RU2793922C2 - IMPROVED IMMUNE CELLS WITH DOUBLE shRNA AND COMPOSITIONS CONTAINING THEM - Google Patents

IMPROVED IMMUNE CELLS WITH DOUBLE shRNA AND COMPOSITIONS CONTAINING THEM Download PDF

Info

Publication number
RU2793922C2
RU2793922C2 RU2020125399A RU2020125399A RU2793922C2 RU 2793922 C2 RU2793922 C2 RU 2793922C2 RU 2020125399 A RU2020125399 A RU 2020125399A RU 2020125399 A RU2020125399 A RU 2020125399A RU 2793922 C2 RU2793922 C2 RU 2793922C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cell
antigen
mage
receptor
shrna
Prior art date
Application number
RU2020125399A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2020125399A (en
RU2020125399A3 (en
Inventor
Чан-Хиук КИМ
Янг-Хо ЛИ
Юдзеан ЛИ
ХиеонгДзи ЛИ
Санг Хоон ЛИ
Original Assignee
Кьюроселл Инк.
Корея Эдванст Инститьют Оф Сайенс Энд Текнолоджи
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Кьюроселл Инк., Корея Эдванст Инститьют Оф Сайенс Энд Текнолоджи filed Critical Кьюроселл Инк.
Priority claimed from PCT/IB2019/050194 external-priority patent/WO2019138354A1/en
Publication of RU2020125399A publication Critical patent/RU2020125399A/en
Publication of RU2020125399A3 publication Critical patent/RU2020125399A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2793922C2 publication Critical patent/RU2793922C2/en

Links

Images

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: in particular, the invention includes an expression vector containing a base sequence encoding two types of short hairpin RNA (shRNA) that inhibit the expression of PD-1 and TIGIT genes that impair T-cell function, and a base sequence encoding a chimeric antigen receptor (CAR) or monoclonal T cell receptor (mTCR), as well as to the T cell containing it. Also disclosed is a pharmaceutical composition containing this T-cell.
EFFECT: invention is effective for treatment of malignant neoplasm.
114 cl, 24 dwg, 1 tbl, 11 ex

Description

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИCROSS REFERENCES TO RELATED APPLICATIONS

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет по заявке на патент Кореи № 10-2018-0004238, поданной 12 января 2018 года, содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки. [0001] This application claims priority from Korean Patent Application No. 10-2018-0004238, filed January 12, 2018, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕLINK TO ELECTRONIC SEQUENCE LISTING

[0002] Данная заявка включает в себя посредством ссылки перечень последовательностей, представленный вместе с этой заявкой, в виде текстового файла с названием 14570-001-228_SEQ_LISTING.txt, созданного 5 января 2019 года, и имеет размер 88751 байт.[0002] This application incorporates by reference the sequence listing submitted with this application as a text file named 14570-001-228_SEQ_LISTING.txt, created on January 5, 2019, and has a size of 88751 bytes.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY

[0003] Данное изобретение в целом относится к области иммунотерапии злокачественного новообразования. Например, данное изобретение в целом относится к иммунной клетке, содержащей генетически сконструированный антигенный рецептор, который специфически связывается с целевым антигеном, и агент генетического разрушения, который уменьшает или способен уменьшить экспрессию в иммунной клетке гена, который ослабляет функцию иммунной клетки. [0003] This invention relates generally to the field of cancer immunotherapy. For example, the invention generally relates to an immune cell comprising a genetically engineered antigen receptor that specifically binds to a target antigen and a genetic disruption agent that reduces or is capable of reducing expression in the immune cell of a gene that impairs immune cell function.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

[0004] Противораковой терапии с использованием иммунных клеток путем выделения Т-клеток или NK-клеток (натуральных клеток-киллеров) из организма пациента или донора, культивирования этих клеток in vitro, и последующего введения их обратно в организм пациента в настоящее время уделяется много внимания как новому способу терапии злокачественного новообразования. В частности, сообщается, что иммунные клетки, в которые вносят новую генетическую информацию с использованием вирусов и т. д. с последующим культивированием в процессе культивирования in vitro, обладают более сильным противораковым действием по сравнению с клетками, которым этого не делают. В данном документе генетическая информация, вводимая в Т-клетки, как правило, представляет собой химерный антигенный рецептор (далее CAR) или моноклональный Т-клеточный рецептор (далее mTCR), модифицированный так, чтобы иметь высокую аффинность к целевому антигену. Эти модифицированные иммунные клетки распознают и атакуют раковые клетки, которые экспрессируют целевой антиген и индуцируют гибель клеток, не ограничиваясь присущими им антигенными специфичностями. Способ генетической модификации Т-клеток с использованием CAR был впервые предложен Eshhar et al. в 1989 году и был назван как «Т-клеточное тельце» (T-body).[0004] Anti-cancer therapy using immune cells by isolating T cells or NK cells (natural killer cells) from the body of a patient or a donor, culturing these cells in vitro , and then introducing them back into the patient's body is currently receiving much attention as a new method of cancer therapy. In particular, immune cells that are introduced with new genetic information using viruses, etc. and then cultured in an in vitro culture process are reported to have a stronger anti-cancer effect compared to cells that are not. Herein, the genetic information introduced into T cells is typically a chimeric antigen receptor (hereinafter CAR) or a monoclonal T cell receptor (hereinafter mTCR) modified to have high affinity for the target antigen. These modified immune cells recognize and attack cancer cells that express the target antigen and induce cell death without being limited by their inherent antigenic specificities. A method for genetically modifying T cells using CAR was first proposed by Eshhar et al. in 1989 and was named as "T-cell body" (T-body).

[0005] В данном документе предложены композиции иммунных клеток и способы, которые решают проблемы традиционных аналогичных способов терапии иммунными клетками, упомянутых выше, в которых указанные проблемы накладывают большое экономическое бремя на пациентов из-за их высокой стоимости, воздействуют на Т-клетки, отличные от CAR-T, и создают риск возникновения симптомов аутоиммунных заболеваний и синдрома высвобождения цитокинов. Вкратце, например, в данном документе описаны способы их получения с высокими показателями выхода и низкими производственными затратами. Кроме того, благодаря ингибированию молекул, которые подавляют функцию иммунных клеток с более высокой вероятностью и эффективностью, описание, приведенное в данном документе, удовлетворяет требованиям технологии в обеспечении эффективной клеточной терапии. Техническая проблема, на решение которой направлено данное описание, не ограничивается технической проблемой, изложенной выше, и для специалистов в данной области техники должны быть очевидны другие технические проблемы, не упомянутые ниже.[0005] Provided herein are immune cell compositions and methods that solve the problems of the traditional analogous immune cell therapies mentioned above, in which these problems impose a large economic burden on patients due to their high cost, target T cells that are different from CAR-T and pose a risk of autoimmune disease symptoms and cytokine release syndrome. Briefly, for example, this document describes how to obtain them with high yields and low production costs. In addition, by inhibiting molecules that suppress the function of immune cells with higher probability and efficiency, the description given in this document satisfies the requirements of the technology in providing effective cell therapy. The technical problem to which this description is directed is not limited to the technical problem set forth above, and other technical problems not mentioned below should be apparent to those skilled in the art.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0006] В данном документе предложены векторы, иммунные клетки, фармацевтические композиции, содержащие иммунные клетки, и композиции, содержащие иммунные клетки. В данном документе также предложены способы получения иммунных клеток и способы лечения и применения иммунных клеток.[0006] Provided herein are vectors, immune cells, pharmaceutical compositions containing immune cells, and compositions containing immune cells. This document also provides methods for producing immune cells and methods for treating and using immune cells.

[0007] В одном аспекте в данном документе предложены векторы. В некоторых вариантах осуществления предложен вектор, содержащий последовательность оснований, кодирующую два типа коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые ингибируют экспрессию генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток, и последовательность оснований, кодирующую химерный антигенный рецептор (CAR) ил Т-клеточный рецептор (TCR), например, моноклональный Т-клеточный рецептор (mTCR). В некоторых вариантах осуществления мишень CAR или TCR, например, mTCR, представляет собой опухолевый антиген человека, выбранный из числа антигенов, проявляющих повышенную экспрессию при злокачественном новообразовании, или из мутированных форм антигена, обнаруженных при злокачественном новообразовании, например, в раковых клетках, раковой ткани и/или микроокружении опухоли.[0007] In one aspect, vectors are provided herein. In some embodiments, a vector is provided that contains a base sequence encoding two types of short hairpin RNA (shRNA) that inhibit the expression of genes that impair immune cell function, and a base sequence encoding a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR). ), such as the monoclonal T cell receptor (mTCR). In some embodiments, a CAR or TCR target, for example, mTCR is a human tumor antigen selected from antigens that are overexpressed in cancer, or from mutated forms of the antigen found in cancer, for example, in cancer cells, cancer tissue, and/or the tumor microenvironment.

[0008] В некоторых вариантах осуществления экспрессия двух типов кшРНК характеризуется тем, что они, соответственно, регулируются двумя разными промоторами.[0008] In some embodiments, expression of two types of shRNA is characterized in that they are respectively regulated by two different promoters.

[0009] В некоторых вариантах осуществления два промотора представляют собой промоторы РНК-полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления два промотора представляют собой промоторы U6, например, промоторы U6, полученные из разных видов. В некоторых вариантах осуществления два промотора ориентированы в одном направлении относительно друг друга в векторе. В некоторых вариантах осуществления два промотора ориентированы в разных направлениях относительно друг друга в векторе. Например, в определенном варианте осуществления промоторы ориентированы в направлении голова к голове. В другом варианте осуществления промоторы ориентированы в направлении хвост к хвосту.[0009] In some embodiments, the two promoters are RNA polymerase III promoters. In some embodiments, the two promoters are U6 promoters, such as U6 promoters derived from different species. In some embodiments, the two promoters are oriented in the same direction relative to each other in the vector. In some embodiments, the two promoters are oriented in different directions relative to each other in the vector. For example, in a certain embodiment, the promoters are oriented in a head-to-head direction. In another embodiment, the promoters are oriented in a tail-to-tail direction.

[0010] В некоторых вариантах осуществления ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, представляет собой рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.[0010] In some embodiments, the immune cell function-impairing gene is an immune checkpoint receptor or ligand.

[0011] В некоторых вариантах осуществления рецептор или лиганд иммунной контрольной точки выбран из группы, состоящей из PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK и 2B4.[0011] In some embodiments, the immune checkpoint receptor or ligand is selected from the group consisting of PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 or CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA , TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK and 2B4.

[0012] В некоторых вариантах осуществления ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, выбран из группы, состоящей из FAS, CD45, PP2A, SHIP1, SHIP2, DGK-альфа, DGK-дзета, Cbl-b, CD147, LRR1, TGFBR1, ИЛ-10R альфа, KLGR1, DNMT3A и A2aR.[0012] In some embodiments, the immune cell function-impairing gene is selected from the group consisting of FAS, CD45, PP2A, SHIP1, SHIP2, DGK-alpha, DGK-zeta, Cbl-b, CD147, LRR1, TGFBR1, IL- 10R alpha, KLGR1, DNMT3A and A2aR.

[0013] В некоторых вариантах осуществления используются два типа кшРНК, которые нацелены на ген или гены, которые ослабляют функцию иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления два типа кшРНК или нацелены на один ген, который ослабляет функцию иммунных клеток, или они нацелены на разные гены, которые ослабляют функцию иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления два типа кшРНК нацелены на PD-1. В некоторых вариантах осуществления, включающих два типа кшРНК, одна кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIM-3. В некоторых вариантах осуществления, включающих два типа кшРНК, одна кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIGIT. [0013] In some embodiments, two types of shRNA are used that target a gene or genes that impair immune cell function. In some embodiments, the two types of shRNA either target the same gene that impairs immune cell function or they target different genes that impair immune cell function. In some embodiments, two types of shRNA target PD-1. In some embodiments involving two types of shRNA, one shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets TIM-3. In some embodiments involving two types of shRNA, one shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets TIGIT.

[0014] кшРНК образует шпилечную структуру, которая содержит смысловую последовательность кшРНК и антисмысловую последовательность кшРНК. В некоторых вариантах осуществления последовательность оснований, кодирующая кшРНК, описанную в данном документе, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-219. В некоторых вариантах осуществления последовательность оснований, кодирующая кшРНК, описанную в данном документе, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-219, причем указанная последовательность кодирует смысловую последовательность кшРНК. В некоторых вариантах осуществления последовательность оснований, кодирующая кшРНК, описанную в данном документе, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-219, причем указанная последовательность кодирует антисмысловую последовательность кшРНК.[0014] The shRNA forms a hairpin structure that contains the shRNA sense sequence and the shRNA antisense sequence. In some embodiments, the base sequence encoding the shRNA described herein contains a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-219. In some embodiments, the base sequence encoding the shRNA described herein contains a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-219, said sequence encoding the sense shRNA sequence. In some embodiments, the base sequence encoding the shRNA described herein comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-219, said sequence encoding an antisense shRNA sequence.

[0015] В некоторых вариантах осуществления вектор содержит любую одну из последовательностей оснований SEQ ID NO: 220 или 221. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой плазмидный вектор или вирусный вектор, например, лентивирусный вектор, например, ретровирусный вектор, аденовирусный вектор или вектор на основе аденоассоциированного вируса.[0015] In some embodiments, the vector comprises any one of the base sequences of SEQ ID NO: 220 or 221. In some embodiments, the vector is a plasmid vector or a viral vector, e.g., a lentiviral vector, e.g., a retroviral vector, an adenoviral vector, or a basis of adeno-associated virus.

[0016] В другом аспекте в данном документе предложены иммунные клетки, содержащие вектор, экспрессирующий CAR или TCR, например, mTCR, и при этом экспрессия целевых генов для двух типов кшРНК снижена до 40% или менее, чем у контрольной группы, которая не экспрессирует кшРНК для целевого гена. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка выбрана из Т-клеток и NK-клеток человеческого происхождения.[0016] In another aspect, this document provides immune cells containing a vector expressing a CAR or TCR, for example, mTCR, and the expression of target genes for two shRNA types is reduced to 40% or less than a control group that does not express shRNA for the target gene. In some embodiments, the immune cell is selected from T cells and NK cells of human origin.

[0017] В другом аспекте в данном документе предложены фармацевтические композиции для иммунотерапии пациентов-людей, содержащие иммунные клетки, описанные выше. В некоторых вариантах осуществления иммунную клетку первоначально получают от пациента. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется опухоль или злокачественное новообразование, при которых обнаруживается увеличение или изменение уровней ракового антигена, на который нацеливается CAR или TCR, например, mTCR, экспрессируемый в клетке.[0017] In another aspect, provided herein are pharmaceutical compositions for the immunotherapy of human patients comprising the immune cells described above. In some embodiments, the immune cell is initially obtained from a patient. In some embodiments, the patient has a tumor or malignancy in which there is an increase or change in levels of a cancer antigen targeted by a CAR or TCR, eg, mTCR expressed in a cell.

[0018] В другом аспекте в данном документе предложены иммунные клетки, содержащие генетически сконструированный антигенный рецептор, который специфически связывается с целевым антигеном, и агент генетического разрушения, снижающий или способный снижать экспрессию в иммунной клетке гена, который ослабляет функцию иммунных клеток. [0018] In another aspect, provided herein are immune cells comprising a genetically engineered antigen receptor that specifically binds to a target antigen, and a genetic disruption agent that reduces or is capable of reducing expression in an immune cell of a gene that impairs immune cell function.

[0019] В другом аспекте в данном документе предложена иммунная клетка, содержащая генетически сконструированный антигенный рецептор, который специфически связывается с целевым антигеном, и агент генетического разрушения, снижающий или способный снижать экспрессию в иммунной клетке гена, который ослабляет функцию иммунной клетки. [0019] In another aspect, provided herein is an immune cell comprising a genetically engineered antigen receptor that specifically binds to a target antigen, and a genetic disruption agent that reduces or is capable of reducing expression in an immune cell of a gene that impairs immune cell function.

[0020] В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR).[0020] In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor is a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR).

[0021] В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой CAR. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточной домен сигнальной трансдукции. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенраспознающий домен CAR специфически связывается с целевым антигеном.[0021] In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor is a CAR. In some embodiments, the CAR comprises an extracellular antigen recognition domain, a transmembrane domain, and an intracellular signal transduction domain. In some embodiments, the CAR extracellular antigen recognition domain specifically binds to a target antigen.

[0022] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен сигнальной трансдукции CAR содержит внутриклеточный домен дзета-цепи CD3 (CD3ζ). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточной домен сигнальной трансдукции CAR дополнительно содержит костимулирующую молекулу. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая молекула выбрана из группы, состоящей из ICOS, 0X40, CD137 (4-1BB), CD27 и CD28. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая молекула представляет собой CD137 (4-1BB). В некоторых вариантах осуществления костимулирующая молекула представляет собой CD28.[0022] In some embodiments, the intracellular signal transduction domain of CAR comprises an intracellular domain of the CD3 zeta chain (CD3ζ). In some embodiments, the intracellular signal transduction domain of the CAR further comprises a co-stimulatory molecule. In some embodiments, the costimulatory molecule is selected from the group consisting of ICOS, 0X40, CD137 (4-1BB), CD27, and CD28. In some embodiments, the costimulatory molecule is CD137 (4-1BB). In some embodiments, the costimulatory molecule is CD28.

[0023] В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой моноклональный TCR (mTCR).[0023] In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor is a TCR. In some embodiments, the TCR is a monoclonal TCR (mTCR).

[0024] В некоторых вариантах осуществления целевой антиген экспрессируется в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли. [0024] In some embodiments, the target antigen is expressed in or on the surface of the cancer cell, cancer tissue, and/or the tumor microenvironment.

[0025] В некоторых вариантах осуществления целевой антиген выбран из группы, состоящей из: 5T4 (трофобластический гликопротеин), 707-AP, 9D7, AFP (α-фетопротеин), AlbZIP (андроген-индуцируемый bZIP), HPG1 (специфический к простате человека ген-1), α5β1-интегрина, α5β6-интегрина, α-метилацил-коэнзим А рацемазы, ART-4 (АДФ рибозилтрансферазы-4), B7H4 (ингибитор активации Т-клеток 1, содержащий вариабельный иммуноглобулиноподобный домен), BAGE-1 (В меланомный антиген-1), BCL-2 (В-клеточный ХЛЛ/лимфома-2), BING-4 ( WD-повтор домена 46), CA 15-3/CA 27-29 (муцин 1), CA 19-9 (раковый антиген 19-9), CA 72-4 (раковый антиген 72-4), CA125 (раковый антиген 125), кальретикулина, CAMEL (ЦТЛ-распознаваемый антиген на меланоме), CASP-8 (каспаза 8), катепсина B, катепсина L, CD19 (кластер дифференцировки 19), CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (раковый эмбриональный антиген SG8), CLCA2 (канал-переносчик-2 для ионов хлора), CML28 (опухолевый антиген хронического миелолейкоза 28), коактозин-подобного белка, коллагена XXIII, COX-2 (циклооксигеназа-2), CT-9/BRD6 (раково-тестикулярный антиген 9), Cten (С-концевой тензиноподобный белок), циклина B1, циклина D1, cyp-B, CYPB1 (цитохром p450 семейство 1, подсемейство b, тип 1), DAM-10/MAGE-B1 (ассоциированный с меланомой антиген B1), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (рецептор эпидермального фактора роста), EMMPRIN (басигин), EpCam, EphA2 (эфрин-рецептор A2), EphA3, ErbB3 (рецептор тирозинкиназы 3 Erb-B2), EZH2 (усилитель субъединицы zeste гомолога 2 policomb-репрессивного комплекса 2), FGF-5 (фактор роста фибробластов 5), FN (фибронектин), Fra-1 (Fos-связанный антиген-1), G250/CAIX (карбоангидраза 9), GAGE-1 (G антиген-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP (ген, дифференциально экспрессируемый в простате), GnT-V (глюконаткиназа), gp100 (специфический для линии меланоцитов антиген GP100), GPC3 (глипикан-3), HAGE (спиральный антиген), HAST-2 (член 1 семейство сульфотрансферазы 1A), гепсина, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 рецептор тирозинкиназы 2), HERV-K-MEL, HNE (медуллазин), гомеобокса NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPVE7, HST-2 (сиртуин-2), hTERT, iCE (каспаза 1), IGF-1R (рецептор инсулиноподобного фактора роста-1), ИЛ-13Ra2 (α-2-субъединица рецептора интерлейкина-13), ИЛ-2R (рецептор интерлейкина-2), ИЛ-5 (интерлейкин-5), незрелого рецептора ламинина, калликреина-2, калликреина-4, Ki67, KIAA0205 (лизофосфатидилглицерол-ацилтрансфераза 1), KK-LC-1 (антиген-1 рака легкого кита-кюсю (kita-kyushu)), KM-HN-1, LAGE-1 (L-антиген, член 1 семейства белков LAGE), ливина, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGEB17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2 (антиген меланомы семейства L2), маммаглобина A, MART-1/Melan-A (антиген меланомы, распознаваемый Т-клетками-1), MART-2, белка матрикса 22, MC1R (рецептор меланокортина-1 ), М-КСФ (макрофагальный колониестимулирующий фактор), мезотелина, MG50/PXDN (пероксидазина), MMP 11 (матриксная металлопротеиназа 11), MN/CA IX-антигена (карбоангидраза 9), MRP-3 (ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью белок-3), MUC1 (муцин 1), MUC2, NA88-A (псевдоген 1 VENT-подобного гомеобокса 2), N-ацетилглюкозаминилтрансферазы-V, Neo-PAP (нео-поли(А)-полимераза), NGEP (новый ген, экспрессируемый в простате), NMP22 (белок ядерного матрикса 22), NPM/ALK (нуклеофосмин), NSE (нейронспецифическая энолаза), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (QTL-1 остеоартрита), OFA-iLRP (раково-эмбриональный антиген-незрелый рецептор ламинина), OGT (O-GlcNAc-трансфераза), OS-9 (лектин эндоплазматического ретикулюма), остеокальцина, остеопонтина, p15 (ингибитор CDK 2B), p53, PAGE-4 (семейство P-антигена, член-4), PAI-1 (ингибитор активатора плазминогена 1), PAI-2, PAP (простатическая кислая фосфатаза), PART-1 (транскрипт-1, регулируемый андрогеном простаты), PATE (белок-1, экспрессируемый простатой и яичками), PDEF (полученный из простаты фактор Ets), Pim-1-киназы (сайт-1 интеграции провирусов), Pin1 (пептидил-пролил-цис-транс-изомераза-1), POTE (экспрессируемый в простате, яичнике, яичке и плаценте), PRAME (преимущественно экспрессируемый антиген при меланоме), простеина, протеиназы-3, PSA (простат-специфический антиген), PSCA (антиген стволовых клеток простаты), PSGR (простат-специфический рецептор, связанный с G-белком), PSM, PSMA (простат-специфический мембранный антиген), RAGE-1 (ассоциированный с опухолью антиген почечных карцином), RHAMM/CD168, RU1 (почечный убиквитарный белок-1), RU2, SAGE (антиген саркомы), SART-1 (антиген-1 плоскоклеточной карциномы, распознаваемый Т-клетками), SART-2, SART-3, Sp17 (белок спермы 17), SSX-1 (член-1 семейства SSX), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (металлоредуктаза STEAP2), STEAP, сурвивина, сурвивина-213, TA-90 (опухоль-ассоциированный антиген-90), TAG-72 (опухоль-ассоциированный гликопротеин-72), TARP(белок TCRγ с альтернативной рамкой считывания), TGFb (трансформирующий фактор роста β), TGFbR11 (рецептор-11 трансформирующего фактора роста β), TGM-4 (трансглютаминаза 4), TRAG-3(ген-3 устойчивости к таксолу), TRG (γ-локус рецептора Т-клеток), TRP-1 (транзиторный рецепторный потенциал 1), TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, тирозиназы, UPA (урокиназный активатор плазминогена), VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия A), VEGFR-2/FLK-1, и WT1 (белок опухоли Вильмса 1). В некоторых вариантах осуществления целевой антиген представляет собой CD19 или CD22. В некоторых вариантах осуществления целевой антиген представляет собой CD19.[0025] In some embodiments, the target antigen is selected from the group consisting of: 5T4 (trophoblastic glycoprotein), 707-AP, 9D7, AFP (α-fetoprotein), AlbZIP (androgen-inducible bZIP), HPG1 (human prostate specific gene -1), α 5 β1-integrin, α5β6-integrin, α-methylacyl-coenzyme A racemase, ART-4 (ADP ribosyltransferase-4), B7H4 (T-cell activation inhibitor 1 containing a variable immunoglobulin-like domain), BAGE-1 (B melanoma antigen-1), BCL-2 (B-cell CLL/lymphoma-2), BING-4 (WD repeat domain 46), CA 15-3/CA 27-29 (mucin 1), CA 19- 9 (cancer antigen 19-9), CA 72-4 (cancer antigen 72-4), CA125 (cancer antigen 125), calreticulin, CAMEL (CTL-recognized antigen on melanoma), CASP-8 (caspase 8), cathepsin B , cathepsin L, CD19 (differentiation cluster 19), CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (SG8 cancer embryonic antigen), CLCA2 (chlorine ion transport channel-2) , CML28 (chronic myeloid leukemia tumor antigen 28), coactosin-like protein, collagen XXIII, COX-2 (cyclooxygenase-2), CT-9/BRD6 (cancer-testicular antigen 9), Cten (C-terminal tensin-like protein), cyclin B1, cyclin D1, cyp-B, CYPB1 (cytochrome p450 family 1, subfamily b, type 1), DAM-10/MAGE-B1 (melanoma-associated antigen B1), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 ( epidermal growth factor receptor), EMMPRIN (basigin), EpCam, EphA2 (ephrin receptor A2), EphA3, ErbB3 (Erb-B2 tyrosine kinase 3 receptor), EZH2 (policomb repressive complex 2 homolog 2 zeste subunit enhancer), FGF-5 (fibroblast growth factor 5), FN (fibronectin), Fra-1 (Fos-related antigen-1), G250/CAIX (carbonic anhydrase 9), GAGE-1 (G antigen-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP (gene differentially expressed in the prostate), GnT-V (gluconate kinase), gp100 (melanocyte lineage specific antigen GP100), GPC3 (glypican -3), HAGE (helical antigen), HAST-2 (sulfotransferase 1A family member 1), hepsin, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 tyrosine kinase receptor 2), HERV-K-MEL, HNE (medullasin), homeobox NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPVE7, HST-2 (sirtuin-2), hTERT, iCE (caspase 1), IGF-1R (insulin-like growth factor receptor- 1), IL-13Ra2 (α-2-subunit of interleukin-13 receptor), IL-2R (interleukin-2 receptor), IL-5 (interleukin-5), immature laminin receptor, kallikrein-2, kallikrein-4, Ki67 , KIAA0205 (lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1), KK-LC-1 (kita-kyushu lung cancer antigen-1), KM-HN-1, LAGE-1 (L-antigen, member 1 of the LAGE protein family) , livine, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGEB17, MAGE -B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2 , MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2 (melanoma L2 family antigen), mammaglobin A, MART-1/Melan-A (melanoma antigen recognized by T-cells-1), MART-2, matrix protein 22, MC1R melanocortin-1), M-CSF (macrophage colony stimulating factor), mesothelin, MG50/PXDN (peroxidazine), MMP 11 (matrix metalloproteinase 11), MN/CA IX antigen (carbonic anhydrase 9), MRP-3 (multidrug-associated resistant protein-3), MUC1 (mucin 1), MUC2, NA88-A (VENT-like homeobox 2 pseudogene 1), N-acetylglucosaminyltransferase-V, Neo-PAP (neo-poly(A)-polymerase), NGEP (new gene expressed in the prostate), NMP22 (nuclear matrix protein 22), NPM/ALK (nucleophosmin), NSE (neuron specific enolase), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (Osteoarthritis QTL-1), OFA- iLRP (cancer embryonic antigen-immature laminin receptor), OGT (O-GlcNAc-transferase), OS-9 (endoplasmic reticulum lectin), osteocalcin, osteopontin, p15 (CDK 2B inhibitor), p53, PAGE-4 (P- family antigen member-4), PAI-1 (Plasminogen Activator Inhibitor 1), PAI-2, PAP (Prostatic Acid Phosphatase), PART-1 (Prostate Androgen Regulated Transcript-1), PATE (Prostate Expressed Protein-1 and testicles), PDEF (prostate-derived Ets factor), Pim-1 kinase (provirus integration site-1), Pin1 (peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase-1), POTE (expressed in the prostate, ovary, testis and placenta), PRAME (predominantly expressed melanoma antigen), protein, proteinase-3, PSA (prostate-specific antigen), PSCA (prostate stem cell antigen), PSGR (prostate-specific G-protein-coupled receptor), PSM, PSMA (prostate-specific membrane antigen), RAGE-1 (tumor-associated renal carcinoma antigen), RHAMM/CD168, RU1 (renal ubiquitin protein-1), RU2, SAGE (sarcoma antigen), SART-1 (squamous cell antigen-1) carcinomas recognized by T cells), SART-2, SART-3, Sp17 (sperm protein 17), SSX-1 (SSX family member-1), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP- 1 (metal reductase STEAP2), STEAP, survivin, survivin-213, TA-90 (tumor-associated antigen-90), TAG-72 (tumor-associated glycoprotein-72), TARP (alternate reading frame TCRγ protein), TGFb ( transforming growth factor β), TGFbR11 (transforming growth factor receptor β 11), TGM-4 (transglutaminase 4), TRAG-3 (taxol resistance gene-3), TRG (T-cell receptor γ-locus), TRP- 1 (transient receptor potential 1), TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, tyrosinase, UPA (urokinase plasminogen activator), VEGF (vascular endothelial growth factor A), VEGFR-2/FLK-1, and WT1 (Wilms tumor protein 1). In some embodiments, the target antigen is CD19 or CD22. In some embodiments, the target antigen is CD19.

[0026] В некоторых вариантах осуществления целевой антиген представляет собой раковый антиген, экспрессия которого повышена в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли.[0026] In some embodiments, the target antigen is a cancer antigen that is upregulated in or on the surface of a cancer cell, cancer tissue, and/or the tumor microenvironment.

[0027] В некоторых вариантах осуществления целевой антиген выбран из группы, состоящей из: α-актинина-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, бета-катенина/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, миозина класса 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII, и TPI/m; и при этом целевой антиген представляет собой мутированную форму ракового антигена, экспрессируемого в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли. [0027] In some embodiments, the target antigen is selected from the group consisting of: α-actinin-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, beta-catenin/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/ m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/ m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM- 1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, myosin class 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/ m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII, and TPI/m; and wherein the target antigen is a mutated form of a cancer antigen expressed in or on the surface of a cancer cell, cancer tissue, and/or the tumor microenvironment.

[0028] В некоторых вариантах осуществления экспрессия гена, который ослабляет функцию иммунной клетки, вызывает одно или более из следующего: [0028] In some embodiments, expression of a gene that impairs immune cell function causes one or more of the following:

i) ингибирование пролиферации иммунной клетки;i) inhibition of immune cell proliferation;

ii) индукция клеточной гибели иммунной клетки;ii) induction of cell death of the immune cell;

iii) ингибирование способности иммунной клетки распознавать целевой антиген и/или активироваться;iii) inhibiting the ability of the immune cell to recognize the target antigen and/or be activated;

iv) индукция дифференцировки иммунной клетки в клетку, которая не индуцирует иммунный ответ на целевой антиген;iv) inducing differentiation of the immune cell into a cell that does not induce an immune response to the target antigen;

v) ослабление реакций иммунной клетки на молекулу, которая способствует иммунному ответу иммунной клетки; илиv) attenuating immune cell responses to a molecule that promotes an immune cell response; or

vi) усиление реакций иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.vi) enhancing immune cell responses to a molecule that suppresses the immune response of the immune cell.

[0029] В некоторых вариантах осуществления ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, выбран из группы, состоящей из: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, 2B4, FAS, CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-альфа, DGK-дзета, Cbl-b, Cbl-c, CD148, LRR1, TGFBR1, ИЛ-10RA, KLGR1, DNMT3A, и A2aR.[0029] In some embodiments, a gene that impairs immune cell function is selected from the group consisting of: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3, or CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, 2B4, FAS, CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-alpha, DGK-zeta, Cbl-b, Cbl-c, CD148, LRR1, TGFBR1, IL- 10RA, KLGR1, DNMT3A, and A2aR.

[0030] В некоторых вариантах осуществления ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, усиливает реакции иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.[0030] In some embodiments, a gene that impairs immune cell function enhances immune cell responses to a molecule that suppresses the immune cell's immune response.

[0031] В некоторых вариантах осуществления ген, который усиливает реакции иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки, кодирует рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.[0031] In some embodiments, a gene that enhances immune cell responses to a molecule that suppresses the immune cell's immune response encodes an immune checkpoint receptor or ligand.

[0032] В некоторых вариантах осуществления рецептор или лиганд иммунной контрольной точки выбран из группы, состоящей из PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK и 2B4.[0032] In some embodiments, the immune checkpoint receptor or ligand is selected from the group consisting of PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 or CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA , TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK and 2B4.

[0033] В некоторых вариантах осуществления агент генетического разрушения снижает экспрессию гена в иммунной клетке, который ослабляет функцию иммунной клетки на по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с иммунной клеткой в отсутствие агента генетического разрушения.[0033] In some embodiments, the genetic disruption agent reduces the expression of a gene in an immune cell that impairs immune cell function by at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 95% compared to the immune cell in the absence of the agent. genetic destruction.

[0034] В некоторых вариантах осуществления агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который усиливает реакции иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.[0034] In some embodiments, the genetic disruption agent reduces the expression of a gene that enhances immune cell responses to a molecule that suppresses the immune cell's immune response.

[0035] В некоторых вариантах осуществления агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который кодирует рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.[0035] In some embodiments, the genetic disruptor reduces the expression of a gene that encodes an immune checkpoint receptor or ligand.

[0036] В некоторых вариантах осуществления агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, выбранного из группы, состоящей из: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK и 2B4. [0036] In some embodiments, the genetic disruption agent reduces the expression of a gene selected from the group consisting of: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 or CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK and 2B4.

[0037] В некоторых вариантах осуществления агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию иммунной клетки посредством РНК-интерференции (РНКи). В некоторых вариантах осуществления более чем один агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию иммунной клетки в иммунной клетке посредством РНКи.[0037] In some embodiments, the genetic disruption agent reduces the expression of a gene that impairs immune cell function through RNA interference (RNAi). In some embodiments, more than one genetic disruption agent reduces the expression of a gene that impairs immune cell function in an immune cell via RNAi.

[0038] В некоторых вариантах осуществления агенты генетического разрушения нацелены на один ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, или нацелены на разные гены, которые ослабляют функцию иммунной клетки, причем первый агент генетического разрушения нацелен на первый ген, а второй агент генетического разрушения нацелен на второй ген или в любой их комбинации.[0038] In some embodiments, the genetic disruption agents target a single gene that impairs immune cell function, or target different genes that impair immune cell function, wherein the first genetic disruptor targets the first gene and the second genetic disruptor targets the second gene, or any combination thereof.

[0039] В некоторых вариантах осуществления РНКи опосредуется короткой шпилечной РНК (кшРНК). В некоторых вариантах осуществления РНКи опосредуется более чем одной кшРНК. В некоторых вариантах осуществления РНКи опосредуется двумя кшРНК.[0039] In some embodiments, RNAi is mediated by short hairpin RNA (shRNA). In some embodiments, the RNAi is mediated by more than one shRNA. In some embodiments, the RNAi is mediated by two shRNAs.

[0040] В некоторых вариантах осуществления две кшРНК нацелены на PD-1. В некоторых вариантах осуществления первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIM-3. В некоторых вариантах осуществления первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на CTLA-4. В некоторых вариантах осуществления первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на LAG-3. В некоторых вариантах осуществления первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIGIT.[0040] In some embodiments, two shRNAs target PD-1. In some embodiments, the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets TIM-3. In some embodiments, the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets CTLA-4. In some embodiments, the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets LAG-3. In some embodiments, the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets TIGIT.

[0041] В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют кшРНК. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют более одной кшРНК. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК. Если не указано иное, используемые в данном документе термины «последовательность оснований» и «нуклеотидная последовательность» являются взаимозаменяемыми.[0041] In some embodiments, the implementation of the immune cell contains nucleotide sequences that encode shRNA. In some embodiments, the implementation of the immune cell contains nucleotide sequences that encode for more than one shRNA. In some embodiments, the immune cell contains nucleotide sequences that encode two shRNAs. Unless otherwise indicated, the terms "base sequence" and "nucleotide sequence" as used herein are used interchangeably.

[0042] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности, кодирующие кшРНК, содержат последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-219 и 238-267. [0042] In some embodiments, the shRNA-encoding nucleotide sequences comprise sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-219 and 238-267.

[0043] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности, кодирующие кшРНК, находятся в векторе. [0043] In some embodiments, the nucleotide sequences encoding the shRNA are in a vector.

[0044] В некоторых вариантах экспрессия разных кшРНК, соответственно, регулируется разными промоторами. В некоторых вариантах экспрессия двух разных кшРНК, соответственно, регулируется двумя разными промоторами. В некоторых вариантах осуществления два разных промотора представляют собой промоторы РНК-полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления два промотора представляют собой промоторы U6. В некоторых вариантах осуществления промоторы U6 получают от разных видов. В некоторых вариантах осуществления два промотора ориентированы в разных направлениях относительно друг друга. Например, в определенном варианте осуществления промоторы ориентированы в направлении голова к голове. В другом варианте осуществления промоторы ориентированы в направлении хвост к хвосту.[0044] In some embodiments, the expression of different shRNAs, respectively, is regulated by different promoters. In some embodiments, the expression of two different shRNAs is respectively regulated by two different promoters. In some embodiments, the two different promoters are RNA polymerase III promoters. In some embodiments, the two promoters are U6 promoters. In some embodiments, U6 promoters are obtained from different species. In some embodiments, the two promoters are oriented in different directions relative to each other. For example, in a certain embodiment, the promoters are oriented in a head-to-head direction. In another embodiment, the promoters are oriented in a tail-to-tail direction.

[0045] В некоторых вариантах осуществления каждый из генетически сконструированного антигенного рецептора и агента генетического разрушения экспрессируется из вектора. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный антигенный рецептор и агент генетического разрушения экспрессируются из одного и того же вектора.[0045] In some embodiments, each of the genetically engineered antigen receptor and the genetic disruptor is expressed from a vector. In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor and the genetic disruptor are expressed from the same vector.

[0046] В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой плазмидный вектор или вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор или аденовирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор.[0046] In some embodiments, the vector is a plasmid vector or a viral vector. In some embodiments, the viral vector is a lentiviral vector or an adenoviral vector. In some embodiments, the lentiviral vector is a retroviral vector.

[0047] В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из Т-клетки и натуральной клетки-киллера (NK). В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления T-клетка представляет собой CD4+ T-клетку или CD8+ T-клетку.[0047] In some embodiments, the immune cell is selected from the group consisting of a T cell and a natural killer (NK) cell. In some embodiments, the immune cell is a T cell. In some embodiments, the T cell is a CD4+ T cell or a CD8+ T cell.

[0048] В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК и CAR в одном и том же векторе. В некоторых вариантах осуществления каждая из двух кшРНК регулируется двумя разными промоторами РНК-полимеразы III, ориентированными в разных направлениях относительно друг друга. Например, в определенном варианте осуществления промоторы ориентированы в направлении голова к голове. В другом варианте осуществления промоторы ориентированы в направлении хвост к хвосту. В некоторых вариантах осуществления CAR нацелен на CD19, первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIGIT. [0048] In some embodiments, the implementation of the immune cell contains nucleotide sequences that encode two shRNA and CAR in the same vector. In some embodiments, each of the two shRNAs is regulated by two different RNA polymerase III promoters oriented in different directions relative to each other. For example, in a certain embodiment, the promoters are oriented in a head-to-head direction. In another embodiment, the promoters are oriented in a tail-to-tail direction. In some embodiments, the CAR targets CD19, the first shRNA targets PD-1, and the second shRNA targets TIGIT.

[0049] В другом аспекте в данном документе предложен способ получения иммунной клетки, включающий введение в иммунную клетку одновременно или последовательно в любом порядке:[0049] In another aspect, this document provides a method for producing an immune cell, comprising introducing into the immune cell simultaneously or sequentially in any order:

(1) гена, кодирующего генетически сконструированный антигенный рецептор, который специфически связывается с целевым антигеном; и (1) a gene encoding a genetically engineered antigen receptor that specifically binds to the target antigen; And

(2) агента генетического разрушения, снижающего или способного снижать экспрессию в иммунной клетке гена, который ослабляет функцию иммунной клетки,(2) a genetic disruptor that reduces or is capable of reducing the expression in an immune cell of a gene that impairs immune cell function,

тем самым получая иммунную клетку, в которой экспрессируется генетически сконструированный антигенный рецептор, и снижается экспрессия гена, который ослабляет функцию иммунной клетки. thereby obtaining an immune cell in which the genetically engineered antigen receptor is expressed and the expression of a gene that impairs immune cell function is reduced.

[0050] В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR).[0050] In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor is a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR).

[0051] В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой CAR. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточной домен сигнальной трансдукции. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенраспознающий домен CAR специфически связывается с целевым антигеном.[0051] In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor is a CAR. In some embodiments, the CAR comprises an extracellular antigen recognition domain, a transmembrane domain, and an intracellular signal transduction domain. In some embodiments, the CAR extracellular antigen recognition domain specifically binds to a target antigen.

[0052] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен сигнальной трансдукции CAR содержит внутриклеточный домен дзета-цепи CD3 (CD3ζ). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточной домен сигнальной трансдукции CAR дополнительно содержит костимулирующую молекулу. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая молекула выбрана из группы, состоящей из ICOS, 0X40, CD137 (4-1BB), CD27 и CD28. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая молекула представляет собой CD137 (4-1BB). В некоторых вариантах осуществления костимулирующая молекула представляет собой CD28.[0052] In some embodiments, the intracellular signal transduction domain of CAR comprises an intracellular domain of the CD3 zeta chain (CD3ζ). In some embodiments, the intracellular signal transduction domain of the CAR further comprises a co-stimulatory molecule. In some embodiments, the costimulatory molecule is selected from the group consisting of ICOS, 0X40, CD137 (4-1BB), CD27, and CD28. In some embodiments, the costimulatory molecule is CD137 (4-1BB). In some embodiments, the costimulatory molecule is CD28.

[0053] В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой TCR. В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой моноклональный TCR (mTCR).[0053] In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor is a TCR. In some embodiments, the TCR is a monoclonal TCR (mTCR).

[0054] В некоторых вариантах осуществления целевой антиген экспрессируется в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли. [0054] In some embodiments, the target antigen is expressed in or on the surface of the cancer cell, cancer tissue, and/or the tumor microenvironment.

[0055] В некоторых вариантах осуществления целевой антиген выбран из группы, состоящей из: [0055] In some embodiments, the target antigen is selected from the group consisting of:

5T4 (трофобластический гликопротеин), 707-AP, 9D7, AFP (α-фетопротеин), AlbZIP (андроген-индуцируемый bZIP), HPG1 (специфический к простате человека ген-1), α5β1-интегрина, α5β6-интегрина, α --метилацил-коэнзим А рацемазы, ART-4 (АДФ рибозилтрансферазы-4), B7H4 (ингибитор активации Т-клеток 1, содержащий вариабельный иммуноглобулиноподобный домен), BAGE-1 (В меланомный антиген-1), BCL-2 (В-клеточный ХЛЛ/лимфома-2), BING-4 ( WD-повтор домена 46), CA 15-3/CA 27-29 (муцин 1), CA 19-9 (раковый антиген 19-9), CA 72-4 (раковый антиген 72-4), CA125 (раковый антиген 125), кальретикулина, CAMEL (ЦТЛ-распознаваемый антиген на меланоме), CASP-8 (каспаза 8), катепсина B, катепсина L, CD19 (кластер дифференцировки 19), CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (раковый эмбриональный антиген SG8), CLCA2 (канал-переносчик-2 для ионов хлора), CML28 (опухолевый антиген хронического миелолейкоза 28), коактозин-подобного белка, коллагена XXIII, COX-2 (циклооксигеназа-2), CT-9/BRD6 (раково-тестикулярный антиген 9), Cten (С-концевой тензиноподобный белок), циклина B1, циклина D1, cyp-B, CYPB1 (цитохром p450 семейство 1, подсемейство b, тип 1), DAM-10/MAGE-B1 (ассоциированный с меланомой антиген B1), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (рецептор эпидермального фактора роста), EMMPRIN (басигин), EpCam, EphA2 (эфрин-рецептор A2), EphA3, ErbB3 (рецептор тирозинкиназы 3 Erb-B2), EZH2 (усилитель субъединицы zeste гомолога 2 policomb-репрессивного комплекса 2), FGF-5 (фактор роста фибробластов 5), FN (фибронектин), Fra-1 (Fos-связанный антиген-1), G250/CAIX (карбоангидраза 9), GAGE-1 (G антиген-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP (ген, дифференциально экспрессируемый в простате), GnT-V (глюконаткиназа), gp100 (специфический для линии меланоцитов антиген GP100), GPC3 (глипикан-3), HAGE (спиральный антиген), HAST-2 (член 1 семейство сульфотрансферазы 1A), гепсина, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 рецептор тирозинкиназы 2), HERV-K-MEL, HNE (медуллазин), гомеобокса NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPVE7, HST-2 (сиртуин-2), hTERT, iCE (каспаза 1), IGF-1R (рецептор инсулиноподобного фактора роста-1), ИЛ-13Ra2 (α-2-субъединица рецептора интерлейкина-13), ИЛ-2R (рецептор интерлейкина-2), ИЛ-5 (интерлейкин-5), незрелого рецептора ламинина, калликреина-2, калликреина-4, Ki67, KIAA0205 (лизофосфатидилглицерол-ацилтрансфераза 1), KK-LC-1 (антиген-1 рака легкого кита-кюсю (kita-kyushu)), KM-HN-1, LAGE-1 (L-антиген, член 1 семейства белков LAGE), ливина, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGEA2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGEB17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2 (антиген меланомы семейства L2), маммаглобина A, MART-1/Melan-A (антиген меланомы, распознаваемый Т-клетками-1), MART-2, белка матрикса 22, MC1R (рецептор меланокортина-1 ), М-КСФ (макрофагальный колониестимулирующий фактор), мезотелина, MG50/PXDN (пероксидазина), MMP 11 (матриксная металлопротеиназа 11), MN/CA IX-антигена (карбоангидраза 9), MRP-3 (ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью белок-3), MUC1 (муцин 1), MUC2, NA88-A (псевдоген 1 VENT-подобного гомеобокса 2), N-ацетилглюкозаминилтрансферазы-V, Neo-PAP (нео-поли(А)-полимераза), NGEP (новый ген, экспрессируемый в простате), NMP22 (белок ядерного матрикса 22), NPM/ALK (нуклеофосмин), NSE (нейронспецифическая энолаза), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (QTL-1 остеоартрита), OFA-iLRP (раково-эмбриональный антиген-незрелый рецептор ламинина), OGT (O-GlcNAc-трансфераза), OS-9 (лектин эндоплазматического ретикулюма), остеокальцина, остеопонтина, p15 (ингибитор CDK 2B), p53, PAGE-4 (семейство P-антигена, член-4), PAI-1 (ингибитор активатора плазминогена 1), PAI-2, PAP (простатическая кислая фосфатаза), PART-1 (транскрипт-1, регулируемый андрогеном простаты), PATE (белок-1, экспрессируемый простатой и яичками), PDEF (полученный из простаты фактор Ets), Pim-1-киназы (сайт-1 интеграции провирусов), Pin1 (пептидил-пролил-цис-транс-изомераза-1), POTE (экспрессируемый в простате, яичнике, яичке и плаценте), PRAME (преимущественно экспрессируемый антиген при меланоме), простеина, протеиназы-3, PSA (простат-специфический антиген), PSCA (антиген стволовых клеток простаты), PSGR (простат-специфический рецептор, связанный с G-белком), PSM, PSMA (простат-специфический мембранный антиген), RAGE-1 (ассоциированный с опухолью антиген почечных карцином), RHAMM/CD168, RU1 (почечный убиквитарный белок-1), RU2, SAGE (антиген саркомы), SART-1 (антиген-1 плоскоклеточной карциномы, распознаваемый Т-клетками), SART-2, SART-3, Sp17 (белок спермы 17), SSX-1 (член-1 семейства SSX), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (металлоредуктаза STEAP2), STEAP, сурвивина, сурвивина-213, TA-90 (опухоль-ассоциированный антиген-90), TAG-72 (опухоль-ассоциированный гликопротеин-72), TARP(белок TCRγ с альтернативной рамкой считывания), TGFb (трансформирующий фактор роста β), TGFbR11 (рецептор-11 трансформирующего фактора роста β), TGM-4 (трансглютаминаза 4), TRAG-3(ген-3 устойчивости к таксолу), TRG (γ-локус рецептора Т-клеток), TRP-1 (транзиторный рецепторный потенциал 1), TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, тирозиназы, UPA (урокиназный активатор плазминогена), VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия A), VEGFR-2/FLK-1, и WT1 (белок опухоли Вильмса 1). В некоторых вариантах осуществления целевой антиген представляет собой CD19 или CD22. В некоторых вариантах осуществления целевой антиген представляет собой CD19.5T4 (trophoblastic glycoprotein), 707-AP, 9D7, AFP (α-fetoprotein), AlbZIP (androgen-inducible bZIP), HPG1 (human prostate-specific gene-1), α5β1 -integrin, α5β6-integrin, α- -methylacyl-coenzyme A of racemase, ART-4 (ADP ribosyltransferase-4), B7H4 (inhibitor of T-cell activation 1 containing a variable immunoglobulin-like domain), BAGE-1 (B melanoma antigen-1), BCL-2 (B-cell CLL/lymphoma-2), BING-4 (WD repeat domain 46), CA 15-3/CA 27-29 (mucin 1), CA 19-9 (cancer antigen 19-9), CA 72-4 (cancer antigen 72-4), CA125 (cancer antigen 125), calreticulin, CAMEL (CTL-recognized antigen on melanoma), CASP-8 (caspase 8), cathepsin B, cathepsin L, CD19 (differentiation cluster 19), CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (SG8 cancer embryonic antigen), CLCA2 (chlorine ion transporter channel-2), CML28 (chronic myeloid leukemia tumor antigen 28), collagen XXIII, COX-2 (cyclooxygenase-2), CT-9/BRD6 (cancer-testicular antigen 9), Cten (C-terminal tensin-like protein), cyclin B1, cyclin D1, cyp-B, CYPB1 (cytochrome p450 family 1 , subfamily b, type 1), DAM-10/MAGE-B1 (melanoma-associated antigen B1), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (epidermal growth factor receptor), EMMPRIN (basigin), EpCam, EphA2 ( ephrin receptor A2), EphA3, ErbB3 (Erb-B2 tyrosine kinase 3 receptor), EZH2 (policomb repressive complex 2 homologue 2 zeste subunit enhancer), FGF-5 (fibroblast growth factor 5), FN (fibronectin), Fra-1 (Fos-linked antigen-1), G250/CAIX (carbonic anhydrase 9), GAGE-1 (G antigen-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b , GAGE-8, GDEP (gene differentially expressed in the prostate), GnT-V (gluconate kinase), gp100 (melanocyte lineage specific antigen GP100), GPC3 (glypican-3), HAGE (helical antigen), HAST-2 (member 1 sulfotransferase family 1A), hepsin, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2), HERV-K-MEL, HNE (medullasin), homeobox NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES -85, HPV-E6, HPVE7, HST-2 (sirtuin-2), hTERT, iCE (caspase 1), IGF-1R (insulin-like growth factor-1 receptor), IL-13Ra2 (α-2-subunit of interleukin receptor- 13), IL-2R (interleukin-2 receptor), IL-5 (interleukin-5), immature laminin receptor, kallikrein-2, kallikrein-4, Ki67, KIAA0205 (lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1), KK-LC-1 ( lung cancer antigen-1 kita-kyushu (kita-kyushu)), KM-HN-1, LAGE-1 (L-antigen, member 1 of the LAGE protein family), livin, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGEA2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGEB17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE- B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2 (L2 family melanoma antigen), mammaglobin A, MART-1/Melan-A (melanoma antigen recognized by T-cells-1), MART-2, matrix protein 22, MC1R (melanocortin-1 receptor), M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), mesothelin, MG50 /PXDN (peroxidazine), MMP 11 (matrix metalloproteinase 11), MN/CA IX antigen (carbonic anhydrase 9), MRP-3 (multidrug resistance-associated protein-3), MUC1 (mucin 1), MUC2, NA88-A (pseudogene 1 of VENT-like homeobox 2), N-acetylglucosaminyltransferase-V, Neo-PAP (neo-poly(A) polymerase), NGEP (new prostate-expressed gene), NMP22 (nuclear matrix protein 22), NPM/ ALK (nucleophosmin), NSE (neuron specific enolase), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (Osteoarthritis QTL-1), OFA-iLRP (cancer embryonic antigen-immature laminin receptor), OGT (O-GlcNAc -transferase), OS-9 (endoplasmic reticulum lectin), osteocalcin, osteopontin, p15 (CDK 2B inhibitor), p53, PAGE-4 (P-antigen family member-4), PAI-1 (plasminogen activator inhibitor 1), PAI-2, PAP (Prostatic Acid Phosphatase), PART-1 (Prostate Androgen Regulated Transcript-1), PATE (Prostate and Testicular Expression Protein-1), PDEF (Prostate-Derived Ets Factor), Pim-1 Kinases (provirus integration site-1), Pin1 (peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase-1), POTE (expressed in prostate, ovary, testis and placenta), PRAME (predominantly expressed melanoma antigen), proteinase, proteinase-3 , PSA (prostate-specific antigen), PSCA (prostate stem cell antigen), PSGR (prostate-specific G protein-coupled receptor), PSM, PSMA (prostate-specific membrane antigen), RAGE-1 (tumor-associated antigen renal carcinomas), RHAMM/CD168, RU1 (renal ubiquitary protein-1), RU2, SAGE (sarcoma antigen), SART-1 (squamous cell carcinoma antigen-1 recognized by T cells), SART-2, SART-3, Sp17 (sperm protein 17), SSX-1 (SSX family member-1), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (metal reductase STEAP2), STEAP, survivin, survivin-213, TA-90 (tumor-associated antigen-90), TAG-72 (tumor-associated glycoprotein-72), TARP (alternate reading frame TCRγ protein), TGFb (transforming growth factor β), TGFbR11 (transforming growth factor receptor-11), TGM-4 (transglutaminase 4), TRAG-3 (Taxol resistance gene-3), TRG (T cell receptor γ locus), TRP-1 (transient receptor potential 1), TRP-2/6b, TRP-2 /INT2, Trp-p8, tyrosinases, UPA (urokinase plasminogen activator), VEGF (vascular endothelial growth factor A), VEGFR-2/FLK-1, and WT1 (Wilms tumor protein 1). In some embodiments, the target antigen is CD19 or CD22. In some embodiments, the target antigen is CD19.

[0056] В некоторых вариантах осуществления целевой антиген представляет собой раковый антиген, экспрессия которого повышена в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли.[0056] In some embodiments, the target antigen is a cancer antigen that is upregulated in or on the surface of a cancer cell, cancer tissue, and/or the tumor microenvironment.

[0057] В некоторых вариантах осуществления целевой антиген выбран из группы, состоящей из: [0057] In some embodiments, the target antigen is selected from the group consisting of:

α-актинина-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, бета-катенина/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, миозина класса 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII, и TPI/m; и при этом целевой антиген представляет собой мутированную форму ракового антигена, экспрессируемого в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли. α-actinin-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, beta-catenin/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, myosin class 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/ m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII, and TPI/m; and wherein the target antigen is a mutated form of a cancer antigen expressed in or on the surface of a cancer cell, cancer tissue, and/or the tumor microenvironment.

[0058] В некоторых вариантах осуществления экспрессия гена, который ослабляет функцию иммунной клетки, вызывает одно или более из следующего: [0058] In some embodiments, expression of a gene that impairs immune cell function causes one or more of the following:

i) ингибирование пролиферации иммунной клетки;i) inhibition of immune cell proliferation;

ii) индукция клеточной гибели иммунной клетки;ii) induction of cell death of the immune cell;

iii) ингибирование способности иммунной клетки распознавать целевой антиген и/или активироваться;iii) inhibiting the ability of the immune cell to recognize the target antigen and/or be activated;

iv) индукция дифференцировки иммунной клетки в клетку, которая не индуцирует иммунный ответ на целевой антиген;iv) inducing differentiation of the immune cell into a cell that does not induce an immune response to the target antigen;

v) ослабление реакций иммунной клетки на молекулу, которая способствует иммунному ответу иммунной клетки; илиv) attenuating immune cell responses to a molecule that promotes an immune cell response; or

vi) усиление реакций иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.vi) enhancing immune cell responses to a molecule that suppresses the immune response of the immune cell.

[0059] В некоторых вариантах осуществления ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, выбран из группы, состоящей из: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, 2B4, FAS, CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-альфа, DGK-дзета, Cbl-b, Cbl-c, CD148, LRR1, TGFBR1, ИЛ-10RA, KLGR1, DNMT3A, и A2aR.[0059] In some embodiments, a gene that impairs immune cell function is selected from the group consisting of: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3, or CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, 2B4, FAS, CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-alpha, DGK-zeta, Cbl-b, Cbl-c, CD148, LRR1, TGFBR1, IL- 10RA, KLGR1, DNMT3A, and A2aR.

[0060] В некоторых вариантах осуществления ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, усиливает реакции иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.[0060] In some embodiments, a gene that impairs immune cell function enhances immune cell responses to a molecule that suppresses the immune cell's immune response.

[0061] В некоторых вариантах осуществления ген, который усиливает реакции иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки, кодирует рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.[0061] In some embodiments, a gene that enhances immune cell responses to a molecule that suppresses the immune cell's immune response encodes an immune checkpoint receptor or ligand.

[0062] В некоторых вариантах осуществления рецептор или лиганд иммунной контрольной точки выбран из группы, состоящей из PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK и 2B4.[0062] In some embodiments, the immune checkpoint receptor or ligand is selected from the group consisting of PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 or CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA , TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK and 2B4.

[0063] В некоторых вариантах осуществления агент генетического разрушения снижает экспрессию гена в иммунной клетке, который ослабляет функцию иммунной клетки на по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с иммунной клеткой в отсутствие агента генетического разрушения.[0063] In some embodiments, the genetic disruption agent reduces the expression of a gene in an immune cell that impairs immune cell function by at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 95% compared to the immune cell in the absence of the agent. genetic destruction.

[0064] В некоторых вариантах осуществления агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который усиливает реакции иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.[0064] In some embodiments, the genetic disruption agent reduces the expression of a gene that enhances immune cell responses to a molecule that suppresses the immune cell's immune response.

[0065] В некоторых вариантах осуществления агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который кодирует рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.[0065] In some embodiments, the genetic disruption agent reduces the expression of a gene that encodes an immune checkpoint receptor or ligand.

[0066] В некоторых вариантах осуществления агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, выбранного из группы, состоящей из: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK и 2B4. [0066] In some embodiments, the genetic disruption agent reduces the expression of a gene selected from the group consisting of: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 or CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK and 2B4.

[0067] В некоторых вариантах осуществления агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию иммунной клетки посредством РНК-интерференции (РНКи). В некоторых вариантах осуществления более чем один агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию иммунной клетки в иммунной клетке посредством РНКи.[0067] In some embodiments, the genetic disruption agent reduces the expression of a gene that impairs immune cell function through RNA interference (RNAi). In some embodiments, more than one genetic disruption agent reduces the expression of a gene that impairs immune cell function in an immune cell via RNAi.

[0068] В некоторых вариантах осуществления агенты генетического разрушения нацелены на один ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, или нацелены на разные гены, которые ослабляют функцию иммунной клетки, причем первый агент генетического разрушения нацелен на первый ген, а второй агент генетического разрушения нацелен на второй ген или в любой их комбинации.[0068] In some embodiments, the genetic disruptors target a single gene that impairs immune cell function, or target different genes that impair immune cell function, with the first genetic disruptor targeting the first gene and the second genetic disruptor targeting the second gene, or any combination thereof.

[0069] В некоторых вариантах осуществления РНКи опосредуется короткой шпилечной РНК (кшРНК). В некоторых вариантах осуществления РНКи опосредуется более чем одной кшРНК. В некоторых вариантах осуществления РНКи опосредуется двумя кшРНК.[0069] In some embodiments, RNAi is mediated by short hairpin RNA (shRNA). In some embodiments, the RNAi is mediated by more than one shRNA. In some embodiments, the RNAi is mediated by two shRNAs.

[0070] В некоторых вариантах осуществления две кшРНК нацелены на PD-1. В некоторых вариантах осуществления первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIM-3. В некоторых вариантах осуществления первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на CTLA-4. В некоторых вариантах осуществления первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на LAG-3. В некоторых вариантах осуществления первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIGIT.[0070] In some embodiments, two shRNAs target PD-1. In some embodiments, the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets TIM-3. In some embodiments, the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets CTLA-4. In some embodiments, the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets LAG-3. In some embodiments, the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets TIGIT.

[0071] В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют кшРНК. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют более одной кшРНК. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК.[0071] In some embodiments, the implementation of the immune cell contains nucleotide sequences that encode shRNA. In some embodiments, the implementation of the immune cell contains nucleotide sequences that encode for more than one shRNA. In some embodiments, the immune cell contains nucleotide sequences that encode two shRNAs.

[0072] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности, кодирующие кшРНК, содержат последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-219 и 238-267. [0072] In some embodiments, the shRNA-encoding nucleotide sequences comprise sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-219 and 238-267.

[0073] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности, кодирующие кшРНК, находятся в векторе. [0073] In some embodiments, the nucleotide sequences encoding the shRNA are in a vector.

[0074] В некоторых вариантах экспрессия разных кшРНК, соответственно, регулируется разными промоторами. В некоторых вариантах экспрессия двух разных кшРНК, соответственно, регулируется двумя разными промоторами. В некоторых вариантах осуществления два разных промотора представляют собой промоторы РНК-полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления два промотора представляют собой промоторы U6. В некоторых вариантах осуществления промоторы U6 получают от разных видов. В некоторых вариантах осуществления два промотора ориентированы в разных направлениях относительно друг друга. Например, в определенном варианте осуществления промоторы ориентированы в направлении голова к голове. В другом варианте осуществления промоторы ориентированы в направлении хвост к хвосту.[0074] In some embodiments, the expression of different shRNAs, respectively, is regulated by different promoters. In some embodiments, the expression of two different shRNAs is respectively regulated by two different promoters. In some embodiments, the two different promoters are RNA polymerase III promoters. In some embodiments, the two promoters are U6 promoters. In some embodiments, U6 promoters are obtained from different species. In some embodiments, the two promoters are oriented in different directions relative to each other. For example, in a certain embodiment, the promoters are oriented in a head-to-head direction. In another embodiment, the promoters are oriented in a tail-to-tail direction.

[0075] В некоторых вариантах осуществления каждый из генетически сконструированного антигенного рецептора и агента генетического разрушения экспрессируется из вектора. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный антигенный рецептор и агент генетического разрушения экспрессируются из одного и того же вектора.[0075] In some embodiments, each of the genetically engineered antigen receptor and the genetic disruptor is expressed from a vector. In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor and the genetic disruptor are expressed from the same vector.

[0076] В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой плазмидный вектор или вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор или аденовирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления лентивирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор.[0076] In some embodiments, the vector is a plasmid vector or a viral vector. In some embodiments, the viral vector is a lentiviral vector or an adenoviral vector. In some embodiments, the lentiviral vector is a retroviral vector.

[0077] В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из Т-клетки и натуральной клетки-киллера (NK). В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления T-клетка представляет собой CD4+ T-клетку или CD8+ T-клетку.[0077] In some embodiments, the immune cell is selected from the group consisting of a T cell and a natural killer (NK) cell. In some embodiments, the immune cell is a T cell. In some embodiments, the T cell is a CD4+ T cell or a CD8+ T cell.

[0078] В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК и CAR в одном и том же векторе. В некоторых вариантах осуществления каждая из двух кшРНК регулируется двумя разными промоторами РНК-полимеразы III, ориентированными в разных направлениях относительно друг друга. Например, в определенном варианте осуществления промоторы ориентированы в направлении голова к голове. В другом варианте осуществления промоторы ориентированы в направлении хвост к хвосту. В некоторых вариантах осуществления CAR нацелен на CD19, первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая нацелена на TIGIT. [0078] In some embodiments, the immune cell contains nucleotide sequences that encode two shRNAs and a CAR in the same vector. In some embodiments, each of the two shRNAs is regulated by two different RNA polymerase III promoters oriented in different directions relative to each other. For example, in a certain embodiment, the promoters are oriented in a head-to-head direction. In another embodiment, the promoters are oriented in a tail-to-tail direction. In some embodiments, the CAR targets CD19, the first shRNA targets PD-1, and the second targets TIGIT.

[0079] В другом аспекте в данном документе предложена композиция, содержащая сконструированную иммунную клетку. В другом аспекте в данном документе предложена фармацевтическая композиция, содержащая иммунную клетку и фармацевтически приемлемый носитель.[0079] In another aspect, this document provides a composition comprising an engineered immune cell. In another aspect, this document provides a pharmaceutical composition comprising an immune cell and a pharmaceutically acceptable carrier.

[0080] В другом аспекте в данном документе предложен способ лечения, включающий введение субъекту, имеющему заболевание или патологические состояние, иммунной клетки или композиции. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный антигенный рецептор специфически связывается с антигеном, связанным с заболеванием или патологическим состоянием. В некоторых вариантах осуществления заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественное новообразование или опухоль. [0080] In another aspect, provided herein is a method of treatment comprising administering to a subject having a disease or condition an immune cell or composition. In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor specifically binds to an antigen associated with a disease or condition. In some embodiments, the disease or condition is a cancer or tumor.

[0081] В другом аспекте в данном документе предложены иммунные клетки или композиции для применения при лечении заболевания или патологического состояния. В другом аспекте в данном документе предложено применение иммунной клетки или композиции в изготовлении лекарственного препарата для лечения заболевания или патологического состояния. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный антигенный рецептор специфически связывается с антигеном, связанным с заболеванием или патологическим состоянием. В некоторых вариантах осуществления заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественное новообразование или опухоль.[0081] In another aspect, this document provides immune cells or compositions for use in the treatment of a disease or condition. In another aspect, this document provides the use of an immune cell or composition in the manufacture of a medicament for the treatment of a disease or condition. In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor specifically binds to an antigen associated with a disease or condition. In some embodiments, the disease or condition is a cancer or tumor.

Дополнительные неограничивающие варианты осуществления представлены ниже.Additional non-limiting embodiments are presented below.

1. Вектор, содержащий:1. Vector containing:

последовательность оснований, кодирующую два типа коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые ингибируют экспрессию по меньшей мере одного гена, ослабляющего функцию иммунных клеток, иa base sequence encoding two types of short hairpin RNA (shRNA) that inhibit the expression of at least one gene that impairs immune cell function, and

последовательность оснований, кодирующую химерный антигенный рецептор (CAR) или моноклональный Т-клеточный рецептор (mTCR).a base sequence encoding a chimeric antigen receptor (CAR) or a monoclonal T cell receptor (mTCR).

2. Вектор по варианту осуществления 1, отличающийся тем, что экспрессия двух типов кшРНК характеризуется тем, что они, соответственно, регулируются двумя разными промоторами.2. The vector according to embodiment 1, characterized in that the expression of two types of shRNA is characterized in that they are respectively regulated by two different promoters.

3. Вектор по варианту осуществления 2, отличающийся тем, что два промотора представляют собой промоторы РНК-полимеразы III.3. The vector of embodiment 2, wherein the two promoters are RNA polymerase III promoters.

4. Вектор по варианту осуществления 2, отличающийся тем, что два промотора представляют собой промоторы U6, полученные из разных видов.4. The vector of embodiment 2, wherein the two promoters are U6 promoters derived from different species.

5. Вектор по варианту осуществления 2, отличающийся тем, что два промотора ориентированы в разных направлениях относительно друг друга в векторе.5. The vector of embodiment 2, wherein the two promoters are oriented in different directions relative to each other in the vector.

6. Вектор по варианту осуществления 1, отличающийся тем, что ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, представляет собой рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.6. The vector of embodiment 1, wherein the immune cell function-impairing gene is an immune checkpoint receptor or ligand.

7. Вектор по варианту осуществления 6, отличающийся тем, что рецептор или лиганд иммунной контрольной точки выбран из группы, состоящей из PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK и 2B4.7. The vector of embodiment 6 wherein the immune checkpoint receptor or ligand is selected from the group consisting of PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 or CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK and 2B4.

8. Вектор по варианту осуществления 1, отличающийся тем, что ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, выбран из группы, состоящей из FAS, CD45, PP2A, SHIP1, SHIP2, DGK-альфа, DGK-дзета, Cbl-b, CD147, LRR1, TGFBR1, ИЛ-10R альфа, KLGR1, DNMT3A и A2aR.8. Vector according to embodiment 1, characterized in that the immune cell function-impairing gene is selected from the group consisting of FAS, CD45, PP2A, SHIP1, SHIP2, DGK-alpha, DGK-zeta, Cbl-b, CD147, LRR1 , TGFBR1, IL-10R alpha, KLGR1, DNMT3A and A2aR.

9. Вектор по варианту осуществления 1, отличающийся тем, что два типа кшРНК нацелены на один ген, который ослабляет функцию иммунных клеток, или при этом два типа кшРНК нацелены на разные гены, которые ослабляют функцию иммунных клеток. 9. The vector of embodiment 1, wherein the two shRNAs target the same gene that impairs immune cell function, or the two shRNAs target different genes that impair immune cell function.

10. Вектор по варианту осуществления 1, отличающийся тем, что два типа кшРНК нацелены на PD-1.10. The vector of embodiment 1, wherein two types of shRNA target PD-1.

11. Вектор по варианту осуществления 1, отличающийся тем, что из двух типов кшРНК i) одна кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIM-3, или ii) одна кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIGIT.11. The vector of embodiment 1, wherein of the two types of shRNA i) one shRNA targets PD-1 and the other shRNA targets TIM-3, or ii) one shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets on TIGIT.

12. Вектор по варианту осуществления 1, отличающийся тем, что из двух типов кшРНК последовательность оснований, кодирующая одну кшРНК, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-219, и последовательность оснований, кодирующую вторую кшРНК, содержит другую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-219.12. The vector according to embodiment 1, characterized in that of the two types of shRNA, the base sequence encoding one shRNA contains a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-219, and the base sequence encoding the second shRNA contains the other a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-219.

13. Вектор по варианту осуществления 1, отличающийся тем, что мишень для CAR или mTCR представляет собой опухолевый антиген человека, экспрессия которого повышена в раковой клетке, раковой ткани и/или микроокружении опухоли, или мутантную форму антигена, обнаруженную в раковой клетке, раковой ткани и/или микроокружении опухоли.13. Vector according to embodiment 1, characterized in that the target for CAR or mTCR is a human tumor antigen, the expression of which is increased in a cancer cell, cancer tissue and/or tumor microenvironment, or a mutant form of the antigen found in a cancer cell, cancer tissue and/or tumor microenvironment.

14. Вектор согласно варианту осуществления 1, отличающийся тем, что вектор содержит последовательность оснований SEQ ID NO: 220 или 221.14. Vector according to embodiment 1, characterized in that the vector contains the base sequence of SEQ ID NO: 220 or 221.

15. Вектор по варианту осуществления 1, отличающийся тем, что вектор представляет собой плазмидный вектор, лентивирусный вектор, аденовирусный вектор, вектор на основе аденоассоциированного вируса или ретровирусный вектор.15. The vector of embodiment 1, wherein the vector is a plasmid vector, a lentiviral vector, an adenoviral vector, an adeno-associated virus vector, or a retroviral vector.

16. Иммунная клетка, содержащая вектор в соответствии с вариантом осуществления 1, отличающаяся тем, что экспрессия одного или более генов снижена до 40% или менее, чем их экспрессия в отсутствие кшРНК.16. An immune cell containing the vector according to embodiment 1, characterized in that the expression of one or more genes is reduced to 40% or less than their expression in the absence of shRNA.

17. Иммунная клетка по варианту осуществления 16, отличающаяся тем, что иммунная клетка представляет собой человеческую Т-клетку или натуральную клетку-киллер (NK).17. The immune cell of embodiment 16, wherein the immune cell is a human T cell or a natural killer (NK) cell.

18. Фармацевтическая композиция, содержащая иммунную клетку по любому из вариантов осуществления 1-17.18. A pharmaceutical composition containing an immune cell according to any one of embodiments 1-17.

19. Фармацевтическая композиция по варианту осуществления 18 для лечения пациента, нуждающегося в иммунной терапии, отличающаяся тем, что иммунную клетку первоначально получают от пациента.19. Pharmaceutical composition according to embodiment 18 for treating a patient in need of immune therapy, characterized in that the immune cell is initially obtained from the patient.

20. Фармацевтическая композиция по варианту осуществления 19, отличающаяся тем, что у пациента имеется опухоль или злокачественное новообразование, при которых обнаруживается мишень и/или увеличение или изменение уровней мишени CAR или mTCR, экспрессируемых в иммунной клетке.20. Pharmaceutical composition according to embodiment 19, characterized in that the patient has a tumor or malignancy in which the target is detected and/or an increase or change in the levels of the target CAR or mTCR expressed in the immune cell.

21. Иммунная клетка, содержащая генетически сконструированный антигенный рецептор, который специфически связывается с целевым антигеном, и агент генетического разрушения, снижающий или способный снижать экспрессию в иммунной клетке гена, который ослабляет функцию иммунной клетки. 21. An immune cell containing a genetically engineered antigen receptor that specifically binds to a target antigen, and a genetic disruption agent that reduces or is capable of reducing expression in an immune cell of a gene that impairs immune cell function.

22. Иммунная клетка по варианту осуществления 21, отличающаяся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR).22. The immune cell of embodiment 21, wherein the genetically engineered antigen receptor is a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR).

23. Иммунная клетка по варианту осуществления 22, отличающаяся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой CAR.23. The immune cell of embodiment 22, wherein the genetically engineered antigen receptor is a CAR.

24. Иммунная клетка по варианту осуществления 23, отличающаяся тем, что CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточной домен сигнальной трансдукции. 24. The immune cell of embodiment 23, wherein the CAR contains an extracellular antigen recognition domain, a transmembrane domain, and an intracellular signal transduction domain.

25. Иммунная клетка по варианту осуществления 24, отличающаяся тем, что внеклеточный антигенраспознающий домен CAR специфически связывается с целевым антигеном.25. The immune cell of embodiment 24, wherein the CAR extracellular antigen recognition domain specifically binds to the target antigen.

26. Иммунная клетка по варианту осуществления 24, отличающаяся тем, что внутриклеточный домен сигнальной трансдукции CAR содержит внутриклеточный домен дзета-цепи CD3 (CD3ζ). 26. The immune cell of embodiment 24, wherein the intracellular signal transduction domain of CAR contains an intracellular domain of the CD3 zeta chain (CD3ζ).

27. Иммунная клетка по варианту осуществления 26, отличающаяся тем, что внутриклеточной домен сигнальной трансдукции CAR дополнительно содержит костимулирующую молекулу.27. An immune cell according to embodiment 26, wherein the intracellular signal transduction domain of CAR further comprises a co-stimulatory molecule.

28. Иммунная клетка по варианту осуществления 27, отличающаяся тем, что костимулирующая молекула выбрана из группы, состоящей из ICOS, 0X40, CD137 (4-1BB), CD27, и CD28.28. The immune cell of embodiment 27 wherein the costimulatory molecule is selected from the group consisting of ICOS, 0X40, CD137 (4-1BB), CD27, and CD28.

29. Иммунная клетка по варианту осуществления 28, отличающаяся тем, что костимулирующая молекула представляет собой CD137 (4-1BB).29. The immune cell of embodiment 28, wherein the costimulatory molecule is CD137 (4-1BB).

30. Иммунная клетка по варианту осуществления 28, отличающаяся тем, что костимулирующая молекула представляет собой CD28.30. The immune cell of embodiment 28, wherein the costimulatory molecule is CD28.

31. Иммунная клетка по варианту осуществления 22, отличающаяся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой TCR.31. The immune cell of embodiment 22, wherein the genetically engineered antigen receptor is a TCR.

