RU2807480C1 - Method for predicting breast cancer metastasis based on set of long non-coding rna genes - Google Patents
Method for predicting breast cancer metastasis based on set of long non-coding rna genes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2807480C1 RU2807480C1 RU2022135085A RU2022135085A RU2807480C1 RU 2807480 C1 RU2807480 C1 RU 2807480C1 RU 2022135085 A RU2022135085 A RU 2022135085A RU 2022135085 A RU2022135085 A RU 2022135085A RU 2807480 C1 RU2807480 C1 RU 2807480C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- breast cancer
- metastases
- markers
- methylation
- genes
- Prior art date
Links
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 52
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 52
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 29
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 108020005198 Long Noncoding RNA Proteins 0.000 description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000578932 Homo sapiens Membrane-associated guanylate kinase, WW and PDZ domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 102100028328 Membrane-associated guanylate kinase, WW and PDZ domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 102100039189 Transcription factor Maf Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000006718 epigenetic regulation Effects 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000003990 molecular pathway Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к области фундаментальной медицины, и касается способа прогноза метастазирования рака молочной железы (РМЖ) с помощью оценки статуса метилирования набора генов длинных некодирующих РНК (днРНК), а именно: HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6. Заявленный способ основан на анализе метилирования набора из пяти генов днРНК и позволяет прогнозировать развитие метастазов РМЖ с 82%-ой специфичностью, 81%-ой чувствительностью и высокой достоверностью (AUC=0.9). Для оценки прогноза метастазирования у пациенток с РМЖ с указанной точностью необходимо выявление метилирования не менее двух любых генов данного набора в ДНК, выделенной из ткани молочной железы.The present invention relates to the field of fundamental medicine, and concerns a method for predicting metastasis of breast cancer (BC) by assessing the methylation status of a set of long non-coding RNA (lncRNA) genes, namely: HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5- AS1 and SNHG6. The claimed method is based on the analysis of methylation of a set of five lncRNA genes and allows predicting the development of breast cancer metastases with 82% specificity, 81% sensitivity and high reliability (AUC=0.9). To assess the prognosis of metastasis in patients with breast cancer with the specified accuracy, it is necessary to detect methylation of at least two genes of a given set in DNA isolated from breast tissue.
Несмотря на многочисленные успехи в диагностике и лечении РМЖ, данный вид опухоли по данным статистики остается наиболее распространенным в онкологии заболеванием среди женщин. Так, по последним оценкам экспертов в 2021 году в России зарегистрировано около 2,6 миллиона новых случаев РМЖ, что составляет 18,3% от общего числа случаев рака. Также, по данным статистики GLOBOCAN, РМЖ занимает лидирующие позиции по заболеваемости и смертности в большинстве других стран мира. Основная сложность терапии данного вида онкологии заключается в его гетерогенности, в том числе и на молекулярном уровне. Тем не менее, оценка процессов эпигенетической регуляции множества задействованных молекулярных путей может дать подход к открытию новых маркеров и терапевтических мишеней. Развитие методов и технологий геномного анализа позволило в значительной мере оценить перспективы некодирующих РНК, включая микроРНК и днРНК, в регуляции опухоль ассоциированных белок-кодирующих генов, включая роль метилирования данных генов в злокачественной трансформации, что определяет их клинический потенциал.Despite numerous advances in the diagnosis and treatment of breast cancer, this type of tumor, according to statistics, remains the most common oncological disease among women. Thus, according to the latest expert estimates, about 2.6 million new cases of breast cancer were registered in Russia in 2021, which is 18.3% of the total number of cancer cases. Also, according to GLOBOCAN statistics, breast cancer occupies a leading position in morbidity and mortality in most other countries of the world. The main difficulty in the treatment of this type of oncology lies in its heterogeneity, including at the molecular level. However, assessing the processes of epigenetic regulation of the multiple molecular pathways involved may provide an approach to the discovery of new markers and therapeutic targets. The development of methods and technologies for genomic analysis has made it possible to significantly evaluate the prospects of non-coding RNAs, including microRNAs and lncRNAs, in the regulation of tumor-associated protein-coding genes, including the role of methylation of these genes in malignant transformation, which determines their clinical potential.
