RU2803259C1

RU2803259C1 - Metabiotic composition based on metabolites of bacillus subtilis

Info

Publication number: RU2803259C1
Application number: RU2022123987A
Authority: RU
Inventors: Александр Владимирович Синица
Original assignee: Александр Владимирович Синица
Filing date: 2022-09-09
Publication date: 2023-09-11

Abstract

FIELD: biotechnology and medicine.

SUBSTANCE: metabiotic composition for normalizing the qualitative and quantitative composition of the intestinal microflora is proposed. The claimed composition includes metabolites of the probiotic strain B. subtilis with a molecular weight of 5–100 kDa and a filler, while the ratio of components, wt. %: metabolites of Bacillus subtilis is 0.6–5; filler is 95–99.4. A method of obtaining metabolites of Bacillus subtilis for their subsequent use in a metabolic composition is proposed. The method includes growing Bacillus subtilis in a liquid nutrient medium; centrifuging the culture suspension in a flow centrifuge to obtain a culture fluid; ultrafiltration of the resulting culture fluid with a cutoff of 100 kDa to obtain permeate; ultrafiltration of the resulting permeate with a cut-off threshold of 5 kDa. The use of the claimed composition for the treatment of post-COVID syndrome is proposed. The claimed composition has a broad antagonistic effect against pathogenic and opportunistic microorganisms, as well as an immunomodulatory effect.

EFFECT: intake of the claimed composition has a positive effect on the state of the gastrointestinal tract and on the psycho-emotional state of patients with post-COVID syndrome.

17 cl, 4 dwg, 4 tbl, 7 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИTECHNICAL FIELD

[0001] Настоящие изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к композициям для лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта на основе метаболитов пробиотических микроорганизмов. Настоящее изобретение может быть использовано в пищевой промышленности, ветеринарии и медицине, в том числе для терапии постковидного синдрома.[0001] The present invention relates to biotechnology and medicine, namely to compositions for the treatment and prevention of diseases of the gastrointestinal tract based on metabolites of probiotic microorganisms. The present invention can be used in the food industry, veterinary medicine and medicine, including for the treatment of post-Covid syndrome.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART

[0002] Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) млекопитающих, в том числе человека, является местом обитания триллионов микроорганизмов, таких как бактерии, археи, грибки, простейшие и вирусы, которые в совокупности называются микробиотой, или микрофлорой кишечника (Shah et al., 2021). Нарушения качественного и/или количественного состава микрофлоры кишечника связаны с развитием различных заболеваний, таких как острые инфекционные заболевания или хронические болезни, например, болезнь Крона или острый язвенный колит. Представляя экстракорпоральный орган, микрофлора организма выполняет или регулирует многообразные функции по поддержанию нормального гомеостаза (Шендеров, 1998). Микрофлора кишечника обеспечивает колонизационную резистентность, формирование иммунного ответа, переваривание пищи, регуляцию моторной функции кишечника, дезинтоксикацию. Отсутствие колонизационной резистентности приводит к значительному ослаблению противоинфекционной защиты организма, увеличению численности и спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а, следовательно, к повышению восприимчивости организма к возникновению инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы (Бондаренко с соавт, 2003; Петровская, 1982; Бухарин, 1999), развитию эндогенных инфекций, суперинфекций различных локализаций (Ленцнер, 1987; Юшков, 2002; Минушкин с соавт., 1999).[0002] The gastrointestinal tract (GIT) of mammals, including humans, is home to trillions of microorganisms such as bacteria, archaea, fungi, protozoa and viruses, which are collectively called the microbiota, or gut flora (Shah et al., 2021). Violations of the qualitative and/or quantitative composition of the intestinal microflora are associated with the development of various diseases, such as acute infectious diseases or chronic diseases, for example, Crohn's disease or acute ulcerative colitis. Representing an extracorporeal organ, the microflora of the body performs or regulates diverse functions to maintain normal homeostasis (Shenderov, 1998). The intestinal microflora provides colonization resistance, the formation of an immune response, food digestion, regulation of intestinal motor function, and detoxification. The absence of colonization resistance leads to a significant weakening of the body's anti-infective defense, an increase in the number and range of pathogenic and opportunistic microorganisms, and, consequently, to an increase in the body's susceptibility to the occurrence of infectious diseases of a bacterial and viral nature (Bondarenko et al., 2003; Petrovskaya, 1982; Bukharin , 1999), the development of endogenous infections, superinfections of various localizations (Lenzner, 1987; Yushkov, 2002; Minushkin et al., 1999).

[0003] Нарушение микрофлоры кишечника может быть вызвано такими факторами, как стресс, физические и психоэмоциональные нагрузки, курение, несбалансированное питание, а также прием антибиотиков (Shah et al., 2021). В ряде случаев при изменении образа жизни возможно самопроизвольное восстановление состава микрофлоры кишечника (Шендеров, 1998; Бондаренко с соавт, 2003; Крамарь 2002). Однако после применения антибиотиков может развиться дисбактериоз, вызванный нарушением качественного и количественного состава микрофлоры кишечника. Лечение дисбактериоза в подобных случаях связано с применением различных иммунобиологических препаратов.[0003] Disturbance of the intestinal microflora can be caused by factors such as stress, physical and psycho-emotional stress, smoking, unbalanced diet, and antibiotic use (Shah et al., 2021). In some cases, with a change in lifestyle, spontaneous restoration of the composition of the intestinal microflora is possible (Shenderov, 1998; Bondarenko et al., 2003; Kramar 2002). However, after the use of antibiotics, dysbiosis may develop, caused by a violation of the qualitative and quantitative composition of the intestinal microflora. Treatment of dysbiosis in such cases is associated with the use of various immunobiological drugs.

[0004] Наиболее популярными иммунобиологическими препаратами, используемыми для лечения и профилактики дисбактериоза, относятся пробиотики, включающие живые пробиотические микроорганизмы. Такие микроорганизмы проявляют антагонистическую активность в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Они способны синтезировать вещества, обладающие противомикробными свойствами, конкурировать с патогенными микроорганизмами за питательные вещества и участки микробной адгезии, модифицировать токсины или рецепторы токсинов (Воробейчиков с соавт., 2005).[0004] The most popular immunobiological drugs used for the treatment and prevention of dysbiosis are probiotics, which include live probiotic microorganisms. Such microorganisms exhibit antagonistic activity against pathogenic and opportunistic microflora. They are capable of synthesizing substances with antimicrobial properties, competing with pathogenic microorganisms for nutrients and sites of microbial adhesion, and modifying toxins or toxin receptors (Vorobeychikov et al., 2005).

[0005] В качестве пробиотических микроорганизмов часто используются молочнокислые бифидо- и лактобактерии, представляющие основу микрофлоры кишечника. Эти бактерии выделяют большое количество кислых продуктов. Создаваемая в результате кислая среда является неблагоприятной для развития патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Кроме того бифидо- и лактобактерии выделяют лизоцим, бактериоцины, спирты, интерфероны, которые ингибируют рост различных патогенов, препятствуя их проникновению в верхние отделы ЖКТ. При развитии дисбактериоза качественный и количественный состав анаэробных бифидо- и лактобактерий претерпевает нарушения в первую очередь.[0005] Lactic acid bifidobacteria and lactobacilli, which represent the basis of the intestinal microflora, are often used as probiotic microorganisms. These bacteria produce large amounts of acidic products. The resulting acidic environment is unfavorable for the development of pathogenic and opportunistic microorganisms. In addition, bifidobacteria and lactobacilli secrete lysozyme, bacteriocins, alcohols, interferons, which inhibit the growth of various pathogens, preventing their penetration into the upper gastrointestinal tract. With the development of dysbacteriosis, the qualitative and quantitative composition of anaerobic bifidobacteria and lactobacilli is the first to be disrupted.

[0006] Для лечения и профилактики дисбактериоза популярны препараты «Линекс» (фирма «Лек», Словения) и «Бифиформ» («Ферросан Интернейшнл А/С», Дания). «Линекс» включает живые лактобактерии Lactobacillus acidophilus, бифидобактерии Bifidobacterium infantis и энтерококки Enterococcus faecium. «Бифиформ» включает бифидобактерии Bifidobacterium longum (штамм АТСС 15707) и энтерококки Enterococcus faecium (штамм SF68). В составы указанных препаратов включены штаммы бактерий с достаточно высоким уровнем антибиотикорезистентности и зачастую рекомендуют их применение одновременно с антибиотиками. Однако опыт использования указанных препаратов в клинической практике с широким спектром антибиотиков при рекомендуемых схемах их назначения показал, что большая часть бактерий при таком сочетанном назначении гибнет, а активность попавших в кишечник в жизнеспособном состоянии чрезвычайно низка. Кроме того, препараты, включающие молочнокислые бактерии, отличаются отсутствием стабильности при длительном хранении, что ведет к снижению эффективности лечебно-профилактических процедур.[0006] For the treatment and prevention of dysbiosis, the drugs “Linex” (company “Lek”, Slovenia) and “Bifiform” (Ferrosan International A/S, Denmark) are popular. "Linex" includes live lactobacilli Lactobacillus acidophilus, bifidobacterium Bifidobacterium infantis and enterococci Enterococcus faecium. “Bifiform” includes bifidobacteria Bifidobacterium longum (strain ATCC 15707) and enterococci Enterococcus faecium (strain SF68). The compositions of these drugs include strains of bacteria with a fairly high level of antibiotic resistance and their use simultaneously with antibiotics is often recommended. However, the experience of using these drugs in clinical practice with a wide range of antibiotics with recommended dosage regimens has shown that most of the bacteria die with such a combined prescription, and the activity of those entering the intestines in a viable state is extremely low. In addition, preparations containing lactic acid bacteria are characterized by a lack of stability during long-term storage, which leads to a decrease in the effectiveness of treatment and prophylactic procedures.

[0007] Более стабильными при хранении являются пробиотики, включающие спорообразующие бактерии. Популярными для создания пробиотиков являются спорообразующие пробиотические штаммы Bacillus subtilis (В. subtilis). Например, известна пищевая добавка, включающая пробиотический штамм В. subtilis subsp. inaquosorum NRRL B-67989 (DE111). Добавка может включать один или несколько сухих носителей, например, олигофруктозу (US 20210315945 A1; опубл. 14.10.2021; МПК: A61K 35/742, A61K 9/00, А61Р 3/04). Известна композиция, включающая штамм В. subtilis QST713. Композиция также может включать пребиотики, например, инулин и/или олигофруктозу (ЕР 2348880 В1; опубл. 22.10.2014; МПК: A61K 23/00, A61K 23/18). Описано использование штамма В. subtilis АТСС РТА-6737 для профилактики и лечения диареи и воспалительного кишечного заболевания. При этом В. subtilis АТСС РТА-6737 может применяться в комбинации с пребиотиком инулином (RU 2412241; опубл. 20.02.2011; МПК: A61K 35/742, A61K 38/16, А61Р 1/00, C12N 1/21, A61K 35/74, C12N 1/20, C12R 1/07). Однако использование в составе указанных композиций живых микроорганизмов затрудняет или исключает использование в комплексной терапии со многими антибиотиками.[0007] Probiotics that include spore-forming bacteria are more shelf stable. Spore-forming probiotic strains of Bacillus subtilis (B. subtilis) are popular for creating probiotics. For example, a food supplement is known that includes a probiotic strain of B. subtilis subsp. inaquosorum NRRL B-67989 (DE111). The additive may include one or more dry carriers, for example, oligofructose (US 20210315945 A1; publ. 10/14/2021; IPC: A61K 35/742, A61K 9/00, A61P 3/04). A known composition includes strain B. subtilis QST713. The composition may also include prebiotics, for example, inulin and/or oligofructose (EP 2348880 B1; published 10/22/2014; IPC: A61K 23/00, A61K 23/18). The use of the B. subtilis strain ATCC PTA-6737 for the prevention and treatment of diarrhea and inflammatory bowel disease is described. In this case, B. subtilis ATCC RTA-6737 can be used in combination with the prebiotic inulin (RU 2412241; published 02.20.2011; IPC: A61K 35/742, A61K 38/16, A61P 1/00, C12N 1/21, A61K 35 /74, C12N 1/20, C12R 1/07). However, the use of living microorganisms in these compositions complicates or precludes their use in complex therapy with many antibiotics.

