RU2793772C2

RU2793772C2 - Dried implant composition and injectable aqueous implant formulation

Info

Publication number: RU2793772C2
Application number: RU2020119258A
Authority: RU
Inventors: Даниэль СУППИГЕР; Пол БАКСТОН; Нино КУРЦ
Original assignee: Гайстлих Фарма Аг
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2023-04-05

Abstract

FIELD: implantology.

SUBSTANCE: group of inventions relates to the field of dried implant compositions for obtaining injectable aqueous implant compositions for use in tissue regeneration, primarily in the regeneration of alveolar bone, root cement or periodontal ligament (PDL), suitable for injection into periodontal pockets. The dried composition of the implant consists of a mixture of nanocrystalline hydroxyapatite particles obtained from natural bone, characterized by a size of 50 to 200 microns, and fragments of natural crosslinked fibrillar material of collagen, which passes through a sieve with a mesh size of 0.5 m. Moreover, the mass ratio of hydroxyapatite and collagen is from 1.8 to 4.5. Also disclosed is an injectable aqueous composition of the implant for use in the regeneration of oral tissues; a ready-to-use syringe containing an injectable aqueous implant compositions a kit for obtaining an injectable aqueous implant composition, as well as a process for obtaining an injectable aqueous implant composition.

EFFECT: group of inventions provides for the development of a dried implant composition that can be used to obtain an injectable aqueous implant composition, and this aqueous implant composition extrudable through a tapering system and a gauge 18 cannula.

15 cl, 5 dwg, 6 tbl, 10 ex

Description

Предпосылки создания настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Изобретение относится к новой высушенной композиции импланта для получения нового инъектируемого водного состава импланта для применения при регенерации тканей, прежде всего при регенерации тканей ротовой полости, прежде всего при регенерации альвеолярной кости, цемента корня зуба или пародонтальной связки (PDL), пригодной для инъекции в пародонтальные карманы через сужающуюся систему и канюлю 18-го калибра, а также к новому инъектируемому водному составу импланта для инъекции, полученной с использованием упомянутой высушенной композиции импланта, к способу и набору для получения упомянутого нового инъектируемого водного состава импланта.The invention relates to a new dried implant composition for obtaining a new injectable aqueous implant composition for use in tissue regeneration, in particular in the regeneration of oral tissues, in particular in the regeneration of alveolar bone, root cementum or periodontal ligament (PDL), suitable for injection into periodontal pockets through a tapering system and an 18 gauge cannula, as well as to a new injectable aqueous implant composition for injection obtained using said dried implant composition, to a method and kit for obtaining said new injectable aqueous implant composition.

Существует множество факторов риска развития заболеваний тканей пародонта, таких как плохая гигиена полости рта, курение табака, диабет, ожирение, генетическая предрасположенность, возраст и социально-экономический статус, которые способствуют накоплению бактерий, образованию биопленок и инфекции зубодесневой борозды и, следовательно, к воспалению десен или гингивиту. Если не лечить, воспаление прогрессирует вдоль корня зуба и вызывает разрушение PDL и окружающей альвеолярной костной ткани, что относится к пародонтиту. По мере прогрессирования заболевания пародонта между зубом и мягкими тканями формируются карманы, которые продолжают расти до тех пор, пока зуб не потеряет свою стабильность и не выпадает. Клиническими признаками заболеваний пародонта являются воспаление мягких тканей, кровотечение при (тканевом) зондировании, возможно, сопровождающееся нагноением, и рентгенографическая потеря альвеолярной кости. Стоматолог может определить наличие и степень заболевания пародонта, используя зонд для измерения глубины пародонтальных карманов, то есть глубины между мягкой тканью или костью и зубом, что относится к потере клинического зубо-десневого прикрепления.There are many risk factors for developing periodontal disease, such as poor oral hygiene, tobacco smoking, diabetes, obesity, genetic predisposition, age, and socioeconomic status, that contribute to bacterial accumulation, biofilm formation, and sulcus infection and hence inflammation. gums or gingivitis. If left untreated, inflammation progresses along the root of the tooth and causes destruction of the PDL and surrounding alveolar bone, which is referred to as periodontitis. As periodontal disease progresses, pockets form between the tooth and soft tissues, which continue to grow until the tooth loses its stability and falls out. Clinical signs of periodontal disease are soft tissue inflammation, bleeding on (tissue) probing, possibly accompanied by suppuration, and radiographic loss of alveolar bone. The dentist can determine the presence and extent of periodontal disease by using a probe to measure the depth of periodontal pockets, that is, the depth between soft tissue or bone and the tooth, which refers to the loss of clinical dentogingival attachment.

Направленная регенерация тканей (GTR) является широко используемой хирургической процедурой для лечения потери пародонтальных структур. В ходе этой процедуры пародонтолог получает доступ к больному корню и окружающей кости через разрезы мягких тканей, чтобы поднять лоскут. Следующим этапом является обработка (санация) поврежденной кости, мягких тканей и поверхности корня с помощью пригодных ручных инструментов, ультразвуковых или лазерных устройств, когда удаляют больные ткани, а поверхность корня очищают от зубного камня и выравнивают. После санации крупных дефектов кости более крупные дефекты кости заполняют материалом для регенерации кости. Для регенерации кости с более глубокими костными дефектами поверх материала для регенерации помещают тканевые барьеры для регенерации ткани, такие как Geistlich Bio-Gide®, описанные в ЕР-В1-1676592 и коммерческие продукты фирмы Geistlich Pharma AG. Пародонтолог закрывает лоскут соответствующими швами. Затем десна, эпителиальное прикрепление, кости и зубо-десневое прикрепление восстанавливаются. Хотя эта процедура была эффективной, разрезы в десне вызывают у пациента дискомфорт, боль, отек, рецессию десны, повышенную чувствительность зубов, длительное время заживления и повышают вероятность повторного заражения.Guided tissue regeneration (GTR) is a widely used surgical procedure to treat loss of periodontal structures. During this procedure, the periodontist accesses the diseased root and surrounding bone through soft tissue incisions to lift the flap. The next step is the treatment (sanation) of the damaged bone, soft tissues and root surface using suitable hand instruments, ultrasonic or laser devices, when diseased tissues are removed, and the root surface is cleaned of tartar and leveled. After sanitation of large bone defects, larger bone defects are filled with bone regeneration material. For bone regeneration with deeper bone defects, tissue regeneration barriers such as the Geistlich Bio-Gide® described in EP-B1-1676592 and commercial products from Geistlich Pharma AG are placed over the regeneration material. The periodontist closes the flap with appropriate sutures. Then the gingiva, epithelial attachment, bones and dentogingival attachment are restored. Although this procedure has been effective, incisions in the gums cause the patient discomfort, pain, swelling, gingival recession, increased tooth sensitivity, prolonged healing time, and increased chances of re-infection.

В качестве материалов для регенерации костей в участках повреждения кости были использованы многочисленные природные и синтетические материалы и композиции.Numerous natural and synthetic materials and compositions have been used as materials for bone regeneration at sites of bone injury.

Хорошо известным природным остеокондуктивным заменителем кости, который способствует росту кости при пародонтальных костных дефектах, является материал Geistlich Bio-Oss®, коммерческий продукт фирмы Geistlich Pharma AG. Этот материал изготавливают из природной кости способом, описанным в патентах США №5167961 и 5417975, который позволяет сохранить трабекулярную архитектуру и нанокристаллическую структуру природной кости, что позволяет сформировать превосходную остеокондуктивную матрицу, которая не резорбируется или очень медленно резорбируется.A well-known natural osteoconductive bone substitute that promotes bone growth in periodontal bone defects is Geistlich Bio-Oss®, a commercial product from Geistlich Pharma AG. This material is made from natural bone in a manner described in US Pat.

Чтобы исключить указанные выше недостатки, связанные с разрезами в десне, существует необходимость в разработке инъектируемого состава импланта для инъекции.In order to overcome the above disadvantages associated with incisions in the gum, there is a need to develop an injectable composition of the implant for injection.

Для повышения восприятия пациентами при инъекции в пародонтальные карманы и удобной инъекции вручную с использованием шприца, этот инъектируемый водный состав импланта должен экструдироваться через канюлю с диаметром не более диаметра канюли или иглы калибра 18 (внутренний диаметр 0,838 мм), предпочтительно при давлении, не превышающем 60 Н.To enhance patient acceptance for injection into periodontal pockets and convenient manual injection using a syringe, this injectable aqueous implant formulation should be extruded through a cannula with a diameter no greater than that of a 18 gauge cannula or needle (0.838 mm ID), preferably at a pressure not exceeding 60 N.

Для оптимальной регенерации ткани ротовой полости, прежде всего для регенерации альвеолярной кости, цемента корня зуба и пародонтальной связки, требуется инъектируемый состав имплант а для инъекции, обеспечивающий матрицу из гидроксиапатита и коллагена, которые близки природной окружающей среде in vivo, где происходит такая регенерация.Optimal oral tissue regeneration, primarily regeneration of alveolar bone, root cementum, and periodontal ligament, requires an injectable implant formulation for injection providing a matrix of hydroxyapatite and collagen that is close to the natural in vivo environment where such regeneration occurs.

Гидроксиапатит, полученный из природной кости, ближе к природной окружающей среде in vivo, в которой происходит регенерация, чем синтетический (небиологический) гидроксиапатит или керамический материал.Hydroxyapatite derived from natural bone is closer to the natural in vivo environment in which regeneration takes place than synthetic (non-biological) hydroxyapatite or ceramic material.

Частицы, полученные при измельчении гидроксиапатита из природной кости, характеризуются неупорядоченной и продольной формой в большей степени, чем округлые частицы, полученные при измельчении синтетического гидроксиапатита или керамического материала. Таким образом они представляют собой высокий риск закупорки канюли калибра 18. На фиг.5 представлены фотографии, полученные на сканирующем электронном микроскопе (СЭМ), нанокристаллических частиц гидроксиапатита из природной кости (слева) и из частиц синтетического бета-трикальцийфосфата (бета-ТКФ) (справа). Таким образом можно лишь частично предсказать результаты экструзии через канюли составов, содержащих частицы из синтетического гидроксиапатита или керамического материала на основании экструзии аналогичных составов, содержащих частицы гидроксиапатита, полученного из природной кости.Particles obtained by grinding hydroxyapatite from natural bone are characterized by a disordered and longitudinal shape to a greater extent than rounded particles obtained by grinding synthetic hydroxyapatite or ceramic material. Thus, they represent a high risk of clogging the 18 gauge cannula. Figure 5 shows scanning electron microscope (SEM) photographs of nanocrystalline hydroxyapatite particles from natural bone (left) and from particles of synthetic beta-tricalcium phosphate (beta-TCP) ( on right). Thus, the results of cannula extrusion of formulations containing particles of synthetic hydroxyapatite or ceramic material can only be partially predicted based on the extrusion of similar formulations containing particles of hydroxyapatite derived from natural bone.

Важными признаками природной кости человека являются морфология и очень малый размер (наноразмер) кристаллов гидроксиапатита, которые в случае минерала кости человека характеризуются следующими параметрами: гексагональная пространственная группа Р6₃/m, длиной приблизительно от 30 до 50 нм (с ось: [0,0,1]) и длиной от 14 до 25 нм (а и b оси: [1,0,0] и [0,1,0]). См. Weiner S. и др., FASEB, 6:879-885 (1992). Таким образом, с учетом природной окружающей среды, в которой происходит регенерация, желательно использовать частицы нанокристаллического гидроксиап,атита, полученные из природной кости, предпочтительно с морфологией и размером кристаллов, близкими к природной кости человека.Important features of natural human bone are the morphology and very small size (nanosize) of hydroxyapatite crystals, which in the case of human bone mineral are characterized by the following parameters: hexagonal space group P6 ₃ /m, approximately 30 to 50 nm long (c axis: [0.0 ,1]) and a length of 14 to 25 nm (a and b axes: [1,0,0] and [0,1,0]). See Weiner S. et al. FASEB 6:879-885 (1992). Thus, in view of the natural environment in which regeneration takes place, it is desirable to use particles of nanocrystalline hydroxyapatite obtained from natural bone, preferably with a morphology and crystal size similar to natural human bone.

В патенте США №2012/0107401 описаны жидкотекучие имплантируемые остеокондуктивные матрицы, которые включают смесь минеральных частиц размером 0,1-2 мм либо из керамического материала, такого как синтетический гидроксиапатит, либо бэта-TCP, либо гидроксиапатит из природной кости, коллаген, который может быть растворимым коллагеном либо нерастворимым коллагеном человеческого или животного происхождения, и терапевтический агент, включающий статин. Указано, что такие жидкотекучие имплантируемые остеокондуктивные матрицы являются пригодными в качестве порошков или гелей, которые можно вводить инъекцией, распылять или вливать в участок-мишень ткани. Указано также, что массовое соотношение керамического материала и коллагена составляет от 0,15 до 22,5 (п. 4) или от 1,5 до 11,5 (п. 5), а в качестве конкретных соотношений керамического материала и коллагена указаны только величины 5 и 4,83 (п. 2 и абз. [0089], [0090]).U.S. Patent No. 2012/0107401 describes fluid implantable osteoconductive matrices that include a mixture of 0.1-2 mm mineral particles of either ceramic material such as synthetic hydroxyapatite or beta-TCP or natural bone hydroxyapatite, collagen, which can be soluble collagen or insoluble collagen of human or animal origin, and a therapeutic agent including a statin. Such flowable implantable osteoconductive matrices are said to be useful as powders or gels that can be injected, sprayed or poured into a tissue target site. It is also indicated that the mass ratio of the ceramic material and collagen is from 0.15 to 22.5 (item 4) or from 1.5 to 11.5 (item 5), and only values 5 and 4.83 (item 2 and paragraphs [0089], [0090]).

В патенте США №7322825 описан способ лечения пародонтоза при инъекции в пародонтальные карманы композиции, которая представляет собой смесь тонко измельченных частиц микрокристаллического гидроксиапатита из кости размером от 50 до 400 мкм и частиц «свободного коллагена» диаметром менее 1 мм, причем отмечается, что эти частицы «свободного коллагена» представляют собой несшитые волокна коллагена малого размера или гель, содержащий фибриллярный коллаген, и необязательно физиологически совместимый загуститель. Вязкость такой смеси является достаточно низкой, чтобы проходить через иглу 18 калибра (внутренний диаметр 0,838 мм) после приложения дополнительной энергии при нагревании, например, микроволновым излучением. Согласно этому патенту, сшитый коллаген, такой как продукт Avitene или Collastat, нельзя разрезать на кусочки достаточно малого размера, чтобы проходить через иглу 18 калибра. Конкретно описанные композиции характеризуются массовым соотношением гидроксиапатита и коллагена от 0,5 до 1,5.US Pat. No. 7,322,825 describes a method for treating periodontal disease by injecting into periodontal pockets a composition that is a mixture of finely divided particles of microcrystalline hydroxyapatite from bone ranging in size from 50 to 400 μm and particles of "free collagen" with a diameter of less than 1 mm, and it is noted that these particles "free collagen" are small, uncrosslinked collagen fibers or a gel containing fibrillar collagen and optionally a physiologically compatible thickener. The viscosity of such a mixture is low enough to pass through an 18 gauge needle (0.838 mm ID) after additional heating energy is applied, for example by microwave radiation. According to this patent, cross-linked collagen, such as the Avitene or Collastat product, cannot be cut into pieces small enough to pass through an 18 gauge needle. Specifically described compositions are characterized by a mass ratio of hydroxyapatite and collagen from 0.5 to 1.5.

