RU2804641C2 - Method for obtaining modified hyaluronic acid and its salts - Google Patents
Method for obtaining modified hyaluronic acid and its salts Download PDFInfo
- Publication number
- RU2804641C2 RU2804641C2 RU2021116454A RU2021116454A RU2804641C2 RU 2804641 C2 RU2804641 C2 RU 2804641C2 RU 2021116454 A RU2021116454 A RU 2021116454A RU 2021116454 A RU2021116454 A RU 2021116454A RU 2804641 C2 RU2804641 C2 RU 2804641C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cross
- hyaluronic acid
- salts
- acid
- linking
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к области фармации, клинической и экспериментальной медицины и ветеринарии, а именно к способу получения нетоксичных составов на основе гиалуроновой кислоты и ее солей путем модифицирования сшивающими агентами из группы замещенных эпоксидных соединений и аминокислотами и использованию их в различных сферах медицины.The present invention relates to the field of pharmacy, clinical and experimental medicine and veterinary medicine, namely to a method for producing non-toxic compositions based on hyaluronic acid and its salts by modification with cross-linking agents from the group of substituted epoxy compounds and amino acids and their use in various fields of medicine.
Гиалуроновая кислота представляет из себя биополимер, состоящий из дисахаридных звеньев D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина, связанных чередующимися гликозидными связями по положениям β-(1→4), при этом мономеры D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина связаны между собой гликозидной связью по положениям β-(1→3) (фиг. 1). Такая структура обусловливает наличие у гиалуроновой кислоты вторичной и третичной структуры в растворах [Fallacara, A.; Baldini, E.; Manfredini, S.; Vertuani, S. Hyaluronic Acid in the Third Millennium. // Polymers - 2018 V. 10(7) - P. 701]. Это обусловливается следующим: карбоксильные группы при нейтральной реакции среды в природных средах имеют отрицательный заряд, вследствие чего образуют соли с катионами металлов и являются сильно гидрофильными [Laurent, T. The biology of hyaluronan. Introduction. // Ciba Found. Symp. - 1989 - V. 143 - P. 1-20; Balazs, E. A.; Laurent, T.C.; Jeanloz, R.W. Nomenclature of hyaluronic acid. // Biochem. J. - 1986 - V. 235 - P. 903]. Окружающие молекулы воды связывают карбоксильные группы и ацетамидные группы водородными связями, что приводит к образованию одноцепочечной, левосторонней спиральной структуре, при этом два дисахидных звена приходится на один виток спирали [Heatley, F.; Scott, J.E. A water molecule participates in the secondary structure of hyaluronan. // Biochem J. - 1988 - V. 254 - P. 489-493]. Гидрофобные взаимодействия и межмолекулярные водородные связи приводят к образованию дуплексов, то есть β-листовой третичной структуре, которые приводят к агрегации полимерных цепей с образованием протяженной сети [Scott, J. E.; Cummings, C.; Brass, A.; Chen, Y. Secondary and tertiary structures of hyaluronan in aqueous solution, investigated by rotary shadowing-electron microscopy and computer simulation. Hyaluronan is a very efficient network-forming polymer. // Biochem J. - 1991 - V. 274 - P. 699-705.; Scott, J. E.; Heatley, F. Hyaluronan forms specific stable tertiary structures in aqueous solution: a 13C NMR study. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 1999 - V. 96 - P. 4850-4855]. Образование третичной структуры обусловливается молекулярным весом гиалуроновой кислоты и концентрацией; например, при молекулярной массе более 106 Да третичная структура образуется даже при крайне низкой концентрации в 1 мкг/мл [Scott, J. E. Supramolecular organization of extracellular matrix glycosaminoglycans, in vitro and in the tissues. // FASEB J. - 1992 - V. 6 - P. 2639-2645].Hyaluronic acid is a biopolymer consisting of disaccharide units of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine, linked by alternating glycosidic bonds at positions β-(1→4), while the monomers D-glucuronic acid and N-acetyl- D-glucosamine is linked to each other by a glycosidic bond at positions β-(1→3) (Fig. 1). This structure determines the presence of secondary and tertiary structures in hyaluronic acid in solutions [Fallacara, A.; Baldini, E.; Manfredini, S.; Vertuani, S. Hyaluronic Acid in the Third Millennium. // Polymers - 2018 V. 10(7) - P. 701]. This is due to the following: carboxyl groups with a neutral reaction in natural environments have a negative charge, as a result of which they form salts with metal cations and are highly hydrophilic [Laurent, T. The biology of hyaluronan. Introduction. // Ciba Found. Symp. - 1989 - V. 143 - P. 1-20; Balazs, E. A.; Laurent, T.C.; Jeanloz, R.W. Nomenclature of hyaluronic acid. // Biochem. J. - 1986 - V. 235 - P. 903]. Surrounding water molecules bind carboxyl groups and acetamide groups with hydrogen bonds, which leads to the formation of a single-stranded, left-handed helical structure, with two disacide units per turn of the helix [Heatley, F.; Scott, J.E. A water molecule participates in the secondary structure of hyaluronan. // Biochem J. - 1988 - V. 254 - P. 489-493]. Hydrophobic interactions and intermolecular hydrogen bonds lead to the formation of duplexes, that is, a β-sheet tertiary structure, which lead to the aggregation of polymer chains to form an extended network [Scott, J. E.; Cummings, C.; Brass, A.; Chen, Y. Secondary and tertiary structures of hyaluronan in aqueous solution, investigated by rotary shadowing-electron microscopy and computer simulation. Hyaluronan is a very efficient network-forming polymer. // Biochem J. - 1991 - V. 274 - P. 699-705.; Scott, J. E.; Heatley, F. Hyaluronan forms specific stable tertiary structures in aqueous solution: a 13C NMR study. //Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 1999 - V. 96 - P. 4850-4855]. The formation of the tertiary structure is determined by the molecular weight of hyaluronic acid and concentration; for example, with a molecular weight of more than 106 Da, a tertiary structure is formed even at an extremely low concentration of 1 μg/ml [Scott, J. E. Supramolecular organization of extracellular matrix glycosaminoglycans, in vitro and in the tissues. // FASEB J. - 1992 - V. 6 - P. 2639-2645].
Такая структура обусловливает свойства водных растворов гиалуроновой кислоты: с повышением молекулярной массы и концентрации вязкость и реологические свойства раствора увеличиваются [Kobayashi, Y.; Okamoto, A.; Nishinari, K. Viscoelasticity of hyaluronic acid with different molecular weights. // Biorheology. - 1994 V. 31 - P. 235-244]. Однако, так как молекула гиалуроновой кислоты является полиэлектролитом, свойства ее водного раствора сильно зависят от ионной силы раствора, водородного показателя pH и температуры: с повышением данных показателей вязкость раствора значительно падает, что обусловливается ослаблением межмолекулярных взаимодействий [Kobayashi, Y.; Okamoto, A.; Nishinari, K. Viscoelasticity of hyaluronic acid with different molecular weights. // Biorheology. - 1994 V. 31 - P. 235-244.; Knopf-Marques, H.; Pravda, M.; Wolfova, L.; Velebny, V.; Schaaf, P.; Vrana, N.E.; Lavalle, P. Hyaluronic Acid and Its Derivatives in Coating and Delivery Systems: Applications in Tissue Engineering // Regenerative Medicine and Immunomodulation. Adv. Healthc. Mater. - 2016 -V. 5 - P. 2841-2855; Balazs, E. A. The physical properties of synovial fluid and the special role of hyaluronic acid. // Disorders of the Knee. - Philadelphia: J.B. Lippincott Company, 1974. - P. 63-75; Rwei, S. P.; Chen, S.W.; Mao, C.F.; Fang, H.W. Viscoelasticity and wearability of hyaluronate solutions. // Biochem. Eng. J. - 2008 - V. 40 - P. 211-217]. В особенности, гиалуроновая кислота чувствительна к изменению водородного показателя pH: в кислой или щелочной среде происходит изменение баланса между силами межмолекулярного и внутримолекулярного притяжения и отталкивания, и при значении водородного показателя менее 4 и более 11 приводит к гидролизу молекулы [Lapcík, L. J.; Lapcík, L.; De Smedt, S.; Demeester, J.; Chabrecek, P. Hyaluronan: Preparation, Structure // Properties, and Applications. Chem. Rev. - 1998 - V. 98 - P. 2663-2684.; Maleki, A.; Kjøniksen, A.L.; Nystrom, B. Effect of pH on the behavior of hyaluronic acid in dilute and semidilute aqueous solutions. // Macromol. Symp. - 2008 - V. 274 - P. 131–140]. В щелочной среде данный эффект более выражен вследствии разрушения водородных связей, играющих высокую роль при структурной организации молекул гиалуроновой кислоты [Ghosh, S.; Kobal, I.; Zanette, D.; Reed, W.F. Conformational contraction and hydrolysis of hyaluronate in sodium hydroxide solutions. // Macromolecules - 1993 - V. 26 - P. 4685–4693.; Morris, E. R.; Rees, D.A.; Welsh, E.J. Conformation and dynamic interactions in hyaluronate solutions. // J. Mol. Biol. - 1980 - V. 138 - P. 383-400].This structure determines the properties of aqueous solutions of hyaluronic acid: with increasing molecular weight and concentration, the viscosity and rheological properties of the solution increase [Kobayashi, Y.; Okamoto, A.; Nishinari, K. Viscoelasticity of hyaluronic acid with different molecular weights. // Biorheology. - 1994 V. 31 - P. 235-244]. However, since the hyaluronic acid molecule is a polyelectrolyte, the properties of its aqueous solution strongly depend on the ionic strength of the solution, pH and temperature: with an increase in these indicators, the viscosity of the solution drops significantly, which is caused by a weakening of intermolecular interactions [Kobayashi, Y.; Okamoto, A.; Nishinari, K. Viscoelasticity of hyaluronic acid with different molecular weights. // Biorheology. - 1994 V. 31 - P. 235-244.; Knopf-Marques, H.; Pravda, M.; Wolfova, L.; Velebny, V.; Schaaf, P.; Vrana, N. E.; Lavalle, P. Hyaluronic Acid and Its Derivatives in Coating and Delivery Systems: Applications in Tissue Engineering // Regenerative Medicine and Immunomodulation. Adv. Healthc. Mater. - 2016 -V. 5 - P. 2841-2855; Balazs, E. A. The physical properties of synovial fluid and the special role of hyaluronic acid. // Disorders of the Knee. - Philadelphia: J.B. Lippincott Company, 1974. - P. 63-75; Rwei, S. P.; Chen, S. W.; Mao, C.F.; Fang, H. W. Viscoelasticity and wearability of hyaluronate solutions. // Biochem. Eng. J. - 2008 - V. 40 - P. 211-217]. In particular, hyaluronic acid is sensitive to changes in the pH value: in an acidic or alkaline environment, a change in the balance between the forces of intermolecular and intramolecular attraction and repulsion occurs, and when the pH value is less than 4 and more than 11, it leads to hydrolysis of the molecule [Lapcík, L. J.; Lapcik, L.; De Smedt, S.; Demeester, J.; Chabrecek, P. Hyaluronan: Preparation, Structure // Properties, and Applications. Chem. Rev. - 1998 - V. 98 - P. 2663-2684.; Maleki, A.; Kjøniksen, A.L.; Nystrom, B. Effect of pH on the behavior of hyaluronic acid in dilute and semidilute aqueous solutions. // Macromol. Symp. - 2008 - V. 274 - P. 131–140]. In an alkaline environment, this effect is more pronounced due to the destruction of hydrogen bonds, which play a high role in the structural organization of hyaluronic acid molecules [Ghosh, S.; Kobal, I.; Zanette, D.; Reed, W.F. Conformational contraction and hydrolysis of hyaluronate in sodium hydroxide solutions. // Macromolecules - 1993 - V. 26 - P. 4685–4693.; Morris, E. R.; Rees, D. A.; Welsh, E.J. Conformation and dynamic interactions in hyaluronate solutions. // J. Mol. Biol. - 1980 - V. 138 - P. 383-400].
