RU2796305C2 - Фармацевтическая композиция для контролированного высвобождения трепростинила - Google Patents

Abstract

В настоящем документе представлены фармацевтические композиции, включающие в себя (а) по меньшей мере одну липосому, включающую в себя по меньшей мере один образующий везикулу фосфолипид; и (b) трепростинил, инкапсулированный в липосому. Соотношение трепростинила и фосфолипида равняется или превышает 0,035 и обеспечивает контролированное высвобождение трепростинила. Также представлено применение фармацевтических композиций для лечения респираторных заболеваний. 3 н. и 15 з.п. ф-лы, 6 ил., 7 табл., 6 пр.

Description

Ссылка на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с заявкой на выдачу патента США с серийным №62/667889, поданной 7 мая 2018 года, а также заявкой на выдачу патента США с серийным №62/670875, поданной 14 мая 2018 года, полные раскрытия которых включены в настоящий документ посредством ссылки.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции контролированного высвобождения трепростинила, который инкапсулируют в липосоме.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Липосомные композиции обладают большим потенциалом для улучшения фармакокинетики лекарственных средств, например, для увеличения времени циркуляции в крови, контролированного высвобождения лекарственного средства, пониженной токсичности и нацеленной доставки лекарственного средства.

Профиль контролированного или продленного высвобождения лекарственного средства предпочтителен для повышения терапевтической эффективности. Однако липосомные композиции с различными профилями контролированного высвобождения имеют определенные недостатки или дефекты.

Например, сообщалось, что образование нерастворимых осадков, кристаллов или гелей лекарственного средства во внутренней водной среде липосом создает проблему быстрого высвобождения или скачкообразного высвобождения инкапсулированного лекарственного средства из обычных липосом, в результате чего такое скачкообразное высвобождение часто вызывает побочные эффекты (Barenholz (2012), Journal of Controlled Release, 160:117-134, и публикация патентного документа США №US 2015/0093434 А1). Однако такие нерастворимые осадки, кристаллы или гели лекарственного средства не обеспечивают адекватного высвобождения лекарственного средства или желаемой терапевтической эффективности, и лекарственное средство может не полностью высвобождаться из липосом, вызывая накопление лекарственного средства в тканях, не являющихся мишенями, что потенциально вызывает неблагоприятные побочные эффекты.

Сохраняется потребность в липосомной композиции без скачкообразного высвобождения для уменьшения потенциального побочного эффекта, но с профилем продленного высвобождения для поддержания терапевтической эффективности. Настоящее изобретение направлено на эти и другие потребности.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в себя одну или несколько липосом, суспендированных во внешней среде, при этом указанная липосома включает в себя (а) внешний липидный бислой, включающий в себя по меньшей мере один образующий везикулу фосфолипид; и (b) внутреннюю водную среду, включающую в себя трепростинил, и соль, которая обеспечивает градиент рН между внутренней водной средой и внешней средой, при этом соотношение масс трепростинила и по меньшей мере одного образующего везикулу фосфолипида (т.е. соотношение Т/Р) равняется или превышает приблизительно 0,035, и приблизительно менее чем 60% трепростинила высвобождается в пределах 2 часов после введения фармацевтической композиции, и более чем 80% трепростинила высвобождается от более чем 2 часов до приблизительно 72 часов после введения фармацевтической композиции.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения респираторного заболевания, предусматривающему стадии введения фармацевтической композиции, описываемой в настоящем документе.

Также представлен способ снижения побочного эффекта ингалируемого трепростинила в верхних дыхательных путях, предусматривающий стадию введения субъекту при необходимости этого эффективного количества фармацевтической композиции, описываемой в настоящем документе.

Термины «изобретение», «данное изобретение», «это изобретение» и «настоящее изобретение», используемые в настоящем патенте, предназначены для широкого обозначения всех заявляемых объектов настоящего патента и приведенной ниже формулы изобретения. Следует учитывать, что утверждения, содержащие эти термины, не ограничивают заявляемый объект, описываемый в настоящем документе, и не ограничивают значение или объем приведенной ниже формулы изобретения. Варианты осуществления настоящего изобретения, на которые распространяется настоящий патент, определяются приведенной ниже формулой изобретения, а не настоящим кратким описанием. Настоящее краткое описание представляет собой общий обзор различных аспектов настоящего изобретения и знакомит с некоторыми концепциями, которые далее описываются в приведенном ниже разделе «Подробное описание». Настоящее краткое описание не предназначено для идентификации ключевых или существенных признаков заявляемого объекта настоящего изобретения и не предназначено для использования изолированно для определения объема заявляемого объекта настоящего изобретения. Для понимания заявляемого объекта необходимо обратиться к соответствующим частям полного описания, любых или всех графических материалов и каждого пункта формулы изобретения.

Настоящее изобретение станет более понятным при чтении следующих сопровождающих графических материалов и подробного описания.

Краткое описание графических материалов

Иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения описываются подробно ниже со ссылкой на следующие графические материалы.

На фиг.1А и фиг.1В представлены линейные графики, демонстрирующие log средней концентрации трепростинила в плазме и линейной средней концентрации трепростинила в плазме у крыс, которым вводили раствор свободного трепростинила и растворы липосомного трепростинила при различных соотношениях Т/Р.

На фиг.2 представлен линейный график, демонстрирующий соотношение площади под кривой зависимости концентрации в плазме от времени от времени ноль до определенного времени (AUC_t) и площади под кривой зависимости концентрации в плазме от времени от времени ноль до бесконечности (AUC_inf).

На фиг.3А - фиг.3С представлены полученные с помощью электронного микроскопа изображения, демонстрирующие присутствие или отсутствие осадка во внутренней водной среде композиций липосомного трепростинила (фиг.3А и фиг.3С) и композиций липосомного метилпреднизолона (MPS) (фиг.3В).

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Используемые в настоящем документе формы единственного числа относятся к одному или более чем одному (т.е. по меньшей мере одному) из грамматических объектов. В качестве примера, «элемент» означает один элемент или более чем один элемент.

Все числа модифицированы термином «приблизительно». Используемый в настоящем документе термин «приблизительно» относится к диапазону ±10% определенного значения.

Термин «включать в себя» или «включающий в себя», как правило, используют в смысле «содержать в себе/содержащий в себе», что означает допущение наличия одного или нескольких признаков, ингредиентов или компонентов.

Термин «субъект» может относиться к позвоночному, страдающему респираторным заболеванием, или к позвоночному животному, которое, как считается, нуждается в лечении респираторного заболевания. Субъекты включают в себя теплокровных животных, таких как млекопитающие, например, приматы и более предпочтительно, человек. Отличные от человека приматы также являются субъектами. Термин «субъект» включает в себя домашних животных, таких как кошки, собаки и т.д., домашний скот (например, крупный рогатый скот, лошади, свиньи, овцы, козы и т.д.) и лабораторных животных (например, мышь, кролик, крыса, песчанка, морская свинка и т.д.). Таким образом, в настоящем документе рассматриваются ветеринарные применения и медицинские составы.

Используемые в настоящем документе термины «инкапсуляция», «нагруженный» и «захваченный» могут быть использованы взаимозаменяемо и относиться к включению или ассоциации биологически активного средства (например, трепростинила) во внутренней водной среде липосомы.

Настоящее раскрытие относится к фармацевтической композиции, включающей в себя одну или несколько липосом, суспендированных во внешней среде, при этом указанная липосома включает в себя (а) внешний липидный бислой, включающий в себя по меньшей мере один образующий везикулу фосфолипид; и (b) внутреннюю водную среду, включающую в себя трепростинил, и соль для обеспечения градиента рН между внутренней водной средой и внешней средой (далее в настоящем документе «соль градиента рН»), при этом соотношение масс трепростинила и по меньшей мере одного образующего везикулу фосфолипида (т.е. соотношение Т/Р) равняется или превышает приблизительно 0,035, и приблизительно менее чем 60% трепростинила высвобождается в пределах 2 часов после введения фармацевтической композиции, и более чем 80% трепростинила высвобождается от более чем 2 часов до приблизительно 72 часов после введения фармацевтической композиции.

