RU2795884C2 - Method for obtaining platelet releasate containing growth factors - Google Patents
Method for obtaining platelet releasate containing growth factors Download PDFInfo
- Publication number
- RU2795884C2 RU2795884C2 RU2019118720A RU2019118720A RU2795884C2 RU 2795884 C2 RU2795884 C2 RU 2795884C2 RU 2019118720 A RU2019118720 A RU 2019118720A RU 2019118720 A RU2019118720 A RU 2019118720A RU 2795884 C2 RU2795884 C2 RU 2795884C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- platelet
- release
- growth factors
- platelets
- concentrate
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к способу получения релизата тромбоцитов, содержащего факторы роста, из концентрата тромбоцитов млекопитающих, согласно ограничительной части первого пункта формулы изобретения.The present invention relates to a method for producing a platelet release containing growth factors from a concentrate of mammalian platelets, according to the preamble of the first claim.
Тромбоциты млекопитающих содержат множество биологически активных веществ с важными физиологическими функциями. Среди этих биологически активных веществ факторы роста представляют особый интерес из-за их роли в усилении пролиферации различных клеточных линий и регенерации тканей, и оба процесса имеют важное значение в регенеративной медицине, при заживлении ран и язв.Mammalian platelets contain many biologically active substances with important physiological functions. Among these biologically active substances, growth factors are of particular interest because of their role in enhancing the proliferation of various cell lines and tissue regeneration, both of which are important in regenerative medicine, wound and ulcer healing.
Концепция использования собственной богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) пациента в стоматологии, пластической хирургии и регенеративной медицине уже была разработана в начале 1990-х годов. Тромбоциты получали либо путем центрифугирования собственной цельной крови пациента с антикоагулянтом, либо с использованием специальных устройств, таких как Magellan Medtronic или SmartPrep Harvest. Однако такое использование аутологичных тромбоцитов может быть поставлено под угрозу у пациентов с анемией, или в случае необходимости использования больших количеств или в течение длительных периодов времени. Одним из наиболее важных ограничений аутологичной БоТП является необходимость наличия специального оборудования или лаборатории для подготовки концентратов тромбоцитов. Чтобы сделать их подходящими для использования, тромбоциты, в частности, активируют, чтобы инициировать высвобождение содержимого их альфа-гранул. Однако обязательно использовать БоТП в течение нескольких часов после ее выделения из организма пациента, так как в противном случае содержащиеся в нем факторы роста могут потерять значительную часть своей биологической активности.The concept of using a patient's own platelet-rich plasma (PRP) in dentistry, plastic surgery, and regenerative medicine was already developed in the early 1990s. Platelets were obtained either by centrifugation of the patient's own whole blood with an anticoagulant, or using special devices such as Magellan Medtronic or SmartPrep Harvest. However, this use of autologous platelets may be compromised in anemic patients, or if large amounts or for long periods of time are needed. One of the most important limitations of autologous PRP is the need for special equipment or a laboratory to prepare platelet concentrates. To make them suitable for use, platelets in particular are activated to initiate the release of the contents of their alpha granules. However, it is imperative to use PRP within a few hours after its isolation from the patient's body, otherwise the growth factors contained in it may lose a significant part of their biological activity.
Было описано несколько способов сохранения тромбоцитов. Добавление ДМСО и трегалозы являются двумя примерами подходящих способов более длительного сохранения тромбоцитов, как для тромбоцитов, которые были подвергнуты лиофилизации (сублимационной сушке), так и для тромбоцитов, которые не были подвергнуты лиофилизации. Криопротекторные композиции, применяемые вместе с процессами лиофилизации, касаемо сохранению тромбоцитов, привели к аналогичному результату. Недостатки этих подходов, которые просто используют консерванты и/или лиофилизацию на интактных тромбоцитах, связаны с тем фактом, что белки, рецепторы и тому подобное сохраняются на поверхности тромбоцитов или внутри тромбоцитов. Например, некоторые рецепторы тромбоцитарной мембраны остаются интактными для связывания с внеклеточными факторами в ответ на активацию тромбоцитов, например, для адгезии, агрегации тромбоцитов, и т.д.Several methods for preserving platelets have been described. The addition of DMSO and trehalose are two examples of suitable ways to preserve platelets longer, both for platelets that have been lyophilized (freeze-dried) and for platelets that have not been lyophilized. Cryoprotective formulations used in conjunction with freeze-drying processes with respect to platelet preservation have led to a similar result. The disadvantages of these approaches, which simply use preservatives and/or freeze-drying on intact platelets, are due to the fact that proteins, receptors, and the like are retained on the platelet surface or within the platelets. For example, some platelet membrane receptors remain intact for binding to extracellular factors in response to platelet activation, such as adhesion, platelet aggregation, and so on.
Поэтому представляется целесообразным использовать более универсальный способ, который позволил бы превратить тромбоциты крови в препарат, подходящий для эффективного использования для широкого ряда применений, включая заживление ран, лечение кожи, лечение нарушений тканей тела (включая органы тела), таких как легочная ткань и тому подобное. Тем самым, вероятно, риск нежелательного взаимодействия такого препарата с внеклеточными факторами будет минимальным.Therefore, it seems appropriate to use a more versatile method that would make it possible to convert blood platelets into a drug suitable for effective use in a wide range of applications, including wound healing, skin treatment, treatment of disorders of body tissues (including body organs) such as lung tissue, and the like. . Thus, it is likely that the risk of undesirable interaction of such a drug with extracellular factors will be minimal.
WO 2013113024 раскрывает способ приготовления композиции, подходящей для терапевтического применения или для применения в качестве культуральной среды, где тромбоциты концентрируют и подвергают лизису для разрушения мембраны тромбоцитов. По меньшей мере 30% тромбоцитов могут быть лизированы. Лиофилизированные лизаты тромбоцитов образуют композицию, которая также содержит высвобожденные концентраты доступных факторов роста, цитокинов и хемокинов. WO 2013113024 также раскрывает способ лечения ткани млекопитающего, который включает стадии нанесения на участок ткани млекопитающего для лечения вышеописанной композиции, содержащей лиофилизированные лизаты тромбоцитов. В одном примере лиофилизированные лизаты тромбоцитов получают из исходных тромбоцитов, где по меньшей мере 30% исходных тромбоцитов лизируют для образования лиофилизированных лизатов тромбоцитов. Однако лизат не обеднен фибриногеном, и WO 2013113024 не обнаруживает проблему вирусной или патогенной инфекции и не решает эту проблему.WO 2013113024 discloses a method for preparing a composition suitable for therapeutic use or for use as a culture medium, where platelets are concentrated and subjected to lysis to disrupt the platelet membrane. At least 30% of platelets can be lysed. Lyophilized platelet lysates form a composition that also contains released concentrates of available growth factors, cytokines and chemokines. WO 2013113024 also discloses a method for treating mammalian tissue, which includes the steps of applying to a site of mammalian tissue for treatment the above-described composition containing lyophilized platelet lysates. In one example, freeze-dried platelet lysates are prepared from stock platelets, where at least 30% of the stock platelets are lysed to form freeze-dried platelet lysates. However, the lysate is not fibrinogen depleted and WO 2013113024 does not detect or solve the problem of viral or pathogenic infection.
ЕР 2389942 раскрывает способ получения вирус-инактивированного, содержащего факторы роста лизата тромбоцитов, обедненного тромбоцитарными факторами роста ТФР (PDGF) и факторами роста эндотелия сосудов (VEGF), причем указанный лизат подходит для клеточной культуры in vitro или ex vivo и для стимулирования пролиферации и/или дифференцировки стволовых клеток в направлении к остеобластной линии и/или хондроцитам. Способ включает стадии контактирования и инкубации концентрата тромбоцитов с от 0,2 до 5 об. % растворителя и/или детергента в течение периода от 5 минут до 6 часов, при рН от около 6,0 до около 9,0 и при температуре от 2 до 50°С, удаления растворителя и/или детергента путем масляной экстракции для получения водной белковой фазы, и инкубации водной белковой фазы с углем для удаления растворителя/детергента. Предварительная стадия может включать приготовление исходного концентрата тромбоцитов путем афереза или выделения из лейкоцитарной пленки, полученной из цельной крови, которая может быть свежей, с истекшим сроком годности и хранящейся в виде жидкости, либо с истекшим сроком годности и хранящейся в замороженном виде. В предпочтительном варианте реализации лизат тромбоцитов содержит факторы роста TGF-B, IGF, EGF и/или bFGF. Однако способ, раскрытый в ЕР 2389942, имеет несколько недостатков. Хотя лизат тромбоцитов может быть подходящим для культур клеток in vitro или ex vivo, ожидается, что он будет недостаточно эффективным для клинического применения для целей регенеративной медицины, включая заживление переломов костей, поскольку полная смесь всех факторов, полученных из тромбоцитов, в частности ТФР (PDGF) и VEGF необходима для клинического применения лизата тромбоцитов в регенеративной медицине, как и в лечении ран. Экстракция растворителем дает низкий выход тромбоцитов, часто 10-15 об. % только по отношению к исходному объему. ЕР 2389942 не включает стадию удаления фибриногена и не включает стадию лиофилизации. Инактивация вирусов растворителем/детергентом применима только к вирусам с оболочкой, но не способна инактивировать вирусы без оболочки, такие как вирус гепатита А и паровирус В19, а также обработка растворителем/детергентом не удаляет другие потенциальные возбудители заболеваний, такие как бактерии или другие микроорганизмы.EP 2389942 discloses a process for the preparation of a virus-inactivated platelet lysate containing growth factors depleted in platelet growth factors TGF (PDGF) and vascular endothelial growth factors (VEGF), said lysate being suitable for cell culture in vitro or ex vivo and for promoting proliferation and/ or differentiation of stem cells towards an osteoblastic lineage and/or chondrocytes. The method includes the steps of contacting and incubating the platelet concentrate with 0.2 to 5 vol. % solvent and/or detergent over a period of 5 minutes to 6 hours, at a pH of about 6.0 to about 9.0 and at a temperature of 2 to 50°C, removing the solvent and/or detergent by oil extraction to obtain an aqueous protein phase, and incubating the aqueous protein phase with charcoal to remove the solvent/detergent. The preliminary step may include preparation of a stock platelet concentrate by apheresis or isolation from a buffy coat obtained from whole blood, which may be fresh, expired and stored as a liquid, or expired and stored frozen. In a preferred embodiment, the platelet lysate contains growth factors TGF-B, IGF, EGF and/or bFGF. However, the method disclosed in EP 2389942 has several disadvantages. Although platelet lysate may be suitable for cell cultures in vitro or ex vivo, it is expected to be insufficiently effective for clinical applications in regenerative medicine, including bone fracture healing, since the complete mixture of all platelet-derived factors, in particular TGF (PDGF ) and VEGF is essential for the clinical application of platelet lysate in regenerative medicine as well as in wound care. Solvent extraction gives a low platelet yield, often 10-15 vol. % only relative to the original volume. EP 2389942 does not include a fibrinogen removal step and does not include a lyophilization step. Solvent/detergent inactivation of viruses is only applicable to enveloped viruses, but cannot inactivate non-enveloped viruses such as hepatitis A virus and parovirus B19, and solvent/detergent treatment does not remove other potential pathogens such as bacteria or other microorganisms.