Молекулы гиалуроновой кислоты широко распространены в природе: они присутствуют в организме человека, животных, бактерий, водорослей, дрожжей и моллюсков, однако они отсутствуют в растениях, грибах и у насекомых [Fallacara, A.; Baldini, E.; Manfredini, S.; Vertuani, S. Hyaluronic Acid in the Third Millennium. // Polymers - 2018 V. 10(7) - P. 701]. В среднем, в организме взрослого человека с массой тела 70 кг содержится около 15 грамм гиалуроновой кислоты, которая преимущественно распределена в коже (дерме и эпидермисе), синовиальной жидкости, стекловидном теле глаза, пуповине [Fallacara, A.; Baldini, E.; Manfredini, S.; Vertuani, S. Hyaluronic Acid in the Third Millennium. // Polymers - 2018 V. 10(7) - P. 701; Laurent, T. C.; Fraser, J.R. Hyaluronan. // FASEB J. - 1992 - V. 6 - P. 2397-2404]. Hyaluronic acid molecules are widespread in nature: they are present in humans, animals, bacteria, algae, yeast and mollusks, but they are absent in plants, fungi and insects [Fallacara, A.; Baldini, E.; Manfredini, S.; Vertuani, S. Hyaluronic Acid in the Third Millennium. // Polymers - 2018 V. 10(7) - P. 701]. On average, the body of an adult with a body weight of 70 kg contains about 15 grams of hyaluronic acid, which is predominantly distributed in the skin (dermis and epidermis), synovial fluid, vitreous body of the eye, umbilical cord [Fallacara, A.; Baldini, E.; Manfredini, S.; Vertuani, S. Hyaluronic Acid in the Third Millennium. // Polymers - 2018 V. 10(7) - P. 701; Laurent, T. C.; Fraser, J.R. Hyaluronan. // FASEB J. - 1992 - V. 6 - P. 2397-2404].
В организме человека гиалуроновая кислота синтезируется и распадается самостоятельно, образуя определенный равновесный материальный баланс, однако с возрастом и при определенных заболеваниях это нарушается. Именно поэтому важно понять пути деградации гиалуроновой кислоты в организме человека. In the human body, hyaluronic acid is synthesized and decomposed independently, forming a certain equilibrium material balance, but with age and certain diseases this is disrupted. That is why it is important to understand the degradation pathways of hyaluronic acid in the human body.
Деградация в организме осуществляется путем трех механизмов: 1) специфичным с использованием ферментов - гиалуронидаз; 2) неспецифичным, путем окислительного повреждения за счет активных форм кислорода; 3) систематическим путем естественного катаболизма в организме, что проявляется преимущественно за счет транспорта лимфой в лимфатические узлы, где она перерабатывается клетками эндотелия лимфатических узлов, и транспорта кровью, где происходит ее разрушение клетками эндотелия печени [Fallacara, A.; Baldini, E.; Manfredini, S.; Vertuani, S. Hyaluronic Acid in the Third Millennium. // Polymers - 2018 V. 10(7) - P. 701; Heldin, P.; Lin, C.Y.; Kolliopoulos, K.; Chen, Y.H.; Skandalis, S.S. Regulation of hyaluronan biosynthesis and clinical impact of excessive hyaluronan production // Matrix Biol - 2018]. На разрушение путем ферментов и активных форм кислорода приходится до 30% от общей массы гиалуроновой кислоты в организме.Degradation in the body is carried out by three mechanisms: 1) specific using enzymes - hyaluronidases; 2) nonspecific, through oxidative damage due to reactive oxygen species; 3) systematically through natural catabolism in the body, which manifests itself primarily through transport by lymph to the lymph nodes, where it is processed by the endothelial cells of the lymph nodes, and transport by the blood, where it is destroyed by liver endothelial cells [Fallacara, A.; Baldini, E.; Manfredini, S.; Vertuani, S. Hyaluronic Acid in the Third Millennium. // Polymers - 2018 V. 10(7) - P. 701; Heldin, P.; Lin, C.Y.; Kolliopoulos, K.; Chen, Y. H.; Skandalis, S.S. Regulation of hyaluronan biosynthesis and clinical impact of excessive hyaluronan production // Matrix Biol - 2018]. Destruction by enzymes and reactive oxygen species accounts for up to 30% of the total mass of hyaluronic acid in the body.
Наличие гиалуроновой кислоты в организме обусловливает ее высокую биосовместимость, неиммуногенность, гипоаллергенность и биодоступность. Именно поэтому, в совокупности с физико-химическими свойствами, гиалуроновая кислота имеет широкое применение в медицине, косметологии, ветеринарии. The presence of hyaluronic acid in the body determines its high biocompatibility, non-immunogenicity, hypoallergenicity and bioavailability. That is why, in combination with its physicochemical properties, hyaluronic acid is widely used in medicine, cosmetology, and veterinary medicine.
Особое значение стоит отметить использование гиалуроновой кислоты в качестве имплантата, что обусловливается наличием гиалуроновой кислоты в организме человека. Так, большая часть протезов синовиальной жидкости, интрадермальных филлеров и офтальмологических вискоэластиков, доступных на рынке, производится на основе гиалуроновой кислоты. Однако в зависимости от медицинского назначения и терапевтических целей требуется регулирование степени биодеградации имплантируемых биополимеров. Для того, чтобы регулировать степень биодеградации гиалуроновой кислоты в тканях организма, зачастую используют химические методы модификации, а именно использование сшивающих агентов, которые образуют ковалентные связи между полимерными цепями гиалуроновой кислоты. Такая модификация существенно уменьшает скорость биодеградации, так как поперечно-сшитые производные биополимера менее склонны к гидролизному распаду, воздействию ферментов и активных форм кислорода, в то же время повышая механические свойства материала, что увеличивает продолжительность полезного эффекта от их применения.Of particular importance is the use of hyaluronic acid as an implant, which is determined by the presence of hyaluronic acid in the human body. Thus, most of the synovial fluid grafts, intradermal fillers and ophthalmic viscoelastics available on the market are based on hyaluronic acid. However, depending on the medical purpose and therapeutic goals, regulation of the degree of biodegradation of implanted biopolymers is required. In order to regulate the degree of biodegradation of hyaluronic acid in body tissues, chemical modification methods are often used, namely the use of cross-linking agents that form covalent bonds between the polymer chains of hyaluronic acid. This modification significantly reduces the rate of biodegradation, since cross-linked biopolymer derivatives are less prone to hydrolytic decomposition, the effects of enzymes and reactive oxygen species, while at the same time increasing the mechanical properties of the material, which increases the duration of the beneficial effect from their use.
Наибольшее распространение в настоящее время получили химические сшивающие агенты, в том числе глутаровый альдегид, дивинилсульфон и замещенные эпоксиды, в том числе 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир и полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир. Применение последних обусловлено опытом их практического применения: на протяжении 15 лет клинического использования 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира была подтверждена клиническая безопасность при соблюдении остаточного содержания менее 1 ppm [Leonardis M, Palange A. New-generation filler based on cross-linked carboxymethylcellulose: study of 350 patients with 3-year follow-up. // Clin Interv Aging. - 2015. - V. 10 – P. 147-155]. Помимо этого, вследствие большого количества веществ из группы замещенных эпоксидов, их использование вследствие разной молекулярной массы, структуры и реакционной способности позволяет создавать продукты с различной степенью биодеградации, что важно для различных сфер применения.The most common chemical crosslinking agents currently available include glutaraldehyde, divinyl sulfone, and substituted epoxides, including 1,4-butanediol diglycidyl ether and polyethylene glycol diglycidyl ether. The use of the latter is due to the experience of their practical application: over 15 years of clinical use of 1,4-butanediol diglycidyl ether, clinical safety was confirmed while maintaining a residual content of less than 1 ppm [Leonardis M, Palange A. New-generation filler based on cross-linked carboxymethylcellulose: study of 350 patients with 3-year follow-up. // Clin Interv Aging. - 2015. - V. 10 – P. 147-155]. In addition, due to the large number of substances from the group of substituted epoxides, their use due to different molecular weights, structures and reactivity makes it possible to create products with varying degrees of biodegradation, which is important for various applications.