Согласно иллюстративному варианту осуществления липосомы суспендируют во внешней среде, и рН внешней среды превышает pKa трепростинила. Согласно другому иллюстративному варианту осуществления рН внутренней водной среды составляет по меньшей мере 0,1 единицы или по меньшей мере на 1 единицу превышает рН внешней среды. Согласно еще одному варианту осуществления эффективность инкапсуляции трепростинила превышает приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90% или приблизительно 95%.

Согласно одному варианту осуществления соотношение трепростинила и фосфолипида равняется или превышает приблизительно 0,035, приблизительно 0,036, приблизительно 0,037, приблизительно 0,038, приблизительно 0,039, приблизительно 0,04, приблизительно 0,041, приблизительно 0,042, приблизительно 0,043, приблизительно 0,044, приблизительно 0,045, приблизительно 0,046, приблизительно 0,047, приблизительно 0,048, приблизительно 0,049, приблизительно 0,05, приблизительно 0,051, приблизительно 0,052, приблизительно 0,053, приблизительно 0,054, приблизительно 0,055, приблизительно 0,056, приблизительно 0,057, приблизительно 0,058, приблизительно 0,059 или приблизительно 0,06.

Согласно другому варианту осуществления фармацевтическая композиция снижает скачкообразное высвобождение трепростинила в верхних дыхательных путях (приблизительно менее чем 60% трепростинила высвобождается в пределах 2 часов после введения), в том числе в ротовой полости, носоглотке и гортани над голосовыми связками. В результате побочные эффекты трепростинила в верхних дыхательных путях, такие как кашель, раздражение горла, боль в глотке, кровотечение из носа, кровохаркание и бронхиальная обструкция, снижаются по сравнению с таковыми фармацевтической композиции, в которой соотношение трепростинила и фосфолипида составляет ниже чем приблизительно 0,035. Согласно еще одному иллюстративному варианту осуществления фармацевтическая композиция продлевает высвобождение трепростинила от более чем 2 часов до по меньшей мере 4 часов, по меньшей мере 6 часов, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 10 часов, по меньшей мере 12 часов по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 24 часов, по меньшей мере 48 часов или по меньшей мере 72 часов после введения фармацевтической композиции (т.е. более чем 80% трепростинила высвобождается от более чем 2 часов до приблизительно 72 часов после введения) и снижает частоту введения дозы.

Также раскрываются способы лечения респираторного заболевания, предусматривающие стадию введения субъекту при необходимости этого эффективного количества фармацевтической композиции, раскрываемой в настоящем документе, при этом соотношение трепростинила и фосфолипида в фармацевтической композиции равняется или превышает приблизительно 0,035, и побочный эффект трепростинила снижается по сравнению с таковым фармацевтической композиции с соотношением трепростинила и фосфолипида менее чем приблизительно 0,035. Неограничивающие примеры респираторного заболевания включают в себя легочную гипертензию и интерстициальное заболевание легких.

Настоящее изобретение также относится к способам снижения побочного эффекта ингалируемого трепростинила в верхних дыхательных путях, предусматривающим введение субъекту при необходимости этого эффективного количества фармацевтической композиции, раскрываемой в настоящем документе, при этом соотношение трепростинила и фосфолипида в фармацевтической композиции равняется или превышает приблизительно 0,035.

Согласно определенным вариантам осуществления фармацевтическую композицию, раскрываемую в настоящем документе, вводят путем ингаляции, и скачкообразное высвобождение и побочный эффект трепростинила снижаются по сравнению с фармацевтической композицией с соотношением трепростинила и фосфолипида менее чем приблизительно 0,035.

А. Липосомные компоненты

Используемый в настоящем документе термин «липосома» относится к микроскопическим везикулам или частицам, состоящим из одного или нескольких липидных бислоев, окружающих внутреннюю водную среду. Для образования липосом необходимо присутствие по меньшей мере одного «образующего везикулу липида», который представляет собой амфипатический липид, способный либо образовывать липидный бислой, либо встраиваться в него. Любой подходящий образующий везикулу липид может быть использован для образования липидного бислоя, составляющего липосомы. Образующий везикулу липид включает в себя без ограничения фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (PC), фосфатидилглицерин (PG), фосфатидилинозитол (PI), фосфатидную кислоту (РА), фосфатидилэтаноламин (РЕ) или фосфатидилсерин (PS), и заряженные липиды, такие как положительно заряженный липид или отрицательно заряженный липид.

Липидный бислой липосомы включает в себя по меньшей мере один образующий везикулу липид и стерол, который выбран из группы, состоящей из холестерина, гексасукцината холестерина, эргостерина, ланостерина и любой их комбинации без ограничения. Согласно иллюстративному варианту осуществления стерол представляет собой холестерин.

Согласно определенным вариантам осуществления образующий везикулу липид представляет собой смесь первого фосфолипида и второго фосфолипида. Согласно некоторым вариантам осуществления первый фосфолипид представляет собой фосфатидилхолин (PC), который выбран из группы, состоящей из гидрогенизированного яичного фосфатидилхолина (НЕРС), гидрогенизированного фосфатидилхолина сои (HSPC), дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), дистеарилоилфосфатидилхолина (DSPC), димиристоилфосфатидилхолина (DMPC), яичного фосфатидилхолина (ЕРС), соевого фосфатидилхолина (SPC), олеоилпальмитоилфосфатидилхолина, диолеоилфосфатидилхолина (DOPC), дипетроселиноилфосфатидилхолина, пальмитоилэлаидоилфосфатидилхолина, пальмитоилолеоилфосфатидилхолина, дилауроилфосфатидилхолина (DLPC), диундеканоилфосфатидилхолина, дидеаноилфосфатидилхолина, динонаноилфосфатидилхолина и любой их комбинации. Согласно другим вариантам осуществления второй фосфолипид представляет собой модифицированный полиэтиленгликолем фосфолипид, включающий в себя полиэтиленгликоль, имеющий молекулярную массу от приблизительно 500 до приблизительно 10000 дальтон, например, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (DSPE-PEG2000), отрицательно заряженный фосфолипид, такой как дистеарилоилфосфатидилглицерин (DSPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG) или димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG). Согласно иллюстративному варианту осуществления мольный процент первого фосфолипида:холестерина:второго фосфолипида составляет 50-70:20-45:0,1-10, 50-70:20-45:0,5-8 или 55-65:25-40:1-6, 50-70:20-45:0,1-10, 50-70:20-45:0,5-8 или 55-65:25-40:1-6.

Согласно другим вариантам осуществления образующие везикулу липиды представляют собой смесь первого фосфолипида и заряженного липида. Согласно иллюстративному варианту осуществления образующие везикулу липиды представляют собой смесь первого фосфолипида, второго фосфолипида и заряженного липида. Заряженный липид включает в себя стеариламин, 1,2-диолеоил-3-триметиламмония-пропан (DOTAP), 3β-[Ν-(N',N'-диметиламиноэтан)-карбамоил]холестерин (DC-холестерин), N⁴-холестерил-спермин (GL67), диметилдиоктадециламмоний (DDAB), 1,2-ди-О-окстадеценил-3-триметиламмония пропан (DOTMA), этилфосфохолин (этил-PC) или их комбинацию. Согласно другому иллюстративному варианту осуществления мольный процент первого фосфолипида:холестерина:заряженного липида составляет 50-70:20-45:0,1-10, 50-70:20-45:0,5-8 или 55-65:25-40:1-6.