Нами ВПЕРВЫЕ в образцах ДНК опухолей больных РМЖ с метастазами обнаружен статистически значимо (р<0.001) повышенный уровень метилирования 5 генов днРНК (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SEMA3B-AS1, SSTR5-AS1) относительно ДНК опухолей больных РМЖ без метастазов. На основе этих 5 генов (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SEMA3B-AS1, SSTR5-AS1) составлен НОВЫЙ набор маркеров и разработан способ для прогноза метастазирования РМЖ с высокой специфичностью и чувствительностью на основе биопсии или резекционного материала пациенток.For the FIRST time, in DNA samples of tumors from patients with breast cancer with metastases, we found a statistically significant (p < 0.001) increased level of methylation of 5 lncRNA genes (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SEMA3B-AS1, SSTR5-AS1) relative to the DNA of tumors from patients with breast cancer without metastases. Based on these 5 genes (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SEMA3B-AS1, SSTR5-AS1), a NEW set of markers was compiled and a method was developed to predict breast cancer metastasis with high specificity and sensitivity based on biopsy or resection material from patients.
По состоянию на данный момент имеется сообщение, касающееся метилирования в опухолях больных РМЖ хозяйского гена днРНК MAGI2-AS3 - MAGI2 среди этих 5 генов [1]. Имеется также Заявка на изобретение [Рег. №2022121163], в которой сообщено о повышенном статусе метилирования генов (HAND2-AS1, KCNK15-AS1 и PLUT) в опухолях больных РМЖ относительно тканей молочной железы от пост-мортальных лиц, умерших без онкопатологии, и возможности применения этих данных для диагностики РМЖ [2]. Данные о различии уровней метилирования 5 отобранных генов (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SEMA3B-AS1, SSTR5-AS1) в опухолях больных РМЖ с метастазами и без метастазов отсутствуют в каких-либо источниках информации.As of now, there is a report regarding the methylation of the host lncRNA gene MAGI2-AS3 - MAGI2 among these 5 genes in tumors of breast cancer patients [1]. There is also an Application for an invention [Reg. No. 2022121163], which reported an increased methylation status of genes (HAND2-AS1, KCNK15-AS1 and PLUT) in tumors of patients with breast cancer relative to breast tissue from post-mortem individuals who died without oncopathology, and the possibility of using these data for the diagnosis of breast cancer [ 2]. Data on differences in methylation levels of 5 selected genes (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SEMA3B-AS1, SSTR5-AS1) in tumors of breast cancer patients with and without metastases are not available in any sources of information.
Согласно данным мировых исследований ранее имелись публикации по разработке способов прогнозирования развития метастазов РМЖ. Так, в исследовании [3] проведен отбор ряда дифференциально экспрессируемых днРНК и отмечена их потенциальная возможность как маркеров метастазирования.According to world research data, there were previously publications on the development of methods for predicting the development of breast cancer metastases. Thus, in a study [3], a number of differentially expressed lncRNAs were selected and their potential as metastasis markers was noted.
Есть работа, в которой описан потенциал эпигенетических маркеров на примере ряда микроРНК и днРНК для прогнозирования неблагоприятного развития и дальнейшей прогрессии РМЖ [4]. В работе приводится ряд маркеров, который, по мнению авторов потенциально может быть использован в составлении прогноза прогрессии РМЖ. В целом работа представляет собой результат биоинформатической оценки эпигенетических маркеров с неизвестным уровнем чувствительности и специфичности. В итоговую таблицу вошло более 30 различных маркеров, полученных в результате эпигеномного анализа.There is work that describes the potential of epigenetic markers using the example of a number of microRNAs and lncRNAs for predicting unfavorable development and further progression of breast cancer [4]. The work presents a number of markers, which, according to the authors, can potentially be used in predicting the progression of breast cancer. Overall, the work represents the result of a bioinformatics assessment of epigenetic markers with unknown levels of sensitivity and specificity. The final table included more than 30 different markers obtained as a result of epigenomic analysis.