Известен целый ряд патентов, где используются замещенные эпоксиды в качестве модифицирующего сшивающего агента: US4716224, US4716154. There are a number of patents that use substituted epoxides as a modifying crosslinking agent: US4716224, US4716154.
Наиболее близким аналогом является решение по заявке WO2013021249, опубл. 2013-02-14, где описан биоразлагаемый, но стойкий к деградации продукт, состоящий из нового сшитого низкомолекулярного полутвердого гидрогеля гиалуроновой кислоты, полученного из субстрата гиалуроната натрия с молекулярной массой от 50 000 до 100 000 Да. Продукт обладает высокой устойчивостью к ферментативной деградации и предназначен для использования в биомедицинских, фармацевтических и косметических целях.The closest analogue is the decision on application WO2013021249, publ. 2013-02-14, which describes a biodegradable but degradation-resistant product consisting of a new cross-linked low molecular weight semi-solid hyaluronic acid hydrogel derived from a sodium hyaluronate substrate with a molecular weight of 50,000 to 100,000 Da. The product is highly resistant to enzymatic degradation and is intended for use in biomedical, pharmaceutical and cosmetic applications.
В прототипе описан способ получения вязкоупругого, полутвердого и прозрачного сшитого низкомолекулярного гиалуроната натрия, включающий взаимодействие 8-40% раствора субстрата гиалуроната натрия со средней молекулярной массой от 50 000 Да до 100 000 Да в 0,75% -1,5% водном растворе гидроксида натрия с количеством 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира, соответствующим от 180 молей до 500 молей на моль субстрата гиалуроната натрия, при температуре от 45 до 60 °С в течение периода времени от от 3 до 8 часов.The prototype describes a method for producing viscoelastic, semi-solid and transparent cross-linked low molecular weight sodium hyaluronate, including the interaction of an 8-40% solution of sodium hyaluronate substrate with an average molecular weight of 50,000 Da to 100,000 Da in a 0.75% -1.5% aqueous hydroxide solution sodium with an amount of 1,4-butanediol diglycidyl ether corresponding to 180 moles to 500 moles per mole of sodium hyaluronate substrate, at a temperature of 45 to 60 °C for a period of 3 to 8 hours.
Однако в известных технических решениях существует техническая проблема, связанная с очисткой и дезактивацией модифицированного состава от остатков сшивающих агентов. После проведения химической модификации сшивающими агентами в полученном составе содержатся остатки непрореагировавшего модифицирующего сшивающего агента, и, что особенно важно, остатки сшивающих агентов, которые прореагировали только по одной эпоксидной группе с молекулой гиалуроновой кислоты. В таком случае может происходить реакции изомеризации оставшейся эпоксидной группы с образованием альдегидной группы, которая обладает высокой токсичностью. Именно поэтому важно отметить, что в результате использования модифицирующих сшивающих агентов требуется очистка от остаточного свободного количества сшивающих агентов и дезактивации свободных эпоксидных групп частично прореагировавших сшивающих агентов, что в приведенных аналогах либо не отмечается, либо используется процесс диализа. Однако этого недостаточно, так как свободные эпоксидные группы, которые связаны с молекулой гиалуроновой кислоты, будут оставаться, что обусловливает токсичность изделия.However, in known technical solutions there is a technical problem associated with cleaning and deactivating the modified composition from residual cross-linking agents. After chemical modification with cross-linking agents, the resulting composition contains the remains of unreacted modifying cross-linking agent, and, most importantly, the remains of cross-linking agents that have reacted only one epoxy group with the hyaluronic acid molecule. In this case, isomerization reactions of the remaining epoxy group may occur to form an aldehyde group, which is highly toxic. That is why it is important to note that as a result of the use of modifying cross-linking agents, it is necessary to remove the residual free amount of cross-linking agents and deactivate the free epoxy groups of partially reacted cross-linking agents, which is either not noted in the above analogues, or the dialysis process is used. However, this is not enough, since free epoxy groups that are associated with the hyaluronic acid molecule will remain, which causes the toxicity of the product.
Именно поэтому при использовании данных прототипов по их способам применения существует вероятность возникновения осложнений, связанная с повышенной токсичностью.That is why when using these prototypes according to their methods of application, there is a possibility of complications associated with increased toxicity.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения составов на основе гиалуроновой кислоты и ее растворимых солей, которые являются модифицированными химически с использованием сшивающих агентов, но в то же время отличающихся низкой токсичностью, что позволяет получить продукты с разными свойствами в зависимости от их целевого применения.The objective of the present invention is to develop a method for producing compositions based on hyaluronic acid and its soluble salts, which are chemically modified using cross-linking agents, but at the same time characterized by low toxicity, which makes it possible to obtain products with different properties depending on their intended use.
Техническим результатом настоящего изобретения является получение состава на основе модифицированной поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты путем взаимодействия со сшивающими агентами, который обладает низкой токсичностью за счет наличия технологических стадий очистки и нейтрализации сшивающего агента. Указанные способы получения хорошо масштабируемы и позволяют получить низкотоксичные составы.The technical result of the present invention is to obtain a composition based on modified cross-linked hyaluronic acid by interaction with cross-linking agents, which has low toxicity due to the presence of technological stages of purification and neutralization of the cross-linking agent. These production methods are highly scalable and make it possible to obtain low-toxic compounds.
Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлен способ получения состава модифицированной гиалуроновой кислоты и ее солей, включающий при изготовлении использование сшивающих агентов в виде замещенных эпоксидных соединений, отличающийся тем, что включает:The specified technical result is achieved due to the fact that a method is claimed for obtaining the composition of modified hyaluronic acid and its salts, which includes the use of cross-linking agents in the form of substituted epoxy compounds in the manufacture, characterized in that it includes:
− стадию модификации гиалуроновой кислоты и ее солей путем ковалентной внутри и межмолекулярной химической сшивки с использованием модифицирующих сшивающих агентов на основе замещенных оксиранов и путем ковалентного связывания остатков свободных эпоксидных групп в составе поперечносшитой гиалуроновой кислоты и/или ее солей с аминокислотой, при этом мольное соотношение сшивающего агента и добавляемой аминокислоты составляет от 1:0,1 до 1:5; − stage of modification of hyaluronic acid and its salts by covalent intra- and intermolecular chemical cross-linking using modifying cross-linking agents based on substituted oxiranes and by covalent binding of the residues of free epoxy groups in the composition of cross-linked hyaluronic acid and/or its salts with an amino acid, while the molar ratio of the cross-linking agent agent and added amino acid is from 1:0.1 to 1:5;
− стадию дезактивацию свободного остаточного сшивающего агента путем реакции с аминокислотами;− stage of deactivation of free residual cross-linking agent by reaction with amino acids;
− стадию последующей очистки от остатков сшивающего агента путем диализного процесса.− the stage of subsequent purification from cross-linking agent residues through the dialysis process.
Допустимо, что используется гиалуроновая кислота и ее соли, включающие в себя: натрия гиалуронат, калия гиалуронат, цинка гиалуронат, магния гиалуронат, железа гиалуронат.It is acceptable that hyaluronic acid and its salts are used, including: sodium hyaluronate, potassium hyaluronate, zinc hyaluronate, magnesium hyaluronate, iron hyaluronate.
Допустимо, что молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 100 000 Да до 6 000 000 Да; в более конкретных вариантах воплощения изобретения молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 1 700 000 Да до 2 800 000 Да.It is acceptable that the molecular weight of hyaluronic acid or its salt is from 100,000 Da to 6,000,000 Da; in more specific embodiments, the molecular weight of hyaluronic acid or a salt thereof is from 1,700,000 Da to 2,800,000 Da.
Допустимо, что массовая концентрация гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 0,1 % до 10 %; в более конкретных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 1 % до 3 %.It is acceptable that the mass concentration of hyaluronic acid or its salt is from 0.1% to 10%; in more specific embodiments of the invention, the mass concentration of hyaluronic acid or a salt thereof is from 1% to 3%.
Допустимо, что массовая концентрация модифицирующего сшивающего агента составляет от 0,1 % до 10 %; в более конкретных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация модифицирующего сшивающего агента составляет от 0,5 % до 5 %.It is acceptable that the mass concentration of the modifying cross-linking agent is from 0.1% to 10%; in more specific embodiments, the weight concentration of the modifying cross-linking agent is from 0.5% to 5%.
Допустимо, что стадию создания поперечных ковалентных связей осуществляют в основной среде и при температуре в диапазоне от 4°С до 60°С. It is conceivable that the step of creating cross-links of covalent bonds is carried out in a basic environment and at a temperature in the range from 4°C to 60°C.
Допустимо, что стадию создания поперечных межмолекулярных и внутримолекулярных ковалентных связей осуществляют в течение от 10 минут до 72 часов, в более конкретных вариантах воплощения изобретения - в течение от 1 часа до 24 часов.It is acceptable that the stage of creating transverse intermolecular and intramolecular covalent bonds is carried out within from 10 minutes to 72 hours, in more specific embodiments of the invention - within from 1 hour to 24 hours.
Допустимо, что после стадии создания поперечных межмолекулярных и внутримолекулярных ковалентных связей состав нейтрализуют до значения водородного показателя pH 6,0-8,5 с использованием любой неорганической или органической кислоты; в более конкретных вариантах воплощения изобретения нейтрализация может происходить с использованием хлороводородной кислоты, или уксусной кислоты, или лимонной кислоты, или молочной кислоты.It is acceptable that after the stage of creating transverse intermolecular and intramolecular covalent bonds, the composition is neutralized to a pH value of 6.0-8.5 using any inorganic or organic acid; in more specific embodiments, neutralization may occur using hydrochloric acid, or acetic acid, or citric acid, or lactic acid.
