RU2797499C1 - New protein variant of the cyanate transporter family and a method for producing l-tryptophan using it - Google Patents
New protein variant of the cyanate transporter family and a method for producing l-tryptophan using it Download PDFInfo
- Publication number
- RU2797499C1 RU2797499C1 RU2022102732A RU2022102732A RU2797499C1 RU 2797499 C1 RU2797499 C1 RU 2797499C1 RU 2022102732 A RU2022102732 A RU 2022102732A RU 2022102732 A RU2022102732 A RU 2022102732A RU 2797499 C1 RU2797499 C1 RU 2797499C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- present disclosure
- sequence
- polynucleotide
- amino acid
- Prior art date
Links
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯFIELD OF THE INVENTION
Настоящее раскрытие относится к новому варианту белка семейства транспортера цианата, штамму Escherichia coli, содержащему данный вариант, и к способу продуцирования L-триптофана с использованием данного штамма.The present disclosure relates to a new variant of the cyanate transporter family protein, a strain of Escherichia coli containing this variant, and to a method for producing L-tryptophan using this strain.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИPRIOR ART
Проводятся разные исследования для разработки высокоэффективных микроорганизмов и технологий способов ферментации для производства L-аминокислот и других полезных веществ. Например, главным образом, используется специфичный подход в отношении целевого вещества, при котором увеличивается экспрессия гена, кодирующего фермент, участвующий в биосинтезе L-триптофана, или при котором удаляются гены, не являющиеся необходимыми для биосинтеза (US 8945907 В2).Various studies are being conducted to develop highly efficient microorganisms and fermentation process technologies for the production of L-amino acids and other beneficial substances. For example, a target-substance-specific approach is mainly used, which increases the expression of a gene encoding an enzyme involved in the biosynthesis of L-tryptophan, or which removes genes that are not necessary for biosynthesis (US 8945907 B2).
Однако все еще необходимо проводить исследования для эффективного увеличения способности к продуцированию L-триптофана, так как возрастает спрос на L-триптофан.However, research is still needed to effectively increase the ability to produce L-tryptophan as the demand for L-tryptophan increases.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDESCRIPTION OF THE INVENTION
Техническая проблемаTechnical problem
Авторы настоящего изобретения разработали новый вариант белка семейства транспортера цианата для увеличения продуцирования L-триптофана, штамм Escherichia coli, содержащий данный вариант, и способ продуцирования L-триптофана с использованием данного штамма, посредством этого осуществляя настоящее раскрытие.The present inventors have developed a new cyanate transporter family protein variant for increasing L-tryptophan production, an Escherichia coli strain containing this variant, and a method for producing L-tryptophan using this strain, thereby accomplishing the present disclosure.
Техническое решениеTechnical solution
Целью настоящего раскрытия является предоставление варианта белка семейства транспортера цианата, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в которой аспарагиновая кислота, которая представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 259 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, заменена аспарагином.The purpose of the present disclosure is to provide a protein variant of the cyanate transporter family consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, in which aspartic acid, which is the amino acid corresponding to position 259 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, has been replaced with asparagine.
Другой целью настоящего раскрытия является предоставление полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему раскрытию.Another object of the present disclosure is to provide a polynucleotide encoding a variant of the present disclosure.
Еще одной другой целью настоящего раскрытия является предоставление штамма Escherichia coli, который содержит вариант по настоящему раскрытию, или полинуклеотид, кодирующий данный вариант, и имеет способность к продуцированию L-триптофана.Yet another object of the present disclosure is to provide an Escherichia coli strain that contains a variant of the present disclosure, or a polynucleotide encoding the variant, and has the ability to produce L-tryptophan.
Еще одной другой целью настоящего раскрытия является предоставление способа продуцирования L-триптофана, который включает культивирование в среде штамма Escherichia coli, который содержит вариант по настоящему раскрытию, или полинуклеотид, кодирующий данный вариант, и имеет способность к продуцированию L-триптофана.Yet another object of the present disclosure is to provide a method for producing L-tryptophan, which comprises culturing in a medium a strain of Escherichia coli that contains a variant of the present disclosure, or a polynucleotide encoding the variant, and has the ability to produce L-tryptophan.
Полезные эффектыBeneficial effects
В случае культивирования штамма Escherichia coli, содержащего вариант белка семейства транспортера цианата по настоящему раскрытию, возможно продуцировать L-триптофан с более высоким выходом по сравнению со случаем существующих микроорганизмов, имеющих немодифицированные полипептиды.In the case of culturing an Escherichia coli strain containing the cyanate transporter family protein variant of the present disclosure, it is possible to produce L-tryptophan in a higher yield compared to the case of existing microorganisms having unmodified polypeptides.
Наилучший способ воплощения изобретенияThe best way to implement the invention
Настоящее раскрытие будет подробно описано следующим образом. Тем временем, каждое из описаний и воплощений, раскрытых в настоящем раскрытии, можно применять к другим описаниям и воплощениям. Другими словами, все комбинации разных элементов, раскрытых в настоящем раскрытии, принадлежат к объему настоящего раскрытия. Кроме того, нельзя считать, что объем настоящего раскрытия ограничивается конкретным описанием, приведенным ниже. Кроме того, во всем настоящем описании изобретения приводятся ссылки целого ряда статей и патентных документов, и указываются их цитирования. Вся полнота содержания, раскрытого в процитированных статьях и патентных документах, включается в настоящее описание изобретения посредством ссылки для того, чтобы более ясно описать уровень технической области, к которой принадлежит настоящее изобретение и содержание настоящего изобретения.The present disclosure will be described in detail as follows. In the meantime, each of the descriptions and embodiments disclosed in this disclosure may apply to other descriptions and embodiments. In other words, all combinations of different elements disclosed in the present disclosure are within the scope of the present disclosure. In addition, the scope of the present disclosure should not be considered to be limited by the specific description provided below. In addition, a number of articles and patent documents are referenced and cited throughout the present specification. The entire content disclosed in the cited articles and patent documents is incorporated into the present specification by reference in order to more clearly describe the level of the technical field to which the present invention belongs and the content of the present invention.
Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложен вариант, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, в котором аспарагиновая кислота, которая представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 259 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, заменена аспарагином.According to one aspect of the present disclosure, there is provided a variant consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, wherein aspartic acid, which is the amino acid corresponding to position 259 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, is replaced with asparagine.
Вариант по настоящему раскрытию может иметь, содержать или по существу состоять из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1.The variant of the present disclosure may have, contain, or essentially consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
В варианте по настоящему раскрытию аминокислота, соответствующая положению 259 на основе аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1, представляет собой аспарагин и может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%-ную, 75%-ную, 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную, 96%-ную, 97%-ную, 98%-ную, 99%-ную, 99,5%-ную, 99,7%-ную или 99,9%-ную или большую гомологию или идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1. Очевидно то, что варианты, имеющие аминокислотные последовательности, в которых некоторые последовательности удалены, модифицированы, заменены, консервативно заменены или добавлены, также включаются в объем настоящего раскрытия, при условии, что аминокислотные последовательности имеют такую гомологию или идентичность и демонстрируют эффективность, соответствующую эффективности варианта по настоящему раскрытию.In the embodiment of the present disclosure, the amino acid corresponding to position 259 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 is asparagine and may contain an amino acid sequence having at least 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% or greater homology or identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Obviously, variants having amino acid sequences in which some sequences are deleted, modified, replaced, conservatively substituted or added are also included within the scope of this disclosure, provided that the amino acid sequences have such homology or identity and exhibit an efficacy corresponding to that of the variant of the present disclosure.
Его примеры включают варианты, имеющие присоединение или делецию последовательности, которые не изменяют функцию варианта по настоящему раскрытию, на N-конце и С-конце аминокислотной последовательности, и/или внутри данной аминокислотной последовательности, встречающуюся в природе мутацию, молчащую мутацию или консервативную замену.Examples thereof include variants having a sequence addition or deletion that does not change the function of the variant of the present disclosure, at the N-terminus and C-terminus of an amino acid sequence, and/or within that amino acid sequence, a naturally occurring mutation, a silent mutation, or a conservative substitution.
Термин «консервативная замена» означает замену одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей аналогичные структурные и/или химические свойства. Такая аминокислотная замена обычно может происходить на основе сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Обычно консервативная замена может слегка влиять или не влияет на активность белков или полипептидов.The term "conservative substitution" means the replacement of one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such an amino acid substitution can typically occur based on similarities in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and/or the amphipathic nature of the residues. Typically, a conservative substitution may or may not affect the activity of proteins or polypeptides.
В настоящем раскрытии термин «вариант» относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность отличную от аминокислотной последовательности данного варианта перед изменением посредством консервативной замены и/или модификации одной или более чем одной аминокислоты, но сохраняет функции или свойства. Такой вариант обычно может быть идентифицирован посредством модифицирования одной или более чем одной аминокислоты аминокислотной последовательности данного полипептида и осуществления оценки свойств данного модифицированного полипептида. Другими словами, способность данного варианта может быть увеличена, оставлена неизменной или снижена по сравнению со способностью полипептида перед изменением. Некоторые варианты могут включать варианты, в которых одна или более чем одна часть, такая как N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен, были удалены. Другие варианты могут включать варианты, в которых была удалена часть зрелого белка от N- и/или С-конца. Термин «вариант» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как модификация, модифицированный полипептид, модифицированный белок, мутант, мутеин и дивергент, и не ограничивается ими, при условии, что он представляет собой термин, используемый со значением изменения. В целях настоящего раскрытия данный вариант может представлять собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, в которой аспарагиновая кислота, которая представляет собой аминокислоту, соответствующую положению 259 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, заменена аспарагином.In the present disclosure, the term "variant" refers to a polypeptide that has an amino acid sequence different from the amino acid sequence of the variant before being altered by conservative substitution and/or modification of one or more amino acids, but retains functions or properties. Such a variant can usually be identified by modifying one or more amino acids of the amino acid sequence of a given polypeptide and evaluating the properties of that modified polypeptide. In other words, the ability of a given variant can be increased, left unchanged, or reduced compared to the ability of the polypeptide before the change. Some variants may include variants in which one or more than one portion, such as the N-terminal leader sequence or the transmembrane domain, has been deleted. Other variants may include variants in which a portion of the mature protein has been removed from the N- and/or C-terminus. The term "variant" can be used interchangeably with and is not limited to terms such as modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, and divergent, as long as it is a term used with the meaning of change. For the purposes of the present disclosure, this variant may be a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in which aspartic acid, which is the amino acid corresponding to position 259 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, has been replaced with asparagine.
Данный вариант может содержать делеции или присоединения аминокислот, которые имеют минимальное влияние на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, с N-концом данного варианта может быть конъюгирована сигнальная (или лидерная) последовательность, которая котрансляционно или посттрансляционно участвует в транслокации белка. Данный вариант может быть конъюгирован с другими последовательностями или линкерами таким образом, чтобы его идентифицировать, очистить или синтезировать.This variant may contain deletions or additions of amino acids that have minimal effect on the properties and secondary structure of the polypeptide. For example, a signal (or leader) sequence that co-translationally or post-translationally participates in protein translocation can be conjugated to the N-terminus of this variant. This variant can be conjugated to other sequences or linkers in such a way as to be identified, purified or synthesized.
В настоящем раскрытии термин «гомология» или «идентичность» означает степень сходства между двумя данными аминокислотными последовательностями или последовательностями оснований и может быть выражена в виде процентной доли. Термины «гомология» и «идентичность» часто могут использоваться взаимозаменяемо.In the present disclosure, the term "homology" or "identity" means the degree of similarity between two given amino acid or base sequences, and may be expressed as a percentage. The terms "homology" and "identity" can often be used interchangeably.
Гомологию или идентичность последовательности консервативного полинуклеотид а или полипептида определяют стандартными алгоритмами выравнивания, и можно совместно использовать штраф за пропуск по умолчанию, установленный применяемой программой. По существу гомологичные или идентичные последовательности обычно способны к гибридизации со всей или с частью последовательности при условиях умеренной или высокой жесткости. Очевидно, что гибридизация также включает гибридизацию полинуклеотид а с полинуклеотидом, содержащим кодон общего типа или вырожденный кодон.Homology or sequence identity of a conserved polynucleotide a or polypeptide is determined by standard alignment algorithms and the default gap penalty set by the application program may be shared. Substantially homologous or identical sequences are generally capable of hybridizing to all or part of the sequence under conditions of moderate to high stringency. Obviously, hybridization also includes the hybridization of polynucleotide a with a polynucleotide containing a common type codon or a degenerate codon.