[0008] Одним из перспективных направлений лечения и профилактики дисбактериоза, особенно вызванного антибиотиками, является применение метабиотиков - препаратов, которые содержат не живые пробиотические микроорганизмы, а их метаболиты (Шендеров, 2019). Например, известен препарат «Бактистатин», включающий стерилизованную культуральную жидкость, содержащую метаболиты Bacillus subtilis (RU 2287335 C1, опубл. 20.11.2006; МПК: А61К 35/74; А61Р 1/00). Также известна композиция, включающая стерилизованные высушенные культуральные жидкости, содержащие метаболиты пробиотических штаммов Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335, Enterococcus faecium L-3, Lactobacillus delbrueckii TS1-06, бактерий Lactobacillus fermentum TS3-06 (RU 2589818 C1, опубл. 10.07.2016; МПК: A61K 35/02; A61K 35/74; A61K 36/899; A61K 47/48; A61K 9/48). Указанные препарат и композиция нормализуют количественный и качественный состав микрофлоры кишечника за счет селективного стимулирования роста и размножения бифидо- и лактобактерий, а также специфической антагонистической активности в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Однако помимо полезных метаболитов пробиотических микроорганизмов культуральные жидкости могут включать вещества, вредные или, как минимум, бесполезные для симбиотической микрофлоры. Это может снижать эффективность метабиотических препаратов на основе культуральных жидкостей.[0008] One of the promising areas for the treatment and prevention of dysbiosis, especially caused by antibiotics, is the use of metabiotics - drugs that contain not live probiotic microorganisms, but their metabolites (Shenderov, 2019). For example, the drug “Bactistatin” is known, including a sterilized cultural liquid containing metabolites of Bacillus subtilis (RU 2287335 C1, published November 20, 2006; IPC: A61K 35/74; A61P 1/00). A composition is also known, including sterilized dried cultural liquids containing metabolites of probiotic strains Bacillus subtilis VKPM No. B-2335, Enterococcus faecium L-3, Lactobacillus delbrueckii TS1-06, bacteria Lactobacillus fermentum TS3-06 (RU 2589818 C1, published 07/10/2016 ; IPC: A61K 35/02; A61K 35/74; A61K 36/899; A61K 47/48; A61K 9/48). The specified drug and composition normalize the quantitative and qualitative composition of the intestinal microflora due to selective stimulation of the growth and reproduction of bifidobacteria and lactobacilli, as well as specific antagonistic activity against a wide range of pathogenic and opportunistic microorganisms. However, in addition to beneficial metabolites of probiotic microorganisms, culture liquids may contain substances that are harmful or, at a minimum, useless for the symbiotic microflora. This may reduce the effectiveness of metabiotic preparations based on culture fluids.

[0009] В связи с вышесказанным представляется полезным создание эффективной метабиотической композиции для нормализации качественного и количественного состава микрофлоры кишечника, особенно в условиях применения антибиотиков.[0009] In connection with the above, it seems useful to create an effective metabiotic composition to normalize the qualitative and quantitative composition of the intestinal microflora, especially under conditions of the use of antibiotics.

ТЕРМИНЫ И СОКРАЩЕНИЯTERMS AND ABBREVIATIONS

[0010] Дисбактериоз это качественное и/или количественное изменение бактериальной микрофлоры в организме, перемещение различных ее представителей в несвойственные им места обитания, сопровождающееся метаболическими и иммунными нарушениями. Причем указанные нарушения не исчезают после устранения неблагоприятного фактора, вызвавшего дисбактериоз. Чаще всего под дисбактериозом подразумевают нарушение микрофлоры кишечника (Хурса с соавт., 2017; Жучкова, 2015).[0010] Dysbacteriosis is a qualitative and/or quantitative change in the bacterial microflora in the body, the movement of its various representatives to unusual habitats, accompanied by metabolic and immune disorders. Moreover, these disorders do not disappear after eliminating the unfavorable factor that caused dysbacteriosis. Most often, dysbiosis refers to a violation of the intestinal microflora (Khursa et al., 2017; Zhuchkova, 2015).

[0011] Культуральная жидкость - жидкая среда, получаемая при культивировании различных про- и эукариотических клеток in vitro и содержащая остаточные питательные вещества и продукты метаболизма этих клеток (Тарантула, 2005).[0011] Culture fluid is a liquid medium obtained by cultivating various pro- and eukaryotic cells in vitro and containing residual nutrients and metabolic products of these cells (Tarantula, 2005).

[0012] Культуральная суспензия жидкая среда, получаемая при культивировании различных про- и эукариотических клеток in vitro и содержащая культивируемые клетки и/или споры.[0012] Culture suspension is a liquid medium obtained by culturing various pro- and eukaryotic cells in vitro and containing cultured cells and/or spores.

[0013] Метабиотики - вещества, являющиеся структурными компонентами пробиотических микроорганизмов и/или их метаболитов, которые способны оптимизировать физиологические функции, метаболические, эпигенетические, информационные, регуляторные, транспортные, иммунные, нейрогормональные, и/или поведенческие реакции, связанные с деятельностью симбиотической (индигенной) микрофлоры организма-хозяина (Шендеров с соавт., 2018).[0013] Metabiotics are substances that are structural components of probiotic microorganisms and/or their metabolites that are capable of optimizing physiological functions, metabolic, epigenetic, informational, regulatory, transport, immune, neurohormonal, and/or behavioral reactions associated with the activity of symbiotic (indigenous) ) microflora of the host organism (Shenderov et al., 2018).

[0014] Микрофлора (микробиота) - совокупность различных видов микроорганизмов, населяющих определенную среду обитания. Постоянно живущие в симбиозе с хозяином микроорганизмы называются нормальной, или симбиотической, микрофлорой (Фирсов, 2006 г.). В данном тексте термин «микрофлора» относится к микрофлоре кишечника.[0014] Microflora (microbiota) is a collection of different types of microorganisms that inhabit a certain habitat. Microorganisms that constantly live in symbiosis with the host are called normal, or symbiotic, microflora (Firsov, 2006). In this text, the term “microflora” refers to the intestinal microflora.

[0015] Пермеат - фаза, прошедшая через мембрану в процессе мембранного разделения, основанного на преимущественной проницаемости одного или нескольких компонентов жидкой либо газовой смеси, а также коллоидной системы, через разделительную перегородку-мембрану. При этом задержанная фаза называется концентратом (Химическая энциклопедия, 1988).[0015] Permeate is a phase that has passed through a membrane in the process of membrane separation, based on the preferential permeability of one or more components of a liquid or gas mixture, as well as a colloidal system, through a dividing partition membrane. In this case, the delayed phase is called a concentrate (Chemical Encyclopedia, 1988).

[0016] Пребиотики - физиологически функциональные пищевые ингредиенты, обеспечивающие благоприятное воздействие на организм человека в результате избирательной стимуляции роста и/или повышения биологической активности нормальной микрофлоры кишечника (ГОСТ Р 52349-2005, Gibson et al., 2017).[0016] Prebiotics are physiologically functional food ingredients that provide a beneficial effect on the human body as a result of selective stimulation of growth and/or increased biological activity of normal intestinal microflora (GOST R 52349-2005, Gibson et al., 2017).

[0017] Пробиотики - функциональный пищевой ингредиент в виде полезных для человека непатогенных и нетоксикогенных живых микроорганизмов, обеспечивающий при систематическом употреблении в пищу в виде препаратов или в составе пищевых продуктов благоприятное воздействие на организм человека в результате нормализации состава и/или повышения биологической активности нормальной микрофлоры кишечника (ГОСТ Р 52349-2005).[0017] Probiotics are a functional food ingredient in the form of non-pathogenic and non-toxicogenic living microorganisms beneficial to humans, which, when systematically consumed in the form of preparations or as part of food products, provides a beneficial effect on the human body as a result of normalizing the composition and/or increasing the biological activity of normal microflora intestines (GOST R 52349-2005).

[0018] Тангенциальная ультрафильтрация - ультрафильтрация, в процессе которой фильтруемая жидкость движется параллельно мембране.[0018] Tangential ultrafiltration - ultrafiltration during which the filtered liquid moves parallel to the membrane.

[0019] Ультрафильтрация - процесс мембранного разделения, а также фракционирования и концентрирования веществ, осуществляемый путем фильтрования жидкости под действием разности давлений до и после мембраны. При этом размер выделяемых частиц (т.е. частицы какого размера не проходят через фильтр, а остаются в концентрате) составляет приблизительно 0,001-0,05 мкм (5-500 кДа).[0019] Ultrafiltration is a process of membrane separation, as well as fractionation and concentration of substances, carried out by filtering a liquid under the influence of a pressure difference before and after the membrane. In this case, the size of the released particles (i.e., what size particles do not pass through the filter, but remain in the concentrate) is approximately 0.001-0.05 microns (5-500 kDa).

[0020] БГКП бактерии группы кишечной палочки[0020] Coliform bacteria of the Escherichia coli group

[0021] ГХЦГ - гексахлоран C₆H₆Cl₆, смесь восьми стереоизомеров 1,2,3,4,5,6-гексахлорциклогексана[0021] HCH - hexachlorane C ₆ H ₆ Cl ₆ , a mixture of eight stereoisomers of 1,2,3,4,5,6-hexachlorocyclohexane

[0022] ДДТ - 1,1,1-трихлор-2,2-бис(4-хлорфенилэтан), или трихлорметилди(п-хлорфенил)метан)[0022] DDT - 1,1,1-trichloro-2,2-bis(4-chlorophenylethane), or trichloromethyldi(p-chlorophenyl)methane)

[0023] ЖКТ - желудочно-кишечный тракт[0023] Gastrointestinal tract - gastrointestinal tract

[0024] кДа - килодальтон[0024] kDa - kilodalton

[0025] КМАФАнМ - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов[0025] KMAFAnM - the number of mesophilic aerobic and facultative anaerobic microorganisms

[0026] КОЕ - колониеобразующая единица[0026] CFU - colony forming unit

[0027] В. subtilis - Bacillus subtilis[0027] B. subtilis - Bacillus subtilis

[0028] Е. coli - Escherichia coli[0028] E. coli - Escherichia coli

[0029] GSRS - Gastrointestinal Symptom Rating Scale[0029] GSRS - Gastrointestinal Symptom Rating Scale

[0030] CD64 - мембранный белок Fc-гамма-рецептор 1, моноцитарный маркер, также провоспалительный маркер макрофагов[0030] CD64 - membrane protein Fc-gamma receptor 1, monocyte marker, also pro-inflammatory marker of macrophages

[0031] IL1b - интерлейкин 1 бета, провоспалительный цитокин[0031] IL1b - interleukin 1 beta, pro-inflammatory cytokine

[0032] IL6 интерлейкин 6, про- и противовоспалительный цитокин, фактор регенерации, фактор активации макрофагов, фактор стимуляции лимфоцитов[0032] IL6 interleukin 6, pro- and anti-inflammatory cytokine, regeneration factor, macrophage activating factor, lymphocyte stimulating factor

[0033] IL10 - интерлейкин 10, противовоспалительный цитокин[0033] IL10 - interleukin 10, anti-inflammatory cytokine

[0034] TNFa - фактор некроза опухолей альфа, фактор активации макрофагов.[0034] TNFa - tumor necrosis factor alpha, macrophage activating factor.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

[0035] Задачей настоящего изобретения является создание композиции для лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта, вызванных дисбактериозом кишечника.[0035] The objective of the present invention is to create a composition for the treatment and prevention of diseases of the gastrointestinal tract caused by intestinal dysbiosis.