Согласно одному варианту осуществления мольный % HSPC, холестерина и DSPG в липидном бислое составляет 50-70:20-45:0,1-10, 50-70:20-45:0,1-5 или 55-65:25-40:0,5-8. Согласно другому варианту осуществления мольный % HSPC, холестерина и DSPE-PEG2000 в липидном бислое составляет 50-70:20-45:0,1-10, 50-70:20-45:0,1-5 или 55-65:25-40:0,5-8. Согласно другому варианту осуществления мольный % DPPC:Chol:DSPE-PEG2000 в липидном бислое составляет 50-70:20-45:0,5-8, 50-70:20-45:0,1-5 или 55-65:25-40:1-6.

Согласно одному варианту осуществления липидный бислой липосом также может включать в себя по меньшей мере один образующий везикулу липид и поверхностно-активное средство, которое может представлять собой неионное поверхностно-активное средство, катионное поверхностно-активное средство или цвиттерионное поверхностно-активное средство. Неионогенное поверхностно-активное средство не имеет формально заряженных групп в своей концевой группе. Катионное поверхностно-активное средство несет в себе суммарный положительный заряд. Цвиттерионное поверхностно-активное средство является электрически нейтральным, но несет формальные положительные и отрицательные заряды на разных атомах.

Неограничивающие примеры неионных поверхностно-активных средств включают в себя неионные водорастворимые моно-, ди- и триглицериды; неионные водорастворимые сложные эфиры одноосновных и двухосновных жирных кислот и полиэтиленгликоля; неионные водорастворимые сложные эфиры сорбитана и жирных кислот (например, моноолеаты сорбитана, такие как TWEEN 20 (полиоксиэтилен-20-сорбитанмоноолеат), SPAN 80); неионные водорастворимые триблок-сополимеры (например, триблок-сополимеры поли(этиленоксида), поли(пропиленоксида) и поли(этиленоксида), такие как POLOXAMER 406 (PLURONIC F-127)) или их производные.

Неограничивающие примеры катионного поверхностно-активного средства включают в себя диметилдиалкиламмония бромид или додецилтриметиламмония бромид.

Неограничивающие примеры цвиттерионного поверхностно-активного средства включают в себя 3-(N,N-диметилпальмитоиламмонио)-пропансульфонат.

Согласно определенным вариантам осуществления липосомы, по сути, не содержат детергент или ионофора, который представляет собой соединение, способное облегчить перенос Н⁺ или ОН^- через липосомную мембрану.

При получении липосом можно использовать растворитель для растворения образующего везикулу липида, например, метанол, этанол, эфир и их комбинации. Необязательно растворитель может быть позже удален сверхкритической жидкостью, и его предпочтительно использовать в минимальном количестве, чтобы сократить время проведения стадии удаления органического растворителя.

В соответствии с настоящим изобретением липосомы получают в среде, включающей в себя соль для обеспечения градиента рН между внутренней водной средой и внешней средой липосомы (далее в настоящем документе «соль градиента рН»). При контакте образующего везикулу липида со средой, включающей в себя соль градиента рН, образуется суспензия липосом.

Липосомы в суспензии подвергаются уменьшению размера. Размер липосомы обычно определяется ее диаметром. Уменьшение размера липосом может быть достигнуто с помощью ряда способов, таких как экструзия, обработка ультразвуком, методики гомогенизации или методики измельчения, которые хорошо известны и могут быть выполнены специалистами в данной области. Экструзия включает в себя пропускание липосом под давлением один или несколько раз через фильтры с определенными размерами пор. Фильтры обычно изготавливаются из поликарбоната, но также могут быть изготовлены из любого прочного материала, который не взаимодействует с липосомами и который достаточно прочен, чтобы обеспечить экструзию при достаточном давлении. Размер липосом можно уменьшить с помощью обработки ультразвуком, при которой используется энергия ультразвука для разрушения или сдвига липосом, которые спонтанно превращаются в более мелкие липосомы. Например, обработка ультразвуком может быть проведена путем погружения стеклянной пробирки, содержащей суспензию липосом, в эпицентр ультразвука, созданный в ультразвуковом устройстве типа ванны, или может использоваться ультразвуковой датчик зондового типа, в котором энергия ультразвука генерируется вибрацией титанового зонда в прямом контакте с суспензией липосом. В соответствии с настоящим изобретением липосомы обычно имеют диаметр от приблизительно 50 нм до 500 им, например, приблизительно 500 нм или меньше, приблизительно 400 нм или меньше, приблизительно 300 нм или меньше, приблизительно 200 нм или меньше или приблизительно 100 нм или меньше.

После оптимизации размеров концентрацию соли градиента рН во внешней среде регулируют для обеспечения градиента рН между внутренней водной средой и внешней средой, что может быть выполнено рядом путей, например, путем замены внешней среды подходящим буфером без солей градиента рН, таким как буфер лимонной кислоты (Н₃С₆Н₅О) и буфер фосфорной кислоты (Н₃РО₄), такими способами, как диафильтрация, диализ, ультрафильтрация или фильтрация с тангенциальным потоком.

Соль градиента рН обеспечивает более низкий внешний и более высокий внутренний градиент рН между внешней средой и внутренней водной средой липосом. Согласно одному варианту осуществления рН внутренней водной среды по меньшей мере на 0,1 единицы выше, чем рН внешней среды. Согласно другому варианту осуществления рН внутренней водной среды по меньшей мере на 1 единицу выше рН внешней среды. Согласно еще одному варианту осуществления рН внутренней водной среды составляет приблизительно 7, 8, 9 или 10, а рН внешней среды составляет менее чем 7, менее чем 6, менее чем 5, менее чем 4, менее чем 3, приблизительно 3-7, приблизительно 3,5-6,5 или приблизительно 4-6. Согласно еще одному иллюстративному варианту осуществления рН внешней среды превышает pKa трепростинила.

Полученные липосомы можно хранить на протяжении значительных периодов времени до загрузки трепростинила и введения субъекту. Например, липосомы можно хранить в условиях охлаждения на протяжении значительных периодов времени перед загрузкой трепростинила. В качестве альтернативы, липосомы можно дегидратировать, хранить, а затем регидратировать и загружать трепростинилом перед введением. Липосомы также могут быть дегидратированы после загрузки трепростинила. Дегидратация может быть проведена рядом способов, доступных и известных в уровне техники. Согласно определенным вариантам осуществления липосомы дегидратируют с использованием стандартного устройства для сушки замораживанием, т.е. для дегидратации в условиях низкого давления. Также липосомы можно замораживать, например, с использованием жидкого азота. Сахариды могут быть добавлены в липосомную среду, например, в буфер, содержащий липосомы, до дегидратации, чтобы гарантировать стабильность и целостность липосом во время дегидратации. Примеры сахаридов включают в себя без ограничения мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, декстрозу, сорбит, маннит, ксилит или их комбинацию.

Суспензия липосом, характеризующаяся соотношением Т/Р, равным или превышающим приблизительно 0,035, как описано выше, готова для загрузки трепростинила. Обычно трепростинил добавляют во внешнюю среду липосомы и полученную суспензию инкубируют, что обеспечивает диффузию трепростинила во внутреннюю водную среду липосомы, до достижения желаемой концентрации загрузки и эффективности инкапсуляции (процент внутреннего/инкапсулированного количества трепростинила по отношению к общему количеству трепростинила в композиции).

