RU2793469C2

RU2793469C2 - Simple method of sialillactose purification

Info

Publication number: RU2793469C2
Application number: RU2020140932A
Authority: RU
Inventors: Штефан ЙЕННЕВАЙН; Маркус ХЕЛЬФРИХ; Бенедикт ЭНГЕЛЬС
Original assignee: Хр. Ханзен ХМО ГмбХ
Priority date: 2018-06-01
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2023-04-04

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention provides a process for purifying sialyllactose from other carbohydrates, characterized in that the process comprises the steps of subjecting an aqueous solution containing sialyllactose to two membrane filtration steps using different membranes, a membrane having a molecular weight cut-off threshold from about 300 Da to about 500 Da and a membrane having a molecular weight cut-off threshold of about 600 Da to about 800 Da.

EFFECT: process for purifying sialyllactose.

8 cl, 10 dwg

Description

Область изобретенияField of invention

Настоящее изобретение относится к способу очистки сиалиллактозы. Более конкретно, настоящее изобретение относится к простому и экономичному способу отделения сиалиллактозы от других углеводов, таких как лактоза и моносахариды, а также больших по размеру олигосахаридов, таких как дисиалиллактоза, которые могут присутствовать в качестве загрязняющих углеводов в ферментационном бульоне, если указанную сиалиллактозу получают посредством микробной ферментации.The present invention relates to a method for purifying sialyllactose. More specifically, the present invention relates to a simple and economical process for separating sialyllactose from other carbohydrates such as lactose and monosaccharides, as well as large oligosaccharides, such as disialyl lactose, which may be present as contaminant carbohydrates in the fermentation broth, if said sialyllactose is produced by microbial fermentation.

Предшествующий уровень техникиPrior Art

Человеческое грудное молоко считается наилучшим питанием для развития младенца. Оно состоит из жиров, белков, витаминов, минеральных веществ, микроэлементов и сложных олигосахаридов. Помимо лактозы человеческое грудное молоко, а также молоко других млекопитающих, содержит разные структурно различные олигосахариды, которые также известны, как олигосахариды грудного молока (ОГМ) (Usashima Т. et al., (2011) Milk Oligosaccharides, Nova Biomedical Books, New York ISBN 978-1-61122-831-1).Human breast milk is considered the best nutrition for infant development. It consists of fats, proteins, vitamins, minerals, trace elements and complex oligosaccharides. In addition to lactose, human breast milk, as well as the milk of other mammals, contains various structurally distinct oligosaccharides, which are also known as human milk oligosaccharides (HMOs) (Usashima T. et al., (2011) Milk Oligosaccharides, Nova Biomedical Books, New York ISBN 978-1-61122-831-1).

Среди ОГМ сиалированные ОГМ (СОГМ), как наблюдалось, поддерживают устойчивость к энтеропатогенным бактериям и вирусам. Что интересно, недавние исследования кроме того продемонстрировали защитное действие длинноцепочечных СОГМ в отношении некротического энтероколита, который является одним из наиболее распространенных и смертельных заболеваний у недоношенных новорожденных. Кроме того, полагают, что СОГМ поддерживают развитие головного мозга младенца и его когнитивные способности. Кроме того, показано, что сиалированные олигосахариды нейтрализуют энтеротоксины разных патогенных микробов, включая Escherichia coli, Vibrio choierae и Salmonella. Кроме того, обнаружено, что сиалированные олигосахариды препятствуют колонизации кишечника Helicobacter pylori и, вследствие этого, предотвращают или ингибируют язвы желудка и двенадцатиперстной кишки.Among HMOs, sialylated HMOs (SGMs) have been observed to maintain resistance to enteropathogenic bacteria and viruses. Interestingly, recent studies have also demonstrated a protective effect of long-chain CBM against necrotizing enterocolitis, which is one of the most common and fatal diseases in preterm infants. In addition, BGM is believed to support infant brain development and cognitive abilities. In addition, sialylated oligosaccharides have been shown to neutralize enterotoxins from various pathogenic microbes, including Escherichia coli, Vibrio choierae, and Salmonella. In addition, sialylated oligosaccharides have been found to interfere with colonization of the intestine by Helicobacter pylori and thereby prevent or inhibit gastric and duodenal ulcers.

Среди сиалированных олигосахаридов 3'-сиалиллактоза и 6'-сиалиллактоза являются наиболее распространенными членами в человеческом грудном молоке.Among the sialylated oligosaccharides, 3'-sialyllactose and 6'-sialyllactose are the most abundant members in human breast milk.

Поскольку сиалированные олигосахариды имеют сложную структуру, их химический или (химико-)ферментативный синтез является проблематичным и ассоциирован с серьезными трудностями, например, контролем стереохимии, образованием специфичных связей, доступностью сырья и т.д. И, как следствие, имеющиеся в продаже сиалированные олигосахариды являются очень дорогими за счет их низкого количества в природных источниках.Since sialylated oligosaccharides have a complex structure, their chemical or (chemo-)enzymatic synthesis is problematic and associated with serious difficulties, for example, control of stereochemistry, formation of specific bonds, availability of raw materials, etc. And, as a consequence, commercially available sialylated oligosaccharides are very expensive due to their low amount in natural sources.

Таким образом, были сделаны попытки в конструировании обмена веществ микроорганизмов для продукции сиалированных олигосахаридов, поскольку данный подход является наиболее перспективным путем для получения ОГМ в промышленном масштабе. Для получения СОГМ посредством микробной ферментации микроорганизм обычно культивируют в присутствии экзогенной сиаловой кислоты.Thus, attempts have been made in designing the metabolism of microorganisms for the production of sialylated oligosaccharides, since this approach is the most promising way to obtain HMO on an industrial scale. To obtain SOGM through microbial fermentation, the microorganism is usually cultivated in the presence of exogenous sialic acid.