[0036] Данная задача решается заявляемым изобретением за счет достижения такого технического результата как создание композиции, обладающей широким антагонистическим действием в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а также иммуномодулирующим потенциалом.[0036] This problem is solved by the claimed invention by achieving such a technical result as the creation of a composition that has a broad antagonistic effect against pathogenic and opportunistic microorganisms, as well as immunomodulatory potential.

[0037] Заявленный технический результат достигается за счет того, что заявленная композиция включает метаболиты В. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа, а также наполнитель. При этом соотношение компонентов в мас. %:[0037] The claimed technical result is achieved due to the fact that the claimed composition includes metabolites of B. subtilis with a molecular weight of 5-100 kDa, as well as a filler. In this case, the ratio of components in wt. %:

метаболиты Bacillus subtilis - 0,6-5metabolites of Bacillus subtilis - 0.6-5

наполнитель - 95-99,4filler - 95-99.4

[0038] Метаболиты представляют собой вещества с молекулярным весом 5-100 кДа, полученные из культуральной жидкости пробиотического штамма В. subtilis. В предпочтительном варианте реализации пробиотический штамм В. subtilis представляет собой В. subtilis ВКМ B-3536D. Метаболиты В. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа способны селективно подавлять рост широкого ряда патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Благодаря отсутствию живых микроорганизмов, заявленная композиция не теряет эффективности при сочетанном приеме с антибиотиками, что позволяет использовать ее для лечения и профилактики дисбактериоза для широкого круга пациентов.[0038] Metabolites are substances with a molecular weight of 5-100 kDa obtained from the culture fluid of the probiotic strain of B. subtilis. In a preferred embodiment, the probiotic strain of B. subtilis is B. subtilis VKM B-3536D. Metabolites of B. subtilis with a molecular weight of 5-100 kDa are capable of selectively inhibiting the growth of a wide range of pathogenic and opportunistic microorganisms. Due to the absence of living microorganisms, the claimed composition does not lose effectiveness when taken in combination with antibiotics, which allows it to be used for the treatment and prevention of dysbiosis for a wide range of patients.

[0039] Наполнитель представляет собой одно или несколько веществ, которые могут способствовать сохранению целостности композиции, сохранению биологической активности указанных метаболитов и/или могут оказывать полезный физиологический эффект, усиливая полезное действие композиции.[0039] An excipient is one or more substances that may help maintain the integrity of the composition, maintain the biological activity of said metabolites, and/or may have a beneficial physiological effect by enhancing the beneficial effects of the composition.

[0040] В предпочтительном варианте реализации заявленная композиция в качестве наполнителя включает один или несколько пребиотиков, которые могут представлять собой ди-, олиго- и полисахариды. В еще более предпочтительном варианте реализации один или несколько пребиотиков могут иметь растительное происхождение. Например, пребиотики могут быть представлены такими полифруктозанами, как, инулин, олигофруктоза или их смесь. Пребиотики стимулируют рост симбиотической микрофлоры кишечника, оказывают иммуномодулирующее и гепатопротекторное действие.[0040] In a preferred embodiment, the claimed composition as a filler includes one or more prebiotics, which can be di-, oligo- and polysaccharides. In an even more preferred embodiment, one or more prebiotics may be of plant origin. For example, prebiotics can be represented by polyfructosans such as inulin, oligofructose, or a mixture thereof. Prebiotics stimulate the growth of symbiotic intestinal microflora and have an immunomodulatory and hepatoprotective effect.

[0041] Технический результат также достигается за счет разработки доступного способа получения метаболитов В. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа, для их последующего применения в заявленной композиции. Способ включает следующие этапы:[0041] The technical result is also achieved through the development of an accessible method for obtaining B. subtilis metabolites with a molecular weight of 5-100 kDa, for their subsequent use in the claimed composition. The method includes the following steps:

а) выращивание В. subtilis в жидкой питательной среде, имеющей исходный рН 7,0±0,2. В предпочтительном варианте реализации проводят глубинное выращивание в ферментере с коэффициентом заполнения 60-70% при температуре 36-38°С при постоянном перемешивании и аэрации. При этом выращивание заканчивают, когда рН культуральной суспензии достигает 8,5-8,9. Такой рН соответствует максимальной концентрации метаболитов В. subtilis в культуральной суспензии. Указанный способ выращивания позволяет максимально эффективно использовать оборудование для получения метаболитов В. subtilis;a) growing B. subtilis in a liquid nutrient medium having an initial pH of 7.0±0.2. In a preferred embodiment, deep cultivation is carried out in a fermenter with a filling factor of 60-70% at a temperature of 36-38°C with constant stirring and aeration. In this case, cultivation is completed when the pH of the culture suspension reaches 8.5-8.9. This pH corresponds to the maximum concentration of B. subtilis metabolites in the culture suspension. This method of cultivation allows for the most efficient use of equipment for obtaining metabolites of B. subtilis;

б) путем центрифугирования культуральной суспензии на проточной центрифуге отделяют клетки от культуральной жидкости;b) by centrifuging the culture suspension in a flow centrifuge, cells are separated from the culture liquid;

в) путем ультрафильтрации полученной культуральной жидкости с порогом отсечения 100 кДа получают пермеат, включающий метаболиты с молекулярным весом 0-100 кДа. В предпочтительном варианте реализации применяют тангенциальную ультрафильтрацию. При этом ультрафильтрацию завершают при снижении скорости фильтрации в 2-3 раза. Указанное снижение скорости фильтрации соответствует моменту получения пермеата с оптимальным содержанием метаболитов. Возможность сориентироваться по скорости фильтрации упрощает процесс получения целевых метаболитов;c) by ultrafiltration of the resulting culture liquid with a cutoff threshold of 100 kDa, a permeate is obtained, including metabolites with a molecular weight of 0-100 kDa. In a preferred embodiment, tangential ultrafiltration is used. In this case, ultrafiltration is completed when the filtration rate is reduced by 2-3 times. The indicated decrease in filtration rate corresponds to the moment of obtaining permeate with the optimal content of metabolites. The ability to navigate by filtration speed simplifies the process of obtaining target metabolites;

г) путем ультрафильтрации полученного пермеата с порогом отсечения 5 кДа с получением целевых метаболитов. В предпочтительном варианте реализации также применяют тангенциальную ультрафильтрацию, которую завершают при снижении скорости фильтрации в 2-3 раза.d) by ultrafiltration of the resulting permeate with a cutoff threshold of 5 kDa to obtain target metabolites. In a preferred embodiment, tangential ultrafiltration is also used, which is completed when the filtration rate is reduced by 2-3 times.

[0042] Заявленный способ обеспечивает получение метаболитов в количествах, необходимых для производства заявленной композиции в промышленных масштабах.[0042] The claimed method ensures the production of metabolites in quantities necessary for the production of the claimed composition on an industrial scale.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙDESCRIPTION OF DRAWINGS

[0043] На Фиг. 1 представлены результаты исследования иммуномодулирующих свойств метаболитов В. subtilis с молекулярным весом 5-100кДа.[0043] In FIG. 1 presents the results of a study of the immunomodulatory properties of B. subtilis metabolites with a molecular weight of 5-100 kDa.

[0044] На Фиг. 2 представлены результаты исследования воздействия заявленной композиции на выраженность гастроэнтерологических симптомов у пациентов с постковидным синдромом.[0044] In FIG. Table 2 presents the results of a study of the effect of the claimed composition on the severity of gastroenterological symptoms in patients with post-Covid syndrome.

[0045] На Фиг. 3 представлены результаты исследования воздействия заявленной композиции на выраженность абдоминальной боли, диарейного синдрома и диспепсического синдрома у пациентов с постковидным синдромом.[0045] In FIG. Table 3 presents the results of a study of the effect of the claimed composition on the severity of abdominal pain, diarrhea syndrome and dyspeptic syndrome in patients with post-Covid syndrome.

[0046] На Фиг. 4 представлены результаты исследования воздействия заявленной композиции на уровень астении у пациентов с постковидным синдромом.[0046] In FIG. Table 4 presents the results of a study of the effect of the claimed composition on the level of asthenia in patients with post-Covid syndrome.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0047] В приведенном ниже подробном описании реализации изобретения приведены многочисленные детали реализации, призванные обеспечить отчетливое понимание настоящего изобретения. Однако, квалифицированному в предметной области специалисту, очевидно, каким образом можно использовать настоящее изобретение, как с данными деталями реализации, так и без них. В других случаях хорошо известные методы, процедуры и компоненты не описаны подробно, чтобы не затруднять излишне понимание особенностей настоящего изобретения.[0047] The following detailed description of the invention sets forth numerous implementation details designed to provide a clear understanding of the present invention. However, it will be apparent to one skilled in the art how the present invention can be used with or without these implementation details. In other cases, well-known methods, procedures and components are not described in detail so as not to unduly obscure the features of the present invention.

[0048] Кроме того, из приведенного изложения ясно, что изобретение не ограничивается приведенной реализацией. Многочисленные возможные модификации, изменения, вариации и замены, сохраняющие суть и форму настоящего изобретения, очевидны для квалифицированных в предметной области специалистов.[0048] In addition, from the above discussion it is clear that the invention is not limited to the above implementation. Numerous possible modifications, alterations, variations and substitutions, while retaining the spirit and form of the present invention, will be apparent to those skilled in the art.

[0049] Заявленная композиция нормализует количественный и качественный состав микрофлоры кишечнике, селективно ингибируя рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и создавая условия для роста симбиотической микрофлоры.[0049] The claimed composition normalizes the quantitative and qualitative composition of the intestinal microflora, selectively inhibiting the growth of pathogenic and opportunistic microorganisms and creating conditions for the growth of symbiotic microflora.

[0050] Заявленная композиция включает метаболиты В. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа в количестве от приблизительно 0,6% мае. до приблизительно 5% мас.[0050] The claimed composition includes metabolites of B. subtilis with a molecular weight of 5-100 kDa in an amount of approximately 0.6% wt. up to approximately 5% wt.

[0051] Метаболиты В. subtilis представлены веществами, полученными из культуральной жидкости пробиотического штамма В. subtilis. Использование указанной фракции метаболитов увеличивает избирательность действия и эффективность заявленной композиции. Так, экспериментальные данные показывают, что указанные метаболиты способны подавлять рост широкого ряда патогенных и условно патогенных микроорганизмов, например: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcuss salivarius, Streptococcus mitis. При этом метаболиты указанной фракции не оказывают ингибирующего воздействия на Escherichia coli (Е. coli) - представителя симбиотической микрофлоры кишечника (Пример 2).[0051] Metabolites of B. subtilis are represented by substances obtained from the culture fluid of the probiotic strain of B. subtilis. The use of the specified fraction of metabolites increases the selectivity of action and the effectiveness of the claimed composition. Thus, experimental data show that these metabolites are capable of inhibiting the growth of a wide range of pathogenic and opportunistic microorganisms, for example: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus salivarius, Streptococcus occus mitis. Moreover, the metabolites of this fraction do not have an inhibitory effect on Escherichia coli (E. coli), a representative of the symbiotic intestinal microflora (Example 2).