Способ лечения пародонтоза, описанный в патенте США №7322825, не получил широкого распространения. Несшитый коллаген, такой как «свободный коллаген», значительно отличается от природной окружающей среды in vivo, которая требуется для регенерации тканей ротовой полости, прежде всего для регенерации альвеолярной кости, цемента корня зуба и пародонтальной связки.The method of treatment of periodontitis described in US patent No. 7322825, is not widely used. Uncrosslinked collagen, such as "free collagen", differs significantly from the natural in vivo environment that is required for oral tissue regeneration, primarily alveolar bone, root cementum, and periodontal ligament regeneration.

В патенте США №5352715 описан инъектируемый керамический состав для восстановления и наращивания мягких и твердых тканей, который включает коллаген и частицы керамического материала из фосфата кальция в фамацевтически приемлемом жидком носителе, где керамические частицы из фосфата кальция характеризуются размером от 50 до 250 мкм и массовым соотношением керамических частиц из фосфата кальция и коллагена от 1:19 до 1:1, предпочтительно от 1:4 до 1:2. Согласно описанию этого патента, керамические частицы из фосфата кальция предпочтительно представляют собой частицы спеченной керамики небиологического (синтетического) происхождения, а коллаген по существу является в значительной степени несшитым, то есть не-содержащим телопептиды, причем предпочтительным реконструированным коллагеном является очищенный коллаген, восстановленный ателопептидами. Такой инъектируемый керамический состав может проходить через иглу 20 калибра (внутренний диаметр 0,603 мм).US Pat. No. 5,352,715 describes an injectable ceramic composition for soft and hard tissue repair and augmentation that includes collagen and calcium phosphate ceramic particles in a pharmaceutically acceptable liquid carrier, wherein the calcium phosphate ceramic particles are characterized by a size of 50 to 250 microns and a weight ratio of ceramic particles from calcium phosphate and collagen from 1:19 to 1:1, preferably from 1:4 to 1:2. According to the description of this patent, the calcium phosphate ceramic particles are preferably sintered ceramic particles of non-biological (synthetic) origin and the collagen is substantially uncrosslinked, i.e. free of telopeptides, with the preferred reconstituted collagen being purified collagen reconstituted with atelopeptides. Such an injectable ceramic composition can be passed through a 20 gauge needle (0.603 mm ID).

Комбинация не-содержащего телопептиды коллагена и синтетических частиц фосфата кальция в значительной степени отличается от природной окружающей среды in vivo, в которой происходит регенерация.The combination of telopeptide-free collagen and synthetic calcium phosphate particles is very different from the natural in vivo environment in which regeneration takes place.

В заявке ЕР-0270254-А2 описана высушенная композиция импланта, включающая смесь, которая содержит по массе без учета влаги, 2-40% реконструированного фибриллярного ателопептидного коллагена, который в основном является несшитым, и 60-98% трикальцийфосфата, такого как гидроксиапатит с размером частиц в интервале 100-2000 мкм, при этом массовое соотношение трикальцийфосфата и ателопептидного коллагена составляет, таким образом, от 1,5 до 49. Такую высушенную композицию импланта обрабатывают гамма-излучением для улучшения как биологических, так и технологических свойств.EP-0270254-A2 describes a dried implant composition comprising a mixture which contains, by weight without moisture, 2-40% reshaped fibrillar atelopeptide collagen, which is substantially uncrosslinked, and 60-98% tricalcium phosphate, such as hydroxyapatite with a size particles in the range of 100-2000 microns, while the mass ratio of tricalcium phosphate and atelopeptide collagen is thus from 1.5 to 49. Such a dried implant composition is treated with gamma radiation to improve both biological and technological properties.

Инъектируемый водный состав импланта, содержащий коллаген, нельзя стерилизовать гамма- или рентгеновским излучением. Для стабильности в течение длительного периода времени (более 6 месяцев) стерильной инъектируемой водной композиции импланта требуются жесткие асептические условия получения и хранения, которые не всегда доступны для применения. Следовательно, требуется обеспечить получение высушенной композиции импланта, стабильность которой сохраняется в течение длительного периода времени и при регидратации которой можно получить инъектируемый водный состав импланта.The injectable aqueous composition of the implant containing collagen cannot be sterilized by gamma or x-ray radiation. Stability over a long period of time (more than 6 months) of a sterile injectable aqueous implant composition requires strict aseptic conditions for preparation and storage, which are not always available for use. Therefore, it is desirable to provide a dried implant composition that is stable for an extended period of time and that upon rehydration can provide an injectable aqueous implant composition.

Краткое описание настоящего изобретенияBrief description of the present invention

Задача или цель настоящего изобретения заключалась в разработке высушенной композиции импланта, которую можно использовать для получения инъектируемого водного состава импланта для применении при регенерации ткани ротовой полости, прежде всего регенерации альвеолярной кости, цемента корня зуба и пародонтальной связки, причем этот водный состав импланта должен экструдироваться через сужающуюся систему и канюлю 18 калибра и при этом следует исключить недостатки составов импланта предшествующего уровня техники.The object or purpose of the present invention was to provide a dried implant composition that can be used to prepare an injectable aqueous implant composition for use in oral tissue regeneration, especially the regeneration of alveolar bone, root cementum and periodontal ligament, this aqueous implant composition being extruded through a tapering system and an 18 gauge cannula, while avoiding the shortcomings of prior art implant formulations.

Варьируя способы получения, компоненты и соотношения компонентов более чем 300 прототипов высушенная композиций имплантов, включающих частицы нанокристаллического гидроксиапатита, полученных из природной кости и природного сшитого фибриллярного коллагена, и подвергая составы, полученные при регидратации и гомогенном смешивании высушенных композиций имплантов, испытанию на экструдируемость с использованием канюли 18 калибра (как описано в примере 9), авторами изобретения были выявлены признаки таких высушенных композиций имплантов, которые неожиданно обеспечивали экструдируемость через сужающуюся систему и канюлю 18 калибра регидратированных и гомогенно смешанных водных составов имплантов, причем указанные составы близки к природной окружающей среде, в которой происходит регенерация.Varying the methods of preparation, components and ratios of components of more than 300 prototype dried implant compositions, including particles of nanocrystalline hydroxyapatite obtained from natural bone and natural cross-linked fibrillar collagen, and subjecting the compositions obtained by rehydration and homogeneous mixing of dried implant compositions to an extrudability test using 18 gauge cannula (as described in Example 9), the inventors found evidence of such dried implant compositions that unexpectedly provided extrudability through the tapering system and 18 gauge cannula of rehydrated and homogeneously mixed aqueous implant formulations, these formulations being close to the natural environment, in which regeneration takes place.

Согласно изобретению указанная выше цель достигается, как определено в прилагаемой формуле изобретения.According to the invention, the above object is achieved as defined in the appended claims.

Изобретение относится к следующим объектам:The invention relates to the following objects:

- высушенная композиция импланта, в основном состоящая из смеси частиц нанокристаллического гидроксиапатита, полученных из природной кости, размером от 50 до 200 мкм, и фрагментов природного сшитого фибриллярного материала коллагена, который проходит через сито с ячейками размером 0,5 мм, причем массовое соотношение нанокристаллического гидроксиапатита и коллагена составляет от 1,8 до 4,5.- dried implant composition, mainly consisting of a mixture of particles of nanocrystalline hydroxyapatite obtained from natural bone, ranging in size from 50 to 200 microns, and fragments of natural cross-linked fibrillar collagen material, which passes through a sieve with cells of 0.5 mm, and the mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite and collagen is from 1.8 to 4.5.

- применение указанной высушенной композиции импланта для получения с помощью регидратации и гомогенного смешивания 25-45 мас. % указанной выше высушенной композиции импланта с фармацевтически приемлемым водным носителем, инъектируемый водный состав импланта для применения при регенерации ткани ротовой полости, который экструдируется через сужающуюся систему и канюлю 18 калибра (внутренний диаметр 0,838 мм) длиной 25,4 мм, и- the use of the specified dried composition of the implant to obtain using rehydration and homogeneous mixing of 25-45 wt. % of the above dried implant composition with a pharmaceutically acceptable aqueous carrier, an injectable aqueous implant formulation for use in oral tissue regeneration, which is extruded through a tapering system and an 18 gauge (0.838 mm ID) cannula 25.4 mm long, and

- инъектируемый водный состав импланта для применения при регенерации ткани ротовой полости, который может экструдироваться через сужающуюся систему и канюлю 18 калибра (внутренний диаметр 0,838 мм) длиной 25,4 мм после приложения силы, не превышающей 60 Н, который включает 25-45 мас. % указанной выше высушенной композиции импланта, регидратированной и гомогенно смешанной со стерильной водой или стерильным изотоническим солевым раствором.- an injectable aqueous composition of the implant for use in the regeneration of oral tissue, which can be extruded through a tapering system and an 18 gauge cannula (inner diameter 0.838 mm) 25.4 mm long after applying a force not exceeding 60 N, which includes 25-45 wt. % of the above dried implant composition, rehydrated and homogeneously mixed with sterile water or sterile isotonic saline.

Термин «в основном состоящий из смеси…» означает, что очень большая доля, обычно по меньшей мере 99 мас. % высушенного импланта, состоит из указанной смеси и не более 6% неорганической соли, такой как, например, хлорид натрия, других компонентов, обычно не более 1 мас. % высушенного импланта, полученного из природного источника, и не оказывает значительного влияния на экструзионные свойства инъектируемого водного состава импланта. Такие компоненты могут представлять собой жир, сульфированную золу, глюкозамин, гелектозамин и части остаточных белков в очень малых количествах, такие как периостин, декорин и люмикан или аналогичные белки. Другие компоненты не включают любой синтетический полимер, прежде всего любой полиэтиленоксид, любой полипропиленоксид или любое синтетическое смазывающее вещество. Другие компоненты не включают любой статин или любой искусственный гидроксиапатит, то есть гидроксиапатит небиологического происхождения.The term "mainly consisting of a mixture of ..." means that a very large proportion, usually at least 99 wt. % dried implant, consists of the specified mixture and not more than 6% inorganic salt, such as, for example, sodium chloride, other components, usually not more than 1 wt. % dried implant obtained from a natural source, and does not significantly affect the extrusion properties of the injectable aqueous composition of the implant. Such components may be fat, sulphated ash, glucosamine, helectosamine, and portions of residual proteins in very small amounts such as periostin, decorin and lumican or similar proteins. The other components do not include any synthetic polymer, especially any polyethylene oxide, any polypropylene oxide, or any synthetic lubricant. The other components do not include any statin or any artificial hydroxyapatite, i.e. non-biological hydroxyapatite.

«Частицы нанокристаллического гидроксиапатита, полученные из природной кости» означают частицы, полученные из природной кости способом, который обеспечивает сохранение нанокристаллической структуры природной кости. Такой способ следует проводить при достаточно низкой температуре, при которой не происходит рекристаллизация природной кости, обычно при температуре, не превышающей 700°С."Nanocrystalline hydroxyapatite particles derived from natural bone" means particles obtained from natural bone in a manner that preserves the nanocrystalline structure of natural bone. Such a method should be carried out at a sufficiently low temperature at which natural bone does not recrystallize, usually at a temperature not exceeding 700°C.

Такой пригодный способ описан в патентах США No. 5167961 или 5417975 и он включает деградацию органического материала в обезжиренной кости при нагревании в присутствии аммиака, экстрагирование солюбилизированных продуктов деградации при промывке водой при температуре менее 60°С и при обработке костного минерала на воздухе при температуре от 250°С до 600°С таком образом, чтобы обеспечить сохранение губчатой структуры и нанокристаллической структуры природной кости, получение нанокристаллического гидроксиапатиата с очень низким содержанием органических примесей или белков. Частицы нанокристаллического гидроксиапатита, полученные из природной кости, можно получить при измельчении и просеивании указанного выше нанокристаллического гидроксиапатита.Such a suitable method is described in U.S. Patent Nos. 5167961 or 5417975 and it includes the degradation of organic material in defatted bone by heating in the presence of ammonia, the extraction of solubilized degradation products by washing with water at a temperature of less than 60°C and by processing the bone mineral in air at a temperature of from 250°C to 600°C in this way to ensure the preservation of the spongy structure and nanocrystalline structure of natural bone, obtaining nanocrystalline hydroxyapatate with a very low content of organic impurities or proteins. Nanocrystalline hydroxyapatite particles obtained from natural bone can be obtained by grinding and sieving the above nanocrystalline hydroxyapatite.

Частицы нанокристаллического гидроксиапатита из природной кости можно также получить удобным способом при измельчении и просеивании гранул Geistlich Bio-Oss® Small Granules (выпускаемых фирмой Geistlich Pharma AG, CH-6110, Швейцария).Nanocrystal hydroxyapatite particles from natural bone can also be conveniently obtained by grinding and sieving Geistlich Bio-Oss® Small Granules (manufactured by Geistlich Pharma AG, CH-6110, Switzerland).

Размер «частиц нанокристаллического гидроксиапатита из природной кости», пригодных для включения в композицию по настоящему изобретению, составляет от 50 до 200 мкм.The size of "natural bone nanocrystalline hydroxyapatite particles" suitable for inclusion in the composition of the present invention is from 50 to 200 microns.

Действительно, если размер частиц нанокристаллического гидроксиапатита из природной кости составляет более 200 мкм, то состав импланта, полученного при регидратации и гомогенном смешивании, имеет тенденцию забивать канюли шприца калибра 18 (внутренний диаметр 0,838 мм), а если размер частиц нанокристаллического гидроксиапатита из природной кости, составляет менее 50 мкм, существует повышенный риск воспаления, вызванного этими мелкими частицами.Indeed, if the particle size of nanocrystalline hydroxyapatite from natural bone is more than 200 microns, then the composition of the implant obtained by rehydration and homogeneous mixing tends to clog the cannulas of a 18 gauge syringe (internal diameter 0.838 mm), and if the particle size of nanocrystalline hydroxyapatite from natural bone, is less than 50 microns, there is an increased risk of inflammation caused by these small particles.