Имеют ли любые две последовательности полинуклеотида или полипептида гомологию, сходство или идентичность, можно определять с использованием известных компьютерных алгоритмов, таких как программа «FASTA», например, с использованием параметров по умолчанию как в Pearson et al, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444. В качестве альтернативы, гомология, сходство или идентичность могут быть определены с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443^-53), как осуществляется в программе Нидлмана пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версия 5.0.0 или более поздняя) (включая программный пакет GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al, JMOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994; и CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Например, для определения гомологии, сходства или идентичности можно использовать BLAST Национального центра биотехнологической информации или ClustalW.Whether any two polynucleotide or polypeptide sequences share homology, similarity, or identity can be determined using known computer algorithms such as the "FASTA" program, for example, using default parameters as in Pearson et al, (1988) Proc. Natl. Acad. sci. USA 85:2444. Alternatively, homology, similarity, or identity can be determined using the Needleman and Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) (version 5.0.0 or later) (including GCG software package (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12 :387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al, JMOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994; and CARILLO et al (1988) SIAM J Applied Math 48:1073) For example, BLAST of the National Center for Biotechnology Information or ClustalW can be used to determine homology, similarity, or identity.
Гомологию, сходство или идентичность полинуклеотидов или полипептидов можно определять посредством сравнения информации по последовательности с использованием, например, компьютерной программы GAP, как, например, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, как анонсировано, например, в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. В заключение, результат программы GAP может быть определен как значение, полученное делением числа аналогичных выровненных символов (а именно: нуклеотидов или аминокислот) на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию программы GAP могут включать (1) матрицу двоичных сравнений (включающую значения 1 для идентичности и 0 для неидентичности) и матрицу взвешенных сравнений Gribskov et al, (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745 (или матрицу замен EDNAFULL (EMBOSS версии NCBI NUC4.4)), как раскрыто в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) штраф 3,0 для каждого пропуска и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом пропуске (или штраф 10 за открытие пропуска, штраф 0,5 за удлинение пропуска); и (3) отсутствие штрафа за концевые пропуски.Homology, similarity, or identity of polynucleotides or polypeptides can be determined by comparing sequence information using, for example, the GAP computer program, such as Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, as announced, for example, in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Finally, the result of the GAP program can be defined as the value obtained by dividing the number of similar aligned characters (namely, nucleotides or amino acids) by the total number of characters in the shorter of the two sequences. The default parameters of the GAP program may include (1) a binary comparison matrix (including values of 1 for identity and 0 for non-identity) and a weighted comparison matrix of Gribskov et al, (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745 (or EDNAFULL substitution matrix (EMBOSS version NCBI NUC4.4)), as disclosed in Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional penalty of 0.10 for each character in each gap (or a penalty of 10 for opening a gap, a penalty of 0.5 for extending a gap); and (3) no end gap penalty.
В качестве примера по настоящему раскрытию, вариант по настоящему раскрытию может демонстрировать активность белка семейства транспортера цианата. Кроме того, вариант по настоящему раскрытию может демонстрировать активность таким образом, чтобы иметь повышенную способность к образованию L-триптофана по сравнению с полипептидом дикого типа, демонстрирующим активность белка семейства транспортера цианата. Термин «белок семейства транспортера цианата» в том виде, как он здесь используется, относится к полипептиду, который транспортирует в клеточной мембране. В частности, термин «белок семейства транспортера цианата» по настоящему раскрытию можно использовать взаимозаменяемо с термином «транспортный белок цианата (CynX)». В настоящем раскрытии последовательность белка семейства транспортера цианата может быть получена из GenBank NCBI известной базы данных. В частности, белок семейства транспортера цианата может представлять собой полипептид, имеющий активность белка семейства транспортера цианата, кодируемый геном cynX, но не ограничивается им.As an example of the present disclosure, a variant of the present disclosure may exhibit the activity of a cyanate transporter family protein. In addition, a variant of the present disclosure may exhibit activity such that it has an increased ability to generate L-tryptophan compared to a wild-type polypeptide exhibiting activity of a cyanate transporter family protein. The term "cyanate transporter family protein" as used herein refers to a polypeptide that is transported in a cell membrane. In particular, the term "cyanate transporter family protein" of the present disclosure may be used interchangeably with the term "cyanate transport protein (CynX)". In the present disclosure, the protein sequence of the cyanate transporter family can be obtained from the GenBank NCBI known database. In particular, the cyanate transporter family protein can be a polypeptide having the activity of the cyanate transporter family protein encoded by the cynX gene, but is not limited thereto.
В настоящем раскрытии термин «соответствующий» относится к аминокислотным остаткам в положениях, перечисленных в полипептиде, или к аминокислотным остаткам, которые являются аналогичными, идентичными или гомологичными остаткам, перечисленным в данном полипептиде. Идентификация аминокислоты в соответствующем положении может определяться специфической аминокислотой в последовательности, которая относится к специфической последовательности. Термин «соответствующая область» в том виде, в котором он здесь используется, обычно относится к аналогичному или соответствующему положению в родственном белке или эталонном белке.In the present disclosure, the term "corresponding" refers to amino acid residues at the positions listed in the polypeptide, or to amino acid residues that are similar, identical or homologous to the residues listed in this polypeptide. The identification of an amino acid at an appropriate position may be determined by the specific amino acid in the sequence that refers to the specific sequence. The term "corresponding region" as used here, usually refers to a similar or corresponding position in a related protein or reference protein.
Например, произвольная аминокислотная последовательность выравнивается с SEQ ID NO: 3, и, на основе этого, каждый аминокислотный остаток данной аминокислотной последовательности может быть пронумерован по отношению к аминокислотному остатку SEQ ID NO: 3 и числовому положению соответствующего аминокислотного остатка. Например, алгоритм выравнивания последовательности, как описано в настоящем описании, может определять положение аминокислоты или положение, в котором происходит модификация, такая как замена, вставка или делеция, посредством сравнения с положением в запрашиваемой последовательности (также именуемой «эталонная последовательность»).For example, an arbitrary amino acid sequence aligns with SEQ ID NO: 3, and based on this, each amino acid residue of that amino acid sequence can be numbered with respect to the amino acid residue of SEQ ID NO: 3 and the numeric position of the corresponding amino acid residue. For example, a sequence alignment algorithm as described herein can determine the position of an amino acid or the position at which a modification occurs, such as a substitution, insertion, or deletion, by comparison with a position in a requested sequence (also referred to as a "reference sequence").
Для таких выравниваний, например, можно использовать алгоритм Нидлмана Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), программу Нидлмана пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277) и тому подобные, но программа и алгоритм не ограничиваются ими, и подходящим образом можно использовать программу выравнивания последовательностей, алгоритм попарного сравнения последовательностей и тому подобное, известные в данной области.For such alignments, for example, the Needleman and Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), the Needleman program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al. , 2000, Trends Genet. 16:276-277) and the like, but the program and algorithm are not limited thereto, and a sequence alignment program, a pairwise sequence comparison algorithm, and the like known in the art may be suitably used.
Другим аспектом настоящего раскрытия является предоставление полинуклеотид а, кодирующего вариант по настоящему раскрытию.Another aspect of the present disclosure is to provide a polynucleotide a encoding a variant of the present disclosure.
В настоящем раскрытии термин «полинуклеотид» представляет собой нить ДНК или РНК, имеющую определенную или большую длину, в качестве полимера нуклеотидов, в котором нуклеотидные мономеры соединяются в длинную цепь ковалентными связями, и, более конкретно, означает фрагмент полинуклеотид а, кодирующий данный вариант.In the present disclosure, the term "polynucleotide" is a strand of DNA or RNA, having a certain or greater length, as a polymer of nucleotides, in which nucleotide monomers are connected in a long chain by covalent bonds, and, more specifically, means a polynucleotide fragment a encoding a given variant.
Полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему раскрытию, может содержать последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1. В качестве примера по настоящему раскрытию полинуклеотид по настоящему раскрытию может иметь или содержать последовательность SEQ ID NO: 2. Полинуклеотид по настоящему раскрытию может состоять или по существу состоит из последовательности SEQ ID NO: 2.A polynucleotide encoding a variant of the present disclosure may comprise a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. As an example of the present disclosure, a polynucleotide of the present disclosure may have or contain the sequence of SEQ ID NO: 2. A polynucleotide of the present disclosure may consist or essentially consist of the sequence of SEQ ID NO: 2.
В полинуклеотиде по настоящему раскрытию могут быть сделаны разные модификации в кодирующей области при условии, что аминокислотная последовательность варианта по настоящему раскрытию не изменяется при рассмотрении вырожденности кодонов или предпочтительных кодонов в организмах, которые предназначены для экспрессии варианта по настоящему раскрытию. В частности, полинуклеотид по настоящему раскрытию имеет или содержит последовательность оснований, имеющую 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, но менее, чем 100%-ную гомологию или идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2 или может состоять или по существу состоит из последовательности оснований, имеющей 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, но менее, чем 100%-ную гомологию или идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2, но не ограничиваясь ей. Здесь в последовательности, имеющей гомологию или идентичность, кодон, кодирующий аминокислоту, соответствующую положению 259 в SEQ ID NO: 1, может представлять собой один из кодонов, кодирующих аспарагин.In a polynucleotide of the present disclosure, various modifications can be made in the coding region, provided that the amino acid sequence of the variant of the present disclosure is not changed when considering codon degeneracy or preferred codons in organisms that are intended to express the variant of the present disclosure. In particular, the polynucleotide of the present disclosure has or contains a base sequence having 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95 % or greater, 96% or greater, 97% or greater, 98% or greater, but less than 100% homology or identity with the sequence of SEQ ID NO: 2 or may consist of or essentially consists of a base sequence having 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96 % or greater, 97% or greater, 98% or greater, but less than 100% homology or identity with the sequence of SEQ ID NO: 2, but not limited to it. Here, in a sequence having homology or identity, the codon encoding the amino acid corresponding to position 259 in SEQ ID NO: 1 may be one of the codons encoding asparagine.
Полинуклеотид по настоящему раскрытию может содержать зонд, который может быть получен из последовательности известного гена, например, последовательности без ограничения при условии, что она представляет собой последовательность, которая может гибридизоваться с комплементарной последовательностью всей или части последовательности полинуклеотида по настоящему раскрытию при жестких условиях. «Жесткие условия» означают условия, которые обеспечивают специфичную гибридизацию между полинуклеотидами. Данные условия конкретно описываются в документах (см. J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8). Их примеры включают условия, при которых полинуклеотиды, имеющие более высокую гомологию или идентичность, а именно: полинуклеотиды, имеющие 70%-ную или большую, 75%-ную или большую, 80%-ную или большую, 85%-ную или большую, 90%-ную или большую, 95%-ную или большую, 96%-ную или большую, 97%-ную или большую, 98%-ную или большую, или 99%-ную или большую гомологию или идентичность, гибридизуются друг с другом, тогда как полинуклеотиды, имеющие меньшую гомологию или идентичность, не гибридизуются друг с другом, или условия, при которых промывка осуществляется один раз, в частности, от двух до трех раз при концентрации соли и температуре, эквивалентных 60°С, 1×SSC (раствор цитрата и хлорида натрия), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), в частности, при 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, более конкретно, при 68°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, которые представляют собой условия промывки для обычной гибридизации по Саузерну.The polynucleotide of the present disclosure may comprise a probe that can be derived from a sequence of a known gene, such as a sequence without limitation, provided that it is a sequence that can hybridize to a complementary sequence of all or part of the sequence of the polynucleotide of the present disclosure under stringent conditions. "Stringent conditions" means conditions that allow for specific hybridization between polynucleotides. These conditions are specifically described in documents (see J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; FM Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8). Examples thereof include conditions under which polynucleotides having higher homology or identity, namely: polynucleotides having 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or greater, 95% or greater, 96% or greater, 97% or greater, 98% or greater, or 99% or greater homology or identity, hybridize with each other , while polynucleotides having less homology or identity do not hybridize with each other, or conditions under which washing is carried out once, in particular two to three times at a salt concentration and temperature equivalent to 60°C, 1×SSC ( citrate and sodium chloride solution), 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate), in particular at 60°C, 0.1×SSC, 0.1% SDS, more specifically at 68°C, 0.1×SSC , 0.1% SDS, which are wash conditions for conventional Southern hybridization.
