрессирующей PD-1 и 4-1BB.In a separate experiment, cells were isolated from a fresh melanoma tumor sample (FrTu#1913) and sorted for the presence of CD3 + /CD8 + /4-1BB + /
В другом опыте суспензию отдельных клеток меланомной опухоли FrTu#3713 выстаивали в течение ночи без цитокинов, после чего клетки отсортировывали на предмет наличия в них CD8+, CD8+/PD-1+, CD8+PD-1-, CD8+/4-1BB+, CD8+/4-1BB-, CD8+/4-1BB+/PD-1-, CD8+/4-1BB+/PD-1+, CD8+/4-1BB-/PD-1+ и CD8+/4-1BB-/PD-1- популяций при помощи FACS. Суспензию отдельных клеток меланомной опухоли FrTu#3612 выстаивали в течение ночи без цитокинов, после чего клетки отсортировывали на предмет наличия в них CD8+, CD8+/PD-1+, CD8+PD-1-, CD8+/4-1BB+/PD-1-, CD8+/4-1BB+/PD-1+, CD8+/4-1BB-/PD-1+ и CD8+/4-1BB-/PD-1- популяций при помощи FACS. Численность отсортированных клеток выращивали в течение 14 дней in vitro. На 14 день клетки промывали, совместно культивировали по отношению к аутологичной опухолевой клеточной линии (1×105 эффекторов: 1×105 клетки-мишени) и оценивали реактивность путем количественного определения процента CD8+ клеток, экспрессирующих 4-1BB (FrTu#3612 и FrTu#3713) и/или величины секреции гамма-IFN (FrTu#3612) через 24 часа после сокультивирования. Результаты представлены на Фиг. 4А и 4В. Как показано на Фиг. 4А, клетки, отсортированные на предмет наличия в них двойной позитивной коэкспресии PD-1 и 4-1BB, имеют такие же уровни усиления экспрессии 4-1BB, как были получены в случае клеток, отсортированных на основании однопозитивной экспрессии PD-1 или 4-1BB. Как показано на Фиг. 4В, клетки, отсортированные на предмет наличия в них двойной позитивной коэкспрессии PD-1 и 4-1BB, имели такие же уровни усиления экспрессии 4-1BB и уровни секреции гамма-IFN, как и клетки, отсортированные на основании однопозитивной экспрессии PD-1.In another experiment, a suspension of individual melanoma tumor
В отдельном опыте клетки, изолированные из меланомной опухоли FrTu#3713, сортировали на предмет наличия в них CD8+/4-1BB+/PD-1-, CD8+/4-1BB+/PD-1+, CD8+/4-1BB-/PD-1+ и CD8+/4-1BB-PD-1- популяций при помощи FACS. Численность отсортированных клеток выращивали в течение 14 дней in vitro. На 15 день клеточные линии-мишени (аутологичные и аллогенные) помечали изотопом 51 Cr и совместно культивировали в течение 4 часов с эффекторными клетками в соотношениях, указанных на Фиг. 5А-5С. Высвобождение 51Cr определяли в трех параллельных опытах при помощи гамма-метрии и вычисляли специфический лизис в процентах по следующей формуле: [(экспериментальное cpm - спонтанное cpm)/(максимальное cpm - спонтанное cpm)] × 100. Результаты представлены на Фиг. 5А-5С. Как показано на Фиг. 5А-5С, клетки, отсортированные на предмет наличия в них одинарной позитивной экспрессии 4-1BB+, одинарной позитивной экспрессии PD-1+ или двойной позитивной экспрессии 4-1BB+/PD-1+, способны лизировать аутологичные опухолевые клетки in vitro.In a separate experiment, cells isolated from the melanoma
Пример 5Example 5
Этот пример демонстрирует реактивность CD8+ клеток, изолированных из образца опухоли желудочно-кишечного тракта (англ. GI) и отсортированных на предмет наличия экспрессии PD-1, TIM-3 или 4-1BB.This example demonstrates the reactivity of CD8 + cells isolated from a gastrointestinal (GI) tumor sample and sorted for expression of PD-1, TIM-3, or 4-1BB.
