RU2800558C1 - IGG4 Fc FRAGMENT CONTAINING A MODIFIED HINGE REGION - Google Patents

IGG4 Fc FRAGMENT CONTAINING A MODIFIED HINGE REGION Download PDF

Info

Publication number
RU2800558C1
RU2800558C1 RU2019123666A RU2019123666A RU2800558C1 RU 2800558 C1 RU2800558 C1 RU 2800558C1 RU 2019123666 A RU2019123666 A RU 2019123666A RU 2019123666 A RU2019123666 A RU 2019123666A RU 2800558 C1 RU2800558 C1 RU 2800558C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
igg4
factor
pro
fragment
ser
Prior art date
Application number
RU2019123666A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Сун Юб Чун
Йонг Хо ХУХ
Сан Хи ПАРК
Чжонг Соо Ли
Ин Юнг ЧОЙ
Original Assignee
Ханми Фарм. Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ханми Фарм. Ко., Лтд. filed Critical Ханми Фарм. Ко., Лтд.
Application granted granted Critical
Publication of RU2800558C1 publication Critical patent/RU2800558C1/en

Links

Abstract

FIELD: biochemistry.
SUBSTANCE: invention relates to a modified IgG4 Fc fragment having a low risk of inducing chain exchange and monomer formation in vivo, as well as to a nucleic acid encoding it. A vector, a host cell containing the above nucleic acid, and a method of obtaining an IgG4 Fc fragment using the above cell are disclosed. The invention also relates to a medicinal product conjugate containing the above IgG4 Fc fragment conjugated to the medicinal product using a linker.
EFFECT: effective minimization of the effector function of IgG4 Fc and the exchange of chains with IgG in vivo, preservation of the activity of the medicinal product conjugate in vivo and improvement of its prolonged release in vivo.
12 cl, 2 dwg, 3 ex

Description

Область изобретенияField of invention

Настоящее изобретение относится к Fc-фрагменту IgG4, пригодному в качестве носителя лекарственного средства, и более конкретно к Fc-фрагменту IgG4, который может минимизировать эффекторные функции с помощью Fc, но не индуцирует обмена цепи с IgG in vivo и может улучшать период полувыведения конъюгированного лекарственного средства in vivo.The present invention relates to an IgG4 Fc fragment useful as a drug carrier, and more particularly to an IgG4 Fc fragment which can minimize effector functions by Fc but does not induce chain exchange with IgG in vivo and can improve the half-life of the conjugated drug. means in vivo .

Предшествующий уровень техникиPrior Art

Развитие технологий генной инженерии привело к изготовлению и использованию различных видов белковых лекарственных препаратов. Однако белковые лекарственные средства имеют критические проблемы, заключающиеся в том, что они легко денатурируют или легко разрушаются in vivo протеазами и, таким образом, не могут сохранять свои концентрации или титры in vivo в течение длительного периода времени. Следовательно, очень важно поддерживать концентрации белковых лекарственных средств в крови и in vivo на подходящем уровне путем увеличения стабильности белка, чтобы обеспечить эффективное лечение пациентов при одновременном уменьшении у пациентов бремени частого введения белков посредством инъекций и т.д. и уменьшении расходов. The development of genetic engineering technologies has led to the manufacture and use of various types of protein drugs. However, protein drugs have critical problems in that they are easily denatured or easily degraded in vivo by proteases and thus cannot maintain their in vivo concentrations or titers over a long period of time . Therefore, it is very important to maintain the concentrations of protein drugs in the blood and in vivo at an appropriate level by increasing the stability of the protein in order to ensure effective treatment of patients while reducing the burden of patients to frequently inject proteins, etc. and cost reduction.

Соответственно, в течение длительного времени предпринимались различные попытки улучшения стабильности белковых лекарственных препаратов in vivo путем изменения типа белкового препарата, слияния с другими белками или присоединения подходящего полимера к поверхностям белков химическими или биологическими методами.Accordingly, various attempts have been made for a long time to improve the stability of protein drugs in vivo by changing the type of protein drug, fusion with other proteins, or attaching a suitable polymer to the surfaces of proteins by chemical or biological methods.

Одна из попыток улучшения стабильности белка путем слияния с другими белками заключается в осуществлении слиянии Fc-фрагмента иммуноглобулина с белком. One attempt to improve the stability of a protein by fusion with other proteins is to fuse an immunoglobulin Fc fragment to a protein.

Fc-участок отвечает за эффекторные функции, такие как комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) и антитело-зависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), в дополнение к антиген-связывающей способности, которая является основной функцией иммуноглобулинов. Кроме того, последовательность FcRn, присутствующая в Fc-участке, играет роль в регулировании уровня IgG в сыворотке путем увеличения времени полувыведения in vivo при конъюгации с рецептором FcRn in vivo. В связи с этим были проведены активные исследования для улучшения терапевтических белков посредством слияний Fc-участка с терапевтическими белками.The Fc region is responsible for effector functions such as complement-dependent cytotoxicity (CDC) and antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), in addition to antigen-binding capacity, which is the main function of immunoglobulins. In addition, the FcRn sequence present in the Fc region plays a role in regulating serum IgG levels by increasing the in vivo half-life when conjugated to the FcRn receptor in vivo . In this regard, active research has been carried out to improve therapeutic proteins through Fc-region fusions with therapeutic proteins.

Однако, Fc-слитые белки, полученные путем генетической рекомбинации, имеют недостатки, заключающиеся в том, что слияние белка возможно только в конкретной области Fc-участка, то есть с амино-концом или карбокси-концом, и только между гликозилированными белками или между агликозилированными белками, но невозможно между гликозилированным белком и агликозилированным белком. Кроме того, Fc-слитые белки, полученные посредством генетической рекомбинации, имеют проблемы, заключающиеся в том, что может иметь место иммунный ответ из-за новой аминокислотной последовательности, созданной посредством слияния, а также возможного повышения чувствительности протеиназы к линкерной области.However, Fc fusion proteins produced by genetic recombination have disadvantages in that protein fusion is possible only in a specific region of the Fc region, i.e. with the amino or carboxy terminus, and only between glycosylated proteins or between aglycosylated proteins. proteins, but not between a glycosylated protein and an aglycosylated protein. In addition, Fc fusion proteins produced by genetic recombination have problems in that an immune response may occur due to the new amino acid sequence created by the fusion, as well as a possible increase in the sensitivity of the proteinase to the linker region.

Кроме того, слитые с Fc белки имеют повышенное время полужизни целевого белка в сыворотке, но в то же время они имеют проблему, заключающуюся в проявлении эффекторных функций, которыми обладает Fc-участок (патент США 5349053). Посредством эффекторных функций Fc-участка слитые белки могут фиксировать комплементы или связываться с клетками, экспрессирующими FcR, для уничтожения конкретных клеток и индукции выработки и секреции различных цитокинов, которые вызывают воспаление, тем самым вызывая воспаление. Кроме того, последовательности белка в областях слияния представляют собой новые белковые последовательности, которые не присутствуют в организме человека и, таким образом, они имеют различные недостатки, включающие возможную индукцию иммунного ответа в случае длительного введения.In addition, Fc fusion proteins have an increased serum half-life of the target protein, but at the same time they have the problem of exhibiting the effector functions that the Fc region has (US Pat. No. 5,349,053). Through the effector functions of the Fc region, fusion proteins can fix complements or bind to FcR expressing cells to kill specific cells and induce the production and secretion of various cytokines that cause inflammation, thereby causing inflammation. In addition, the protein sequences at the confluence regions are novel protein sequences that are not present in the human body and thus have various disadvantages, including the possible induction of an immune response in case of long-term administration.

Соответственно, исследования были сосредоточены на использовании иммуноглобулинов или фрагментов иммуноглобулинов, в которых были удалены эффекторные функции, при сохранении времени полужизни в сыворотке. Cole et al. ранее сообщали, что ADCC-активность была ингибирована путем замены 234-ного, 235-ного и 237-ного остатков аланином в домене CH2, который, как известно, играет важную роль в связывании с Fc-рецепторами, для продуцирования Fc-производных с пониженными аффинностями к Fc-рецепторам (Cole et al., J. Immunol. 159: 3613-3621, 1997). Однако все они имеют несоответствующие аминокислоты, которые отличаются от аминокислот в природном Fc-участке человека, и могут, таким образом, иметь более высокий иммунитет или антигенность, а предпочтительные функции Fc могут быть утеряны.Accordingly, research has focused on the use of immunoglobulins or immunoglobulin fragments in which effector functions have been removed while maintaining serum half-life. Cole et al . previously reported that ADCC activity was inhibited by replacing residues 234, 235, and 237 with alanine in the CH2 domain, which is known to play an important role in binding to Fc receptors, to produce Fc derivatives with reduced affinities for Fc receptors (Cole et al. , J. Immunol . 159: 3613-3621, 1997). However, they all have mismatched amino acids that differ from the amino acids in the natural human Fc region, and may thus have higher immunity or antigenicity, and the preferred Fc functions may be lost.

В качестве способа удаления или уменьшения нежелательных эффекторных функций при сохранении высокой концентрации иммуноглобулинов в крови изучали способ удаления сахаридов в иммуноглобулинах. В патенте США 5585097 агликозилированные производные антител получали путем замещения остатка аспарагина в положении 297 домена CH2, который представляет собой гликозилированный остаток CD3-антител, другой аминокислотой при получении CD3-антител и, в частности, производные показывали снижение эффекторных функций при сохранении силы связывания с рецепторами FcRn без изменения их времени полужизни в сыворотке. Однако этот способ также имеет проблему, заключающуюся в том, что они могут быть опознаны как инородные вещества и, как таковые, отвергнуты иммунной системой из-за получения новой рекомбинантной конструкции. As a method for removing or reducing unwanted effector functions while maintaining a high concentration of immunoglobulins in the blood, a method for removing saccharides in immunoglobulins has been studied. In US Pat. FcRn without changing their serum half-life. However, this method also has the problem that they can be recognized as foreign substances and, as such, rejected by the immune system due to the production of a new recombinant construct.

При получении слитых белков с использованием последовательностей нативного IgG Fc может быть выбран IgG4 Fc для того, чтобы минимизировать эффекторные функции Fc. Известно, что IgG4 имеет время полужизни in vivo, аналогичное времени полужизни IgG1, но обладает относительно небольшими эффекторными функциями из-за разницы в аминокислотной последовательности. Однако, несмотря на преимущества IgG4, имеющего пониженные эффекторые функции, может происходить обмен цепей in vivo между IgG4 из-за его специфической шарнирной последовательности и, таким образом, сообщалось, что возникает много сложностей при использовании слитых белков в лечебных целях (van der Neut Kolfschoten, et al., Science, 317:1554-1557, 2007). То есть существует проблема, заключающаяся в том, что при использовании Fc IgG4 в качестве носителя для слитого белка происходит обмен цепей с IgG4, присутствующим in vivo, что приводит к образованию гибрида с нативным IgG4, или он может присутствовать в форме мономеров, тем самым изменяя исходную структуру и имею структуру с низкой терапевтической активностью. Общей проблемой является можно ли продукт слияния между Fc-фрагментом IgG4 и физиологически активным материалом получить посредством генной инженерии или in vitro.When preparing fusion proteins using native IgG Fc sequences, IgG4 Fc can be selected to minimize Fc effector functions. It is known that IgG4 has a similar in vivo half-life to IgG1, but has relatively small effector functions due to the difference in amino acid sequence. However, despite the advantages of IgG4 having reduced effector functions, in vivo chain exchange can occur between IgG4 due to its specific hinge sequence and thus many difficulties have been reported in the use of fusion proteins for therapeutic purposes (van der Neut Kolfschoten , et al ., Science, 317:1554-1557, 2007). That is, there is a problem that when using IgG4 Fc as a carrier for the fusion protein, there is an exchange of chains with IgG4 present in vivo , resulting in a hybrid with native IgG4, or it may be present in the form of monomers, thereby changing the original structure and have a structure with low therapeutic activity. A common problem is whether a fusion product between an IgG4 Fc fragment and a physiologically active material can be obtained through genetic engineering or in vitro .

Описание изобретенияDescription of the invention

Техническая проблемаTechnical problem

В этих условиях авторы настоящего изобретения в результате исследований при разработке Fc-фрагмента IgG, способного действовать в качестве носителя лекарственного средства с низким риском индуцирования реакции обмена Fab-области с IgG in vivo и эффекторных функций, но способного преодолеть недостатки технологии слияния посредством генетической рекомбинации, обнаружили, что может быть образован конъюгат лекарственного средства с увеличенной долговечностью, но без риска индукцирования реакции обмена Fab-области с IgG in vivo и эффекторных функций, когда шарнирная последовательность Fc-фрагмента IgG4, которая подвергнута мутации так, чтобы иметь только один остаток цистеина, продуцировалась в E. coli и была конъюгирована с лекарственным средством, тем самым осуществляя настоящее изобретение.Under these conditions, the present inventors, as a result of research into the development of an IgG Fc fragment capable of acting as a drug carrier with a low risk of inducing Fab region exchange reaction with IgG in vivo and effector functions, but able to overcome the disadvantages of fusion technology through genetic recombination, found that a drug conjugate with increased longevity but without the risk of inducing Fab-IgG exchange reaction in vivo and effector functions can be formed when the hinge sequence of an IgG4 Fc fragment that is mutated to have only one cysteine residue, was produced in E. coli and was conjugated with a drug, thereby carrying out the present invention.

Техническое решениеTechnical solution

Целью настоящего изобретения является предложение Fc-фрагмента IgG4, который имеет низкий риск индуцирования реакции обмена цепей с IgG in vivo или эффекторных функций и может действовать в качестве носителя лекарственного средства. Более конкретно, целью настоящего изобретения является предложение модифицированного Fc-фрагмента IgG4, включающего модифицированную шарнирную область, где часть шарнирной последовательности удалена так, чтобы содержался только один остаток цистеина. The aim of the present invention is to provide an IgG4 Fc fragment that has a low risk of inducing IgG chain exchange reaction in vivo or effector functions and can act as a drug carrier. More specifically, it is an object of the present invention to provide a modified IgG4 Fc fragment comprising a modified hinge region where a portion of the hinge sequence is removed so that only one cysteine residue is contained.