Для гибридизации требуется то, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя и допускаются несоответствия между основаниями, в зависимости от жесткости гибридизации. Термин «комплементарный» используется для описания связи между нуклеотидными основаниями, способными к гибридизации друг с другом. Например, в отношении ДНК, аденин является комплементарным тимину, а цитозин является комплементарным гуанину. Следовательно, полинуклеотид по настоящему раскрытию также может содержать по существу аналогичные последовательности нуклеиновой кислоты, а также фрагменты выделенной нуклеиновой кислоты, которые являются комплементарными всей последовательности.Hybridization requires that the two nucleic acids have complementary sequences, although mismatches between bases are tolerated, depending on the stringency of the hybridization. The term "complementary" is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing with each other. For example, in relation to DNA, adenine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine. Therefore, a polynucleotide of the present disclosure may also contain substantially similar nucleic acid sequences, as well as isolated nucleic acid fragments that are complementary to the entire sequence.
В частности, полинуклеотид, имеющий гомологию или идентичность с полинуклеотидом по настоящему раскрытию, может быть выявлен с использованием условий гибридизации, включая стадию гибридизации при значении Tm 55°С и вышеописанных условиях. Значение Tm может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничивается ими, и его могут подходящим образом корректировать специалисты в данной области согласно цели.In particular, a polynucleotide having homology or identity with a polynucleotide of the present disclosure can be detected using hybridization conditions, including a hybridization step at a T m value of 55°C and the conditions described above. The T m value may be 60° C., 63° C. or 65° C., but is not limited to, and may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to purpose.
Подходящая жесткость для гибридизации полинуклеотида зависит от длины и степени комплементарно ста данного полинуклеотида, и переменные хорошо известны в данной области (например, J. Sambrook et at, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).The appropriate stringency for hybridization of a polynucleotide depends on the length and degree of complementarity of the given polynucleotide, and the variables are well known in the art (e.g., J. Sambrook et at, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Другим аспектом настоящего раскрытия является предложение вектора, содержащего полинуклеотид по настоящему раскрытию. Данный вектор может представлять собой экспрессионный вектор для осуществления экспрессии полинуклеотида в клетке-хозяине, но не ограничивается им.Another aspect of the present disclosure is the provision of a vector containing the polynucleotide of the present disclosure. This vector may be an expression vector for carrying out the expression of a polynucleotide in a host cell, but is not limited to it.
Вектор по настоящему раскрытию может включать ДНК-конструкцию, содержащую последовательность оснований полинуклеотида, кодирующую интересующий полипептид, связанный функциональным образом с подходящей регуляторной областью экспрессии (или регуляторной последовательностью экспрессии) таким образом, что интересующий полипептид может экспрессироваться в подходящем хозяине. Регуляторная область экспрессии может содержать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую последовательность оператора для осуществления регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания рибосомы с мРНК, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции. Данный вектор можно трансформировать в подходящую клетку-хозяина, и затем он может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина, или может сам интегрироваться в геном.The vector of the present disclosure may include a DNA construct comprising a polynucleotide base sequence encoding a polypeptide of interest operably linked to an appropriate expression control region (or expression control sequence) such that the polypeptide of interest can be expressed in a suitable host. The regulatory expression region may comprise a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable ribosome-mRNA binding site, and a sequence regulating transcription and translation termination. This vector can be transformed into a suitable host cell and then can replicate or function independently of the host genome, or can integrate itself into the genome.
Вектор, используемый в настоящем раскрытии, конкретно не ограничивается, но можно использовать любой вектор, известный в данной области. Примеры обычно используемых векторов включают природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора можно использовать pWE15, М13, MBL3, MBL4, ГХП, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A и тому подобные, и в качестве плазмидного вектора можно использовать систему pDZ, систему pBR, систему pUC, систему pBluescript II, систему pGEM, систему pTZ, систему pCL, систему рЕТ и тому подобные. В частности, можно использовать векторы pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 и pCC1BAC, и тому подобные.The vector used in the present disclosure is not specifically limited, but any vector known in the art can be used. Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses, and bacteriophages. For example, pWE15, M13, MBL3, MBL4, HXP, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A and the like can be used as the phage vector or cosmid vector, and the pDZ system, pBR system, pUC, pBluescript II system, pGEM system, pTZ system, pCL system, pET system, and the like. In particular, pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 and pCC1BAC vectors, and the like can be used.
Например, полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид, можно вставлять в хромосому посредством вектора для внутриклеточной хромосомной вставки. Вставку данного полинуклеотида в хромосому можно осуществлять любым способом, известным в данной области, например, гомологичной рекомбинацией, но не ограничивается им. Данный вектор может дополнительно содержать селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Данный селективный маркер служит для отбора клеток, трансформированных векторами, то есть, для подтверждения вставки интересующей молекулы нуклеиновой кислоты, и можно использовать маркеры, которые придают селектируемые фенотипы, такие как устойчивость к лекарственным средствам, ауксотрофия, устойчивость к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностных полипептидов. В среде при обработке селективным агентом выживают или демонстрируют другие фенотипические признаки только клетки, экспрессирующие селективный маркер, и, таким образом, могут быть отобраны трансформированные клетки.For example, a polynucleotide encoding a polypeptide of interest can be inserted into a chromosome via an intracellular chromosomal insertion vector. Insertion of a given polynucleotide into a chromosome can be done by any method known in the art, such as, but not limited to, homologous recombination. This vector may further contain a selectable marker to confirm the insertion into the chromosome. This selectable marker serves to select cells transformed with vectors, i.e. to confirm the insertion of a nucleic acid molecule of interest, and markers that confer selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or expression of surface polypeptides can be used. In the medium treated with the selective agent, only cells expressing the selectable marker survive or exhibit other phenotypic characteristics, and thus transformed cells can be selected.
В настоящем раскрытии термин «трансформация» означает то, что вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, вводится в клетку-хозяина или микроорганизм таким образом, что полипептид, кодируемый данным полинуклеотидом, может экспрессироваться в клетке-хозяине. Трансформированный полинуклеотид может локализоваться посредством вставки в хромосому клетки-хозяина или локализоваться вне хромосомы, при условии, что он может экспрессироваться в данной клетке-хозяине. Данный полинуклеотид содержит ДНК и/или РНК, кодирующую интересующий полипептид. Данный полинуклеотид может быть вставлен в любой форме, при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и может экспрессироваться. Например, данный полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в виде экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, содержащую все элементы, требующиеся для автономной экспрессии. Данная экспрессионная кассета обычно может содержать промотор, связанный функциональным образом с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции. Данная экспрессионная кассета может находиться в виде экспрессионного вектора, способного к автономной репликации. Полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина сам по себе и связан функциональным образом с последовательностью, требующейся для экспрессии в клетке-хозяине, но не ограничиваясь ей.In the present disclosure, the term "transformation" means that a vector containing a polynucleotide encoding a target polypeptide is introduced into a host cell or microorganism such that the polypeptide encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell. The transformed polynucleotide may be localized by insertion into the chromosome of the host cell, or localized off the chromosome, so long as it can be expressed in the host cell. This polynucleotide contains DNA and/or RNA encoding the polypeptide of interest. This polynucleotide can be inserted in any form, provided that it can be introduced into the host cell and can be expressed. For example, a given polynucleotide can be introduced into a host cell as an expression cassette, which is a genetic construct containing all the elements required for autonomous expression. This expression cassette typically may contain a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal. This expression cassette may be in the form of an expression vector capable of autonomous replication. A polynucleotide can be introduced into a host cell by itself and is operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited to.
В приведенном выше термин «связанный функциональным образом» означает то, что последовательность полинуклеотида функционально связана с последовательностью промотора, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего интересующий вариант по настоящему раскрытию.As used above, "operably linked" means that a polynucleotide sequence is operably linked to a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding a variant of interest according to the present disclosure.
Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение штамма Escherichia coli, который содержит вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию.Yet another aspect of the present disclosure is to provide a strain of Escherichia coli that contains a variant of the present disclosure or a polynucleotide of the present disclosure.
Штамм по настоящему раскрытию может содержать модифицированный полипептид по настоящему раскрытию, полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, или вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему раскрытию.The strain of the present disclosure may contain a modified polypeptide of the present disclosure, a polynucleotide encoding the polypeptide, or a vector containing the polynucleotide of the present disclosure.
В настоящем раскрытии «штамм (или микроорганизм)» включает все микроорганизмы дикого типа или естественно или искусственно генетически модифицированные микроорганизмы, и он может представлять собой микроорганизм, в котором ослаблен или усилен специфический механизм из-за вставки внешнего гена или усиления активности, или инактивации эндогенного гена, и он может представлять собой микроорганизм, содержащий генетическую модификацию для продуцирования интересующего полипептида, белка или продукта.In the present disclosure, a "strain (or microorganism)" includes all wild type or naturally or artificially genetically modified microorganism, and may be a microorganism in which a specific mechanism is weakened or enhanced due to the insertion of an external gene or an increase in activity, or inactivation of an endogenous a gene, and it may be a microorganism containing a genetic modification to produce a polypeptide, protein or product of interest.
Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой штамм, содержащий любой один или более чем один вариант по настоящему раскрытию, полинуклеотид по настоящему раскрытию или вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему раскрытию; штамм, модифицированный для экспрессии варианта по настоящему раскрытию или полинуклеотида по настоящему раскрытию; штамм (например, рекомбинантный штамм), экспрессирующий вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию; или штамм (например, рекомбинантный штамм), демонстрирующий активность варианта по настоящему раскрытию, но не ограничивается ими.The strain of the present disclosure may be a strain containing any one or more variants of the present disclosure, a polynucleotide of the present disclosure, or a vector containing a polynucleotide of the present disclosure; a strain modified to express a variant of the present disclosure or a polynucleotide of the present disclosure; a strain (eg, a recombinant strain) expressing a variant of the present disclosure or a polynucleotide of the present disclosure; or a strain (eg, a recombinant strain) that exhibits, but is not limited to, activity of the variant of the present disclosure.
Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой штамм, имеющий способность к продуцированию L-триптофана.The strain of the present disclosure may be a strain having the ability to produce L-tryptophan.
Штамм по настоящему раскрытию может представлять собой микроорганизм, имеющий в природе белок семейства танспортера цианата или способность к продуцированию L-триптофана, или микроорганизм, в котором вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид, кодирующий данный вариант (или вектор, содержащий данный полинуклеотид), вводят в родительский штамм, который не имеет белка семейства танспортера цианата или способности к продуцированию L-триптофана, и/или в котором способность к продуцированию L-триптофана придается родительскому штамму, но не ограничивается им.The strain of the present disclosure may be a microorganism having a naturally occurring cyanate transporter family protein or the ability to produce L-tryptophan, or a microorganism in which a variant of the present disclosure or a polynucleotide encoding the variant (or a vector containing the polynucleotide) is introduced into a parent strain that lacks the cyanate transporter family protein or L-tryptophan producing ability, and/or in which L-tryptophan producing ability is conferred to, but not limited to, the parent strain.
