RU2800605C1 - Способ активации в-лимфоцитов для приобретения ими супрессивного фенотипа - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам активации всего пула В-лимфоцитов, позволяющих дифференцировать их в регуляторные В-клетки с выраженными иммуносупрессивными свойствами. Настоящее изобретение также относится к способу создания клеточных моделей В-лимфоцитов человека с супрессивным фенотипом. 4 ил.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области молекулярной иммунологии и может быть использовано для индукции супрессивного фенотипа в культуре В-клеток, выделенных из периферической крови человека, и их дифференцировке в регуляторные В-лимфоциты.

Уровень техники

Регуляторные В-лимфоциты (Bregs) являются субпопуляцией В-клеток, обладающей выраженными иммуносупрессивными свойствами, заключающимися в подавлении активности иммунных клеток-эффекторов (Inoue, S., Leitner, W.W., Golding, В., & Scott, D. (2006). Inhibitory effects of В cells on antitumor immunity. Cancer research, 66(15), 7741-7747; Sarvaria, A., Madrigal, J.A., & Saudemont, A. (2017). В cell regulation in cancer and anti-tumor immunity. Cellular & molecular immunology, 14(8), 662-674). Известно непосредственное участие Bregs в патогенезе ревматоидного артрита, псориаза, рассеянного склероза, диабета I типа, синдрома Шегрена, системной красной волчанки, миокардита, аллергии, бактериальных и вирусных инфекций, онкологических заболеваний, а также реакции «трансплантат против хозяина» (Wu, Н., Su, Z., & Barnie, P.А. (2020). The role of В regulatory (B10) cells in inflammatory disorders and their potential as therapeutic targets. International Immunopharmacology, 78, 106111; Jansen, K., Cevhertas, L., Ma, S., Satitsuksanoa, P., Akdis, M., & van de Veen, W. (2021). Regulatory В cells, A to Z. Allergy, 76(9), 2699-2715; Yanaba, K., Kamata, M., Ishiura, N., Shibata, S., Asano, Y., Tada, Y., … & Sato, S. (2013). Regulatory В cells suppress imiquimod-induced, psoriasis-like skin inflammation. Journal of leukocyte biology, 94(4), 563-573). Снижение пула Bregs показано у пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями, аутоиммунными патологиями и астмой (Ray, А., & Dittel, В.N. (2017). Mechanisms of regulatory В cell function in autoimmune and inflammatory diseases beyond IL-10. Journal of clinical medicine, 6(1), 12; Kamekura, R., Shigehara, K., Miyajima, S., Jitsukawa, S., Kawata, K., Yamashita, K., … & Ichimiya, S. (2015). Alteration of circulating type 2 follicular helper T cells and regulatory В cells underlies the comorbid association of allergic rhinitis with bronchial asthma. Clinical immunology, 158(2), 204-211). Повышенное содержание Bregs наблюдается при онкологических заболеваниях и при острых бактериальных инфекциях (Sarvaria, A., Madrigal, J.А., & Saudemont, А. (2017). В cell regulation in cancer and anti-tumor immunity. Cellular & molecular immunology, 14(8), 662-674; Fillatreau, S. (2016). Regulatory roles of В cells in infectious diseases. Clin Exp Rheumatol, 34(4 Suppl 98), 1-5.). Недавно было показано, что у больных COVID-19 в крови увеличено количество Bregs по сравнению со здоровыми донорами (Gupta, S., Su, Н., Narsai, Т., & Agrawal, S. (2021). SARS-CoV-2-associated T-cell responses in the presence of humoral immunodeficiency. International archives of allergy and immunology, 182(3), 195-209). Кроме того, убедительно продемонстрирована способность некоторых субпопуляций Bregs подавлять эффекторные Т-лимфоциты и NK-клетки в опухолевом микроокружении, что облегчает ускользание опухоли от иммунного ответа (Inoue, S., Leitner, W.W., Golding, В., & Scott, D. (2006). Inhibitory effects of В cells on antitumor immunity. Cancer research, 66(15), 7741-7747; Sarvaria, A., Madrigal, J.A., & Saudemont, A. (2017). В cell regulation in cancer and anti-tumor immunity. Cellular & molecular immunology, 14(8), 662-674).