Таким образом интервал размера от 50 до 200 мкм имеет определяющее значение.Thus, the size range from 50 to 200 µm is of decisive importance.

Предпочтительно размер частиц нанокристаллического гидроксиапатита из природной кости составляет от 100 до 180 мкм. Таким образом сводится к минимуму риск воспаления или засорения.Preferably, the particle size of nanocrystalline hydroxyapatite from natural bone is from 100 to 180 microns. This minimizes the risk of inflammation or blockage.

Термин «материал из природного сшитого фибриллярного коллагена» означает материал из фибриллярного коллагена, полученный из материала природной ткани способом, позволяющим сохранить телопептидную структуру и наибольшую степень его природной сшивки. Такой материал из природного сшитого фибриллярного коллагена представляет собой нерастворимый материал коллагена, который не подвергали любой ферментативной обработке, любой химической сшивке или любой физической сшивке (такой как, например, обработка DeHydroThermal DHT, УФ-облучение и т.п…). Действительно, любая из указанных обработок может значительно изменить структуру телопептидов и/или природную сшивку, свойственную материалу из природной ткани.The term "natural cross-linked fibrillar collagen material" means a fibrillar collagen material obtained from natural tissue material in a manner that preserves the telopeptide structure and the greatest degree of its natural cross-linking. Such natural cross-linked fibrillar collagen material is an insoluble collagen material that has not been subjected to any enzymatic treatment, any chemical cross-linking or any physical cross-linking (such as, for example, DeHydroThermal DHT treatment, UV irradiation, etc...). Indeed, any of these treatments can significantly alter the structure of the telopeptides and/or the natural crosslinking inherent in the natural tissue material.

Пригодным материалом из природного сшитого фибриллярного коллагена является материал из природных тканей, который содержит от 50 до 100 мас. % коллагена и от 0 до 50 мас. % эластина, предпочтительно от 70 до 95 мас. % и от 5 до 30% эластина по данным определения десмозина/изодесмозина согласно модифицированному известному методу, включающему гидролиз и оф-ВЭЖХ (см., например, работы Guida Ε. и др. 1990 Development and validation of a high performance chromatography method for the determination of desmosines in tissues, Journal of Chromatography или Rodriguqe Ρ 2008 Quantification of Mouse Lung Elastin During Prenatal Development, The Open Respiratory Medicine Journal). Примеры таких тканей включают ткани позвоночных, прежде всего млекопитающих (например, свиней, крупного рогатого скота, лошадей, овец, коз, кроликов), мембрану брюшной полости и перикарда, подслизистую оболочку тонкой кишки (SIS) и дерму. Такими тканями предпочтительно являются ткани свиней, крупного рогатого скота или лошадей. Представляют интерес ткани мембраны брюшной полости и дермы свиньи, крупного рогатого скота или лошади.A suitable material of natural cross-linked fibrillar collagen is a material from natural tissues, which contains from 50 to 100 wt. % collagen and from 0 to 50 wt. % elastin, preferably from 70 to 95 wt. % and 5 to 30% elastin as determined by the determination of desmosine/isodesmosine according to a modified known method including hydrolysis and RP-HPLC (see, for example, Guida E. et al. 1990 Development and validation of a high performance chromatography method for the determination of desmosines in tissues, Journal of Chromatography or Rodriguqe P 2008 Quantification of Mouse Lung Elastin During Prenatal Development, The Open Respiratory Medicine Journal). Examples of such tissues include those of vertebrates, especially mammals (eg, pigs, cattle, horses, sheep, goats, rabbits), abdominal and pericardial membranes, small intestinal submucosa (SIS), and dermis. Such tissues are preferably those of pigs, cattle or horses. Of interest are the membrane tissues of the abdominal cavity and the dermis of pigs, cattle or horses.

Предпочтительно материал природного сшитого фибриллярного коллагена выбирают из группы, состоящей из дермы свиньи и мембраны брюшной полости или перикарда свиньи.Preferably, the natural cross-linked fibrillar collagen material is selected from the group consisting of porcine dermis and porcine abdominal or pericardial membrane.

Обычно коллаген представляет собой преимущественно коллаген типа I, коллаген типа III или их смесь. Коллаген может также включать значительную долю коллагена типа II, типа IV, типа VI или типа VIII или любую комбинацию любых из указанных типов коллагена.Typically, the collagen is predominantly type I collagen, type III collagen, or a mixture thereof. Collagen may also include a significant proportion of collagen type II, type IV, type VI or type VIII, or any combination of any of these types of collagen.

Обычно материал из природного сшитого фибриллярного коллагена содержит от 50 до 100 мас. % коллагена и от 0 до 50 мас. % эластина, предпочтительно от 70 до 95 мас. % коллагена и от 5 до 30 мас. % эластина.Typically, the material of natural cross-linked fibrillar collagen contains from 50 to 100 wt. % collagen and from 0 to 50 wt. % elastin, preferably from 70 to 95 wt. % collagen and from 5 to 30 wt. % elastin.

Пригодным материалом из природного сшитого фибриллярного коллагена из природных тканей является коллагеновая мембрана брюшной полости и перикарда свиньи, крупного рогатого скота или лошади, полученная по методике, аналогичной описанной в разделе Примеры в патенте ЕР-В1-1676592, включающей щелочную обработку, кислотную обработку и обработку органическими растворителями с последующим измельчением до фрагментов, проходящих через сито с размером ячеек 0,5 мм.A suitable material of natural cross-linked fibrillar collagen from natural tissues is a collagen membrane of the abdominal cavity and pericardium of a pig, cattle or horse, obtained by a method similar to that described in the Examples section in patent EP-B1-1676592, including alkaline treatment, acid treatment and treatment organic solvents, followed by grinding to fragments passing through a sieve with a mesh size of 0.5 mm.

Другим пригодным материалом из природного сшитого фибриллярного коллагена из природных тканей является продукт Geistlich Bio-Gide® (выпускаемый фирмой Geistlich Pharma AG), который измельчают до фрагментов, проходящих через сито с размером ячеек 0,5 мм.Another suitable natural tissue cross-linked fibrillar collagen material is Geistlich Bio-Gide® (manufactured by Geistlich Pharma AG), which is ground to fragments that pass through a 0.5 mm sieve.

Еще одним пригодным материалом природного сшитого фибриллярного коллагена из природных тканей является дерма свиньи, полученная по методике, описанной в примере 7 патента ЕР-В1-2654816, включающей щелочную обработку, кислотную обработку, лиофилизацию и очистку органическими растворителями с последующим измельчением до фрагментов, проходящих через сито с размером ячеек 0,5 мм.Another suitable material for natural cross-linked fibrillar collagen from natural tissues is the dermis of a pig, obtained by the method described in example 7 of patent EP-B1-2654816, including alkaline treatment, acid treatment, lyophilization and purification with organic solvents, followed by grinding to fragments passing through a sieve with a mesh size of 0.5 mm.

Следует отметить, что материал из природного сшитого фибриллярного коллагена включает зрелые коллагеновые волокна, характеризующиеся тройной спиральностью по данным спектроскопии кругового дихроизма. Такие волокна действительно образуют каркас, который способствует колонизации клетками для регенерации тканей ротовой полости, прежде всего клетками для регенерации кости и клетками для регенерации пародонтальной связки (PDL).It should be noted that the natural cross-linked fibrillar collagen material includes mature collagen fibers characterized by triple helicity according to circular dichroism spectroscopy. Such fibers do form a scaffold that promotes colonization by oral tissue regeneration cells, primarily bone regeneration cells and periodontal ligament (PDL) regeneration cells.

Материал из природного сшитого фибриллярного коллагена должен присутствовать в виде фрагментов, проходящих через сито с размером ячеек 0,5 мм. Такие фрагменты в основном получают при измельчении природного сшитого фибриллярного коллагена по методике, включающей центробежную мельницу и просеивание фрагментов коллагена.The natural cross-linked fibrillar collagen material should be present as fragments passing through a 0.5 mm sieve. Such fragments are generally obtained by grinding natural cross-linked fibrillar collagen by a technique involving a centrifugal mill and sieving of collagen fragments.

Характеристика материала из природного сшитого фибриллярного коллагена, присутствующего в виде фрагментов, проходящих через сито с размером ячеек 0,5 мм, является критичной для экструзии через сужающуюся систему и канюлю шприца калибра 18 (внутренний диаметр 0,838 мм). Действительно, как было показано в экспериментах, проведенных с использованием множества прототипов, если в составе высушенной композиции импланта использовать более крупные фрагменты природного сшитого фибриллярного материала, например, которые проходят через сито с размером ячеек 0,6 или 0,7 мм, то существует значительный риск того, что состав импланта, полученный после регидратации и гомогенного смешивания высушенной композиции импланта, будет засорять канюлю калибра 18.The performance of the natural cross-linked fibrillar collagen material present as fragments passing through a 0.5 mm sieve is critical for extrusion through the tapering system and 18 gauge syringe cannula (0.838 mm ID). Indeed, as shown in experiments conducted using many prototypes, if larger fragments of natural cross-linked fibrillar material are used in the dried implant composition, for example, which pass through a sieve with a mesh size of 0.6 or 0.7 mm, then there is a significant the risk that the implant composition obtained after rehydration and homogeneous mixing of the dried implant composition will clog the 18 gauge cannula.

Другим важным параметром для экструзии через сужающуюсяю систему и канюлю калибра 18 (внутренний диаметр 0,838 мм) является массовое соотношение нанокристаллического гидроксиапатита и коллагена.Another important parameter for extrusion through a tapering system and a 18 gauge cannula (inner diameter 0.838 mm) is the mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite to collagen.

Действительно, как было показано в экспериментах, проведенных с использованием множества прототипов, если массовое соотношение гидроксиапатита и коллагена составляет менее 1,8 или более 4,5, то состав импланта, полученный после регидратации и гомогенного смешивания, будет с трудом проходить через шприц, так как сила, необходимая для экструзии через сужающуюся систему и канюлю калибра 18 (внутренний диаметр 0,838 мм) слишком высока. Такой неожиданный результат, по-видимому, трудно объяснить. Сила, необходимая для экструзии, резко увеличивается с 1,8 до 1,5, но лишь умеренно увеличивается с 4,5 до 6. Однако, как показали эксперименты, проведенные с использованием многочисленных прототипов, когда это отношение превышает 4,5, например, 5, воспроизводимость силы, необходимой для экструзии композиции импланта, недостаточна. Высокая воспроизводимость, необходимая для коммерческого импланта, достигается только тогда, когда соотношение нанокристаллического гидроксиапатита и коллагена составляет от 1,8 до 4,5.Indeed, as has been shown in experiments conducted using a variety of prototypes, if the mass ratio of hydroxyapatite and collagen is less than 1.8 or more than 4.5, then the implant composition obtained after rehydration and homogeneous mixing will be difficult to pass through the syringe, so as the force required to extrude through the tapering system and 18 gauge cannula (0.838 mm ID) is too high. Such an unexpected result is apparently difficult to explain. The force required for extrusion increases dramatically from 1.8 to 1.5, but only moderately increases from 4.5 to 6. However, as experiments conducted using numerous prototypes have shown, when this ratio exceeds 4.5, for example, 5, the reproducibility of the force required to extrude the implant composition is insufficient. The high reproducibility required for a commercial implant is only achieved when the ratio of nanocrystalline hydroxyapatite to collagen is between 1.8 and 4.5.

Таким образом массовое соотношение нанокристаллического гидроксиапатита и коллагена от 1,8 до 4,5 является критическим.Thus, the mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite and collagen from 1.8 to 4.5 is critical.

Предпочтительно массовое соотношение нанокристаллического гидроксиапатита и коллагена составляет от 2,5 до 4,2. Обычно в этом интервале для экструзии требуется более слабая сила.Preferably, the weight ratio of nanocrystalline hydroxyapatite and collagen is from 2.5 to 4.2. Typically, a weaker force is required for extrusion in this range.

Наиболее предпочтительно массовое соотношение нанокристаллического гидроксиапатита и коллагена составляет от 2,5 до 4,0. Действительно, было установлено, что для инъектируемых водных составов имплантов с таким массовым соотношением нанокристаллического гидроксиапатита и коллагена достигается самая высокая воспроизводимость при малой силе.Most preferably, the weight ratio of nanocrystalline hydroxyapatite and collagen is from 2.5 to 4.0. Indeed, it has been found that injectable aqueous implant formulations with this mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite and collagen achieve the highest reproducibility at low force.

Для повышения экструдируемости инъектируемого водного состава импланта необходимо стерилизовать высушенную водную композицию импланта гамма- или рентгеновским излучением с использованием обычных доз радиации для стерилизации, обычно 27-33 кГр. При такой обработке действительно происходит разрыв определенных связей в природном сшитом фибриллярном коллагене, что способствует повышению его текучести и экструдируемости.To increase the extrudability of the injectable aqueous implant composition, it is necessary to sterilize the dried aqueous implant composition with gamma or x-ray radiation using conventional sterilization radiation doses, typically 27-33 kGy. With such processing, certain bonds in the natural cross-linked fibrillar collagen actually break, which contributes to an increase in its fluidity and extrudability.

Термин «инъектируемый водный состава импланта» относится к составу импланта, полученного после регидратации и гомогенного смешивания высушенной композиции импланта с фармацевтически приемлемым водным носителем, который можно удобно инъектировать в организм человека или животного для регенерации тканей ротовой полости, прежде всего в пародонтальных карманах, при экструзии через сужающуюсяю систему и канюлю калибра 18 (внутренний диаметр 0,838 мм) длиной 25,4 мм.The term "injectable aqueous implant composition" refers to an implant composition obtained after rehydration and homogeneous mixing of the dried implant composition with a pharmaceutically acceptable aqueous carrier that can be conveniently injected into the human or animal body for the regeneration of oral tissues, especially in periodontal pockets, by extrusion through a tapering system and a 18 gauge cannula (inner diameter 0.838 mm) 25.4 mm long.

Обычно инъектируемый водный состава импланта можно экструдировать через сужающуюсяю систему и канюлю калибра 18 (внутренний диаметр 0,838 мм) длиной 25,4 мм с силой, не превышающей 60 Н.Typically, the injectable aqueous formulation of the implant can be extruded through a tapering system and a 18 gauge (0.838 mm ID) cannula 25.4 mm long with a force not exceeding 60 N.

В основном таким фармацевтически приемлемым водным носителем является вода, стерильный изотонический солевой раствор, кровь или ее фракции, обычно собственная кровь пациента.In general, such a pharmaceutically acceptable aqueous vehicle is water, sterile isotonic saline, blood or fractions thereof, usually the patient's own blood.