32. Иммунная клетка по варианту осуществления 31, отличающаяся тем, что TCR представляет собой моноклональный TCR (mTCR).32. An immune cell according to embodiment 31, wherein the TCR is a monoclonal TCR (mTCR).

33. Иммунная клетка по варианту осуществления 31 или 32, отличающаяся тем, что целевой антиген экспрессируется в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли.33. The immune cell of embodiment 31 or 32, wherein the target antigen is expressed in or on the surface of the cancer cell, cancer tissue, and/or the tumor microenvironment.

34. Иммунная клетка по варианту осуществления 33, отличающаяся тем, что целевой антиген выбран из группы, состоящей из: 34. An immune cell according to embodiment 33, characterized in that the target antigen is selected from the group consisting of:

5T4 (трофобластический гликопротеин), 707-AP, 9D7, AFP (α-фетопротеин), AlbZIP (андроген-индуцируемый bZIP), HPG1 (специфический к простате человека ген-1), α5β1-интегрина, α5β6-интегрина, α --метилацил-коэнзим А рацемазы, ART-4 (АДФ рибозилтрансферазы-4), B7H4 (ингибитор активации Т-клеток 1, содержащий вариабельный иммуноглобулиноподобный домен), BAGE-1 (В меланомный антиген-1), BCL-2 (В-клеточный ХЛЛ/лимфома-2), BING-4 ( WD-повтор домена 46), CA 15-3/CA 27-29 (муцин 1), CA 19-9 (раковый антиген 19-9), CA 72-4 (раковый антиген 72-4), CA125 (раковый антиген 125), кальретикулина, CAMEL (ЦТЛ-распознаваемый антиген на меланоме), CASP-8 (каспаза 8), катепсина B, катепсина L, CD19 (кластер дифференцировки 19), CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (раковый эмбриональный антиген SG8), CLCA2 (канал-переносчик-2 для ионов хлора), CML28 (опухолевый антиген хронического миелолейкоза 28), коактозин-подобного белка, коллагена XXIII, COX-2 (циклооксигеназа-2), CT-9/BRD6 (раково-тестикулярный антиген 9), Cten (С-концевой тензиноподобный белок), циклина B1, циклина D1, cyp-B, CYPB1 (цитохром p450 семейство 1, подсемейство b, тип 1), DAM-10/MAGE-B1 (ассоциированный с меланомой антиген B1), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (рецептор эпидермального фактора роста), EMMPRIN (басигин), EpCam, EphA2 (эфрин-рецептор A2), EphA3, ErbB3 (рецептор тирозинкиназы 3 Erb-B2), EZH2 (усилитель субъединицы zeste гомолога 2 policomb-репрессивного комплекса 2), FGF-5 (фактор роста фибробластов 5), FN (фибронектин), Fra-1 (Fos-связанный антиген-1), G250/CAIX (карбоангидраза 9), GAGE-1 (G антиген-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP (ген, дифференциально экспрессируемый в простате), GnT-V (глюконаткиназа), gp100 (специфический для линии меланоцитов антиген GP100), GPC3 (глипикан-3), HAGE (спиральный антиген), HAST-2 (член 1 семейство сульфотрансферазы 1A), гепсина, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 рецептор тирозинкиназы 2), HERV-K-MEL, HNE (медуллазин), гомеобокса NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPVE7, HST-2 (сиртуин-2), hTERT, iCE (каспаза 1), IGF-1R (рецептор инсулиноподобного фактора роста-1), ИЛ-13Ra2 (α-2-субъединица рецептора интерлейкина-13), ИЛ-2R (рецептор интерлейкина-2), ИЛ-5 (интерлейкин-5), незрелого рецептора ламинина, калликреина-2, калликреина-4, Ki67, KIAA0205 (лизофосфатидилглицерол-ацилтрансфераза 1), KK-LC-1 (антиген-1 рака легкого кита-кюсю (kita-kyushu)), KM-HN-1, LAGE-1 (L-антиген, член 1 семейства белков LAGE), ливина, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGEA2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGEB17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2 (антиген меланомы семейства L2), маммаглобина A, MART-1/Melan-A (антиген меланомы, распознаваемый Т-клетками-1), MART-2, белка матрикса 22, MC1R (рецептор меланокортина-1 ), М-КСФ (макрофагальный колониестимулирующий фактор), мезотелина, MG50/PXDN (пероксидазина), MMP 11 (матриксная металлопротеиназа 11), MN/CA IX-антигена (карбоангидраза 9), MRP-3 (ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью белок-3), MUC1 (муцин 1), MUC2, NA88-A (псевдоген 1 VENT-подобного гомеобокса 2), N-ацетилглюкозаминилтрансферазы-V, Neo-PAP (нео-поли(А)-полимераза), NGEP (новый ген, экспрессируемый в простате), NMP22 (белок ядерного матрикса 22), NPM/ALK (нуклеофосмин), NSE (нейронспецифическая энолаза), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (QTL-1 остеоартрита), OFA-iLRP (раково-эмбриональный антиген-незрелый рецептор ламинина), OGT (O-GlcNAc-трансфераза), OS-9 (лектин эндоплазматического ретикулюма), остеокальцина, остеопонтина, p15 (ингибитор CDK 2B), p53, PAGE-4 (семейство P-антигена, член-4), PAI-1 (ингибитор активатора плазминогена 1), PAI-2, PAP (простатическая кислая фосфатаза), PART-1 (транскрипт-1, регулируемый андрогеном простаты), PATE (белок-1, экспрессируемый простатой и яичками), PDEF (полученный из простаты фактор Ets), Pim-1-киназы (сайт-1 интеграции провирусов), Pin1 (пептидил-пролил-цис-транс-изомераза-1), POTE (экспрессируемый в простате, яичнике, яичке и плаценте), PRAME (преимущественно экспрессируемый антиген при меланоме), простеина, протеиназы-3, PSA (простат-специфический антиген), PSCA (антиген стволовых клеток простаты), PSGR (простат-специфический рецептор, связанный с G-белком), PSM, PSMA (простат-специфический мембранный антиген), RAGE-1 (ассоциированный с опухолью антиген почечных карцином), RHAMM/CD168, RU1 (почечный убиквитарный белок-1), RU2, SAGE (антиген саркомы), SART-1 (антиген-1 плоскоклеточной карциномы, распознаваемый Т-клетками), SART-2, SART-3, Sp17 (белок спермы 17), SSX-1 (член-1 семейства SSX), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (металлоредуктаза STEAP2), STEAP, сурвивина, сурвивина-213, TA-90 (опухоль-ассоциированный антиген-90), TAG-72 (опухоль-ассоциированный гликопротеин-72), TARP(белок TCRγ с альтернативной рамкой считывания), TGFb (трансформирующий фактор роста β), TGFbR11 (рецептор-11 трансформирующего фактора роста β), TGM-4 (трансглютаминаза 4), TRAG-3(ген-3 устойчивости к таксолу), TRG (γ-локус рецептора Т-клеток), TRP-1 (транзиторный рецепторный потенциал 1), TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, тирозиназы, UPA (урокиназный активатор плазминогена), VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия A), VEGFR-2/FLK-1, и WT1 (белок опухоли Вильмса 1). 5T4 (trophoblastic glycoprotein), 707-AP, 9D7, AFP (α-fetoprotein), AlbZIP (androgen-inducible bZIP), HPG1 (human prostate-specific gene-1), α5β1-integrin, α5β6-integrin, α-methylacyl -coenzyme A of racemase, ART-4 (ADP ribosyltransferase-4), B7H4 (inhibitor of T-cell activation 1 containing a variable immunoglobulin-like domain), BAGE-1 (B melanoma antigen-1), BCL-2 (B-cell CLL/ lymphoma-2), BING-4 (WD repeat domain 46), CA 15-3/CA 27-29 (mucin 1), CA 19-9 (cancer antigen 19-9), CA 72-4 (cancer antigen 72 -4), CA125 (cancer antigen 125), calreticulin, CAMEL (CTL-recognized antigen on melanoma), CASP-8 (caspase 8), cathepsin B, cathepsin L, CD19 (differentiation cluster 19), CD20, CD22, CD25, CD30 CD33 CD4 CD52 CD55 CD56 CD80 , COX-2 (cyclooxygenase-2), CT-9/BRD6 (cancer-testicular antigen 9), Cten (C-terminal tensin-like protein), cyclin B1, cyclin D1, cyp-B, CYPB1 (cytochrome p450 family 1, subfamily b, type 1), DAM-10/MAGE-B1 (melanoma-associated B1 antigen), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (epidermal growth factor receptor), EMMPRIN (basigin), EpCam, EphA2 (ephrin- receptor A2), EphA3, ErbB3 (Erb-B2 tyrosine kinase 3 receptor), EZH2 (policomb repressive complex 2 homologue 2 zeste subunit enhancer), FGF-5 (fibroblast growth factor 5), FN (fibronectin), Fra-1 (Fos -linked antigen-1), G250/CAIX (carbonic anhydrase 9), GAGE-1 (G antigen-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE -8, GDEP (gene differentially expressed in the prostate), GnT-V (gluconate kinase), gp100 (melanocyte lineage-specific antigen GP100), GPC3 (glypican-3), HAGE (helical antigen), HAST-2 (member of the 1 family sulfotransferase 1A), hepsin, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2), HERV-K-MEL, HNE (medullazine), homeobox NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85 , HPV-E6, HPVE7, HST-2 (sirtuin-2), hTERT, iCE (caspase 1), IGF-1R (insulin-like growth factor-1 receptor), IL-13Ra2 (α-2 subunit of interleukin-13 receptor) , IL-2R (interleukin-2 receptor), IL-5 (interleukin-5), immature laminin receptor, kallikrein-2, kallikrein-4, Ki67, KIAA0205 (lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1), KK-LC-1 (antigen- 1 lung cancer kita-kyushu (kita-kyushu)), KM-HN-1, LAGE-1 (L-antigen, member 1 of the LAGE protein family), livin, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGEA2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGEB17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2 (L2 family melanoma antigen), mammaglobin A , MART-1/Melan-A (melanoma antigen recognized by T-cells-1), MART-2, matrix protein 22, MC1R (melanocortin-1 receptor), M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), mesothelin, MG50/PXDN (peroxidazine), MMP 11 (matrix metalloproteinase 11), MN/CA IX antigen (carbonic anhydrase 9), MRP-3 (multidrug resistance-associated protein-3), MUC1 (mucin 1), MUC2, NA88-A (pseudogene 1 VENT-like homeobox 2), N-acetylglucosaminyltransferase-V, Neo-PAP (neo-poly(A) polymerase), NGEP (new prostate-expressed gene), NMP22 (nuclear matrix protein 22), NPM/ALK ( nucleophosmin), NSE (neuron-specific enolase), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (Osteoarthritis QTL-1), OFA-iLRP (cancer-embryonic antigen-immature laminin receptor), OGT (O-GlcNAc-transferase ), OS-9 (endoplasmic reticulum lectin), osteocalcin, osteopontin, p15 (CDK 2B inhibitor), p53, PAGE-4 (P antigen family member-4), PAI-1 (plasminogen activator inhibitor 1), PAI- 2, PAP (Prostatic Acid Phosphatase), PART-1 (Prostate Androgen Regulated Transcript-1), PATE (Prostate-Testicular Expression Protein-1), PDEF (Prostate-Derived Factor Ets), Pim-1 Kinase (Site -1 integration of proviruses), Pin1 (peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase-1), POTE (expressed in prostate, ovary, testicle and placenta), PRAME (predominantly expressed antigen in melanoma), protein, proteinase-3, PSA (prostate-specific antigen), PSCA (prostate stem cell antigen), PSGR (prostate-specific G protein-coupled receptor), PSM, PSMA (prostate-specific membrane antigen), RAGE-1 (tumor-associated renal carcinoma antigen) ), RHAMM/CD168, RU1 (renal ubiquitary protein-1), RU2, SAGE (sarcoma antigen), SART-1 (squamous cell carcinoma antigen-1 recognized by T cells), SART-2, SART-3, Sp17 (protein sperm 17), SSX-1 (SSX family member-1), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (metal reductase STEAP2), STEAP, survivin, survivin-213, TA-90 (tumor -associated antigen-90), TAG-72 (tumor-associated glycoprotein-72), TARP (alternative reading frame protein TCRγ), TGFb (transforming growth factor β), TGFbR11 (transforming growth factor receptor 11), TGM- 4 (transglutaminase 4), TRAG-3 (taxol resistance gene-3), TRG (T cell receptor γ locus), TRP-1 (transient receptor potential 1), TRP-2/6b, TRP-2/INT2 , Trp-p8, tyrosinases, UPA (urokinase plasminogen activator), VEGF (vascular endothelial growth factor A), VEGFR-2/FLK-1, and WT1 (Wilms tumor protein 1).

35. Иммунная клетка по варианту осуществления 35, отличающаяся тем, что целевой антиген представляет собой CD19 или CD22.35. The immune cell of embodiment 35, wherein the target antigen is CD19 or CD22.

36. Иммунная клетка по варианту осуществления 36, отличающаяся тем, что целевой антиген представляет собой CD19.36. The immune cell of embodiment 36, wherein the target antigen is CD19.

37. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 34-36, отличающаяся тем, что целевой антиген представляет собой раковый антиген, экспрессия которого повышена в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли.37. The immune cell of any one of embodiments 34-36, wherein the target antigen is a cancer antigen that is overexpressed in or on the surface of the cancer cell, cancer tissue, and/or the tumor microenvironment.

38. Иммунная клетка по варианту осуществления 33, отличающаяся тем, что целевой антиген выбран из группы, состоящей из: 38. An immune cell according to embodiment 33, characterized in that the target antigen is selected from the group consisting of:

α-актинина-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, бета-катенина/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, миозина класса 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII, и TPI/m; иα-actinin-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, beta-catenin/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, myosin class 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/ m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII, and TPI/m; And

при этом целевой антиген представляет собой раковый антиген, который представляет собой мутированную форму антигена, экспрессируемого в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли. wherein the target antigen is a cancer antigen, which is a mutated form of an antigen expressed in or on the surface of a cancer cell, cancer tissue, and/or in the tumor microenvironment.

39. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 21-38, отличающаяся тем, что экспрессия гена, который ослабляет функцию иммунной клетки, вызывает одно или более из следующего: 39. The immune cell of any one of embodiments 21-38, wherein expression of a gene that impairs immune cell function causes one or more of the following:

i) ингибирование пролиферации иммунной клетки;i) inhibition of immune cell proliferation;

ii) индукция клеточной гибели иммунной клетки;ii) induction of cell death of the immune cell;

iii) ингибирование способности иммунной клетки распознавать целевой антиген и/или подвергаться активации;iii) inhibiting the ability of the immune cell to recognize the target antigen and/or be activated;

iv) индукция дифференцировки иммунной клетки в клетку, которая не индуцирует иммунный ответ на целевой антиген;iv) inducing differentiation of the immune cell into a cell that does not induce an immune response to the target antigen;

v) ослабление реакций иммунной клетки на молекулу, которая способствует иммунному ответу иммунной клетки; илиv) attenuating immune cell responses to a molecule that promotes an immune cell response; or

vi) усиление реакции иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.vi) enhancing the response of an immune cell to a molecule that suppresses the immune response of the immune cell.

40. Иммунная клетка по варианту осуществления 39, отличающаяся тем, что ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, выбран из группы, состоящей из: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, 2B4, FAS, CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-альфа, DGK-дзета, Cbl-b, Cbl-c, CD148, LRR1, TGFBR1, ИЛ-10RA, KLGR1, DNMT3A, и A2aR.40. An immune cell according to embodiment 39, wherein the gene that impairs immune cell function is selected from the group consisting of: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3, or CEACAM- 5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, 2B4, FAS, CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-alpha, DGK-zeta, Cbl-b, Cbl-c, CD148, LRR1, TGFBR1, IL-10RA, KLGR1, DNMT3A, and A2aR.

41. Иммунная клетка по варианту осуществления 39, отличающаяся тем, что где ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, усиливает реакцию иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.41. An immune cell according to embodiment 39, wherein the gene that impairs the function of the immune cell enhances the response of the immune cell to a molecule that suppresses the immune response of the immune cell.

42. Иммунная клетка по варианту осуществления 41, отличающаяся тем, что ген, который усиливает реакцию иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки, кодирует рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.42. The immune cell of embodiment 41, wherein the gene that enhances the immune cell's response to a molecule that suppresses the immune cell's immune response encodes an immune checkpoint receptor or ligand.

43. Иммунная клетка по варианту осуществления 42, отличающаяся тем, что рецептор или лиганд иммунной контрольной точки выбран из группы, состоящей из PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK и 2B4.43. The immune cell of embodiment 42, wherein the immune checkpoint receptor or ligand is selected from the group consisting of PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3, or CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK and 2B4.

44. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 21-43, отличающаяся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена в иммунной клетке, который ослабляет функцию иммунной клетки на по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с иммунной клеткой в отсутствие агента генетического разрушения.44. The immune cell of any one of embodiments 21-43, wherein the genetic disruption agent reduces the expression of a gene in the immune cell that reduces immune cell function by at least 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 95% compared to an immune cell in the absence of a genetic disruptor.

45. Иммунная клетка по варианту осуществления 44, отличающаяся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который усиливает реакцию иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.45. The immune cell of embodiment 44, wherein the genetic disruptor reduces the expression of a gene that enhances the immune cell's response to a molecule that suppresses the immune cell's immune response.

46. Иммунная клетка по варианту осуществления 45, отличающаяся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который кодирует рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.46. The immune cell of embodiment 45, wherein the genetic disruptor reduces the expression of a gene that encodes an immune checkpoint receptor or ligand.

47. Иммунная клетка по варианту осуществления 46, отличающаяся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, выбранного из группы, состоящей из: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, и 2B4. 47. An immune cell according to embodiment 46, wherein the genetic disruption agent reduces the expression of a gene selected from the group consisting of: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3, or CEACAM-5 ), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, and 2B4.

48. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 45-47, отличающаяся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию иммунной клетки посредством РНК-интерференции (РНКи).48. The immune cell of any one of embodiments 45-47, wherein the genetic disruption agent reduces the expression of a gene that impairs immune cell function through RNA interference (RNAi).

49. Иммунная клетка по варианту осуществления 48, отличающаяся тем, что более чем один агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию иммунной клетки в иммунной клетке посредством РНКи.49. The immune cell of embodiment 48 wherein more than one genetic disruption agent reduces the expression of a gene that impairs immune cell function in the immune cell via RNAi.

50. Иммунная клетка по варианту осуществления 49, отличающаяся тем, что агенты генетического разрушения нацелены на один ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, или при этом различные агенты генетического разрушения нацелены на разные гены, которые ослабляют функцию иммунной клетки, например, при этом первый агент генетического разрушения нацелен на первый ген, а второй агент генетического разрушения нацелен на второй ген.50. The immune cell of embodiment 49, wherein the genetic disruptors target one gene that impairs immune cell function, or wherein the different genetic disruptors target different genes that impair immune cell function, e.g. the genetic disruptor agent targets the first gene and the second genetic disruptor targets the second gene.

51. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 48-50, отличающаяся тем, что РНКи опосредуется короткой шпилечной РНК (кшРНК).51. The immune cell of any one of embodiments 48-50, wherein the RNAi is mediated by short hairpin RNA (shRNA).

52. Иммунная клетка по варианту осуществления 51, отличающаяся тем, что РНКи опосредуется более чем одной кшРНК.52. The immune cell of embodiment 51, wherein the RNAi is mediated by more than one shRNA.

53. Иммунная клетка по варианту осуществления 52, отличающаяся тем, что РНКи опосредуется двумя кшРНК.53. The immune cell of embodiment 52, wherein the RNAi is mediated by two shRNAs.

54. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 52-53, отличающаяся тем, что две кшРНК нацелены на PD-1.54. An immune cell according to any one of embodiments 52-53, wherein two shRNAs target PD-1.

55. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 52-53, отличающаяся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIM-3.55. An immune cell according to any one of embodiments 52-53, wherein the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets TIM-3.

56. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 52-53, отличающаяся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на CTLA-4.56. An immune cell according to any one of embodiments 52-53, wherein the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets CTLA-4.

57. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 52-53, отличающаяся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на LAG-3.57. An immune cell according to any one of embodiments 52-53, wherein the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets LAG-3.

58. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 52-53, отличающаяся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIGIT.58. The immune cell of any one of embodiments 52-53, wherein the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets TIGIT.

59. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 51-58, отличающаяся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют кшРНК.59. An immune cell according to any one of embodiments 51-58, wherein the immune cell contains nucleotide sequences that encode shRNA.

60. Иммунная клетка по варианту осуществления 59, отличающаяся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют более одной кшРНК.60. The immune cell of embodiment 59, wherein the immune cell contains nucleotide sequences that encode more than one shRNA.

61. Иммунная клетка по варианту осуществления 59, отличающаяся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК.61. The immune cell of embodiment 59, wherein the immune cell contains nucleotide sequences that encode two shRNAs.

62. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 59-61, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая кшРНК, содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-219 и 238-267. 62. An immune cell according to any one of embodiments 59-61, wherein the nucleotide sequence encoding the shRNA contains a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-219 and 238-267.

63. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 59-62, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая кшРНК, присутствует в векторе. 63. An immune cell according to any one of embodiments 59-62, wherein the nucleotide sequence encoding the shRNA is present in the vector.

64. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 63, отличающаяся тем, что экспрессия разных кшРНК регулируется разными промоторами.64. An immune cell according to any one of embodiments 63, characterized in that the expression of different shRNAs is regulated by different promoters.

65. Иммунная клетка по варианту осуществления 64, отличающаяся тем, что экспрессия двух разных кшРНК регулируется двумя разными промоторами.65. An immune cell according to embodiment 64, wherein the expression of two different shRNAs is regulated by two different promoters.

66. Иммунная клетка по варианту осуществления 65, отличающаяся тем, что два разных промотора представляют собой промоторы РНК-полимеразы III.66. The immune cell of embodiment 65, wherein the two different promoters are RNA polymerase III promoters.

67. Иммунная клетка по варианту осуществления 66, отличающаяся тем, что два промотора представляют собой промоторы U6.67. The immune cell of embodiment 66, wherein the two promoters are U6 promoters.

68. Иммунная клетка по варианту осуществления 67, отличающаяся тем, что промоторы U6 получают из разных видов.68. An immune cell according to embodiment 67, wherein the U6 promoters are obtained from different species.

69. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 65-68, отличающаяся тем, что два промотора ориентированы в разных направлениях относительно друг друга.69. An immune cell according to any one of embodiments 65-68, characterized in that the two promoters are oriented in different directions relative to each other.

70. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 21-69, отличающаяся тем, что каждый из генетически сконструированного антигенного рецептора и агента(ов) генетического разрушения экспрессируется из вектора.70. The immune cell of any one of embodiments 21-69, wherein each of the genetically engineered antigen receptor and genetic disruption agent(s) is expressed from a vector.

71. Иммунная клетка по варианту осуществления 70, отличающаяся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор и агент(ы) генетического разрушения экспрессируются из одного и того же вектора.71. The immune cell of embodiment 70, wherein the genetically engineered antigen receptor and the genetic disruption agent(s) are expressed from the same vector.

72. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 70-71, отличающаяся тем, что вектор представляет собой плазмидный вектор или вирусный вектор.72. An immune cell according to any one of embodiments 70-71, wherein the vector is a plasmid vector or a viral vector.

73. Иммунная клетка по варианту осуществления 72, отличающаяся тем, что вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор, аденовирусный вектор или вектор на основе аденоассоциированного вируса.73. The immune cell of embodiment 72, wherein the viral vector is a lentiviral vector, an adenoviral vector, or an adeno-associated virus vector.

74. Иммунная клетка по варианту осуществления 73, отличающаяся тем, что лентивирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор.74. The immune cell of embodiment 73, wherein the lentiviral vector is a retroviral vector.

75. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 21-74, отличающаяся тем, что иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из Т-клетки и натуральной клетки-киллера (NK).75. The immune cell of any one of embodiments 21-74, wherein the immune cell is selected from the group consisting of a T cell and a natural killer (NK) cell.

76. Иммунная клетка по варианту осуществления 75, отличающаяся тем, что иммунная клетка представляет собой Т-клетку.76. The immune cell of embodiment 75, wherein the immune cell is a T cell.

77. Иммунная клетка по варианту осуществления 76, отличающаяся тем, что Т-клетка представляет собой CD4+ Т-клетку или CD8+ Т-клетку.77. The immune cell of embodiment 76, wherein the T cell is a CD4+ T cell or a CD8+ T cell.

78. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 76 или 77, отличающаяся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК и CAR или mTCR в одном и том же векторе. 78. An immune cell according to any one of embodiments 76 or 77, wherein the immune cell contains nucleotide sequences that encode two shRNAs and a CAR or mTCR in the same vector.

79. Иммунная клетка по варианту осуществления 78, отличающаяся тем, что каждая из двух кшРНК регулируется двумя разными промоторами РНК-полимеразы III, ориентированными в разных направлениях относительно друг друга.79. An immune cell according to embodiment 78, wherein each of the two shRNAs is regulated by two different RNA polymerase III promoters oriented in different directions relative to each other.

80. Иммунная клетка по варианту осуществления 79, отличающаяся тем, что CAR нацелен на CD19, первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIGIT. 80. The immune cell of embodiment 79, wherein CAR targets CD19, the first shRNA targets PD-1, and the second shRNA targets TIGIT.

81. Способ получения иммунной клетки, включающий введение в иммунную клетку одновременно или последовательно в любом порядке:81. A method for producing an immune cell, which includes introducing into the immune cell simultaneously or sequentially in any order:

(1) гена, кодирующего генетически сконструированный антигенный рецептор, который специфически связывается с целевым антигеном; и (1) a gene encoding a genetically engineered antigen receptor that specifically binds to the target antigen; And

(2) агента генетического разрушения, причем агент генетического разрушения, или его экспрессия, снижает или способна снижать экспрессию в иммунной клетке гена, который ослабляет функцию иммунной клетки,(2) a genetic disruptor, wherein the genetic disruptor, or expression thereof, reduces or is capable of reducing expression in an immune cell of a gene that impairs immune cell function,

тем самым получая иммунную клетку, в которой экспрессируется генетически сконструированный антигенный рецептор, и снижается экспрессия гена, который ослабляет функцию иммунной клетки. thereby obtaining an immune cell in which the genetically engineered antigen receptor is expressed and the expression of a gene that impairs immune cell function is reduced.

82. Способ по варианту осуществления 81, отличающийся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR).82. The method of Embodiment 81 wherein the genetically engineered antigen receptor is a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR).

83. Способ по варианту осуществления 82, отличающийся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой CAR.83. The method of embodiment 82 wherein the genetically engineered antigen receptor is a CAR.

84. Способ по варианту осуществления 83, отличающийся тем, что CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточной домен сигнальной трансдукции. 84. The method of embodiment 83 wherein the CAR comprises an extracellular antigen recognition domain, a transmembrane domain, and an intracellular signal transduction domain.

85. Способ по варианту осуществления 84, отличающийся тем, что внеклеточный антигенраспознающий домен CAR специфически связывается с целевым антигеном.85. The method of embodiment 84, wherein the extracellular antigen recognition domain of CAR specifically binds to the target antigen.

86. Способ по варианту осуществления 84, отличающийся тем, что внутриклеточный домен сигнальной трансдукции CAR содержит внутриклеточный домен дзета-цепи CD3 (CD3ζ). 86. The method of embodiment 84 wherein the intracellular signal transduction domain of CAR comprises an intracellular domain of the CD3 zeta chain (CD3ζ).

87. Способ по варианту осуществления 86, отличающийся тем, что внутриклеточной домен сигнальной трансдукции CAR дополнительно содержит костимулирующую молекулу.87. The method of embodiment 86 wherein the intracellular signal transduction domain of CAR further comprises a co-stimulatory molecule.

88. Способ по варианту осуществления 87, отличающийся тем, что костимулирующая молекула выбрана из группы, состоящей из ICOS, 0X40, CD137 (4-1BB), CD27, и CD28.88. The method of embodiment 87 wherein the costimulatory molecule is selected from the group consisting of ICOS, 0X40, CD137 (4-1BB), CD27, and CD28.

89. Способ по варианту осуществления 88, отличающийся тем, что костимулирующая молекула представляет собой CD137 (4-1BB).89. The method of embodiment 88 wherein the costimulatory molecule is CD137 (4-1BB).

90. Способ по варианту осуществления 88, отличающийся тем, что костимулирующая молекула представляет собой CD28.90. The method of embodiment 88 wherein the costimulatory molecule is CD28.

91. Способ по варианту осуществления 82, отличающийся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой TCR.91. The method of embodiment 82 wherein the genetically engineered antigen receptor is a TCR.

92. Способ по варианту осуществления 91, отличающийся тем, что TCR представляет собой моноклональный TCR (mTCR).92. The method of embodiment 91 wherein the TCR is a monoclonal TCR (mTCR).

93. Способ по любому из вариантов осуществления 81-92, отличающаяся тем, что целевой антиген экспрессируется в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли.93. The method of any one of embodiments 81-92, wherein the target antigen is expressed in or on the surface of the cancer cell, cancer tissue, and/or the tumor microenvironment.

94. Способ по варианту осуществления 93, отличающийся тем, что целевой антиген выбран из группы, состоящей из: 94. The method of embodiment 93, wherein the target antigen is selected from the group consisting of:

5T4 (трофобластический гликопротеин), 707-AP, 9D7, AFP (α-фетопротеин), AlbZIP (андроген-индуцируемый bZIP), HPG1 (специфический к простате человека ген-1), α5β1-интегрина, α5β6-интегрина, α --метилацил-коэнзим А рацемазы, ART-4 (АДФ рибозилтрансферазы-4), B7H4 (ингибитор активации Т-клеток 1, содержащий вариабельный иммуноглобулиноподобный домен), BAGE-1 (В меланомный антиген-1), BCL-2 (В-клеточный ХЛЛ/лимфома-2), BING-4 ( WD-повтор домена 46), CA 15-3/CA 27-29 (муцин 1), CA 19-9 (раковый антиген 19-9), CA 72-4 (раковый антиген 72-4), CA125 (раковый антиген 125), кальретикулина, CAMEL (ЦТЛ-распознаваемый антиген на меланоме), CASP-8 (каспаза 8), катепсина B, катепсина L, CD19 (кластер дифференцировки 19), CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (раковый эмбриональный антиген SG8), CLCA2 (канал-переносчик-2 для ионов хлора), CML28 (опухолевый антиген хронического миелолейкоза 28), коактозин-подобного белка, коллагена XXIII, COX-2 (циклооксигеназа-2), CT-9/BRD6 (раково-тестикулярный антиген 9), Cten (С-концевой тензиноподобный белок), циклина B1, циклина D1, cyp-B, CYPB1 (цитохром p450 семейство 1, подсемейство b, тип 1), DAM-10/MAGE-B1 (ассоциированный с меланомой антиген B1), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (рецептор эпидермального фактора роста), EMMPRIN (басигин), EpCam, EphA2 (эфрин-рецептор A2), EphA3, ErbB3 (рецептор тирозинкиназы 3 Erb-B2), EZH2 (усилитель субъединицы zeste гомолога 2 policomb-репрессивного комплекса 2), FGF-5 (фактор роста фибробластов 5), FN (фибронектин), Fra-1 (Fos-связанный антиген-1), G250/CAIX (карбоангидраза 9), GAGE-1 (G антиген-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP (ген, дифференциально экспрессируемый в простате), GnT-V (глюконаткиназа), gp100 (специфический для линии меланоцитов антиген GP100), GPC3 (глипикан-3), HAGE (спиральный антиген), HAST-2 (член 1 семейство сульфотрансферазы 1A), гепсина, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 рецептор тирозинкиназы 2), HERV-K-MEL, HNE (медуллазин), гомеобокса NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPVE7, HST-2 (сиртуин-2), hTERT, iCE (каспаза 1), IGF-1R (рецептор инсулиноподобного фактора роста-1), ИЛ-13Ra2 (α-2-субъединица рецептора интерлейкина-13), ИЛ-2R (рецептор интерлейкина-2), ИЛ-5 (интерлейкин-5), незрелого рецептора ламинина, калликреина-2, калликреина-4, Ki67, KIAA0205 (лизофосфатидилглицерол-ацилтрансфераза 1), KK-LC-1 (антиген-1 рака легкого кита-кюсю (kita-kyushu)), KM-HN-1, LAGE-1 (L-антиген, член 1 семейства белков LAGE), ливина, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGEA2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGEB17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2 (антиген меланомы семейства L2), маммаглобина A, MART-1/Melan-A (антиген меланомы, распознаваемый Т-клетками-1), MART-2, белка матрикса 22, MC1R (рецептор меланокортина-1 ), М-КСФ (макрофагальный колониестимулирующий фактор), мезотелина, MG50/PXDN (пероксидазина), MMP 11 (матриксная металлопротеиназа 11), MN/CA IX-антигена (карбоангидраза 9), MRP-3 (ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью белок-3), MUC1 (муцин 1), MUC2, NA88-A (псевдоген 1 VENT-подобного гомеобокса 2), N-ацетилглюкозаминилтрансферазы-V, Neo-PAP (нео-поли(А)-полимераза), NGEP (новый ген, экспрессируемый в простате), NMP22 (белок ядерного матрикса 22), NPM/ALK (нуклеофосмин), NSE (нейронспецифическая энолаза), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (QTL-1 остеоартрита), OFA-iLRP (раково-эмбриональный антиген-незрелый рецептор ламинина), OGT (O-GlcNAc-трансфераза), OS-9 (лектин эндоплазматического ретикулюма), остеокальцина, остеопонтина, p15 (ингибитор CDK 2B), p53, PAGE-4 (семейство P-антигена, член-4), PAI-1 (ингибитор активатора плазминогена 1), PAI-2, PAP (простатическая кислая фосфатаза), PART-1 (транскрипт-1, регулируемый андрогеном простаты), PATE (белок-1, экспрессируемый простатой и яичками), PDEF (полученный из простаты фактор Ets), Pim-1-киназы (сайт-1 интеграции провирусов), Pin1 (пептидил-пролил-цис-транс-изомераза-1), POTE (экспрессируемый в простате, яичнике, яичке и плаценте), PRAME (преимущественно экспрессируемый антиген при меланоме), простеина, протеиназы-3, PSA (простат-специфический антиген), PSCA (антиген стволовых клеток простаты), PSGR (простат-специфический рецептор, связанный с G-белком), PSM, PSMA (простат-специфический мембранный антиген), RAGE-1 (ассоциированный с опухолью антиген почечных карцином), RHAMM/CD168, RU1 (почечный убиквитарный белок-1), RU2, SAGE (антиген саркомы), SART-1 (антиген-1 плоскоклеточной карциномы, распознаваемый Т-клетками), SART-2, SART-3, Sp17 (белок спермы 17), SSX-1 (член-1 семейства SSX), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (металлоредуктаза STEAP2), STEAP, сурвивина, сурвивина-213, TA-90 (опухоль-ассоциированный антиген-90), TAG-72 (опухоль-ассоциированный гликопротеин-72), TARP(белок TCRγ с альтернативной рамкой считывания), TGFb (трансформирующий фактор роста β), TGFbR11 (рецептор-11 трансформирующего фактора роста β), TGM-4 (трансглютаминаза 4), TRAG-3(ген-3 устойчивости к таксолу), TRG (γ-локус рецептора Т-клеток), TRP-1 (транзиторный рецепторный потенциал 1), TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, тирозиназы, UPA (урокиназный активатор плазминогена), VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия A), VEGFR-2/FLK-1, и WT1 (белок опухоли Вильмса 1). 5T4 (trophoblastic glycoprotein), 707-AP, 9D7, AFP (α-fetoprotein), AlbZIP (androgen-inducible bZIP), HPG1 (human prostate-specific gene-1), α5β1 -integrin, α5β6-integrin, α- -methylacyl-coenzyme A of racemase, ART-4 (ADP ribosyltransferase-4), B7H4 (inhibitor of T-cell activation 1 containing a variable immunoglobulin-like domain), BAGE-1 (B melanoma antigen-1), BCL-2 (B-cell CLL/lymphoma-2), BING-4 (WD repeat domain 46), CA 15-3/CA 27-29 (mucin 1), CA 19-9 (cancer antigen 19-9), CA 72-4 (cancer antigen 72-4), CA125 (cancer antigen 125), calreticulin, CAMEL (CTL-recognized antigen on melanoma), CASP-8 (caspase 8), cathepsin B, cathepsin L, CD19 (differentiation cluster 19), CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (SG8 cancer embryonic antigen), CLCA2 (chlorine ion transporter channel-2), CML28 (chronic myeloid leukemia tumor antigen 28), collagen XXIII, COX-2 (cyclooxygenase-2), CT-9/BRD6 (cancer-testicular antigen 9), Cten (C-terminal tensin-like protein), cyclin B1, cyclin D1, cyp-B, CYPB1 (cytochrome p450 family 1 , subfamily b, type 1), DAM-10/MAGE-B1 (melanoma-associated antigen B1), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (epidermal growth factor receptor), EMMPRIN (basigin), EpCam, EphA2 ( ephrin receptor A2), EphA3, ErbB3 (Erb-B2 tyrosine kinase 3 receptor), EZH2 (policomb repressive complex 2 homologue 2 zeste subunit enhancer), FGF-5 (fibroblast growth factor 5), FN (fibronectin), Fra-1 (Fos-linked antigen-1), G250/CAIX (carbonic anhydrase 9), GAGE-1 (G antigen-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b , GAGE-8, GDEP (gene differentially expressed in the prostate), GnT-V (gluconate kinase), gp100 (melanocyte lineage specific antigen GP100), GPC3 (glypican-3), HAGE (helical antigen), HAST-2 (member 1 sulfotransferase family 1A), hepsin, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2), HERV-K-MEL, HNE (medullasin), homeobox NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES -85, HPV-E6, HPVE7, HST-2 (sirtuin-2), hTERT, iCE (caspase 1), IGF-1R (insulin-like growth factor-1 receptor), IL-13Ra2 (α-2-subunit of interleukin receptor- 13), IL-2R (interleukin-2 receptor), IL-5 (interleukin-5), immature laminin receptor, kallikrein-2, kallikrein-4, Ki67, KIAA0205 (lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1), KK-LC-1 ( lung cancer antigen-1 kita-kyushu (kita-kyushu)), KM-HN-1, LAGE-1 (L-antigen, member 1 of the LAGE protein family), livin, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGEA2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGEB17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE- B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2 (L2 family melanoma antigen), mammaglobin A, MART-1/Melan-A (melanoma antigen recognized by T-cells-1), MART-2, matrix protein 22, MC1R (melanocortin-1 receptor), M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), mesothelin, MG50 /PXDN (peroxidazine), MMP 11 (matrix metalloproteinase 11), MN/CA IX antigen (carbonic anhydrase 9), MRP-3 (multidrug resistance-associated protein-3), MUC1 (mucin 1), MUC2, NA88-A (pseudogene 1 of VENT-like homeobox 2), N-acetylglucosaminyltransferase-V, Neo-PAP (neo-poly(A) polymerase), NGEP (new prostate-expressed gene), NMP22 (nuclear matrix protein 22), NPM/ ALK (nucleophosmin), NSE (neuron specific enolase), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (Osteoarthritis QTL-1), OFA-iLRP (cancer embryonic antigen-immature laminin receptor), OGT (O-GlcNAc -transferase), OS-9 (endoplasmic reticulum lectin), osteocalcin, osteopontin, p15 (CDK 2B inhibitor), p53, PAGE-4 (P-antigen family member-4), PAI-1 (plasminogen activator inhibitor 1), PAI-2, PAP (Prostatic Acid Phosphatase), PART-1 (Prostate Androgen Regulated Transcript-1), PATE (Prostate and Testicular Expression Protein-1), PDEF (Prostate-Derived Ets Factor), Pim-1 Kinases (provirus integration site-1), Pin1 (peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase-1), POTE (expressed in prostate, ovary, testis and placenta), PRAME (predominantly expressed melanoma antigen), proteinase, proteinase-3 , PSA (prostate-specific antigen), PSCA (prostate stem cell antigen), PSGR (prostate-specific G protein-coupled receptor), PSM, PSMA (prostate-specific membrane antigen), RAGE-1 (tumor-associated antigen renal carcinomas), RHAMM/CD168, RU1 (renal ubiquitary protein-1), RU2, SAGE (sarcoma antigen), SART-1 (squamous cell carcinoma antigen-1 recognized by T cells), SART-2, SART-3, Sp17 (sperm protein 17), SSX-1 (SSX family member-1), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (metal reductase STEAP2), STEAP, survivin, survivin-213, TA-90 (tumor-associated antigen-90), TAG-72 (tumor-associated glycoprotein-72), TARP (alternate reading frame TCRγ protein), TGFb (transforming growth factor β), TGFbR11 (transforming growth factor receptor-11), TGM-4 (transglutaminase 4), TRAG-3 (Taxol resistance gene-3), TRG (T cell receptor γ locus), TRP-1 (transient receptor potential 1), TRP-2/6b, TRP-2 /INT2, Trp-p8, tyrosinases, UPA (urokinase plasminogen activator), VEGF (vascular endothelial growth factor A), VEGFR-2/FLK-1, and WT1 (Wilms tumor protein 1).

95. Способ по варианту осуществления 95, отличающийся тем, что целевой антиген представляет собой CD19 или CD22.95. The method of embodiment 95 wherein the target antigen is CD19 or CD22.

96. Способ по варианту осуществления 96, отличающийся тем, что целевой антиген представляет собой CD19.96. The method of embodiment 96 wherein the target antigen is CD19.

97. Способ по любому из вариантов осуществления 94-96, отличающийся тем, что целевой антиген представляет собой раковый антиген, при этом раковый антиген представляет собой антиген, экспрессия которого повышена в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли.97. The method of any one of embodiments 94-96, wherein the target antigen is a cancer antigen, wherein the cancer antigen is an antigen that is overexpressed in or on the surface of a cancer cell, cancer tissue, and/or the tumor microenvironment.

98. Способ по варианту осуществления 93, отличающийся тем, что целевой антиген выбран из группы, состоящей из: 98. The method of embodiment 93, wherein the target antigen is selected from the group consisting of:

α-актинина-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, бета-катенина/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, миозина класса 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII, и TPI/m; иα-actinin-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, beta-catenin/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, myosin class 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/ m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII, and TPI/m; And

при этом целевой антиген представляет собой раковый антиген, причем раковый антиген представляет собой мутированную форму антигена, экспрессируемого в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли. wherein the target antigen is a cancer antigen, wherein the cancer antigen is a mutated form of an antigen expressed in or on the surface of a cancer cell, cancer tissue, and/or in the tumor microenvironment.

99. Способ по любому из вариантов осуществления 81-98, отличающийся тем, что экспрессия гена, который ослабляет функцию иммунной клетки, вызывает одно или более из следующего: 99. The method of any one of embodiments 81-98, wherein expression of a gene that impairs immune cell function causes one or more of the following:

i) ингибирование пролиферации иммунной клетки;i) inhibition of immune cell proliferation;

ii) индукция клеточной гибели иммунной клетки;ii) induction of cell death of the immune cell;

iii) ингибирование способности иммунной клетки распознавать целевой антиген и/или активироваться;iii) inhibiting the ability of the immune cell to recognize the target antigen and/or be activated;

iv) индукция дифференцировки иммунной клетки в клетку, которая не индуцирует иммунный ответ на целевой антиген;iv) inducing differentiation of the immune cell into a cell that does not induce an immune response to the target antigen;

v) ослабление реакции иммунной клетки на молекулу, которая способствует иммунному ответу иммунной клетки; илиv) weakening the response of the immune cell to a molecule that promotes the immune response of the immune cell; or

vi) усиление реакции иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.vi) enhancing the response of an immune cell to a molecule that suppresses the immune response of the immune cell.

100. Способ по варианту осуществления 99, отличающаяся тем, что ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, выбран из группы, состоящей из: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, 2B4, FAS, CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-альфа, DGK-дзета, Cbl-b, Cbl-c, CD148, LRR1, TGFBR1, ИЛ-10RA, KLGR1, DNMT3A, и A2aR.100. The method of Embodiment 99 wherein the gene that impairs immune cell function is selected from the group consisting of: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 or CEACAM-5 ), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, 2B4, FAS, CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-alpha, DGK-zeta, Cbl-b, Cbl-c, CD148, LRR1 , TGFBR1, IL-10RA, KLGR1, DNMT3A, and A2aR.

101. Способ по варианту осуществления 99, отличающийся тем, что где ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, усиливает реакцию иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.101. The method of embodiment 99 wherein the gene that impairs immune cell function enhances the immune cell's response to a molecule that suppresses the immune cell's immune response.

102. Способ по варианту осуществления 101, отличающийся тем, что ген, который усиливает реакцию иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки, кодирует рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.102. The method of embodiment 101 wherein the gene that enhances an immune cell's response to a molecule that suppresses the immune cell's immune response encodes an immune checkpoint receptor or ligand.

103. Способ по варианту осуществления 102, отличающийся тем, что рецептор или лиганд иммунной контрольной точки выбран из группы, состоящей из PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK и 2B4.103. The method of embodiment 102 wherein the immune checkpoint receptor or ligand is selected from the group consisting of PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 or CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK and 2B4.

104. Способ по любому из вариантов осуществления 81-103, отличающийся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена в иммунной клетке, который ослабляет функцию иммунной клетки на по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с иммунной клеткой в отсутствие агента(ов) генетического разрушения.104. The method of any one of embodiments 81-103, wherein the genetic disruption agent reduces the expression of a gene in an immune cell that impairs immune cell function by at least 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 95 % compared with the immune cell in the absence of agent(s) of genetic destruction.

105. Способ по варианту осуществления 104, отличающийся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который усиливает реакцию иммунной клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.105. The method of embodiment 104 wherein the genetic disruption agent reduces the expression of a gene that enhances an immune cell's response to a molecule that suppresses the immune cell's immune response.

106. Способ по варианту осуществления 105, отличающийся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который кодирует рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.106. The method of embodiment 105 wherein the genetic disruption agent reduces the expression of a gene that encodes an immune checkpoint receptor or ligand.

107. Способ по варианту осуществления 106, отличающийся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, выбранного из группы, состоящей из: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, и 2B4. 107. The method of embodiment 106 wherein the genetic disruption agent reduces the expression of a gene selected from the group consisting of: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3, or CEACAM-5) , LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, and 2B4.

108. Способ по любому из вариантов осуществления 105-107, отличающийся тем, что агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию иммунной клетки посредством РНК-интерференции (РНКи).108. The method of any one of embodiments 105-107, wherein the genetic disruption agent reduces the expression of a gene that impairs immune cell function through RNA interference (RNAi).

109. Способ по варианту осуществления 108, отличающийся тем, что более чем один агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию иммунной клетки в иммунной клетке посредством РНКи.109. The method of embodiment 108 wherein more than one genetic disruption agent reduces the expression of a gene that impairs immune cell function in the immune cell via RNAi.

110. Способ по варианту осуществления 109, отличающийся тем, что агенты генетического разрушения нацелены на один ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, или нацелены на разные гены, которые ослабляют функцию иммунной клетки, причем первый агент генетического разрушения нацелен на первый ген, а второй агент генетического разрушения нацелен на второй ген или в любой их комбинации. 110. The method of embodiment 109, wherein the genetic disruptors target one gene that impairs immune cell function, or target different genes that impair immune cell function, wherein the first genetic disruptor targets the first gene and the second the genetic disruption agent targets the second gene, or any combination thereof.

111. Способ по любому из вариантов осуществления 108-110, отличающийся тем, что РНКи опосредуется короткой шпилечной РНК (кшРНК).111. The method of any one of embodiments 108-110, wherein the RNAi is mediated by short hairpin RNA (shRNA).

112. Способ по варианту осуществления 111, отличающийся тем, что РНКи опосредуется более чем одной кшРНК.112. The method of embodiment 111 wherein the RNAi is mediated by more than one shRNA.

113. Способ по варианту осуществления 112, отличающийся тем, что РНКи опосредуется двумя кшРНК.113. The method of embodiment 112 wherein the RNAi is mediated by two shRNAs.

114. Способ по варианту осуществления 112 или 113, отличающийся тем, что две кшРНК нацелены на PD-1.114. The method of embodiment 112 or 113, wherein two shRNAs target PD-1.

115. Способ по варианту осуществления 112 или 113, отличающийся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIM-3.115. The method of embodiment 112 or 113 wherein the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets TIM-3.

116. Способ по варианту осуществления 112 или 113, отличающийся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на CTLA-4.116. The method of embodiment 112 or 113 wherein the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets CTLA-4.

117. Способ по варианту осуществления 112 или 113, отличающийся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на LAG-3.117. The method of embodiment 112 or 113 wherein the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets LAG-3.

118. Способ по варианту осуществления 112 или 113, отличающийся тем, что первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIGIT.118. The method of embodiment 112 or 113 wherein the first shRNA targets PD-1 and the second shRNA targets TIGIT.

119. Способ по любому из вариантов осуществления 111-118, отличающийся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют кшРНК.119. The method of any one of embodiments 111-118, wherein the immune cell contains nucleotide sequences that encode shRNA.

120. Способ по варианту осуществления 119, отличающийся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют более одной кшРНК.120. The method of embodiment 119, wherein the immune cell contains nucleotide sequences that encode more than one shRNA.

121. Способ по варианту осуществления 119, отличающийся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК.121. The method of embodiment 119, wherein the immune cell contains nucleotide sequences that encode two shRNAs.

122. Способ по любому из вариантов осуществления 119-121, отличающийся тем, что нуклеотидные последовательности, кодирующие кшРНК, содержат последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-219 и 238-267. 122. The method of any one of embodiments 119-121, wherein the shRNA-encoding nucleotide sequences comprise sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-219 and 238-267.

123. Способ по любому из вариантов осуществления 119-122, отличающийся тем, что нуклеотидные последовательности, кодирующие кшРНК, присутствует в векторе. 123. The method of any one of embodiments 119-122, wherein the nucleotide sequences encoding the shRNA are present in the vector.

124. Способ по варианту осуществления 123, отличающийся тем, что экспрессия разных кшРНК, соответственно, регулируется разными промоторами.124. The method of embodiment 123, wherein the expression of different shRNAs is respectively regulated by different promoters.

125. Способ по варианту осуществления 124, отличающийся тем, что экспрессия двух разных кшРНК, соответственно, регулируется двумя разными промоторами.125. The method of embodiment 124, wherein the expression of two different shRNAs is respectively regulated by two different promoters.

126. Способ по варианту осуществления 125, отличающийся тем, что два разных промотора представляют собой промоторы РНК-полимеразы III.126. The method of embodiment 125 wherein the two different promoters are RNA polymerase III promoters.

127. Способ по варианту осуществления 126, отличающийся тем, что два промотора представляют собой промоторы U6.127. The method of embodiment 126 wherein the two promoters are U6 promoters.

128. Способ по варианту осуществления 127, отличающийся тем, что промоторы U6 получают из разных видов.128. The method of embodiment 127, wherein the U6 promoters are obtained from different species.

129. Способ по любому из вариантов осуществления 125-128, отличающийся тем, что два промотора ориентированы в разных направлениях относительно друг друга.129. The method of any one of embodiments 125-128, wherein the two promoters are oriented in different directions relative to each other.

130. Способ по любому из вариантов осуществления 81-129, отличающийся тем, что каждый из генетически сконструированного антигенного рецептора и агента(ов) генетического разрушения экспрессируется из вектора.130. The method of any one of embodiments 81-129, wherein each of the genetically engineered antigen receptor and genetic disruption agent(s) is expressed from a vector.

131. Способ по варианту осуществления 130, отличающийся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор и агент(ы) генетического разрушения экспрессируются из одного и того же вектора.131. The method of embodiment 130, wherein the genetically engineered antigen receptor and the genetic disruption agent(s) are expressed from the same vector.

132. Способ по любому из вариантов осуществления 130-131, отличающийся тем, что вектор представляет собой плазмидный вектор или вирусный вектор.132. The method of any one of embodiments 130-131, wherein the vector is a plasmid vector or a viral vector.

133. Способ по варианту осуществления 132, отличающийся тем, что вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор, аденовирусный вектор или вектор на основе аденоассоциированного вируса.133. The method of embodiment 132, wherein the viral vector is a lentiviral vector, an adenoviral vector, or an adeno-associated virus vector.

134. Способ по варианту осуществления 133, отличающийся тем, что лентивирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор.134. The method of embodiment 133 wherein the lentiviral vector is a retroviral vector.

135. Способ по любому из вариантов осуществления 81-134, отличающийся тем, что иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из Т-клетки и натуральной клетки-киллера (NK).135. The method of any one of embodiments 81-134, wherein the immune cell is selected from the group consisting of a T cell and a natural killer (NK) cell.

136. Способ по варианту осуществления 135, отличающийся тем, что иммунная клетка представляет собой Т-клетку.136. The method of embodiment 135 wherein the immune cell is a T cell.

137. Способ по варианту осуществления 136, отличающийся тем, что Т-клетка представляет собой CD4+ T-клетку или CD8+ T-клетку.137. The method of embodiment 136 wherein the T cell is a CD4+ T cell or a CD8+ T cell.

138. Способ по любому из вариантов осуществления 136 или 137, отличающийся тем, что иммунная клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК и CAR в одном и том же векторе. 138. The method of any one of embodiments 136 or 137, wherein the immune cell contains nucleotide sequences that encode two shRNAs and a CAR in the same vector.

139. Способ по варианту осуществления 138, отличающийся тем, что каждая из двух кшРНК регулируется двумя разными промоторами РНК-полимеразы III, ориентированными в разных направлениях относительно друг друга.139. The method of embodiment 138, wherein the two shRNAs are each regulated by two different RNA polymerase III promoters oriented in different directions relative to each other.

140. Способ по варианту осуществления 139, отличающийся тем, что CAR нацелен на CD19, первая кшРНК нацелена на PD-1, а вторая кшРНК нацелена на TIGIT. 140. The method of embodiment 139, wherein CAR targets CD19, the first shRNA targets PD-1, and the second shRNA targets TIGIT.

141. Композиция, содержащая иммунную клетку по любому из вариантов осуществления 21-80.141. A composition comprising an immune cell according to any one of embodiments 21-80.

142. Фармацевтическая композиция, содержащая иммунную клетку по любому из вариантов осуществления 21-80 и фармацевтически приемлемый носитель.142. A pharmaceutical composition comprising an immune cell according to any one of embodiments 21-80 and a pharmaceutically acceptable carrier.

143. Способ лечения, включающий введение субъекту, имеющему заболевание или патологическое состояние, нуждающемуся в иммунотерапии, иммунной клетки по любому из вариантов осуществления 21-80 или композиции по варианту осуществления 141 или 142.143. A method of treatment comprising administering to a subject having a disease or condition in need of immunotherapy an immune cell according to any one of embodiments 21-80 or a composition according to embodiment 141 or 142.

144. Способ по варианту осуществления 143, отличающийся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор специфически связывается с антигеном, связанным с заболеванием или патологическим состоянием. 144. The method of embodiment 143 wherein the genetically engineered antigen receptor specifically binds to an antigen associated with a disease or condition.

145. Способ по варианту осуществления 143 или 144, отличающийся тем, что заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественное новообразование, например, опухоль. 145. The method of embodiment 143 or 144, wherein the disease or condition is a malignancy, such as a tumor.

146. Иммунная клетка по любому из вариантов осуществления 21-80 или композиция по вариантам осуществления 141-142 для применения при лечении заболевания или патологического состояния.146. The immune cell of any one of embodiments 21-80 or the composition of embodiments 141-142 for use in the treatment of a disease or condition.

147. Применение иммунной клетки по любому из вариантов осуществления 21-80 или композиции по вариантам осуществления 121-122 в изготовлении лекарственного препарата для лечения заболевания или патологического состояния.147. The use of an immune cell according to any one of embodiments 21-80 or a composition according to embodiments 121-122 in the manufacture of a medicament for the treatment of a disease or pathological condition.

148. Иммунные клетки или композиция по варианту осуществления 146, или применение по варианту осуществления 147, отличающиеся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор специфически связывается с антигеном, связанным с заболеванием или патологическим состоянием. 148. Immune cells or composition according to embodiment 146 or use according to embodiment 147, characterized in that the genetically engineered antigen receptor specifically binds to an antigen associated with a disease or pathological condition.

149. Применение, композиция или иммунная клетка по варианту осуществления 147 или варианту осуществления 148, отличающиеся тем, что заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественное новообразование, например, опухоль.149. The use, composition, or immune cell of embodiment 147 or embodiment 148, wherein the disease or condition is a malignant neoplasm, eg, a tumor.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS

[0082] Фиг. 1A-1E. Генерация CAR-T-клеток с блокадой внутриклеточной части PD-1. (Фиг. 1A) Схема векторов CAR «два в одном». (Фиг. 1B-C) Экспрессию LNGFR и CAR анализировали через 4 суток после трансдукции. (Фиг. 1D) CAR-T-клетки сортировали с использованием магнитных гранул LNGFR и высевали при 2 × 105/мл. Совокупное количество CAR-Т-клеток оценивали при помощи окрашивания трипановым синим. (Фиг. 1E) LNGFR+ CAR T-клетки смешивали с γ-облученным NALM-6 без экзогенных цитокинов. [0082] FIG. 1A-1E. Generation of CAR-T cells with blockade of the intracellular part of PD-1. (Fig. 1A) Two-in-one CAR vector scheme. (FIG. 1B-C) LNGFR and CAR expression was analyzed 4 days after transduction. (FIG. 1D) CAR-T cells were sorted using LNGFR magnetic beads and seeded at 2 x 10 5 /ml. The total number of CAR T cells was assessed by trypan blue staining. (FIG. 1E) LNGFR+ CAR T cells were mixed with γ-irradiated NALM-6 without exogenous cytokines.

[0083] Фиг. 2. Влияние типов промотора Pol Ⅲ на блокаду внутриклеточной части PD-1. [0083] FIG. 2. Influence of Pol Ⅲ promoter types on the blockade of the intracellular part of PD-1.

[0084] Фиг. 3A-3B. In vitro цитотоксичность и пролиферация при стимуляции CD19 и PD-L1 с помощью блокады PD-1. (Фиг. 3А) LNGFR+ CAR-Т-клетки смешивают с живыми NALM-6 или NALM-6-PDL1 при соотношении E: T 1:1, 0,3:1, 0.1:1. (Фиг. 3В). LNGFR+ CAR-Т-клетки смешивали с γ-облученными NALM-6-PDL1, NALM-6-PDL1-CD80 или K562-CD19-PDL1 в соотношении E: T 1:1 без экзогенных цитокинов. [0084] FIG. 3A-3B. In vitro cytotoxicity and proliferation upon stimulation of CD19 and PD-L1 by blockade of PD-1. (FIG. 3A) LNGFR+ CAR T cells are mixed with live NALM-6 or NALM-6-PDL1 at an E:T ratio of 1:1, 0.3:1, 0.1:1. (Fig. 3B). LNGFR+ CAR T cells were mixed with γ-irradiated NALM-6-PDL1, NALM-6-PDL1-CD80 or K562-CD19-PDL1 in an E:T ratio of 1:1 without exogenous cytokines.

[0085] Фиг. 4. Противоопухолевая функция CAR-T-клеток in vivo с блокадой внутриклеточной части PD-1. [0085] FIG. 4. Antitumor function of CAR-T cells in vivo with blockade of the intracellular part of PD-1.

[0086] Фиг. 5A. Снижение выработки цитокинов in vivo при разрушении внутриклеточной части PD-1 в CAR-T-клетках. На Фиг. 5B показана замедленная in vivo экспансия CAR-T-клеток с разрушением внутриклеточной части PD-1. [0086] FIG. 5A. Decreased production of cytokines in vivo upon destruction of the intracellular portion of PD-1 in CAR-T cells. On FIG. 5B shows delayed in vivo expansion of CAR-T cells with destruction of the intracellular portion of PD-1.

[0087] Фиг. 6A-6B. Функция CD28/CD3ζ или 4-1BB/CD3ζ CAR-T-клеток в разрушении внутриклеточной части PD-1. (Фиг. 6А) Схема векторов G28z, GBBz, P28z и PBBz. (Фиг. 6В) Анализ методом проточной цитометрии, демонстрирующий экспрессию LNGFR трансдуцированных Т-клеток через 4 суток после трансдукции. [0087] FIG. 6A-6B. Function of CD28/CD3ζ or 4-1BB/CD3ζ CAR-T cells to destroy the intracellular portion of PD-1. (Fig. 6A) Schematic of the G28z, GBBz, P28z, and PBBz vectors. (FIG. 6B) Flow cytometry analysis showing LNGFR expression of transduced T cells 4 days post transduction.

[0088] Фиг. 7A-7B. Уровень экспрессии PD-1 при костимуляции CD28 или 4-1BB. (Фиг. 7А) LNGFR+ CAR-Т-клетки инкубировали с γ-облученным NALM-6 или K562-CD19 без экзогенных цитокинов. Экспрессию PD-1 LNGFR+ CAR-Т-клетками анализировали через 3 суток после инкубации. (Фиг. 7B) Количественные результаты ПЦР в реальном времени, выполненные с праймерами PD-1. [0088] FIG. 7A-7B. Expression level of PD-1 upon costimulation of CD28 or 4-1BB. (FIG. 7A) LNGFR+ CAR T cells were incubated with γ-irradiated NALM-6 or K562-CD19 without exogenous cytokines. Expression of PD-1 LNGFR+ CAR T cells was analyzed 3 days after incubation. (Fig. 7B) Quantitative real-time PCR results performed with PD-1 primers.

[0089] Фиг. 8A-8B. Создание системы репортеров NFAT или NF-κB. (Фиг. 8A) Схема репортерных векторов NFAT-RE 3x-eGFP и NF-κB-RE 5x-eGFR. (Фиг. 8В) Изменение кратности репортерной активности, рассчитанное с использованием гСИФ eGFP LNGFR+ CAR-T-клеток. [0089] FIG. 8A-8B. Creation of an NFAT or NF-κB reporter system. (Fig. 8A) Diagram of NFAT-RE 3x-eGFP and NF-κB-RE 5x-eGFR reporter vectors. (FIG. 8B) Change in reporter activity fold calculated using gSIF of eGFP LNGFR+ CAR-T cells.

[0090] Фиг. 9A-9B. Активированный сигналинг NFAT при костимуляции CD28, но не при костимуляции 4-1BB. (Фиг. 9А) Репортер-трансдуцированные Т-клетки повторно стимулировали и трансдуцировали G28z или GBBz. (Фиг. 9B) Уровень мРНК целевых генов NFAT в CAR-клетках оценивали при помощи кПЦР. [0090] FIG. 9A-9B. Activated NFAT signaling with CD28 costimulation but not with 4-1BB costimulation. (FIG. 9A) Reporter transduced T cells were restimulated and transduced with G28z or GBBz. (FIG. 9B) mRNA levels of target NFAT genes in CAR cells were assessed by qPCR.

[0091] Фиг. 10. Активированный сигналинг NF-κB при костимуляции CD28 и 4-1BB. [0091] FIG. 10. Activated NF-κB signaling upon costimulation of CD28 and 4-1BB.

[0092] Фиг. 11A-11C. Интенсивность сигналинга ТФР-β G28z CART немного выше BBz CART. (Фиг. 11А) Фосфорилированный SMAD2/3 в CAR-T-клетках анализировали с помощью проточной цитометрии с внутриклеточным окрашиванием после инкубации с NALM-6 в соотношении клеток E: T 1:1 в течение 4 часов или 24 часов. (Фиг. 11В) Анализ методом проточной цитометрии, демонстрирующий экспрессию PD-1 в G28z и GBBz CAR T-клетках с 10 нг/мл рекомбинантного человеческого ТФР-β1. (Фиг. 11C) Уровень мРНК ТФР-β1, TGFBR1 и TGFBR2 в CAR-T-клетках оценивали при помощи кПЦР. [0092] FIG. 11A-11C. The TGF-β signaling intensity of G28z CART is slightly higher than that of BBz CART. (FIG. 11A) Phosphorylated SMAD2/3 in CAR-T cells was analyzed by flow cytometry with intracellular staining after incubation with NALM-6 at a 1:1 E:T cell ratio for 4 hours or 24 hours. (FIG. 11B) Flow cytometry analysis demonstrating PD-1 expression in G28z and GBBz CAR T cells with 10 ng/ml recombinant human TGF-β1. (FIG. 11C) TGF-β1, TGFBR1, and TGFBR2 mRNA levels in CAR-T cells were assessed by qPCR.

[0093] Фиг. 12A-12B. Сохраняет цитотоксичность и пролиферативную способность in vitro PBBz CAR-Т-клеток при повторной стимуляции CD19 и PD-L1. (Фиг. 12А) Цитотоксичность. Вверху, после магнитной сортировки LNGFR, 12-суточные первичные LNGFR+ CAR-T-клетки были смешаны с NALM-6-PDL1 в соотношении E: T 1:1, 0,3:1, 0,1:1. Внизу LNGFR+ CAR-T-клетки стимулировали γ-облученным K562-CD19-PDL1 в соотношении E: T 1:1. (Фиг. 12В) LNGFR+ CAR Т-клетки многократно стимулировали в смеси с γ-облученными NALM-6-PDL1-CD80 или K562-CD19-PDL1 в соотношении E: T 1:1 без экзогенных цитокинов. [0093] FIG. 12A-12B. Retains cytotoxicity and in vitro proliferative capacity of PBBz CAR-T cells upon repeated stimulation of CD19 and PD-L1. (Fig. 12A) Cytotoxicity. Above, after magnetic sorting of LNGFR, 12 day old primary LNGFR+ CAR-T cells were mixed with NALM-6-PDL1 in an E:T ratio of 1:1, 0.3:1, 0.1:1. Below, LNGFR+ CAR-T cells were stimulated with γ-irradiated K562-CD19-PDL1 at an E:T ratio of 1:1. (FIG. 12B) LNGFR+ CAR T cells were repeatedly stimulated in admixture with γ-irradiated NALM-6-PDL1-CD80 or K562-CD19-PDL1 in an E:T ratio of 1:1 without exogenous cytokines.

[0094] Фиг.13A-13C. Менее чувствительны к опосредованной ТФР-бета дисфункции и слабо генерируется в in vitro регуляторными Т-клетками, полученными из CARТ, в PBBz CAR-Т-клетках. (Фиг. 13A) Опосредованное ТФР-бета подавление пролиферации CAR-T. (Фиг. 13B) Чувствительность к ТФР-бета для индукции Трег. (Фиг. 13C) Влияние PDL1/PD-1 на индукцию Трег.[0094] Figs. 13A-13C. Less sensitive to TGF-beta-mediated dysfunction and weakly generated in vitro by CART-derived regulatory T cells in PBBz CAR T cells. (FIG. 13A) TGF-beta-mediated inhibition of CAR-T proliferation. (FIG. 13B) TGF-beta sensitivity for Treg induction. (Fig. 13C) Effect of PDL1/PD-1 on Treg induction.

[0095] Фиг. 14. Непрерывное ингибирование прогрессирования лейкоза PBBz CAR-T-клетками. [0095] FIG. 14. Continuous inhibition of leukemia progression by PBBz CAR-T cells.

[0096] Фиг. 15. Диаграмма состава двух типов векторов, кодирующих два типа кшРНК, один из которых ингибирует экспрессию PD-1, а второй из которых ингибирует экспрессию TIM-3, и кассету экспрессии CD19 CAR.[0096] FIG. 15. Diagram of the composition of two types of vectors encoding two types of shRNA, one of which inhibits the expression of PD-1, and the second of which inhibits the expression of TIM-3, and the CD19 CAR expression cassette.

[0097] Фиг. 16. Схема процесса получения CAR-T-клеток, в которой клетки δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3 →← shPD-1-hU6 и клетки δLNGFR-CART19/shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1 были получены и выделены как описано в данном документе.[0097] FIG. 16. Schematic of a CAR-T cell production process in which δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3 →← shPD-1-hU6 cells and δLNGFR-CART19/shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1 cells were generated and highlighted as described in this document.

[0098] Фиг. 17. Данные проточной цитометрии от CAR-T-клеток, содержащих векторы, проиллюстрированные на Фиг. 15 (клетки δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6 и клетки δLNGFR-CART19/shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1).[0098] FIG. 17. Flow cytometry data from CAR-T cells containing the vectors illustrated in FIG. 15 (δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6 cells and δLNGFR-CART19/shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1 cells).

[0099] Фиг. 18A-18B. Фиг. 18A. Данные проточной цитометрии для клеток δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6 и клеток δLNGFR-CART19/shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1, полученных с использованием способов в Примере 8. Фиг. 18В. Экспрессия PD-1 и TIM-3 в CAR-T-клетках.[0099] FIG. 18A-18B. Fig. 18A. Flow cytometry data for δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6 cells and δLNGFR-CART19/shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1 cells obtained using the methods in Example 8. FIG. 18V. Expression of PD-1 and TIM-3 in CAR-T cells.

[00100] Фиг. 19. Данные проточной цитометрии, в которой CAR-T-клетки многократно стимулировали с использованием целевых клеток, после чего степень дифференцировки клеток подтверждали с использованием антител к CD45RA и CCR7. [00100] FIG. 19. Flow cytometry data in which CAR-T cells were repeatedly stimulated using target cells, after which the degree of cell differentiation was confirmed using antibodies to CD45RA and CCR7.

[00101] Фиг. 20A-20C. Оценка CAR-T-клеток, полученных с использованием способов в Примере 8. Фиг. 20А: эффективность трансдукции. Фиг. 20B: способность к пролиферации. Фиг. 20C: Жизнеспособность.[00101] FIG. 20A-20C. Evaluation of CAR-T cells obtained using the methods in Example 8. FIG. 20A: Transduction efficiency. Fig. 20B: ability to proliferate. Fig. 20C: Vitality.

[00102] Фиг. 21A-21C. Селекция кшРНК, нацеленных на CTLA-4, LAG-3, TIGIT и TIM-3. Фиг. 21А: 2-суточные CD3/CD28-стимулированные Т-клетки электропорируют 21-мерными киРНК, нацеленными на CTLA-4, LAG-3, TIGIT и TIM-3. киРНК-опосредованная эффективность нокдауна была подтверждена через 2 суток после трансфекции. Штриховка: на основе последовательности выбранных киРНК были сконструированы векторы «два в одном», экспрессирующие CAR и кшРНК. Штриховка указывает на первоначально выбранные киРНК. Фиг. 21B: Т-клетки трансдуцировали векторами «два в одном», содержащими кшРНК, нацеленными на CTLA-4, LAG-3, TIGIT или TIM-3, и сортировали с помощью магнитных гранул LNGFR. Количество LNGFR+ CAR-Т-клеток измеряли каждые 3 суток после высева при 2 × 105/мл. Фиг. 21C: Экспрессия Tim3 (%).[00102] FIG. 21A-21C. Selection of shRNAs targeting CTLA-4, LAG-3, TIGIT and TIM-3. Fig. 21A: 2-day-old CD3/CD28-stimulated T cells are electroporated with 21mer siRNAs targeting CTLA-4, LAG-3, TIGIT, and TIM-3. The siRNA-mediated knockdown efficiency was confirmed 2 days after transfection. Hatching: Based on the sequence of the selected siRNAs, two-in-one vectors expressing CAR and shRNA were constructed. Hatching indicates the originally selected siRNAs. Fig. 21B: T cells were transduced with two-in-one vectors containing shRNA targeting CTLA-4, LAG-3, TIGIT, or TIM-3 and sorted with LNGFR magnetic beads. The number of LNGFR+ CAR T cells was measured every 3 days after seeding at 2×10 5 /ml. Fig. 21C: Tim3 expression (%).

[00103] Фиг. 22A-22E. Генерация CAR-Т-клеток с разрушением двух иммунных контрольных точек. (Фиг. 22A) Схема двойных векторов «два в одном». Фиг. 22B: % LNGFR+ T-клеток анализировали через 4 суток после трансдукции двойным вектором «два в одном». (Фиг. 22C) CAR-T-клетки с двойным KD (нокдаун) сортировали и высевали при 2 × 105/мл. Совокупное количество CAR-Т-клеток измеряли при помощи окрашивания трипановым синим. (Фиг. 22D-22E) Экспрессию LAG-4, PD-1, TIGIT или TIM-3 в LNGFR+ CAR-T-клетках анализировали через 3 суток после γ-облучения совместной культуры NALM-6 или K562-CD19. Экспрессию CTLA-4 анализировали с помощью проточной цитометрии с внутриклеточным окрашиванием. [00103] FIG. 22A-22E. Generation of CAR T cells with destruction of two immune checkpoints. (Fig. 22A) Two-in-one double vector scheme. Fig. 22B: % LNGFR+ T cells were analyzed 4 days after transduction with the two-in-one double vector. (Fig. 22C) Double KD (knockdown) CAR-T cells were sorted and seeded at 2 x 10 5 /ml. The total number of CAR T cells was measured by trypan blue staining. (Fig. 22D-22E) Expression of LAG-4, PD-1, TIGIT or TIM-3 in LNGFR+ CAR-T cells was analyzed 3 days after γ-irradiation of co-culture NALM-6 or K562-CD19. CTLA-4 expression was analyzed by flow cytometry with intracellular staining.

[00104] Фиг. 23. Лечение CD19+ гемобластоза in vivo с использованием CAR-T-клеток с двойным KD, нацеленных на две иммунные контрольные точки.[00104] FIG. 23. In vivo treatment of CD19+ hemoblastosis using dual-KD CAR-T cells targeting two immune checkpoints.

[00105] Фиг. 24. Лечение рака на модели солидной опухоли с использованием CAR-T-клеток с двойным KD, нацеленных на PD-1 и TIGIT.[00105] FIG. 24. Cancer treatment in a solid tumor model using dual-KD CAR-T cells targeting PD-1 and TIGIT.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[00106] Особенности данного описания изложены, в частности, в прилагаемой формуле изобретения. Лучшее понимание особенностей и преимуществ данного изобретения будет получено на основе следующего подробного описания, в котором изложены иллюстративные варианты осуществления, в которых используются принципы изобретения. Для облегчения полного понимания описания, изложенного в данном документе, ниже приведен ряд терминов.[00106] The features of this description are set forth in particular in the appended claims. A better understanding of the features and advantages of this invention will be obtained from the following detailed description, which sets forth illustrative embodiments that use the principles of the invention. To facilitate a thorough understanding of the description set forth in this document, a number of terms are provided below.

[00107] Вкратце, в одном аспекте в данном документе описаны векторы, содержащие: последовательность оснований, кодирующую два типа коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые ингибируют экспрессию одного или более генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток, включая рецепторы и лиганды иммунных контрольных точек, и последовательность оснований, кодирующую антигенный рецептор, такой как химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), например, моноклональный Т-клеточный рецептор (mTCR); иммунная клетка, содержащая генетически сконструированный антигенный рецептор, который специфически связывается с целевым антигеном, и один или более агентов генетического разрушения, которые снижают или способны снижать экспрессию в иммунной клетке гена или генов, которые ослабляют функцию иммунной клетки; способы получения иммунной клетки; композиция или фармацевтическая композиция, содержащая иммунные клетки, например, для иммунотерапии пациентов-людей; и способ лечения, включающий введение иммунной клетки субъекту, имеющему заболевание или патологическое состояние. Поскольку иммунная клетка, композиция или фармацевтическая композиция содержат один или более агентов генетического разрушения, например, кодируют две кшРНК, которые снижают экспрессию двух генов молекул иммунных контрольных точек, которые могут активироваться раковыми клетками для ослабления функции иммунных клеток, можно устранить серьезные и системные нежелательные явления, такие как синдром высвобождения цитокинов или симптомы аутоиммунных заболеваний, которые могут возникнуть в результате использования отдельного ингибитора для этих генов, а также снизить нагрузку из-за увеличения стоимости лечения в результате дорогостоящих аналогичных способов терапии, при этом обеспечивая более эффективную клеточную терапию, чем в тех случаях, когда экспрессируется только одна кшРНК. [00107] Briefly, in one aspect, this document describes vectors containing: a base sequence encoding two types of short hairpin RNA (shRNA) that inhibit the expression of one or more genes that impair immune cell function, including receptors and immune checkpoint ligands , and a base sequence encoding an antigen receptor, such as a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR), eg, a monoclonal T cell receptor (mTCR); an immune cell comprising a genetically engineered antigen receptor that specifically binds to a target antigen and one or more genetic disruption agents that reduce or are capable of reducing expression in an immune cell of a gene or genes that impair immune cell function; methods for obtaining immune cells; composition or pharmaceutical composition containing immune cells, for example, for immunotherapy of human patients; and a method of treatment comprising administering an immune cell to a subject having a disease or condition. Because the immune cell, composition, or pharmaceutical composition contains one or more genetic disruptive agents, for example, encoding two shRNAs that downregulate the expression of two genes of immune checkpoint molecules that can be activated by cancer cells to impair immune cell function, serious and systemic adverse events can be eliminated. such as cytokine release syndrome or symptoms of autoimmune disease that can result from the use of a single inhibitor for these genes, as well as reduce the burden of increased treatment costs from expensive similar therapies, while providing a more effective cell therapy than in when only one shRNA is expressed.