В международных публикациях WO 2007/101862 А1 и WO 2014/153252 А1 раскрыты способы и композиции для конструирования бактерий, продуцирующих сиалированные олигосахариды. Однако, ферментативная продукция 6'-сиалиллактозы, как известно, ассоциирована с биосинтезом других углеводов, таких как дисиалиллактоза (Drouillard, S. et al. (2010) Efficient synthesis of 6'-sialyllactose, 6,6'-disialyllactose, and 6'-KDO-lactose by metabolically engineered E.coli expressing a multifunctional sialyltransferase from the Photobacterium sp.JT-ISH-224. Carbohydrate Research 345: 1394-1399), которая образуется из 6'-сиалиллактозы за счет активности сиалилтрансферазы, экспрессируемой в генетически сконструированных бактериях. Кроме того, автоклавирование (тепловая обработка) углеводов (например, лактозы) приводит к образованию нежелательных побочных продуктов, таких как продукты альдольной реакции или реакции Майяра, или реакциям перегруппировки (например, превращение лактозы в лактулозу). Наличие таких загрязняющих веществ в конечном продукте, в частности в больших количествах, является нежелательным или даже неприемлемым.International publications WO 2007/101862 A1 and WO 2014/153252 A1 disclose methods and compositions for constructing bacteria that produce sialylated oligosaccharides. However, the enzymatic production of 6'-sialyllactose is known to be associated with the biosynthesis of other carbohydrates such as disialyl lactose (Drouillard, S. et al. (2010) Efficient synthesis of 6'-sialyllactose, 6,6'-disialyllactose, and 6' -KDO-lactose by metabolically engineered E. coli expressing a multifunctional sialyltransferase from the Photobacterium sp. JT-ISH-224. Carbohydrate Research 345: 1394-1399), which is formed from 6'-sialyl lactose due to the activity of sialyl transferase expressed in genetically engineered bacteria. In addition, autoclaving (heat treatment) of carbohydrates (eg lactose) leads to the formation of undesirable by-products such as aldol or Maillard reaction products or rearrangement reactions (eg conversion of lactose to lactulose). The presence of such contaminants in the final product, in particular in large quantities, is undesirable or even unacceptable.

Кроме того, применение генетически сконструированных бактерий для продукции олигосахаридов приводит к загрязнению ферментационного бульона рекомбинантным материалом, таким как молекулы нуклеиновых кислот или полипептиды, происходящие из данного микроорганизма. Однако, загрязнение продукта для потребления человеком рекомбинантной ДНК или белками на сегодняшний день является неприемлемым как со стороны регулирующих органов, так и потребителей. Таким образом, любые нуклеиновые кислоты и белки, происходящие из рекомбинантного микроорганизма, должны быть удалены из желательных олигосахаридов грудного молока. Пределы обнаружения для рекомбинантных молекул ДНК на сегодняшний день являются очень низкими, что требует схем тщательной очистки. В случае выявления ДНК на основе кПЦР (количественная полимеразная цепная реакция), в образце может быть выявлено даже вплоть до одиночной молекулы ДНК.In addition, the use of genetically engineered bacteria to produce oligosaccharides results in contamination of the fermentation broth with recombinant material such as nucleic acid molecules or polypeptides derived from the microorganism. However, contamination of a product for human consumption with recombinant DNA or proteins is currently unacceptable by both regulators and consumers. Thus, any nucleic acids and proteins derived from the recombinant microorganism must be removed from the desired human milk oligosaccharides. Limits of detection for recombinant DNA molecules are currently very low, requiring extensive purification schemes. In the case of DNA detection based on qPCR (quantitative polymerase chain reaction), even down to a single DNA molecule can be detected in the sample.

Способы очистки отдельных олигосахаридов от ферментационного бульона «современного уровня техники» являются технически сложными и часто неэкономичными, в частности, когда указанный олигосахарид предназначен для применений в пище. Для очистки дисахарида лактоза или сахароза от сложных смесей, таких как молочная сыворотка или патока, были разработаны промышленные способы, которые включают множественные стадии кристаллизации. Однако, указанные способы дорабатываются и приводят лишь к низким выходам. Также, данные способы не применимы для предоставления олигосахарида, полученного посредством микробной ферментации, подходящего для применения в пищевой промышленности, по существу ферментационный бульон - в отличие от молочной сыворотки и патоки - еще не является пищевым продуктом.Methods for purifying individual oligosaccharides from "state of the art" fermentation broth are technically complex and often uneconomical, in particular when said oligosaccharide is intended for food applications. To purify the disaccharide lactose or sucrose from complex mixtures such as whey or molasses, industrial processes have been developed that involve multiple crystallization steps. However, these methods are being developed and only lead to low yields. Also, these methods are not applicable to provide an oligosaccharide obtained by microbial fermentation, suitable for use in the food industry, as such fermentation broth - unlike whey and molasses - is not yet a food product.

Однако, способы фильтрации, подобно ультрафильтрации, микрофильтрации и нанофильтрации, технически легко осуществить, если все параметры способа известны и оптимизированы. Диафильтрация является еще одним подходящим способом, который включает добавление к раствору свежей воды для удаления мембранопроницаемых компонентов. Ультрафильтрацию и микрофильтрацию обычно используют для отделения от ферментационного бульона или водного раствора гораздо более крупных молекул, подобно белкам или клеткам. Кроме того, удаление воды, минеральных веществ и очень маленьких молекул посредством нанофильтрации хорошо известно и используется в молочной промышленности для концентрирования и деминерализации молочной сыворотки. В большинстве случаев материалы мембраны для нано- и ультрафильтрации основаны на материалах, подобно пиперазину, полиамиду, полиэфирсульфону, полиэтиленгликолю и керамике. Мембраны могут быть собраны, например, в виде половолоконных модулей, спиральнонавитых модулей и мембран с плоским слоем, и данная сборка может приводить к разным выполнениям разделения. В общем, нанофильтрационные мембраны имеют порог отсечения по молекулярной массе в интервале 150-300 Дальтон. Мембраны с порогом отсечения по молекулярной массе в интервале 400-600 Дальтон являются очень редкими, особенно для крупномасштабного промышленного производства. Это делает разделение олигосахаридов еще сложнее, поскольку необходимы другие методики разделения, такие как хроматография, или партиями или в непрерывном режиме.However, filtration processes like ultrafiltration, microfiltration and nanofiltration are technically easy to implement if all process parameters are known and optimized. Diafiltration is another suitable method which involves adding fresh water to the solution to remove membrane-permeable components. Ultrafiltration and microfiltration are typically used to separate much larger molecules, like proteins or cells, from a fermentation broth or aqueous solution. In addition, the removal of water, minerals and very small molecules by nanofiltration is well known and is used in the dairy industry to concentrate and demineralize whey. In most cases, nano- and ultrafiltration membrane materials are based on materials like piperazine, polyamide, polyethersulfone, polyethylene glycol, and ceramics. The membranes may be assembled, for example, as hollow fiber modules, spiral wound modules, and flat bed membranes, and this assembly may result in different separation performances. In general, nanofiltration membranes have a molecular weight cut-off in the range of 150-300 Daltons. Membranes with a molecular weight cut-off in the range of 400-600 Daltons are very rare, especially for large scale industrial production. This makes the separation of oligosaccharides even more difficult since other separation techniques are needed, such as chromatography, either in batches or in continuous mode.

