RU2798839C1 - Способ получения гемостатического препарата в форме аэрогеля на основе бактериальной целлюлозы и альгината кальция - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу получения гемостатического препарата в форме аэрогеля на основе бактериальной целлюлозы и альгината кальция, включающему получение биокомпозита на основе окисленной бактериальной целлюлозы, полученной при культивировании продуцента Komagataeibacter sucrofermentans H-110 (ВКПМ-11267), альгината кальция, тромбина или Х фактора свертывания крови или тромбина и фузидина натрия, а для получения аэрогеля биокомпозит замораживают в низкотемпературном холодильнике в течение 1 сут., после чего лиофильно высушивают. Настоящее изобретение обеспечивает получение гемостатического препарата в форме аэрогеля на основе окисленной бактериальной целлюлозы и альгината кальция, который способен остановить кровотечение в течение 60-120 с. 3 з.п. ф-лы, 4 пр.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к способу получения гемостатического препарата в форме аэрогеля на основе бактериальной целлюлозы и альгината, используемого для достижения быстрого гемостатического эффекта при оказании экстренной медицинской помощи и самопомощи в условиях чрезвычайных ситуаций (вооруженные конфликты, катастрофы, стихийные бедствия) при производственных, бытовых и других видов травм.

Кровь в организме человека участвует в важных процессах, включая транспортировку кислорода и других питательных веществ к различным органам, регулирование температуры тела и т.д. (Hematology.org. Hematology glossary [Internet]. Available from: https://www.hematology.org/education/patients/blood-basics).

Различные физические, химические и человеческие факторы могут привести к травмам, вызывающим в последствии кровотечение. Неконтролируемое кровотечение в 30 % случаев приводит к летальному исходу, половина из которых происходит на догоспитальном этапе (Behrens A. M., Sikorski M. J., Kofinas P. Hemostatic strategies for traumatic and surgical bleeding // Journal of Biomedical Materials Research Part A. – 2014. – Т. 102. – №. 11. – С. 4182-4194). Неконтролируемое кровотечение может привести к серьезным повреждениям, включая геморрагический шок, гипотермию, гипотензию, полиорганную недостаточность, ацидоз и инфекции (Hickman D. S. A. et al. Biomaterials and advanced technologies for hemostatic management of bleeding // Advanced Materials. – 2018. – Т. 30. – №. 4. – С. 1700859).

Внутренний механизм гемостаза человеческого организма имеет ограниченные возможности и может нуждаться в помощи гемостатических материалов или устройств для быстрой остановки кровотечений, особенно в чрезвычайных ситуациях (Yang X. et al. Design and development of polysaccharide hemostatic materials and their hemostatic mechanism // Biomaterials science. – 2017. – Т. 5. – №. 12. – С. 2357-2368).

Известна сублимационно-высушенная гемостатическая губка с антимикробным (бактерицидным) эффектом, включающая альгинат, хитозан и покрытые белковой оболочкой наночастицы серебра, полученные микробным синтезом с использованием грибных культур-продуцентов восстановительных биологически активных соединений, в соотношениях (0,5-1,5) : (0,5-1,0) : 10^-3, также раскрыт способ ее получения (RU 2732156, МПК A61L 15/18, A61L 15/28, A61P 7/04, A61P 31/04, опубл. 11.09.2020).

Известна гемостатическая губка, содержащая основу, а в качестве активного вещества – соли железа, отличающаяся тем, что основа и активное вещество высушены сублимационной сушкой, при этом в качестве основы губка содержит альгинат натрия, а в качестве активного вещества – сульфат железа, причем компоненты в губке находятся в определенном соотношении в конечном водном растворе, в объеме 1 литр в %. Изобретение обеспечивает расширение ассортимента гемостатических губок с выраженным гемостатическим действием и исключением прямого неблагоприятного воздействия активного вещества на раневую поверхность и окружающие ее ткани за счет фармакологической формы губки (RU 2627855, МПК A61K 33/26, A61K 31/715, A61K 31/717, A61K 31/722, A61K 31/197, A61P 7/04, опубл. 14.08.2017).

Недостатком известных решений является то, что данные раневые покрытия способны остановить лишь небольшие капиллярно-паренхиматозные кровотечения и не могут справится с более сильным потоком крови.