Инъектируемый водный состав импланта предпочтительно получают при регидратации и гомогенном смешивании 25-45 мас. % высушенной композиции импланта, более предпочтительно 30-40 мас. % высушенной композиции импланта со стерильной водой, стерильным изотоническим солевым раствором или кровью. При использовании указанного количества высушенной композиции импланта, инъектируемый водный состав импланта представляет собой новый состав, который можно экструдировать через сужающуюсяю систему и канюлю калибра 18 (внутренний диаметр 0,838 мм) длиной 25,4 мм с силой, не превышающей 60 Н.The injectable aqueous composition of the implant is preferably obtained by rehydration and homogeneous mixing of 25-45 wt. % of the dried composition of the implant, more preferably 30-40 wt. % dried implant composition with sterile water, sterile isotonic saline or blood. Using the indicated amount of dried implant composition, the injectable aqueous implant composition is a novel composition that can be extruded through a tapering system and a 18 gauge (0.838 mm ID) cannula 25.4 mm long with a force not exceeding 60 N.

Если инъектируемый водный состав импланта получают при регидратации и гомогенном смешивании 30-40 мас. % описанной выше высушенной композиции импланта со стерильной водой или стерильным изотоническим солевым раствором, сила, необходимая для экструдирования через сужающуюсяю систему и канюлю калибра 18 (внутренний диаметр 0,838 мм) длиной 25,4 мм, составляет менее 40 Н, предпочтительно менее 20 Н.If the injectable aqueous composition of the implant is obtained by rehydration and homogeneous mixing of 30-40 wt. % of the dried implant composition described above with sterile water or sterile isotonic saline, the force required to extrude through the tapering system and a 18 gauge (0.838 mm ID) cannula 25.4 mm long is less than 40 N, preferably less than 20 N.

Если инъектируемый водный состав импланта получают при регидратации и гомогенном смешивании 30-40 мас. % описанной выше высушенной композиции импланта с кровью, сила, необходимая для экструдирования высушенного инъектируемого водного состава импланта, содержащего 30-40 мас. % высушенной композиции импланта в фармацевтически приемлемом носителе, составляет менее 45 Н, предпочтительно менее 25 Н.If the injectable aqueous composition of the implant is obtained by rehydration and homogeneous mixing of 30-40 wt. % of the dried composition of the implant with blood described above, the force required to extrude the dried injectable aqueous composition of the implant containing 30-40 wt. % of the dried implant composition in a pharmaceutically acceptable carrier is less than 45 N, preferably less than 25 N.

Высушенную композицию импланта, используемую согласно настоящему изобретению, можно получать способом, включающим следующие стадии:The dried implant composition used in accordance with the present invention can be prepared by a process comprising the following steps:

(а) Получение частиц нанокристаллического гидроксиапатита из природной кости, характеризующихся размером от 50 до 200 мкм,(a) Obtaining particles of nanocrystalline hydroxyapatite from natural bone, characterized by a size of from 50 to 200 microns,

(б) Получение измельченного природного сшитого фибриллярного коллагена способом, включающим щелочную обработку, кислотную обработку и обработку органическими растворителями, и измельчение на фрагменты, проходящие через сито с размером ячеек 0,5 мм,(b) Obtaining ground natural cross-linked fibrillar collagen by a method including alkali treatment, acid treatment and treatment with organic solvents, and grinding into fragments passing through a sieve with a mesh size of 0.5 mm,

(в) Добавление смеси измельченного природного сшитого фибриллярного коллагена, полученного на стадии (б), в водный раствор, интенсивное смешивание, при этом получают суспензию коллагена, добавление частиц нанокристаллического гидроксиапатита размером от 50 до 200 мкм, полученных на стадии (а), и интенсивное смешивание при поддерживании рН в интервале от 4,2 до 7,5,(c) Adding a mixture of pulverized natural cross-linked fibrillar collagen obtained in step (b) to an aqueous solution, vigorously mixing to obtain a suspension of collagen, adding nanocrystalline hydroxyapatite particles of 50 to 200 µm in size obtained in step (a), and intensive mixing while maintaining the pH in the range from 4.2 to 7.5,

(г) Высушивание смешанной композиции, содержащей частицы нанокристаллического гидроксиапатита и коллаген, полученный на стадии (в), и(d) Drying the mixed composition containing nanocrystalline hydroxyapatite particles and collagen obtained in step (c), and

(д) Стерилизация гамма- или рентгеновским излучением высушенной композиции импланта, полученной на стадии (г).(e) Gamma or X-ray sterilization of the dried implant composition obtained in step (d).

Керамический материал частиц нанокристаллического гидроксиапатита из природной кости представляет собой частицы, полученные из природной кости способом, позволяющим сохранить нанокристаллическую структуру природной кости, как описано выше.The ceramic material of the natural bone nanocrystalline hydroxyapatite particles are particles obtained from natural bone in a manner that preserves the nanocrystalline structure of natural bone as described above.

Костный материал с высокой степенью чистоты, полученный описанным выше способом, можно измельчать и просеивать таким образом, чтобы получить требуемый размер.High purity bone material obtained by the method described above can be crushed and sieved in such a way as to obtain the desired size.

В другом варианте частицы керамического материала, полученные из природной кости, требуемого размера можно получить из продукта Geistlich Bio-Oss® (производства фирмы Geistlich Pharma AG) с использованием стадий измельчения и просеивания.In another embodiment, natural bone-derived ceramic particles of the required size can be obtained from Geistlich Bio-Oss® (manufactured by Geistlich Pharma AG) using grinding and screening steps.

Измельченный природный сшитый фибриллярный коллаген, полученный на стадии (б), можно получить способом, аналогично тому, как описано в примере 7 патента ЕР-В1-2654815, который включает измельчение в воде кожевенного сырья свиней, крупного рогатого скота, лошадей, коз или кроликов до частиц размером от 0,5 до 30 мм, удаление воды с использованием водорастворимого растворителя, такого как спирт или кетон, обезжиривание с использованием хлорированного углеводорода, такого как дихлорэтан или хлористый метилен или нехлорированный углеводород, такой как гексан или толуол, обработку коллагена сильным неорганическим основанием при рН выше 12,0 и сильной неорганической кислотой при рН от 0 до 1, лиофильное высушивание и очистку высушенных губчатых волокон коллагена, полученных при обработке органическими растворителями, такими как спирты, простые эфиры, кетоны и хлорированные углеводороды, удаление растворителей в вакууме и дальнейшее измельчение очищенного губчатого коллагена до фрагментов, которые проходят через ячейки сита размером 0,5 мм по методике, включающей центробежную мельницу и просеивание фрагментов коллагена.The ground natural cross-linked fibrillar collagen obtained in step (b) can be obtained in a manner analogous to that described in Example 7 of EP-B1-2654815, which includes grinding raw hides of pigs, cattle, horses, goats or rabbits in water. to particle sizes of 0.5 to 30 mm, removal of water using a water-soluble solvent such as alcohol or ketone, degreasing using a chlorinated hydrocarbon such as dichloroethane or methylene chloride or a non-chlorinated hydrocarbon such as hexane or toluene, treating collagen with a strong inorganic base at pH above 12.0 and strong inorganic acid at pH 0 to 1, freeze drying and purification of dried spongy collagen fibers obtained by treatment with organic solvents such as alcohols, ethers, ketones and chlorinated hydrocarbons, removal of solvents in vacuum and further grinding the purified spongy collagen to fragments that pass through a 0.5 mm sieve using a technique that includes a centrifugal mill and sifting collagen fragments.

Измельченный природный сшитый фибриллярный коллаген, полученный на стадии (б), можно получить способом, аналогично тому, как описано в патенте ЕР-В1-1676592, который включает отделение от мяса и жира при механической обработке мембран брюшной полости иди миокарда свиньи, крупного рогатого скота, лошади, промывку водой, обработку 1-5%-ным раствором гидроксида натрия, промывку водой, подкисление 0,2-0,8%-ной соляной кислотой, промывку водой до рН 3.5, нейтрализацию раствором NaHCO₃, промывку водой, дегидратацию водорастворимым растворителем, таким как спирт или кетон, обезжиривание углеводородом, таким как гексан, и последующее измельчение очищенных мембран коллагена на фрагменты, проходящие через сито с размером ячеек 0,5 мм, по методике, включающей центробежную мельницу и просеивание фрагментов коллагена.The crushed natural cross-linked fibrillar collagen obtained in step (b) can be obtained by a method similar to that described in patent EP-B1-1676592, which includes separation from meat and fat during mechanical processing of membranes of the abdominal cavity or myocardium of a pig, cattle , horses, washing with water, treatment with 1-5% sodium hydroxide solution, washing with water, acidification with 0.2-0.8% hydrochloric acid, washing with water to pH 3.5, neutralization with NaHCO ₃ solution, washing with water, dehydration with water-soluble solvent such as alcohol or ketone, degreasing with a hydrocarbon such as hexane, and then grinding the purified collagen membranes into fragments passing through a sieve with a mesh size of 0.5 mm, according to a technique involving a centrifugal mill and sieving the collagen fragments.

На стадии (в) измельченный природный сшитый фибриллярный коллаген, полученный на стадии (б), добавляют в водный раствор и интенсивно перемешивают, при этом получают суспензию коллагена, затем полученные на стадии (а) частицы нанокристаллического гидроксиапатита с размером от 50 до 200 мкм добавляют в суспензию коллагена и интенсивно перемешивают.In step (c), the crushed natural cross-linked fibrillar collagen obtained in step (b) is added to an aqueous solution and intensively mixed, thus obtaining a suspension of collagen, then nanocrystalline hydroxyapatite particles obtained in step (a) with a size of 50 to 200 μm are added into the collagen suspension and vigorously mixed.

Обычно величина рН, измеренная на стадии (в), составляет от 4,2 до 7,5, предпочтительно от 4,5 до 7,5.Typically, the pH value measured in step (c) is between 4.2 and 7.5, preferably between 4.5 and 7.5.

Стадия (г) обычно включает высушивание смешанной композиции, содержащей частицы нанокристаллического гидроксиапатита и коллаген, полученный на стадии (в), лиофильно или на воздухе предпочтительно при пониженном давлении.Step (d) typically involves drying the mixed composition containing the nanocrystalline hydroxyapatite particles and the collagen obtained in step (c) freeze-dried or in air, preferably under reduced pressure.

Содержание воды в высушенной композиции импланта, полученной на стадии (б), обычно составляет 3-7%, по данным измерения методом титрования Карла Фишера.The water content of the dried implant composition obtained in step (b) is typically 3-7% as measured by Karl Fischer titration.

После стадии (г) необязательно проводят стадию (д) стерилизации гамма- или рентгеновским излучением, обычно используя обычные радиационные дозы для стерилизации, обычно 27-33 кГр.Step (d) is optionally followed by step (e) of gamma or x-ray sterilization, typically using conventional sterilization radiation doses, typically 27-33 kGy.

Изобретение относится также к новому инъектируемому водному составу импланта для применения при регенерации тканей ротовой полости, который можно экструдировать через сужающуюся систему и канюлю калибра 18 (внутренний диаметр 0,838 мм) длиной 25,4 мм, с приложением силы, не превышающей 60 Н, который включает 25-45 мас. % указанной выше высушенной композиции импланта, которую подвергали регидратации и гомогенному смешиванию со стерильной водой или стерильным изотоническим солевым раствором.The invention also relates to a new injectable aqueous implant composition for use in oral tissue regeneration, which can be extruded through a tapering system and a 18 gauge (inner diameter 0.838 mm) cannula 25.4 mm long, with a force not exceeding 60 N, which includes 25-45 wt. % of the above dried implant composition, which has been rehydrated and mixed homogeneously with sterile water or sterile isotonic saline.

Если инъектируемый водный состав импланта включает 30-40 мас. % указанной выше высушенной композиции импланта, которую подвергали регидратации и гомогенному перемешиванию со стерильной водой или стерильным изотоническим солевым раствором, то сила, необходимая для экструдирования инъектируемого водного состава импланта через сужающуюся систему и канюлю калибра 18 (внутренний диаметр 0,838 мм) длиной 25,4 мм составляет менее 40 Н, в большинстве случаев менее 20 Н.If the injectable aqueous composition of the implant includes 30-40 wt. % of the above dried implant composition that has been rehydrated and homogeneously mixed with sterile water or sterile isotonic saline, then the force required to extrude the injectable aqueous implant composition through a constrictor system and a 18 gauge cannula (inner diameter 0.838 mm) 25.4 mm long is less than 40 N, in most cases less than 20 N.

Наблюдалось, что остеобласты могут расти in vitro в инъектируемом водном составе импланта по настоящему изобретению, что указывает на высокую биосовместимость такого инъектируемого водного состава импланта, которая обеспечивает при имплантации матрицу, очень близкую к естественной среде in vivo, в которой происходит регенерация.It has been observed that osteoblasts can grow in vitro in the injectable aqueous implant composition of the present invention, indicating a high biocompatibility of such an injectable aqueous implant composition, which provides, upon implantation, a matrix very close to the natural in vivo environment in which regeneration occurs.

Изобретение также относится к способу получения указанного выше инъектируемого водного состава импланта, который включает регидратацию и гомогенное перемешивание 25-45 мас. %, соответственно 30-40 мас. % указанной выше высушенной композиции импланта со стерильной водой или стерильным изотоническим солевым раствором.The invention also relates to a method for obtaining the above injectable aqueous composition of the implant, which includes rehydration and homogeneous mixing of 25-45 wt. %, respectively 30-40 wt. % of the above dried implant composition with sterile water or sterile isotonic saline.

Гомогенное смешивание материала после регидратации имеет существенное значение для его экструзии из шприца с приложением низкой силы.Homogeneous mixing of the material after rehydration is essential for its extrusion from a syringe with low force.

Проведение регидратации и гомогенного смешивания высушенной композиции импланта со стерильной водой или стерильным изотоническим солевым раствором в шприце, снабженном смешивающим устройством, является достаточно удобным способом.Conducting rehydration and homogeneous mixing of the dried implant composition with sterile water or sterile isotonic saline in a syringe equipped with a mixing device is a fairly convenient method.

Таким пригодным шприцом является система смешивания в шприце Medmix (MEDMIX, SP 003-00М-02 /В, номер по каталогу 507211), представленная на фиг. 1.Such a suitable syringe is the Medmix syringe mixing system (MEDMIX, SP 003-00M-02 /B, catalog number 507211) shown in FIG. 1.

Более того изобретение относится к готовому к применению шприцу, содержащему инъектируемый состав импланта.Moreover, the invention relates to a ready-to-use syringe containing an injectable implant composition.

Такой готовый к применению шприц можно изготовить задолго до инъекции в очень жестких стерильных условиях при получении указанного выше высушенного состава импланта и проведении регидратации и гомогенного смешивания 25-45 мас. % указанной выше высушенной композиции импланта со стерильной водой или стерильным изотоническим солевым раствором и введении в шприц инъектируемого водного состава импланта.Such a ready-to-use syringe can be made well in advance of injection under very stringent sterile conditions, upon receipt of the above dried implant composition and rehydration and homogeneous mixing of 25-45 wt. % of the above dried implant composition with sterile water or sterile isotonic saline and injecting an injectable aqueous implant composition into a syringe.