1. Общие методики 1. General methods

[00108] Методики и процедуры, описанные в данном документе или на которые он ссылается, включают те, которые в целом хорошо известны и/или обычно применяются с использованием традиционной методологии специалистами в данной области техники, такие как, например, широко используемые методологии, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed. 2012); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed. 2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar ed. 2010); и Antibody Engineering том 1 и 2 (Kontermann and Dübel eds., 2nd ed. 2010). Molecular Biology of the Cell (6th Ed., 2014). [00108] The techniques and procedures described or referred to herein include those generally well known and/or commonly used using conventional methodology by those skilled in the art, such as, for example, the widely used methodologies described in Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed. 2012); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed. 2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar ed. 2010); and Antibody Engineering vols. 1 and 2 (Kontermann and Dübel eds., 2nd ed. 2010). Molecular Biology of the Cell (6th Ed., 2014).

2. Определения 2. Definitions

[00109] Если не указано иное, все технические и научные термины, употребляемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники. В целях интерпретации этого описания применяется следующее описание терминов и во всех случаях, когда это целесообразно, термины, употребляемые в единственном числе, также включают множественное число и наоборот. Все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации в полном объеме включены посредством ссылки. В случае, когда какое-либо из приведенных описаний терминов противоречит любому документу, включенному в данный документ посредством ссылки, приоритет имеет описание термина, приведенное ниже.[00109] Unless otherwise indicated, all technical and scientific terms used in this document have the same meaning, which is usually understood by a person skilled in the art. For the purposes of interpreting this description, the following description of terms applies and, whenever appropriate, terms used in the singular also include the plural and vice versa. All patents, applications, published applications and other publications are incorporated by reference in their entirety. In the event that any of the above descriptions of terms conflict with any document incorporated herein by reference, the description of the term below takes precedence.

[00110] Термины, используемые в данном описании, используются только для объяснения конкретных вариантов осуществления и не предназначены для ограничения объема данного изобретения. Выражения в единственном числе, если в контексте не указано иное, включают выражения во множественном числе. Следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами, реагентами и т. п., описанными в данном документе, поскольку таковые могут изменяться. Используемая в данном документе терминология применяется только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема данного изобретения, который определен исключительно формулой изобретения.[00110] The terms used in this description are used only to explain specific embodiments and are not intended to limit the scope of this invention. Expressions in the singular, unless otherwise indicated in the context, include expressions in the plural. It should be understood that this invention is not limited to the particular methodology, protocols, reagents, and the like described herein, as these may vary. The terminology used in this document is used only to describe specific embodiments and is not intended to limit the scope of this invention, which is defined solely by the claims.

[00111] В контексте данного документа форма единственного числа используется в данном документе для обозначения одного или более чем одного (т. е. по меньшей мере одного) грамматического объекта. В качестве примера, «элемент» означает один элемент или более одного элемента.[00111] In the context of this document, the singular form is used herein to denote one or more than one (i.e., at least one) grammatical object. By way of example, "element" means one element or more than one element.

[00112] Использование альтернативы (например, «или») следует понимать как означающее один из вариантов, оба варианта или любую из комбинаций в качестве альтернативы. [00112] The use of an alternative (eg, "or") should be understood to mean one of the options, both options, or any combination of alternatives.

[00113] Термин «и/или» следует понимать как означающий или одну, или обе альтернативы. [00113] The term "and/or" should be understood to mean either one or both of the alternatives.

[00114] В контексте данного документа термин «около» или «приблизительно» относится к численности, уровню, значению, числу, частоте, проценту, величине, размеру, количеству, массе или длине, которые варьируются вплоть до 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% по сравнению с эталонной численностью, уровнем, значением, числом, частотой, процентом, величиной, размером, количеством, массой или длиной. В одном варианте осуществления термин «около» или «приблизительно» относится к диапазону количества, уровня, значения, числа, частоты, процента, величины, размера, количества, массы или длины в ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% или ± 1% относительно эталонной численности, уровня, значения, числа, частоты, процента, величины, размера, количества, веса или длины.[00114] As used herein, the term "about" or "approximately" refers to an amount, level, value, number, frequency, percentage, magnitude, size, amount, mass, or length that ranges up to 15%, 10%, 9 %, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, or 1% compared to a reference count, level, value, number, frequency, percentage, magnitude, size, amount, weight, or length . In one embodiment, the term "about" or "approximately" refers to a range of amount, level, value, number, frequency, percentage, magnitude, size, amount, mass, or length of ±15%, ±10%, ±9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% or ± 1% relative to the reference number, level, value, number, frequency, percentage, magnitude, size, amount, weight or length.

[00115] В тексте этого описания отсылка к «одному варианту осуществления», «варианту осуществления», «конкретному варианту осуществления», «связанному варианту осуществления», «определенному варианту осуществления», «дополнительному варианту осуществления» или «еще одному варианту осуществления» или их комбинации или подобному означает, что конкретные признак, структура или характеристика, описанные в связи с этим вариантом осуществления, включены по меньшей мере в один вариант осуществления данного изобретения. Таким образом, появления вышеупомянутых фраз в различных местах в этом описании необязательно все относятся к одному и тому же варианту осуществления. Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть подходящим образом скомбинированы в одном или более вариантах осуществления.[00115] In the text of this description, reference to "one embodiment", "an embodiment", "a specific embodiment", "a related embodiment", "a certain embodiment", "an additional embodiment", or "another embodiment" or combinations thereof or the like means that the particular feature, structure or characteristic described in connection with this embodiment is included in at least one embodiment of the present invention. Thus, the occurrences of the above phrases in various places in this specification do not necessarily all refer to the same embodiment. In addition, specific features, structures, or characteristics may be appropriately combined in one or more embodiments.

[00116] «Конструкт» относится к макромолекуле или комплексу молекул, содержащих полинуклеотид, для доставки в целевую клетку или in vitro или in vivo. В контексте данного документа термин «вектор» относится к любому конструкту нуклеиновой кислоты, способной направлять доставку или перенос чужеродного генетического материала в целевые клетки, где он может быть реплицирован и/или экспрессирован. В контексте данного документа термин «вектор» содержит конструкт, подлежащий доставке. Вектор может представлять собой линейную или кольцевую молекулу. Вектор может быть интегрирующим или неинтегрирующим. Основные типы векторов включают, но не ограничиваются ими, плазмиды, эписомальный вектор, вирусные векторы, космиды и искусственные хромосомы. Вирусные векторы включают, но не ограничиваются ими, аденовирусный вектор, вектор на основе аденоассоциированного вируса, ретровирусный вектор, лентивирусный вектор, вектор на основе вируса Сендай и тому подобное. [00116] "Construct" refers to a macromolecule or complex of molecules containing a polynucleotide for delivery to a target cell, either in vitro or in vivo . As used herein, the term "vector" refers to any nucleic acid construct capable of directing the delivery or transfer of foreign genetic material to target cells where it can be replicated and/or expressed. In the context of this document, the term "vector" contains the construct to be delivered. The vector may be a linear or circular molecule. The vector can be integrating or non-integrating. The main types of vectors include, but are not limited to, plasmids, episomal vector, viral vectors, cosmids, and artificial chromosomes. Viral vectors include, but are not limited to, an adenoviral vector, an adeno-associated virus vector, a retroviral vector, a lentiviral vector, a Sendai virus vector, and the like.

[00117] Вектор «два в одном», как описано в данном документе, представляет собой вектор, который содержит последовательность оснований, кодирующую одну или более коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые ингибируют экспрессию гена или генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток, и последовательность оснований, кодирующую химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор, например, моноклональный Т-клеточный рецептор (mTCR). Двойной вектор «два в одном», как описано в данном документе, представляет собой вектор, который содержит последовательность оснований, кодирующую два типа коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые ингибируют экспрессию генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток, и последовательность оснований, кодирующую любой из химерного антигенного рецептора (CAR) и Т-клеточного рецептора, например, моноклонального Т-клеточного рецептора (mTCR). Двойные векторы «два в одном», описанные в данном документе, представляют собой форму вектора «два в одном».[00117] A two-in-one vector, as described herein, is a vector that contains a base sequence encoding one or more short hairpin RNAs (shRNAs) that inhibit the expression of a gene or genes that impair immune cell function, and a base sequence encoding a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor, such as the monoclonal T cell receptor (mTCR). A two-in-one dual vector as described herein is a vector that contains a base sequence encoding two types of short hairpin RNA (shRNA) that inhibit the expression of genes that impair immune cell function, and a base sequence encoding either from a chimeric antigen receptor (CAR) and a T cell receptor, such as the monoclonal T cell receptor (mTCR). The two-in-one dual vectors described herein are a form of the two-in-one vector.

[00118] «РНКи» (также известный как посттранскрипционный сайленсинг генов (PTGS), подавление или косупрессия) представляет собой процесс посттранскрипционного сайленсинга генов, в котором молекулы РНК специфическим для последовательности образом ингибируют экспрессию генов, как правило, вызывая разрушение специфических молекул мРНК. Активные компоненты РНКи представляют собой короткие/маленькие двухцепочечные РНК (дцРНК), называемые короткими интерферирующими РНК (киРНК), которые, как правило, содержат 15-30 нуклеотидов (например, 19-25, 19-24 или 19-21 нуклеотидов) и 2-нуклеотидных 3'-липких конца и соответствует последовательности нуклеиновой кислоты целевого гена. Эти виды коротких РНК могут естественным образом продуцироваться in vivo с помощью Dicer-опосредованного расщепления более крупных дцРНК, и они являются функциональными в клетках млекопитающих. Плазмиды экспрессии ДНК могут быть использованы для стабильной экспрессии дуплексов киРНК или дцРНК согласно данному описанию в клетках и достижения длительного ингибирования экспрессии целевого гена. В одном аспекте смысловая и антисмысловая цепи дуплекса киРНК обычно связаны короткой спейсерной последовательностью, приводящей к экспрессии структуры типа «стебель-петля», называемой короткой шпилечной РНК (кшРНК). Шпилька распознается и расщепляется Dicer, таким образом генерируя зрелые молекулы киРНК.[00118] "RNAi" (also known as post-transcriptional gene silencing (PTGS), downregulation or cosuppression) is a process of post-transcriptional gene silencing in which RNA molecules inhibit gene expression in a sequence-specific manner, typically causing destruction of specific mRNA molecules. The active components of RNAi are short/small double-stranded RNAs (dsRNAs) called short interfering RNAs (siRNAs) that are typically 15-30 nucleotides (e.g. 19-25, 19-24 or 19-21 nucleotides) and 2 -nucleotide 3'-sticky end and corresponds to the nucleic acid sequence of the target gene. These short RNAs can be naturally produced in vivo by Dicer-mediated cleavage of larger dsRNAs and are functional in mammalian cells. DNA expression plasmids can be used to stably express siRNA or dsRNA duplexes as described herein in cells and achieve long-term inhibition of target gene expression. In one aspect, the sense and antisense strands of an siRNA duplex are typically linked by a short spacer sequence resulting in the expression of a stem-loop structure called short hairpin RNA (shRNA). The hairpin is recognized and cleaved by Dicer, thus generating mature siRNA molecules.

[00119] Термин «кшРНК» относится к молекуле РНК, в которой некоторые самокомплементарные последовательности образуют плотную шпилечную структуру со своим стеблем. Молекула РНК может иметь длину около 80 п.о. Когда кшРНК экспрессируется в клетке, она проходит через серию стадий, превращаясь в короткую интерферирующую РНК (киРНК), которая действует в качестве гида для сайленсинга генов. Не вдаваясь в подробности, когда экспрессируется кшРНК, она процессируется комплексами Drosha в клетке, превращаясь в пре-кшРНК, которая затем транспортируется за пределы ядра, где она подвергается дальнейшему процессингу при помощи Dicer для превращения в киРНК, а затем переходит в одноцепочечное состояние и загружается в RISC-комплекс (РНК-индуцируемый сайленсинг-комплекс). При этом антисмысловая цепь киРНК действует в качестве гида для RISC-комплекса, что присоединиться к мРНК целевого гена, и когда комплекс RISC, который присоединен таким образом, разрезает мРНК, то происходит сайленсинг гена. Поскольку кшРНК в целевом гене обеспечивает сайленсинг гена, который сохраняется и специфичен в отношении определенного гена, она включена в вектор с целью ингибирования целевого гена. [00119] The term "shRNA" refers to an RNA molecule in which certain self-complementary sequences form a tight hairpin structure with their stem. An RNA molecule can be about 80 bp long. When shRNA is expressed in a cell, it goes through a series of steps to become short interfering RNA (siRNA), which acts as a guide for gene silencing. Without going into details, when shRNA is expressed, it is processed by Drosha complexes in the cell to become pre-shRNA, which is then transported outside the nucleus where it is further processed by Dicer to become siRNA, and then becomes single-stranded and loaded. into a RISC complex (RNA-induced silencing complex). In this case, the antisense strand of the siRNA acts as a guide for the RISC complex to attach to the mRNA of the target gene, and when the RISC complex, which is attached in this way, cuts the mRNA, gene silencing occurs. Because shRNA in the target gene provides gene silencing that is conserved and specific for a particular gene, it is included in the vector to inhibit the target gene.

[00120] Термин «промотор» относится к расположенной против хода транскрипции области гена, участвующей в начале транскрипции гена. Описанные выше два типа кшРНК также обуславливают регуляцию экспрессии промотором. При этом экспрессия двух типов кшРНК может быть охарактеризована тем, что они регулируются двумя разными промоторами, соответственно. Если клонирование происходит с идентичными последовательностями оснований с использованием повторяющихся вставок, то весьма вероятно, что надлежащее клонирование не произойдет из-за связывания между этими идентичными последовательностями оснований, что приведет к рекомбинации или делеции. Промоторы могут представлять собой промотор РНК-полимеразы I, промотор РНК-полимеразы II или промотор РНК-полимеразы III, в зависимости от того, какая РНК-полимераза присоединяется к промотору и начинает транскрипцию. Два указанных выше промотора могут быть охарактеризованы тем, что они представляют собой промоторы РНК-полимеразы III (далее промотор pol III). Промоторы Pol III могут быть сделаны так, чтобы точно транскрибироваться от 5'-конца к 3'-концу без присоединения кэпа на 5'-конце или поли(A)-хвоста на 3'-конце РНК, которая транскрибируется с регуляцией промотором. Типы промотора pol III включают, но не ограничиваются ими, промотор U6, промотор H1 и промотор 7SK и т.д. [00120] The term "promoter" refers to the upstream region of a gene involved in the start of gene transcription. The two types of shRNAs described above also determine the regulation of expression by the promoter. In this case, the expression of two types of shRNA can be characterized by the fact that they are regulated by two different promoters, respectively. If cloning occurs with identical base sequences using repeated insertions, then it is highly likely that proper cloning will not occur due to binding between these identical base sequences, resulting in recombination or deletion. Promoters can be an RNA polymerase I promoter, an RNA polymerase II promoter, or an RNA polymerase III promoter, depending on which RNA polymerase attaches to the promoter and starts transcription. The above two promoters can be characterized in that they are promoters of RNA polymerase III (hereinafter pol III promoter). Pol III promoters can be made to be accurately transcribed 5' to 3' without adding a cap at the 5' end or a poly(A) tail at the 3' end of the RNA that is transcribed under the regulation of the promoter. Types of pol III promoter include, but are not limited to, the U6 promoter, the H1 promoter, and the 7SK promoter, etc.

[00121] В контексте данного документа термин «G28z» относится к конструкту, который содержит кассету экспрессии shGFP, костимулирующий домен CD28 и домен CD3ζ (Фиг. 6A). Более конкретно, в термине «G28z» «G» обозначает shGFP; «28» обозначает CD28; «z» обозначает CD3ζ. Следуя той же схеме, термин «P28z», используемый в данном документе, относится к конструкту, который содержит кассету экспрессии shPD-1, костимулирующий домен CD28 и домен CD3ζ (Фиг. 6A), где «P» обозначает shPD-1, «28» обозначает «CD28 », а «z» обозначает CD3ζ. В контексте данного документа термин «GBBz» относится к конструкту, который содержит кассету экспрессии shGFP, костимулирующий домен 4-1BB и домен CD3ζ (Фиг. 6A), где «G» обозначает shGFP; «BB» обозначает 4-1BB; «z» обозначает CD3ζ. Используемый в данном документе термин «PBBz» относится к конструкту, который содержит кассету экспрессии shPD-1, костимулирующий домен 4-1BB и домен CD3ζ (Фиг. 6A), где «P» обозначает shPD-1; «BB» обозначает 4-1BB; «z» обозначает CD3ζ.[00121] As used herein, the term "G28z" refers to a construct that contains an shGFP expression cassette, a costimulatory CD28 domain, and a CD3ζ domain (FIG. 6A). More specifically, in the term "G28z", "G" stands for shGFP; "28" stands for CD28; "z" stands for CD3ζ. Following the same scheme, the term "P28z" as used herein refers to a construct that contains the shPD-1 expression cassette, the CD28 co-stimulatory domain, and the CD3ζ domain (Fig. 6A), where "P" stands for shPD-1, "28 " stands for "CD28" and "z" stands for CD3ζ. As used herein, the term "GBBz" refers to a construct that contains an shGFP expression cassette, a costimulatory 4-1BB domain, and a CD3ζ domain (FIG. 6A), where "G" is shGFP; "BB" stands for 4-1BB; "z" stands for CD3ζ. As used herein, the term "PBBz" refers to a construct that contains an shPD-1 expression cassette, a 4-1BB costimulatory domain, and a CD3ζ domain (FIG. 6A), where "P" stands for shPD-1; "BB" stands for 4-1BB; "z" stands for CD3ζ.

[00122] «CAR», как правило, представляет собой набор полипептидов, которые, когда они присутствуют на иммунной клетке, вызывают специфичность иммунной клетки к целевой клетке (как правило, раковой клетке), вызывая при этом сигнальную трансдукцию в клетке. Как минимум, CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, который распознает целевой антиген, который будет описан ниже, трансмембранный домен и внутриклеточной домен сигнальной трансдукции, причем внутриклеточной домен сигнальной трансдукции получен из стимулирующих молекул или костимулирующих молекул, которые будут описаны ниже. Набор, содержащий полипептиды, может быть присоединен или может иметь форму, в которой они присоединяются через переключатель, который димеризуется посредством стимуляции. Стимулирующая молекула может представлять собой дзета-цепь TCR, описанную выше. «CD19 CAR» представляет собой CAR, который нацелен на раковый антиген CD19.[00122] A "CAR" is generally a set of polypeptides that, when present on an immune cell, causes the immune cell to become specific to the target cell (typically a cancer cell), thereby causing signal transduction in the cell. At a minimum, a CAR contains an extracellular antigen recognition domain that recognizes a target antigen, which will be described below, a transmembrane domain, and an intracellular signal transduction domain, the intracellular signal transduction domain being derived from stimulatory molecules or co-stimulatory molecules, which will be described below. The set containing the polypeptides may be attached or may be in the form in which they are attached through a switch that dimerizes through stimulation. The stimulatory molecule may be the TCR zeta chain described above. "CD19 CAR" is a CAR that targets the CD19 cancer antigen.

[00123] В контексте данного документа термин «Т-клеточный рецептор (TCR)» относится к белковому рецептору на Т-клетках, который состоит из гетеродимера цепи альфа (α) и бета (β), хотя в некоторых клетках TCR состоит из цепи гамма и дельта (γ/δ). В некоторых вариантах осуществления TCR может быть модифицирован, например, в любой клетке, содержащей TCR, включая вспомогательную T-клетку, цитотоксическую T-клетку, T-клетку памяти, регуляторную T-клетку, натуральный T-киллер и гамма/дельта T-клетку.[00123] In the context of this document, the term "T cell receptor (TCR)" refers to a protein receptor on T cells that consists of a heterodimer of the alpha (α) and beta (β) chain, although in some cells the TCR consists of the gamma chain and delta (γ/δ). In some embodiments, the TCR may be modified, for example, in any cell containing the TCR, including a helper T cell, a cytotoxic T cell, a memory T cell, a regulatory T cell, a natural killer T cell, and a gamma/delta T cell. .

[00124] В контексте данного документа термин «моноклональный Т-клеточный рецептор (mTCR)» относится к Т-клеточному рецептору (TCR), который генетически модифицирован для специфического нацеливания на определенный антиген. Его также можно назвать антигенспецифическим TCR. Сообщается, что Т-клетки, имеющие mTCR, используются в иммунотерапии, такой как адоптивная Т-клеточная терапия, для вирусной инфекции и злокачественного новообразования. В некоторых аспектах в качестве стратегии для получения Т-клеток с определенной антигенспецифичностью был использован ретровирусный перенос химерных конструктов на основе одноцепочечных антител (scFv). По большей части химерные конструкты scFv были связаны с внутриклеточными сигнальными доменами FcR-гамма или CD3-дзета для индукции эффекторной функции Т-клеток. Домен CD3-дзета был объединен с сигнальными доменами костимулирующих молекул, таких как CD28, 4-1BB или OX40. Моноклональные T-клеточные рецепторы (mTCR) и их применения в терапии злокачественного новообразования описаны в Stauss et al., 2007, Molecular Therapy, 15(10):1744-50, Zhang and Morgan, 2012, Advanced Drug Delivery Reviews, 64(8): 756-762, и Liddy et al., 2012, Nature Medicine, 18(6):980-7, содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.[00124] As used herein, the term "monoclonal T cell receptor (mTCR)" refers to a T cell receptor (TCR) that is genetically modified to specifically target a specific antigen. It can also be called antigen-specific TCR. It is reported that T cells having mTCR are used in immunotherapy such as adoptive T cell therapy for viral infection and malignancy. In some aspects, the retroviral transfer of chimeric single chain antibody (scFv) constructs has been used as a strategy to generate T cells with specific antigen specificity. For the most part, scFv chimeric constructs have been linked to intracellular FcR-gamma or CD3-zeta signaling domains to induce T-cell effector function. The CD3-zeta domain has been combined with the signaling domains of co-stimulatory molecules such as CD28, 4-1BB or OX40. Monoclonal T cell receptors (mTCRs) and their applications in cancer therapy are described in Stauss et al., 2007, Molecular Therapy, 15(10):1744-50, Zhang and Morgan, 2012, Advanced Drug Delivery Reviews, 64(8 ): 756-762, and Liddy et al., 2012, Nature Medicine, 18(6):980-7, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

[00125] В контексте данного документа термин «δLNGFR» относится к LNGFR (низкоаффинному рецептору фактора роста нервов) без цитоплазматического домена, используемого для очистки клеток, в которых имеет место описанная выше вставка. [00125] In the context of this document, the term "δLNGFR" refers to LNGFR (low affinity nerve growth factor receptor) without a cytoplasmic domain used to clear cells in which the insert described above takes place.

[00126] «Иммунная клетка» может быть охарактеризована в данном документе как выбранная, но не ограничиваясь этим, из лимфоцитов, таких как Т-киллеры, Т-хелперы, гамма/дельта Т-клетки и В-клетки, натуральные киллеры, тучные клетки, эозинофилы, базофилы; и фагоцитарные клетки включают макрофаги, нейтрофилы и дендритные клетки. Т-клетки включают CD4+ T-клетки и CD8+ T-клетки. [00126] An "immune cell" may be characterized herein as selected from, but not limited to, lymphocytes such as killer T cells, T helpers, gamma/delta T cells and B cells, natural killer cells, mast cells , eosinophils, basophils; and phagocytic cells include macrophages, neutrophils, and dendritic cells. T cells include CD4+ T cells and CD8+ T cells.

[00127] В контексте данного документа термины «Т-лимфоцит» и «Т-клетка» используются взаимозаменяемо и относятся к основному типу лейкоцитов, который завершает созревание в тимусе и который выполняет различные функции в иммунной системе, включая идентификацию специфических чужеродных антигенов в организме и активацию и дезактивацию других иммунных клеток. Т-клетка может представлять собой любую Т-клетку, такую как культивируемая Т-клетка, например, первичная Т-клетка или Т-клетка из культивируемой линии Т-клеток, например, Jurkat, SupT1 и т.д., или Т-клетка, полученная от млекопитающего. Т-клетка может представлять собой CD3+ клетки. Т-клетка может представлять собой любой тип Т-клетки и может иметь любую стадию развития, включая, но не ограничиваясь этим, CD4+/CD8+ дважды положительные Т-клетки, CD4+ Т-хелперы (например, Th1- и Th2-клетки), CD8+ Т-клетки (например, цитотоксические Т-клетки), мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), лейкоциты периферической крови (PBL), инфильтрирующие опухоли лимфоциты (TIL), T-клетки памяти, наивные T-клетки, регуляторные T-клетки, гамма/дельта T-клетки (γδ T-клетки), и тому подобное. Дополнительные типы Т-хелперов включают клетки, такие как Th3- (Treg), Th17-, Th9- или Tfh-клетки. Дополнительные типы T-клеток памяти включают такие клетки, как T-клетки центральной памяти (Tcm-клетки), эффекторные T-клетки памяти (Tem-клетки и TEMRA-клетки). Т-клетка также может относиться к генетически сконструированной Т-клетке, такой как Т-клетка, модифицированная для экспрессии Т-клеточного рецептора (TCR) или химерного антигенного рецептора (CAR). Т-клетка также может быть дифференцирована из стволовой клетки или клетки-предшественника.[00127] In the context of this document, the terms "T-lymphocyte" and "T-cell" are used interchangeably and refer to the main type of leukocyte that completes maturation in the thymus and that performs various functions in the immune system, including the identification of specific foreign antigens in the body and activation and deactivation of other immune cells. The T cell can be any T cell, such as a cultured T cell, e.g., a primary T cell or a T cell from a cultured T cell line, e.g., Jurkat, SupT1, etc., or a T cell obtained from a mammal. The T cell may be CD3+ cells. The T cell may be any type of T cell and may be at any stage of development including, but not limited to, CD4+/CD8+ double positive T cells, CD4+ T helper cells (e.g., Th1 and Th2 cells), CD8+ T cells (eg, cytotoxic T cells), peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), peripheral blood leukocytes (PBLs), tumor infiltrating lymphocytes (TILs), memory T cells, naïve T cells, regulatory T cells, gamma /delta T cells (γδ T cells), and the like. Additional types of T helpers include cells such as Th3 (Treg), Th17, Th9 or Tfh cells. Additional types of memory T cells include cells such as central memory T cells (Tcm cells), effector memory T cells (Tem cells and TEMRA cells). A T cell can also refer to a genetically engineered T cell, such as a T cell modified to express a T cell receptor (TCR) or a chimeric antigen receptor (CAR). The T cell can also be differentiated from a stem cell or progenitor cell.

[00128] «CD4+ T-клетки» относится к субпопуляции T-клеток, которые экспрессируют CD4 на своей поверхности и связаны с клеточно-опосредованным иммунным ответом. Они характеризуются профилями секреции после стимуляции, которые могут включать секрецию цитокинов, таких как ИФН-гамма, ФНО-альфа, ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-10. «CD4» представляют собой гликопротеины массой 55 кДа, первоначально определяемые как антигены дифференцировки на Т-лимфоцитах, но также обнаруживаемые в других клетках, включая моноциты/макрофаги. Антигены CD4 являются членами семейства супергенов иммуноглобулинов и участвуют в качестве элементов ассоциативного распознавания в ограниченных ГКГС класса II (главный комплекс гистосовместимости) иммунных реакциях. На Т-лимфоцитах они определяют субпопуляцию хелпер/индуктор.[00128] "CD4+ T cells" refers to a subpopulation of T cells that express CD4 on their surface and are associated with a cell-mediated immune response. They are characterized by secretion profiles after stimulation, which may include the secretion of cytokines such as IFN-gamma, TNF-alpha, IL-2, IL-4 and IL-10. "CD4" are 55 kDa glycoproteins, originally defined as differentiation antigens on T-lymphocytes, but also found on other cells, including monocytes/macrophages. CD4 antigens are members of the immunoglobulin supergene family and are involved as associative recognition elements in MHC class II (major histocompatibility complex) restricted immune responses. On T-lymphocytes, they define the helper/inducer subpopulation.

[00129] «CD8+ T-клетки» относится к субпопуляции T-клеток, которые экспрессируют CD8 на своей поверхности, ограничены по ГКГС класса I и функционируют как цитотоксические T-клетки. Молекулы «CD8» являются дифференцировочными антигенами, обнаруженными на тимоцитах и цитотоксических Т-лимфоцитах и Т-супрессорах. Антигены CD8 являются членами семейства супергенов иммуноглобулинов и являются элементами ассоциативного распознавания во взаимодействиях, ограниченных главным комплексом гистосовместимости класса I.[00129] "CD8+ T cells" refers to a subset of T cells that express CD8 on their surface, are MHC class I restricted, and function as cytotoxic T cells. "CD8" molecules are differentiation antigens found on thymocytes and cytotoxic T-lymphocytes and T-suppressors. CD8 antigens are members of the immunoglobulin supergene family and are elements of associative recognition in interactions limited by the class I major histocompatibility complex.

[00130] В контексте данного документа термин «NK-клетка» или «натуральная клетка-киллер» относится к субпопуляции лимфоцитов периферической крови, определяемой по экспрессии CD56 или CD16 и отсутствием Т-клеточного рецептора (CD3). В контексте данного документа термины «адаптивная NK-клетка» и «NK-клетка памяти» являются взаимозаменяемыми и относятся к субпопуляции NK-клеток с CD3- и CD56+ фенотипом, экспрессирующим по меньшей мере один из NKG2C и CD57 и, необязательно, CD16, но не экспрессирующим один или более из следующего: PLZF, SYK, FceRɣ и EAT-2. В некоторых вариантах осуществления выделенные субпопуляции CD56+ NK-клеток включают экспрессию CD16, NKG2C, CD57, NKG2D, лигандов NCR, NKp30, NKp40, NKp46, активирующих и ингибирующих KIR, NKG2A и/или DNAM-1. CD56+ может быть слабо или сильно экспрессироваться.[00130] As used herein, the term "NK cell" or "natural killer cell" refers to a subpopulation of peripheral blood lymphocytes defined by CD56 or CD16 expression and the absence of the T cell receptor (CD3). In the context of this document, the terms "adaptive NK cell" and "memory NK cell" are used interchangeably and refer to a subpopulation of NK cells with a CD3 and CD56+ phenotype expressing at least one of NKG2C and CD57 and optionally CD16, but not expressing one or more of the following: PLZF, SYK, FceRɣ, and EAT-2. In some embodiments, isolated subpopulations of CD56+ NK cells include expression of CD16, NKG2C, CD57, NKG2D, NCR ligands, NKp30, NKp40, NKp46 activating and inhibiting KIR, NKG2A and/or DNAM-1. CD56+ may be weakly or strongly expressed.

[00131] В контексте данного документа термин «иммунные контрольные точки» относится к молекулам, которые существуют в иммунной системе и способны включать или выключать иммунный ответ. Первоначально они являются защитным механизмом для регуляции чрезмерной активации иммунных клеток, которая вызывает гибель клеток или аутоиммунный ответ. Эти молекулы иммунных контрольных точек могут быть в целом разделены на молекулы стимулирующих иммунных контрольных точек, которые усиливают иммунный ответ, и молекулы ингибирующих иммунных контрольных точек, которые ингибируют иммунный ответ. Например, рецептор и лиганды иммунной контрольной точки могут быть выбраны из группы, состоящей из PD1 (белок программируемой клеточной смерти 1), PD-L1 (лиганд-1 белка программируемой клеточной гибели), CTLA4 (цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4), TIM- 3 (белок 3, содержащий домены T-клеточного иммуноглобулина и муцина), CEACAM (молекула адгезии клеток, связанная с раковым эмбриональным антигеном, включая три подтипа CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG3 (ген активации лимфоцитов-3), VISTA (V-доменный супрессор активации Т-клеток), BTLA (B- и T-лимфоцитарный аттенюатор), TIGIT (T-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM), LAIR1 (связанный с лейкоцитами иммуноглобулин-подобный рецептор 1), CD160 (кластер дифференцировки 160), CD96 (кластер дифференцировки 96), MerTK (протоонкогенная тирозинпротеинкиназа MER) и 2B4 (лиганд, индуцирующий активацию NK-клеток), и, например, могут быть выбраны между PD1 и TIM3.[00131] As used herein, the term "immune checkpoints" refers to molecules that exist in the immune system and are capable of turning the immune response on or off. Initially, they are a defense mechanism to regulate overactivation of immune cells that causes cell death or an autoimmune response. These immune checkpoint molecules can be broadly divided into stimulatory immune checkpoint molecules, which enhance the immune response, and inhibitory immune checkpoint molecules, which inhibit the immune response. For example, the immune checkpoint receptor and ligands can be selected from the group consisting of PD1 (programmed cell death protein 1), PD-L1 (programmed cell death protein ligand-1), CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), TIM-3 (protein 3 containing T-cell immunoglobulin and mucin domains), CEACAM (cell adhesion molecule associated with cancer embryonic antigen, including the three subtypes CEACAM-1, CEACAM-3 or CEACAM-5), LAG3 (lymphocyte activation gene -3), VISTA (V-domain suppressor of T-cell activation), BTLA (B- and T-lymphocyte attenuator), TIGIT (T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains), LAIR1 (leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 ), CD160 (differentiation cluster 160), CD96 (differentiation cluster 96), MerTK (proto-oncogenic tyrosine protein kinase MER) and 2B4 (ligand that induces NK cell activation), and, for example, can be selected between PD1 and TIM3.

[00132] Термин «культура» или «клеточная культура» относится к поддержанию, росту и/или дифференцировке клеток в условиях in vitro. «Среда для культивирования клеток», «среда для культивирования» (в каждом отдельном случае «среда»), «добавка» и «добавка к среде» относятся к питательным композициям, в которых культивируют клеточные культуры. Термин «культивировать» или «поддерживать» относится к поддержанию, размножению (росту) и/или дифференцировке клеток вне ткани или тела, например, в стерильной пластиковой (или покрытой пластиком) чашке Петри или колбе для культивирования клеток. Для «культивирования» или «поддержания» можно использовать среду для культивирования в качестве источника питательных веществ, гормонов и/или других факторов, полезных для размножения и/или поддержания клеток.[00132] The term "culture" or "cell culture" refers to the maintenance, growth and/or differentiation of cells under in vitro conditions. "Cell culture medium", "culture medium" (in each case "medium"), "supplement" and "medium supplement" refer to nutritional compositions in which cell cultures are cultivated. The term "cultivate" or "maintain" refers to the maintenance, propagation (growth) and/or differentiation of cells outside the tissue or body, for example, in a sterile plastic (or plastic-coated) Petri dish or cell culture flask. For "cultivation" or "maintenance", the culture medium may be used as a source of nutrients, hormones, and/or other factors useful for cell propagation and/or maintenance.

[00133] «Фармацевтическая композиция» для иммунотерапии пациентов-людей, описанная в данном документе, содержит иммунные клетки. Поскольку очевидно, что в дополнение к клеткам к фармацевтической композиции могут быть добавлены другие фармацевтически приемлемые соли, носители, вспомогательные вещества, наполнители, и другие добавки и т. д., которые могут дополнительно улучшить иммунный ответ, подробное их описание будет опущено.[00133] The "pharmaceutical composition" for immunotherapy of human patients described herein contains immune cells. Since it is obvious that, in addition to cells, other pharmaceutically acceptable salts, carriers, excipients, excipients, and other additives, etc., which can further improve the immune response, can be added to the pharmaceutical composition, a detailed description of them will be omitted.

[00134] Термин «субъект» относится к любому животному (например, млекопитающему), включая, но не ограничиваясь этим, людей, приматов, псовых, кошачьих, грызунов, и тому подобное, которое должно быть получателем конкретного лечения. Как правило, термины «субъект» и «пациент» используются в данном документе взаимозаменяемо по отношению к субъекту-человеку. [00134] The term "subject" refers to any animal (eg, mammal), including, but not limited to, humans, primates, canines, felines, rodents, and the like, that is to be the recipient of a particular treatment. Generally, the terms "subject" and "patient" are used interchangeably herein with respect to a human subject.

[00135] Термины «лечение» или «лечить» относятся к подавлению, устранению, уменьшению и/или ослаблению симптома, тяжести симптома и/или частоте появления симптома заболевания, подлежащего лечению. Используемые здесь термины «лечат», «лечение» и «процесс лечения» также относятся к уменьшению или ослаблению прогрессирования, тяжести и/или продолжительности заболевания или патологического состояния, возникающего в результате применения одного или более способов лечения.[00135] The terms "treatment" or "treat" refer to the suppression, elimination, reduction and/or amelioration of a symptom, the severity of the symptom, and/or the frequency of occurrence of a symptom of the disease being treated. As used herein, the terms "treat", "treatment" and "process of treatment" also refer to reducing or attenuating the progression, severity and/or duration of a disease or condition resulting from the use of one or more treatments.

[00136] «Эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к количеству соединения, препарата, материала или композиции, например, Т-клеток, как описано в данном документе, эффективному для достижения конкретного биологического результата. Такие результаты могут включать, но не ограничиваются ими, ингибирование злокачественного новообразования, определяемое любыми способами, подходящими для использования в данной области техники.[00136] "Effective amount" or "therapeutically effective amount" are used interchangeably herein and refer to an amount of a compound, drug, material, or composition, such as T cells, as described herein, effective to achieve a particular biological result. Such results may include, but are not limited to, cancer inhibition as measured by any methods suitable for use in the art.

[00137] Термины «вводить» или «введение» относятся к действию, состоящему в инъекции или ином варианте физической доставки вещества в том виде, в котором оно существует за пределами организма, в организм пациента, например, путем мукозальной, интрадермальной, внутривенной, внутримышечной доставки, и/или любому другому способу физической доставки, описанному в данном документе или известному в данной области техники. [00137] The terms "administer" or "administration" refer to the act of injecting or otherwise physically delivering a substance, as it exists outside the body, into a patient's body, e.g., by mucosal, intradermal, intravenous, intramuscular delivery, and/or any other physical delivery method described herein or known in the art.

3. Векторы «два в одном», нацеленные на одну или более иммунных контрольных точек 3. Two-in-one vectors targeting one or more immune checkpoints

[00138] Опухолевые клетки экспрессируют различные иммунные контрольные точки, например, лиганды контрольных точек. Следовательно, даже если одна иммунная контрольная точка ингибируется, может быть трудно ожидать устойчивого эффекта CAR-T из-за активации других иммунных контрольных точек. Комбинацию моноклональных антител в основном использовали для подавления множества иммунных контрольных точек, и о ее противоопухолевом эффекте сообщалось постоянно (J Clin Invest., 2015, Chauvin JM; PNAS, 2010, Curran MA; Blood, 2018, Wierz M; Cancer cell. 2014, Johnston RJ). Однако было известно, что терапевтические антитела могут систематически индуцировать избыточный иммунный ответ. Кроме того, CAR-T-клеточная терапия также связана с угрожающим жизни синдромом высвобождения цитокинов (CRS) и нейротоксичностью (Nat Rev Clin Oncol, 2017, Neelapu SS), предполагая, что комбинация CAR-T терапии и терапии антителами может максимизировать потенциальные побочные эффекты. Кроме того, традиционные аналогичные способы терапии иммунными клетками возлагают на пациентов еще большое экономическое бремя из-за их высокой стоимости и того, что они также воздействуют на Т-клетки, отличные от CAR-T, и создают риск возникновения симптомов аутоиммунных заболеваний и синдрома высвобождения цитокинов. Данное изобретение было разработано для решения вышеуказанных проблем. [00138] Tumor cells express various immune checkpoints, such as checkpoint ligands. Therefore, even if one immune checkpoint is inhibited, it may be difficult to expect a sustained effect of CAR-T due to the activation of other immune checkpoints. The combination of monoclonal antibodies has mainly been used to suppress multiple immune checkpoints, and its antitumor effect has been consistently reported (J Clin Invest., 2015, Chauvin JM; PNAS, 2010, Curran MA; Blood, 2018, Wierz M; Cancer cell. 2014, Johnston RJ). However, it has been known that therapeutic antibodies can systematically induce an excessive immune response. In addition, CAR-T cell therapy is also associated with life-threatening cytokine release syndrome (CRS) and neurotoxicity (Nat Rev Clin Oncol, 2017, Neelapu SS), suggesting that the combination of CAR-T therapy and antibody therapy may maximize potential side effects. . In addition, traditional similar immune cell therapies place an even greater economic burden on patients due to their high cost and the fact that they also act on T cells other than CAR-T and pose a risk of autoimmune disease symptoms and release syndrome. cytokines. The present invention has been developed to solve the above problems.

[00139] В одном варианте осуществления в данном документе предложен вектор «два в одном», причем вектор содержит: последовательность оснований, кодирующую один или более типов коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые ингибируют экспрессию генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток, и последовательность оснований, кодирующую химерный антигенный рецептор (CAR), Т-клеточный рецептор, такой как моноклональный Т-клеточный рецептор (mTCR). [00139] In one embodiment, provided herein is a two-in-one vector, wherein the vector contains: a base sequence encoding one or more short hairpin RNA (shRNA) types that inhibit the expression of genes that impair immune cell function, and a base sequence bases encoding a chimeric antigen receptor (CAR), a T cell receptor such as the monoclonal T cell receptor (mTCR).

[00140] Вектор может быть выбран из ДНК, РНК, плазмиды, лентивирусного вектора, аденовирусного вектора и ретровирусного вектора. Например, лентивирусный вектор и ретровирусные векторы могут вставлять гены в геномную ДНК клеток, обеспечивая стабильную экспрессию генов. В некоторых вариантах осуществления, например, лентивирусный вектор «два в одном», например, двойной вектор «два в одном» можно использовать для передачи генов при помощи вектора в геном клеток.[00140] The vector can be selected from DNA, RNA, plasmid, lentiviral vector, adenoviral vector, and retroviral vector. For example, a lentiviral vector and retroviral vectors can insert genes into the genomic DNA of cells, allowing for stable gene expression. In some embodiments, for example, a two-in-one lentiviral vector, such as a two-in-one double vector, can be used to transfer genes with the vector into the genome of cells.

[00141] В некоторых вариантах осуществления предложен вектор, содержащий последовательность оснований, кодирующую два типа коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые ингибируют экспрессию генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток, и последовательность оснований, кодирующую любой из химерного антигенного рецептора (CAR) и Т-клеточного рецептора, например, моноклонального Т-клеточного рецептора (mTCR).[00141] In some embodiments, a vector is provided that contains a base sequence encoding two types of short hairpin RNA (shRNA) that inhibit the expression of genes that impair immune cell function, and a base sequence encoding either chimeric antigen receptor (CAR) and T -cell receptor, for example, the monoclonal T-cell receptor (mTCR).

[00142] В некоторых вариантах осуществления экспрессия двух типов кшРНК характеризуется тем, что они, соответственно, регулируются двумя разными промоторами. В некоторых вариантах осуществления два промотора представляют собой промоторы РНК-полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления два промотора представляют собой промоторы U6, полученные из разных видов. В некоторых вариантах осуществления два промотора ориентированы в разных направлениях относительно друг друга в векторе. Например, в определенном варианте осуществления промоторы ориентированы в направлении голова к голове. В другом варианте осуществления промоторы ориентированы в направлении хвост к хвосту. В некоторых вариантах осуществления ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, представляет собой рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.[00142] In some embodiments, expression of two types of shRNA is characterized in that they are respectively regulated by two different promoters. In some embodiments, the two promoters are RNA polymerase III promoters. In some embodiments, the two promoters are U6 promoters derived from different species. In some embodiments, the two promoters are oriented in different directions relative to each other in the vector. For example, in a certain embodiment, the promoters are oriented in a head-to-head direction. In another embodiment, the promoters are oriented in a tail-to-tail direction. In some embodiments, the immune cell function-impairing gene is an immune checkpoint receptor or ligand.

[00143] В некоторых вариантах осуществления рецептор или лиганд иммунной контрольной точки выбран из группы, состоящей из PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK и 2B4. В некоторых вариантах осуществления ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, выбран из группы, состоящей из FAS, CD45, PP2A, SHIP1, SHIP2, DGK-альфа, DGK-дзета, Cbl-b, CD147, LRR1, TGFBR1, ИЛ-10R альфа, KLGR1, DNMT3A и A2aR.[00143] In some embodiments, the immune checkpoint receptor or ligand is selected from the group consisting of PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 or CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA , TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK and 2B4. In some embodiments, an immune cell function-impairing gene is selected from the group consisting of FAS, CD45, PP2A, SHIP1, SHIP2, DGK-alpha, DGK-zeta, Cbl-b, CD147, LRR1, TGFBR1, IL-10R alpha, KLGR1, DNMT3A and A2aR.

[00144] В некоторых вариантах осуществления два типа кшРНК или нацелены на разные части одного гена, который ослабляет функцию иммунных клеток, или они нацелены на разные гены, которые ослабляют функцию иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления два типа кшРНК нацелены на разные части PD-1. В некоторых вариантах осуществления два типа кшРНК нацелены на PD-1 и TIM-3, соответственно. В некоторых вариантах осуществления последовательности оснований, кодирующие два типа кшРНК, содержат разные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-219.[00144] In some embodiments, the two shRNA types either target different parts of the same gene that impairs immune cell function, or they target different genes that impair immune cell function. In some embodiments, the two types of shRNA target different parts of PD-1. In some embodiments, the two types of shRNA target PD-1 and TIM-3, respectively. In some embodiments, the base sequences encoding the two types of shRNA contain different sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-219.

[00145] В некоторых вариантах осуществления мишень CAR или TCR, например, mTCR, представляет собой опухолевый антиген человека, выбранный из числа раковых антигенов при злокачественном новообразовании с повышенным уровнем или из мутированных форм ракового антигена, обнаруженного при злокачественном новообразовании.[00145] In some embodiments, the CAR or TCR target, e.g., mTCR, is a human tumor antigen selected from elevated cancer antigens or mutated forms of a cancer antigen found in cancer.

[00146] В некоторых вариантах осуществления вектор содержит любую одну из последовательностей оснований SEQ ID NO: 220 или 221. В некоторых вариантах осуществления вектор выбран из ДНК, РНК, плазмиды, лентивирусного вектора, аденовирусного вектора и ретровирусного вектора. [00146] In some embodiments, the vector comprises any one of the base sequences of SEQ ID NO: 220 or 221. In some embodiments, the vector is selected from DNA, RNA, plasmid, lentiviral vector, adenoviral vector, and retroviral vector.

3.1 РНК-интерференция и короткая шпилечная РНК 3.1 RNA interference and short hairpin RNA

[00147] РНКи (также известная как посттранскрипционный сайленсинг генов (PTGS), подавление или косупрессия) представляет собой процесс посттранскрипционного сайленсинга генов, в котором молекулы РНК специфическим для последовательности образом ингибируют экспрессию генов, как правило, вызывая разрушение специфических молекул мРНК. Активные компоненты РНКи представляют собой короткие/маленькие двухцепочечные РНК (дцРНК), называемые короткими интерферирующими РНК (киРНК), которые, как правило, содержат 15-30 нуклеотидов (например, 19-25, 19-24 или 19-21 нуклеотидов) и 2-нуклеотидных 3'-липких конца и соответствует последовательности нуклеиновой кислоты целевого гена. Эти виды коротких РНК могут естественным образом продуцироваться in vivo с помощью Dicer-опосредованного расщепления более крупных дцРНК, и они являются функциональными в клетках млекопитающих. Плазмиды экспрессии ДНК можно использовать для стабильной экспрессии дуплексов киРНК или дцРНК, описанных в данном документе, в клетках и достижения длительного ингибирования экспрессии целевого гена. В одном аспекте смысловая и антисмысловая цепи дуплекса киРНК обычно связаны короткой спейсерной последовательностью, приводящей к экспрессии структуры типа «стебель-петля», называемой короткой шпилечной РНК (кшРНК). Шпилька распознается и расщепляется Dicer, таким образом генерируя зрелые молекулы киРНК.[00147] RNAi (also known as post-transcriptional gene silencing (PTGS), silencing or co-suppression) is a process of post-transcriptional gene silencing in which RNA molecules inhibit gene expression in a sequence-specific manner, typically causing destruction of specific mRNA molecules. The active components of RNAi are short/small double-stranded RNAs (dsRNAs) called short interfering RNAs (siRNAs) that are typically 15-30 nucleotides (e.g. 19-25, 19-24 or 19-21 nucleotides) and 2 -nucleotide 3'-sticky end and corresponds to the nucleic acid sequence of the target gene. These short RNAs can be naturally produced in vivo by Dicer-mediated cleavage of larger dsRNAs and are functional in mammalian cells. DNA expression plasmids can be used to stably express the siRNA or dsRNA duplexes described herein in cells and achieve long-term inhibition of target gene expression. In one aspect, the sense and antisense strands of an siRNA duplex are typically linked by a short spacer sequence resulting in the expression of a stem-loop structure called short hairpin RNA (shRNA). The hairpin is recognized and cleaved by Dicer, thus generating mature siRNA molecules.

[00148] В контексте данного документа короткая шпилечная РНК (кшРНК) представляет собой молекулу РНК, в которой некоторые самокомплементарные последовательности образуют плотную шпилечную структуру со своим стеблем. Молекулы кшРНК, описанные в данном документе, могут иметь длину от около 40 до 120 нуклеотидов, например, длину от около 70 до 90 нуклеотидов. В иллюстративном варианте осуществления кшРНК может иметь длину 80 нуклеотидов. кшРНК моделируют на основе микроинтерферирующей РНК (миРНК), эндогенного триггера пути РНКи (Lu et al., 2005, Advances in Genetics 54: 117-142, Fewell et al., 2006, Drug Discovery Today 11: 975-982). Когда кшРНК экспрессируется в клетке, она проходит через серию стадий, превращаясь в короткую интерферирующую РНК (киРНК), которая действует в качестве гида для сайленсинга генов. Не вдаваясь в подробности, когда экспрессируется кшРНК, она процессируется комплексами Drosha в клетке, превращаясь в пре-кшРНК, которая затем транспортируется за пределы ядра, где она подвергается дальнейшему процессингу Dicer для превращения в киРНК, а затем переходит в одноцепочечное состояние и загружается в RISC (РНК-индуцируемый сайленсинг-комплекс). При этом антисмысловая цепь киРНК действует в качестве гида для RISC-комплекса, что присоединиться к мРНК целевого гена, и когда комплекс RISC, который присоединен таким образом, разрезает мРНК, то происходит сайленсинг гена. Поскольку кшРНК в целевом гене обеспечивает сайленсинг гена, который сохраняется и специфичен в отношении определенного гена, она включена в вектор с целью ингибирования целевого гена. [00148] In the context of this document, short hairpin RNA (shRNA) is an RNA molecule in which some self-complementary sequences form a dense hairpin structure with its stem. The shRNA molecules described herein may be about 40 to 120 nucleotides in length, eg, about 70 to 90 nucleotides in length. In an exemplary embodiment, shRNA may be 80 nucleotides in length. shRNAs are modeled on microinterfering RNA (siRNA), an endogenous trigger of the RNAi pathway (Lu et al., 2005, Advances in Genetics 54: 117-142, Fewell et al., 2006, Drug Discovery Today 11: 975-982). When shRNA is expressed in a cell, it goes through a series of steps to become short interfering RNA (siRNA), which acts as a guide for gene silencing. Without going into details, when shRNA is expressed, it is processed by Drosha complexes in the cell to become pre-shRNA, which is then transported outside the nucleus where it is further processed by Dicer to become siRNA, and then becomes single-stranded and loaded into RISC (RNA-induced silencing complex). In this case, the antisense strand of the siRNA acts as a guide for the RISC complex to attach to the mRNA of the target gene, and when the RISC complex, which is attached in this way, cuts the mRNA, gene silencing occurs. Because shRNA in the target gene provides gene silencing that is conserved and specific for a particular gene, it is included in the vector to inhibit the target gene.

[00149] Естественно экспрессируемые молекулы малых РНК, называемые микроРНК (миРНК), вызывают сайленсинг генов путем регуляции экспрессии мРНК. миРНК, содержащие RISC, нацелены на мРНК, имеющие полную комплементарность последовательности с нуклеотидами 2-7 в 5'-области миРНК, которая называется затравочной областью, и другими парами оснований с ее 3'-областью. Опосредованное миРНК снижение экспрессии генов может быть вызвано расщеплением целевых мРНК, ингибированием трансляции целевых мРНК или разрушением мРНК. Направленные на миРНК последовательности обычно расположены в 3'-НТО целевых мРНК. Одна миРНК может быть нацелена на более чем 100 транскриптов от различных генов, а на одну мРНК могут быть нацелены разные миРНК. [00149] Naturally expressed small RNA molecules called microRNAs (miRNAs) induce gene silencing by regulating mRNA expression. RISC-containing siRNAs target mRNAs having complete sequence complementarity with nucleotides 2-7 in the 5' region of the siRNA, called the seed region, and other base pairs with its 3' region. MiRNA-mediated reduction in gene expression can be caused by cleavage of target mRNAs, inhibition of translation of target mRNAs, or disruption of mRNAs. MiRNA-targeting sequences are usually located in the 3'-UTR of the target mRNA. One siRNA can target more than 100 transcripts from different genes, and different siRNAs can target one mRNA.

[00150] Дуплексы киРНК или дцРНК, нацеленные на специфическую мРНК, могут быть сконструированы и синтезированы in vitro и введены в клетки для активации процессов РНКи. Elbashir et al. продемонстрировали, что 21-нуклеотидные дуплексы киРНК (называемые короткими интерферирующими РНК) способны вызывать мощный и специфический нокдаун генов без индукции иммунного ответа в клетках млекопитающих (Elbashir SM et al., Nature, 2001, 411, 494-498). Начиная с этого первичного отчета, посттранскрипционный сайленсинг генов при помощи киРНК быстро превратился в мощный инструмент генетического анализа в клетках млекопитающих и обладает потенциалом для создания новых терапевтических средств. [00150] siRNA or dsRNA duplexes targeting a specific mRNA can be designed and synthesized in vitro and introduced into cells to activate RNAi processes. Elbashir et al. demonstrated that 21-nucleotide siRNA duplexes (termed short interfering RNAs) are able to induce powerful and specific gene knockdown without inducing an immune response in mammalian cells (Elbashir SM et al., Nature , 2001, 411, 494-498). Since this initial report, post-transcriptional gene silencing by siRNA has rapidly emerged as a powerful tool for genetic analysis in mammalian cells and has the potential to generate new therapeutic agents.

[00151] Молекулы РНКи, которые были разработаны для нацеливания против последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует белки с полиглутаминовыми повторами, которые вызывают заболевания, связанные с полиглутаминовой экспансией, такие как болезнь Хантингтона, описаны в патентах США №№ 9169483 и 9181544 и международной патентной публикации № WO2015179525, содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. В каждом из патентов США №№ 9169483 и 9181544 и международной патентной публикации № WO2015179525 предложены выделенные дуплексы РНК, содержащие первую цепь РНК (например, 15 смежных нуклеотидов) и вторую цепь РНК (например, комплементарную по меньшей мере 12 смежным нуклеотидам первой цепи), причем дуплекс РНК имеет длину от 15 до 30 пар оснований. Первая цепь РНК и вторая цепь РНК могут быть функционально связаны с помощью петли РНК (~4-50 нуклеотидов) с образованием шпилечной структуры, которая может быть вставлена в кассету экспрессии. Неограничивающие примеры участков петли включают SEQ ID NO: 9-14 из патента США № 9169483, содержание которого полностью включено в данный документ посредством ссылки. Неограничивающие примеры цепей РНК, которые можно использовать, или полной последовательности, или части последовательности, для образования дуплексов РНК, включают SEQ ID NO: 1-8 из патента США № 9169483 и SEQ ID NO: 1-11, 33 -59, 208-210, 213-215 и 218-221 из патента США № 9181454, содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Неограничивающие примеры молекул РНКи включают SEQ ID NO: 1-8 из патента США № 9169483, SEQ ID NO: 1-11, 33-59, 208-210, 213-215 и 218-221 из патента США №. 9115544 и SEQ ID NO: 1, 6, 7 и 35-38 из международной патентной публикации № WO2015179525, содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.[00151] RNAi molecules that have been designed to target against a nucleic acid sequence that encodes polyglutamine repeat proteins that cause polyglutamine expansion related diseases such as Huntington's disease are described in US Patent Nos. 9,169,483 and 9,181,544 and International Patent Publication No. WO2015179525, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety. US Pat. Nos. 9,169,483 and 9,181,544 and International Patent Publication No. WO2015179525 each provide isolated RNA duplexes comprising a first RNA strand (e.g., 15 contiguous nucleotides) and a second RNA strand (e.g., complementary to at least 12 contiguous nucleotides of the first strand), moreover, the RNA duplex has a length of 15 to 30 base pairs. The first RNA strand and the second RNA strand can be operably linked by an RNA loop (~4-50 nucleotides) to form a hairpin structure that can be inserted into the expression cassette. Non-limiting examples of loop sections include SEQ ID NO: 9-14 of US Pat. No. 9,169,483, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety. Non-limiting examples of RNA strands that can be used, either the entire sequence or a portion of a sequence, to form RNA duplexes include SEQ ID NOs: 1-8 of US Pat. No. 9,169,483 and SEQ ID NOs: 1-11, 33-59, 208- 210, 213-215, and 218-221 of US Pat. No. 9,181,454, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety. Non-limiting examples of RNAi molecules include SEQ ID NOs: 1-8 of US Pat. No. 9,169,483; SEQ ID NOs: 1-11; 33-59; 208-210; 9115544 and SEQ ID NOs: 1, 6, 7 and 35-38 of International Patent Publication No. WO2015179525, the contents of each of which are incorporated herein by reference in their entirety.

[00152] Синтезированные in vitro молекулы киРНК могут быть введены в клетки для активации РНКи. Экзогенный дуплекс киРНК, когда он вводится в клетки, аналогично эндогенным дцРНК, может быть собран с образованием РНК-индуцируемого сайленсинг-комплекса (RISC), мультиединичного комплекса, который взаимодействует с последовательностями РНК, которые комплементарны одной из двух цепей дуплекса киРНК (т. е. антисмысловой цепи). В ходе этого процесса смысловая цепь (или сопровождающая цепь) киРНК удаляется из комплекса, в то время как антисмысловая цепь (или направляющая цепь) киРНК сопоставляется с ее комплементарной РНК. В частности, мишени киРНК-содержащих RISC-комплексов представляют собой мРНК, имеющие точную комплементарность последовательностей. Затем киРНК-опосредованный сайленсинг гена происходит путем расщепления, высвобождения и деградации мишени. [00152] In vitro synthesized siRNA molecules can be introduced into cells to activate the RNAi. An exogenous siRNA duplex, when introduced into cells, similar to endogenous dsRNAs, can be assembled to form the RNA-Inducible Silencing Complex (RISC), a multi-unit complex that interacts with RNA sequences that are complementary to one of the two strands of the siRNA duplex (i.e., . antisense strand). During this process, the sense strand (or guide strand) of the siRNA is removed from the complex, while the antisense strand (or guide strand) of the siRNA is matched to its complementary RNA. In particular, the targets of siRNA-containing RISC complexes are mRNAs with exact sequence complementarity. Then, siRNA-mediated gene silencing occurs by cleavage, release, and degradation of the target.

[00153] Дуплекс киРНК, состоящий из смысловой цепи, гомологичной целевой мРНК, и антисмысловой цепи, которая комплементарна целевой мРНК, дает гораздо большее преимущество с точки зрения эффективности разрушения целевой РНК по сравнению с использованием одноцепочечных (оц)-киРНК (например, антисмысловой цепи РНК или антисмысловых олигонуклеотидов). Во многих случаях требуется более высокая концентрация оц-киРНК для достижения оптимальной активности сайленсинга гена соответствующего дуплекса.[00153] An siRNA duplex consisting of a sense strand that is homologous to the target mRNA and an antisense strand that is complementary to the target mRNA offers a much greater advantage in terms of efficiency in destroying the target RNA compared to using single-stranded (ss)-siRNAs (e.g., antisense strand RNA or antisense oligonucleotides). In many cases, a higher concentration of ss-siRNA is required to achieve optimal gene silencing activity of the corresponding duplex.

[00154] В данной области техники имеются методические указания для конструирования киРНК. В этих методических указаниях, как правило, рекомендуется получение 19-нуклеотидного дуплексного участка, симметричных 2-3 нуклеотидных 3'-липких концов, 5'-фосфатных и 3'-гидроксильных групп, нацеленных на область в гене, которую нужно подвергнуть сайленсингу. Другие правила, которые могут определять предпочтение последовательности киРНК, включают, но не ограничиваются, (i) A/U на 5'-конце антисмысловой цепи; (ii) G/C на 5'-конце смысловой цепи; (iii) по меньшей мере пять остатков A/U в одной трети 5'-концевой области антисмысловой цепи; и (iv) отсутствие какого-либо участка GC длиной более 9 нуклеотидов. В соответствии с этим соображением вместе со специфической последовательностью целевого гена могут быть легко разработаны высокоэффективные молекулы киРНК, необходимые для подавления экспрессии целевого гена млекопитающих. [00154] There are guidelines in the art for constructing siRNAs. These guidelines generally recommend the generation of a 19-nt duplex region, symmetrical 2-3 nt 3' cohesive ends, 5'-phosphate and 3'-hydroxyl groups, targeting the region in the gene to be silenced. Other rules that may determine siRNA sequence preference include, but are not limited to, (i) A/U at the 5' end of the antisense strand; (ii) G/C at the 5' end of the sense strand; (iii) at least five A/U residues in one third of the 5'-terminal region of the antisense strand; and (iv) the absence of any GC region longer than 9 nucleotides. In accordance with this consideration, together with the specific sequence of the target gene, highly effective siRNA molecules necessary to suppress the expression of the mammalian target gene can be easily developed.

[00155] Как указано в данном документе, вектор «два в одном» содержит последовательность оснований, кодирующую один или более типов коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые ингибируют экспрессию одного или более генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток, и последовательность оснований, кодирующую любой один из химерного антигенного рецептора (CAR) или Т-клеточного рецептора, например, моноклонального Т-клеточного рецептора (mTCR). [00155] As described herein, a two-in-one vector contains a base sequence encoding one or more short hairpin RNA (shRNA) types that inhibit the expression of one or more genes that impair immune cell function, and a base sequence encoding any one of a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor, such as the monoclonal T cell receptor (mTCR).

[00156] В некоторых вариантах осуществления последовательность оснований кодирует один тип кшРНК, который ингибирует экспрессию гена, который ослабляет функцию иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления последовательность оснований кодирует два типа кшРНК, которые ингибируют экспрессию двух генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток, при этом вектор можно обозначить как двойной вектор «два в одном». В других вариантах осуществления последовательность оснований кодирует более двух типов кшРНК, которые ингибируют экспрессию более двух генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток. [00156] In some embodiments, the base sequence encodes a single type of shRNA that inhibits the expression of a gene that impairs immune cell function. In some embodiments, the base sequence encodes two types of shRNAs that inhibit the expression of two genes that impair immune cell function, the vector being referred to as a two-in-one dual vector. In other embodiments, the base sequence encodes more than two shRNA types that inhibit the expression of more than two genes that impair immune cell function.

[00157] В некоторых вариантах осуществления два или более типов кшРНК могут быть охарактеризованы тем, что они нацелены на один ген, например, на разные части одного гена, что ослабляет функцию иммунных клеток. Например, два или более типов кшРНК могут нацеливаться на PD-1, например, на разные части PD-1. В других вариантах осуществления два или более типов кшРНК могут быть охарактеризованы тем, что они нацелены на разные гены, которые ослабляют функцию иммунных клеток, например, нацелены на PD-1 и TIM-3. [00157] In some embodiments, two or more shRNA types can be characterized in that they target the same gene, such as different parts of the same gene, which impairs immune cell function. For example, two or more types of shRNA can target PD-1, eg different parts of PD-1. In other embodiments, two or more shRNA types can be characterized in that they target different genes that impair immune cell function, such as targeting PD-1 and TIM-3.

[00158] В иллюстративных вариантах осуществления последовательности оснований, кодирующие два или более типов кшРНК, могут быть охарактеризованы тем, что они содержат разные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-219 и 238-267, например, они могут содержать разные выбранные последовательности из группы, состоящей из SEQ ID NO:2-117 и 238-267, например, они могут содержать разные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-12, 70-75 и 266-267.[00158] In exemplary embodiments, base sequences encoding two or more shRNA types can be characterized in that they contain different sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-219 and 238-267, for example, they can contain different selected sequences from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-117 and 238-267, for example, they may contain different sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-12, 70-75 and 266-267 .

[00159] В некоторых вариантах экспрессия двух типов кшРНК может быть охарактеризована тем, что они регулируются двумя разными промоторами, соответственно, чтобы минимизировать артефакты рекомбинации или делеции во время клонирования. [00159] In some embodiments, the expression of two shRNA types can be characterized in that they are regulated by two different promoters, respectively, to minimize recombination or deletion artifacts during cloning.

[00160] В некоторых вариантах осуществления промоторы могут представлять собой промотор РНК-полимеразы I, промотор РНК-полимеразы II или промотор РНК-полимеразы III, в зависимости от того, какая РНК-полимераза присоединяется к промотору и начинает транскрипцию. Два указанных выше промотора могут быть охарактеризованы тем, что они представляют собой промоторы РНК-полимеразы III (далее промоторы pol III). Промоторы Pol III могут быть сделаны так, чтобы точно транскрибироваться от 5'-конца к 3'-концу без присоединения кэпа на 5'-конце или поли(A)-хвоста на 3'-конце РНК, которая транскрибируется с регуляцией промотором. Типы промотора pol III включают, но не ограничиваются ими, промотор U6, промотор H1 и промотор 7SK и т. д. Два промотора, включенные в вектор, могут быть разными, выбранными из промоторов pol III, включая три типа, указанных выше, и, если выбираются одни и те же типы промоторов, они могут быть получены из разных видов. Например, два промотора могут представлять собой промоторы U6, например, промоторы U6, полученные из разных видов, такие как промоторы U6, полученные от людей и мышей. Поскольку транскрипт, созданный промотором U6, остается в ядре, считается, что это может привести к тому, что комплекс Drosha, который находится в ядре, будет способствовать процессу, в котором кшРНК превращается в пре-кшРНК.[00160] In some embodiments, promoters can be an RNA polymerase I promoter, an RNA polymerase II promoter, or an RNA polymerase III promoter, depending on which RNA polymerase attaches to the promoter and starts transcription. The above two promoters can be characterized in that they are RNA polymerase III promoters (hereinafter pol III promoters). Pol III promoters can be made to be accurately transcribed 5' to 3' without adding a cap at the 5' end or a poly(A) tail at the 3' end of the RNA that is transcribed under the regulation of the promoter. The types of pol III promoter include, but are not limited to, the U6 promoter, the H1 promoter, and the 7SK promoter, etc. The two promoters included in the vector may be different, selected from the pol III promoters, including the three types mentioned above, and, if the same types of promoters are chosen, they can be obtained from different species. For example, the two promoters may be U6 promoters, such as U6 promoters derived from different species, such as U6 promoters derived from humans and mice. Since the transcript generated by the U6 promoter remains in the nucleus, it is believed that this may result in the Drosha complex, which is located in the nucleus, to facilitate the process by which shRNA is converted to pre-shRNA.

[00161] В некоторых вариантах осуществления два или более промоторов могут быть охарактеризованы тем, что они ориентированы в разных направлениях относительно других в векторе. Например, в определенном варианте осуществления промоторы ориентированы в направлении голова к голове (→←). В другом варианте осуществления промоторы ориентированы в направлении хвост к хвосту (←→). В двойном векторе «два в одном» ориентация вектора в разных направлениях означает, что когда транскрибируются соответствующие кшРНК, экспрессия которых регулируется двумя промоторами, направления, в которых движутся РНК-полимеразы, ориентированы в разных направлениях в одной молекуле нуклеиновой кислоты. В иллюстративном варианте осуществления два промотора могут находиться в направлениях →← (Фиг. 15A). В другом иллюстративном варианте осуществления два промотора могут находиться в направлениях ←→ (Фиг. 15B). Например, два промотора могут принимать направления →← в векторе.[00161] In some embodiments, two or more promoters can be characterized in that they are oriented in different directions relative to others in the vector. For example, in a certain embodiment, the promoters are oriented in a head-to-head (→←) direction. In another embodiment, the promoters are oriented in a tail-to-tail (←→) direction. In a two-in-one double vector, the orientation of the vector in different directions means that when the corresponding shRNAs, whose expression is regulated by two promoters, are transcribed, the directions in which the RNA polymerases move are oriented in different directions in one nucleic acid molecule. In an exemplary embodiment, the two promoters may be in the →← directions (FIG. 15A). In another exemplary embodiment, the two promoters may be in the ←→ directions (FIG. 15B). For example, two promoters may take the →← directions in the vector.

[00162] В некоторых вариантах осуществления экспрессия целевых генов одного или более типов кшРНК снижается до около 90% или менее от экспрессии контрольной группы, например, экспрессия целевых генов снижается до около 80% или менее, около 70% или менее, около 60% или менее, около 50% или менее, около 40% или менее, около 30% или менее, около 20% или менее, и около 10% или менее от экспрессии контрольной группы.[00162] In some embodiments, target gene expression of one or more shRNA types is reduced to about 90% or less of that of a control group, e.g., target gene expression is reduced to about 80% or less, about 70% or less, about 60%, or less, about 50% or less, about 40% or less, about 30% or less, about 20% or less, and about 10% or less of the expression of the control group.

[00163] Как правило, кшРНК конструируют так, чтобы она имела последовательность, имеющую высокую гомологию с частью последовательности мРНК ее целевого гена (далее последовательность оснований смысловой кшРНК), последовательность, способную образовывать острую шпильку, и последовательность, комплементарную последовательности, имеющей высокую гомологию (далее последовательность оснований антисмысловой кшРНК). Нековалентные связи между самокомплементарными частями образуют структуру стебля, и когда кшРНК экспрессируется и процессируется в клетке, последовательность оснований антисмысловой кшРНК действует как гид для мРНК целевого гена в процессе сайленсинга генов. Например, последовательности оснований кассеты, используемые в данном документе для экспрессии кшРНК, могут содержать структуру NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (21 оснований) - последовательность петли - NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (19 оснований). В одном варианте осуществления участок из 21 основания кодирует последовательности оснований смысловой кшРНК, а участок из 19 оснований является комплементарным или существенно комплементарным участку из 21 основания и кодирует последовательности оснований антисмысловой кшРНК. В другом варианте осуществления участок из 19 основания кодирует последовательности оснований смысловой кшРНК, а участок из 21 оснований является комплементарным или существенно комплементарным участку из 19 основания и кодирует последовательности оснований антисмысловой кшРНК. Следовательно, при экспрессии полученная РНК образует структуру стебля и петли. В некоторых вариантах осуществления такие последовательности оснований смысловой или антисмысловой кшРНК для целевого гена (человеческого происхождения), которые могут быть включены в кассету, выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-219. В конкретных вариантах осуществления последовательности оснований кассеты, используемые в данном документе для экспрессии кшРНК, могут быть выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 220-224. [00163] Typically, shRNA is designed to have a sequence that has high homology to a portion of the mRNA sequence of its target gene (hereinafter, the base sequence of sense shRNA), a sequence capable of forming a sharp hairpin, and a sequence that is complementary to a sequence that has high homology ( hereinafter, the base sequence of the antisense shRNA). Non-covalent bonds between self-complementary parts form the structure of the stem, and when shRNA is expressed and processed in the cell, the base sequence of the antisense shRNA acts as a guide for the mRNA of the target gene in the process of gene silencing. For example, cassette base sequences used herein to express shRNA may comprise the structure NNNNNNNNNNNNNNNNNNN (21 bases) - loop sequence - NNNNNNNNNNNNNNNNNN (19 bases). In one embodiment, the 21 base region encodes sense shRNA base sequences and the 19 base region is complementary or substantially complementary to the 21 base region and encodes antisense shRNA base sequences. In another embodiment, the 19 base region encodes the sense shRNA base sequences and the 21 base region is complementary or substantially complementary to the 19 base region and encodes the antisense shRNA base sequences. Therefore, when expressed, the resulting RNA forms a stem and loop structure. In some embodiments, such sense or antisense shRNA base sequences for the target gene (of human origin) that can be included in the cassette are selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-219. In specific embodiments, the cassette base sequences used herein for shRNA expression may be selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 220-224.

[00164] В некоторых вариантах осуществления вся последовательность оснований кшРНК может быть расположена в 3'-концевой области промотора U6 мыши или человека, а TTTTT, необходимый для терминации транскрипции промотором U6, может быть расположен в 3'-концевой области всех последовательностей оснований кшРНК. [00164] In some embodiments, the entire shRNA base sequence may be located in the 3' region of the mouse or human U6 promoter, and the TTTTT required for transcription termination by the U6 promoter may be located in the 3' region of all shRNA base sequences.

[00165] В некоторых вариантах осуществления последовательности нуклеиновых кислот соответствующих кшРНК могут, в дополнение к последовательностям, описанным в данном документе, содержать последовательности нуклеиновых кислот, проявляющие по меньшей мере 50%, конкретно по меньшей мере 70%, более конкретно по меньшей мере 80%, еще более конкретно по меньшей мере 90%, и наиболее конкретно по меньшей мере 95% гомологии последовательностей с этими последовательностями. Сообщалось, что это связано с тем, что в случае киРНК (короткой интерферирующей РНК) и кшРНК, которые процессируются внутри клетки с образованием, в частности, киРНК, что незначительная мутация, особенно мутация в 5'-концевой области, является допустимой, вызывая нормальный нокдаун целевого гена, и что мутации киРНК и кшРНК, которые имеют структуру, сходную со структурой миРНК, играющей роль в сайленсинге генов, более эффективно индуцирует нокдаун целевого гена. Кроме того, при использовании векторов специалистам в данной области техники очевидны вариации в векторе, то есть добавление, модификация или делеция последовательностей оснований, которые могут происходить в процессе клонирования для введения определенной последовательности в вектор, или изменения или введения компонентов для повышения простоты использования вектора в той степени, в которой экспрессируется предполагаемый ген.[00165] In some embodiments, the respective shRNA nucleic acid sequences may, in addition to the sequences described herein, contain nucleic acid sequences exhibiting at least 50%, specifically at least 70%, more specifically at least 80% , even more specifically at least 90%, and most specifically at least 95% sequence homology with these sequences. It has been reported that this is because, in the case of siRNA (short interfering RNA) and shRNA, which are processed intracellularly to form, in particular, siRNA, that a minor mutation, especially a mutation in the 5'-terminal region, is tolerated, causing normal knockdown of the target gene, and that mutations in siRNA and shRNA, which have a structure similar to that of the siRNA that plays a role in gene silencing, more effectively induce knockdown of the target gene. Furthermore, when using vectors, variations in the vector will be apparent to those skilled in the art, i.e. addition, modification, or deletion of base sequences, which may occur during the cloning process to introduce a specific sequence into the vector, or alteration or introduction of components to improve the ease of use of the vector in the extent to which the putative gene is expressed.

[00166] Существуют различные механизмы действия генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток. Примеры включают ингибирование пролиферации иммунных клеток или вызывание гибели клеток, уменьшение реакций с молекулами, с которыми иммунные клетки должны реагировать, чтобы активироваться, ингибирование экспрессии генов, необходимых иммунным клеткам для распознавания мишеней реакции, и вызывание дифференциации в различные типы иммунной клетки для выполнения другой функции, а не вызывания иммунного ответа на конкретную мишень. Иллюстративные примеры включают, но не ограничиваются ими, молекулы, связанные с иммунными контрольными точками, которые будут рассмотрены ниже.[00166] There are various mechanisms of action of genes that impair the function of immune cells. Examples include inhibiting immune cell proliferation or inducing cell death, reducing reactions with molecules that immune cells must react with in order to be activated, inhibiting the expression of genes required by immune cells to recognize reaction targets, and causing differentiation into different types of immune cell to perform another function. rather than inducing an immune response to a specific target. Illustrative examples include, but are not limited to, immune checkpoint-associated molecules, which will be discussed below.