Например, штамм по настоящему раскрытию представляет собой клетку или микроорганизм, который трансформирован вектором, содержащим полинуклеотид по настоящему раскрытию, или полинуклеотидом, кодирующим вариант по настоящему раскрытию, и экспрессирует вариант по настоящему раскрытию. В целях настоящего раскрытия штамм по настоящему раскрытию может включать все микроорганизмы, которые содержат вариант по настоящему раскрытию и могут продуцировать L-триптофан. Например, штамм по настоящему раскрытию может представлять собой рекомбинантный штамм, в котором полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему раскрытию, вводят в природный микроорганизм дикого типа или микроорганизм, продуцирующий L-триптофан, для того, чтобы, таким образом, экспрессировать вариант белка семейства танспортера цианата и иметь повышенную способность к продуцированию L-триптофана. Рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию L-аминокислоты, может представлять собой микроорганизм, имеющий повышенную способность к продуцированию L-триптофана по сравнению с природным микроорганизмом дикого типа или микроорганизмом, не модифицированным белком семейства танспортера цианата (а именно: микроорганизмом, экспрессирующим белок семейства танспортера цианата дикого типа (SEQ ID NO: 3), или микроорганизмом, который не экспрессирует модифицированный белок (SEQ ID NO: 1), но не ограничивается им. Например, штамм по настоящему раскрытию, имеющий повышенную способность к продуцированию L-триптофана, может представлять собой микроорганизм, имеющий повышенную способность к продуцированию L-триптофана по сравнению с Escherichia coli, которая содержит полипептид SEQ ID NO: 3 или полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, но не ограничивается им. В качестве примера, микроорганизм, не модифицированный белком семейства танспортера цианата, который представляет собой целевой штамм для сравнения увеличения способности к продуцированию L-триптофана, может представлять собой штамм CJ600 (KCCM10812P, KR 10-0792095), но не ограничивается им.For example, the strain of the present disclosure is a cell or microorganism that has been transformed with a vector containing a polynucleotide of the present disclosure or a polynucleotide encoding a variant of the present disclosure and expresses the variant of the present disclosure. For the purposes of this disclosure, the strain of the present disclosure may include all microorganisms that contain a variant of the present disclosure and can produce L-tryptophan. For example, the strain of the present disclosure may be a recombinant strain in which a polynucleotide encoding a variant of the present disclosure is introduced into a natural wild-type microorganism or an L-tryptophan producing microorganism, in order to thereby express a variant cyanate transporter family protein. and have an increased ability to produce L-tryptophan. The recombinant strain having an increased ability to produce L-amino acid may be a microorganism having an increased ability to produce L-tryptophan compared to a natural wild-type microorganism or a microorganism not modified with a protein of the cyanate transporter family (namely, a microorganism expressing a protein of the family a wild-type cyanate transporter (SEQ ID NO: 3), or a microorganism that does not express the modified protein (SEQ ID NO: 1), but is not limited to. is a microorganism having an increased ability to produce L-tryptophan compared to Escherichia coli which contains, but is not limited to, a polypeptide of SEQ ID NO: 3 or a polynucleotide encoding this polypeptide. , which is a target strain for comparison of increasing L-tryptophan producing ability, may be, but is not limited to, CJ600 strain (KCCM10812P, KR 10-0792095).
Например, рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию, может иметь способность к продуцированию L-триптофана, повышенную примерно на 1% или более, примерно на 2,5% или более, примерно на 5% или больше, примерно на 7% или больше, примерно на 10% или более, примерно на 12% или больше, примерно на 15% или больше, примерно на 17% или более, примерно на 19% или более, примерно на 20% или более, примерно на 21% или более, примерно на 22% или более, примерно на 23% или более, примерно на 24% или более, примерно на 24,5% или более, или примерно на 24,6% или более (верхняя граница конкретно не ограничивается и может составлять, например, примерно 200% или менее, примерно 150% или менее, примерно 100% или менее, примерно 50% или менее, примерно 45% или менее, примерно 40% или менее, примерно 35% или менее, примерно 30% или менее, примерно 27% или меньше, или примерно 25% или менее) по сравнению со способностью к продуцированию L-триптофана родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом, но повышенное значение не ограничивается им, при условии, что способность к продуцированию имеет повышенное значение плюс значения по сравнению со способностью к продуцированию родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом. В другом примере рекомбинантный штамм, имеющий повышенную способность к продуцированию, может иметь способность к продуцированию L-триптофана, увеличенную примерно в 1,01 раза или более, примерно в 1,02 раза или более, примерно в 1,05 раза или более, примерно в 1,07 раза или более, примерно в 1,1 раза или более, примерно в 1,12 раза или более, примерно в 1,15 раза или более, примерно в 1,17 раза или более, примерно в 1,19 раза или более, примерно в 1,2 раза или более, примерно в 1,21 раза или более, примерно в 1,22 раза или более, примерно в 1,23 раза или более, примерно в 1,24 раза или более, или примерно в 1,25 раза или больше (верхняя граница конкретно не ограничивается и может, например, быть примерно в 10 раз или менее, примерно в 5 раз или менее, примерно в 3 раза или менее, примерно в 2 раза или менее, или примерно в 1,5 раза или менее, или примерно в 1,3 раза или менее) по сравнению со способностью к продуцированию L-триптофана родительского штамма перед изменением или с немодифицированным микроорганизмом, но данный показатель увеличения не ограничивается ими. Термин «примерно» представляет собой интервал, включающий все из плюс/минус 0,5; плюс/минус 0,4; плюс/минус 0,3; плюс/минус 0,2; плюс/минус 0,1 и тому подобных, и включает все значения в интервале, равные или аналогичные значению после термина «примерно», но не ограничивается ими.For example, a recombinant strain having an increased production capacity may have an L-tryptophan production capacity increased by about 1% or more, about 2.5% or more, about 5% or more, about 7% or more , about 10% or more, about 12% or more, about 15% or more, about 17% or more, about 19% or more, about 20% or more, about 21% or more, about 22% or more, about 23% or more, about 24% or more, about 24.5% or more, or about 24.6% or more (the upper limit is not specifically limited and may be, for example, , about 200% or less, about 150% or less, about 100% or less, about 50% or less, about 45% or less, about 40% or less, about 35% or less, about 30% or less, about 27% or less, or about 25% or less) compared with the L-tryptophan producing ability of the parent strain before the modification or with the non-modified microorganism, but the increased value is not limited thereto, provided that the production ability has an increased value plus the values by compared with the ability to produce the parent strain before the change or with the unmodified microorganism. In another example, a recombinant strain having an increased production capacity may have an L-tryptophan production capacity increased by about 1.01 times or more, about 1.02 times or more, about 1.05 times or more, about 1.07 times or more, about 1.1 times or more, about 1.12 times or more, about 1.15 times or more, about 1.17 times or more, about 1.19 times or more, about 1.2 times or more, about 1.21 times or more, about 1.22 times or more, about 1.23 times or more, about 1.24 times or more, or about 1.25 times or more (the upper limit is not particularly limited, and may, for example, be about 10 times or less, about 5 times or less, about 3 times or less, about 2 times or less, or about 1.5 times or less, or about 1.3 times or less) compared with the L-tryptophan producing ability of the parental strain before the modification or with the non-modified microorganism, but this increase is not limited to them. The term "about" is an interval including all of plus/minus 0.5; plus/minus 0.4; plus/minus 0.3; plus/minus 0.2; plus/minus 0.1 and the like, and includes all values in the range equal to or similar to the value after the term "about", but is not limited to them.
В настоящем раскрытии «немодифицированный микроорганизм» не исключает штаммы, содержащие мутацию, которая может случаться у микроорганизмов в природе, и может представлять собой штамм дикого типа или сам природный штамм, или может представлять собой штамм перед изменением признака посредством генетической вариации из-за природных или искусственных факторов. Например, данный немодифицированный микроорганизм может представлять собой штамм, в который не вводится или еще не был введен вариант белка семейства танспортера цианата, описанный в настоящем описании изобретения. Термин «немодифицированный микроорганизм» можно использовать взаимозаменяемо с фразами «штамм перед модификацией», «микроорганизм перед модификацией», «неизмененный штамм», «немодифицированный штамм», «неизмененный микроорганизм» или «эталонный микроорганизм».In the present disclosure, "non-modified microorganism" does not exclude strains containing a mutation that may occur in microorganisms in nature, and may be a wild-type strain or a natural strain itself, or may be a strain before a trait is changed through genetic variation due to natural or artificial factors. For example, the unmodified microorganism may be a strain that has not or has not yet been introduced the cyanate transporter family protein variant described herein. The term "unmodified microorganism" can be used interchangeably with the phrases "pre-modification strain", "pre-modification microorganism", "unchanged strain", "unmodified strain", "unchanged microorganism", or "reference microorganism".
В другом примере настоящего раскрытия микроорганизм по настоящему раскрытию может представлять собой Escherichia coli.In another example of the present disclosure, the microorganism of the present disclosure may be Escherichia coli.
В настоящем раскрытии «ослабление» активности полипептида включает оба случая, где активность снижена по сравнению с эндогенной активностью или отсутствует. Термин «ослабление» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как инактивация, недостаточность, понижающая регуляция, снижение, уменьшение и аттенюация.In the present disclosure, "weakening" of the activity of the polypeptide includes both cases where the activity is reduced compared to endogenous activity or absent. The term "attenuation" can be used interchangeably with terms such as inactivation, insufficiency, down regulation, reduction, reduction and attenuation.
Ослабление также может включать случай, когда активность самого полипептида снижена или устранена по сравнению с активностью полипептида, которой исходно обладал микроорганизм, посредством изменения полинуклеотида, кодирующего данный полипептид, и тому подобного, случай, где общие уровень активности и/или концентрация (уровень экспрессии) полипептида в клетке ниже по сравнению с уровнем активности или концентрацией природного штамма посредством ингибирования экспрессии гена полинуклеотида, кодирующего полипептид, или ингибирования трансляции в полипептид, случай, где данный полинуклеотид совсем не экспрессируется, и/или случай, где активность полипептида не проявляется даже при экспрессии полинуклеотида. Термин «эндогенная активность» означает активность конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака, или микроорганизм дикого типа, или немодифицированный микроорганизм при изменении признака генетической вариацией из-за природных или искусственных факторов. Фразу «эндогенная активность» можно использовать взаимозаменяемо с фразой «активность перед модификацией». Тот факт, что активность полипептида является «инактивированной, недостаточной, пониженной, подвергнувшейся понижающей регуляции, сниженной или ослабленной» по сравнению с эндогенной активностью означает то, что активность полипептида снижается по сравнению с активностью конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака или микроорганизм дикого типа, или немодифицированный микроорганизм.Attenuation may also include the case where the activity of the polypeptide itself is reduced or eliminated compared to the activity of the polypeptide that the microorganism originally had, by changing the polynucleotide encoding the polypeptide, and the like, the case where the overall level of activity and/or concentration (expression level) of the polypeptide in the cell is lower than the level of activity or concentration of the natural strain by inhibiting the expression of the gene of the polynucleotide encoding the polypeptide or inhibiting translation into the polypeptide, the case where the polynucleotide is not expressed at all, and/or the case where the activity of the polypeptide is not shown even when expressed polynucleotide. The term "endogenous activity" means the activity of a particular polypeptide, which was originally possessed by the parental strain before changing the trait, or a wild-type microorganism, or an unmodified microorganism when the trait is changed by genetic variation due to natural or artificial factors. The phrase "endogenous activity" can be used interchangeably with the phrase "activity before modification". The fact that the activity of a polypeptide is "inactivated, deficient, reduced, down-regulated, reduced or attenuated" compared to endogenous activity means that the activity of the polypeptide is reduced compared to the activity of the particular polypeptide that the parent strain originally had before the trait change or a wild-type microorganism, or an unmodified microorganism.
Такое ослабление активности полипептида можно осуществлять любым способом, известным в данной области, но данный способ не ограничивается им, и ослабления можно достигнуть применением разных способов, хорошо известных в данной области (например, Nakashima N. et at, Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014; 15(2): 2773-2793, Sambrook et at, Molecular Cloning 2012, и тому подобные).Such weakening of the activity of the polypeptide can be carried out by any method known in this field, but this method is not limited to them, and weakening can be achieved using various methods well known in this field (for example, Nakashima N. et at, Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing Int J Mol Sci 2014; 15(2): 2773-2793, Sambrook et at, Molecular Cloning 2012, et al.).
В частности, ослабление активности полипептида в настоящем раскрытии может представлять собой:In particular, the weakening of the activity of the polypeptide in the present disclosure may be:
1) делецию всего или части гена, кодирующего полипептид;1) deletion of all or part of the gene encoding the polypeptide;
2) модификацию регуляторной области экспрессии (или регуляторной последовательности экспрессии) для уменьшения экспрессии гена, кодирующего полипептид;2) modification of the regulatory region of expression (or regulatory sequence of expression) to reduce the expression of the gene encoding the polypeptide;
3) модификацию аминокислотной последовательности, составляющей полипептид, для устранения или ослабления активности полипептида (например, делеция/замена/присоединение одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотной последовательности);3) modifying the amino acid sequence constituting the polypeptide to eliminate or reduce the activity of the polypeptide (eg, deletion/substitution/addition of one or more amino acids in the amino acid sequence);
4) модификацию последовательности гена, кодирующей полипептид, для устранения или ослабления активности данного полипептида (например, делеция/замена/присоединение одного или более чем одного основания нуклеиновой кислоты в последовательности оснований нуклеиновой кислоты гена полипептида для кодирования полипептида, который был модифицирован для устранения или ослабления активности данного полипептида);4) modification of a gene sequence encoding a polypeptide to eliminate or reduce the activity of a given polypeptide (for example, deletion/substitution/addition of one or more nucleic acid bases in the nucleic acid base sequence of a polypeptide gene to encode a polypeptide that has been modified to eliminate or weaken activity of the given polypeptide);
5) модификацию инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR (5'-нетранслируемая область) область;5) modification of the initiating codon of the transcript of the gene encoding the polypeptide, or the base sequence encoding the 5'-UTR (5'-untranslated region) region;
6) введение антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид;6) introducing an antisense oligonucleotide (eg, antisense RNA) that binds complementarily to the transcript of the gene encoding the polypeptide;
7) добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, перед последовательностью Шайна-Дальгарно гена, кодирующего полипептид, для того, чтобы образовать вторичную структуру, к которой не может присоединяться рибосома;7) adding a sequence complementary to the Shine-Dalgarno sequence before the Shine-Dalgarno sequence of the gene encoding the polypeptide in order to form a secondary structure to which the ribosome cannot attach;
8) добавление промотора, подлежащего транскрипции в противоположном направлении относительно 3'-конца открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид (инженерия обратной транскрипции, RTE); или8) adding a promoter to be transcribed in the opposite direction to the 3' end of the open reading frame (ORF) of the gene sequence encoding the polypeptide (reverse transcription engineering, RTE); or
9) комбинацию двух или более чем двух, выбранных из (1) - (8), но, в частности, не ограничивается ими.9) a combination of two or more than two selected from (1) to (8), but is not particularly limited to them.