Согласно более ранней патентной заявке европейских ученых WO 2016/135168 2016.09.01 (2016), исследователям удалось выделить две панели маркеров, основанных на определении статуса метилирования и/или уровня экспрессии ряда генов, кодирующих белки и определении группы маркеров микроРНК в РМЖ и других видах рака. Данные панели, согласно авторам, должны работать вместе, что потенциально снижает эффективность выявления точной комбинации маркеров, необходимой для оценки качественной тактики лечения. Кроме того, методология патента не позволяет оценить метастатический потенциал опухоли у пациента. Тем не менее, одна из панелей имеет высокие (0,89) показатели специфичности и чувствительности диагностики и/или возможной прогрессии любого рака, в частности РМЖ [5].According to an earlier patent application by European scientists WO 2016/135168 2016.09.01 (2016), the researchers were able to identify two panels of markers based on determining the methylation status and/or expression level of a number of protein-coding genes and identifying a group of microRNA markers in breast cancer and other types cancer. These panels, according to the authors, must work together, potentially reducing the power to identify the precise combination of markers needed to evaluate quality treatment strategies. In addition, the patent's methodology does not allow assessing the metastatic potential of a patient's tumor. However, one of the panels has high (0.89) specificity and sensitivity for diagnosis and/or possible progression of any cancer, in particular breast cancer [5].
В более раннем патенте WO 2012/045905 A3 (2012) представлен способ комплексной оценки прогрессии опухоли молочной железы с образованием метастазов по уровню изменения экспрессии одного гена c-MAF. Согласно заключению авторов патента, данная модель наиболее применима для определения изменений в рецептор - зависимых типах РМЖ. Кроме того, система не содержит данных по чувствительности и специфичности, что не позволяет в полной мере оценить рабочий потенциал модели [6].An earlier patent WO 2012/045905 A3 (2012) presents a method for comprehensively assessing the progression of a breast tumor with the formation of metastases based on the level of changes in the expression of one c-MAF gene. According to the conclusion of the patent authors, this model is most applicable for determining changes in receptor-dependent types of breast cancer. In addition, the system does not contain data on sensitivity and specificity, which does not allow us to fully assess the working potential of the model [6].
В патенте WO 2021/170777 А1 (2021) авторы изучили возможности применения межгенной днРНК LINC01087 не только для диагностики, но и для прогноза и лечения РМЖ. По мнению авторов работы, существенное снижение уровня экспрессии LINC01087 при трижды негативном подтипе РМЖ может рассматриваться как фактор неблагоприятного прогноза течения заболевания, позволяющий выявить более агрессивный фенотип на более ранних этапах. К сожалению, данный маркер не позволяет оценить потенциал метастазирования для любого типа РМЖ и не может дать точной картины прогноза течения заболевания для люминального фенотипа опухоли [7].In patent WO 2021/170777 A1 (2021), the authors studied the possibilities of using intergenic lncRNA LINC01087 not only for diagnosis, but also for the prognosis and treatment of breast cancer. According to the authors of the work, a significant decrease in the expression level of LINC01087 in the triple-negative subtype of breast cancer can be considered as a factor in the unfavorable prognosis of the disease, making it possible to identify a more aggressive phenotype at earlier stages. Unfortunately, this marker does not allow assessing the metastasis potential for any type of breast cancer and cannot provide an accurate picture of the prognosis of the disease for the luminal phenotype of the tumor [7].
Наиболее похожими по специфике аналогами могут считаться два патента. Один из них [6] рассмотрен нами выше. Другой патент WO 2017/ 095213 А1 рассматривает в качестве метода оценки прогрессии опухоли профиль изменения экспрессии ряда микроРНК. Однако проект ограничивает прогноз течения РМЖ показателем выживаемости и не может использоваться в широком спектре случаев [8].Two patents can be considered the most similar in specificity. One of them [6] was considered above. Another patent WO 2017/095213 A1 considers a profile of changes in the expression of a number of microRNAs as a method for assessing tumor progression. However, the project limits the prognosis of breast cancer to survival and cannot be used in a wide range of cases [8].
Задача заявляемого изобретения - расширить возможности методов прогноза метастазирования РМЖ с помощью применения новых маркеров на основе группы генов днРНК.The objective of the claimed invention is to expand the capabilities of methods for predicting breast cancer metastasis through the use of new markers based on a group of lncRNA genes.