B. Амфифильный трепростинил

Используемые в настоящем документе термины «амфифильный трепростинил» и «трепростинил» могут использоваться взаимозаменяемо, при этом оба относятся к биологически активному трепростинилу, предназначенному для загрузки в липосомы, и также содержащему по меньшей мере одну функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из карбоксильной группы (-СООН) и гидроксильной группы (-ОН), который в основном растворим без образования нерастворимых кристаллов, осадков или гелей и устойчив в щелочном растворе. Трепростинил может также содержать одну или несколько функциональных групп в дополнение к карбоксильной функциональности, хотя присутствие такой функциональной группы не должно существенно изменять кислотность трепростинила по сравнению с кислотностью его нефункционализированного аналога.

В соответствии с настоящим раскрытием амфифильный трепростинил может быть биологически активным в своей протонированной форме или в форме любой своей соли. Соль амфифильного трепростинила может сопровождаться любым фармацевтически приемлемым противоионом, который находится в водорастворимой форме.

Согласно одному варианту осуществления амфифильный трепростинил представляет собой трепростинил.

C. Связь между соотношением трепростинила и фосфолипида и профилем контролируемого высвобождения

В соответствии с настоящим раскрытием соль градиента рН используют для обеспечения градиента рН между внутри- и экстралипосомными компартментами и обеспечения загрузки трепростинила во внутреннюю водную среду, а не захвата в липосомную мембрану или связывания с внешней поверхностью липидного бислоя.

Неограничивающие примеры соли градиента рН включают в себя соль слабой кислоты (такую как соль карбоновой кислоты или бикарбонатную соль) или аминокислоты (такой как полярная аминокислота).

Используемый в настоящем документе термин «бикарбонатная соль» относится к фармацевтически приемлемой соли соединения, включающей в себя бикарбонатный анион и катионный компонент. Согласно одному варианту осуществления катионный компонент соли соединения представляет собой металл. Неограничивающие примеры металла включают в себя металл IA или IIA группы, такой как калий (K), натрий (Na), кальций (Са), магний (Mg), цезий (Cs) и литий (Li), или металл, отличный от металла IA или IIА группы, такой как двухвалентное железо (Fe) и никель (Ni). Примеры бикарбонатной соли включают в себя без ограничения бикарбонат калия, бикарбонат натрия, бикарбонат кальция, бикарбонат магния, бикарбонат цезия, бикарбонат лития, бикарбонат никеля, бикарбонат двухвалентного железа или любую их комбинацию.

Используемый в настоящем документе термин «соль карбоновой кислоты» включает в себя без ограничения формиат, ацетат, пропионат, бутират, изобутират, валерат, изовалерат или их комбинацию. Согласно одному иллюстративному варианту осуществления ацетат представляет собой ацетат натрия, ацетат кальция или их комбинацию.

В таблице 1 показана классификация 20 аминокислот. 20 аминокислот классифицируют согласно Juang RH (2007) Biochemistry. Согласно одному варианту осуществления соль градиента рН представляет собой соль полярной аминокислоты, включающей в себя нейтральную полярную аминокислоту (тирозин, аспарагин, глутамин, цистеин, серии, треонин), основную полярную аминокислоту (аргинин, лизин, гистидин), кислотную полярную аминокислоту (аспартат, глутамат) или их комбинацию.

Согласно некоторым вариантам осуществления соль градиента рН не является фосфатом. Согласно иллюстративному варианту осуществления соль градиента рН является бикарбонатом. Согласно другому иллюстративному варианту осуществления соль градиента рН является ацетатом.

Противоион выбирается для сопровождения соли градиента рН для поддержания стабильного градиента рН, так что взаимодействие между противоионом и солью градиента рН вместе обеспечивает оптимальный эффект соли градиента рН, т.е. инкапсуляцию высокой концентрации трепростинила во внутренней водной среде липосомы и/или увеличение скорости высвобождение его из липосомы. Следует учитывать, что после установления градиента рН избыточные противоионы в липосомах обеспечивают большое количество гидроксида, и эти противоионы отдельно не способны проникать через мембраны. Трепростинил в своей нейтральной форме может проникать в липидный бислой в условиях инкубации во время загрузки липосом и депротонироваться в ответ на противоионы. Депротонированный трепростинил с трудом проникает через липосомный бислой. Согласно некоторым вариантам осуществления противоион может быть ионом щелочного металла.

Согласно определенному варианту осуществления внутренняя водная среда, по сути, не содержит осадков, кристаллов или гелей. Внутренняя водная среда считается, по сути, несодержащей осадков, кристаллов или гелей, если такие осадки, кристаллы или гели не видны при электронной микроскопии с увеличением по меньшей мере 5000×, 8000×, 10000×, 12000×, 15000× или 20000×.

Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением, характеризующиеся определенным диапазоном соотношения трепростинила и фосфолипида, уменьшают скачкообразное высвобождение инкапсулированного трепростинила и, следовательно, уменьшают побочный эффект трепростинила. Кроме того, из фармацевтической композиции высвобождается достаточное количество трепростинила для желаемого терапевтического эффекта, и профиль высвобождения продлевается по сравнению с профилем высвобождения фармацевтической композиции с соотношением трепростинила и фосфолипида, выходящим за пределы определенного диапазона в соответствии с настоящим раскрытием. Такое заявляемое соотношение трепростинила и фосфолипида неожиданно продлевает высвобождение захваченного трепростинила из липосомной композиции при одновременном снижении побочных эффектов трепростинила без использования детергента или ионофора (такого как ионофор кальция) для профиля высвобождения, описываемого в настоящем документе.

Используемый в настоящем документе термин «скачкообразное высвобождение» относится к быстрому и/или в известной степени неконтролированному высвобождению >60% трепростинила из фармацевтической композиции в пределах 2 часов после введения фармацевтической композиции. Согласно некоторым вариантам осуществления скачкообразное высвобождение трепростинила из фармацевтической композиции, раскрываемой в настоящем документе, снижется, так что высвобождается менее чем приблизительно 62%, приблизительно 61%, приблизительно 60%, приблизительно 59%, приблизительно 58%, приблизительно 57%, приблизительно 56%, приблизительно 55%, приблизительно 54%, приблизительно 53%, приблизительно 52%, приблизительно 51%, приблизительно 50%, приблизительно 49%, приблизительно 48%, приблизительно 47%, приблизительно 46%, приблизительно 45%, приблизительно 44%, приблизительно 43%, приблизительно 42%, приблизительно 41%, приблизительно 40%, приблизительно 39% или приблизительно 38% инкапсулированного трепростинила в пределах приблизительно 2 часов после введения лекарственного средства.

Используемый в настоящем документе термин «продленное высвобождение» может быть использован взаимозаменяемо с терминами «контролированное высвобождения», «отсроченное высвобождение», «модифицированное высвобождение», «пролонгированное высвобождение», «программированное высвобождение», «высвобождение с течением времени», «с контролированной скоростью» или «замедленное высвобождение» и относится к высвобождению более чем 80% трепростинила на протяжении периода от более чем 2 часов до приблизительно 72 часов после введения фармацевтической композиции.

Согласно одному варианту осуществления профиль замедленного высвобождения фармацевтической композиции основывается на in vitro анализе высвобождения (IVR) и/или in vivo исследовании фармакокинетических показателей захваченного трепростинила.

Согласно некоторым вариантам осуществления на основании in vitro анализа высвобождения (IVR) и/или in vivo исследования фармакокинетических показателей фармацевтическая композиция характеризуется профилем высвобождения, при котором менее чем приблизительно 60%, 55%, 50%, 45%, 40% или 35% по массе захваченного трепростинила высвобождается в пределах 2 часов от момента введения лекарственного средства.

Согласно некоторым вариантам осуществления на основании in vitro анализа высвобождения (IVR) и/или in vivo исследования фармакокинетических показателей фармацевтическая композиция характеризуется профилем высвобождения, при котором более чем приблизительно 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60% или 55% по массе захваченного трепростинила высвобождается из липосомы от более чем 2 часов до 4 часов, 8 часов, 12 часов, 24 часов, 48 часов или 72 часов от момента введения лекарственного средства.