Существует несколько гипотетических моделей развития Bregs, одна из которых основывается на предположении, что любая В-клетка может дифференцироваться в Breg в зависимости от специфических стимулов микроокружения (Mauri, С, & Menon, М. (2015). The expanding family of regulatory В cells. International immunology, 27(10), 479-486). В пользу этой модели свидетельствуют эксперименты по индукции субпопуляций Bregs при добавлении различных стимуляционных агентов (Rosser, Е.С., Oleinika, K., Tonon, S., Doyle, R., Bosma, A., Carter, N.А., … & Mauri, С.(2014). Regulatory В cells are induced by gut microbiota-driven interleukin-ip and interleukin-6 production. Nature medicine, 20(11), 1334-1339; Wang, R.X., Yu, C.R., Dambuza, I.M., Mahdi, R.M., Dolinska, M.В., Sergeev, Y.V., … & Egwuagu, С.E. (2014). Interleukin-35 induces regulatory В cells that suppress autoimmune disease. Nature medicine, 20(6), 633-641). На основании этой модели также существует гипотеза, согласно которой есть два типа Bregs, образование каждого из которых зависит от пути активации: "приобретенный" и "врожденный" тип (Mizoguchi, А., & Bhan, А.K. (2006). A case for regulatory В cells. The Journal of Immunology, 176(2), 705-710). Для дифференцировки "приобретенных" Bregs требуется поступление сигнала через BCR и взаимодействие CD40/CD40L. В норме взаимодействие CD40-CD40L между В- и Т-клетками соответственно индуцирует образование антитело-секретирующих клеток. Но чрезмерная продолжительность такого сигнала ингибирует дифференцировку плазматических клеток и приводит в основном к образованию Bregs. Роль CD40 в индукции Bregs была подтверждена в экспериментах на мышах с В-лимфоцитами, дефицитными по CD40. У этих мышей наблюдалась тяжелая форма экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, сопровождающаяся снижением продукции IL10 и увеличением Th1- и Th17-ответов (Fillatreau, S., Sweenie, С.Н., McGeachy, М.J., Gray, D., & Anderton, S. М. (2002). В cells regulate autoimmunity by provision of IL-10. Nature immunology, 3(10), 944-950; Mizoguchi, E., Mizoguchi, A., Preffer, F.I., & Bhan, A.K. (2000). Regulatory role of mature В cells in a murine model of inflammatory bowel disease. International immunology, 12(5), 597-605). Для дифференцировки "врожденных" Bregs в основном необходима поликлональная активация с участием лигандов Толл-подобных рецепторов (TLR) (липополисахарид, CpG). Было замечено, что фолликулярные В-клетки при стимуляции лигандами TLR2 или TLR4 синтезировали IL6 и IFNγ, а В-клетки MZ выделяли в основном IL10 (Gray, D., Gray, М., & Barr, Т. (2007). Innate responses of В cells. European journal of immunology, 37(12), 3304-3310; Lampropoulou, V., Hoehlig, K., Roch, Т., Neves, P., Gömez, E.C., Sweenie, С.H., … & Fillatreau, S. (2008). TLR-activated В cells suppress T cell-mediated autoimmunity. The Journal of Immunology, 180(7), 4763-4773).

Толл-подобные рецепторы, играющие ключевую роль в защите организма от патогенов, могут иметь протективное значение при аутоиммунных патологиях. Было показано, что агонистическая стимуляция через TLR4 и/или TLR9 приводит к снижению симптомов диабета, ЭАЭ и артрита у мышей, а снижение экспрессии TLR9 у людей приводит к увеличению заболеваемости системной красной волчанкой (Buenafe, А.С., & Bourdette, D.N. (2007). Lipopolysaccharide pretreatment modulates the disease course in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of neuroimmunology, 182(1-2), 32-40; Christensen, S.R., Shupe, J., Nickerson, K., Kashgarian, M., Flavell, R.A., & Shlomchik, M.J. (2006). Toll-like receptor 7 and TLR9 dictate autoantibody specificity and have opposing inflammatory and regulatory roles in a murine model of lupus. Immunity, 25(3), 417-428; Lampropoulou, V., Hoehlig, K., Roch, Т., Neves, P., Gomez, E.C., Sweenie, С.H., … & Fillatreau, S. (2008). TLR-activated В cells suppress T cell-mediated autoimmunity. The Journal of Immunology, 180(7), 4763-4773; Quintana, F.J., Rotem, A., Carmi, P., & Cohen, I.R. (2000). Vaccination with empty plasmid DNA or CpG oligonucleotide inhibits diabetes in nonobese diabetic mice: modulation of spontaneous 60-kDa heat shock protein autoimmunity. The Journal of Immunology, 165(11), 6148-6155). При исследовании роли регуляторных В-клеток в различных патологиях наиболее часто выделяют субпопуляции CD27⁺ Bregs (CD19⁺CD24^hiCD27⁺) и CD38^hi Bregs (CD19⁺CD24^hiCD38^hi).