[00167] В некоторых вариантах осуществления ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, можно охарактеризовать тем, что он представляет собой рецептор или лиганд иммунной контрольной точки. Иммунные контрольные точки представляют собой молекулы, которые существуют в иммунной системе и способны включать или выключать иммунный ответ. Их можно рассматривать как защитные механизмы для регуляции чрезмерной активации иммунных клеток, которая вызывает гибель клеток или аутоиммунный ответ. Эти молекулы иммунных контрольных точек могут быть в целом разделены на молекулы стимулирующих иммунных контрольных точек, которые усиливают иммунный ответ, и молекулы ингибирующих иммунных контрольных точек, которые ингибируют иммунный ответ. Сообщается, что многие раковые клетки избегают иммунной системы, активируя сигналы ингибирующей иммунной контрольной точки, особенно рецепторы и лиганды ингибирующей иммунной контрольной точки на иммунных клетках. Соответственно, иммунная клеточная терапия, нацеленная на конкретное злокачественное новообразование, может быть эффективной, если сделать это уклоняющееся действие злокачественных новообразований неэффективным, и это может быть достигнуто путем ингибирования активации рецепторов ингибирующей иммунной контрольной точки и их лигандов или путем снижения их экспрессии. Например, рецептор и лиганды иммунной контрольной точки могут быть выбраны из группы, состоящей из PD1 (белок программируемой клеточной смерти 1), PD-L1 (лиганд-1 белка программируемой клеточной гибели), CTLA4 (цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4), TIM- 3 (белок 3, содержащий домены T-клеточного иммуноглобулина и муцина), CEACAM (молекула адгезии клеток, связанная с раковым эмбриональным антигеном, включая три подтипа CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG3 (ген активации лимфоцитов-3), VISTA (V-доменный супрессор активации Т-клеток), BTLA (B- и T-лимфоцитарный аттенюатор), TIGIT (T-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM), LAIR1 (связанный с лейкоцитами иммуноглобулин-подобный рецептор 1), CD160 (кластер дифференцировки 160), CD96 (кластер дифференцировки 96), MerTK (протоонкогенная тирозинпротеинкиназа MER) и 2B4 (лиганд, индуцирующий активацию NK-клеток), и, например, могут быть выбраны из PD1, TIM3 и TIGIT.[00167] In some embodiments, a gene that impairs immune cell function can be characterized in that it is an immune checkpoint receptor or ligand. Immune checkpoints are molecules that exist in the immune system and are capable of turning the immune response on or off. They can be considered as protective mechanisms to regulate the overactivation of immune cells that causes cell death or an autoimmune response. These immune checkpoint molecules can be broadly divided into stimulatory immune checkpoint molecules, which enhance the immune response, and inhibitory immune checkpoint molecules, which inhibit the immune response. Many cancer cells are reported to escape the immune system by activating inhibitory immune checkpoint signals, especially inhibitory immune checkpoint receptors and ligands on immune cells. Accordingly, an immune cell therapy targeting a particular cancer can be effective by making this cancer evading action ineffective, and this can be achieved by inhibiting the activation of inhibitory immune checkpoint receptors and their ligands or by reducing their expression. For example, the immune checkpoint receptor and ligands can be selected from the group consisting of PD1 (programmed cell death protein 1), PD-L1 (programmed cell death protein ligand-1), CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), TIM-3 (protein 3 containing T cell immunoglobulin and mucin domains), CEACAM (cell adhesion molecule associated with cancer embryonic antigen, including the three subtypes CEACAM-1, CEACAM-3 or CEACAM-5), LAG3 (lymphocyte activation gene -3), VISTA (V-domain suppressor of T-cell activation), BTLA (B- and T-lymphocyte attenuator), TIGIT (T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains), LAIR1 (leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1 ), CD160 (differentiation cluster 160), CD96 (differentiation cluster 96), MerTK (proto-oncogenic tyrosine protein kinase MER) and 2B4 (ligand that induces NK cell activation), and, for example, can be selected from PD1, TIM3 and TIGIT.

[00168] В других вариантах осуществления ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, можно охарактеризовать тем, что он кодирует рецептор, который может стимулировать AICD (клеточную смерть, индуцированную активацией), действуя в качестве негативного регулятора для Т-лимфоцитов, которые были активированы путем повторной стимуляции с помощью TCR, например, FAS (также известный как CD95, APO-1 или апоптозный антиген-1). В некоторых вариантах осуществления ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, может быть охарактеризован тем, что он кодирует факторы, которые подавляют сигнальную активацию TCR, например, факторы могут быть выбраны из CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-альфа, DGK-дзета, Cbl -b, Cbl-c и CD148. В некоторых вариантах осуществления ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, может быть охарактеризован тем, что он кодирует белок, который подавляет эффективность CAR и/или TCR, например, mTCR посредством подавления сигнала 4-1BB, где 4-1BB представляет собой описанную в данном документе костимулирующую молекулу TCR, например, LRR1 (содержащий лейцин-богатые повторы белок 1). В некоторых вариантах осуществления ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, может быть охарактеризован тем, что он кодирует рецептор, лигандом которого является цитокин, который подавляет Т-клетки, например, TGFBR1 (рецептор 1 трансформирующего фактора роста бета) и ИЛ-10R-альфа (альфа-субъединица ИЛ-10R). В некоторых вариантах осуществления ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, может быть охарактеризован тем, что он кодирует рецептор, который ингибирует пролиферативную способность и цитотоксичность Т-клеток и NK-клеток, например, KLGR1 (лектиноподобный рецептор G1 киллерных клеток). В некоторых вариантах осуществления ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, можно охарактеризовать тем, что он кодирует регулятор, связанный с метилированием новой ДНК, который, как сообщается, подавляет истощение Т-клеток при нокауте (KO), например, TNMT3a (ДНК-метилтрансфераза 3-альфа). В некоторых вариантах осуществления ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, может быть охарактеризован тем, что он кодирует аденозиновый рецептор, который присутствует в избытке в микроокружении опухоли, который при активации может ингибировать клеточную токсичность и способность Т-клеток продуцировать цитокины, например, A2aR (аденозиновый рецептор подтипа A2a).[00168] In other embodiments, an immune cell function-impairing gene can be characterized in that it encodes a receptor that can stimulate AICD (activation-induced cell death) by acting as a negative regulator for T-lymphocytes that have been activated by repeated stimulation with a TCR, such as FAS (also known as CD95, APO-1, or apoptotic antigen-1). In some embodiments, a gene that impairs immune cell function can be characterized in that it encodes factors that suppress TCR signaling activation, for example, factors can be selected from CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-alpha, DGK-zeta, Cbl-b, Cbl-c and CD148. In some embodiments, an immune cell function-impairing gene can be characterized in that it encodes a protein that suppresses the effectiveness of a CAR and/or TCR, e.g., mTCR, by downregulating the 4-1BB signal, where 4-1BB is the a costimulatory TCR molecule, such as LRR1 (containing leucine-rich repeat protein 1). In some embodiments, a gene that impairs immune cell function can be characterized in that it encodes a receptor whose ligand is a cytokine that suppresses T cells, such as TGFBR1 (transforming growth factor receptor 1 beta) and IL-10R-alpha ( alpha subunit of IL-10R). In some embodiments, a gene that impairs immune cell function can be characterized in that it encodes a receptor that inhibits the proliferative capacity and cytotoxicity of T cells and NK cells, for example, KLGR1 (G1 lectin-like killer cell receptor). In some embodiments, a gene that attenuates immune cell function can be characterized in that it encodes a novel DNA methylation-associated regulator that is reported to suppress knockout (KO) T-cell depletion, e.g., TNMT3a (DNA methyltransferase 3 -alpha). In some embodiments, a gene that impairs immune cell function can be characterized in that it encodes an adenosine receptor that is present in excess in the tumor microenvironment, which, when activated, can inhibit cellular toxicity and the ability of T cells to produce cytokines, e.g., A2aR (adenosine receptor subtype A2a).

[00169] В некоторых вариантах осуществления ген, ослабляющий функцию иммунных клеток, может быть охарактеризован тем, что он выбран из группы, состоящей из FAS, CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-альфа, DGK-дзета, Cbl-b, Cbl-c, CD148, LRR1, TGFBR1, ИЛ-10RA, KLGR1, DNMT3A и A2aR.[00169] In some embodiments, an immune cell function-impairing gene can be characterized in that it is selected from the group consisting of FAS, CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-alpha, DGK-zeta, Cbl-b, Cbl -c, CD148, LRR1, TGFBR1, IL-10RA, KLGR1, DNMT3A and A2aR.

3.2 Химерный антигенный рецептор (CAR) и Т-клеточный рецептор, например, моноклональный Т-клеточный рецептор (mTCR). 3.2 Chimeric antigen receptor (CAR) and T cell receptor, eg monoclonal T cell receptor (mTCR).

[00170] Как указано в данном документе, вектор «два в одном» содержит последовательность оснований, кодирующую один или более типов коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые ингибируют экспрессию одного или более генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток, и последовательность оснований, кодирующую любой один из химерного антигенного рецептора (CAR) или Т-клеточного рецептора, например, моноклонального Т-клеточного рецептора (mTCR). [00170] As described herein, a two-in-one vector contains a base sequence encoding one or more types of short hairpin RNA (shRNA) that inhibit the expression of one or more genes that impair immune cell function, and a base sequence encoding any one of a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor, such as the monoclonal T cell receptor (mTCR).

[00171] CAR, как правило, представляет собой набор полипептидов, которые, когда они присутствуют на иммунной клетке, вызывают специфичность иммунной клетки к целевой клетке (как правило, раковой клетке), вызывая при этом сигнальную трансдукцию в клетке. Как минимум, CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, который распознает целевой антиген, который будет описан ниже, трансмембранный домен и внутриклеточной домен сигнальной трансдукции, причем внутриклеточной домен сигнальной трансдукции получен из стимулирующих молекул или костимулирующих молекул. [00171] CARs are typically a set of polypeptides that, when present on an immune cell, cause the immune cell to become specific to the target cell (typically a cancer cell), thereby causing signal transduction in the cell. At a minimum, a CAR contains an extracellular antigen recognition domain that recognizes a target antigen to be described below, a transmembrane domain, and an intracellular signal transduction domain, the intracellular signal transduction domain being derived from stimulatory molecules or co-stimulatory molecules.

[00172] Структура CAR, обычно применяемая сегодня в клинических целях, содержит домен одноцепочечного вариабельного фрагмента (далее scFv), который придает специфичность антигену, спейсерный домен, регулирующий расстояние между scFv и клеточной мембраной, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен (далее ISD). ISD, в свою очередь, содержит костимулирующий домен (CD28, CD137 или OX40), который способствует пролиферации in vivo и долгой жизни одной или более Т-клеток, и сигнальный домен TCR (CD3-дзета, CD3ζ), который способствует активации Т-клеток. Т-клетки, модифицированные для экспрессии CAR, которые были получены таким образом, могут быть активированы путем распознавания раковых клеток, которые экспрессируют целевой антиген с высокой специфичностью, эффективно индуцируют гибель таких раковых клеток, одновременно экспоненциально размножаются в организме и остаются живыми в течение продолжительного времени. Например, когда пациенту с В-клеточным лейкозом вводили CAR-T-клетки (CART-19), полученные для нацеливания на CD19, специфический для В-клеток антиген, сообщалось, что эти клетки пролиферировали в 1000-10000 раз и оставались живыми в организме в течение нескольких лет. В результате CART-19 продемонстрировал 90% - ный полный ответ в клиническом исследовании, проведенном с участием больных в терминальной стадии острого лимфобластного лейкоза (В-ОЛЛ), которым проводили традиционную химиотерапию и др., и которая оказалась не эффективной, что привело к редкому случаю лицензирования глобальной фармацевтической компании на ранней стадии инициированных исследователем клинических испытаний. Он стал первым агентом CAR-T-клеточной терапии, получившим одобрение FDA США в 2017 году, и после этого был также утвержден второй CAR-T. [00172] The CAR structure commonly used in clinical practice today contains a single chain variable fragment domain (hereinafter scFv) that confers antigen specificity, a spacer domain regulating the distance between the scFv and the cell membrane, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain (hereinafter ISD). The ISD, in turn, contains a co-stimulatory domain (CD28, CD137, or OX40) that promotes in vivo proliferation and longevity of one or more T cells, and a TCR signaling domain (CD3-zeta, CD3ζ) that promotes T cell activation. . T cells modified to express CARs thus obtained can be activated by recognizing cancer cells that express the target antigen with high specificity, effectively induce the death of such cancer cells, simultaneously proliferate exponentially in the body, and remain alive for a long time. . For example, when a patient with B-cell leukemia was injected with CAR-T cells (CART-19) prepared to target CD19, a B-cell-specific antigen, these cells were reported to proliferate 1,000-10,000-fold and remain alive in the body. for several years. As a result, CART-19 demonstrated a 90% complete response rate in a clinical trial conducted in patients with end-stage acute lymphoblastic leukemia (V-ALL) treated with traditional chemotherapy, etc., and which was not effective, resulting in a rare the case of a global pharmaceutical company being licensed at an early stage of an investigator-initiated clinical trial. It became the first CAR-T cell therapy agent to receive US FDA approval in 2017, and a second CAR-T was also approved thereafter.

[00173] На поверхности иммунных клеток, например, Т-клеток, существуют рецепторы иммунных контрольных точек, такие как CTLA-4 (цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4) или PD-1 (белок программируемой клеточной смерти 1). Эти рецепторы изначально являются защитными механизмами для регуляции чрезмерной активации и гибели Т-клеток или запуска аутоиммунных реакций. Однако сообщается, что раковые клетки, особенно солидные злокачественные опухоли, используют это, чтобы избежать Т-клеточного иммунологического надзора. Например, если раковая клетка экспрессирует PD-L1 (лиганд-1 белка программируемой клеточной гибели) на поверхности, Т-клетка, которая экспрессирует PD-1, рецептор для него, распознает раковую клетку и активируется, но вскоре сигнал ингибирования активации от PD-1 истощается. Для предотвращения ингибирования активности Т-клеток сигналами от этих рецепторов иммунной контрольной точки были разработаны моноклональные антитела к CTLA4 или PD-1 и т. д., которые ингибируют передачу сигнала целевыми рецепторами иммунной контрольной точки. Терапевтические средства, которая улучшает общую иммунную функцию Т-клеток путем блокирования иммунных контрольных точек с использованием этих ингибиторов рецепторов иммунных контрольных точек, также демонстрирует эффективность против различных солидных злокачественных новообразований.[00173] On the surface of immune cells, such as T cells, there are immune checkpoint receptors such as CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) or PD-1 (programmed cell death protein 1). These receptors are initially defense mechanisms to regulate over-activation and death of T cells or trigger autoimmune reactions. However, cancer cells, especially solid malignant tumors, are reported to use this to avoid T-cell immunosurveillance. For example, if a cancer cell expresses PD-L1 (programmed cell death protein ligand-1) on the surface, a T cell that expresses PD-1, the receptor for it, recognizes the cancer cell and is activated, but soon the activation inhibition signal from PD-1 depleted. To prevent inhibition of T cell activity by signals from these immune checkpoint receptors, monoclonal antibodies to CTLA4 or PD-1, etc., have been developed that inhibit signaling by target immune checkpoint receptors. Therapeutics that improve overall T cell immune function by blocking immune checkpoints using these immune checkpoint receptor inhibitors also demonstrate efficacy against a variety of solid malignancies.

[00174] Поскольку клетки CAR-T в конечном счете также являются терапией, основанной на цитотоксичности активированных Т-клеток, наличие иммуносупрессивной среды вокруг CAR-T-клеток действует как серьезное препятствие для их терапевтического эффекта. Фактически, в отличие от своих терапевтических эффектов, проявляемых при В-клеточном лейкозе, CAR-T-клетки, приготовленные для нацеливания на солидные опухоли, редко демонстрировали обнадеживающие терапевтические эффекты. Предполагается, что это связано с тем, что солидные опухоли, в отличие от гемобластозов, создают иммуносупрессивное микроокружение опухоли для подавления активности и пролиферации CAR-T-клеток. Кроме того, даже в случае В-клеточных гемобластозов, и сообщалось, что в отличие от пациентов с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), из которых почти 90% отвечали на терапию с использованием CART-19, терапевтические эффекты были относительно меньшими у пациентов с лимфомой (от 20 до 50% ответа) или с хроническим лимфобластным лейкозом (ХЛЛ, около 20% ответа).[00174] Because CAR-T cells are ultimately also a therapy based on the cytotoxicity of activated T cells, the presence of an immunosuppressive environment around CAR-T cells acts as a major barrier to their therapeutic effect. In fact, in contrast to their therapeutic effects in B-cell leukemia, CAR-T cells prepared to target solid tumors have rarely shown encouraging therapeutic effects. It is hypothesized that this is due to the fact that solid tumors, unlike hemoblastoses, create an immunosuppressive tumor microenvironment to suppress the activity and proliferation of CAR-T cells. In addition, even in the case of B-cell hemoblastoses, and it has been reported that in contrast to patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL), of which almost 90% responded to therapy using CART-19, therapeutic effects were relatively smaller in patients with lymphoma. (from 20 to 50% response) or with chronic lymphoblastic leukemia (CLL, about 20% response).

[00175] Кроме того, сообщалось, что в микроокружении опухоли, образованном лимфомой, экспрессируются PD-L1 и другие иммуносупрессивные лиганды, поэтому функция Т-клеток внутри раковой ткани истощается. Кроме того, сообщалось, что Т-клетки, полученные от пациентов с ХЛЛ, уже были в значительной степени истощены, с высокой степенью экспрессии рецепторов иммунных контрольных точек, таких как PD-1, CD160 и CD244.[00175] In addition, it has been reported that in the tumor microenvironment formed by lymphoma, PD-L1 and other immunosuppressive ligands are expressed, so the function of T cells inside the cancer tissue is depleted. In addition, it has been reported that T cells derived from CLL patients were already largely depleted, with a high degree of expression of immune checkpoint receptors such as PD-1, CD160 and CD244.

[00176] Сообщалось о результатах доклинических испытаний, демонстрирующих, что одновременное использование анти-CTLA или анти-PD-1 ингибирующих антител с CAR-T-клетками для восстановления этой пониженной активности CAR-T-клеток улучшает противораковый эффект, и в настоящее время с использованием этих комбинаций проводятся клинические испытания. Однако проблема такой одновременной терапии антителами и CAR-T-клетками заключается в том, что антитела, распространяющиеся по всему телу, воздействуют не только на CAR-T-клетки, но и на все другие T-клетки, которые присутствуют в организме, что может привести к серьезным и системным нежелательным реакциям, таким как синдром высвобождения цитокинов, а также симптомы аутоиммунных заболеваний. Другой проблемой, на которую было указано, является повышенная стоимость лечения из-за одновременного использования дорогостоящей терапии антителами с клеточной терапией.[00176] Pre-clinical results have been reported demonstrating that the concomitant use of anti-CTLA or anti-PD-1 inhibitory antibodies with CAR-T cells to restore this reduced CAR-T cell activity improves the anti-cancer effect, and currently with clinical trials are being conducted using these combinations. However, the problem with this simultaneous therapy with antibodies and CAR-T cells is that antibodies that spread throughout the body affect not only CAR-T cells, but also all other T cells that are present in the body, which can lead to serious and systemic adverse reactions such as cytokine release syndrome, as well as symptoms of autoimmune diseases. Another problem that has been pointed out is the increased cost of treatment due to the simultaneous use of expensive antibody therapy with cell therapy.

[00177] Соответственно, в последнее время предпринимались попытки регулировать экспрессию генов в клетках, чтобы обеспечить подавление иммунных контрольных точек CAR-T-клеток. Международная патентная заявка WO2016/069282 раскрывает композиции и способы получения модифицированной Т-клетки с нуклеиновой кислотой, способной подавлять экспрессию эндогенного гена, выбранной из группы, состоящей из α-цепи TCR, β-цепи TCR, β-2-микроглобулина и FAS, дополнительно содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую модифицированный Т-клеточный рецептор (TCR), имеющий аффинность к поверхностному антигену на целевой клетке, или электропорированную нуклеиновую кислоту, кодирующую химерный антигенный рецептор (CAR). В публикации говорится, что генные ножницы, такие как CRISPR/Cas9, могут быть использованы для подавления экспрессии эндогенных генов, но способ получения CAR-T-клеток, раскрытый в патентной публикации, довольно сложен и имеет проблемы с низким выходом продукции и высокой стоимостью производства.[00177] Accordingly, recent attempts have been made to regulate gene expression in cells in order to suppress the immune checkpoints of CAR-T cells. International patent application WO2016/069282 discloses compositions and methods for producing a modified T cell with a nucleic acid capable of suppressing the expression of an endogenous gene selected from the group consisting of TCR α-chain, TCR β-chain, β-2-microglobulin and FAS, additionally containing a nucleic acid encoding a modified T cell receptor (TCR) having affinity for a surface antigen on a target cell, or an electroporated nucleic acid encoding a chimeric antigen receptor (CAR). The publication states that gene scissors such as CRISPR/Cas9 can be used to suppress the expression of endogenous genes, but the method for obtaining CAR-T cells disclosed in the patent publication is quite complicated and has problems with low production yield and high production cost. .

[00178] Между тем, международная патентная публикация WO2015/090230 раскрывает, что один тип короткой шпилечной РНК (кшРНК), ингибирующей молекулу, которая дополнительно подавляет функцию Т-клеток, может использоваться в клетках, экспрессирующих CAR. Поскольку стоимость клеточной терапии высока, пациент сталкивается с различными трудностями в случае неудачи. Однако один тип кшРНК не может эффективно ингибировать активность таких целевых молекул. В некоторых вариантах осуществления набор, содержащий полипептиды, может быть присоединен. В некоторых вариантах осуществления набор, содержащий полипептид, может быть в форме, в которой он присоединяется через переключатель, который димеризуется посредством стимуляции. В некоторых вариантах осуществления CAR может представлять собой слитый белок, который содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточной домен сигнальной трансдукции. В других вариантах осуществления слитый белок CAR может дополнительно содержать лидерную последовательность на N-конце, и лидерная последовательность может быть вырезана в процессе экспрессии CAR и закрепления в клеточной мембране. [00178] Meanwhile, International Patent Publication WO2015/090230 discloses that one type of short hairpin RNA (shRNA) inhibitory molecule that further inhibits T cell function can be used in cells expressing CAR. Since the cost of cell therapy is high, the patient faces various difficulties in case of failure. However, one type of shRNA cannot effectively inhibit the activity of such target molecules. In some embodiments, a kit containing polypeptides may be attached. In some embodiments, the implementation of the kit containing the polypeptide may be in the form in which it is attached through a switch that dimerizes through stimulation. In some embodiments, a CAR may be a fusion protein that contains an extracellular antigen recognition domain, a transmembrane domain, and an intracellular signal transduction domain. In other embodiments, the CAR fusion protein may further comprise a leader sequence at the N-terminus, and the leader sequence may be excised during CAR expression and anchoring in the cell membrane.

[00179] TCR, например, mTCR, описанный в данном документе, может содержать цепь, выбранную из цепей α, β, γ и δ. В некоторых вариантах осуществления цепи способны распознавать целевой антиген, который будет описан ниже, CD3 и дзета-цепь, и дополнительно костимулирующую молекулу, причем костимулирующая молекула может быть выбрана из ICOS, OX40, CD137 (4-1BB), CD27 или CD28.[00179] TCR, for example, mTCR described herein, may contain a chain selected from chains α, β, γ and δ. In some embodiments, the chains are capable of recognizing a target antigen, to be described below, CD3 and a zeta chain, and additionally a costimulatory molecule, where the costimulatory molecule can be selected from ICOS, OX40, CD137 (4-1BB), CD27, or CD28.

[00180] В некоторых вариантах осуществления ретровирусный перенос химерных конструктов на основе одноцепочечных антител (scFv) можно использовать для получения TCR, например, mTCR с определенной антигенспецифичностью. В других вариантах осуществления химерные конструкты scFv могут быть связаны с внутриклеточными сигнальными доменами FcR-гамма или CD3ζ для индукции эффекторной функции Т-клеток. В домене CD3ζ могут быть объединены сигнальные домены костимулирующих молекул, причем взаимодействие с антителом может запускать эффекторную функцию Т-клеток, а также доставлять костимулирующие сигналы. В дополнительных вариантах осуществления костимулирующие молекулы могут быть выбраны из CD28, 4-1BB и OX40.[00180] In some embodiments, retroviral transfer of chimeric single chain antibody (scFv) constructs can be used to generate a TCR, eg, an mTCR with defined antigen specificity. In other embodiments, the chimeric scFv constructs can be linked to FcR-gamma or CD3ζ intracellular signaling domains to induce T cell effector function. In the CD3ζ domain, signaling domains of costimulatory molecules can be combined, and interaction with an antibody can trigger the effector function of T cells, as well as deliver costimulatory signals. In additional embodiments, the co-stimulatory molecules may be selected from CD28, 4-1BB, and OX40.

[00181] В некоторых вариантах осуществления векторы «два в одном» могут содержать домен CD3ζ, в котором цепи TCR, например, mTCR, могут образовывать комплекс через нековалентные связи с CD3 и дзета (ζ)-цепью. Когда антиген распознается посредством сайта распознавания антигена цепей, CD3 и дзета-цепи посылают сигналы в цитоплазму иммунных клеток, в которых экспрессируется такой комплекс TCR, вызывая функциональную активацию. [00181] In some embodiments, two-in-one vectors may contain a CD3ζ domain in which TCR chains, such as mTCRs, can be complexed through non-covalent bonds with CD3 and the zeta (ζ) chain. When an antigen is recognized through the antigen recognition site of the chains, CD3 and zeta chains send signals to the cytoplasm of immune cells that express such a TCR complex, causing functional activation.

[00182] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточной домен сигнальной трансдукции может дополнительно содержать один или более функциональных доменов сигнальной трансдукции, полученных из костимулирующих молекул. В некоторых вариантах осуществления стимулирующая молекула может представлять собой дзета-цепь TCR, описанную выше.[00182] In some embodiments, the intracellular signal transduction domain may further comprise one or more functional signal transduction domains derived from costimulatory molecules. In some embodiments, the stimulatory molecule may be the TCR zeta chain described above.

[00183] CAR и TCR, например, mTCR представляют собой рецепторы клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления мишень для CAR или TCR, например, mTCR, может быть охарактеризована тем, что она представляет собой раковый антиген, экспрессия которого специфически увеличивается при злокачественном новообразовании. В некоторых вариантах осуществления мишень для CAR или TCR, например, mTCR, может быть охарактеризована тем, что она представляет собой раковый антиген, который присутствует в мутированных формах при злокачественном новообразовании. [00183] CAR and TCR, for example, mTCR are cell surface receptors. In some embodiments, a CAR or TCR target, such as mTCR, can be characterized in that it is a cancer antigen whose expression is specifically upregulated in cancer. In some embodiments, a CAR or TCR target, such as mTCR, can be characterized in that it is a cancer antigen that is present in mutated forms in cancer.

[00184] В некоторых вариантах осуществления мишенью для CAR или TCR, например, mTCR, может быть опухолевый антиген человека, экспрессия которого повышена при злокачественном новообразовании, подлежащем лечению. Например, мишень может быть выбрана из 5T4 (трофобластический гликопротеин), 707-AP, 9D7, AFP (α-фетопротеин), AlbZIP (андроген-индуцируемый bZIP), HPG1 (специфический к простате человека ген-1), α5β1-интегрина, α5β6-интегрина, α --метилацил-коэнзим А рацемазы, ART-4 (АДФ рибозилтрансферазы-4), B7H4 (ингибитор активации Т-клеток 1, содержащий вариабельный иммуноглобулиноподобный домен), BAGE-1 (В меланомный антиген-1), BCL-2 (В-клеточный ХЛЛ/лимфома-2), BING-4 ( WD-повтор домена 46), CA 15-3/CA 27-29 (муцин 1), CA 19-9 (раковый антиген 19-9), CA 72-4 (раковый антиген 72-4), CA125 (раковый антиген 125), кальретикулина, CAMEL (ЦТЛ-распознаваемый антиген на меланоме), CASP-8 (каспаза 8), катепсина B, катепсина L, CD19 (кластер дифференцировки 19), CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (раковый эмбриональный антиген SG8), CLCA2 (канал-переносчик-2 для ионов хлора), CML28 (опухолевый антиген хронического миелолейкоза 28), коактозин-подобного белка, коллагена XXIII, COX-2 (циклооксигеназа-2), CT-9/BRD6 (раково-тестикулярный антиген 9), Cten (С-концевой тензиноподобный белок), циклина B1, циклина D1, cyp-B, CYPB1 (цитохром p450 семейство 1, подсемейство b, тип 1), DAM-10/MAGE-B1 (ассоциированный с меланомой антиген B1), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (рецептор эпидермального фактора роста), EMMPRIN (басигин), EpCam, EphA2 (эфрин-рецептор A2), EphA3, ErbB3 (рецептор тирозинкиназы 3 Erb-B2), EZH2 (усилитель субъединицы zeste гомолога 2 policomb-репрессивного комплекса 2), FGF-5 (фактор роста фибробластов 5), FN (фибронектин), Fra-1 (Fos-связанный антиген-1), G250/CAIX (карбоангидраза 9), GAGE-1 (G антиген-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP (ген, дифференциально экспрессируемый в простате), GnT-V (глюконаткиназа), gp100 (специфический для линии меланоцитов антиген GP100), GPC3 (глипикан-3), HAGE (спиральный антиген), HAST-2 (член 1 семейство сульфотрансферазы 1A), гепсина, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 рецептор тирозинкиназы 2), HERV-K-MEL, HNE (медуллазин), гомеобокса NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPVE7, HST-2 (сиртуин-2), hTERT, iCE (каспаза 1), IGF-1R (рецептор инсулиноподобного фактора роста-1), ИЛ-13Ra2 (α-2-субъединица рецептора интерлейкина-13), ИЛ-2R (рецептор интерлейкина-2), ИЛ-5 (интерлейкин-5), незрелого рецептора ламинина, калликреина-2, калликреина-4, Ki67, KIAA0205 (лизофосфатидилглицерол-ацилтрансфераза 1), KK-LC-1 (антиген-1 рака легкого кита-кюсю (kita-kyushu)), KM-HN-1, LAGE-1 (L-антиген, член 1 семейства белков LAGE), ливина, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGEA2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGEB17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2 (антиген меланомы семейства L2), маммаглобина A, MART-1/Melan-A (антиген меланомы, распознаваемый Т-клетками-1), MART-2, белка матрикса 22, MC1R (рецептор меланокортина-1 ), М-КСФ (макрофагальный колониестимулирующий фактор), мезотелина, MG50/PXDN (пероксидазина), MMP 11 (матриксная металлопротеиназа 11), MN/CA IX-антигена (карбоангидраза 9), MRP-3 (ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью белок-3), MUC1 (муцин 1), MUC2, NA88-A (псевдоген 1 VENT-подобного гомеобокса 2), N-ацетилглюкозаминилтрансферазы-V, Neo-PAP (нео-поли(А)-полимераза), NGEP (новый ген, экспрессируемый в простате), NMP22 (белок ядерного матрикса 22), NPM/ALK (нуклеофосмин), NSE (нейронспецифическая энолаза), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (QTL-1 остеоартрита), OFA-iLRP (раково-эмбриональный антиген-незрелый рецептор ламинина), OGT (O-GlcNAc-трансфераза), OS-9 (лектин эндоплазматического ретикулюма), остеокальцина, остеопонтина, p15 (ингибитор CDK 2B), p53, PAGE-4 (семейство P-антигена, член-4), PAI-1 (ингибитор активатора плазминогена 1), PAI-2, PAP (простатическая кислая фосфатаза), PART-1 (транскрипт-1, регулируемый андрогеном простаты), PATE (белок-1, экспрессируемый простатой и яичками), PDEF (полученный из простаты фактор Ets), Pim-1-киназы (сайт-1 интеграции провирусов), Pin1 (пептидил-пролил-цис-транс-изомераза-1), POTE (экспрессируемый в простате, яичнике, яичке и плаценте), PRAME (преимущественно экспрессируемый антиген при меланоме), простеина, протеиназы-3, PSA (простат-специфический антиген), PSCA (антиген стволовых клеток простаты), PSGR (простат-специфический рецептор, связанный с G-белком), PSM, PSMA (простат-специфический мембранный антиген), RAGE-1 (ассоциированный с опухолью антиген почечных карцином), RHAMM/CD168, RU1 (почечный убиквитарный белок-1), RU2, SAGE (антиген саркомы), SART-1 (антиген-1 плоскоклеточной карциномы, распознаваемый Т-клетками), SART-2, SART-3, Sp17 (белок спермы 17), SSX-1 (член-1 семейства SSX), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (металлоредуктаза STEAP2), STEAP, сурвивина, сурвивина-213, TA-90 (опухоль-ассоциированный антиген-90), TAG-72 (опухоль-ассоциированный гликопротеин-72), TARP(белок TCRγ с альтернативной рамкой считывания), TGFb (трансформирующий фактор роста β), TGFbR11 (рецептор-11 трансформирующего фактора роста β), TGM-4 (трансглютаминаза 4), TRAG-3(ген-3 устойчивости к таксолу), TRG (γ-локус рецептора Т-клеток), TRP-1 (транзиторный рецепторный потенциал 1), TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, тирозиназы, UPA (урокиназный активатор плазминогена), VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия A), VEGFR-2/FLK-1, и WT1 (белок опухоли Вильмса 1) или может представлять собой мутированную форму опухолевого антигена человека, обнаруженного в подлежащем лечению раке, выбранную из α-актина 4/m, ARTC1/m, bcr/abl, бета-катенина/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, миозина класса 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII и TPI/m. Например, целевой антиген может быть выбран между CD19 или CD22.[00184] In some embodiments, the target for a CAR or TCR, such as mTCR, may be a human tumor antigen that is overexpressed in the cancer being treated. For example, the target can be selected from 5T4 (trophoblastic glycoprotein), 707-AP, 9D7, AFP (α-fetoprotein), AlbZIP (androgen-inducible bZIP), HPG1 (human prostate-specific gene-1), α5β1-integrin, α5β6 -integrin, α-methylacyl-coenzyme A of racemase, ART-4 (ADP ribosyltransferase-4), B7H4 (inhibitor of T-cell activation 1 containing a variable immunoglobulin-like domain), BAGE-1 (B melanoma antigen-1), BCL- 2 (B-cell CLL/lymphoma-2), BING-4 (WD repeat domain 46), CA 15-3/CA 27-29 (mucin 1), CA 19-9 (cancer antigen 19-9), CA 72-4 (cancer antigen 72-4), CA125 (cancer antigen 125), calreticulin, CAMEL (CTL-recognized antigen on melanoma), CASP-8 (caspase 8), cathepsin B, cathepsin L, CD19 (differentiation cluster 19) , CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (SG8 cancer embryonic antigen), CLCA2 (chlorine ion transporter channel-2), CML28 (chronic myeloid leukemia tumor antigen 28), coactosin-like protein, collagen XXIII, COX-2 (cyclooxygenase-2), CT-9/BRD6 (cancer-testicular antigen 9), Cten (C-terminal tensin-like protein), cyclin B1, cyclin D1, cyp-B, CYPB1 (cytochrome p450 family 1, subfamily b, type 1), DAM-10/MAGE-B1 (melanoma-associated antigen B1), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (epidermal growth factor receptor), EMMPRIN (basigin) , EpCam, EphA2 (ephrin receptor A2), EphA3, ErbB3 (Erb-B2 tyrosine kinase 3 receptor), EZH2 (policomb repressive complex 2 homolog 2 zeste subunit enhancer), FGF-5 (fibroblast growth factor 5), FN (fibronectin ), Fra-1 (Fos-bound antigen-1), G250/CAIX (carbonic anhydrase 9), GAGE-1 (G antigen-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE- 6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP (gene differentially expressed in the prostate), GnT-V (gluconate kinase), gp100 (melanocyte lineage specific antigen GP100), GPC3 (glypican-3), HAGE (helical antigen), HAST-2 (sulfotransferase 1A family member 1A), hepsin, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2), HERV-K-MEL, HNE (medullasin), homeobox NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP- 1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPVE7, HST-2 (sirtuin-2), hTERT, iCE (caspase 1), IGF-1R (insulin-like growth factor receptor-1), IL-13Ra2 (α-2 -interleukin-13 receptor subunit), IL-2R (interleukin-2 receptor), IL-5 (interleukin-5), immature laminin receptor, kallikrein-2, kallikrein-4, Ki67, KIAA0205 (lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1), KK -LC-1 (kita-kyushu lung cancer antigen-1), KM-HN-1, LAGE-1 (L-antigen, member 1 of the LAGE protein family), livin, MAGE-A1, MAGE-A10 , MAGE-A12, MAGEA2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGEB17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE -B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2 (antigen melanoma family L2), mammaglobin A, MART-1/Melan-A (melanoma antigen recognized by T-cells-1), MART-2, matrix protein 22, MC1R (melanocortin-1 receptor), M-CSF (macrophage colony-stimulating factor ), mesothelin, MG50/PXDN (peroxidazine), MMP 11 (matrix metalloproteinase 11), MN/CA IX antigen (carbonic anhydrase 9), MRP-3 (multidrug resistance-associated protein-3), MUC1 (mucin 1), MUC2, NA88-A (VENT-like homeobox 2 pseudogene 1), N-acetylglucosaminyltransferase-V, Neo-PAP (neo-poly(A) polymerase), NGEP (new prostate-expressed gene), NMP22 (nuclear matrix protein 22), NPM/ALK (nucleophosmin), NSE (neuron-specific enolase), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (Osteoarthritis QTL-1), OFA-iLRP (cancer embryonic antigen-immature laminin receptor), OGT (O-GlcNAc-transferase), OS-9 (endoplasmic reticulum lectin), osteocalcin, osteopontin, p15 (CDK 2B inhibitor), p53, PAGE-4 (P-antigen family member-4), PAI-1 (inhibitor plasminogen activator 1), PAI-2, PAP (prostatic acid phosphatase), PART-1 (prostate androgen regulated transcript-1), PATE (prostate and testis expressed protein-1), PDEF (prostate-derived factor Ets), Pim-1 kinases (provirus integration site-1), Pin1 (peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase-1), POTE (expressed in the prostate, ovary, testis and placenta), PRAME (predominantly expressed antigen in melanoma), proteinase, proteinase-3, PSA (prostate-specific antigen), PSCA (prostate stem cell antigen), PSGR (prostate-specific G protein-coupled receptor), PSM, PSMA (prostate-specific membrane antigen), RAGE-1 (tumor-associated antigen of renal carcinomas), RHAMM/CD168, RU1 (renal ubiquitary protein-1), RU2, SAGE (sarcoma antigen), SART-1 (squamous cell carcinoma antigen-1 recognized by T cells), SART-2, SART-3, Sp17 (sperm protein 17), SSX-1 (SSX family member-1), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (STEAP2 metal reductase), STEAP, survivin, survivin- 213, TA-90 (tumor-associated antigen-90), TAG-72 (tumor-associated glycoprotein-72), TARP (alternate reading frame protein TCRγ), TGFb (transforming growth factor β), TGFbR11 (transforming growth factor receptor-11). growth factor β), TGM-4 (transglutaminase 4), TRAG-3 (taxol resistance gene-3), TRG (γ-locus of T-cell receptor), TRP-1 (transient receptor potential 1), TRP-2/ 6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, tyrosinases, UPA (urokinase plasminogen activator), VEGF (vascular endothelial growth factor A), VEGFR-2/FLK-1, and WT1 (Wilms tumor protein 1) or may be a mutated form of a human tumor antigen found in the cancer being treated, selected from α-actin 4/m, ARTC1/m, bcr/abl, beta-catenin/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP -8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA -A*0201-R170I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m , MUM-2/m, MUM-3/m, myosin class 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml /RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII and TPI/m. For example, the target antigen can be selected between CD19 or CD22.

3.3 Компоненты векторов «два в одном» 3.3 Components of two-in-one vectors

[00185] Как указано в данном документе, вектор «два в одном» содержит последовательность оснований, кодирующую один или более типов коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые ингибируют экспрессию одного или более генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток, и последовательность оснований, кодирующую химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), например, моноклональный Т-клеточный рецептор (mTCR). [00185] As described herein, a two-in-one vector contains a base sequence encoding one or more types of short hairpin RNA (shRNA) that inhibit the expression of one or more genes that impair immune cell function, and a base sequence encoding a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR) such as the monoclonal T cell receptor (mTCR).

[00186] В некоторых вариантах осуществления векторы «два в одном» могут содержать последовательности, кодирующие факторы, которые способствуют вставке последовательностей в геном клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления последовательности расположены на одном или обоих концах вектора гена. В некоторых вариантах последовательности представляют собой ДКП (длинные концевые повторы). [00186] In some embodiments, two-in-one vectors may contain sequences encoding factors that facilitate the insertion of sequences into the genome of a host cell. In some embodiments, the sequences are located at one or both ends of the gene vector. In some embodiments, the sequences are LTRs (long terminal repeats).

[00187] В некоторых вариантах осуществления векторы «два в одном» могут содержать домен, кодирующий белки, которые используются для очистки клеток, в которых произошла вставка, описанная выше. В некоторых вариантах осуществления домен представляет собой домен δLNGFR, причем δLNGFR представляет собой LNGFR (низкоаффинный рецептор фактора роста нервов) без цитоплазматического домена, используемого для очистки клеток, где произошла вставка, описанная выше. [00187] In some embodiments, two-in-one vectors may contain a domain encoding proteins that are used to purify cells in which the insertion described above has occurred. In some embodiments, the domain is a δLNGFR domain, where δLNGFR is LNGFR (low affinity nerve growth factor receptor) without the cytoplasmic domain used to clear cells where the insertion described above has occurred.

[00188] В некоторых вариантах осуществления векторы «два в одном» могут содержать промоторы, которые индуцируют экспрессию как δLNGFR, так и CAR, характеризуемые устойчивой экспрессией, например, промотор EF1α, индуцирующий экспрессию как δLNGFR, так и CD19 CAR, как показано на Фиг. 22А. В других вариантах осуществления, δLNGFR и CD19 CAR сначала транскрибируются в форме, в которой они находятся в одной мРНК. В таких вариантах осуществления, где два или более цистронов находятся в одной и той же мРНК, между ними может быть вставлен IRES (внутренний участок посадки рибосомы), чтобы вызвать экспрессию обоих цистронов. Однако IRES является чрезмерно длинным, и было сообщено, что эффективность экспрессии расположенного по ходу транскрипции цистрона снижается. В некоторых вариантах осуществления для преодоления таких недостатков могут использоваться компоненты, отличные от IRES, например, P2A (пептид 2a), в котором во время трансляции рибосома проходит без образования пептидной связи на C-конце P2A, что позволяет экспрессироваться расположенному по ходу транскрипции гену позже.[00188] In some embodiments, two-in-one vectors may contain promoters that induce expression of both δLNGFR and CARs characterized by stable expression, such as the EF1α promoter that induces expression of both δLNGFR and CD19 CAR, as shown in FIG. . 22A. In other embodiments, the δLNGFR and CD19 CAR are first transcribed in the form they are in the same mRNA. In such embodiments, where two or more cistrons are in the same mRNA, an IRES (internal ribosome entry site) can be inserted between them to cause expression of both cistrons. However, the IRES is excessively long and it has been reported that the expression efficiency of the downstream cistron is reduced. In some embodiments, non-IRES components can be used to overcome these shortcomings, such as P2A (peptide 2a), in which the ribosome passes through during translation without forming a peptide bond at the C-terminus of P2A, allowing the downstream gene to be expressed later. .

[00189] Некоторые иллюстративные векторы «два в одном» представляют собой векторы «два в одном», приведенные на Фиг. 1, 6, 14 и 22А, причем вектор содержит любую одну из последовательностей оснований SEQ ID 220 или 221. Иллюстративные векторы, которые содержат последовательности оснований SEQ ID 220 и 221, могут иметь структуру, приведенную на Фиг. 1А и 1В. Некоторые иллюстративные плазмиды перечислены в таблице 1.[00189] Some exemplary two-in-one vectors are the two-in-one vectors shown in FIG. 1, 6, 14, and 22A, with the vector containing any one of the base sequences of SEQ ID 220 or 221. Exemplary vectors that contain the base sequences of SEQ ID 220 and 221 may have the structure shown in FIG. 1A and 1B. Some illustrative plasmids are listed in Table 1.

Figure 00000001
Figure 00000001

[00190] В некоторых вариантах осуществления последовательности оснований, включенные в вектор, описанный выше, и последовательности нуклеиновых кислот соответствующих кшРНК могут, в дополнение к последовательностям, описанным в данном документе, содержать последовательности нуклеиновых кислот, проявляющие по меньшей мере 50%, конкретно по меньшей мере 70%, более конкретно по меньшей мере 80%, еще более конкретно по меньшей мере 90%, и наиболее конкретно по меньшей мере 95% гомологии последовательностей с этими последовательностями. Сообщалось, что это связано с тем, что в случае киРНК (короткой интерферирующей РНК) и кшРНК, которые процессируются внутри клетки с образованием, в частности, киРНК, что незначительная мутация, особенно мутация в 5'-концевой области, является допустимой, вызывая нормальный нокдаун целевого гена, и что мутации киРНК и кшРНК, которые имеют структуру, сходную со структурой миРНК, играющей роль в сайленсинге генов, более эффективно индуцирует нокдаун целевого гена. Кроме того, при использовании векторов специалистам в данной области техники очевидны вариации в векторе, то есть добавление, модификация или делеция последовательностей оснований, которые могут происходить в процессе клонирования для введения определенной последовательности в вектор, или изменения или введения компонентов для повышения простоты использования вектора в той степени, в которой экспрессируется предполагаемый ген. [00190] In some embodiments, the base sequences included in the vector described above and the corresponding shRNA nucleic acid sequences may, in addition to the sequences described herein, contain nucleic acid sequences exhibiting at least 50%, specifically at least at least 70%, more specifically at least 80%, even more specifically at least 90%, and most specifically at least 95% sequence homology with these sequences. It has been reported that this is because, in the case of siRNA (short interfering RNA) and shRNA, which are processed intracellularly to form, in particular, siRNA, that a minor mutation, especially a mutation in the 5'-terminal region, is tolerable, causing normal knockdown of the target gene, and that mutations in siRNAs and shRNAs, which have a structure similar to that of siRNAs that play a role in gene silencing, more effectively induce knockdown of the target gene. In addition, when using vectors, variations in the vector will be apparent to those skilled in the art, i.e. addition, modification, or deletion of base sequences that may occur during cloning to introduce a specific sequence into the vector, or modification or introduction of components to improve the ease of use of the vector in the extent to which the putative gene is expressed.

4. Получение и оценка CAR-T-клеток, нацеленных на одну или более иммунных контрольных точек 4. Generation and Evaluation of CAR-T Cells Targeting One or More Immune Checkpoints

[00191] Как указано в данном документе, вектор «два в одном» содержит последовательность оснований, кодирующую один или более типов коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые ингибируют экспрессию генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток, и последовательность оснований, кодирующую любой один из химерного антигенного рецептора (CAR) и Т-клеточного рецептора (TCR), например, моноклонального Т-клеточного рецептора (mTCR). Вектор может быть использован для получения иммунных клеток, имеющих ингибированную экспрессию генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток. В некоторых вариантах осуществления вектор выбран из группы, состоящей из ДНК, РНК, плазмиды, лентивирусного вектора, аденовирусного вектора и ретровирусного вектора.[00191] As described herein, a two-in-one vector contains a base sequence encoding one or more types of short hairpin RNA (shRNA) that inhibit the expression of genes that impair immune cell function, and a base sequence encoding any one of a chimeric antigen receptor (CAR) and a T cell receptor (TCR), such as the monoclonal T cell receptor (mTCR). The vector can be used to generate immune cells having inhibited expression of genes that impair immune cell function. In some embodiments, the vector is selected from the group consisting of DNA, RNA, plasmid, lentiviral vector, adenoviral vector, and retroviral vector.

[00192] В одном аспекте описанная в данном документе иммунная клетка отличается тем, что она содержит указанный выше вектор и экспрессирует CAR или TCR, например, mTCR, и при этом экспрессия целевых генов одного или более типов кшРНК снижается. В некоторых вариантах осуществления экспрессия целевых генов одного или более типов кшРНК снижается до около 90% или менее от экспрессии контрольной группы, например, экспрессия целевых генов снижается до около 80% или менее, около 70% или менее, около 60% или менее, около 50% или менее, около 40% или менее, около 30% или менее, около 20% или менее, и около 10% или менее от экспрессии контрольной группы. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка выбрана из Т-клеток и NK-клеток человеческого происхождения.[00192] In one aspect, the immune cell described herein is characterized in that it contains the above vector and expresses a CAR or TCR, for example, mTCR, and the expression of target genes of one or more shRNA types is reduced. In some embodiments, target gene expression of one or more shRNA types is reduced to about 90% or less of a control group, e.g., target gene expression is reduced to about 80% or less, about 70% or less, about 60% or less, about 50% or less, about 40% or less, about 30% or less, about 20% or less, and about 10% or less of the expression of the control group. In some embodiments, the immune cell is selected from T cells and NK cells of human origin.

[00193] В другом аспекте в данном документе предложены способы. В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения иммунной клетки, включающий введение в иммунную клетку одновременно или последовательно в любом порядке: (1) гена, кодирующего генетически сконструированный антигенный рецептор, который специфически связывается с целевым антигеном; и (2) агента генетического разрушения, снижающего или способного уменьшать экспрессию в иммунной клетке гена, который ослабляет функцию иммунной клетки, тем самым получая иммунную клетку, в которой экспрессируется генетически сконструированный антигенный рецептор, и снижается экспрессия гена, который ослабляет функцию иммунной клетки. [00193] In another aspect, methods are provided herein. In some embodiments, a method for producing an immune cell is provided, comprising introducing into the immune cell simultaneously or sequentially in any order: (1) a gene encoding a genetically engineered antigen receptor that specifically binds to a target antigen; and (2) a genetic disruption agent that reduces or is capable of reducing expression in an immune cell of a gene that impairs immune cell function, thereby providing an immune cell that expresses the genetically engineered antigen receptor and reduces expression of a gene that impairs immune cell function.

[00194] В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR). В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой CAR. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточной домен сигнальной трансдукции. [00194] In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor is a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR). In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor is a CAR. In some embodiments, the CAR comprises an extracellular antigen recognition domain, a transmembrane domain, and an intracellular signal transduction domain.

[00195] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный антигенраспознающий домен CAR специфически связывается с целевым антигеном.[00195] In some embodiments, the CAR extracellular antigen recognition domain specifically binds to a target antigen.

[00196] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен сигнальной трансдукции CAR содержит внутриклеточный домен дзета-цепи CD3 (CD3ζ). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточной домен сигнальной трансдукции CAR дополнительно содержит костимулирующую молекулу.[00196] In some embodiments, the intracellular signal transduction domain of CAR comprises an intracellular domain of the CD3 zeta chain (CD3ζ). In some embodiments, the intracellular signal transduction domain of the CAR further comprises a co-stimulatory molecule.

[00197] В некоторых вариантах осуществления костимулирующая молекула выбрана из группы, состоящей из ICOS, OX40, CD137 (4-1BB), CD27 и CD28. В некоторых вариантах осуществления костимулирующая молекула представляет собой CD137 (4-1BB). В некоторых вариантах осуществления костимулирующая молекула представляет собой CD28.[00197] In some embodiments, the costimulatory molecule is selected from the group consisting of ICOS, OX40, CD137 (4-1BB), CD27, and CD28. In some embodiments, the costimulatory molecule is CD137 (4-1BB). In some embodiments, the costimulatory molecule is CD28.

[00198] В некоторых вариантах осуществления целевой антиген экспрессируется на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в микроокружении опухоли. В некоторых вариантах осуществления целевой антиген представляет собой или раковый антиген, экспрессия которого повышена, или мутированную форму ракового антигена в раковой клетке, раковой ткани и/или микроокружении опухоли.[00198] In some embodiments, the target antigen is expressed on the surface of the cancer cell, cancer tissue, and/or in the tumor microenvironment. In some embodiments, the target antigen is either an overexpressed cancer antigen or a mutated form of the cancer antigen in the cancer cell, cancer tissue, and/or tumor microenvironment.

[00199] В некоторых вариантах осуществления раковый антиген, экспрессия которого повышена в раковой клетке, раковой ткани и/или микроокружении опухоли, выбран из группы, состоящей из: 5T4 (трофобластический гликопротеин), 707-AP, 9D7, AFP (α-фетопротеин), AlbZIP (андроген-индуцируемый bZIP), HPG1 (специфический к простате человека ген-1), α5β1-интегрина, α5β6-интегрина, α --метилацил-коэнзим А рацемазы, ART-4 (АДФ рибозилтрансферазы-4), B7H4 (ингибитор активации Т-клеток 1, содержащий вариабельный иммуноглобулиноподобный домен), BAGE-1 (В меланомный антиген-1), BCL-2 (В-клеточный ХЛЛ/лимфома-2), BING-4 ( WD-повтор домена 46), CA 15-3/CA 27-29 (муцин 1), CA 19-9 (раковый антиген 19-9), CA 72-4 (раковый антиген 72-4), CA125 (раковый антиген 125), кальретикулина, CAMEL (ЦТЛ-распознаваемый антиген на меланоме), CASP-8 (каспаза 8), катепсина B, катепсина L, CD19 (кластер дифференцировки 19), CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (раковый эмбриональный антиген SG8), CLCA2 (канал-переносчик-2 для ионов хлора), CML28 (опухолевый антиген хронического миелолейкоза 28), коактозин-подобного белка, коллагена XXIII, COX-2 (циклооксигеназа-2), CT-9/BRD6 (раково-тестикулярный антиген 9), Cten (С-концевой тензиноподобный белок), циклина B1, циклина D1, cyp-B, CYPB1 (цитохром p450 семейство 1, подсемейство b, тип 1), DAM-10/MAGE-B1 (ассоциированный с меланомой антиген B1), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (рецептор эпидермального фактора роста), EMMPRIN (басигин), EpCam, EphA2 (эфрин-рецептор A2), EphA3, ErbB3 (рецептор тирозинкиназы 3 Erb-B2), EZH2 (усилитель субъединицы zeste гомолога 2 policomb-репрессивного комплекса 2), FGF-5 (фактор роста фибробластов 5), FN (фибронектин), Fra-1 (Fos-связанный антиген-1), G250/CAIX (карбоангидраза 9), GAGE-1 (G антиген-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP (ген, дифференциально экспрессируемый в простате), GnT-V (глюконаткиназа), gp100 (специфический для линии меланоцитов антиген GP100), GPC3 (глипикан-3), HAGE (спиральный антиген), HAST-2 (член 1 семейство сульфотрансферазы 1A), гепсина, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 рецептор тирозинкиназы 2), HERV-K-MEL, HNE (медуллазин), гомеобокса NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPVE7, HST-2 (сиртуин-2), hTERT, iCE (каспаза 1), IGF-1R (рецептор инсулиноподобного фактора роста-1), ИЛ-13Ra2 (α-2-субъединица рецептора интерлейкина-13), ИЛ-2R (рецептор интерлейкина-2), ИЛ-5 (интерлейкин-5), незрелого рецептора ламинина, калликреина-2, калликреина-4, Ki67, KIAA0205 (лизофосфатидилглицерол-ацилтрансфераза 1), KK-LC-1 (антиген-1 рака легкого кита-кюсю (kita-kyushu)), KM-HN-1, LAGE-1 (L-антиген, член 1 семейства белков LAGE), ливина, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGEA2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGEB17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2 (антиген меланомы семейства L2), маммаглобина A, MART-1/Melan-A (антиген меланомы, распознаваемый Т-клетками-1), MART-2, белка матрикса 22, MC1R (рецептор меланокортина-1 ), М-КСФ (макрофагальный колониестимулирующий фактор), мезотелина, MG50/PXDN (пероксидазина), MMP 11 (матриксная металлопротеиназа 11), MN/CA IX-антигена (карбоангидраза 9), MRP-3 (ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью белок-3), MUC1 (муцин 1), MUC2, NA88-A (псевдоген 1 VENT-подобного гомеобокса 2), N-ацетилглюкозаминилтрансферазы-V, Neo-PAP (нео-поли(А)-полимераза), NGEP (новый ген, экспрессируемый в простате), NMP22 (белок ядерного матрикса 22), NPM/ALK (нуклеофосмин), NSE (нейронспецифическая энолаза), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (QTL-1 остеоартрита), OFA-iLRP (раково-эмбриональный антиген-незрелый рецептор ламинина), OGT (O-GlcNAc-трансфераза), OS-9 (лектин эндоплазматического ретикулюма), остеокальцина, остеопонтина, p15 (ингибитор CDK 2B), p53, PAGE-4 (семейство P-антигена, член-4), PAI-1 (ингибитор активатора плазминогена 1), PAI-2, PAP (простатическая кислая фосфатаза), PART-1 (транскрипт-1, регулируемый андрогеном простаты), PATE (белок-1, экспрессируемый простатой и яичками), PDEF (полученный из простаты фактор Ets), Pim-1-киназы (сайт-1 интеграции провирусов), Pin1 (пептидил-пролил-цис-транс-изомераза-1), POTE (экспрессируемый в простате, яичнике, яичке и плаценте), PRAME (преимущественно экспрессируемый антиген при меланоме), простеина, протеиназы-3, PSA (простат-специфический антиген), PSCA (антиген стволовых клеток простаты), PSGR (простат-специфический рецептор, связанный с G-белком), PSM, PSMA (простат-специфический мембранный антиген), RAGE-1 (ассоциированный с опухолью антиген почечных карцином), RHAMM/CD168, RU1 (почечный убиквитарный белок-1), RU2, SAGE (антиген саркомы), SART-1 (антиген-1 плоскоклеточной карциномы, распознаваемый Т-клетками), SART-2, SART-3, Sp17 (белок спермы 17), SSX-1 (член-1 семейства SSX), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (металлоредуктаза STEAP2), STEAP, сурвивина, сурвивина-213, TA-90 (опухоль-ассоциированный антиген-90), TAG-72 (опухоль-ассоциированный гликопротеин-72), TARP(белок TCRγ с альтернативной рамкой считывания), TGFb (трансформирующий фактор роста β), TGFbR11 (рецептор-11 трансформирующего фактора роста β), TGM-4 (трансглютаминаза 4), TRAG-3(ген-3 устойчивости к таксолу), TRG (γ-локус рецептора Т-клеток), TRP-1 (транзиторный рецепторный потенциал 1), TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, тирозиназы, UPA (урокиназный активатор плазминогена), VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия A), VEGFR-2/FLK-1, и WT1 (белок опухоли Вильмса 1). [00199] In some embodiments, the cancer antigen, which is overexpressed in the cancer cell, cancer tissue, and/or tumor microenvironment, is selected from the group consisting of: 5T4 (trophoblastic glycoprotein), 707-AP, 9D7, AFP (α-fetoprotein) , AlbZIP (androgen-inducible bZIP), HPG1 (human prostate-specific gene-1), α5β1-integrin, α5β6-integrin, α-methylacyl-coenzyme A racemase, ART-4 (ADP ribosyltransferase-4), B7H4 (inhibitor T cell activation 1 containing variable immunoglobulin-like domain), BAGE-1 (B melanoma antigen-1), BCL-2 (B-cell CLL/lymphoma-2), BING-4 (WD repeat domain 46), CA 15 -3/CA 27-29 (mucin 1), CA 19-9 (cancer antigen 19-9), CA 72-4 (cancer antigen 72-4), CA125 (cancer antigen 125), calreticulin, CAMEL (CTL-recognized antigen on melanoma), CASP-8 (caspase 8), cathepsin B, cathepsin L, CD19 (differentiation cluster 19), CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (cancer embryonic SG8 antigen), CLCA2 (chlorine ion transport channel-2), CML28 (chronic myeloid leukemia tumor antigen 28), coactosin-like protein, collagen XXIII, COX-2 (cyclooxygenase-2), CT-9/BRD6 (cancer- testicular antigen 9), Cten (C-terminal tensin-like protein), cyclin B1, cyclin D1, cyp-B, CYPB1 (cytochrome p450 family 1, subfamily b, type 1), DAM-10/MAGE-B1 (melanoma-associated antigen B1), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (epidermal growth factor receptor), EMMPRIN (basigin), EpCam, EphA2 (ephrin receptor A2), EphA3, ErbB3 (Erb-B2 tyrosine kinase 3 receptor), EZH2 ( policomb repressive complex 2 homologue zeste subunit enhancer 2), FGF-5 (fibroblast growth factor 5), FN (fibronectin), Fra-1 (Fos-related antigen-1), G250/CAIX (carbonic anhydrase 9), GAGE-1 (G antigen-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP (prostate differentially expressed gene), GnT-V (gluconate kinase ), gp100 (melanocyte lineage specific antigen GP100), GPC3 (glypican-3), HAGE (helical antigen), HAST-2 (sulfotransferase 1A family member 1), hepsin, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2 ), HERV-K-MEL, HNE (medullasin), homeobox NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPVE7, HST-2 (sirtuin-2), hTERT, iCE (caspase 1), IGF-1R (insulin-like growth factor-1 receptor), IL-13Ra2 (α-2 subunit of interleukin-13 receptor), IL-2R (interleukin-2 receptor), IL-5 (interleukin-5 ), immature laminin receptor, kallikrein-2, kallikrein-4, Ki67, KIAA0205 (lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1), KK-LC-1 (kita-kyushu lung cancer antigen-1), KM-HN-1 , LAGE-1 (L-antigen, member 1 of the LAGE protein family), livin, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGEA2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE- B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGEB17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE- D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2 (melanoma antigen of the L2 family), mammaglobin A, MART-1/Melan-A (melanoma antigen recognized by T-cells-1 ), MART-2, matrix protein 22, MC1R (melanocortin-1 receptor), M-CSF (macrophage colony stimulating factor), mesothelin, MG50/PXDN (peroxidazine), MMP 11 (matrix metalloproteinase 11), MN/CA IX antigen (carbonic anhydrase 9), MRP-3 (multidrug resistance-associated protein-3), MUC1 (mucin 1), MUC2, NA88-A (VENT-like homeobox 2 pseudogene 1), N-acetylglucosaminyltransferase-V, Neo-PAP ( neo-poly(A) polymerase), NGEP (new prostate-expressed gene), NMP22 (nuclear matrix protein 22), NPM/ALK (nucleophosmin), NSE (neuron-specific enolase), NY-ESO-1, NY-ESO -B, OA1 (QTL-1 osteoarthritis), OFA-iLRP (cancer embryonic antigen-immature laminin receptor), OGT (O-GlcNAc-transferase), OS-9 (endoplasmic reticulum lectin), osteocalcin, osteopontin, p15 (inhibitor CDK 2B), p53, PAGE-4 (P antigen family, member-4), PAI-1 (plasminogen activator inhibitor 1), PAI-2, PAP (prostatic acid phosphatase), PART-1 (transcript-1, regulated prostate androgen), PATE (protein-1 expressed by the prostate and testicles), PDEF (prostate derived factor Ets), Pim-1-kinase (provirus integration site-1), Pin1 (peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase- 1), POTE (expressed in prostate, ovary, testis and placenta), PRAME (predominantly expressed antigen in melanoma), protein, proteinase-3, PSA (prostate specific antigen), PSCA (prostate stem cell antigen), PSGR (prostate G-protein-coupled receptor), PSM, PSMA (prostate-specific membrane antigen), RAGE-1 (tumor-associated renal carcinoma antigen), RHAMM/CD168, RU1 (renal ubiquitary protein-1), RU2, SAGE (sarcoma antigen), SART-1 (squamous cell carcinoma antigen-1 recognized by T cells), SART-2, SART-3, Sp17 (sperm protein 17), SSX-1 (SSX family member 1), SSX-2 /HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (metal reductase STEAP2), STEAP, survivin, survivin-213, TA-90 (tumor-associated antigen-90), TAG-72 (tumor-associated glycoprotein-72) , TARP (alternate reading frame TCRγ protein), TGFb (transforming growth factor β), TGFbR11 (transforming growth factor receptor β), TGM-4 (transglutaminase 4), TRAG-3 (taxol resistance gene-3), TRG (γ locus of T cell receptor), TRP-1 (transient receptor potential 1), TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, tyrosinase, UPA (urokinase plasminogen activator), VEGF (growth factor vascular endothelium A), VEGFR-2/FLK-1, and WT1 (Wilms tumor protein 1).

[00200] В некоторых вариантах осуществления целевой антиген представляет собой CD19 или CD22. В некоторых вариантах осуществления целевой антиген представляет собой CD19.[00200] In some embodiments, the target antigen is CD19 or CD22. In some embodiments, the target antigen is CD19.

[00201] В некоторых вариантах осуществления мутированная форма опухолевого антигена выбрана из группы, состоящей из: α-актинина-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, бета-катенина/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, миозина класса 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII, и TPI/m. [00201] In some embodiments, the mutated form of the tumor antigen is selected from the group consisting of: α-actinin-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, beta-catenin/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP- 5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, myosin class 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII, and TPI/m.

[00202] В некоторых вариантах осуществления экспрессия гена, который ослабляет функцию иммунной клетки, вызывает одно или более из следующего: i) ингибирует пролиферацию иммунной клетки; ii) вызывает гибель иммунной клетки; iii) ингибирует функцию молекулы, необходимую иммунной клетке для распознавания целевого антигена и/или активации; iv) индуцирует дифференцировку иммунной клетки в другой тип, который выполняет другую функцию вместо того, чтобы вызывать иммунный ответ на целевой антиген; v) уменьшает реакции иммунной клетки с молекулой, которая способствует иммунному ответу иммунной клетки; или vi) усиливает реакцию иммунной клетки с молекулой, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки.[00202] In some embodiments, expression of a gene that impairs immune cell function causes one or more of the following: i) inhibits immune cell proliferation; ii) causes immune cell death; iii) inhibits the function of the molecule required by the immune cell for target antigen recognition and/or activation; iv) induces immune cell differentiation into a different type that performs a different function instead of eliciting an immune response to the target antigen; v) reduces immune cell responses to a molecule that promotes the immune cell's immune response; or vi) enhances the immune cell's response to a molecule that suppresses the immune cell's immune response.

[00203] В некоторых вариантах осуществления ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, выбран из группы, состоящей из: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, 2B4, FAS, CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-альфа, DGK-дзета, Cbl-b, Cbl-c, CD148, LRR1, TGFBR1, ИЛ-10RA, KLGR1, DNMT3A, и A2aR. В некоторых вариантах осуществления ген, который ослабляет функцию иммунной клетки, усиливает реакции иммунной клетки с молекулой, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления ген, который усиливает реакции иммунной клетки с молекулой, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки, кодирует рецептор или лиганд иммунной контрольной точки.[00203] In some embodiments, a gene that impairs immune cell function is selected from the group consisting of: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3, or CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK, 2B4, FAS, CD45, PP2A, SHP1, SHP2, DGK-alpha, DGK-zeta, Cbl-b, Cbl-c, CD148, LRR1, TGFBR1, IL- 10RA, KLGR1, DNMT3A, and A2aR. In some embodiments, a gene that impairs immune cell function enhances immune cell responses to a molecule that suppresses the immune cell's immune response. In some embodiments, a gene that enhances immune cell responses to a molecule that suppresses the immune cell's immune response encodes an immune checkpoint receptor or ligand.

[00204] В некоторых вариантах осуществления рецептор или лиганд иммунной контрольной точки выбран из группы, состоящей из PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK и 2B4.[00204] In some embodiments, the immune checkpoint receptor or ligand is selected from the group consisting of PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 or CEACAM-5), LAG 3, VISTA, BTLA , TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK and 2B4.

[00205] В некоторых вариантах осуществления агент генетического разрушения снижает экспрессию гена в иммунной клетке, который ослабляет функцию иммунной клетки на по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с иммунной клеткой в отсутствие агента генетического разрушения. В некоторых вариантах осуществления агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который усиливает реакции иммунной клетки с молекулой, которая подавляет иммунный ответ иммунной клетки. В некоторых вариантах осуществления агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который кодирует рецептор или лиганд иммунной контрольной точки. В некоторых вариантах осуществления агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, выбранного из группы, состоящей из: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, CD96, MerTK и 2B4. [00205] In some embodiments, the genetic disruption agent reduces the expression of a gene in an immune cell that impairs immune cell function by at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 95% compared to the immune cell in the absence of the agent. genetic destruction. In some embodiments, the genetic disruption agent reduces the expression of a gene that enhances immune cell responses to a molecule that suppresses the immune cell's immune response. In some embodiments, the genetic disruption agent reduces the expression of a gene that encodes for an immune checkpoint receptor or ligand. In some embodiments, the genetic disruption agent reduces the expression of a gene selected from the group consisting of: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (CEACAM-1, CEACAM-3, or CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT , LAIR1, CD160, CD96, MerTK and 2B4.

[00206] В некоторых вариантах осуществления агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию иммунной клетки посредством РНК-интерференции (РНКи). В некоторых вариантах осуществления более чем один агент генетического разрушения снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию иммунной клетки в иммунной клетке посредством РНКи. В некоторых вариантах осуществления агенты генетического разрушения нацелены на разные части одного гена, который ослабляет функцию иммунной клетки, нацелены на разные гены, которые ослабляют функцию иммунной клетки, или в любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления РНКи опосредуется короткой шпилечной РНК (кшРНК). В некоторых вариантах осуществления РНКи опосредуется более чем одной кшРНК. [00206] In some embodiments, the genetic disruption agent reduces the expression of a gene that impairs immune cell function through RNA interference (RNAi). In some embodiments, more than one genetic disruption agent reduces the expression of a gene that impairs immune cell function in an immune cell via RNAi. In some embodiments, the genetic disruptors target different parts of the same gene that impairs immune cell function, target different genes that impair immune cell function, or any combination thereof. In some embodiments, the RNAi is mediated by short hairpin RNA (shRNA). In some embodiments, the RNAi is mediated by more than one shRNA.

[00207] В некоторых вариантах осуществления РНКи опосредуется двумя кшРНК. В некоторых вариантах осуществления две кшРНК нацелены на разные части PD-1. В некоторых вариантах осуществления две кшРНК нацелены на PD-1 и TIM-3, соответственно. В некоторых вариантах осуществления две кшРНК нацелены на PD-1 и CTLA-4, соответственно. В некоторых вариантах осуществления две кшРНК нацелены на PD-1 и LAG-3, соответственно. В некоторых вариантах осуществления две кшРНК нацелены на PD-1 и TIGIT, соответственно.[00207] In some embodiments, the RNAi is mediated by two shRNAs. In some embodiments, the two shRNAs target different parts of PD-1. In some embodiments, two shRNAs target PD-1 and TIM-3, respectively. In some embodiments, two shRNAs target PD-1 and CTLA-4, respectively. In some embodiments, two shRNAs target PD-1 and LAG-3, respectively. In some embodiments, two shRNAs target PD-1 and TIGIT, respectively.

[00208] В некоторых вариантах осуществления последовательности оснований, кодирующие кшРНК, содержат последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-219 и 238-267. [00208] In some embodiments, the shRNA-encoding base sequences comprise sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-219 and 238-267.

[00209] В некоторых вариантах экспрессия разных кшРНК, соответственно, регулируется разными промоторами. В некоторых вариантах экспрессия двух разных кшРНК, соответственно, регулируется двумя разными промоторами. В некоторых вариантах осуществления два разных промотора представляют собой промоторы РНК-полимеразы III. В некоторых вариантах осуществления два промотора представляют собой промоторы U6, полученные из разных видов. В некоторых вариантах осуществления два промотора ориентированы в разных направлениях относительно друг друга. [00209] In some embodiments, the expression of different shRNAs, respectively, is regulated by different promoters. In some embodiments, the expression of two different shRNAs is respectively regulated by two different promoters. In some embodiments, the two different promoters are RNA polymerase III promoters. In some embodiments, the two promoters are U6 promoters derived from different species. In some embodiments, the two promoters are oriented in different directions relative to each other.

[00210] В некоторых вариантах осуществления каждый из генетически сконструированного антигенного рецептора и агента генетического разрушения экспрессируется из вектора. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный антигенный рецептор и агент генетического разрушения экспрессируются из одного и того же вектора. В некоторых вариантах осуществления вектор выбран из группы, состоящей из ДНК, РНК, плазмиды, лентивирусного вектора, аденовирусного вектора и ретровирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой лентивирусный вектор.[00210] In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor and the genetic disruptor are each expressed from a vector. In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor and the genetic disruptor are expressed from the same vector. In some embodiments, the vector is selected from the group consisting of DNA, RNA, plasmid, lentiviral vector, adenoviral vector, and retroviral vector. In some embodiments, the vector is a lentiviral vector.

[00211] Иммунная клетка может быть охарактеризована тем, что она выбрана из лимфоцитов, таких как Т-киллеры, Т-хелперы, гамма/дельта Т-клетки и В-клетки, натуральные киллеры, тучные клетки, эозинофилы, базофилы; и фагоцитарные клетки включают макрофаги, нейтрофилы и дендритные клетки. Т-клетки включают CD4+ T-клетки и CD8+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления B-клеточная лимфома представляет собой диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL), первичную медиастинальную B-клеточную лимфому (PMBL), лимфому Ходжкина (HL), неходжкинскую лимфому, медиастинальную лимфому серой зоны или HL с нодулярным склерозом. В некоторых вариантах осуществления Т-клеточная лимфома представляет собой анапластическую крупноклеточную лимфому (ALCL), периферическую Т-клеточную лимфому, без дополнительного уточнения (PTCL-NOS), или ангиоиммунобластную Т-клеточную лимфому (AITL). В предпочтительном варианте осуществления иммунная клетка может быть выбрана из человеческих Т-клеток или Т-лимфоцитов и натуральных киллеров (NK). В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления T-клетка представляет собой CD4+ T-клетку или CD8+ T-клетку.[00211] An immune cell can be characterized in that it is selected from lymphocytes such as killer T cells, helper T cells, gamma/delta T cells and B cells, natural killer cells, mast cells, eosinophils, basophils; and phagocytic cells include macrophages, neutrophils, and dendritic cells. T cells include CD4+ T cells and CD8+ T cells. In some embodiments, the B-cell lymphoma is diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), primary mediastinal B-cell lymphoma (PMBL), Hodgkin's lymphoma (HL), non-Hodgkin's lymphoma, mediastinal gray zone lymphoma, or HL with nodular sclerosis. In some embodiments, the T cell lymphoma is anaplastic large cell lymphoma (ALCL), peripheral T cell lymphoma not otherwise specified (PTCL-NOS), or angioimmunoblastic T cell lymphoma (AITL). In a preferred embodiment, the immune cell may be selected from human T cells or T lymphocytes and natural killer (NK) cells. In some embodiments, the immune cell is a T cell. In some embodiments, the T cell is a CD4+ T cell or a CD8+ T cell.

[00212] В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки получают из клеток, первоначально полученных от субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект может представлять собой человека. В некоторых вариантах осуществления человек может представлять собой здорового донора. В других вариантах осуществления субъект может быть охарактеризован как имеющий опухоль или злокачественное новообразование, при котором обнаруживается увеличение или изменение уровней ракового антигена, на который нацеливается CAR или TCR, например, mTCR, экспрессируемый в клетке. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть получены и размножены, как правило, с использованием способов, описанных, например, в патентах США № 6352694; 6534055; 6905680; 6692964; 5858358; 6887466; 6905681; 7144575; 7067318; 7172869; 7232566; 7175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041; и публикации заявки на патент США № 20060121005.[00212] In some embodiments, immune cells are obtained from cells originally obtained from a subject. In some embodiments, the subject may be a human. In some embodiments, the implementation of the person may be a healthy donor. In other embodiments, the subject may be characterized as having a tumor or malignancy in which there is an increase or change in levels of a cancer antigen targeted by a CAR or TCR, eg, mTCR expressed in a cell. In some embodiments, the implementation of the cells can be obtained and propagated, usually using the methods described, for example, in US patent No. 6352694; 6534055; 6905680; 6692964; 5858358; 6887466; 6905681; 7144575; 7067318; 7172869; 7232566; 7175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041; and U.S. Patent Application Publication No. 20060121005.