Задача решена путем:The problem was solved by:
- разработки заявляемого способа для прогноза метастазирования РМЖ на основе анализа уровня метилирования набора из пяти генов днРНК (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6) в биопсийных или резекционных образцах опухолей больных РМЖ и позволяющего оценить прогноз развития метастазов с высокой точностью, с помощью выявления метилирования у двух или более генов из этого набора- development of the proposed method for predicting metastasis of breast cancer based on analysis of the methylation level of a set of five lncRNA genes (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 and SNHG6) in biopsy or resection samples of tumors from patients with breast cancer and allowing to assess the prognosis of development metastases with high accuracy, by identifying methylation in two or more genes from this set
Прогноз метастазирования РМЖ осуществляют по методу:Prediction of breast cancer metastasis is carried out using the following method:
Собирают образцы ткани опухоли молочной железы и прилежащей, гистологически неизмененной ткани у лиц, с выявленным онкологическим заболеванием. Выделение и очистку ДНК из образцов ткани молочной железы проводят методом фенол-хлороформенной экстракции. Качество и точную концентрацию ДНК определяют спектрофотометрически по соотношению оптической плотности при длинах волн 260 и 280 нм. Анализ уровня метилирования генов днРНК проводят с применением бисульфитной конверсии ДНК и количественной метил-специфичной ПЦР (qMSP) с детекцией в реальном времени, как описано в работе [9].Samples of breast tumor tissue and adjacent, histologically unchanged tissue are collected from individuals with diagnosed cancer. Isolation and purification of DNA from breast tissue samples is carried out using phenol-chloroform extraction. The quality and exact concentration of DNA is determined spectrophotometrically by the ratio of optical density at wavelengths of 260 and 280 nm. Analysis of the methylation level of lncRNA genes is carried out using bisulfite conversion of DNA and quantitative methyl-specific PCR (qMSP) with real-time detection, as described in [9].
Для оценки значимости различий применяют непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия считают значимыми при р<0.05. Расчеты проводят в системе для статистического анализа данных IBM SPSS Statistics 22. При оценке значимости различий в уровне метилирования учитывают пороговый уровень, рассчитанный на основании данных по уровню метилирования каждого гена в образцах РМЖ без метастазов [10]. Затем по этим значениям отбирают образцы опухоли РМЖ с уровнем метилирования выше порога, рассчитанного для каждого гена. Далее сравнивают образцы опухолей от больных с метастазами и без метастазов. И методом ROC-анализа определяют набор маркеров, позволяющих наиболее значимо различить пациентов с метастазами и без метастазов. С помощью ROC-анализа рассчитывают также специфичность, чувствительность и значение AUC (Area Under Curve) для набора маркеров и для характеристики ЗАЯВЛЯЕМОГО способа прогноза метастазирования больных РМЖ.To assess the significance of differences, the nonparametric Mann-Whitney test is used. Differences are considered significant at p<0.05. Calculations are carried out in the system for statistical data analysis IBM SPSS Statistics 22. When assessing the significance of differences in the methylation level, a threshold level is taken into account, calculated on the basis of data on the methylation level of each gene in breast cancer samples without metastases [10]. Then, based on these values, breast cancer tumor samples with a methylation level above the threshold calculated for each gene are selected. Next, tumor samples from patients with and without metastases are compared. And using ROC analysis, a set of markers is determined that can most significantly distinguish between patients with metastases and those without metastases. Using ROC analysis, the specificity, sensitivity and AUC (Area Under Curve) value are also calculated for a set of markers and to characterize the APPLIED method for predicting metastasis in patients with breast cancer.
На Фиг. 1 изображена система из пяти маркеров (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1, SNHG6) для прогноза образования метастазов у больных РМЖ с чувствительностью 80,5% и специфичностью 81,6% (AUC=0,896), составленная методом ROC-анализа. Примечание: уровень значимости р<0,0001.In FIG. Figure 1 shows a system of five markers (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1, SNHG6) for predicting the formation of metastases in patients with breast cancer with a sensitivity of 80.5% and a specificity of 81.6% (AUC = 0.896), compiled by ROC analysis. Note: significance level p<0.0001.