Допустимо, что в качестве аминокислоты может использоваться: глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, тирозин, аспартат, глутамат, лизин, аргинин, гистидин, таурин.It is acceptable that the following amino acids can be used: glycine, alanine, valine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, serine, threonine, cysteine, asparagine, glutamine, tyrosine, aspartate, glutamate, lysine, arginine, histidine, taurine.
Допустимо, что после стадии добавления аминокислоты реакционную смесь перемешивают при температуре от плюс 4°C до плюс 60°C в течение от 1 часа до 24 часов.It is conceivable that after the amino acid addition step, the reaction mixture is stirred at a temperature of from plus 4°C to plus 60°C for 1 hour to 24 hours.
Допустимо, что полученный состав подвергают диализу в растворе осмотического агента, либо в воде для инъекций. It is acceptable that the resulting composition is dialyzed in a solution of an osmotic agent or in water for injection.
Допустимо, что полученный после диализа состав стерилизуют влажным теплом для достижения уровня стерильности 10-6.It is acceptable that the composition obtained after dialysis is sterilized with moist heat to achieve a sterility level of 10 -6 .
Допустимо, что полученный после диализа состав асептически фильтруют для получения стерильного изделия.It is conceivable that the composition obtained after dialysis is aseptically filtered to obtain a sterile product.
Также заявлен состав на основе модифицированной гиалуроновой кислоты и ее производных, содержащий остатки сшивающего агента на основе замещенных эпоксидных соединений в качестве поперечной химической ковалентной сшивки, отличающийся тем, что содержит в своем составе аминокислотный остаток, полученный по заявленному способу.Also claimed is a composition based on modified hyaluronic acid and its derivatives, containing residues of a cross-linking agent based on substituted epoxy compounds as a cross-linking chemical covalent cross-link, characterized in that it contains an amino acid residue obtained by the claimed method.
Допустимо, что аминокислотный остаток является остатком следующих аминокислот и сульфокислот: глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, тирозин, аспартат, глутамат, лизин, аргинин, гистидин, таурин.It is acceptable that the amino acid residue is the residue of the following amino acids and sulfonic acids: glycine, alanine, valine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, serine, threonine, cysteine, asparagine, glutamine, tyrosine, aspartate, glutamate, lysine, arginine, histidine, taurine
Допустимо, что используется гиалуроновая кислота и ее соли, включающие в себя: натрия гиалуронат, калия гиалуронат, цинка гиалуронат, магния гиалуронат, железа гиалуронат.It is acceptable that hyaluronic acid and its salts are used, including: sodium hyaluronate, potassium hyaluronate, zinc hyaluronate, magnesium hyaluronate, iron hyaluronate.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
На Фиг. 1 – Структурная формула молекулы гиалуроната натрия.In FIG. 1 – Structural formula of the sodium hyaluronate molecule.
На Фиг. 2 – Химическая схема реакции поперечного сшивания гиалуроната натрия посредством использования модифицирующего сшивающего агента на основе полиэтиленгликольдиглицидилового эфира.In FIG. 2 – Chemical scheme of the cross-linking reaction of sodium hyaluronate using a modifying cross-linking agent based on polyethylene glycol diglycidyl ether.
На Фиг. 3 – Химическая схема реакции поперечного сшивания гиалуроната натрия посредством использования модифицирующего сшивающего агента на основе 1,4-бутандиодиглицидилового эфира.In FIG. 3 – Chemical scheme of the cross-linking reaction of sodium hyaluronate using a modifying cross-linking agent based on 1,4-butanediodiglycidyl ether.
На Фиг. 4 – Химическая схема реакции одной молекулы гиалуроната натрия со сшивающим агентом на примере полиэтиленгликольдиглицидилового эфира в качестве модифицирующего сшивающего агента без поперечного сшивания.In FIG. 4 – Chemical scheme of the reaction of one molecule of sodium hyaluronate with a cross-linking agent using the example of polyethylene glycol diglycidyl ether as a modifying cross-linking agent without cross-linking.
На Фиг. 5 – Химическая схема реакции нейтрализации аминокислотой эпоксидных групп в модифицированном сшитым агентом гиалуронате натрия на примере взаимодействия с глицином и полиэтиленгликольдиглицидиловом эфире в качестве модифицирующего сшивающего агента.In FIG. 5 – Chemical scheme of the reaction of neutralization of epoxy groups by an amino acid in sodium hyaluronate modified with a cross-linking agent using the example of interaction with glycine and polyethylene glycol diglycidyl ether as a modifying cross-linking agent.
На Фиг. 6 – Химическая схема реакции нейтрализации аминокислоты на примере глицина со сшивающим агентом на примере полиэтиленгликольдиглицидилового эфира.In FIG. 6 – Chemical scheme of the reaction of neutralization of an amino acid using the example of glycine with a cross-linking agent using the example of polyethylene glycol diglycidyl ether.
На Фиг. 7 – Градуировочная зависимость площади пика 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира от его концентрации.In FIG. 7 – Calibration dependence of the peak area of 1,4-butanediol diglycidyl ether on its concentration.
На Фиг. 8 – Хроматограммы ВЭЖХ-МС (ESI+), записанные по избранному иону с m/z=220 (аддукт 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира с NH4 +), стандартного раствора 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира (фиолетовая) и образца, приготовленного по Примеру 1 настоящего изобретения (зеленый).In FIG. 8 – HPLC-MS (ESI+) chromatograms recorded for the selected ion with m/z = 220 (adduct of 1,4-butanediol diglycidyl ether with NH 4 + ), a standard solution of 1,4-butanediol diglycidyl ether (violet) and a sample prepared according to Example 1 of the present invention (green).
На Фиг. 9 – Спектр МС/МС (ESI+) компонента образца, приготовленного по Примеру 1 настоящего изобретения, с tR = 8,2 мин соответствует 1,4-бутандиолдиглицидиловому эфиру. In FIG. 9 – MS/MS spectrum (ESI+) of a component of the sample prepared according to Example 1 of the present invention, with t R = 8.2 min corresponding to 1,4-butanediol diglycidyl ether.
На Фиг. 10 – Хроматограмма ВЭЖХ-МС (ESI+) образца, приготовленного по Примеру 1 настоящего изобретения, записанная в режиме полного ионного тока. In FIG. 10 – HPLC-MS (ESI+) chromatogram of a sample prepared according to Example 1 of the present invention, recorded in total ion current mode.
Определения и терминыDefinitions and terms
Для лучшего понимания изобретения ниже приведены термины, использованные в настоящем описании изобретения. For a better understanding of the invention, the following terms are used in the present description of the invention.
Термины «включает» и «включающий» означают в описании данного изобретения «включает, помимо всего прочего», то есть указанные термины не истолковываются как «состоит только из».The terms “includes” and “including” mean, as used herein, “includes, but is not limited to,” that is, the terms are not construed to mean “consists only of.”
Термин «фармацевтически применимые» означает, что относящееся к данному определению вещество и/или группа веществ не вызывают побочных, аллергических и нежелательных реакций при медицинском/ветеринарном применении у млекопитающих.The term “pharmaceutically applicable” means that a substance and/or group of substances falling within this definition does not cause adverse, allergic or undesirable reactions during medical/veterinary use in mammals.
Термины «поперечно-сшитый», «поперечная сшивка» означает ковалентное связывание двух полимерных цепей гиалуроновой кислоты и/или ее солей вместе с использованием химических сшивающих агентов.The terms "cross-linked", "cross-linked" means the covalent linking of two polymer chains of hyaluronic acid and/or its salts together using chemical cross-linking agents.
Термин «сшивающий агент» означает химический агент, модифицирующий агент, который используется при ковалентном химическом связывании двух полимерных цепей гиалуроновой кислоты и/или ее солей друг к другу. The term "cross-linking agent" means a chemical agent, a modifying agent, which is used to covalently chemically link two polymer chains of hyaluronic acid and/or its salts to each other.
Термин «Дальтон» или «Да» означает внесисистемную единицу измерения молекулярной массы, рекомендованную к применению ИЮПАК, эквивалентную молярной массе вещества, выраженной в граммах на моль.The term “Dalton” or “Da” refers to an extrasystemic unit of molecular mass recommended for use by the IUPAC, equivalent to the molar mass of a substance, expressed in grams per mole.
Замещенный эпоксид, или замещенный оксиран, или эпоксидное соединение – группа химических веществ, относящихся к сшивающим агентам, имеющая в своем составе функциональную группу в виде насыщенного трехчленного гетероцикла, циклического эфира, в котором к двум соседним атомам углерода присоединяется атом кислорода. Substituted epoxide, or substituted oxirane, or epoxy compound is a group of chemical substances related to cross-linking agents, containing a functional group in the form of a saturated three-membered heterocycle, a cyclic ether, in which an oxygen atom is attached to two adjacent carbon atoms.
1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир или 1,4-бис(2,3-эпоксипропилокси)бутан – сшивающий агент, замещенный эпоксид, с брутто-формулой C10H18O4.1,4-butanediol diglycidyl ether or 1,4-bis(2,3-epoxypropyloxy)butane is a cross-linking agent, substituted epoxide, with the gross formula C 10 H 18 O 4 .
Полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир – сшивающий агент, замещенный эпоксид, общей формулой C3H5O2-(C2H4O)n-C3H5O, молекулярная масса которого может находиться в диапазоне от 500 до 8000 Да.Polyethylene glycol diglycidyl ether is a cross-linking agent, substituted epoxide, with the general formula C 3 H 5 O 2 -(C 2 H 4 O) n -C 3 H 5 O, the molecular weight of which can be in the range from 500 to 8000 Da.