Тогда как эксклюзионная хроматография представляет собой удобный лабораторный метод, только хроматография с псевдодвижущимся слоем представляет подходящий способ очистки 6-SL (от англ. sialyllactose) в масштабах, сопоставимых с производством продуктов питания. Однако, все другие опубликованные способы страдают недостатком, заключающимся в том, что загрязняющие углеводы не могут быть эффективно удалены из желательного продукта.While size exclusion chromatography is a convenient laboratory method, only pseudo-moving bed chromatography is a suitable way to purify 6-SL (from English sialyllactose) on a scale comparable to food production. However, all other published methods suffer from the disadvantage that contaminating carbohydrates cannot be effectively removed from the desired product.

Таким образом, цель настоящего изобретения заключалась в предложении простого и экономически выгодного способа очистки сиалиллактозы от продуктов микробной ферментации, где нуклеиновые кислоты и полипептиды, происходящие из рекомбинантного микроорганизма, могут быть отделены от желательного олигосахарида, а также других указанных углеводов.Thus, the aim of the present invention was to propose a simple and cost-effective method for purifying sialyllactose from microbial fermentation products, where nucleic acids and polypeptides derived from a recombinant microorganism can be separated from the desired oligosaccharide, as well as other specified carbohydrates.

Краткое изложение сущности изобретенияBrief summary of the invention

Предложен способ очистки сиалиллактозы, который является простым, экономически эффективным и масштабируемым. Способ очистки сиалиллактозы может быть осуществлен без применения органического растворителя для кристаллизации указанной сиалиллактозы. Кроме того, способ очистки сиалиллактозы можно осуществить без стадии прерываемой хроматографии.A method for purifying sialyllactose is proposed, which is simple, cost-effective and scalable. The method for purifying sialyllactose can be carried out without using an organic solvent to crystallize said sialyllactose. In addition, the sialyllactose purification process can be carried out without an interrupted chromatography step.

Сиалиллактоза представляет олигосахарид грудного молока, чье включение в детскую питательную смесь и лечебный продукт питания является крайне желательным. Высокая стоимость сиалиллактозы препятствует ее широкому применению, в частности, в детской питательной смеси. В частности, очистка продуктов от продуктов микробной ферментации часто является сложной и дорогой. Также применение органических растворителей и стадий прерываемой хроматографии делает 6'-сиалиллактозу и другие нейтральные олигосахариды чрезмерно дорогими. Также применение этанола неприменимо по некоторым религиозным пищевым стандартам, например, Халяль. Таким образом, изобретение относится к простому экономически эффективному способу очистки сиалиллактозы от продуктов микробной ферментации с использованием рекомбинантного технологического вспомогательного средства, приводящему к получению продукта сиалиллактоза, подходящего для потребления человеком, в частности, подходящего для продукта для детского питания и лечебных продуктов питания.Sialyl lactose is a human milk oligosaccharide whose inclusion in infant formula and health foods is highly desirable. The high cost of sialyllactose prevents its widespread use, in particular in infant formula. In particular, purification of products from microbial fermentation products is often difficult and expensive. Also, the use of organic solvents and interrupted chromatography steps makes 6'-sialyllactose and other neutral oligosaccharides prohibitively expensive. Also, the use of ethanol is not applicable according to some religious food standards, such as Halal. Thus, the invention relates to a simple, cost-effective process for purifying sialyllactose from microbial fermentation products using a recombinant processing aid, resulting in a sialyllactose product suitable for human consumption, in particular suitable for baby food and health foods.

Способ очистки основан на применении двух разных мембран для очистки/отделения сиалиллактозы от загрязняющих углеводов посредством фильтрации и включает две стадии мембранной фильтрации, где одна мембрана имеет порог отсечения по молекулярной массе от примерно 300 до примерно 500 Дальтон, и где другая мембрана имеет порог отсечения по молекулярной массе от примерно 600 до примерно 800 Дальтон.The purification method is based on the use of two different membranes for purification/separation of sialyllactose from contaminating carbohydrates by filtration and includes two stages of membrane filtration, where one membrane has a molecular weight cut-off from about 300 to about 500 Daltons, and where the other membrane has a cut-off at molecular weight from about 600 to about 800 Daltons.

Подробное описаниеDetailed description

Предложен способ очистки сиалиллактозы от других углеводов, где данный способ включает стадии подвергания водного раствора, содержащего сиалиллактозу и другие указанные углеводы, двум стадиям мембранной фильтрации с использованием разных мембран, где одна мембрана имеет порог отсечения по молекулярной массе от примерно 300 до примерно 500 Дальтон, и где другая мембрана имеет порог отсечения по молекулярной массе от примерно 600 до примерно 800 Дальтон.What is proposed is a method for purifying sialyllactose from other carbohydrates, where this method includes the steps of subjecting an aqueous solution containing sialyllactose and other specified carbohydrates to two stages of membrane filtration using different membranes, where one membrane has a cut-off threshold for molecular weight from about 300 to about 500 Daltons, and wherein the other membrane has a molecular weight cutoff of about 600 to about 800 Daltons.

Мембрана, имеющая порог отсечения по молекулярной массе от примерно 300 до примерно 500 Дальтон, делает возможным удаление основной части углеводов, имеющих молекулярную массу, которая меньше, чем молекулярная масса сиалиллактозы. При фильтрации SL и углеводы, имеющие молекулярную массу больше, чем молекулярная масса SL, остаются в ретентате.A membrane having a molecular weight cut-off of about 300 to about 500 daltons allows the removal of the majority of carbohydrates having a molecular weight that is less than that of sialyllactose. During filtration, SL and carbohydrates having a molecular weight greater than the molecular weight of SL remain in the retentate.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении мембрана, имеющая порог отсечения по молекулярной массе от примерно 300 до примерно 500 Дальтон, имеет размер пор от 1 до 2 нм.In a further and/or alternative embodiment, a membrane having a molecular weight cutoff of about 300 to about 500 Daltons has a pore size of 1 to 2 nm.

Подходящие мембраны, имеющие порог отсечения по молекулярной массе, которая меньше молекулярной массы SL, представляют сбой, например, TriSep XN-45 (TriSep Corporation, США), Dairy DK (Suez Water Technologies, formely GE) и Filmtech NF270 (Dow).Suitable membranes having a molecular weight cut-off that is less than the molecular weight SL present a failure, for example, TriSep XN-45 (TriSep Corporation, USA), Dairy DK (Suez Water Technologies, formely GE) and Filmtech NF270 (Dow).