Другой целью настоящего изобретения является предложение нуклеиновой кислоты, которая кодирует модифицированный Fc-фрагмент IgG4, включающий модифицированную шарнирную область, где часть шарнирной последовательности удалена так, чтобы содержался только один остаток цистеина. Another object of the present invention is to provide a nucleic acid that encodes a modified IgG4 Fc fragment comprising a modified hinge region, where part of the hinge sequence is deleted so that only one cysteine residue is contained.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение вектора, включающего нуклеиновую кислоту, которая кодирует модифицированный Fc-фрагмент IgG4, включающий модифицированную шарнирную область, где часть шарнирной последовательности удалена так, чтобы содержался только один остаток цистеина.Yet another object of the present invention is to provide a vector comprising a nucleic acid that encodes a modified IgG4 Fc fragment comprising a modified hinge region, where part of the hinge sequence is deleted so that only one cysteine residue is contained.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение микроорганизма с введенным вектором, включающим нуклеиновую кислоту, которая кодирует модифицированный Fc-фрагмент IgG4, включающий модифицированную шарнирную область, где часть шарнирной последовательности удалена так, чтобы содержался только один остаток цистеина.Another object of the present invention is to provide a microorganism with an introduced vector comprising a nucleic acid that encodes a modified IgG4 Fc fragment comprising a modified hinge region, where part of the hinge sequence is deleted so that only one cysteine residue is contained.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение способа получения модифицированного Fc-фрагмента IgG4, включающего культивирование микроорганизма, в который вводят вектор, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует модифицированный Fc-фрагмент IgG4.Yet another object of the present invention is to provide a method for producing a modified IgG4 Fc fragment, comprising culturing a microorganism into which a vector comprising a nucleic acid encoding a modified IgG4 Fc fragment is introduced.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение конъюгата лекарственного средства, где лекарственное средство и модифицированный Fc-фрагмент IgG4 конъюгированы с помощью линкера.Yet another object of the present invention is to provide a drug conjugate wherein the drug and a modified IgG4 Fc fragment are conjugated with a linker.

Еще одной целью настоящего изобретения является предложение фармацевтической композиции, содержащей конъюгат лекарственного средства, где лекарственное средство и модифицированный Fc-фрагмент IgG4 конъюгированы с помощью линкера.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising a drug conjugate, wherein the drug and a modified IgG4 Fc fragment are conjugated with a linker.

Полезные эффекты изобретенияUseful effects of the invention

Настоящее изобретение может предложить модифицированный Fc-фрагмент IgG4, который обладает минимизированной эффекторной функцией без замены или добавления аминокислот или добавления гликанов, а также не имеет реакции обмена цепей с IgG4 in vivo. Модифицированный Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению, независимо от способа конъюгирования его с лекарственным средством, такого как метод генной инженерии и ковалентный метод in vitro, может ингибировать реакцию обмена цепей in vivo конъюгированного лекарственного средства, когда он конъюгирован с лекарственным средством, и может таким образом обеспечить значительное терапевтическое превосходство по сравнению с нативным Fc-фрагментом IgG4.The present invention can provide a modified IgG4 Fc fragment that has a minimized effector function without substitution or addition of amino acids or addition of glycans, and also does not have a chain exchange reaction with IgG4 in vivo . The modified IgG4 Fc fragment of the present invention, regardless of its drug conjugation method such as genetic engineering method and in vitro covalent method, can inhibit the in vivo chain exchange reaction of the conjugated drug when it is conjugated to the drug, and can way to provide a significant therapeutic superiority compared with the native Fc fragment of IgG4.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS

На Фиг. 1 показано присутствие/отсутствие обмена цепи человеческого IgG4 между биотинилированным hIgG4 и конъюгатом человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор-PEG (полиэтиленгликоль)-Fc-фрагмент IgG4 в крысиной крови.On FIG. 1 shows the presence/absence of a human IgG4 chain exchange between biotinylated hIgG4 and a human granulocyte colony stimulating factor-PEG (polyethylene glycol)-IgG4 Fc fragment conjugate in rat blood.

На Фиг. 2 показано присутствие/отсутствие обмена цепи человеческого IgG4 между биотинилированным hIgG4 и конъюгатом человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор-PEG (полиэтиленгликоль)-Fc-фрагмент IgG4 в человеческой кровиOn FIG. 2 shows the presence/absence of a human IgG4 chain exchange between biotinylated hIgG4 and a human granulocyte colony stimulating factor-PEG (polyethylene glycol)-IgG4 Fc fragment conjugate in human blood.

ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯBEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

Предпочтительные воплощения настоящего изобретения будут описаны ниже более подробно со ссылкой на сопутствующие графические материалы. Настоящее изобретение может, однако, быть воплощено в разных формах и не должно рассматриваться, как ограниченное воплощениями, изложенными в данном описании изобретения. Скорее эти воплощения представлены так, чтобы это описание было полным и всесторонни и полностью указывало объем настоящего изобретения специалистам в данной области техники.Preferred embodiments of the present invention will be described below in more detail with reference to the accompanying drawings. The present invention may, however, be embodied in various forms and should not be construed as being limited to the embodiments set forth in this specification. Rather, these embodiments are presented so that this description is complete and comprehensive and fully indicates the scope of the present invention to those skilled in the art.

В одном аспекте для достижения вышеуказанных задач в настоящем изобретении предложен модифицированный Fc-фрагмент IgG4, полезный в качестве носителя лекарственного средства. Более конкретно, в настоящем изобретении предложен модифицированный Fc-фрагмент IgG4, включающий модифицированную шарнирную область, где часть шарнирной последовательности удалена так, чтобы содержался только один остаток цистеина.In one aspect, in order to achieve the above objects, the present invention provides a modified IgG4 Fc fragment useful as a drug carrier. More specifically, the present invention provides a modified IgG4 Fc fragment comprising a modified hinge region where a portion of the hinge sequence is removed so that only one cysteine residue is contained.

Модифицированный Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению включает модифицированную шарнирную область, где часть шарнирной области, представленная следующей аминокислотной последовательностью, удалена так, чтобы содержался только один остаток цистеина:The modified IgG4 Fc fragment of the present invention includes a modified hinge region where the portion of the hinge region represented by the following amino acid sequence has been removed so that only one cysteine residue is contained:

Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro (SEQ ID NO: 1).Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro (SEQ ID NO: 1).

Авторы настоящего изобретения, стремясь решить проблему Fc-участка IgG4, имеющего низкую полезность из-за реакции обмена цепей с IgG4 in vivo, несмотря на его полезность в качестве носителя для увеличения времени полужизни лекарственных средств, обнаружили, что реакция обмена цепей in vivo и образование мономера не происходит, когда Fc-фрагмент IgG4 модифицирован удалением, путем делеции, одного из двух остатков цистеина, присутствующих в шарнирной Fc-участке-фрагмента IgG4, а также части шарнирной области, тем самым подтверждая, что модифицированный Fc-фрагмент IgG4, может быть эффективно использован в качестве носителя лекарственного средства.The inventors of the present invention, seeking to solve the problem of the Fc region of IgG4 having low utility due to the chain exchange reaction with IgG4 in vivo despite its usefulness as a carrier for increasing the half-life of drugs, found that the chain exchange reaction in vivo and the formation no monomer occurs when the IgG4 Fc fragment is modified by removing, by deletion, one of the two cysteine residues present in the IgG4 Fc hinge region as well as part of the hinge region, thereby confirming that the modified IgG4 Fc fragment may be effectively used as a drug carrier.

В одном воплощении Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению может включать шарнирную область, которая модифицирована путем делеции 1-8 аминокислот, включая остаток Cys в 8-ом положении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.In one embodiment, an IgG4 Fc fragment of the present invention may include a hinge region that is modified by deletion of 1-8 amino acids, including the Cys residue at position 8 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

Кроме того, в одном воплощении Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению может включать шарнирную область, которая модифицирована путем делеции 1-8 аминокислот, включая остаток Cys в 11-ом положении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.In addition, in one embodiment, the IgG4 Fc fragment of the present invention may include a hinge region that is modified by deletion of 1-8 amino acids, including the Cys residue at position 11 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

Альтернативно, в одном воплощении Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению может включать шарнирную область, которая модифицирована путем делеции 1-5 аминокислот, включая остаток Cys в 8-ом положении, или 1-5 аминокислот, включая остаток Cys в 11-ом положении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.Alternatively, in one embodiment, an IgG4 Fc fragment of the present invention may include a hinge region that is modified by deletion of 1-5 amino acids, including the Cys residue at position 8, or 1-5 amino acids, including the Cys residue at position 11 of the amino acid sequences SEQ ID NO: 1.

Альтернативно, в одном воплощении Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению может включать шарнирную область, которая модифицирована путем делеции 1-3 аминокислот, включая остаток Cys в 8-ом положении, или 1-3 аминокислот, включая остаток Cys в 11-ом положении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.Alternatively, in one embodiment, an IgG4 Fc fragment of the present invention may include a hinge region that is modified by deletion of 1-3 amino acids, including the Cys residue at position 8, or 1-3 amino acids, including the Cys residue at position 11 of the amino acid sequences SEQ ID NO: 1.

Аминокислотные остатки, удаленные как указано выше, могут быть расположены непрерывно или прерываться.Amino acid residues removed as above may be continuous or discontinuous.

Шарнирная Fc-участок-фрагмента IgG4 по настоящему изобретению характеризуется тем, что она модифицирована так, чтобы включать только один остаток цистеина между двумя остатками цистеина в 8-ом и 11-ом положениях аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и так, чтобы оба из этих двух остатков цистеина не были удалены.The hinge Fc region of the IgG4 fragment of the present invention is characterized in that it is modified to include only one cysteine residue between the two cysteine residues at the 8th and 11th positions of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and so that both of these two cysteine residues were not removed.

Шарнирная область, модифицированная так, чтобы включать только один остаток цистеина из двух остатков цистеина в шарнирной области, оказывает воздействие без обмена цепи in vivo, образования мономера и т.д. на модифицированном Fc-фрагменте IgG4.The hinge region modified to include only one cysteine residue of the two cysteine residues in the hinge region affects without chain exchangein vivo, monomer formation, etc. on a modified IgG4 Fc fragment.

При использовании здесь термин “носитель” относится к веществу, которое конъюгировано с лекарственным средством и, будучи конъюгированным с лекарственным средством, обычно увеличивает или ликвидирует физиологические активности лекарственного средства. Однако, носитель по настоящему изобретению увеличивает стабильность лекарственного средства in vivo, одновременно минимизируя снижение физиологической активности лекарственного средства, и носитель по настоящему изобретению характеризуется тем, что он не оказывает никаких фармакологических эффектов по противодействию терапевтическим активностям лекарственного средства, конъюгированного с этим носителем, таких как апоптоз или активация комплемента, и связывание с конкретным белком.As used herein, the term “carrier” refers to a substance that is conjugated to a drug and, when conjugated to the drug, typically enhances or eliminates the physiological activities of the drug. However, the carrier of the present invention increases the in vivo stability of the drug while minimizing the decrease in the physiological activity of the drug, and the carrier of the present invention is characterized in that it does not have any pharmacological effects to counteract the therapeutic activities of the drug conjugated to the carrier, such as apoptosis or complement activation, and binding to a specific protein.

При использовании здесь термин “Fc-фрагмент IgG4” относится к константной области 2 тяжелой цепи (CH2) и константной области 3 тяжелой цепи (CH3), исключая вариабельные области тяжелой и легкой цепи, константную область 1 тяжелой цепи (CH1) и константную область 1 легкой цепи (CL1) IgG4, но включая модифицированную шарнирную область в константной области тяжелой цепь. Кроме того, Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению может относиться к удлиненному Fc-участку, включающему часть или всю константную область 1 тяжелой цепи (CH1) и/или константную область 1 легкой цепи (CL1), за исключением вариабельных областей тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, поскольку Fc-фрагмент IgG4 обеспечивает по существу такой же эффект или улучшенный эффект по сравнению с эффектом нативного типа.As used herein, the term “IgG4 Fc fragment” refers to heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3), excluding heavy and light chain variable regions, heavy chain constant region 1 (CH1) and constant region 1 light chain (CL1) IgG4, but including a modified hinge region in the heavy chain constant region. In addition, an IgG4 Fc fragment of the present invention may refer to an extended Fc region comprising part or all of the heavy chain constant region 1 (CH1) and/or light chain constant region 1 (CL1), excluding the heavy and light chain variable regions. immunoglobulin, since the Fc fragment of IgG4 provides essentially the same effect or an improved effect compared to the effect of the native type.

Кроме того, Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению включает не только свою природную аминокислотную последовательность, но также производное его последовательности (мутеин). При использовании здесь термин “мутеин Fc-фрагмента IgG4” относится к Fc-фрагменту IgG4, имеющему аминокислотную последовательность, отличающуюся от его природного типа делецией, вставкой, консервативной заменой, неконсервативной заменой по меньшей мере одного аминокислотного остатка или их комбинацией в природной аминокислотной последовательности в области, не включающей его шарнирную область. Кроме того, возможны различные типы производных, у которых удалена область, способная образовывать дисульфидную связь, удалены несколько аминокислот из N-конца природного Fc или возможно добавление остатка метионина к N-концу природного Fc. Кроме того, область связывания комплемента, например C1q-связывающая область или область ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность), может быть удалена для ликвидации эффекторных функций. Способы получения мутеинов Fc-участка раскрыты в международных патентных публикациях WO 97/34631, WO 96/32478 и т.д.In addition, the Fc fragment of IgG4 of the present invention includes not only its natural amino acid sequence, but also a derivative of its sequence (mutein). As used herein, the term "IgG4 Fc mutein" refers to an IgG4 Fc fragment having an amino acid sequence that differs from its natural type by a deletion, insertion, conservative substitution, non-conservative substitution of at least one amino acid residue, or a combination thereof in the naturally occurring amino acid sequence in region that does not include its hinge region. In addition, various types of derivatives are possible in which the region capable of forming a disulfide bond has been removed, several amino acids have been removed from the N-terminus of natural Fc, or a methionine residue may have been added to the N-terminus of natural Fc. In addition, a complement binding region, such as a C1q binding region or an ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity) region, can be removed to abolish effector functions. Methods for producing Fc region muteins are disclosed in international patent publications WO 97/34631, WO 96/32478, etc.

