RU2807575C1 - Method for determination of cattle genetic resistance to leukemia virus - Google Patents
Method for determination of cattle genetic resistance to leukemia virus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2807575C1 RU2807575C1 RU2022128287A RU2022128287A RU2807575C1 RU 2807575 C1 RU2807575 C1 RU 2807575C1 RU 2022128287 A RU2022128287 A RU 2022128287A RU 2022128287 A RU2022128287 A RU 2022128287A RU 2807575 C1 RU2807575 C1 RU 2807575C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- resistance
- leukemia
- cattle
- bola
- alleles
- Prior art date
Links
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108010063590 BoLA-DRB3 antigen Proteins 0.000 claims description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims 1
- 101150034979 DRB3 gene Proteins 0.000 claims 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 1
- 101100278514 Oryza sativa subsp. japonica DRB2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 abstract description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 5
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 description 4
- 206010025280 Lymphocytosis Diseases 0.000 description 4
- 244000144980 herd Species 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 2-bromophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Br VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 101001100327 Homo sapiens RNA-binding protein 45 Proteins 0.000 description 1
- 201000009794 Idiopathic Pulmonary Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100038823 RNA-binding protein 45 Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000036971 interstitial lung disease 2 Diseases 0.000 description 1
- 206010024378 leukocytosis Diseases 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной генетики в сельском хозяйстве, в частности к способам диагностики генетической устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу. The invention relates to the field of biotechnology and molecular genetics in agriculture, in particular to methods for diagnosing the genetic resistance of cattle to leukemia.
Лейкоз крупного рогатого скота - одна из главных проблем скотоводства, так как очень легко передается от одного животного другому. Оздоровление стада после обнаружения больных животных - сложный процесс, который несет за собой большие материальные затраты. Необходимо регулярно проверять поголовье на наличие вируса лейкоза КРС, на протяжении многих лет выбраковывать коров с подтвержденным диагнозом, производить ремонт стада, заменяя выявленных больных животных здоровыми.Bovine leukosis is one of the main problems of cattle breeding, as it is very easily transmitted from one animal to another. Improving the health of the herd after the discovery of sick animals is a complex process that entails large material costs. It is necessary to regularly check the livestock for the presence of the bovine leukemia virus, cull cows with a confirmed diagnosis for many years, and repair the herd, replacing identified sick animals with healthy ones.
Данное заболевание характеризуется поражением кроветворной системы, лимфоцитозом, возникновением новообразований. Лейкоз КРС характеризуется продолжительным инкубационным периодом, чаще всего проявляется у коров старше четырех лет. Заболевание протекает двухстадийно. На гематологическом этапе лейкоз диагностируют по результатам анализа крови. Наблюдают лейкоцитоз, главным образом за счет лимфоцитов, появление в периферической крови функционально незрелых клеток. На онкологической стадии становятся заметными характерные клинические признаки. Чаще скотоводы имеют дело с энзоотической формой лейкоза коров, диагностируемого по результатам серологических и гематологических исследований крови, которые проводят весной и осенью у животных, достигших полугода.This disease is characterized by damage to the hematopoietic system, lymphocytosis, and the occurrence of neoplasms. Bovine leukemia is characterized by a long incubation period and most often occurs in cows over four years of age. The disease occurs in two stages. At the hematological stage, leukemia is diagnosed based on the results of a blood test. Leukocytosis is observed, mainly due to lymphocytes, and the appearance of functionally immature cells in the peripheral blood. At the oncological stage, characteristic clinical signs become noticeable. More often, cattle breeders deal with an enzootic form of bovine leukemia, diagnosed based on the results of serological and hematological blood tests, which are carried out in spring and autumn in animals that have reached six months.
Чтобы предотвратить экономический ущерб, существует множество методов определения генетической устойчивости животных к лейкозу путем их генотипирования в раннем возрасте. Таким образом, появляется возможность заранее комплектовать стадо из животных с повышенной резистентностью к данному заболеванию.To prevent economic damage, there are many methods to determine the genetic resistance of animals to leukemia by genotyping them at an early age. Thus, it becomes possible to pre-assemble a herd of animals with increased resistance to this disease.