[0052] Избирательность ингибирующего действия метаболитов В. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа может быть связана с тем, что данная фракция не включает некоторые вещества с известным антибактериальным эффектом. Например, такие биологически активные липопептиды, как итурины, сурфактины и фенгицины имеют размер 1-1,5 кДа (Onega et al., 2007), и, соответственно, не попадают в указанную фракцию. При этом способность указанных метаболитов подавлять рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов может быть связана с действием лизоцима и бактериоцинов (Тагиева и Гахраманова, 2020).[0052] The selectivity of the inhibitory effect of B. subtilis metabolites with a molecular weight of 5-100 kDa may be due to the fact that this fraction does not include some substances with a known antibacterial effect. For example, biologically active lipopeptides such as iturins, surfactins and fengycins have a size of 1-1.5 kDa (Onega et al., 2007), and, accordingly, do not fall into this fraction. Moreover, the ability of these metabolites to suppress the growth of pathogenic and opportunistic microorganisms may be associated with the action of lysozyme and bacteriocins (Tagieva and Gahramanova, 2020).

[0053] Кроме того, В. subtilis вырабатывают различные ферменты и коферменты, полипептиды, пребиотические компоненты, способствующие росту симбиотической микрофлоры, влияющие на обменные процессы и оказывающие иммуномодулирующее действие.[0053] In addition, B. subtilis produces various enzymes and coenzymes, polypeptides, prebiotic components that promote the growth of symbiotic microflora, affect metabolic processes and have an immunomodulatory effect.

[0054] Использование метаболитов В. subtilis в концентрации менее 0,6% мае. приводит к существенному снижению эффективности композиции. Увеличение содержания метаболитов более 5% мае. нерационально, так как увеличивает стоимость производства и при этом не оказывает значительного влияния на эффективность композиции.[0054] Use of metabolites of B. subtilis in a concentration of less than 0.6% wt. leads to a significant decrease in the effectiveness of the composition. An increase in the content of metabolites by more than 5% May. irrational, as it increases the cost of production and does not have a significant impact on the effectiveness of the composition.

[0055] В качестве пробиотического штамма В. subtilis могут быть использованы штаммы В. subtilis ВКПМ №В-2335 (3), В. subtilis 534, В. subtilis ТПИ 13 - 07.06.21 - ДЕП/ВГНКИ, В. subtilis ВКПМ №В4759 (3), В. subtilis р ВМВ105, В. subtilis ТПИ 9; В. subtilis рВМВ 105. В предпочтительном варианте реализации пробиотический штамм В. subtilis представляет собой В. subtilis ВКМ B-3536D.[0055] Strains of B. subtilis VKPM No. B-2335 (3), B. subtilis 534, B. subtilis TPI 13 - 06/07/21 - DEP/VGNKI, B. subtilis VKPM No. can be used as a probiotic strain of B. subtilis B4759 (3), B. subtilis p VMV105, B. subtilis TPI 9; B. subtilis rBMW 105. In a preferred embodiment, the probiotic strain of B. subtilis is B. subtilis BKM B-3536D.

[0056] Остальную часть композиции - 95-99,4% мае. - составляет наполнитель, представляющий собой одно или несколько веществ, которые могут способствовать сохранению целостности композиции, сохранению биологической активности указанных метаболитов и/или могут оказывать полезный физиологический эффект, усиливая полезное действие композиции. В качестве наполнителя могут быть использованы, например, но не ограничиваясь этим: мальтодекстрин, пищевые волокна, производные крахмала, пектины, целлюлоза, микрокристаллическая целлюлоза и другие производные целлюлозы, а также другие технологически приемлемые наполнители (например, выбранные из списка, представленного на сайте https://lexparency.org/eu/32008R1333/ANX_III/).[0056] The rest of the composition is 95-99.4% wt. - constitutes an excipient, which is one or more substances that may help maintain the integrity of the composition, preserve the biological activity of the specified metabolites and/or may have a beneficial physiological effect, enhancing the beneficial effect of the composition. The following can be used as a filler, for example, but not limited to: maltodextrin, dietary fiber, starch derivatives, pectins, cellulose, microcrystalline cellulose and other cellulose derivatives, as well as other technologically acceptable fillers (for example, selected from the list provided on the website https ://lexparency.org/eu/32008R1333/ANX_III/).

[0057] В предпочтительном варианте реализации заявленная композиция в качестве наполнителя включает один или несколько пребиотиков, которые могут представлять собой ди-, олиго- и полисахариды. Причем такие ди-, олиго- и полисахариды устойчивы к гидролизу пищеварительными ферментами человека и не абсорбируются в верхних отделах пищеварительного тракта. Например, это могут быть пищевые волокна злаковых, овощей, фруктов, трав, или синтетические полисахариды, такие как лактулоза, или их сочетания. В еще более предпочтительном варианте реализации один или несколько пребиотиков могут иметь растительное происхождение. Например, в качестве пребиотиков могут быть использованы полифруктозаны (фруктаны), такие, как инулин и/или олигофруктоза. При этом полифруктозаны могут быть получены, например, из цикория, топинамбура, георгина, артишока, свеклы и др. растений.[0057] In a preferred embodiment, the claimed composition as a filler includes one or more prebiotics, which can be di-, oligo- and polysaccharides. Moreover, such di-, oligo- and polysaccharides are resistant to hydrolysis by human digestive enzymes and are not absorbed in the upper parts of the digestive tract. For example, this may be dietary fiber from cereals, vegetables, fruits, herbs, or synthetic polysaccharides such as lactulose, or combinations thereof. In an even more preferred embodiment, one or more prebiotics may be of plant origin. For example, polyfructosans (fructans), such as inulin and/or oligofructose, can be used as prebiotics. In this case, polyfructosans can be obtained, for example, from chicory, Jerusalem artichoke, dahlia, artichoke, beet and other plants.

[0058] Инулин это полисахарид, который состоит из 27-35 остатков D-фруктозы в фуранозной форме и одного остатка глюкозы. Молекула инулина устойчива к воздействию слюнных и кишечных ферментов. Не подвергаясь расщеплению, инулин достигает просвета толстой кишки, где происходит его бактериальная ферментация благодаря наличию бифидобактерий. Инулин, в свою очередь, стимулирует рост бифидобактерий, практически не влияя на других представителей кишечной микрофлоры (Gibson et al., 2017).[0058] Inulin is a polysaccharide that consists of 27-35 D-fructose residues in the furanose form and one glucose residue. The inulin molecule is resistant to salivary and intestinal enzymes. Without undergoing cleavage, inulin reaches the lumen of the colon, where its bacterial fermentation occurs due to the presence of bifidobacteria. Inulin, in turn, stimulates the growth of bifidobacteria, with virtually no effect on other representatives of the intestinal microflora (Gibson et al., 2017).

[0059] В результате ферментации инулина кишечными микроорганизмами в толстой кишке увеличивается бактериальная биомасса, снижается внутрикишечный уровень рН, образуется большое количество продуктов ферментации, в частности, короткоцепочечные жирные кислоты. Снижение рН приводит к повышению количества воды в просвете толстой кишки за счет осмотического эффекта. Это увеличивает объем каловых масс и усиливает перистальтику кишечника. В результате устраняется запор, снижается всасывание и ускоряется выведение жиров, токсичных метаболитов, канцерогенов. Таким образом, инулин содействует нормальному функционированию ЖКТ. Кроме того, инулин противодействует возникновению онкологических заболеваний, оказывает иммуномодулирующее и гепатопротекторное действие (Лузина, 2013).[0059] As a result of fermentation of inulin by intestinal microorganisms in the colon, bacterial biomass increases, the intestinal pH level decreases, and a large number of fermentation products are formed, in particular short-chain fatty acids. A decrease in pH leads to an increase in the amount of water in the lumen of the colon due to the osmotic effect. This increases the volume of stool and enhances intestinal motility. As a result, constipation is eliminated, absorption is reduced and elimination of fats, toxic metabolites, and carcinogens is accelerated. Thus, inulin contributes to the normal functioning of the gastrointestinal tract. In addition, inulin counteracts the occurrence of cancer and has immunomodulatory and hepatoprotective effects (Luzina, 2013).

[0060] Олигофруктоза является продуктом частичного ферментативного гидролиза инулина. Она представляет собой смесь олигосахаридов, состоящих из линейных цепочек фруктозных звеньев, соединенных между собой р-2,1-связями. Семейство олигофруктозы отличается от инулина длиной цепи, которая может колебаться от 2 до 8 мономеров, в то время как степень полимеризации инулина может достигать 60 (Архипов, 2014).[0060] Oligofructose is a product of partial enzymatic hydrolysis of inulin. It is a mixture of oligosaccharides consisting of linear chains of fructose units connected by p-2,1 bonds. The oligofructose family differs from inulin in chain length, which can range from 2 to 8 monomers, while the degree of polymerization of inulin can reach 60 (Arkhipov, 2014).

[0061] Олигофруктоза и инулин способствуют дезинтоксикации организма, так как обладают способностью сорбировать токсины, тяжелые металлы из ЖКТ. Кроме того, короткоцепочечные жирные кислоты, образующиеся при гидролизе инулина, стимулируют детоксицирующую активность печени. Также употребление инулина и олигофруктозы ассоциировано со снижением массы тела, в частности, снижением жировой массы, улучшением контроля глюкозы, уменьшением воспаления (Gibson et al., 2017).[0061] Oligofructose and inulin promote detoxification of the body, as they have the ability to absorb toxins and heavy metals from the gastrointestinal tract. In addition, short-chain fatty acids formed during the hydrolysis of inulin stimulate the detoxifying activity of the liver. Also, the consumption of inulin and oligofructose is associated with a decrease in body weight, in particular, a decrease in fat mass, improved glucose control, and a decrease in inflammation (Gibson et al., 2017).

[0062] Заявленная композиция может применяться для лечения и профилактики дисбактериоза кишечника различного генеза: при хронических заболеваниях пищеварительного тракта, после перенесенных острых кишечных инфекций, на фоне и после приема антибиотиков, после проведения химиотерапии, на фоне длительной гормональной терапии, в условиях хронических стрессовых состояний, при нерациональной диете. Кроме того, экспериментальные данные показывают, что заявленная композиция может применяться для облегчения таких сложных дисфункциональных состояний, как постковидный синдром (Пример 6).[0062] The claimed composition can be used for the treatment and prevention of intestinal dysbiosis of various origins: for chronic diseases of the digestive tract, after acute intestinal infections, during and after taking antibiotics, after chemotherapy, during long-term hormonal therapy, in conditions of chronic stressful conditions , with an irrational diet. In addition, experimental data show that the claimed composition can be used to alleviate complex dysfunctional conditions such as post-Covid syndrome (Example 6).

[0063] Благодаря отсутствию в составе живых микроорганизмов композиция не теряет своей эффективности при сочетании с антибиотиками.[0063] Due to the absence of living microorganisms, the composition does not lose its effectiveness when combined with antibiotics.

[0064] Заявленная композиция может быть использована для изготовления пищевой добавки или фармацевтического препарата в виде порошка, эмульсии, таблетки или капсулы. Последняя форма является наиболее удобной для применения. При этом оболочка капсулы может быть выполнена из желатина.[0064] The claimed composition can be used for the manufacture of a dietary supplement or pharmaceutical preparation in the form of a powder, emulsion, tablet or capsule. The last form is the most convenient to use. In this case, the capsule shell can be made of gelatin.