Ранее был описана замена аминокислот в белках или пептидах без полного изменения активности молекул (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Самыми обычными заменами является замена аминокислотных остатков Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly. В некоторых случаях модификация может быть осуществлена путем фосфорилирования, сульфатирования, ацилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования, амидирования и т.д.The replacement of amino acids in proteins or peptides without a complete change in the activity of the molecules has been previously described (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most common substitutions are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro , Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu and Asp/Gly. In some cases, the modification may be by phosphorylation, sulfation, acylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation, amidation, etc.

При этом Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению может быть получен от людей, крупного рогатого скота, коз, свиней, мышей, кроликов, хомячков, крыс, морских свинок и т.д., и предпочтительно от человека.Meanwhile, the IgG4 Fc fragment of the present invention can be obtained from humans, cattle, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, guinea pigs, etc., and preferably from humans.

Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению может представлять собой рекомбинантный тип Fc-фрагмента IgG4, в котором Fc-участок, происходящий из людей, крупного рогатого скота, коз, свиней, мышей, кроликов, хомячков, крыс, морских свинок и т.д., был получен из микроорганизма.The IgG4 Fc fragment of the present invention may be a recombinant type of IgG4 Fc fragment in which an Fc region originating from humans, cattle, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, guinea pigs, etc. , was obtained from a microorganism.

Кроме того, Fc-фрагмент IgG4 может быть в форме нативных гликанов, гликанов с увеличенным количеством по сравнению с нативным гликаном или в форме без гликанов. Увеличение, уменьшение или удаление Fc-гликанов в иммуноглобулинах может быть осуществлено с использованием обычного способа, такого как химический способ, ферментативный способ, метод генной инженерии с использованием микроорганизмов и т.д. В частности, так как Fc-участок иммуноглобулина, где гликаны удалены из Fc, демонстрирует значительное ухудшение способности связывания комплемента (c1q) и уменьшение или элиминацию антителозависимой цитотоксичности или комплементзависимой цитотоксичности, ненужные иммунные ответы in vivo не индуцируются. В связи с этим более подходящим типом Fc-фрагмента IgG4, который лучше соответствует первоначальной цели использования в качестве носителя лекарственного средства, может быть агликозилированный Fc-фрагмент IgG4.In addition, the IgG4 Fc fragment can be in the form of native glycans, glycans with an increased amount compared to the native glycan, or in the form without glycans. The increase, decrease or removal of Fc-glycans in immunoglobulins can be carried out using a conventional method such as a chemical method, an enzymatic method, a genetic engineering method using microorganisms, etc. In particular, since the Fc region of an immunoglobulin where the glycans are removed from the Fc exhibits a significant deterioration in complement binding capacity (c1q) and a reduction or elimination of antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity, unnecessary in vivo immune responses are not induced. In this regard, a more suitable type of IgG4 Fc fragment, which better suits the original purpose of use as a drug carrier, may be an aglycosylated IgG4 Fc fragment.

При использовании здесь термин “дегликозилирование” относится к Fc-участку, где сахариды удаляются с помощью фермента, и “агликозилирование” относится к агликозилированному Fc-фрагменту, продуцируемому в прокариотической клетке, предпочтительно в E. coli.As used herein, the term “deglycosylation” refers to an Fc region where saccharides are removed by an enzyme, and “aglycosylation” refers to an aglycosylated Fc fragment produced in a prokaryotic cell, preferably E. coli .

Кроме того, Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению может быть модифицирован непептидным полимером. Предпочтительно, Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению может быть модифицирован полиэтиленгликолем. Fc-фрагмент IgG4, модифицированный полиэтиленгликолем, может быть получен посредством взаимодействия с полиэтиленгликолем при pH 7 или выше, предпочтительно при pH 7,5 - pH 9 и более предпочтительно при pH 8,0.In addition, the IgG4 Fc fragment of the present invention can be modified with a non-peptide polymer. Preferably, the IgG4 Fc fragment of the present invention may be modified with polyethylene glycol. An IgG4 Fc fragment modified with polyethylene glycol can be obtained by reaction with polyethylene glycol at pH 7 or higher, preferably at pH 7.5 - pH 9, and more preferably at pH 8.0.

При использовании здесь термин “модифицированная шарнирная область” относится к шарнирной области, в которой удален какой-либо один остаток цистеина из цистеиновых остатков в 8-ом и 11-ом положениях аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, которая представляет собой последовательность шарнирной области нативного Fc-фрагмента IgG4 и кроме того дополнительно удалена часть аминокислот.As used herein, the term “modified hinge region” refers to a hinge region in which any one cysteine residue is removed from the cysteine residues at positions 8 and 11 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which is the hinge sequence of the native Fc-fragment of IgG4 and additionally removed part of the amino acids.

В настоящем изобретении количество аминокислотных остатков, удаленных в шарнирной области, может находиться в диапазоне от 1 до 8, и, в частности, остатки аминокислот могут быть расположены непрерывно или быть прерваны. В частности, например, модифицированная шарнирная область по настоящему изобретению может включать делецию только одного остатка цистеина в 8-ом положении или в 11-ом положении; или делецию от 2 до 8 непрерывных или прерываемых аминокислот, включающих остаток цистеина в 8-ом положении; или делецию 2-8 непрерывных или прерываемых аминокислот, включающих остаток цистеина в 11-ом положении.In the present invention, the number of amino acid residues removed in the hinge region may range from 1 to 8, and in particular, the amino acid residues may be contiguous or interrupted. In particular, for example, the modified hinge region of the present invention may include the deletion of only one cysteine residue at the 8th position or at the 11th position; or a deletion of 2 to 8 continuous or discontinuous amino acids, including a cysteine residue in the 8th position; or a deletion of 2-8 continuous or discontinuous amino acids including a cysteine residue at position 11.

Модифицированная шарнирная область по настоящему изобретению может иметь, например, по меньшей мере одну аминокислотную последовательность из аминокислотных последовательностей, показанных ниже:The modified hinge region of the present invention may have, for example, at least one amino acid sequence from the amino acid sequences shown below:

Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro, Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys, Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys, Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Pro-Ser-Cys-Pro, Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro, Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys, Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Pro-Ser-Cys.Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro, Glu-Ser-Lys- Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro, Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys, Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys, Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Pro-Ser-Cys- Pro, Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro, Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu- Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys, Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro, Glu-Ser- Lys-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Pro-Ser-Cys.

В типичном воплощении настоящего изобретения, для того чтобы исследовать механизм обмена цепей между IgG4, присутствующим в крысиной крови и человеческой крови, и конъюгатом модифицированного Fc-фрагмента IgG4 и физиологически активного белка по настоящему изобретению, крысиную кровь и человеческую кровь соответственно смешивали с конъюгатом Fc IgG4 и физиологически активного белка и образцы собирали в соответствии с каждой временной зоной и подвергали анализу Вестерн-блоттинга, используя антитела к физиологически активному белку. В результате было подтверждено, что молекулы, которые могут образоваться в результате обмена цепей с крысиным IgG4 или IgG4 человека, не образовывались.In a typical embodiment of the present invention, in order to investigate the mechanism of chain exchange between IgG4 present in rat blood and human blood and the modified IgG4 Fc fragment and physiologically active protein conjugate of the present invention, rat blood and human blood, respectively, were mixed with an IgG4 Fc conjugate. and physiologically active protein, and samples were collected according to each time zone and subjected to Western blot analysis using antibodies to physiologically active protein. As a result, it was confirmed that molecules that could be generated by chain exchange with rat IgG4 or human IgG4 were not generated.

Соответственно, когда модифицированный Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению используют как носитель лекарственных средств, его можно эффективно использовать для увеличения времени полужизни лекарственных средств в сыворотке и улучшения физиологической активности лекарственных средств без обмена с нативными иммуноглобулинами in vivo. Accordingly, when the modified IgG4 Fc fragment of the present invention is used as a drug carrier, it can be effectively used to increase the serum half-life of drugs and improve the physiological activity of drugs without in vivo exchange with native immunoglobulins.

Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предлагается нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный Fc-фрагмент IgG4, имеющий шарнирную область, которая мутирована так, чтобы включать только один остаток цистеина, посредством удаления части аминокислот в шарнирной области, а также вектор, включающий эту нуклеиновую кислоту.According to another aspect, the present invention provides a nucleic acid encoding a modified IgG4 Fc fragment having a hinge region that is mutated to include only one cysteine residue by deleting a portion of the amino acids in the hinge region, as well as a vector comprising the nucleic acid.

Нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению, включает нуклеиновые кислоты, кодирующие модифицированный Fc-фрагмент IgG4, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (Pro-Ser-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Phe-Leu-Gly- Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys- Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr- Pro-Glu-Val-Thr-Cys-Val-Val-Val-Asp-Val- Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn- Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His-Asn- Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe- Asn-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu- Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly- Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys- Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr-Ile- Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro- Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu- Glu-Met-Thr-Lys-Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr- Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp- Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly-Gln- Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro- Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu- Tyr-Ser-Arg-Leu-Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg- Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser- Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His-Tyr- Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Lys). Например, нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может включать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3The nucleic acid encoding a modified IgG4 Fc fragment of the present invention includes nucleic acids encoding a modified IgG4 Fc fragment comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (Pro-Ser-Cys-Pro-Ala-Pro-Glu-Phe-Leu -Gly- Gly-Pro-Ser-Val-Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys- Pro-Lys-Asp-Thr-Leu-Met-Ile-Ser-Arg-Thr- Pro-Glu-Val-Thr -Cys-Val-Val-Val-Asp-Val- Ser-Gln-Glu-Asp-Pro-Glu-Val-Gln-Phe-Asn-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Glu-Val-His -Asn- Ala-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Glu-Glu-Gln-Phe- Asn-Ser-Thr-Tyr-Arg-Val-Val-Ser-Val-Leu- Thr-Val-Leu-His -Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly- Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys- Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Ile-Glu-Lys-Thr -Ile- Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro- Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-Met-Thr-Lys -Asn-Gln-Val-Ser-Leu-Thr- Cys-Leu-Val-Lys-Gly-Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-Asn-Gly -Gln- Pro-Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys-Thr-Thr-Pro-Pro- Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Phe-Phe-Leu- Tyr-Ser-Arg-Leu -Thr-Val-Asp-Lys-Ser-Arg-Trp-Gln-Glu-Gly-Asn-Val-Phe-Ser-Cys-Ser-Val-Met-His-Glu-Ala-Leu-His-Asn-His -Tyr-Thr-Gln-Lys-Ser-Leu-Ser-Leu-Ser-Leu-Gly-Lys). For example, the nucleic acid of the present invention may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3

При использовании здесь термин “вектор” относится к рекомбинантному вектору, способному экспрессировать целевой белок в подходящей клетке-хозяине, который представляет собой генетическую конструкцию, включающую регуляторные факторы, функционально связанные так, чтобы сделать возможной экспрессию генной вставки.As used herein, the term "vector" refers to a recombinant vector capable of expressing a target protein in a suitable host cell, which is a genetic construct comprising regulatory factors operably linked to allow expression of the gene insert.

При использовании здесь термин “функционально связанный” означает, что регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей целевой белок, так что осуществляться основные функции. Функциональное связывание с вектором может быть выполнено с помощью метода генетической рекомбинации, хорошо известного в данной области техники, и сайт-специфического расщепления ДНК, а связывание может быть легко выполнено с использованием ферментов и т.д., как правило, хорошо известных в данной области. Подходящие экспрессионный векторы могут включать последовательности регуляторных элементов экспрессии, такие как промотор, стартовый кодон, терминирующий кодон, сигнал полиаденилирования и энхансер. Стартовый кодон и терминирующий кодон должны по существу оказывать свои действия в субъекте, когда в него вводится генетическая конструкция, и должны быть в рамке считывания с кодирующей последовательностью. Обычный промотор может быть конститутивным или индуцируемым. Экспрессионный вектор также может включать селективный маркер для селекции клетки-хозяина, содержащей вектор, и для реплицируемого экспрессионного вектора он может включать точку начала репликации.As used herein, the term "operably linked" means that a regulatory nucleic acid sequence is operably linked to a nucleic acid sequence encoding a target protein such that essential functions are performed. Functional binding to the vector can be done using genetic recombination techniques well known in the art and site-specific DNA cleavage, and binding can be easily done using enzymes etc. generally well known in the art. . Suitable expression vectors may include expression control sequences such as a promoter, start codon, stop codon, polyadenylation signal, and enhancer. The start codon and the stop codon must essentially have their effect in the subject when the genetic construct is introduced into it, and must be in reading frame with the coding sequence. A typical promoter may be constitutive or inducible. The expression vector may also include a selectable marker for selection of a host cell containing the vector, and for a replicable expression vector, it may include an origin of replication.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен микроорганизм, в который вводят указанный выше вектор, способный продуцировать модифицированные Fc-фрагменты IgG4.In another aspect of the present invention, a microorganism is provided into which the above vector is introduced, capable of producing modified IgG4 Fc fragments.