Впервые селекционно-генетический способ определения устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу в системе регистрации результатов исследовательской деятельности Российской Федерации упоминается в патенте RU 2032337 С1 (опубл. 10.04.1995). Его суть состоит в определении наследственно обусловленной устойчивости животных к заболеванию лейкозом путем выявления специфических маркеров, представленных определенными эритроцитарными антигенами Несмотря на свою прогрессивность относительно серологических методов, данное изобретение обладает существенными недостатками ввиду выбора в качестве генетических маркеров эритроцитарных антигенов, имеющих весьма опосредованную связь с устойчивостью к лейкозу.For the first time, a selection and genetic method for determining the resistance of cattle to leukemia in the system for registering the results of research activities of the Russian Federation is mentioned in patent RU 2032337 C1 (published on April 10, 1995). Its essence is to determine the hereditarily determined resistance of animals to leukemia by identifying specific markers represented by certain erythrocyte antigens Despite its progressiveness relative to serological methods, this invention has significant drawbacks due to the choice of erythrocyte antigens, which have a very indirect connection with resistance to leukemia, as genetic markers.
Более точный способ определения генетической устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу был предложен в патенте RU2287587 С2 (опубл. 20.11.2006), где в качестве генетического маркера устойчивости к заболеванию указываются аллельные варианты гена BoLA-DRB3 главного комплекса гистосовместимости класса II (МНС class II), ассоциированного с иммунным ответом. Указанным способом возможно определение 30 аллелей гена BoLA-DRB3, в том числе, аллелей *11, *23 и *28, ассоциированных с устойчивостью к персистентному лимфоцитозу крупного рогатого скота, однако данный метод предполагает проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) с определением полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), в которой участвует комбинация из 4 эндонуклеаз (RsaI, HaeIII, BstYI и Bst2UI), что сильно усложняет проведение анализа.A more accurate method for determining the genetic resistance of cattle to leukemia was proposed in patent RU2287587 C2 (published on November 20, 2006), where allelic variants of the BoLA-DRB3 gene of the major histocompatibility complex class II (MHC class II) are indicated as a genetic marker of resistance to the disease. associated with the immune response. Using this method, it is possible to determine 30 alleles of the BoLA-DRB3 gene, including alleles *11, *23 and *28, associated with resistance to persistent lymphocytosis in cattle, but this method requires a polymerase chain reaction (PCR) to determine length polymorphism restriction fragment analysis (RFLP), which involves a combination of 4 endonucleases (RsaI, HaeIII, BstYI and Bst2UI), which greatly complicates the analysis.
Развитием идеи использования гена BoLA-DRB3 в качестве генетического маркера, ассоциированного с устойчивостью крупного рогатого скота к заболеванию лейкозом, является патент RU2316207 (опубл. 10.02.2008). Его суть заключается в создании высокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу стада крупного рогатого скота путем определения генотипов коров маточного поголовья и племенных быков по гену BoLA-DRB3 и дальнейшего распределения животных по группам с различной чувствительностью к лимфоцитозу с осуществлением специального подбора пар. Недостатком метода является то, что распределение крупного рогатого скота на группы осуществляется на основе определения восьми аллелей, признанных отвечающими за устойчивость или чувствительность к лейкозу без учета специфических аллелей устойчивости, а также анализ осуществляется методом ПЦР ПДРФ с использованием эндонуклеаз Rsa I, Нае III, Bst YI, что удлиняет и усложняет процесс анализа.The development of the idea of using the BoLA-DRB3 gene as a genetic marker associated with the resistance of cattle to leukemia is patent RU2316207 (published on February 10, 2008). Its essence is to create a highly productive herd of cattle that is resistant to persistent lymphocytosis by determining the genotypes of breeding cows and breeding bulls using the BoLA-DRB3 gene and further distributing animals into groups with different sensitivity to lymphocytosis with special selection of pairs. The disadvantage of the method is that the distribution of cattle into groups is carried out on the basis of identifying eight alleles recognized as responsible for resistance or sensitivity to leukemia without taking into account specific resistance alleles, and the analysis is carried out by PCR RFLP using endonucleases Rsa I, Hae III, Bst YI, which lengthens and complicates the analysis process.