US 8734854 раскрывает способ высвобождения факторов роста из цельной крови или плазмы пациента в среде без разрушения. Факторы роста, полученные этим способом, пригодны для местного нанесения на поверхность области раны, для стимулирования заживления раны, для инъекции в мягкие ткани, такие как разорванное сухожилие, для стимулирования роста и заживления ткани. В другом способе факторы роста высвобождаются из цельной крови и высушиваются традиционным методом лиофилизации. Лиофилизированный продукт может быть восстановлен нормальным солевым раствором для лечения раны пациента или для применения в хирургической операции. Хотя US 8734854 раскрывает, что конечный продукт может быть лиофилизирован, оказалось, что одна только лиофилизация недостаточна для обеспечения надежного удаления патогенов. Более того, факторы роста, полученные по способу US 8734854, не обеднены фибриногеном.US 8734854 discloses a method for releasing growth factors from a patient's whole blood or plasma in a non-destructive environment. Growth factors prepared by this method are suitable for topical application to the surface of a wound area, for promoting wound healing, for injection into soft tissues such as a torn tendon, for promoting tissue growth and healing. In another method, growth factors are released from whole blood and dried by conventional lyophilization. The lyophilized product may be reconstituted with normal saline for the treatment of a patient's wound or for use in a surgical operation. Although US 8,734,854 discloses that the final product can be lyophilized, lyophilization alone has proven insufficient to ensure reliable pathogen removal. Moreover, the growth factors obtained by the method of US 8734854 are not depleted in fibrinogen.
Другие известные факторы роста, высвобождаемые тромбоцитами, включают разработанный компанией Cambium Medical Technologies аллогенный объединенный лизат человеческих тромбоцитов. Продукт еще не представлен в качестве коммерческого продукта, и хотя указано, что он обеднен фибриногеном, никоим образом не показано, что он подвергался обработке для удаления патогенов/вирусов.Other known growth factors released by platelets include Cambium Medical Technologies' allogeneic pooled human platelet lysate. The product has not yet been released as a commercial product and although it is stated to be depleted in fibrinogen, it is by no means shown to have been processed to remove pathogens/viruses.
Многочисленные статьи описывают роль факторов роста, высвобождаемых тромбоцитами, как заменителя фетальной бычьей сыворотки. Предложен обзор о тромбоцитарном лизате в качестве замены фетальной бычьей сыворотке в культурах мезенхимальных стромальных клеток, Transfus Med Hemother 2013; 40: 326-335.Numerous articles describe the role of platelet-released growth factors as a substitute for fetal bovine serum. A review on platelet lysate as a replacement for fetal bovine serum in mesenchymal stromal cell cultures is provided, Transfus Med Hemother 2013; 40:326-335.
ЕР 27757979 раскрывает способ получения лизата тромбоцитов, способного действовать в качестве коадъюванта для выделения и/или роста и/или размножения стволовых клеток, фибробластов или дендритных клеток. Способ включает стадии (а) выделения фракции лейкоцитарной пленки из смеси образцов цельной крови, полученных по меньшей мере от двух субъектов; (b) подвергание выделенной фракции лейкоцитарной пленки воздействию фотохимического агента и УФ-излучению для удаления любых присутствующих заражающих агентов; (с) подвергание фракции лейкоцитарной пленки по меньшей мере одному циклу замораживания/оттаивания для достижения лизиса содержащихся в ней тромбоцитов; (d) центрифугирование фракции и сбор жидкой фазы. Полученный таким образом лизат тромбоцитов можно использовать в качестве ко-адъюванта для культивирования, роста и/или размножения стволовых клеток, в частности мезенхимальных, из мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани, фибробластов и дендритных клеток. Однако лизат тромбоцитов, полученный способом, раскрытым в ЕР 27757879, не обеднен фибриногеном, сомнительно, способны ли циклы замораживания/оттаивания вызывать эффективное высвобождение факторов роста и влияют ли на действие факторов роста повторные циклы замор аживания/оттаивания, и способ использует только одну стадию удаления патогенов.EP 27757979 discloses a process for the preparation of a platelet lysate capable of acting as a coadjuvant for the isolation and/or growth and/or expansion of stem cells, fibroblasts or dendritic cells. The method includes the steps of (a) isolating a buffy coat fraction from a mixture of whole blood samples obtained from at least two subjects; (b) subjecting the isolated buffy coat fraction to a photochemical agent and UV radiation to remove any contaminating agents present; (c) subjecting the buffy coat fraction to at least one freeze/thaw cycle to achieve lysis of the platelets it contains; (d) centrifugation of the fraction and collection of the liquid phase. The platelet lysate thus obtained can be used as a co-adjuvant for the cultivation, growth and/or expansion of stem cells, in particular mesenchymal stem cells, from adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, fibroblasts and dendritic cells. However, the platelet lysate prepared by the method disclosed in EP 27757879 is not deficient in fibrinogen, it is questionable whether freeze/thaw cycles are able to induce an efficient release of growth factors and whether repeated freeze/thaw cycles affect the effect of growth factors, and the method uses only one removal step. pathogens.
Доступны коммерческие лизаты тромбоцитов, например, от Macopharma. К сожалению, эти лизаты доступны в виде больших объемов замороженного материала, которые после размораживания необходимо разделить на аликвоты меньшего размера с потенциальным риском микробиологического загрязнения. Лизаты тромбоцитов человека от Millipore, PLTMax, и те, что предоставлены Zenbio, также доступны только в больших объемах замороженного материала; они предназначены только для исследовательских целей и не предназначены для терапевтического применения ex vivo.Commercial platelet lysates are available, for example from Macopharma. Unfortunately, these lysates are available as large volumes of frozen material which, after thawing, must be divided into smaller aliquots with the potential risk of microbiological contamination. Human platelet lysates from Millipore, PLTMax, and those provided by Zenbio are also only available in bulk frozen material; they are intended for research purposes only and are not intended for ex vivo therapeutic use.
Согласно T. Burnouf и др., Biomaterials 76 (2016), 371-387, факторы роста и цитокины, содержащиеся в гранулах тромбоцитов, могут высвобождаться путем прямой активации с помощью добавления раствора соли хлорида кальция, образования фибрина и дегрануляции тромбоцитов, или используя тромбин. Другие способы обеспечения высвобождения факторов роста и других биомолекул из тромбоцитов включают повторяющиеся циклы замор аживания/оттаивания, обработку ультразвуком отдельно или в сочетании с циклами замораживания/оттаивания или обработку растворителем/детергентом, которая также инактивирует вирусы, покрытые липидной оболочкой. Однако считается, что воздействие на тромбоциты повторяющихся циклов замораживания/оттаивания влияет на факторы роста. Риск передачи инфекционных агентов контролируется обязательным исследованием каждой отдельной порции сданной крови, и не использованием порции сданной крови с положительным результатом. Рекомендуется обязательное исследование для выявления ВИЧ-1/ВИЧ-2, антител, поверхностного антигена гепатита В, антител к вирусу гепатита С.According to T. Burnouf et al., Biomaterials 76 (2016), 371-387, growth factors and cytokines contained in platelet granules can be released by direct activation with the addition of a calcium chloride salt solution, fibrin formation and platelet degranulation, or using thrombin . Other methods of causing release of growth factors and other biomolecules from platelets include repeated freeze/thaw cycles, sonication alone or in combination with freeze/thaw cycles, or solvent/detergent treatments that also inactivate lipid-coated viruses. However, exposure of platelets to repeated freeze/thaw cycles is thought to affect growth factors. The risk of transmission of infectious agents is controlled by mandatory testing of each individual donated blood unit, and not using a donated blood unit with a positive result. A mandatory test is recommended to detect HIV-1 / HIV-2, antibodies, hepatitis B surface antigen, antibodies to hepatitis C virus.
Таким образом, все еще существует потребность в способе получения факторов роста, полученных из тромбоцитов, который обеспечивает оптимальный выход факторов роста и который демонстрирует минимальный риск присутствия патогенов, включая вирусы с липидной оболочкой, а также вирусы без оболочки и бактерии.Thus, there is still a need for a process for the production of platelet-derived growth factors that provides an optimal yield of growth factors and that exhibits minimal risk of pathogens, including lipid-enveloped as well as non-enveloped viruses and bacteria.
Поэтому целью настоящего изобретения является создание способа получения факторов роста, полученных из тромбоцитов в виде концентрата тромбоцитов млекопитающих, который позволяет достичь оптимального выхода факторов роста, который показывает минимальный риск присутствия вирусов как в оболочке, так и без оболочки, бактерий, грибков и других микроорганизмов, переносимых кровью.Therefore, the aim of the present invention is to provide a method for obtaining growth factors derived from platelets in the form of a concentrate of mammalian platelets, which allows to achieve an optimal yield of growth factors, which shows a minimum risk of the presence of both enveloped and non-enveloped viruses, bacteria, fungi and other microorganisms, carried by blood.
В предпочтительном варианте реализации целью настоящего изобретения является создание способа получения факторов роста, полученных из тромбоцитов, с улучшенной инактивацией не только наиболее распространенных патогенов, но также патогенов, которые не могут или вряд ли могут быть инактивированы с помощью существующих способов.In a preferred embodiment, it is an object of the present invention to provide a method for producing platelet-derived growth factors with improved inactivation of not only the most common pathogens, but also pathogens that cannot or are unlikely to be inactivated by existing methods.
Другая предпочтительная реализация данного изобретения направлена на получение тромбоцитарного релизата, который подходит для применения в регенеративной медицине и уходе за ранами. Еще один предпочтительный вариант реализации направлен на получение релизата тромбоцитов, который можно использовать в качестве заменителя фетальной бычьей сыворотки в среде для культивирования клеток.Another preferred embodiment of the present invention is directed to the production of a platelet release which is suitable for use in regenerative medicine and wound care. Yet another preferred embodiment is directed to providing a platelet release that can be used as a substitute for fetal bovine serum in cell culture medium.
Задача создания способа получения факторов роста, полученных из тромбоцитов, из концентрата тромбоцитов млекопитающих, который обеспечивает оптимальный выход факторов роста, при котором факторы роста, полученные из тромбоцитов, демонстрируют минимальный риск присутствия патогенов, включая вирусы с липидной оболочкой и вирусы без оболочки, бактерии и другие переносимые с кровью патогенные микроорганизмы, описанные выше, могжет быть решена в соответствии с настоящим изобретением с помощью способа, который показывает технические характеристики отличительной части первого пункта формулы изобретения.The objective is to provide a method for obtaining platelet-derived growth factors from a mammalian platelet concentrate that provides an optimal yield of growth factors, in which platelet-derived growth factors exhibit minimal risk of the presence of pathogens, including lipid-enveloped and non-enveloped viruses, bacteria and other blood-borne pathogens described above can be dealt with in accordance with the present invention by a method that shows the technical characteristics of the characterizing part of the first claim.