Мембрана, имеющая порог отсечения по молекулярной массе от примерно 600 до примерно 800 Дальтон, обладает проницаемостью к сиалиллактозе и углеводам, имеющим молекулярную массу меньше, чем молекулярная масса SL. При фильтрации SL находится в фильтрате, тогда как углеводы, имеющие молекулярную массу больше, чем молекулярная масса SL, остаются в ретентате.A membrane having a molecular weight cut-off of about 600 to about 800 Daltons is permeable to sialyllactose and carbohydrates having a molecular weight less than that of SL. In filtration, SL is in the filtrate, while carbohydrates having a molecular weight greater than the molecular weight of SL remain in the retentate.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении мембрана, имеющая порог отсечения по молекулярной массе от примерно 600 до примерно 800 Дальтон, имеет размер пор 2,5-3 нм.In a further and/or alternative embodiment, a membrane having a molecular weight cutoff of about 600 to about 800 Daltons has a pore size of 2.5-3 nm.

Подходящие мембраны для обладания проницаемостью в отношении 6-SL и задерживания углеводов, имеющих молекулярную массу больше, чем молекулярная масса 6-SL, в ретентате, представляют собой, например, мембрану 0,65 кДа TangenX SIUS TFF (Repligen Corporation), модули Zirkonia 3 нм (Pervatech BV) и S-CUT YSNF-YS600 (CUT/

).Suitable membranes for having 6-SL permeability and retaining carbohydrates having a molecular weight greater than the molecular weight of 6-SL in the retentate are, for example, TangenX SIUS TFF 0.65 kDa membrane (Repligen Corporation), Zirkonia 3 modules nm (Pervatech BV) and S-CUT YSNF-YS600 (CUT/

).

Способ не подразумевает применения дорогих стадий прерывающейся хроматографии и также делает ненужными стадии осаждения или кристаллизации с использованием органических растворителей. Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении способ не включает одну или более стадий прерывающейся хроматографии и/или одну или более стадий осаждения и/или кристаллизации 6-SL посредством использования органического растворителя.The method does not involve expensive intermittent chromatography steps and also eliminates the need for precipitation or crystallization steps using organic solvents. Thus, in a further and/or alternative embodiment, the method does not include one or more intermittent chromatography steps and/or one or more precipitation and/or crystallization steps of 6-SL using an organic solvent.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении водный раствор получают в результате ферментации или ферментативного процесса для получения сиалиллактозы.In a further and/or alternative embodiment, the aqueous solution is obtained from a fermentation or enzymatic process to produce sialyllactose.

Способ, описанный в данном документе, подходит для очистки олигосахаридов грудного молока - 3'-сиалиллактозы или 6'-сиалиллактозы - от продуктов микробной ферментации или реакции биокатализа в многотонных количествах, поскольку он является экономически целесообразным и масштабируемым.The method described herein is suitable for purifying human milk oligosaccharides, 3'-sialyllactose or 6'-sialyllactose, from microbial fermentation or biocatalysis reaction products in multi-ton quantities because it is economically viable and scalable.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении водный раствор получают в результате ферментации, а именно культивирования микробных клеток, которые способны продуцировать сиалиллактозу в культуральной среде (ферментационном бульоне) и в условиях, которые являются пермиссивными в отношении продукции микробными клетками сиалиллактозы, посредством отделения биомассы от ферментационного бульона. Предпочтительно, отделение биомассы от ферментационного бульона включает по меньшей мере одну стадию ультрафильтрации, предпочтительно две стадии ультрафильтрации, более предпочтительно первую ультрафильтрацию с использованием мембраны, имеющей порог отсечения по молекулярной массе примерно 500 кДа, и вторую ультрафильтрацию с использованием мембраны, имеющей порог отсечения по молекулярной массе примерно 150 кДа.In a further and/or alternative embodiment, the aqueous solution is obtained by fermentation, namely the cultivation of microbial cells that are capable of producing sialyllactose in a culture medium (fermentation broth) and under conditions that are permissive for the production of sialyllactose by microbial cells, by separating the biomass from the fermentation broth. Preferably, the separation of the biomass from the fermentation broth comprises at least one ultrafiltration step, preferably two ultrafiltration steps, more preferably a first ultrafiltration using a membrane having a molecular weight cutoff of about 500 kDa and a second ultrafiltration using a membrane having a molecular weight cutoff. mass is approximately 150 kDa.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении водный раствор обрабатывают катионообменной смолой, предпочтительно в форме Н⁺, и анионообменной смолой, предпочтительно в форме Cl^-. Предпочтительно, водный раствор, содержащий сиалиллактозу и другие углеводы, обрабатывают ионообменными смолами перед подверганием стадиям мембранной фильтрации для удаления других углеводов.In a further and/or alternative embodiment, the aqueous solution is treated with a cation exchange resin, preferably in the form of H ⁺ , and an anion exchange resin, preferably in the form of Cl ^- . Preferably, the aqueous solution containing sialyllactose and other carbohydrates is treated with ion exchange resins prior to being subjected to membrane filtration steps to remove other carbohydrates.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении способ дополнительно включает стадию диализа, предпочтительно стадию электролиза, для удаления ионов. Предпочтительно, водный раствор, содержащий сиалиллактозу, подвергают диализу и/или электродиализу после удаления других указанных углеводов из водного раствора.In a further and/or alternative embodiment, the method further comprises a dialysis step, preferably an electrolysis step, to remove ions. Preferably, the aqueous solution containing sialyllactose is subjected to dialysis and/or electrodialysis after removal of the other said carbohydrates from the aqueous solution.

Продукт можно наиболее удобным образом поставлять в виде стерильного концентрата или в виде продукта, подвергнутого распылительной сушке.The product can most conveniently be supplied as a sterile concentrate or as a spray-dried product.