D. Введение

Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть введена в полость субъекта, которая не имеет прямого контакта с кровотоком. Примеры путей введения включают в себя без ограничения ингаляцию, интратрахеальную инъекцию, подкожную инъекцию, внутрисуставную инъекцию, внутримышечную инъекцию, интравитреальную инъекцию и интратекальную инъекцию.

Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция может быть введена путем интратрахеальной инъекции. Согласно определенным вариантам осуществления фармацевтическая композиция может быть введена путем подкожной инъекции.

Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением также может быть введена непосредственно в кровоток субъекта.

В соответствии с настоящим раскрытием фармацевтическая композиция может быть введена от одного раза до трех раз в сутки, один раз каждые 2 суток или один раз каждые 3 суток.

Далее настоящее раскрытие будет описываться следующими примерами. Однако следует учитывать, что следующие примеры предназначены исключительно для иллюстративной цели и не должны рассматриваться как ограничивающие осуществление настоящего раскрытия.

ПРИМЕРЫ

Общие экспериментальные процедуры

1. Получение липосомной композиции трепростинила

Готовили липосомную коллоидную суспензию с использованием методики введения этанола. Конкретно, все липидные ингредиенты, в том числе первый фосфолипид (т.е. HSPC), холестерин и второй фосфолипид (т.е. DSPE-PEG2000) при молярном соотношении 3:2:0,075 растворяли в 2,86 мл раствора этанола при приблизительно 60°С. Затем полученный в результате раствор липидом впрыскивали в 17,14 мл раствор бикарбоната натрия (400 мМ; рН 8,5) и взбалтывали при 60°С для гидратации липосом. Смесь экструдировали 6-10 раз через поликарбонатные мембраны с определенными размерами пор (0,2 и/или 0,1 мкм, соответственно) с получением суспензии липосом, имеющих средний размер частиц от приблизительно 100 нм до 200 нм и индекс полидисперсности (PdI)<0,2. Затем суспензию липосом диализировали с помощью системы фильтрации с тангенциальным потоком против 50 мМ буфера цитрата натрия (рН 5,5) с образованием трансмембранного градиента рН между внутренней водной средой липосомы и внешней средой (т.е. более высокого внутреннего и более низкого внешнего градиента рН). Суспензию липосом с трансмембранным градиентом рН хранили при 4°С до процесса загрузки лекарственного средства.

Трепростинил (приобретенный в компании Cayman Chemical, USA) растворяли в 50 мМ водного раствора цитрата натрия, затем добавляли в суспензию липосом при заданном соотношении трепростинила и фосфолипида и инкубировали при 40°С в течение 30 минут. Полученную в результате смесь доводили с помощью буфера цитрата натрия (рН 5,5) с получением липосомной композиции трепростинила, характеризующейся рН 5,5 и концентрацией фосфолипида 8,59 мг/мл.

Общий способ анализа

1. Количественная характеристика липосомной композиции трепростинила

а. Концентрации инкапсулированного и свободного трепростинила

Липосомную композицию трепростинила помещали в колонку PD MiniTrap™ G-25 (GE Healthcare) для отделения загруженной трепростинилом липосомы (т.е. инкапсулированного трепростинила в липосоме) от свободного трепростинила (т.е. вне липосомы).

Композицию липосомного трепростинила повреждали с использованием метанола (90% метанола и 10% суспензии липосом), концентрацию инкапсулированного трепростинила и концентрацию свободного трепростинила (вне липосомы), соответственно, анализировали количественно путем инъекции вышеуказанного раствора тестируемого образца (20 мкл) в систему Waters Acquity HPLC, оснащенную детектором на основе фотодиодной матрицы (PDA). Подвижная фаза представляет собой смесь ацетонитрила и фосфатного буфера (рН 2,5) (50:50, объем/объем), а скорость потока подвижной фазы составляет 1,0 мл/минута. Разделение выполняли с использованием колонки С18, имеющей размер 4,6 мм × 15 см, 5 мкм, при 45°С, и пик поглощения регистрировали при 220 нм.

Концентрация суммарного количества трепростинила в липосомальной композиции трепростинила, которая включает в себя инкапсулированный трепростинил во внутренней водной среде (L) и свободный трепростинил во внешней среде (F), представлена как [TRE].

I). Эффективность инкапсуляции (ББ) и соотношение трепростинила и фосфолипида (Т/Р)

Эффективность инкапсуляции (ЕЕ) вычисляли как процент инкапсулированного трепростинила во внутренней водной среде липосомы (L) относительно суммарного количества трепростинила [TRE] (т.е. суммы инкапсулированного трепростинила (L) и свободного (неинкапсулированного) трепростинила во внешней среде (F)). Другими словами, ЕЕ вычисляли с использованием следующей формулы:

ЕЕ (%)=[L/(L+F)] × 100.

Соотношение Т/Р в липосомной композиции трепростинила вычисляли с использованием следующей формулы:

Соотношение Т/Р=(В × C)/D,

В = концентрация суммарного количества трепростинила (L + F) = [TRE] (мг/мл),

С = эффективность инкапсуляции (ЕЕ),

D = концентрация фосфолипида.

с. Средний размер частиц и индекс полидисперсности (PdI)

Средний размер частиц липосомы оценивали с помощью динамического рассеяния света. Индекс полидисперсности (PdI), значение, указывающее распределение размеров липосом, определяли с использованием той же методики оценивания, что и для среднего размера частиц, с использованием анализатора частиц Beckman Coulter Delsa™ Nano С.

Пример 1. In vitro профиль высвобождения (IVR) и in vivo профиль фармакокинетических (PK) показателей липосомных композиций трепростинила с использованием бикарбонатной соли с разным соотношением трепростинила и фосфолипида (Т/Р)

Экспериментальные процедуры

A. In vitro анализ высвобождения (IVR)

Для исследования влияния соотношения трепростинила и фосфолипида на высвобождение инкапсулированного трепростинила готовили липосомные композиции итрепростинил, составленные с HSPC, холестерином и DSPE-PEG2000 с определенными соотношениями трепростинила и фосфолипида, как показано в таблице 2, в соответствии с процедурами, описанными в предыдущем разделе, озаглавленном «1. Получение липосомной композиции трепростинила», общих экспериментальных процедур. Средний размер частиц липосомы составлял 100-200 нм, a PdI составлял менее чем 0,20.

Выполняли количественную характеристику липосомных композиций трепростинила, в том числе концентраций инкапсулированного и свободного трепростинила, эффективности инкапсуляции, соотношения трепростинила и фосфолипида, среднего размера частиц и PdI, в соответствии с процедурами, описанными в предыдущем разделе, озаглавленном «1. Количественная характеристика липосомной композиции трепростинила», общего способа анализа.

Различные анализы IVR можно использовать для оценивания профиля IVR. Фактический анализ IVR известен или будет очевиден специалистам в данной области в зависимости от трепростинила в заявляемой липосомной композиции. Профиль IVR трепростинила оценивали с помощью анализа IVR согласно M.R.C. Marques et al. (2011), Dissolution Technologies, 18:15-2. Вкратце, 0,5 мл среды высвобождения получали в соответствии с M.R.C. Marques et al. (2011) и добавляли в диализную трубку с мембраной из сложного эфира целлюлозы 20 кДа (№по каталогу 88405, Thermo Fisher Scientific), а затем диализную трубку с мембраной из сложного эфира целлюлозы помещали в коническую пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 15 мл, содержащую 14 мл среды высвобождения. Неограничивающий пример среды высвобождения включает в себя имитированную легочную жидкость (SLF).