Наиболее близким техническим решением к заявленному является раневое покрытие, обладающее гемостатическим действием, содержащее бактериальную целлюлозу, синтезированную с помощью симбиотической культуры Medusomyces gisevii Sa-12 в виде губки, содержащее до 10% гемостатических и до 3% антимикробных средств по отношению к бактериальной целлюлозе. В качестве гемостатического компонента содержит фибрин-мономер, тромбин, факторы свертывания крови VIII и IX, железную соль полиакриловой кислоты, например, феракрил. В качестве антимикробного компонента содержит диоксидин или хлоргексидин, или серебро, или раствор «доктор Чистотелофф», антибиотики широкого спектра действия, например, цефипим или азитромицин (RU 2624242, МПК A31L 15/18, A61L 15/44, A61L 15/28, A61F 13/00, опубл. 03.07.2017).

Недостатком известного решения является длительное время остановки кровотечения, что позволяет останавливать только капиллярно-паренхиматозные кровотечения.

Технический результат заявленного изобретения заключается в получении гемостатического препарата в форме аэрогеля на основе окисленной бактериальной целлюлозы и альгината кальция, который способен остановить кровотечение в течение 60-120 с.

Сущность изобретения заключается в том, что способ получения гемостатического препарата в форме аэрогеля на основе бактериальной целлюлозы и альгината кальция заключается в получении биокомпозита на основе окисленной бактериальной целлюлозы, полученной при культивировании продуцента Komagataeibacter sucrofermentans H-110 (ВКПМ-11267), альгината кальция, тромбина или Х фактора свертывания крови, или тромбина и фузидина натрия, а для получения аэрогеля биокомпозит замораживают в низкотемпературном холодильнике в течение 1 сут, после чего лиофильно высушивают. Так же получают биокомпозит «окисленная бактериальная целлюлоза / альгинат / тромбин» путем смешения 2%-ного раствора альгината и гидрогеля окисленной бактериальной целлюлозы в соотношении 50:50, с последующим добавлением 0,02% 5%-ного раствора СаСl₂, 0,02% тромбина в концентрации 0,5 мг/мл. Так же получают биокомпозит «окисленная бактериальная целлюлоза / альгинат / тромбин/ фузидин натрия» путем смешения 2%-ного раствора альгината и гидрогеля окисленной бактериальной целлюлозы в соотношении 50:50, с последующим добавлением 0,02% 5%-ного раствора СаСl₂, 0,02% тромбина в концентрации 0,5 мг/мл и 0,05% фузидина натрия в концентрации 0,75 мг/мл. Так же получают биокомпозит «окисленная бактериальная целлюлоза / альгинат / Х фактор свертывания крови» путем смешения 2%-ного раствора альгината и гидрогеля окисленной бактериальной целлюлозы в соотношении 50:50, с последующим добавлением 0,02% 5%-ого раствора СаСl₂, 0,02% Х фактора свертывания крови в концентрации 10 мкг/мл.

Бактериальная целлюлоза, также известная как микробная целлюлоза, представляет собой линейный гомополисахарид, синтезируемый бактериями. Нановолокна бактериальной целлюлозы представляют собой лентообразные структуры диаметром около 100 нм и длиной около 100 мкм. Эти ленты состоят из пучков целлюлозных микрофибрилл диаметром 2-4 нм (Ревин В. В., Лияськина Е. В., Пестов Н. А. Получение бактериальной целлюлозы и нанокомпозиционных материалов. – 2014, с. 5-13).

Бактериальная целлюлоза является биоразлагаемым, нетоксичным и биосовместимым полимером. Одним из основных преимуществ бактериальной целлюлозы, по сравнению с растительной, является ее уникальная природная чистота, которая допускает ее прямое использование.

Химические модификации, которые могут изменить физические и химические свойства целлюлозы, являются главным способом функционализации целлюлозных аэрогелей. В настоящее время наиболее распространенными типами аэрогелей на основе производных наноцеллюлозы являются аэрогели наноцеллюлозы, окисленные 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксильными радикалами (ТЕМРО), и аэрогели наноцеллюлозы с функционализированными поверхностями. ТЕМРО позволяет избирательно окислять первичные спиртовые группы в молекулярной цепи целлюлозы до отрицательно заряженных групп, например, карбоксильных (Cheng F. et al. Preparation and characterization of 2, 2, 6, 6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMPO)-oxidized cellulose nanocrystal/alginate biodegradable composite dressing for hemostasis applications // ACS Sustainable Chemistry & Engineering. – 2017. – Т. 5. – №. 5. – С. 3819-3828).