Такой готовый к применению шприц можно изготовить незадолго перед инъекцией из шприца с перемешивающим устройством, который содержит указанную выше высушенную композицию импланта, при проведении регидратации и гомогенного смешивания в шприце указанной высушенной композиции импланта со стерильной водой, стерильным изотоническим солевым раствором или кровью.Such a ready-to-use syringe can be prepared shortly before injection from a stirred syringe that contains the above dried implant composition by rehydrating and homogeneously in-syringing said dried implant composition with sterile water, sterile isotonic saline or blood.

Изобретение также относится к набору для получения указанного выше инъектируемого водного состава импланта, предназначенного для применения при регенерации тканей в ротовой полости, который включает:The invention also relates to a kit for obtaining the above injectable aqueous composition of the implant, intended for use in tissue regeneration in the oral cavity, which includes:

- шприц, снабженный смешивающим устройством, содержащий высушенную композицию импланта, указанную выше, сужающейся системой и канюлей калибра 18 (внутренний диаметр 0,838 мм) длиной 25,4 мм,- a syringe equipped with a mixing device containing the dried implant composition indicated above, a tapering system and an 18 gauge cannula (inner diameter 0.838 mm) 25.4 mm long,

- контейнер, заполненный соответствующим количеством стерильной воды или стерильного изотонического раствора.- a container filled with an appropriate amount of sterile water or sterile isotonic saline.

Предпочтительно контейнер, заполненный соответствующим количеством стерильной воды или стерильным изотоническим раствором, представляет собой шприц с канюлей. Таким образом жидкость можно удобно вводить в шприц, снабженный смешивающим устройством, и который содержит высушенную композицию импланта.Preferably, the container, filled with an appropriate amount of sterile water or sterile isotonic saline, is a syringe with a cannula. Thus, the liquid can be conveniently injected into a syringe provided with a mixing device and which contains the dried implant composition.

Кроме того, изобретение также относится к способу ускорения регенерации альвеолярной кости, цемента корня зуба или PDL за счет имплантации в ротовую полость указанного выше инъектируемого состава импланта.In addition, the invention also relates to a method for accelerating the regeneration of alveolar bone, root cementum or PDL by implanting the above injectable implant composition into the oral cavity.

Краткое описание фигурBrief description of the figures

Изобретение будет описано более подробно со ссылкой на иллюстративные примеры предпочтительных вариантов осуществления изобретения и на прилагаемые фигуры.The invention will be described in more detail with reference to illustrative examples of preferred embodiments of the invention and to the accompanying figures.

На фиг. 1 представлена система шприца со смешивающим устройством Medmix (MEDMIX, SP 003-00М-02 /В, номер по каталогу 507211), (1) - шприц, содержащий высушенный биоматериал, (2) - колпачок Люэра с открытым выпускным отверстием, совместимый с любой канюлей Люэра, (3) колпачок с открытым отверстием для закрытия шприца во время процесса смешивания, (4) перемешивающее устройство, представляющее собой гибкий смеситель, когда поршень удален, и (5) поршень, который может быть удален для перемешивания материала в шприце, а затем может быть возвращен в исходное положение для вытеснения материала.In FIG. 1 shows a syringe system with a Medmix mixing device (MEDMIX, SP 003-00M-02 /B, catalog number 507211), (1) - a syringe containing dried biomaterial, (2) - a Luer cap with an open outlet, compatible with any luer cannula, (3) an open cap to close the syringe during the mixing process, (4) a mixing device that is a flexible mixer when the plunger is removed, and (5) a plunger that can be removed to mix the material in the syringe, and can then be returned to its original position to expel the material.

На фиг. 2 показана копия процедуры смешивания фирмы Medmix, как описано в инструкции по применению, которая прилагается к системе смешивания в шприце Medmix.In FIG. Figure 2 shows a copy of the Medmix mixing procedure as described in the Instructions for Use that accompanies the Medmix Syringe Mixing System.

На фиг. 3А и 3Б представлены кривые экструзии инъектируемых водных составов импланта, полученных при проведении регидратации и гомогенного смешивания высушенных композиций имплантов 2 и 4, полученных в примерах, с изотоническим солевым раствором (кривые (1) и (3)) или со свежей кровью человека (кривые (2) и (4)), соответственно.In FIG. 3A and 3B are extrusion curves of injectable aqueous implant formulations obtained by rehydration and homogeneous mixing of the dried implant formulations 2 and 4 obtained in the examples with isotonic saline (curves (1) and (3)) or with fresh human blood (curves (2) and (4)), respectively.

На фиг. 4 представлено микроскопическое изображение, полученное с использованием конфокального вращающегося дискового микроскопа CV1000 с возбуждением лазерным излучением при 561 нм, инъектируемого водного состава импланта 4, полученного при регидратации и гомогенном смешивании высушенной композиции импланта 4 (полученной в примере 6) с кровью человека: четко видны растущие клетки МС3Т3 CytoLight Red.In FIG. 4 shows a microscopic image obtained using a confocal rotating disk microscope CV1000 with laser excitation at 561 nm, of an injectable aqueous composition of implant 4 obtained by rehydration and homogeneous mixing of the dried composition of implant 4 (obtained in example 6) with human blood: clearly visible growing MC3T3 CytoLight Red cells.

На фиг. 5 слева представлена сканирующая электронная микрофотография (СЭМ) нанокристаллических частиц гидроксиапатита, полученных из природной кости, а справа - SEM синтетических частиц бета-ТСР.In FIG. 5 on the left is a scanning electron micrograph (SEM) of nanocrystalline hydroxyapatite particles derived from natural bone, and on the right is an SEM of synthetic beta-TCP particles.

Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention

Настоящие примеры иллюстрируют изобретение, не ограничиваясь только ими.The present examples illustrate the invention without being limited to them.

Пример 1Example 1

Получение неочищенных материаловReceipt of crude materials

1) Получение тонкодисперсных нанокристаллических частиц гидроксиапатита размером от 100 до 150 мкм или от 125 до 180 мкм1) Obtaining finely dispersed nanocrystalline particles of hydroxyapatite with a size of 100 to 150 microns or from 125 to 180 microns

Тонкодисперсные нанокристаллические частицы гидроксиапатита из костных минералов получали из кортикального слоя или губчатого вещества кости, как описано в патенте US-A-5417975, примеры 1-4, с использованием дополнительной стадии просеивания для получения частиц размером от 100 до 150 мкм или от 125 до 180 мкм, соответственно.Finely divided nanocrystalline particles of hydroxyapatite from bone minerals were obtained from the cortical layer or cancellous bone, as described in US-A-5417975, examples 1-4, using an additional sieving step to obtain particles with a size of 100 to 150 microns or from 125 to 180 µm, respectively.

В другом варианте тонкодисперсные нанокристаллические частицы гидроксиапатита из костных минералов получали при измельчении гранул Geistlich Bio-Oss® Small (выпускаемых фирмой Geistlich Pharma AG, CH-6110, Швейцария),с последующим осторожным уплотнением с использованием специального пульверизатора и дополнительной стадии просеивания для получения частиц размером от 100 до 150 мкм или от 125 до 180 мкм, соответственно.In another embodiment, fine nanocrystalline hydroxyapatite particles from bone minerals were obtained by grinding Geistlich Bio-Oss® Small granules (manufactured by Geistlich Pharma AG, CH-6110, Switzerland), followed by gentle compaction using a special pulverizer and an additional sieving step to obtain particle sizes 100 to 150 µm or 125 to 180 µm, respectively.

Полученные, как указано выше, тонкодисперсные нанокристаллические частицы гидроксиапатита из костных минералов размером от 100 до 150 мкм или от 125 до 180 мкм хранили в стеклянных флаконах до использования.Obtained as above, fine nanocrystalline particles of hydroxyapatite from bone minerals with a size of 100 to 150 μm or 125 to 180 μm were stored in glass vials until use.

2) Получение коллагена А2) Obtaining collagen A

Кожевенное сырье свиньи измельчали в мясорубке до кусочков размером от 1 до 20 мм. Воду удаляли с помощью водорастворимого растворителя, такого как спирт или кетон. Волокна коллагена обезжиривали с использованием хлорированного углеводорода, такого как дихлорэтан или хлористый метилен, или нехлорированного углеводорода, такого как гексан или толуол. После удаления растворителя коллаген обрабатывали сильным органическим основанием при рН выше 12 в течение от 6 до 24 ч., и обрабатывали сильной неорганической кислотой при рН от 0 до 1 в течение от 1 до 12 ч. Избыток кислоты удаляли при промывке водой и суспензию гомогенизировали до образования 0,5 до 2% гомогенной суспензии волокон коллагена в присутствии регулятора набухания, такого как неорганическая соль. Суспензию высушивали лиофильно и полученные высушенные волокна губчатого коллагена последовательно очищали различными органическими растворителями, такими как спирты, простые эфиры, кетоны и хлорированные углеводороды, затем растворители выпаривали в вакууме до остаточного содержания растворителя менее 1%.Raw hides of pigs were crushed in a meat grinder to pieces ranging in size from 1 to 20 mm. Water was removed with a water soluble solvent such as an alcohol or a ketone. The collagen fibers were defatted using a chlorinated hydrocarbon such as dichloroethane or methylene chloride, or a non-chlorinated hydrocarbon such as hexane or toluene. After removal of the solvent, the collagen was treated with a strong organic base at pH above 12 for 6 to 24 hours, and treated with a strong inorganic acid at pH 0 to 1 for 1 to 12 hours. Excess acid was removed by washing with water and the suspension was homogenized to forming a 0.5 to 2% homogeneous suspension of collagen fibers in the presence of a swelling regulator such as an inorganic salt. The suspension was freeze-dried and the resulting dried spongy collagen fibers were successively purified with various organic solvents such as alcohols, ethers, ketones and chlorinated hydrocarbons, then the solvents were evaporated in vacuum to a residual solvent content of less than 1%.

Кусочки размером 1x1 см очищенного губчатого коллагена назрезали вручную ножницами. Нарезанные кусочки дополнительно измельчали, используя сначала режущую мельницу, которая включает сито от 0,5 до 4,0 мм, затем центробежную мельницу (Retsch, ZM200) с ситом 0,5 мм, включающую трапециевидные отверстия. В другом варианте нарезанные ножницами кусочки измельчали напрямую на центробежной мельнице.Pieces of 1x1 cm in size of the purified spongy collagen were cut by hand with scissors. The cut pieces were further ground using first a cutting mill which included a 0.5 to 4.0 mm sieve, then a centrifugal mill (Retsch, ZM200) with a 0.5 mm sieve including trapezoidal holes. In another embodiment, the pieces cut with scissors were ground directly in a centrifugal mill.

Таким образом получали фрагменты природного сшитого фибриллярного коллагена, содержащие коллаген А и которые проходят через сито с размером ячеек 0,5 мм.In this way, fragments of natural cross-linked fibrillar collagen containing collagen A were obtained and which passed through a sieve with a mesh size of 0.5 mm.

3) Получение коллагена В3) Obtaining collagen B

Мембраны брюшной полости поросят полностью отделяли от мяса и обезжиривали механическим способом, промывали в проточной воде и обрабатывали 2%-ным раствором NaOH в течение 12 ч. Затем мембраны промывали проточной водой и подкисляли 0,5%-ной HCl. После подкисления материала на всю его глубину (в течение 15 мин) материал промывали до достижения рН 3,5. Затем материал уплотняли 7%-ным солевым раствором, нейтрализовали 1%-ным раствором NaHCO₃ и промывали проточной водой, и подвергали дегидратации ацетоном и обезжириванию н-гексаном.The membranes of the abdominal cavity of piglets were completely separated from the meat and defatted mechanically, washed in running water, and treated with 2% NaOH solution for 12 h. Then, the membranes were washed with running water and acidified with 0.5% HCl. After acidifying the material to its full depth (for 15 min), the material was washed until a pH of 3.5 was reached. The material was then compacted with 7% saline, neutralized with 1% NaHCO ₃ solution and washed with running water, and subjected to dehydration with acetone and degreasing with n-hexane.

Затем материал сушили с использованием этилового эфира и измельчали на режущей мельнице (например, Pulverisette 25 фирмы Fritsch: см. www.fritsch.de./produkte/mahlen/schneidmuehlen/pulverisette-25 или SM300 фирмы Retsch: www.retsch.de/de/produkte/zerkleinern/schneidmuehlen.htlm), которая включает трапециевидные отверстия от 0,5 до 1,0 мм.The material was then dried with ethyl ether and ground in a cutting mill (e.g. Pulverisette 25 from Fritsch: see www.fritsch.de./produkte/mahlen/schneidmuehlen/pulverisette-25 or SM300 from Retsch: www.retsch.de/de /produkte/zerkleinern/schneidmuehlen.htlm), which includes trapezoidal holes from 0.5 to 1.0 mm.

Затем нарезанные сегменты волокон коллагена дополнительно измельчали с использованием центробежной мельницы, которая включает трапециевидные отверстия с ячейками 0,5 мм (Retsch, ZM200).The cut segments of collagen fibers were then further ground using a centrifugal mill that included trapezoidal holes with 0.5 mm mesh (Retsch, ZM200).

Таким образом получали фрагменты природного сшитого фибриллярного коллагена, содержащие коллаген В, которые проходят через сито с размером ячеек 0,5 мм.In this way, fragments of natural cross-linked fibrillar collagen containing collagen B were obtained, which pass through a sieve with a mesh size of 0.5 mm.

Пример 2Example 2

Высушивание и стерилизация смешанных композиций, содержащих нанокристаллические частицы гидроксиапатита и коллагенDrying and sterilization of mixed compositions containing nanocrystalline particles of hydroxyapatite and collagen

Смешанные композиции, содержащие нанокристаллические частицы гидроксиапатита и коллаген (полученный, как описано в примерах 3-8), высушивали лиофильно или на воздухе при пониженном давлении и стерилизовали с использованием гамма- или рентгеновского облучения.Mixed compositions containing nanocrystalline particles of hydroxyapatite and collagen (prepared as described in examples 3-8) were freeze-dried or in air under reduced pressure and sterilized using gamma or x-ray irradiation.