Подходящее количество липосомальной композиции трепростинила добавляли в коническую пробирку с получением конечной концентрации трепростинила 5 мкг/мл с последующим диализом при 37°С и 100 оборотах/в минуту. В заранее установленный момент времени (т.е. через 0, 2, 4, 8, 12, 24, 48 и 72 часа после диализа) приблизительно 0,5 мл смеси извлекали из диализной трубки для измерения концентрации трепростинила, высвобожденного из липосомы в диализную трубку, с использованием HPLC в соответствии с процедурами, описанными в предыдущем разделе.

Процент инкапсулированного трепростинила, высвобождаемого из SLF, вычисляли с использованием уравнения 1.

Высвобождение

в котором

• C_{Release at t} (мкг/мл) - концентрация трепростинила, высвобождаемого из липосомной композиции в определенное время (t, секунды);

• C_{Encap at t0} (мкг/мл) - начальная (t₀) концентрация инкапсулированного трепростинила липосомной композиции;

• C_{Non-encap at t0} (мкг/мл) - начальная (t₀) концентрация неинкапсулированного трепростинила липосомной композиции;

• C_{Non-encap at t} (мкг/мл) - концентрация неинкапсулированного трепростинила липосомной композиции в определенное время (t, секунды);

• (C_{Non-encap at t}) _{diffuse at t} - измеренная концентрация неинкапсулированного трепростинила липосомной композиции, который диффундирует сквозь диализную мембрану в определенное время (t, секунды);

• (C_{Non-encap at t0}) _{diffuse at t} - предполагаемая начальная (t₀) концентрация неинкапсулированного трепростинила липосомной композиции, который диффундирует сквозь диализную мембрану в определенное время (t, секунды);

• (C_{Encap at t0}) _{diffuse at t} - предполагаемая начальная (t₀) концентрация инкапсулированного трепростинила, который диффундирует сквозь диализную мембрану в определенное время (t, секунды).

При этом (C_{Non-encap at t0}) _{diffuse at t} вычисляли с использованием уравнений 1-(1) и 1-(2), а (C_{Encap at t0}) _{diffuse at t} вычисляли с использованием уравнений 1-(3) и 1-(4) следующим образом:

в которых

• C_{release medium} (мкг/мл) - начальная концентрация трепростинила в среде высвобождения;

ЕЕ (%) - эффективность инкапсуляции трепростинила в липосоме.

Коэффициент диффузии (D) трепростинила, который диффундирует сквозь диализную мембрану, оценивали прежде всего по свободной форме трепростинила, который растворяется в среде высвобождения. Исходя из предположения, что диффузия трепростинила подчиняется закону Фика (уравнение 1), концентрация диффузного трепростинила через диализную мембрану возрастает экспоненциально в течение определенного периода времени и может быть рассчитана с использованием уравнения 2:

в котором

C_t (мкг/мл) - концентрация трепростинила, который диффундирует сквозь диализную мембрану в определенное время (t, секунды);

C_max (мкг/мл) - концентрация трепростинила, который диффундирует сквозь диализную мембрану, при равновесии;

С₀ (мкг/мл) - начальная (to) концентрация трепростинила в диализной мембране (5 мкг/мл).

Результаты

Физико-химическая характеристика и профиль IVE. липосомных композиций трепростинила с разными соотношениями Т/Р показаны в таблице 2.

В таблице 2 показано, что достигается ЕЕ>90% с солью бикарбоната натрия. Липосомные композиции трепростинила в таблице 2 с соотношением Т/Р, превышающим 0,035 (т.е. LB00400, LB00500, LB01000, LB01500 и LB02000), демонстрировали контролированное in vitro высвобождение со следующими характеристиками: менее чем 60% трепростинила высвобождается в пределах 2 часов от момента введения, и более чем 80% трепростинила высвобождается в пределах от более чем 2 часов до 24 часов от момента введения (т.е. 8 часов, 12 часов или 24 часов), при сравнении композиций, характеризующихся соотношением Т/Р ниже чем 0,035 (т.е. LB00300).

В. In vivo фармакокинетическое (РК) исследование липосомных композиций трепростинила

Экспериментальные процедуры

В данном in vivo PK исследовании крыс Sprague-Dawley (приобретенных в компании BioLASCO Taiwan Co., Ltd.) анестезировали изофлураном и надежно размещали на спине на изогнутой платформе в дорсальном положении под углом от 45 до 50° с использованием ленты, обвитой вокруг верхних резцов. Наконечник аэрозольного микрораспылителя (Microsprayer, PennCentury, Philadelphia, USA) вставляли в бифуркацию трахеи каждой крысы и тестируемый образец (т.е. композиции из таблицы 2 или раствор свободного трепростинила) вводили интратрахеально каждой крысе в заданной дозе с использованием шприца высокого давления, который прикреплялся к аэрозольному микрораспылительному устройству. Раствор свободного трепростинила готовили путем растворения 6 мг трепростинила в 50 мМ водного раствора цитрата натрия, а затем доводили его до 10 мл 0,9% физиологическим раствором.

В предварительно определенный момент времени (т.е. через 0, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 и 12 часов после введения) собирали образец крови у каждой крысы в содержащую гепарин пробирку и держали на влажном льду. Затем образец крови центрифугировали при приблизительно 2500×g в течение 15 минут и при 4±2°С в пределах 1 часа после сбора, чтобы отделить плазму от клеток крови. Приблизительно 0,1 мл полученного образца плазмы от каждой крысы добавляли в новую пробирку для хранения и хранили в морозильной камере с температурой, поддерживаемой на уровне -70±2°С.

Для количественного определения концентрации трепростинила 50 мкл образца плазмы каждой крысы переносили в лунку 96-луночного планшета с последующим добавлением 150 мкл нитрата ацетона в каждую лунку. Полученную смесь откручивали на вортексе в течение 1 минуты, чтобы нарушить связывание белков плазмы с трепростинилом, с последующим центрифугированием при 3000 оборотах в минуту в течение 5 минут. Полученную надосадочную жидкость (150 мкл) смешивали с равным объемом H₂O и анализировали методом жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS) для определения концентрации трепростинила в образце плазмы крысы.

Логарифм средней концентрации трепростинила и линейной средней концентрации трепростинила в образцах плазмы крыс, которым вводили различные тестируемые образцы в заданной дозе, в зависимости от времени введения до 12 часов были соответственно наносили на график, как показано на фиг.1А и 1В.

С целью определения суммарного воздействия трепростинила за период времени и для нормализации различных дозировок трепростинила, используемых в каждом тестируемом образце, на фиг.2 показано соотношение площади под кривой зависимости концентрации в плазме от времени от времени ноль до определенного времени (AUC_t) и площади под кривой зависимости концентрации в плазме от времени от времени ноль до бесконечности (AUC_inf).

Результаты

Как показано на фиг.1А и 1В концентрация трепростинила в плазме достигала пикового значения в пределах первых 5 минут после введения свободного трепростинила. После введения липосомных композиций трепростинила (т.е. LB00300, LB01000, LB01500 и LB02000) отмечали незначительный пик. Как показано на фиг.2, высвобождалось > 60% трепростинила (AUC_t/AUC_inf) в пределах 2 часов после введения свободного трепростинила и введения LB00300 (Т/Р<0,035), что указывает на скачкообразное высвобождение.

Композиции липосомного трепростинила LB01000, LB01500 и LB02000, все из которых характеризовались соотношением Т/Р, превышающим 0,035, демонстрировали профиль замедленного высвобождения (>80% AUC_t/AUC_inf наблюдали в пределах от более чем 2 часов до приблизительно 72 часов после введения) и без скачкообразного высвобождения (т.е. AUC_t/AUC_inf<60% в пределах 2 часов после введения).