Принцип гемостатического действия окисленной целлюлозы заключается в том, что при контакте с кровью создается кислая среда (pH 2,5-4,5), которая усиливает гемостатические качества окисленной бактериальной целлюлозы, основанные на ее впитывающих способностях. В кислой среде собственные тромбоциты и разрушившиеся эритроциты, выделившие кислый гематин, выступают в роли каркаса для образования тромбоцитарного сгустка. Также кислая среда в зоне повреждающего воздействия создает условия для выраженной противомикробной активности окисленной бактериальной целлюлозы, в том числе, и в отношении антибиотико-резистентных микроорганизмов. Поскольку низкий pH влияет на довольно широкий спектр бактерий, включая стафилококки, псевдомонады, стрептококки, кишечную палочку и другие микробы, часто вызывающие хирургические инфекции, которые передаются через медицинские инструменты, и, в отличие от антибиотиков, не имеет узкоспецифичного механизма действия (Качмазов А. А., Жернов А. А. Методы гемостаза и применение препаратов из окисленной восстановленной целлюлозы при резекции почки // Экспериментальная и клиническая урология. – 2010. – №. 4. – С. 68-71).

Альгинат представляет собой природный анионный полисахарид, представляющий собой линейную цепь β-D-маннуроновой кислоты (M единиц) и α-L-гиалуроновой кислоты (G единиц), связанных 1,4-гликозидной связью, в основном из бурых водорослей и бактерий (Zhong H. et al. The structural characteristics of seaweed polysaccharides and their application in gel drug delivery systems // Marine drugs. – 2020. – Т. 18. – №. 12. – С. 658). Альгинаты биосовместимы, биодеградируемы и относительно недороги в производстве, хорошо растворяются в воде и обладают высокой водоудерживающей способностью, легко образуют гидрогели, которые представляют собой трехмерные сетки, образованные сшивающимися гидрофильными полимерами (Li Y., Yang H. Y., Lee D. S. Advances in biodegradable and injectable hydrogels for biomedical applications // Journal of Controlled Release. – 2021. – Т. 330. – С. 151-160). Кроме того, они проявляют различные виды биологической активности (иммуномодулирующая, противовирусная, гемостатическая), не токсичны и используются при создании раневых покрытий для различных ран (Kim J. O. et al. Development of polyvinyl alcohol–sodium alginate gel-matrix-based wound dressing system containing nitrofurazone // International journal of pharmaceutics. – 2008. – Т. 359. – №. 1-2. – С. 79-86). Альгинат был одобрен FDA в качестве материала, общепризнанного безопасным (GRAS) без особых ограничений.

Альгинат кальция является наиболее распространенным альгинатным кровоостанавливающим материалом. Гидрогели альгината кальция могут способствовать проникновению ионов кальция в рану посредством реакции ионного обмена с ионами натрия в крови. Затем они стимулируют выработку факторов свертывания VII, IX и X, а также тромбоцитов, активируют каскадную реакцию свертывания и ускоряют процесс гемостаза (Wu X. et al. Fabrication of chitosan@ calcium alginate microspheres with porous core and compact shell, and application as a quick traumatic hemostat // Carbohydrate polymers. – 2020. – Т. 247. – С. 116669).

Альгинат кальция содержит фитогемагглютинин, который может агрегировать эритроциты и изменять морфологию эритроцитов, выделяя фосфатидилсерин на поверхности эритроцитов, тем самым ускоряя локальное превращение протромбина в тромбин (Wang L., Li W., Qin S. Three Polymers from the Sea: Unique Structures, Directional Modifications, and Medical Applications // Polymers. – 2021. – Т. 13. – №. 15. – С. 2482).

Кроме того, альгинатные гидрогели также могут быть загружены кровоостанавливающими препаратами или биоактивными ингредиентами для ускорения гемостаза и заживления (Ehterami A. et al. Chitosan/alginate hydrogels containing Alpha-tocopherol for wound healing in rat model // Journal of Drug Delivery Science and Technology. – 2019. – Т. 51. – С. 204-213).

Фактор Х, или фактор Стюарта-Прауера – это витамин К-зависимый многодоменный белок, который участвует как во внутренней, так и во внешней частях каскада свертывания [Neuenschwander P. F. Coagulation cascade. Factor X. / P. F. Neuenschwander // Encyclopedia of Respiratory Medicine. – 2006. – P.499–503. – URL: file:///C:/Users/111/Downloads/neuenschwander2006.pdf].