Способ делает возможной очистку 3'-сиалиллактозы или 6'-сиалиллактозы, а именно отделение 3-SL или 6-SL от других углеводов, где чистота сиалиллактозы в водном растворе составляет 70% или меньше, 60% или меньше, 50% или меньше, 40% или меньше, 30% или меньше, 20% или меньше; 10% или меньше или 5% или меньше перед очисткой, и/или водный раствор содержит сиалиллактозу с чистотой 80% или больше, предпочтительно 85% или больше или более предпочтительно 90% или больше после очистки.The method makes it possible to purify 3'-sialyllactose or 6'-sialyllactose, namely the separation of 3-SL or 6-SL from other carbohydrates, where the purity of sialyllactose in aqueous solution is 70% or less, 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less; 10% or less or 5% or less before purification, and/or the aqueous solution contains sialyllactose with a purity of 80% or more, preferably 85% or more or more preferably 90% or more after purification.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении очистка включает следующие стадии:In a further and/or alternative embodiment, the purification comprises the following steps:

i) отделение биомассы от ферментационного бульона;i) separating the biomass from the fermentation broth;

ii) подвергание бесклеточного ферментационного бульона по меньшей мере одной обработке ионообменной смолой для удаления заряженного вещества, предпочтительно обработке анионообменной смолой и обработке катионообменной смолой;ii) subjecting the cell-free fermentation broth to at least one treatment with an ion exchange resin to remove the charged substance, preferably with an anion exchange resin and a treatment with a cation exchange resin;

iii) подвергание водного раствора, полученного на стадии ii., стадии мембранной фильтрации с использованием мембраны, имеющей порог отсечения по молекулярной массе от примерно 300 до примерно 500 Дальтон, для удаления углеводов, имеющих молекулярную массу меньше, чем молекулярная масса сиалиллактозы;iii) subjecting the aqueous solution obtained in step ii. to a membrane filtration step using a membrane having a molecular weight cutoff of about 300 to about 500 Daltons to remove carbohydrates having a molecular weight less than that of sialyllactose;

iv) подвергание ретентата, полученного на стадии iii., стадии мембранной фильтрации с использованием мембраны, имеющей порог отсечения по молекулярной массе от примерно 600 до примерно 800 Дальтон, для удаления углеводов, имеющих молекулярную массу больше, чем молекулярная масса сиалиллактозы; и - возможно -iv) subjecting the retentate obtained in step iii. to a membrane filtration step using a membrane having a molecular weight cutoff of about 600 to about 800 Daltons to remove carbohydrates having a molecular weight greater than that of sialyllactose; and, perhaps -

v) повышение концентрации сиалиллактозы, находящейся в фильтрате стадии iv.v) increasing the concentration of sialyllactose present in the filtrate of step iv.

Ввиду того, что другие способы, используемые для очистки сиалиллактозы, являются довольно сложными и, вследствие этого, дорогими, способ, ранее описанный в данном документе, основан главным образом на применении двух стадий мембранной фильтрации.In view of the fact that other methods used to purify sialyllactose are quite complex and therefore expensive, the method previously described in this document is based mainly on the use of two stages of membrane filtration.

Некоторые воплощения включают одну или более дополнительных стадий, таких как стадии диализа (для удаления солей), электродиализ (для удаления заряженных молекул), обработка активированным углем (для обесцвечения раствора продукта) и/или другие процессы фильтрации (подобно удалению эндотоксинов и/или стерильной фильтрации). Хотя и необязательно, способ может включать обработку водного раствора, содержащего сиалиллактозу, органическим растворителем (таким как короткоцепочечные спирты, подобно метанолу) для осаждения загрязняющих олигосахаридов или для элюирования после адсорбции на активированном угле с помощью смесей короткоцепочечных спиртов и воды, и/или для кристаллизации сиалиллактозы.Some embodiments include one or more additional steps such as dialysis steps (to remove salts), electrodialysis (to remove charged molecules), activated carbon treatment (to decolorize the product solution), and/or other filtration processes (like removal of endotoxins and/or sterile filtering). Although optional, the method may include treating an aqueous solution containing sialyllactose with an organic solvent (such as short chain alcohols like methanol) to precipitate contaminating oligosaccharides or to elute after being adsorbed on activated carbon with mixtures of short chain alcohols and water, and/or to crystallize sialyllactose.

Водный раствор, полученный посредством способа, содержит сиалиллактозу, но не содержит нуклеиновых кислот и полипептидов микробных клеток. Кроме того, указанный водный раствор едва ли содержит, если вообще содержит, моносахариды и/или дисиалиллактозу.The aqueous solution obtained by the method contains sialyllactose, but does not contain nucleic acids and polypeptides of microbial cells. Furthermore, said aqueous solution hardly, if at all, contains monosaccharides and/or disialyl lactose.

Настоящее изобретение будет описано в отношении конкретных воплощений, но данное изобретение не ограничивается ими, а только формулой изобретения. Кроме того, термины первый, второй и тому подобное в описании и в формуле изобретения используются для проведения различия между похожими элементами и не обязательно для описания последовательности, во времени, в пространстве, по рангу или любым другим образом. Следует понимать, что термины, используемые таким образом, являются взаимозаменяемыми в соответствующих обстоятельствах, и что воплощения изобретения, описанные в данном документе, способны работать в последовательностях, отличных от описанных или проиллюстрированных в данном документе.The present invention will be described in relation to specific embodiments, but the present invention is not limited to them, but only by the claims. In addition, the terms first, second, and the like in the specification and claims are used to distinguish between like elements, and not necessarily to describe sequence, time, space, rank, or in any other way. It should be understood that the terms used in this way are interchangeable in appropriate circumstances, and that the embodiments of the invention described herein are capable of operating in sequences other than those described or illustrated herein.

Следует понимать, что термин «содержащий», используемый в формуле изобретения, не следует считать ограничивающимся средствами, перечисленными в дальнейшем; он не исключает других элементов или стадий. Таким образом, его следует считать определяющим наличие заявленных признаков, целых чисел, стадий или компонентов, на которые ссылаются, но он не исключает наличие или добавление одного или более других признаков, целых чисел, стадий или компонентов или их групп. Таким образом, объем выражения «устройство, содержащее средства А и В» не следует ограничивать устройствами, состоящими только из компонентов А и В. Оно означает, что в отношении настоящего изобретения, единственными релевантными компонентами устройства являются А и В.It should be understood that the term "comprising" used in the claims should not be considered limited to the means listed hereinafter; it does not exclude other elements or steps. Thus, it should be considered as defining the presence of the claimed features, integers, steps, or components referred to, but it does not preclude the presence or addition of one or more other features, integers, steps, or components, or groups thereof. Thus, the scope of the expression "device comprising means A and B" should not be limited to devices consisting only of components A and B. It means that, with respect to the present invention, the only relevant components of the device are A and B.