Например:For example:
1) Делецией части или всего гена, кодирующего полипептид, может быть удаление всего полинуклеотида, кодирующего интересующий эндогенный полипептид в хромосоме, или замена полинуклеотидом, в котором некоторые нуклеотиды делетированы, или замена маркерным геном.1) The deletion of part or all of the gene encoding the polypeptide may be the removal of the entire polynucleotide encoding the endogenous polypeptide of interest on the chromosome, or replacement with a polynucleotide in which some nucleotides are deleted, or replacement with a marker gene.
2) Модификацией регуляторной области экспрессии (или регуляторной последовательности экспрессии) может быть делеция, вставка, неконсервативная или консервативная замена, или появление изменения в регуляторной области экспрессии (или регуляторной последовательности экспрессии) из-за их комбинации, или замена последовательностью, демонстрирующей более слабую активность. Регуляторная область экспрессии содержит промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции, но не ограничивается ими.2) Modification of the expression regulatory region (or expression regulatory sequence) may be a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or the appearance of a change in the expression regulatory region (or expression regulatory sequence) due to their combination, or replacement by a sequence showing weaker activity . The expression regulatory region contains, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence regulating transcription and translation termination.
5) Модификацией инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область, может быть, например, замена последовательностью оснований, кодирующей другой инициирующий кодон, имеющий меньшую скорость экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но не ограничивается ей.5) Modification of the start codon of the transcript of the gene encoding the polypeptide, or the base sequence encoding the 5'-UTR region, may be, for example, replacing the base sequence encoding a different start codon having a lower expression rate of the polypeptide compared to the endogenous start codon, but not limited to her.
3) и 4) Модификацией аминокислотной последовательности или последовательности полинуклеотида может быть делеция, вставка или неконсервативная, или консервативная замена аминокислотной последовательности полипептида или последовательности полинуклеотида, кодирующей данный полипептид, или появление изменения в последовательности из-за их комбинации, или замена аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной так, чтобы демонстрировать более слабую активность, или аминокислотной последовательностью, или последовательностью полинуклеотида, модифицированной так, чтобы быть неактивной, таким образом, что активность данного полипептида ослабевает, но не ограничивается ими. Например, экспрессию гена можно ингибировать или ослаблять посредством введения изменения в последовательность полинуклеотида и образования терминирующего кодона, но модификация не ограничивается ей.3) and 4) A modification of the amino acid sequence or sequence of a polynucleotide can be a deletion, insertion, or a non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of a polypeptide or a polynucleotide sequence encoding the polypeptide, or the appearance of a change in sequence due to their combination, or a substitution by an amino acid sequence or sequence a polynucleotide modified to exhibit weaker activity, or an amino acid sequence, or a polynucleotide sequence modified to be inactive such that the activity of the polypeptide is reduced, but is not limited to. For example, gene expression can be inhibited or attenuated by introducing a change in the sequence of a polynucleotide and the formation of a stop codon, but the modification is not limited thereto.
6) Для введения антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид, можно сделать ссылку на документы, например, Weintraub, Н. et al, Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews-Trends in Genetics, Vol.1(1) 1986.6) To introduce an antisense oligonucleotide (eg, antisense RNA) that binds complementarily to the transcript of the gene encoding the polypeptide, reference can be made to documents such as Weintraub, H. et al, Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986.
7) Добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, перед последовательностью Шайна-Дальгарно, гена, кодирующего полипептид, для того, чтобы образовать вторичную структуру, к которой не может присоединиться рибосома, может осуществляться для того, чтобы сделать невозможной трансляцию мРНК или для замедления скорости трансляции мРНК.7) The addition of a sequence complementary to the Shine-Dalgarno sequence before the Shine-Dalgarno sequence of the gene encoding the polypeptide, in order to form a secondary structure to which the ribosome cannot attach, can be done to prevent mRNA translation or to slow down mRNA translation rate.
8) Добавление промотора, подлежащего транскрипции в противоположном направлении относительно 3'-конца открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид (инженерия обратной транскрипции, RTE), может служить для ослабления активности посредством получения антисмыслового нуклеотида, комплементарного транскрипту гена, кодирующего полипептид.8) The addition of a promoter to be transcribed in the opposite direction to the 3' end of the open reading frame (ORF) of the sequence of the gene encoding the polypeptide (reverse transcription engineering, RTE) can serve to attenuate the activity by obtaining an antisense nucleotide complementary to the transcript of the gene encoding the polypeptide .
В настоящем раскрытии термин «усиление» активности полипептида означает то, что активность полипептида увеличивается по сравнению с эндогенной активностью. Термин «усиление» можно использовать взаимозаменяемо с такими терминами, как активация, повышающая регуляция, сверхэкспрессия и увеличение. Здесь активация, усиление, повышающая регуляция, сверхэкспрессия и увеличение могут включать как демонстрирование активности, которой исходно не обладали, так и демонстрирование улучшенной активности по сравнению с эндогенной активностью или активностью перед модификацией. Термин «эндогенная активность» означает активность конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака или немодифицированный микроорганизм при изменении признака посредством генетической вариации из-за природных или искусственных факторов. Это можно использовать взаимозаменяемо с «активностью перед модификацией». Тот факт, что активность полипептида «усиливается», «подвергается повышающей регуляции», «сверхэкспрессируется» или «увеличивается» по сравнению с эндогенной активностью означает то, что активность полипептида улучшается по сравнению с активностью и/или концентрацией (уровнем экспрессии) конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм перед изменением признака или немодифицированный микроорганизм.In the present disclosure, the term "enhancement" of the activity of the polypeptide means that the activity of the polypeptide is increased compared to endogenous activity. The term "enhancement" can be used interchangeably with terms such as activation, upregulation, overexpression and increase. Here, activation, amplification, upregulation, overexpression, and increase can include both showing activity that was not originally present, and showing improved activity compared to endogenous activity or activity before modification. The term "endogenous activity" means the activity of a particular polypeptide, which was originally possessed by the parental strain before changing the trait or an unmodified microorganism when the trait is changed through genetic variation due to natural or artificial factors. This can be used interchangeably with "activity before modification". The fact that the activity of a polypeptide is "upregulated", "upregulated", "overexpressed" or "increased" compared to endogenous activity means that the activity of the polypeptide is improved relative to the activity and/or concentration (expression level) of a particular polypeptide, which the parent strain originally possessed before the trait change or unmodified microorganism.
Данное усиление может быть достигнуто посредством введения чужеродного полипептида или увеличения эндогенной активности и/или концентрации (уровня экспрессии) данного полипептида. Усиление активности полипептида может быть подтверждено увеличением степени активности и уровня экспрессии полипептида или количества продукта, продуцируемого из данного полипептида.This enhancement can be achieved by introducing a foreign polypeptide or by increasing the endogenous activity and/or concentration (expression level) of the polypeptide. An increase in the activity of a polypeptide can be evidenced by an increase in the degree of activity and level of expression of the polypeptide or the amount of product produced from the polypeptide.
Для усиления активности полипептида можно применять разные способы, хорошо известные в данной области, и данный способ не ограничивается, при условии, что активность интересующего полипептида может быть усилена по сравнению с активностью микроорганизма до модификации. В частности, можно использовать генную инженерию и/или белковую инженерию, хорошо известные специалистам в данной области, которые представляют собой традиционные способы молекулярной биологии, но данный способ не ограничивается ими (например, Sitnicka et al, Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol.2. 1-16; Sambrook et at, Molecular Cloning 2012; и тому подобные).Various methods well known in the art can be used to enhance the activity of a polypeptide, and this method is not limited, provided that the activity of the polypeptide of interest can be enhanced relative to the activity of the microorganism before the modification. In particular, genetic engineering and/or protein engineering well known to those skilled in the art can be used, which are traditional molecular biology techniques, but this technique is not limited to them (e.g., Sitnicka et al, Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology 2010, Vol. 2. 1-16; Sambrook et at, Molecular Cloning 2012; and the like).
В частности, усиление активности полипептида по настоящему раскрытию может представлять собой:In particular, enhancing the activity of a polypeptide of the present disclosure may be:
1) увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид;1) an increase in the number of intracellular copies of the polynucleotide encoding the polypeptide;
2) замену регуляторной области экспрессии гена на хромосоме, кодирующей полипептид, последовательностью, демонстрирующей сильную активность;2) replacing the gene expression regulatory region on the chromosome encoding the polypeptide with a sequence showing strong activity;
3) модификацию инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область;3) modification of the initiating codon of the transcript of the gene encoding the polypeptide, or the base sequence encoding the 5'-UTR region;
4) модификацию аминокислотной последовательности полипептида для увеличения активности данного полипептида;4) modification of the amino acid sequence of the polypeptide to increase the activity of this polypeptide;
5) модификацию последовательности полинуклеотида, кодирующей полипептид, для усиления активности данного полипептида (например, модификацию последовательности полинуклеотида гена полипептида для кодирования полипептида, который был модифицирован для усиления активности данного полипептида);5) modifying a polynucleotide sequence encoding a polypeptide to enhance the activity of that polypeptide (eg, modifying the polynucleotide sequence of a polypeptide gene to encode a polypeptide that has been modified to enhance the activity of that polypeptide);
6) введение чужеродного полипептида, демонстрирующего активность данного полипептида, или чужеродного полинуклеотида, кодирующего данный полипептид;6) introduction of a foreign polypeptide demonstrating the activity of this polypeptide, or a foreign polynucleotide encoding this polypeptide;
7) оптимизацию кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид;7) codon optimization of the polynucleotide encoding the polypeptide;
8) анализ третичной структуры полипептида для отбора и модификации или химической модификации экспонированного сайта; или8) analysis of the tertiary structure of the polypeptide to select and modify or chemically modify the exposed site; or
9) комбинацию двух или более чем двух, выбранных из (1) - (8), но конкретно не ограничиваясь ими.9) a combination of two or more than two selected from (1) - (8), but not specifically limited to them.
Более конкретно:More specific:
1) Увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид, может быть достигнуто посредством введения в клетку-хозяина вектора, который может реплицироваться и функционировать независимо от хозяина, и с которым полинуклеотид, кодирующий данный полипептид, связан функциональным образом. В качестве альтернативы, увеличение может быть достигнуто введением одной копии или двух или более чем двух копий полинуклеотида, кодирующего данный полипептид, в хромосому клетки-хозяина. Введение в хромосому можно осуществлять введением вектора, способного вставлять полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, в клетку-хозяина, но не ограничивается им. Данный вектор является таким, как описано выше.1) An increase in the intracellular copy number of a polynucleotide encoding a polypeptide can be achieved by introducing into the host cell a vector that can replicate and function independently of the host and to which the polynucleotide encoding the polypeptide is operably linked. Alternatively, the increase can be achieved by introducing one copy or two or more than two copies of the polynucleotide encoding the polypeptide into the chromosome of the host cell. The introduction into the chromosome can be carried out by the introduction of a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome of the host cell, into the host cell, but is not limited to. This vector is as described above.