В процессе свертывания крови фактор Х активирует фактор II в присутствии фактора V и ионов кальция с образованием тромбина. Тромбин в свою очередь может вызывать специфический протеолиз фибриногена с образованием мономеров фибрина. Тромбин играет роль сильного активатора тромбоцитов.

В заявленном изобретении также используется антибиотик фузидин натрия для придания гемостатическому препарату антибактериальных свойств.

Фузидовая кислота – антибиотик, продуцентом которого является гриб Fusidium coccineum. Благодаря своей активности в отношении ряда грамположительных бактерий, фузидовая кислота используется для лечения различных заболеваний. Помимо антибактериального, она обладает слабым иммуномодулирующим действием, которое связывают с подавлением продукции и секреции цитокинов, особенно интерлейкинов, и фактора некроза опухолей.

Способ получения гемостатического препарата в форме аэрогеля на основе бактериальной целлюлозы и альгината, осуществляют следующим образом.

Пример 1. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании продуцента Komagataeibacter sucrofermentans H-110 (ВКПМ-11267) в статических условиях окисляют посредством добавления к водной целлюлозной суспензии NaClO в присутствии катализатора 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил и NaBr при pH 10-11 при комнатной температуре. Проводят механическое измельчение модифицированной гель-пленки бактериальной целлюлозы с получением гидромодуля в соотношении 1:2.

Для получения биокомпозита «окисленная бактериальная целлюлоза / альгинат / тромбин» смешивают 2%-ный раствор альгината и гидрогель окисленной бактериальной целлюлозы в соотношении 50:50, дополнительно вносят 0,02% 5%-го раствора СаСl₂ и 0,02 % тромбина в концентрации 0,5 мг/мл. Для получения аэрогелей, полученный образец замораживают в низкотемпературном холодильнике в течение 1 сут., далее лиофильно высушивают.

Антибактериальные свойства заявленного гемостатического препарата определяют методом, основанным на способности антибиотических веществ диффундировать в агаровых средах и образовывать зоны, в которых не развиваются чувствительные к этим антибиотикам тест-микроорганизмы. В качестве тест-микроорганизмов используют бактерии Staphylococcus aureus 209 Р и Bacillus licheniformis ВКПМ В-7847. Антибактериальная активность при использовании препарата, полученного на основе аэрогелей окисленной бактериальной целлюлозы, альгината, СаСl₂, тромбина по отношению к Staphylococcus aureus 209 Р и Bacillus licheniformis ВКПМ В-7847 не наблюдалась.

Для исследования гемостатических свойств используют кровь доноров, смешанную с 3,2%-ным раствором цитрата натрия (в качестве антикоагулянта), в соотношении 9:1 (9 объемов крови : 1 объем цитрата натрия). Рекальцификацию крови проводят раствором 0,2М СaCl₂×6 H₂O. Пластину аэрогеля массой 1,5-2,5 мг помещают в смесь цитратной крови и хлорида кальция и фиксируют время образования устойчивого кровяного сгустка. При проведении серий опытов по определению гемокоагулирующей активности препарата время гемостаза сокращалось на 61,3%.

Пример 2. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании продуцента Komagataeibacter sucrofermentans H-110 (ВКПМ-11267) в статических условиях окисляют посредством добавления к водной целлюлозной суспензии NaClO в присутствии катализатора 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил и NaBr при pH 10-11 при комнатной температуре. Проводят механическое измельчение модифицированной гель-пленки бактериальной целлюлозы с получением гидромодуля в соотношении 1:2.

Для получения биокомпозита «окисленная бактериальная целлюлоза / альгинат / тромбин/ фузидин натрия» смешивают 2%-ный раствор альгината и гидрогель окисленной бактериальной целлюлозы в соотношении 50:50, дополнительно вносят 0,02% 5%-го раствора СаСl₂, 0,02% тромбина в концентрации 0,5 мг/мл и 0,05% фузидина натрия в концентрации 0,75 мг/мл. Для получения аэрогелей, полученный образец замораживают в низкотемпературном холодильнике в течение 1 сут., далее лиофильно высушивают.