Пример 1. Анализ уровня метилирования пяти генов днРНК HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6, используемых в заявляемом способе для прогноза метастазирования РМЖ.Example 1. Analysis of the methylation level of five lncRNA genes HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 and SNHG6, used in the claimed method for predicting breast cancer metastasis.
Статус метилирования каждого гена оценивают с использованием двух пар праймеров, специфичных как к метилированному, так и к неметилированному аллелю (Таблица 1). Используют набор реактивов «qPCRmix-HS SYBR» по протоколу фирмы Евроген. Амплификацию проводят в системе Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System (США) в соответствии с прилагаемым к прибору протоколом. Полноту конверсии ДНК определяют с помощью контрольного локуса АСТВ с использованием олигонуклеотидов специфичных к неконвертированной матрице [9]. Для сравнительного анализа эффективности амплификации также применяют локус АСТВ с использованием олигонуклеотидов, специфичных к конвертированной матрице. В качестве контролей для неметилированных аллелей используют коммерческий препарат ДНК #G1471 (Promega, США). В качестве позитивного контроля 100%-ого метилирования используют коммерческий препарат ДНК #SD1131 (Thermo Scientific, США). Соотношение уровней метилирования и их значимость оценивают с применением непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считают значимыми при р<0.001. Уровень метилирования пяти генов днРНК HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6 определен в 41 образце РМЖ с метастазами и в 39 образцах РМЖ без метастазов (Таблица 2).The methylation status of each gene is assessed using two pairs of primers specific for both the methylated and unmethylated allele (Table 1). The qPCRmix-HS SYBR reagent kit is used according to the Evrogen protocol. Amplification is carried out in the Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System (USA) in accordance with the protocol supplied with the device. The completeness of DNA conversion is determined using the ACTB control locus using oligonucleotides specific to the unconverted template [9]. For comparative analysis of amplification efficiency, the ACTB locus is also used using oligonucleotides specific to the converted template. Commercial DNA preparation #G1471 (Promega, USA) is used as controls for unmethylated alleles. Commercial DNA preparation #SD1131 (Thermo Scientific, USA) is used as a positive control for 100% methylation. The ratio of methylation levels and their significance are assessed using the nonparametric Mann-Whitney test. Differences are considered significant at p<0.001. The methylation level of five lncRNA genes HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 and SNHG6 was determined in 41 breast cancer samples with metastases and in 39 breast cancer samples without metastases (Table 2).
Пример 2. Оценка различий статуса метилирования пяти генов днРНК HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6 с учетом порогового уровня в образцах опухоли с метастазами и без.Example 2. Assessment of differences in the methylation status of five lncRNA genes HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 and SNHG6 taking into account the threshold level in tumor samples with and without metastases.
Для выявления различий гиперметилирования исследуемых генов днРНК HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6 в опухоли с метастазами и без них был выбран пороговый уровень, который рассчитывался для каждого гена на основании данных, полученных для образцов без метастазов (табл. 2). Пороговый уровень равен N(mean) + 2SD, где N(mean) - средний уровень метилирования в выборке (образцы без метастазов), SD - стандартное отклонение [10]. Оценка статуса метилирования генов в клинических образцах РМЖ с метастазами и без них с учетом порогового уровня дана в Таблице 3.To identify differences in hypermethylation of the studied lncRNA genes HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 and SNHG6 in tumors with and without metastases, a threshold level was selected, which was calculated for each gene based on data obtained for samples without metastases (Table 2). The threshold level is N(mean) + 2SD, where N(mean) is the average methylation level in the sample (samples without metastases), SD is the standard deviation [10]. An assessment of gene methylation status in clinical samples of breast cancer with and without metastases, taking into account the threshold level, is given in Table 3.
Пример 3. Оценка чувствительности и специфичности заявляемого способа для прогноза образования метастазов РМЖ на основе набора маркеров (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6) с применением ROC-анализа.Example 3. Assessment of the sensitivity and specificity of the proposed method for predicting the formation of breast cancer metastases based on a set of markers (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 and SNHG6) using ROC analysis.