[00213] В некоторых вариантах осуществления получают CAR-T-клетки. В других вариантах осуществления получение CAR-T-клеток включает стадию обеспечения моноклональных клеток периферической крови. В других вариантах осуществления моноклональные клетки периферической крови могут быть отделены от образцов цельной крови. В некоторых вариантах осуществления получение CAR-T-клеток, описанных в данном документе, включает стадию стимуляции моноклональных клеток периферической крови с использованием антител. Например, агент, обеспечивающий первичный стимулирующий сигнал, представляет собой антитело против CD3 или его антигенсвязывающий фрагмент, а агент, обеспечивающий костимулирующий сигнал, представляет собой антитело против CD28 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления получение CAR-T-клеток, описанных в данном документе, включает стадию трансдукции CAR, причем CAR может нацеливаться на любую мишень, описанную в данном документе, и на любые другие известные цели CAR, например, CAR может представлять собой CD19 CAR, который нацелен на CD19. В других вариантах осуществления полученные CAR-T-клетки выделяют. [00213] In some embodiments, CAR-T cells are obtained. In other embodiments, obtaining CAR-T cells includes the step of providing peripheral blood monoclonal cells. In other embodiments, peripheral blood monoclonal cells may be separated from whole blood samples. In some embodiments, the production of CAR-T cells described herein includes the step of stimulating peripheral blood monoclonal cells using antibodies. For example, an agent providing a primary stimulatory signal is an anti-CD3 antibody or an antigen-binding fragment thereof, and an agent providing a costimulatory signal is an anti-CD28 antibody or an antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the production of CAR-T cells described herein includes the step of transducing the CAR, wherein the CAR may target any of the targets described herein and any other known CAR targets, for example, the CAR may be a CD19 CAR , which targets CD19. In other embodiments, the resulting CAR-T cells are isolated.

[00214] Условия, подходящие для культуры Т-клеток, включают подходящие среды (например, минимальные питательные среды или среды RPMI 1640 или X-vivo 15 (Lonza)), которые могут содержать факторы, необходимые для пролиферации и жизнеспособности, включая сыворотку (например, эмбриональную бычью или человеческую сыворотку), интерлейкин-2 (ИЛ-2), инсулин, ИФН-γ, ИЛ-4, ИЛ-7, ГМ-КСФ, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-15, ТФР-β и ФНО-α или любые другие добавки для роста клеток известны специалисту в данной области техники. Другие добавки для роста клеток включают, но не ограничиваются ими, сурфактант, плазманат и восстановители, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среды может включать RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 и X-Vivo 20, Optimizer, с добавлением аминокислот, пирувата натрия и витаминов, или без сыворотки, или с добавлением соответствующего количества сыворотки (или плазмы) или определенного набора гормонов и/или количества цитокинов, достаточного для роста и экспансии Т-клеток. Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включают только в экспериментальные культуры, но не в культуры клеток, которые должны быть введены субъекту. Целевые клетки поддерживают в условиях, необходимых для поддержания роста, например, при подходящей температуре (например, 37°C) и атмосфере (например, воздух плюс 5% CO2). Также может быть желательно несколько циклов стимуляции, так что время культивирования Т-клеток может составлять 60 суток или более. [00214] Suitable conditions for T cell culture include suitable media (e.g., minimal culture media or RPMI 1640 or X-vivo 15 (Lonza) media) that may contain factors necessary for proliferation and viability, including serum (e.g. , fetal bovine or human serum), interleukin-2 (IL-2), insulin, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGF-β and TNF-α or any other cell growth supplements known to the person skilled in the art. Other cell growth additives include, but are not limited to, surfactant, plasmanate, and reducing agents such as N-acetylcysteine and 2-mercaptoethanol. Media may include RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 and X-Vivo 20, Optimizer, supplemented with amino acids, sodium pyruvate and vitamins, or without or with serum an appropriate amount of serum (or plasma) or a specific set of hormones and / or cytokines sufficient for the growth and expansion of T cells. Antibiotics, such as penicillin and streptomycin, are only included in experimental cultures, not in cell cultures to be administered to a subject. Target cells are maintained under conditions necessary to support growth, eg at a suitable temperature (eg 37° C.) and atmosphere (eg air plus 5% CO2). Multiple cycles of stimulation may also be desirable, so that the T cell culture time may be 60 days or more.

[00215] Т-клетки, которые подвергали стимуляции в течение различных периодов времени, могут обладать различными характеристиками. Например, типичные продукты мононуклеарных клеток крови или продукты мононуклеарных клеток периферической крови после афереза содержат популяцию Т-хелперных клеток (TH, CD4+), которая больше, чем популяция цитотоксических или супрессорных Т-клеток (TC, CD8+). Экспансия Т-клеток ex vivo посредством стимуляции рецепторов CD3 и CD28 приводит к получению популяции Т-клеток, которая до приблизительно 8-9 суток состоит преимущественно из TH-клеток, тогда как приблизительно через 8-9 суток популяция T-клеток содержит возрастающую популяцию TC-клеток. Соответственно, в зависимости от цели лечения, может быть полезным введение субъекту популяции Т-клеток, состоящей преимущественно из Т-клеток. Аналогично, если была выделена антиген-специфическая субпопуляция TC-клеток, может быть полезно размножение этой субпопуляции до большего количества. Более того, в дополнение к маркерам CD4 и CD8 во время процесса экспансии клеток значительно изменяются другие фенотипические маркеры, но в значительной степени воспроизводимо. Таким образом, такая воспроизводимость обеспечивает возможность адаптации продукта активированных Т-клеток к конкретным целям.[00215] T cells that have been stimulated for different periods of time may have different characteristics. For example, typical blood mononuclear cell products or peripheral blood mononuclear cell products after apheresis contain a population of T helper cells (TH, CD4+) that is larger than a population of cytotoxic or suppressor T cells (TC, CD8+). Ex vivo expansion of T cells via stimulation of CD3 and CD28 receptors results in a T cell population that is predominantly TH until about 8-9 days, while after about 8-9 days the T cell population contains an increasing population of TC -cells. Accordingly, depending on the goal of treatment, it may be beneficial to administer to the subject a population of T cells consisting predominantly of T cells. Similarly, if an antigen-specific subpopulation of TC cells has been isolated, it may be beneficial to expand this subpopulation to a larger number. Moreover, in addition to the CD4 and CD8 markers, other phenotypic markers are significantly altered during the cell expansion process, but largely reproducibly. Thus, this reproducibility allows the activated T cell product to be tailored to specific targets.

[00216] Можно использовать различные анализы для оценки CAR-T-клеток, такие как, но не ограничиваясь ими, анализы способности к экспансии после стимуляции антигеном, способности к сохранению экспансии Т-клеток в отсутствие повторной стимуляции, а также анализы противораковой активности в соответствующих условиях in vitro и на животных моделях. Анализы более подробно описаны ниже. [00216] Various assays can be used to evaluate CAR-T cells, such as, but not limited to, assays of expandability after antigen challenge, the ability to maintain expansion of T cells in the absence of restimulation, and assays for anticancer activity in appropriate in vitro conditions and in animal models. The assays are described in more detail below.

[00217] В некоторых вариантах осуществления Вестерн-блот анализ экспрессии CAR в первичных Т-клетках можно использовать для обнаружения присутствия мономеров и димеров. См., например, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009).[00217] In some embodiments, Western blot analysis of CAR expression in primary T cells can be used to detect the presence of monomers and dimers. See, for example, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009).

[00218] В некоторых вариантах осуществления экспансия CAR+ T-клеток in vitro после стимуляции антигеном может быть измерена при помощи проточной цитометрии. Например, смесь CD4+ и CD8+ Т-клеток стимулируют αCD3/αCD28 иАПК с последующей трансдукцией лентивирусными векторами, экспрессирующими GFP, под контролем промоторов, подлежащих анализу. Иллюстративные промоторы включают промоторы гена IE ЦМВ, EF-1 альфа, убиквитина С или фосфоглицерокиназы (PGK). Флуоресценцию GFP оценивают на 6 сутки культивирования в субпопуляциях CD4+ и/или CD8+ Т-клеток при помощи проточной цитометрии. См, например, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Альтернативно, смесь CD4+ и CD8+ Т-клеток стимулируют с помощью магнитных гранул, покрытых αCD3/αCD28 на 0 сутки и трансдуцируют с помощью CAR на 1 сутки, используя бицистронный лентивирусный вектор, экспрессирующий CAR, вместе с eGFP с помощью последовательности ухода с рибосомы 2А. Культуры повторно стимулируют, например, клетками K562, экспрессирующими hCD32 и 4-lBBL, в присутствии антител против CD3 и против CD28 (K562-BBL-3/28) после промывки. Экзогенный ИЛ-2 добавляют к культурам через сутки в концентрации 100 МЕ/мл. GFP+ T-клетки подсчитывают при помощи проточной цитометрии с использованием подсчета на основе гранул. См, например, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Также можно измерить устойчивую экспансию CAR+ T-клеток в отсутствие повторной стимуляции.[00218] In some embodiments , in vitro expansion of CAR+ T cells following antigen challenge can be measured by flow cytometry. For example, a mixture of CD4+ and CD8+ T cells are stimulated with αCD3/αCD28 and APC followed by transduction with lentiviral vectors expressing GFP under the control of the promoters to be analyzed. Illustrative promoters include the CMV IE, EF-1 alpha, ubiquitin C, or phosphoglycerokinase (PGK) gene promoters. GFP fluorescence was assessed on day 6 of culture in CD4+ and/or CD8+ T cell subpopulations by flow cytometry. See, for example, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Alternatively, a mixture of CD4+ and CD8+ T cells are stimulated with αCD3/αCD28-coated magnetic beads on day 0 and transduced with CAR on day 1 using a CAR-expressing bicistronic lentiviral vector, together with eGFP with a 2A ribosome escape sequence. Cultures are restimulated with, for example, K562 cells expressing hCD32 and 4-lBBL in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies (K562-BBL-3/28) after washing. Exogenous IL-2 is added to the cultures every other day at a concentration of 100 IU/ml. GFP+ T cells are counted by flow cytometry using bead-based scoring. See, for example, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). It is also possible to measure the sustained expansion of CAR+ T cells in the absence of restimulation.

[00219] Оценка пролиферации клеток и выработки цитокинов была описана ранее, например, у Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Вкратце, оценку CAR-опосредованной пролиферации проводят в титрационных микропланшетах путем смешивания промытых Т-клеток с целевыми клетками, такими как клетки K562-Meso, Ovcar3, Ovcar8, SW1990, Panc02.03 или CD32 и CD137 (KT32-BBL) для конечного соотношения Т-клетки: целевые клетки 1:1. Моноклональные антитела против CD3 (клон OKT3) и против CD28 (клон 9.3) добавляют в культуры с клетками KT32-BBL в качестве положительного контроля для стимуляции пролиферации Т-клеток, поскольку эти сигналы поддерживают длительную экспансию CD8+ Т-клеток ex vivo. Т-клетки в культурах подсчитывают с использованием флуоресцентных гранул CountBright ™ (Invitrogen, Карслбад, Калифорния) и проточной цитометрии, как описано производителем. CAR+ Т-клетки идентифицируют путем экспрессии GFP, используя Т-клетки, которые были сконструированы с использованием экспрессирующих CAR лентивирусных векторов, связанных с eGFP-2A. Экспрессию CD4+ и CD8+ на Т-клетках также одновременно определяют с помощью специфических моноклональных антител (BD Biosciences). Измерения цитокинов выполняют в супернатантах, собранных через 24 часа после повторной стимуляции, используя набор для количественного определения растворимых форм цитокинов human TH1/TH2 cytokine cytometric bead array kit (BD Biosciences, Сан-Диего, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Флуоресценцию оценивают с помощью проточного цитометра FACScalibur, а данные анализируют в соответствии с инструкциями производителя.[00219] Assessing cell proliferation and cytokine production has been previously described in, for example , Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Briefly, assessment of CAR-mediated proliferation is performed in microtiter plates by mixing washed T cells with target cells such as K562-Meso, Ovcar3, Ovcar8, SW1990, Panc02.03 or CD32 and CD137 (KT32-BBL) cells for a final T ratio -cells: target cells 1:1. Anti-CD3 (clone OKT3) and anti-CD28 (clone 9.3) monoclonal antibodies are added to cultures with KT32-BBL cells as a positive control to stimulate T cell proliferation, since these signals support the long-term expansion of CD8+ T cells ex vivo. T cells in cultures were counted using CountBright™ fluorescent beads (Invitrogen, Carslbad, CA) and flow cytometry as described by the manufacturer. CAR+ T cells are identified by GFP expression using T cells that have been constructed using CAR-expressing eGFP-2A-coupled lentiviral vectors. The expression of CD4+ and CD8+ on T cells is also simultaneously determined using specific monoclonal antibodies (BD Biosciences). Cytokine measurements are performed on supernatants collected 24 hours after restimulation using the human TH1/TH2 cytokine cytometric bead array kit (BD Biosciences, San Diego, CA) according to the manufacturer's instructions. Fluorescence is assessed using a FACScalibur flow cytometer and data is analyzed according to the manufacturer's instructions.

[00220] Цитотоксичность можно оценить при помощи способов, описанных в данном документе, например, в примерах, или при помощи стандартного анализа высвобождения 51Cr (Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)). Вкратце, целевые клетки (например, клетки BHK или CHO) загружают 51 Cr (как NaCr04, New England Nuclear, Бостон, Массачусетс) при 37°C в течение 2 часов при частом перемешивании, дважды промывают в полной среде RPMI и помещают в титрационные микропланшеты. Эффекторные Т-клетки смешивают с целевыми клетками в лунках в полной среде RPMI в различных соотношениях эффекторных клеток с целевыми клетками (E:T). Готовят также дополнительные лунки, содержащие только среду (спонтанное высвобождение, СВ) или 1% раствор детергента тритон-Х 100 (полное высвобождение, ПВ). Через 4 часа инкубации при температуре 37°C собирают супернатант из каждой лунки. Затем измеряют высвобожденный 51Cr с помощью счетчика гамма-частиц (Packard Instrument Co., Уолтем, Массачусетс). Каждое условие выполняют по меньшей мере в трех повторностях, а процентное содержание лизиса подсчитывают, используя следующую формулу: % лизиса = (ER- SR) / (TR - SR), где ER представляет среднее значение высвобожденного 51Cr для каждого экспериментального условия. Также можно использовать альтернативные анализы цитотоксичности, такие как анализы цитотоксичности на основе проточной цитометрии.[00220] Cytotoxicity can be assessed using the methods described herein, for example, in the examples, or using a standard 51 Cr release assay (Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)). Briefly, target cells (eg, BHK or CHO cells) are loaded with 51 Cr (as NaCr04, New England Nuclear, Boston, MA) at 37°C for 2 hours with frequent agitation, washed twice in complete RPMI medium, and plated in microtiter plates . Effector T cells are mixed with target cells in wells in complete RPMI medium in varying ratios of effector cells to target cells (E:T). Additional wells are also prepared containing only the medium (spontaneous release, CB) or 1% solution of detergent Triton-X 100 (full release, CR). After 4 hours of incubation at 37°C, collect the supernatant from each well. The released 51 Cr is then measured using a gamma counter (Packard Instrument Co., Waltham, MA). Each condition is performed in at least triplicate and the percent lysis is calculated using the following formula: % lysis = (ER-SR)/(TR-SR) where ER is the average 51 Cr released for each experimental condition. Alternative cytotoxicity assays, such as flow cytometry-based cytotoxicity assays, may also be used.

[00221] Другие анализы, в том числе те, которые описаны в разделе «Примеры» в данном документе, а также те, которые известны в данной области техники, также могут быть использованы для оценки CAR-T-клеток, полученных в соответствии с данным документом. [00221] Other assays, including those described in the "Examples" section of this document, as well as those known in the art, can also be used to evaluate CAR-T cells obtained in accordance with this document.

[00222] В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки, полученные в соответствии с данным документом, могут участвовать в иммунном ответе на заболевания, при которых экспрессируются антигены, на которые нацелены два типа кшРНК, и CAR или TCR, например, mTCR. В дополнительных вариантах осуществления иммунные клетки можно использовать для обеспечения фармацевтической композиции для иммунотерапии пациентов-людей. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может иметь терапевтический эффект на заболевание-мишень без необходимости применения ингибиторов иммунной контрольной точки, которые могут вызывать тяжелые побочные реакции и дополнительно обременять пациента высокими затратами.[00222] In some embodiments, immune cells obtained in accordance with this document can participate in the immune response to diseases in which antigens targeted by two types of shRNA and CAR or TCR, for example, mTCR are expressed. In additional embodiments, the implementation of immune cells can be used to provide a pharmaceutical composition for immunotherapy of human patients. In some embodiments, the pharmaceutical composition may have a therapeutic effect on the target disease without the need for immune checkpoint inhibitors, which can cause severe adverse reactions and further burden the patient with high costs.

[00223] В некоторых вариантах осуществления иммунные клетки можно использовать в качестве терапевтических агентов для иммунных клеток; такие иммунные клетки, как правило, используются для лечения злокачественных новообразований, но не ограничиваются ими. В дополнительных вариантах осуществления, чтобы обучить эти иммунные клетки распознавать злокачественные опухоли, их модифицируют, чтобы они экспрессировали рецепторы клеточной поверхности, которые нацелены на раковые антигены.[00223] In some embodiments, immune cells can be used as therapeutic agents for immune cells; such immune cells are generally used for the treatment of malignant neoplasms, but are not limited to them. In further embodiments, to train these immune cells to recognize cancers, they are modified to express cell surface receptors that target cancer antigens.

[00224] В другом аспекте в данном документе предложены композиции, содержащие сконструированные иммунные клетки, описанные выше.[00224] In another aspect, this document provides compositions containing the engineered immune cells described above.

5. Лечение с использованием CAR-T-клеток, которые нацелены на одну или более иммунных контрольных точек 5. Treatment with CAR-T cells that target one or more immune checkpoints

[00225] Как указано в данном документе, вектор «два в одном» содержит последовательность оснований, кодирующую один или более типов коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые ингибируют экспрессию генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток, и последовательность оснований, кодирующую любой один из химерного антигенного рецептора (CAR) и Т-клеточного рецептора (TCR), например, моноклонального Т-клеточного рецептора (mTCR). Используя вектор в соответствии с одним вариантом осуществления, могут быть получены иммунные клетки, причем иммунные клетки имеют сниженную экспрессию рецептора иммунной контрольной точки и экспрессируют CAR или TCR, например, mTCR, специфический для целевых молекул. Указанные иммунные клетки могут быть использованы для обеспечения фармацевтической композиции для иммунотерапии. [00225] As described herein, a two-in-one vector contains a base sequence encoding one or more types of short hairpin RNA (shRNA) that inhibit the expression of genes that impair immune cell function, and a base sequence encoding any one of a chimeric antigen receptor (CAR) and a T cell receptor (TCR), such as the monoclonal T cell receptor (mTCR). Using a vector in accordance with one embodiment, immune cells can be generated wherein the immune cells have reduced expression of the immune checkpoint receptor and express a CAR or TCR, eg, an mTCR specific for the target molecules. These immune cells can be used to provide a pharmaceutical composition for immunotherapy.

[00226] Разнообразные заболевания могут быть облегчены путем введения иммунных клеток, как описано в данном документе, субъекту, подходящему для адоптивной иммунотерапии. В некоторых вариантах осуществления полученные CAR-T-клетки, как предусмотрено, предназначены для аллогенной адоптивной клеточной терапии. Кроме того, в данном документе предложено терапевтическое применение композиций, описанных в данном документе, включающее введение композиции субъекту, подходящему для адоптивной клеточной терапии, причем субъект имеет аутоиммунное расстройство; гематобластоз; солидную опухоль; или инфекцию, связанную с ВИЧ, РСВ, ВЭБ, ЦМВ, аденовирусом или полиомавирусом BK. [00226] A variety of diseases can be alleviated by administering immune cells, as described herein, to a subject suitable for adoptive immunotherapy. In some embodiments, the resulting CAR-T cells are provided for allogeneic adoptive cell therapy. In addition, this document provides a therapeutic use of the compositions described herein, including the introduction of the composition to a subject suitable for adoptive cell therapy, and the subject has an autoimmune disorder; hematoblastosis; solid tumor; or an infection associated with HIV, RSV, EBV, CMV, adenovirus, or polyomavirus BK.

[00227] Примеры гемобластозов включают, но не ограничиваются ими, острые и хронические лейкозы (острый миелогенный лейкоз (ОМЛ), острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ), лимфомы, неходжкинскую лимфому (НХЛ), болезнь Ходжкина, множественную миелому и миелодиспластические синдромы. Примеры солидных злокачественных новообразований включают, но не ограничиваются ими, рак головного мозга, предстательной железы, молочной железы, легкого, толстой кишки, матки, кожи, печени, кости, поджелудочной железы, яичника, яичек, мочевого пузыря, почек, головы, шеи, желудка, шейки матки, прямой кишки, гортани и пищевода. Примеры различных аутоиммунных расстройств включают, но не ограничиваются ими, очаговую алопецию, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, дерматомиозит, диабет (тип 1), некоторые формы ювенильного идиопатического артрита, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, миастению гравис, некоторые формы миокардита, рассеянный склероз, пузырчатку/пемфигоид, пернициозную анемию, узелковый полиартериит, полимиозит, первичный билиарный цирроз, псориаз, ревматоидный артрит, склеродермию/системный склероз, синдром Шегрена, системную красную волчанку, эритематоз, некоторые формы тиреоидита, некоторые формы увеита, витилиго, гранулематоз с полиангиитом (Вегенера). Примеры вирусных инфекций включают, но не ограничиваются ими, расстройства, связанные с ВИЧ (вирусом иммунодефицита человека), ВПЧ (вирусом простого герпеса), KSHV (герпесвирусом, связанным с саркомой Капоши), РСВ (респираторно-синцитиальным вирусом), ВЭБ (вирусом Эпштейна-Барра), ЦМВ (цитомегаловирусом), ВВО (вирусом ветряной оспы), аденовирусом, лентивирусом, полиомавирусом BK. [00227] Examples of hemoblastoses include, but are not limited to, acute and chronic leukemias (acute myelogenous leukemia (AML), acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic myelogenous leukemia (CML), lymphomas, non-Hodgkin's lymphoma (NHL), Hodgkin's disease, multiple myeloma and myelodysplastic syndromes Examples of solid malignancies include, but are not limited to, cancers of the brain, prostate, breast, lung, colon, uterus, skin, liver, bone, pancreas, ovary, testis, bladder, kidney , head, neck, stomach, cervix, rectum, larynx, and esophagus.Examples of various autoimmune disorders include, but are not limited to, alopecia areata, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune hepatitis, dermatomyositis, diabetes (type 1), some forms of juvenile idiopathic arthritis, glomerulonephritis, Graves' disease, Guillain-Barré syndrome, idiopathic thrombocytopenic purpura, myasthenia gravis, some forms of myocarditis, multiple sclerosis, pemphigus/pemphigoid, pernicious anemia, polyarteritis nodosa, polymyositis, primary biliary cirrhosis, psoriasis, rheumatoid arthritis, scleroderma/systemic sclerosis, Sjögren's syndrome, systemic lupus erythematosus, erythematosis, some forms of thyroiditis, some forms of uveitis, vitiligo, granulomatosis with polyangiitis (Wegener). Examples of viral infections include, but are not limited to, disorders associated with HIV (human immunodeficiency virus), HPV (herpes simplex virus), KSHV (Kaposi's sarcoma-associated herpes virus), RSV (respiratory syncytial virus), EBV (Epstein virus). -Barr), CMV (cytomegalovirus), VZV (varicella-zoster virus), adenovirus, lentivirus, polyomavirus BK.

[00228] Острый лейкоз характеризуется быстрым размножением незрелых клеток крови. Эта скученность делает костный мозг неспособным производить здоровые клетки крови. Острые формы лейкоза могут возникать у детей и молодых людей. На самом деле, это более распространенная причина смерти детей в США, чем любой другой вид злокачественных новообразований. При остром лейкозе требуется немедленное лечение в связи с быстрым прогрессированием и накоплением злокачественных клеток, которые затем попадают в кровоток и распространяются на другие органы организма. Вовлечение центральной нервной системы (ЦНС) встречается редко, хотя заболевание может иногда вызывать паралич черепных нервов. Хронический лейкоз отличается чрезмерным накоплением относительно зрелых, но все еще ненормальных клеток крови. Как правило, прогрессирование происходит в течение от нескольких месяцев до нескольких лет, клетки вырабатываются с гораздо большей скоростью, чем нормальные клетки, в результате чего в крови образуется много аномальных белых кровяных телец. Хронический лейкоз чаще встречается у пожилых людей, но теоретически может встречаться в любой возрастной группе. Принимая во внимание, что острый лейкоз должен лечиться немедленно, хронические формы иногда проверяются в течение некоторого времени перед лечением, чтобы гарантировать максимальную эффективность терапии. Кроме того, заболевания классифицируются на лимфоцитарные или лимфобластные, которые указывают на то, что раковое изменение произошло в типе клеток костного мозга, которые обычно продолжают формировать лимфоциты, и миелогенные или миелоидные, которые указывают на то, что раковое изменение произошло в типе клеток костного мозга, которые обычно продолжают формировать эритроциты, некоторые типы белых клеток и тромбоциты (см. лимфоидные клетки и миелоидные клетки).[00228] Acute leukemia is characterized by the rapid proliferation of immature blood cells. This crowding makes the bone marrow unable to produce healthy blood cells. Acute forms of leukemia can occur in children and young people. In fact, it is a more common cause of death for children in the US than any other type of cancer. Acute leukemia requires immediate treatment due to the rapid progression and accumulation of malignant cells, which then enter the bloodstream and spread to other organs of the body. Involvement of the central nervous system (CNS) is rare, although the disease can sometimes cause cranial nerve palsies. Chronic leukemia is characterized by an excessive accumulation of relatively mature but still abnormal blood cells. Typically progressing over months to years, cells are produced at a much faster rate than normal cells, resulting in many abnormal white blood cells in the blood. Chronic leukemia is more common in the elderly, but theoretically can occur in any age group. Whereas acute leukemia must be treated immediately, chronic forms are sometimes tested for some time before treatment to ensure that therapy is as effective as possible. In addition, diseases are classified into lymphocytic or lymphoblastic, which indicates that a cancerous change has occurred in a type of bone marrow cell that normally continues to form lymphocytes, and myelogenous or myeloid, which indicates that a cancerous change has occurred in a type of bone marrow cell. , which normally go on to form red blood cells, some types of white cells, and platelets (see lymphoid cells and myeloid cells).

[00229] Острый лимфобластный лейкоз (также известный как острый лимфобластный лейкоз, или ОЛЛ) является наиболее распространенным типом лейкоза у маленьких детей. Эта болезнь также поражает взрослых, особенно в возрасте 65 лет и старше. Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) чаще всего поражает взрослых в возрасте старше 55 лет. Иногда он встречается у молодых взрослых, но почти никогда не поражает детей. Острый миелогенный лейкоз (также известный как острый миелолейкоз, или ОМЛ) встречается чаще у взрослых, чем у детей. Этот тип лейкоза ранее называли «острым нелимфобластным лейкозом». Хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ) встречается в основном у взрослых. У очень небольшого числа детей также развивается эта болезнь.[00229] Acute lymphoblastic leukemia (also known as acute lymphoblastic leukemia, or ALL) is the most common type of leukemia in young children. This disease also affects adults, especially those aged 65 and over. Chronic lymphocytic leukemia (CLL) most commonly affects adults over the age of 55. It sometimes occurs in young adults but almost never affects children. Acute myelogenous leukemia (also known as acute myelogenous leukemia, or AML) is more common in adults than in children. This type of leukemia was previously called "acute non-lymphoblastic leukemia." Chronic myelogenous leukemia (CML) occurs mainly in adults. A very small number of children also develop this disease.

[00230] Лимфома представляет собой тип злокачественного новообразования, которое возникает в лимфоцитах (тип лейкоцитов в иммунной системе позвоночных). Существует много типов лимфомы. По данным Национального института здравоохранения США, лимфомы составляют около пяти процентов всех случаев рака в Соединенных Штатах, а лимфома Ходжкина, в частности, составляет менее одного процента всех случаев злокачественных новообразований в Соединенных Штатах. Поскольку лимфатическая система является частью иммунной системы организма, пациенты с ослабленной иммунной системой, например, из-за ВИЧ-инфекции, или определенных лекарственных средств, или медикаментозного лечения, также имеют более высокую частоту возникновения лимфомы.[00230] Lymphoma is a type of cancer that occurs in lymphocytes (a type of white blood cell in the immune system of vertebrates). There are many types of lymphoma. According to the US National Institutes of Health, lymphomas account for about five percent of all cancers in the United States, and Hodgkin's lymphoma in particular accounts for less than one percent of all cancers in the United States. Since the lymphatic system is part of the body's immune system, patients with a weakened immune system, such as due to HIV infection, or certain drugs or drug treatments, also have a higher incidence of lymphoma.

[00231] В XIX и XX веках это заболевание называлось «болезнью Ходжкина», так как оно было открыто Томасом Ходжкиным в 1832 году. В общем лимфому, как правило, подразделяют на лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому (все другие типы лимфомы). Научная классификация типов лимфом является более детальной. Хотя в более ранних классификациях они относились к гистиоцитарным лимфомам, в более новых классификациях они определяются как происходящие из B-, T- или NK-клеток.[00231] In the 19th and 20th centuries, this disease was called "Hodgkin's disease" because it was discovered by Thomas Hodgkin in 1832. In general, lymphoma is generally divided into Hodgkin's lymphoma and non-Hodgkin's lymphoma (all other types of lymphoma). The scientific classification of types of lymphomas is more detailed. Although they were classified as histiocytic lymphomas in earlier classifications, in newer classifications they are defined as originating from B, T, or NK cells.

[00232] Когда фармацевтическую композицию вводят пациенту со злокачественной опухолью, в которой экспрессируется целевая молекула CAR или TCR, например, mTCR, фармацевтическая композиция может распознавать злокачественную опухоль и обладать иммунной активностью без активации генов, которые ослабляют функцию иммунных клеток по отношению к раковым клеткам, и без таких проблем, как истощение из-за ингибирующего активацию сигналинга, вызванного тем самым.[00232] When a pharmaceutical composition is administered to a patient with a cancer that expresses a target CAR or TCR molecule, such as mTCR, the pharmaceutical composition can recognize the cancer and have immune activity without activating genes that impair immune cell function toward cancer cells, and without problems such as exhaustion due to activation-inhibiting signaling thereby caused.

[00233] В некоторых вариантах осуществления вышеуказанная фармацевтическая композиция, содержащая иммунные клетки, способна более эффективно подавлять экспрессию рецепторов иммунной контрольной точки, одновременно обеспечивая максимальную эффективность противораковой терапии иммунными клетками, при этом химерные антигенные рецепторы могут функционировать. В других вариантах осуществления, поскольку в фармацевтической композиции используются клетки, в которых экспрессия рецепторов иммунной контрольной точки подавлена, как описано выше, можно устранить серьезные и системные побочные реакции, такие как синдром высвобождения цитокинов или симптомы аутоиммунных заболеваний, которые могут возникнуть в результате использования отдельного ингибитора для рецептора иммунной контрольной точки, а также бремя, связанное с увеличением стоимости лечения в результате одновременного использования дорогостоящей терапии антителами с клеточной терапией.[00233] In some embodiments, the above pharmaceutical composition containing immune cells is able to more effectively suppress the expression of immune checkpoint receptors while maximizing the effectiveness of anti-cancer therapy with immune cells, while chimeric antigen receptors can function. In other embodiments, since cells in which immune checkpoint receptor expression is downregulated as described above are used in the pharmaceutical composition, serious and systemic adverse reactions, such as cytokine release syndrome or autoimmune disease symptoms, that may result from the use of a single an inhibitor for the immune checkpoint receptor; and the burden of increased treatment costs resulting from the concomitant use of expensive antibody therapy with cell therapy.

[00234] Поскольку очевидно, что в дополнение к клеткам к фармацевтической композиции могут быть добавлены другие фармацевтически приемлемые соли, носители, вспомогательные вещества, наполнители, и другие добавки и т. д., которые могут дополнительно улучшить иммунный ответ, подробное их описание будет опущено. [00234] Since it is obvious that, in addition to cells, other pharmaceutically acceptable salts, carriers, excipients, excipients, and other additives, etc., which can further improve the immune response, can be added to the pharmaceutical composition, a detailed description of them will be omitted. .

[00235] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит две CAR-T-клетки, нацеленные на две иммунные контрольные точки, как описано в данном документе. Например, двойные иммунные контрольные точки могут быть выбраны из группы, состоящей из PD1 (белок программируемой клеточной смерти 1), PD-L1 (лиганд-1 белка программируемой клеточной гибели), CTLA4 (цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4), TIM- 3 (белок 3, содержащий домены T-клеточного иммуноглобулина и муцина), CEACAM (молекула адгезии клеток, связанная с раковым эмбриональным антигеном, включая три подтипа CEACAM-1, CEACAM-3 или CEACAM-5), LAG3 (ген активации лимфоцитов-3), VISTA (V-доменный супрессор активации Т-клеток), BTLA (B- и T-лимфоцитарный аттенюатор), TIGIT (T-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM), LAIR1 (связанный с лейкоцитами иммуноглобулин-подобный рецептор 1), CD160 (кластер дифференцировки 160), CD96 (кластер дифференцировки 96), MerTK (протоонкогенная тирозинпротеинкиназа MER) и 2B4 (лиганд, индуцирующий активацию NK-клеток), и, например, могут быть выбраны между PD1 и TIM3. [00235] In some embodiments, the implementation of the pharmaceutical composition contains two CAR-T cells that target two immune checkpoints, as described in this document. For example, dual immune checkpoints can be selected from the group consisting of PD1 (programmed cell death protein 1), PD-L1 (programmed cell death protein ligand-1), CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), TIM- 3 (protein 3 containing T-cell immunoglobulin and mucin domains), CEACAM (cell adhesion molecule associated with cancer embryonic antigen, including the three subtypes CEACAM-1, CEACAM-3 or CEACAM-5), LAG3 (lymphocyte activation gene-3 ), VISTA (V-domain suppressor of T-cell activation), BTLA (B- and T-lymphocyte attenuator), TIGIT (T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains), LAIR1 (leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor 1), CD160 (differentiation cluster 160), CD96 (differentiation cluster 96), MerTK (proto-oncogenic tyrosine protein kinase MER) and 2B4 (ligand that induces NK cell activation), and, for example, can be selected between PD1 and TIM3.

[00236] В некоторых вариантах осуществления типы целевых иммунных контрольных точек влияют на противоопухолевый эффект фармацевтической композиции. Например, фармацевтическая композиция, нацеленная на PD-1 и TIM3, может демонстрировать другой уровень противоопухолевого эффекта по сравнению с фармацевтической композицией, нацеленной на PD-1 и TIGIT. В других вариантах осуществления указанное различие в противоопухолевом эффекте является непредсказуемым из известных знаний об противоопухолевом эффекте других лекарственных средств, нацеленных на ту же иммунную контрольную точку, например, других лекарственных средств, которые могут включать антитело, нацеленное на иммунную контрольную точку. В некоторых вариантах осуществления нацеливание на определенные две иммунные контрольные точки может вызывать неожиданно высокий противоопухолевый эффект. В иллюстративном варианте осуществления (пример 10) CAR-T-клетки, нацеленные на PD-1 и TIGIT, демонстрируют неожиданно превосходный противоопухолевый эффект по сравнению с другими двойными KD CAR-T-клетками, нацеленными на комбинации PD-1 и CTLA-4, PD-1 и LAG-3, и PD-1 и TIM-3.[00236] In some embodiments, the types of target immune checkpoints affect the antitumor effect of the pharmaceutical composition. For example, a pharmaceutical composition that targets PD-1 and TIM3 may exhibit a different level of antitumor effect compared to a pharmaceutical composition that targets PD-1 and TIGIT. In other embodiments, said difference in antitumor effect is unpredictable from known knowledge of the antitumor effect of other drugs targeting the same immune checkpoint, such as other drugs that may include an antibody that targets the immune checkpoint. In some embodiments, targeting certain two immune checkpoints can produce an unexpectedly high antitumor effect. In an exemplary embodiment (Example 10), CAR-T cells targeting PD-1 and TIGIT show an unexpectedly superior antitumor effect compared to other dual-KD CAR-T cells targeting combinations of PD-1 and CTLA-4, PD-1 and LAG-3, and PD-1 and TIM-3.

[00237] В одном аспекте композиция, описанная в данном документе, может быть предоставлена в единичной дозированной форме, причем каждая дозированная единица, например, инъекция, содержит заранее определенное количество композиции, отдельно или в подходящей комбинации с другими активными агентами. В контексте данного документа термин единичная дозированная форма относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для людей и животных, причем каждая единичная дозированная форма содержит заданное количество композиции, описанной в данном документе, отдельно или в комбинации с другими активными агентами, рассчитанными в количестве, достаточном для достижения желаемого эффекта, в комбинации с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или наполнителем там, где это необходимо. Спецификации для новых единичных дозированных форм клеток или композиций, описанных в данном документе, зависят от конкретной фармакодинамики, связанной с фармацевтической композицией у конкретного субъекта.[00237] In one aspect, the composition described herein may be provided in unit dosage form, with each dosage unit, such as an injection, containing a predetermined amount of the composition, alone or in a suitable combination with other active agents. In the context of this document, the term unit dosage form refers to physically discrete units suitable as unit doses for humans and animals, with each unit dosage form containing a given amount of the composition described herein, alone or in combination with other active agents, calculated in an amount sufficient to achieve the desired effect, in combination with a pharmaceutically acceptable diluent, carrier or excipient, where necessary. Specifications for novel unit dosage forms of cells or compositions described herein depend on the particular pharmacodynamics associated with the pharmaceutical composition in a particular subject.

[00238] В некоторых вариантах осуществления предпочтительная лекарственная форма для клеток или композиций, описанных в данном документе, может быть определена на основе содержания данного описания и общих знаний о методах изготовления и в соответствии с предполагаемым путем введения, способом доставки и целевой дозой. Несмотря на способ введения, эффективная доза может быть рассчитана в соответствии с массой тела пациента, площадью поверхности или размером органа. Расчеты для определения соответствующих доз введения для терапии с использованием соответствующих лекарственных форм, указанных в данной спецификации, а также дополнительной очистки проводятся ежедневно в данной области техники и включены в объем работ, выполняемых ежедневно в данной области техники. Соответствующие дозы введения могут быть определены с помощью соответствующих данных о зависимости между дозой и эффектом. [00238] In some embodiments, the preferred dosage form for the cells or compositions described herein can be determined based on the contents of this description and general knowledge of manufacturing methods and in accordance with the intended route of administration, method of delivery and target dose. Regardless of the route of administration, an effective dose may be calculated according to the patient's body weight, surface area, or organ size. Calculations to determine the appropriate doses of administration for therapy using the appropriate dosage forms specified in this specification, as well as additional purification, are performed daily in the art and are included in the scope of work performed daily in the art. Appropriate doses of administration can be determined using appropriate dose-effect relationship data.

[00239] Фармацевтические композиции, описанные в данном документе, могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими известными агентами, полезными для лечения злокачественного новообразования. Независимо от того, доставляются ли они по отдельности или в комбинации с другими агентами, фармацевтические композиции, описанные в данном документе, могут доставляться различными путями и в различные органы и ткани организма млекопитающего, в частности, человека, для достижения определенного эффекта. Специалисту в данной области техники будет понятно, что, хотя для введения можно использовать более одного пути, конкретный путь может обеспечить более немедленную и более эффективную реакцию, чем другой путь. Например, внутрикожная доставка может иметь преимущество в использовании относительно ингаляции для лечения меланомы. Местная или системная доставка может быть достигнута путем введения, включающего нанесение или инстилляцию препарата в полости тела, ингаляцию или инсуффляцию аэрозоля, или путем парентерального введения, включающего внутримышечное, внутривенное, интрапортальное, внутрипеченочное, перитонеальное, подкожное или внутрикожное введение. Иллюстративный путь введения субъекту включает внутривенную (в/в) инъекцию и регионарное (внутриопухолевое, внутрибрюшинное) введение. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию можно вводить путем инфузии в солидную опухоль. [00239] The pharmaceutical compositions described herein may be used alone or in combination with other known agents useful in the treatment of cancer. Whether delivered alone or in combination with other agents, the pharmaceutical compositions described herein can be delivered in a variety of ways and to various organs and tissues of the mammalian body, particularly humans, to achieve a particular effect. One of skill in the art will appreciate that while more than one route may be used for administration, a particular route may provide a more immediate and more effective response than another route. For example, intradermal delivery may be advantageous over inhalation for the treatment of melanoma. Local or systemic delivery can be achieved by administration, including application or instillation of the drug into the body cavity, inhalation or insufflation of an aerosol, or by parenteral administration, including intramuscular, intravenous, intraportal, intrahepatic, peritoneal, subcutaneous or intradermal administration. An exemplary route of administration to a subject includes intravenous (IV) injection and regional (intratumoral, intraperitoneal) administration. In some embodiments, the implementation of the pharmaceutical composition can be administered by infusion into a solid tumor.

[00240] В некоторых вариантах осуществления в дополнение к генетически сконструированным иммунным клеткам, предложенным в данном документе, дополнительный терапевтический агент, содержащий антитело или фрагмент антитела, который нацелен на антиген, связанный с патологическим состоянием, заболеванием или показанием, может использоваться с этими эффекторными клетками в комбинированной терапии. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело, гуманизированное моноклональное антитело или химерное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела специфически связывается с вирусным антигеном. В других вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела специфически связывается с опухолевым антигеном. В некоторых вариантах осуществления антитела, подходящие для комбинированного лечения в качестве дополнительного терапевтического агента к введенным генетически сконструированным иммунным клеткам, включают, но не ограничиваются ими, анти-CD20 (ритуксимаб, велтузумаб, офатумумаб, ублитуксимаб, окаратузумаб, обинутузумаб), анти-HER2 (трастузумаб, пертузумаб), анти-CD52 (алемтузумаб), анти-EGFR (цертуксимаб), анти-GD2 (динутуксимаб), анти-PDL1 (авелумаб), анти-CD38 (даратумумаб, изатуксимаб, MOR202), анти-CD123 (7G3, CSL362), анти-SLAMF7 (элотузумаб); и их гуманизированные или Fc-модифицированные варианты или фрагменты, или их функциональные эквиваленты и биологические аналоги. [00240] In some embodiments, in addition to the genetically engineered immune cells provided herein, an additional therapeutic agent containing an antibody or antibody fragment that targets an antigen associated with a disease state, disease, or indication can be used with these effector cells. in combination therapy. In some embodiments, the antibody is a monoclonal antibody. In some embodiments, the antibody is a humanized antibody, a humanized monoclonal antibody, or a chimeric antibody. In some embodiments, the antibody or antibody fragment specifically binds to a viral antigen. In other embodiments, the antibody or antibody fragment specifically binds to a tumor antigen. In some embodiments, antibodies suitable for combination treatment as an additional therapeutic agent to administered genetically engineered immune cells include, but are not limited to, anti-CD20 (rituximab, veltuzumab, ofatumumab, ublituximab, ocaratuzumab, obinutuzumab), anti-HER2 ( trastuzumab, pertuzumab), anti-CD52 (alemtuzumab), anti-EGFR (certuximab), anti-GD2 (dinutuximab), anti-PDL1 (avelumab), anti-CD38 (daratumumab, isatuximab, MOR202), anti-CD123 (7G3, CSL362), anti-SLAMF7 (elotuzumab); and their humanized or Fc-modified variants or fragments, or their functional equivalents and biological analogues.

[00241] Желательно, чтобы эффективное количество или достаточное количество выделенных трансдуцированных Т-клеток присутствовало в композиции и вводилось субъекту таким образом, чтобы они формировали длительные специфические противоопухолевые ответы для уменьшения размера опухоли или устранения роста или повторного роста опухоли, чем в противном случае привело бы отсутствие такого лечения. Желательно, чтобы количество трансдуцированных Т-клеток, повторно введенных в организм субъекта, приводило к 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 100% уменьшению размера опухоли по сравнению с другими аналогичными условиями, при которых трансдуцированные Т-клетки отсутствуют.[00241] Desirably, an effective amount or a sufficient amount of isolated transduced T cells are present in the composition and administered to the subject in such a way that they generate long-term specific antitumor responses to reduce tumor size or eliminate tumor growth or regrowth, which would otherwise lead to no such treatment. Desirably, the number of transduced T cells reintroduced into the subject's body results in 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, or 100% reduction in tumor size compared to other similar conditions in which transduced T cells are absent.

[00242] Соответственно, для количества вводимых трансдуцированных Т-клеток должен учитываться путь введения и он должно быть таким, чтобы вводилось достаточное количество трансдуцированных Т-клеток для достижения желаемого терапевтического ответа. Кроме того, количества каждого активного агента, включенного в композиции, описанные в данном документе (например, количество на каждую клетку, с которой необходимо приводить в контакт, или количество на определенную массу тела), могут варьироваться в различных применениях. В общем, концентрация трансдуцированных Т-клеток у субъекта, подвергаемого лечению, желательно должна быть достаточной для обеспечения по меньшей мере от около 1×106 до около 1×109 трансдуцированных Т-клеток, еще более желательно от около 1×107 до около 5×108 трансдуцированных Т-клеток, хотя может быть использовано любое подходящее количество: или выше, например, более 5 × 108 клеток, или ниже, например, менее 1 × 107 клеток. Схема применения может быть основана на хорошо зарекомендовавших себя способах лечения на основе клеток (см., например, Topalian and Rosenberg, 1987; патент США № 4690915), или может использоваться альтернативная стратегия непрерывной инфузии.[00242] Accordingly, the number of transduced T cells administered must take into account the route of administration and should be such that a sufficient number of transduced T cells are administered to achieve the desired therapeutic response. In addition, the amounts of each active agent included in the compositions described herein (eg, the amount per cell to be contacted, or the amount per specific body weight) may vary in different applications. In general, the concentration of transduced T cells in a subject to be treated should desirably be sufficient to provide at least about 1×10 6 to about 1×10 9 transduced T cells, even more desirably from about 1×10 7 to about 5×10 8 transduced T cells, although any suitable number may be used: either higher, eg more than 5×10 8 cells, or lower, eg less than 1×10 7 cells. The application regimen may be based on well-established cell-based therapies (see, for example, Topalian and Rosenberg, 1987; US Pat. No. 4,690,915), or an alternative continuous infusion strategy may be used.

[00243] Эти значения обеспечивают общие рекомендации в отношении диапазона трансдуцированных Т-клеток, которые должны использоваться практикующим врачом при оптимизации описанных в данном документе способов. Перечисление в данном документе таких диапазонов никоим образом не исключает использование более высокого или более низкого количества компонента, что может быть оправдано в конкретном применении. Например, фактическая доза и схема приема могут варьироваться в зависимости от того, вводится ли композиции в комбинации с другими фармацевтическими композициями или в зависимости от индивидуальных различий в фармакокинетике, расположении лекарственного средства и метаболизме. Специалист в данной области техники может легко внести любые необходимые корректировки в соответствии с требованиями конкретной ситуации.[00243] These values provide general guidance on the range of transduced T cells that should be used by the practitioner when optimizing the methods described herein. The listing herein of such ranges does not in any way exclude the use of higher or lower amounts of the component, which may be justified in a particular application. For example, the actual dose and dosage regimen may vary depending on whether the compositions are administered in combination with other pharmaceutical compositions or depending on individual differences in pharmacokinetics, drug location and metabolism. A person skilled in the art can easily make any necessary adjustments to suit the requirements of a particular situation.

[00244] В набор может быть включена любая из композиций, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления CAR-T-клетки предложены в наборе, который также может содержать реагенты, подходящие для экспансии клеток, такие как среды, иАПК, факторы роста, антитела (например, для сортировки или определения характеристик CAR-T-клеток) и/или плазмиды, кодирующие CAR или транспозазу.[00244] Any of the compositions described herein may be included in the kit. In some embodiments, CAR-T cells are provided in a kit that may also contain reagents suitable for cell expansion, such as media, iAPK, growth factors, antibodies (eg, for sorting or characterizing CAR-T cells), and/ or plasmids encoding CAR or transposase.

[00245] В неограничивающем примере, конструкция, экспрессирующая химерный рецептор, один или более реагентов для создания конструкции экспрессирующей химерный рецептор, клетки для трансфекции экспрессирующей конструкции и/или один или более инструментов для получения аллогенных клеток для трансфекции экспрессирующей конструкции (таким инструментом может быть шприц, пипетка, щипцы и/или любой подобный медицинский прибор).[00245] In a non-limiting example, a construct expressing a chimeric receptor, one or more reagents for creating a construct expressing a chimeric receptor, cells for transfecting the expression construct, and/or one or more tools for obtaining allogeneic cells for transfecting the expression construct (such a tool can be a syringe , pipette, forceps and/or any similar medical device).

[00246] В некоторых вариантах осуществления в наборе предложена экспрессирующая конструкция для устранения эндогенной экспрессии α/β TCR, один или более реагентов для получения конструкции и/или CAR+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления включены экспрессирующие конструкции, которые кодируют нуклеазу(ы) с цинковыми пальцами. В некоторых аспектах набор включает реагенты или прибор для электропорации клеток.[00246] In some embodiments, the kit provides an expression construct to abolish endogenous α/β TCR expression, one or more construct generating reagents, and/or CAR + T cells. In some embodiments, expression constructs are included that encode zinc finger nuclease(s). In some aspects, the kit includes reagents or a device for electroporation of cells.

[00247] Наборы могут содержать одну или более подходящих разделенных на аликвоты композиций, описанных в данном документе, или реагенты для получения композиций, как описано в данном документе. Компоненты наборов могут быть упакованы или в водной среде, или в лиофилизированной форме. Контейнерные средства наборов могут включать по меньшей мере один флакон, пробирку, колбу, флакон, шприц или другие контейнерные средства, в которые может быть помещен компонент, и в некоторых вариантах осуществления соответствующим образом разделен на аликвоты. Если в наборе имеется более одного компонента, набор также обычно содержит второй, третий или другой дополнительный контейнер, в который дополнительные компоненты могут быть помещены отдельно. Тем не менее во флаконе могут содержаться различные комбинации компонентов. Описанные в данном документе наборы также обычно содержат средства для размещения конструкции химерного рецептора и любых других контейнеров с реагентами в закрывающемся контейнере для коммерческой продажи. Такие контейнеры могут включать пластмассовые контейнеры, полученные с помощью формования с раздувом или литья под давлением, в которые, например, помещаются нужные флаконы.[00247] The kits may contain one or more suitable aliquoted compositions described herein or reagents for preparing compositions as described herein. The components of the kits may be packaged either in an aqueous medium or in lyophilized form. Kit container means may include at least one vial, tube, flask, vial, syringe, or other container means into which a component may be placed and, in some embodiments, aliquoted as appropriate. If there is more than one component in the kit, the kit also typically contains a second, third, or other additional container into which the additional components can be placed separately. However, the vial may contain various combinations of components. The kits described herein also typically contain means for placing the chimeric receptor construct and any other reagent containers in a commercially resealable container. Such containers may include blow-molded or injection-molded plastic containers into which, for example, the desired vials are placed.

[00248] В одном аспекте в данном документе предложены фармацевтические композиции, содержащие иммунную клетку, описанную выше, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом аспекте в данном документе предложены фармацевтические композиции для иммунотерапии пациентов-людей, содержащие иммунные клетки, описанные выше. В некоторых вариантах осуществления иммунную клетку первоначально получают от пациента. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется опухоль или злокачественное новообразование, при которых обнаруживается увеличение или изменение уровней ракового антигена, на который нацеливается CAR или TCR, например, mTCR, экспрессируемый в клетке.[00248] In one aspect, provided herein are pharmaceutical compositions comprising an immune cell as described above and a pharmaceutically acceptable carrier. In another aspect, this document provides pharmaceutical compositions for the immunotherapy of human patients containing the immune cells described above. In some embodiments, the immune cell is initially obtained from a patient. In some embodiments, the patient has a tumor or malignancy in which there is an increase or change in levels of a cancer antigen targeted by a CAR or TCR, eg, mTCR expressed in a cell.

[00249] В другом аспекте в данном документе предложены способы. В некоторых вариантах осуществления предложены способы лечения, включающие введение субъекту, имеющему заболевание или патологическое состояние, иммунной клетки, описанной выше, или композиции, описанной выше. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный антигенный рецептор специфически связывается с антигеном, связанным с заболеванием или патологическим состоянием. В некоторых вариантах осуществления заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественное новообразование или опухоль. [00249] In another aspect, methods are provided herein. In some embodiments, methods of treatment are provided, comprising administering to a subject having a disease or condition an immune cell as described above or a composition as described above. In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor specifically binds to an antigen associated with a disease or condition. In some embodiments, the disease or condition is a cancer or tumor.

[00250] В другом аспекте в данном документе предложены иммунные клетки и композиции. В некоторых вариантах осуществления предложены иммунные клетки и композиции, описанные выше, для применения при лечении заболевания или патологического состояния.[00250] In another aspect, this document provides immune cells and compositions. In some embodiments, the immune cells and compositions described above are provided for use in the treatment of a disease or condition.

[00251] В другом аспекте в данном документе предложено применение иммунных клеток или композиций. В некоторых вариантах осуществления предложено применение иммунных клеток или композиций, описанных выше, при изготовлении лекарственного препарата для применения в способе лечения заболевания или патологического состояния. В некоторых вариантах осуществления генетически сконструированный антигенный рецептор специфически связывается с антигеном, связанным с заболеванием или патологическим состоянием. В некоторых вариантах осуществления заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественное новообразование или опухоль.[00251] In another aspect, this document provides for the use of immune cells or compositions. In some embodiments, the use of immune cells or compositions as described above is provided in the manufacture of a medicament for use in a method of treating a disease or condition. In some embodiments, the genetically engineered antigen receptor specifically binds to an antigen associated with a disease or condition. In some embodiments, the disease or condition is a cancer or tumor.

[00252] Приведенное выше описание данного изобретения предназначено для примера, и специалисты в данной области техники должны понимать, что данное изобретение может быть легко модифицировано в некоторые другие формы без изменения технической идеи или существенных характеристик данного изобретения. Соответственно, варианты осуществления, описанные выше, следует понимать как иллюстративные и не ограничивающие во всех аспектах. Например, соответствующие составляющие элементы, которые описаны как объединенные, могут выполняться отдельно, и аналогичным образом, составляющие элементы, которые описываются как выполняемые отдельно, могут выполняться вместе.[00252] The above description of the present invention is by way of example, and those skilled in the art will appreciate that the present invention may be readily modified into certain other forms without altering the technical idea or essential characteristics of the present invention. Accordingly, the embodiments described above are to be understood as illustrative and not restrictive in all respects. For example, respective constituent elements that are described as being combined may be performed separately, and similarly, constituent elements that are described as being performed separately may be performed together.

[00253] Объем данного изобретения представлен прилагаемой формулой изобретения, и все модифицированные или измененные формы, полученные из значения и объема формулы изобретения и эквивалентных ей концепций, должны интерпретироваться как входящие в объем данного изобретения.[00253] The scope of this invention is represented by the appended claims, and all modified or altered forms derived from the meaning and scope of the claims and equivalent concepts are to be interpreted as being within the scope of this invention.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ SEQUENCE LIST

SEQ ID NO.SEQID NO. ПоследовательностьSubsequence 1. 1. tctcggcatggacgagctgtatctcggcatggacgagctgta 2. 2. tggaacccattcctgaaattatggaacccattcctgaaatta 3. 3. ggaacccattcctgaaattatggaacccattcctgaaattat 4. 4. gaacccattcctgaaattattgaacccattcctgaaattatt 5. 5. acccattcctgaaattatttaacccattcctgaaattattta 6. 6. cccattcctgaaattatttaacccattcctgaaattatttaa 7. 7. ccttccctgtggttctattatccttccctgtggttctattat 8. 8. cttccctgtggttctattatacttccctgtggttctattata 9. 9. ttccctgtggttctattatatttccctgtggttctattatat 10. 10. tccctgtggttctattatatttccctgtggttctattatatt 11. eleven. ccctgtggttctattatattaccctgtggttctattatatta 12. 12. cctgtggttctattatattatcctgtggttctattatattat 13. 13. gatgaaagggatgtgaattatgatgaaagggatgtgaattat 14. 14. gggagcctccctgatataaatgggagcctccctgatataaat 15. 15. ggaattcgctcagaagaaaggaattcgctcagaagaaa 16. 16. ggaccaaactgaagctatattggaccaaactgaagctatatt 17. 17. agaactttggtttcctttaatagaactttggttttcctttaat 18. 18. atgaaagggatgtgaattattatgaaagggatgtgaattatt 19. 19. tcttatcttcggcgctttaattcttatcttcggcgctttaat 20. 20. cttatcttcggcgctttaattcttatcttcggcgctttaatt 21. 21. ttatcttcggcgctttaatttttatcttcggcgctttaattt 22. 22. gaggagcccaatgagtattatgaggagcccaatgagtattat 23. 23. aggagcccaatgagtattattaggagcccaatgagtattatt 24. 24. atagatccaaccaccttatttatagatccaaccacctttttt 25. 25. atgtcattgcctctgtatttaatgtcattgcctctgtattta 26. 26. tgtcattgcctctgtatttaatgtcattgcctctgtatttaa 27. 27. accaccatgcccagctaatttaccaccatgcccagctaattt 28. 28. tgttgagatttaggcttattttgttgagatttaggcttattt 29. 29. gaccaaactgaagctatatttgaccaaactgaagctatattt 30. thirty. aggccttcagcaatctatattaggccttcagcaatctatatt 31. 31. ggccttcagcaatctatattaggccttcagcaatctatatta 32. 32. gagtggtccctaaacttaaatgagtggtccctaaacttaaat 33. 33. agtggtccctaaacttaaattagtggtccctaaacttaaatt 34. 34. gtggtccctaaacttaaatttgtggtccctaaacttaaattt 35. 35. ctaacacaaatatccacatctaacacaaatatccacat 36. 36. tcagcagcccagtccaaataatcagcagcccagtccaaataa 37. 37. cagcagcccagtccaaataaacagcagcccagtccaaataaa 38. 38. tcaacgtctccatcatgtatatcaacgtctccatcatgtata 39. 39. caacgtctccatcatgtataacaacgtctccatcatgtataa 40. 40. ctggagacaatggcgactttactggagacaatggcgacttta 41. 41. ctcagcagcccagtccaaatactcagcagcccagtccaaata 42. 42. agcagcccagtccaaataaacagcagcccagtccaaataaac 43. 43. gggatcaaagctatctatatagggatcaaagctatctatata 44. 44. ggatcaaagctatctatataaggatcaaagctatctatataa 45. 45. ggcaacggaacccagatttatggcaacggaacccagatttat 46. 46. tgaagaagagagtccatattttgaagaagagagtccatattt 47. 47. ttggatgcggaacccaaattattggatgcggaacccaaatta 48. 48. agcatcacttgggattaatatagcatcacttgggattaatat 49. 49. tgatgtgggtcaaggaattaatgatgtgggtcaaggaattaa 50. 50. agcgagggagaagactatattagcgaggggagaagactatatt 51. 51. tttacgtatgagacgtttatatttacgtatgagacgtttata 52. 52. gctcctgtatagtttacttccgctcctgtatagtttacttcc 53. 53. ggaaattaacctggttgatgcggaaattaacctggttgatgc 54. 54. gcaccaacagaatatgcatccgcaccaacagaatatgcatcc 55. 55. gctcaacaggatgtcaaataagctcaacaggatgtcaaataa 56. 56. gcatcttgctgttcttcttacgcatcttgctgttcttcttac 57. 57. gcatttgtggacaacttatgtgcatttgtggacaacttatgt 58. 58. ggaacgcgactaaacttaatcggaacgcgactaaacttaatc 59. 59. gatgttcaccataagccaagtgatgttcaccataagccaagt 60. 60. gcaagatgagtctgactatgggcaagatgagtctgactatgg 61. 61. ggcacagagaagaatgcaacaggcacagaagaagaatgcaaca 62. 62. gggaagagatgctaaatatacgggaagagatgctaaatatac 63. 63. gcaaatcagtgtaatccttgagcaaatcagtgtaatccttga 64. 64. gcaacttctccatcaccatgcgcaacttctccatcaccatgc 65. 65. gcaaagatgcaccatccaactgcaaagatgcaccatccaact 66. 66. gcggatggacagcaacattcagcggatggacagcaacattca 67. 67. ggacacttctgagtatgaagcggacacttctgagtatgaagc 68. 68. gggaaccacaatgcacgaaaggggaaccacaatgcacgaaag 69. 69. ggtgctttccaacacactttcggtgctttccaacacactttc 70. 70. gcttctggccatttgtaatgcgcttctggccatttgtaatgc 71. 71. gggagtacttctgcatctatcgggagtacttctgcatctatc 72. 72. gctgcatgactacttcaatgtgctgcatgactacttcaatgt 73. 73. taacgtggatcttgatcataataacgtggatcttgatcataa 74. 74. ggagacatacacaggccttcaggagacatacacaggccttca 75. 75. gcatttgggccttgatctaccgcatttgggccttgatctacc 76. 76. gacaggttgcaaggcagttctgacaggttgcaaggcagttct 77. 77. gggagtgcctcttcagttacagggagtgcctcttcagttaca 78. 78. ggacgaggaggttgacattaaggacgaggagggttgacattaa 79. 79. gaggagaaagaggaaggagaagaggagaaaggaaggagaa 80. 80. gcccttccttcaatagcactagcccttccttcaatagcacta 81. 81. ggttgactgcatttctagactggttgactgcatttctagact 82. 82. gcatttgctgaacgcatttacgcatttgctgaacgcatttac 83. 83. gctgcactaattgtctattgggctgcactaattgtctattgg 84. 84. ggatccagtcacctctgaacaggatccagtcacctctgaaca 85. 85. gcacatcctccaaatgaaagggcacatcctccaaatgaaagg 86. 86. ggattctcaacctgtggtttaggattctcaacctgtggttta 87. 87. ggtgcttggtctcctctataaggtgcttggtctcctctataa 88. 88. gcacagtactcctggcttatcgcacagtactcctggcttatc 89. 89. gcaacaggaccacagtcaagagcaacaggaccacagtcaaga 90. 90. gcaacaccaccctcagcataagcaacaccccctcagcataa 91. 91. gcctgttcagagcactcattcgcctgttcagagcactcattc 92. 92. gcagtaatgccttctcctattgcagtaatgccttctcctatt 93. 93. gcaccttggtgcttagctagagcaccttggtgcttagctaga 94. 94. gcttccatctatgaggaattggcttccatctatgaggaattg 95. 95. gccagagaaccagctataagtgccagagaaccagctataagt 96. 96. gggtccctgatgaatatctgggggtccctgatgaatatctgg 97. 97. ggcttgcagggaaagtgaatgggcttgcagggaaagtgaatg 98. 98. gcttgcagggaaagtgaatgggcttgcagggaaagtgaatgg 99. 99. agcttccatctatgaggaattagcttccatctatgaggaatt 100. 100. ggaatccagaacgaattaagtggaatccagaacgaattaagt 101. 101. ggctgattgatgggaacatccggctgattgatgggaacatcc 102. 102. ggactacagtcaagacaatcaggactacagtcaagacaatca 103. 103. ggaccctcactctattcaatgggaccctcactctattcaatg 104. 104. gctactggccgcaataattccgctactggccgcaataattcc 105. 105. gctctttgtatgacagaatacgctctttgtatgacagaatac 106. 106. ggtccaaggtcaccaataagaggtccaaggtcaccaataaga 107. 107. gcaaccatacgatagaaataggcaaccatacgatagaaaatag 108. 108. ggttctgaaatttcctcaacaggttctgaaatttcctcaaca 109. 109. gcaagatatccagctacatctgcaagatatccagctacatct 110. 110. gcaactcaccctcttccatctgcaactcaccctcttccatct 111. 111. gctgcattccctaagataattgctgcattccctaagataatt 112. 112. gggacagtagatccacatacagggacagtagatccacataca 113. 113. ggacaacagtcacaatgagcaggacaacagtcacaatgagca 114. 114. ggctgttgatgttctagagagggctgttgatgttctagagag 115. 115. gcagacaaggccacagtcaatgcagacaaggccacagtcaat 116. 116. ggaggtttctaaccagcatccggaggtttctaaccagcatcc 117. 117. gccttgagactgtgctatacagccttgagactgtgctataca 118. 118. ccaagcccagaatgactatggccaagcccagaatgactatgg 119. 119. gccttcttgttcttgccttgtgccttcttgttcttgccttgt 120. 120. gcttctgactgcagttcttctgcttctgactgcagttcttct 121. 121. gctggatgaaatatggtaaccgctggatgaaatatggtaacc 122. 122. ggaaatgagcctgctccaagtggaaatgagcctgctccaagt 123. 123. ggattggtctgaggaacaattggattggtctgaggaacaatt 124. 124. gccaagaagggaaggagtacagccaagaagggaaggagtaca 125. 125. gccaattccactaattgtttggccaattcactaattgtttg 126. 126. ggttctcatgaatctccaactggttctcatgaatctccaact 127. 127. gctggagtcatgacactaagtgctggagtcatgacactaagt 128. 128. gcctggtttggagatactaacgcctggtttggagatactaac 129. 129. ggaaccacctaaagaacttccggaaccacctaaagaacttcc 130. 130. ccgcgttgatttaaagaaagaccgcgttgatttaaagaaaga 131. 131. gcctgatacatatcagcatttgcctgatacatatcagcattt 132. 132. gcggaattggaatttcttagcgcggaattggaatttcttagc 133. 133. gcacgactacagaaatatagcgcacgactacagaaatatagc 134. 134. tttccggttaagttgcactcgtttccggttaagttgcactcg 135. 135. gcctggatctaattcagaaaggcctggatctaattcagaaag 136. 136. gaaagccactgttcggttaaagaaagccactgttcggttaaa 137. 137. tcctgtggatatctgtctaagtcctgtggatatctgtctaag 138. 138. ggctcatagaggctgtaatgtggctcatagaggctgtaatgt 139. 139. gggcttgtccgagttgatatggggcttgtccgagttgatatg 140. 140. aagatttggataccgcaaaaaaagatttggataccgcaaaaa 141. 141. gtggtactgaagcacctattagtggtactgaagcacctatta 142. 142. gcttgttcagagaacaattgcgcttgttcagagaacaattgc 143. 143. ggagattgttggtacccaaggggagattgttggtacccaagg 144. 144. gcagctaggcttacagcattggcagctaggcttacagcattg 145. 145. ggtcctttctgtgcactatgaggtcctttctgtgcactatga 146. 146. ggtggtagctaaagaacattcggtggtagctaaagaacattc 147. 147. ggacctgtctacaggtgatctggacctgtctacaggtgatct 148. 148. gccaaggtcattgcaggaatggccaaggtcattgcaggaatg 149. 149. gcagaacaagcccatgattgagcagaacaagcccatgattga 150. 150. cccaaggtcaaggagattattcccaaggtcaaggagattatt 151. 151. gcagaagtgccggaacattgagcagaagtgccgggaacattga 152. 152. gcgtcacacagaagcatatccgcgtcacacagaagcatatcc 153. 153. ccggctcttctttgagttctaccggctcttctttgagttcta 154. 154. cagaacgtcaccaactactttcagaacgtcaccaactacttt 155. 155. ccatgctaggttggaacaactccatgctaggttggaacaact 156. 156. ccaagtggcctgtctctttgaccaagtggcctgtctctttga 157. 157. ggtgtctatttgcggatcttcggtgtctatttgcggatcttc 158. 158. agaccttccgcaagatcattcagaccttccgcaagatcattc 159. 159. tccttagccatgagctcaaggtccttagccatgagctcaagg 160. 160. gaaagtactgtggacacatgtgaaagtactgtggacacatgt 161. 161. gcacgtgtccatcttcgagttgcacgtgtccatcttcgagtt 162. 162. ggccaacactcctcaagaactggccaacactcctcaagaact 163. 163. ggcttctacctctacccagatggcttctacctacccagat 164. 164. ggccatggactccacatttgaggccatggactccacatttga 165. 165. ggccgtgagtatctaccagttggccgtgagtatctaccagtt 166. 166. gccagaagacaagttagaattgccagaagacaagttagaatt 167. 167. gctctggaagttccagtatatgctctggaagttccagtatat 168. 168. ggaaatgatctggctcgatgcggaaatgatctggctcgatgc 169. 169. gcaaagatcctcaaggatttagcaaagatcctcaaggattta 170. 170. ggatgcctctattgctcatcgggatgcctctattgctcatcg 171. 171. gctatggtacttcgaatttgcgctatggtacttcgaatttgc 172. 172. ggaagggattccagcagaagtggaagggattccagcagaagt 173. 173. gcaaggagattgtggccatcagcaaggagattgtggccatca 174. 174. gggcatccttcaagaggaagtgggcatccttcaagaggaagt 175. 175. gcaaagatcatccagtctttcgcaaagatcatccagtctttc 176. 176. gctggagatgtaccgcaaagtgctggagatgtaccgcaaagt 177. 177. gcacaggatgagatttatatcgcacaggatgagatttatatc 178. 178. ggaagaccacatacaggaaacggaagaccacatacaggaaac 179. 179. gcattggtgtttcctgcatgagcattggtgtttcctgcatga 180. 180. gcacacggttgggtagattatgcacacggttgggtagattat 181. 181. gggtctgtaatggaaggaaatgggtctgtaatggaaggaaat 182. 182. gcatgttgcgagatgacatgagcatgttgcgagatgacatga 183. 183. gcagaccgagtctacacaagtgcagaccgagtctacacaagt 184. 184. gcaccatcatccacctcaagtgcaccatcatccacctcaagt 185. 185. ggtcacccacatcaaggtcatggtcacccacatcaaggtcat 186. 186. gggcaagaaccgctacaagaagggcaagaaccgctacaagaa 187. 187. ggaacaaatgcgtcccatactggaacaaatgcgtcccatact 188. 188. gcctggactgtgacattgacagcctggactgtgacattgaca 189. 189. gaacctgcacactaagaacaagaacctgcacactaagaacaa 190. 190. gcagatcctacctctgaaagggcagatcctacctctgaaagg 191. 191. gcaatgacggcaagtctaaaggcaatgacggcaagtctaaag 192. 192. ggaactgaaatacgacgttggggaactgaaatacgttgg 193. 193. gcgtgttaggaacgtcaaagagcgtgttaggaacgtcaaaga 194. 194. gctcatgactatacgctaagagctcatgactatacgctaaga 195. 195. ggagagaacggtctggcaataggagagaacggtctggcaata 196. 196. gcagctgaacgagaaccaagtgcagctgaacgagaaccaagt 197. 197. ggagactgtgactcttcttgtggagactgtgactctcttcttgt 198. 198. ggaatgccaacgtttggaaatggaatgccaacgtttggaaat 199. 199. ggatcgtttacaggaagttccggatcgttttacaggaagttcc 200. 200. gcctttgtatgtggaagtatagcctttgtatgtggaagtata 201. 201. gcctgctgtatttatagtaacgcctgctgtatttatagtaac 202. 202. gctgcacatcaaggagtaattgctgcacatcaaggagtaatt 203. 203. gctggaaatactctggttagagctggaaatactctggttaga 204. 204. ggagcttgttgaaagggatgaggagcttgttgaaagggatga 205. 205. gcagaatactggccgtcaatggcagaatactggccgtcaatg 206. 206. ggttatgttgtcaagctaaggggttatgttgtcaagctaagg 207. 207. gcagaacccaaggaattaatcgcagaacccaaggaattaatc 208. 208. ggtgtaacatcacaggcttacggtgtaacatcacaggcttac 209. 209. gccatagagttcaggacaaatgccatagagttcaggacaat 210. 210. gcaattctcgggtagaaataagcaattctcgggtagaaataa 211. 211. gctggcttcaccaacattaccgctggcttcaccaacattacc 212. 212. gggagcaaatcatctgcattcgggagcaaatcatctgcattc 213. 213. gcgactcaaatatcaccttgagcgactcaaatatcaccttga 214. 214. gctcctgaggtatggaatagagctcctgaggtatggaataga 215. 215. gcaaatgacacatatgaaagcgcaaatgacacatatgaaagc 216. 216. ggtctaaagaggagtgcatctggtctaaagaggagtgcatct 217. 217. gggctatttgaaacaggatccgggctatttgaaacaggatcc 218. 218. gctgtaggaatggaagcttcagctgtaggaatggaagcttca 219. 219. gcttgtgtttgctgctaatgtgcttgtgtttgctgctaatgt 220. 220. gttaacaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgcctgtggttctattatattatttcaagagaataatataatagaaccacaggtttttgactagtcaaaaaggaattcgctcagaagaaatctcttgaatttcttctgagcgaattccaaacaaggcttttctccaagggatatttatagtctcaaaacacacaattactttacagttagggtgagtttccttttgtgctgttttttaaaataataatttagtatttgtatctcttatagaaatccaagcctatcatgtaaaatgtagctagtattaaaaagaacagattatctgtcttttatcgcacattaagcctctatagttactaggaaatattatatgcaaattaaccggggcaggggagtagccgagcttctcccacaagtctgtgcgagggggccggcgcgggcctagagatggcggcgtcggatcgctagccatatgtctagagtatacgttaacaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgcctgtggttctattatattatttcaagagaataatataatagaaccacaggtttttgactagtcaaaaaggaattcgctcagaagaaatctcttgaatttcttctgagcgaattccaaacaaggcttttctccaagggatatttatagtctcaaaacacacaattactttacagttagggtgagtttccttttgtgctgttttttaaaataataatttagtatttgtatctcttatagaaatccaagcctatcatgtaaaatgtagctagtattaaaaagaacagattatctgtcttttatcgcacattaagcctctatagttactaggaaatattatatgcaaattaaccggggcaggggagtagccgagcttctcccacaagtctgtgcgagggggccggcgcgggcctagagatggcggcgtcggatcgctagccatatgtctagagtatac 221. 221. gttaaccaaaaacctgtggttctattatattattctcttgaaataatataatagaaccacaggcggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccattttaaaacataattttaaaactgcaaactacccaagaaattattactttctacgtcacgtattttgtactaatatctttgtgtttacagtcaaattaattctaattatctctctaacagccttgtatcgtatatgcaaatatgaaggaatcatgggaaataggccctcttcctgcccgaccttactagtgatccgacgccgccatctctaggcccgcgccggccccctcgcacagacttgtgggagaagctcggctactcccctgccccggttaatttgcatataatatttcctagtaactatagaggcttaatgtgcgataaaagacagataatctgttctttttaatactagctacattttacatgataggcttggatttctataagagatacaaatactaaattattattttaaaaaacagcacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagactataaatatcccttggagaaaagccttgtttggaattcgctcagaagaaattcaagagatttcttctgagcgaattcctttttggctagccatatgtctagagtatacgttaaccaaaaacctgtggttctattatattattctcttgaaataatataatagaaccacaggcggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccattttaaaacataattttaaaactgcaaactacccaagaaattattactttctacgtcacgtattttgtactaatatctttgtgtttacagtcaaattaattctaattatctctctaacagccttgtatcgtatatgcaaatatgaaggaatcatgggaaataggccctcttcctgcccgaccttactagtgatccgacgccgccatctctaggcccgcgccggccccctcgcacagacttgtgggagaagctcggctactcccctgccccggttaatttgcatataatatttcctagtaactatagaggcttaatgtgcgataaaagacagataatctgttctttttaatactagctacattttacatgataggcttggatttctataagagatacaaatactaaattattattttaaaaaacagcacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagactataaatatcccttggagaaaagccttgtttggaattcgctcagaagaaattcaagagatttcttctgagcgaattcctttttggctagccatatgtctagagtatac 222. 222. gttaacgatccgacgccgccatctctaggcccgcgccggccccctcgcacagacttgtgggagaagctcggctactcccctgccccggttaatttgcatataatatttcctagtaactatagaggcttaatgtgcgataaaagacagataatctgttctttttaatactagctacattttacatgataggcttggatttctataagagatacaaatactaaattattattttaaaaaacagcacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagactataaatatcccttggagaaaagccttgtttgnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnttcaagagannnnnnnnnnnnnnnnnnnnntttttggttaacgttaacgatccgacgccgccatctctaggcccgcgccggccccctcgcacagacttgtgggagaagctcggctactcccctgccccggttaatttgcatataatatttcctagtaactatagaggcttaatgtgcgataaaagacagataatctgttctttttaatactagctacattttacatgataggcttggatttctataagagatacaaatactaaattattattttaaaaaacagcacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagactataaatatcccttggagaaaagccttgtttgnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnttcaagagannnnnnnnnnnnnnnnnnnnntttttggttaac 223. 223. gttaacgatccgacgccgccatctctaggcccgcgccggccccctcgcacagacttgtgggagaagctcggctactcccctgccccggttaatttgcatataatatttcctagtaactatagaggcttaatgtgcgataaaagacagataatctgttctttttaatactagctacattttacatgataggcttggatttctataagagatacaaatactaaattattattttaaaaaacagcacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagactataaatatcccttggagaaaagccttgtttgcctgtggttctattatattatttcaagagaataatataatagaaccacaggtttttgactagtgctagccatatgtctagagtatacgttaacgatccgacgccgccatctctaggcccgcgccggccccctcgcacagacttgtgggagaagctcggctactcccctgccccggttaatttgcatataatatttcctagtaactatagaggcttaatgtgcgataaaagacagataatctgttctttttaatactagctacattttacatgataggcttggatttctataagagatacaaatactaaattattattttaaaaaacagcacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagactataaatatcccttggagaaaagccttgtttgcctgtggttctattatattatttcaagagaataatataatagaaccacaggtttttgactagtgctagccatatgtctagagtatac 224. 224. gttaacaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgcctgtggttctattatattatttcaagagaataatataatagaaccacaggtttttggttaacaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgcctgtggttctattatattatttcaagagaataatataatagaaccacaggtttttg 225. 225. QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEITTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEITTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 226. 226. MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRMALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 227. 227. MGAGATGRAMDGPRLLLLLLLGVSLGGAKEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDNLIPVYCSILAAVVVGLVAYIAFKRWGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRMGAGATGRAMDGPRLLLLLLLGVSLGGAKEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDNLIPVYCSILAAVVVGLVAYIAFKRWGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 228. 228. ggtatactctagacatatggctagcactagtcaaaaacctgtggttcggtatactctagacatatggctagcactagtcaaaaacctgtggttc 229. 229. ttgtaccgttaacgatccgacgccgcttgtaccgttaacgatccgacgccgc 230. 230. tgactagtcaaaaacctgtggttctattatattattctcttgaaataatataatagaaccacaggcggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaatgactagtcaaaaacctgtggttctattatattattctcttgaaataatataatagaaccacaggcggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaa 231. 231. gtaccgttaacaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattcctgtaccgttaacaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattcct 232. 232. aggactagtcaaaaaggaattcgctcagaagaaatctctaggactagtcaaaaaggaattcgctcagaagaaatctct 233. 233. ctagctagcgatccgacgccgccatctctagctagcgatccgacgccgccatct 234. 234. atgttaaccaaaaacctgtggttctattatattattctcttgatgttaaccaaaaacctgtggttctattatattattctcttg 235. 235. tcactagtaaggtcgggcaggaagagggcctatttcactagtaaggtcgggcaggaaggggcctatt 236. 236. taggccctcactagtgatccgacgccgcctaggccctcactagtgatccgacgccgcc 237. 237. ctagctagccaaaaaggaattcgctcagaagaaatctcctagctagccaaaaaggaattcgctcagaagaaatctc 238. 238. gcttctggccatttgtaatgc gcttctggccatttgtaatgc 239. 239. gggagtacttctgcatctatc gggagtacttctgcatctatc 240. 240. gctgcatgactacttcaatgt gctgcatgactacttcaatgt 241. 241. taacgtggatcttgatcataa taacgtggatcttgatcataa 242. 242. ggagacatacacaggccttca ggagacatacacaggccttca 243. 243. gcatttgggccttgatctacc gcatttgggccttgatctacc 244. 244. ccagctttccagctttcctctccagctttccagctttcctct 245. 245. gatctcagccttctgcgaaga gatctcagccttctgcgaaga 246. 246. gcttcaacgtctccatcatgtgcttcaacgtctccatcatgt 247. 247. ggtctttcctcactgccaagt ggtctttcctcactgccaagt 248. 248. ctggagacaatggcgactttactggagacaatggcgacttta 249. 249. gccactgtcacattggcaatc gccactgtcacattggcaatc 250. 250. tccagtatctggacaagaacg tccagtatctggacaagaacg 251. 251. gcagcagtgtacttcacagaggcagcagtgtacttcacagag 252. 252. gctgtttctcatccttggtgt gctgtttctcatccttggtgt 253. 253. gcctttggctttcacctttgg gcctttggctttcaccttttgg 254. 254. tcagcagcccagtccaaataatcagcagcccagtccaaataa 255. 255. ggtggagctcatgtacccacc ggtggagctcatgtacccacc 256. 256. cccaaattacgtgtactacaa cccaaattacgtgtactacaa 257. 257. gcatcacttgggattaatatg gcatcacttgggattaatatg 258. 258. gcgagggagaagactatattg gcgagggagaagactatattg 259. 259. gccagtgatgctaaaggttgt gccagtgatgctaaaggttgt 260. 260. ggtggtatctgagttgacttg ggtggtatctgagttgacttg 261. 261. gatgaaagggatgtgaattatgatgaaagggatgtgaattat 262. 262. gggagcctccctgatataaatgggagcctccctgatataaat 263. 263. ggaattcgctcagaagaaaggaattcgctcagaagaaa 264. 264. ggaccaaactgaagctatattggaccaaactgaagctatatt 265. 265. cctgtggttctattatattatcctgtggttctattatattat 266. 266. gcctagagaagtttcagggaagcctagagaagtttcagggaa 267. 267. cattgtctttcctagcggaatcattgtctttcctagcggaat 268. 268. gattaagtccctgccctttggattaagtccctgccctttg 269. 269. gttcacctacggaaaccttggttcacctacggaaaccttg 270. 270. cctccacctttacacatgcccctccacctttacacatgcc 271. 271. cttactgcctcagcttccctcttactgcctcagcttccct 272. 272. ccaagaaggccacagaactgaccaagaaggccacagaactga 273. 273. gttgtttcagatccctttagttccaggttgtttcagatccctttagttccag 274. 274. actttgaacagcctcacagagactttgaacagcctcacagag 275. 275. ccgagttgaccgtaacagacatccgagttgaccgtaacagacat 276. 276. caaccgatccacctcaccttcaaccgatccacctcacctt 277. 277. ggcactttgcctcccagatggcactttgcctcccagat 278. 278. cacaagctctgccactcggaacacaagctctgccactcggaa 279. 279. tgcagtgacctggaaggctctgcagtgacctggaaggctc 280. 280. ctacctgggcataggcaacgctacctgggcataggcaacg 281. 281. ccccgaactaactgctgcaaccccgaactaactgctgcaa 282. 282. gaaacagcacattcccagagttcgaaacagcacattcccagagttc 283. 283. atggcccagcggatgagatggcccagcggatgag 284. 284. cccagcatctgcaaagctccccagcatctgcaaagctc 285. 285. gtccttgcggaagtcaatgtgtccttgcggaagtcaatgt 286. 286. acatgattcagccacagataccacatgattcagccacagatacc 287. 287. gcatagatgtcagcacgtttggcatagatgtcagcacgtttg 288. 288. acgtgttgagagatcgaggacgtgttgagagatcgagg 289. 289. cccagcactcagtcaacgtccccagcactcagtcaacgtc

ПРИМЕРЫEXAMPLES

[00254] Примеры, относящиеся к данному изобретению, описаны ниже. В большинстве случаев могут быть использованы альтернативные методы. Примеры предназначены для иллюстрации и не являются ограничивающими объем изобретения. [00254] Examples related to this invention are described below. In most cases, alternative methods can be used. The examples are intended to be illustrative and do not limit the scope of the invention.