Для целей настоящего изобретения микроорганизм предпочтительно представляет собой эукариотическую клетку. Эукариотическая клетка может представлять собой Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Pseudomonas, Proteus mirabilis, Staphylococcus и т.д., и предпочтительно Escherichia coli. Escherichia coli может представлять собой E. coli XL-1 blue, E. coli BL21 (DE3), E. coli JM109, виды E. coli DH, E. coli TOP10 и E. coli HB101 и более предпочтительно E. coli BL21 (DE3), но не ограничена ими. Когда E. coli используют в качестве клетки-хозяина, Fc-участок иммуноглобулинов может быть получен в форме, где сахариды, присутствующие в домене CH2 нативных иммуноглобулинов, изначально удалены, так как E. coli не обладает системой конъюгирования гликанов с белками. Хотя сахариды, присутствующие в домене CH2 иммуноглобулинов, не влияют на структурную стабильность иммуноглобулинов, известно, что иммуноглобулины могут связываться с клетками, экспрессирующими Fc-рецептор, и вызывать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность, индуцировать секрецию цитокинов иммунными клетками, таким образом вызывая воспалительные ответы, и связываться с элементом C1q комплементов и индуцировать комплементсвязывающие реакции. Соответственно, если Fc-участки агликозилированных иммуноглобулинов образуются и конъюгируют с терапевтическими белками, концентрация терапевтических белков в сыворотке может поддерживаться в течение длительного периода времени, не индуцируя эффекторных функций иммуноглобулинов.For the purposes of the present invention, the microorganism is preferably a eukaryotic cell. The eukaryotic cell may be Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Pseudomonas, Proteus mirabilis, Staphylococcus, etc., and preferably Escherichia coli . Escherichia coli can be E. coli XL-1 blue, E. coli BL21 (DE3), E. coli JM109, E. coli DH species, E. coli TOP10 and E. coli HB101 , and more preferably E. coli BL21 (DE3 ), but is not limited to them. When E. coli is used as a host cell, the Fc region of immunoglobulins can be obtained in a form where the saccharides present in the CH2 domain of native immunoglobulins are initially removed, since E. coli does not have a glycan-to-protein conjugation system. Although the saccharides present in the CH2 domain of immunoglobulins do not affect the structural stability of immunoglobulins, it is known that immunoglobulins can bind to cells expressing the Fc receptor and induce antibody-dependent cellular cytotoxicity, induce cytokine secretion by immune cells, thus inducing inflammatory responses, and bind to the C1q element of complements and induce complement-fixing reactions. Accordingly, if the Fc regions of aglycosylated immunoglobulins are formed and conjugated to therapeutic proteins, the serum concentration of therapeutic proteins can be maintained for a long period of time without inducing the effector functions of the immunoglobulins.

Метод трансформации прокариотических клеток указанным выше вектором может включать любой метод, который может вводить нуклеиновые кислоты в клетку, и трансформацию можно выполнять путем выбора стандартной методики, подходящей для данной клетки-хозяина, известной в данной области техники. Примеры метода могут включать электропорацию, слияние протопластов, преципитацию с помощью фосфата кальция (CaPO4), преципитацию с помощью хлорида кальция (CaCl2), перемешивание с использованием волокон карбида кремния, ПЭГ (полиэтиленгликоля), декстрансульфата, липофектамина и т.д., но не ограничены ими.The method for transforming prokaryotic cells with the above vector may include any method that can introduce nucleic acids into the cell, and transformation can be performed by selecting a standard technique suitable for a given host cell known in the art. Examples of the method may include electroporation, protoplast fusion, calcium phosphate precipitation (CaPO 4 ), calcium chloride precipitation (CaCl 2 ), agitation using silicon carbide fibers, PEG (polyethylene glycol), dextran sulfate, lipofectamine, etc., but not limited to them.

Микроорганизм, с введенным рекомбинантным экспрессионным вектором можно культивировать обычным способом.The microorganism introduced with the recombinant expression vector can be cultured in a conventional manner.

Процесс культивирования можно использовать после легкой корректировки в соответствии с выбранным микроорганизмом. Как правило, среда, используемая для культивирования, должна содержать все питательные вещества, необходимые для роста и выживания клеток. Среда может содержать различные источники углерода, источники азота и микроэлементные компоненты. Примеры источников углерода могут включать углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло, кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Такие источники углерода можно использованы по отдельности или в комбинации. Примеры источников азота могут включать органические источники азота, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной соус, солодовый экстракт, кукурузный экстракт (CSL) и жмых соевых бобов; и неорганические источники азота, такие как мочевина, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота можно использовать по отдельности или в комбинации. В указанной выше среде в качестве источников фосфора могут содержаться дигидрофосфат, гидрофосфат и соответствующие натрий-содержащие соли. Кроме того могут содержаться соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа. Кроме того, могут также содержаться аминокислоты, витамины и соответствующие предшественники. Во время периода культивирования рН культуры можно корректировать путем добавления к культуре подходящим образом таких соединений, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Кроме того, во время периода культивирования можно добавлять пеногаситель, такой как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты, для предотвращения пенообразования. Дополнительно, для того чтобы поддерживать аэробное состояние культуры, можно вводить в культуру кислород или кислород-содержащий газ (например воздух). Температура культуры может, как правило, составлять от 20°C до 45°C и предпочтительно от 25°C до 40°C. Кроме того, может быть использован ферментатор. Когда белки получают с использованием ферментатора, следует учитывать различные факторы, включающие скорость роста и количество экспрессированных клеткой-хозяином продуктов. Экспрессия белка может быть индуцирована добавлением IPTG (изопропилтиогалактозид) или тому подобного в подходящих условиях культивирования. Модифицированный Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению может сверхэкспрессироваться в клетке-хозяине в форме агрегата или может экспрессироваться в водной форме. Независимо от типа экспрессии, белки могут быть очищены с помощью обычного способа очистки белков.The culture process can be used after slight adjustment according to the selected microorganism. As a rule, the medium used for culturing should contain all the nutrients necessary for cell growth and survival. The environment may contain various carbon sources, nitrogen sources and trace elements. Examples of carbon sources may include carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch and cellulose; fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil; fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid; alcohols such as glycerol and ethanol; and organic acids such as acetic acid. Such carbon sources may be used singly or in combination. Examples of nitrogen sources may include organic nitrogen sources such as peptone, yeast extract, meat sauce, malt extract, corn extract (CSL) and soybean meal; and inorganic nitrogen sources such as urea, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate. These nitrogen sources can be used singly or in combination. In the above medium, dihydrogen phosphate, hydrogen phosphate and the corresponding sodium-containing salts can be contained as sources of phosphorus. In addition, metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate may be present. In addition, amino acids, vitamins and corresponding precursors may also be contained. During the culture period, the pH of the culture can be adjusted by adding compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, and sulfuric acid to the culture, as appropriate. Furthermore, during the culture period, a defoamer such as a polyglycol fatty acid ester may be added to prevent foaming. Additionally, in order to maintain the aerobic state of the culture, oxygen or an oxygen-containing gas (eg air) can be introduced into the culture. The temperature of the culture may generally be from 20°C to 45°C and preferably from 25°C to 40°C. In addition, a fermenter may be used. When proteins are produced using a fermenter, various factors must be considered, including the rate of growth and the amount of products expressed by the host cell. Protein expression can be induced by adding IPTG (isopropylthiogalactoside) or the like under suitable culture conditions. The modified IgG4 Fc fragment of the present invention may be overexpressed in the host cell in the form of an aggregate, or may be expressed in an aqueous form. Regardless of the type of expression, proteins can be purified using conventional protein purification methods.

Соответственно, в другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения модифицированного Fc-фрагмента IgG4, и этот способ включает культивирование микроорганизма с введенной в него нуклеиновой кислотой, кодирующей модифицированный Fc-фрагмент IgG4.Accordingly, in another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a modified IgG4 Fc fragment, and the method comprises culturing a microorganism introduced into it with a nucleic acid encoding a modified IgG4 Fc fragment.

В соответствии с указанным выше способом, промышленное применение указанного выше Fc-фрагмента IgG4, продуцируемого в прокариотической клетке, такой как E. coli, не имеет особых ограничений. Примером применения может быть его использование в качестве носителя для образования конъюгата с произвольным лекарственным средством.According to the above method, the industrial use of the above IgG4 Fc fragment produced in a prokaryotic cell such as E. coli is not particularly limited. An example of application would be its use as a carrier for the formation of a conjugate with an arbitrary drug.

Соответственно, в другом аспекте настоящего изобретения предлагается лекарственное средство и конъюгат лекарственного средства, в котором модифицированный Fc-фрагмент IgG4 конъюгирован с ним посредством линкера.Accordingly, in another aspect of the present invention, there is provided a drug and a drug conjugate wherein a modified IgG4 Fc fragment is conjugated thereto via a linker.

При использовании здесь "конъюгат лекарственного средства" или "конъюгат" означает, что по меньшей мере одно лекарственное средство объединено по меньшей мере с одним из модифицированных Fc-фрагментов IgG4.As used herein, "drug conjugate" or "conjugate" means that at least one drug is combined with at least one of the modified IgG4 Fc fragments.

При использовании здесь лекарственное средство относится к веществу, которое может демонстрировать терапевтические активности при введении людям или животным, и оно может включать полипептид, соединение, экстракт, нуклеиновую кислоту и т.д., но не ограничено ими. Предпочтительно, лекарственное средство представляет собой полипептидное лекарственное средство.As used herein, a drug refers to a substance that can exhibit therapeutic activities when administered to humans or animals, and may include, but is not limited to, a polypeptide, compound, extract, nucleic acid, etc. Preferably, the drug is a polypeptide drug.

При использовании здесь, физиологически активное полипептидное лекарственное средство, полипептидное лекарственное средство и белковое лекарственное средство следует понимать как имеющие одинаковое значение, и они характеризуются тем, что являются физиологически активными типами, проявляющими антагонизм к различным физиологическим явлениям in vivo. As used herein, a physiologically active polypeptide drug, a polypeptide drug, and a protein drug should be understood to have the same meaning, and are characterized by being physiologically active types antagonizing various physiological phenomena in vivo .

Тип конъюгата, в котором Fc-фрагмент IgG4 конъюгирован с лекарственным средством, конкретно не ограничен, и Fc-фрагмент IgG4 и лекарственное средство могут быть конъюгированы в различных соотношениях.The type of conjugate in which the IgG4 Fc fragment is conjugated to a drug is not particularly limited, and the IgG4 Fc fragment and the drug can be conjugated in various ratios.

В настоящем изобретении линкер может относиться как к пептидному линкеру, так и к непептидному линкеру, предпочтительно к непептидному линкеру, и более предпочтительно к непептидному полимеру.In the present invention, a linker may refer to both a peptide linker and a non-peptide linker, preferably a non-peptide linker, and more preferably a non-peptide polymer.

Непептидный полимер относится к биосовместимому полимеру, с которым конъюгированы по меньшей мере два повторяющихся звена, и повторяющиеся звенья соединены произвольными ковалентными связями, отличными от пептидных связей. Непептидный полимер может быть выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемого полимера, такого как полимолочная кислота (PLA) и сополимер поли-молочная-гликолевая кислота (PLGA), липидного полимера, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации, и предпочтительно полиэтиленгликоля. Производные, известные в данной области, и производные, которые могут быть легко получены с использованием методик, известных в данной области техники, также включены в объем настоящего изобретения.A non-peptide polymer refers to a biocompatible polymer to which at least two repeat units are conjugated and the repeat units are linked by arbitrary covalent bonds other than peptide bonds. The non-peptidic polymer may be selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene glycol-propylene glycol copolymer, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, a biodegradable polymer such as polylactic acid (PLA), and polylactic-glycolic acid copolymer. (PLGA), lipid polymer, chitins, hyaluronic acid and combinations thereof, and preferably polyethylene glycol. Derivatives known in the art, and derivatives that can be easily obtained using techniques known in the art, are also included in the scope of the present invention.

В настоящем изобретении непептидный полимер может иметь две или три реакционноспособные концевые группы, и концевая реакционноспособная группа непептидного полимера предпочтительно выбрана из группы, состоящей из реакционноспособной альдегидной группы, пропионовой альдегидной группы, бутилальдегидной группы, малеимидной группы и сукцинимидного производного. Примеры сукцинимидного производного могут включать сукцинимидилпропионат, гидроксилсукцинимидил, сукцинимидилкарбоксиметил и сукцинимидилкарбонат. В частности, когда непептидный полимер в качестве реакционноспособной группы содержит реакционноспособную альдегидную группу на своем конце, это может свести к минимуму неспецифические взаимодействия и является эффективным в его соответствующем связывания с физиологическим полипептидом и Fc-фрагментом иммуноглобулина. Конечный продукт, продуцируемый путем восстановительного алкилирования посредством альдегидного связывания, является более стабильным, чем присоединенный посредством амидной связи. Альдегидная реакционноспособная группа селективно взаимодействует на N-конце при низком pH, и при высоком pH, например pH 9,0, она может образовать ковалентную связь с остатком лизина.In the present invention, the non-peptide polymer may have two or three reactive end groups, and the reactive end group of the non-peptide polymer is preferably selected from the group consisting of a reactive aldehyde group, a propionic aldehyde group, a butylaldehyde group, a maleimide group, and a succinimide derivative. Examples of the succinimide derivative may include succinimidyl propionate, hydroxyl succinimidyl, succinimidyl carboxymethyl, and succinimidyl carbonate. In particular, when the non-peptide polymer contains a reactive aldehyde group at its end as a reactive group, it can minimize non-specific interactions and is effective in its appropriate binding to a physiological polypeptide and an immunoglobulin Fc fragment. The end product produced by reductive alkylation through aldehyde bonding is more stable than that attached through an amide bond. The aldehyde reactive group reacts selectively at the N-terminus at low pH, and at high pH, eg pH 9.0, it can form a covalent bond with the lysine residue.

Концевые реакционноспособные группы непептидного полимера могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Например, непептидный полимер может иметь малеимидную группу на одном конце, и при этом иметь альдегидную группу, пропиональдегидную группу или бутилальдегидную группу на другом конце. При использовании полиэтиленгликоля или непептидного полимера, имеющего гидроксильную реакционноспособную группу на обоих концах, конъюгат по настоящему изобретению может быть получен путем активации гидроксильной группы с помощью различных реакционноспособных групп в соответствии с известной химической реакцией или с использованием полиэтиленгликоля, имеющего модифицированную реакционноспособную группу, который имеется в продаже.The terminal reactive groups of the non-peptide polymer may be the same or different from each other. For example, a non-peptide polymer may have a maleimide group at one end, yet have an aldehyde group, a propionaldehyde group, or a butylaldehyde group at the other end. When using polyethylene glycol or a non-peptide polymer having a hydroxyl reactive group at both ends, the conjugate of the present invention can be obtained by activating the hydroxyl group with various reactive groups according to a known chemical reaction, or using polyethylene glycol having a modified reactive group, which is available in sale.