Это исследование показывает, что композиции липосомного трепростинила с соотношением Т/Р, равным или превышающим 0,035, обладают следующими характеристиками:

(a) отсутствие скачкообразного высвобождения трепростинила и, следовательно, снижение побочных эффектов;

(b) уровень трепростинила в плазме оставался постоянным с небольшими колебаниями с достижением стабильного терапевтического окна; и

(c) продленное высвобождение в течение более длительного периода времени.

Пример 2. Профиль IVR липосомных композиций трепростинила с разными образующими везикулу фосфолипидами

Экспериментальные процедуры

Выполняли in vitro исследование для изучения влияния липосомного фосфолипида на профиль высвобождения трепростинила. Липосомные композиции трепростинила в данном исследовании получали в соответствии с процедурами, описанными в предыдущем разделе, озаглавленном «1. Получение липосомной композиции трепростинила», и анализировали в соответствии с процедурами, описанными в предыдущем разделе, озаглавленном «1. Количественная характеристика липосомной композиции трепростинила». Профиль IVR липосомных композиций трепростинила определяли в соответствии с процедурами, описанными в примере 1, озаглавленном «А. In vitro анализ высвобождения (IVR)» экспериментальных процедур.

Результаты

Физико-химическая характеристика и профиль IVR различных липосомных композиций трепростинила показаны в таблице 3.

Как показано в таблице 3, липосомные композиции трепростинила, включающие в себя фосфолипид DSPG (т.е. LB11000 и LB11500) или фосфолипид DSPE-PEG2000 (т.е. LB01000 и LB01500), демонстрируют подобные профили IVR (менее чем 60% трепростинила высвобождается в пределах 2 часов от момента введения, и более чем 80% трепростинила высвобождается от более чем 2 часов до 72 часов (т.е. 12 часов или 24 часа) от момента введения).

Пример 3. Профиль IVR липосомных композиций трепростинила с разными растворами солей

Экспериментальные процедуры

Выполняли in vitro исследование для изучения влияния различных солей на профиль IVR липосомных композиций трепростинила. Липосомные композиции в этом исследовании получали и профили IVR анализировали в соответствии с процедурами, описанными в примере 1.

Использовали три раствора соли слабой кислоты для загрузки трепростинила в данном примере: раствор бикарбоната натрия (400 мМ; рН 8,5), раствор ацетата натрия (400 мМ; рН 8,5) и раствор фосфата натрия (400 мМ; рН 8,5).

Результаты

Физико-химическая характеристика и профиль IVR липосомных композиций трепростинила с использованием разных солей показаны в таблице 4.

В таблице 4 показано отсутствие скачкообразного высвобождения (менее чем 60% трепростинила высвобождается в пределах 2 часов от момента введения), и профиль продленного IVR (более чем 80% трепростинила высвобождается в пределах от более чем 2 часов до 72 часов (т.е. 12 часов) от момента введения) достигался с бикарбонатной и ацетатной солями, но не с фосфатной солью. Без ограничения какой-либо теорией полагают, что бикарбонатные и ацетатные ионы могут проникать сквозь липидный бислой с достижением адекватного трансмембранного градиента рН между внутренней водной средой и внешней средой липосомы для загрузки трепростинила, тогда как фосфатные ионы не могут образовывать достаточный трансмембранный градиент рН (поскольку фосфат не проникает через липидный бислой), следовательно, соотношение Т/Р составляло менее чем 0,035 и ограничивало загрузку трепростинила.

Приведенные выше результаты подтверждают то, что трансмембранный градиент рН липосомы, созданный бикарбонатной и ацетатной солями (но не фосфатной солью), важен для достижения соотношения Т/Р не менее чем 0,035, снижения скачкообразного высвобождения и контролированного или продленного профиля IVR.

Пример 4. Оценка безопасности ингалируемой липосомной композиции трепростинила

Экспериментальные процедуры

В данном исследование 8 самцов крыс Sprague Dawley (приобретенных в компании BioLASCO Taiwan Co., Ltd.) делили на 3 группы: контрольная группа (n=2), группа сравнения (n=3) и экспериментальная группа (n=3). Крыс экспериментальной группы и крыс группы сравнения помещали в удерживающие трубы и давали распыленную липосомную композицию трепростинила LB11500 из примера 2 и раствор свободного трепростинила, соответственно, при дозировке 6 мкг/кг/сутки в течение 10 суток с помощью 20-портной исключительно назальной системы ингаляционного воздействия Buxco (DSI, USA). Воздушный поток, несущий аэрозоль, создаваемый сетчатым вибрационным небулайзером, подавали в башню системы, в которой были заключены крысы, со скоростью 10 л/минута. Крысы контрольной группы не подвергались действию лекарственного средства.

Во время исследования за каждой крысой проводилось клиническое наблюдение со стороны клетки одним наблюдателем для регистрации случаев раздражения верхних дыхательных путей из-за ингалируемой распыленной липосомной композиции трепростинила или раствора свободного трепростинила. Проявления раздражения верхних дыхательных путей включают в себя напряжение, чихание, покраснение ушных раковин, тремор, сутулость, пилоэрекцию, тахипноэ и затрудненное дыхание, гиперпноэ и носовое кровотечение.

Результаты

В таблице 5 показана частота возникновения раздражения верхних дыхательных путей, регистрируемого в каждой группе крыс.

Данное исследование демонстрирует иллюстративные варианты осуществления липосомных композиций трепростинила в соответствии с настоящим изобретением, индуцирующих меньшее раздражение верхних дыхательных путей, чем раствор свободного трепростинила.

Пример 5. Профиль IVR и статус осаждения липосомных композиций трепростинила с разными лекарственными средствами и разными солями слабой кислоты

Липосомные композиции, включающие в себя HSPC, холестерин и PEG2000-DSPE при молярном соотношении 3:2:0,075, получали в соответствии с процедурами, описанными в примере 1. Средний размер частиц липосомы составлял 100-140 нм, a PdI составлял менее чем 0,20. Трепростинил (TRE), MRE-269 или Iloprost загружали в липосомную композицию с использованием ацетата кальция (Са(АС)₂), ацетата натрия (NaAC) или бикарбоната натрия (NaBic).

Липосомную композицию с метилпреднизолона сукцинатом натрия (MPS) получали в соответствии с процедурами в Barenholz et al. (2012), Journal of Controlled Release, 160:117-134.

Профили IVR липосомных композиций оценивали с использованием процедур, описываемых в примере 1. Присутствие осадка во внутренней водной среде липосом оценивали с помощью трансмиссионной криоэлектронной микроскопии (Cryo-ΤΕΜ) с использованием электронного микроскопа JEOL JEM-2100, функционирующего при 200 кэВ, оснащенного камерой CCD Gatan 832 (4 К × 2 К). Решетки из стекловидного льда переносили в электронный микроскоп с использованием криостата, который поддерживает решетку при температуре ниже -170°С. Изображения Cryo-ΤΕΜ получали в модели LOW-Dose, обеспечивающей 20000-кратное увеличение (0,30 нм/пиксель).

Результаты

В таблице 6 показана физико-химическая характеристика, профиль IVR и присутствие или отсутствие осадка разных липосомных композиций.

В таблице 6 показано, что липосомные композиции с трепростинилом, MRE-269, Iloprost и MPS характеризуются ЕЕ>80%, независимо от типов соли слабой кислоты, используемой для загрузки лекарственного средства. Однако только липосомные композиции трепростинила демонстрируют пониженное скачкообразное высвобождение (менее чем 60% трепростинила высвобождается в пределах 2 часов от момента введения) и профиль продленного IVR (более чем 80% трепростинила высвобождается в пределах от более чем 2 часов до 72 часов (т.е. 12 часов) от момента введения).