[0065] При получении заявленной композиции используют метаболиты В. subtilis размером 5-100 кДа, полученные следующим способом. На этапе а) проводят глубинное выращивание пробиотического штамма В. subtilis в жидкой питательной среде, имеющей исходный рН 7,0±0,2. В предпочтительном варианте реализации глубинное выращивание проводят в ферментере. При этом коэффициент заполнения ферментера может составлять от приблизительно 60% до приблизительно 70%. Указанный коэффициент заполнения, с одной стороны, позволяет избежать нежелательного пенообразования, и с другой стороны, позволяет максимально эффективно использовать оборудование для получения культуральной суспензии, насыщенной метаболитами пробиотического штамма В. subtilis. Глубинное выращивание проводят при температуре 36-38°С при постоянном перемешивании и аэрации до тех пор, когда рН культуральной суспензии достигнет 8,5-8,9 и/или до достижения созревания более 90%.[0065] When preparing the claimed composition, metabolites of B. subtilis with a size of 5-100 kDa, obtained by the following method, are used. At stage a) the probiotic strain B. subtilis is grown in depth in a liquid nutrient medium having an initial pH of 7.0±0.2. In a preferred embodiment, deep cultivation is carried out in a fermenter. The fermenter fill factor may range from about 60% to about 70%. The specified filling factor, on the one hand, avoids unwanted foaming, and on the other hand, allows for the most efficient use of equipment to obtain a cultural suspension saturated with metabolites of the probiotic strain B. subtilis. Deep cultivation is carried out at a temperature of 36-38°C with constant stirring and aeration until the pH of the cultural suspension reaches 8.5-8.9 and/or until maturity reaches more than 90%.

[0066] На этапе б) проводят центрифугирование культуральной суспензии на проточной центрифуге до получения прозрачного супернатанта, представляющего собой культуральную жидкость. При этом происходит отделение основного количества биомассы В. subtilis от культуральной жидкости, включающей метаболиты В. subtilis.[0066] At step b) the cultural suspension is centrifuged in a flow centrifuge until a clear supernatant, which is a cultural liquid, is obtained. In this case, the main amount of B. subtilis biomass is separated from the culture liquid, including B. subtilis metabolites.

[0067] На этапе в) проводят ультрафильтрацию культуральной жидкости, полученной на этапе б). В предпочтительном варианте реализации применяют тангенциальную ультрафильтрацию со степенью концентрирования в 10-15 раз. Процесс ультрафильтрации завершают при снижении скорости фильтрации в 2-3 раза. Для ультрафильтрации могут использовать любые подходящие фильтрующие мембраны с порогом отсечения 100 кДа. В результате получают пермеат, включающий метаболиты с молекулярным весом менее 100 кДа.[0067] In step c), ultrafiltration of the culture fluid obtained in step b) is carried out. In a preferred embodiment, tangential ultrafiltration is used with a concentration degree of 10-15 times. The ultrafiltration process is completed when the filtration rate is reduced by 2-3 times. For ultrafiltration, any suitable filter membranes with a cutoff threshold of 100 kDa can be used. The result is a permeate containing metabolites with a molecular weight of less than 100 kDa.

[0068] На этапе г) проводят ультрафильтрацию пермеата, полученного на этапе в). В предпочтительном варианте реализации применяют тангенциальную ультрафильтрацию со степенью концентрирования в 10-15 раз. Процесс ультрафильтрации завершают при снижении скорости фильтрации в 2-3 раза. При этом могут использовать любые подходящие фильтрующие мембраны с порогом отсечения 5 кДа. В результате получают концентрат, включающий целевые метаболиты с молекулярным весом 5-100 кДа.[0068] In step d), ultrafiltration of the permeate obtained in step c) is carried out. In a preferred embodiment, tangential ultrafiltration is used with a concentration degree of 10-15 times. The ultrafiltration process is completed when the filtration rate is reduced by 2-3 times. In this case, any suitable filter membranes with a cutoff threshold of 5 kDa can be used. As a result, a concentrate is obtained, including target metabolites with a molecular weight of 5-100 kDa.

[0069] Полученные метаболиты могут быть смешаны с пребиотиками и другими компонентами для получения фармацевтического препарата в форме эмульсии.[0069] The resulting metabolites can be mixed with prebiotics and other components to obtain a pharmaceutical preparation in the form of an emulsion.

[0070] Также полученные метаболиты могут быть лиофилизированы стандартными методами, известными в данной области техники. Лиофилизированные метаболиты могут быть использованы для получения заявленной композиции в сухом виде. Лиофилизация продлевает срок хранения как самих метаболитов, так и заявленной композиции в сухом виде.[0070] Also, the resulting metabolites can be lyophilized by standard methods known in the art. Lyophilized metabolites can be used to obtain the claimed composition in dry form. Lyophilization extends the shelf life of both the metabolites themselves and the claimed composition in dry form.

Описание реализации изобретенияDescription of the invention implementation

[0071] Пример 1. Получение метаболитов В. subtilis.[0071] Example 1. Preparation of B. subtilis metabolites.

[0072] В данном примере получали метаболиты штамма В. subtilis ВКМ B-3536D. Процесс глубинного культивирования вели в ферментере Р1000 фирмы Bioengineering (Швейцария) объемом 1000 дм³ с коэффициентом заполнения 0,6. В процессе культивирования поддерживали температуру 37±1°С. Скорость перемешивания составляля 250 об/мин. Начальная скорость аэрации составляла 0,2 об/об/мин, через 16 часов роста скорость изменяли до значения 0,5 об/об/мин. Процесс глубинного культивирования вели в течение 32 часов.[0072] In this example, metabolites of the B. subtilis strain VKM B-3536D were obtained. The deep cultivation process was carried out in a P1000 fermenter from Bioengineering (Switzerland) with a volume of 1000 dm ³ with a filling factor of 0.6. During the cultivation process, the temperature was maintained at 37±1°C. The stirring speed was 250 rpm. The initial aeration speed was 0.2 rpm, after 16 hours of growth the speed was changed to 0.5 rpm. The deep cultivation process was carried out for 32 hours.

[0073] Культуральную суспензию В. subtilis ВКМ B-3536D подвергали центрифугированию на проточной суперцентрифуге Sharpless AS-26. Полученную культуральную жидкость подвергали ультрафильтрации на установке тангенциальной ультрафильтрации в две стадии. На первой стадии использовали фильтрующую мембрану АР-3-100. При этом получали концентрат №1 с порогом отсечения 100 кДа, включающий высокомолекулярную фракцию метаболитов весом более 100 кДа. Пермеат, полученный после первой стадии ультрафильтрации, вновь подвергали тангенциальной ультрафильтрации с использованием фильтрующей мембраны АР-3-5. В результате получали концентрат №2 с порогом отсечения 5 кДа. Полученный концентрат №2 составлял около 10% от исходного объема культуральной жидкости. Полученный концентрат №2 включал в себя метаболиты В. subtilis ВКМ B-3536D с молекулярным весом 5-100 кДа.[0073] A culture suspension of B. subtilis VKM B-3536D was centrifuged in a Sharpless AS-26 flow supercentrifuge. The resulting culture liquid was subjected to ultrafiltration using a tangential ultrafiltration unit in two stages. At the first stage, an AP-3-100 filter membrane was used. In this case, concentrate No. 1 was obtained with a cutoff threshold of 100 kDa, including a high molecular weight fraction of metabolites weighing more than 100 kDa. The permeate obtained after the first stage of ultrafiltration was again subjected to tangential ultrafiltration using an AP-3-5 filter membrane. As a result, concentrate No. 2 was obtained with a cutoff threshold of 5 kDa. The resulting concentrate No. 2 was about 10% of the original volume of culture fluid. The resulting concentrate No. 2 included metabolites of B. subtilis VKM B-3536D with a molecular weight of 5-100 kDa.

[0074] Пример 2. Изучение воздействия метаболитов В. subtilis на ингибирование роста патогенной и условно-патогенной микрофлоры.[0074] Example 2. Study of the effect of B. subtilis metabolites on inhibiting the growth of pathogenic and opportunistic microflora.

[0075] В данном примере изучали способность метаболитов штамма В. subtilis ВКМ В-3536D с молекулярным весом 5-100 кДа подавлять рост индикаторных культур. Исследование проводили с использованием адаптированного метода стандартных дисков для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Использованные в данном примере индикаторные культуры представлены патогенными и условно-патогенными для человека микроорганизмами. Для реализации метода индикаторные культуры помещали на поверхность агаризованной питательной среды Луриа-Бертани в чашке Петри в количестве 107 КОЕ. После застывания чашки Петри подсушивали в течение 15 минут при 37°С. Затем на поверхность питательной среды с индикаторными культурами в виде капель диаметром 5±1 мм наносили по 10 мкл концентратов №1 и №2, полученных в Примере 1. Затем чашки Петри оставляли при комнатной температуре до полного впитывания капель и затем инкубировали при 37°С в течение 24-48 часов. Детекцию результатов проводили путем измерения зоны задержки роста индикаторных культур вокруг области нанесения концентратов, включающих метаболиты В. subtilis ВКМ B-3536D. Появление зон, свободных от индикаторных культур, вокруг области нанесения концентратов указывает на антагонистическое действие метаболитов В. subtilis ВКМ В-3536 в отношении указанных в Таблице 1 индикаторных культур. Величина зон, свободных от индикаторных культур, указывает на эффективность антагонистического действия метаболитов В. subtilis ВКМ В-3536.[0075] In this example, the ability of metabolites of the B. subtilis strain VKM B-3536D with a molecular weight of 5-100 kDa to suppress the growth of indicator cultures was studied. The study was carried out using an adapted standard disk method for determining the sensitivity of microorganisms to antibiotics. The indicator cultures used in this example are represented by pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms for humans. To implement the method, indicator cultures were placed on the surface of the Luria-Bertani agar nutrient medium in a Petri dish in an amount of 107 CFU. After solidification, the Petri dishes were dried for 15 minutes at 37°C. Then, 10 μl of concentrates No. 1 and No. 2 obtained in Example 1 were applied to the surface of the nutrient medium with indicator cultures in the form of drops with a diameter of 5 ± 1 mm. Then the Petri dishes were left at room temperature until the drops were completely absorbed and then incubated at 37 ° C within 24-48 hours. Detection of the results was carried out by measuring the zone of growth inhibition of indicator cultures around the area of application of concentrates including metabolites of B. subtilis VKM B-3536D. The appearance of zones free from indicator cultures around the area of application of concentrates indicates the antagonistic effect of metabolites of B. subtilis VKM B-3536 in relation to the indicator cultures indicated in Table 1. The size of zones free from indicator cultures indicates the effectiveness of the antagonistic action of metabolites of B. subtilis VKM B-3536.

[0076] Таблица 1. Задержка роста индикаторных культур при воздействии метаболитов В. subtils.[0076] Table 1. Growth retardation of indicator cultures when exposed to B. subtils metabolites.

[0077] Из Таблицы 1 видно, что способностью к подавлению роста обладают как высокомолекулярные метаболиты весом более 100 кДа (концентрат №1), так и метаболиты весом 5-100кДа (концентрат №2). При этом в воздействии этих двух вариантов метаболитов есть существенная разница: высокомолекулярные метаболиты вызывают задержку роста Е. coli, а целевые метаболиты весом 5-100 кДа не вызывают. При том, что Е. coli является представителем нормальной микрофлоры кишечника, отсутствие подавляющего воздействия концентрата 2 на данную культуру, говорит об избирательности действия метаболитов весом 5-100кДа.[0077] From Table 1 it is clear that both high molecular weight metabolites weighing more than 100 kDa (concentrate No. 1) and metabolites weighing 5-100 kDa (concentrate No. 2) have the ability to suppress growth. However, there is a significant difference in the effects of these two variants of metabolites: high molecular weight metabolites cause growth retardation of E. coli, but target metabolites weighing 5-100 kDa do not. Given that E. coli is a representative of the normal intestinal microflora, the absence of an inhibitory effect of concentrate 2 on this culture indicates the selectivity of the action of metabolites weighing 5-100 kDa.

[0078] Стоит отметить, что культуральная суспензия штамма В. subtilis ВКМ B-3536D, включающая все метаболиты, также вызывала значительную задержку роста Е. coli. Такие данные были получены в исследовании антагонистической активности штамма В. subtilis ВКМ B-3536D методом перпендикулярных штрихов.[0078] It is worth noting that the culture suspension of the B. subtilis strain VKM B-3536D, including all metabolites, also caused a significant delay in the growth of E. coli. Such data were obtained in a study of the antagonistic activity of the B. subtilis strain VKM B-3536D using the perpendicular streak method.