Что касается физиологически активных полипептидов для применения путем связывания с модифицированным Fc-фрагментом IgG4 по настоящему изобретению, любой из них, требующий увеличения времени полужизни в сыворотке может быть использован без ограничения. Например, могут быть использованы различные физиологически активные полипептиды, такие как цитокины, интерлейкины, интерлейкин-связывающие белки, ферменты, антитела, факторы роста, факторы регуляции транскрипции, факторы свертывания крови, вакцины, структурные белки, лигандные белки или рецепторы, антигены клеточной поверхности, антагонисты рецептора, их производные и их аналоги.With regard to physiologically active polypeptides for use by binding to a modified IgG4 Fc fragment of the present invention, any of them requiring an increase in serum half-life can be used without limitation. For example, various physiologically active polypeptides can be used, such as cytokines, interleukins, interleukin-binding proteins, enzymes, antibodies, growth factors, transcription regulation factors, blood coagulation factors, vaccines, structural proteins, ligand proteins or receptors, cell surface antigens, receptor antagonists, their derivatives and their analogues.

Более конкретно, физиологически активные полипептиды могут включать гормон роста человека; гормон, высвобождающий гормон роста; пептид, высвобождающий гормон роста; интерфероны и рецепторы интерферона (например интерферон-α, -β и -γ, растворимый рецептор интерферона I типа и т.д.), колониестимулирующие факторы, интерлейкины (например интерлейкин-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30 и т.д.) и рецепторы интерлейкина (например рецептор IL-1, рецептор IL-4, и т.д.), ферменты (например глюкоцереброзидазу, идуронат-2-сульфатазу, α-галактозидазу-А, агалзидазу α, β, α-L-идуронидазу, бутирилхолинэстеразу, хитиназу, глутаматдекарбоксилазу, имиглюцеразу, липазу, уриказу, ацетилгидролазу фактора активации тромбоцитов, нейтральную эндопептидазу, миелопероксидазу и т.д.), интерлейкин- и цитокин -связывающие белки (например IL-18bp, TNF-связывающий белок и т.д.), фактор активации макрофагов, макрофагальный пептид, B-клеточные факторы, Т-клеточные факторы, белок A, факторы ингибирования аллергии, гликопротеины некроза, иммунотоксины, лимфотоксины, факторы некроза опухоли, опухолевые супрессоры, трансформирующие факторы роста, α-1- антитрипсин, альбумин, α-лактальбумин, аполипопротеин-Е, эритропоэтин, высокогликозилированный эритропоэтин, ангиопоэтины, гемоглобины, тромбин, пептид, активирующий рецептор тромбина, тромбомодулин, фактор коагуляции крови VII, фактор коагуляции крови VIIα, фактор коагуляции крови VIII, фактор коагуляции IX, фактор коагуляции крови XIII, активаторы плазминогена, фибрин-связывающий пептид, урокиназу, стрептокиназу, гирудин, протеин C, C-реактивный белок, ингибитор ренина, ингибитор коллагеназы, супероксиддисмутазу, лептин, тромбоцитарный фактор роста, эпителиальный фактор роста, эпидермальный фактор роста, ангиостатин, ангиотензин, костный морфогенетический фактор роста, костный морфогенетический белок, кальцитонин, инсулин и производное инсулина, атриопептин, хрящевой индуцирующий фактор, элкатонин, активирующий фактор соединительной ткани, ингибитор пути тканевого фактора, фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, гормон высвобождения лютеинизирующего гормона, факторы роста нервов (например фактор роста нервов, цилиарный нейротрофический фактор, фактор аксогенезиса-1, мозговой натрийуретический пептид, нейротрофический фактор глиальных клеток, нетрин, фактор ингибирования нейтрофилов, нейротрофические факторы, неврин и т.д.), паратиреоидный гормон, релаксин, секретин, соматомедин, инсулиноподобный фактор роста, адренокортикальный гормон, глюкагон, инсулинотропные пептиды, включающие глюкагон-подобный пептид-1 и экзендин-4, инкретины, секретируемые в кишечнике, адипоциты, включающие лептоны, и нейроцитокины, эффективные для метаболического синдрома, холецистокинин, полипептиды поджелудочной железы, гастрин-высвобождающие пептиды, кортикотропин-высвобождающий фактор, тиреостимулирующий гормон, аутотаксин, лактоферрин, миостатин, рецепторы (например TNFR (P75), TNFR (P55), рецептор IL-1, рецептор VEGF, рецептор активации B-клеток и т.д.), антагонисты рецепторов (например IL1-Ra, и т.д.), антигены клеточной поверхности (например CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69, и т.д.), моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антител (например scFv, Fab, Fab', F(ab')2 и Fd), вирусный вакцинный антиген и т.д., но не ограничиваются ими. Физиологически активный полипептид, применимый в настоящем изобретении, может быть природного типа; полученным посредством генетической рекомбинации в прокариотической клетке, такой как E. coli, или в эукариотической клетке, такой как дрожжевая клетка, клетка насекомого или клетка животного; или производным, которое имеет активность, эквивалентную природному типу и мутацию по меньшей мере в одном положении аминокислоты.More specifically, physiologically active polypeptides may include human growth hormone; growth hormone releasing hormone; growth hormone releasing peptide; interferons and interferon receptors (e.g. interferon-α, -β and -γ, soluble type I interferon receptor, etc.), colony stimulating factors, interleukins (e.g. interleukin-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22 , -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30, etc.) and interleukin receptors (e.g., IL-1 receptor, IL-4 receptor, etc. ), enzymes (e.g. glucocerebrosidase, iduronate-2-sulfatase, α-galactosidase-A, agalsidase α, β, α-L-iduronidase, butyrylcholinesterase, chitinase, glutamate decarboxylase, imiglucerase, lipase, uricase, platelet activating factor acetylhydrolase, neutral endopeptidase, myeloperoxidase, etc.), interleukin and cytokine binding proteins (e.g. IL-18bp, TNF binding protein, etc.), macrophage activating factor, macrophage peptide, B-cell factors, T-cell factors, protein A, allergy inhibitory factors, necrosis glycoproteins, immunotoxins, lymphotoxins, tumor necrosis factors, tumor suppressors, transforming growth factors, α-1-antitrypsin, albumin, α-lactalbumin, apolipoprotein-E, erythropoietin, highly glycosylated erythropoietin, angiopoietins, hemoglobins, thrombin , thrombin receptor activating peptide, thrombomodulin, blood coagulation factor VII, blood coagulation factor VIIα, blood coagulation factor VIII, coagulation factor IX, blood coagulation factor XIII, plasminogen activators, fibrin-binding peptide, urokinase, streptokinase, hirudin, protein C, C-reactive protein, renin inhibitor, collagenase inhibitor, superoxide dismutase, leptin, platelet-derived growth factor, epithelial growth factor, epidermal growth factor, angiostatin, angiotensin, bone morphogenetic growth factor, bone morphogenetic protein, calcitonin, insulin and insulin derivative, atriopeptin, cartilage inducing factor, elkatonin, connective tissue activating factor, tissue factor pathway inhibitor, follicle stimulating hormone, luteinizing hormone, luteinizing hormone releasing hormone, nerve growth factors (eg, nerve growth factor, ciliary neurotrophic factor, axogenesis factor-1, brain natriuretic peptide, neurotrophic factor glial cells, netrin, neutrophil inhibitory factor, neurotrophic factors, neurin, etc.), parathyroid hormone, relaxin, secretin, somatomedin, insulin-like growth factor, adrenocortical hormone, glucagon, insulinotropic peptides, including glucagon-like peptide-1 and exendin -4, incretins secreted in the gut, adipocytes including leptons and neurocytokines effective for metabolic syndrome, cholecystokinin, pancreatic polypeptides, gastrin-releasing peptides, corticotropin-releasing factor, thyroid-stimulating hormone, autotaxin, lactoferrin, myostatin, receptors (e.g. TNFR (P75), TNFR (P55), IL-1 receptor, VEGF receptor, B cell activation receptor, etc.), receptor antagonists (e.g. IL1-Ra, etc.), cell surface antigens (e.g. CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69, etc.), monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, antibody fragments (eg scFv, Fab, Fab', F(ab') 2 and Fd), viral vaccine antigen, etc., but are not limited to. The physiologically active polypeptide useful in the present invention may be of the naturally occurring type; obtained by genetic recombination in a prokaryotic cell, such as E. coli, or in a eukaryotic cell, such as a yeast cell, an insect cell, or an animal cell; or a derivative which has an activity equivalent to the natural type and a mutation in at least one amino acid position.

Модифицированный Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению может продуцироваться в клетке после соединения его с физиологически активным полипептидом в виде одной последовательности генов с использованием метода прямой генетической рекомбинации или Fc-фрагмент IgG4 может продуцироваться независимо и конъюгирован с лекарственным средством, таким как физиологически активный полипептид, in vitro.The modified IgG4 Fc fragment of the present invention can be produced in a cell after it is coupled to a physiologically active polypeptide as a single gene sequence using a direct genetic recombination method, or an IgG4 Fc fragment can be produced independently and conjugated to a drug such as a physiologically active polypeptide, in vitro .

В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая указанный выше конъюгат лекарственного средства по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента.In yet another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising the above drug conjugate of the present invention as an active ingredient.

Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по настоящему изобретению, может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Примеры фармацевтически приемлемого носителя могут включать связывающее вещество, смазывающее вещество, разрыхлитель, эксципиент, солюбилизирующий агент, диспергирующий агент, стабилизатор, суспендирующий агент, краситель, ароматизатор и т.д.; для инъекционных композиций могут быть смешаны для применения буферный агент, консервант, анальгетик, изотонический агент, стабилизатор и т.д.; и для местных композиций могут быть использованы основа, эксципиент, смазывающее вещество, консервант и т.д.The pharmaceutical composition containing the conjugate of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier. Examples of a pharmaceutically acceptable carrier may include a binder, lubricant, disintegrant, excipient, solubilizing agent, dispersing agent, stabilizer, suspending agent, coloring agent, flavoring agent, etc.; for injectable compositions, buffering agent, preservative, analgesic, isotonic agent, stabilizer, etc. may be mixed for use; and for topical formulations, a base, excipient, lubricant, preservative, etc. may be used.

Разный тип препарата фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть получен путем комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Например, для перорального введения фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.д. Для инъекций фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде препарата в однодозовых ампулах или в многодозовых контейнерах. Фармацевтическая композиция может также быть приготовлена в виде растворов, суспензий, таблеток, капсул и препаратов с замедленным высвобождением.A different type of preparation of the pharmaceutical composition of the present invention can be obtained by combination with a pharmaceutically acceptable carrier. For example, for oral administration, the pharmaceutical composition may be formulated as tablets, lozenges, capsules, elixirs, suspensions, syrups, cachets, and the like. For injection, the pharmaceutical composition may be formulated in single dose ampoules or in multi-dose containers. The pharmaceutical composition may also be formulated as solutions, suspensions, tablets, capsules and sustained release preparations.

При этом примеры подходящих носителей, эксципиентов и разбавителей могут включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и т.д. Кроме того, композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать наполнитель, антикоагулянт, смазывающее вещество, увлажнитель, ароматизатор, эмульгатор, консервант, и т.д.While examples of suitable carriers, excipients and diluents may include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum arabic, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. In addition, the composition of the present invention may further contain a filler, an anticoagulant, a lubricant, a humectant, a fragrance, an emulsifier, a preservative, and the like.

В настоящем изобретении фактическая доза лекарственных средств, где Fc-фрагмент IgG4 используется в качестве носителя, будет определяться на основе типов лекарственных средств, используемых в качестве активных ингредиентов, наряду с различными факторами, такими как заболевание, подлежащее лечению, путь введения, возраст, пол и масса пациента, тяжесть заболевания и т.д. Так как фармацевтическая композиция по настоящему изобретению имеет превосходную продолжительность действия in vivo, количество и частоту введений фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно существенно снизить.In the present invention, the actual dose of drugs where the IgG4 Fc fragment is used as a carrier will be determined based on the types of drugs used as active ingredients, along with various factors such as the disease being treated, route of administration, age, sex and patient weight, disease severity, etc. Since the pharmaceutical composition of the present invention has an excellent duration of action in vivo , the number and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention can be significantly reduced.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена различными путями.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered in various ways.

При использовании здесь термин “введение” относится к введению конкретного вещества пациенту подходящим образом и конъюгированное лекарственное средство по настоящему изобретению может быть введено любым из обычных путей, при условии, что это лекарственное средство может достигать ткани-мишени. Например, может быть осуществлено внутрибрюшинное, внутривенное, внутримышечное, подкожное, внутрикожное, пероральное, местное, интраназальное, внутрилегочное и ректальное введение, но путь введения не ограничивается ими. Однако, поскольку пептиды перевариваются при пероральном введении, активные ингредиенты композиции для перорального введения должны иметь покрытие или приготовлены в виде препарата с защитой от разрушения в желудке. Предпочтительно настоящая композиция может быть введена в инъекционной форме. Кроме того, фармацевтическую композицию можно вводить, используя определенное устройство, способного транспортировать активные ингредиенты в целевую клетку.As used herein, the term “administering” refers to administering a particular substance to a patient in a suitable manner, and the conjugate drug of the present invention may be administered by any of the usual routes, provided that the drug can reach the target tissue. For example, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, oral, topical, intranasal, intrapulmonary, and rectal administration may be performed, but the route of administration is not limited thereto. However, since the peptides are digested upon oral administration, the active ingredients of the composition for oral administration must be coated or formulated to protect against degradation in the stomach. Preferably, the present composition may be administered in injectable form. In addition, the pharmaceutical composition can be administered using a specific device capable of transporting the active ingredients into the target cell.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие ниже Примеры. Однако эти Примеры приведены только в иллюстративных целях и изобретение не следует ограничивать этими Примерами.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following Examples. However, these Examples are provided for illustrative purposes only and the invention should not be limited to these Examples.