Кроме того, способ получения лизата тромбоцитов, содержащего факторы роста, по данному изобретению включает последовательные стадии:In addition, the method of obtaining platelet lysate containing growth factors according to this invention includes the following steps:
a. подвергание концентрата тромбоцитов первому этапу снижения концентрации патогенных микроорганизмов с целью разрушения как ДНК, так и РНК микроорганизмов, присутствующих в концентрате тромбоцитов, где микроорганизмы включают в себя вирусы с оболочкой, вирусы без оболочки, или бактерии, грибы и т.д.;a. subjecting the platelet concentrate to a first pathogen reduction step to destroy both DNA and RNA of microorganisms present in the platelet concentrate, where the microorganisms include enveloped viruses, non-enveloped viruses, or bacteria, fungi, etc.;
b. подвергание концентрата тромбоцитов стадии активации, через контакт с активирующим агентом, чтобы стимулировать высвобождение тромбоцитами по меньшей мере части альфа-гранул и факторов роста, присутствующих в них, обеспечивая тем самым получение жидкого релизата тромбоцитов;b. subjecting the platelet concentrate to an activation step, through contact with an activating agent, to stimulate platelet release of at least a portion of the alpha granules and growth factors present therein, thereby providing a liquid platelet release;
c. подвергание жидкого релизата тромбоцитов стадии снижения концентрации фибриногена и выделение релизата тромбоцитов, обедненного фибриногеном; эта стадия направлена на удаление фибриногена из жидкого релизата тромбоцитов;c. subjecting the liquid platelet release to a fibrinogen concentration reduction step and isolating the fibrinogen-depleted platelet release; this stage is aimed at removing fibrinogen from the liquid platelet release;
d подвергание жидкого релизата тромбоцитов, обедненного фибриногеном второй подтверждающей стадии снижения концентрации патогенов с целью разрушения вирусов с оболочкой;d exposure of fibrinogen-depleted platelet release fluid to a second confirmatory pathogen reduction step to destroy enveloped viruses;
е. подвергание релизата тромбоцитов стерильной фильтрации и выделение отфильтрованной жидкости, содержащей факторы роста.e. subjecting the platelet release to sterile filtration and isolating the filtered liquid containing growth factors.
Способ получения лизата тромбоцитов, содержащего факторы роста, по данному изобретению включает следующие стадии:The process for preparing a platelet lysate containing growth factors according to the present invention includes the following steps:
(a) подвергание концентрата тромбоцитов первой стадии снижения концентрации патогенов. В предпочтительном варианте осуществления первая стадия снижения концентрации патогена включает стадию инкубации концентрата тромбоцитов с фотохимически активным агентом и воздействия на концентрат тромбоцитов ультрафиолетового излучения. Этот этап позволяет получить концентрат тромбоцитов с пониженным содержанием патогенных микроорганизмов вследствие инактивации или разрушения РНК и/или ДНК микроорганизмов, присутствующих в концентрате тромбоцитов. В частности, концентрат тромбоцитов становится концентратом, в котором снижена концентрация вирусов с оболочкой и без оболочки. Эта первая стадия может также позволить инактивировать другие переносимые кровью микроорганизмы, содержащиеся в концентрате тромбоцитов;(a) subjecting the platelet concentrate to a first stage of pathogen reduction. In a preferred embodiment, the first step of reducing the concentration of the pathogen includes the step of incubating the platelet concentrate with a photochemically active agent and exposing the platelet concentrate to ultraviolet radiation. This step makes it possible to obtain a platelet concentrate with a reduced content of pathogenic microorganisms due to the inactivation or destruction of the RNA and/or DNA of microorganisms present in the platelet concentrate. In particular, the platelet concentrate becomes a concentrate in which the concentration of enveloped and non-enveloped viruses is reduced. This first step may also allow for the inactivation of other blood-borne microorganisms contained in the platelet concentrate;
(b) подвергание обработанного таким образом концентрата тромбоцитов стадии активации путем приведения концентрата тромбоцитов в контакт с активирующим агентом для стимулирования высвобождения тромбоцитами по меньшей мере части их содержимого, в частности, по меньшей мере, части альфа-гранул, присутствующих в тромбоцитах, а также содержимого таких альфа-гранул, включая факторы роста, и обеспечения получения релизата тромбоцитов. Релизат тромбоцитов обычно принимает форму жидкой композиции, которая содержит то, что остается от активированных тромбоцитов и содержимое тромбоцитов, которое высвободилось на стадии активации. В результате этой стадии активации сверхфизиологические дозы факторов роста и цитокинов будут высвобождаться из тромбоцитов в композицию или раствор, содержащий концентрат тромбоцитов, в дополнение к фибриногену. Это важно, поскольку альфа-гранулы обычно содержат большую часть факторов роста. Активация тромбоцитов млекопитающих и их концентратов может быть достигнута путем их контакта с активатором тромбоцитов, способным вызывать разрыв тромбоцитов и вызывать высвобождение по меньшей мере части содержимого, включая надфизиологические дозы факторов роста, цитокинов и хемокинов. Подходящие активаторы включают водные растворы солей кальция, например, хлористый кальций, тромбин, коллаген, тромбоксан А2 и аденозиндифосфат (АДФ). Добавление тромбина вызывает образование огромного сгустка, который содержит практически все содержимое концентрата тромбоцитов. Инкубация при температуре около температуры тела, около 37°С в течение достаточно длительного времени, часто 3 часа или более, приводит к тому, что сгусток сжимается до незначительного размера с выжиманием всех факторов роста внутри захваченных тромбоцитов. Таким образом, настоящее изобретение позволяет достичь высвобождения такого объема факторов роста, взвешенных в плазме, который практически идентичен начальному объему концентрата тромбоцитов, (с) Подвергание жидкого релизата тромбоцитов удалению фибриногена и выделение жидкости, релизата, обедненного фибриногеном. Эта стадия фактически содержит этапы выделения фибринового сгустка, образовавшегося после взаимодействия фибриногена, высвобождаемого из тромбоцитов, с активирующим агентом, добавленным на предыдущей стадии, чтобы вызвать высвобождение содержимого тромбоцитов. Целесообразно удалить фибриноген, который высвобождается при активации тромбоцитов в максимально возможной степени из релизата, так как фибриноген может привести к образованию полутвердого геля, который может вызвать нежелательные последствия, когда плазма крови, которая была обогащена тромбоцитами (ПРП), дополнительно применяется, например, для инъекции в область поражения при травмах опорно-двигательного аппарата, включая сухожилия, связки и суставы, или при омоложения кожи лица или при любом другом лечении. Тем не менее, концентрация фибриногена в тромбоцитах ниже, чем в плазме. Способ по настоящему изобретению может дополнительно содержать этап выделения фибриногена из релизата тромбоцитов и восстановления для дальнейшего применения релизата тромбоцитов, обедненного фибриногеном.(b) subjecting the platelet concentrate thus treated to an activation step by bringing the platelet concentrate into contact with an activating agent to stimulate the release of at least a portion of the platelet contents, in particular at least a portion of the alpha granules present in the platelets, as well as the platelet contents such alpha granules, including growth factors, and ensure the production of platelet release. The platelet release usually takes the form of a liquid composition that contains what remains of the activated platelets and the contents of the platelets that were released during the activation step. As a result of this activation step, supraphysiological doses of growth factors and cytokines will be released from the platelets into the composition or solution containing the platelet concentrate, in addition to fibrinogen. This is important because alpha granules usually contain most of the growth factors. Activation of mammalian platelets and their concentrates can be achieved by contacting them with a platelet activator capable of inducing platelet rupture and releasing at least a portion of the contents, including supraphysiological doses of growth factors, cytokines, and chemokines. Suitable activators include aqueous solutions of calcium salts, for example calcium chloride, thrombin, collagen, thromboxane A2 and adenosine diphosphate (ADP). The addition of thrombin causes the formation of a huge clot that contains almost all of the contents of the platelet concentrate. Incubation at about body temperature, about 37° C. for a sufficiently long time, often 3 hours or more, causes the clot to shrink to a negligible size, squeezing out all the growth factors within the trapped platelets. Thus, the present invention achieves a release of a volume of growth factors suspended in plasma that is almost identical to the initial volume of the platelet concentrate, (c) Subjecting the liquid platelet release to fibrinogen removal and isolating the liquid, the release, depleted of fibrinogen. This step actually comprises the steps of isolating the fibrin clot formed after the interaction of the fibrinogen released from the platelets with the activating agent added in the previous step to cause the release of the contents of the platelets. It is advisable to remove fibrinogen, which is released upon platelet activation, to the maximum extent possible from the release, since fibrinogen can lead to the formation of a semi-solid gel, which can cause undesirable consequences when blood plasma that has been platelet-rich (PRP) is additionally applied, for example, to injections into the affected area for injuries of the musculoskeletal system, including tendons, ligaments and joints, or for facial skin rejuvenation or any other treatment. However, the concentration of fibrinogen in platelets is lower than in plasma. The method of the present invention may further comprise the step of separating fibrinogen from the platelet release and recovering the fibrinogen-depleted platelet release for further use.
(d) Подвергание релизата тромбоцитов, обедненного фибриногеном, второй стадии снижения концентрации патогенов для разрушения или инактивации вирусов с оболочкой и выделения водной белковой фазы, содержащей факторы роста. Основной целью этой стадии является подтверждение удаления вирусов с оболочкой, таких как вирус гепатита В с липидной оболочкой, вирусы гепатита С и ВИЧ с оболочкой. Использование двух ортогональных стадий инактивации патогена (стадия а и стадия d), как это сделано в настоящем изобретении, особенно важно, так как оно позволяет достичь инактивации как вирусов без оболочки, так и вирусов с оболочкой, а также инактивации более крупных микроорганизмов, таких как бактерии и паразиты, например, простейшие. При этом способ по настоящему изобретению отвечает основному требованию современных правил биофармацевтической промышленности, касающихся продуктов, полученных из крови. Эта стадия гарантирует, что риск нежелательного взаимодействия с внеклеточными факторами будет минимизирован.(d) Subjecting the fibrinogen-depleted platelet release to a second pathogen reduction step to destroy or inactivate enveloped viruses and isolate an aqueous protein phase containing growth factors. The main purpose of this step is to confirm the removal of enveloped viruses such as lipid-enveloped hepatitis B virus, hepatitis C viruses and enveloped HIV. The use of two orthogonal pathogen inactivation steps (step a and step d), as done in the present invention, is particularly important as it allows inactivation of both non-enveloped and enveloped viruses as well as inactivation of larger microorganisms such as bacteria and parasites, such as protozoa. In doing so, the method of the present invention meets the basic requirement of current biopharmaceutical industry regulations regarding products derived from blood. This stage ensures that the risk of unwanted interaction with extracellular factors is minimized.
(e) Подвергание релизата тромбоцитов, обедненного фибриногеном, стерильной фильтрации с целью удаления любых оставшихся твердых веществ и бактерий и получения жидкости, содержащей факторы роста, или жидкого фильтрата. Поскольку тромбоциты происходят из крови млекопитающих, жидкость или жидкий фильтрат представлен в основном на водной основе или в виде водного раствора, который содержит белковую фазу.(e) Subjecting the fibrinogen-depleted platelet release to sterile filtration to remove any remaining solids and bacteria and obtain a liquid containing growth factors or liquid filtrate. Since platelets are derived from the blood of mammals, the liquid or liquid filtrate is present primarily in an aqueous basis or as an aqueous solution which contains a protein phase.
В вышеописанном способе стадии предпочтительно выполняются последовательно в описанном порядке.In the method described above, the steps are preferably carried out sequentially in the order described.