Ссылка на всем протяжении данного описания изобретения на «одно воплощение» или «воплощение» означает, что конкретный признак, структура или характеристика, описанные в связи с данным воплощением, включены в по меньшей мере одно воплощение настоящего изобретения. Таким образом, появления фраз «в одном воплощении» или «в воплощении» в разных местах по всему объему данного описания изобретения не обязательно все относятся к одному и тому же воплощению, но могут. Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом, как будет очевидно обычному специалисту в данной области из данного раскрытия, в одном или более воплощениях.Reference throughout this specification to "one embodiment" or "an embodiment" means that a particular feature, structure, or characteristic described in connection with a given embodiment is included in at least one embodiment of the present invention. Thus, the occurrences of the phrases "in one embodiment" or "in an embodiment" in various places throughout this specification do not necessarily all refer to the same embodiment, but may. In addition, specific features, structures, or characteristics may be combined in any suitable manner, as will be apparent to one of ordinary skill in the art from this disclosure, in one or more embodiments.

Аналогично следует понимать, что в описании иллюстративных воплощений изобретения разные признаки изобретения иногда сгруппированы вместе в одном единственном воплощении, фигуре или его описании в целях упрощения раскрытия и помощи в понимании одного или более разных аспектов изобретения. Данный способ раскрытия, однако, не нужно считать отражающим мысль, что заявленное изобретение требует больше признаков, чем явным образом перечислены в каждом пункте. Скорее, как отражено в приведенной далее формуле изобретения, аспекты изобретения заключаются меньше чем во всех признаках одного вышеизложенного раскрытого воплощения. Таким образом, формула изобретения после подробного описания явным образом включена тем самым в данное подробное описание, причем каждый пункт отдельно стоит в виде отдельного воплощения данного изобретения.Likewise, it should be understood that in the description of illustrative embodiments of the invention, various features of the invention are sometimes grouped together in one single embodiment, figure, or description thereof for the purpose of simplifying the disclosure and aiding in understanding one or more different aspects of the invention. This mode of disclosure, however, should not be taken to reflect the idea that the claimed invention requires more features than are explicitly listed in each claim. Rather, as reflected in the following claims, aspects of the invention are contained in less than all of the features of one of the foregoing disclosed embodiments. Thus, the claims after the detailed description are hereby expressly incorporated into this detailed description, each claim standing alone as a separate embodiment of the present invention.

Кроме того, в то время как некоторые воплощения, описанные в данном документе, включают некоторые, но не все признаки, включенные в другие воплощения, подразумевается, что комбинации признаков разных воплощений находятся в объеме изобретения и образуют разные воплощения, как будет понятно специалистам в данной области. Например, в приведенной ниже формуле изобретения любое из заявленных воплощений можно использовать в любой комбинации.Furthermore, while some embodiments described herein include some but not all of the features included in other embodiments, combinations of features of different embodiments are intended to be within the scope of the invention and form different embodiments, as will be appreciated by those skilled in the art. areas. For example, in the claims below, any of the claimed embodiments may be used in any combination.

Кроме того, некоторые из воплощений описаны в данном документе как способ или комбинация элементов способа, которые могут быть реализованы посредством процессора компьютерной системы или с помощью других средств выполнения функции. Таким образом, процессор с необходимыми инструкциями для осуществления такого способа или элемента способа образует средство осуществления способа или элемента способа. Кроме того, описанный в данном документе элемент воплощения аппарата представляет собой пример средства осуществления функции, выполняемой элементом, с целью осуществления изобретения.In addition, some of the embodiments are described herein as a method or combination of method elements that may be implemented by a computer system processor or by other means of performing a function. Thus, the processor, with the necessary instructions for implementing such a method or method element, constitutes a means for implementing the method or method element. In addition, the apparatus embodiment element described herein is an example of a means for carrying out the function performed by the element for carrying out the invention.

В описании и графических материалах, предоставленных в данном документе, изложены многочисленные конкретные подробности. Однако, понятно, что воплощения изобретения можно осуществлять на практике без данных конкретных подробностей. В других примерах хорошо известные способы, структуры и методики не были показаны подробно для того, чтобы не затруднять понимание данного описания.Numerous specific details are set forth in the description and graphics provided herein. However, it is understood that embodiments of the invention may be practiced without these specific details. In other examples, well-known methods, structures, and techniques have not been shown in detail in order not to obscure this description.

Теперь изобретение будет описано с помощью подробного описания нескольких воплощений изобретения. Ясно, что другие воплощения изобретения могут быть скомпонованы в соответствии со знаниями специалистов в данной области, не отклоняясь от истинной сущности или технической идеи изобретения, причем изобретение ограничено только условиями прилагаемой формулы изобретения.The invention will now be described by way of a detailed description of several embodiments of the invention. It is clear that other embodiments of the invention can be arranged in accordance with the knowledge of experts in this field, without deviating from the true essence or technical idea of the invention, and the invention is limited only by the terms of the attached claims.

ПримерыExamples

Пример 1. Ферментативное получение 6'-сиалиллактозыExample 1 Enzymatic Preparation of 6'-sialyllactose