1) Лиофилизация1) Lyophilization

Из шприца объемом 50 мл массой наполняли шприцы объемом 1 мл (с нижней стороны шприца) из циклического олефинового сополимера (СОС). Заполняли примерно 0,5 мл объема шприца объемом 1 мл. Шприцы хранили закрытыми с обеих сторон в течение 5 ч в холодильнике при 4°С. Затем шприцы открывали с обеих сторон и помещали на металлическую пластину в лиофилизатор, причем каждый шприц находился в лежачем положении, чтобы иметь большую поверхность контакта с металлической пластиной. Затем включали следующую программу лиофилизации:From a 50 ml syringe, the mass was filled into 1 ml syringes (from the underside of the syringe) of cyclic olefin copolymer (COC). Approximately 0.5 ml volume was filled into a 1 ml syringe. The syringes were kept closed on both sides for 5 hours in a refrigerator at 4°C. The syringes were then opened on both sides and placed on a metal plate in the lyophilizer with each syringe in a recumbent position to have a large contact surface with the metal plate. The following lyophilization program was then included:

1. замораживание при -40°С в течение 7 ч1. freezing at -40°C for 7 hours

2. выдерживание при -40°С в течение 4 ч2. holding at -40°C for 4 hours

3. первичное высушивание при -10°С и 850 мкбар в течение 20 ч3. primary drying at -10°C and 850 µbar for 20 h

4. вторичное высушивание при +20°С и 100 мкбар в течение 6 ч.4. secondary drying at +20°C and 100 µbar for 6 hours.

В другом варианте вязкую массу нанокристаллических частиц гидроксиапатита и коллагена лиофилизировали не в шприцах, а на пластинах из нержавеющей стали или в небольших формах из нержавеющей стали диаметром менее 25 мм и глубиной менее 10 мм. Полученный после лиоффилизации высушенный материал измельчали на частицы размером от 0,1 до 2 мм с использованием центробежной мельницы (Retsch, ZM200) с размером ячеек от 1,5 до 10 мм. После измельчения в мельнице получали более мелкие нанокристаллические частицы гидроксиапатита в восстановленном конечном продукте.In another embodiment, a viscous mass of nanocrystalline particles of hydroxyapatite and collagen was lyophilized not in syringes, but on stainless steel plates or in small stainless steel molds with a diameter of less than 25 mm and a depth of less than 10 mm. The dried material obtained after lyophilization was ground into particles with a size of 0.1 to 2 mm using a centrifugal mill (Retsch, ZM200) with a mesh size of 1.5 to 10 mm. After milling, finer nanocrystalline hydroxyapatite particles were obtained in the reduced final product.

В другом варианте для измельчения вязкую массу нанокристаллических частиц гидроксиапатита и коллагена экструдировали из выходного отверстия стандартного люэровского шприца и формировали в виде прямых полос на пластинах из нержавеющей стали. Затем материал сам по себе высушивали лиофилизацией.In another embodiment, for grinding, a viscous mass of nanocrystalline particles of hydroxyapatite and collagen was extruded from the outlet of a standard Luer syringe and formed into straight strips on stainless steel plates. Then the material itself was dried by lyophilization.

2) Высушивание на воздухе2) Air drying

В другом варианте вязкую массу нанокристаллических частиц гидроксиапатита и коллагена, например, сформированную в виде прямых полос, высушивали в вакуумной сушильном шкафу при 30°С и 10 мкбар в течение 24 ч. Высушенные прямые полоски вручную измельчали на полоски длиной от 5 до 10 мм.In another version, a viscous mass of nanocrystalline particles of hydroxyapatite and collagen, for example, formed in the form of straight strips, was dried in a vacuum oven at 30°C and 10 μbar for 24 h. The dried straight strips were manually crushed into strips 5 to 10 mm long.

Затем гранулированный материал или небольшие полоски помещали в систему смешивания шприца объемом 3 мл (MEDMIX, SP 003-00М-02/В, номер по каталогу 507211) с колпачком шприца, включающим люэр с открытым отверстием и колпачок с открытым отверстием (MEDMIX, CP 000- 76M/D, номер по каталогу 506964).The granular material or small strips were then placed in a 3 ml syringe mixing system (MEDMIX, SP 003-00M-02/B, cat. no. - 76M/D, part number 506964).

3) Стерилизация3) Sterilization

Высушенную композицию импланта, полученную после лиофилизации или высушивания на воздухе при пониженном давлении стерилизовали с использованием гамма- или рентгеновского облучения при 27-33 кГр.The dried implant composition obtained after lyophilization or drying in air under reduced pressure was sterilized using gamma or X-ray irradiation at 27-33 kGy.

Содержание воды в высушенном продукте сразу после стерилизации составляло 3-7% по данным измерения методом титрования Карла Фишера.The water content of the dried product immediately after sterilization was 3-7% as measured by Karl Fischer titration.

Пример 3Example 3

Получение высушенной композиции импланта 1. содержащей частицы нанокристаллического гидроксиапатита размером от 100 до 150 мкм или от 125 до 180 мкм и коллаген А при массовом соотношении нанокристаллический гидроксиапатит/коллаген 4,0Obtaining a dried implant composition 1. containing particles of nanocrystalline hydroxyapatite with a size of 100 to 150 microns or from 125 to 180 microns and collagen A at a mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite/collagen of 4.0

Получение композиции нанокристаллического гидроксиапатита и коллагена В химическом стакане с помощью шпателя смешивали воду и соляную кислоту (2М). Затем добавляли измельченный коллаген А, полученный в примере 1, осторожно погружали в жидкость, чтобы смочить весь коллаген. Стакан закрывали завинчивающейся крышкой, и водно-коллагеновую суспензию гомогенно перемешивали на мешалке Speedmixer (фирмы CosSearch GmbH, Speedmixer DAC400.1FVZ) в течение 4 мин со скоростью 2500 об/мин. Суспензию коллагена слегка нагревали во время процедуры перемешивания. Затем суспензию коллагена охлаждали в течение 30 мин в холодильнике при 4°С.Preparation of Nanocrystalline Hydroxyapatite and Collagen Composition In a beaker, water and hydrochloric acid (2M) were mixed with a spatula. Then, crushed collagen A obtained in example 1 was added, carefully immersed in liquid to wet all the collagen. The beaker was closed with a screw cap, and the water-collagen suspension was homogeneously stirred on a Speedmixer (CosSearch GmbH, Speedmixer DAC400.1FVZ) for 4 minutes at 2500 rpm. The collagen suspension was slightly heated during the mixing procedure. Then the collagen suspension was cooled for 30 min in a refrigerator at 4°C.

Суспензию коллагена снова смешивали на мешалке Speedmixer в течение 2 мин со скоростью 2500 об/мин. Затем частицы костного тонкодисперсного нанокристаллического гидроксиапатита размером от 100 до 150 мкм или от 125 до 180 мкм, полученные в примере 1, добавляли в химический стакан, содержащий суспензию коллагена, и массу перемешивали на мешалке Speedmixer в течение 2 мин со скоростью 2000 об/мин. При этом величина рН составляла приблизительно 4,5.The collagen suspension was again mixed on the Speedmixer for 2 minutes at 2500 rpm. Then, particles of bone finely dispersed nanocrystalline hydroxyapatite with a size of 100 to 150 µm or 125 to 180 µm, obtained in Example 1, were added to a beaker containing a suspension of collagen, and the mass was stirred on a Speedmixer for 2 minutes at a speed of 2000 rpm. The pH value was approximately 4.5.

Количество материалов, использованных в описанных выше экспериментах, указано в следующей таблице.The amount of materials used in the experiments described above is indicated in the following table.

Высушивание композиции нанокристаллического гидроксиапатита и коллагенаDrying the Composition of Nanocrystalline Hydroxyapatite and Collagen

Высушивание методом лиофилизации или на воздухе при пониженном давлении и стерилизацию проводили, как описано в примере 2.Drying by lyophilization or in air under reduced pressure and sterilization was carried out as described in example 2.

Таким образом получали высушенную композицию импланта 1, содержащую частицы нанокристаллического гидроксиапатита, размером от 100 до 150 мкм или от 125 до 180 мкм и коллаген А при массовом соотношении нанокристаллический гидроксиапатит/коллаген 4,0, при рН до 4,5 после дегидратации деминерализованной водой, которую проводили, как описано в примере 9.Thus, a dried implant composition 1 was obtained containing particles of nanocrystalline hydroxyapatite with a size of 100 to 150 μm or 125 to 180 μm and collagen A at a mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite/collagen of 4.0, at a pH of up to 4.5 after dehydration with demineralized water, which was carried out as described in example 9.

Пример 4Example 4

Получение высушенной композиции импланта 2. содержащей частицы нанокристаллического гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм и коллаген В при массовом соотношении нанокристаллический гидроксиапатит/коллаген 4.0Obtaining a dried implant composition 2. containing particles of nanocrystalline hydroxyapatite with a size of 125 to 180 microns and collagen B at a mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite/collagen 4.0

Получение композиции нанокристаллического гидроксиапатита и коллагенаObtaining a composition of nanocrystalline hydroxyapatite and collagen

Измельченный коллаген В, полученный в примере 1, осторожно погружали в деминерализованную воду, чтобы смочить весь коллаген. Стакан закрывали завинчивающейся крышкой, и водно-коллагеновую суспензию гомогенно перемешивали на мешалке Speedmixer в течение 1 мин со скоростью 2500 об/мин. Суспензию коллагена нагревали до 70°С на водяной бане в течение 4 ч. Затем суспензию коллагена охлаждали в течение 30 мин при комнатной температуре или в холодильнике или на водяной бане.Crushed collagen B, obtained in example 1, was carefully immersed in demineralized water to wet all the collagen. The beaker was closed with a screw cap and the water-collagen slurry was homogeneously stirred on a Speedmixer for 1 minute at 2500 rpm. The collagen suspension was heated to 70° C. in a water bath for 4 hours. Then the collagen suspension was cooled for 30 minutes at room temperature or in a refrigerator or in a water bath.

Суспензию коллагена снова смешивали на мешалке Speedmixer в течение 2 мин со скоростью 2500 об/мин. Затем частицы костного тонкодисперсного нанокристаллического гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм, полученные в примере 1, добавляли в химический стакан, содержащий суспензию коллагена, и массу перемешивали на мешалке Speedmixer в течение 2 мин со скоростью 2000 об/мин. При этом величина рН составляла 6,2.The collagen suspension was again mixed on the Speedmixer for 2 minutes at 2500 rpm. Then, particles of bone finely dispersed nanocrystalline hydroxyapatite with a size of 125 to 180 μm, obtained in example 1, were added to a beaker containing a suspension of collagen, and the mass was stirred on a Speedmixer for 2 minutes at a speed of 2000 rpm. The pH value was 6.2.

Таким образом получали высушенную композицию импланта 2, содержащую частицы нанокристаллического гидроксиапатита, размером или от 125 до 180 мкм и коллаген В, при массовом соотношении нанокристаллический гидроксиапатит/коллаген 4,0, при рН 6,2 после дегидратации деминерализованной водой, которую проводили, как описано в примере 9.Thus, a dried implant composition 2 was obtained containing particles of nanocrystalline hydroxyapatite, with a size of or from 125 to 180 μm and collagen B, at a mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite/collagen 4.0, at pH 6.2 after dehydration with demineralized water, which was carried out as described in example 9.

Пример 5Example 5

Получение высушенной композиции импланта 3. содержащей частицы нанокристаллического гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм и смесь 2 частей коллагена А и одной части коллагена В при массовом соотношении нанокристаллический гидроксиапатит/коллаген 2.67Obtaining a dried implant composition 3. containing particles of nanocrystalline hydroxyapatite with a size of 125 to 180 microns and a mixture of 2 parts of collagen A and one part of collagen B at a mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite/collagen 2.67

В химическом стакане с помощью шпателя смешивали воду и соляную кислоту (2М). Затем добавляли измельченный коллаген В, полученный в примере 1, осторожно погружали в жидкость, чтобы смочить весь коллаген. Стакан закрывали завинчивающейся крышкой, и водно-коллагеновую суспензию гомогенно перемешивали на мешалке Speedmixer в течение 2 мин со скоростью 2500 об/мин, при этом величина рН составляла от 0,9 до 1. Суспензию коллагена нагревали до 70°С на водяной бане в течение 20 мин. Затем суспензию коллагена охлаждали в течение 30 мин на водяной бане при 25°С.In a beaker, water and hydrochloric acid (2M) were mixed with a spatula. Then, crushed collagen B, obtained in example 1, was added, carefully immersed in a liquid to wet all the collagen. The beaker was closed with a screw cap, and the water-collagen suspension was homogeneously mixed on a Speedmixer for 2 min at 2500 rpm, while the pH was from 0.9 to 1. The collagen suspension was heated to 70°C in a water bath for 20 minutes. Then the collagen suspension was cooled for 30 min in a water bath at 25°C.

Измельченный коллаген А, полученный в примере 1, добавляли и осторожно погружали в жидкость, чтобы смочить весь коллаген. Затем суспензию перемешивали на мешалке Speedmixer в течение 4 мин со скоростью 2500 об/мин.Crushed collagen A, obtained in example 1, was added and carefully immersed in the liquid to wet all the collagen. The slurry was then stirred on a Speedmixer for 4 minutes at 2500 rpm.

И наконец, частицы костного тонкодисперсного нанокристаллического гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм, полученные в примере 1, добавляли в химический стакан, содержащий суспензию коллагена, и массу перемешивали на мешалке Speedmixer в течение 2 мин со скоростью 2000 об/мин. При этом величина рН составляла приблизительно 4,5.Finally, particles of bone fine nanocrystalline hydroxyapatite with a size of 125 to 180 μm obtained in Example 1 were added to a beaker containing a suspension of collagen, and the mass was stirred on a Speedmixer for 2 minutes at a speed of 2000 rpm. The pH value was approximately 4.5.

Таким образом получали высушенную композицию импланта 3, содержащую частицы нанокристаллического гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм, и смесь 2 частей коллагена А и 1 часть коллагена В, при массовом соотношении нанокристаллический гидроксиапатит/коллаген 2,67, при рН 4,5 после дегидратации деминерализованной водой, которую проводили, как описано в примере 9.Thus, a dried implant composition 3 was obtained containing particles of nanocrystalline hydroxyapatite with a size of 125 to 180 μm, and a mixture of 2 parts of collagen A and 1 part of collagen B, at a mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite/collagen of 2.67, at pH 4.5 after dehydration of the demineralized water, which was carried out as described in example 9.

Пример 6Example 6

Получение высушенной композиции импланта 4. содержащей частицы нанокристаллического гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм и смесь 2 частей коллагена А и 1 части коллагена В при массовом соотношении нанокристаллический гидроксиапатит/коллаген 2.67Obtaining a dried implant composition 4. containing particles of nanocrystalline hydroxyapatite with a size of 125 to 180 microns and a mixture of 2 parts of collagen A and 1 part of collagen B at a mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite/collagen of 2.67

Получение композиции нанокристаллического гидроксиапатита и коллагена Измельченный коллаген В, полученный в примере 1, добавляли и осторожно погружали в жидкость, чтобы смочить весь коллаген. Стакан закрывали завинчивающейся крышкой, и водно-коллагеновую суспензию гомогенно перемешивали на мешалке Speedmixer в течение 1 мин со скоростью 2500 об/мин. Суспензию коллагена нагревали до 70°С на водяной бане в течение 20 мин. Затем суспензию коллагена охлаждали в течение 30 мин на водяной бане при 25°С.Preparation of Nanocrystalline Hydroxyapatite and Collagen Composition Crushed collagen B prepared in Example 1 was added and carefully immersed in a liquid to wet all of the collagen. The beaker was closed with a screw cap and the water-collagen slurry was homogeneously stirred on a Speedmixer for 1 minute at 2500 rpm. The collagen suspension was heated to 70°C in a water bath for 20 min. Then the collagen suspension was cooled for 30 min in a water bath at 25°C.