Важным свойством заявляемого способа для прогноза образования метастазов при РМЖ является высокая специфичность относительно ложноположительных случаев и высокая чувствительность. С учетом данных по статусу метилирования пяти генов (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 и SNHG6) в образцах пациенток с РМЖ, из которых 41 образец имеет метастазы, а 38 не имеет (табл. 2), проведен анализ характеристик набора маркеров методом ROC-анализа, как показано на Рисунке. Согласно результатам ROC-анализа, чувствительность и специфичность заявляемого способа для прогноза образования метастазов при РМЖ, составили 80.5% и 81,6%, соответственно, а величина AUC (Area Under the ROC Curve) составила 0,896 (~0,9), что считается показателем высокой точности для набора маркеров. Таким образом, заявляемый способ позволяет осуществить прогноз образования метастазов у пациенток с РМЖ с 81%-ой чувствительностью и 82%-ой специфичностью. Согласно параметрам, оценивающим набор маркеров (в частности, критерий >0,2), необходимо и достаточно выявления метилирования двух любых маркерных генов из пяти маркеров данного набора для прогноза возникновения метастазов у больной РМЖ с указанной точностью.An important property of the proposed method for predicting the formation of metastases in breast cancer is its high specificity relative to false-positive cases and high sensitivity. Taking into account the data on the methylation status of five genes (HAND2-AS1, KCNK15-AS1, MAGI2-AS3, SSTR5-AS1 and SNHG6) in samples from patients with breast cancer, of which 41 samples had metastases and 38 did not (Table 2), The characteristics of the set of markers were analyzed using ROC analysis, as shown in the Figure. According to the results of ROC analysis, the sensitivity and specificity of the proposed method for predicting the formation of metastases in breast cancer were 80.5% and 81.6%, respectively, and the AUC value (Area Under the ROC Curve) was 0.896 (~0.9), which is considered high accuracy indicator for a set of markers. Thus, the proposed method makes it possible to predict the formation of metastases in patients with breast cancer with 81% sensitivity and 82% specificity. According to the parameters that evaluate a set of markers (in particular, the criterion >0.2), it is necessary and sufficient to identify the methylation of any two marker genes from the five markers of this set to predict the occurrence of metastases in a breast cancer patient with the specified accuracy.
Заявляемый способ для прогноза образования метастазов у больных РМЖ характеризуются тем, чтоThe inventive method for predicting the formation of metastases in patients with breast cancer is characterized by the fact that
- Позволяет прогнозировать развитие метастазов у больных РМЖ с высокой чувствительностью (81%) и специфичностью (82%) при величине AUC=0.9. Рассмотренные ближайшие аналоги (WO 2012/045905 A3 (2012), WO 2017/095213 А1) не позволяют в полной мере оценить метастатический потенциал РМЖ, в особенности учитывая гетерогенный характер этого вида рака. Эти работы рассматривают очень узкий диапазон применимости выбранных авторами маркеров. Кроме того, информация о чувствительности и специфичности методов отсутствует [6, 8].- Allows to predict the development of metastases in patients with breast cancer with high sensitivity (81%) and specificity (82%) with an AUC value of 0.9. The closest analogues considered (WO 2012/045905 A3 (2012), WO 2017/095213 A1) do not allow us to fully assess the metastatic potential of breast cancer, especially considering the heterogeneous nature of this type of cancer. These works consider a very narrow range of applicability of the markers chosen by the authors. In addition, information on the sensitivity and specificity of the methods is lacking [6, 8].
Цитированные источники научно-технической информации:Cited sources of scientific and technical information:
1. Xu X, Yuan X, Ni J, Guo J, Gao Y, Yin W, Li F, Wei L, Zhang J. MAGI2-AS3 inhibits breast cancer by downregulating DNA methylation of MAGE. J Cell Physiol. 2021;236(2):1116-1130. doi: 10.1002/jcp.29922. PMID: 32730644.1. Xu X, Yuan X, Ni J, Guo J, Gao Y, Yin W, Li F, Wei L, Zhang J. MAGI2-AS3 inhibits breast cancer by downregulating DNA methylation of MAGE. J Cell Physiol. 2021;236(2):1116-1130. doi: 10.1002/jcp.29922. PMID: 32730644.