На фиг.3В показано присутствие осадка во внутренней водной среде липосомной композиции с MPS, тогда как внутренняя водная среда липосомной композиции трепростинила, по сути, не имеет осадка (фиг.3А и фиг.3С). Без ограничения какой-либо теорией полагают, что высвобождение лекарственного средства из липосомной композиции с MPS пролонгируется или продлевается за счет присутствия осадка между MPS и кальцием во внутренней водной среде в течение более длительного периода времени. Следовательно, MPS не мог полностью высвободиться из осадка для достижения терапевтического эффекта.

Пример 6. Профиль IVR липосомных композиций трепростинила с разными соотношениями Т/Р

Липосомные композиции, включающие в себя HSPC, холестерин, PEG2000-DSPE при молярном соотношении 3:2:0,075 (8,59 мг/мл фосфолипида) получали в соответствии с процедурами, описанными в примере 1. Средний размер частиц липосомы составлял 100-140 нм или 180-200 нм (отмечено с помощью **), a PdI составлял менее чем 0,20. Трепростинил (TRE) загружали в липосомную композицию с использованием ацетата кальция (Са(АС)₂), ацетата натрия (NaAC), бикарбоната натрия (NaBic) или лизина.

Профиль IVR композиций липосомного трепростинила оценивали с использованием процедур, описанных в примере 1.

Результаты

В таблице 7 показаны физико-химическая характеристика и профиль IVR липосомных композиций трепростинила с разными соотношениями Т/Р.

В таблице 7 показано, что липосомные композиции трепростинила (с использованием ацетата натрия, ацетата кальция, бикарбоната натрия или лизина для установления градиента рН) демонстрируют пониженное скачкообразное высвобождение (менее чем 60% трепростинила высвобождается в пределах 2 часов от момента введения) и профиль продленного IVR (более чем 80% трепростинила высвобождается в пределах от более чем 2 часов до 72 часов (т.е. 8, 12, 24 часа) от момента введения), при условии, что соотношение Т/Р равняется или превышает 0,035.

В приведенном выше описании с целью объяснения были изложены многочисленные конкретные детали, чтобы обеспечить полное понимание вариантов осуществления. Однако для специалистов в данной области будет очевидно, что один или несколько других вариантов осуществления могут быть реализованы на практике без некоторых из этих конкретных деталей. Также следует принимать во внимание, что ссылки в настоящем описании на «один вариант осуществления», «вариант осуществления», вариант осуществления с указанием порядкового номера и так далее означают, что конкретные признак, структура или характеристика могут быть включены в осуществление настоящего раскрытия. Также следует учитывать, что в настоящем описании различные признаки иногда сгруппированы вместе в одном варианте осуществления, графическом материале или их описании с целью упрощения раскрытия и для помощи в понимании различных аспектов настоящего изобретения, и что один или несколько признаков или конкретные детали из одного варианта осуществления могут быть применены при осуществлении вместе с одним или несколькими признаками или конкретными деталями из другого варианта осуществления, где это уместно, при осуществлении настоящего раскрытия.

Claims (24)

1. Фармацевтическая композиция для снижения побочного эффекта ингалируемого трепростинила при лечении респираторных заболеваний, включающая в себя одну или несколько липосом, суспендированных во внешней среде, при этом указанная липосома включает в себя:

(a) внешний липидный бислой, включающий в себя по меньшей мере один образующий везикулу фосфолипид; и

(b) внутреннюю водную среду, включающую в себя трепростинил и соль для обеспечения градиента рН между внутренней водной средой и внешней средой, где указанная соль представляет собой нейтральную полярную аминокислоту, основную полярную аминокислоту или соль слабой кислоты, которая не является фосфатом,

при этом соотношение масс трепростинила и по меньшей мере одного образующего везикулу фосфолипида (т.е. соотношение T/P) равняется или превышает приблизительно 0,035.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой соотношение T/P равняется или превышает приблизительно 0,041.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой соотношение T/P равняется или превышает приблизительно 0,052.

4. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой соотношение T/P равняется или превышает приблизительно 0,056.

5. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой внешний липидный бислой дополнительно включает в себя стерол.

6. Фармацевтическая композиция по п. 5, в которой указанный стерол выбран из группы, состоящей из холестерина, гексасукцината холестерина, эргостерола, ланостерола и их комбинации.

7. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой соль слабой кислоты представляет собой соль карбоновой кислоты или бикарбонатную соль.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, в которой соль карбоновой кислоты выбрана из группы, состоящей из формиата, ацетата, пропионата, бутирата, изобутирата, валерата, изовалерата или их комбинации.

9. Фармацевтическая композиция по п. 8, в которой ацетат представляет собой ацетат натрия, ацетат кальция или их комбинацию.

10. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой внутренняя водная среда не содержит осадка.

11. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой образующий везикулу липид представляет собой смесь первого фосфолипида и второго фосфолипида или смесь первого фосфолипида и заряженного липида.

12. Фармацевтическая композиция по п. 11, в которой первый фосфолипид выбран из группы, состоящей из фосфатидилхолина (PC), фосфатидилглицерина (PG), фосфатидилинозитола (PI), фосфатидной кислоты (PA), фосфатидилэтаноламина (PE), фосфатидилсерина (PS) и любой их комбинации, второй фосфолипид представляет собой модифицированный PEG фосфолипид, положительно заряженный или отрицательно заряженный фосфолипид, а заряженный липид представляет собой положительно заряженный или отрицательно заряженный липид.

13. Фармацевтическая композиция по п. 11, в которой первый фосфолипид выбран из HSPC, DSPC, DPPC, DMPC или их комбинации, а второй фосфолипид выбран из DSPG, DPPG, DMPG, PEG-DSPE или их комбинации.

14. Фармацевтическая композиция по п. 11, в которой первый фосфолипид выбран из HSPC, DSPC, DPPC, DMPC или их комбинации, а заряженный липид представляет собой стеариламин, 1,2-диолеоил-3-триметиламмония-пропан (DOTAP), 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)-карбамоил]холестерин (DC-холестерин), N4-холестерил-спермин (GL67), диметилдиоктадециламмоний (DDAB), 1,2-ди-O-окстадеценил-3-триметиламмония пропан (DOTMA), этилфосфохолин (этил-PC) или их комбинацию.

15. Фармацевтическая композиция по п. 1, при этом фармацевтическая композиция, по сути, не содержит детергент или ионофор.

16. Применение фармацевтической композиции для лечения респираторного заболевания, где указанная фармацевтическая композиция включает в себя одну или несколько липосом, при этом указанная липосома включает в себя:

(a) внешний липидный бислой, включающий в себя по меньшей мере один образующий везикулу фосфолипид; и

(b) внутреннюю водную среду, включающую в себя трепростинил и соль для обеспечения градиента рН между внутренней водной средой и внешней средой, где указанная соль представляет собой нейтральную полярную аминокислоту, основную полярную аминокислоту или соль слабой кислоты, которая не является фосфатом,

при этом соотношение масс трепростинила и по меньшей мере одного образующего везикулу фосфолипида (т.е. соотношение T/P) равняется или превышает приблизительно 0,035, и приблизительно менее чем 60% трепростинила высвобождается в пределах 2 часов после введения фармацевтической композиции, и более чем 80% трепростинила высвобождается от более чем 2 часов до приблизительно 72 часов после введения фармацевтической композиции.

17. Применение по п. 16, при котором фармацевтическую композицию вводят путем ингаляции, и побочный эффект трепростинила в верхних дыхательных путях снижается.

18. Применение фармацевтической композиции по п. 1 для снижения побочного эффекта ингалируемого трепростинила в верхних дыхательных путях у субъекта при необходимости.

Images