2) Замена регуляторной области экспрессии гена (или регуляторной последовательности экспрессии) на хромосоме, кодирующей полипептид, последовательностью, демонстрирующей сильную активность, может представлять собой, например, делецию, вставку, неконсервативную или консервативную замену, или появление изменения в последовательности из-за их комбинации, или замену последовательностью, демонстрирующей более сильную активность, таким образом, что активность регуляторной области экспрессии дополнительно усиливается. Регуляторная область экспрессии конкретно не ограничивается ими, но может содержать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции, и тому подобные. Например, замена может представлять собой замену исходного промотора сильным промотором, но не ограничивается ей.2) Replacement of a gene expression regulatory region (or an expression regulatory sequence) on a chromosome encoding a polypeptide with a sequence exhibiting strong activity may be, for example, a deletion, an insertion, a non-conservative or conservative substitution, or the occurrence of a change in sequence due to a combination thereof , or replacement with a sequence showing stronger activity, such that the activity of the regulatory region of expression is further enhanced. The regulatory region of expression is not specifically limited thereto, but may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, a sequence regulating transcription and translation termination, and the like. For example, the replacement may be, but is not limited to, replacing the original promoter with a strong promoter.
Примеры известных сильных промоторов включают промоторы CJ1 - CJ7 (US 7662943 В2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор PR фага лямбда, промотор PL, промотор tet, промотор gapA, промотор SPL7, промотор SPL13 (sm3) (US 10584338 В2), промотор 02 (US 10273491 В2), промотор tkt и промотор уссА, но не ограничиваются ими.Examples of known strong promoters include CJ1 - CJ7 promoters (US 7662943 B2), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 promoter, SPL13 (sm3) promoter ( US 10584338 B2), promoter 02 (US 10273491 B2), tkt promoter and ucsA promoter, but are not limited to them.
3) Модификация инициирующего кодона транскрипта гена, кодирующего полипептид, или последовательности оснований, кодирующей 5'-UTR область, может представлять собой, например, замену последовательностью оснований, кодирующей другой инициирующий кодон, имеющий более высокую скорость экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но не ограничивается ей.3) Modification of the initiation codon of the transcript of the gene encoding the polypeptide, or the base sequence encoding the 5'-UTR region, may be, for example, a replacement with a base sequence encoding a different initiation codon having a higher expression rate of the polypeptide compared to the endogenous initiation codon, but not limited to it.
4) и 5) Модификация аминокислотной последовательности или последовательности полинуклеотида может представлять собой делецию, вставку, неконсервативную или консервативную замену аминокислотной последовательности полипептида или последовательности полинуклеотида, кодирующей данный полипептид, или появление изменения в данной последовательности из-за их комбинации или замены аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной для демонстрации более сильной активности, или аминокислотной последовательностью или последовательностью полинуклеотида, модифицированной для того, чтобы быть более активной, таким образом, что активность данного полипептида усиливается, но не ограничивается ими. Данную замену можно конкретно осуществлять посредством вставки полинуклеотида в хромосому гомологичной рекомбинацией, но не ограничивается ей. Используемый здесь вектор может дополнительно содержать селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Селективный маркер является таким, как описано выше.4) and 5) Modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence can be a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding this polypeptide, or the appearance of a change in this sequence due to their combination or replacement by an amino acid sequence or sequence a polynucleotide modified to exhibit stronger activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence modified to be more active such that the activity of the polypeptide is enhanced, but is not limited to. This replacement can be specifically carried out by inserting a polynucleotide into the chromosome by homologous recombination, but is not limited to it. Used here, the vector may additionally contain a selectable marker to confirm insertion into the chromosome. The selectable marker is as described above.
6) Введение чужеродного полипептида, демонстрирующего активность полипептида, может представлять собой введение в клетку-хозяина чужеродного полинуклеотида, кодирующего полипептид, демонстрирующий такую же или аналогичную данному полипептиду активность. Данный чужеродный полинуклеотид не ограничивается по его происхождению или последовательности при условии, что он демонстрирует такую же или аналогичную данному полипептиду активность. Введение можно осуществлять посредством подходящего выбора способа трансформации, известного специалистам в данной области. Поскольку введенный полинуклеотид экспрессируется в клетке-хозяине, может продуцироваться полипептид, и может увеличиваться его активность.6) The introduction of a foreign polypeptide showing the activity of the polypeptide may be the introduction into the host cell of a foreign polynucleotide encoding a polypeptide showing the same or similar activity to this polypeptide. This foreign polynucleotide is not limited in its origin or sequence, provided that it exhibits the same or similar activity to this polypeptide. The introduction can be carried out by a suitable choice of transformation method, known to experts in this field. Since the introduced polynucleotide is expressed in the host cell, the polypeptide can be produced and its activity can be increased.
7) Оптимизация кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид, может представлять собой оптимизацию кодонов эндогенного полинуклеотида таким образом, чтобы увеличивать транскрипцию или трансляцию в клетке-хозяине, или оптимизацию кодонов чужеродного полинуклеотида таким образом, чтобы осуществлять оптимизированную транскрипцию и трансляцию в клетке-хозяине.7) Codon optimization of a polynucleotide encoding a polypeptide can be codon optimization of an endogenous polynucleotide so as to increase transcription or translation in the host cell, or codon optimization of a foreign polynucleotide so as to achieve optimized transcription and translation in the host cell.
8) Анализ третичной структуры полипептида для выбора и модификации или химическая модификация экспонированного сайта могут осуществляться, например, для определения шаблонного белка-кандидата согласно степени сходства последовательности посредством сравнения информации по последовательности полипептида, подлежащего анализу, с хранилищем информации по последовательностям известных белков базы данных для подтверждения структуры на основе этого и для выбора и модификации или химической модификации экспонированной части, подлежащей модификации или химической модификации.8) Analyzing the tertiary structure of a polypeptide for selection and modification or chemically modifying an exposed site can be carried out, for example, to determine a template candidate protein according to the degree of sequence similarity by comparing the sequence information of the polypeptide to be analyzed with a repository of information on the sequences of known database proteins for confirming the structure based on this and for selecting and modifying or chemically modifying the exposed portion to be modified or chemically modified.
Такое усиление активности полипептида может представлять собой увеличение активности или концентрации, или уровня экспрессии соответствующего полипептида на основе активности или концентрации полипептида, экспрессируемого в микробном штамме дикого типа или в микробном штамме перед модификацией, или увеличение количества продукта, продуцируемого из полипептида, но не ограничивается ими.Such an increase in the activity of a polypeptide can be, but is not limited to, an increase in the activity or concentration or level of expression of the corresponding polypeptide based on the activity or concentration of the polypeptide expressed in the wild-type microbial strain or in the microbial strain before modification, or an increase in the amount of product produced from the polypeptide. .
В микроорганизме по настоящему раскрытию частичная или полная модификация полинуклеотида может индуцироваться (а) гомологичной рекомбинацией с использованием вектора для вставки в хромосому в микроорганизме или редактированием генома с использованием генетически модифицированной нуклеазы (например, CRISPR-Cas9), и/или (б) обработкой светом, таким как ультрафиолетовые лучи и излучение, и/или химическими агентами, но не ограничиваясь ими. Способ осуществления модификации части или всего гена может включать способ с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Например, посредством введения в микроорганизм нуклеотидной последовательности или вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, гомологичную интересующему гену, для вызова гомологичной рекомбинации можно удалить часть гена или весь данный ген. Введенная нуклеотидная последовательность или вектор может содержать доминантный селективный маркер, но не ограничиваясь им.In the microorganism of the present disclosure, partial or complete modification of a polynucleotide can be induced by (a) homologous recombination using a vector to insert into a chromosome in the microorganism, or by editing the genome using a genetically modified nuclease (e.g., CRISPR-Cas9), and/or (b) by light treatment such as ultraviolet rays and radiation, and/or chemical agents, but not limited to. The method for modifying part or all of a gene may include a method using recombinant DNA technology. For example, by introducing into the microorganism a nucleotide sequence or a vector containing a nucleotide sequence homologous to a gene of interest, part or all of the gene can be removed to induce homologous recombination. The introduced nucleotide sequence or vector may contain, but is not limited to, a dominant selectable marker.
В микроорганизме по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, L-триптофан и тому подобные являются такими, как описано в других аспектах.In the microorganism of the present disclosure, the variant, polynucleotide, L-tryptophan, and the like are as described in other aspects.
Согласно еще одному другому аспекту настоящего раскрытия предложен способ продуцирования L-аминокислоты, который включает культивирование в среде штамма Escherichia coli, содержащего вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию.According to yet another aspect of the present disclosure, a method for producing an L-amino acid is provided, which comprises culturing in a medium an Escherichia coli strain containing a variant of the present disclosure or a polynucleotide of the present disclosure.
Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может включать культивирование в среде штамма Escherichia coli, содержащего вариант по настоящему раскрытию или полинуклеотид по настоящему раскрытию, или вектор по настоящему раскрытию.The method for producing an L-amino acid of the present disclosure may include culturing in a medium an Escherichia coli strain containing a variant of the present disclosure or a polynucleotide of the present disclosure or a vector of the present disclosure.
Кроме того, L-аминокислота по настоящему раскрытию может представлять собой L-триптофан.In addition, the L-amino acid of the present disclosure may be L-tryptophan.
В настоящем раскрытии термин «культивирование» означает выращивание штамма Escherichia coli по настоящему раскрытию при условиях среды, контролируемых подходящим образом. Способ культивирования по настоящему раскрытию можно осуществлять в соответствии с подходящей средой и условиями культивирования, известными в данной области. Такой способ культивирования можно легко корректировать и использовать специалистами в данной области согласно выбранному штамму. В частности, культивирование может быть периодического типа, непрерывного типа и/или типа с подпиткой, но не ограничивается ими.In the present disclosure, the term "cultivation" means the cultivation of the Escherichia coli strain of the present disclosure under suitably controlled environmental conditions. The culturing method of the present disclosure can be carried out in accordance with a suitable medium and culturing conditions known in the art. Such a culture method can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain. In particular, the cultivation may be of batch type, continuous type, and/or fed-batch type, but is not limited to them.
В настоящем раскрытии термин «среда» означает смешанное вещество, содержащее питательные вещества, требующиеся для культивирования штамма Escherichia coli по настоящему раскрытию в качестве главного компонента, и данная среда поставляет питательные вещества, факторы роста и тому подобное, включая воду, которые являются незаменимыми для выживания и развития. В частности, в качестве среды и других условий культивирования, используемых для культивирования штамма Escherichia coli по настоящему раскрытию, можно использовать любые без конкретного ограничения, при условии, что она представляет собой среду, используемую для обычного культивирования микроорганизмов. Штамм Escherichia coli по настоящему раскрытию можно культивировать в обычной среде, содержащей правильные источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины, и тому подобное, при одновременном осуществлении контроля температуры, рН и тому подобного при аэробных условиях.In the present disclosure, the term "medium" means a mixed substance containing the nutrients required for cultivating the strain of Escherichia coli of the present disclosure as the main component, and this medium supplies nutrients, growth factors and the like, including water, which are indispensable for survival. and development. In particular, as the medium and other culture conditions used for culturing the Escherichia coli strain of the present disclosure, any without particular limitation can be used, as long as it is a medium used for conventional cultivation of microorganisms. The Escherichia coli strain of the present disclosure can be cultivated in a conventional medium containing proper carbon sources, nitrogen sources, phosphorus sources, inorganic compounds, amino acids and/or vitamins, and the like, while controlling temperature, pH, and the like under aerobic conditions.
В частности, культуральную среду для штамма Escherichia coli можно найти в документе "Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington, D.C., USA, 1981).In particular, a culture medium for a strain of Escherichia coli can be found in "Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington, D.C., USA, 1981).
В настоящем раскрытии источники углерода включают углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, сахароза и мальтоза; сахароспирты, такие как маннит и сорбит; органические кислоты, такие как пировиноградная кислота, молочная кислота и лимонная кислота; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и лизин; и тому подобное. Можно использовать природные органические питательные вещества, такие как гидролизат крахмала, мелассу, сырую мелассу, рисовые отруби, маниок, остаток сахарного тростника и жидкий кукурузный экстракт. В частности, можно использовать углеводы, такие как глюкоза и стерилизованные предобработанные мелассы (а именно: мелассы, превращенные в восстанавливающий сахар), и можно использовать подходящие количества других источников углерода разными способами без ограничения. Данные источники углерода можно использовать одиночно или в комбинации с двумя или более чем двумя, но не ограничиваясь ими.In the present disclosure, carbon sources include carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, sucrose, and maltose; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid and citric acid; amino acids such as glutamic acid, methionine and lysine; etc. Natural organic nutrients such as hydrolysed starch, molasses, raw molasses, rice bran, cassava, sugar cane residue and liquid corn extract can be used. In particular, carbohydrates such as glucose and sterilized pre-treated molasses (namely, molasses converted to reducing sugar) can be used, and suitable amounts of other carbon sources can be used in a variety of ways without limitation. These carbon sources can be used alone or in combination with, but not limited to, two or more.