В дополнение к первой стадии А, которая позволяет достичь инактивации вирусов без оболочки, присутствующих в концентрате тромбоцитов, способ по настоящему изобретению также содержит стадию, на которой инактивируют вирусы с оболочкой, обычно вирусы с липидной оболочкой, которые могут содержаться либо концентрате тромбоцитов, либо в тромбоцитах как таковых. Предпочтительный способ достижения этого заключается в том, что релизат тромбоцитов подвергают воздействию или приводят в контакт с растворителем и/или детергентом с целью растворения липидных мембран, содержащихся в релизате, и разрушения содержащихся в нем нуклеиновых кислот с последующей стадией экстракции, предпочтительно, масляной, с целью удаления растворителя и/или детергента, содержащего растворенные липидные мембраны, и стадию фильтрации для удаления любых оставшихся твердых веществ. Из-за наличия стадий экстракции и фильтрации, вирусы в липидной оболочке, а также другие патогены, такие как бактерии и паразиты, например, простейшие, могут быть инактивированы, а липиды плазмы и тромбоцитов, которые могут содержаться в исходном концентрате тромбоцитов, могут быть удалены. Стадии процесса масляной экстракции и фильтрации позволяют легко, быстро и эффективно подготовить релизат тромбоцитов, содержащий факторы роста, с инактвированными вирусами и бактериями, причем концентрации растворителя и детергента соответствуют пределам, утвержденным регулирующими органами для парентеральных препаратов, полученных из крови.In addition to the first step A, which achieves the inactivation of non-enveloped viruses present in the platelet concentrate, the method of the present invention also comprises the step of inactivating enveloped viruses, usually lipid-enveloped viruses, which can be contained either in the platelet concentrate or in platelets as such. A preferred way of achieving this is that the platelet release is exposed to or brought into contact with a solvent and/or detergent to dissolve the lipid membranes contained in the release and destroy the nucleic acids contained therein, followed by an extraction step, preferably an oily one, with the purpose of removing solvent and/or detergent containing dissolved lipid membranes, and a filtration step to remove any remaining solids. Due to the presence of extraction and filtration steps, lipid-enveloped viruses as well as other pathogens such as bacteria and parasites such as protozoa can be inactivated and plasma and platelet lipids that may be present in the original platelet concentrate can be removed. . The oil extraction and filtration process steps make it easy, fast and efficient to prepare a platelet release containing growth factors with inactivated viruses and bacteria, with solvent and detergent concentrations within the limits approved by regulatory authorities for parenteral products derived from blood.
В настоящем изобретении авторами предложен способ приготовления релизата тромбоцитов, содержащего факторы роста, с помощью которого риск передачи остаточных заболеваний, передаваемых через кровь, неисчислимым фактором, особенно в случае тромбоцитарных продуктов, которые происходят из крови, которая систематически подвергалась удалению лейкоцитов, может быть сведен к минимуму. Удаление лейкоцитов, в частности, приводит к тому, что способность крови к самостоятельной стерилизации теряется в значительной степени и часто полностью теряется. Это важно, поскольку плазма представляет собой оптимальную среду для выживания или роста для широкого спектра патогенов.In the present invention, the authors propose a method for preparing a platelet release containing growth factors, by which the risk of transmission of residual blood-borne diseases by an incalculable factor, especially in the case of platelet products that originate from blood that has been systematically subjected to the removal of leukocytes, can be reduced to minimum. The removal of leukocytes, in particular, results in the blood's ability to sterilize itself to a great extent, and often is completely lost. This is important because plasma represents the optimal survival or growth medium for a wide range of pathogens.
Кроме того, благодаря выбранной комбинации методов инактивации патогенов может быть обеспечена абсолютная безопасность факторов роста, полученных из тромбоцитов с помощью данного изобретения. Поэтому могут быть предоставлены смеси полученных из тромбоцитов факторов роста с инактивированными вирусами, которые могут быть эффективно стандартизированы для использования в терапевтическом лечении, клеточной терапии или культивировании клеток. Двойная стадия инактивации вирусов/патогенов позволяет квалифицировать продукт, полученный по способу согласно данному изобретению, для безопасного использования в клинических исследованиях и выращивания мезенхимальных стволовых клеток для применения in vivo. В результате необходимость использования аутологичных тромбоцитов у пациента с соответствующими ограничениями устраняется. Кроме того, вместо навязывания использования аутологичных тромбоцитов настоящее изобретение открывает возможность использования релизата тромбоцитов, полученного из пула продуктов крови млекопитающих, которые происходят от нескольких субъектов, с минимальным риском передачи заболеваний, передающихся через кровь, которые могут происходить от одного или больше субъектов, от которых получены концентраты тромбоцитов.In addition, thanks to the chosen combination of pathogen inactivation methods, the absolute safety of platelet-derived growth factors using the present invention can be ensured. Therefore, mixtures of platelet-derived growth factors with inactivated viruses can be provided that can be effectively standardized for use in therapeutic treatment, cell therapy or cell culture. The dual virus/pathogen inactivation step allows the product obtained by the method of the present invention to be qualified for safe use in clinical trials and cultivation of mesenchymal stem cells for in vivo use. As a result, the need to use autologous platelets in a patient with appropriate limitations is eliminated. Furthermore, instead of forcing the use of autologous platelets, the present invention opens up the possibility of using a platelet release derived from a pool of mammalian blood products that originate from multiple subjects, with minimal risk of transmission of blood-borne diseases that may originate from one or more subjects from which received platelet concentrates.
Способ согласно настоящему изобретению подходит не только для получения факторов роста, полученных из тромбоцитов человека, но также может использоваться с минимальными корректировками для получения лошадиных факторов роста, полученных из тромбоцитов животных, например, из тромбоцитов лошади с аналогичными медицинскими применениями. Восстановленные лиофилизированные факторы роста, полученные из тромбоцитов, могут быть дополнительно использованы в качестве альтернативы фетальной бычьей сыворотке в среде для культивирования клеток и в выращивании мезенхимальных стволовых клеток.The method of the present invention is not only suitable for the production of growth factors derived from human platelets, but can also be used with minimal modifications for the production of equine growth factors derived from animal platelets, for example, horse platelets with similar medical applications. Reconstituted lyophilized platelet-derived growth factors can additionally be used as an alternative to fetal bovine serum in cell culture media and in the cultivation of mesenchymal stem cells.
Учитывая тот факт, что, частично из-за риска бактериального загрязнения и потери функциональной активности при гемостазе, тромбоциты обычно имеют ограниченный срок хранения 5 или 7 дней, когда клинически используются внутривенно для коррекции количественной или функциональной тромбоцитопении, большое число единиц тромбоцитов старше 5 или 7 дней обычно выбрасывают каждый год. Позволяя использовать запасы тромбоцитов с истекшим сроком годности для приготовления продуктов, полученных из тромбоцитов, таких как релизат тромбоцитов согласно данному изобретению, способ согласно изобретению демонстрирует многообещающий экономический интерес.Given the fact that, due in part to the risk of bacterial contamination and loss of functional activity by hemostasis, platelets typically have a limited shelf life of 5 or 7 days, when clinically used intravenously to correct quantitative or functional thrombocytopenia, a large number of platelet units are older than 5 or 7 days are usually thrown away each year. By allowing expired stocks of platelets to be used for the preparation of platelet-derived products, such as the platelet release of the present invention, the method of the invention shows promising economic interest.
Данное изобретение также позволяет максимизировать количество полученного объема релизата путем выполнения этапов процесса в последовательности, описанной выше. Современные технологии, такие как система Mirasol™, позволяют подвергать большое количество концентратов тромбоцитов, собранных путем ферезиса тромбоцитов, инактивации патогенных микроорганизмов с минимальным риском уменьшения объема собранных тромбоцитов. Путем проведения стадии масляной экстракции только после того, как была проведена первая вирусная инактивация, потеря или уменьшение количества доступного релизата в результате обработок по удалению патогена могут быть сведены к минимуму.The invention also makes it possible to maximize the amount of release volume obtained by performing the process steps in the sequence described above. Modern technologies, such as the Mirasol™ system, allow large amounts of platelet concentrates collected by platelet feresis to be subjected to pathogen inactivation with minimal risk of reduction in the volume of collected platelets. By performing the oil extraction step only after the first viral inactivation has been carried out, loss or reduction in the amount of available release due to pathogen removal treatments can be minimized.
Поскольку можно избежать использования циклов замораживания/оттаивания, настоящее изобретение представляет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что существует минимальный риск того, что содержание в основных белках факторов роста, полученных с ним, таких как альбумин и иммуноглобулины, а также концентрация факторов роста в релизате, отличные от тромбоцитарных факторов роста (PDGF) и факторов роста эндотелия сосудов (VEGF), такие как TGF-B1, EGF и IGF будут испытывать неблагоприятное воздействие.Since the use of freeze/thaw cycles can be avoided, the present invention has the additional advantage that there is a minimal risk that the content of growth factors derived with it, such as albumin and immunoglobulins, in the main proteins, as well as the concentration of growth factors in the release , other than platelet-derived growth factors (PDGF) and vascular endothelial growth factors (VEGF), such as TGF-B1, EGF and IGF will be adversely affected.
В предпочтительном варианте реализации изобретения, содержащий факторы роста релизат тромбоцитов, полученный с помощью способа согласно настоящему изобретению, можно лиофилизировать в сосудах небольшого объема, которые могут быть легко разбавлены до нужной концентрации в одну стадию путем добавления воды или солевого раствора в соответствии с фактическими потребностями. Таким образом, объем предпочтительно выбирается таким, чтобы он содержал количество факторов роста, достаточное для одной обработки. Внутри и между партиями концентрацию факторов роста на сосуд можно стандартизировать, регулируя объем высвобождаемых факторов роста, распределенных в каждом сосуде, в соответствии с начальным количеством тромбоцитов, то есть количеством тромбоцитов, которое подвергается последовательным стадиям (а)-(d), описанным выше. В предпочтительном варианте реализации жидкий фильтрат, полученный на стадии (е) выше, делится на отдельные объемы, причем каждый отдельный объем регулируется таким образом, чтобы он составлял от 2×105 до 2×107 тромбоцитов на см3, предпочтительно около 2×106 тромбоцитов на см см3. При желании, релизат тромбоцитов может быть обогащен определенным набором факторов роста в зависимости от предполагаемого использования. Стандартизируя число факторов роста для каждого сосуда, необходимость изготовления небольших аликвот из большего стокового объема с потенциальным риском загрязнения и потери активности из-за многократных циклов оттаивания и замораживания, которому стоковый объем должен быть подвергнут, чтобы извлечь желаемую небольшую аликвоту, данный риск может быть устранен.In a preferred embodiment of the invention, the growth factor-containing platelet release obtained by the method of the present invention can be lyophilized in small volume vials, which can be easily diluted to the desired concentration in one step by adding water or saline according to actual needs. Thus, the volume is preferably chosen to contain sufficient growth factors for one treatment. Within and between batches, the concentration of growth factors per vessel can be standardized by adjusting the volume of released growth factors distributed in each vessel according to the initial platelet count, i.e. the number of platelets that undergoes the successive steps (a)-(d) described above. In a preferred embodiment, the liquid filtrate obtained in step (e) above is divided into separate volumes, with each separate volume adjusted to be between 2x10 5 and 2x10 7 platelets per cm 3 , preferably about 2x 10 6 platelets per cm cm 3 . If desired, the platelet release may be enriched with a specific set of growth factors, depending on the intended use. By standardizing the number of growth factors for each vessel, the need to make small aliquots from a larger stock volume with the potential risk of contamination and loss of activity due to the multiple thaw and freeze cycles that the stock volume must be subjected to in order to recover the desired small aliquot, this risk can be eliminated. .