Использование Bregs является перспективным методом терапии заболеваний, связанных с избыточной активацией иммунных реакций. Они обладают уникальным спектром механизмов иммуносупрессии - как при помощи растворимых факторов (IL10, IL35, TGFβ, гранзима В), так и поверхностных молекул (PD-L1, FasL, CD39, CD73) (Catalan, D., Mansilla, M.A., Ferrier, A., Soto, L., Oleinika, K., Aguillón, J.C., & Aravena, O. (2021). Immunosuppressive mechanisms of regulatory В cells. Frontiers in Immunology, 12, 611795; Nouel, A., Pochard, P., Simon, Q., Segalen, I., Le Meur, Y., Pers, J. O., & Hillion, S. (2015). B-Cells induce regulatory T cells through TGFβ/IDO production in A CTLA-4 dependent manner. Journal of autoimmunity, 59, 53-60; Shen, P., Roch, Т., Lampropoulou, V., O'Connor, R.A., Stervbo, U., Hilgenberg, E., … & Fillatreau, S. (2014). IL-35-producing В cells are critical regulators of immunity during autoimmune and infectious diseases. Nature, 507(7492), 366-370; Xu, L., Liu, X., Liu, H., Zhu, L., Zhu, H., Zhang, J., … & Su, Y. (2017). Impairment of granzyme B-producing regulatory В cells correlates with exacerbated rheumatoid arthritis. Frontiers in immunology, 8, 768.; Figueiro, F., Muller, L., Funk, S., Jackson, E.K., Battastini, A. M. O., & Whiteside, T.L. (2016). Phenotypic and functional characteristics of CD39high human regulatory В cells (Breg). Oncoimmunology, 5(2), el082703; Kaku, H., Cheng, K.F., Al-Abed, Y., & Rothstein, T.L. (2014). A novel mechanism of В cell-mediated immune suppression through CD73 expression and adenosine production. The Journal of Immunology, 193(12), 5904-5913), причем большую часть механизмов, определяющих их иммуносупрессивную функциональность, еще предстоит изучить. Широкий репертуар механизмов иммуносупрессии делает Bregs привлекательным инструментом для адоптивной клеточной терапии. В то же время имеется ряд ограничений для использования Bregs в терапии - прежде всего, их малочисленность и крайне низкая выживаемость, которая характерна для всех первичных культур В-клеток.