Общие способыGeneral methods

[00255] Клеточные линии и культура. Клеточные линии Nalm-6, Nalm-6GL (экспрессирующие GFP и люциферазу светлячка), K562, K562-CD19, IM-9, Raji, Daudi культивировали в RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки и 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина в инкубаторе с увлажнением с 5% CO2 при 37 °C. Клеточную линию Lenti-X™ 293T приобретали у Takara и культивировали в DMEM с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глютамина, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия и 1% пенициллина/стрептомицина. Для получения линий D19+ PD-L1+ клеток, клетки K562-CD19 или NALM-6-GL трансдуцировали лентивирусом, кодирующим человеческий PD-L1 (NM_014143.3). Линию клеток Nalm-6-PDL1-CD80 получали путем трансдукции клеток Nalm-6-PDL1 лентивирусом, кодирующим CD80 человека (NM_005191.3). [00255] Cell lines and culture. Cell lines Nalm-6, Nalm-6GL (expressing GFP and firefly luciferase), K562, K562-CD19, IM-9, Raji, Daudi were cultured in RPMI-1640 supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum and 2 mM L-glutamine and 1% penicillin /streptomycin in a humidified incubator with 5% CO 2 at 37 °C. The Lenti-X™ 293T cell line was purchased from Takara and cultured in DMEM supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, and 1% penicillin /streptomycin . To obtain D19 + PD-L1 + cell lines, K562-CD19 or NALM-6-GL cells were transduced with a lentivirus encoding human PD-L1 (NM_014143.3). The Nalm-6-PDL1-CD80 cell line was obtained by transducing Nalm-6-PDL1 cells with a lentivirus encoding human CD80 (NM_005191.3).

[00256] Плазмидный конструкт. Конструирование вектора pLV-CD19-BBz, содержащего анти-CD19 scFv (FMC63), шарнирную и трансмембранную области CD8α и цитоплазматические домены 4-1BB (CD137) и CD3ζ, было описано ранее (PNAS, 2016, Ma JSY). Для получения pLV-CD19-28z цитоплазматический домен 4-1BB заменяли на последовательность костимулирующего домена CD28 человека. Для обнаружения и очистки трансдуцированных CAR-T-клеток последовательность δLNGFR (CD271 с усеченным цитоплазматическим доменом) амплифицировали из вектора pMACS-δLNGFR (Milteny Biotec) и вставляли перед CAR-трансгеном через последовательность P2A, чтобы получить pLV-δLNGFR-CD19-28z или pLV-δLNGFR-CD19-BBz. [00256] Plasmid construct. Construction of the pLV-CD19-BBz vector containing anti-CD19 scFv (FMC63), CD8α hinge and transmembrane regions, and 4-1BB (CD137) and CD3ζ cytoplasmic domains has been described previously (PNAS, 2016, Ma JSY). To obtain pLV-CD19-28z, the 4-1BB cytoplasmic domain was replaced with a human CD28 co-stimulatory domain sequence. To detect and purify transduced CAR-T cells, the δLNGFR sequence (CD271 with a truncated cytoplasmic domain) was amplified from the pMACS-δLNGFR vector (Milteny Biotec) and inserted upstream of the CAR transgene via the P2A sequence to give pLV-δLNGFR-CD19-28z or pLV -δLNGFR-CD19-BBz.

[00257] Для генерации лентивирусных (LV) векторов «два в одном», которые кодируют как кассеты экспрессии CAR, так и кшРНК, синтезировали экспрессирующую кшРНК кассету, содержащую кшРНК (линкерная последовательность; TTCAAGAGA, последовательность терминации; TTTTT) и промоторы Pol (mU6, hU6 или hH1), и субклонировали в CAR-кодирующие лентивирусные векторы в область, расположенную выше против хода транскрипции от центрального полипуринового тракта (cPPT). Для получения двойных векторов «два в одном», экспрессирующих две кшРНК разными промоторами (mU6 и hU6), последовательность MCS BstZ171-Xba1-Nde1-Bmt1-Spe1 была вставлена в вектор pLV-hU6-shPD-1_δLNGFR-CD19-BBz далее по ходу транскрипции от промотора hU6. Фрагменты второй кассеты mU6-shRNA субклонировали в MCS. [00257] To generate two-in-one lentiviral (LV) vectors that encode both CAR and shRNA expression cassettes, a shRNA expression cassette was synthesized containing shRNA (linker sequence; TTCAAGAGA, termination sequence; TTTTT) and Pol (mU6 , hU6 or hH1) and subcloned into CAR-coding lentiviral vectors upstream of the central polypurine tract (cPPT). To generate two-in-one dual vectors expressing two shRNAs with different promoters (mU6 and hU6), the BstZ171-Xba1-Nde1-Bmt1-Spe1 MCS sequence was inserted into the pLV-hU6-shPD-1_δLNGFR-CD19-BBz vector downstream. transcription from the hU6 promoter. Fragments of the second mU6-shRNA cassette were subcloned into MCS.

[00258] Для создания репортерных векторов последовательность NFAT RE x3, полученную из репортера pGL2_NFAT-Luc (addgene № 10959), амплифицируют с помощью ПЦР. NF-kB-RE 5x (5'-GGGAATTTCC-3') и последовательность miniP были синтезированы (IDT Technologies). Промотор EF-1a вектора pLV-eGFP был заменен этими репортерными фрагментами для получения репортерных векторов pLV-NFAT-RE 3x-eGFP или pLV-NF-kB-RE 5x-eGFP. [00258] To generate reporter vectors, the x3 NFAT RE sequence derived from the pGL2_NFAT-Luc reporter (addgene #10959) is amplified by PCR. NF-kB-RE 5x (5'-GGGAATTTCC-3') and miniP sequence were synthesized (IDT Technologies). The EF-1a promoter of the pLV-eGFP vector was replaced with these reporter fragments to generate reporter vectors pLV-NFAT-RE 3x-eGFP or pLV-NF-kB-RE 5x-eGFP.

[00259] Выбор последовательностей миРНК или кшРНК. Последовательности-кандидаты 21-мерных киРНК, которые специфичны для ингибирующих контрольных иммунных точек (CTLA-4, LAG-3, TIGIT и TIM-3), были разработаны с использованием программ BLOCK-iT™ RNAi Designer или Sfold перед синтезом. РНК-олигомеры. киРНК, нацеленные на CTLA-4, были выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 255-260. киРНК, нацеленные на LAG-3, были выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 244-254. киРНК, нацеленные на TIGIT, были выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 238-243. киРНК, нацеленные на TIM-3, были выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 261-264) (IDT Technologies). Для анализа кинетики экспрессии иммунных контрольных точек МКПК стимулировали активатором Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Thermofisher) или 4 мкг/мл антитела против CD3 и 2 мкг/мл антитела против CD28 в присутствии человеческого рекомбинантного ИЛ-2. Уровни экспрессии иммунных контрольных точек анализировали в течение 12 суток (3 сутки, 6 сутки и 12 сутки). Для выбора оптимальных последовательностей киРНК через 2 суток после стимуляции МКПК электропорировали олигомерами киРНК с использованием Neon® Transfection System (Thermofisher). Эффективность нокдауна киРНК измеряли через 2 суток после трансфекции при помощи проточной цитометрии. 2-3 последовательности киРНК были отобраны для каждой иммунной контрольной точки на основе их эффективности и были преобразованы в формат киРНК для генерации двойных лентивирусных векторов «два в одном». Для подтверждения эффективности нокдауна, опосредованного кшРНК, трансдуцированные лентивирусом Т-клетки стимулировали γ-облученными клетками K562-CD19 в соотношении 1:1 в течение 3 суток и анализировали на уровни экспрессии иммунных контрольных точек при помощи проточной цитометрии.[00259] Selection of siRNA or shRNA sequences. Candidate 21-mer siRNA sequences that are specific for inhibitory immune checkpoints (CTLA-4, LAG-3, TIGIT and TIM-3) were designed using the BLOCK-iT™ RNAi Designer or Sfold software prior to synthesis. RNA oligomers. siRNAs targeting CTLA-4 were selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 255-260. siRNAs targeting LAG-3 were selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 244-254. siRNAs targeting TIGIT were selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 238-243. siRNAs targeting TIM-3 were selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 261-264) (IDT Technologies). To analyze the kinetics of immune checkpoint expression, PBMCs were stimulated with Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 activator (Thermofisher) or 4 µg/ml anti-CD3 antibody and 2 µg/ml anti-CD28 antibody in the presence of human recombinant IL-2. Expression levels of immune checkpoints were analyzed for 12 days (day 3, day 6 and day 12). To select the optimal siRNA sequences, 2 days after stimulation, PBMCs were electroporated with siRNA oligomers using the Neon® Transfection System (Thermofisher). The efficiency of siRNA knockdown was measured 2 days after transfection using flow cytometry. 2-3 siRNA sequences were selected for each immune checkpoint based on their potency and were converted to siRNA format to generate two-in-one double lentiviral vectors. To confirm the efficacy of shRNA-mediated knockdown, lentivirus-transduced T cells were stimulated with γ-irradiated K562-CD19 cells at a 1:1 ratio for 3 days and analyzed for immune checkpoint expression levels by flow cytometry.

[00260] Проточная цитометрия. Уровень экспрессии анти-CD19 CAR анализировали с помощью AF647-конъюгированного антитела против мышиного F(ab') (115-606-072, Jackson ImmunoResearch) или биотин-конъюгированного rhCD19-Fc (CD9-H5259, ACRO Biosystems) в комбинации с AF647-конъюгированным стрептавидином (405237, Biolegend). Экспрессию δLNGFR анализировали с помощью АРС- или FITC- конъюгированного антитела против CD271 (ME20.4-1.H4; Mitenyi Biotec). Экспрессию иммунных контрольных точек в CAR-T-клетках измеряли при помощи обычной проточной цитометрии с использованием следующих антител: PD-1 (PE, клон J105; Thermofisher), TIM-3 (PE, клон 344823; R&D systems), LAG-3 (PE, клон 7H2C65; Biolgend), TIGIT (PE, клон MBSA43; Thermofisher). [00260] Flow cytometry. Anti-CD19 CAR expression level was analyzed using AF647-conjugated anti-mouse F(ab') antibody (115-606-072, Jackson ImmunoResearch) or biotin-conjugated rhCD19-Fc (CD9-H5259, ACRO Biosystems) in combination with AF647- conjugated streptavidin (405237, Biolegend). δLNGFR expression was analyzed with an APC or FITC conjugated anti-CD271 antibody (ME20.4-1.H4; Mitenyi Biotec) . Immune checkpoint expression in CAR-T cells was measured by conventional flow cytometry using the following antibodies: PD-1 (PE, clone J105; Thermofisher), TIM-3 (PE, clone 344823; R&D systems), LAG-3 ( PE, clone 7H2C65; Biolgend), TIGIT (PE, clone MBSA43; Thermofisher).

[00261] Экспрессию CTLA-4 на CAR-T-клетках анализировали с помощью проточной цитометрии с внутриклеточным окрашиванием после инкубации с облученными клетками NALM-6 или K562-CD19 в соотношении E: T 1:1 в течение 3 суток. Клетки фиксировали/пермеабилизировали раствором Cytofix/Cytoperm™ (BD Bioscience) с последующим окрашиванием антителом против человеческого CD152 (CTLA-4) (PE, клон BNI3; Biolegend). [00261] Expression of CTLA-4 on CAR-T cells was analyzed by flow cytometry with intracellular staining after incubation with irradiated NALM-6 or K562-CD19 cells at a ratio of E:T 1:1 for 3 days. Cells were fixed/permeabilized with Cytofix/Cytoperm™ solution (BD Bioscience) followed by staining with anti-human CD152 antibody (CTLA-4) (PE, clone BNI3; Biolegend).

[00262] Экспрессию стимулирующих или лигандов ингибирующих иммунных контрольных точек на опухолевых клетках анализировали с использованием следующих антител: CD80 (PE, клон 2D10; Biolgend), CD86 (BV421, клон 2331 (FUN-1); BD Bioscience), PD-L1 (APC, клон 29E.2A3; Biolgend), HLA-DR (PE, клон L243; Biolgend), CD112 (PE, клон TX31; Biolgend), CD155 (PE, клон SKⅡ.4; Biolgend). [00262] Expression of stimulatory or inhibitory immune checkpoint ligands on tumor cells was analyzed using the following antibodies: CD80 (PE, clone 2D10; Biolgend), CD86 (BV421, clone 2331 (FUN-1); BD Bioscience), PD-L1 ( APC, clone 29E.2A3; Biolgend), HLA-DR (PE, clone L243; Biolgend), CD112 (PE, clone TX31; Biolgend), CD155 (PE, clone SKⅡ.4; Biolgend).

[00263] Для анализа влияния ТФР-β на экспрессию PD-1 CAR-T-клетки стимулировали облученными клетками NALM-6 в течение 3 суток в присутствии 10 нг/мл рекомбинантного человеческого ТФР-β1 (R & D systems) до измерения экспрессии PD-1 при помощи проточной цитометрии. [00263] To analyze the effect of TGF-β on PD-1 expression, CAR-T cells were stimulated with irradiated NALM-6 cells for 3 days in the presence of 10 ng/ml recombinant human TGF-β1 (R & D systems) to measure PD expression -1 by flow cytometry.

[00264] Анализ статуса фосфорилирования SMAD2/3 при помощи проточной цитометрии с внутриклеточным окрашиванием. Для определения статуса фосфорилирования SMAD2/3, CAR-T-клетки инкубировали с клетками NALM-6 в соотношении клеток E: T 1:1 в течение 4 часов или 24 часов. Клетки фиксировали с помощью Lyse/Fix Buffer (BD Bioscience) с последующей пермеабилизацией с помощью Perm Buffer® (BD Bioscience). Статус фосфорилирования на LNGFR+CAR-T-клетках определяли с помощью антитела против человеческого Smad2(pS465/pS467)/Smad3 (pS423/pS425) (PE, клон O72-670; BD Bioscience). [00264] Analysis of SMAD2/3 phosphorylation status by flow cytometry with intracellular staining. To determine the phosphorylation status of SMAD2/3, CAR-T cells were incubated with NALM-6 cells at a ratio of E:T cells of 1:1 for 4 hours or 24 hours. Cells were fixed with Lyse/Fix Buffer (BD Bioscience) followed by permeabilization with Perm Buffer® (BD Bioscience). Phosphorylation status on LNGFR + CAR-T cells was determined with an anti-human Smad2(pS465/pS467)/Smad3 (pS423/pS425) antibody (PE, clone O72-670; BD Bioscience).

[00265] Обнаружение индуцированных регуляторных Т-клеток. Индукцию регуляторных Т-клеток (CD4+CD25+FOXP3+), полученных из CAR-T-клеток, анализировали путем внутриклеточного окрашивания после совместного культивирования с клетками NALM-6 в течение 3 суток. Клетки, которые были зафиксированы и пермеабилизированы, с помощью буфера для окрашивания Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer (Thermofisher) были окрашены следующими антителами: анти-CD4 (BV605, клон OKT4; Biolgend), анти-CD25 (FITC, клон VT-072; Biolgend) и анти-FOXP3 (APC, клон 236A/E7; Thermofisher).[00265] Detection of induced regulatory T cells. The induction of regulatory T cells (CD4 + CD25 + FOXP3 + ) derived from CAR-T cells was analyzed by intracellular staining after co-culture with NALM-6 cells for 3 days. Cells that were fixed and permeabilized with Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer (Thermofisher) were stained with the following antibodies: anti-CD4 (BV605, clone OKT4; Biolgend), anti-CD25 (FITC, clone VT-072; Biolgend) and anti-FOXP3 (APC, clone 236A/E7; Thermofisher).

[00266] Анализ пролиферации CAR-T. CAR-T-клетки, экспрессирующие поверхностный маркер δLNGFR, сортировали при помощи магнитных гранул (Miltenyi Biotec). LNGFR+CAR-T-клетки (1 × 106; > 95% чистоты) стимулировали γ-облученными клетками K562-CD19-PDL1 (1 × 106) каждые 6 суток в отсутствие цитокинов. Кратность экспансии CAR-T-клеток рассчитывали путем подсчета клеток на 6, 12 и 18 сутки при помощи способа вытеснения трипанового синего.[00266] CAR-T proliferation assay. CAR-T cells expressing the δLNGFR surface marker were sorted using magnetic beads (Miltenyi Biotec). LNGFR + CAR-T cells (1 x 10 6 ; >95% pure) were stimulated with γ-irradiated K562-CD19-PDL1 cells (1 x 10 6 ) every 6 days in the absence of cytokines. The fold expansion of CAR-T cells was calculated by counting cells on days 6, 12 and 18 using the trypan blue displacement method.

[00267] In vitro цитотоксичность CAR-T-клеток. Цитотоксичность CAR-T-клеток определяли с использованием системы прижизненного клеточного анализа Incucyte S3. Целевые клетки NALM-6 или NALM-6-PDL1, которые конститутивно экспрессируют GFP, высевали в 96-луночный планшет с плотностью 1 × 105 клеток на лунку в трех повторностях. LNGFR+CAR-T-клетки добавляли в каждую лунку в соотношении E: T 1:1, 0,3:1, 0,1:1. Изменение интенсивности GFP в каждой лунке в режиме реального времени регистрировали каждые 2 часа в виде интегральной интенсивности зеленого объекта (средняя арифметическая интенсивность GFP х мкм2/лунки). Процент относительной интегрированной интенсивности зеленого объекта рассчитывали по следующей формуле: (общая интегрированная интенсивность GFP в каждой временной точке/общая интегрированная интенсивность GFP в начальной временной точке)*100.[00267] In vitro cytotoxicity of CAR-T cells. The cytotoxicity of CAR-T cells was determined using the Incucyte S3 in vivo cell assay system. Target NALM-6 or NALM-6-PDL1 cells that constitutively express GFP were seeded in a 96-well plate at a density of 1 x 10 5 cells per well in triplicate. LNGFR + CAR-T cells were added to each well in an E:T ratio of 1:1, 0.3:1, 0.1:1. The change in GFP intensity in each well in real time was recorded every 2 hours as the integrated intensity of the green object (arithmetic mean intensity of GFP x μm 2 /well). The percentage of relative integrated intensity of the green object was calculated by the following formula: (total integrated GFP intensity at each time point/total integrated GFP intensity at the starting time point)*100.

[00268] Репортерный анализ NFAT и NF-κB. Для определения специфической активности фактора транскрипции NFAT в CAR-T-клетках, МКПК, которые стимулировали 4 мкг/мл анти-CD3 и 2 мкг/мл антителами против CD28 в присутствии человеческого рекомбинантного ИЛ-2 (300 МЕ/мл) в течение 2 суток, сначала трансдуцировали лентивирусом, кодирующим репортерный ген NFAT-RE x3-eGFP. Через восемь суток после трансдукции все клетки повторно стимулировали антителом против CD3 и против CD28 в присутствии человеческого рекомбинантного ИЛ-2 (300 МЕ/мл) в течение 2 суток. Активированные клетки разделяли на две отдельные лунки и трансдуцировали различным CAR-кодирующим лентивирусом (CD19-28z или CD19-BBz). Через 6 суток все клетки в каждой лунке совместно инкубировали с клетками NALM-6 в соотношении 1:1. Репортерную активность NFAT в CAR-T-клетках определяли по значению гСИФ сигнала eGFP в LNGFR+ CAR-T популяциях (20-25% от общего числа CD3+ клеток) в 24- и 48-часовой момент времени. Удельную активность фактора транскрипции NF-κB в CAR-T-клетках измеряли по аналогичной процедуре, но с использованием лентивируса, кодирующего репортерный ген NNF-κB-RE x5-eGFP.[00268] NFAT and NF-κ B Reporter Assay. To determine the specific activity of the transcription factor NFAT in CAR-T cells, PBMCs stimulated with 4 μg/ml anti-CD3 and 2 μg/ml anti-CD28 antibodies in the presence of human recombinant IL -2 (300 IU/ml) for 2 days, first transduced with lentivirus encoding the NFAT-RE x3-eGFP reporter gene. Eight days after transduction, all cells were restimulated with anti-CD3 and anti-CD28 antibody in the presence of human recombinant IL-2 (300 IU/ml) for 2 days. Activated cells were split into two separate wells and transduced with different CAR encoding lentivirus (CD19-28z or CD19-BBz). After 6 days, all cells in each well were co-incubated with NALM-6 cells at a ratio of 1:1. The reporter activity of NFAT in CAR-T cells was determined by the value of the gSIF signal of eGFP in LNGFR + CAR-T populations (20-25% of the total number of CD3+ cells) at the 24- and 48-hour time points. The specific activity of the transcription factor NF-κB in CAR-T cells was measured by a similar procedure, but using a lentivirus encoding the NNF-κB-RE x5-eGFP reporter gene.

[00269] Количественная ПЦР в реальном времени. 3 × 106 LNGFR+ G28z или GBBz CAR-T-клетки совместно культивировали с CD19+ целевыми клетками NALM-6 в соотношении 1:1. После 4 и 48 часов совместного культивирования LNGFR+CAR-T-клетки сортировали с использованием сортера MoFlo Astrios (Beckman Coulter). мРНК из LNGFR+ CAR-T-клеток выделяли с помощью набора RNeasy mini kit (Qiagen) и обратно транскрибировали в кДНК с использованием набора QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). Количественную ПЦР в реальном времени проводили по протоколу SYBR с использованием системы обнаружения ПЦР в реальном времени CFX96 (Biorad) и мастер-микса для ПЦР в реальном времени SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO). Последовательности праймеров для обнаружения 18s рРНК содержат SEQ ID NO: 268 и 269. Последовательности праймеров для обнаружения PDCD1 содержат SEQ ID NO: 270 и 271. Последовательности праймеров для обнаружения ИЛ-2 содержат SEQ ID NO: 272 и 273. Последовательности праймеров для обнаружения ИЛ-4 содержат SEQ ID NO: 274 и 275. Последовательности праймеров для обнаружения ИЛ-17A содержат SEQ ID NO: 276 и 277. Последовательности праймеров для обнаружения CD25 содержат SEQ ID NO: 278 и 279. Последовательности праймеров для обнаружения CTLA4 содержат SEQ ID NO: 280 и 281. Последовательности праймеров для обнаружения FOXP3 содержат SEQ ID NO: 282 и 283. Последовательности праймеров для обнаружения ТФР-бета1 содержат SEQ ID NO: 284 и 285. Последовательности праймеров для обнаружения TGFBR1 содержат SEQ ID NO: 286 и 287. Последовательности праймеров для обнаружения TGFBR2 содержат SEQ ID NO: 288 и 289.[00269] Real time quantitative PCR. 3×10 6 LNGFR + G28z or GBBz CAR-T cells were co-cultured with CD19 + target NALM-6 cells in a 1:1 ratio. After 4 and 48 hours of co-culture, LNGFR + CAR-T cells were sorted using a MoFlo Astrios sorter (Beckman Coulter). mRNA from LNGFR + CAR-T cells was isolated using the RNeasy mini kit (Qiagen) and reverse transcribed into cDNA using the QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). Real-time quantitative PCR was performed according to the SYBR protocol using the CFX96 real-time PCR detection system (Biorad) and the SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO). Primer sequences for detecting 18s rRNA contain SEQ ID NOs: 268 and 269. Primer sequences for detecting PDCD1 contain SEQ ID NOs: 270 and 271. Primer sequences for detecting IL-2 contain SEQ ID NOs: 272 and 273. Primer sequences for detecting IL -4 contain SEQ ID NOs: 274 and 275. The primer sequences for detecting IL-17A contain SEQ ID NOs: 276 and 277. The primer sequences for detecting CD25 contain SEQ ID NOs: 278 and 279. The primer sequences for detecting CTLA4 contain SEQ ID NOs : 280 and 281. The primer sequences for detecting FOXP3 comprise SEQ ID NOs: 282 and 283. The primer sequences for detecting TGF-beta1 comprise SEQ ID NOs: 284 and 285. The primer sequences for detecting TBR1 comprise SEQ ID NOGF: 286 and 287. primers for TGFBR2 detection contain SEQ ID NOS: 288 and 289.

[00270] Количество целевой мРНК было нормализовано к эндогенной эталонной 18s рРНК: δCt (образец) = Ct (ген мишени) - Ct (18s рРНК). Сравнительный метод Ct был применен для анализа относительного кратного изменения целевой мРНК по сравнению с условием без стимуляции на основе следующего уравнения: 2-δδCt=2^-(δCt[стимулированный] - δCt[нестимулированный]). [00270] The amount of target mRNA was normalized to the endogenous reference 18s rRNA: δCt (sample) = Ct (target gene) - Ct (18s rRNA). The comparative Ct method was applied to analyze the relative fold change of the target mRNA compared to the no stimulation condition based on the following equation: 2 - δδCt =2^-(δCt[stimulated] - δCt[unstimulated]).

[00271] Эксперименты на животных. Все процедуры, описанные в данном документе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию при KAIST. Для получения CD19+ модели гемобластоза, мышам NSG (в возрасте от 4 до 6 недель) внутривенно инъецировали 1×106 CD19+ лейкозных клеток NALM-6, которые сконструированы для экспрессии EGFP-слитой люциферазы светлячка, а также человеческого PDL1 (клетки NALM6-GL-PDL1). CAR-T-клетки получали из образцов цельной крови здоровых доноров, следуя процедурам, описанным выше. На 4 сутки после трансдукции CAR-T-клетки сортировали и дополнительно размножали в течение 6 суток до инъекции мышам. Через пять суток после инъекции клеток NALM6-GL-PDL1 мышам внутривенно вводили 2,5 или 1 × 106 CAR-T-клеток. Биолюминесцентную визуализации NALM6-GL-PDL1 у мышей фиксировали с помощью Xenogen IVIS Spectrum, а сигналы количественно определяли как излучение в представляющей интерес области (фотон/с) с использованием программного обеспечения Living Image (Perkin Elmer). Для модели солидной опухоли мышам NSG подкожно инъецировали 5 × 106 клеток IM-9 (CD19+ PD-L1+CD155+). LNGFR+CAR-T-клетки вводят мышам внутривенно через 14 суток после инъекции опухолевых клеток (объем опухоли приблизительно 150-300 мм3). Опухоли контролировали каждую неделю путем измерения штангенциркулем, а объем оценивали как (длина × ширина2)/2. [00271] Animal experiments. All procedures described in this document have been approved by the KAIST Institutional Animal Care and Use Committee. To obtain a CD19 + model of hemoblastosis, NSG mice (4 to 6 weeks old) were intravenously injected with 1×10 6 CD19 + NALM-6 leukemic cells, which are engineered to express firefly EGFP-fused luciferase as well as human PDL1 (NALM6- GL-PDL1). CAR-T cells were obtained from whole blood samples from healthy donors following the procedures described above. On the 4th day after transduction, CAR - T cells were sorted and further propagated for 6 days prior to injection into mice. Five days after the injection of NALM6-GL-PDL1 cells, mice were intravenously injected with 2.5 or 1×10 6 CAR-T cells. Bioluminescent imaging of NALM6-GL-PDL1 in mice was captured using Xenogen IVIS Spectrum and signals were quantified as radiation in the region of interest (photon/s) using Living Image software (Perkin Elmer). For the solid tumor model, NSG mice were injected subcutaneously with 5×10 6 IM-9 cells (CD19 + PD-L1 + CD155 + ). LNGFR + CAR-T cells are administered intravenously to mice 14 days after tumor cell injection (tumor volume approximately 150-300 mm 3 ). Tumors were monitored every week by caliper measurement, and the volume was estimated as (length × width 2 )/2.

Пример 1. Способы получения и оценки векторов «два в одном», экспрессирующих CART19 и кшРНК, нацеленных на PD-1Example 1 Methods for Producing and Evaluating Two-in-One Vectors Expressing CART19 and shRNA Targeting PD-1

[00272] В этом примере описаны способы получения и оценки векторов «два в одном», экспрессирующих CART19, и кшРНК, ингибирующих экспрессию PD-1. [00272] This example describes methods for obtaining and evaluating two-in-one vectors expressing CART19 and shRNAs that inhibit PD-1 expression.

[00273] Для генерации лентивирусных векторов «два в одном», которые кодируют как кассеты экспрессии CAR, так и кшРНК, синтезировали экспрессирующие кшРНК кассеты, содержащие кшРНК (линкерная последовательность; TTCAAGAGA, последовательность терминации; TTTTT) и промоторы Pol (mU6, hU6 или hH1), и субклонировали в CAR-кодирующие лентивирусные векторы в область, расположенную выше против хода транскрипции от центрального полипуринового тракта (cPPT). Был сконструирован лентивирусный вектор, который спонтанно экспрессирует CART19 на основе 4-1BB с помощью промотора EF-1α и направленную на PD-1 кшРНК с помощью промотора mU6 (Фиг. 1A и 1B). [00273] To generate two-in-one lentiviral vectors that encode both CAR and shRNA expression cassettes, shRNA expression cassettes were synthesized containing shRNA (linker sequence; TTCAAGAGA, termination sequence; TTTTT) and Pol promoters (mU6, hU6 or hH1) and subcloned into CAR-coding lentiviral vectors upstream of the central polypurine tract (cPPT). A lentiviral vector was constructed that spontaneously expresses 4-1BB-based CART19 with the EF-1α promoter and PD-1-targeted shRNA with the mU6 promoter (FIGS. 1A and 1B).

[00274] Для отбора нацеленной на PD-1 кшРНК были использованы три кандидата кшРНК. shPD-1 № 1 продемонстрировал удивительно эффективное ингибирующее действие на экспрессию PD-1 (Фиг. 1F), не влияя на экспрессию CAR (Фиг. 1C), гомеостатическую экспансию (Фиг. 1D), статус дифференцировки и композицию CD4/CD8. (Фиг. 1F). Сообщалось, что уровень экспрессии кшРНК может быть различным в зависимости от типов промотора Pol III (Mol Ther., 2006, Irvin S.Y. Chen). Поэтому оценивали влияние промоторов mU6, hU6 или hH1 на экспрессию PD-1. mU6 и hu6 имели сходную эффективность KD, но у hH1 было меньше (Фиг. 2). [00274] Three shRNA candidates were used to select for PD-1 targeting . shPD-1 #1 showed a surprisingly effective inhibitory effect on PD-1 expression (FIG. 1F) without affecting CAR expression (FIG. 1C) , homeostatic expansion (FIG. 1D) , differentiation status, and CD4/CD8 composition. (Fig. 1F). It has been reported that the level of shRNA expression may be different depending on the Pol III promoter types ( Mol Ther ., 2006, Irvin SY Chen). Therefore, the effect of mU6, hU6 or hH1 promoters on PD-1 expression was evaluated. mU6 and hu6 had similar KD efficiency, but hH1 had less (FIG. 2).

[00275] Лентивирусные векторы «два в одном», полученные в соответствии с данным документом, продемонстрировали неожиданно эффективное ингибирование экспрессии PD-1, поэтому они могут быть использованы при получении модифицированных PD-1 KD CAR-T-клеток в следующем примере.[00275] Two-in-one lentiviral vectors prepared according to this document showed surprisingly effective inhibition of PD-1 expression, so they can be used in the production of PD-1 modified KD CAR-T cells in the following example.

Пример 2. Способы получения и оценки Example 2. Methods for obtaining and evaluating in vitro in vitro PD-1 KD CAR-T-клетокPD-1 KD CAR-T cells

[00276] В этом примере описаны способы получения и оценки in vitro модифицированных PD-1 KD CAR-T-клеток. [00276] This example describes methods for generating and evaluating in vitro modified PD-1 KD CAR-T cells.

[00277] Мононуклеарные клетки периферической крови отделяли от образцов цельной крови здоровых доноров методом центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Эти клетки стимулировали 4 мкг/мл связанного с планшетом антитела против CD3 (клон ОКТ3; клетка BioX) и 2 мкг/мл растворимого антитела против CD28 (клон CD28.2; клетка BioX) в присутствии 300 МЕ/мл человеческого рекомбинантного ИЛ-2 (BMIKOREA). Для получения рекомбинантного лентивируса 6×105 клеток 293T в 2,5 мл ростовой среды (DMEM с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 0,1 мМ заменимых аминокислот и 1 мМ пирувата натрия) высевали в 6-луночный планшет за 24 часа до этого для трансфекции. Клетки трансфицировали смесью упаковочных векторов (pMDL, pRev, pMDG.1) и вектора для переноса, используя 10 мкл Lipofectamine2000 (Thermofisher). Через двое суток после трансфекции культуральный супернатант, содержащий лентивирус, собирали и центрифугировали при 1800 об/мин в течение 5 минут. Активированные Т-клетки смешивали с вирусным супернатантом в присутствии протаминсульфата (1 мкг/мл), центрифугировали при 1000 × g в течение 90 минут и инкубировали в течение ночи при 37 °С. На следующие сутки культуральный супернатант аспирировали и заменяли свежей PRMI-1640 с добавлением 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия и 55 мкМ β-меркаптоэтанола. Трансдуцированные Т-клетки культивировали при плотности ниже 1 × 106 клеток/мл в RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной нагреванием FBS и 2 мМ L-глутамина и 1% пенициллин/стрептомицин, средах для культивирования Т-клеток, содержащих человеческий рекомбинантный ИЛ-2 (300 МЕ/мл), которые пополняли каждые 2-3 суток.[00277] Peripheral blood mononuclear cells were separated from healthy donor whole blood samples by Ficoll-Paque Plus density gradient centrifugation (GE Healthcare). These cells were stimulated with 4 μg/ml plate-bound anti-CD3 antibody (clone OKT3; BioX cell) and 2 μg/ml soluble anti-CD28 antibody (clone CD28.2; BioX cell) in the presence of 300 IU/ml human recombinant IL-2 ( BMIKOREA). To obtain recombinant lentivirus, 6×10 5 293T cells in 2.5 ml of growth medium (DMEM supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids and 1 mM sodium pyruvate) were seeded into a 6-well plate for 24 hours before for transfection. Cells were transfected with a mixture of packaging vectors (pMDL, pRev, pMDG.1) and transfer vector using 10 μl of Lipofectamine2000 (Thermofisher). Two days after transfection, the culture supernatant containing lentivirus was collected and centrifuged at 1800 rpm for 5 minutes. Activated T cells were mixed with viral supernatant in the presence of protamine sulfate (1 μg/ml), centrifuged at 1000 × g for 90 minutes, and incubated overnight at 37°C. The next day, the culture supernatant was aspirated and replaced with fresh PRMI-1640 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM non-essential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, and 55 μM β-mercaptoethanol. Transduced T cells were cultured at a density below 1 x 10 6 cells/ml in RPMI-1640 supplemented with 10% heat inactivated FBS and 2 mM L-glutamine and 1% penicillin/streptomycin, T cell culture media containing human recombinant IL -2 (300 IU/ml), which were replenished every 2-3 days.

[00278] Исследовали in vitro литическую и пролиферативную активность shPD-1 CAR-T-клеток. Nalm-6-PDL1 или K562-CD19-PDL1 использовали в качестве CD19+PDL1+ целевых клеток. Сначала была исследована длительная литическая активность с использованием системы визуализации в реальном времени IncuCyte. Когда CAR-T-клетки смешивали с клетками NALM-6, CAR-T-клетки ДТ (shGFP) и PD-1 KD CAR-T-клетки (shPD-1) имели сходную литическую активность. Однако CAR-T-клетки shPD-1 проявили удивительно более эффективную литическую активность, чем клетки shGFP CAR, когда CAR-T-клетки культивировали с клеткой NALM-6-PDL1 (Фиг. 3А). Было также обнаружено, что BBz CAR-T-клетки без кассеты кшРНК и shGFP CAR-T-клетки неожиданно сохраняют сходную цитотоксичность, что позволяет предположить, что сама экспрессия кшРНК мало влияет на активность CAR-T-клеток.[00278] The lytic and proliferative activity of shPD-1 CAR-T cells was studied in vitro . Nalm-6-PDL1 or K562-CD19-PDL1 was used as CD19 + PDL1 + target cells. First, long-term lytic activity was examined using the IncuCyte real-time imaging system. When CAR-T cells were mixed with NALM-6 cells, DT CAR-T cells ( shGFP ) and PD-1 KD CAR-T cells ( shPD-1 ) had similar lytic activity. However, shPD-1 CAR-T cells showed surprisingly more efficient lytic activity than shGFP CAR cells when CAR-T cells were cultured with NALM-6-PDL1 cell (FIG. 3A) . It was also found that shRNA cassette-less BBz CAR-T cells and shGFP CAR-T cells surprisingly retain similar cytotoxicity, suggesting that shRNA expression itself has little effect on CAR-T cell activity.

[00279] Затем оценивали пролиферативную активность CAR-T-клеток, многократно подвергавшихся воздействию антигена CD19 и PD-L1. shPD-1 CAR-T клетки достигли в 4-5 раз большей пролиферативной активности T-клеток против мишени K562-CD19-PDL1, чем shGFP CAR-T-клетки в отсутствие экзогенного ИЛ-2 (Фиг. 3B). Известно, что костимулирующие лиганды способствуют оптимальной экспансии Т-клеток и нередко экспрессируются в опухолевых клетках. Чтобы исследовать, влияет ли экспрессия костимулирующего лиганда в целевых клетках на пролиферацию клеток при повторной стимуляции, было исследовано, экспрессируется ли CD80, типичный костимулирующий лиганд, в целевых клетках. K562-CD19 экспрессировал CD80, но не Nalm-6 (Фиг. 3C). Было обнаружено, что CD80-сверхэкспрессирующий NALM-6-PDL1 (NALM-6-PDL1-CD80) позволяет CAR-T-клеткам пролиферировать при повторной стимуляции. CD80 может способствовать пролиферации CART при повторной стимуляции in vitro (Фиг. 3B). В совокупности было подтверждено, что разрушение внутриклеточной части PD-1 неожиданно эффективно способствует функциональному улучшению in vitro CD19-специфических CAR-T-клеток при повторной стимуляции CAR и PDL1. [00279] The proliferative activity of CAR-T cells repeatedly exposed to CD19 and PD-L1 antigen was then assessed. shPD-1 CAR-T cells achieved 4-5 times more T cell proliferative activity against the K562-CD19-PDL1 target than shGFP CAR-T cells in the absence of exogenous IL-2 (Figure 3B) . It is known that costimulatory ligands promote optimal expansion of T cells and are often expressed in tumor cells. To investigate whether expression of a costimulatory ligand in target cells affects cell proliferation upon restimulation, it was investigated whether CD80, a typical costimulatory ligand, is expressed in target cells. K562-CD19 expressed CD80 but not Nalm-6 (Fig. 3C) . CD80-overexpressing NALM-6-PDL1 (NALM-6-PDL1-CD80) has been found to allow CAR-T cells to proliferate upon repeated stimulation. CD80 can promote CART proliferation upon in vitro restimulation (Figure 3B) . Taken together, disruption of the intracellular portion of PD-1 was surprisingly effective in promoting in vitro functional improvement of CD19-specific CAR-T cells upon restimulation of CAR and PDL1.

[00280] В этом примере модифицированные PD-1 KD CAR-T-клетки, полученные с использованием векторов «два в одном», описанных в примере 1, продемонстрировали удивительный уровень усиления литической и пролиферативной активности in vitro по сравнению с CAR-T-клетками ДТ, таким образом, их терапевтический потенциал дополнительно оценивали на мышиных моделях in vivo, несущих CD19+PDL1+ опухоль крови, в приведенном ниже примере.[00280] In this example, PD-1 KD modified CAR-T cells generated using the two-in-one vectors described in Example 1 showed a surprising level of enhancement of lytic and proliferative activity in vitro compared to CAR-T cells. DTs, therefore, their therapeutic potential were further evaluated in in vivo mouse models carrying CD19 + PDL1 + blood tumor, in the example below.

Пример 3: Способы лечения CD19+ гемобластоза Example 3: Methods for the treatment of CD19+ hemoblastosis in vivoin vivo с использованием PD-1 KD CAR-T клеток using PD-1 KD CAR-T cells

[00281] В этом примере описаны способы лечения CD19+ гемобластоза in vivo с использованием PD-1 KD CAR-T-клеток. [00281] This example describes methods for treating CD19 + hemoblastosis in vivo using PD-1 KD CAR-T cells.

[00282] Для получения CD19+ модели гемобластоза, мышам NSG (в возрасте от 4 до 6 недель) внутривенно инъецировали 1×106 CD19+ лейкозных клеток NALM-6, которые сконструированы для экспрессии EGFP-слитой люциферазы светлячка, а также человеческого PDL1 (клетки NALM6-GL-PDL1). CAR-T-клетки получали из образцов цельной крови здоровых доноров, следуя процедурам, описанным выше. На 4 сутки после трансдукции CAR-T-клетки сортировали и дополнительно размножали в течение 6 суток до инъекции мышам. Через пять суток после инъекции клеток NALM6-GL-PDL1 мышам внутривенно вводили 1 × 106 CAR-T-клеток. Биолюминесцентную визуализацию NALM6-GL-PDL1 у мышей фиксировали с помощью Xenogen IVIS Spectrum, а сигналы количественно определяли как излучение в представляющей интерес области (фотон/с) с использованием программного обеспечения Living Image (Perkin Elmer). Мыши, получавшие лечение shPD-1 CAR-T-клетками, имели неожиданно равномерное снижение опухолевой нагрузки по сравнению с shGFP CAR-T-клетками (Фиг. 4). Кроме того, было обнаружено, что два типа промотора, экспрессирующего кшРНК, обладают сходным противоопухолевым эффектом, и сама экспрессия кшРНК неожиданно не влияет на противоопухолевый эффект. [00282] To obtain a CD19 + model of hemoblastosis, NSG mice (aged 4 to 6 weeks) were intravenously injected with 1×10 6 CD19 + NALM-6 leukemia cells, which are engineered to express firefly EGFP-fused luciferase as well as human PDL1 ( NALM6-GL-PDL1 cells). CAR-T cells were obtained from whole blood samples from healthy donors following the procedures described above. On the 4th day after transduction, CAR - T cells were sorted and further propagated for 6 days prior to injection into mice. Five days after the injection of NALM6-GL-PDL1 cells, mice were intravenously injected with 1 x 10 6 CAR-T cells. Bioluminescent imaging of NALM6-GL-PDL1 in mice was captured using Xenogen IVIS Spectrum and signals were quantified as radiation in the region of interest (photon/s) using Living Image software (Perkin Elmer). Mice treated with shPD-1 CAR-T cells had an unexpectedly uniform reduction in tumor burden compared to shGFP CAR-T cells (FIG. 4) . In addition, the two types of shRNA-expressing promoter were found to have a similar antitumor effect, and the expression of shRNA itself surprisingly did not affect the antitumor effect.

[00283] Изучение влияние разрушения внутриклеточной части PD-1 CAR-T-клеток на выработку цитокинов in vivo. Периферическую кровь отдельных мышей получали через 24 и 72 часа после введения CAR-T. Плазму собирали из периферической крови при помощи центрифугирования в течение 5 минут при 300 × g при комнатной температуре. Уровень цитокинов in vivo анализируют с помощью набора Human Th1/Th2 Cytokine Kit (BD Bioscience), следуя инструкциям производителя. Разрушение внутриклеточной части PD-1 CAR-T-клеток неожиданно снижало выработку цитокинов in vivo (Фиг. 5A). [00283] Studying the effect of destruction of the intracellular portion of PD-1 CAR-T cells on cytokine production in vivo. Peripheral blood from individual mice was obtained 24 and 72 hours after CAR-T administration. Plasma was collected from peripheral blood by centrifugation for 5 minutes at 300×g at room temperature. In vivo cytokine levels are analyzed using the Human Th1/Th2 Cytokine Kit (BD Bioscience) following the manufacturer's instructions. Destruction of the intracellular portion of PD-1 CAR-T cells unexpectedly reduced cytokine production in vivo (FIG. 5A) .

[00284] Для исследования влияния разрушения внутриклеточной части PD-1 CAR-T-клеток на in vivo экспансию CAR-T-клеток, селезенку отдельных мышей получали через 3 или 20 суток после инъекции CAR-T. Процент CAR-T-клеток (Live/Dead-CD3+) или NALM-6-PDL1 (Live/Dead-GFP+) оценивали при помощи проточной цитометрии. Разрушение внутриклеточной части PD-1 в клетке неожиданно задерживает in vivo экспансию CAR-T-клеток (Фиг. 5B). [00284] To investigate the effect of destruction of the intracellular portion of PD-1 CAR-T cells on in vivo expansion of CAR-T cells, spleens from individual mice were obtained 3 or 20 days after CAR-T injection. The percentage of CAR-T cells (Live/Dead - CD3 + ) or NALM-6-PDL1 (Live/Dead - GFP + ) was assessed using flow cytometry. Destruction of the intracellular portion of PD-1 in the cell surprisingly delays in vivo expansion of CAR-T cells (FIG. 5B).

[00285] Разрушение внутриклеточной части PD-1 CAR-T-клеток, достигнутое при помощи векторной системы «два в одном», описанной в данном документе, показало неожиданно высокий уровень усиления противоопухолевого эффекта in vivo CD19-специфических CAR-T-клеток в отношении CD19+PDL1+ опухоли. Таким образом, PD-1 KD CAR-T-клетки были дополнительно использованы в способах в следующих примерах.[00285] Destruction of the intracellular portion of PD-1 CAR-T cells achieved with the two-in-one vector system described herein showed an unexpectedly high level of enhancement of the in vivo antitumor effect of CD19-specific CAR-T cells against CD19+PDL1+ tumors. Thus, PD-1 KD CAR-T cells were further used in the methods in the following examples.

Пример 4: Оценка окружения костимулирующих молекул в сигналинге PD-1Example 4 Estimating the Environment of Costimulatory Molecules in PD-1 Signaling

[00286] В этом примере описывается оценка окружающей среды костимулирующих молекул, включая CD28 и 4-1BB, в сигналинге PD-1.[00286] This example describes environmental assessment of co-stimulatory molecules, including CD28 and 4-1BB, in PD-1 signaling.

[00287] Было исследовано, как разрушение внутриклеточной части PD-1 влияет на функцию CD28/CD3ζ или 4-1BB/CD3ζ CAR-T-клеток (Фиг. 6A). Были впервые получены G28z, GBBz, P28z и PBBz CAR-T-клетки. Эти CAR-T­клетки аналогичным образом трансдуцировали (Фиг. 6B). Уровень экспрессии PD-1 был выше в G28z CAR-T-клетках, чем в GBBz CAR-T-клетках, а уровень PD-1 в P28z был выше, чем в PBBz (Фиг. 7A). Также было установлено, что этот отличающийся уровень белка PD-1 обусловлен уровнем транскрипции (Фиг. 7B). Было выдвинуто предположение, что каждый костимулирующий домен имеет различную интенсивность активации факторов, участвующих в транскрипции PD-1. Среди транскрипционных факторов, вовлеченных в транскрипцию PD-1, NFAT и NF-κB, были значительно вовлечены в транскрипцию PD-1, а SMAD2/3 были вовлечены в транскрипцию PD-1 в присутствии экзогенного ТФР-β, который является основным иммуносупрессивным фактором микроокружения опухоли (Cancer Discov., 2016, Benjamine V. Park). Активность NFAT или NF-kB исследовали во время стимуляции CAR. Был сконструирован лентивирусный вектор с репортером «элемент ответа NFAT (NFAT-RE x3) -eGFP» или с классическим репортером «элемент ответ N-κB(NF-κB RE x5)-eGFP. Была показана NFAT- или NF-kB RE-опосредованная индукция eGFP (Фиг. 8A и 8B). Репортер-трансдуцированные Т-клетки повторно стимулируют и дополнительно трансдуцируют G28z или GBBz. Было обнаружено, что трансдуцированные G28z CAR-T-клетки с репортером NFAT (G28z-NFAT) имели слегка повышенный уровень активности NFAT по сравнению с GBBz-NFAT (Фиг. 9A), и уровень мРНК целевых генов NFAT также был выше у G28z (Фиг. 9B). Тем не менее трансдуцированные G28z CAR-T-клетки c репортером NF-κB (G28z-NF-κB) сходны по активности NFAT с GBB-NF-κB (Фиг. 10). Для исследования активности SMAD2/3 каждой CAR-T-клетки, G28z или GBBz CAR-T-клетки во время стимуляции CAR обрабатывали ТФР-β. Было обнаружено, что фосфорилирование SMAD2/3 G28z CART немного выше BBz CART (Фиг. 11A), а степень увеличения экспрессии PD-1 при обработке ТФР-β выше для G28z, чем для GBBz (кратность изменения для G28z 2,39±0,031, для GBBz 1,61+0,034) (Фиг. 11B). Было исследовано, связано ли это различие с различиями в уровнях экспрессии элементов сигналинга ТФР-β. Было обнаружено, что ТФР-β и рецептор 1 ТФР-β (TGFBR1) существенно не различались между двумя CART, но рецептор 2 ТФР-β (TGFBR2) экспрессировался на более высоком уровне в CD28z (Фиг. 11C). [00287] It was investigated how the destruction of the intracellular part of PD-1 affects the function of CD28/CD3ζ or 4-1BB/CD3ζ CAR-T cells (Fig. 6A) . G28z, GBBz, P28z, and PBBz CAR-T cells were obtained for the first time. These CAR T cells were similarly transduced (FIG. 6B) . The expression level of PD-1 was higher in G28z CAR-T cells than in GBBz CAR-T cells, and the level of PD-1 in P28z was higher than in PBBz (Fig. 7A) . This differing level of PD-1 protein was also found to be due to the level of transcription (FIG. 7B) . It has been suggested that each co-stimulatory domain has a different intensity of activation of factors involved in PD-1 transcription. Among the transcription factors involved in PD-1 transcription, NFAT and NF-κB were significantly involved in PD-1 transcription, and SMAD2/3 were involved in PD-1 transcription in the presence of exogenous TGF-β, which is a major immunosuppressive microenvironmental factor. tumors ( Cancer Discov ., 2016, Benjamine V. Park). NFAT or NF-kB activity was examined during CAR stimulation. A lentiviral vector was constructed with the NFAT (NFAT-RE x3)-eGFP response element reporter or with the classic N-κB(NF-κB RE x5)-eGFP response element reporter. NFAT- or NF-kB RE-mediated eGFP induction was shown (FIGS. 8A and 8B) . Reporter transduced T cells are restimulated and further transduced with G28z or GBBz. G28z-transduced NFAT reporter (G28z-NFAT) CAR-T cells were found to have slightly increased levels of NFAT activity compared to GBBz-NFAT ( Fig. 9A), and mRNA levels of target NFAT genes were also higher in G28z ( Fig. .9B) . However, G28z transduced NF-κB reporter CAR-T cells (G28z-NF-κB) are similar in NFAT activity to GBB-NF-κB (Fig. 10) . To examine the SMAD2/3 activity of each CAR-T cell, G28z or GBBz CAR-T cells during CAR stimulation were treated with TGF-β. SMAD2/3 phosphorylation of G28z CART was found to be slightly higher than BBz CART (Fig. 11A), and the degree of increase in PD-1 expression by TGF-β treatment was higher for G28z than for GBBz (fold change for G28z 2.39 ± 0.031, for GBBz 1.61+0.034) (Fig. 11B) . It was investigated whether this difference is due to differences in the expression levels of TGF-β signaling elements. TGF-β and TGF-β receptor 1 (TGFBR1) were not found to be significantly different between the two CARTs, but TGF-β receptor 2 (TGFBR2) was expressed at a higher level in CD28z (Fig. 11C) .

[00288] В этом примере оценивали окружение костимулирующих молекул, включая CD28 и 4-1BB, в сигналинге PD-1. Костимуляция CD28 сильно индуцировала сигналинг, связанный с транскрипцией PD-1, и индукция могла быть связана с активацией сигналинга NFAT и ТФР-β. Индукция костимуляции CD28 была сильнее, чем индукция костимуляции 4-1BB. [00288] In this example, the environment of co-stimulatory molecules, including CD28 and 4-1BB, in PD-1 signaling was assessed. Costimulation of CD28 strongly induced signaling associated with PD-1 transcription, and the induction could be associated with activation of NFAT and TGF-β signaling. The induction of CD28 costimulation was stronger than that of 4-1BB costimulation.

Пример 5: Способы конструирования и оценки PD-1 KD CAR-T клеток Example 5: Methods for constructing and evaluating PD-1 KD CAR-T cells

[00289] В этот примере описаны способы конструирования и оценки PD-1 KD CAR-T-клеток.[00289] This example describes methods for constructing and evaluating PD-1 KD CAR-T cells.

[00290] Для имитации условий in vivo CAR-T-клеток с многократными последовательными контактами антигена и лиганда иммунной контрольной точки, CAR-T-клетки совместно культивировали с CD19+ PDL1+ целевыми клетками без экзогенных цитокинов. В первичных CAR-T-клетках группы PD-1 KD CAR-T демонстрировали неожиданно более высокую литическую активность, чем группы CAR-T ДТ, но не было различий в литической активности между группами CAR-T на основе CD28 и 4-1BB (Фиг. 12А). После 2-й повторной стимуляции CAR-T-клеток, G28z CAR-T-клетки теряли способность к размножению после второй стимуляции, таким образом анализировали литическую активность 3 CAR-T-клеток. PBBz и P28z CAR-T-клетки обладали неожиданно более высокой литической активностью при повторном воздействии антигена и PD-L1, чем GBBz CAR-T-клетки. PBBz CAR-T-клетки продемонстрировали неожиданно более высокую способность сохранять литическую функцию, чем P28z CAR-T-клетки (Фиг. 12A). Эта тенденция также наблюдалась в анализе пролиферации клеток (Фиг. 12B). В совокупности применение костимулирующего домена 4-1BB с PD-1 KD CART способствует сохранению цитотоксичности и пролиферативной способности in vitro по сравнению с применением костимулирующего домена CD28. PBBz CAR-T-клетки демонстрируют замедленное истощение при повторном воздействии CD19 и PD-L1. [00290] To mimic the in vivo conditions of CAR-T cells with multiple sequential antigen and immune checkpoint ligand contacts, CAR-T cells were co-cultured with CD19 + PDL1 + target cells without exogenous cytokines. In primary CAR-T cells, the PD-1 KD CAR-T group showed unexpectedly higher lytic activity than the DT CAR-T groups, but there was no difference in lytic activity between the CD28 and 4-1BB based CAR-T groups (Fig . .12A) . After the 2nd re-stimulation of CAR-T cells, G28z CAR-T cells lost their ability to multiply after the second stimulation, thus analyzing the lytic activity of 3 CAR-T cells. PBBz and P28z CAR-T cells had unexpectedly higher lytic activity upon repeated exposure to antigen and PD-L1 than GBBz CAR-T cells. PBBz CAR-T cells showed an unexpectedly higher ability to maintain lytic function than P28z CAR-T cells (Fig. 12A) . This trend was also observed in the cell proliferation assay (Fig. 12B) . Taken together, the use of the 4-1BB costimulatory domain with PD-1 KD CART promotes cytotoxicity and proliferative capacity in vitro compared to the use of the CD28 costimulatory domain. PBBz CAR-T cells show delayed depletion upon repeated exposure to CD19 and PD-L1.

[00291] Было рассмотрено возможное влияние иммуносупрессивного механизма на BBz CAR-T-клетки. CD28 CAR-T-клетки были более чувствительны к ТФР-β, чем BBz CART (Фиг. 11), поэтому GBBz CAR-T-клетки сравнивали с G28z CAR-T-клетками в отношении того, насколько их антигенспецифическая пролиферация будет подавлена ТФР-β. Хотя во время стимуляции CAR без ТФР-β между двумя CAR-T-клетками не наблюдали значительного различия в пролиферации, в отличие от GBBz CAR-T-клеток у G28z CAR-T-клеток была значительно снижена пролиферация (Фиг. 13A). [00291] The possible impact of an immunosuppressive mechanism on BBz CAR-T cells has been considered. CD28 CAR-T cells were more sensitive to TGF-β than BBz CART (Fig. 11) , so GBBz CAR-T cells were compared with G28z CAR-T cells in terms of how much their antigen-specific proliferation would be suppressed by TGF- β. Although no significant difference in proliferation was observed between the two CAR-T cells during CAR stimulation without TGF-β, in contrast to GBBz CAR-T cells, G28z CAR-T cells had significantly reduced proliferation (Fig. 13A) .

[00292] Сообщалось, что ТФР-β не только ингибирует пролиферацию, но и глубоко вовлечен в индукцию регуляторных Т-клеток (JEM, 2003, WanJun Chen; Science, 2003, Shohei Hori; Blood, 2007, Dat Q. Tran). Чтобы исследовать, отличается ли индукция Трег между G28z и BBz CAR-T-клетками в отсутствие экзогенных ТФР-β, G28z и BBz CAR-T-клетки культивировали с целевыми клетками NALM-6 в течение 3 суток. G28z CAR-T-клеток in vitro имели в два-три раза больший % CD4+CD25+FOXP3+ Трег по сравнению с GBBz CAR-T-клетками (Фиг. 13B). Этот результат согласуется с увеличением экспрессии связанных с Трег генов, таких как CD25 и FOXP3 (Фиг. 9B). Затем наблюдали и сравнивали изменения в % Трег после обработки ТФР-β. Было показано, что ТФР-β значительно увеличивал % Трег среди 28z CAR-T-клеток, но не влиял на % Трег среди BBz CAR-T-клеток (Фиг. 13B). Был сделан вывод, что костимуляция CD28 имеет больший потенциал индуцировать Трег, чем костимуляция 4-1BB, и, если присутствует ТФР-β, ее потенциал дополнительно возрастает. Было исследовано, влияет ли разрушение внутриклеточной части PD-1 на индукцию Трег. P28z и PBBz CAR-T-клетки имели в два-три раза более низкий % Tрег по сравнению с G28z и GBBz, соответственно. В частности, PBBz имел самый низкий % Трег (Фиг. 13C). Наконец, исследовали процент Трег при условии, что сигналинг PD-1/PD-L1 был активирован. Было исследовано изменение % Трег после совместного культивирования NALM-6 или NALM-6-PDL1. Было обнаружено, что сигналинг PD-1/PDL1 существенно не влияет на индукцию Трег, полученных из CAR-T (Фиг. 13С), предполагая, что уровни экспрессии внутриклеточного PD-1 связаны с образованием Трег. Был сделан вывод, что PBBz CAR-T-клетки могут быть неожиданным образом нечувствительными к иммуносупрессивному механизму.[00292] It has been reported that TGF-β not only inhibits proliferation, but is also deeply involved in the induction of regulatory T cells (JEM, 2003, WanJun Chen; Science, 2003, Shohei Hori; Blood, 2007, Dat Q. Tran). To investigate whether Treg induction differs between G28z and BBz CAR-T cells in the absence of exogenous TGF-β, G28z and BBz CAR-T cells were cultured with target NALM-6 cells for 3 days. G28z CAR-T cells in vitro had two to three times the % CD4 + CD25 + FOXP3 + Treg compared to GBBz CAR-T cells (FIG. 13B). This result is consistent with increased expression of Treg-related genes such as CD25 and FOXP3 (Fig. 9B) . Changes in % Treg after treatment with TGF-β were then observed and compared. It was shown that TGF-β significantly increased % Treg among 28z CAR-T cells, but did not affect % Treg among BBz CAR-T cells (Fig. 13B) . It was concluded that CD28 costimulation has a greater potential to induce Treg than 4-1BB costimulation, and if TGF-β is present, its potential is further increased. It was investigated whether the destruction of the intracellular part of PD-1 affects the induction of Tregs. P28z and PBBz CAR-T cells had two to three times lower % Treg compared to G28z and GBBz, respectively. In particular, PBBz had the lowest % Treg (FIG. 13C) . Finally, the percentage of Tregs was examined provided that PD-1/PD-L1 signaling was activated. The change in % Treg after co-cultivation of NALM-6 or NALM-6-PDL1 was investigated. PD-1/PDL1 signaling was found not to significantly affect the induction of CAR-T derived Tregs (FIG. 13C) , suggesting that intracellular PD-1 expression levels are associated with Tregs formation. It was concluded that PBBz CAR-T cells may be surprisingly insensitive to an immunosuppressive mechanism.

[00293] В этом примере PBBz CAR-T-клетки продуцировались и демонстрировали замедленное истощение при повторном воздействии CD19 и PD-L1. PBBz CAR-T-клетки также неожиданным образом ускользают от иммуносупрессивного механизма. Таким образом, эти клетки дополнительно оценивали на их противоопухолевый эффект in vivo. [00293] In this example, PBBz CAR-T cells were produced and showed delayed depletion upon repeated exposure to CD19 and PD-L1. PBBz CAR-T cells also elude the immunosuppressive mechanism in an unexpected way. Thus, these cells were further evaluated for their antitumor effect in vivo.

Пример 6: Способы лечения CD19+ гемобластоза Example 6: Methods for the treatment of CD19+ hemoblastosis in vivoin vivo с использованием PBBz CAR-T-клеток using PBBz CAR-T cells

[00294] В этом примере описаны способы лечения CD19+ гемобластоза in vivo с использованием PBBz CAR-T-клеток. [00294] This example describes methods for treating CD19+ hemoblastosis in vivo using PBBz CAR-T cells.

[00295] Модель CD19+опухоли крови получали как описано в примере 3. Сравнивали противоопухолевый эффект G28z, GBBz, P28z и PBBz CAR-T-клеток с таковым у CD19+ клеток B-ОЛЛ in vivo. CAR-T-клетки вводят в разовой дозе 2,5 × 106 на 4 сутки после инфузии целевых клеток. In vivo визуализацию мышей, несущих NALM6-GL-PDL1, выполняли с помощью Xenogen IVIS Spectrum и количественно определяли как излучение в представляющей интерес области (фотон/сек). Как показано на Фиг. 14, PD-1 KD CART-клетки (PBBz или P28z) демонстрируют превосходный противоопухолевый эффект по сравнению с CAR-T-клетками ДТ (GBBz или G28z). В частности, PBBz CAR-T-клетки ингибировали прогрессирование лейкоза в течение более длительных периодов, чем другие три CAR-T-клетки. CAR-T-клетки ДТ имели сильный противоопухолевый ответ, но не имели устойчивого противоопухолевого ответа. С другой стороны, PD-1 KD CAR-T в начальные периоды демонстрировали слабый, но постоянный противоопухолевый ответ, что позволяет предположить, что разрушение PD-1 в CAR-T-клетках может потенциально снизить риск для CRS. PBBz CAR-T-клетки обладают неожиданно лучшим противоопухолевым эффектом in vivo, чем P28z. [00295] The CD19 + blood tumor model was prepared as described in Example 3. The antitumor effect of G28z, GBBz, P28z and PBBz CAR-T cells was compared with that of CD19 + B-ALL cells in vivo . CAR-T cells are administered at a single dose of 2.5×10 6 on day 4 after target cell infusion. In vivo imaging of mice bearing NALM6-GL-PDL1 was performed using the Xenogen IVIS Spectrum and quantified as radiation in the region of interest (photon/sec). As shown in FIG. 14 , PD-1 KD CART cells (PBBz or P28z) show superior antitumor effect compared to DT CAR-T cells (GBBz or G28z). In particular, PBBz CAR-T cells inhibited leukemia progression for longer periods than the other three CAR-T cells. WT CAR-T cells had a strong antitumor response, but did not have a sustained antitumor response. On the other hand, PD-1 KD CAR-Ts showed a weak but persistent antitumor response in the initial periods, suggesting that disruption of PD-1 in CAR-T cells could potentially reduce the risk for CRS. PBBz CAR-T cells have an unexpectedly better antitumor effect in vivo than P28z.

Пример 7: Способы получения двойных векторов «два в одном», имеющих 2 типа кассет кшРНК, вводимых в направлениях →← или ←→Example 7: Methods for obtaining two-in-one dual vectors having 2 types of shRNA cassettes introduced in the →← or ←→ directions

[00296] В этом примере описываются способы получения двойных векторов «два в одном», в которых 2 типа кассет кшРНК вводятся в направлениях ←→ (shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1) или в направлениях →←(mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6) и экспрессируют shPD-1, shTIM-3 и CD19-CAR, одновременно.[00296] This example describes methods for producing two-in-one dual vectors in which 2 types of shRNA cassettes are introduced in the ←→ directions (shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1) or in the →←(mU6- shTIM-3→←shPD-1-hU6) and express shPD-1, shTIM-3 and CD19-CAR simultaneously.

[00297] Для конструирования лентивируса, в котором экспрессия кшРНК для PD-1 (далее shPD-1), кшРНК для TIM-3 (далее shTIM-3) и CD19-CAR регулируются промотором U6 человека (далее hU6), промотором U6 мыши (далее mU6) и промотором EF1-α, соответственно. Плазмиду, в которой оба типа кшРНК экспрессируются одновременно, получали таким образом, чтобы соответствующие кассеты кщРНК располагались в направлении →← (mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6) и в направлении ←→ (shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1) (Фиг. 15). С этой целью (1) вставляли сайт множественного клонирования (MCS), (2) осуществляли конверсию промотора U6 мыши shPD-1 в промотор U6 человека, (3) вставляли shTIM-3 и (4) осуществляли клонирование, такое как переключение положений shTIM-3 и shPD-1. [00297] To construct a lentivirus in which the expression of shRNA for PD-1 (hereinafter shPD-1), shRNA for TIM-3 (hereinafter shTIM-3) and CD19-CAR are regulated by the human U6 promoter (hereinafter hU6), the mouse U6 promoter ( hereafter mU6) and the EF1-α promoter, respectively. A plasmid in which both shRNA types are expressed simultaneously was obtained in such a way that the corresponding shRNA cassettes were located in the →← direction (mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6) and in the ←→ direction (shTIM-3-mU6←→ hU6-shPD-1) (Fig. 15). To this end, (1) a multiple cloning site (MCS) was inserted, (2) the mouse shPD-1 U6 promoter was converted to the human U6 promoter, (3) shTIM-3 was inserted, and (4) cloning such as shTIM- position switching was performed. 3 and shPD-1.

[00298] Для вставки MCS в mU6-shPD-1 3'-часть pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-shPD-1 (плазмида ID № 2) и праймеры, содержащие SEQ ID NO:228 и 229, использовали для получения продукта ПЦР (416 п.н.), при этом сайт распознавания рестриктазы Hpa1 mU6-shPD-1 3' модифицировали в сайт множественного клонирования BsgZ171-Xba1-Nde-1-Bmt1-Spe1. После этого продукт ПЦР обрабатывали рестриктазами BstZ17y и Hpa1, а плазмиду ID № 2 обрабатывали рестриктазой Hpa1 и CIP, после чего использовали лигирование по тупым концам для получения pLV-δLNGFR-P2A-CD19-CAR-mU6-shPD-1_MCS (плазмиды И № 4), включая основную последовательность shPD-1-mU6-MCS (кассета кшРНК SEQ ID NO.223).[00298] To insert MCS into mU6-shPD-1, the 3'-part of pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-shPD-1 (plasmid ID no. 2) and primers containing SEQ ID NOS: 228 and 229 were used to obtain a PCR product (416 bp), while the restriction enzyme recognition site Hpa1 mU6-shPD-1 3' was modified into the multiple cloning site BsgZ171-Xba1-Nde-1-Bmt1-Spe1. After that, the PCR product was digested with BstZ17y and Hpa1 restriction enzymes, and plasmid ID no. ), including the core sequence shPD-1-mU6-MCS (shRNA cassette SEQ ID NO.223).

[00299] После этого конструировали плазмиду так, чтобы shPD-1 экспрессировалась под контролем промотора U6 человека вместо промотора U6 мыши. Плазмиду LentiCRISPR V2 использовали с праймерами, содержащими SEQ ID NO: 230 и 231, чтобы получить продукт ПЦР, содержащий промотор U6 человека. Продукт ПЦР обрабатывали рестриктазой Hpa1 и Spe1, а затем лигировали плазмидой ID № 4, обработанной рестриктазой Hpa1 и Spe1, для получения pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR_hU6-shPD-1_MSC (плазмида ID № 5), содержащей последовательность оснований hU6-shPD-1 (SEQ ID NO: 224). Предполагалось вставить кассету mU6-shTIM-3 в плазмиду ID № 5, чтобы сконструировать плазмиду, которая одновременно экспрессирует shTIM-3 и shPd-1.[00299] A plasmid was then constructed so that shPD-1 was expressed under the control of the human U6 promoter instead of the mouse U6 promoter. Plasmid LentiCRISPR V2 was used with primers containing SEQ ID NOs: 230 and 231 to obtain a PCR product containing the human U6 promoter. The PCR product was digested with Hpa1 and Spe1 and then ligated with Hpa1 and Spe1 digested plasmid ID no. 4 to obtain pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR_hU6-shPD-1_MSC (plasmid ID no. 5) containing the hU6-shPD-1 base sequence (SEQ ID NO: 224). It was intended to insert the mU6-shTIM-3 cassette into plasmid ID no. 5 to construct a plasmid that simultaneously expresses shTIM-3 and shPd-1.

[00300] Продукт ПЦР, содержащий кассету mU6-shtim-3, был получен с использованием плазмиды ID №3 и праймеров, содержащих SEQ ID NO: 232 и 233. После обработки продукта ПЦР рестриктазами Bmt1 и Spe1 его лигировали с плазмидой ID № 5, обработанной рестриктазами Bmt1 и Spe1, для получения pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR mU6-shTIM-3 →← shPD-1-hU6 (плазмиды ID № 6), содержащей последовательность оснований в направлении →← (mU6-shTIM-3 →← shPD-1-hU6) (SEQ ID NO: 220).[00300] A PCR product containing the mU6-shtim-3 cassette was generated using plasmid ID No. 3 and primers containing SEQ ID NOs: 232 and 233. After the PCR product was digested with Bmt1 and Spe1 restriction enzymes, it was ligated to plasmid ID No. 5, treated with restrictases Bmt1 and Spe1 to obtain pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR mU6-shTIM-3 →← shPD-1-hU6 (plasmid ID no. 6) containing the base sequence in the →← direction (mU6-shTIM-3 →← shPD-1 -hU6) (SEQ ID NO: 220).