Пример 1. Получение конъюгата человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор-ПЭГ-иммуноглобулинExample 1 Preparation of Human Granulocyte Colony Stimulating Factor-PEG-Immunoglobulin Conjugate

<1-1> Конструирование вектора, экспрессирующего Fc-домен IgG4 <1-1> Construction of a vector expressing the Fc domain of IgG4

Для клонирования Fc-участка тяжелой цепи, включающей шарнирную область IgG4, выполняли RT-PCR с использованием клеток крови, собранных из человеческой крови, в качестве матрицы, как описано ниже. Сначала выделяли общую РНК из крови при примерно pH 6, и ген амплифицировали на основе РНК-матрицы с использованием набора Qiamp RNA blood kit (Qiagen). В частности, пару SEQ ID NO: 4 (gggcatatgc catcatgccc agcacctgag ttcctgggg) и SEQ ID NO: 5 (gggggatccc tatttaccca gagacaggga ga) использовали в качестве праймеров. Чтобы облегчить последующий процесс, домен, способный узнавать сайты рестрикции NdeI и ATG, стартовый кодон, необходимый для экспрессии белка, встраивали в праймеры, и домен, способный узнавать сайты рестрикции BamHI, встраивали в 3-праймер SEQ ID NO: 5. Продукт с Fc-участком, амплифицированный с их помощью, расщепляли с использованием NdeI и BamHI, соответственно, и субклонировали в pET22b (Novagen Co., Ltd.) с получением плазмиды. Плазмида была сконструирована таким образом, что Fc-фрагмент IgG4 мог включать шарнирную последовательность, где удалены аминокислотные остатки в 1-8-ом положениях полной аминокислотной последовательности Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro в Fc-шарнире IgG4.To clone the heavy chain Fc region including the IgG4 hinge region, RT-PCR was performed using blood cells harvested from human blood as a template, as described below. First, total RNA was isolated from blood at about pH 6, and the gene was amplified from the RNA template using the Qiamp RNA blood kit (Qiagen). In particular, a pair of SEQ ID NO: 4 (gggcatatgc catcatgccc agcacctgag ttcctgggg) and SEQ ID NO: 5 (gggggatccc tatttaccca gagacaggga ga) were used as primers. To facilitate the subsequent process, a domain capable of recognizing NdeI and ATG restriction sites, a start codon required for protein expression were inserted into the primers, and a domain capable of recognizing BamHI restriction sites was inserted into the 3-primer of SEQ ID NO: 5. Product with Fc The α-site amplified with them was digested with NdeI and BamHI, respectively, and subcloned into pET22b (Novagen Co., Ltd.) to obtain a plasmid. The plasmid was designed in such a way that the Fc fragment of IgG4 could include a hinge sequence where amino acid residues in the 1-8th positions of the complete amino acid sequence of Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser- Cys-Pro in the IgG4 Fc hinge.

Плазмиду, полученную в данном Примере, назвали “pmHMC001”, и результат анализа ее последовательности показал, что нуклеиновая кислота, кодирующая Fc-фрагмент IgG4, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3 и Fc-фрагмент IgG4 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 во время экспрессии.The plasmid obtained in this Example was named “pmHMC001”, and the result of analysis of its sequence showed that the nucleic acid encoding the Fc fragment of IgG4 has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the Fc fragment of IgG4 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 during expression.

Полученный таким образом экспрессионный вектор использовали для трансформации E. coli BL21 (DE3) и тем самым получали трансформант E. coli - E. coli BL21/pmHMC001 (HMC001).The expression vector thus obtained was used to transform E. coli BL21 (DE3), and thereby the E. coli transformant E. coli BL21/pmHMC001 (HMC001) was obtained.

<1-2> Экспрессия и очистка Fc-участка IgG4<1-2> Expression and purification of the Fc region of IgG4

Трансформант микроорганизма, полученный в Примере <1-1>, инокулировали в ферментатор (Marubishi Co., Ltd.) для ферментации и исследовали экспрессию Fc-фрагмента IgG4 .The microorganism transformant obtained in Example <1-1> was inoculated into a fermenter (Marubishi Co., Ltd.) for fermentation, and expression of the IgG4 Fc fragment was examined.

Сначала указанные выше трансформанты, помещенные в 100 мл среды LB, культивировали на водяной бане со встряхиванием в течение ночи и затем инокулировали в ферментатор для продолжения культивирования. Ферментатор поддерживали при 35°C или 28°C и культивирование начинали путем встряхивания при 500 оборотах в минуту с подачей туда воздуха при 20 об/об/мин для предотвращения возникновения анаэробного состояния. В ходе ферментации недостаточные для роста микроорганизма источники энергии пополняли, используя глюкозу и дрожжевой экстракт, в соответствии с ферментационным состоянием микроорганизма, и экспрессию индуцировали путем добавления индуктора IPTG (изопропилтиогалактозид), когда значение OD при 600 нм достигала 80. Культивирование продолжали в течение 40-45 часов, пока значение OD при 600 нм не достигало диапазона от 100 до 120, с получением высококонцентрированной культуры.First, the above transformants, placed in 100 ml of LB medium, were cultured in a shaking water bath overnight and then inoculated into a fermenter to continue cultivation. The fermenter was maintained at 35° C. or 28° C., and culture was started by shaking at 500 rpm with air blowing there at 20 rpm to prevent anaerobic condition. During the fermentation, energy sources insufficient for the growth of the microorganism were replenished using glucose and yeast extract, according to the fermentation state of the microorganism, and expression was induced by adding the inducer IPTG (isopropylthiogalactoside) when the OD value at 600 nm reached 80. Cultivation was continued for 40- 45 hours until the OD value at 600 nm reaches the range from 100 to 120, obtaining a highly concentrated culture.

Экспрессию Fc IgG4 в трансформанте E. coli подтверждали с помощью эксперимента, описанного ниже.Expression of Fc IgG4 in the E. coli transformant was confirmed using the experiment described below.

Для того чтобы подтвердить завершенную экспрессию Fc IgG4 в цитоплазме, часть ферментационной жидкости смешивали с равным количеством 2x белкового капельного буфера и подвергали электрофорезу на 15% SDS-PAGE (Criterion Gel, Bio-Rad). В результате было подтверждено, что Fc IgG сверхэкспрессируется в полученном трансформанте. Было показано, что сверхэкспрессированный белок образует коагулянты, и белок очищали посредством рефолдинга и осуществляли пропускание коагулянтов через колонку таким же образом. Сначала 10 г клеток растворяли в 100 мл лизирующего буфера (10 мМ Tris, pH 9,0, 1 мМ EDTA, 0,5% Triton X-100 и 0,2 M NaCl) и затем подвергали ультразвуковой обработке. Полученный продукт подвергали центрифугированию при 10000 оборотов в минуту в течение 20 минут для разделения на растворимую и нерастворимую фракции, и 2 г нерастворимого коагулянта растворяли в 20 мл буфера для солюбилизации (6 M гуанидин и 50 мМ Tris) и затем оставляли взаимодействовать в течение 30 минут при 4 при осторожном встряхивании. По окончании реакции полученный продукт разбавляли путем добавления 10 объемов буфера для рефолдинга (2 M мочевины, 50 мМ Tris, 0,25 M аргинина и 3 мМ цистеина, pH 9,0) и затем оставляли взаимодействовать в течение ночи при осторожном встряхивании. По завершении реакции в образце обеспечивали свежий буфер 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), используя Sephadex G25. Образец с замененным буфером элюировали в градиенте концентрации Tris-HCl (pH 8,0) и NaCl, используя DEAE-FF (GE healthcare), и фенил-FF (GE healthcare) элюировали градиентом концентрации сульфата аммония и 10 мМ Tris-HCl (pH 7,5), для того чтобы удалить большое количество мультимеров и мономеров. Для последующего пропускания через колонку полученный продукт обессоливали с помощью 10 мМ Tris (pH 7,5), используя Sephadex G25 (GE healthcare), и затем для получения Fc IgG4 с высокой степенью чистоты, 15Q (GE healthcare) элюировали градиентом концентрации 10 мМ Tris-HCl (pH 7,5) и NaCl, и наконец получали Fc IgG4 .In order to confirm complete expression of Fc IgG4 in the cytoplasm, a portion of the fermentation liquid was mixed with an equal amount of 2x protein drop buffer and subjected to electrophoresis on 15% SDS-PAGE (Criterion Gel, Bio-Rad). As a result, it was confirmed that Fc IgG was overexpressed in the obtained transformant. The overexpressed protein was shown to form coagulants and the protein was purified by refolding and the coagulants were run through the column in the same manner. First, 10 g of cells were dissolved in 100 ml of lysis buffer (10 mM Tris, pH 9.0, 1 mM EDTA, 0.5% Triton X-100 and 0.2 M NaCl) and then sonicated. The resulting product was subjected to centrifugation at 10,000 rpm for 20 minutes to separate into soluble and insoluble fractions, and 2 g of insoluble coagulant was dissolved in 20 ml of solubilization buffer (6 M guanidine and 50 mM Tris) and then allowed to react for 30 minutes at 4 with gentle shaking. At the end of the reaction, the resulting product was diluted by adding 10 volumes of refolding buffer (2 M urea, 50 mM Tris, 0.25 M arginine and 3 mM cysteine, pH 9.0) and then allowed to react overnight with gentle shaking. Upon completion of the reaction, the sample was provided with fresh buffer 10 mm Tris-HCl (pH 8.0) using Sephadex G25. The buffer exchanged sample was eluted with a gradient of Tris-HCl (pH 8.0) and NaCl using DEAE-FF (GE healthcare) and phenyl-FF (GE healthcare) was eluted with a gradient of ammonium sulfate and 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) in order to remove a large amount of multimers and monomers. For subsequent column run, the resulting product was desalted with 10 mM Tris (pH 7.5) using Sephadex G25 (GE healthcare) and then eluted with a concentration gradient of 10 mM Tris to obtain high purity IgG4 Fc, 15Q (GE healthcare). -HCl (pH 7.5) and NaCl, and finally received Fc IgG4 .

<1-3> Получение конъюгата лекарственного средства I<1-3> Preparation of drug conjugate I

1) Получение конъюгата гранулоцитарных колониестимулирующих факторов и PEG1) Obtaining a conjugate of granulocyte colony stimulating factors and PEG

ALD-PEG-ALD (Shearwater Inc., USA), поли(этиленгликоль), имеющий молекулярную массу 3,4 кДа, с альдегидными реакционноспособными группами на обоих концах добавляли в 100 мМ фосфатный буфер, в котором были растворены гранулоцитарные колониестимулирующие факторы в концентрации 5 мг/мл, так что молярное соотношение гранулоцитарные колониестимулирующие факторы:PEG составляло 1:5. Цианоборгидрид натрия (NaCNBH3), восстанавливающий агент, добавляли до конечной концентрации 20 мМ и проводили реакцию в течение 3 часов при 4 при медленном перемешиванием. Чтобы получить конъюгат, в котором PEG селективно конъюгирован с аминоконцом гранулоцитарных колониестимулирующих факторов и PEG и гранулоцитарные колониестимулирующие факторы конъюгированы в соотношении 1:1, реакционную смесь подвергали гель-проникающей хроматографии Superdex (Superdex R, Pharmacia, USA). Колониестимулирующие факторы очищали, используя 10 мМ калий-фосфатный буфер (pH 6,0) в качестве раствора для элюирования, при этом гранулоцитарные колониестимулирующие факторы, которые не были конъюгированы с PEG, непрореагировавший PEG и димерные побочные продукты, где два гранулоцитарных колониестимулирующих фактора были конъюгированы с PEG, были удалены. Очищенный конъюгат гранулоцитарный колониестимулирующий фактор-PEG концентрировали до 5 мг/мл.ALD-PEG-ALD (Shearwater Inc., USA), poly(ethylene glycol) having a molecular weight of 3.4 kDa with aldehyde reactive groups at both ends was added to 100 mM phosphate buffer in which granulocyte colony stimulating factors were dissolved at a concentration of 5 mg/ml, so that the molar ratio of granulocyte colony stimulating factors:PEG was 1:5. Sodium cyanoborohydride (NaCNBH 3 ), a reducing agent, was added to a final concentration of 20 mM and reacted for 3 hours at 4 with slow stirring. To prepare a conjugate in which PEG is selectively conjugated to the amino terminus of granulocyte colony stimulating factors and PEG and granulocyte colony stimulating factors are conjugated in a 1:1 ratio, the reaction mixture was subjected to Superdex gel permeation chromatography (Superdex R, Pharmacia, USA). Colony stimulating factors were purified using 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) as elution solution, with granulocyte colony stimulating factors that were not conjugated to PEG, unreacted PEG, and dimer by-products where two granulocyte colony stimulating factors were conjugated with PEG were removed. The purified granulocyte colony stimulating factor-PEG conjugate was concentrated to 5 mg/ml.