Суспензию отдельных клеток из свежего образца опухоли желудочно-кишечного тракта (англ. GI) (FrTu#3446b) выстаивали в течение ночи без цитокинов и сортировали в соответствии с экспрессией PD-1, TIM-3 или 4-1BB при помощи FACS. Численность отсортированных клеток выращивали in vitro в течение 14 дней. На 14 день клетки промывали, сокультивировали по отношению к аутологичной опухолевой клеточной линии (1×105 эффекторы: 1×105 клетки-мишени) и количественно оценивали реактивность на основании высвобождения гамма-IFN и процентного содержания CD8+ клеток, экспрессирующих 4-1BB, через 24 часа после совместного культивирования. Результаты представлены на Фиг. 6. Как показано на Фиг. 6, клетки, отсортированные в соответствии с экспрессиией PD-1, TIM-3 или 4-1BB, продемонстрировали более высокую реактивность в отношении опухоли, определяемую на основании экспрессии 4-1BB, по сравнению с клеточными популяциями, не обладающими экспрессией PD-1, TIM-3 или 4-1BB, соответственно. Хотя секрецию гамма-IFN не регистрировали, специфическое усиление экспрессии 4-1BB показывает, что клетки были реактивными в отношении опухоли.A single cell suspension from a fresh gastrointestinal (GI) tumor sample (
Пример 6Example 6
Этот пример показывает, что отсортированные PD-1+ клетки являются более олигоклональными, чем PD-1- клетки после роста численности клеток in vitro. Этот пример также показывает, что отсортированные PD-1+ клетки содержат нацеленные на клоны мутированные эпитопы, экспрессированные аутологичной опухолью после роста численности клеток in vitro.This example shows that sorted PD-1 + cells are more oligoclonal than PD-1 − cells after cell expansion in vitro. This example also shows that sorted PD-1 + cells contain lineage-targeting mutated epitopes expressed by the autologous tumor following cell expansion in vitro.
Суспензию отдельных клеток из свежего образца гидролизата опухоли меланомы (FrTu#1913) выстаивали в течение ночи без цитокинов и сортировали в соответствии с экспрессией PD-1 при помощи FACS. Численность отсортированных клеток выращивали in vitro в течение 14 дней. Бета-цепь TCR (Т-клеточных рецепторов) РНК экстрагировали при помощи набора для выделения РНК μMACS RNA (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Осуществляли синтез кДНК и 5'RACE. Штрих-коды наносили на концы продукта PCR при помощи PCR для идентификации образцов. Продукт PCR промывали и подсчитывали размер библиотеки. Выполняли глубокое секвенирование (Illumina, Inc., San Diego, CA). Определяли частоту встречаемости каждой уникальной аминокислотной последовательности CDR3 области бета-цепи TCR в популяции. Результаты представлены на Фиг. 7А-7С. Как показано на Фиг. 7А-7С, отсортированные PD-1+ клетки являются более олигоклональными, чем PD-1- клетки после роста численности клеток in vitro.A single cell suspension from a fresh melanoma tumor digest sample (FrTu#1913) was incubated overnight without cytokines and sorted according to PD-1 expression by FACS. The numbers of sorted cells were grown in vitro for 14 days. TCR (T cell receptor) beta strand RNA was extracted using the μMACS RNA Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). cDNA synthesis and 5'RACE were performed. Barcodes were applied to the ends of the PCR product using PCR to identify samples. The PCR product was washed and the library size was calculated. Deep sequencing was performed (Illumina, Inc., San Diego, CA). The frequency of occurrence of each unique amino acid sequence of the CDR3 region of the TCR beta chain in the population was determined. The results are presented in Fig. 7A-7C. As shown in FIG. 7A-7C, sorted PD-1 + cells are more oligoclonal than PD-1 − cells after cell expansion in vitro.