Указанная выше формулировка «концентрат тромбоцитов» относится к любой жидкости, биологической или искусственной, которая содержит тромбоциты. Неограничивающие примеры таких жидкостей включают различные формы цельной крови, плазмы крови, плазмы, обогащенной тромбоцитами, концентрированные тромбоциты в любой среде и т.п., полученные из млекопитающих, которые могут быть людьми или животными. Жидкость обычно представлена на водной основе. Таким образом, жидкость может быть аутологичной, или это может быть пул аллогенных жидкостей, которые происходят от нескольких различных субъектов, например, из концентратов тромбоцитов, полученных из афереза или лейкоцитарной пленки, с определенным минимальным содержанием тромбоцитов, обычно готовящихся в банках крови. Обычно производство является стандартизированным производством из аллогенных продуктов с истекшим сроком годности. Концентраты тромбоцитов, как правило, готовят с использованием метода лейкоцитарной пленки, в котором используется цельная кровь, метод БоТП или тромбоциты после афереза, которые получают из хранимых индивидуально донорских порций крови. Использование последнего является предпочтительным, в частности, когда дополнительно производят удаление лейкоцитов перед хранением. Кроме того, концентраты тромбоцитов, которые нельзя переливать из-за того, что они достигли предела хранения в пять-семь дней, могут быть заморожены, храниться и использоваться в качестве дополнения к питательной среде.The above wording "platelet concentrate" refers to any liquid, biological or artificial, that contains platelets. Non-limiting examples of such fluids include various forms of whole blood, blood plasma, platelet rich plasma, concentrated platelets in any medium, and the like, derived from mammals, which may be humans or animals. The fluid is usually water-based. Thus, the fluid may be autologous, or it may be a pool of allogeneic fluids that originate from several different entities, such as platelet concentrates obtained from apheresis or buffy coat, with a certain minimum platelet content, usually prepared in blood banks. Typically, production is standardized production from expired allogeneic products. Platelet concentrates are typically prepared using the buffy coat method, which uses whole blood, the PRP method, or apheresis platelets obtained from individually stored donated blood. The use of the latter is preferred, in particular when additional removal of leukocytes is carried out prior to storage. In addition, platelet concentrates that cannot be transfused because they have reached the five to seven day storage limit can be frozen, stored, and used as a supplement to culture media.
Концентрат тромбоцитов может поддерживаться в плазме или в смеси плазмы и добавочного раствора. Чтобы увеличить срок годности, концентраты тромбоцитов могут состоять из больших пулов замороженных концентратов тромбоцитов.The platelet concentrate may be maintained in plasma or in a mixture of plasma and supplemental solution. To increase shelf life, platelet concentrates may be composed of large pools of frozen platelet concentrates.
Термин «концентрат» или «концентрирование» может относиться к отделению тромбоцитов от массы плазмы, цельной крови или другой жидкости, в которой они присутствуют, но он также может относиться к исходному продукту как таковому, например, ко всей крови или плазме. Центрифугирование, спектрометрия, фильтрация, декантация, гравитационное осаждение или другие методы концентрирования тромбоцитов из жидкостей, содержащих тромбоциты, могут быть использованы для производства концентрата. При концентрировании тромбоцитов может быть желательным применение антикоагулянта (особенно для центрифугирования или гравитационного осаждения) вместе с источником тромбоцитов для предотвращения свертывания во время отделения тромбоцитов от других компонентов крови, плазмы или другой жидкости. Термин «антикоагулянт» относится к составам, которые ингибируют свертывание при концентрировании или сборе тромбоцитов для использования в соответствии с примерами настоящего раскрытия изобретения. Антикоагулянты обычно доступны в качестве ингибиторов синтеза фактора свертывания крови, ингибиторов тромбина или антиагрегантов. Ингибиторы синтеза факторов свертывания, которые ингибируют выработку определенных факторов свертывания в печени, включают такие составы, как варфарин (Coumadin). Ингибиторы тромбина препятствуют свертыванию крови, блокируя активность тромбина, и включают такие составы, как гепарин и лепирудин (Refludan). Антиагрегантные препараты взаимодействуют с самими тромбоцитами и включают такие препараты, как аспирин, тиклопидин (Ticlid), клопидогрел (Plavix), тирофибан (Aggrastat), эптифибатид (Integrilin) и др.The term "concentrate" or "concentration" may refer to the separation of platelets from a mass of plasma, whole blood, or other fluid in which they are present, but it may also refer to the original product as such, such as whole blood or plasma. Centrifugation, spectrometry, filtration, decantation, gravity settling, or other methods of concentrating platelets from platelet-containing fluids can be used to produce a concentrate. When concentrating platelets, it may be desirable to use an anticoagulant (especially for centrifugation or gravity settling) along with a source of platelets to prevent clotting during separation of platelets from other components of blood, plasma, or other fluid. The term "anticoagulant" refers to compounds that inhibit clotting when concentrating or collecting platelets for use in accordance with examples of the present disclosure. Anticoagulants are commonly available as clotting factor synthesis inhibitors, thrombin inhibitors, or antiplatelet agents. Coagulation factor synthesis inhibitors that inhibit the production of certain clotting factors in the liver include compounds such as warfarin (Coumadin). Thrombin inhibitors interfere with blood clotting by blocking thrombin activity and include compounds such as heparin and lepirudin (Refludan). Antiplatelet drugs interact with platelets themselves and include drugs such as aspirin, ticlopidine (Ticlid), clopidogrel (Plavix), tirofiban (Aggrastat), eptifibatide (Integrilin), and others.
В приведенном выше описании термин «релизат тромбоцитов» относится к композиции, получаемой, когда концентрат тромбоцитов подвергают стадии активации, и содержимое, высвобождаемое тромбоцитами, выделяют, как было описано выше, на конкретной стадии b, как описано выше.In the above description, the term "platelet release" refers to the composition obtained when the platelet concentrate is subjected to the activation step and the content released by the platelets is isolated as described above, in specific step b as described above.
Указанное выше «подвергание концентрата тромбоцитов стадии активации или обработке активатором» означает разрушение тромбоцитов путем разрушения их клеточной мембраны для стимулирования высвобождения тромбоцитами содержимого своих гранул, в частности альфа-гранул, содержащихся в тромбоцитах. Активированные тромбоциты могут высвобождать большое количество содержащихся в них соединений, белков, клеточных микровезикул, например, микрочастиц, полученных из плазматической мембраны, экзосом, факторов роста, таких как VEGF, bFGF, PDGF, TGF-B и других цитокинов. Это может быть выполнено химически, механически, путем жидкостной гомогенизации, обработки ультразвуком или лизирования. В соответствии с данным изобретением активация предпочтительно осуществляется путем контактирования концентрата тромбоцитов с активирующим агентом, поскольку это позволяет максимизировать высвобождение содержимого тромбоцитов в жидкий релизат тромбоцитов. Подходящие лизирующие агенты включают растворы тромбина, коллагена, тромбоксана А2 или АДФ и соли кальция или смесь двух или более указанных веществ. Примером подходящей соли кальция является хлорид кальция. Однако любые другие лизирующие агенты, которые квалифицированный специалист считает подходящими, также могут быть использованы.The above "subjecting the platelet concentrate to an activation step or treatment with an activator" means the destruction of platelets by destroying their cell membrane to stimulate the release of the contents of their granules, in particular the alpha granules contained in platelets, by the platelets. Activated platelets can release a large amount of their compounds, proteins, cellular microvesicles such as plasma membrane-derived microparticles, exosomes, growth factors such as VEGF, bFGF, PDGF, TGF-B and other cytokines. This can be done chemically, mechanically, by liquid homogenization, sonication or lysis. In accordance with the present invention, activation is preferably carried out by contacting the platelet concentrate with an activating agent, since this maximizes the release of the platelet contents into the liquid platelet release. Suitable lysing agents include solutions of thrombin, collagen, thromboxane A2 or ADP and calcium salts, or a mixture of two or more of these. An example of a suitable calcium salt is calcium chloride. However, any other lysing agents deemed appropriate by the skilled artisan may also be used.
Механический лизис может, например, проводиться с использованием цикла замораживания-оттаивания, замораживания суспензии тромбоцитов и затем оттаивания материала до температуры выше комнатной, например, от 30°С до 45°С. Этот метод заставляет клетки набухать и разрушаться по мере образования кристаллов льда с последующим сжатием при оттаивании. В результате циклического набухания и сжатия тромбоциты открываются. В зависимости от количества циклов замораживания-оттаивания может быть достигнута различная степень цитолиза тромбоцитов, например, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 90% или до 100% цитолиза по подсчету тромбоцитов. В рамках настоящего изобретения может рассматриваться механическое лизирование, но предпочтительно обходиться без него из-за предполагаемой потери качества высвобождения.Mechanical lysis can, for example, be carried out using a freeze-thaw cycle, freezing the platelet suspension and then thawing the material to a temperature above room temperature, for example, from 30°C to 45°C. This method causes cells to swell and collapse as ice crystals form, followed by contraction when thawed. As a result of cyclic swelling and contraction, platelets open. Depending on the number of freeze-thaw cycles, varying degrees of platelet cytolysis can be achieved, e.g., at least 30%, at least 50%, at least 70%, at least 90%, or up to 100% cytolysis by platelet count. Mechanical lysis may be considered within the scope of the present invention, but is preferably omitted due to the perceived loss in release quality.
В рамках данного изобретения «лиофилизированные релизаты тромбоцитов» включают в себя «лиофилизированные релизаты плазмы, обогащенной тромбоцитами» или «LPRRL» в качестве специфического типа лиофилизированных релизатов тромбоцитов, но не ограничиваются указанными.As used herein, "lyophilized platelet releases" include, but are not limited to, "lyophilized platelet-rich plasma releases" or "LPRRL" as a specific type of lyophilized platelet releases.
В рамках настоящего изобретения «антикоагулянт» представляет собой композицию, которая ингибирует свертывание при концентрировании или сборе тромбоцитов для применения в соответствии с настоящим изобретением. Антикоагулянты, как правило, доступны в виде комплексообразующих/хелатирующих агентов с ионами кальция, ингибиторов синтеза факторов свертывания, ингибиторов тромбина или антиагрегантов. Ингибиторы синтеза факторов свертывания, которые ингибируют выработку определенных факторов свертывания в печени, включают такие составы, как варфарин (Coumadin). Ингибиторы тромбина включают такие составы, как гепарин и лепирудин (Refludan). Антиагрегантные препараты взаимодействуют с самими тромбоцитами и включают такие препараты, как аспирин, тиклопидин (Ticlid), клопидогрел (Plavix), тирофибан (Aggrastat), эптифибатид (Integrilin) и др.In the context of the present invention, an "anticoagulant" is a composition that inhibits clotting upon concentration or collection of platelets for use in accordance with the present invention. Anticoagulants are generally available as calcium complexing/chelating agents, clotting factor synthesis inhibitors, thrombin inhibitors, or antiplatelet agents. Coagulation factor synthesis inhibitors that inhibit the production of certain clotting factors in the liver include compounds such as warfarin (Coumadin). Thrombin inhibitors include formulations such as heparin and lepirudin (Refludan). Antiplatelet drugs interact with platelets themselves and include drugs such as aspirin, ticlopidine (Ticlid), clopidogrel (Plavix), tirofiban (Aggrastat), eptifibatide (Integrilin), and others.