2) Образование конъюгата между конъюгатом гранулоцитарный колониестимулирующий фактор-PEG и Fc-фрагментом IgG4 2) Formation of a conjugate between a granulocyte colony stimulating factor-PEG conjugate and an IgG4 Fc fragment

Fc-фрагмент IgG4 по настоящему изобретению растворяли в 100 мМ фосфатном буфере. Для конъюгирования Fc-фрагмента IgG4 с альдегидными реакционноспособными группами очищенного выше конъюгата гранулоцитарный колониестимулирующий фактор-PEG, конъюгат гранулоцитарный колониестимулирующий фактор-PEG добавляли к буферу, содержащему Fc-фрагмент IgG4, так что молярное соотношение конъюгат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора-PEG : Fc-фрагмент IgG4 составляло 1:5. К нему добавляли восстанавливающий агент, цианоборгидрид натрия (NaCNBH3), до конечной концентрации 20 мМ, и реакционная смесь взаимодействовала в течение 20 часов при 4 при медленном перемешивании. После завершения реакции конъюгации непрореагировавшее вещество и побочные продукты удаляли, и конъюгат гранулоцитарный колониестимулирующий фактор-PEG-иммуноглобулиновый белок очищали посредством анионообменной хроматографии. Конъюгат гранулоцитарный колониестимулирующий фактор-PEG-Fc-фрагмент IgG4 очищали путем добавления вышеприведенной реакционной смеси к DEAE колонке (Pharmacia, USA), которая была уравновешена 20 мМ Tris буфером (pH 7,5), с последующим промыванием тем же буфером, содержащим 1 M NaCl, с использованием метода линейного градиента концентрации (концентрация NaCl: 0 M → 0,5 M). Для удаления небольшого количества непрореагировавших иммуноглобулинов и гормона роста человека, смешанного в виде примесей с фракцией таким образом полученного конъюгата гранулоцитарный колониестимулирующий фактор-PEG-Fc-фрагмент IgG4, дополнительно проводили катионообменную хроматографию. Фракцию конъюгата гранулоцитарный колониестимулирующий фактор-PEG-Fc-фрагмент IgG4 вносили на polyCAT колонку (PolyLC, USA), которая была уравновешена 10 мМ ацетата натрия (pH 4,5) и дополнительно очищали путем пропускания 10 мМ натрий-ацетатного буфера (pH 4,5), содержащего 1 M NaCl, метода линейного градиента концентрации (концентрация NaCl: 0 M → 0,5 M), и посредством этого конъюгат гранулоцитарный колониестимулирующий фактор-PEG-Fc-фрагмент IgG4 (HM10460A) был получен чистым. The IgG4 Fc fragment of the present invention was dissolved in 100 mM phosphate buffer. For conjugation of the IgG4 Fc fragment with aldehyde reactive groups of the granulocyte colony stimulating factor-PEG conjugate purified above, the granulocyte colony stimulating factor-PEG conjugate was added to the buffer containing the IgG4 Fc fragment, so that the molar ratio of the granulocyte colony stimulating factor conjugate-PEG : Fc fragment I gG4 was 1:5. To this was added a reducing agent, sodium cyanoborohydride (NaCNBH 3 ), to a final concentration of 20 mM, and the reaction mixture was reacted for 20 hours at 4 with slow stirring. After completion of the conjugation reaction, the unreacted substance and by-products were removed, and the granulocyte colony stimulating factor-PEG-immunoglobulin protein conjugate was purified by anion exchange chromatography. The granulocyte colony stimulating factor-PEG-Fc fragment IgG4 conjugate was purified by adding the above reaction mixture to a DEAE column (Pharmacia, USA) which had been equilibrated with 20 mM Tris buffer (pH 7.5), followed by washing with the same buffer containing 1 M NaCl, using the linear concentration gradient method (NaCl concentration: 0 M → 0.5 M). Cation exchange chromatography was additionally performed to remove a small amount of unreacted immunoglobulins and human growth hormone admixed with a fraction of the granulocyte colony stimulating factor-PEG-Fc fragment IgG4 conjugate thus obtained. The granulocyte colony stimulating factor-PEG-Fc-fragment IgG4 conjugate fraction was applied to a polyCAT column (PolyLC, USA), which was equilibrated with 10 mM sodium acetate (pH 4.5) and further purified by passing 10 mM sodium acetate buffer (pH 4, 5) containing 1 M NaCl by the linear concentration gradient method (NaCl concentration: 0 M → 0.5 M), and thereby the granulocyte colony stimulating factor-PEG-Fc fragment IgG4 conjugate (HM10460A) was obtained pure.

Пример 2. Подтверждение обмена цепей между конъюгатом человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор-PEG-иммуноглобулин и человеческим IgG4 в крови крысыExample 2 Confirmation of chain exchange between human granulocyte colony stimulating factor-PEG-immunoglobulin conjugate and human IgG4 in rat blood

Человеческий IgG4 в количестве 2 мг метили биотином путем смешивания с 20 мг/мл раствора биотин-7-NHL в молекулярном соотношении 1:10 и очищали с помощью набора для мечения белка биотином Biotin Protein Labeling Kit (Roche). Кровь, собранную из нормальных крыс, обрабатывали гепарином для предупреждения коагуляции и добавляли пенициллин-стрептомицин (1% об/об). 1,5 мг меченого биотином IgG4 и 1,32 мг HM10460A добавляли в 3 мл крови, смешивали, и смесь аликвотировали в 6 пробирок (0,5 мл/пробирка) и инкубировали в инкубаторе при 37°C. По одной пробирке извлекали во временные точки 0 часов, 4 часа, 10 часов, 24 часа и 48 часов, соответственно, и из них отделяли плазму и хранили при -20°C. Каждый из образцов плазмы и стандартных веществ смешивали с невосстанавливающим образец белка буфере, и полученный продукт был подвергнут SDS-PAGE с использованием полиакриламидного геля с градиентом концентрации 4%-15%. Меченный биотином IgG4 и HM10460A использовали в качестве стандартных веществ. Гель после завершения электрофореза подвергали блоттингу на PVDF (поливинилиденфторидной) мембране (Immobilon-P, MILLIPORE) и анализировали с использованием антител против человеческого GCSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор) и стрептавидин-HRP (пероксидаза хрена). Что касается условий связывания антител, то антитела против Fc IgG человека (Sigma) использовали в условиях блокирования - 5% обезжиренном молоке после разведения в соотношении 1:150000, антитела против GCSF человека (Human G-CSF Assay Kit. IBL) в условиях блокирования - 1% обезжиренного молока после разведения в соотношении 1:2000 и стрептавидин-HRP в условиях блокирования - 5% обезжиренном молоке после разведения в соотношении 1:5000 соответственно. Было подтверждено, что HM10460A образует димеры (94 кДа), которые имеют два G-CSF на каждый Fc-фрагмент IgG4, и Fc-фрагменты IgG4 (50 кДа), путем механизма обмена цепей между самими HM10460A.Human IgG4 at 2 mg was labeled with biotin by mixing with a 20 mg/ml solution of biotin-7-NHL in a 1:10 molecular ratio and purified using a Biotin Protein Labeling Kit (Roche). Blood collected from normal rats was treated with heparin to prevent coagulation and penicillin-streptomycin (1% v/v) was added. 1.5 mg of biotin-labeled IgG4 and 1.32 mg of HM10460A were added to 3 ml of blood, mixed, and the mixture was aliquoted into 6 tubes (0.5 ml/tube) and incubated in an incubator at 37°C. One tube was removed at the time points of 0 hours, 4 hours, 10 hours, 24 hours and 48 hours, respectively, and plasma was separated from them and stored at -20°C. Each of the plasma samples and standards were mixed with a non-reducing protein sample buffer, and the resulting product was subjected to SDS-PAGE using a polyacrylamide gel with a concentration gradient of 4%-15%. Biotin labeled IgG4 and HM10460A were used as reference substances. The gel after completion of electrophoresis was blotted on a PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane (Immobilon-P, MILLIPORE) and analyzed using antibodies against human GCSF (granulocyte colony stimulating factor) and streptavidin-HRP (horseradish peroxidase). With regard to antibody binding conditions, anti-human IgG Fc antibodies (Sigma) were used under blocking conditions - 5% skim milk after dilution at a ratio of 1:150000, anti-human GCSF antibodies (Human G-CSF Assay Kit. IBL) under blocking conditions - 1% skim milk after a 1:2000 dilution and streptavidin-HRP under blocking conditions - 5% skim milk after a 1:5000 dilution, respectively. HM10460A was confirmed to form dimers (94 kDa) that have two G-CSFs per IgG4 Fc fragment and IgG4 Fc fragments (50 kDa) by a chain exchange mechanism between HM10460A itself.

В противоположность этому, когда HM10460A индуцирует реакцию взаимного обмена цепей между HM10460A и человеческим IgG4, ожидалось, что образуются молекулы размером 100 кДа и 122 кДа. Однако эти молекулы не наблюдались при вестерн-блоттинге. Напротив, при анализе с помощью стрептавидин-HRP, полоса 75 кДа появлялась на дорожке человеческого IgG4 и это подтверждает образование мономеров из человеческого IgG4, который сам по своей природе является димером человеческого IgG4 (Фиг. 1).In contrast, when HM10460A induces a cross-chain exchange reaction between HM10460A and human IgG4, 100 kD and 122 kD molecules were expected to be generated. However, these molecules were not observed by Western blotting. In contrast, when analyzed with streptavidin-HRP, a 75 kDa band appeared in the human IgG4 lane and this confirms the formation of monomers from human IgG4, which itself is a dimer of human IgG4 (FIG. 1).

Пример 3.Example 3 Подтверждение обмена цепей между конъюгатом человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор-PEG-иммуноглобулин и человеческим IgG4 в крови человекаConfirmation of chain exchange between human granulocyte colony stimulating factor-PEG-immunoglobulin conjugate and human IgG4 in human blood

К человеческой крови, собранной от донора, добавляли пенициллин-стрептомицин (1% об/об). 1,32 мг HM10460A, полученного в Примере 1, смешивали с 3 мл крови, и смеси аликвотировали в 6 пробирок (0,5 мл/пробирка) и инкубировали в инкубаторе при 37°C. По одной пробирке вынимали в следующие временные точки 0 часов, 4 часа, 10 часов, 24 часа и 48 часов соответственно, и из них отделяли плазму и хранили при -20°C перед анализом. Каждый из образцов плазмы, а также HM10460A и Fc-фрагмент IgG4 в различных концентрациях в качестве контрольных веществ, смешивали с невосстанавливающим образец белка буфере, и полученный продукт подвергали SDS-PAGE с использованием полиакриламидного геля с градиентом концентрации 4%-15%. Гель после завершения электрофореза подвергали блоттингу на PVDF мембране (Immobilon-P, MILLIPORE) и анализировали с использованием антител против человеческого GCSF. Антитела против человеческого GCSF (Human G-CSF Assay Kit, IBL) использовали в условиях блокирования - 1% обезжиренном молоке после разведения в соотношении 1:2000. Как и в крови крыс, молекулы размером 100 кДа и 122 kD, которые могли образоваться в результате обмена цепей с человеческим IgG4, не образовались (Фиг. 2).Penicillin-streptomycin (1% v/v) was added to human blood collected from a donor. 1.32 mg of HM10460A prepared in Example 1 was mixed with 3 ml of blood, and the mixtures were aliquoted into 6 tubes (0.5 ml/tube) and incubated in an incubator at 37°C. One tube was taken out at the following time points of 0 hours, 4 hours, 10 hours, 24 hours and 48 hours, respectively, and plasma was separated from them and stored at -20°C before analysis. Each of the plasma samples, as well as HM10460A and IgG4 Fc fragment at various concentrations as controls, were mixed with a non-reducing protein sample buffer, and the resulting product was subjected to SDS-PAGE using a polyacrylamide gel with a concentration gradient of 4%-15%. The gel after completion of electrophoresis was blotted on a PVDF membrane (Immobilon-P, MILLIPORE) and analyzed using antibodies against human GCSF. Anti-human GCSF antibodies (Human G-CSF Assay Kit, IBL) were used under blocking conditions - 1% skim milk after a 1:2000 dilution. As in rat blood, the 100 kD and 122 kD molecules that could have been produced by chain exchange with human IgG4 were not produced (FIG. 2).

Специалистам в данной области понятно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отклонения от его сущности или существенных характеристик. Описанные воплощения следует рассматривать только как иллюстративные и не ограничивающие во всех отношениях. Объем настоящего изобретения, таким образом, определяется прилагаемой формулой изобретения, а не предшествующим описанием изобретения. Все изменения, которые подпадают под значение и диапазон эквивалентности формулы изобретения, должны быть включены в объем настоящего изобретения.Those skilled in the art will appreciate that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from its spirit or essential characteristics. The described embodiments are to be considered as illustrative only and not restrictive in all respects. The scope of the present invention is thus defined by the appended claims and not by the preceding description of the invention. All changes that fall within the meaning and equivalence range of the claims are to be included within the scope of the present invention.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST

<110> HANMI PHARM. CO., LTD.<110> HANMI PHARM. CO., LTD.