2. Заявка на патент на изобретение, регистрационный №2022121163 от 03.08.2022. Филиппова Е.А. и др. «Способ для диагностирования рака молочной железы на основе набора генов длинных некодирующих РНК».2. Application for a patent for an invention, registration No. 2022121163 dated 08/03/2022. Filippova E.A. et al. “Method for diagnosing breast cancer based on a set of long non-coding RNA genes.”
3. Zhang K, Luo Z, Zhang Y, Song X, Zhang L, Wu L, Liu J. Long non-coding RNAs as novel biomarkers for breast cancer invasion and metastasis. Oncol Lett. 2017;14(2):1895-1904. doi: 10.3892/ol.2017.6462. PMID: 28789424;3. Zhang K, Luo Z, Zhang Y, Song X, Zhang L, Wu L, Liu J. Long non-coding RNAs as novel biomarkers for breast cancer invasion and metastasis. Oncol Lett. 2017;14(2):1895-1904. doi: 10.3892/ol.2017.6462. PMID: 28789424;
4. Sobhani, N.; Chahwan, R.; Roudi, R.; Morris, R.; Volinia, S.; Chai, D.; D'Angelo, A.; Generali, D. Predictive and Prognostic Value of Non-Coding RNA in Breast Cancer. Cancers 2022, 14, 2952. https://doi.org/10.3390/cancers14122952. PMID: 357406184. Sobhani, N.; Chahwan, R.; Roudi, R.; Morris, R.; Volinia, S.; Chai, D.; D'Angelo, A.; Generali, D. Predictive and Prognostic Value of Non-Coding RNA in Breast Cancer. Cancers 2022, 14, 2952. https://doi.org/10.3390/cancers14122952. PMID: 35740618
5. WO 2016/135168 2016.09.01 (2016). Burwinkel Barbara et. al. Biomarker panel for the detection of cancer.5. WO 2016/135168 2016.09.01 (2016). Burwinkel Barbara et. al. Biomarker panel for the detection of cancer.
6. WO 2012/045905 A3 (2012) Gomis Cabre Roger et al. Methods for the diagnosis, prognosis and treatment of breast cancer metastasis.6. WO 2012/045905 A3 (2012) Gomis Cabre Roger et al. Methods for the diagnosis, prognosis and treatment of breast cancer metastasis.
7. WO 2021/170777 A1 (2021). Maiuri Chiara et al. Methods for diagnosing, prognosing and managing treatment of breast cancer.7. WO 2021/170777 A1 (2021). Maiuri Chiara et al. Methods for diagnosing, prognosing and managing treatment of breast cancer.
8. WO 2017/ 095213 A1 Melendez Zajgla J. et. al. Method for prognosis in breast cancer.8. WO 2017/ 095213 A1 Melendez Zajgla J. et. al. Method for prognosis in breast cancer.
9. Hattermann K., Mehdorn H.M., Mentlein R., Schultka S., Held-Feindt J. A methylation-specific and SYBR-green-based quantitative polymerase chain reaction technique for 06-methylguanine DNA methyltransferase promoter methylation analysis. Analytical Biochemistry. 2008. Vol.377, N 1, 62-71. doi 10.1016/j.ab.2008.03.014. PMID: 183847369. Hattermann K., Mehdorn H.M., Mentlein R., Schultka S., Held-Feindt J. A methylation-specific and SYBR-green-based quantitative polymerase chain reaction technique for 06-methylguanine DNA methyltransferase promoter methylation analysis. Analytical Biochemistry. 2008. Vol.377, N 1, 62-71. doi 10.1016/j.ab.2008.03.014. PMID: 18384736
10. Lehmann U, Berg-Ribbe I, Wingen LU, Brakensiek K, Becker T, Klempnauer J, Schlegelberger B, Kreipe H, Flemming P. Distinct methylation patterns of benign and malignant liver tumors revealed by quantitative methylation profiling. Clin Cancer Res. 2005;11(10):3654-60. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-04-2462. PMID: 158975610. Lehmann U, Berg-Ribbe I, Wingen LU, Brakensiek K, Becker T, Klempnauer J, Schlegelberger B, Kreipe H, Flemming P. Distinct methylation patterns of benign and malignant liver tumors revealed by quantitative methylation profiling. Clin Cancer Res. 2005;11(10):3654-60. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-04-2462. PMID: 1589756