[00301] Для создания плазмиды, в которой два типа кассет кшРНК расположены в направлениях ←→ (shTIM-3-mU6 ←→ hU6-shPD-1), плазмиду ID № 6 и праймеры, содержащие SEQ ID NO: 234 и 235, использовали для получения продукта ПЦР. После обработки рестриктазой Spe1 и Hpa1 его вставляли в плазмиду ID № 4, обработанную теми же рестриктазами, для получения pLV-δLNGFR-P2A-CD19-CAR-shPD-1-hU6-MCS (плазмида ID № 7). После этого плазмиду ID №6 и праймеры, содержащие SEQ ID NO: 236 и 237, использовали для получения продукта ПЦР. После обработки рестриктазой Bmt1 и Spe1 его лигировали с плазмидой ID № 7, обработанной тем же рестриктазой, чтобы в конечном итоге получить pLV-δLNGFR-P2A-CD19-CAR_shTIM-3-mU6 ←→ hU6-shPD-1 (плазмида ID № 8), содержащую последовательность оснований ←→ (shTIM-3-mU6 ←→ hU6-shPD-1) (SEQ ID NO: 221).[00301] To create a plasmid in which two types of shRNA cassettes are located in the ←→ directions (shTIM-3-mU6 ←→ hU6-shPD-1), plasmid ID no. 6 and primers containing SEQ ID NOS: 234 and 235 were used to obtain a PCR product. After digestion with Spe1 and Hpa1, it was inserted into plasmid ID no. 4 treated with the same restrictases to obtain pLV-δLNGFR-P2A-CD19-CAR-shPD-1-hU6-MCS (plasmid ID no. 7). Thereafter, plasmid ID No. 6 and primers containing SEQ ID NOs: 236 and 237 were used to obtain a PCR product. After digestion with Bmt1 and Spe1, it was ligated to plasmid ID no. 7 treated with the same restriction enzyme to ultimately give pLV-δLNGFR-P2A-CD19-CAR_shTIM-3-mU6 ←→ hU6-shPD-1 (plasmid ID no. 8) , containing the base sequence ←→ (shTIM-3-mU6 ←→ hU6-shPD-1) (SEQ ID NO: 221).

[00302] Лентивирусные векторы «два в одном», в которых 2 типа кассет кшРНК вводятся в направлениях ←→ или →←, полученные согласно данному документу, могут быть использованы в получении модифицированных PD-1 KD CAR-T-клеток в следующих примерах.[00302] Two-in-one lentiviral vectors in which 2 types of shRNA cassettes are introduced in the ←→ or →← directions obtained according to this document can be used in the production of modified PD-1 KD CAR-T cells in the following examples.

Пример 8. Способы получения и оценки Example 8 Obtaining and Estimating Methods in vitroin vitro PD-1 KD CAR-T-клеток PD-1 KD CAR-T cells

[00303] В этом примере описаны способы получения и оценки in vitro CAR-T-клеток с двойным KD, в которых shPD-1, shTIM-3 и CD19-CAR экспрессируются одновременно.[00303] This example describes methods for generating and evaluating in vitro dual KD CAR-T cells in which shPD-1, shTIM-3, and CD19-CAR are expressed simultaneously.

[00304] Плазмиды ID № 1 (pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-shGFP), № 6 (pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6) и № 8 (pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR_shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1) в таблице 1, и упаковочные плазмиды pMDL g/p, pRSVrev и pMDG.1 были трансфицированы в T-клетки HEK293 с использованием липофектамина, и по истечении 48 часов получали среду для культивирования клеток, включая лентивирус. Используя раствор Ficoll-Paque, мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли из крови человека, и антитела, нацеленные на CD3 и CD28 человека, использовали для специфической активации Т-клеток. Через один-два дня после начальной активации Т-клеток, их трансдуцировали с использованием ранее полученного вируса. Полученные CAR-T-клетки затем культивировали с использованием среды для культивирования AIM-V, содержащей 5% человеческой плазмы и человеческого ИЛ-2. На шестые сутки после трансдукции систему MACSelect LNGFR (miltenyibiotec, Германия) использовали для получения чистых CAR-T-клеток, а антитело, нацеленное на LNGFR, использовали для выделения LNGFR+ CAR-T-клеток с помощью проточного цитометра. Далее клетки, полученные с использованием плазмид ID № 1, № 6 и № 8, обозначены как δLNGFRCART19/shGFP (или shGFP/CART19), δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3 →← shPD-1-hU6 (или shPD -1_shTIM-3/CART19) и δLNGFR-CART19/shTIM-3-mU6 ←→ hU6-shPD-1, соответственно (Фиг. 16).[00304] Plasmid ID #1 (pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-shGFP), #6 (pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6) and #8 (pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR_shTIM-3-mU6) ←→hU6-shPD-1) in Table 1, and the packaging plasmids pMDL g/p, pRSVrev and pMDG.1 were transfected into HEK293 T cells using lipofectamine, and after 48 hours, a cell culture medium including lentivirus was obtained. Using Ficoll-Paque solution, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from human blood, and antibodies targeting human CD3 and CD28 were used to specifically activate T cells. One to two days after the initial activation of the T cells, they were transduced using the previously obtained virus. The resulting CAR-T cells were then cultured using AIM-V culture medium containing 5% human plasma and human IL-2. On the sixth day after transduction, the MACSelect LNGFR system (miltenyibiotec, Germany) was used to obtain pure CAR-T cells, and the LNGFR-targeted antibody was used to isolate LNGFR+ CAR-T cells using a flow cytometer. Further, cells obtained using plasmids ID no. 1, no. 6, and no. -3/CART19) and δLNGFR-CART19/shTIM-3-mU6 ←→ hU6-shPD-1, respectively (Fig. 16) .

[00305] Для приготовления контрольных CAR-T-клеток, содержащих кассеты mU6-shPD-1, mU6-TIM-3 и shPD-1-hU6, соответственно, плазмиды ID № 2 (pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-shPD-1), № 3 (pLV -δLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-shTIM-3) и № 7 (pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR_shPD-1-hU6_MCS) в таблице 1, и упаковочные плазмиды pMDL g/p, pRSVrev и pMDG.1 трансфицировали в T-клетки HEK293 с использованием липофектамина. Через 48 часов получали среду для культивирования клеток, включая лентивирус. Используя раствор Ficoll-Paque, мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли из крови человека, и антитела, нацеленные на CD3 и CD28 человека, использовали для специфической активации Т-клеток. Через один-два дня после начальной активации Т-клеток, их трансдуцировали с использованием ранее полученного вируса. Полученные CAR-T-клетки затем культивировали с использованием среды для культивирования AIM-V, содержащей 5% человеческой плазмы и человеческого ИЛ-2. На шестые сутки после трансдукции систему MACSelect LNGFR (miltenyibiotec, Германия) использовали для получения чистых CAR-T-клеток, а антитело, нацеленное на LNGFR, использовали для выделения LNGFR+ CAR-T-клеток с помощью проточного цитометра. Далее клетки, полученные с использованием плазмид ID № 2, № 3 и № 7, обозначены как δLNGFR-CART19/shPD-1 (или shPD-1/CART19), δLNGFR-CART19/shTIM-3 (или shTIM-3/CART19) и δLNGFRCART19/shPD-1-hU6, соответственно.[00305] To prepare control CAR-T cells containing mU6-shPD-1, mU6-TIM-3 and shPD-1-hU6 cassettes, respectively, plasmid ID no. 2 (pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-shPD-1), #3 (pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-shTIM-3) and #7 (pLV-δLNGFR_P2A_CD19-CAR_shPD-1-hU6_MCS) in Table 1, and packaging plasmids pMDL g/p, pRSVrev and pMDG.1 were transfected into HEK293 T cells using lipofectamine. After 48 hours, a cell culture medium was obtained, including lentivirus. Using Ficoll-Paque solution, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from human blood, and antibodies targeting human CD3 and CD28 were used to specifically activate T cells. One to two days after the initial activation of the T cells, they were transduced using the previously obtained virus. The resulting CAR-T cells were then cultured using AIM-V culture medium containing 5% human plasma and human IL-2. On the sixth day after transduction, the MACSelect LNGFR system (miltenyibiotec, Germany) was used to obtain pure CAR-T cells, and the LNGFR-targeted antibody was used to isolate LNGFR+ CAR-T cells using a flow cytometer. Further, cells obtained using plasmids ID no. 2, no. 3, and no. and δLNGFRCART19/shPD-1-hU6, respectively.

[00306] Для измерения чистоты полученных в соответствии с данным документом CAR-T-клеток с двойным KD, проточную цитометрию выполняли с использованием антител, направленных на LNGFR, для клеток, полученных выше. Как показано на Фиг. 17, было получено около 80% LNGFR+ CAR-T-клеток.[00306] To measure the purity of double KD CAR-T cells produced herein, flow cytometry was performed using antibodies directed to LNGFR on the cells obtained above. As shown in FIG. 17 , about 80% of LNGFR+ CAR-T cells were obtained.

[00307] Было измерено снижение экспрессии PD-1 и TIM-3 в CAR-T-клетках с двойным KD, полученных в соответствии с данным документом, и устойчивое снижение их экспрессии. CAR-T-клетки с двойным KD стимулировали в течение трех суток антителом, направленным на CD3 и CD28 человека, для индукции экспрессии PD-1 и TIM-3. После этого экспрессию PD-1 и TIM-3 в CAR-T-клетках с двойным KD анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием антител, нацеленных на CAR, PD-1 и TIM-3. Как показано на Фиг. 18A и 18B, анализ влияния двух одновременно экспрессируемых типов кшРНК на снижение экспрессии PD-1 и TIM-3 показал, что степень снижения экспрессии PD-1 и TIM-3, наблюдаемая в CD19-CAR-T-клетке, экспрессирующей shPD-1 и shTIM-3 одновременно, была аналогична степени снижения в CD19-CAR-T-клетке, в которой экспрессируется только shPD-1 или shTIM-3. [00307] The decrease in expression of PD-1 and TIM-3 in dual KD CAR-T cells obtained in accordance with this document and a steady decrease in their expression was measured. Dual KD CAR-T cells were stimulated for three days with an antibody directed to human CD3 and CD28 to induce expression of PD-1 and TIM-3. Thereafter, expression of PD-1 and TIM-3 in dual KD CAR-T cells was analyzed by flow cytometry using antibodies targeting CAR, PD-1 and TIM-3. As shown in FIG. 18A and 18B , an analysis of the effect of two concurrently expressed shRNA types on downregulation of PD-1 and TIM-3 showed that the degree of downregulation of PD-1 and TIM-3 observed in a CD19-CAR-T cell expressing shPD-1 and shTIM-3 at the same time was similar to the degree of reduction in a CD19-CAR-T cell that expresses only shPD-1 or shTIM-3.

[00308] Было определено влияние CAR-T клеток с двойным KD, полученных в соответствии с данным документом, на дифференцировку. Для определения степени дифференцировки PD-1 и TIM-3 для CAR-T клеток с двойным KD, выполняли проточную цитометрию с использованием антител, направленных на CD45RA и CCR7. Как показано на Фиг. 19, в клетках δLNGFR-CART19/shPD-1, подвергнутых повторной стимуляции антигеном, наблюдается увеличение количества терминально дифференцированных T-клеток TEMRA (CCR7-CD45RA+) по сравнению с δLNGFR-CART19 /shGFP. С другой стороны, δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6, к которым был добавлен shTIM-3, содержат больше подтипов TN (CCR7+CD45RA+) T-клеток, TCM (CCR7+CD45RA-) T-клеток и TEM (CCR7-CD45RA-) Т-клеток, чем δLNGFR-CART19/shPD-1. Поскольку сходные результаты наблюдаются и с клетками δLNGFR-CART19/shTIM-3, можно сказать, что сниженная способность к дифференцировке клеток δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6 возникает вследствие подавления TIM-3, и, соответственно, можно сказать, что эффект shTIM-3 имеет приоритет над эффектом shPD-1 с точки зрения влияния на дифференцировку клеток. Поскольку известно, что менее дифференцированные подтипы Т-клеток могут способствовать улучшению противораковой терапевтической активности Т-клеток, ожидается, что клетки δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6 будут демонстрировать лучшую противораковую эффективность in vivo, чем клетки δLNGFR-CART19/shPD-1. [00308] The effect of CAR-T cells with double KD, obtained in accordance with this document, on differentiation was determined. To determine the degree of differentiation of PD-1 and TIM-3 for CAR-T cells with double KD, flow cytometry was performed using antibodies directed to CD45RA and CCR7. As shown in FIG. 19 , δLNGFR-CART19/shPD-1 cells re-stimulated with antigen showed an increase in terminally differentiated TEMRA T cells (CCR7-CD45RA+) compared to δLNGFR-CART19/shGFP. On the other hand, δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6, to which shTIM-3 was added, contain more subtypes of TN (CCR7+CD45RA+) T cells, TCM (CCR7+CD45RA-) T -cells and TEM (CCR7-CD45RA-) T cells than δLNGFR-CART19/shPD-1. Since similar results are observed with δLNGFR-CART19/shTIM-3 cells, it can be said that the reduced differentiation ability of δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6 cells occurs due to the suppression of TIM-3, and, accordingly, , we can say that the effect of shTIM-3 takes precedence over the effect of shPD-1 in terms of influence on cell differentiation. Since it is known that less differentiated T cell subtypes can improve the anti-cancer therapeutic activity of T cells, it is expected that δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6 cells will show better anti-cancer efficacy in vivo than cells δLNGFR-CART19/shPD-1.

[00309] Сравнивали эффективность трансдукции, способность к пролиферации и жизнеспособность CAR-T-клеток с двойным KD, в которые были введены векторы CD19-CAR, содержащие кассеты кшРНК с различной ориентацией. Для CAR-T-клеток, полученных в соответствии с данным документом, проточную цитометрию проводили с использованием антитела к LNTFR для клеток с использованием плазмид, содержащих кассеты в направлении →← (mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6) и направлении ←→ (shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1). Для анализа жизнеспособности клеток проводили окрашивание трипановым синим и определяли соотношение неокрашенных клеток. Как показано на Фиг. 20A-20C, по сравнению с клетками, в которых используется направление кассет →←, (δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6), клетки, в которых используется направление кассет ←→, (δLNGFR-CART19/shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1), имели неожиданные проблемы с получением трансдуцированных клеток, а трансдуцированные Т-клетки обладали низкой способностью к пролиферации и жизнеспособностью.[00309] The transduction efficiency, proliferative capacity, and viability of dual KD CAR-T cells introduced with CD19-CAR vectors containing shRNA cassettes in different orientations was compared. For CAR-T cells prepared according to this document, flow cytometry was performed using an anti-LNTFR antibody for cells using plasmids containing cassettes in the →← direction (mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6) and in the direction ←→ (shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1). To analyze cell viability, trypan blue staining was performed and the ratio of unstained cells was determined. As shown in FIG. 20A-20C compared to cells using the →← cassette direction, (δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6), cells using the ←→ cassette direction, (δLNGFR-CART19 /shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1) had unexpected problems in obtaining transduced cells, and the transduced T cells had low proliferation and viability.

[00310] В этом примере описаны способы получения CAR-T-клеток с двойным KD, в которых shPD-1, shTIM-3 и CD19-CAR экспрессируются одновременно. CAR-T-клетки с двойным KD были получены с использованием полученных в соответствии с данным документом лентивирусных векторов «два в одном», содержащих 2 типа кассет кшРНК, вводимых в направлениях →← или ←→. По сравнению с клетками, в которых используется направление кассет ←→, клетки, в которых используется направление кассеты →←, (δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6), показали удивительно более высокую пролиферативную способность и жизнеспособность и, по этой причине, использовались в следующих примерах.[00310] This example describes methods for generating dual-KD CAR-T cells in which shPD-1, shTIM-3, and CD19-CAR are expressed simultaneously. Dual KD CAR-T cells were generated using two-in-one lentiviral vectors prepared according to this document, containing 2 types of shRNA cassettes introduced in the →← or ←→ directions. Compared to cells using the ←→ cassette direction, cells using the →← cassette direction (δLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6) showed surprisingly higher proliferative capacity and viability. and, for this reason, were used in the following examples.

Пример 9: Способы получения двойных векторов «два в одном» и CAR-T-клеток с двойным KDExample 9: Methods for Producing 2-in-1 Dual Vectors and Dual KD CAR-T Cells

[00311] В этом примере описаны способы получения двойных векторов «два в одном» и CAR-T-клеток с двойным KD.[00311] This example describes how to obtain two-in-one dual vectors and dual KD CAR-T cells.

[00312] Для создания двойных векторов «два в одном», экспрессирующих две кшРНК разными промоторами (mU6 и hU6), сайт множественного клонирования BstZ171-Xba1-Nde1-Bmt1-Spe1 (MCS) вставляли в вектор pLV-hU6-shPD-1_δLNGFR-CD19-BBz далее походу транскрипции от промотора hU6. Фрагменты второй кассеты mU6-кшРНК субклонировали в MCS. Чтобы ограничить блокаду нескольких иммунных контрольных точек только CAR-T-клетками был разработан вектор «два в одном» для экспрессии двух кшРНК промоторами mU6 и hU6 Pol Ⅲ для репрессии экспрессии двух иммунных контрольных точек CAR-T-клеток. Чтобы найти эффективные киРНК, нацеленные на CTLA-4, LAG-3, TIGIT или TIM-3, киРНК электропорировали в CD3/CD28-стимулированные Т-клетки. Были выбраны две или более эффективных киРНК (Фиг. 21А). Вектор «два в одном» для CAR-T-клеток с нокдауном CTLA-4, LAG-3, TIGIT или TIM-3 конструировали путем трансформации 21-мерных киРНК в формат кшРНК и, наконец, отбирали каждую иммунную контрольную точку, нацеленную на кшРНК (shCTLA-4: № 1; shLAG-3: № 1278; shTIGIT: № 739; shTIM-3: № 3), которые значительно подавляют экспрессию и меньше влияют на экспансию CAR-T (Фиг. 21B-C). Наконец, PD-1_CTLA-4, PD-1_LAG-3, PD-1_TIGIT или PD-1_TIM-3 CAR-T-клетки конструировали с помощью двойного вектора «два в одном» (Фиг. 22A-22E). Все CAR-T клетки с двойным KD были менее размножены по сравнению с CAR-T-клетками с одиночным KD PD-1 (Фиг. 22C). Эти результаты также наблюдались для CAR-T-клеток с одиночным KD (Фиг. 21B).[00312] To create two-in-one dual vectors expressing two shRNAs with different promoters (mU6 and hU6), the BstZ171-Xba1-Nde1-Bmt1-Spe1 (MCS) multiple cloning site was inserted into the pLV-hU6-shPD-1_δLNGFR- CD19-BBz downstream of transcription from the hU6 promoter. Fragments of the second mU6 shRNA cassette were subcloned into MCS. To limit the blockade of several immune checkpoints to CAR-T cells only, a two-in-one vector was designed to express two shRNAs with the mU6 and hU6 Pol Ⅲ promoters to repress the expression of the two immune checkpoints of CAR-T cells. To find effective siRNAs targeting CTLA-4, LAG-3, TIGIT, or TIM-3, siRNAs were electroporated into CD3/CD28-stimulated T cells. Two or more effective siRNAs were selected (FIG. 21A). A two-in-one vector for CAR-T cells with CTLA-4, LAG-3, TIGIT or TIM-3 knockdown was constructed by transforming 21mer siRNAs into shRNA format and finally selecting each immune checkpoint targeting shRNA (shCTLA-4: No. 1; shLAG-3: No. 1278; shTIGIT: No. 739; shTIM-3: No. 3), which significantly downregulate CAR-T expression and have less effect on CAR-T expansion (Fig. 21B-C) . Finally, PD-1_CTLA-4, PD-1_LAG-3, PD-1_TIGIT, or PD-1_TIM-3 CAR-T cells were constructed using a two-in-one dual vector (FIGS. 22A-22E) . All double KD CAR-T cells were less proliferated compared to PD-1 single KD CAR-T cells (Fig. 22C) . These results were also observed for single KD CAR-T cells (Figure 21B) .

[00313] В этом примере получали двойные векторы «два в одном». CAR-T-клетки с двойным KD получали с использованием двух векторов «два в одном», и их терапевтический потенциал дополнительно оценивали на мышиной модели in vivo, несущей CD19+PDL1+ опухоль крови, и на модели солидной опухоли в приведенном ниже примере.[00313] In this example, two-in-one double vectors were generated. Dual KD CAR-T cells were generated using two two-in-one vectors and their therapeutic potential was further evaluated in an in vivo mouse model carrying a CD19 + PDL1 + blood tumor and a solid tumor model in the example below.

Пример 10. Способы лечения CD19+ гемобластоза Example 10 Treatment Methods for CD19+ Hemoblastosis in vivoin vivo с использованием CAR-T-клеток с двойным KD, нацеленных на PD-1 и TIGIT using dual-KD CAR-T cells targeting PD-1 and TIGIT

[00314] В этом примере описываются способы лечения CD19+ гемобластоза in vivo с использованием CAR-T-клеток с двойным KD, нацеленных на две иммунные контрольные точки, включая следующие комбинации: PD-1 и CTLA-4, PD-1 и LAG-3, PD-1 и TIGIT, и PD-1 и TIM-3. [00314] This example describes methods of treating CD19+ hemoblastosis in vivo using dual KD CAR-T cells targeting two immune checkpoints, including the following combinations: PD-1 and CTLA-4, PD-1 and LAG-3 , PD-1 and TIGIT, and PD-1 and TIM-3.

[00315] Модель CD19+ опухоли крови получали как описано в примере 3. Был оценен противоопухолевый эффект CAR-T-клеток с KD PD-1_CTLA-4, PD-1_LAG-3, PD-1_TIGIT или PD-1_TIM-3 против CD19+ модели B-ОЛЛ модели. Каждый тип CAR-T-клеток вводили в однократной дозе 1 × 106 через 5 суток после инфузии целевых клеток. Было обнаружено, что PD-1_TIGIT KD CAR-T-клетки демонстрируют неожиданно превосходящий противоопухолевый эффект по сравнению с другими CAR-T клетками с двойным KD (Фиг. 23). Таким образом, PD-1_TIGIT KD CAR-T-клетки в модели солидной опухоли были дополнительно оценены в следующем примере. [00315] A model of CD19 + blood tumors was prepared as described in Example 3. The antitumor effect of CAR-T cells with KD PD-1_CTLA-4, PD-1_LAG-3, PD-1_TIGIT or PD-1_TIM-3 against CD19 + was evaluated. models B-ALL models. Each type of CAR-T cells was administered in a single dose of 1×10 6 5 days after target cell infusion. PD-1_TIGIT KD CAR-T cells were found to show an unexpectedly superior antitumor effect compared to other dual KD CAR-T cells (FIG. 23) . Thus, PD-1_TIGIT KD CAR-T cells in a solid tumor model were further evaluated in the following example.

Пример 11. Способы лечения на модели солидной опухоли с использованием CAR-T-клеток с двойным KD, нацеленных на PD-1 и TIGITExample 11 Treatment Methods in a Solid Tumor Model Using Dual KD CAR-T Cells Targeting PD-1 and TIGIT

[00316] В этом примере описаны способы лечения злокачественного новообразования на модели солидной опухоли с использованием CAR-T-клеток с двойным KD, нацеленных на PD-1 и TIGIT.[00316] This example describes methods of treating cancer in a solid tumor model using dual KD CAR-T cells targeting PD-1 and TIGIT.

Для получения модели солидной опухоли, мышам NSG в возрасте от 4 до 6 недель подкожно вводили 5 × 106 клеток IM-9 (CD19+ PD-L1+CD155+). Как только опухоли достигали объема 150~250мм 3 , CAR-T-клетки вводили внутривенно в однократной дозе 3×106. Опухоли отслеживали каждую неделю путем измерения штангенциркулем, а объем оценивали как (длина × ширина2)/2. Как показано на модели опухоли крови (Nalm-6-PDL1), PD-1_TIGIT KD CAR-T-клетки также были неожиданным образом наиболее эффективны против модели солидной опухоли (IM-9) (Фиг. 24). Блокада внутриклеточной части PD-1_TIGIT обладает неожиданным образом более высоким уровнем противоопухолевого эффекта, чем блокада PD-1.To obtain a solid tumor model, 4 to 6 weeks old NSG mice were injected subcutaneously with 5 x 10 6 IM-9 (CD19 + PD-L1 + CD155 + ) cells. Once the tumors reached a volume of 150~ 250mm 3 , CAR-T cells were injected intravenously in a single dose of 3×10 6 . Tumors were monitored every week by caliper measurement, and the volume was estimated as (length × width 2 )/2. As shown in the blood tumor model (Nalm-6-PDL1), PD-1_TIGIT KD CAR-T cells were also surprisingly most effective against the solid tumor model (IM-9) (FIG. 24) . Blockade of the intracellular portion of PD-1_TIGIT has an unexpectedly higher level of antitumor effect than blockade of PD-1.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST

<110> CUROCELL CO. LTD.<110> CUROCELL CO. Ltd.

KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGYKOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

<120> УЛУЧШЕННЫЕ ИММУННЫЕ КЛЕТКИ С ДВОЙНОЙ КШРНК И КОМПОЗИЦИИ,<120> IMPROVED IMMUNE CELLS WITH DOUBLE SHRNA AND COMPOSITIONS,

СОДЕРЖАЩИЕ ИХCONTAINING THEM

<130> 14570-001-228<130> 14570-001-228

<140> будет назначено<140> will be assigned

<141> Подан вместе с заявкой<141> Submitted along with the application

<150> KR 10-2018-0004238<150> KR 10-2018-0004238

<151> 12.01.2018<151> 01/12/2018

<160> 289<160> 289

<170> PatentIn версия 3.5<170> PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой GFP для<223> partial shRNA sequence included in the target GFP for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 1<400> 1

tctcggcatg gacgagctgt a 21tctcggcatg gacgagctgt a 21

<210> 2<210> 2

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 2<400> 2

tggaacccat tcctgaaatt a 21tggaacccat tcctgaaatt a 21

<210> 3<210> 3

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 3<400> 3

ggaacccatt cctgaaatta t 21ggaacccatt cctgaaatta t 21

<210> 4<210> 4

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 4<400> 4

gaacccattc ctgaaattat t 21gaacccattc ctgaaattat t 21

<210> 5<210> 5

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 5<400> 5

acccattcct gaaattattt a 21acccattcct gaaattattt a 21

<210> 6<210> 6

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 6<400> 6

cccattcctg aaattattta a 21cccattcctg aaattattta a 21

<210> 7<210> 7

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 7<400> 7

ccttccctgt ggttctatta t 21ccttccctgt ggttctatta t 21

<210> 8<210> 8

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 8<400> 8

cttccctgtg gttctattat a 21cttccctgtg gttctattat a 21

<210> 9<210> 9

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 9<400> 9

ttccctgtgg ttctattata t 21ttccctgtgg ttctattata t 21

<210> 10<210> 10

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 10<400> 10

tccctgtggt tctattatat t 21tccctgtggt tctattatat t 21

<210> 11<210> 11

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 11<400> 11

ccctgtggtt ctattatatt a 21ccctgtggtt ctattatatt a 21

<210> 12<210> 12

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 12<400> 12

cctgtggttc tattatatta t 21cctgtggttc tattatatta t 21

<210> 13<210> 13

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 13<400> 13

gatgaaaggg atgtgaatta t 21gatgaaaggg atgtgaatta t 21

<210> 14<210> 14

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 14<400> 14

gggagcctcc ctgatataaa t 21gggagcctcc ctgatataaa t 21

<210> 15<210> 15

<211> 19<211> 19

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 15<400> 15

ggaattcgct cagaagaaa 19ggaattcgct cagaagaaa 19

<210> 16<210> 16

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 16<400> 16

ggaccaaact gaagctatat t 21ggaccaaact gaagctatat t 21

<210> 17<210> 17

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 17<400> 17

agaactttgg tttcctttaa t 21agaactttgg tttcctttaa t 21

<210> 18<210> 18

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 18<400> 18

atgaaaggga tgtgaattat t 21atgaaaggga tgtgaattat t 21

<210> 19<210> 19

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 19<400> 19

tcttatcttc ggcgctttaa t 21tcttatcttc ggcgctttaa t 21

<210> 20<210> 20

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 20<400> 20

cttatcttcg gcgctttaat t 21cttatcttcg gcgctttaat t 21

<210> 21<210> 21

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 21<400> 21

ttatcttcgg cgctttaatt t 21ttatcttcgg cgctttaatt t 21

<210> 22<210> 22

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 22<400> 22

gaggagccca atgagtatta t 21gaggagccca atgagtatta t 21

<210> 23<210> 23

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 23<400> 23

aggagcccaa tgagtattat t 21aggagcccaa tgagtattat t 21

<210> 24<210> 24

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 24<400> 24

atagatccaa ccaccttatt t 21atagatccaa ccaccttatt t 21

<210> 25<210> 25

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 25<400> 25

atgtcattgc ctctgtattt a 21atgtcattgc ctctgtattt a 21

<210> 26<210> 26

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 26<400> 26

tgtcattgcc tctgtattta a 21tgtcattgcc tctgtattta a 21

<210> 27<210> 27

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 27<400> 27

accaccatgc ccagctaatt t 21accaccatgc ccagctaatt t 21

<210> 28<210> 28

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 28<400> 28

tgttgagatt taggcttatt t 21tgttgagatt taggcttatt t 21

<210> 29<210> 29

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 29<400> 29

gaccaaactg aagctatatt t 21gaccaaactg aagctatatt t 21

<210> 30<210> 30

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 30<400> 30

aggccttcag caatctatat t 21aggccttcag caatctatat t 21

<210> 31<210> 31

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 31<400> 31

ggccttcagc aatctatatt a 21ggccttcagc aatctatatt a 21

<210> 32<210> 32

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 32<400> 32

gagtggtccc taaacttaaa t 21gagtggtccc taaacttaaa t 21

<210> 33<210> 33

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 33<400> 33

agtggtccct aaacttaaat t 21agtggtccct aaacttaaat t 21

<210> 34<210> 34

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 34<400> 34

gtggtcccta aacttaaatt t 21gtggtcccta aacttaaatt t 21

<210> 35<210> 35

<211> 19<211> 19

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target TIM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 35<400> 35

ctaacacaaa tatccacat 19ctaacacaaa tatccacat 19

<210> 36<210> 36

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LAG-3 для<223> partial shRNA sequence included in target LAG-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 36<400> 36

tcagcagccc agtccaaata a 21tcagcagccc agtccaaata a 21

<210> 37<210> 37

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LAG-3 для<223> partial shRNA sequence included in target LAG-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 37<400> 37

cagcagccca gtccaaataa a 21cagcagccca gtccaaataa a 21

<210> 38<210> 38

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LAG-3 для<223> partial shRNA sequence included in target LAG-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 38<400> 38

tcaacgtctc catcatgtat a 21tcaacgtctc catcatgtat a 21

<210> 39<210> 39

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LAG-3 для<223> partial shRNA sequence included in target LAG-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 39<400> 39

caacgtctcc atcatgtata a 21caacgtctcc atcatgtata a 21

<210> 40<210> 40

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LAG-3 для<223> partial shRNA sequence included in target LAG-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 40<400> 40

ctggagacaa tggcgacttt a 21ctggagacaa tggcgacttt a 21

<210> 41<210> 41

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LAG-3 для<223> partial shRNA sequence included in target LAG-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 41<400> 41

ctcagcagcc cagtccaaat a 21ctcagcagcc cagtccaaat a 21

<210> 42<210> 42

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LAG-3 для<223> partial shRNA sequence included in target LAG-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 42<400> 42

agcagcccag tccaaataaa c 21agcagcccag tccaaataaa c 21

<210> 43<210> 43

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CTLA-4 для<223> partial shRNA sequence included in target CTLA-4 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 43<400> 43

gggatcaaag ctatctatat a 21gggatcaaag ctatctatat a 21

<210> 44<210> 44

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CTLA-4 для<223> partial shRNA sequence included in target CTLA-4 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 44<400> 44

ggatcaaagc tatctatata a 21ggatcaaagc tatctatata a 21

<210> 45<210> 45

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CTLA-4 для<223> partial shRNA sequence included in target CTLA-4 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 45<400> 45

ggcaacggaa cccagattta t 21ggcaacggaa cccagattta t 21

<210> 46<210> 46

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CTLA-4 для<223> partial shRNA sequence included in target CTLA-4 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 46<400> 46

tgaagaagag agtccatatt t 21tgaagaagag agtccatatt t 21

<210> 47<210> 47

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CTLA-4 для<223> partial shRNA sequence included in target CTLA-4 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 47<400> 47

ttggatgcgg aacccaaatt a 21ttggatgcgg aacccaaatt a 21

<210> 48<210> 48

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CTLA-4 для<223> partial shRNA sequence included in target CTLA-4 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 48<400> 48

agcatcactt gggattaata t 21agcatcactt gggattaata t 21

<210> 49<210> 49

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CTLA-4 для<223> partial shRNA sequence included in target CTLA-4 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 49<400> 49

tgatgtgggt caaggaatta a 21tgatgtgggt caaggaatta a 21

<210> 50<210> 50

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CTLA-4 для<223> partial shRNA sequence included in target CTLA-4 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 50<400> 50

agcgagggag aagactatat t 21agcgagggag aagactatat t 21

<210> 51<210> 51

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CTLA-4 для<223> partial shRNA sequence included in target CTLA-4 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 51<400> 51

tttacgtatg agacgtttat a 21tttacgtatgagacgtttat a 21

<210> 52<210> 52

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой BTLA для<223> partial shRNA sequence included in target BTLA for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 52<400> 52

gctcctgtat agtttacttc c 21gctcctgtat agtttacttc c 21

<210> 53<210> 53

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой BTLA для<223> partial shRNA sequence included in target BTLA for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 53<400> 53

ggaaattaac ctggttgatg c 21ggaaattaac ctggttgatg c 21

<210> 54<210> 54

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой BTLA для<223> partial shRNA sequence included in target BTLA for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 54<400> 54

gcaccaacag aatatgcatc c 21gcaccaacag aatatgcatc c 21

<210> 55<210> 55

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой BTLA для<223> partial shRNA sequence included in target BTLA for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 55<400> 55

gctcaacagg atgtcaaata a 21gctcaacagg atgtcaaata a 21

<210> 56<210> 56

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой BTLA для<223> partial shRNA sequence included in target BTLA for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 56<400> 56

gcatcttgct gttcttctta c 21gcatcttgct gttcttctta c 21

<210> 57<210> 57

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой BTLA для<223> partial shRNA sequence included in target BTLA for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 57<400> 57

gcatttgtgg acaacttatg t 21gcatttgtgg acaacttatg t 21

<210> 58<210> 58

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD160 для<223> partial shRNA sequence included in target CD160 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 58<400> 58

ggaacgcgac taaacttaat c 21ggaacgcgac taaacttaat c 21

<210> 59<210> 59

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD160 для<223> partial shRNA sequence included in target CD160 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 59<400> 59

gatgttcacc ataagccaag t 21gatgttcacc ataagccaag t 21

<210> 60<210> 60

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD160 для<223> partial shRNA sequence included in target CD160 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 60<400> 60

gcaagatgag tctgactatg g 21gcaagatgag tctgactatg g 21

<210> 61<210> 61

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD160 для<223> partial shRNA sequence included in target CD160 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 61<400> 61

ggcacagaga agaatgcaac a 21ggcacagaga agaatgcaac a 21

<210> 62<210> 62

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD160 для<223> partial shRNA sequence included in target CD160 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 62<400> 62

gggaagagat gctaaatata c 21gggaagagat gctaaatata c 21

<210> 63<210> 63

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD160 для<223> partial shRNA sequence included in target CD160 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 63<400> 63

gcaaatcagt gtaatccttg a 21gcaaatcagt gtaatccttg a 21

<210> 64<210> 64

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой VISTA для<223> partial shRNA sequence included in target VISTA for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 64<400> 64

gcaacttctc catcaccatg c 21gcaacttctc catcaccatg c 21

<210> 65<210> 65

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой VISTA для<223> partial shRNA sequence included in target VISTA for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 65<400> 65

gcaaagatgc accatccaac t 21gcaaagatgc accatccaac t 21

<210> 66<210> 66

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой VISTA для<223> partial shRNA sequence included in target VISTA for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 66<400> 66

gcggatggac agcaacattc a 21gcggatggac agcaacattc a 21

<210> 67<210> 67

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой VISTA для<223> partial shRNA sequence included in target VISTA for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 67<400> 67

ggacacttct gagtatgaag c 21ggacacttct gagtatgaag c 21

<210> 68<210> 68

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой VISTA для<223> partial shRNA sequence included in target VISTA for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 68<400> 68

gggaaccaca atgcacgaaa g 21gggaaccaca atgcacgaaa g 21

<210> 69<210> 69

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой VISTA для<223> partial shRNA sequence included in target VISTA for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 69<400> 69

ggtgctttcc aacacacttt c 21ggtgctttcc aacacacttt c 21

<210> 70<210> 70

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIGIT для<223> partial shRNA sequence included in target TIGIT for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 70<400> 70

gcttctggcc atttgtaatg c 21gcttctggcc atttgtaatg c 21

<210> 71<210> 71

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIGIT для<223> partial shRNA sequence included in target TIGIT for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 71<400> 71

gggagtactt ctgcatctat c 21gggagtactt ctgcatctat c 21

<210> 72<210> 72

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIGIT для<223> partial shRNA sequence included in target TIGIT for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 72<400> 72

gctgcatgac tacttcaatg t 21gctgcatgac tacttcaatg t 21

<210> 73<210> 73

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIGIT для<223> partial shRNA sequence included in target TIGIT for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 73<400> 73

taacgtggat cttgatcata a 21taacgtggat cttgatcata a 21

<210> 74<210> 74

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIGIT для<223> partial shRNA sequence included in target TIGIT for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 74<400> 74

ggagacatac acaggccttc a 21ggagacatac acaggccttc a 21

<210> 75<210> 75

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TIGIT для<223> partial shRNA sequence included in target TIGIT for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 75<400> 75

gcatttgggc cttgatctac c 21gcatttgggc cttgatctac c 21

<210> 76<210> 76

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой 2B4 для<223> partial shRNA sequence included in target 2B4 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 76<400> 76

gacaggttgc aaggcagttc t 21gacaggttgc aaggcagttc t 21

<210> 77<210> 77

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой 2B4 для<223> partial shRNA sequence included in target 2B4 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 77<400> 77

gggagtgcct cttcagttac a 21gggagtgcct cttcagttac a 21

<210> 78<210> 78

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой 2B4 для<223> partial shRNA sequence included in target 2B4 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 78<400> 78

ggacgaggag gttgacatta a 21ggacgaggag gttgacatta a 21

<210> 79<210> 79

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой 2B4 для<223> partial shRNA sequence included in target 2B4 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 79<400> 79

gaggagaaag aggaaggaga a 21gaggagaaag aggaaggaga a 21

<210> 80<210> 80

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой 2B4 для<223> partial shRNA sequence included in target 2B4 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 80<400> 80

gcccttcctt caatagcact a 21gcccttcctt caatagcact a 21

<210> 81<210> 81

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой 2B4 для<223> partial shRNA sequence included in target 2B4 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 81<400> 81

ggttgactgc atttctagac t 21ggttgactgc atttctagac t 21

<210> 82<210> 82

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-L1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-L1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 82<400> 82

gcatttgctg aacgcattta c 21gcatttgctg aacgcattta c 21

<210> 83<210> 83

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-L1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-L1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 83<400> 83

gctgcactaa ttgtctattg g 21gctgcactaa ttgtctattg g 21

<210> 84<210> 84

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-L1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-L1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 84<400> 84

ggatccagtc acctctgaac a 21ggatccagtc acctctgaac a 21

<210> 85<210> 85

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-L1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-L1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 85<400> 85

gcacatcctc caaatgaaag g 21gcacatcctc caaatgaaag g 21

<210> 86<210> 86

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-L1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-L1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 86<400> 86

ggattctcaa cctgtggttt a 21ggattctcaa cctgtggttt a 21

<210> 87<210> 87

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PD-L1 для<223> partial shRNA sequence included in target PD-L1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 87<400> 87

ggtgcttggt ctcctctata a 21ggtgcttggt ctcctctata a 21

<210> 88<210> 88

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-1 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 88<400> 88

gcacagtact cctggcttat c 21gcacagtact cctggcttat c 21

<210> 89<210> 89

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-1 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 89<400> 89

gcaacaggac cacagtcaag a 21gcaacaggac cacagtcaag a 21

<210> 90<210> 90

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-1 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 90<400> 90

gcaacaccac cctcagcata a 21gcaacaccac cctcagcata a 21

<210> 91<210> 91

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-1 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 91<400> 91

gcctgttcag agcactcatt c 21gcctgttcag agcactcatt c 21

<210> 92<210> 92

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-1 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 92<400> 92

gcagtaatgc cttctcctat t 21gcagtaatgc cttctcctat t 21

<210> 93<210> 93

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-1 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 93<400> 93

gcaccttggt gcttagctag a 21gcaccttggt gcttagctag a 21

<210> 94<210> 94

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 94<400> 94

gcttccatct atgaggaatt g 21gcttccatct atgaggaatt g 21

<210> 95<210> 95

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 95<400> 95

gccagagaac cagctataag t 21gccagagaac cagctataag t 21

<210> 96<210> 96

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 96<400> 96

gggtccctga tgaatatctg g 21gggtccctga tgaatatctg g 21

<210> 97<210> 97

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 97<400> 97

ggcttgcagg gaaagtgaat g 21ggcttgcagg gaaagtgaat g 21

<210> 98<210> 98

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 98<400> 98

gcttgcaggg aaagtgaatg g 21gcttgcaggg aaagtgaatg g 21

<210> 99<210> 99

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-3 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-3 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 99<400> 99

agcttccatc tatgaggaat t 21agcttccatc tatgaggaat t 21

<210> 100<210> 100

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-5 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-5 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 100<400> 100

ggaatccaga acgaattaag t 21ggaatccaga acgaattaag t 21

<210> 101<210> 101

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-5 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-5 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 101<400> 101

ggctgattga tgggaacatc c 21ggctgattga tgggaacatc c 21

<210> 102<210> 102

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-5 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-5 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 102<400> 102

ggactacagt caagacaatc a 21ggactacagt caagacaatc a 21

<210> 103<210> 103

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-5 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-5 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 103<400> 103

ggaccctcac tctattcaat g 21ggaccctcac tctattcaat g 21

<210> 104<210> 104

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-5 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-5 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 104<400> 104

gctactggcc gcaataattc c 21gctactggcc gcaataattc c 21

<210> 105<210> 105

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CEACAM-5 для<223> partial shRNA sequence included in target CEACAM-5 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 105<400> 105

gctctttgta tgacagaata c 21gctctttgta tgacagaata c 21

<210> 106<210> 106

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD96 для<223> partial shRNA sequence included in target CD96 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 106<400> 106

ggtccaaggt caccaataag a 21ggtccaaggt caccaataag a 21

<210> 107<210> 107

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD96 для<223> partial shRNA sequence included in target CD96 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 107<400> 107

gcaaccatac gatagaaata g 21gcaaccatac gatagaaata g 21

<210> 108<210> 108

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD96 для<223> partial shRNA sequence included in target CD96 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 108<400> 108

ggttctgaaa tttcctcaac a 21ggttctgaaa ttttcctcaac a 21

<210> 109<210> 109

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD96 для<223> partial shRNA sequence included in target CD96 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 109<400> 109

gcaagatatc cagctacatc t 21gcaagatatc cagctacatc t 21

<210> 110<210> 110

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD96 для<223> partial shRNA sequence included in target CD96 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 110<400> 110

gcaactcacc ctcttccatc t 21gcaactcacc ctcttccatc t 21

<210> 111<210> 111

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD96 для<223> partial shRNA sequence included in target CD96 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 111<400> 111

gctgcattcc ctaagataat t 21gctgcattcc ctaagataat t 21

<210> 112<210> 112

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LAIR1 для<223> partial shRNA sequence included in target LAIR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 112<400> 112

gggacagtag atccacatac a 21gggacagtag atccacatac a 21

<210> 113<210> 113

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LAIR1 для<223> partial shRNA sequence included in target LAIR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 113<400> 113

ggacaacagt cacaatgagc a 21ggacaacagt cacaatgagc a 21

<210> 114<210> 114

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LAIR1 для<223> partial shRNA sequence included in target LAIR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 114<400> 114

ggctgttgat gttctagaga g 21ggctgttgat gttctagaga g 21

<210> 115<210> 115

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LAIR1 для<223> partial shRNA sequence included in target LAIR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 115<400> 115

gcagacaagg ccacagtcaa t 21gcagacaagg ccacagtcaa t 21

<210> 116<210> 116

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LAIR1 для<223> partial shRNA sequence included in target LAIR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 116<400> 116

ggaggtttct aaccagcatc c 21ggaggtttct aaccagcatc c 21

<210> 117<210> 117

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LAIR1 для<223> partial shRNA sequence included in target LAIR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 117<400> 117

gccttgagac tgtgctatac a 21gccttgagac tgtgctatac a 21

<210> 118<210> 118

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой KLRG1 для<223> partial shRNA sequence included in target KLRG1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 118<400> 118

ccaagcccag aatgactatg g 21ccaagcccag aatgactatg g 21

<210> 119<210> 119

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой KLRG1 для<223> partial shRNA sequence included in target KLRG1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 119<400> 119

gccttcttgt tcttgccttg t 21gccttcttgt tcttgccttg t 21

<210> 120<210> 120

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой KLRG1 для<223> partial shRNA sequence included in target KLRG1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 120<400> 120

gcttctgact gcagttcttc t 21gcttctgact gcagttcttc t 21

<210> 121<210> 121

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой KLRG1 для<223> partial shRNA sequence included in target KLRG1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 121<400> 121

gctggatgaa atatggtaac c 21gctggatgaa atatggtaac c 21

<210> 122<210> 122

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой KLRG1 для<223> partial shRNA sequence included in target KLRG1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 122<400> 122

ggaaatgagc ctgctccaag t 21ggaaatgagc ctgctccaag t 21

<210> 123<210> 123

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой KLRG1 для<223> partial shRNA sequence included in target KLRG1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 123<400> 123

ggattggtct gaggaacaat t 21ggattggtct gaggaacaat t 21

<210> 124<210> 124

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой FAS для<223> partial shRNA sequence included in the target FAS for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 124<400> 124

gccaagaagg gaaggagtac a 21gccaagaagg gaaggagtac a 21

<210> 125<210> 125

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой FAS для<223> partial shRNA sequence included in the target FAS for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 125<400> 125

gccaattcca ctaattgttt g 21gccaattcca ctaattgttt g 21

<210> 126<210> 126

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой FAS для<223> partial shRNA sequence included in the target FAS for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 126<400> 126

ggttctcatg aatctccaac t 21ggttctcatg aatctccaac t 21

<210> 127<210> 127

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой FAS для<223> partial shRNA sequence included in the target FAS for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 127<400> 127

gctggagtca tgacactaag t 21gctggagtca tgacactaag t 21

<210> 128<210> 128

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой FAS для<223> partial shRNA sequence included in the target FAS for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 128<400> 128

gcctggtttg gagatactaa c 21gcctggtttg gagatactaa c 21

<210> 129<210> 129

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой FAS для<223> partial shRNA sequence included in the target FAS for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 129<400> 129

ggaaccacct aaagaacttc c 21ggaacccacct aaagaacttc c 21

<210> 130<210> 130

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой Cbl-b для<223> partial shRNA sequence included in target Cbl-b for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 130<400> 130

ccgcgttgat ttaaagaaag a 21ccgcgttgat ttaaagaaag a 21

<210> 131<210> 131

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой Cbl-b для<223> partial shRNA sequence included in target Cbl-b for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 131<400> 131

gcctgataca tatcagcatt t 21gcctgataca tatcagcatt t 21

<210> 132<210> 132

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой Cbl-b для<223> partial shRNA sequence included in target Cbl-b for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 132<400> 132

gcggaattgg aatttcttag c 21gcggaattgg aatttcttag c 21

<210> 133<210> 133

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой Cbl-b для<223> partial shRNA sequence included in target Cbl-b for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 133<400> 133

gcacgactac agaaatatag c 21gcacgactac agaaatatag c 21

<210> 134<210> 134

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой Cbl-b для<223> partial shRNA sequence included in target Cbl-b for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 134<400> 134

tttccggtta agttgcactc g 21tttccggtta agttgcactc g 21

<210> 135<210> 135

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой Cbl-b для<223> partial shRNA sequence included in target Cbl-b for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 135<400> 135

gcctggatct aattcagaaa g 21gcctggatct aattcagaaa g 21

<210> 136<210> 136

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LRR1 для<223> partial shRNA sequence included in target LRR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 136<400> 136

gaaagccact gttcggttaa a 21gaaagccact gttcggttaa a 21

<210> 137<210> 137

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LRR1 для<223> partial shRNA sequence included in target LRR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 137<400> 137

tcctgtggat atctgtctaa g 21tcctgtggat atctgtctaa g 21

<210> 138<210> 138

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LRR1 для<223> partial shRNA sequence included in target LRR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 138<400> 138

ggctcataga ggctgtaatg t 21ggctcataga ggctgtaatg t 21

<210> 139<210> 139

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LRR1 для<223> partial shRNA sequence included in target LRR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 139<400> 139

gggcttgtcc gagttgatat g 21gggcttgtcc gagttgatat g 21

<210> 140<210> 140

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LRR1 для<223> partial shRNA sequence included in target LRR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 140<400> 140

aagatttgga taccgcaaaa a 21aagatttgga taccgcaaaa a 21

<210> 141<210> 141

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой LRR1 для<223> partial shRNA sequence included in target LRR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 141<400> 141

gtggtactga agcacctatt a 21gtggtactga agcacctatt a 21

<210> 142<210> 142

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TGFBR1 для<223> partial shRNA sequence included in target TGFBR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 142<400> 142

gcttgttcag agaacaattg c 21gcttgttcag agaacaattg c 21

<210> 143<210> 143

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TGFBR1 для<223> partial shRNA sequence included in target TGFBR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 143<400> 143

ggagattgtt ggtacccaag g 21ggagattgtt ggtacccaag g 21

<210> 144<210> 144

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TGFBR1 для<223> partial shRNA sequence included in target TGFBR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 144<400> 144

gcagctaggc ttacagcatt g 21gcagctaggc ttacagcatt g 21

<210> 145<210> 145

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TGFBR1 для<223> partial shRNA sequence included in target TGFBR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 145<400> 145

ggtcctttct gtgcactatg a 21ggtccttttct gtgcactatg a 21

<210> 146<210> 146

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TGFBR1 для<223> partial shRNA sequence included in target TGFBR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 146<400> 146

ggtggtagct aaagaacatt c 21ggtggtagct aaagaacatt c 21

<210> 147<210> 147

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой TGFBR1 для<223> partial shRNA sequence included in target TGFBR1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 147<400> 147

ggacctgtct acaggtgatc t 21ggacctgtct acaggtgatc t 21

<210> 148<210> 148

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DNMT3A для<223> partial shRNA sequence included in target DNMT3A for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 148<400> 148

gccaaggtca ttgcaggaat g 21gccaaggtca ttgcaggaat g 21

<210> 149<210> 149

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DNMT3A для<223> partial shRNA sequence included in target DNMT3A for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 149<400> 149

gcagaacaag cccatgattg a 21gcagaacaag cccatgattg a 21

<210> 150<210> 150

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DNMT3A для<223> partial shRNA sequence included in target DNMT3A for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 150<400> 150

cccaaggtca aggagattat t 21cccaaggtca aggagattat t 21

<210> 151<210> 151

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DNMT3A для<223> partial shRNA sequence included in target DNMT3A for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 151<400> 151

gcagaagtgc cggaacattg a 21gcagaagtgc cggaacattg a 21

<210> 152<210> 152

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DNMT3A для<223> partial shRNA sequence included in target DNMT3A for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 152<400> 152

gcgtcacaca gaagcatatc c 21gcgtcacaca gaagcatatc c 21

<210> 153<210> 153

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DNMT3A для<223> partial shRNA sequence included in target DNMT3A for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 153<400> 153

ccggctcttc tttgagttct a 21ccggctcttc tttgagttct a 21

<210> 154<210> 154

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой A2aR для<223> partial shRNA sequence included in target A2aR for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 154<400> 154

cagaacgtca ccaactactt t 21cagaacgtca ccaactactt t 21

<210> 155<210> 155

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой A2aR для<223> partial shRNA sequence included in target A2aR for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 155<400> 155

ccatgctagg ttggaacaac t 21ccatgctagg ttggaacaac t 21

<210> 156<210> 156

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой A2aR для<223> partial shRNA sequence included in target A2aR for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 156<400> 156

ccaagtggcc tgtctctttg a 21ccaagtggcc tgtctctttg a 21

<210> 157<210> 157

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой A2aR для<223> partial shRNA sequence included in target A2aR for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 157<400> 157

ggtgtctatt tgcggatctt c 21ggtgtctatt tgcggatctt c 21

<210> 158<210> 158

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой A2aR для<223> partial shRNA sequence included in target A2aR for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 158<400> 158

agaccttccg caagatcatt c 21agaccttccg caagatcatt c 21

<210> 159<210> 159

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой A2aR для<223> partial shRNA sequence included in target A2aR for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 159<400> 159

tccttagcca tgagctcaag g 21tccttagcca tgagctcaag g 21

<210> 160<210> 160

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой Cbl-c для<223> partial shRNA sequence included in target Cbl-c for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 160<400> 160

gaaagtactg tggacacatg t 21gaaagtactg tggacacatg t 21

<210> 161<210> 161

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой Cbl-c для<223> partial shRNA sequence included in target Cbl-c for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 161<400> 161

gcacgtgtcc atcttcgagt t 21gcacgtgtcc atcttcgagt t 21

<210> 162<210> 162

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой Cbl-c для<223> partial shRNA sequence included in target Cbl-c for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 162<400> 162

ggccaacact cctcaagaac t 21ggccaacact cctcaagaac t 21

<210> 163<210> 163

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой Cbl-c для<223> partial shRNA sequence included in target Cbl-c for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 163<400> 163

ggcttctacc tctacccaga t 21ggcttctacc tctacccaga t 21

<210> 164<210> 164

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой Cbl-c для<223> partial shRNA sequence included in target Cbl-c for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 164<400> 164

ggccatggac tccacatttg a 21ggccatggac tccacatttg a 21

<210> 165<210> 165

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой Cbl-c для<223> partial shRNA sequence included in target Cbl-c for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 165<400> 165

ggccgtgagt atctaccagt t 21ggccgtgagt atctaccagt t 21

<210> 166<210> 166

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DGK-альфа для<223> partial shRNA sequence included in target DGK-alpha for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 166<400> 166

gccagaagac aagttagaat t 21gccagaagac aagttagaat t 21

<210> 167<210> 167

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DGK-альфа для<223> partial shRNA sequence included in target DGK-alpha for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 167<400> 167

gctctggaag ttccagtata t 21gctctggaag ttccagtata t 21

<210> 168<210> 168

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DGK-альфа для<223> partial shRNA sequence included in target DGK-alpha for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 168<400> 168

ggaaatgatc tggctcgatg c 21ggaaatgatc tggctcgatg c 21

<210> 169<210> 169

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DGK-альфа для<223> partial shRNA sequence included in target DGK-alpha for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 169<400> 169

gcaaagatcc tcaaggattt a 21gcaaagatcc tcaaggattt a 21

<210> 170<210> 170

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DGK-альфа для<223> partial shRNA sequence included in target DGK-alpha for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 170<400> 170

ggatgcctct attgctcatc g 21ggatgcctct attgctcatc g 21

<210> 171<210> 171

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DGK-альфа для<223> partial shRNA sequence included in target DGK-alpha for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 171<400> 171

gctatggtac ttcgaatttg c 21gctatggtac ttcgaatttg c 21

<210> 172<210> 172

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DGK-дзета для<223> partial shRNA sequence included in target DGK-zeta for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 172<400> 172

ggaagggatt ccagcagaag t 21ggaagggatt ccagcagaag t 21

<210> 173<210> 173

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DGK-дзета для<223> partial shRNA sequence included in target DGK-zeta for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 173<400> 173

gcaaggagat tgtggccatc a 21gcaaggagat tgtggccatc a 21

<210> 174<210> 174

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DGK-дзета для<223> partial shRNA sequence included in target DGK-zeta for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 174<400> 174

gggcatcctt caagaggaag t 21gggcatcctt caagaggaag t 21

<210> 175<210> 175

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DGK-дзета для<223> partial shRNA sequence included in target DGK-zeta for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 175<400> 175

gcaaagatca tccagtcttt c 21gcaaagatca tccagtcttt c 21

<210> 176<210> 176

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DGK-дзета для<223> partial shRNA sequence included in target DGK-zeta for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 176<400> 176

gctggagatg taccgcaaag t 21gctggagatg taccgcaaag t 21

<210> 177<210> 177

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой DGK-дзета для<223> partial shRNA sequence included in target DGK-zeta for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 177<400> 177

gcacaggatg agatttatat c 21gcacaggatg agatttatat c 21

<210> 178<210> 178

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой MerTK для<223> partial shRNA sequence included in target MerTK for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 178<400> 178

ggaagaccac atacaggaaa c 21ggaagaccac atacaggaaa c 21

<210> 179<210> 179

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой MerTK для<223> partial shRNA sequence included in target MerTK for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 179<400> 179

gcattggtgt ttcctgcatg a 21gcattggtgt ttcctgcatg a 21

<210> 180<210> 180

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой MerTK для<223> partial shRNA sequence included in target MerTK for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 180<400> 180

gcacacggtt gggtagatta t 21gcacacggtt gggtagatta t 21

<210> 181<210> 181

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой MerTK для<223> partial shRNA sequence included in target MerTK for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 181<400> 181

gggtctgtaa tggaaggaaa t 21gggtctgtaa tggaaggaaa t 21

<210> 182<210> 182

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой MerTK для<223> partial shRNA sequence included in target MerTK for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 182<400> 182

gcatgttgcg agatgacatg a 21gcatgttgcg agatgacatg a 21

<210> 183<210> 183

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой MerTK для<223> partial shRNA sequence included in target MerTK for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 183<400> 183

gcagaccgag tctacacaag t 21gcagaccgag tctacacaag t 21

<210> 184<210> 184

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой SHP1 для<223> partial shRNA sequence included in target SHP1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 184<400> 184

gcaccatcat ccacctcaag t 21gcaccatcat ccacctcaag t 21

<210> 185<210> 185

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой SHP1 для<223> partial shRNA sequence included in target SHP1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 185<400> 185

ggtcacccac atcaaggtca t 21ggtcacccac atcaaggtca t 21

<210> 186<210> 186

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой SHP1 для<223> partial shRNA sequence included in target SHP1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 186<400> 186

gggcaagaac cgctacaaga a 21gggcaagaac cgctacaaga a 21

<210> 187<210> 187

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой SHP1 для<223> partial shRNA sequence included in target SHP1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 187<400> 187

ggaacaaatg cgtcccatac t 21ggaacaaatg cgtcccatac t 21

<210> 188<210> 188

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой SHP1 для<223> partial shRNA sequence included in target SHP1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 188<400> 188

gcctggactg tgacattgac a 21gcctggactg tgacattgac a 21

<210> 189<210> 189

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой SHP1 для<223> partial shRNA sequence included in target SHP1 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 189<400> 189

gaacctgcac actaagaaca a 21gaacctgcac actaagaaca a 21

<210> 190<210> 190

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой SHP2 для<223> partial shRNA sequence included in target SHP2 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 190<400> 190

gcagatccta cctctgaaag g 21gcagatccta cctctgaaag g 21

<210> 191<210> 191

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой SHP2 для<223> partial shRNA sequence included in target SHP2 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 191<400> 191

gcaatgacgg caagtctaaa g 21gcaatgacgg caagtctaaa g 21

<210> 192<210> 192

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой SHP2 для<223> partial shRNA sequence included in target SHP2 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 192<400> 192

ggaactgaaa tacgacgttg g 21ggaactgaaa tacgacgttg g 21

<210> 193<210> 193

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой SHP2 для<223> partial shRNA sequence included in target SHP2 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 193<400> 193

gcgtgttagg aacgtcaaag a 21gcgtgttagg aacgtcaaag a 21

<210> 194<210> 194

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой SHP2 для<223> partial shRNA sequence included in target SHP2 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 194<400> 194

gctcatgact atacgctaag a 21gctcatgact atacgctaag a 21

<210> 195<210> 195

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой SHP2 для<223> partial shRNA sequence included in target SHP2 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 195<400> 195

ggagagaacg gtctggcaat a 21ggagagaacg gtctggcaat a 21

<210> 196<210> 196

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PP2A для<223> partial shRNA sequence included in target PP2A for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 196<400> 196

gcagctgaac gagaaccaag t 21gcagctgaac gagaaccaag t 21

<210> 197<210> 197

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PP2A для<223> partial shRNA sequence included in target PP2A for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 197<400> 197

ggagactgtg actcttcttg t 21ggagactgtg actcttcttg t 21

<210> 198<210> 198

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PP2A для<223> partial shRNA sequence included in target PP2A for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 198<400> 198

ggaatgccaa cgtttggaaa t 21ggaatgccaa cgtttggaaa t 21

<210> 199<210> 199

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PP2A для<223> partial shRNA sequence included in target PP2A for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 199<400> 199

ggatcgttta caggaagttc c 21ggatcgttta caggaagttc c 21

<210> 200<210> 200

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PP2A для<223> partial shRNA sequence included in target PP2A for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 200<400> 200

gcctttgtat gtggaagtat a 21gcctttgtat gtggaagtat a 21

<210> 201<210> 201

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой PP2A для<223> partial shRNA sequence included in target PP2A for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 201<400> 201

gcctgctgta tttatagtaa c 21gcctgctgta tttatagtaa c 21

<210> 202<210> 202

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD45 для<223> partial shRNA sequence included in target CD45 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 202<400> 202

gctgcacatc aaggagtaat t 21gctgcacatc aaggagtaat t 21

<210> 203<210> 203

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD45 для<223> partial shRNA sequence included in target CD45 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 203<400> 203

gctggaaata ctctggttag a 21gctggaaata ctctggttag a 21

<210> 204<210> 204

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD45 для<223> partial shRNA sequence included in target CD45 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 204<400> 204

ggagcttgtt gaaagggatg a 21ggagcttgtt gaaagggatg a 21

<210> 205<210> 205

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD45 для<223> partial shRNA sequence included in target CD45 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 205<400> 205

gcagaatact ggccgtcaat g 21gcagaatact ggccgtcaat g 21

<210> 206<210> 206

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD45 для<223> partial shRNA sequence included in target CD45 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 206<400> 206

ggttatgttg tcaagctaag g 21ggttatgttg tcaagctaag g 21

<210> 207<210> 207

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD45 для<223> partial shRNA sequence included in target CD45 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 207<400> 207

gcagaaccca aggaattaat c 21gcagaaccca aggaattaat c 21

<210> 208<210> 208

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD148 для<223> partial shRNA sequence included in target CD148 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 208<400> 208

ggtgtaacat cacaggctta c 21ggtgtaacat cacaggctta c 21

<210> 209<210> 209

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD148 для<223> partial shRNA sequence included in target CD148 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 209<400> 209

gccatagagt tcaggacaaa t 21gccatagagt tcaggacaaa t 21

<210> 210<210> 210

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD148 для<223> partial shRNA sequence included in target CD148 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 210<400> 210

gcaattctcg ggtagaaata a 21gcaattctcg ggtagaaata a 21

<210> 211<210> 211

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD148 для<223> partial shRNA sequence included in target CD148 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 211<400> 211

gctggcttca ccaacattac c 21gctggcttca ccaacattac c 21

<210> 212<210> 212

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD148 для<223> partial shRNA sequence included in target CD148 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 212<400> 212

gggagcaaat catctgcatt c 21gggagcaaat catctgcatt c 21

<210> 213<210> 213

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой CD148 для<223> partial shRNA sequence included in target CD148 for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 213<400> 213

gcgactcaaa tatcaccttg a 21gcgactcaaa tatcaccttg a 21

<210> 214<210> 214

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой ИЛ-10R для<223> partial shRNA sequence included in target IL-10R for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 214<400> 214

gctcctgagg tatggaatag a 21gctcctgagg tatggaatag a 21

<210> 215<210> 215

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой ИЛ-10R для<223> partial shRNA sequence included in target IL-10R for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 215<400> 215

gcaaatgaca catatgaaag c 21gcaaatgaca catatgaaag c 21

<210> 216<210> 216

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой ИЛ-10R для<223> partial shRNA sequence included in target IL-10R for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 216<400> 216

ggtctaaaga ggagtgcatc t 21ggtctaaaga ggagtgcatc t 21

<210> 217<210> 217

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой ИЛ-10R для<223> partial shRNA sequence included in target IL-10R for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 217<400> 217

gggctatttg aaacaggatc c 21gggctatttg aaacaggatc c 21

<210> 218<210> 218

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой ИЛ-10R для<223> partial shRNA sequence included in target IL-10R for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 218<400> 218

gctgtaggaa tggaagcttc a 21gctgtaggaa tggaagcttc a 21

<210> 219<210> 219

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> частичная последовательность кшРНК, включенная в целевой ИЛ-10R для<223> partial shRNA sequence included in target IL-10R for

РНК-интерференцииRNA interference

<400> 219<400> 219

gcttgtgttt gctgctaatg t 21gcttgtgttt gctgctaatg t 21

<210> 220<210> 220

<211> 726<211> 726

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> mU6-shTIM-3-><-shPD-1-hU6<223> mU6-shTIM-3-><-shPD-1-hU6

<400> 220<400> 220

gttaacaagg tcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata 6060

cgatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta 120cgatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta 120

gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta 180180 gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa

tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct 240240

ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc gcctgtggtt ctattatatt atttcaagag 300ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc gcctgtggtt ctattatatt atttcaagag 300

aataatataa tagaaccaca ggtttttgac tagtcaaaaa ggaattcgct cagaagaaat 360360

ctcttgaatt tcttctgagc gaattccaaa caaggctttt ctccaaggga tatttatagt 420ctcttgaatt tcttctgagc gaattccaaa caaggctttt ctccaaggga tatttatagt 420

ctcaaaacac acaattactt tacagttagg gtgagtttcc ttttgtgctg ttttttaaaa 480ctcaaaacac acaattactt tacagttagg gtgagtttcc ttttgtgctg ttttttaaaa 480

taataattta gtatttgtat ctcttataga aatccaagcc tatcatgtaa aatgtagcta 540taataattta gtatttgtat ctcttataga aatccaagcc tatcatgtaa aatgtagcta 540

gtattaaaaa gaacagatta tctgtctttt atcgcacatt aagcctctat agttactagg 600gtattaaaaa gaacagatta tctgtctttt atcgcacatt aagcctctat agttactagg 600

aaatattata tgcaaattaa ccggggcagg ggagtagccg agcttctccc acaagtctgt 660aaatattata tgcaaattaa ccggggcagg ggagtagccg agcttctccc acaagtctgt 660

gcgagggggc cggcgcgggc ctagagatgg cggcgtcgga tcgctagcca tatgtctaga 720gcgaggggggc cggcgcgggc ctagagatgg cggcgtcgga tcgctagcca tatgtctaga 720

gtatac 726gtatac 726

<210> 221<210> 221

<211> 726<211> 726

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> shTIM-3-mU6<-->hU6-shPD-1<223> shTIM-3-mU6<-->hU6-shPD-1

<400> 221<400> 221

gttaaccaaa aacctgtggt tctattatat tattctcttg aaataatata atagaaccac 60gttaaccaaa aacctgtggt tctattatat tattctcttg aaataatata atagaaccac 60

aggcggtgtt tcgtcctttc cacaagatat ataaagccaa gaaatcgaaa tactttcaag 120aggcggtgtt tcgtcctttc cacaagatat ataaagccaa gaaatcgaaa tactttcaag 120

ttacggtaag catatgatag tccattttaa aacataattt taaaactgca aactacccaa 180ttacggtaag catatgatag tccattttaa aacataattt taaaactgca aactacccaa 180

gaaattatta ctttctacgt cacgtatttt gtactaatat ctttgtgttt acagtcaaat 240gaaattatta ctttctacgt cacgtatttt gtactaatat ctttgtgttt acagtcaaat 240

taattctaat tatctctcta acagccttgt atcgtatatg caaatatgaa ggaatcatgg 300taattctaat tatctctcta acagccttgt atcgtatatg caaatatgaa ggaatcatgg 300

gaaataggcc ctcttcctgc ccgaccttac tagtgatccg acgccgccat ctctaggccc 360gaaataggcc ctcttcctgc ccgaccttac tagtgatccg acgccgccat ctctaggccc 360

gcgccggccc cctcgcacag acttgtggga gaagctcggc tactcccctg ccccggttaa 420gcgccggccc cctcgcacag acttgtggga gaagctcggc tactcccctg ccccggttaa 420

tttgcatata atatttccta gtaactatag aggcttaatg tgcgataaaa gacagataat 480tttgcatata atatttccta gtaactatag aggcttaatg tgcgataaaa gacagataat 480

ctgttctttt taatactagc tacattttac atgataggct tggatttcta taagagatac 540540

aaatactaaa ttattatttt aaaaaacagc acaaaaggaa actcacccta actgtaaagt 600aaatactaaa ttattatttt aaaaaacagc acaaaaggaa actcacccta actgtaaagt 600

aattgtgtgt tttgagacta taaatatccc ttggagaaaa gccttgtttg gaattcgctc 660aattgtgtgt tttgagacta taaatatccc ttggagaaaa gccttgtttg gaattcgctc 660

agaagaaatt caagagattt cttctgagcg aattcctttt tggctagcca tatgtctaga 720agaagaaatt caagagattt cttctgagcg aattcctttt tggctagcca tatgtctaga 720

gtatac 726gtatac 726

<210> 222<210> 222

<211> 385<211> 385

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> последовательность оснований кассеты кшРНК<223> shRNA cassette base sequence

<220><220>

<221> прочий_признак<221> other_characteristic

<222> (323)..(343)<222> (323)..(343)

<223> n представляет собой a, c, g или t<223> n is a, c, g or t

<220><220>

<221> прочий_признак<221> other_characteristic

<222> (353)..(373)<222> (353)..(373)

<223> n представляет собой a, c, g или t<223> n is a, c, g or t

<400> 222<400> 222

gttaacgatc cgacgccgcc atctctaggc ccgcgccggc cccctcgcac agacttgtgg 60gttaacgatc cgacgccgcc atctctaggc ccgcgccggc cccctcgcac agacttgtgg 60

gagaagctcg gctactcccc tgccccggtt aatttgcata taatatttcc tagtaactat 120gagaagctcg gctactcccc tgccccggtt aatttgcata taatatttcc tagtaactat 120

agaggcttaa tgtgcgataa aagacagata atctgttctt tttaatacta gctacatttt 180agaggcttaa tgtgcgataa aagacagata atctgttctt tttaatacta gctacatttt 180

acatgatagg cttggatttc tataagagat acaaatacta aattattatt ttaaaaaaca 240acatgatagg cttggatttc tataagagat acaaatacta aattattatt ttaaaaaaca 240

gcacaaaagg aaactcaccc taactgtaaa gtaattgtgt gttttgagac tataaatatc 300gcacaaaagg aaactcaccc taactgtaaa gtaattgtgt gttttgagac tataaatatc 300

ccttggagaa aagccttgtt tgnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnttcaaga gannnnnnnn 360ccttggagaa aagccttgtt tgnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnttcaaga gannnnnnnn 360

nnnnnnnnnn nnntttttgg ttaac 385nnnnnnnnnn nnntttttgg ttaac 385

<210> 223<210> 223

<211> 409<211> 409

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> последовательность оснований mU6-shPD-1 MCS<223> mU6-shPD-1 MCS base sequence

<400> 223<400> 223

gttaacgatc cgacgccgcc atctctaggc ccgcgccggc cccctcgcac agacttgtgg 60gttaacgatc cgacgccgcc atctctaggc ccgcgccggc cccctcgcac agacttgtgg 60

gagaagctcg gctactcccc tgccccggtt aatttgcata taatatttcc tagtaactat 120gagaagctcg gctactcccc tgccccggtt aatttgcata taatatttcc tagtaactat 120

agaggcttaa tgtgcgataa aagacagata atctgttctt tttaatacta gctacatttt 180agaggcttaa tgtgcgataa aagacagata atctgttctt tttaatacta gctacatttt 180

acatgatagg cttggatttc tataagagat acaaatacta aattattatt ttaaaaaaca 240acatgatagg cttggatttc tataagagat acaaatacta aattattatt ttaaaaaaca 240

gcacaaaagg aaactcaccc taactgtaaa gtaattgtgt gttttgagac tataaatatc 300gcacaaaagg aaactcaccc taactgtaaa gtaattgtgt gttttgagac tataaatatc 300

ccttggagaa aagccttgtt tgcctgtggt tctattatat tatttcaaga gaataatata 360360

atagaaccac aggtttttga ctagtgctag ccatatgtct agagtatac 409atagaaccac aggtttttga ctagtgctag ccatatgtct aggtatac 409

<210> 224<210> 224

<211> 328<211> 328

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> последовательность оснований hU6-shPD-1<223> base sequence hU6-shPD-1

<400> 224<400> 224

gttaacaagg tcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata 6060

cgatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta 120cgatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta 120

gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta 180180 gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa

tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct 240240

ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc gcctgtggtt ctattatatt atttcaagag 300ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc gcctgtggtt ctattatatt atttcaagag 300

aataatataa tagaaccaca ggtttttg 328aataatataa tagaaccaca ggttttttg 328

<210> 225<210> 225

<211> 468<211> 468

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CD22-CAR<223> CD22-CAR

<400> 225<400> 225

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser GlnGln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 151 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser AsnThr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30 20 25 30

Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu GluSer Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45 35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr AlaTrp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60 50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys AsnVal Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 8065 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala ValGln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe AspTyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp

100 105 110 100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly GlyIle Trp Gly Glyn Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met ThrSer Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr

130 135 140 130 135 140

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr IleGln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

145 150 155 160145 150 155 160

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr GlnThr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

165 170 175 165 170 175

Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser SerGln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser

180 185 190 180 185 190

Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly ThrLeu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr

195 200 205 195 200 205

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala ThrAsp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr

210 215 220 210 215 220

Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln GlyTyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly

225 230 235 240225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr ProThr Lys Leu Glu Ile Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

245 250 255 245 250 255

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala CysAla Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

260 265 270 260 265 270

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe AlaArg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

275 280 285 275 280 285

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val LeuCys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

290 295 300 290 295 300

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys LysLeu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys

305 310 315 320305 310 315 320

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr ThrLeu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

325 330 335 325 330 335

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu GlyGln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

340 345 350 340 345 350

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro AlaGly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

355 360 365 355 360 365

Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly ArgTyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

370 375 380 370 375 380

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro GluArg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

385 390 395 400385 390 395 400

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr AsnMet Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

405 410 415 405 410 415

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly MetGlu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

420 425 430 420 425 430

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln GlyLys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

435 440 445 435 440 445

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln AlaLeu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

450 455 460 450 455 460

Leu Pro Pro ArgLeu Pro Pro Arg

465465

<210> 226<210> 226

<211> 486<211> 486

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CD19-CAR<223> CD19-CAR

<400> 226<400> 226

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu LeuMet Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 151 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser LeuHis Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30 20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser GlnSer Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45 35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly ThrAsp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60 50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val ProVal Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 8065 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr IleSer Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95 85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln GlySer Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110 100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile ThrAsn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125 115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser GluGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

130 135 140 130 135 140

Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln SerVal Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser

145 150 155 160145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr GlyLeu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175 165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu GlyVal Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190 180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys SerVal Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205 195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu LysArg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys

210 215 220 210 215 220

Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala LysMet Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln GlyHis Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255 245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro ProThr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270 260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro GluThr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285 275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu AspAla Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300 290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys GlyPhe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly ArgVal Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

325 330 335 325 330 335

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val GlnLys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

340 345 350 340 345 350

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu GluThr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

355 360 365 355 360 365

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp AlaGlu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