Существуют разные подходы для повышения выживаемости В-клеток in vitro. Долгое время активация и пролиферация В клеток in vitro достигалась за счет систем фидерных клеточных культур, экспрессирующих CD40L на плазматической мембране (Liebig, Т. М., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, А., & von Bergwelt-Baildon, М. S. (2009). Generation of human CD40-activated В cells. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (32), e1373). CD40L, связывающийся с CD40R, экспрессирующимся на В-клетках, имитирует сигнал от фолликулярных Т-хелперов. Экспрессируя CD40L и IL21, эти клетки дают В-лимфоцитам мощный костимуляторный сигнал. Фидерные системы показывали свою эффективность во многих исследованиях, но в экспериментах усложняет стандартизацию протоколов. В связи с этим постепенно началось внедрение растворимого CD40L в лабораторную культуру (Wagner, М., Poeck, Н., Jahrsdoerfer, В., Rothenfusser, S., Prell, D., Bohle, В., … & Hartmann, G. (2004). IL-12p70-dependent Th1 induction by human В cells requires combined activation with CD40 ligand and CpG DNA. The Journal of Immunology, 172(2), 954-963). In vitro CD40L может быть замещен антителом к CD40. Некоторые производители (Miltenyi Biotech, Германия) используют антитела для кросс-линкирования рецепторов CD40 на поверхности клеток, что усиливает внутриклеточный сигналинг, тем самым способствуя более эффективной активации. CD40L часто используется вместе с антителами к В-клеточному рецептору (BCR) - для имитирования связывания BCR с антигеном (Marasco, Е., Farroni, С, Cascioli, S., Marcellini, V., Scarsella, М., Giorda, Е., … & Carsetti, R. (2017). B-cell activation with CD40L or CpG measures the function of B-cell subsets and identifies specific defects in immunodeficient patients. European journal of immunology, 47(1), 131-143). Активация с использованием CD40L вместе с антителами к BCR по большей части способствует пролиферации наивных В-клеток («naive В cells»), в то время как добавление IL21 в активационную среду способствует пролиферации всех субтипов В-клеток (Karnell, J.L., & Ettinger, R. (2012). The interplay of IL-21 and BAFF in the formation and maintenance of human В cell memory. Frontiers in immunology, 3, 2). IL21 добавляется в тех случаях, когда необходимо дифференцировать В-клетки в плазматические клетки.

Существуют модифицированные протоколы, где вместо IL21 используется IL4. Было показано, что добавление IL4 способствует лучшему выживанию непереключенных клеток памяти (Banchereau, J., De Paoli, P., Valle, A., Garcia, E., & Rousset, F. (1991). Long-term human В cell lines dependent on interleukin-4 and antibody to CD40. Science, 251(4989), 70-72), в то время как IL21, напротив, способствует дифференцировке в более зрелое состояние, что сопровождается увеличением количества плазматических клеток и переключенных клеток памяти (Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G.P., Sheng, C., Phillips, Т.M., Lipsky, P.E., & Ettinger, R. (2007). Essential role of IL-21 in В cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. The Journal of Immunology, 179(9), 5886-5896). Для активации В-клеток in vitro также могут быть использованы антагонисты TLR. Известно, что стимуляция CpG (лигандом TLR9) способствует пролиферации и дифференцировке В-клеток памяти, причем клетки с переключенным изотипом антител активируются лучше непереключенных.

Для активации и проявления супрессивных функций В-клеткам необходим запуск нескольких сигнальных путей от TLR, CD40, BCR, CD80, CD86, а также некоторых рецепторов цитокинов (Mauri, С., & Menon, М. (2017). Human regulatory В cells in health and disease: therapeutic potential. The Journal of clinical investigation, 127(3), 772-779). Существуют разные подходы для повышения выживаемости Bregs в условиях in vitro. Наиболее популярными стимуляционными агентами для культивирования Bregs являются CpG, CD40L и форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА) в различных комбинациях. Guo Chen и коллеги в своей работе по исследованию Bregs у больных с тиреоид-ассоциированной офтальмопатией использовали комбинации CD40L и CpG для обогащения мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) фракцией CD19⁺IL10⁺ Bregs (Chen, G., Ding, Y., Li, Q., Li, Y., Wen, X., Ji, X., … & Yang, H. (2019). Defective regulatory В cells are associated with thyroid-associated ophthalmopathy. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 104(9), 4067-4077). Yohei Iwata с коллегами изучали индукцию дифференцировки РВМС в В10 (В-клетки, экспрессирующие IL10) клетки при помощи стимуляционньгх агентов: липополисахарида, CD40L, антитела к CD40, CpG, РМА и иономицина в различных комбинациях (Iwata, Y., Matsushita, Т., Horikawa, М., DiLillo, D.J., Yanaba, K., Venturi, G.M., … & Tedder, T.F. (2011). Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology, 117(2), 530-541). В другой работе выделенные из РВМС В-лимфоциты активировали с помощью CpG (ODN 2006) и обнаружили повышенную секрецию ими противовоспалительного цитокина TGFβ и индоламин-2,3-диоксигеназы, за счет чего В-клетки подавляли активность Т-лимфоцитов (Nouel, A., Pochard, P., Simon, Q., Segalen, I., Le Meur, Y., Pers, J.O., & Hillion, S. (2015). B-Cells induce regulatory T cells through TGF-p/IDO production in A CTLA-4 dependent manner. Journal of autoimmunity, 59, 53-60).