<120> FC-фрагмент IGG4, содержащий модифицированную шарнирную область<120> IGG4 FC fragment containing a modified hinge region

<130> OPA14085<130>OPA14085

<140> 10-2013-0063029<140> 10-2013-0063029

<141> 2013-05-31<141> 2013-05-31

<160> 21<160> 21

<170> KopatentIn 2.0<170> KopatentIn 2.0

<210> 1<210> 1

<211> 12<211> 12

<212> PRT<212> PRT

<213> HOMO SAPIENS<213> HOMO SAPIENS

<400> 1<400> 1

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys ProGlu Ser Lys Tyr Gly Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10 1 5 10

<210> 2<210> 2

<211> 221<211> 221

<212> PRT<212> PRT

<213> HOMO SAPIENS<213> HOMO SAPIENS

<400> 2<400> 2

Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe LeuPro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro GluPhe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

20 25 30 20 25 30

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val GlnVal Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

35 40 45 35 40 45

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr LysPhe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

50 55 60 50 55 60

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val LeuPro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys LysThr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

85 90 95 85 90 95

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser LysVal Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

100 105 110 100 105 110

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro SerAla Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

115 120 125 115 120 125

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val LysGln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

130 135 140 130 135 140

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly GlnGly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

145 150 155 160 145 150 155 160

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp GlyPro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

165 170 175 165 170 175

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp GlnSer Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

180 185 190 180 185 190

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His AsnGlu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

195 200 205 195 200 205

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly LysHis Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215 220 210 215 220

<210> 3<210> 3

<211> 663<211> 663

<212> ДНК<212> DNA

<213> HOMO SAPIENS<213> HOMO SAPIENS

<400> 3<400> 3

ccatcatgcc cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa 60ccatcatgcc cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa 60

cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 120cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 120

agccaggaag accctgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 180agccaggaag accctgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 180

gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 240gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 240

accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 300accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 300

ggcctcccat cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 360ggcctcccat cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 360

caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 420caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 420

tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 480tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 480

ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 540ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 540

tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg tggcaggagg ggaacgtctt ctcatgctcc 600tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg tggcaggagg ggaacgtctt ctcatgctcc 600

gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt 660gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt 660

aaa 663aaa 663

<210> 4<210> 4

<211> 11<211> 11

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 4<400> 4

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Pro Ser Cys ProGlu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Pro Ser Cys Pro

1 5 10 1 5 10

<210> 5<210> 5

<211> 11<211> 11

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 5<400> 5

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser ProGlu Ser Lys Tyr Gly Pro Cys Pro Ser Pro

1 5 10 1 5 10

<210> 6<210> 6

<211> 10<211> 10

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 6<400> 6

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro SerGlu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser

1 5 10 1 5 10

<210> 7<210> 7

<211> 10<211> 10

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 7<400> 7

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro ProGlu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

1 5 10 1 5 10

<210> 8<210> 8

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 8<400> 8

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro SerLys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser

1 5 15

<210> 9<210> 9

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 9<400> 9

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro CysGlu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

1 5 15

<210> 10<210> 10

<211> 7<211> 7

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 10<400> 10

Glu Lys Tyr Gly Pro Pro CysGlu Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

1 5 15

<210> 11<210> 11

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 11<400> 11

Glu Ser Pro Ser Cys ProGlu Ser Pro Ser Cys Pro

1 5 15

<210> 12<210> 12

<211> 5<211> 5

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 12<400> 12

Glu Pro Ser Cys ProGlu Pro Ser Cys Pro

1 5 15

<210> 13<210> 13

<211> 4<211> 4

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 13<400> 13

Pro Ser Cys ProPro Ser Cys Pro

1 1

<210> 14<210> 14

<211> 10<211> 10

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 14<400> 14

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Cys ProGlu Ser Lys Tyr Gly Pro Ser Cys Pro

1 5 10 1 5 10

<210> 15<210> 15

<211> 9<211> 9

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 15<400> 15

Lys Tyr Gly Pro Pro Pro Ser Cys ProLys Tyr Gly Pro Pro Ser Cys Pro

1 5 15

<210> 16<210> 16

<211> 9<211> 9

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 16<400> 16

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Ser Cys ProGlu Ser Lys Tyr Gly Pro Ser Cys Pro

1 5 15

<210> 17<210> 17

<211> 8<211> 8

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 17<400> 17

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro CysGlu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

1 5 15

<210> 18<210> 18

<211> 7<211> 7

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 18<400> 18

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys ProLys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

1 5 15

<210> 19<210> 19

<211> 7<211> 7

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 19<400> 19

Glu Ser Lys Pro Ser Cys ProGlu Ser Lys Pro Ser Cys Pro

1 5 15

<210> 20<210> 20

<211> 6<211> 6

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 20<400> 20

Glu Ser Pro Ser Cys ProGlu Ser Pro Ser Cys Pro

1 5 15

<210> 21<210> 21

<211> 4<211> 4

<212> PRT<212> PRT

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Вариант шарнирной области<223> Hinge region option

<400> 21<400> 21

Glu Pro Ser CysGlu Pro Ser Cys

1 1

<---<---

Claims (12)

1. Модифицированный Fc-фрагмент IgG4, имеющий низкий риск индуцирования обмена цепей и образования мономера in vivo и содержащий шарнирную область, представленную любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4, 10, 11, 12, 14, 15, 19, 20 и 21, где указанная шарнирная область содержит только один остаток цистеина.1. A modified IgG4 Fc fragment having a low risk of inducing chain exchange and monomer formation in vivo and containing a hinge region represented by any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 10, 11, 12, 14, 15, 19, 20 and 21 where said hinge region contains only one cysteine residue. 2. Модифицированный Fc-фрагмент IgG4 по п. 1, который является агликозилированным.2. A modified IgG4 Fc fragment according to claim 1, which is aglycosylated. 3. Нуклеиновая кислота, кодирующая Fc-фрагмент IgG4 по п. 1.3. Nucleic acid encoding the IgG4 Fc fragment according to claim 1. 4. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 3.4. Expression vector containing the nucleic acid according to claim 3. 5. Клетка-хозяин Е. coli для продуцирования модифицированного Fc-фрагмента IgG4 по п. 1, в которую введен вектор по п. 4.5. An E. coli host cell for producing a modified IgG4 Fc fragment according to claim 1, into which the vector according to claim 4 is introduced. 6. Способ получения Fc-фрагмента IgG4 по п. 1 или 2, включающий культивирование микроорганизма по п. 5.6. A method for obtaining an IgG4 Fc fragment according to claim 1 or 2, including culturing the microorganism according to claim 5. 7. Конъюгат лекарственного средства, имеющий низкий риск индуцирования обмена цепей и образования мономера in vivo, где Fc-фрагмент IgG4 по п. 1 или 2 конъюгирован с лекарственным средством с помощью линкера, выбранного из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, полимолочной кислоты (PLA), сополимера полимолочная-гликолевая кислота (PLGA), липидного полимера, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации.7. A drug conjugate having a low risk of inducing chain exchange and monomer formation in vivo, wherein the IgG4 Fc fragment of claim 1 or 2 is drug-conjugated with a linker selected from the group consisting of polyethylene glycol, polypropylene glycol, an ethylene glycol copolymer, and propylene glycol, polyoxyethylated polyol, polyvinyl alcohol, polysaccharide, dextran, polyvinyl ethyl ether, polylactic acid (PLA), polylactic-glycolic acid (PLGA), lipid polymer, chitins, hyaluronic acid, and combinations thereof. 8. Конъюгат лекарственного средства по п. 7, где лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из гормона роста человека; гормона, высвобождающего гормон роста; пептида, высвобождающего гормон роста; интерферонов и рецепторов интерферона; колониестимулирующего фактора; интерлейкинов и рецепторов интерлейкинов; ферментов; интерлейкин- и цитокин-связывающих белков; фактора активации макрофагов; макрофагального пептида; В-клеточного фактора; Т-клеточного фактора; белка А, фактора ингибирования аллергии, гликопротеина некроза, иммунотоксина, лимфотоксина, фактора некроза опухоли, опухолевого супрессора, трансформирующего фактора роста, α-1-антитрипсина, альбумина, α-лактальбумина, аполипопротеина-Е, эритропоэтина, высокогликозилированного эритропоэтина, ангиопоэтина, гемоглобина, тромбина; пептида, активирующего рецептор тромбина; тромбомодулина, фактора коагуляции крови VII, фактора коагуляции крови VIIα, фактора коагуляции крови VIII, фактора коагуляции IX, фактора коагуляции крови XIII, активатора плазминогена, фибрин-связывающего пептида, урокиназы, стрептокиназы, гирудина, протеина С, С-реактивного белка, ингибитора ренина, ингибитора коллагеназы, супероксиддисмутазы, лептина, тромбоцитарного фактора роста, эпителиального фактора роста, эпидермального фактора роста, ангиостатина, ангиотензина, костного морфогенетического фактора роста, костного морфогенетического белка, кальцитонина, инсулина и производного инсулина, атриопептина, хрящевого индуцирующего фактора, элкатонина, активирующего фактора соединительной ткани, ингибитора пути тканевого фактора, фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, гормона высвобождения лютеинизирующего гормона, факторов роста нервов (например, фактора роста нервов, цилиарного нейротрофического фактора, фактора аксогенезиса-1, мозгового натрийуретического пептида, нейротрофического фактора глиальных клеток, нетрина, фактора ингибирования нейтрофилов, нейротрофического фактора и неврина), паратиреоидного гормона, релаксина, секретина, соматомедина, инсулиноподобного фактора роста, адренокортикального гормона, глюкагона, инсулинотропных пептидов, включающих глюкагон-подобный пептид-1 и экзендин-4, инкретинов, секретируемых в кишечнике, адипоцитов, включающих лептоны, и нейроцитокинов, эффективных для метаболического синдрома, холецистокинина, полипептидов поджелудочной железы, гастрин-высвобождающих пептидов, кортикотропин-высвобождающего фактора, тиреостимулирующего гормона, аутотаксина, лактоферрина, миостатина, рецептора, антагониста рецептора, антигена клеточной поверхности, моноклонального антитела, поликлонального антитела, фрагментов антител и вирусного вакцинного антигена.8. The drug conjugate of claim 7, wherein the drug is selected from the group consisting of human growth hormone; growth hormone releasing hormone; a growth hormone releasing peptide; interferons and interferon receptors; colony stimulating factor; interleukins and interleukin receptors; enzymes; interleukin and cytokine binding proteins; macrophage activation factor; macrophage peptide; B-cell factor; T-cell factor; protein A, allergy inhibitory factor, necrosis glycoprotein, immunotoxin, lymphotoxin, tumor necrosis factor, tumor suppressor, transforming growth factor, α-1-antitrypsin, albumin, α-lactalbumin, apolipoprotein-E, erythropoietin, highly glycosylated erythropoietin, angiopoietin, hemoglobin, thrombin; a peptide that activates the thrombin receptor; thrombomodulin, blood coagulation factor VII, blood coagulation factor VIIα, blood coagulation factor VIII, coagulation factor IX, blood coagulation factor XIII, plasminogen activator, fibrin-binding peptide, urokinase, streptokinase, hirudin, protein C, C-reactive protein, renin inhibitor , collagenase inhibitor, superoxide dismutase, leptin, platelet-derived growth factor, epithelial growth factor, epidermal growth factor, angiostatin, angiotensin, bone morphogenetic growth factor, bone morphogenetic protein, calcitonin, insulin and insulin derivative, atriopeptin, cartilage inducing factor, elkatonin, activating factor connective tissue, tissue factor pathway inhibitor, follicle stimulating hormone, luteinizing hormone, luteinizing hormone releasing hormone, nerve growth factors (eg, nerve growth factor, ciliary neurotrophic factor, axogenesis factor-1, brain natriuretic peptide, glial cell neurotrophic factor, netrin, inhibition of neutrophils, neurotrophic factor and neurin), parathyroid hormone, relaxin, secretin, somatomedin, insulin-like growth factor, adrenocortical hormone, glucagon, insulinotropic peptides, including glucagon-like peptide-1 and exendin-4, incretins secreted in the intestine, adipocytes, including leptons, and neurocytokins, effective for metabolic syndrome, cholecystokinin, pancreatic polypeptides, gastrointestinal peptides, corticotropin factor, thyroidimulating hormone, autotaxin, lactoperrin, myostatin, receptor, antagonist, antigenist, antigen of Cleaver accurate surface, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies , fragments of antibodies and viral vaccine antigen. 9. Конъюгат лекарственного средства по п. 7, где лекарственное средство представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.9. The drug conjugate of claim 7, wherein the drug is a granulocyte colony stimulating factor. 10. Конъюгат лекарственного средства по п. 7, где линкер представляет собой непептидильный полимер.10. The drug conjugate of claim 7, wherein the linker is a non-peptidyl polymer. 11. Конъюгат лекарственного средства по п. 10, где непептидильный полимер имеет два или три реакционноспособных конца.11. The drug conjugate of claim 10 wherein the non-peptidyl polymer has two or three reactive ends. 12. Фармацевтическая композиция, имеющая низкий риск индуцирования обмена цепей и образования мономера in vivo и содержащая конъюгат по п. 7 и фармацевтически приемлемый носитель.12. A pharmaceutical composition having a low risk of inducing chain exchange and monomer formation in vivo and containing the conjugate of claim 7 and a pharmaceutically acceptable carrier.
RU2019123666A 2013-05-31 2014-05-29 IGG4 Fc FRAGMENT CONTAINING A MODIFIED HINGE REGION RU2800558C1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2013-0063029 2013-05-31

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015153162A Division RU2696973C2 (en) 2013-05-31 2014-05-29 Fc-FRAGMENT IgG4 CONTAINING MODIFIED HINGE REGION

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2800558C1 true RU2800558C1 (en) 2023-07-24

Family

ID=

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2224764C2 (en) * 1995-04-14 2004-02-27 Генентек, Инк. Modified polypeptide with increased half-life value, its preparing and using
WO2006113665A2 (en) * 2005-04-15 2006-10-26 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
WO2010106180A2 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Lfb Biotechnologies Optimized fc variants
WO2012022982A2 (en) * 2010-08-20 2012-02-23 Ucb Pharma S.A. Improved antibodies of the class igg4
WO2013012733A1 (en) * 2011-07-15 2013-01-24 Biogen Idec Ma Inc. Heterodimeric fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2224764C2 (en) * 1995-04-14 2004-02-27 Генентек, Инк. Modified polypeptide with increased half-life value, its preparing and using
WO2006113665A2 (en) * 2005-04-15 2006-10-26 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
WO2010106180A2 (en) * 2009-03-20 2010-09-23 Lfb Biotechnologies Optimized fc variants
WO2012022982A2 (en) * 2010-08-20 2012-02-23 Ucb Pharma S.A. Improved antibodies of the class igg4
WO2013012733A1 (en) * 2011-07-15 2013-01-24 Biogen Idec Ma Inc. Heterodimeric fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021225249B2 (en) IGG4 FC Fragment Comprising Modified Hinge Region
JP6976400B2 (en) A conjugate of a bioactive polypeptide monomer and an immunoglobulin Fc fragment having reduced receptor-mediated clearance, and a method for producing the same.
KR102041412B1 (en) Derivatives of Immunglobulin Fc fragment
EP1866340B1 (en) Immunoglobulin fc fragment modified by non-peptide polymer and pharmaceutical composition comprising the same
US20220249615A1 (en) Protein complex by use of a specific site of an immunoglobulin fragment for linkage
RU2800558C1 (en) IGG4 Fc FRAGMENT CONTAINING A MODIFIED HINGE REGION
NZ716251B2 (en) Conjugate of biologically active polypeptide monomer and immunoglobulin fc fragment with reduced receptor-mediated clearance, and the method for preparing the same