И наконец, тонкодисперсные нанокристаллического частицы костного гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм, полученные в примере 1, добавляли в химический стакан, содержащий суспензию коллагена, и массу перемешивали на мешалке Speedmixer в течение 2 мин со скоростью 2000 об/мин. При этом величина рН составляла 6,0.Finally, the 125 to 180 µm fine nanocrystalline bone hydroxyapatite particles obtained in Example 1 were added to the beaker containing the collagen suspension, and the mass was stirred on a Speedmixer for 2 minutes at a speed of 2000 rpm. The pH value was 6.0.

Таким образом получали высушенную композицию импланта 4, содержащую частицы нанокристаллического гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм, и смесь 2 частей коллагена А и 1 части коллагена В, при массовом соотношении нанокристаллический гидроксиапатит/коллаген 2,67, при рН 6,0 после дегидратации деминерализованной водой, которую проводили, как описано в примере 9.Thus, a dried implant composition 4 was obtained containing particles of nanocrystalline hydroxyapatite with a size of 125 to 180 μm, and a mixture of 2 parts of collagen A and 1 part of collagen B, at a mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite/collagen of 2.67, at pH 6.0 after dehydration of the demineralized water, which was carried out as described in example 9.

Пример 7Example 7

Получение высушенной композиции импланта 5. содержащей частицы нанокристаллического гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм и коллаген А при массовом соотношении нанокристаллический гидроксиапатит/коллаген 4.0Obtaining a dried implant composition 5. containing particles of nanocrystalline hydroxyapatite with a size of 125 to 180 μm and collagen A at a mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite/collagen 4.0

Получение композиции нанокристаллического гидроксиапатита и коллагена Измельченный коллаген А, полученный в примере 1, добавляли и осторожно погружали в деминерализованную воду, чтобы смочить весь коллаген. В химический стакан добавляли частицы нанокристаллического костного гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм, полученные в примере 1, и стакан закрывали завинчивающейся крышкой. Водную суспензию коллагена и нанокристаллического гидроксиапатита гомогенно перемешивали на мешалке Vortex в течение 1 мин и с использованием медицинского долота в течение 1 мин.Preparation of Nanocrystalline Hydroxyapatite and Collagen Composition Crushed collagen A obtained in Example 1 was added and gently immersed in demineralized water to wet all of the collagen. The 125 to 180 μm nanocrystalline bone hydroxyapatite particles obtained in Example 1 were added to the beaker, and the beaker was closed with a screw cap. An aqueous suspension of collagen and nanocrystalline hydroxyapatite was homogeneously mixed on a Vortex mixer for 1 min and using a medical chisel for 1 min.

При этом величина рН составляла 6,1.The pH value was 6.1.

Таким образом получали высушенную композицию импланта 5, содержащую частицы нанокристаллического гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм, и коллаген А, при массовом соотношении нанокристаллический гидроксиапатит/коллаген 4,0, при рН 6,1 после дегидратации деминерализованной водой, которую проводили, как описано в примере 9.Thus, a dried implant composition 5 was obtained containing nanocrystalline hydroxyapatite particles ranging in size from 125 to 180 μm and collagen A, at a mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite/collagen 4.0, at pH 6.1 after dehydration with demineralized water, which was carried out as described in example 9.

Пример 8Example 8

Получение высушенной композиции импланта 6. содержащей частицы нанокристаллического гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм и коллаген А при массовом соотношении нанокристаллический гидроксиапатит/коллаген 2.0Obtaining a dried composition of the implant 6. containing particles of nanocrystalline hydroxyapatite with a size of 125 to 180 μm and collagen A at a mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite/collagen 2.0

Получение композиции нанокристаллического гидроксиапатита и коллагена Измельченный коллаген А, добавляли и его осторожно погружали в деминерализованную воду, чтобы смочить весь коллаген. В химический стакан добавляли частицы тонкодисперсного нанокристаллического костного гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм, полученные в примере 1, и стакан закрывали завинчивающейся крышкой. Водную суспензию коллагена и нанокристаллического гидроксиапатитагомогенно перемешивали на мешалке Vortex в течение 1 мин и с использованием медицинского долота в течение 1 мин.Preparation of Nanocrystalline Hydroxyapatite and Collagen Composition Crushed collagen A was added and gently immersed in demineralized water to wet all of the collagen. Particles of finely dispersed nanocrystalline bone hydroxyapatite with a size of 125 to 180 μm obtained in Example 1 were added to the beaker, and the beaker was closed with a screw cap. An aqueous suspension of collagen and nanocrystalline hydroxyapatite was homogeneously mixed on a Vortex mixer for 1 min and using a medical chisel for 1 min.

При этом величина рН составляла 5,8.The pH value was 5.8.

Пример 9Example 9

Получение готового к применению шприца, содержащего инъектируемый водный состав импланта при регидратации высушенной композиции импланта в шприцеObtaining a ready-to-use syringe containing an injectable aqueous implant composition by rehydrating the dried implant composition in a syringe

1) Получение готового к применению шприца, содержащего инъектируемый водный состав импланта, полученный при регидратации и гомогенном смешивании высушенной композиции импланта1) Obtaining a ready-to-use syringe containing an injectable aqueous implant composition obtained by rehydration and homogeneous mixing of the dried implant composition

а) Использование адаптера с люэровской насадкой с трехходовым запорным краном и шприца объемом 1 млa) Using a luer lock adapter with a 3-way stopcock and a 1 ml syringe

2) Высушенные стерильные композиции нанокристаллического гидроксиапатита и коллагена в шприце-продукте объемом 1 мл подвергали регидратации с использованием адаптера с люэровской насадкой с трехходовым запорным краном (люэровская насадка), адаптера (BD Connecta, трехходового крана, номер по каталогу 394600), шприцов Vaclok (Qosina, шприц Vaclok, номер по каталогу С1097) и обычного одноразового дополнительного шприца объемом 1 мл (с люэровской насадкой).2) Dried sterile formulations of nanocrystalline hydroxyapatite and collagen in a 1 ml syringe product were rehydrated using a Luer lock adapter with a 3-way stopcock (Luer lock), adapter (BD Connecta, 3-way stopcock, part number 394600), Vaclok syringes ( Qosina, Vaclok Syringe, part number C1097) and a conventional disposable secondary 1 ml syringe (with a luer lock).

В качестве жидкости для регидратации использовали деминерализованную воду, изотонический солевой раствор, буферный раствор PBS, рН 7,4, содержащий 150 мМ фосфатного буферного вещества (полученный при растворении NaH₂PO₄ в деминерализованной воде и при доведении рН гидроксидом натрия) или кровь.The rehydration fluid used was demineralized water, isotonic saline, PBS buffer pH 7.4 containing 150 mM phosphate buffer (prepared by dissolving NaH ₂ PO ₄ in demineralized water and adjusting the pH with sodium hydroxide) or blood.

Масса высушенного биоматериала (высушенная композиция импланта, полученная в одном из примеров 3-8) в шприце известна или ее можно измерить. Дополнительный шприц заполняли жидкостью для регидратации, например, чтобы получить инъектируемую пасту, содержащую 38 мас. % высушенного биоматериала.The mass of dried biomaterial (dried implant composition obtained in one of examples 3-8) in the syringe is known or can be measured. An additional syringe was filled with liquid for rehydration, for example, to obtain an injectable paste containing 38 wt. % dried biomaterial.

Затем шприц-продукт присоединяли к 3-ходовому запорному крану и канал запорного крана закрывали запорным компачком, поворачивая его на 180°. В третьем положении 3-ходового крана (поворот на 90° от шприца-продукта) шприц Vaclok объемом 60 мл присоединяли к системе. Из шприца-продукта удаляли воздух, продвигая поршень шприца Vaclok и закрывая объем на 50 мл. Затем 3-ходовой кран поворачивали на 180°, чтобы сохранить вакуум в шприце-продукте, при этом шприц Vaclok заменяли на дополнительный шприц, заполненный жидкостью. Затем 3-ходовой кран поворачивали на 180°. За счет вакуума жидкость автоматически перетекает в шприц-продукт и смачивает продукт. Чтобы полностью переместить жидкость в шприц-продукт, поршень шприца-продукта отводили назад. Материал остается в шприце в течение 30 с для обеспечения регидратации перед его перемещением из шприца-продукта в дополнительный шприц и обратно, при этом эту процедуру повторяют 40 раз для получения гомогенной смеси материала. После завершения процедуры смешивания 3-ходовой кран заменяют на аппликатор, который представляет собой сужающуюся систему и канюлю с тупым концом 18 калибра (внутренний диаметр 0,838 мм) длиной 25,4 мм. рН в реконструированном инъекцируемом водном составе импланта, полученного после редигратации и гомогенного смешивания каждой из высушенных композиций импланта 1-6 с деминерализованной водой составляет приблизительно близкое к значению рН, измеренному перед лиофилизацией, а именно приблизительно 4,2, 6,2, 4,5, 6,0, 6,1 и 5,8, соответственно.The syringe product was then connected to a 3-way stopcock and the stopcock channel was closed with the stopcock by turning it through 180°. In the third position of the 3-way stopcock (rotated 90° away from the product syringe), a 60 ml Vaclok syringe was attached to the system. Air was removed from the product syringe by advancing the plunger of the Vaclok syringe and closing the volume at 50 ml. The 3-way stopcock was then turned 180° to maintain a vacuum in the product syringe while the Vaclok syringe was replaced with an additional fluid-filled syringe. The 3-way valve was then turned 180°. Due to the vacuum, the liquid automatically flows into the syringe product and wets the product. To completely move the liquid into the syringe product, the plunger of the syringe product was retracted. The material remains in the syringe for 30 seconds to ensure rehydration before being transferred from the product syringe to the additional syringe and back, while this procedure is repeated 40 times to obtain a homogeneous mixture of material. After the mixing procedure is completed, the 3-way stopcock is replaced with an applicator, which is a tapering system and a cannula with a blunt end 18 gauge (internal diameter 0.838 mm) 25.4 mm long. The pH in the reconstituted injectable aqueous implant composition obtained after re-grading and homogeneous mixing of each of the dried implant compositions 1-6 with demineralized water is approximately close to the pH value measured before lyophilization, namely approximately 4.2, 6.2, 4.5 , 6.0, 6.1 and 5.8, respectively.

б) Использование шприца Medmix с системой смешивания объемом 3 мл В другом варианте частицы высушенного материала подвергали регидратации минерализованной водой, изотоническим солевым раствором, буферным раствором PBS, рН 7,4, содержащим 150 мМ фосфатного буферного вещества, или кровью, в системе смешивания шприца Medmix (MEDMIX, SP 003-00М-02/В номер по каталогу 507211), включающей колпачок шприца с открытым люэровским отверстием и открытым отверстием колпачка (MEDMIX, CP 000-76M/D, номер по каталогу 506964), и указанная система представлена на фиг.1, где (1) означает шприц, содержащий высушенной биоматериал, (2) означает колпачок шприца с открытым люэровским отверстием, которое совместимо с любой люэровской канюлей, (3) означает открытое отверстие колпачка, закрывающее шприц в ходе процесса смешивания, (4) смешивающее устройство, которым является гибкий смеситель после удаления поршня, (5) поршень, который можно извлечь для смешивания материала в шприце и можно снова вставить для вытеснения материала.b) Use of a Medmix Syringe with a 3 ml Mixing System In another embodiment, dried material particles were rehydrated with saline water, isotonic saline, PBS buffer, pH 7.4 containing 150 mM phosphate buffer, or blood, in a Medmix syringe mixing system. (MEDMIX, SP 003-00M-02/B cat. no. 507211), which includes a syringe cap with an open luer lock and an open cap opening (MEDMIX, CP 000-76M/D, cat. no. 506964), and this system is shown in Fig. .1 where (1) means the syringe containing the dried biomaterial, (2) means the syringe cap with an open luer lock that is compatible with any Luer lock, (3) means the open cap opening that covers the syringe during the mixing process, (4) a mixing device, which is a flexible mixer after removing the piston, (5) a piston that can be removed to mix the material in the syringe and can be reinserted to expel the material.

Затем поводили процедуру смешивания Medmix, как показано на фиг.2. Для получения оптимального результата после стадии 4 поршень передвигали 3 раза, чтобы протолкнуть жидкость в материал для его смачивания, и обеспечить стадию смешивания (стадия 6) в течение 60 с.На стадии 8 весь воздух удаляли.The Medmix mixing procedure was then carried out as shown in FIG. 2. For optimal results, after step 4, the piston was moved 3 times to force the liquid into the material to wet it and allow the mixing step (step 6) to last 60 seconds. In step 8, all air was removed.

3) Испытание на экструдируемость3) Extrudability test

Экструдируемость реконструированного инъектируемого водного состава импланта исследовали на установке для испытаний на растяжение и давление (Zwick & Roell, BT1-FR2.5TS.D14). Готовый к применению шприц, изготовленный, как описано выше, устанавливали вертикально в держатель шприца, и поршень передвигали вниз из машины, в то время как силу выдавливания продукта из шприца через аппликатор, содержащий сужающуюся систему и канюлю с тупым концом 18 калибра (внутренний диаметр 0,838 мм) 25,4 мм (Nordson EFD, Precision Tip 18GA 1”, номер по каталогу 7018110), измеряли по следующей программе:The extrudability of the reconstituted injectable aqueous implant formulation was tested on a tensile and pressure tester (Zwick & Roell, BT1-FR2.5TS.D14). A ready-to-use syringe, made as described above, was placed vertically in the syringe holder and the plunger was moved down out of the machine while the force of expelling the product from the syringe through the applicator containing the tapering system and an 18 gauge blunt cannula (0.838 ID) mm) 25.4 mm (Nordson EFD, Precision Tip 18GA 1”, part number 7018110), measured using the following program:

- сила до сопротивления: 0,1 Η- force to resistance: 0.1 Η

- скорость до сопротивления: 100 мм/мин- speed to resistance: 100 mm/min

- скорость испытания: 1 мм/с, контроль положения- test speed: 1 mm/s, position control

- завершение испытаний: предел силы. 150 Η- Completion of tests: force limit. 150 H

- датчик силы: 200 Н.- force sensor: 200 N.