Ультрафиолетовое облучение, проводимое на стадии а способа по настоящему изобретению, предпочтительно включает воздействие на релизат тромбоцитов облучения УФА, предпочтительно воздействие УФА-излучения с плотностью энергии от 1 до 10 Дж/см2, более предпочтительно около 3 Дж/см2. Воздействие ультрафиолетового излучения предпочтительно проводить после инкубации релизата тромбоцитов с фотохимическим агентом, в частности псораленом, в частности амотосаленом, или рибофлавином.The ultraviolet irradiation carried out in step a of the method of the present invention preferably comprises exposing the platelet release to UVA irradiation, preferably exposure to UVA radiation with an energy density of 1 to 10 J/cm 2 , more preferably about 3 J/cm 2 . Exposure to ultraviolet radiation is preferably carried out after incubation of the platelet release with a photochemical agent, in particular psoralen, in particular amotosalen, or riboflavin.
На стадии d способа согласно данному изобретению, где релизат тромбоцитов приводят в контакт с растворителем и/или детергентом для растворения мембраны вирусов с оболочкой или других патогенов, предпочтительно использовать растворитель для инкубации концентрата тромбоцитов, выбранный из группы ди- или триалкилфосфатов и предпочтительно представляет собой три-н-бутилфосфат.Подходящие детергенты для использования на стадии d способа по данному изобретению включают детергенты, выбранные из группы полиоксиэтиленовых производных жирных кислот, частичных сложных эфиров ангидридов сорбита, неионных детергентов, дезоксихолата натрия и сульфобетаинов, и предпочтительно представляют собой Triton Х-45, Triton Х-100 или Tween 80.In step d of the method according to the invention, where the platelet release is brought into contact with a solvent and/or detergent to dissolve the membrane of enveloped viruses or other pathogens, it is preferred to use a platelet concentrate incubation solvent selected from the group of di- or trialkyl phosphates and is preferably three -n-butyl phosphate. Suitable detergents for use in step d of the process of this invention include detergents selected from the group of polyoxyethylene fatty acid derivatives, partial esters of sorbitol anhydrides, non-ionic detergents, sodium deoxycholate and sulfobetaines, and are preferably Triton X-45, Triton X-100 or Tween 80.
Количество масла, используемого на последующей стадии экстракции для удаления растворителя и/или детергента и растворенных в нем компонентов, может варьироваться в широком диапазоне, но предпочтительно количество масла составляет от 2 до 20 мас. %, Предпочтительно от 5 до 15 мас. %, Более предпочтительно от 5 до 10 мас. %, В расчете на общий объем смеси концентрата тромбоцитов и растворителя и/или детергента. Таким образом, предпочтительно использовать масло фармацевтического качества, например, касторовое масло. В процессе экстракции обычно к определенному объему релизата тромбоцитов добавляют определенный объем масла и встряхивают в смесителе крови в течение определенного периода времени, обычно 30, 20 или 15 минут или менее. После этого контейнер, в котором проводится экстракция, может быть установлен в перевернутом положении на определенный период времени, например, 10 минут или менее, или дольше, чтобы получить верхнюю масляную фазу и нижнюю фазу релизата тромбоцитов, которая отделена гравитацией от верхней фазы. Этот этап может повторяться один или два, или более раз, в зависимости от эффективности экстракции.The amount of oil used in the subsequent extraction step to remove the solvent and/or detergent and components dissolved therein can vary over a wide range, but preferably the amount of oil is from 2 to 20 wt. %, Preferably from 5 to 15 wt. %, More preferably from 5 to 10 wt. % Based on the total volume of the mixture of platelet concentrate and solvent and/or detergent. Thus, it is preferable to use a pharmaceutical grade oil such as castor oil. In the extraction process, usually a certain volume of platelet release is added to a certain volume of oil and shaken in a blood mixer for a certain period of time, usually 30, 20 or 15 minutes or less. After that, the container in which the extraction is carried out can be set upside down for a certain period of time, for example, 10 minutes or less, or longer, to obtain an upper oil phase and a lower platelet release phase, which is separated by gravity from the upper phase. This step may be repeated one or two or more times, depending on the efficiency of the extraction.
Способ согласно настоящему изобретению может включать после стадии экстракции е по меньшей мере одну стадию центрифугирования для отделения тромбоцитов от масляной и водной белковой фазы. Обычно релизат тромбоцитов подвергают центрифугированию при низкой температуре, обычно ниже 10°С, предпочтительно ниже 5°С, обычно около 4°С, предпочтительно в перевернутом положении для отделения любых остатков масла в верхней фазе и релизата тромбоцитов в нижней фазе, которая образуется под действием силы тяжести.The method according to the present invention may include, after the extraction step e, at least one centrifugation step to separate the platelets from the oily and aqueous protein phase. Typically, platelet release is subjected to low temperature centrifugation, typically below 10°C, preferably below 5°C, typically around 4°C, preferably in an inverted position to separate any residual oil in the upper phase and platelet release in the lower phase, which is formed by the action of gravity.
Способ согласно настоящему изобретению может включать в себя после стадии фильтрации е стадию лиофилизации для продления срока хранения релизата тромбоцитов. Перед осущетсвлением лиофилизации, жидкость или жидкий фильтрат, полученный на этапе е, может быть разделен на несколько объемов, причем объем регулируется таким образом, чтобы каждый объем содержал релизат заданного количества тромбоцитов на см3, например релизат примерно из 2×105 до 2×107 тромбоцитов, более предпочтительно релизат из около 2×106 тромбоцитов на см3, но специалист может выбрать любую другую концентрацию тромбоцитов. Продукт, полученный способом согласно данному изобретению, сочетает в себе характеристики лиофилизации в разумных объемах, которые подходят для немедленного использования, не требуя дальнейшего разделения на подходящие аликвоты, с простотой хранения и восстановления и низким содержанием фибриногена.The method of the present invention may include, after a filtration step, a lyophilization step to extend the shelf life of the platelet release. Before performing lyophilization, the liquid or liquid filtrate obtained in step e may be divided into several volumes, the volume being adjusted so that each volume contains a release of a given number of platelets per cm 3 , for example a release of about 2×10 5 to 2× 10 7 platelets, more preferably a release of about 2×10 6 platelets per cm 3 , but any other concentration of platelets may be chosen by the skilled person. The product obtained by the method of this invention combines reasonable volume freeze-drying characteristics that are suitable for immediate use without requiring further division into suitable aliquots, with ease of storage and reconstitution, and low fibrinogen content.
В предпочтительном варианте реализации для достижения криозащиты факторов роста перед лиофилизацией человеческий альбумин добавляют в жидкий фильтрат, полученный на стадии е.In a preferred embodiment, to achieve cryoprotection of the growth factors, before lyophilization, human albumin is added to the liquid filtrate obtained in step e.
В рамках данного изобретения «лиофилизация» относится к процессу сушки вымораживанием или дегидратации, который часто используется для консервирования тромбоцитов. Лиофилизация, однако, может также использоваться не только в качестве консервирующего процесса, но также и в качестве воздействия для лизиса тромбоцитов, чтобы дополнительно лизировать тромбоциты после того, как проводится первоначальная заморозка-оттаивание или другой метод лизиса. Другими словами, в соответствии с примерами настоящего раскрытия изобретения, после того, как релизаты образуются, как описано здесь, лиофилизация обеспечивает дополнительное преимущество сохранения факторов роста, цитокинов, хемокинов и другого содержимого, первоначально заключенного внутри или связанного с поверхностью тромбоцитов, но которые высвобождаются, когда тромбоциты лизируются, как описано здесь, например, через заморозку-оттаивание. Процесс обычно осуществляется замораживанием материала и снижением окружающего давления, чтобы позволить замерзшей воде в материале сублимироваться непосредственно из твердой фазы в газовую фазу.As used herein, "lyophilization" refers to a freeze-drying or dehydration process that is often used to preserve platelets. Lyophilization, however, can also be used not only as a preservative process, but also as a platelet lysis treatment to further lyse platelets after the initial freeze-thaw or other lysis method is performed. In other words, in accordance with the examples of the present disclosure, after the releases are formed as described here, freeze-drying provides the additional benefit of preserving growth factors, cytokines, chemokines and other contents originally contained within or associated with the surface of platelets, but which are released, when the platelets are lysed, as described here, for example, via freeze-thaw. The process is usually carried out by freezing the material and reducing the ambient pressure to allow the frozen water in the material to sublimate directly from the solid phase to the gas phase.
При желании концентрат тромбоцитов может быть подвергнут стадии удаления лейкоцитов перед тем, как подвергнуть тромбоциты стадии активации, чтобы стимулировать высвобождение их содержимого. Удаление лейкоцитов в основном направлено на снижение риска возникновения нежелательных осложнений, связанных с переливаемыми лейкоцитами, представленными в единицах эритроцитов и тромбоцитов.If desired, the platelet concentrate may be subjected to a leukocyte removal step prior to subjecting the platelets to an activation step to stimulate the release of their contents. The removal of leukocytes is mainly aimed at reducing the risk of unwanted complications associated with transfused leukocytes, presented in units of erythrocytes and platelets.
Способ согласно настоящему изобретению предназначен для приготовления лизата тромбоцитов, обедненных фибриногеном, обогащенного факторами роста, из концентрата тромбоцитов млекопитающих, который может представлять собой тромбоциты человека или животных, например, тромбоциты лошади. Релизат может быть лиофилизирован или не лиофилизирован.The method of the present invention is for preparing a fibrinogen-depleted platelet lysate enriched in growth factors from a mammalian platelet concentrate, which may be human or animal platelets, eg horse platelets. The release may or may not be lyophilized.
Релизаты тромбоцитов, полученные способом согласно данному изобретению, можно применять для лечения ран, язв или ожогов. Релизаты тромбоцитов могут применяться в сухом виде или быть регидротированными перед применением или в виде геля. Альтернативно, даже если кожа не повреждена раной, язвой или ожогом, ее можно применять для восстановления других типов повреждений, возникающих в результате старения, фотоповреждения, патологического или дегенеративного заболевания, или тому подобного. Концентрация тромбоцитов в релизате, полученном способом согласно данному изобретению, может варьироваться в широких пределах, но предпочтительно концентрация настолько высока, насколько это возможно, для достижения максимального эффекта.The platelet releases obtained by the method of this invention can be used to treat wounds, ulcers or burns. Platelet releases can be applied dry or rehydrated prior to use or as a gel. Alternatively, even if the skin is not damaged by a wound, ulcer, or burn, it can be used to repair other types of damage resulting from aging, photodamage, pathological or degenerative disease, or the like. The concentration of platelets in the release obtained by the method according to this invention may vary widely, but preferably the concentration is as high as possible to achieve maximum effect.
Вышеупомянутый термин «рана» относится к любому повреждению любой ткани субъекта, включая повреждение кожи, а также повреждение более глубоких тканей. Таким образом, рана может быть получена случайно или преднамеренно, или могла быть получена в следствие нормального течения патологического, болезненного или дегенеративного состояния. Например, повреждение может быть результатом травмы или операции. Неограничивающие примеры травм включают язвы, ожоги, переломы костей, проколы, порезы и царапины, рваные раны, хирургические разрезы, воспаление, инфекцию, и тому подобное.The above term "wound" refers to any damage to any tissue of the subject, including damage to the skin, as well as damage to deeper tissues. Thus, the wound may have been caused accidentally or intentionally, or may have been received as a consequence of the normal course of a pathological, diseased, or degenerative condition. For example, the injury may be the result of an injury or surgery. Non-limiting examples of injuries include ulcers, burns, bone fractures, punctures, cuts and scrapes, lacerations, surgical incisions, inflammation, infection, and the like.