20 наиболее часто встречающихся клонотипов в PD-1+ популяции представлены на Фиг. 8. Как показано на Фиг. 8, наиболее часто встречающиеся клонотипы бета-цепи TCR в отсортированных PD-1+ клетках после роста численности клеток редко встречались в PD-1- фракции. Как показано на Фиг. 8, клоны, распознающие мутированные эпитопы, экспрессируемые аутологичной опухолевой клеточной линией, были найдены в пределах 20 наиболее часто встречающихся клонов в PD-1+ популяции и очень редко встречались в PD-1- популяции. Эти результаты показывают, что реактивные в отношении опухоли нацеленные на клоны мутированные эпитопы изначально экспрессировали PD-1 в свежем образце опухоли.The 20 most common clonotypes in the PD-1 + population are presented in Fig. 8. As shown in FIG. 8, the most common TCR beta chain clonotypes in sorted PD-1 + cells after cell expansion were rarely found in the PD-1 − fraction. As shown in FIG. 8, clones recognizing mutated epitopes expressed by an autologous tumor cell line were found within the 20 most common clones in the PD-1 + population and were very rare in the PD-1 − population. These results indicate that tumor-reactive lineage-targeted mutated epitopes were initially expressed by PD-1 in the fresh tumor sample.
Все ссылки, включая публикации, заявки на патенты и патенты, процитированные в данном документе, тем самым включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая ссылка была перечислена по отдельности и конкретно для включения ее посредством ссылки и была представлена здесь во всей своей полноте.All references, including publications, patent applications and patents cited herein, are hereby incorporated herein by reference to the same extent as if each reference had been individually listed and specifically incorporated by reference and provided herein. in its entirety.
Использование артиклей "а" и "an" и "the", а также сочетаний "по меньшей мере один" и подобных обозначений в контексте описания изобретения (особенно в контексте последующей формулы изобретения) следует интерпретировать, как охватывающее единственное и множественное число, если в документе не указано иное или нет явного противоречия с контекстом. Использование термина "по меньшей мере один" с последующим перечислением одного или более компонентов (например, "по меньшей мере один из А и В") следует интерпретировать для обозначения одного компонента, выбранного из перечисленных компонентов (А или В) или любой комбинации двух или более из перечисленных компонентов (А и В), если в документе не указано иное или нет явного противоречия с контекстом. Термины "включающий в себя," "имеющий," "имеющий в своем составе" и "содержащий" следует рассматривать как неограничивающие термины (то есть означающие "включающий, не ограничиваясь перечнем"), если не указано иное. Перечисление диапазона значений в данном контексте служит исключительно в качестве сокращенного способа обращения к каждой отдельной величине, попадающей в указанный диапазон, если в документе не указано иное, при этом каждая отдельная величина включена в описание, как если бы она была отдельно упомянута в данном документе. Все способы, описанные в данном контексте, могут быть выполнены в любой подходящей последовательности, если в документе не указано иное или нет иного явного противоречия с контекстом. Использование всех без исключения примеров или приводимой в качестве примера формулировки (например, "такие как"), представленных в данном контексте, предназначено исключительно для лучшего освещения и не ориентировано на ограничение объема изобретения, если не заявляется иное. Никакие формулировки в описании не следует рассматривать, как указание на какой-либо незаявляемый элемент, как существенный для практического осуществления изобретения.The use of the articles "a" and "an" and "the", as well as combinations of "at least one" and similar designations in the context of the description of the invention (especially in the context of the following claims) should be interpreted as covering the singular and plural, if in document does not indicate otherwise or is clearly inconsistent with the context. Use of the term “at least one” followed by a listing of one or more components (for example, “at least one of A and B”) should be interpreted to mean one component selected from the listed components (A or B) or any combination of two or more of the listed components (A and B), unless the document indicates otherwise or there is a clear contradiction in the context. The terms “including,” “having,” “consisting of,” and “comprising” are to be considered non-limiting terms (i.e., meaning “including but not limited to”) unless otherwise noted. The listing of a range of values in this context serves solely as a shorthand way of referring to each individual value falling within the specified range, unless otherwise specified in the document, and each individual value is included in the description as if it were separately mentioned in this document. All methods described in this context may be performed in any suitable sequence unless otherwise indicated in the document or otherwise clearly inconsistent with the context. The use of any and all examples or exemplary language (eg, "such as") presented in this context is intended solely for better illumination and is not intended to limit the scope of the invention unless otherwise stated. Nothing in the specification should be construed as indicating any element not claimed as essential to the practice of the invention.