[0079] В результате исследования установлена выраженная избирательная способность метаболитов штамма В. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа к подавлению роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.[0079] As a result of the study, a pronounced selective ability of metabolites of the B. subtilis strain with a molecular weight of 5-100 kDa to suppress the growth of pathogenic and opportunistic microorganisms was established.

[0080] Пример 3. Санитарно-химический анализ заявленной композиции.[0080] Example 3. Sanitary-chemical analysis of the claimed composition.

[0081] Санитарно-химический анализ проводили с целью определения содержания пестицидов и тяжелых металлов в образцах композиции, включающей пребиотики растительного происхождения. Содержание хлорорганических пестицидов (токсикантов) определяли методом хроматографии в тонком слое согласно методическим указаниям по определению хлорорганических пестицидов в воде, продуктах питания, кормах и табачных изделиях (№2142-80).[0081] Sanitary chemical analysis was carried out to determine the content of pesticides and heavy metals in samples of the composition including plant-derived prebiotics. The content of organochlorine pesticides (toxicants) was determined by thin layer chromatography in accordance with the guidelines for the determination of organochlorine pesticides in water, food, feed and tobacco products (No. 2142-80).

[0082] Содержание тяжелых металлов исследовали с помощью атомно-абсорбционного спектрометра МГА-1000. Содержание свинца и кадмия определяли в соответствии с МУК 4.1.986-00 «Методикой выполнения измерений массовой доли свинца и кадмия в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом электротермической атомно-абсорбционной спектрометрии». Содержание мышьяка определяли в соответствии с ГОСТ Р 51766-2001 «Атомно-абсорбционным методом определения мышьяка». Содержание ртути определяли в соответствии с «Методикой выполнения измерений массовой доли ртути в пробах пищевого сырья и пищевых продуктов методом электротермической атомно-абсорбционной спектрометрии» (Аттестат ВНИИМС Л 301/174-98). Результаты проведенных измерений представлены в Таблице 2.[0082] The content of heavy metals was studied using an MGA-1000 atomic absorption spectrometer. The content of lead and cadmium was determined in accordance with MUK 4.1.986-00 “Methodology for measuring the mass fraction of lead and cadmium in food products and food raw materials by electrothermal atomic absorption spectrometry.” The arsenic content was determined in accordance with GOST R 51766-2001 “Atomic absorption method for determination of arsenic”. The mercury content was determined in accordance with the “Method for measuring the mass fraction of mercury in samples of food raw materials and food products using the method of electrothermal atomic absorption spectrometry” (VNIIMS Certificate L 301/174-98). The results of the measurements are presented in Table 2.

[0083] Таблица 2. Содержание в заявленной композиции хлорорганических пестицидов и тяжелых металлов.[0083] Table 2. Content of organochlorine pesticides and heavy metals in the claimed composition.

[0084] Результаты измерений свидетельствуют о том, что в заявляемой метабиотической композиции содержание токсичных и опасных для здоровья хлорорганических пестицидов ГХЦТ и ДЛТ) тяжелых металлов (свинец, кадмий, ртуть, мышьяк) не превышает допустимые уровни, установленные Техническим регламентом Таможенного союза TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» (приложение 3, раздел 10). Такие пестициды как алдрин и гептахлор в заявляемой метабиотической композиции не обнаружены.[0084] The measurement results indicate that in the claimed metabiotic composition the content of toxic and hazardous organochlorine pesticides HCCT and DLT) heavy metals (lead, cadmium, mercury, arsenic) does not exceed the permissible levels established by the Technical Regulations of the Customs Union TP CU 021 /2011 “On food safety” (Appendix 3, section 10). Pesticides such as aldrin and heptachlor were not found in the claimed metabiotic composition.

[0085] Пример 4. Микробиологический анализ заявленной композиции. [0086] Микробиологические исследования проводили в соответствии с ГОСТ 10444.15-94 «Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов», с ГОСТ 31747-2012 «Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)», с ГОСТ 31659-2012 «Метод выявления бактерий рода Salmonella», с ГОСТ 31708-2012 «Метод обнаружения и определения количества презумптивных бактерий Escherichia coli», с ГОСТ 10444.12-2013 «Методы выявления и подсчета количества дрожжей и плесневых грибов». Результаты исследований представлены в Таблице 3.[0085] Example 4. Microbiological analysis of the claimed composition. [0086] Microbiological studies were carried out in accordance with GOST 10444.15-94 “Methods for determining the number of mesophilic aerobic and facultative anaerobic microorganisms”, with GOST 31747-2012 “Methods for identifying and determining the number of bacteria of the coliform group (coliform bacteria)”, with GOST 31659 -2012 “Method for identifying bacteria of the genus Salmonella”, with GOST 31708-2012 “Method for detecting and determining the number of presumptive bacteria Escherichia coli”, with GOST 10444.12-2013 “Methods for identifying and counting the number of yeasts and molds”. The research results are presented in Table 3.

[0087] Таблица 3. Микробиологические показатели безопасности заявленной композиции.[0087] Table 3. Microbiological safety indicators of the claimed composition.

[0088] Результаты исследования показывают, что по микробиологическим показателям безопасности заявленная композиция соответствует требованиям, установленным Техническим регламентом Таможенного союза TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» (приложения 1 и 2, раздел 1.9). Кроме того, заявленная композиция, действительно, является метабиотической, т.е. не содержит живых пробиотических бактерий В. subtilis.[0088] The results of the study show that in terms of microbiological safety indicators, the claimed composition complies with the requirements established by the Technical Regulations of the Customs Union TP CU 021/2011 “On the safety of food products” (Appendices 1 and 2, section 1.9). In addition, the claimed composition is indeed metabiotic, i.e. does not contain live probiotic bacteria B. subtilis.

[0089] Пример 5. Исследование цитотоксичности метаболитов В. subtilis в отношении клеток млекопитающих.[0089] Example 5. Study of the cytotoxicity of B. subtilis metabolites against mammalian cells.

[0090] В данном примере исследовали потенциальную цитотоксичность метаболитов штамма В. subtilis ВКМ B-3536D. Цитотоксичность оценивали согласно рекомендациям Европейского Агентства по безопасности пищевых продуктов (EFSA) для характеризации микроорганизмов используемых в качестве кормовых добавок или штаммов-продуцентов (Rychen et al., 2018). Штамм В. subtilis ВКМ B-3536D выращивали в сердечно-мозговом бульоне при 30°С в течение 6 ч. Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием.[0090] In this example, the potential cytotoxicity of metabolites of the B. subtilis strain VKM B-3536D was examined. Cytotoxicity was assessed according to the recommendations of the European Food Safety Authority (EFSA) for the characterization of microorganisms used as feed additives or producer strains (Rychen et al., 2018). B. subtilis strain VKM B-3536D was grown in brain heart broth at 30°C for 6 hours. Cells were separated from the culture liquid by centrifugation.

[0091] Анализ цитотоксичности на клетках Vero (клеточная линия почечного эпителия зеленой мартышки) проводили по методу (Roberts et al., 2001) с модификациями. Клетки Vero инкубировали с культуральной жидкостью. Степень поврежденности клеток Vero оценивали по выделению клетками фермента лактат-дегидрогеназы. Цитотоксичность выражали в процентах от токсичности детергента Triton-X100, вызывающего выход из клеток лактат-дегидрогеназы за счет перфорации клеточных мембран. В качестве контрольных штаммов использовали цитотоксичный и нецитотоксичный штаммы рода Bacillus. В Таблице 4 представлены средние значения 3 (штамм ВКМ B-3536D) или 2 (контрольные штаммы) экспериментов. Каждый эксперимент проводился в двух повторах.[0091] Cytotoxicity assay on Vero cells (a green monkey renal epithelial cell line) was performed according to the method of (Roberts et al., 2001) with modifications. Vero cells were incubated with culture fluid. The degree of damage to Vero cells was assessed by the cells secreting the enzyme lactate dehydrogenase. Cytotoxicity was expressed as a percentage of the toxicity of the detergent Triton-X100, which causes the release of lactate dehydrogenase from cells due to perforation of cell membranes. Cytotoxic and non-cytotoxic strains of the genus Bacillus were used as control strains. Table 4 presents the average values of 3 (VKM strain B-3536D) or 2 (control strains) experiments. Each experiment was carried out in duplicate.

[0092] Таблица 4. Цитотоксичность метаболитов В. subtilis в отношении клеток Vero.[0092] Table 4. Cytotoxicity of B. subtilis metabolites to Vero cells.

[0093] Из представленных результатов видно, что цитотоксичность культуральной жидкости штамма В. subtilis ВКМ B-3536D не превышает границы в 20%. Таким образом, метаболиты штамма В. subtilis ВКМ B-3536D, содержащиеся в исследованной культуральной жидкости, не являются токсичными в отношении клеток Vero, и могут считаться безопасными для клеток млекопитающих.[0093] From the presented results it is clear that the cytotoxicity of the culture liquid of the B. subtilis strain VKM B-3536D does not exceed the limit of 20%. Thus, the metabolites of the B. subtilis strain VKM B-3536D contained in the studied culture liquid are not toxic to Vero cells and can be considered safe for mammalian cells.

[0094] Пример 6. Оценка иммуномодулирующих свойств лиофилизированных метаболитов В. subtilis с молекулярным весом 5-100кДа.[0094] Example 6. Evaluation of the immunomodulatory properties of lyophilized metabolites of B. subtilis with a molecular weight of 5-100 kDa.

[0095] В данном примере исследовали иммуномодулирующие свойства метаболитов с молекулярным весом 5-100кДа пробиотического штамма В. subtilis ВКМ B-3536D. Для этого лиофилизированные метаболиты 5-100 кДа с добавлением мальтодекстрина в качестве носителя добавляли в культуру клеток моноцитов человека ТНР-1. Сравнивали эффект добавления метаболитов по отношению к контролю без метаболитов 1) на стадии дифференцировки моноцитов в макрофаги с помощью форбол-миристат-ацетата и 2) на стадии поляризации ранее дифференцированных моноцитов. Эффект оценивали методом обратной транскрипции (RT-PCR), по экспрессии мРНК маркерных генов, кодирующих интерлейкины и другие факторы: IL1b, IL6, IL10, TNFa и CD64.[0095] In this example, the immunomodulatory properties of metabolites with a molecular weight of 5-100 kDa of the probiotic strain B. subtilis VKM B-3536D were studied. For this purpose, lyophilized metabolites of 5-100 kDa with the addition of maltodextrin as a carrier were added to the THP-1 human monocyte cell culture. The effect of adding metabolites was compared with a control without metabolites 1) at the stage of differentiation of monocytes into macrophages using phorbol myristate acetate and 2) at the stage of polarization of previously differentiated monocytes. The effect was assessed by reverse transcription-PCR (RT-PCR) by the expression of mRNA of marker genes encoding interleukins and other factors: IL1b, IL6, IL10, TNFa and CD64.

[0096] На Фиг. 1 показаны значения экспрессии указанных маркерных генов при добавлении метаболитов, нормализованные к контролю без добавления метаболитов. Указаны средние значения двух экспериментов, по три повтора в каждом эксперименте. Статистически значимые (р<0,05) количественные изменения (не менее чем в два раза по сравнению с контролем) в обоих экспериментах отмечены звездочкой (*). Светло-серые столбцы отражают уровень экспрессии соответствующего гена на стадии дифференцировки, темно-серые столбцы отражают уровень экспрессии на стадии поляризации.[0096] In FIG. Figure 1 shows the expression values of the indicated marker genes with the addition of metabolites, normalized to the control without the addition of metabolites. The average values of two experiments are indicated, with three replicates per experiment. Statistically significant (p<0.05) quantitative changes (at least twofold compared to the control) in both experiments are marked with an asterisk (*). Light gray bars reflect the expression level of the corresponding gene at the differentiation stage, dark gray bars reflect the expression level at the polarization stage.