Проводили периодическую ферментацию с подпиткой для получения 6'-сиалиллактозы с использованием штамма Е. coli, синтезирующего рекомбинантную 6'-сиалиллактозу (Е. coli BL21(DE3) ΔlacZ), экспрессирующего ген α-2,6-сиалилтрансферазы plsT6 из Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-119. Для усиления биосинтеза СМР-сиаловой кислоты, гены, кодирующие глюкозамин-6-фосфатсинтазу GlmS из Е. coli, N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу Slr1975 из Synechocystis sp., глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу Gna1 из Saccharomyces cerevisiae, фосфоенолпируватсинтазу PpsA из E. coli, N-ацетилнейраминатсинтазу NeuB и синтетазу СМР-сиаловой кислоты NeuA, обе последние из Campylobacter jejuni, хромосомно интегрировали в хозяина Е. coli BL21(DE3). Кроме того, ген, кодирующий лактозопермеазу LacY из Е. coli, и гены cscB (сахарозопермеаза), cscK (фруктокиназа), cscA (сахарозогидролаза) и cscR (регулятор транскрипции) из Е. coli W интегрировали в геном BL21, таким образом, чтобы транскрипция интегрированных генов инициировалась с конститутивных промоторов, или с тетрациклин-чувствительного промотора P_tet или промотора РТ5. Функциональный gal-оперон (галактозный оперон), состоящий из генов galE (УДФ (Уридиндифосфат)-глюкозо-4-эпимераза), galT (галактозо-1-фосфат уридилилтрансфераза), galK (галактокиназа) и galM (галактозо-1-эпимераза) переносили из Е. coli K12 в геном штамма BL21. Для предотвращения деградации N-ацетилглюкозамин-6-фосфата, гены, кодирующие N-ацетилглюкозамин-6-фосфат деацетилазу (NagA), глюкозамин-6-фосфат-деаминазу (NagB) и N-ацетилглюкозамин-специфичный PTS белок МАВС (NagE), удаляли из бактериальной хромосомы. Кроме того, оперон manXYZ, кодирующий транспортер Сахаров PTS системы Е. coli для маннозы, глюкозы, глюкозамина и N-ацетилглюкозамина, удаляли, а также гены папА, nanK, папЕ и папТ, кодирующие N-ацетилнейраминатлиазу, N-ацетилманнозаминкиназу, N-ацетилманнозамин-6-фосфатэпимеразу и транспортер сиаловой кислоты, соответственно. Ген, кодирующий N-ацетилгалактозамин-6-фосфатдеацетилазу (AgaA), также удаляли.Fed-batch fermentation was carried out to produce 6'-sialyllactose using an E. coli strain synthesizing recombinant 6'-sialyllactose (E. coli BL21(DE3) ΔlacZ) expressing the gene for α-2,6-sialyltransferase plsT6 from Photobacterium leiognathi JT- SHIZ-119. To enhance the biosynthesis of CMP-sialic acid, genes encoding glucosamine-6-phosphate synthase GlmS from E. coli, N-acetylglucosamine-2-epimerase Slr1975 from Synechocystis sp., glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase Gna1 from Saccharomyces cerevisiae, phosphoenolpyruvate synthase PpsA from E. coli, N-acetylneuraminate synthase NeuB, and CMP-sialic acid synthetase NeuA, both of the latter from Campylobacter jejuni, were chromosomally integrated into the E. coli host BL21(DE3). In addition, the gene encoding lactose permease LacY from E. coli and the cscB (sucrose permease), cscK (fructokinase), cscA (sucrose hydrolase), and cscR (transcriptional regulator) genes from E. coli W were integrated into the BL21 genome so that transcription integrated genes was initiated from constitutive promoters, or from the tetracycline-responsive P _tet promoter or the PT5 promoter. Functional gal-operon (galactose operon), consisting of genes galE (UDP (uridine diphosphate)-glucose-4-epimerase), galT (galactose-1-phosphate uridylyltransferase), galK (galactokinase) and galM (galactose-1-epimerase) were transferred from E. coli K12 into the BL21 strain genome. To prevent the degradation of N-acetylglucosamine-6-phosphate, the genes encoding N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase (NagA), glucosamine-6-phosphate deaminase (NagB), and N-acetylglucosamine-specific PTS protein MABC (NagE) were removed. from the bacterial chromosome. In addition, the manXYZ operon encoding the PTS sugar transporter of the E. coli system for mannose, glucose, glucosamine, and N-acetylglucosamine was deleted, as well as the papA, nanK, papE, and papT genes encoding N-acetylneuraminate lyase, N-acetylmannosamine kinase, and N-acetylmannosamine. -6-phosphate epimerase and sialic acid transporter, respectively. The gene encoding N-acetylgalactosamine-6-phosphate deacetylase (AgaA) was also deleted.

Штамм Е. coli, продуцирующий 6'-сиалиллактозу, выращивали в среде с определенными минеральными солями, содержащей 7 г⋅л^-1 NH₄H₂PO₄, 7 г⋅л^-1 K₂HPO₄, 2 г⋅л^-1 KOH, 0,3 г⋅л^-1 лимонной кислоты, 5 г⋅л^-1 NH₄Cl, 1 мл⋅л^-1 пеногасителя (Struktol J673, Schill + Seilacher), 0,1 мМ CaCl₂, 8 мМ MgSO₄, микроэлементы и 2% сахарозы в качестве источника углерода. Микроэлементы состояли из 0,101 г⋅л^-1 нитрилотриуксусной кислоты, рН 6,5, 0,056 г⋅л^-1 цитрата железа(III)-аммония, 0,01 г⋅л^-1 MnCl₂ × 4 H₂O, 0,002 г⋅л^-1 CoCl₂ × 6 H₂O, 0,001 г⋅л^-1 CuCl₂ × 2 H₂O, 0,002 г⋅л^-1 борной кислоты, 0,009 г⋅л^-1 ZnSO₄ × 7 H₂O, 0,001 г⋅л^-1 Na₂MoO₄ × 2 H₂O, 0,002 г⋅л^-1 Na₂SeO₃, 0,002 г⋅л^-1 NiSO₄ × 6 H2O.E. coli strain producing 6'-sialyllactose was grown in a medium with certain mineral salts containing 7 g⋅l ^-1 NH ₄ H ₂ PO ₄ , 7 g⋅l ^-1 K ₂ HPO ₄ , 2 g⋅l ^-1 KOH, 0.3 g⋅l ^-1 citric acid, 5 g⋅l ^-1 NH ₄ Cl, 1 ml⋅l ^-1 defoamer (Struktol J673, Schill + Seilacher), 0.1 mM CaCl ₂ , 8 mM MgSO ₄ , trace elements and 2% sucrose as a carbon source. Trace elements consisted of 0.101 g⋅l ^-1 nitrilotriacetic acid, pH 6.5, 0.056 g⋅l ^-1 iron(III)-ammonium citrate, 0.01 g⋅l ^-1 MnCl ₂ × 4 H ₂ O, 0.002 g⋅ l ^-1 CoCl ₂ × 6 H ₂ O, 0.001 g⋅l ^-1 CuCl ₂ × 2 H ₂ O, 0.002 g⋅l ^-1 boric acid, 0.009 g⋅l ^-1 ZnSO ₄ × 7 H ₂ O, 0.001 g ⋅l ^-1 Na ₂ MoO ₄ × 2 H ₂ O, 0.002 g⋅l ^-1 Na ₂ SeO ₃ , 0.002 g⋅l ^-1 NiSO ₄ × 6 H2O.

При подаче сахарозы (500 г⋅л^-1) добавляли 8 мМ MgSO₄, 0,1 мМ CaCl₂, микроэлементы и 5 г⋅л^-1 NH₄Cl. Для образования 6'-сиалиллактозы использовали подачу лактозы 216 г⋅л^-1. рН культуральной среды контролировали посредством использования раствора аммония (25 об./об.%). Периодическую ферментацию с подпиткой проводили при 30°С при постоянной аэрации и перемешивании в течение 72 часов посредством применения скорости подачи сахарозы 5,5-7 мл⋅л^-1⋅ч^-1 относительно исходного объема. Через 72 часа после начала ферментации наибольшая часть добавленной лактозы превращалась в 6'-сиалиллактозу. Для удаления остаточной лактозы в ферментационном супернатанте в ферментационный чан добавляли β-галактозидазу.When applying sucrose (500 g⋅l ^-1 ) was added 8 mm MgSO ₄ , 0.1 mm CaCl ₂ , trace elements and 5 g⋅l ^-1 NH ₄ Cl. For the formation of 6'-sialyllactose used the supply of lactose 216 g⋅l ^-1 . The pH of the culture medium was controlled by using ammonium solution (25 vol./vol.%). Fed-batch fermentation was carried out at 30°C with constant aeration and stirring for 72 hours by applying a sucrose feed rate of 5.5-7 ml.l ^-1 .h ^-1 relative to the original volume. 72 hours after the start of fermentation, most of the added lactose was converted to 6'-sialyllactose. To remove residual lactose in the fermentation supernatant, β-galactosidase was added to the fermentation tank.