В качестве источников азота можно использовать неорганические источники азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония; и органические источники азота, такие как аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и глутамин, пептон, NZ-амин, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, гидролизат казеина, рыба или продукты ее разложения и обезжиренный соевый жмых или продукты его разложения. Данные источники азота можно использовать одиночно или в комбинации двух или более чем двух, но не ограничиваясь ими.As nitrogen sources, inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used; and organic nitrogen sources such as amino acids such as glutamic acid, methionine and glutamine, peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, liquid corn extract, casein hydrolysate, fish or its decomposition products and defatted soybean meal or its decomposition products. These nitrogen sources can be used alone or in combination of two or more, but not limited to.
Источники фосфора могут включать монокалия фосфат, дикалия фосфат или соответствующие им натрийсодержащие соли. В качестве неорганических соединений можно использовать хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и тому подобное. Помимо них могут содержаться аминокислоты, витамины и/или подходящие предшественники, и тому подобное. Данные компоненты или предшественники можно добавлять в среду порционно или непрерывно, но способ добавления не ограничивается ими.Phosphorus sources may include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, or their respective sodium salts. As inorganic compounds, sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate and the like can be used. In addition, amino acids, vitamins and/or suitable precursors and the like may be contained. These components or precursors can be added to the medium in batches or continuously, but the method of addition is not limited to them.
Во время культивирования штамма Escherichia coli по настоящему раскрытию рН среды можно корректировать добавлением в данную среду правильным способом таких соединений, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Во время культивирования пенообразование можно подавлять посредством применения пеногасителя, такого как сложный полигликоле вый эфир жирной кислоты. В среду можно инъецировать кислород или кислородсодержащий газ для поддержания аэробного состояния данной среды, или газ можно не инъецировать, или можно инъецировать газообразный азот, водород или диоксид углерода для того, чтобы поддерживать анаэробное и микроаэробное состояния, но способ поддержания данного состояния не ограничивается ими.During cultivation of the Escherichia coli strain of the present disclosure, the pH of the medium can be adjusted by adding compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, and sulfuric acid to the medium in the correct manner. During cultivation, foaming can be suppressed by the use of a defoamer such as a polyglycol fatty acid ester. Oxygen or an oxygen-containing gas may be injected into the environment to maintain the aerobic state of the environment, or the gas may not be injected, or nitrogen, hydrogen, or carbon dioxide gas may be injected in order to maintain the anaerobic and microaerobic conditions, but the method of maintaining this state is not limited to them.
При культивировании по настоящему раскрытию можно поддерживать температуру культивирования от 20°С до 45°С, в частности, от 25°С до 40°С, и данный штамм можно культивировать в течение примерно от 10 до 160 часов, но условия культивирования не ограничиваются ими.When cultivating according to the present disclosure, it is possible to maintain the culturing temperature from 20°C to 45°C, in particular, from 25°C to 40°C, and this strain can be cultivated for about 10 to 160 hours, but the culturing conditions are not limited to them. .
L-аминокислота, продуцируемая посредством культивирования по настоящему раскрытию, может секретироваться в среду или может оставаться в клетках.The L-amino acid produced by the cultivation of the present disclosure may be secreted into the medium or may remain in the cells.
Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию получения штамма Escherichia coli по настоящему раскрытию, стадию приготовления среды для культивирования данного штамма или их комбинацию (в любом порядке), например, перед стадией культивирования.The method for producing an L-amino acid according to the present disclosure may further include the step of obtaining the Escherichia coli strain of the present disclosure, the step of preparing a culture medium for the strain, or a combination thereof (in any order), for example, before the cultivation step.
Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию выделения L-аминокислоты из среды в соответствии с культивированием (среда, подвергнувшаяся воздействию культуры) или из штамма Escherichia coli. После стадии культивирования может быть дополнительно включена стадия выделения.The method for producing an L-amino acid of the present disclosure may further include the step of isolating the L-amino acid from a medium according to cultivation (media exposed to culture) or from a strain of Escherichia coli. After the culture step, an isolation step may be further included.
Выделение может служить для сбора интересующей L-аминокислоты посредством подходящего способа, известного в данной области, согласно способу культивирования микроорганизма по настоящему раскрытию, например, способу периодического, непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. Например, можно использовать центрифугирование, фильтрование, обработку осадителем кристаллизованного белка (высаливание), экстракцию, ультразвуковое разрушение, ультрафильтрацию, диализ, разные виды хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография и аффинная хроматография, ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), или их комбинацию. Интересующую L-аминокислоту можно выделять из среды или микроорганизма посредством подходящего способа, известного в данной области.The isolation may serve to collect the L-amino acid of interest by a suitable method known in the art according to the microorganism culture method of the present disclosure, for example, a batch, continuous or fed-batch culture method. For example, centrifugation, filtration, precipitant treatment of the crystallized protein (salting out), extraction, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, various types of chromatography such as molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography can be used, HPLC (high performance liquid chromatography), or a combination of both. The L-amino acid of interest can be isolated from the medium or microorganism by a suitable method known in the art.
Способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию может дополнительно включать стадию очистки. Очистку можно осуществлять посредством подходящего способа, известного в данной области. В одном примере, когда способ продуцирования L-аминокислоты по настоящему раскрытию включает и стадию выделения, и стадию очистки, данные стадии выделения и очистки можно осуществлять непрерывно или прерывисто, независимо от порядка, или можно осуществлять одновременно, или посредством объединения в одну стадию, но способ осуществления данных стадий не ограничивается ими.The method for producing an L-amino acid according to the present disclosure may further include a purification step. Purification can be carried out by a suitable method known in this field. In one example, when the method for producing an L-amino acid of the present disclosure includes both a isolation step and a purification step, these isolation and purification steps may be performed continuously or discontinuously regardless of the order, or may be performed simultaneously, or by combining in one step, but the manner in which these steps are carried out is not limited thereto.
В способе по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, вектор, штамм и тому подобное являются такими, как описано в других аспектах.In the method of the present disclosure, the variant, polynucleotide, vector, strain, and the like are as described in other aspects.
Еще одним другим аспектом настоящего раскрытия является предложение композиции для продуцирования L-аминокислоты, которая содержит штамм Escherichia coli, содержащий вариант по настоящему раскрытию, полинуклеотид, кодирующий данный вариант, вектор, содержащий данный полинуклеотид, или полинуклеотид по настоящему раскрытию; среду, в которой культивировали данный штамм Escherichia coli; или комбинации двух или более чем двух из них.Yet another aspect of the present disclosure is to provide a composition for producing an L-amino acid, which comprises an Escherichia coli strain containing a variant of the present disclosure, a polynucleotide encoding the variant, a vector containing the polynucleotide, or a polynucleotide of the present disclosure; the medium in which the strain of Escherichia coli was cultured; or combinations of two or more than two of them.
Композиция по настоящему раскрытию может дополнительно содержать произвольные подходящие эксципиенты, подлежащие обычному применению в композициях для продуцирования L-аминокислот. Такие эксципиенты могут представлять собой, например, консервант, увлажнитель, диспергирующий агент, суспендирующий агент, буферизующий агент, стабилизатор или изотоничный агент, но не ограничиваются ими.The composition of the present disclosure may additionally contain any suitable excipients, subject to conventional use in compositions for the production of L-amino acids. Such excipients can be, for example, but not limited to a preservative, humectant, dispersing agent, suspending agent, buffering agent, stabilizer or isotonic agent.
В композиции по настоящему раскрытию вариант, полинуклеотид, вектор, штамм, среда, L-аминокислота и тому подобные являются такими, как описано в других аспектах.In the composition of the present disclosure, the variant, polynucleotide, vector, strain, medium, L-amino acid, and the like are as described in other aspects.
Способ осуществления изобретенияMethod for carrying out the invention
Ниже настоящее раскрытие будет более подробно описано посредством Примеров. Однако следующие Примеры являются лишь предпочтительными воплощениями для иллюстрации настоящего раскрытия и, таким образом, не предназначены для ограничения ими объема настоящего раскрытия. Тем не менее, технические вопросы, не описанные в настоящем описании изобретения, могут быть в достаточной степени поняты и легко воплощены специалистами в технической области настоящего раскрытия или в аналогичных технических областях.Below, the present disclosure will be described in more detail by way of Examples. However, the following Examples are merely preferred embodiments for illustrating the present disclosure, and thus are not intended to limit the scope of the present disclosure. However, technical issues not described in the present description of the invention can be sufficiently understood and easily implemented by experts in the technical field of the present disclosure or in similar technical fields.
Пример 1. Конструирование штамма, экспрессирующего вариант белка семейства транспортера цианатаExample 1 Construction of a strain expressing a protein variant of the cyanate transporter family
Для того чтобы сконструировать штамм Е. coli с фенотипом варианта cynX (D259N; SEQ ID NO: 1), получали каждый из фрагментов для расположенной выше области и расположенной ниже области варианта D259N cynX Е. coli посредством осуществления ПЦР (полимеразная цепная реакция) с использованием гДНК W3110 Е. coli в качестве матрицы, наряду с парой праймеров SEQ ID NO: 5 и 6, и парой праймеров SEQ ID NO: 7 и 8. В качестве полимеразы использовали ДНК-полимеразу Solg™ Pfu-X, и ПЦР-амплификацию проводили следующим образом: денатурация при 95°С в течение 2 минут; 27 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 55°С в течение 1 минуты, полимеризация при 72°С в течение 1 минуты и полимеризация при 72°С в течение 5 минут. Для индукции гомологичной рекомбинации на хромосоме рекомбинантную плазмиду получали клонированием каждой из амплифицированных расположенной выше области и расположенной ниже области варианта D259N cynX и плазмиды pSG76-C, которая представляет собой вектор для хромосомной трансформации, расщепленный рестрикционным ферментом Smal (Journal Of Bacteriology, July 1997, p. 4426-4428) с использованием Gibson Assembly, и называли pSG76-C-cynX(D259N). Клонирование осуществляли посредством смешивания реактива Gibson Assembly и каждого из фрагментов гена при расчетном числе моль, с последующим хранением при 50°С в течение одного часа. Штамм CJ600 (KR 10-0792095) трансформировали плазмидой pSG76-C-cynX(D259N), культивировали в среде LB-Cm (10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 10 г/л триптона, 25 мкг/л хлорамфеникола), и затем отбирали колонии с устойчивостью к хлорамфениколу. Подтверждали то, что отобранный трансформант представляет собой штамм, в котором плазмида pSG76-C-cynX(D259N) была вставлена в область гена cynX в хромосоме с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 9 и 10. Штамм, для которого было сначала подтверждено, что в него был вставлен вариант cynX(D259N), был трансформирован pST76-AsceP (Nucleic Acids Research, том 27, номер 22, 1 ноября 1999, страницы 4409 4415), и отбирали колонии, которые вырастали в твердой среде LB-Amp (10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 10 г/л триптона, 100 мкг/л ампициллина) при 30°С. Отобранные колонии собирали в твердую среду LB, LB-Amp и LB-Cm, соответственно, и культивировали при 42°С в течение 16 часов. Подтвердили то, что плазмида pST76-AsceP сохранялась в колониях, которые росли на твердой среде LB, но не росли на твердой среде LB-Amp, LB-Cm. Наконец, в колониях, где было подтверждено сохранение плазмиды pST76-AsceP, ген cynX амплифицировали с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 9 и 10, соответственно, и штамм, в котором ген cynX был заменен на cynX(D259N), был отобран посредством секвенирования. Сконструированный таким образом штамм назвали CJ600 cynX D259N.In order to construct an E. coli strain with the phenotype of the cynX variant (D259N; SEQ ID NO: 1), each of the fragments for the upstream region and the downstream region of the E. coli variant D259N cynX was obtained by performing PCR (polymerase chain reaction) using E. coli W3110 gDNA as template, along with primer pair SEQ ID NO: 5 and 6, and primer pair SEQ ID NO: 7 and 8. Solg™ Pfu-X DNA polymerase was used as polymerase and PCR amplification was performed as follows: denaturation at 95°C for 2 minutes; 27 denaturation cycles at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 1 minute, polymerization at 72°C for 1 minute and polymerization at 72°C for 5 minutes. To induce homologous recombination on a chromosome, a recombinant plasmid was prepared by cloning each of the amplified upstream and downstream regions of the D259N cynX variant and plasmid pSG76-C, which is a chromosomal transformation vector cleaved with the restriction enzyme Smal (Journal Of Bacteriology, July 1997, p 4426-4428) using Gibson Assembly and named pSG76-C-cynX(D259N). Cloning was performed by mixing the Gibson Assembly reagent and each of the gene fragments at the calculated number of mol, followed by storage at 50°C for one hour. The CJ600 strain (KR 10-0792095) was transformed with the plasmid pSG76-C-cynX(D259N), cultivated in LB-Cm medium (10 g/l yeast extract, 5 g/l NaCl, 10 g/l tryptone, 25 μg/l chloramphenicol ), and then selected colonies with resistance to chloramphenicol. The selected transformant was confirmed to be a strain in which the plasmid pSG76-C-cynX(D259N) was inserted into the region of the cynX gene in the chromosome using primer pair SEQ ID NOs: 9 and 10. The strain for which it was first confirmed that variant cynX(D259N) was inserted into it, pST76-AsceP was transformed (Nucleic Acids Research vol. 27, number 22, Nov. 1, 1999, pages 4409-4415), and colonies were selected that grew in LB-Amp solid medium (10 g /l yeast extract, 5 g/l NaCl, 10 g/l tryptone, 100 μg/l ampicillin) at 30°C. Selected colonies were collected in LB solid medium, LB-Amp and LB-Cm, respectively, and cultured at 42°C for 16 hours. It was confirmed that plasmid pST76-AsceP was maintained in colonies that grew on LB solid medium but did not grow on LB-Amp, LB-Cm solid medium. Finally, in colonies where the retention of plasmid pST76-AsceP was confirmed, the cynX gene was amplified using primer pair SEQ ID NO: 9 and 10, respectively, and the strain in which the cynX gene was changed to cynX(D259N) was selected by sequencing. . The strain thus constructed was named CJ600 cynX D259N.