[0097] Видно, что на стадии дифференцировки исследованные метаболиты значительно усиливали экспрессию гена TNFa, и в то же время значительно снижали экспрессию гена CD64. Это указывает на усиление процесса дифференцировки моноцитов в макрофаги. Также значительно снижалась экспрессия цитокина IL1b, что указывает на противовоспалительный эффект. На стадии поляризации исследуемые метаболиты значительно повышали экспрессию цитокинов IL6 и IL10. IL10 классический противовоспалительный цитокин, и повышение его экспрессии свидетельствует об активации противовоспалительной поляризации макрофагов. IL6 - важный цитокин, высокие концентрации которого также ассоциированы с противовоспалительным эффектом.[0097] It can be seen that at the differentiation stage, the studied metabolites significantly increased the expression of the TNFa gene, and at the same time significantly decreased the expression of the CD64 gene. This indicates an increase in the process of differentiation of monocytes into macrophages. The expression of the cytokine IL1b was also significantly reduced, indicating an anti-inflammatory effect. At the polarization stage, the studied metabolites significantly increased the expression of the cytokines IL6 and IL10. IL10 is a classic anti-inflammatory cytokine, and increased expression indicates activation of anti-inflammatory macrophage polarization. IL6 is an important cytokine, high concentrations of which are also associated with anti-inflammatory effects.

[0098] Полученные данные указывают на то, что исследованные метаболиты обладают иммуно модулирующими свойствами. Они могут способствовать дифференцировке моноцитов в макрофаги, а также способствовать противовоспалительной поляризации макрофагов, которая необходима для окончания воспаления и регенерации тканей.[0098] The data obtained indicate that the studied metabolites have immunomodulatory properties. They may promote the differentiation of monocytes into macrophages, as well as promote anti-inflammatory polarization of macrophages, which is necessary for the end of inflammation and tissue regeneration.

[0099] Пример 7. Оценка эффективности применения заявленной композиции в терапии у пациентов с постковидным синдромом.[0099] Example 7. Evaluation of the effectiveness of the claimed composition in therapy in patients with post-Covid syndrome.

[00100] В данном примере проводили рандомизированное одноцентровое открытое проспективное исследование эффективности и безопасности заявленной композиции с участием пациентов с постковидным синдромом. Использованная в примере композиция включала метаболиты штамма В. subtilis ВКМ B-3536D с молекулярным весом 5-100 кДа, в качестве наполнителя включала смесь инулина и олигофруктозы. В исследование было включено 40 пациентов обоих полов в возрасте от 18 до 60 лет включительно с диагнозом постковидный синдром. Все пациенты были поровну разбиты на экспериментальную группу 1 и контрольную группу 2. Пациенты из экспериментальной группы 1 в течение 28 дней получали заявленную композицию, включающую олигофруктозу и инулин. Пациенты из контрольной группы 2 не получали заявленной композиции. Выраженность симптомов, характерных для постковидного синдрома оценивали с помощью опросников, которые все пациенты заполняли перед началом эксперимента и через 28 дней от начала эксперимента.[00100] In this example, a randomized, single-center, open-label, prospective study of the effectiveness and safety of the claimed composition was conducted in patients with post-Covid syndrome. The composition used in the example included metabolites of the B. subtilis strain VKM B-3536D with a molecular weight of 5-100 kDa, and included a mixture of inulin and oligofructose as a filler. The study included 40 patients of both sexes aged from 18 to 60 years inclusive with a diagnosis of post-Covid syndrome. All patients were equally divided into experimental group 1 and control group 2. Patients from experimental group 1 received the claimed composition, including oligofructose and inulin, for 28 days. Patients from control group 2 did not receive the declared composition. The severity of symptoms characteristic of post-Covid syndrome was assessed using questionnaires that all patients filled out before the start of the experiment and 28 days after the start of the experiment.

[00101] Опросник GSRS позволяет оценить выраженность гастроэнтерологических симптомов. Опросник состоит из 15 пунктов, которые преобразуются в 5 шкал: абдоминальная боль (а), рефлюкс-синдром (b), диарейный синдром (с), синдром запоров (d) и диспептический синдром (е). Показатели шкал колеблются от 1 до 7, более высокие значения соответствуют более выраженным симптомам и более низкому качеству жизни. Шкала суммарного измерения строится на основе ответов на все 15 вопросов опросника и позволяет оценить общую динамику клинической картины.[00101] The GSRS questionnaire assesses the severity of gastroenterological symptoms. The questionnaire consists of 15 items, which are converted into 5 scales: abdominal pain (a), reflux syndrome (b), diarrhea syndrome (c), constipation syndrome (d) and dyspeptic syndrome (e). Scale scores range from 1 to 7, with higher scores corresponding to more severe symptoms and lower quality of life. The summary measurement scale is based on answers to all 15 questions of the questionnaire and allows you to assess the overall dynamics of the clinical picture.

[00102] На Фиг. 2 представлены средние значения GSRS в экспериментальной группе 1 и в контрольной группе 2. Среднее значение измеряется в баллах, отложенных по оси ординат. Светло-серые столбцы отражают средние значения GSRS, полученные до начала эксперимента, темно-серые столбцы отражают средние значения GSRS, полученные через 28 дней после начала эксперимента. Видно, что среднее значение GSRS в экспериментальной группе 1 снизилось приблизительно на 40%, в то время как в контрольной группе 2 среднее значение GSRS снизилось менее чем на 15%. Это говорит об уменьшении выраженности гастроэнтерологических симптомов на фоне приема заявленной композиции.[00102] In FIG. Figure 2 shows the average GSRS values in experimental group 1 and control group 2. The average value is measured in points plotted on the ordinate. Light gray bars reflect mean GSRS values obtained before the start of the experiment, dark gray bars reflect mean GSRS values obtained 28 days after the start of the experiment. It can be seen that the mean GSRS value in experimental group 1 decreased by approximately 40%, while in control group 2 the mean GSRS value decreased by less than 15%. This indicates a decrease in the severity of gastroenterological symptoms while taking the claimed composition.

[00103] Наилучшая положительная динамика наблюдалась по шкалам[00103] The best positive dynamics were observed on the scales

абдоминальная боль (а), диарейный синдром (с) и диспепсический синдром (е), как показано на Фиг. 3. Высота столбцов отражает выраженность соответствующих симптомов в экспериментальной группе 1 (сплошные столбцы) и в контрольной группе 2 (заштрихованные столбцы). Выраженность симптомов измеряется в баллах, отложенных по оси ординат. Светло-серые столбцы отражают выраженность симптома до начала эксперимента, темно-серые столбцы отражают выраженность симптома через 28 дней после начала эксперимента. В экспериментальной группе 1 выраженность абдоминальной боли (а) снизилась более чем на 45%, в то время как в контрольной группе 2 выраженность этого симптома снизилась менее чем на 20%. Выраженность диарейного синдрома (с) в экспериментальной группе 1 снизилась более чем на 40%, в то время как в контрольной группе 2 выраженность этого симптома снизилась менее чем на 20%. Выраженность диспепсического синдрома (е) в экспериментальной группе 1 снизилась более чем на 50%, в то время как в контрольной группе 2 выраженность этого симптома снизилась менее чем на 15%. Полученные данные говорят о том, что применение заявленной композиции заметно снижает выраженность указанных симптомов.abdominal pain (a), diarrheal syndrome (c) and dyspeptic syndrome (e), as shown in Fig. 3. The height of the bars reflects the severity of the corresponding symptoms in experimental group 1 (solid bars) and in control group 2 (shaded bars). The severity of symptoms is measured in points plotted along the y-axis. Light gray bars reflect the severity of the symptom before the start of the experiment, dark gray bars reflect the severity of the symptom 28 days after the start of the experiment. In experimental group 1, the severity of abdominal pain (a) decreased by more than 45%, while in control group 2, the severity of this symptom decreased by less than 20%. The severity of diarrhea syndrome (c) in experimental group 1 decreased by more than 40%, while in control group 2 the severity of this symptom decreased by less than 20%. The severity of dyspeptic syndrome (e) in experimental group 1 decreased by more than 50%, while in control group 2 the severity of this symptom decreased by less than 15%. The data obtained indicate that the use of the claimed composition significantly reduces the severity of these symptoms.

[00104] Астения является одним из наиболее характерных симптомов постковидного синдрома. Для оценки уровня астении использовали шкалу астенического состояния (ШАС). Результаты представлены на Фиг. 4. Уровень астении измеряется в баллах, отложенных по оси ординат. Светло-серые столбцы отражают уровень астении до начала эксперимента, темно-серые столбцы отражают уровень астении через 28 дней после начала эксперимента. Уровень астении в экспериментальной группе 1 снизился более чем на 60%, в то время как в контрольной группе 2 уровень астении увеличился более чем на 10%. Это говорит о том, что прием заявленной композиции влияет положительно не только на состояние ЖКТ, но и на психоэмоциональное состояние пациентов с постковидным синдромом.[00104] Asthenia is one of the most characteristic symptoms of post-Covid syndrome. To assess the level of asthenia, the asthenic state scale (ASS) was used. The results are presented in Fig. 4. The level of asthenia is measured in points plotted along the ordinate. Light gray bars reflect the level of asthenia before the start of the experiment, dark gray bars reflect the level of asthenia 28 days after the start of the experiment. The level of asthenia in experimental group 1 decreased by more than 60%, while in control group 2 the level of asthenia increased by more than 10%. This suggests that taking the claimed composition has a positive effect not only on the state of the gastrointestinal tract, but also on the psycho-emotional state of patients with post-Covid syndrome.

[00105] Таким образом, можно заключить, что пациенты из экспериментальной группы 1 продемонстрировали статистически значимую положительную динамику клинических симптомов в отличие от контрольной группы 2.[00105] Thus, we can conclude that patients from experimental group 1 demonstrated statistically significant positive dynamics in clinical symptoms, in contrast to control group 2.

[00106] В настоящих материалах заявки представлено предпочтительное раскрытие осуществления заявленного технического решения, которое не должно использоваться как ограничивающее иные, частные воплощения его реализации, которые не выходят за рамки испрашиваемого объема правовой охраны и являются очевидными для специалистов в соответствующей области техники.[00106] These application materials provide a preferred disclosure of the implementation of the claimed technical solution, which should not be used as limiting other, private embodiments of its implementation, which do not go beyond the scope of the requested scope of legal protection and are obvious to specialists in the relevant field of technology.

ЛитератураLiterature

Gibson, G., Hutkins, R., Sanders, M. et al. «Expert consensus document: The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on the definition and scope of prebiotics» // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2017, 14, 491-502. https://doi.org/10.1038/nrgastro.2017.75.Gibson, G., Hutkins, R., Sanders, M. et al. “Expert consensus document: The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on the definition and scope of prebiotics” // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2017, 14, 491-502. https://doi.org/10.1038/nrgastro.2017.75.

Ongena M, Jourdan E, Adam A, Paquot M, Brans A, Joris B, Arpigny JL, Thonart P. «Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants» // Environ Microbiol. 2007 Apr;9(4): 1084-90. doi: 10.1111/j.1462-2920.2006.01202.x. PMID: 17359279.Ongena M, Jourdan E, Adam A, Paquot M, Brans A, Joris B, Arpigny JL, Thonart P. “Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants” // Environ Microbiol. 2007 Apr;9(4): 1084-90. doi: 10.1111/j.1462-2920.2006.01202.x. PMID: 17359279.