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2807480C1 true RU2807480C1 (en) | 2023-11-15 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107326090A (en) * | 2017-08-23 | 2017-11-07 | 武汉大学 | Quantitative detecting method for the blood platelet LncRNA of Diagnosis of Non-Small Cell Lung |
| CN108949988A (en) * | 2018-08-03 | 2018-12-07 | 武汉大学 | A kind of application of long-chain non-coding RNA SNHG6 in breast cancer diagnosis or treatment |
| JP2020536503A (en) * | 2017-09-05 | 2020-12-17 | アモネタ・ダイアグノスティクスＡｍｏｎｅｔａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ | Non-coding RNA (ncRNA) for the diagnosis of cognitive impairment |
| RU2779550C1 (en) * | 2021-06-22 | 2022-09-08 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") | Method for diagnosing ovarian cancer based on a set of genes of long non-coding rna |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107326090A (en) * | 2017-08-23 | 2017-11-07 | 武汉大学 | Quantitative detecting method for the blood platelet LncRNA of Diagnosis of Non-Small Cell Lung |
| JP2020536503A (en) * | 2017-09-05 | 2020-12-17 | アモネタ・ダイアグノスティクスＡｍｏｎｅｔａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ | Non-coding RNA (ncRNA) for the diagnosis of cognitive impairment |
| CN108949988A (en) * | 2018-08-03 | 2018-12-07 | 武汉大学 | A kind of application of long-chain non-coding RNA SNHG6 in breast cancer diagnosis or treatment |
| RU2779550C1 (en) * | 2021-06-22 | 2022-09-08 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") | Method for diagnosing ovarian cancer based on a set of genes of long non-coding rna |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220267861A1 (en) | Non-invasive determination of tissue source of cell-free dna | |
| KR102148547B1 (en) | Non-invasive determination of methylome of fetus or tumor from plasma | |
| CN112159844B (en) | Method and reagent for detecting DNA methylation of colorectal cancer | |
| Fang et al. | Genome-wide analysis of aberrant DNA methylation for identification of potential biomarkers in colorectal cancer patients | |
| EP3658684B1 (en) | Enhancement of cancer screening using cell-free viral nucleic acids | |
| EP2707506A2 (en) | Method of detecting cancer through generalized loss of stability of epigenetic domains, and compositions thereof | |
| AU2013275761B2 (en) | Biomarkers for prostate cancer | |
| US10214778B2 (en) | Methods and nucleotide fragments of predicting occurrence, metastasis of cancers and patients' postoperative survival in vitro | |
| US20150072947A1 (en) | Gene biomarkers for prediction of susceptibility of ovarian neoplasms and/or prognosis or malignancy of ovarian cancers | |
| RU2807480C1 (en) | Method for predicting breast cancer metastasis based on set of long non-coding rna genes | |
| JPWO2020116573A1 (en) | How to determine the prognosis of endometrial cancer | |
| US20230203596A1 (en) | A method of diagnosing, prognosing and/or monitoring ovarian cancer | |
| CN116783309A (en) | Methods for detecting and predicting cancer and/or CIN3 | |
| RU2779550C1 (en) | Method for diagnosing ovarian cancer based on a set of genes of long non-coding rna | |
| CN111440866A (en) | Application of DUSP3 gene methylation detection reagent in preparation of colorectal cancer prognosis diagnosis reagent | |
| RU2795976C1 (en) | Method for diagnosing breast cancer based on a set of long non-coding rna genes | |
| AU2021291133A1 (en) | Methods for detecting and predicting cancer and/or CIN3 | |
| CA3227863A1 (en) | Method for the diagnosis and/or prognosis of cancer of the biliary tract | |
| CN116219023A (en) | Gel method kit for detecting methylation of lung cancer specific marker and application | |
| Wang et al. | Early Detection of Metastatic Relapse and Monitoring of Therapeutic Efficacy by a Five Circulating Tumor DNA Methylation Signature in Colorectal Cancer |