Антибактериальные свойства заявленного гемостатического препарата определяют методом, основанном на способности антибиотических веществ диффундировать в агаровых средах и образовывать зоны, в которых не развиваются чувствительные к этим антибиотикам тест-микроорганизмы. В качестве тест-микроорганизмов используют бактерии Staphylococcus aureus 209 Р и Bacillus licheniformis ВКПМ В-7847. Антибактериальная активность при использовании препарата, полученного на основе аэрогелей окисленной бактериальной целлюлозы, альгината, СаСl₂, тромбина и фузидина натрия составила 8 ± 1 мм по отношению к Staphylococcus aureus 209 Р и 5 ± 1 мм по отношению Bacillus licheniformis ВКПМ В-7847.

Для исследования гемостатических свойств используют кровь доноров, смешанную с 3,2%-ным раствором цитрата натрия (в качестве антикоагулянта), в соотношении 9:1 (9 объемов крови : 1 объем цитрата натрия). Рекальцификацию крови проводят раствором 0,2М СaCl₂×6 H₂O. Пластину аэрогеля массой 1,5-2,5 мг помещают в смесь цитратной крови и хлорида кальция и фиксируют время образования устойчивого кровяного сгустка. При проведении серий опытов по определению гемокоагулирующей активности препарата время гемостаза сокращалось в среднем на 60,9%.

Пример 3. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании продуцента Komagataeibacter sucrofermentans H-110 (ВКПМ-11267) в статических условиях окисляют посредством добавления к водной целлюлозной суспензии NaClO в присутствии катализатора 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил и NaBr при pH 10-11 при комнатной температуре. Проводят механическое измельчение модифицированной гель-пленки бактериальной целлюлозы с получением гидромодуля в соотношении 1:2.

Для получения биокомпозита «окисленная бактериальная целлюлоза / альгинат / Х фактор» смешивают 2%-ный раствор альгината и гидрогель окисленной бактериальной целлюлозы в соотношении 50:50, дополнительно вносят 0,02% 5%-го раствора СаСl₂, 0,02% Х фактора свертывания крови в концентрации 10 мкг/мл. Для получения аэрогелей, полученный образец замораживают в низкотемпературном холодильнике в течение 1 сут., далее лиофильно высушивают.

Антибактериальные свойства заявленного гемостатического препарата определяют методом, основанном на способности антибиотических веществ диффундировать в агаровых средах и образовывать зоны, в которых не развиваются чувствительные к этим антибиотикам тест-микроорганизмы. В качестве тест-микроорганизмов используют бактерии Staphylococcus aureus 209 Р и Bacillus licheniformis ВКПМ В-7847. Антибактериальная активность при использовании препарата, полученного на основе аэрогелей окисленной бактериальной целлюлозы, альгината, СаСl₂, Х фактора по отношению к Staphylococcus aureus 209 Р и Bacillus licheniformis ВКПМ В-7847 не наблюдалась.

Для исследования гемостатических свойств используют кровь доноров, смешанную с 3,2%-ным раствором цитрата натрия (в качестве антикоагулянта), в соотношении 9:1 (9 объемов крови : 1 объем цитрата натрия). Рекальцификацию крови проводят раствором 0,2М СaCl₂×6 H₂O. Пластину аэрогеля массой 1,5-2,5 мг помещают в смесь цитратной крови и хлорида кальция и фиксируют время образования устойчивого кровяного сгустка. При проведении серий опытов по определению гемокоагулирующей активности препарата время гемостаза сокращалось в среднем на 89,3%.

Пример 4. Бактериальную целлюлозу, полученную при культивировании продуцента Komagataeibacter sucrofermentans H-110 (ВКПМ-11267) в статических условиях окисляют посредством добавления к водной целлюлозной суспензии NaClO в присутствии катализатора 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил и NaBr при pH 10-11 при комнатной температуре. Проводят механическое измельчение модифицированной гель-пленки бактериальной целлюлозы с получением гидромодуля в соотношении 1:2.

Для получения биокомпозита «окисленная бактериальная целлюлоза / альгинат / тромбин / фузидин натрия» смешивают 2%-ный раствор альгината и гидрогель окисленной бактериальной целлюлозы в соотношении 50:50, дополнительно вносят 0,02% 5%-ного раствор СаСl₂, 0,02% Х фактора свертывания крови в концентрации 10 мкг/мл и 0,05 % фузидина натрия в концентрации 0,75 мг/мл. Для получения аэрогелей, полученный образец замораживают в низкотемпературном холодильнике в течение 1 сут., далее лиофильно высушивают.