В данном контексте описаны предпочтительные варианты осуществления данного изобретения, включая наилучшее известное авторам техническое выполнение изобретения. Изменения таких предпочтительных вариантов осуществления изобретения будут очевидными для специалистов в данной области после прочтения предшествующего описания. Авторы изобретения ожидают, что специалисты смогут использовать такие изменения по мере необходимости, при этом авторы изобретения предполагают, что изобретение может применяться на практике и иначе, чем конкретно описано в данном контексте. Соответственно, авторы изобретения включают все модификации и эквиваленты предмета изобретения, содержащегося в формуле изобретения, прилагаемой к нему, как допустимые применяемыми правовыми нормами. Вследствие этого, любая комбинация описанных выше элементов во всех возможных вариантах включена в изобретение, если в документе не указано иное или нет явного противоречия с контекстом.In this context, preferred embodiments of the present invention are described, including the best technical embodiment of the invention known to the authors. Variations in such preferred embodiments of the invention will be apparent to those skilled in the art upon reading the foregoing description. The inventors expect that those skilled in the art will be able to make use of such modifications as needed, while the inventors anticipate that the invention may be practiced in ways other than those specifically described herein. Accordingly, the inventors include all modifications and equivalents of the subject matter contained in the claims appended thereto as permitted by the applicable law. Therefore, any combination of the elements described above in all possible embodiments is included in the invention, unless otherwise indicated in the document or there is a clear contradiction from the context.
Claims (12)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201361771247P | 2013-03-01 | 2013-03-01 | |
| US61/771,247 | 2013-03-01 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015138483A Division RU2671897C2 (en) | 2013-03-01 | 2013-04-30 | Methods of producing enriched populations of tumour-reactive t cells from tumour |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2018136226A RU2018136226A (en) | 2019-03-21 |
| RU2808817C2 true RU2808817C2 (en) | 2023-12-05 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2277422C2 (en) * | 2004-07-06 | 2006-06-10 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН | Method for production of polyclonal t-cell vaccine useful in treatment of immunological disorders |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2277422C2 (en) * | 2004-07-06 | 2006-06-10 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН | Method for production of polyclonal t-cell vaccine useful in treatment of immunological disorders |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PRIETO P. et al., Enrichment of CD8+ Cells from melanoma tumor-infiltrating lymphocyte cultures reveals tumor reactivity for use in adoptive cell therapy, Journal of Immunotherapy, Vol. 33, No. 5, 2010, pp. 547-556. TAKASHI I. et al., Selection of CD8+PD-1+ Lymphocytes in Fresh Human Melanomas Enriches for Tumor-reactive T Cells, Journal of Immunotherapy, Vol. 33, No. 9, 2010, pp. 956-964. WOO S-R. et al., Immune inhibitory molecules LAG-3 and PD-1 synergistically regulate T cell function to promote tumoral immune escape, Cancer Research, 2012, 15, 72 (4), pp. 917-927. RICHTER K. et al., On the role of the inhibitory receptor LAG-3 in acute and chronic LCMV infection, Int Immunol, 2010, vol. 22, N. 1, pp. 13-23. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7181917B2 (en) | Methods for generating enriched tumor-reactive T-cell populations from tumors | |
| US11679128B2 (en) | Methods of producing enriched populations of tumor reactive T cells from peripheral blood | |
| AU2018342245B2 (en) | Methods of isolating T cells having antigenic specificity for a p53 cancer-specific mutation | |
| EP2893003A1 (en) | Selective and controlled expansion of educated nk cells | |
| RU2808817C2 (en) | Methods for producing enriched populations of tumor-reactive t-cells from a tumor |