В настоящий момент наиболее совершенный метод определения устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу методом ПЦР ПДРФ, зарегистрированный в патентной системе Российской Федерации, изложен в патенте RU2737552 С1 (опубл. 12.01.2020). Тестирование с помощью данного метода позволяет выявить животных-носителей не только общепризнанных аллелей устойчивости к лейкозу (0902, 2701, 2702, 2703, 2704, 2705, 2706, 0701), но и аллелей 1801 и 0601, являющихся специфическими генетическим маркерами резистентности к вирусу лейкоза. Недостатком данного способа является специфика проведения полимеразных цепных реакций типа ПДРФ - необходимость выполнения дополнительных процедур после процесса амплификации ДНК (рестрикция и электрофорез), что увеличивает возможность ошибок при проведении лабораторных процедур. При этом сам анализ и интерпретация его результатов требует определенной квалификации от сотрудников, занимает значительное количество времени и плохо поддается переводу в цифровой формат.Currently, the most advanced method for determining the resistance of cattle to leukemia using the PCR RFLP method, registered in the patent system of the Russian Federation, is set out in patent RU2737552 C1 (published on January 12, 2020). Testing using this method allows us to identify animal carriers of not only the generally recognized alleles of resistance to leukemia (0902, 2701, 2702, 2703, 2704, 2705, 2706, 0701), but also alleles 1801 and 0601, which are specific genetic markers of resistance to the leukemia virus . The disadvantage of this method is the specificity of carrying out polymerase chain reactions of the RFLP type - the need to perform additional procedures after the DNA amplification process (restriction and electrophoresis), which increases the possibility of errors during laboratory procedures. At the same time, the analysis itself and the interpretation of its results require certain qualifications from employees, takes a significant amount of time and is difficult to transfer into digital format.
Наиболее близким по сущности аналогом к предлагаемому является способ диагностики устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу (патент России RU2428485 С1, опубл. 10.09.2011), который предполагает проведение аллель-специфичной Nested-ПЦР с праймерами, подобранными к позициям 70-71 в аминокислотной последовательности таким образом, что выявляют животных-носителей, только устойчивых к лейкозу, с последующим определением гомо- или гетерозиготности этих животных по данным аллелям путем пиросеквенирования. Несмотря на прогрессивность данного способа относительно методов ПЦР ПДРФ, он также обладает существенными недостатками: необходимость конструировать специфические праймеры для каждого диагностируемого аллеля гена BoLA-DRB3, большое количество дополнительных инструментальных операций в процессе анализа, требующих дополнительного оборудования, а также учет в анализе только аллелей, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу.The closest analogue to the proposed one is a method for diagnosing the resistance of cattle to leukemia (Russian patent RU2428485 C1, published on September 10, 2011), which involves carrying out allele-specific Nested PCR with primers selected to positions 70-71 in the amino acid sequence in such a way that carrier animals that are only resistant to leukemia are identified, with subsequent determination of the homo- or heterozygosity of these animals for these alleles by pyrosequencing. Despite the progressiveness of this method relative to PCR RFLP methods, it also has significant disadvantages: the need to design specific primers for each diagnosed allele of the BoLA-DRB3 gene, a large number of additional instrumental operations in the analysis process that require additional equipment, as well as taking into account only alleles in the analysis associated with resistance to leukemia.