Осуществление изобретенияCarrying out the invention
Способ получения нетоксичного состава на основе гиалуроновой кислоты и ее замещенных, модифицированной химически путем реакции со сшивающими агентами на основе замещенных эпоксидов и аминокислоты, согласно изобретению, заключается в создании поперечных ковалентных эфирных связей между мономерами гиалуроновой кислоы в результате введения сшивающих агентов в виде замещенных эпоксидов и далее путем ковалентного связывания остатков свободных эпоксидных групп в составе поперечносшитой карбоксиметилцеллюлозы с аминокислотой, после чего полученный гель проходит стадию дезактивации и удаления остаточного количества сшивающего агента за счет реакции с аминокислотой и диализного процесса. Создание поперечных ковалентных связей между мономерами гиалуроновой кислоты и ее производных посредством введения модифицирующих сшивающих агентов, выполняется на основе замещенных эпоксидных соединений в основной среде, а именно: 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир; полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир (см. фиг. 2, 3, 4). Модификация поперечносшитой гиалуроновой кислоты и ее производных путем ковалентного связывания остатков свободных эпоксидных групп в составе поперечносшитой гиалуроновой кислоты с аминокислотами показана на фиг. 5.The method of obtaining a non-toxic composition based on hyaluronic acid and its substitutes, modified chemically by reaction with cross-linking agents based on substituted epoxides and amino acids, according to the invention, consists in the creation of cross-linked covalent ester bonds between the monomers of hyaluronic acid as a result of the introduction of cross-linking agents in the form of substituted epoxides and further by covalently binding the residues of free epoxy groups in the composition of cross-linked carboxymethylcellulose with an amino acid, after which the resulting gel goes through the stage of deactivation and removal of the residual amount of the cross-linking agent due to reaction with the amino acid and the dialysis process. The creation of cross-links between the monomers of hyaluronic acid and its derivatives through the introduction of modifying cross-linking agents is carried out on the basis of substituted epoxy compounds in the basic medium, namely: 1,4-butanediol diglycidyl ether; polyethylene glycol diglycidyl ether (see Fig. 2, 3, 4). Modification of cross-linked hyaluronic acid and its derivatives by covalent binding of free epoxy group residues in cross-linked hyaluronic acid with amino acids is shown in Fig. 5.
На всем протяжении технологического процесса производства модифицируемый состав доводится до требуемых показателей по параметрам ионной силы раствора, осмоляльности, водородного показателя pH. Так, после стадии сшивки в основной среде идет стадия нейтрализации раствором кислоты; стадия диализа в физиологическом фосфатном буфере или воде для инъекций помимо очистки способствует достижению данных показателей до физиологических значений либо тех значений, которые необходимы для конкретного медицинского применения. Нейтрализация остаточного количества сшивающего агента путем ковалентного связывания свободных эпоксидных групп с аминокислотами показана на фиг. 6.Throughout the entire production process, the modified composition is brought to the required parameters in terms of the ionic strength of the solution, osmolality, and pH. Thus, after the crosslinking stage in a basic medium, there is a neutralization stage with an acid solution; The stage of dialysis in physiological phosphate buffer or water for injection, in addition to purification, helps to achieve these indicators to physiological values or those values that are necessary for a specific medical application. Neutralization of residual cross-linker by covalently linking free epoxy groups to amino acids is shown in FIG. 6.
Основным сырьем для получения модифицируемого состава является гиалуроновая кислота и ее соли, включающие в себя: натрия гиалуронат, калия гиалуронат, цинка гиалуронат, магния гиалуронат, железа гиалуронат, которая, согласно данному изобретению, может использоваться в диапазоне массовых концентраций от 0,1 % до 10 %, либо в диапазоне массовых концентраций от 1 % до 3 %; молекулярная масса может быть в диапазоне от 100 000 Да до 6 000 000 Да; в более конкретных вариантах воплощения изобретения молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 1 700 000 Да до 2 800 000 Да. The main raw material for obtaining the modified composition is hyaluronic acid and its salts, including: sodium hyaluronate, potassium hyaluronate, zinc hyaluronate, magnesium hyaluronate, iron hyaluronate, which, according to this invention, can be used in the range of mass concentrations from 0.1% to 10%, or in the range of mass concentrations from 1% to 3%; molecular weight may range from 100,000 Da to 6,000,000 Da; in more specific embodiments, the molecular weight of hyaluronic acid or a salt thereof is from 1,700,000 Da to 2,800,000 Da.
Сшивающими агентами могут выступать любые соединения из группы замещенных эпоксидов, включая следующие: 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир; полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир. Использование сшивающих агентов, согласно данному изобретению, возможно в диапазоне от 0,1 % до 10 % либо в диапазоне от 0,5 % до 5 %. Молекулярная масса некоторых соединений из группы замещенных эпоксидов, включая полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир, вследствие химических особенностей может варьироваться; в частности, согласно данному изобретению, для изготовления изделий может быть использован полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир с молекулярной массой в диапазоне от 500 Да до 8000 Да.Crosslinking agents can be any compounds from the group of substituted epoxides, including the following: 1,4-butanediol diglycidyl ether; polyethylene glycol diglycidyl ether. The use of crosslinking agents according to this invention is possible in the range from 0.1% to 10% or in the range from 0.5% to 5%. The molecular weight of some compounds from the group of substituted epoxides, including polyethylene glycol diglycidyl ether, may vary due to chemical characteristics; in particular, according to this invention, polyethylene glycol diglycidyl ether with a molecular weight in the range from 500 Da to 8000 Da can be used for the manufacture of products.
В качестве основания может использоваться любое неорганическое основание, в частности гидроксид натрия или гидроксид калия, с массовой концентрацией в диапазоне от 0,01% до 10%. The base can be any inorganic base, in particular sodium hydroxide or potassium hydroxide, with a mass concentration ranging from 0.01% to 10%.
В общем случае для производства модифицированного состава, согласно данному изобретению, предварительно взвешенная масса гиалуроновой кислоты и/или ее солей добавляется в емкость с основным раствором гидроксида натрия и перемешивается до полного растворения при температуре не выше плюс 60°С. После этого к полученному раствору добавляется предварительно взвешенная/отмеренная масса/объем сшивающего агента при постоянном перемешивании до получения гомогенной смеси. После процесса химической сшивки полученная смесь нейтрализуется путем добавления кислоты до значения водородного показателя pH в диапазоне значений от 6,0 до 8,5. In general, to produce a modified composition according to this invention, a pre-weighed mass of hyaluronic acid and/or its salts is added to a container with a basic solution of sodium hydroxide and mixed until completely dissolved at a temperature not exceeding plus 60°C. After this, a pre-weighed/measured mass/volume of the cross-linking agent is added to the resulting solution with constant stirring until a homogeneous mixture is obtained. After the chemical crosslinking process, the resulting mixture is neutralized by adding acid to a pH value ranging from 6.0 to 8.5.
В качестве нейтрализующей кислоты может быть использована любая неорганическая или органическая кислота, в частности хлороводородная кислота, или уксусная кислота, или лимонная кислота, или молочная кислота.Any inorganic or organic acid can be used as a neutralizing acid, in particular hydrochloric acid, or acetic acid, or citric acid, or lactic acid.
После этого добавляется аминокислота и осуществляется перемешивание. Мольное соотношение сшивающего агента к аминокислоте составляет от 1:0.5 до 1:5. Время перемешивания смеси с аминокислотой должно составлять не менее 1 часа; температура не должна превышать 60°С.After this, the amino acid is added and mixing is carried out. The molar ratio of crosslinking agent to amino acid is from 1:0.5 to 1:5. The mixing time of the mixture with the amino acid should be at least 1 hour; the temperature should not exceed 60°C.
Затем полученная смесь помещается подвергается процессу диализа в фосфатном физиологическом буферном растворе, либо в воде для инъекций, таким образом итоговое значение водородного показателя pH, ионной силы раствора и осмоляльности принимают физиологические значения либо те значения, которые необходимы для конкретного медицинского применения. The resulting mixture is then dialyzed in phosphate buffered saline or water for injection, so that the resulting pH, ionic strength and osmolality are either physiological values or those required for a particular medical application.
После процедуры диализа полученный гель гомогенизируется путем перемешивания, при необходимости добавляется требуемое количество воды для инъекции согласно целевому показателю концентрации карбоксиметилцеллюлозы в готовом изделии, и перемешивается или гомогенизируется до однородного состояния. Далее полученный модифицированный состав поступают на стадию фасовки, где он разливается в фасовочную емкость в зависимости от целевого назначения, включающую в себя первичную упаковку системы «контейнер-укупорка», и подвергается процессу стерилизации влажным теплом или асептической фильтрацией через стерилизующие микрофильтры. After the dialysis procedure, the resulting gel is homogenized by mixing, if necessary, the required amount of water for injection is added according to the target concentration of carboxymethylcellulose in the finished product, and mixed or homogenized until homogeneous. Next, the resulting modified composition enters the packaging stage, where it is poured into a packaging container depending on the intended purpose, which includes the primary packaging of the “container-closure” system, and is subjected to a sterilization process with moist heat or aseptic filtration through sterilizing microfilters.
Очистка полученного модифицированного сшитого состава путем использования диализного процесса осуществляется с целью дополнительной очистки от остатков сшивающих агентов.Purification of the resulting modified cross-linked composition using the dialysis process is carried out for the purpose of additional purification from residual cross-linking agents.