Пример 2. Оценка способности к продуцированию L-триптофана микроорганизма, экспрессирующего вариант белка семейства транспортера цианатаExample 2 Evaluation of the L-Tryptophan Producing Ability of a Microorganism Expressing a Cyanate Transporter Family Protein Variant
Способности к продуцированию L-триптофана каждого из штаммов, полученных в Примере 1, и родительского штамма (контрольного штамма) анализировали посредством оценки титра ферментации данных штаммов в колбе.The ability to produce L-tryptophan of each of the strains obtained in Example 1 and the parent strain (control strain) was analyzed by evaluating the fermentation titer of these strains in the flask.
Колонии контрольного родительского штамма CJ600 и рекомбинантного штамма CJ600_cynX_D259N, полученные в Примере 1, культивировали в течение ночи в твердой среде LB с использованием инокуляционной петли. Каждый из выращенных штаммов инокулировали в 250 мл колбе с угловыми перегородками, содержащей 25 мл продукционной среды, и культивировали со встряхиванием при 37°С при 200 об./мин в течение 48 часов. После завершения культивирования способности к продуцированию L-триптофана данных колоний измеряли посредством ВЭЖХ.Colonies of the control parental strain CJ600 and the recombinant strain CJ600_cynX_D259N obtained in Example 1 were cultured overnight in solid LB medium using an inoculation loop. Each of the grown strains was inoculated into a 250 ml baffled flask containing 25 ml of production medium and cultured with shaking at 37° C. at 200 rpm for 48 hours. After completion of the cultivation, the L-tryptophan producing ability of these colonies was measured by HPLC.
Продукционная среда (рН 7,0)Production medium (pH 7.0)
60 г глюкозы, 2,5 г дрожжевого экстракта, 20 г сульфата аммония [(NH4)2SO4⋅7H2O], 1 г сульфата магния (MgSO4), 2 г дигидрофосфата калия (KH2PO4), 5 г цитрата натрия (Na-цитрат), 1 г хлорида натрия (NaCl), 0,1 г тирозина (L-тирозин), 0,15 г L-фенилаланина, 40 г карбоната кальция (СаСО3) (на основе 1 литра дистиллированной воды).60 g glucose, 2.5 g yeast extract, 20 g ammonium sulfate [(NH 4 ) 2 SO 4 ⋅7H 2 O], 1 g magnesium sulfate (MgSO 4 ), 2 g potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ), 5 g sodium citrate (Na-citrate), 1 g sodium chloride (NaCl), 0.1 g tyrosine (L-tyrosine), 0.15 g L-phenylalanine, 40 g calcium carbonate (CaCO 3 ) (based on 1 liter of distilled water).
Данный эксперимент повторяли 3 раза, и средние значения результатов анализа показаны в Таблице 1 ниже.This experiment was repeated 3 times, and the average values of the results of the analysis are shown in Table 1 below.
Как представлено в Таблице 1, штамм CJ600_cynX_D259N демонстрировал повышенную способность к продуцированию L-триптофана по сравнению с контрольной группой.As shown in Table 1, the CJ600_cynX_D259N strain showed an increased ability to produce L-tryptophan compared to the control group.
Штамм CJ600_cynX_D259N был назван СА04-4595, депонирован в Корейский центр культуры микроорганизмов учреждение депонирования, работающее согласно Будапештскому соглашению, 22 декабря 2020 г., и ему был присвоен номер доступа KCCM12914P.The CJ600_cynX_D259N strain was named CA04-4595, deposited with the Korea Center for Microorganism Culture and the Budapest Agreement Depository on December 22, 2020, and was assigned accession number KCCM12914P.
Из приведенного выше описания специалистам в технической области, к которой принадлежит настоящее раскрытие, будет понятно то, что настоящее раскрытие можно осуществлять в других конкретных формах без изменения его технической сущности или важных характеристик. В данном отношении следует понимать то, что воплощения, описанные выше, являются во всех отношениях иллюстративными и не ограничивающими. Объем настоящего раскрытия следует истолковывать как включающий все изменения или модифицированные формы, происходящие из значения и объема формулы изобретения, подлежащей описанию ниже, а не из приведенного выше подробного описания и эквивалентных ему идей.From the foregoing description, those skilled in the technical field to which the present disclosure belongs will appreciate that the present disclosure may be embodied in other specific forms without altering its technical nature or essential characteristics. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are in all respects illustrative and not restrictive. The scope of the present disclosure is to be construed to include all changes or modified forms deriving from the meaning and scope of the claims to be described below, and not from the foregoing detailed description and equivalent ideas.
Claims (5)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2021-0013186 | 2021-01-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2797499C1 true RU2797499C1 (en) | 2023-06-06 |
Family
ID=
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2261912C2 (en) * | 1999-09-15 | 2005-10-10 | Дегусса Аг | Polynucleotide3 encoding polypeptide eliciting activity of glucose-6-phosphate isomerase, expression plasmid vector, method for enhancing metabolism intensity in pentose phosphate cycle and method for preparing l-amino acids |
| RU2310686C2 (en) * | 1999-06-25 | 2007-11-20 | Басф Акциенгезелльшафт | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins participating in carbon metabolism and energy producing |
| RU2364628C2 (en) * | 2007-07-18 | 2009-08-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Method of obtaining l-amino acids using bacteria of family enterobacteriaceae |
| CN101914584A (en) * | 2010-09-03 | 2010-12-15 | 王东阳 | Method for producing L-tryptophan |
| RU2692645C2 (en) * | 2015-05-14 | 2019-06-25 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Escherichia genus microorganism producing l-tryptophan, and method of producing l-tryptophan using thereof |
| CN106434478B (en) * | 2016-10-26 | 2019-09-24 | 福建师范大学 | A kind of Corynebacterium glutamicum strain and its application in fermenting and producing L-Trp |
| KR102035844B1 (en) * | 2018-02-23 | 2019-10-23 | 씨제이제일제당 주식회사 | Recombinant coryneform microorganism to produce L-tryptophan and method for producing L-tryptophan using the same |
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2310686C2 (en) * | 1999-06-25 | 2007-11-20 | Басф Акциенгезелльшафт | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins participating in carbon metabolism and energy producing |
| RU2261912C2 (en) * | 1999-09-15 | 2005-10-10 | Дегусса Аг | Polynucleotide3 encoding polypeptide eliciting activity of glucose-6-phosphate isomerase, expression plasmid vector, method for enhancing metabolism intensity in pentose phosphate cycle and method for preparing l-amino acids |
| RU2364628C2 (en) * | 2007-07-18 | 2009-08-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Method of obtaining l-amino acids using bacteria of family enterobacteriaceae |
| CN101914584A (en) * | 2010-09-03 | 2010-12-15 | 王东阳 | Method for producing L-tryptophan |
| RU2692645C2 (en) * | 2015-05-14 | 2019-06-25 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Escherichia genus microorganism producing l-tryptophan, and method of producing l-tryptophan using thereof |
| CN106434478B (en) * | 2016-10-26 | 2019-09-24 | 福建师范大学 | A kind of Corynebacterium glutamicum strain and its application in fermenting and producing L-Trp |
| KR102035844B1 (en) * | 2018-02-23 | 2019-10-23 | 씨제이제일제당 주식회사 | Recombinant coryneform microorganism to produce L-tryptophan and method for producing L-tryptophan using the same |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP4053270B1 (en) | Novel cytosine permease variant, and method for producing l-tryptophan using same | |
| EP4053273A1 (en) | Novel ferrochelatase variant, and method for producing l-tryptophan using same | |
| EP4053271A1 (en) | Novel deoxyguanosinetriphosphate triphosphohydrolase variant, and method for producing l-tryptophan using same | |
| RU2797499C1 (en) | New protein variant of the cyanate transporter family and a method for producing l-tryptophan using it | |
| RU2790562C1 (en) | New ppta tautomerase variant and a method to produce l-tryptophan using the ppta tautomerase | |
| RU2791193C1 (en) | New ferrochelatase variant and a method to produce l-tryptophan using the ferrochelatase | |
| RU2793185C1 (en) | New version of hydrolase and a method for obtaining l-tryptophan | |
| RU2790564C1 (en) | A new variant of h(+)/cl(-) exchange transporter and a method to produce l-tryptophan using the h(+)/cl(-) exchange transporter | |
| RU2795972C1 (en) | New version of the htrl protein and a method for obtaining l-tryptophan using it | |
| RU2790563C1 (en) | New variant of deoxyguanosine triphosphate triphosphohydrolase and a method for producing l-tryptophan with its use | |
| RU2791243C1 (en) | A new variant of soluble pyridine nucleotide transhydrogenase and a method of producing l-tryptophan using the soluble pyridine nucleotide transhydrogenase | |
| RU2790565C1 (en) | A new variant of copper-exporting p-type atphase a and a method to produce l-tryptophan using the copper-exporting p-type atphase a | |
| RU2787791C1 (en) | NEW VARIANT OF CYTOSINE PERMEASE AND A METHOD FOR PRODUCING l-TRYPTOPHAN WITH ITS USE | |
| RU2795053C1 (en) | NEW VARIANT OF THE Co/Zn/Cd OUTFLOW SYSTEM COMPONENT AND A METHOD FOR OBTAINING L-LYSINE WITH ITS USE | |
| RU2790512C1 (en) | New variant of isocitrate dehydrogenase kinase/phosphatase and method for producing l-tryptophan using the same | |
| RU2793368C1 (en) | New version of the transcription regulator and a method for obtaining l-valine with its use | |
| RU2795162C1 (en) | New option of the transcription regulator whca of the whib family and a method for producing l-valine using it | |
| RU2792638C1 (en) | New variant of branch-chain amino acid permease and method for producing l-valine with its use | |
| RU2794484C1 (en) | New option of dahp synthases and a method for obtaining l-lysine with its use | |
| RU2792640C1 (en) | New variant of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and method for obtaining l-valine with its use | |
| RU2793441C1 (en) | New variant of primosome assembly protein and method for obtaining l-lysine with its use | |
| RU2793436C1 (en) | New variant of sugar phosphate-isomerase/epimerase and a method for obtaining l-lysine with its use | |
| RU2793435C1 (en) | New variant of the membrane protein terc and a method for obtaining l-lysine using it | |
| RU2793429C1 (en) | New variant of dihydrolipoamidacetiltransferase and a method for obtaining l-valine with its use | |
| RU2794550C1 (en) | New gamma subunits of dna polymerase iii and tau variant and method for producing l-lysine |