Roberts PH, Davis КС, Garstka W, Bhunia AK, «Lactate dehydrogenase release assay from Vero cells to distinguish verotoxin producing Escherichia coli from non-verotoxin producing strains» // Journal of Microbiological, 2001, Methods, 43: 171-181. https://doi.org/10.1016/S0167-7012(00)00222-0.Roberts PH, Davis KS, Garstka W, Bhunia AK, “Lactate dehydrogenase release assay from Vero cells to distinguish verotoxin producing Escherichia coli from non-verotoxin producing strains” // Journal of Microbiological, 2001, Methods, 43: 171-181. https://doi.org/10.1016/S0167-7012(00)00222-0.

Rychen G, Aquilina G, Azimonti G, Bampidis V, Bastos ML, Bories G, Chesson A, Cocconcelli PS, Flachowsky G, Gropp J, Kolar B, Kouba M, Lopez-Alonso M, Lopez Puente S, Mantovani A, Mayo B, Ramos F, Saarela M, Villa RE, Wallace RJ, Wester P, Glandorf B, Herman L, Karenlampi S, Aguilera J, Anguita M, Brozzi R, Galobart J «EFSA FEEDAP Panel (EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed): Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms» // EFSA Journal, 2018, 16(3), 5206, 24 pp. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5206.Rychen G, Aquilina G, Azimonti G, Bampidis V, Bastos ML, Bories G, Chesson A, Cocconcelli PS, Flachowsky G, Gropp J, Kolar B, Kouba M, Lopez-Alonso M, Lopez Puente S, Mantovani A, Mayo B , Ramos F, Saarela M, Villa RE, Wallace RJ, Wester P, Glandorf B, Herman L, Karenlampi S, Aguilera J, Anguita M, Brozzi R, Galobart J "EFSA FEEDAP Panel (EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed): Guidance on the characterization of microorganisms used as feed additives or as production organisms” // EFSA Journal, 2018, 16(3), 5206, 24 pp. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5206.

Shah Т., Baloch Z., Shah Z., Cui X., Xia X. «The Intestinal Microbiota: Impacts of Antibiotics Therapy, Colonization Resistance and Diseases» // hit. J. Mol. Sci. 2021, 22, 6597. https://doi.org/10.3390/ijms22126597.Shah T., Baloch Z., Shah Z., Cui X., Xia X. “The Intestinal Microbiota: Impacts of Antibiotics Therapy, Colonization Resistance and Diseases” // hit. J. Mol. Sci. 2021, 22, 6597. https://doi.org/10.3390/ijms22126597.

https://lexparency.org/eu/32008R1333/ANX_III/https://lexparency.org/eu/32008R1333/ANX_III/

Архипов В.Ю. «Инулин и олигофруктоза: эффективность в качестве пребиотического волокна для кондитерской промышленности» // Фундаментальные исследования. 2014. №9(6) С.1216-1219.Arkhipov V.Yu. “Inulin and oligofructose: effectiveness as a prebiotic fiber for the confectionery industry” // Fundamental Research. 2014. No. 9(6) P.1216-1219.

Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. «Дисбактериозы кишечника у взрослых» //М.: КМК. - 2003. - 224 с. Bondarenko V.M., Gracheva N.M., Matsulevich T.V. “Intestinal dysbacteriosis in adults” // M.: KMK. - 2003. - 224 p.

Бухарин О.В. «Персистенция патогенных бактерий» // М.: Медицина - 1999. - 364 с. Bukharin O.V. “Persistence of pathogenic bacteria” // M.: Medicine - 1999. - 364 p.

Воробейчиков Е.В., Василенко А.Ж., Синица А.В и др. «Методологические аспекты применения пробиотиков и антибиотиков для экстренной профилактики инфекционных заболеваний» // Сб. научн. тр. III съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. - М: МаксПресс, 2005. - С.35-36.Vorobeychikov E.V., Vasilenko A.Zh., Sinitsa A.V. et al. “Methodological aspects of the use of probiotics and antibiotics for emergency prevention of infectious diseases” // Collection. scientific tr. III Congress of the Society of Biotechnologists of Russia named after. Yu.A. Ovchinnikova. - M: MaxPress, 2005. - P.35-36.

ГОСТ Р 52349-2005 «Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. ТерминыGOST R 52349-2005 “Food products. Functional food products. Terms

и определения» (с Изменением N 1) // ГОСТ Р от 31 мая 2005 г. №52349-2005. Жучкова Т.В., «Современные представления о микрофлоре человека: что такоеand definitions" (with Amendment No. 1) // GOST R dated May 31, 2005 No. 52349-2005. Zhuchkova T.V., “Modern ideas about human microflora: what is

дисбактериоз?» // Медицинская энциклопедия Видаль: Гастроэнтерология, 2015. Кнунянц И. Л. «Химическая энциклопедия»//М.: Советская энциклопедия. 1988. Крамарь Л.В. «Микроэкология кишечника здоровых людей в условиях техногенного воздействия крупного промышленного города» // Вестн. РАМН. - 2002. - №8. - С.37-40.dysbacteriosis? // Vidal Medical Encyclopedia: Gastroenterology, 2015. Knunyants I. L. “Chemical Encyclopedia” // M.: Soviet Encyclopedia. 1988. Kramar L.V. “Microecology of the intestines of healthy people under the conditions of technogenic impact of a large industrial city” // Vestn. RAMS. - 2002. - No. 8. - P.37-40.

Ленцнер А.А., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э. и др. «Лактофлора и колонизационная резистентность» // Антибиотики и мед. биотехнология. - 1987. - №3. - С.173-179.Lenzner A.A., Lenzner H.P., Mikelssaar M.E. and others. “Lactoflora and colonization resistance” // Antibiotics and honey. biotechnology. - 1987. - No. 3. - P.173-179.

Лузина Е.В. «Пищевая ценность цикория» // Вопр. питания. 2013; №2: 62-65.Luzina E.V. “Nutritional value of chicory” // Question. nutrition. 2013; No. 2: 62-65.

Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин А.В. «Дисбактериоз кишечника» // Рос.мед. журнал. - 1999. - №3. - С.40-45.Minushkin O.N., Ardatskaya M.D., Babin V.N., Domaradsky I.V., Dubinin A.V. “Intestinal dysbiosis” // Ros.med. magazine. - 1999. - No. 3. - P.40-45.

Петровская В.Г. «Общие закономерности взаимодействия в системе паразит-хозяин и проблема смешанных инфекций»//Журн. микробиол. - 1982. - №8. - С.24-31.Petrovskaya V.G. “General patterns of interaction in the parasite-host system and the problem of mixed infections” // Journal. microbiol. - 1982. - No. 8. - P.24-31.

Тагиева С.А., Гахраманова Ф. X. «Преимущества применения бактериоцинных препаратов по сравнению с химическими антибиотиками для лечения инфекций у человека и животных» // Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация, 2020, №4.Tagieva S.A., Gahramanova F.X. “Advantages of using bacteriocin drugs compared to chemical antibiotics for the treatment of infections in humans and animals” // Vestnik VSU, Series: Chemistry. Biology. Pharmacy, 2020, No. 4.

Тарантула В.З. «Словарь биотехнологических терминов» // Москва: Роспатент, 2005. Технический регламент Таможенного союза TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции».Tarantula V.Z. “Dictionary of biotechnological terms” // Moscow: Rospatent, 2005. Technical Regulations of the Customs Union TP CU 021/2011 “On the safety of food products”.

Фирсов Н.Н., «Микробиология: словарь терминов» // М: Дрофа, 2006.Firsov N.N., “Microbiology: dictionary of terms” // M: Drofa, 2006.

Хурса Р. В., Месникова И. Л., Микша Я. С.«Кишечная микрофлора: роль в поддержании здоровья и развитии патологии, возможности коррекции» // Минск БГМУ, 2017.Khursa R.V., Mesnikova I.L., Miksha Ya.S. “Intestinal microflora: role in maintaining health and the development of pathology, possibilities of correction” // Minsk BSMU, 2017.

Шендеров Б.А., Ткаченко Е.И., Лазебник Л. Б., Ардатская М. Д., Синица А.В., Захарченко М. М. «Метабиотики новая технология профилактики и лечения заболеваний, связанных с микроэкологическими нарушениями в организме человека» // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2018; 151(3): 83-92.Shenderov B.A., Tkachenko E.I., Lazebnik L.B., Ardatskaya M.D., Sinitsa A.V., Zakharchenko M.M. “Metabiotics is a new technology for the prevention and treatment of diseases associated with microecological disorders in the body human” // Experimental and clinical gastroenterology. 2018; 151(3): 83-92.

Шендеров Б.А. «Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т./ Т. 1: Микрофлора человека и животных и ее функции» // М.: ГРАНТЪ, 1998. - 288 с. Юшков В.В. и др. «Иммунокорректоры: Руководство для врачей и провизоров» // Екатеринбург: ООО «ИРА УТК», 2002. - 255 с. Shenderov B.A. “Medical microbial ecology and functional nutrition: in 3 volumes / T. 1: Microflora of humans and animals and its functions” // M.: GRANT, 1998. - 288 p. Yushkov V.V. and others. “Immunocorrectors: A Guide for Doctors and Pharmacists” // Ekaterinburg: LLC “IRA UTK”, 2002. - 255 p.

Claims

1. Metabiotic composition for normalizing the qualitative and quantitative composition of intestinal microflora, characterized in that it includes Bacillus subtilis metabolites with a molecular weight of 5-100 kDa and a filler, with the ratio of components, wt. %:

metabolites of Bacillus subtilis - 0.6-5;

filler - 95-99.4.

2. Metabiotic composition according to claim 1, characterized in that the metabolites of Bacillus subtilis are metabolites isolated from the culture liquid by ultrafiltration.

3. Metabiotic composition according to claim 1, characterized in that the Bacillus subtilis metabolites are metabolites isolated from the culture liquid of the Bacillus subtilis strain VKM B-3536D.

4. Metabiotic composition according to claim 1, characterized in that the filler includes a prebiotic.

5. Metabiotic composition according to claim 4, characterized in that the prebiotic is a disaccharide, oligosaccharide, polysaccharide or a mixture thereof.

6. Metabiotic composition according to claim 5, characterized in that the prebiotic is polyfructosan.

7. Metabiotic composition according to claim 6, characterized in that polyfructosan is oligofructose, inulin or a mixture thereof.

8. A method for obtaining Bacillus subtilis metabolites for their subsequent use in a metabiotic composition according to claim 1, including:

a) growing Bacillus subtilis in a liquid nutrient medium;

b) centrifugation of the culture suspension in a flow centrifuge to obtain a culture liquid;

c) ultrafiltration of the resulting culture liquid with a cutoff threshold of 100 kDa to obtain permeate;

d) ultrafiltration of the resulting permeate with a cutoff threshold of 5 kDa.

9. The method according to claim 8, in which the cultivation of Bacillus subtilis is carried out using the deep method.

10. The method according to claim 9, in which the cultivation is carried out in a fermenter with a filling factor of 60-70%.

11. The method according to claim 9, in which the cultivation is carried out at a temperature of 36-38°C.

12. The method according to claim 9, in which the cultivation is carried out with constant stirring and aeration.

13. The method according to claim 8, in which a nutrient medium with an initial pH of 6.8-7.2 is used.

14. The method according to claim 10, in which the cultivation of Bacillus subtilis is carried out until the liquid nutrient medium reaches pH=8.5-8.9.

15. The method according to claim 8, in which tangential ultrafiltration is used.

16. The method according to claim 14, in which tangential ultrafiltration is carried out until the filtration rate decreases by 2-3 times.

17. Use of the composition according to claim 1 for the treatment of post-Covid syndrome.