Антибактериальные свойства заявленного гемостатического препарата определяют методом, основанном на способности антибиотических веществ диффундировать в агаровых средах и образовывать зоны, в которых не развиваются чувствительные к этим антибиотикам тест-микроорганизмы. В качестве тест-микроорганизмов используют бактерии Staphylococcus aureus 209 Р и Bacillus licheniformis ВКПМ В-7847. Антибактериальная активность при использовании препарата, полученного на основе аэрогелей окисленной бактериальной целлюлозы, альгината, СаСl₂, тромбина составила 10 ± 1 мм по отношению к Staphylococcus aureus 209 Р и 6 ± 1 мм по отношению Bacillus licheniformis ВКПМ В-7847.

Для исследования гемостатических свойств используют кровь доноров, смешанную с 3,2%-ным раствором цитрата натрия (в качестве антикоагулянта), в соотношении 9:1 (9 объемов крови : 1 объем цитрата натрия). Рекальцификацию крови проводят раствором 0,2М СaCl₂×6 H₂O. Пластину аэрогеля массой 1,5-2,5 мг помещают в смесь цитратной крови и хлорида кальция и фиксируют время образования устойчивого кровяного сгустка.

При проведении серий опытов по определению гемокоагулирующей активности препарата время гемостаза сокращалось в среднем на 88,1%.

Антибактериальная активность при использовании препарата, полученного на основе аэрогелей окисленной бактериальной целлюлозы, альгината, СаСl₂, тромбина и фузидина натрия составила 8-10 ± 1 мм по отношению к Staphylococcus aureus 209 Р и 5-6 ± 1 мм по отношению Bacillus licheniformis ВКПМ В-7847, в то время как гемостатические препараты, в составе которых отсутствовал фузидин натрия, не проявляли активность против тест-микроорганизмов.

При проведении серий опытов по определению гемокоагулирующей активности препарата время гемостаза сокращалось в среднем на 89% в случае с Х фактором и на 61% в случае с тромбином.

Таким образом, преимуществом заявленного изобретения, по сравнению с известным решением, является высокая влагосвязывающая способность и степень набухания полученных гемостатических материалов, что позволяет поглощать кровь в 200 раз больше своего собственного объема. Помимо того, этот гемокоагулирующий процесс проходит параллельно с каскадом свертывания крови за счет альгината и включенных в состав факторов. Данный гемостатический материал в форме аэрогеля способен останавливать артериальное кровотечение.

Claims (4)

1. Способ получения гемостатического препарата в форме аэрогеля на основе бактериальной целлюлозы и альгината кальция, включающий получение биокомпозита на основе окисленной бактериальной целлюлозы, полученной при культивировании продуцента Komagataeibacter sucrofermentans H-110 (ВКПМ-11267), альгината кальция, тромбина или Х фактора свертывания крови или тромбина и фузидина натрия, а для получения аэрогеля биокомпозит замораживают в низкотемпературном холодильнике в течение 1 сут., после чего лиофильно высушивают.

2. Способ получения гемостатического препарата по п.1, отличающийся тем, что для получения биокомпозита «окисленная бактериальная целлюлоза / альгинат / тромбин» смешивают 2%-ный раствор альгината и гидрогель окисленной бактериальной целлюлозы в соотношении 50:50, дополнительно вносят 0,02% 5%-ного раствора СаСl₂ и 0,02% тромбина в концентрации 0,5 мг/мл.

3. Способ получения гемостатического препарата по п.1, отличающийся тем, что для получения биокомпозита «окисленная бактериальная целлюлоза / альгинат / тромбин/ фузидин натрия» смешивают 2%-ный раствор альгината и гидрогель окисленной бактериальной целлюлозы в соотношении 50:50, дополнительно вносят 0,02% 5%-ного раствора СаСl₂, 0,02% тромбина в концентрации 0,5 мг/мл и 0,05% фузидина натрия в концентрации 0,75 мг/мл.

4. Способ получения гемостатического препарата по п.1, отличающийся тем, что для получения биокомпозита «окисленная бактериальная целлюлоза / альгинат / Х фактор свертывания крови» смешивают 2%-ный раствор альгината и гидрогель окисленной бактериальной целлюлозы в соотношении 50:50, дополнительно вносят 0,02% 5%-ного раствора СаСl₂, 0,02% Х фактора свертывания крови в концентрации 10 мкг/мл.