Техническим результатом настоящего изобретения является создание способа выявления носителей аллеля *0902, ассоциированного с устойчивостью к лейкозу крупного рогатого скота, и аллеля *1501, ассоциированного с восприимчивостью к данному заболеванию, в любых популяциях, что позволяет отбирать животных, устойчивых к вирусу лейкоза крупного рогатого скота и отбраковывать носителей генетической предрасположенности к заболеванию. Путем воспроизводства особей с генетической устойчивостью можно обеспечить формирование популяций крупного рогатого скота, устойчивых к заболеванию лейкозом.The technical result of the present invention is the creation of a method for identifying carriers of the *0902 allele, associated with resistance to bovine leukemia virus, and the *1501 allele, associated with susceptibility to this disease, in any population, which allows the selection of animals resistant to bovine leukemia virus and reject carriers of a genetic predisposition to the disease. By reproducing individuals with genetic resistance, it is possible to ensure the formation of populations of cattle resistant to leukemia.
Технический результат изобретения достигается путем амплификации определенного участка второго экзона гена BoLA-DRB3 и последующего секвенирования полученной матрицы для определения первичной структуры исследуемого участка ДНК с автоматической расшифровкой хроматограммы и выравниванием ее относительно референс-последовательности. Далее вырожденные (варьирующие) нуклеотиды обозначаются вручную, после чего применяют сценарий BDRB32ex, сверяющий исследуемую последовательность с референсной базой данных последовательностей всех аллелей и распознающий отдельный аллель или группу аллелей гена BOLA-DRB3. ПЦР проводится с праймерами ex2_for - 5'-GTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3' и ex2_rev - 5'-CGACCCCGTAGTTGTGTCTG-3', ограничивающими фрагмент длиной 216 нуклеотидов в пределах второго экзона гена BOLA-DRB3 крупного рогатого скота. Последовательность нуклеотидов на указанном фрагменте генома включает аллель *0902, ассоциированный с устойчивостью к лейкозу КРС, и аллель и *1501, ассоциированный с восприимчивостью к данному заболеванию. Данным способом может быть определена групповая специфичность или иные аллели, определяемые в составе фрагмента гена. При этом использование данного метода не требует от оператора амплификатора никаких дополнительных манипуляций с пробирками или приборами, а интерпретация полученных данных автоматизирована и формализована.The technical result of the invention is achieved by amplification of a certain section of the second exon of the BoLA-DRB3 gene and subsequent sequencing of the resulting matrix to determine the primary structure of the DNA region under study with automatic decoding of the chromatogram and its alignment with respect to the reference sequence. Next, degenerate (variant) nucleotides are designated manually, after which the BDRB32ex script is used, which checks the sequence under study against a reference database of sequences of all alleles and recognizes an individual allele or group of alleles of the BOLA-DRB3 gene. PCR is carried out with primers ex2_for - 5'-GTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3' and ex2_rev - 5'-CGACCCCGTAGTTGTGTCTG-3', limiting a fragment of 216 nucleotides in length within the second exon of the bovine BOLA-DRB3 gene. The nucleotide sequence on the specified genome fragment includes the *0902 allele, associated with resistance to bovine leukemia, and the *1501 allele, associated with susceptibility to this disease. This method can be used to determine group specificity or other alleles determined within a gene fragment. Moreover, the use of this method does not require any additional manipulations with test tubes or instruments from the cycler operator, and the interpretation of the data obtained is automated and formalized.
Предлагаемый способ предназначен для проведения исследований по идентификации аллеля *0902, ассоциированного с устойчивостью к лейкозу КРС, и аллеля и *1501, ассоциированного с восприимчивостью к данному заболеванию.The proposed method is intended for conducting research to identify the *0902 allele associated with resistance to bovine leukemia, and the *1501 allele associated with susceptibility to this disease.