370 375 380 370 375 380

Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn LeuPro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

385 390 395 400385 390 395 400

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg AspGly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

405 410 415 405 410 415

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly LeuPro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

420 425 430 420 425 430

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu IleTyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

435 440 445 435 440 445

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu TyrGly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

450 455 460 450 455 460

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His MetGln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

465 470 475 480465 470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro ArgGln Ala Leu Pro Pro Arg

485 485

<210> 227<210> 227

<211> 782<211> 782

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Дельта LNGFR_P2A_CD19-CAR<223> Delta LNGFR_P2A_CD19-CAR

<400> 227<400> 227

Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu LeuMet Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu

1 5 10 151 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala CysLeu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys

20 25 30 20 25 30

Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys AsnPro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn

35 40 45 35 40 45

Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val CysLeu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys

50 55 60 50 55 60

Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala ThrGlu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr

65 70 75 8065 70 75 80

Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met SerGlu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser

85 90 95 85 90 95

Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr GlyAla Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly

100 105 110 100 105 110

Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val CysTyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys

115 120 125 115 120 125

Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn ThrGlu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr

130 135 140 130 135 140

Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn HisVal Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His

145 150 155 160145 150 155 160

Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg GlnVal Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln

165 170 175 165 170 175

Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile ProLeu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro

180 185 190 180 185 190

Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser ThrGly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr

195 200 205 195 200 205

Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu IleAla Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile

210 215 220 210 215 220

Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser GlnAla Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln

225 230 235 240225 230 235 240

Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr CysPro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr Cys

245 250 255 245 250 255

Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala PheSer Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe

260 265 270 260 265 270

Lys Arg Trp Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln AlaLys Arg Trp Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala

275 280 285 275 280 285

Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Ala Leu Pro Val Thr Ala LeuGly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu

290 295 300 290 295 300

Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asp Ile GlnLeu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln

305 310 315 320305 310 315 320

Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg ValMet Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val

325 330 335 325 330 335

Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn TrpThr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp

340 345 350 340 345 350

Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His ThrTyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr

355 360 365 355 360 365

Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly SerSer Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

370 375 380 370 375 380

Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp IleGly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile

385 390 395 400385 390 395 400

Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe GlyAla Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly

405 410 415 405 410 415

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

420 425 430 420 425 430

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly ProGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro

435 440 445 435 440 445

Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val SerGly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser

450 455 460 450 455 460

Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro ProGly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro

465 470 475 480465 470 475 480

Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr ThrArg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr

485 490 495 485 490 495

Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp AsnTyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn

500 505 510 500 505 510

Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp AspSer Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp

515 520 525 515 520 525

Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser TyrThr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr

530 535 540 530 535 540

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser ThrAla Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr

545 550 555 560545 550 555 560

Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala SerThr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser

565 570 575 565 570 575

Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly GlyGln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly

580 585 590 580 585 590

Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile TrpAla Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp

595 600 605 595 600 605

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val IleAla Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

610 615 620 610 615 620

Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe LysThr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

625 630 635 640625 630 635 640

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly CysGln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

645 650 655 645 650 655

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg ValSer Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

660 665 670 660 665 670

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln AsnLys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn

675 680 685 675 680 685

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp ValGln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

690 695 700 690 695 700

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro ArgLeu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

705 710 715 720705 710 715 720

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp LysArg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

725 730 735 725 730 735

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg ArgMet Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

740 745 750 740 745 750

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr LysGly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

755 760 765 755 760 765

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro ArgAsp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

770 775 780 770 775 780

<210> 228<210> 228

<211> 47<211> 47

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямой клонирующий праймер #1 для ПЦР<223> Forward cloning primer #1 for PCR

<400> 228<400> 228

ggtatactct agacatatgg ctagcactag tcaaaaacct gtggttc 47ggtatactct agacatatgg ctagcactag tcaaaaacct gtggttc 47

<210> 229<210> 229

<211> 26<211> 26

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратный клонирующий праймер #1 для ПЦР<223> Reverse cloning primer #1 for PCR

<400> 229<400> 229

ttgtaccgtt aacgatccga cgccgc 26ttgtaccgtt aacgatccga cgccgc 26

<210> 230<210> 230

<211> 102<211> 102

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямой клонирующий праймер #2 для ПЦР<223> Forward cloning primer #2 for PCR

<400> 230<400> 230

tgactagtca aaaacctgtg gttctattat attattctct tgaaataata taatagaacc 60tgactagtca aaaacctgtg gttctattat attattctct tgaaataata taatagaacc 60

acaggcggtg tttcgtcctt tccacaagat atataaagcc aa 102acaggcggtg tttcgtcctt tccacaagat atataaagcc aa 102

<210> 231<210> 231

<211> 50<211> 50

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратный клонирующий праймер #2 для ПЦР<223> Reverse cloning primer #2 for PCR

<400> 231<400> 231

gtaccgttaa caaggtcggg caggaagagg gcctatttcc catgattcct 50gtaccgttaa caaggtcggg caggaagagg gcctatttcc catgattcct 50

<210> 232<210> 232

<211> 39<211> 39

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямой клонирующий праймер #3 для ПЦР<223> Forward cloning primer #3 for PCR

<400> 232<400> 232

aggactagtc aaaaaggaat tcgctcagaa gaaatctct 39aggactagtc aaaaaggaat tcgctcagaa gaaatctct 39

<210> 233<210> 233

<211> 27<211> 27

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратный клонирующий праймер #3 для ПЦР<223> Reverse cloning primer #3 for PCR

<400> 233<400> 233

ctagctagcg atccgacgcc gccatct 27ctagctagcg atccgacgcc gccatct 27

<210> 234<210> 234

<211> 42<211> 42

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямой клонирующий праймер #4 для ПЦР<223> Forward cloning primer #4 for PCR

<400> 234<400> 234

atgttaacca aaaacctgtg gttctattat attattctct tg 42atgttaacca aaaacctgtg gttctattat attattctct tg 42

<210> 235<210> 235

<211> 34<211> 34

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратный клонирующий праймер #4 для ПЦР<223> Reverse cloning primer #4 for PCR

<400> 235<400> 235

tcactagtaa ggtcgggcag gaagagggcc tatt 34tcactagtaa ggtcggggcag gaagagggcc tatt 34

<210> 236<210> 236

<211> 29<211> 29

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямой клонирующий праймер #5 для ПЦР<223> Forward cloning primer #5 for PCR

<400> 236<400> 236

taggccctca ctagtgatcc gacgccgcc 29taggccctca ctagtgatcc gacgccgcc 29

<210> 237<210> 237

<211> 38<211> 38

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратный клонирующий праймер #5 для ПЦР<223> Reverse cloning primer #5 for PCR

<400> 237<400> 237

ctagctagcc aaaaaggaat tcgctcagaa gaaatctc 38ctagctagcc aaaaaggaat tcgctcagaa gaaatctc 38

<210> 238<210> 238

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> TIGIT-268<223> TIGIT-268

<400> 238<400> 238

gcttctggcc atttgtaatg c 21gcttctggcc atttgtaatg c 21

<210> 239<210> 239

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> TIGIT-2<223> TIGIT-2

<400> 239<400> 239

gggagtactt ctgcatctat c 21gggagtactt ctgcatctat c 21

<210> 240<210> 240

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> TIGIT-739<223> TIGIT-739

<400> 240<400> 240

gctgcatgac tacttcaatg t 21gctgcatgac tacttcaatg t 21

<210> 241<210> 241

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> TIGIT-1<223> TIGIT-1

<400> 241<400> 241

taacgtggat cttgatcata a 21taacgtggat cttgatcata a 21

<210> 242<210> 242

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> TIGIT-1386<223> TIGIT-1386

<400> 242<400> 242

ggagacatac acaggccttc a 21ggagacatac acaggccttc a 21

<210> 243<210> 243

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> TIGIT-1750<223> TIGIT-1750

<400> 243<400> 243

gcatttgggc cttgatctac c 21gcatttgggc cttgatctac c 21

<210> 244<210> 244

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> LAG3-138<223>LAG3-138

<400> 244<400> 244

ccagctttcc agctttcctc t 21ccagctttcc agctttcctc t 21

<210> 245<210> 245

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> LAG3-503<223>LAG3-503

<400> 245<400> 245

gatctcagcc ttctgcgaag a 21gatctcagcc ttctgcgaag a 21

<210> 246<210> 246

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> LAG3-1092<223>LAG3-1092

<400> 246<400> 246

gcttcaacgt ctccatcatg t 21gcttcaacgt ctccatcatg t 21

<210> 247<210> 247

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> LAG3-1221<223>LAG3-1221

<400> 247<400> 247

ggtctttcct cactgccaag t 21ggtctttcct cactgccaag t 21

<210> 248<210> 248

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> LAG3-1278<223>LAG3-1278

<400> 248<400> 248

ctggagacaa tggcgacttt a 21ctggagacaa tggcgacttt a 21

<210> 249<210> 249

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> LAG3-1379<223> LAG3-1379

<400> 249<400> 249

gccactgtca cattggcaat c 21gccactgtca cattggcaat c 21

<210> 250<210> 250

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> LAG3-1465<223>LAG3-1465

<400> 250<400> 250

tccagtatct ggacaagaac g 21tccagtatct ggacaagaac g 21

<210> 251<210> 251

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> LAG3-1616<223>LAG3-1616

<400> 251<400> 251

gcagcagtgt acttcacaga g 21gcagcagtgt acttcacaga g 21

<210> 252<210> 252

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> LAG3-1702<223>LAG3-1702

<400> 252<400> 252

gctgtttctc atccttggtg t 21gctgtttctc atccttggtg t 21

<210> 253<210> 253

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> LAG3-1751<223> LAG3-1751

<400> 253<400> 253

gcctttggct ttcacctttg g 21gcctttggct ttcacctttg g 21

<210> 254<210> 254

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> LAG3-1954<223>LAG3-1954

<400> 254<400> 254

tcagcagccc agtccaaata a 21tcagcagccc agtccaaata a 21

<210> 255<210> 255

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CTLA4-3<223> CTLA4-3

<400> 255<400> 255

ggtggagctc atgtacccac c 21ggtggagctc atgtacccac c 21

<210> 256<210> 256

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CTLA4-1<223> CTLA4-1

<400> 256<400> 256

cccaaattac gtgtactaca a 21cccaaattac gtgtactaca a 21

<210> 257<210> 257

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CTLA4-1058<223> CTLA4-1058

<400> 257<400> 257

gcatcacttg ggattaatat g 21gcatcacttg ggattaatat g 21

<210> 258<210> 258

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CTLA4-1154<223> CTLA4-1154

<400> 258<400> 258

gcgagggaga agactatatt g 21gcgagggaga agactatatt g 21

<210> 259<210> 259

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CTLA4-1309<223> CTLA4-1309

<400> 259<400> 259

gccagtgatg ctaaaggttg t 21gccagtgatg ctaaaggttg t 21

<210> 260<210> 260

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> CTLA4-1686<223> CTLA4-1686

<400> 260<400> 260

ggtggtatct gagttgactt g 21ggtggtatct gagttgactt g 21

<210> 261<210> 261

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Tim3-1<223> Tim3-1

<400> 261<400> 261

gatgaaaggg atgtgaatta t 21gatgaaaggg atgtgaatta t 21

<210> 262<210> 262

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Tim3-2<223> Tim3-2

<400> 262<400> 262

gggagcctcc ctgatataaa t 21gggagcctcc ctgatataaa t 21

<210> 263<210> 263

<211> 19<211> 19

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Tim3-3<223> Tim3-3

<400> 263<400> 263

ggaattcgct cagaagaaa 19ggaattcgct cagaagaaa 19

<210> 264<210> 264

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Tim3-4<223> Tim3-4

<400> 264<400> 264

ggaccaaact gaagctatat t 21ggaccaaact gaagctatat t 21

<210> 265<210> 265

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> PD1-1<223> PD1-1

<400> 265<400> 265

cctgtggttc tattatatta t 21cctgtggttc tattatatta t 21

<210> 266<210> 266

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> PD1-2<223> PD1-2

<400> 266<400> 266

gcctagagaa gtttcaggga a 21gcctagagaa gtttcaggga a 21

<210> 267<210> 267

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> PD1-3<223> PD1-3

<400> 267<400> 267

cattgtcttt cctagcggaa t 21cattgtcttt cctagcggaa t 21

<210> 268<210> 268

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямая 18s рРНК<223> Direct 18s rRNA

<400> 268<400> 268

gattaagtcc ctgccctttg 20gattaagtcc ctgccctttg 20

<210> 269<210> 269

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратная 18s рРНК<223> Reverse 18s rRNA

<400> 269<400> 269

gttcacctac ggaaaccttg 20gttcacctac ggaaaccttg 20

<210> 270<210> 270

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямой PDCD1<223> Direct PDCD1

<400> 270<400> 270

cctccacctt tacacatgcc 20ccctccacctt tacacatgcc 20

<210> 271<210> 271

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратный PDCD1<223> Reverse PDCD1

<400> 271<400> 271

cttactgcct cagcttccct 20cttactgcct cagcttccct 20

<210> 272<210> 272

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямой IL2<223> Direct IL2

<400> 272<400> 272

ccaagaaggc cacagaactg a 21ccaagaaggc cacagaactg a 21

<210> 273<210> 273

<211> 26<211> 26

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратный IL2<223> Reverse IL2

<400> 273<400> 273

gttgtttcag atccctttag ttccag 26gttgtttcag atccctttag ttccag 26

<210> 274<210> 274

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямой IL4<223> Direct IL4

<400> 274<400> 274

actttgaaca gcctcacaga g 21actttgaaca gcctcacaga g 21

<210> 275<210> 275

<211> 22<211> 22

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратный IL4<223> Reverse IL4

<400> 275<400> 275

ccgagttgac cgtaacagac at 22ccgagttgac cgtaacagac at 22

<210> 276<210> 276

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямой IL17A<223> Straight IL17A

<400> 276<400> 276

caaccgatcc acctcacctt 20caaccgatcc acctcacctt 20

<210> 277<210> 277

<211> 19<211> 19

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратный IL17A<223> Reverse IL17A

<400> 277<400> 277

ggcactttgc ctcccagat 19ggcactttgc ctcccagat 19

<210> 278<210> 278

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямой CD25<223> Direct CD25

<400> 278<400> 278

cacaagctct gccactcgga a 21cacaagctct gccactcgga a 21

<210> 279<210> 279

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратный CD25<223> Reverse CD25

<400> 279<400> 279

tgcagtgacc tggaaggctc 20tgcagtgacc tggaaggctc 20

<210> 280<210> 280

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямой CTLA4<223> Direct CTLA4

<400> 280<400> 280

ctacctgggc ataggcaacg 20ctacctgggc ataggcaacg 20

<210> 281<210> 281

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратный CTLA4<223> Reverse CTLA4

<400> 281<400> 281

ccccgaacta actgctgcaa 20ccccgaacta actgctgcaa 20

<210> 282<210> 282

<211> 23<211> 23

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямой FOXP3<223> Direct FOXP3

<400> 282<400> 282

gaaacagcac attcccagag ttc 23gaaacagcac attcccagag ttc 23

<210> 283<210> 283

<211> 17<211> 17

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратный FOXP3<223> Reverse FOXP3

<400> 283<400> 283

atggcccagc ggatgag 17atggcccagc ggatgag 17

<210> 284<210> 284

<211> 19<211> 19

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямой TGF-бета1<223> Direct TGF-beta1

<400> 284<400> 284

cccagcatct gcaaagctc 19cccagcatct gcaaagctc 19

<210> 285<210> 285

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратный TGF-бета1<223> Reverse TGF-beta1

<400> 285<400> 285

gtccttgcgg aagtcaatgt 20gtccttgcgg aagtcaatgt 20

<210> 286<210> 286

<211> 22<211> 22

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямой TGFBR1<223> Direct TGFBR1

<400> 286<400> 286

acatgattca gccacagata cc 22acatgattca gccacagata cc 22

<210> 287<210> 287

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратный TGFBR1<223> Inverse TGFBR1

<400> 287<400> 287

gcatagatgt cagcacgttt g 21gcatagatgt cagcacgttt g 21

<210> 288<210> 288

<211> 19<211> 19

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Прямой TGFBR2<223> Direct TGFBR2

<400> 288<400> 288

acgtgttgag agatcgagg 19acgtgttgag agatcgagg 19

<210> 289<210> 289

<211> 20<211> 20

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Обратный TGFBR2<223> Inverse TGFBR2

<400> 289<400> 289

cccagcactc agtcaacgtc 20cccagcactc agtcaacgtc 20

<---<---

Claims (138)

1. Вектор экспресcии, содержащий:1. An expression vector containing: последовательность оснований, кодирующую два типа коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые ингибируют экспрессию генов PD-1 и TIGIT, ослабляющих функцию Т-клеток, иa base sequence encoding two types of short hairpin RNA (shRNA) that inhibit the expression of the PD-1 and TIGIT genes that impair T cell function, and последовательность оснований, кодирующую химерный антигенный рецептор (CAR) или моноклональный Т-клеточный рецептор (mTCR).a base sequence encoding a chimeric antigen receptor (CAR) or a monoclonal T cell receptor (mTCR). 2. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что экспрессия двух типов кшРНК характеризуется тем, что они, соответственно, регулируются двумя разными промоторами.2. The vector according to claim 1, characterized in that the expression of two types of shRNA is characterized by the fact that they are, respectively, regulated by two different promoters. 3. Вектор по п. 2, отличающийся тем, что два промотора представляют собой промоторы РНК-полимеразы III.3. Vector according to claim 2, characterized in that the two promoters are RNA polymerase III promoters. 4. Вектор по п. 2, отличающийся тем, что два промотора представляют собой промоторы U6, полученные из разных видов.4. The vector of claim 2, wherein the two promoters are U6 promoters derived from different species. 5. Вектор по п. 2, отличающийся тем, что два промотора ориентированы в разных направлениях относительно друг друга в векторе.5. Vector according to claim 2, characterized in that the two promoters are oriented in different directions relative to each other in the vector. 6. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что из двух типов кшРНК последовательность оснований, кодирующая одну кшРНК, содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-12, 70-75, 238-243 и 265-267, а последовательность оснований, кодирующая вторую кшРНК, содержит другую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-12, 70-75, 238-243 и 265-267.6. The vector according to claim 1, characterized in that of the two types of shRNA, the base sequence encoding one shRNA contains a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-12, 70-75, 238-243 and 265- 267 and the base sequence encoding the second shRNA contains another sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2-12, 70-75, 238-243 and 265-267. 7. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что мишень для CAR или mTCR представляет собой опухолевый антиген человека, экспрессия которого повышена в раковой клетке, раковой ткани и/или их микроокружении, или мутантную форму антигена, обнаруженную в раковой клетке, раковой ткани и/или их микроокружении.7. The vector according to claim 1, characterized in that the target for CAR or mTCR is a human tumor antigen, the expression of which is increased in a cancer cell, cancer tissue and / or their microenvironment, or a mutant form of the antigen found in a cancer cell, cancer tissue and/or their microenvironment. 8. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что вектор содержит последовательность оснований SEQ ID NO: 220 или 221.8. Vector according to claim 1, characterized in that the vector contains the base sequence SEQ ID NO: 220 or 221. 9. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что вектор представляет собой плазмидный вектор, лентивирусный вектор, аденовирусный вектор, вектор на основе аденоассоциированного вируса или ретровирусный вектор.9. Vector according to claim 1, characterized in that the vector is a plasmid vector, a lentiviral vector, an adenoviral vector, an adeno-associated virus vector, or a retroviral vector. 10. Т-клетка, экспрессирующая CAR, содержащая вектор экспрессии, содержащий последовательность оснований, кодирующую два типа коротких шпилечных РНК (кшРНК), которые ингибируют экспрессию генов PD-1 и TIGIT, ослабляющих функцию Т-клеток, и последовательность оснований, кодирующую химерный антигенный рецептор (CAR),10. T-cell expressing CAR, containing an expression vector containing a base sequence encoding two types of short hairpin RNA (shRNA) that inhibit the expression of PD-1 and TIGIT genes that impair T-cell function, and a base sequence encoding a chimeric antigenic receptor (CAR), где экспрессия генов PD-1 и TIGIT снижена до 40% или менее, по сравнению с их экспрессией в отсутствие кшРНК.where the expression of the PD-1 and TIGIT genes is reduced to 40% or less compared to their expression in the absence of shRNA. 11. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественного новообразования, содержащая эффективное количество Т-клетки по п. 10.11. A pharmaceutical composition for the treatment of a malignant neoplasm, containing an effective amount of a T cell according to claim 10. 12. Фармацевтическая композиция по п. 11 для лечения пациента, нуждающегося в иммунной терапии, отличающаяся тем, что Т-клетку первоначально получают от пациента.12. A pharmaceutical composition according to claim 11 for treating a patient in need of immune therapy, characterized in that the T cell is initially obtained from the patient. 13. Фармацевтическая композиция по п. 12, отличающаяся тем, что у пациента имеется злокачественное новообразование, при которых обнаруживается мишень и/или увеличение или изменение уровней мишени CAR, экспрессируемых в Т-клетке.13. Pharmaceutical composition according to claim 12, characterized in that the patient has a malignant neoplasm in which a target and/or an increase or change in the target levels of CAR expressed in a T cell is detected. 14. Т-клетка, экспрессирующая генетически сконструированный антигенный рецептор, содержащая генетически сконструированный антигенный рецептор, который специфически связывается с целевым антигеном, и кшРНК, снижающий или способный снижать экспрессию в Т-клетке генов PD-1 и TIGIT, который ослабляет функцию Т-клетки. 14. A T cell expressing a genetically engineered antigen receptor, comprising a genetically engineered antigen receptor that specifically binds to a target antigen, and shRNA that reduces or is capable of reducing expression of the PD-1 and TIGIT genes in the T cell, which impairs T cell function . 15. Т-клетка по п. 14, отличающаяся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR).15. A T cell according to claim 14, wherein the genetically engineered antigen receptor is a chimeric antigen receptor (CAR) or a T cell receptor (TCR). 16. Т-клетка по п. 15, отличающаяся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой CAR.16. A T cell according to claim 15, wherein the genetically engineered antigen receptor is a CAR. 17. Т-клетка по п. 16, отличающаяся тем, что CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен сигнальной трансдукции. 17. A T cell according to claim 16, characterized in that CAR contains an extracellular antigen recognition domain, a transmembrane domain, and an intracellular signal transduction domain. 18. Т-клетка по п. 17, отличающаяся тем, что внеклеточный антигенраспознающий домен CAR специфически связывается с целевым антигеном.18. A T cell according to claim 17, characterized in that the extracellular antigen-recognition domain of CAR specifically binds to the target antigen. 19. Т-клетка по п. 17, отличающаяся тем, что внутриклеточный домен сигнальной трансдукции CAR содержит внутриклеточный домен дзета-цепи CD3 (CD3ζ). 19. A T cell according to claim 17, characterized in that the intracellular signal transduction domain of CAR contains an intracellular domain of the CD3 zeta chain (CD3ζ). 20. Т-клетка по п. 19, отличающаяся тем, что внутриклеточный домен сигнальной трансдукции CAR дополнительно содержит костимулирующую молекулу.20. A T cell according to claim 19, characterized in that the intracellular CAR signal transduction domain additionally contains a co-stimulatory molecule. 21. Т-клетка по п. 20, отличающаяся тем, что костимулирующая молекула выбрана из группы, состоящей из ICOS, 0X40, CD137 (4-1BB), CD27 и CD28.21. A T cell according to claim 20, wherein the costimulatory molecule is selected from the group consisting of ICOS, 0X40, CD137 (4-1BB), CD27 and CD28. 22. Т-клетка по п. 21, отличающаяся тем, что костимулирующая молекула представляет собой CD137 (4-1BB).22. A T cell according to claim 21, wherein the costimulatory molecule is CD137 (4-1BB). 23. Т-клетка по п. 21, отличающаяся тем, что костимулирующая молекула представляет собой CD28.23. A T cell according to claim 21, wherein the costimulatory molecule is CD28. 24. Т-клетка по п. 15, отличающаяся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой TCR.24. A T cell according to claim 15, wherein the genetically engineered antigen receptor is a TCR. 25. Т-клетка по п. 24, отличающаяся тем, что TCR представляет собой моноклональный TCR (mTCR).25. A T cell according to claim 24, wherein the TCR is a monoclonal TCR (mTCR). 26. Т-клетка по п. 14, отличающаяся тем, что целевой антиген экспрессируется в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в их микроокружении.26. A T cell according to claim 14, characterized in that the target antigen is expressed in or on the surface of the cancer cell, cancer tissue and/or their microenvironment. 27. Т-клетка по п. 26, отличающаяся тем, что целевой антиген выбран из группы, состоящей из: 27. T cell according to claim 26, characterized in that the target antigen is selected from the group consisting of: 5T4 (трофобластического гликопротеина), 707-AP, 9D7, AFP (α-фетопротеина), AlbZIP (андроген-индуцируемого bZIP), HPG1 (специфического к простате человека гена-1), α5β1-интегрина, α5β6-интегрина, α-метилацил-коэнзим А рацемазы, ART-4 (АДФ рибозилтрансферазы-4), B7H4 (ингибитора активации Т-клеток 1, содержащего вариабельный иммуноглобулиноподобный домен), BAGE-1 (В меланомного антигена-1), BCL-2 (В-клеточного ХЛЛ/лимфома-2), BING-4 (WD-повтора домена 46), CA 15-3/CA 27-29 (муцина 1), CA 19-9 (ракового антигена 19-9), CA 72-4 (ракового антигена 72-4), CA125 (ракового антигена 125), кальретикулина, CAMEL (ЦТЛ-распознаваемого антигена на меланоме), CASP-8 (каспазы 8), катепсина B, катепсина L, CD19 (кластера дифференцировки 19), CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (ракового эмбрионального антигена SG8), CLCA2 (канал-переносчика-2 для ионов хлора), CML28 (опухолевого антигена хронического миелолейкоза 28), коактозин-подобного белка, коллагена XXIII, COX-2 (циклооксигеназы-2), CT-9/BRD6 (раково-тестикулярного антигена 9), Cten (С-концевого тензиноподобного белка), циклина B1, циклина D1, cyp-B, CYPB1 (цитохрома p450 типа 1 подсемейства b семейства 1), DAM-10/MAGE-B1 (ассоциированного с меланомой антигена B1), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (рецептора эпидермального фактора роста), EMMPRIN (басигина), EpCam, EphA2 (эфрин-рецептора A2), EphA3, ErbB3 (рецептора тирозинкиназы 3 Erb-B2), EZH2 (усилителя субъединицы zeste гомолога 2 policomb-репрессивного комплекса 2), FGF-5 (фактора роста фибробластов 5), FN (фибронектина), Fra-1 (Fos-связанного антигена-1), G250/CAIX (карбоангидразы 9), GAGE-1 (G антигена-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP (гена, дифференциально экспрессируемого в простате), GnT-V (глюконаткиназы), gp100 (специфического для линии меланоцитов антигена GP100), GPC3 (глипикана-3), HAGE (спирального антигена), HAST-2 (члена 1 семейства сульфотрансферазы 1A), гепсина, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 рецептора тирозинкиназы 2), HERV-K-MEL, HNE (медуллазина), гомеобокса NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPVE7, HST-2 (сиртуина-2), hTERT, iCE (каспазы 1), IGF-1R (рецептора инсулиноподобного фактора роста-1), ИЛ-13Ra2 (α-2-субъединицы рецептора интерлейкина-13), ИЛ-2R (рецептора интерлейкина-2), ИЛ-5 (интерлейкина-5), незрелого рецептора ламинина, калликреина-2, калликреина-4, Ki67, KIAA0205 (лизофосфатидилглицерол-ацилтрансферазы 1), KK-LC-1 (антигена-1 рака легкого кита-кюсю (kita-kyushu)), KM-HN-1, LAGE-1 (L-антигена, член 1 семейства белков LAGE), ливина, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGE-L2 (антигена меланомы семейства L2), маммаглобина A, MART-1/Mel an-A (антигена меланомы, распознаваемого Т-клетками-1), MART-2, белка матрикса 22, MC1R (рецептора меланокортина-1), М-КСФ (макрофагального колониестимулирующего фактора), мезотелина, MG50/PXDN (пероксидазина), MMP 11 (матриксной металлопротеиназы 11), MN/CA IX-антигена (карбоангидразы 9), MRP-3 (ассоциированного с множественной лекарственной устойчивостью белка-3), MUC1 (муцина 1), MUC2, NA88-A (псевдогена 1 VENT-подобного гомеобокса 2), N-ацетилглюкозаминилтрансферазы-V, Neo-PAP (нео-поли(А)-полимеразы), NGEP (нового гена, экспрессируемого в простате), NMP22 (белка ядерного матрикса 22), NPM/ALK (нуклеофосмина), NSE (нейронспецифической энолазы), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (QTL-1 остеоартрита), OFA-iLRP (раково-эмбрионального антиген-незрелого рецептора ламинина), OGT (O-GlcNAc-трансферазы), OS-9 (лектина эндоплазматического ретикулюма), остеокальцина, остеопонтина, p15 (ингибитора CDK 2B), p53, PAGE-4 (члена-4 семейства P-антигена), PAI-1 (ингибитора активатора плазминогена 1), PAI-2, PAP (простатической кислой фосфатазы), PART-1 (транскрипта-1, регулируемого андрогеном простаты), PATE (белка-1, экспрессируемого простатой и яичками), PDEF (полученного из простаты фактора Ets), Pim-1-киназы (сайта-1 интеграции провирусов), Pin1 (пептидил-пролил-цис-транс-изомеразы-1), POTE (экспрессируемого в простате, яичнике, яичке и плаценте), PRAME (антигена, преимущественно экспрессируемого при меланоме), простеина, протеиназы-3, PSA (простат-специфического антигена), PSCA (антигена стволовых клеток простаты), PSGR (простат-специфического рецептора, связанного с G-белком), PSM, PSMA (простат-специфического мембранного антигена), RAGE-1 (ассоциированного с опухолью антигена почечных карцином), RHAMM/CD168, RET1 (почечного убиквитарного белка-1), RET2, SAGE (антигена саркомы), SART-1 (антигена-1 плоскоклеточной карциномы, распознаваемого Т-клетками), SART-2, SART-3, Sp17 (белка спермы 17), SSX-1 (члена-1 семейства SSX), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (металлоредуктазы STEAP2), STEAP, сурвивина, сурвивина-213, TA-90 (опухоль-ассоциированного антигена-90), TAG-72 (опухоль-ассоциированного гликопротеина-72), TARP(белка TCRγ с альтернативной рамкой считывания), TGFb (трансформирующего фактора роста β), TGFbR1 1 (рецептора-11 трансформирующего фактора роста β), TGM-4 (трансглютаминазы 4), TRAG-3(гена-3 устойчивости к таксолу), TRG (γ-локуса рецептора Т-клеток), TRP-1 (транзиторного рецепторного потенциала 1), TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, тирозиназы, UPA (урокиназного активатора плазминогена), VEGF (фактора роста сосудистого эндотелия A), VEGFR-2/FLK-1 и WT1 (белка опухоли Вильмса 1). 5T4 (trophoblastic glycoprotein), 707-AP, 9D7, AFP (α-fetoprotein), AlbZIP (androgen-inducible bZIP), HPG1 (human prostate-specific gene-1), α5β1-integrin, α5β6-integrin, α-methylacyl- racemase coenzyme A, ART-4 (ADP ribosyltransferase-4), B7H4 (variable immunoglobulin-like domain-containing T-cell activation inhibitor 1), BAGE-1 (B melanoma antigen-1), BCL-2 (B-cell CLL/lymphoma -2), BING-4 (WD repeat domain 46), CA 15-3/CA 27-29 (mucin 1), CA 19-9 (cancer antigen 19-9), CA 72-4 (cancer antigen 72- 4), CA125 (cancer antigen 125), calreticulin, CAMEL (CTL-recognized antigen on melanoma), CASP-8 (caspase 8), cathepsin B, cathepsin L, CD19 (differentiation cluster 19), CD20, CD22, CD25, CD30 , CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (SG8 cancer embryonic antigen), CLCA2 (chlorine ion transporter channel-2), CML28 (chronic myeloid leukemia tumor antigen 28), coactosin-like protein, collagen XXIII, COX-2 (cyclooxygenase-2), CT-9/BRD6 (cancer-testicular antigen 9), Cten (C-terminal tensin-like protein), cyclin B1, cyclin D1, cyp-B, CYPB1 (cytochrome p450 type 1 subfamily b family 1), DAM-10/MAGE-B1 (melanoma-associated B1 antigen), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (epidermal growth factor receptor), EMMPRIN (basigin), EpCam, EphA2 (ephrin receptor A2) , EphA3, ErbB3 (Erb-B2 tyrosine kinase receptor 3), EZH2 (policomb-repressive complex 2 homologue zeste subunit enhancer 2), FGF-5 (fibroblast growth factor 5), FN (fibronectin), Fra-1 (Fos-related antigen -1), G250/CAIX (carbonic anhydrase 9), GAGE-1 (G antigen-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP (gene differentially expressed in the prostate), GnT-V (gluconate kinases), gp100 (melanocyte lineage-specific antigen GP100), GPC3 (glypican-3), HAGE (helical antigen), HAST-2 (sulfotransferase family member 1A 1A) , hepsin, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2), HERV-K-MEL, HNE (medullasin), homeobox NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV- E6, HPVE7, HST-2 (sirtuin-2), hTERT, iCE (caspase 1), IGF-1R (insulin-like growth factor-1 receptor), IL-13Ra2 (α-2-subunit of interleukin-13 receptor), IL- 2R (interleukin-2 receptor), IL-5 (interleukin-5), immature laminin receptor, kallikrein-2, kallikrein-4, Ki67, KIAA0205 (lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1), KK-LC-1 (lung cancer antigen-1 kita-kyushu (kita-kyushu)), KM-HN-1, LAGE-1 (L-antigen, member 1 of the LAGE protein family), livin, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE -A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6 , MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGE-L2 (melanoma antigen L2 family) , mammaglobin A, MART-1/Mel an-A (melanoma antigen recognized by T-cells-1), MART-2, matrix protein 22, MC1R (melanocortin receptor-1), M-CSF (macrophage colony stimulating factor), mesothelin , MG50/PXDN (peroxidazine), MMP 11 (matrix metalloproteinase 11), MN/CA IX antigen (carbonic anhydrase 9), MRP-3 (multidrug resistance-associated protein-3), MUC1 (mucin 1), MUC2, NA88 -A (pseudogene 1 of VENT-like homeobox 2), N-acetylglucosaminyltransferase-V, Neo-PAP (neo-poly(A) polymerase), NGEP (new prostate-expressed gene), NMP22 (nuclear matrix protein 22), NPM/ALK (nucleophosmin), NSE (neuron-specific enolase), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (Osteoarthritis QTL-1), OFA-iLRP (cancer embryonic antigen-immature laminin receptor), OGT (O -GlcNAc-transferase), OS-9 (endoplasmic reticulum lectin), osteocalcin, osteopontin, p15 (CDK 2B inhibitor), p53, PAGE-4 (P-antigen family member-4), PAI-1 (plasminogen activator inhibitor 1) , PAI-2, PAP (Prostatic Acid Phosphatase), PART-1 (Prostate Androgen Regulated Transcript-1), PATE (Prostate and Testicular Expression Protein-1), PDEF (Prostate Derived Factor Ets), Pim-1- kinase (provirus integration site-1), Pin1 (peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase-1), POTE (expressed in the prostate, ovary, testis and placenta), PRAME (an antigen predominantly expressed in melanoma), protein, proteinase -3, PSA (prostate specific antigen), PSCA (prostate stem cell antigen), PSGR (prostate specific G protein-coupled receptor), PSM, PSMA (prostate specific membrane antigen), RAGE-1 (associated with renal carcinoma antigen tumor), RHAMM/CD168, RET1 (renal ubiquitous protein-1), RET2, SAGE (sarcoma antigen), SART-1 (squamous cell carcinoma antigen-1 recognized by T cells), SART-2, SART-3 , Sp17 (sperm protein 17), SSX-1 (SSX family member-1), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (STEAP2 metal reductases), STEAP, survivin, survivin-213, TA -90 (tumor-associated antigen-90), TAG-72 (tumor-associated glycoprotein-72), TARP (alternate reading frame protein TCRγ), TGFb (transforming growth factor β), TGFbR1 1 (transforming growth factor receptor-11 β), TGM-4 (transglutaminase 4), TRAG-3 (taxol resistance gene-3), TRG (T-cell receptor γ-locus), TRP-1 (transient receptor potential 1), TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, tyrosinase, UPA (urokinase plasminogen activator), VEGF (vascular endothelial growth factor A), VEGFR-2/FLK-1 and WT1 (Wilms tumor protein 1). 28. Т-клетка по п. 27, отличающаяся тем, что целевой антиген представляет собой CD19 или CD22.28. T cell according to claim 27, characterized in that the target antigen is CD19 or CD22. 29. Т-клетка по п. 28, отличающаяся тем, что целевой антиген представляет собой CD19.29. A T cell according to claim 28, characterized in that the target antigen is CD19. 30. Т-клетка по любому из пп. 27-29, отличающаяся тем, что целевой антиген представляет собой раковый антиген, экспрессия которого повышена в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в их микроокружении.30. T-cell according to any one of paragraphs. 27-29, characterized in that the target antigen is a cancer antigen, the expression of which is increased in or on the surface of the cancer cell, cancer tissue and/or in their microenvironment. 31. Т-клетка по п. 26, отличающаяся тем, что целевой антиген выбран из группы, состоящей из: 31. T cell according to claim 26, characterized in that the target antigen is selected from the group consisting of: α-актинина-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, бета-катенина/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A1 1/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, миозина класса 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII и TPI/m; иα-actinin-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, beta-catenin/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A1 1/m , HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m , myosin class 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600 /m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII and TPI/m; And при этом целевой антиген представляет собой раковый антиген, который представляет собой мутированную форму антигена, экспрессируемого в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в их микроокружении. wherein the target antigen is a cancer antigen, which is a mutated form of an antigen expressed in or on the surface of a cancer cell, cancer tissue and/or their microenvironment. 32. Т-клетка по любому из пп. 14-31, отличающаяся тем, что экспрессия генов, которые ослабляют функцию Т-клетки, вызывает одно или более из следующего: 32. T cell according to any one of paragraphs. 14-31, characterized in that the expression of genes that impair T cell function causes one or more of the following: i) ингибирование пролиферации Т-клетки;i) inhibition of T cell proliferation; ii) индукцию клеточной гибели Т-клетки;ii) inducing cell death of the T cell; iii) ингибирование способности Т-клетки распознавать целевой антиген и/или подвергаться активации;iii) inhibiting the ability of the T cell to recognize the target antigen and/or be activated; iv) индукцию дифференцировки Т-клетки в клетку, которая не индуцирует иммунный ответ на целевой антиген;iv) inducing differentiation of the T cell into a cell that does not induce an immune response to the target antigen; v) ослабление реакций Т-клетки на молекулу, которая способствует иммунному ответу Т-клетки; илиv) attenuating T cell responses to a molecule that promotes the T cell's immune response; or vi) усиление реакции Т-клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ Т-клетки.vi) enhancing the response of the T cell to a molecule that suppresses the immune response of the T cell. 33. Т-клетка по п. 32, отличающаяся тем, что ген, который ослабляет функцию Т-клетки, усиливает реакцию Т-клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ Т-клетки.33. A T cell according to claim 32, characterized in that the gene that impairs the function of the T cell enhances the response of the T cell to a molecule that suppresses the immune response of the T cell. 34. Т-клетка по любому из пп. 14-33, отличающаяся тем, что кшРНК снижает экспрессию генов в Т-клетке, которые ослабляют функцию Т-клетки на по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с иммунной клеткой в отсутствие кшРНК.34. T cell according to any one of paragraphs. 14-33, characterized in that shRNA reduces the expression of genes in the T cell that impair the function of the T cell by at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 95% compared to an immune cell in the absence of shRNA. 35. Т-клетка по п. 34, отличающаяся тем, что кшРНК снижает экспрессию гена, который усиливает реакцию Т-клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ Т-клетки.35. A T cell according to claim 34, characterized in that the shRNA reduces the expression of a gene that enhances the response of the T cell to a molecule that suppresses the immune response of the T cell. 36. Т-клетка по п. 35, отличающаяся тем, что кшРНК снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию Т-клетки посредством РНК-интерференции (РНКи).36. A T cell according to claim 35, characterized in that the shRNA reduces the expression of a gene that impairs the function of the T cell through RNA interference (RNAi). 37. Т-клетка по п. 36, отличающаяся тем, что более чем один кшРНК снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию Т-клетки, в Т-клетке посредством РНКи.37. A T cell according to claim 36, characterized in that more than one shRNA reduces the expression of a gene that impairs T cell function in the T cell via RNAi. 38. Т-клетка по любому из пп. 36, 37, отличающаяся тем, что РНКи опосредуется короткой шпилечной РНК (кшРНК).38. T-cell according to any one of paragraphs. 36, 37, characterized in that RNAi is mediated by short hairpin RNA (shRNA). 39. Т-клетка по п. 38, отличающаяся тем, что РНКи опосредуется более чем одной кшРНК.39. A T cell according to claim 38, characterized in that the RNAi is mediated by more than one shRNA. 40. Т-клетка по п. 39, отличающаяся тем, что РНКи опосредуется двумя кшРНК.40. A T cell according to claim 39, characterized in that the RNAi is mediated by two shRNAs. 41. Т-клетка по любому из пп. 38-40, отличающаяся тем, что Т-клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют кшРНК.41. T cell according to any one of paragraphs. 38-40, characterized in that the T cell contains nucleotide sequences that encode shRNA. 42. Т-клетка по п. 41, отличающаяся тем, что Т-клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют более одной кшРНК.42. A T cell according to claim 41, characterized in that the T cell contains nucleotide sequences that encode more than one shRNA. 43. Т-клетка по п. 41, отличающаяся тем, что Т-клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК.43. A T cell according to claim 41, characterized in that the T cell contains nucleotide sequences that encode two shRNAs. 44. Т-клетка по любому из пп. 41-43, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая кшРНК, содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-12, 70-75, 238-243 и 265-267. 44. T cell according to any one of paragraphs. 41-43, characterized in that the nucleotide sequence encoding shRNA contains a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-12, 70-75, 238-243 and 265-267. 45. Т-клетка по любому из пп. 41-44, отличающаяся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая кшРНК, присутствует в векторе. 45. T cell according to any one of paragraphs. 41-44, characterized in that the nucleotide sequence encoding the shRNA is present in the vector. 46. Т-клетка по п. 45, отличающаяся тем, что экспрессия разных кшРНК регулируется разными промоторами.46. A T cell according to claim 45, characterized in that the expression of different shRNAs is regulated by different promoters. 47. Т-клетка по п. 46, отличающаяся тем, что экспрессия двух разных кшРНК регулируется двумя разными промоторами.47. A T cell according to claim 46, characterized in that the expression of two different shRNAs is regulated by two different promoters. 48. Т-клетка по п. 47, отличающаяся тем, что два разных промотора представляют собой промоторы РНК-полимеразы III.48. A T cell according to claim 47, characterized in that the two different promoters are RNA polymerase III promoters. 49. Т-клетка по п. 48, отличающаяся тем, что два промотора представляют собой промоторы U6.49. A T cell according to claim 48, wherein the two promoters are U6 promoters. 50. Т-клетка по п. 49, отличающаяся тем, что промоторы U6 получают из разных видов.50. A T cell according to claim 49, characterized in that U6 promoters are obtained from different species. 51. Т-клетка по любому из пп. 47-50, отличающаяся тем, что два промотора ориентированы в разных направлениях относительно друг друга.51. T cell according to any one of paragraphs. 47-50, characterized in that the two promoters are oriented in different directions relative to each other. 52. Т-клетка по любому из пп. 14-51, отличающаяся тем, что каждый из генетически сконструированного антигенного рецептора и кшРНК экспрессируется из вектора.52. T cell according to any one of paragraphs. 14-51, characterized in that each of the genetically engineered antigen receptor and shRNA is expressed from a vector. 53. Т-клетка по п. 52, отличающаяся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор и кшРНК экспрессируются из одного и того же вектора.53. A T cell according to claim 52, characterized in that the genetically engineered antigen receptor and shRNA are expressed from the same vector. 54. Т-клетка по любому из пп. 52, 53, отличающаяся тем, что вектор представляет собой плазмидный вектор или вирусный вектор.54. T cell according to any one of paragraphs. 52, 53, characterized in that the vector is a plasmid vector or a viral vector. 55. Т-клетка по п. 54, отличающаяся тем, что вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор, аденовирусный вектор или вектор на основе аденоассоциированного вируса.55. A T cell according to claim 54, wherein the viral vector is a lentiviral vector, an adenoviral vector, or an adeno-associated virus vector. 56. Т-клетка по п. 55, отличающаяся тем, что лентивирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор.56. A T cell according to claim 55, wherein the lentiviral vector is a retroviral vector. 57. Т-клетка по п. 56, отличающаяся тем, что Т-клетка представляет собой CD4+ Т-клетку или CD8+ Т-клетку.57. A T cell according to claim 56, wherein the T cell is a CD4+ T cell or a CD8+ T cell. 58. Т-клетка по п. 56 или 57, отличающаяся тем, что Т-клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК и CAR или mTCR в одном и том же векторе. 58. A T cell according to claim 56 or 57, characterized in that the T cell contains nucleotide sequences that encode two shRNAs and a CAR or mTCR in the same vector. 59. Т-клетка по п. 58, отличающаяся тем, что каждая из двух кшРНК регулируется двумя разными промоторами РНК-полимеразы III, ориентированными в разных направлениях относительно друг друга.59. A T cell according to claim 58, characterized in that each of the two shRNAs is regulated by two different RNA polymerase III promoters oriented in different directions relative to each other. 60. Т-клетка по п. 59, отличающаяся тем, что CAR нацелен на CD19. 60. T cell according to claim 59, characterized in that CAR targets CD19. 61. Способ получения Т-клетки, включающий введение в Т-клетку одновременно или последовательно в любом порядке:61. A method for obtaining a T cell, including introducing into a T cell simultaneously or sequentially in any order: (1) гена, кодирующего генетически сконструированный антигенный рецептор, который специфически связывается с целевым антигеном; и (1) a gene encoding a genetically engineered antigen receptor that specifically binds to the target antigen; And (2) кшРНК, причем кшРНК или его экспрессия снижает или способна снижать экспрессию в Т-клетке генов PD-1 и TIGIT, которые ослабляют функцию Т-клетки,(2) shRNA, wherein the shRNA or its expression reduces or is able to reduce the expression in the T cell of the PD-1 and TIGIT genes, which impair the function of the T cell, тем самым получая иммунную клетку, в которой экспрессируется генетически сконструированный антигенный рецептор и снижается экспрессия генов PD-1 и TIGIT, которые ослабляют функцию Т-клетки. thereby obtaining an immune cell in which the genetically engineered antigen receptor is expressed and the expression of the PD-1 and TIGIT genes, which impair the function of the T cell, is reduced. 62. Способ по п. 61, отличающийся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR).62. The method of claim. 61, wherein the genetically engineered antigen receptor is a chimeric antigen receptor (CAR) or T cell receptor (TCR). 63. Способ по п. 62, отличающийся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой CAR.63. The method of claim 62, wherein the genetically engineered antigen receptor is a CAR. 64. Способ по п. 63, отличающийся тем, что CAR содержит внеклеточный антигенраспознающий домен, трансмембранный домен и внутриклеточной домен сигнальной трансдукции. 64. The method according to p. 63, characterized in that CAR contains an extracellular antigen recognition domain, a transmembrane domain and an intracellular signal transduction domain. 65. Способ по п. 64, отличающийся тем, что внеклеточный антигенраспознающий домен CAR специфически связывается с целевым антигеном.65. The method according to p. 64, characterized in that the extracellular antigen-recognition domain of CAR specifically binds to the target antigen. 66. Способ по п. 64, отличающийся тем, что внутриклеточный домен сигнальной трансдукции CAR содержит внутриклеточный домен дзета-цепи CD3 (CD3ζ). 66. The method of claim 64, wherein the intracellular signal transduction domain of CAR contains an intracellular domain of the CD3 zeta chain (CD3ζ). 67. Способ по п. 66, отличающийся тем, что внутриклеточной домен сигнальной трансдукции CAR дополнительно содержит костимулирующую молекулу.67. The method of claim 66, wherein the intracellular signal transduction domain of CAR further comprises a co-stimulatory molecule. 68. Способ по п. 67, отличающийся тем, что костимулирующая молекула выбрана из группы, состоящей из ICOS, 0X40, CD137 (4-1BB), CD27 и CD28.68. The method of claim 67 wherein the costimulatory molecule is selected from the group consisting of ICOS, 0X40, CD137 (4-1BB), CD27 and CD28. 69. Способ по п. 68, отличающийся тем, что костимулирующая молекула представляет собой CD137 (4-1BB).69. The method of claim 68, wherein the costimulatory molecule is CD137 (4-1BB). 70. Способ по п. 68, отличающийся тем, что костимулирующая молекула представляет собой CD28.70. The method of claim 68 wherein the costimulatory molecule is CD28. 71. Способ по п. 62, отличающийся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор представляет собой TCR.71. The method of claim 62, wherein the genetically engineered antigen receptor is a TCR. 72. Способ по п. 71, отличающийся тем, что TCR представляет собой моноклональный TCR (mTCR).72. The method of claim 71, wherein the TCR is a monoclonal TCR (mTCR). 73. Способ по любому из пп. 61-72, отличающийся тем, что целевой антиген экспрессируется в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в их микроокружении.73. The method according to any one of paragraphs. 61-72, characterized in that the target antigen is expressed in or on the surface of the cancer cell, cancer tissue and/or in their microenvironment. 74. Способ по п. 73, отличающийся тем, что целевой антиген выбран из группы, состоящей из: 74. The method according to p. 73, characterized in that the target antigen is selected from the group consisting of: 5T4 (трофобластического гликопротеина), 707-AP, 9D7, AFP (α-фетопротеина), AlbZIP (андроген-индуцируемого bZIP), HPG1 (специфического к простате человека гена-1), α5β1-интегрина, α5β6-интегрина, α-метилацил-коэнзим А рацемазы, ART-4 (АДФ рибозилтрансферазы-4), B7H4 (ингибитора активации Т-клеток 1, содержащего вариабельный иммуноглобулиноподобный домен), BAGE-1 (В меланомного антигена-1), BCL-2 (В-клеточного ХЛЛ/лимфома-2), BING-4 (WD-повтора домена 46), CA 15-3/CA 27-29 (муцина 1), CA 19-9 (ракового антигена 19-9), CA 72-4 (ракового антигена 72-4), CA125 (ракового антигена 125), кальретикулина, CAMEL (ЦТЛ-распознаваемого антигена на меланоме), CASP-8 (каспазы 8), катепсина B, катепсина L, CD19 (кластера дифференцировки 19), CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (ракового эмбрионального антигена SG8), CLCA2 (канал-переносчика-2 для ионов хлора), CML28 (опухолевого антигена хронического миелолейкоза 28), коактозин-подобного белка, коллагена XXIII, COX-2 (циклооксигеназы-2), CT-9/BRD6 (раково-тестикулярного антигена 9), Cten (С-концевого тензиноподобного белка), циклина B1, циклина D1, cyp-B, CYPB1 (цитохрома p450 типа 1 подсемейства b семейства 1), DAM-10/MAGE-B1 (ассоциированного с меланомой антигена B1), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (рецептора эпидермального фактора роста), EMMPRIN (басигина), EpCam, EphA2 (эфрин-рецептора A2), EphA3, ErbB3 (рецептора тирозинкиназы 3 Erb-B2), EZH2 (усилителя субъединицы zeste гомолога 2 policomb-репрессивного комплекса 2), FGF-5 (фактора роста фибробластов 5), FN (фибронектина), Fra-1 (Fos-связанного антигена-1), G250/CAIX (карбоангидразы 9), GAGE-1 (G антигена-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP (гена, дифференциально экспрессируемого в простате), GnT-V (глюконаткиназы), gp100 (специфического для линии меланоцитов антигена GP100), GPC3 (глипикана-3), HAGE (спирального антигена), HAST-2 (члена 1 семейства сульфотрансферазы 1A), гепсина, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 рецептора тирозинкиназы 2), HERV-K-MEL, HNE (медуллазина), гомеобокса NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPVE7, HST-2 (сиртуина-2), hTERT, iCE (каспазы 1), IGF-1R (рецептора инсулиноподобного фактора роста-1), ИЛ-13Ra2 (α-2-субъединицы рецептора интерлейкина-13), ИЛ-2R (рецептора интерлейкина-2), ИЛ-5 (интерлейкина-5), незрелого рецептора ламинина, калликреина-2, калликреина-4, Ki67, KIAA0205 (лизофосфатидилглицерол-ацилтрансферазы 1), KK-LC-1 (антигена-1 рака легкого кита-кюсю (kita-kyushu)), KM-HN-1, LAGE-1 (L-антигена, член 1 семейства белков LAGE), ливина, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGE-L2 (антигена меланомы семейства L2), маммаглобина A, MART-1/Melan-A (антигена меланомы, распознаваемого Т-клетками-1), MART-2, белка матрикса 22, MC1R (рецептора меланокортина-1), М-КСФ (макрофагального колониестимулирующего фактора), мезотелина, MG50/PXDN (пероксидазина), MMP 11 (матриксной металлопротеиназы 11), MN/CA IX-антигена (карбоангидразы 9), MRP-3 (ассоциированного с множественной лекарственной устойчивостью белка-3), MUC1 (муцина 1), MUC2, NA88-A (псевдогена 1 VENT-подобного гомеобокса 2), N-ацетилглюкозаминилтрансферазы-V, Neo-PAP (нео-поли(А)-полимеразы), NGEP (нового гена, экспрессируемого в простате), NMP22 (белка ядерного матрикса 22), NPM/ALK (нуклеофосмина), NSE (нейронспецифической энолазы), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (QTL-1 остеоартрита), OFA-iLRP (раково-эмбрионального антиген-незрелого рецептора ламинина), OGT (O-GlcNAc-трансферазы), OS-9 (лектина эндоплазматического ретикулюма), остеокальцина, остеопонтина, p15 (ингибитора CDK 2B), p53, PAGE-4 (члена-4 семейства P-антигена), PAI-1 (ингибитора активатора плазминогена 1), PAI-2, PAP (простатической кислой фосфатазы), PART-1 (транскрипта-1, регулируемого андрогеном простаты), PATE (белка-1, экспрессируемого простатой и яичками), PDEF (полученного из простаты фактора Ets), Pim-1-киназы (сайта-1 интеграции провирусов), Pin1 (пептидил-пролил-цис-транс-изомеразы-1), POTE (экспрессируемого в простате, яичнике, яичке и плаценте), PRAME (антигена, преимущественно экспрессируемого при меланоме), простеина, протеиназы-3, PSA (простат-специфического антигена), PSCA (антигена стволовых клеток простаты), PSGR (простат-специфического рецептора, связанного с G-белком), PSM, PSMA (простат-специфического мембранного антигена), RAGE-1 (ассоциированного с опухолью антигена почечных карцином), RHAMM/CD168, RET1 (почечного убиквитарного белка-1), RET2, SAGE (антигена саркомы), SART-1 (антигена-1 плоскоклеточной карциномы, распознаваемого Т-клетками), SART-2, SART-3, Sp17 (белка спермы 17), SSX-1 (члена-1 семейства SSX), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (металлоредуктазы STEAP2), STEAP, сурвивина, сурвивина-213, TA-90 (опухоль-ассоциированного антигена-90), TAG-72 (опухоль-ассоциированного гликопротеина-72), TARP (белка TCRγ с альтернативной рамкой считывания), TGFb (трансформирующего фактора роста β), TGFbR1 1 (рецептора-11 трансформирующего фактора роста β), TGM-4 (трансглютаминазы 4), TRAG-3(гена-3 устойчивости к таксолу), TRG (γ-локуса рецептора Т-клеток), TRP-1 (транзиторного рецепторного потенциала 1), TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, тирозиназы, UPA (урокиназного активатора плазминогена), VEGF (фактора роста сосудистого эндотелия A), VEGFR-2/FLK-1 и WT1 (белка опухоли Вильмса 1). 5T4 (trophoblastic glycoprotein), 707-AP, 9D7, AFP (α-fetoprotein), AlbZIP (androgen-inducible bZIP), HPG1 (human prostate-specific gene-1), α5β1-integrin, α5β6-integrin, α-methylacyl- racemase coenzyme A, ART-4 (ADP ribosyltransferase-4), B7H4 (variable immunoglobulin-like domain-containing T-cell activation inhibitor 1), BAGE-1 (B melanoma antigen-1), BCL-2 (B-cell CLL/lymphoma -2), BING-4 (WD repeat domain 46), CA 15-3/CA 27-29 (mucin 1), CA 19-9 (cancer antigen 19-9), CA 72-4 (cancer antigen 72- 4), CA125 (cancer antigen 125), calreticulin, CAMEL (CTL-recognized antigen on melanoma), CASP-8 (caspase 8), cathepsin B, cathepsin L, CD19 (differentiation cluster 19), CD20, CD22, CD25, CD30 , CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CEA (SG8 cancer embryonic antigen), CLCA2 (chlorine ion transporter channel-2), CML28 (chronic myeloid leukemia tumor antigen 28), coactosin-like protein, collagen XXIII, COX-2 (cyclooxygenase-2), CT-9/BRD6 (cancer-testicular antigen 9), Cten (C-terminal tensin-like protein), cyclin B1, cyclin D1, cyp-B, CYPB1 (cytochrome p450 type 1 subfamily b family 1), DAM-10/MAGE-B1 (melanoma-associated B1 antigen), DAM-6/MAGE-B2, EGFR/Her1 (epidermal growth factor receptor), EMMPRIN (basigin), EpCam, EphA2 (ephrin receptor A2) , EphA3, ErbB3 (Erb-B2 tyrosine kinase receptor 3), EZH2 (policomb-repressive complex 2 homologue zeste subunit enhancer 2), FGF-5 (fibroblast growth factor 5), FN (fibronectin), Fra-1 (Fos-related antigen -1), G250/CAIX (carboanhydrase 9), GAGE-1 (G antigen-1), GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP (gene differentially expressed in the prostate), GnT-V (gluconate kinases), gp100 (melanocyte lineage-specific antigen GP100), GPC3 (glypican-3), HAGE (helical antigen), HAST-2 (sulfotransferase family member 1A 1A) , hepsin, Her2/neu/ErbB2 (Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2), HERV-K-MEL, HNE (medullasin), homeobox NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV- E6, HPVE7, HST-2 (sirtuin-2), hTERT, iCE (caspase 1), IGF-1R (insulin-like growth factor-1 receptor), IL-13Ra2 (α-2-subunit of interleukin-13 receptor), IL- 2R (interleukin-2 receptor), IL-5 (interleukin-5), immature laminin receptor, kallikrein-2, kallikrein-4, Ki67, KIAA0205 (lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1), KK-LC-1 (lung cancer antigen-1 kita-kyushu (kita-kyushu)), KM-HN-1, LAGE-1 (L-antigen, member 1 of the LAGE protein family), livin, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE -A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6 , MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGE-L2 (melanoma antigen L2 family) , mammaglobin A, MART-1/Melan-A (melanoma antigen recognized by T-cells-1), MART-2, matrix protein 22, MC1R (melanocortin receptor-1), M-CSF (macrophage colony stimulating factor), mesothelin, MG50/PXDN (peroxidazine), MMP 11 (matrix metalloproteinase 11), MN/CA IX antigen (carbonic anhydrase 9), MRP-3 (multidrug resistance-associated protein-3), MUC1 (mucin 1), MUC2, NA88- A (VENT-like homeobox 2 pseudogene 1), N-acetylglucosaminyltransferase-V, Neo-PAP (neo-poly(A) polymerase), NGEP (new prostate-expressed gene), NMP22 (nuclear matrix protein 22), NPM /ALK (nucleophosmin), NSE (neuron-specific enolase), NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1 (Osteoarthritis QTL-1), OFA-iLRP (cancer-embryonic antigen-immature laminin receptor), OGT (O- GlcNAc transferase), OS-9 (endoplasmic reticulum lectin), osteocalcin, osteopontin, p15 (CDK 2B inhibitor), p53, PAGE-4 (P-antigen family member-4), PAI-1 (plasminogen activator inhibitor 1), PAI-2, PAP (Prostatic Acid Phosphatase), PART-1 (Prostate Androgen Regulated Transcript-1), PATE (Prostate and Testicular Expression Protein-1), PDEF (Prostate Derived Factor Ets), Pim-1 Kinase (provirus integration site-1), Pin1 (peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase-1), POTE (expressed in the prostate, ovary, testicle and placenta), PRAME (antigen predominantly expressed in melanoma), protein, proteinase- 3, PSA (prostate specific antigen), PSCA (prostate stem cell antigen), PSGR (prostate specific G protein-coupled receptor), PSM, PSMA (prostate specific membrane antigen), RAGE-1 (tumor associated renal carcinoma antigen), RHAMM/CD168, RET1 (renal ubiquitous protein-1), RET2, SAGE (sarcoma antigen), SART-1 (squamous cell carcinoma antigen-1 recognized by T cells), SART-2, SART-3, Sp17 (sperm protein 17), SSX-1 (SSX family member-1), SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1 (STEAP2 metal reductases), STEAP, survivin, survivin-213, TA- 90 (Tumor Associated Antigen-90), TAG-72 (Tumor Associated Glycoprotein-72), TARP (Alternate Reading Frame Protein TCRγ), TGFb (Transforming Growth Factor β), TGFbR1 1 (Transforming Growth Factor receptor 11 ), TGM-4 (transglutaminase 4), TRAG-3 (taxol resistance gene-3), TRG (γ-locus T cell receptor), TRP-1 (transient receptor potential 1), TRP-2/6b, TRP -2/INT2, Trp-p8, tyrosinase, UPA (urokinase plasminogen activator), VEGF (vascular endothelial growth factor A), VEGFR-2/FLK-1 and WT1 (Wilms tumor protein 1). 75. Способ по п. 74, отличающийся тем, что целевой антиген представляет собой CD19 или CD22.75. The method of claim 74, wherein the target antigen is CD19 or CD22. 76. Способ по п. 75, отличающийся тем, что целевой антиген представляет собой CD19.76. The method of claim 75, wherein the target antigen is CD19. 77. Способ по любому из пп. 74-76, отличающийся тем, что целевой антиген представляет собой раковый антиген, при этом раковый антиген представляет собой антиген, экспрессия которого повышена в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в их микроокружении.77. The method according to any one of paragraphs. 74-76, characterized in that the target antigen is a cancer antigen, wherein the cancer antigen is an antigen whose expression is increased in or on the surface of a cancer cell, cancer tissue and/or in their microenvironment. 78. Способ по п. 73, отличающийся тем, что целевой антиген выбран из группы, состоящей из: 78. The method according to p. 73, characterized in that the target antigen is selected from the group consisting of: α-актинина-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, бета-катенина/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A1 1/m, HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, миозина класса 1/m, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600/m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII и TPI/m; иα-actinin-4/m, ARTC1/m, bcr/abl, beta-catenin/m, BRCA1/m, BRCA2/m, CASP-5/m, CASP-8/m, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CML66, COA-1/m, DEK-CAN, EFTUD2/m, ELF2/m, ETV6-AML1, FN1/m, GPNMB/m, HLA-A*0201-R170I, HLA-A1 1/m , HLA-A2/m, HSP70-2M, KIAA0205/m, K-Ras/m, LDLR-FUT, MART2/m, ME1/m, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m , class 1/m myosin, neo-PAP/m, NFYC/m, N-Ras/m, OGT/m, OS-9/m, p53/m, Pml/RARa, PRDX5/m, PTPRX/m, RBAF600 /m, SIRT2/m, SYTSSX-1, SYT-SSX-2, TEL-AML1, TGFbRII and TPI/m; And при этом целевой антиген представляет собой раковый антиген, причем раковый антиген представляет собой мутированную форму антигена, экспрессируемого в или на поверхности раковой клетки, раковой ткани и/или в их микроокружении. wherein the target antigen is a cancer antigen, wherein the cancer antigen is a mutated form of an antigen expressed in or on the surface of a cancer cell, cancer tissue and/or their microenvironment. 79. Способ по любому из пп. 61-78, отличающийся тем, что экспрессия гена, который ослабляет функцию Т-клетки, вызывает одно или более из следующего: 79. The method according to any one of paragraphs. 61-78, wherein expression of a gene that impairs T cell function causes one or more of the following: i) ингибирование пролиферации Т-клетки;i) inhibition of T cell proliferation; ii) индукцию клеточной гибели Т-клетки;ii) inducing cell death of the T cell; iii) ингибирование способности Т-клетки распознавать целевой антиген и/или активироваться;iii) inhibiting the ability of the T cell to recognize the target antigen and/or be activated; iv) индукцию дифференцировки Т-клетки в клетку, которая не индуцирует иммунный ответ на целевой антиген;iv) inducing differentiation of the T cell into a cell that does not induce an immune response to the target antigen; v) ослабление реакции Т-клетки на молекулу, которая способствует иммунному ответу Т-клетки; илиv) weakening the response of the T cell to a molecule that promotes the immune response of the T cell; or vi) усиление реакции Т-клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ Т-клетки.vi) enhancing the response of the T cell to a molecule that suppresses the immune response of the T cell. 80. Способ по п. 79, отличающийся тем, что ген, который ослабляет функцию Т-клетки, усиливает реакцию Т-клетки на молекулу, которая подавляет иммунный ответ Т-клетки.80. The method of claim 79, wherein the gene that impairs T cell function enhances the T cell's response to a molecule that suppresses the T cell's immune response. 81. Способ по любому из пп. 61-80, отличающийся тем, что кшРНК снижает экспрессию гена в иммунной клетке, который ослабляет функцию Т-клетки на по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% по сравнению с иммунной клеткой в отсутствие кшРНК.81. The method according to any one of paragraphs. 61-80, characterized in that shRNA reduces the expression of a gene in an immune cell that impairs T cell function by at least 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 95% compared to an immune cell in the absence of shRNA . 82. Способ по п. 81, отличающийся тем, что кшРНК снижает экспрессию генов, которые усиливает реакцию Т-клетки на молекулу, которая подавляют иммунный ответ Т-клетки.82. The method of claim 81, wherein the shRNA reduces the expression of genes that enhance the response of the T cell to a molecule that suppresses the immune response of the T cell. 83. Способ по п. 82, отличающийся тем, что кшРНК снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию Т-клетки посредством РНК-интерференции (РНКи).83. The method of claim 82, wherein shRNA reduces the expression of a gene that impairs T cell function through RNA interference (RNAi). 84. Способ по п. 83, отличающийся тем, что более чем один кшРНК снижает экспрессию гена, который ослабляет функцию Т-клетки в иммунной клетке посредством РНКи.84. The method of claim 83, wherein more than one shRNA reduces the expression of a gene that impairs T cell function in an immune cell via RNAi. 85. Способ по любому из пп. 83, 84, отличающийся тем, что РНКи опосредуется короткой шпилечной РНК (кшРНК).85. The method according to any one of paragraphs. 83, 84, characterized in that RNAi is mediated by short hairpin RNA (shRNA). 86. Способ по п. 85, отличающийся тем, что РНКи опосредуется более чем одной кшРНК.86. The method of claim 85, wherein the RNAi is mediated by more than one shRNA. 87. Способ по п. 86, отличающийся тем, что РНКи опосредуется двумя кшРНК.87. The method of claim 86, wherein the RNAi is mediated by two shRNAs. 88. Способ по любому из пп. 85-87, отличающийся тем, что Т-клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют кшРНК.88. The method according to any one of paragraphs. 85-87, characterized in that the T cell contains nucleotide sequences that encode shRNA. 89. Способ по п. 88, отличающийся тем, что Т-клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют более одной кшРНК.89. The method of claim 88, wherein the T cell contains nucleotide sequences that encode more than one shRNA. 90. Способ по п. 88, отличающийся тем, что Т-клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК.90. The method of claim 88, wherein the T cell contains nucleotide sequences that encode two shRNAs. 91. Способ по любому из пп. 88-90, отличающийся тем, что нуклеотидные последовательности, кодирующие кшРНК, содержат последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-12, 70-75 и 238-243, 265-267. 91. The method according to any one of paragraphs. 88-90, characterized in that the nucleotide sequences encoding shRNA contain sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-12, 70-75 and 238-243, 265-267. 92. Способ по любому из пп. 88-91, отличающийся тем, что нуклеотидные последовательности, кодирующие кшРНК, присутствуют в векторе. 92. The method according to any one of paragraphs. 88-91, characterized in that the nucleotide sequences encoding the shRNA are present in the vector. 93. Способ по п. 92, отличающийся тем, что экспрессия разных кшРНК, соответственно, регулируется разными промоторами.93. The method according to p. 92, characterized in that the expression of different shRNAs, respectively, is regulated by different promoters. 94. Способ по п. 93, отличающийся тем, что экспрессия двух разных кшРНК, соответственно, регулируется двумя разными промоторами.94. The method according to claim 93, characterized in that the expression of two different shRNAs, respectively, is regulated by two different promoters. 95. Способ по п. 94, отличающийся тем, что два разных промотора представляют собой промоторы РНК-полимеразы III.95. The method of claim 94, wherein the two different promoters are RNA polymerase III promoters. 96. Способ по п. 95, отличающийся тем, что два промотора представляют собой промоторы U6.96. The method of claim 95, wherein the two promoters are U6 promoters. 97. Способ по п. 96, отличающийся тем, что промоторы U6 получают из разных видов.97. The method according to p. 96, characterized in that the U6 promoters are obtained from different species. 98. Способ по любому из пп. 94-97, отличающийся тем, что два промотора ориентированы в разных направлениях относительно друг друга.98. The method according to any one of paragraphs. 94-97, characterized in that the two promoters are oriented in different directions relative to each other. 99. Способ по любому из пп. 61-98, отличающийся тем, что каждый из генетически сконструированного антигенного рецептора и кшРНК экспрессируется из вектора.99. The method according to any one of paragraphs. 61-98, characterized in that each of the genetically engineered antigen receptor and shRNA is expressed from a vector. 100. Способ по п. 99, отличающийся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор и кшРНК экспрессируются из одного и того же вектора.100. The method of claim 99, wherein the genetically engineered antigen receptor and shRNA are expressed from the same vector. 101. Способ по любому из пп. 99, 100, отличающийся тем, что вектор представляет собой плазмидный вектор или вирусный вектор.101. The method according to any one of paragraphs. 99, 100, characterized in that the vector is a plasmid vector or a viral vector. 102. Способ по п. 101, отличающийся тем, что вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор, аденовирусный вектор или вектор на основе аденоассоциированного вируса.102. The method of claim 101, wherein the viral vector is a lentiviral vector, an adenoviral vector, or an adeno-associated virus vector. 103. Способ по п. 102, отличающийся тем, что лентивирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор.103. The method of claim 102, wherein the lentiviral vector is a retroviral vector. 104. Способ по п. 61, отличающийся тем, что Т-клетка представляет собой CD4+ Т-клетку или CD8+ Т-клетку.104. The method of claim 61 wherein the T cell is a CD4+ T cell or a CD8+ T cell. 105. Способ по п. 104, отличающийся тем, что Т-клетка содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют две кшРНК и CAR в одном и том же векторе. 105. The method of claim 104, wherein the T cell contains nucleotide sequences that encode two shRNAs and a CAR in the same vector. 106. Способ по п. 105, отличающийся тем, что каждая из двух кшРНК регулируется двумя разными промоторами РНК-полимеразы III, ориентированными в разных направлениях относительно друг друга.106. The method according to p. 105, characterized in that each of the two shRNAs is regulated by two different RNA polymerase III promoters oriented in different directions relative to each other. 107. Способ по п. 106, отличающийся тем, что CAR нацелен на CD19. 107. The method of claim 106, wherein the CAR targets CD19. 108. Композиция, способная специфически связываться с целевым антигеном, содержащая эффективное количество Т-клетки по любому из пп. 14-60.108. A composition capable of specifically binding to a target antigen, containing an effective amount of a T cell according to any one of paragraphs. 14-60. 109. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественного новообразования, содержащая эффективное количество Т-клетки по любому из пп. 14-60 и фармацевтически приемлемый носитель.109. Pharmaceutical composition for the treatment of cancer, containing an effective amount of T-cells according to any one of paragraphs. 14-60 and a pharmaceutically acceptable carrier. 110. Способ лечения злокачественного новообразования, включающий введение нуждающемуся в иммунотерапии субъекту Т-клетки по любому из пп. 14-60 или композиции по п. 108 или 109.110. A method of treating a malignant neoplasm, comprising administering a T cell to a subject in need of immunotherapy according to any one of paragraphs. 14-60 or compositions according to item 108 or 109. 111. Способ по п. 110, отличающийся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор специфически связывается с антигеном, связанным с злокачественным новообразованием. 111. The method of claim 110, wherein the genetically engineered antigen receptor specifically binds to an antigen associated with the cancer. 112. Т-клетка по любому из пп. 14-60 или композиция по пп. 108, 109 для применения при лечении злокачественного новообразования.112. T-cell according to any one of paragraphs. 14-60 or the composition according to paragraphs. 108, 109 for use in the treatment of cancer. 113. Применение Т-клетки по любому из пп. 14-60 или композиции по пп. 108, 109 в изготовлении лекарственного препарата для лечения злокачественного новообразования.113. The use of T-cells according to any one of paragraphs. 14-60 or compositions according to paragraphs. 108, 109 in the manufacture of a medicament for the treatment of cancer. 114. Т-клетка или композиция по п. 112 или применение по п. 113, отличающиеся тем, что генетически сконструированный антигенный рецептор специфически связывается с антигеном, связанным с злокачественным новообразованием.114. The T cell or composition of claim 112 or the use of claim 113, wherein the genetically engineered antigen receptor specifically binds to an antigen associated with the cancer.
RU2020125399A 2018-01-12 2019-01-10 IMPROVED IMMUNE CELLS WITH DOUBLE shRNA AND COMPOSITIONS CONTAINING THEM RU2793922C2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2018-0004238 2018-01-12
KR20180004238 2018-01-12
PCT/IB2019/050194 WO2019138354A1 (en) 2018-01-12 2019-01-10 Enhanced immune cells using dual shrna and composition including the same

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2020125399A RU2020125399A (en) 2022-02-15
RU2020125399A3 RU2020125399A3 (en) 2022-02-15
RU2793922C2 true RU2793922C2 (en) 2023-04-10

Family

ID=

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015142675A2 (en) * 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
WO2017040945A1 (en) * 2015-09-04 2017-03-09 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immune cell compositions and methods of use
RU2015139874A (en) * 2013-02-20 2017-03-24 Новартис Аг CANCER TREATMENT USING A CHIMER ANTIGEN SPECIFIC RECEPTOR BASED ON A HUMANIZED ANTIBODY AGAINST EGFRvIII

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2015139874A (en) * 2013-02-20 2017-03-24 Новартис Аг CANCER TREATMENT USING A CHIMER ANTIGEN SPECIFIC RECEPTOR BASED ON A HUMANIZED ANTIBODY AGAINST EGFRvIII
WO2015142675A2 (en) * 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
WO2017040945A1 (en) * 2015-09-04 2017-03-09 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Immune cell compositions and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEONID CHERKASSKY et al., Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition, J Clin Invest, 2016, Vol.126(8), pp.3130-3144. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11679129B2 (en) Enhanced immune cells using dual shRNA and composition including the same
EP3286225B1 (en) Cd5 chimeric antigen receptor for adoptive t cell therapy
US20180327470A1 (en) Chimeric antigen receptor-modified immune effector cell carrying pd-l1 blocking agent
JP7475088B2 (en) Immunocompetent cells expressing cell surface molecules that specifically recognize human mesothelin, IL-7, and CCL19
KR20210033941A (en) Improved T-cell therapy
WO2022225981A2 (en) Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
CN115885038A (en) Immunocompetent cells expressing chimeric antigen receptors
US20220348928A1 (en) Enhanced immune cells using dual shrna and composition including the same
RU2793922C2 (en) IMPROVED IMMUNE CELLS WITH DOUBLE shRNA AND COMPOSITIONS CONTAINING THEM
US20230226181A1 (en) GENETIC ENGINEERING OF gamma delta T CELLS FOR IMMUNOTHERAPY
US20230338422A1 (en) Engineering gamma delta t cells with interleukin-36 for immunotherapy
WO2024030758A1 (en) Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
JP2022531814A (en) Amplification of modified cells and their applications