Исходя из вышесказанного можно заключить, что поиск новых комбинаций стимулирующих агентов для наиболее эффективной активации В-лимфоцитов, позволяющей дифференцировать их в регуляторные В-клетки с иммуносупрессивными свойствами, остается актуальной задачей.

Раскрытие сущности изобретения

Технический результат заявляемого изобретения заключается в создании нового способа активации всего пула В-лимфоцитов, позволяющий дифференцировать их в регуляторные В-клетки с выраженными иммуносупрессивными свойствами.

Технический результат достигается тем, что на выделенные из периферической крови доноров В-клетки воздействуют новой комбинацией стимуляционньгх агентов - CD40L, CpG и IL21 на протяжении 7 суток, в результате чего клетки приобретают иммуносупрессивную функциональность.

Краткое описание фигур

Фигура 1. Уровень выживаемости изолированной первичной культуры В-лимфоцитов после стимуляции смесью CD40L, CpG и IL21 на протяжении 7 дней был выше по сравнению с клетками, инкубирующимися без активации (контроль). Данные получены в четырех независимых экспериментах и представлены в виде средних значений ± SE. **Р<0,01 согласно непарному t-критерию Стьюдента.

Фигура 2. Доля CD24^hiCD27⁺ и CD24^hiCD38^hi субпопуляций среди CD19⁺ клеток через 7 дней инкубации без активации (контроль) и после стимуляции смесью CD40L, CpG и IL21. Данные получены в четырех независимых экспериментах и представлены в виде средних значений ± SE. *Р<0,05 при сравнении долей CD24^hiCD38^hi субпопуляции в нестимулированных и активированных В-лимфоцитах согласно t-критерию Уэлча.

Фигура 3. Активация первичной культуры В-лимфоцитов с использованием CD40L, CpG и IL21 приводит к повышению уровня мРНК генов CD274 (А) и EBI3 (Б), кодирующих иммунологический чекпойнт PD-L1 и общую субъединицу цитокинов IL27 и IL35, соотвественно. Данные получены в четырех независимых экспериментах и представлены в виде средних значений ± SE. *Р<0,05, ****р<0,0001 согласно непарному t-критерию Стьюдента.

Фигура 4. Культура В-лимфоцитов после активации CD40L, CpG и IL21 продуцирует больше провоспалительного цитокина IL10 в супернатант по сравнению с нестимулированными клетками. Данные получены в четырех независимых экспериментах и представлены в виде средних значений ± SE. ****Р<0,0001 согласно непарному t-критерию Стьюдента.

Осуществление изобретения

Предлагаемый способ активации В-лимфоцитов для их дифференцировки в регуляторные В-клетки позволит индуцировать их иммуносупрессивные свойства и обогатить субпопуляции CD19⁺CD24^hiCD27⁺ и CD19⁺CD24^hiCD38^hi В-лимфоцитов человека, что в свою очередь будет способствовать созданию клеточных моделей В-лимфоцитов человека с супрессивным фенотипом, а также повысит возможность использования регуляторных В-клеток для адоптивной клеточной терапии.

Изобретение осуществляется следующим способом, включающим несколько этапов.

I этап - изоляция В-клеток из РВМС.40 мл венозной крови здоровых доноров собирают в пробирки с ЭДТА (Sarstedt, Германия) и подвергают градиентному центрифугированию (400 g, 30 мин) в фиколле (плотность 1,077 г/см3, ПанЭко, Россия). Производят магнитную сепарацию В-клеток из РВМС с помощью CD19-MicroBeads (130-050-301, Miltenyi Biotech, Германия).

II этап - культивирование и активация В-клеток. Клетки культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 2 мМ глютамина, 20% FBS, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES и 0,5% пенициллина-стрептомицина (все ПанЭко, Россия). Посадка клеток производится в концентрации 1 млн/мл. В-клетки культивируют в активационной среде в течение 7 суток. В качестве стимуляционных агентов используют CD40L (591704, BioLegend, США), IL21 (130-095-784, Miltenyi Biotec, Германия), CpG (ODN2006, 5'-TCGTCGTCGTTGTGTCGTTGTGTGTGT-3', все связи тиофосфатные, ДНК-Синтез, Россия). Отрицательный контроль культивируется только в ростовой среде.