Принцип действия: определение аллелей основано на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, ограничивающими фрагмент длиной 216 нуклеотидов в пределах второго экзона гена BOLA-DRB3 крупного рогатого скота. Продукты ПЦР используются в качестве матрицы для определения первичной последовательности фрагмента гена BOLA-DRB3. В сиквенсной реакции используется комплементарный праймер ex2_for - 5'-GTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3' и набор меченых дидезоксирибонуклеотидтрифосфатов BigDye Terminator Kit (Applied Biosystems, США). Реакция проводится в соответствии с инструкцией к набору для секвенирования BigDye™ Terminator Kit (Thermofisher, США). Возможность определения первичной нуклеотидной последовательности обеспечивается добавлением в сиквенсную реакцию меченых нуклеотидов, терминирующих синтез. Формирующиеся фрагменты разной длины, несущие меченый концевой нуклеотид, разделяются по длине с фиксацией спектра излучения флуорофора. Продукт сиквенсной реакции используется для постановки на автоматическом секвенаторе ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) или аналогичном оборудовании последующих поколений в соответствии с инструкцией производителя. Визуализация хроматограм осуществляется с помощью он-лайн алгоритма Benchling (https://www.benchling.com/). Определение аллелей производится автоматически с помощью программного сценария BDRB32ex.Operating principle: determination of alleles is based on polymerase chain reaction (PCR) with primers that limit a fragment of 216 nucleotides in length within the second exon of the bovine BOLA-DRB3 gene. PCR products are used as a template to determine the primary sequence of the BOLA-DRB3 gene fragment. The sequence reaction uses the complementary primer ex2_for - 5'-GTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3' and a set of labeled dideoxyribonucleotide triphosphates BigDye Terminator Kit (Applied Biosystems, USA). The reaction is carried out in accordance with the instructions for the BigDye™ Terminator Kit sequencing kit (Thermofisher, USA). The ability to determine the primary nucleotide sequence is ensured by adding labeled nucleotides to the sequence reaction that terminate synthesis. The resulting fragments of different lengths, carrying a labeled terminal nucleotide, are separated by length and the emission spectrum of the fluorophore is recorded. The sequence reaction product is used for production on an automatic sequencer ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) or similar equipment of subsequent generations in accordance with the manufacturer’s instructions. Visualization of chromatograms is carried out using the Benchling online algorithm (https://www.benchling.com/). Alleles are determined automatically using the BDRB32ex software script.
После проведения секвенирования и первичной обработки хроматограм с помощью алгоритма Benchling выделяются вырожденные нуклеотиды в соответствии с международной номенклатурой и загружаются последовательности в программный сценарий BDRB32ex, написанный на языке программирования «Python». На начальном этапе обработки программный сценарий осуществляет выравнивание загружаемых последовательностей против конкретного референс-аллеля и посимвольно сравнивает с ним изучаемую последовательность. Если совпадения не обнаружено, сценарий выравнивает каждую из загружаемых последовательностей относительно базы данных, содержащей информацию о всех аллелях, детектируемых в пределах анализируемого фрагмента. На первом этапе алгоритм исключает наличие аллелей *0902 и *1501 в загруженных последовательностях. На втором этапе обработки программный сценарий определяет наличие иных аллелей, детектируемых в пределах анализируемого фрагмента гена BOLA-DRB3. В результате анализа можно определить аллель образца с точностью до группы аллелей или конкретного аллеля.After sequencing and primary processing of chromatograms using the Benchling algorithm, degenerate nucleotides are isolated in accordance with the international nomenclature and the sequences are loaded into the BDRB32ex software script written in the Python programming language. At the initial stage of processing, the software script aligns the loaded sequences against a specific reference allele and character-by-character compares the studied sequence with it. If no match is found, the script aligns each of the downloaded sequences against a database containing information about all alleles detected within the analyzed fragment. At the first stage, the algorithm excludes the presence of alleles *0902 and *1501 in the loaded sequences. At the second stage of processing, the software script determines the presence of other alleles detected within the analyzed fragment of the BOLA-DRB3 gene. As a result of the analysis, it is possible to determine the allele of a sample with an accuracy of a group of alleles or a specific allele.
В апробации разработанного метода использовался биоматериал (периферическая кровь), отобранный у крупного рогатого скота костромской породы (n=50) из хвостовой вены в промаркированные стерильные вакуумные пробирки «Vacumed» с антикоагулянтом ЭДТА K2 («Greiner Bio-One», Австрия). Очистку ДНК проводили при помощи набора «DNeasy Blood & Tissue Kit» для выделения ДНК из образцов крови и тканей животных, а также из клеток, дрожжей, бактерий и вирусов («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией производителя.To test the developed method, biomaterial (peripheral blood) was used, collected from Kostroma cattle (n=50) from the tail vein into labeled sterile vacuum tubes “Vacumed” with anticoagulant EDTA K2 (Greiner Bio-One, Austria). DNA purification was carried out using the DNeasy Blood & Tissue Kit for DNA extraction from animal blood and tissue samples, as well as from cells, yeast, bacteria and viruses (Qiagen, Germany) in accordance with the manufacturer’s instructions.
Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология») в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем, по следующей программе: 94°С - 10 с, 56°С - 20 с, 72°С - 20 с в течение 40 циклов. Для контроля качества ДНК и оценки эффективности работы праймеров продукты ПЦР анализировали методом агарозного гель-электрофореза. Для приготовления 1 л 10 кратного ТВЕ-буфера добавляли в мерную колбу 108 г TRIS (основного), 55 г. борной кислоты, 40 мл 0,5М ЭДТА (рН 8,0) и довести объем mQ до 1 л. Для приготовления геля для электрофореза в мерном стакане на 50 мл смешивали 25 мл 1% ТВЕ-буфера, 0,25 г агарозы и 1 мкл бромистого этидия. Разогревали смесь в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Заливали смесь в камеру для приготовления гелей. Образцы наносили в лунки в составе 5× загрузочного буфера (бромфенол/глицерин). Условия проведения электрофореза выставляли в соответствии с инструкцией производителя камеры Mupid-exU, Япония. Специфические ПЦР-продукты использовали в качестве ДНК-матрицы при проведении сиквенсной реакции. Затем применяли предлагаемый способ.The polymerase chain reaction was carried out in a Tertsik thermal cycler (JSC NPF DNA-Technology) in accordance with the protocol recommended by the manufacturer, according to the following program: 94°C - 10 s, 56°C - 20 s, 72°C - 20 s for 40 cycles. To control DNA quality and evaluate the efficiency of primers, PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis. To prepare 1 L of 10x TBE buffer, add 108 g of TRIS (basic), 55 g of boric acid, 40 ml of 0.5 M EDTA (pH 8.0) to a volumetric flask and adjust the volume mQ to 1 L. To prepare the electrophoresis gel, 25 ml of 1% TBE buffer, 0.25 g of agarose and 1 μl of ethidium bromide were mixed in a 50 ml beaker. The mixture was heated in a microwave oven until the agarose was completely dissolved. The mixture was poured into the chamber for preparing gels. Samples were loaded into wells in 5× loading buffer (bromophenol/glycerol). Electrophoresis conditions were set in accordance with the instructions of the manufacturer of the Mupid-exU camera, Japan. Specific PCR products were used as a DNA template when carrying out a sequence reaction. Then the proposed method was applied.
В результате исследований установлено, что в протестированной выборке животных костромской породы отсутствует аллель BoLA-DRB3 *1501, связанный с высокой вирусной нагрузкой (таблица 1).As a result of the research, it was established that in the tested sample of Kostroma breed animals there is no allele BoLA-DRB3 *1501, associated with a high viral load (Table 1).
В то же время, выявлено 6 носителей (12%) аллельного варианта BoLA-DRB3 *0902, ассоциированного с подавлением репликации вируса бычьего лейкоза. Таким образом, отсутствие в исследуемой группе животных с аллелем BoLA-DRB3 *1501 в сочетании с присутствием в выборке носителей аллеля BoLA-DRB3 *0902 позволяет судить о высокой устойчивости данных животных к лейкозу, что корреспондируется с данными о генетической устойчивости скота костромской породы к лейкозу.At the same time, 6 carriers (12%) of the BoLA-DRB3 *0902 allelic variant, associated with suppression of bovine leukemia virus replication, were identified. Thus, the absence in the study group of animals with the BoLA-DRB3 *1501 allele, combined with the presence in the sample of carriers of the BoLA-DRB3 *0902 allele, allows us to judge the high resistance of these animals to leukemia, which corresponds with data on the genetic resistance of Kostroma breed cattle to leukemia .