Релизаты тромбоцитов могут быть введены с использованием способов введения, известных специалисту, включая использование жидкостей, аэрозолей, спреев, туманов, лосьонов, кремов, мазей, гелей, камедей, распыляемых капель или порошков, дозирующих флаконов, предварительно пропитанной ткани, шприцов, повязок, кожных пластырей или пластырей и т.д. В предпочтительном варианте реализации изобретения релизат тромбоцитов, полученный способом согласно данному изобретению, может храниться в стабильной форме в наборе для применения в чрезвычайных ситуациях для лечения ран. Релизат тромбоцитов может быть восстановлен для немедленного применения при необходимости. В другом аспекте настоящее изобретение относится к аэрозолю, лечебному средству, спрею, туману, лосьону, крему, мази, гелю, камеди, повязке, кожному пластырю, пластырю, содержащему релизат тромбоцитов, содержащий факторы роста, полученный с помощью способа согласно настоящему изобретению.Platelet releases may be administered using administration methods known to those skilled in the art, including the use of liquids, aerosols, sprays, mists, lotions, creams, ointments, gels, gums, spray drops or powders, dosage vials, pre-impregnated tissue, syringes, dressings, skin patches or patches, etc. In a preferred embodiment of the invention, the platelet release obtained by the method of this invention may be stored in a stable form in a wound care emergency kit. Platelet release can be reconstituted for immediate use if needed. In another aspect, the present invention relates to an aerosol, therapeutic agent, spray, mist, lotion, cream, ointment, gel, gum, dressing, skin patch, patch containing platelet release containing growth factors obtained using the method according to the present invention.
Релизаты тромбоцитов, полученные способом согласно данному изобретению, могут содержать повышенные количества факторов роста, цитокинов, хемокинов и т.д. Примеры факторов роста и других веществ, которые могут присутствовать в рилизате, включают, без ограничения, PDGF, PDAF, VEGF, PDEGF, PF-4, TGF-B, FGF-A, FGF-B, TGF-A, IGF-1, IGF-2, BTG, TSP, vWF, PAI-1, IgG, IgM, IgA, KGF, EGF, FGF, TNF, IL-1, KGF-2, фибринопептид А, фибриноген, альбумин, остеонектин, gro-alpha, витронектин, D-димер фибрина, фактор V, антитромбин III, макроглобулин а2, антиогенин, Fg-D и эластазу. Более подробно, факторы роста, цитокины или тому подобное, которые могут присутствовать и включают в себя, без ограничения, LIF, противоопухолевые факторы роста, такие как IGFBP3, эйкозаноиды, такие как PGs или лейкотриены, IL-1 TNF альфа, INFs, TNF-a IL-6, IL-1 (a/b), метаболиты простаноидов, компоненты комплемента, активные формы кислорода в промежуточных соединениях, метаболиты арахидоновой кислоты, факторы свертывания крови, нитраты и хемокины. Факторы роста, полученные от человека, хемокины, цитокины и гормоны могут включать альфа дефензин, альфа синуклеин, бета синуклеин, 4-1 BBL, 6Ckine, кислый FGF, активин А, активин Rib, ангиопоэтин 2, B-DNF, BAFF, ВСА-1, ВСА-1, BD-1, ВМР-2, ВМР-4, ВМР-7, BMPRA1, BDNF, CNTF, CTGF, CTI_A-4Fc, CXCL1, CXCL2, кардиотрофин-1, Cripto, Cystatin С, Dkk-1, EGF AOF, EGF, EMAPII, ENA-78, EPO, Эотаксин, основной FGF AOF, FGF-10, FGF-16, FGF 17, FGF 18, FGF19, FGF4, FGF6, FGF7, FGF8, FGF8b, FGF9, Flt3, G-CSF, GDNF, GMCSF, HGF, HGH, IFN alpha A, IFN alpha A/D, IFN alpha D, IFN alpha a2b, IFN, beta 1A, IFN-gamma, IGF1, IGFil, IGFBP-4, IGFBP6, ILI alpha, IL-lBeta, НЛО, IL11, IL12, НЛЗ, IL15, IL17, IL17A. IL17F, IL18, IL19, IL2, IL20, IL21, IL23, IL28A, IL28B, IL29, IL3, IL31, IL33, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IT AC, KGF2, Калликреин 1 1, Калликреин 4, Калликреин 7, LEFTY-A, LIF, лептин, MCSF AOF, MCSF, MCP- 1, MCP2, МСРЗ, MCP4, MDC, MIG, MFP1 alpha, MIP1 beta, MIP3 alpha, MIP3 beta, MIP4, MIP5, мидкин, NAP2, NT3, NT4, Neurotactin, нейротурин, онкостатин, остеопротегрин, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PTN, лиганд Rank, рецептор Rank, RANTES< SCF, SCFAOF, SDF-1 alpha, SDF-1 Beta, CD4, CD40L, TNF-RI, TNFRII, TARO, TECK, TGF alpha, TGF1 Betal, TGF Beta2, TGF Beta3, TNF beta/лимфотоксин, TNF-alpha, TPO, TRAIL, TWEAK, и VEGF.Platelet releases obtained by the method of this invention may contain increased amounts of growth factors, cytokines, chemokines, etc. Examples of growth factors and other substances that may be present in rilizat include, without limitation, PDGF, PDAF, VEGF, PDEGF, PF-4, TGF-B, FGF-A, FGF-B, TGF-A, IGF-1, IGF-2, BTG, TSP, vWF, PAI-1, IgG, IgM, IgA, KGF, EGF, FGF, TNF, IL-1, KGF-2, fibrinopeptide A, fibrinogen, albumin, osteonectin, gro-alpha, vitronectin , fibrin D-dimer, factor V, antithrombin III, macroglobulin a2, antiogenin, Fg-D and elastase. In more detail, growth factors, cytokines, or the like, which may be present and include, but are not limited to, LIF, antitumor growth factors such as IGFBP3, eicosanoids such as PGs or leukotrienes, IL-1 TNF alpha, INFs, TNF- a IL-6, IL-1 (a/b), prostanoid metabolites, complement components, reactive oxygen species in intermediates, arachidonic acid metabolites, coagulation factors, nitrates and chemokines. Human derived growth factors, chemokines, cytokines and hormones may include alpha defensin, alpha synuclein, beta synuclein, 4-1 BBL, 6Ckine, acidic FGF, activin A, activin Rib, angiopoietin 2, B-DNF, BAFF, BCA- 1, BCA-1, BD-1, BMP-2, BMP-4, BMP-7, BMPRA1, BDNF, CNTF, CTGF, CTI_A-4Fc, CXCL1, CXCL2, cardiotrophin-1, Cripto, Cystatin C, Dkk-1 , EGF AOF, EGF, EMAPII, ENA-78, EPO, Eotaxin, basic FGF AOF, FGF-10, FGF-16, FGF 17, FGF 18, FGF19, FGF4, FGF6, FGF7, FGF8, FGF8b, FGF9, Flt3, G-CSF, GDNF, GMCSF, HGF, HGH, IFN alpha A, IFN alpha A/D, IFN alpha D, IFN alpha a2b, IFN, beta 1A, IFN-gamma, IGF1, IGFil, IGFBP-4, IGFBP6, ILI alpha, IL-lBeta, UFO, IL11, IL12, NLZ, IL15, IL17, IL17A. IL17F, IL18, IL19, IL2, IL20, IL21, IL23, IL28A, IL28B, IL29, IL3, IL31, IL33, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IT AC, KGF2, Kallikrein 1 1, Kallikrein 4, Kallikrein 7, LEFTY-A, LIF, leptin, MCSF AOF, MCSF, MCP-1, MCP2, MCRP, MCP4, MDC, MIG, MFP1 alpha, MIP1 beta, MIP3 alpha, MIP3 beta, MIP4, MIP5, midkin, NAP2, NT3, NT4, Neurotactin, neuroturin, oncostatin, osteoprotegrin, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PTN, Rank ligand, Rank receptor, RANTES< SCF, SCFAOF, SDF-1 alpha, SDF-1 Beta, CD4, CD40L, TNF-RI, TNFRII, TARO, TECK, TGF alpha, TGF1 Betal, TGF Beta2, TGF Beta3, TNF beta/lymphotoxin, TNF-alpha, TPO, TRAIL, TWEAK, and VEGF.
Релизат тромбоцитов, полученный способом согласно настоящему изобретению, имеет два основных назначения, в которых он показал значительную ценность, хотя его можно использовать и для других назначений. Первым назначением является его прменение в качестве терапевтического средства для усиления пролиферации клеток множественных линий в регенеративной медицине и в лечении незаживающих ран и резистентных язв. Использованный в этих применениях релизат тромбоцитов, содержащий факторы роста, получали из тромбоцитов человека или лошади. Релизат тромбоцитов, полученный способом согласно данному изобретению, может также использоваться в средах для культивирования клеток, в частности стволовых клеток, фибробластов или дендритных клеток. Вторым назначением является замена фетальной бычьей сыворотки в клеточных культуральных средах. Релизаты тромбоцитов с низким содержанием фибриногена, позволяют избежать нежелательных эффектов гелеобразования, а подвергание релизата двум стадиям удаления патогенов/вирусов обеспечивает безопасность продукта. В результате, аутологичные концентраты тромбоцитов больше не являются необходимостью, и концентрат тромбоцитов млекопитающих, который используется в способе согласно данному изобретению, может содержать пул тромбоцитов, которые происходят от различных млекопитающих субъектов.The platelet release produced by the method of the present invention has two main uses in which it has shown significant value, although it can be used for other uses as well. Its first use is as a therapeutic agent to enhance the proliferation of multiple cell lines in regenerative medicine and in the treatment of non-healing wounds and resistant ulcers. The platelet release containing growth factors used in these applications was derived from human or horse platelets. The platelet release obtained by the method of the invention can also be used in cell culture media, in particular stem cells, fibroblasts or dendritic cells. The second purpose is to replace fetal bovine serum in cell culture media. Platelet releases with low fibrinogen content avoid unwanted gelation effects, and subjecting the release to two stages of pathogen/virus removal ensures product safety. As a result, autologous platelet concentrates are no longer a necessity, and the mammalian platelet concentrate used in the method of this invention may contain a pool of platelets that originate from various mammalian subjects.
Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется приведенным ниже примером.The present invention is further illustrated by the following example.