Использование аминокислот в модифицирующем составе обосновано тем, что аминокислоты являются нуклеофильными агентами за счет наличия аминогруппы, в результате чего присоединяются к свободным эпоксидным группам остаточного сшивающего агента и модифицированного состава, таким образом блокируя их дальнейшую изомеризацию; выбор аминокислот в качестве нуклеофильных агентов обусловлен их биологической совместимостью, вследствие чего они не проявляют токсичности; выбор конкретной аминокислоты для воплощения изобретения обусловливается методом стерилизации изделия, медицинским применением и экономической себестоимостью.The use of amino acids in the modifying composition is justified by the fact that amino acids are nucleophilic agents due to the presence of an amino group, as a result of which they attach to the free epoxy groups of the residual cross-linking agent and the modified composition, thus blocking their further isomerization; the choice of amino acids as nucleophilic agents is due to their biological compatibility, as a result of which they do not exhibit toxicity; the choice of a specific amino acid to implement the invention is determined by the method of sterilization of the product, medical use and economic cost.
В частных вариантах воплощения изобретения сшивающие агенты представляет собой замещенные эпоксидные соединения; в более конкретных вариантах воплощения изобретения используются сшивающие агенты со следующими характеристиками:In particular embodiments of the invention, the cross-linking agents are substituted epoxy compounds; In more specific embodiments of the invention, crosslinking agents with the following characteristics are used:
− 1,4-бутандиодиглицидиловый эфир с молекулярной массой 202,25 Да;− 1,4-butanediodiglycidyl ether with a molecular weight of 202.25 Da;
− полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир с молекулярной массой от 500 Да до 8000 Да. − polyethylene glycol diglycidyl ether with a molecular weight from 500 Da to 8000 Da.
В частных вариантах воплощения изобретения используется гиалуроновая кислота и ее соли, включающие в себя: натрия гиалуронат, калия гиалуронат, цинка гиалуронат, магния гиалуронат, железа гиалуронат. In particular embodiments of the invention, hyaluronic acid and its salts are used, including: sodium hyaluronate, potassium hyaluronate, zinc hyaluronate, magnesium hyaluronate, iron hyaluronate.
В частных вариантах воплощения изобретения молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 100 000 Да до 6 000 000 Да; в более конкретных вариантах воплощения изобретения молекулярная масса гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 1 700 000 Да до 2 800 000 Да.In particular embodiments of the invention, the molecular weight of hyaluronic acid or its salt is from 100,000 Da to 6,000,000 Da; in more specific embodiments, the molecular weight of hyaluronic acid or a salt thereof is from 1,700,000 Da to 2,800,000 Da.
В частных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 0,1% до 10%; в более конкретных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация гиалуроновой кислоты или ее соли составляет от 1% до 3%.In particular embodiments of the invention, the mass concentration of hyaluronic acid or its salt is from 0.1% to 10%; in more specific embodiments, the weight concentration of hyaluronic acid or a salt thereof is from 1% to 3%.
В частных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация модифицирующего сшивающего агента составляет от 0,1% до 10%; в более конкретных вариантах воплощения изобретения массовая концентрация модифицирующего сшивающего агента составляет от 0,5% до 5%.In particular embodiments of the invention, the mass concentration of the modifying cross-linking agent is from 0.1% to 10%; in more specific embodiments, the weight concentration of the modifying crosslinking agent is from 0.5% to 5%.
В частных вариантах воплощения изобретения стадию образования поперечных ковалентных связей осуществляют в основной среде при температуре в диапазоне от плюс 4°С до плюс 60°С. In particular embodiments of the invention, the stage of formation of cross-sectional covalent bonds is carried out in a basic environment at a temperature in the range from plus 4°C to plus 60°C.
В частных вариантах воплощения изобретения стадию создания поперечных межмолекулярных и внутримолекулярных ковалентных связей осуществляют в течение от 10 минут до 72 часов, в более конкретных вариантах воплощения изобретения – в течение от 1 часа до 24 часов.In particular embodiments of the invention, the stage of creating transverse intermolecular and intramolecular covalent bonds is carried out within 10 minutes to 72 hours, in more specific embodiments of the invention - within 1 hour to 24 hours.
В частных вариантах воплощения изобретения полученный модифицированный состав нейтрализуют до значения водородного показателя pH от 6,0 до 8,5 с использованием любой неорганической или органической кислоты; в более конкретных вариантах воплощения изобретения нейтрализация может происходить с использованием водных растворов хлороводородной кислоты, или уксусной кислоты, или лимонной кислоты, или молочной кислоты.In particular embodiments of the invention, the resulting modified composition is neutralized to a pH value of 6.0 to 8.5 using any inorganic or organic acid; in more specific embodiments, neutralization may occur using aqueous solutions of hydrochloric acid, or acetic acid, or citric acid, or lactic acid.
В частных вариантах воплощения изобретения после стадии нейтрализации добавляется аминокислота, при этом мольное соотношение сшивающего агента к аминокислоте составляет от 1:0.5 до 1:5.In particular embodiments of the invention, an amino acid is added after the neutralization step, wherein the molar ratio of cross-linking agent to amino acid is from 1:0.5 to 1:5.
В частных вариантах воплощения изобретения в качестве аминокислоты используется любая из аминокислот (за исключением пролина, который химически относится к иминокислотам, но который часто приписывают к аминокислотам), в т.ч. сульфоаминокислоты. В более конкретных вариантах воплощения изобретения в качестве аминокислоты могут использоваться: глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, тирозин, аспартат, глутамат, лизин, аргинин, гистидин, таурин.In particular embodiments of the invention, any of the amino acids is used as an amino acid (with the exception of proline, which chemically belongs to imino acids, but which is often attributed to amino acids), incl. sulfoamino acids. In more specific embodiments, the amino acid used may be: glycine, alanine, valine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, serine, threonine, cysteine, asparagine, glutamine, tyrosine, aspartate, glutamate, lysine, arginine, histidine, taurine
В частных вариантах воплощения изобретения после стадии добавления аминокислоты модифицируемый состав перемешивают при температуре от плюс 4°C до 60°C в течение от 1 часа до 24 часов.In particular embodiments of the invention, after the stage of adding an amino acid, the modified composition is stirred at a temperature from plus 4°C to 60°C for from 1 hour to 24 hours.
В частных вариантах воплощения изобретения полученный модифицированный состав подвергают диализу в растворе осмотического агента, например, физиологического буферного раствора, либо в воде для инъекций, таким образом конечное значение водородного показателя pH, ионной силы раствора и осмоляльности принимают физиологически применимые значения либо те значения, которые необходимы для конкретного медицинского применения. In particular embodiments of the invention, the resulting modified composition is dialyzed in a solution of an osmotic agent, for example, a physiological buffer solution, or in water for injection, so that the final value of pH, ionic strength of the solution and osmolality take on physiologically applicable values or those values that are necessary for specific medical use.
В частных вариантах воплощения изобретения могут использоваться дополнительные фармацевтически применимые вещества, используемые при создании фармацевтических композиций, без ограничений, таких как: консерванты, антиоксиданты, эмульгаторы, изотонические и осмотические агенты, ароматизаторы, красители, отдушки и т.д.In particular embodiments of the invention, additional pharmaceutically applicable substances used in the creation of pharmaceutical compositions can be used, without limitation, such as: preservatives, antioxidants, emulsifiers, isotonic and osmotic agents, flavors, dyes, fragrances, etc.
В частных вариантах воплощения изобретения полученный модифицируемый состав стерилизуют влажным теплом. Режим стерилизации (а именно показатели продолжительности стерилизации и температуры стерилизации) подбирается таким образом, чтобы допустимый уровень обеспечения стерильности был не менее 10-6.In particular embodiments of the invention, the resulting modified composition is sterilized with moist heat. The sterilization regime (namely, the indicators of sterilization duration and sterilization temperature) is selected in such a way that the acceptable level of sterility is at least 10 -6 .
В частных вариантах воплощения изобретения полученный модифицируемый состав стерилизуют асептически путем фильтрации через микрофильтр.In particular embodiments of the invention, the resulting modified composition is sterilized aseptically by filtration through a microfilter.
Полученным таким модифицируемый состав является нетоксичным и биосовместимым, что позволяет использовать его в различных областях медицины и ветеринарии, включающих в себя:The resulting modified composition is non-toxic and biocompatible, which allows its use in various fields of medicine and veterinary medicine, including:
1) в качестве вещества-носителя при использовании систем доставки лекарственных средств и систем контролирования высвобождения лекарственных средств, в том числе при доставке токсичных веществ в химиотерапии;1) as a carrier substance when using drug delivery systems and drug release control systems, including when delivering toxic substances in chemotherapy;
2) в качестве лубриканта и/или антиадгезионного барьера при хирургических вмешательствах;2) as a lubricant and/or anti-adhesive barrier during surgical interventions;
3) в качестве противоспаечного геля при хирургических вмешательствах;3) as an anti-adhesion gel during surgical interventions;
4) в качестве интрадермального филлера для коррекции косметических дефектов;4) as an intradermal filler for the correction of cosmetic defects;
5) в качестве протеза синовиальной жидкости при внутрисуставных инъекций;5) as a synovial fluid prosthesis for intra-articular injections;
6) в качестве протектора межклеточного вещества уротелия, в том числе при облегчении симптомов заболеваний и операционных вмешательствах;6) as a protector of the intercellular substance of the urothelium, including in alleviating the symptoms of diseases and surgical interventions;
7) в качестве офтальмологического вискоэластика и растворов при офтальмологических заболеваниях;7) as an ophthalmic viscoelastic and solutions for ophthalmic diseases;
8) в качестве материала для регенерации кожи при лечении трофических язв и длительно незаживающих ран, в том числе вызванных диабетом.8) as a material for skin regeneration in the treatment of trophic ulcers and long-term non-healing wounds, including those caused by diabetes.
Реализацию способа получения геля модифицированной гиалуроновой кислоты можно проиллюстрировать на следующих примерах.The implementation of the method for producing a modified hyaluronic acid gel can be illustrated by the following examples.