Источники информации:Information sources:
1. Шинкаренко А.С. Селекционно-генетический способ профилактики лейкозов у крупного рогатого скота [Текст] / Патент России RU2032337 С1 - 1995 г. - Журнал «Ветеринария», 1987, № 2, С. 28-29.1. Shinkarenko A.S. Selection and genetic method for the prevention of leukemia in cattle [Text] / Russian Patent RU2032337 C1 - 1995 - Journal "Veterinary Medicine", 1987, No. 2, pp. 28-29.
2. Ковалюк Н.В., Ковалюк А.Н., Сивогривое Д.Е. Способ определения генотипа крупного рогатого скота [Текст] / Патент России RU2287587 С2. - 2006 г. - Бюлл. №32.2. Kovalyuk N.V., Kovalyuk A.N., Sivogrivoe D.E. Method for determining the genotype of cattle [Text] / Russian Patent RU2287587 C2. - 2006 - Bulletin. No. 32.
3. Горковенко Л.Г., Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф. Селекционно-генетический способ создания высокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу стада крупного рогатого скота [Текст] // Патент России RU2316207 С2 - 2008 г. - Бюлл. №4.3. Gorkovenko L.G., Kovalyuk N.V., Satsuk V.F. Selection and genetic method for creating a highly productive and resistant to persistent lymphocytosis cattle herd [Text] // Russian Patent RU2316207 C2 - 2008 - Bull. No. 4.
4. Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Быкова А.С., Эрнст Л.К. Способ диагностики устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза [Текст] / Патент России RU2428485 С1 - 2011 г. - Бюлл. №25.4. Gladyr E.A., Zinovieva N.A., Bykova A.S., Ernst L.K. Method for diagnosing resistance of cattle to the leukemia virus [Text] / Russian Patent RU2428485 C1 - 2011 - Bulletin. No. 25.
5. Ласкавый В.Н., Малинин М.Л., Кузнецова А. Е., Караблин П.М., Шибаева М.А. Способ оценки устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу [Текст] // Патент России RU2452955 С1 - 2012 г. - Бюлл. №16.5. Laskavyi V.N., Malinin M.L., Kuznetsova A.E., Karablin P.M., Shibaeva M.A. Method for assessing the resistance of cattle to leukemia [Text] // Russian Patent RU2452955 C1 - 2012 - Bull. No. 16.
6. Чалова Н.А., Корякина К.С., Плешков В.А., Миронов А.Н. Способ оценки устойчивости к лейкозу крупного рогатого скота [Текст] // Патент России RU2737552 C1 - 2020 г. - Бюлл. №34.6. Chalova N.A., Koryakina K.S., Pleshkov V.A., Mironov A.N. Method for assessing resistance to leukemia in cattle [Text] // Russian Patent RU2737552 C1 - 2020 - Bull. No. 34.