Далее настоящее изобретение детально проиллюстрировано с использованием конкретных примеров, представляющих предпочтительные воплощения изобретения. В то же время, изобретение не ограничивается описанными воплощениями, а включает любые альтернативные варианты и модификации, применение которых возможно с учетом сущности изобретения.

Пример 1. Определение фенотипа активированных CD40L, CpG, IL21 В-клеток.

CD19⁺ клетки, выделенные из периферической крови доноров, культивируют in vitro на протяжении 7 суток в присутствии CD40L в концентрации 1 мкг/мл, CpG в концентрации 2 мкМ, IL21 в концентрации 25 нг/мл. Далее определяют относительное количество (%) клеток с фенотипом CD24^hiCD27⁺ и CD24^hiCD38^hi с помощью проточной цитометрии. В результате было подтверждено увеличение числа живых В-клеток по сравнению с неактивированным контролем (Фигура 1), а также значительное повышение относительного количества регуляторных В-клеток под влиянием комбинации стимуляционных агентов по сравнению с неактивированным контролем (Фигура 2).

Пример 2. Анализ уровня экспрессии генов, кодирующих основные ингибиторные молекулы EBI3 (общая субъединица IL35 и IL27), кодируемой геном EBI3, и PD-L1, кодируемой геном CD274.

CD19⁺ клетки, выделенные из периферической крови доноров, культивируют in vitro на протяжении 7 суток в присутствии CD40L в концентрации 1 мкг/мл, CpG в концентрации 2 мкМ, IL21 в концентрации 25 нг/мл. Тотальную РНК выделяли из активированных В-клеток на 7-й день с помощью реагента ExtractRNA (Евроген, Россия). кДНК синтезировали с помощью набора MMLV RT kit (Евроген, Россия), а экспрессию мРНК определяли на Bio-Rad Real-time CFX96 Touch (Bio-Rad, США) с использованием qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия). Метод ΔΔCt (Livak, K.J., & Schmittgen, Т. D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2- ΔΔСТ method, methods, 25(4), 402-408) был использован для нормализации уровня экспрессии генов к АСТВ (бета-актин). Были использованы следующие пары праймеров: CD274 человека - SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, EBB человека - SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, АСТВ человека - SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6. В результате было установлено значительное увеличение экспрессии генов EBI3 и CD274 в активированных В-клетках по сравнению с нестимулированным контролем (Фигура 3).

Пример 3. Измерение уровней про- и противовоспалительных цитокинов в кондиционированной среде через 7 суток.

CD19⁺ клетки, выделенные из периферической крови доноров, культивируют in vitro на протяжении 7 суток в присутствии CD40L в концентрации 1 мкг/мл, CpG в концентрации 2 мкМ, IL21 в концентрации 25 нг/мл. Супернатанты активированных В-клеток собирают на 7-й день. Концентрацию про- и противовоспалительных цитокинов: IL10 и TNF, соответственно, определяют методом ИФА (88-7106 и 88-7346, ThermoFisher, США). В результате было установлено значительное повышение концентрации противовоспалительного цитокина IL10 в супернатантах от активированных В-клеток в сравнении с контролем. В свою очередь, уровень провоспалительного цитокина TNF, используемого в данном случае как контроль, после активации не возрастал (Фигура 4).

Как видно из Примеров 1-3, комбинация стимуляционньгх агентов CD40L, CpG и IL21 показывает высокую эффективность индукции иммуносупрессивных свойств в В-клетках, выделенных из периферической крови человека.

Claims (1)

1. Способ активации В-лимфоцитов для приобретения ими супрессивного фенотипа, включающий выделение мононуклеарных клеток из периферической крови человека методом градиентного центрифугирования, магнитную сепарацию CD19⁺ лимфоцитов из мононуклеарных клеток, активацию В-клеток олигонуклеотидом CpG, CD40L и IL21 в течение 7 суток.