ПРИМЕР 1EXAMPLE 1
Человек был подключен к устройству для ферезиса (HaemoneticsLICS +9000а) для получения обогащенного тромбоцитами концентрата, с количеством тромбоцитов в 3-5 раз превышающим начальное количество тромбоцитов. Обогащенный тромбоцитами концентрат инкубировали с рибофлавином и облучали ультрафиолетовыми лучами с помощью системы MIRASOL™ в качестве первой стадии снижения количества патогенов. После этого, стерильный Тромбинь был добавлен в подходящей концентрации 500 единиц/м3/мин для активации тромбоцитов в указанном концентрате. Это привело к последующему высвобождению из гранул тромбоцитов надфизиологических доз факторов роста и цитокинов. Кроме того, активированные тромбоциты высвобождают содержащийся в альфа-гранулах фибриноген, который активируется тромбином с образованием нерастворимого сгустка. При центрифугировании концентрат тромбоцитов, обработанный тромбином, разделился на супернатант, содержащий прозрачную светло-красную жидкость или жидкость, которая состоит в основном из лизированных тромбоцитов, содержимое которых представляет собой сверхфизиологические дозы факторов роста, высвобождаемых из гранул тромбоцитов, и отложение нерастворимого фибринового сгустка. Супернатант переносили в новый контейнер для дальнейших этапов подготовки. Релизат тромбоцитов обрабатывали системой растворителей и детергентов (0,3% TNBPc и 1% tween 20d) в течение 1 часа при 31°С. Этот шаг способен разрушить вирусы с оболочкой (в основном, НВС, HCV и ВИЧ).После этого растворитель и детергент удаляли тремя последовательными стадиями экстракции с помощью растительного масла. Стерильное касторовое масло (7,5% от общего объема) добавляли к релизату тромбоцитов, и смесь встряхивали в смесителе крови в течение 15 минут, затем контейнер устанавливали в перевернутом положении в течение 10 минут для получения верхней масляной фазы и нижней фазы лизата тромбоцитов, которая отделена силой тяжести от верхней фазы. Этот этап повторяли еще два раза, затем релизат тромбоцитов центрифугировали в течение 20 минут при 4°С и 1500g в перевернутом положении, чтобы разделить остатки масла в верхней фазе и релизат тромбоцитов в нижней фазе, которая образуется под действием силы тяжести.The person was connected to a pheresis device (Haemonetics LICS +9000a) to produce a platelet-enriched concentrate with platelet counts 3-5 times the initial platelet count. The platelet-rich concentrate was incubated with riboflavin and irradiated with ultraviolet light using the MIRASOL™ system as a first step in pathogen reduction. Thereafter, sterile Thrombin was added at the appropriate concentration of 500 units/m 3 /min to activate the platelets in said concentrate. This led to the subsequent release of supraphysiological doses of growth factors and cytokines from platelet granules. In addition, activated platelets release fibrinogen contained in alpha granules, which is activated by thrombin to form an insoluble clot. Upon centrifugation, the thrombin-treated platelet concentrate separated into a supernatant containing a clear light red liquid or a liquid that consists mainly of lysed platelets, the contents of which are superphysiological doses of growth factors released from platelet granules, and the deposition of an insoluble fibrin clot. The supernatant was transferred to a new container for further preparation steps. The platelet release was treated with a system of solvents and detergents (0.3% TNBPc and 1% tween 20d) for 1 hour at 31°C. This step is able to destroy enveloped viruses (mainly HBC, HCV and HIV). Thereafter, the solvent and detergent were removed by three successive vegetable oil extraction steps. Sterile castor oil (7.5% of total volume) was added to the platelet release and the mixture was shaken in a blood mixer for 15 minutes, then the container was set upside down for 10 minutes to obtain an upper oil phase and a lower platelet lysate phase, which separated by gravity from the upper phase. This step was repeated two more times, then the platelet release was centrifuged for 20 minutes at 4°C and 1500g inverted to separate the remaining oil in the upper phase and the platelet release in the lower phase, which is formed by gravity.
Затем релизат тромбоцитов подвергали этапу стерильной фильтрации для обеспечения удаления любых бактериальных возбудителей, а затем жидкость или жидкий фильтрат распределяли в заранее определенные объемы (регулируется в соответствии с начальным количеством тромбоцитов концентрата, чтобы обеспечить эквивалент около 1 млн тромбоциты на см3) в стеклянные сосуды и лиофилизировали такой фильтрат, который состоял в основном из факторов роста, полученных из тромбоцитов.The platelet release was then subjected to a sterile filtration step to ensure the removal of any bacterial pathogens, and then the liquid or liquid filtrate was dispensed in predetermined volumes (adjusted according to the concentrate's initial platelet count to provide the equivalent of about 1 million platelets per cm 3 ) into glass vials and lyophilized such a filtrate, which consisted mainly of growth factors derived from platelets.
ПРИМЕР 2EXAMPLE 2
Релизат тромбоцитов, полученный в примере 1, использовали для достижения омоложения лица. Одну ампулу, которая была получена из 2×106 тромбоцитов, вводили с каждой стороны лица женщины в подбородок, щеку и носогубные складки. Покраснение, боль и отек были значительно уменьшены. Восстановительный эффект длился не менее 6 месяцев.The platelet release obtained in Example 1 was used to achieve facial rejuvenation. One ampoule, which was prepared from 2×10 6 platelets, was injected from each side of the woman's face into the chin, cheek and nasolabial folds. Redness, pain and swelling were significantly reduced. The recovery effect lasted at least 6 months.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ЭКСПЕРИМЕНТCOMPARATIVE EXPERIMENT
Объем, содержащий 2×106 аутологичных тромбоцитов, вводили с каждой стороны лица женщины, страдающей теми же дефектами, что и в примере 2. Покраснение, боль и отек были уменьшены только в ограниченной степени.A volume containing 2×10 6 autologous platelets was injected on each side of the face of a woman suffering from the same defects as in Example 2. Redness, pain and swelling were only reduced to a limited extent.
ПРИМЕР 3EXAMPLE 3
Релизат тромбоцитов, полученный в примере 1, использовали для облегчения боли при лечении боли в пояснице. Две ампулы, которые были получены из 2×106 тромбоцитов, были введены в нижнюю часть спины. Боль могла быть значительно уменьшена. Лечение повторили через неделю, инъекцией одной ампулы. Восстановительный эффект длился несколько месяцев.The platelet release obtained in Example 1 was used for pain relief in the treatment of low back pain. Two ampoules, which were obtained from 2×10 6 platelets, were injected into the lower back. The pain could be greatly reduced. The treatment was repeated a week later, with an injection of one ampoule. The recovery effect lasted several months.
ПРИМЕР 4EXAMPLE 4
Релизат тромбоцитов, полученный в примере 1, вводили в гидрогелевую повязку из альгината натрия коллагена и наносили на диабетические язвы, которые не заживали в течение более чем 6 месяцев. В течение нескольких дней было достигнуто значительное заживление ран.The platelet release obtained in Example 1 was injected into a collagen sodium alginate hydrogel dressing and applied to diabetic ulcers that had not healed for more than 6 months. Significant wound healing was achieved within a few days.
ПРИМЕР 5EXAMPLE 5
Релизат тромбоцитов готовили по методике примера 1, на этот раз с использованием крови лошади. Две ампулы, каждая из которых была получена из 2×106 тромбоцитов, вводили инъекционно в поврежденную мышцу лошади. Лечение повторяли через неделю. Мышца зажила без следов травмы.The platelet release was prepared as described in Example 1, this time using horse blood. Two ampoules, each prepared from 2×10 6 platelets, were injected into injured horse muscle. The treatment was repeated after a week. The muscle healed without injury.
Claims (28)
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP16199628 | 2016-11-18 | ||
EP16199628.5 | 2016-11-18 | ||
PCT/EP2017/079809 WO2018091713A1 (en) | 2016-11-18 | 2017-11-20 | A method for preparing a growth factors containing platelet releasate |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2019118720A RU2019118720A (en) | 2020-12-18 |
RU2019118720A3 RU2019118720A3 (en) | 2021-03-18 |
RU2795884C2 true RU2795884C2 (en) | 2023-05-12 |
Family
ID=
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008034803A1 (en) * | 2006-09-18 | 2008-03-27 | Medizinische Universität Graz | Plasma-free platelet lysate for use as a supplement in cell cultures and for the preparation of cell therapeutics |
EP2389942A1 (en) * | 2010-05-25 | 2011-11-30 | GWO REI Biomedical Technology Corp. | Virally-inactivated growth factors-containing platelet lysate depleted of PDGF and VEGF and preparation method thereof |
WO2013042095A1 (en) * | 2011-09-23 | 2013-03-28 | Università Degli Studi Di Roma "La Sapienza" | Platelet lysate, uses and method for the preparation thereof |
WO2013113024A1 (en) * | 2012-01-26 | 2013-08-01 | Jadi Cell Llc | Lyophilized platelet lysates |
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008034803A1 (en) * | 2006-09-18 | 2008-03-27 | Medizinische Universität Graz | Plasma-free platelet lysate for use as a supplement in cell cultures and for the preparation of cell therapeutics |
EP2389942A1 (en) * | 2010-05-25 | 2011-11-30 | GWO REI Biomedical Technology Corp. | Virally-inactivated growth factors-containing platelet lysate depleted of PDGF and VEGF and preparation method thereof |
WO2013042095A1 (en) * | 2011-09-23 | 2013-03-28 | Università Degli Studi Di Roma "La Sapienza" | Platelet lysate, uses and method for the preparation thereof |
WO2013113024A1 (en) * | 2012-01-26 | 2013-08-01 | Jadi Cell Llc | Lyophilized platelet lysates |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BURNOUF THIERRY ET AL., "Human platelet lysate: Replacing fetal bovine serum as a gold standard for human cell propagation?", BIOMATERIALS, (20151028), vol. 76, pages 371 - 387, DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.10.065. PAOLA IUDICONE ET AL., "Pathogen-free, plasma-poor platelet lysate and expansion of human mesenchymal stem cells", JOURNAL OF TRANSLATIONAL MEDICINE, BIOMED CENTRAL, LONDON, GB, (20140127), vol. 12, no. 1, doi:10.1186/1479-5876-12-28, page 28. * |
Накастоев И.М. Автореферат на соискание уч. степени канд. мед. наук. Влияние инактивации патогенов в концентратах тромбоцитов на функцию тромбоцитов, Москва 2013, 07.11.2013. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2017360070B2 (en) | A method for preparing a growth factors containing platelet releasate | |
US10980837B2 (en) | Lyophilized platelet lysates | |
Shih et al. | Preparation, quality criteria, and properties of human blood platelet lysate supplements for ex vivo stem cell expansion | |
JP6649257B2 (en) | Bioactive composition derivable from concentrated platelets, and methods for preparing and using the same | |
KR102671387B1 (en) | Method for sterilizing platelet lysate | |
US20170252372A1 (en) | Viral inactivated biological mixture | |
JP2020535163A (en) | Methods for Preparing Platelet Dissolved Fractions, Platelet Dissolved Fractions, and Its Use for Treating Central Nervous System Disorders | |
RU2795884C2 (en) | Method for obtaining platelet releasate containing growth factors | |
WO2017082441A1 (en) | Veterinary medicinal composition for treatment of wound of animal comprising activated platelet-rich plasma as active ingredient | |
AU2021249444B2 (en) | Viral infections- treatment with convalescent plasma/serum | |
KR20150061806A (en) | Veterinary composition for wound healing of animal containing activated platelet rich plasma | |
US20210292740A1 (en) | Methods for viral inactivation of human platelet lysate | |
Goczyńska et al. | Innovative applications of platelet derivatives in light of information presented during the 2022 virtual congress of the International Society of Blood Transfusion (ISBT); selected issues | |
WO2024110937A1 (en) | Compositions based on a mixture of bioactive molecules and exosomes for use in the treatment of conditions requiring tissue repair and regeneration | |
TW200930726A (en) | Clottable concentrate of platelet growth factors and preparation method thereof |