7. Xue J, Gochuico BR, Alawad AS, Feghali-Bostwick CA, Noth I, Nathan SD, Rosen GD, Rosas IO, Dacic S, Ocak I, Fuhrman CR, Cuenco KT, Smith MA, Jacobs SS, Zeevi A, Morel PA, Pilewski JM, Valentine VG, Gibson KF, Kaminski N, Sciurba FC, Zhang Y, Duncan SR. The HLA class II Allele DRB1* 1501 is over-represented in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. PLoS One. 2011 Feb 23;6(2):e14715. doi: 10.1371/journal.pone.0014715. PMID: 21373184; PMCID: PMC3044131.7. Xue J, Gochuico BR, Alawad AS, Feghali-Bostwick CA, Noth I, Nathan SD, Rosen GD, Rosas IO, Dacic S, Ocak I, Fuhrman CR, Cuenco KT, Smith MA, Jacobs SS, Zeevi A, Morel PA, Pilewski JM, Valentine VG, Gibson KF, Kaminski N, Sciurba FC, Zhang Y, Duncan SR. The HLA class II Allele DRB1* 1501 is over-represented in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. PLoS One. 2011 Feb 23;6(2):e14715. doi: 10.1371/journal.pone.0014715. PMID: 21373184; PMCID: PMC3044131.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2807575C1 true RU2807575C1 (en) | 2023-11-16 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2824666C1 (en) * | 2024-03-06 | 2024-08-12 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии имени Н.И. Вавилова" | Oligonucleotide primers for detecting bovine enzootic leukaemia virus by polymerase chain reaction |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2428485C1 (en) * | 2010-03-09 | 2011-09-10 | Государственное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук" ГНУ ВНИИЖ Россельхозакадемии | Diagnostic technique for cattle leukemia virus tolerance |
| RU2737552C1 (en) * | 2020-06-02 | 2020-12-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия" | Method for assessment of cattle leukemia resistance |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2428485C1 (en) * | 2010-03-09 | 2011-09-10 | Государственное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук" ГНУ ВНИИЖ Россельхозакадемии | Diagnostic technique for cattle leukemia virus tolerance |
| RU2737552C1 (en) * | 2020-06-02 | 2020-12-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия" | Method for assessment of cattle leukemia resistance |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| IMTIAZ A.S., et al., DNA Testing and Genetic Evaluation for Poll Breeding in Tropically Adapted Beef Cattle, Proceedings2019, 36, 98; doi:10.3390/proceedings2019036098. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2824666C1 (en) * | 2024-03-06 | 2024-08-12 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский государственный университет генетики, биотехнологии и инженерии имени Н.И. Вавилова" | Oligonucleotide primers for detecting bovine enzootic leukaemia virus by polymerase chain reaction |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105339508B (en) | Multiple DNA typing method and kit for HLA gene | |
| US20060147925A1 (en) | Method of detection | |
| EP3075863B1 (en) | Simple method and kit for dna profiling of hla genes by high-throughput massively parallel sequencer | |
| KR20060015604A (en) | Identification of clonal cells by repeats in (eg.) t-cell receptor v/d/j genes | |
| JPH06511380A (en) | Methods and kits for determining genotypes by comparing nucleotide sequences of gene family members | |
| CN107794304B (en) | Genotyping detection kit for yak individual identification and paternity test | |
| CN107760789B (en) | Genotyping detection kit for parent-child identification and individual identification of yaks | |
| WO2023001209A1 (en) | Gene chip, molecular probe combination, test kit and application for analyzing sheep fat tails | |
| CN113481311B (en) | SNP molecular marker for identifying Brucella vaccine strain M5 and application thereof | |
| WO2023001212A1 (en) | Gene chip, molecular probe combination and kit for analyzing sheep milk production performance, and use | |
| CN111793704B (en) | SNP molecular marker for identifying Brucella vaccine strain S2 and wild strain and application thereof | |
| CN101671736B (en) | Gene detection kit used for detecting cell chimerism or individual recognition | |
| RU2807575C1 (en) | Method for determination of cattle genetic resistance to leukemia virus | |
| JP2020043859A (en) | Major histocompatibility complex single nucleotide polymorphisms | |
| CN116121383A (en) | Composition for clinical diagnosis and treatment of hematological malignant tumor and application thereof | |
| CN112501320B (en) | Snake origin component rapid detection kit and application thereof | |
| CN109371119A (en) | Primer pair, kit and its method deleting mutation for detecting human mtdna and exhausting | |
| WO2023021978A1 (en) | Method for examining autoimmune disease | |
| CN110863044A (en) | Primer combination for detecting VCL gene mutation and application thereof | |
| CN117265091B (en) | Primer group, kit and application for HLA-DRB3/4/5 genotyping | |
| CN115873962B (en) | Method for identifying Tiger macula cloud Ling cattle variety by utilizing SETX gene mononucleotide genetic marker | |
| CN114480615B (en) | Primer group and kit for detecting HLA-B5101 alleles | |
| JP2001137000A (en) | Distinction of gene mutation | |
| JPH11216000A (en) | Discrimination of hla-a allele type | |
| Kouniaki et al. | Short Tandem Repeats Loci in Parentage Testing |