Пример 1. В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 1 г натриевой соли гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 2 800 000 Да). Затем в колбу добавили 1%-ный раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 25 мл. Проводили растворение гиалуроновой кислоты в щелочном растворе в течение 1 часа при температуре 20°С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,4 Да) массой 2,5 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20°С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции смесь нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5, и затем добавили 900 мг глицина. Смесь перемешивали в течение часа при температуре 20°С при скорости перемешивания 40 об/мин. После этого гель был помещен в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили фосфатно-солевым буфером. Диализ вели при температуре плюс 20°С, общее время диализа составило 24 часа. После диализа модифицированный состав довели до объема 50 мл фосфатно-солевым физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения, и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121°С.Example 1. 1 g of sodium salt of hyaluronic acid (molecular weight 2,800,000 Da) was placed in a round-bottomed flask (100 ml) equipped with an overhead stirrer with a gearbox. Then a 1% solution by weight of sodium hydroxide in water for injection was added to the flask in an amount of 25 ml. Hyaluronic acid was dissolved in an alkaline solution for 1 hour at a temperature of 20°C and stirring at 50-60 rpm. After complete dissolution, 1,4-butanediol diglycidyl ether (molecular weight 202.4 Da) weighing 2.5 g was added. The resulting mixture was stirred at a temperature of 20°C for 19 hours at a stirring speed of 40 rpm. After the reaction, the mixture was neutralized with a solution of hydrochloric acid with a molar concentration of 1 M to pH values from 6.0 to 8.5, and then 900 mg of glycine was added. The mixture was stirred for an hour at a temperature of 20°C with a stirring speed of 40 rpm. The gel was then placed in a sterile dialysis bag of appropriate size (pore size corresponding to the cut-off limit of 12,000 Da) and placed in a 1 L container. The container was filled with phosphate-buffered saline. Dialysis was carried out at a temperature of plus 20°C, the total dialysis time was 24 hours. After dialysis, the modified formulation was brought to a volume of 50 ml with phosphate-buffered saline solution and packaged into pre-fill syringes and capped, after which it was sterilized with moist heat with a sterilization regime of 20 min at a temperature of 121°C.
Пример 2. В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 3 г натриевой соли гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 1 700 000 Да). Затем в колбу добавили 1%-ый раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 25 мл. Проводили растворение гиалуроновой кислоты в щелочном растворе в течение 1 часа при температуре 20°С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,4 Да) массой 0,25 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20°С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции смесь нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5, и затем добавили 500 мг глутамина. Смесь перемешивали в течение часа при температуре 20°С при скорости перемешивания 40 об/мин. После этого гель был помещен в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили фосфатно-солевым буфером. Диализ вели при температуре плюс 20°С, общее время диализа составило 24 часа. После диализа модифицированный состав довели до объема 50 мл фосфатно-солевым физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения, и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121°С.Example 2. 3 g of sodium salt of hyaluronic acid (molecular weight 1,700,000 Da) was placed in a round-bottomed flask (100 ml) equipped with an overhead stirrer with a gearbox. Then a 1% solution by weight of sodium hydroxide in water for injection was added to the flask in an amount of 25 ml. Hyaluronic acid was dissolved in an alkaline solution for 1 hour at a temperature of 20°C and stirring at 50-60 rpm. After complete dissolution, 1,4-butanediol diglycidyl ether (molecular weight 202.4 Da) weighing 0.25 g was added. The resulting mixture was stirred at a temperature of 20°C for 19 hours at a stirring speed of 40 rpm. After the reaction, the mixture was neutralized with a solution of hydrochloric acid with a molar concentration of 1 M to a pH value of 6.0 to 8.5, and then 500 mg of glutamine was added. The mixture was stirred for an hour at a temperature of 20°C with a stirring speed of 40 rpm. The gel was then placed in a sterile dialysis bag of appropriate size (pore size corresponding to the cut-off limit of 12,000 Da) and placed in a 1 L container. The container was filled with phosphate-buffered saline. Dialysis was carried out at a temperature of plus 20°C, the total dialysis time was 24 hours. After dialysis, the modified formulation was brought to a volume of 50 ml with phosphate-buffered saline solution and packaged into pre-fill syringes and capped, after which it was sterilized with moist heat with a sterilization regime of 20 min at a temperature of 121°C.
Пример 3. В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 2 г натриевой соли гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 2 400 000 Да). Затем в колбу добавили 1%-ный раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 25 мл. Проводили растворение гиалуроновой кислоты в щелочном растворе в течение 1 часа при температуре 20°С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 8000 Да) массой 0,5 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20°С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции смесь нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5, и затем добавили 2,5 г глицина. Смесь перемешивали в течение часа при температуре 20°С при скорости перемешивания 40 об/мин. После этого гель был помещен в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили фосфатно-солевым буфером. Диализ вели при температуре плюс 20°С, общее время диализа составило 24 часа. После диализа модифицированный состав довели до объема 50 мл фосфатно-солевым физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения, и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121°С.Example 3. 2 g of sodium salt of hyaluronic acid (molecular weight 2,400,000 Da) was placed in a round-bottomed flask (100 ml) equipped with an overhead stirrer with a gearbox. Then a 1% solution by weight of sodium hydroxide in water for injection was added to the flask in an amount of 25 ml. Hyaluronic acid was dissolved in an alkaline solution for 1 hour at a temperature of 20°C and stirring at 50-60 rpm. After complete dissolution, polyethylene glycol diglycidyl ether (molecular weight 8000 Da) weighing 0.5 g was added. The resulting mixture was stirred at a temperature of 20°C for 19 hours at a stirring speed of 40 rpm. After the reaction, the mixture was neutralized with a solution of hydrochloric acid with a molar concentration of 1 M to pH values from 6.0 to 8.5, and then 2.5 g of glycine was added. The mixture was stirred for an hour at a temperature of 20°C with a stirring speed of 40 rpm. The gel was then placed in a sterile dialysis bag of appropriate size (pore size corresponding to the cut-off limit of 12,000 Da) and placed in a 1 L container. The container was filled with phosphate-buffered saline. Dialysis was carried out at a temperature of plus 20°C, the total dialysis time was 24 hours. After dialysis, the modified formulation was brought to a volume of 50 ml with phosphate-buffered saline solution and packaged into pre-fill syringes and capped, after which it was sterilized with moist heat with a sterilization regime of 20 min at a temperature of 121°C.
Пример 4. В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 2 г натриевой соли гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 2 400 000 Да). Затем в колбу добавили 1%-ный раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 25 мл. Проводили растворение гиалуроновой кислоты в щелочном растворе в течение 1 часа при температуре 20°С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 500 Да) массой 2,00 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20 °С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции смесь нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5, и затем добавили 10 г лизина. Смесь перемешивали в течение часа при температуре 20°С при скорости перемешивания 40 об/мин. После этого гель был помещен в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили фосфатно-солевым буфером. Диализ вели при температуре плюс 20°С, общее время диализа составило 24 часа. После диализа модифицированный состав довели до объема 50 мл фосфатно-солевым физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения, и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121°С.Example 4. 2 g of sodium salt of hyaluronic acid (molecular weight 2,400,000 Da) was placed in a round-bottomed flask (100 ml) equipped with an overhead stirrer with a gearbox. Then a 1% solution by weight of sodium hydroxide in water for injection was added to the flask in an amount of 25 ml. Hyaluronic acid was dissolved in an alkaline solution for 1 hour at a temperature of 20°C and stirring at 50-60 rpm. After complete dissolution, polyethylene glycol diglycidyl ether (molecular weight 500 Da) weighing 2.00 g was added. The resulting mixture was stirred at a temperature of 20 °C for 19 hours at a stirring speed of 40 rpm. After the reaction, the mixture was neutralized with a solution of hydrochloric acid with a molar concentration of 1 M to a pH value of 6.0 to 8.5, and then 10 g of lysine was added. The mixture was stirred for an hour at a temperature of 20°C with a stirring speed of 40 rpm. The gel was then placed in a sterile dialysis bag of appropriate size (pore size corresponding to the cut-off limit of 12,000 Da) and placed in a 1 L container. The container was filled with phosphate-buffered saline. Dialysis was carried out at a temperature of plus 20°C, the total dialysis time was 24 hours. After dialysis, the modified formulation was brought to a volume of 50 ml with phosphate-buffered saline solution and packaged into pre-fill syringes and capped, after which it was sterilized with moist heat with a sterilization regime of 20 min at a temperature of 121°C.
Пример 5. В круглодонную колбу (100 мл), снабженную верхнеприводной мешалкой с редуктором, поместили 2 г натриевой соли гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 2 400 000 Да). Затем в колбу добавили 1%-ный раствор по массе гидроксида натрия в воде для инъекций в количестве 25 мл. Проводили растворение гиалуроновой кислоты в щелочном растворе в течение 1 часа при температуре 20°С и перемешивании при 50-60 об/мин. После полного растворения добавили полиэтиленгликольдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 500 Да) массой 2,00 г и 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир (молекулярная масса 202,4 Да) массой 0,25 г. Полученную смесь перемешивали при температуре 20°С в течение 19 часов при скорости перемешивания 40 об/мин. После проведения реакции смесь нейтрализовали раствором соляной кислоты молярной концентрацией 1 М до значений показателя pH от 6,0 до 8,5, и затем добавили 300 мг аргинина. Смесь перемешивали в течение часа при температуре 20°С при скорости перемешивания 40 об/мин. После этого гель был помещен в стерильный диализный мешок соответствующего размера (размер пор соответствует пределу отсечения в 12000 Да) и поместили в емкость объемом 1 л. Емкость заполнили фосфатно-солевым буфером. Диализ вели при температуре плюс 20°C, общее время диализа составило 24 часа. После диализа модифицированный состав довели до объема 50 мл фосфатно-солевым физиологическим буферным раствором и расфасовали по шприцам, предназначенным для предварительного наполнения, и укупорили, после чего простерилизовали влажным теплом с режимом стерилизации 20 мин при температуре 121°С.Example 5. 2 g of sodium salt of hyaluronic acid (molecular weight 2,400,000 Da) was placed in a round-bottomed flask (100 ml) equipped with an overhead stirrer with a gearbox. Then a 1% solution by weight of sodium hydroxide in water for injection was added to the flask in an amount of 25 ml. Hyaluronic acid was dissolved in an alkaline solution for 1 hour at a temperature of 20°C and stirring at 50-60 rpm. After complete dissolution, polyethylene glycol diglycidyl ether (molecular weight 500 Da) weighing 2.00 g and 1,4-butanediol diglycidyl ether (molecular weight 202.4 Da) weighing 0.25 g were added. The resulting mixture was stirred at a temperature of 20 ° C for 19 hours at a stirring speed of 40 rpm. After the reaction, the mixture was neutralized with a solution of hydrochloric acid with a molar concentration of 1 M to pH values from 6.0 to 8.5, and then 300 mg of arginine was added. The mixture was stirred for an hour at a temperature of 20°C with a stirring speed of 40 rpm. The gel was then placed in a sterile dialysis bag of appropriate size (pore size corresponding to the cut-off limit of 12,000 Da) and placed in a 1 L container. The container was filled with phosphate-buffered saline. Dialysis was carried out at a temperature of plus 20°C, the total dialysis time was 24 hours. After dialysis, the modified formulation was brought to a volume of 50 ml with phosphate-buffered saline solution and packaged into pre-fill syringes and capped, after which it was sterilized with moist heat with a sterilization regime of 20 min at a temperature of 121°C.