Для всех исследованных инъектируемых составов импланта, полученных при регидратации и гомогенном смешивании с деминерализованной водой, изотоническим солевым раствором, буферным раствором PBS, а именно для инъектируемых составов, полученных из высушенных композиций имплантов 1-6, измеренная сила не превышала 40 Н. Для всех исследованных инъектируемых составов, полученных при регидратации и гомогенном смешивании с кровью, а именно для инъектируемых составов импланта, полученных из высушенных композиций имплантов 1-6, измеренная сила не превышала 45 Н.For all studied injectable implant compositions obtained by rehydration and homogeneous mixing with demineralized water, isotonic saline, PBS buffer solution, namely for injectable compositions obtained from dried implant compositions 1-6, the measured force did not exceed 40 N. For all studied for injectable formulations obtained by rehydration and homogeneous mixing with blood, namely for injectable implant formulations obtained from dried implant compositions 1-6, the measured force did not exceed 45 N.

Для инъектируемых составов импланта, полученных при регидратации и гомогенном смешивании с деминерализованной водой, изотоническим солевым раствором, буферным раствором PBS, полученных из высушенных композиций имплантов 1, 2, 3, 5 и 6, измеренная сила не превышала 20 Н.For injectable implant compositions prepared by rehydration and homogeneous mixing with demineralized water, isotonic saline, buffered PBS prepared from dried implant compositions 1, 2, 3, 5 and 6, the measured force did not exceed 20 N.

Для инъектируемых составов импланта, полученных при регидратации и гомогенном смешивании с кровью, полученных при регидратации и гомогенном смешивании с кровью, полученных из высушенной композиции импланта 1 (содержащей частицы нанокристаллического гидроксиапатита размером от 100 до 150 мкм или от 125 до 180 мкм, и коллаген В при массовом соотношении нанокристаллический гидроксиапатит/коллаген 4,0) и высушенной композиции импланта 2 (содержащей частицы нанокристаллического гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм, и коллаген А при массовом соотношении нанокристаллический гидроксиапатит/коллаген 4,0), измеренная сила не превышала 25 Н.For injectable implant formulations obtained by rehydration and homogeneous mixing with blood, obtained by rehydration and homogeneous mixing with blood, obtained from the dried implant composition 1 (containing particles of nanocrystalline hydroxyapatite with a size of 100 to 150 μm or 125 to 180 μm, and collagen B at a mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite/collagen 4.0) and dried implant composition 2 (containing nanocrystalline hydroxyapatite particles ranging in size from 125 to 180 μm, and collagen A at a mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite/collagen 4.0), the measured force did not exceed 25 N.

На фиг. 3А и 3Б показаны кривые экструзии инъектируемых составов импланта, полученных при регидратации и гомогенном смешивании высушенных композиций имплантов 2 и 4 с изотоническим солевым раствором или свежей кровью человека, соответственно.In FIG. 3A and 3B show extrusion curves of injectable implant formulations obtained by rehydration and homogeneous mixing of dried implant formulations 2 and 4 with isotonic saline or fresh human blood, respectively.

- на фиг. 3А, (1) и (2), представлены кривые экструзии высушенной композиции импланта 2 (содержащей частицы нанокристаллического гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм, и коллаген В при массовом соотношении нанокристаллический гидроксиапатит/коллаген 4,0), который подвергали регидратации изотоническим солевым раствором и свежей кровью человека, соответственно.- in Fig. 3A, (1) and (2) are extrusion curves of the dried implant composition 2 (comprising particles of nanocrystalline hydroxyapatite ranging in size from 125 to 180 µm and collagen B at a mass ratio of nanocrystalline hydroxyapatite/collagen of 4.0), which was rehydrated with isotonic saline. and fresh human blood, respectively.

- на фиг. 3Б, (3) и (4), представлены кривые экструзии высушенной композиции импланта 4 (содержащей частицы нанокристаллического гидроксиапатита размером от 125 до 180 мкм, и смесь 2 частей коллагена А и 1 части коллагена В при массовом соотношении нанокристаллический гидроксиапатит/коллаген 2,67), который подвергали регидратации изотоническим солевым раствором и свежей кровью человека, соответственно.- in Fig. 3B, (3) and (4), shows the extrusion curves of the dried implant composition 4 (containing nanocrystalline hydroxyapatite particles ranging in size from 125 to 180 μm, and a mixture of 2 parts of collagen A and 1 part of collagen B at a nanocrystalline hydroxyapatite/collagen mass ratio of 2.67 ), which was rehydrated with isotonic saline and fresh human blood, respectively.

Пример 10Example 10

Биосовместимость: исследование роста in vitro двух клеточных линий остеобластов в инъектируемых водных составах имплантов по изобретению Клетки:Biocompatibility: in vitro growth study of two osteoblast cell lines in injectable aqueous formulations of the implants of the invention Cells:

МС3Т3 CytoLight Red, линия клеток-предшественников остеобластов, происходящие из свода черепа мыши (АТСС CRL-2593), которые трансдуцировали для экспрессии красного флуоресцентного белка в цитоплазме с использованием лентивируса Cytolight Red Lentivirus (Essen Bioscience), илиMC3T3 CytoLight Red, a mouse calvarium-derived osteoblast progenitor cell line (ATCC CRL-2593) transduced to express red fluorescent protein in the cytoplasm using the Cytolight Red Lentivirus (Essen Bioscience), or

- MG63 (клеточная линия из остеосаркомы человека)- MG63 (cell line from human osteosarcoma)

исследовали на их способность колонизировать инъектируемый водный состав импланта по изобретению, следующим образом.investigated for their ability to colonize the injectable aqueous composition of the implant according to the invention, as follows.

Эти клетки культивировали в рекомендованных производителем условиях, а именно клетки МСЗТЗ Cytolight Red культивировали в среде аМЕМ (GIBCO) дополненной 10% эмбриональной сывороткой теленка (FBS, Lubio), 1% пенициллином-стрептомицином (GIBCO) и 0,5 мкг/мл пуромицином (Sigma), а клетки MG63 культивировали в среде DMEM (GIBCO) дополненной 10% FBS (Lubio), 1% пенициллином-стрептомицином (GIBCO). Слой таких клеток добавляли в лунки многолуночного планшета и приблизительно 1 мл биоматериала добавляли на слой клеток в каждой лунке с использованием шприцов Medmix объемом 3 мл, содержащих инъектируемые составы имплантов 1-4, полученные при регидратации и гомогенном смешивании высушенных композиций имплантов 1-4 (полученных в примерах 3-6) с кровью человека или изотоническим солевым раствором. Клетки культивировали в течение 8 суток.These cells were cultured under the manufacturer's recommended conditions, i.e., MC3T3 Cytolight Red cells were cultured in aMEM (GIBCO) medium supplemented with 10% fetal calf serum (FBS, Lubio), 1% penicillin-streptomycin (GIBCO), and 0.5 µg/mL puromycin ( Sigma), and MG63 cells were cultured in DMEM (GIBCO) supplemented with 10% FBS (Lubio), 1% penicillin-streptomycin (GIBCO). A layer of such cells was added to the wells of a multiwell plate and approximately 1 ml of biomaterial was added per cell layer in each well using 3 ml Medmix syringes containing injectable Implant Formulations 1-4 obtained by rehydration and homogeneous mixing of the dried Implant Formulations 1-4 (prepared in examples 3-6) with human blood or isotonic saline. Cells were cultured for 8 days.

В результате этих экспериментов для каждого инъектируемого состава импланта 1-4 наблюдалась колонизация биоматериала каждой линией клеток МС3Т3 CytoLight Red и М63.As a result of these experiments, for each injectable composition of the implant 1-4, colonization of the biomaterial was observed with each cell line MC3T3 CytoLight Red and M63.

На фиг. 4 представлено микроскопическое изображение, полученное с использованием конфокального вращающегося дискового микроскопа CV1000 (Yokogawa) с возбуждением лазерным излучением при 561 нм, инъектируемого водного состава импланта 4, полученного при регидратации и гомогенном смешивании высушенной композиции импланта 4 (полученной в примере 6) с кровью человека: четко видны растущие клетки МС3Т3 CytoLight Red.In FIG. 4 shows a microscopic image obtained using a confocal rotating disk microscope CV1000 (Yokogawa) with laser excitation at 561 nm, of an injectable aqueous composition of implant 4 obtained by rehydration and homogeneous mixing of the dried composition of implant 4 (obtained in example 6) with human blood: Growing MC3T3 CytoLight Red cells are clearly visible.

Эти эксперименты свидетельствуют о том, что остеобласты могут расти in vitro в инъектируемом водном составе импланта по изобретению. Эти результаты свидетельствует о высокой биосовместимости указанного инъектируемого водного состава импланта, что обеспечивает при имплантации матрицу, которая близка природной окружающей среде in vivo, где происходит такая регенерация.These experiments indicate that osteoblasts can grow in vitro in the injectable aqueous formulation of the implant of the invention. These results are indicative of the high biocompatibility of said injectable aqueous implant composition, which provides, upon implantation, a matrix that is close to the natural in vivo environment where such regeneration takes place.

Claims

1. The dried composition of the implant, consisting of a mixture of particles of nanocrystalline hydroxyapatite obtained from natural bone, characterized by a size of 50 to 200 μm, and fragments of natural cross-linked fibrillar material of collagen, which passes through a sieve with a mesh size of 0.5 mm, and the mass ratio of hydroxyapatite and collagen is from 1.8 to 4.5.

2. An injectable aqueous implant composition for use in the regeneration of oral tissues, where the injectable aqueous implant composition includes 25-45 wt.% of the dried implant composition, consisting of a mixture of particles of nanocrystalline hydroxyapatite obtained from natural bone, characterized by a size of 50 to 200 microns, and fragments of natural crosslinked fibrillar material of collagen, which passes through a sieve with a mesh size of 0.5 mm, and the mass ratio of hydroxyapatite and collagen is from 1.8 to 4.5, homogenized with a pharmaceutically acceptable aqueous carrier, where the injectable aqueous composition of the implant has the properties such that it is capable of being extruded through a tapering system and an 18 gauge cannula, internal diameter 0.838 mm, length 25.4 mm, with a force not exceeding 60 N.

3. An injectable aqueous implant composition according to claim 2, wherein the composition comprises 30-40 wt % dried implant and has properties such that it is extrudable through a tapering system and an 18 gauge cannula, inner diameter 0.838 mm, length 25.4 mm, with a force not exceeding 40 N.

4. The injectable aqueous implant composition of claim 2, wherein the dried implant composition has a hydroxyapatite to collagen weight ratio of 2.5 to 4.2.

5. The injectable aqueous implant composition according to claim 2, which is used in a method of treating a patient with an injectable aqueous implant composition, and the patient needs regeneration of oral tissues, including implanting the injectable aqueous implant composition according to claim 2 into the oral cavity of the patient by extrusion of the injectable aqueous composition implant according to claim 2 through a tapering system and a 18 gauge cannula, an inner diameter of 0.838 mm, located in the implantation site.

6. The injectable aqueous implant composition of claim 5, wherein the method further comprises prior to said implantation:

a) providing a dried composition of the implant, consisting of a mixture of particles of nanocrystalline hydroxyapatite obtained from natural bone, characterized by a size of from 50 to 200 microns, and fragments of natural cross-linked collagen fibrillar material, which passes through a sieve with a mesh size of 0.5 mm, and the mass ratio hydroxyapatite and collagen is from 1.8 to 4.5; And

b) rehydrating 25-45% by weight of the dried implant composition with a pharmaceutically acceptable aqueous carrier and mixing to form an injectable, rehydrated aqueous implant composition.

7. The injectable aqueous implant composition of claim 6 wherein the dried implant composition has a hydroxyapatite to collagen weight ratio of 2.5 to 4.2.

8. An injectable aqueous implant composition according to claim 6, wherein in the dried implant composition, hydroxyapatite particles are characterized by a size of 100 to 180 microns.

9. The injectable aqueous implant composition of claim 6, wherein the dried implant composition has been sterilized by gamma or x-ray radiation.

10. Ready-to-use syringe containing the injectable aqueous composition of the implant according to claim 2.

11. A kit for obtaining an injectable aqueous composition of an implant intended for use in tissue regeneration in the oral cavity according to claim 2, which includes:

- a syringe equipped with a mixing device and containing:

a dried implant composition consisting of a mixture of particles of nanocrystalline hydroxyapatite obtained from natural bone, characterized by a size of 50 to 200 μm, and fragments of natural cross-linked fibrillar material of collagen, which passes through a sieve with a mesh size of 0.5 mm, and the mass ratio of hydroxyapatite and collagen ranges from 1.8 to 4.5; tapering system and 18 gauge cannula, inner diameter 0.838 mm; And

- a container filled with an appropriate amount of sterile water or sterile isotonic saline.

12. The kit of claim 11 wherein the container containing sterile water or sterile isotonic saline is a syringe with a cannula.

13. A method for producing an injectable aqueous implant composition according to claim 2, including: providing a dried implant composition consisting of a mixture of particles of nanocrystalline hydroxyapatite obtained from natural bone, characterized by a size of 50 to 200 microns, and fragments of natural cross-linked collagen fibrillar material, which passes through a sieve with a mesh size of 0.5 mm, and the mass ratio of hydroxyapatite and collagen is from 1.8 to 4.5; rehydration and homogeneous mixing of 25-45% by weight of the dried implant composition with sterile water or sterile isotonic saline.

14. The method according to p. 13, including rehydration and homogeneous mixing of 25-45 wt.% of the dried composition of the implant in a syringe equipped with a mixing device.

15. The method of claim 13 wherein providing the dried implant composition comprises the steps of:

(a) obtaining particles of nanocrystalline hydroxyapatite, characterized by a size of from 50 to 200 microns,

(b) obtaining pulverized natural cross-linked fibrillar collagen material by a method including alkali treatment, acid treatment and treatment with organic solvents, and pulverizing the natural cross-linked fibrillar collagen material into fragments passing through a 0.5 mm sieve to obtain pulverized natural cross-linked material fibrillar collagen,

(c) adding a mixture of pulverized natural cross-linked fibrillar collagen obtained in step (b) to an aqueous solution, vigorously mixing the aqueous solution so as to obtain a suspension of collagen, adding particles of nanocrystalline hydroxyapatite with a size of 50 to 200 μm obtained in step (a) into a collagen suspension, wherein the mass ratio of hydroxyapatite and collagen is from 1.8 to 4.5, and intensive mixing is carried out at a pH in the range from 4.2 to 7.5 to obtain a mixed composition,

(d) drying the mixed composition containing nanocrystalline hydroxyapatite particles and collagen obtained in step (c) to obtain a dried implant composition, and

(e) gamma or x-ray sterilization of the dried implant composition obtained in step (d).