Исследование остаточного количества сшивающего агентаStudy of residual amount of cross-linking agent
Для того чтобы определить остаточное содержание сшивающего агента, на исследование был направлен образец, полученный в соответствии с Примером 1 настоящего изобретения.In order to determine the residual content of the crosslinking agent, a sample obtained in accordance with Example 1 of the present invention was sent for testing.
Определение содержания 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира проводили методом ВЭЖХ-МС с помощью градуировочной зависимости площади пика 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира от его концентрации, общий вид которой приведен на фиг. 7.The determination of the content of 1,4-butanediol diglycidyl ether was carried out by HPLC-MS using the calibration dependence of the peak area of 1,4-butanediol diglycidyl ether on its concentration, the general form of which is shown in Fig. 7.
Пробоподготовка образца заключалась в его фильтрации. Объем вводимой пробы полученного фильтрата 20 мкл. Sample preparation of the sample consisted of its filtration. The volume of the injected sample of the resulting filtrate is 20 µl.
На основании полученных данных было установлено, что концентрация остаточного 1,4-бутандиолдиглицидилового эфира в образце, полученном в соответствии с Примером 1 настоящего изобретения, составляет 0,11 м.д., что существенно ниже требуемых 2 м.д. для безопасного клинического использования.Based on the data obtained, it was found that the concentration of residual 1,4-butanediol diglycidyl ether in the sample obtained in accordance with Example 1 of the present invention was 0.11 ppm, which was significantly lower than the required 2 ppm. for safe clinical use.
Таким образом, подтверждается достижение технического результата данного изобретения, а именно получение состава на основе модифицированной поперечно-сшитой гиалуроновой кислоты путем взаимодействия со сшивающими агентами, который обладает низкой токсичностью за счет наличия технологических стадий очистки и нейтрализации сшивающего агента.Thus, the achievement of the technical result of this invention is confirmed, namely the production of a composition based on modified cross-linked hyaluronic acid by interaction with cross-linking agents, which has low toxicity due to the presence of technological stages of purification and neutralization of the cross-linking agent.
Хроматограммы ВЭЖХ-МС образцов «ГК филлер 3» и стандартного раствора БДДЭ, спектр МС/МС БДДЭ, полученный в режиме ионизации электрораспылением в положительных ионах, приведены на фиг. 2 - фиг.6.HPLC-MS chromatograms of samples of “HA filler 3” and a standard solution of BDDE, the MS/MS spectrum of BDDE obtained in the electrospray ionization mode in positive ions are shown in Fig. 2 - Fig.6.
Claims (16)
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021116454A RU2021116454A (en) | 2022-12-07 |
| RU2804641C2 true RU2804641C2 (en) | 2023-10-03 |
Family
ID=
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013021249A1 (en) * | 2011-08-10 | 2013-02-14 | Glycores 2000 S.R.L. | Degradation-resistant cross-linked, low-molecular-weight hyaluronate |
| RU2588620C2 (en) * | 2010-12-10 | 2016-07-10 | Басф Се | Aqueous polishing composition and method for chemical-mechanical polishing of substrates, containing film based on silicon oxide dielectric and based on polycrystalline silicon |
| KR101855878B1 (en) * | 2015-07-24 | 2018-05-10 | 한양대학교 산학협력단 | Hydrogel Composition for Dermal Fillers |
| US20190055368A1 (en) * | 2017-08-16 | 2019-02-21 | Hangzhou Singclean Medical Products Co., Ltd. | Method of Preparing Single-Phase Modified Sodium Hyaluronate Gel |
| RU2712641C2 (en) * | 2014-11-13 | 2020-01-30 | Мерц Фарма Гмбх Унд Ко. Кгаа | Dermal filler based on cross-linked hyaluronic acid and carboxymethyl cellulose as lubricant |
| RU2733444C2 (en) * | 2016-03-24 | 2020-10-01 | Мерц Фарма Гмбх Энд Ко. Кгаа | Modified hyaluronic acid, method for production thereof and use thereof |
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2588620C2 (en) * | 2010-12-10 | 2016-07-10 | Басф Се | Aqueous polishing composition and method for chemical-mechanical polishing of substrates, containing film based on silicon oxide dielectric and based on polycrystalline silicon |
| WO2013021249A1 (en) * | 2011-08-10 | 2013-02-14 | Glycores 2000 S.R.L. | Degradation-resistant cross-linked, low-molecular-weight hyaluronate |
| RU2712641C2 (en) * | 2014-11-13 | 2020-01-30 | Мерц Фарма Гмбх Унд Ко. Кгаа | Dermal filler based on cross-linked hyaluronic acid and carboxymethyl cellulose as lubricant |
| KR101855878B1 (en) * | 2015-07-24 | 2018-05-10 | 한양대학교 산학협력단 | Hydrogel Composition for Dermal Fillers |
| RU2733444C2 (en) * | 2016-03-24 | 2020-10-01 | Мерц Фарма Гмбх Энд Ко. Кгаа | Modified hyaluronic acid, method for production thereof and use thereof |
| US20190055368A1 (en) * | 2017-08-16 | 2019-02-21 | Hangzhou Singclean Medical Products Co., Ltd. | Method of Preparing Single-Phase Modified Sodium Hyaluronate Gel |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GISELA CRISTINA DA CUNHA MENDES, TERESA RIBEIRO DA SILVA BRANDÃO AND CRISTINA LUISA MIRANDA SILVA "Ethylene oxide potential toxicity", pp. 323-328, опубл. 09.01.2014, https://doi.org/10.1586/17434440.5.3.323. * |
| SCHANTE, C.E., ZUBER, G., HERLIN, C., & VANDAMME, T.F. "Improvement of hyaluronic acid enzymatic stability by the grafting of amino-acids", Carbohydrate Polymers, 87(3), 25.10.2011, pp.2211-2216. doi:10.1016/j.carbpol.2011.10.050 (реферат; с.2213, прав.кол. - с.2214, лев.кол.; с.2215, прав.кол.). * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7651702B2 (en) | Crosslinking hyaluronan and chitosanic polymers | |
| JP6106686B2 (en) | Water-insoluble gel composition and method for producing the same | |
| US7226972B2 (en) | Process for cross-linking hyaluronic acid to polymers | |
| CN106890360B (en) | Sterilized composition comprising at least one hyaluronic acid and magnesium ascorbyl phosphate | |
| US8455465B2 (en) | Heat sterilised injectable composition of hyaluronic acid or one of the salts thereof, polyols and lidocaine | |
| JP5657545B2 (en) | Method for preparing an injectable hydrogel crosslinked in an injectable container | |
| AU2013276343B2 (en) | Composition, in an aqueous medium, including at least one hyaluronic acid and at least one sucrose octasulphate water-soluble salt | |
| EP3381438A1 (en) | Composition for injection of hyaluronic acid, containing hyaluronic acid derivative and dna fraction, and use thereof | |
| JP6446462B2 (en) | Hyaluronic acid composition containing mepivacaine | |
| EP3107587B1 (en) | Dermocosmetic filler and uses thereof for aesthetic purposes | |
| US20150297731A1 (en) | Thermosensitive injectable glaucoma drug carrier gel and the fabricating method thereof | |
| JP2022533772A (en) | Chitosan and its uses | |
| US20220233745A1 (en) | Resorbable implantable device based on crosslinked glycosaminoglycans, and process for the preparation thereof | |
| CN105324486B (en) | Method for producing hyaluronic acid and anti-adhesive composition containing hyaluronic acid produced by the production method | |
| US11208501B2 (en) | Process for depleting epoxide species in crosslinked polysaccharide gel compositions and compositions obtained thereby | |
| RU2804641C2 (en) | Method for obtaining modified hyaluronic acid and its salts | |
| JP6561133B2 (en) | Biocompatible composition and method for producing the same | |
| KR102226724B1 (en) | Preparing Method of Hyaluronic Acid Hydrogel by Physical Treatment | |
| RU2759295C1 (en) | Method for obtaining non-toxic gels based on modified carboxymethylcellulose and their use in medicine | |
| US10588922B2 (en) | Method for preparing an injectable cross-linked hydrogel, hydrogel obtained; and use of the obtained hydrogel | |
| RU2778332C2 (en) | Absorbable implanted devices based on cross-linked glycosaminoglycans, and their production method | |
| AU2004229592B2 (en) | Cross-linked polysaccharide composition | |
| WO2021133190A1 (en) | Method for producing modified hyaluronan |