Пример 2: Получение бесклеточного ферментационного бульонаExample 2: Preparation of a cell-free fermentation broth

Клеточную массу (примерно 10% ферментационного бульона) отделяли от среды посредством ультрафильтрации (порог отсечения 0,05 мкм) (CUT membrane technology, Erkrath, Германия) с последующими фильтрациями с перекрестным током с использованием фильтра, имеющего MWCO (от англ. Molecular-weight cutoff - порог отсечения по молекулярной массе) 150 кДа (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Германия).The cell mass (approximately 10% fermentation broth) was separated from the medium by ultrafiltration (cutoff 0.05 μm) (CUT membrane technology, Erkrath, Germany) followed by cross-flow filtrations using a filter having an MWCO (from the English. Molecular-weight cutoff - molecular weight cutoff) 150 kDa (Microdyn-Nadir, Wiesbaden, Germany).

Пример 3: Обработка ионообменной смолой бесклеточного ферментационного бульона, содержащего 6'-сиалиллактозуExample 3 Ion Exchange Resin Treatment of a Cell-Free Fermentation Broth Containing 6'-sialyllactose

Бесклеточный ферментационный бульон, как получено в примере 2, содержал 6'-сиалиллактозу (с чистотой 9% на сухую массу) в объеме 1000 литров и пропускали через сильную катионообменную смолу (Lewatit® S2568, полученная от компании Lanxess, Германия) в форме Н⁺ для удаления положительно заряженных загрязняющих веществ (размер объема слоя ионообменника составлял 200 л). Элюирование 6-SL с ионообменной смолы продолжалось с помощью деионизированной воды. Затем рН полученного раствора устанавливали на уровне 7 посредством добавления раствора гидроксида натрия. Затем раствор (без задержки) пропускали через колонку с анионообменником (объем слоя ионообменника составлял 200 л). Используемый сильный анионообменник Lewatit® S6368 A (Lanxess, Германия) находился в форме хлорида (СГ). Элюирование 6-SL продолжали посредством деионизированной воды. Полученный раствор снова нейтрализовали до рН 7.The cell-free fermentation broth as prepared in Example 2 contained 6'-sialyllactose (9% pure by dry weight) in a volume of 1000 liters and passed through a strong cation exchange resin (Lewatit® S2568, obtained from Lanxess, Germany) in the form of H ⁺ to remove positively charged contaminants (ion exchanger bed volume size was 200 L). Elution of 6-SL from the ion exchange resin was continued with deionized water. The resulting solution was then adjusted to pH 7 by adding sodium hydroxide solution. Then the solution (without delay) was passed through a column with an anion exchanger (the volume of the bed of the ion exchanger was 200 l). The strong anion exchanger Lewatit® S6368 A (Lanxess, Germany) used was in the form of chloride (CH). Elution of 6-SL was continued with deionized water. The resulting solution was again neutralized to pH 7.

Пример 4: Первая фильтрация для удаления молекул/углеводов меньшего размераExample 4 First Filtration to Remove Smaller Molecules/Carbohydrates

Раствор, полученный в результате обработки ионообменной смолой, изложенной в примере 3, подвергали диафильтрации, используя нанофильтрационную мембрану TriSep XN-45 (TriSep Corporation, США) и 500 л деионизированной воды. Полученный раствор дополнительно концентрировали, используя нанофильтрационную мембрану (RE 8040-ВЕ, CSM-Saehan), где получали раствор 6'-сиалиллактозы с чистотой 31% (на сухую массу) и электропроводность 8 мСм/см.The solution resulting from treatment with the ion exchange resin set forth in Example 3 was diafiltered using a TriSep XN-45 nanofiltration membrane (TriSep Corporation, USA) and 500 L of deionized water. The resulting solution was further concentrated using a nanofiltration membrane (RE 8040-BE, CSM-Saehan) where a 6'-sialyllactose solution was obtained with a purity of 31% (dry weight) and a conductivity of 8 mS/cm.

Пример 5: Вторая фильтрация для удаления молекул/углеводов большего размераExample 5 Second Filtration to Remove Larger Molecules/Carbohydrates

Для отделения 6'-сиалиллактозы от полученного в результате ферментации побочного продукта - дисиалиллактозы использовали вторую мембранную обработку. Для фильтрования использовали мембрану TangenX SIUS TFF с номинальным порогом отсечения 0,65 кДа (Repligen Corporation). Раствор, содержащий 94,4% 6'-сиалиллактозы и 6,6% дисиалиллактозы (соотношение 15:1) подвергали фильтрации с перекрестным током с помощью описанной системы, и концентрацию 6'-сиалиллактозы и дисиалиллактозы определяли внутри пермеата и ретентата. Результаты показывают значимое уменьшение количества дисиалиллактозы внутри пермеата с 6,6% до 0,2% (отношение 6'-сиалиллактозы к дисиалиллактозе составляло 55:1), тогда как отношение 6'-сиалиллактозы к дисиалиллактозе внутри ретентата составляло 14:1. Данный результат показывает, что 6'-сиалиллактоза могла быть отделена от дисиалиллактозы посредством использования дополнительной стадии фильтрации. Данное наблюдение могло быть также продемонстрировано посредством использования второго вида мембраны с похожим порогом отсечения от другого поставщика. Посредством использования мембраны S-CUT YSNF-YS600-2540-M46D-ATD (CUT Membrane Technology GmbH) с номинальным порогом отсечения 600-800 Да 6'-сиалиллактозу также отделяли от дисиалиллактозы посредством фильтрации с перекрестным током.A second membrane treatment was used to separate the 6'-sialyllactose from the fermentation by-product, disialyl lactose. Filtration used a TangenX SIUS TFF membrane with a nominal cutoff of 0.65 kDa (Repligen Corporation). A solution containing 94.4% 6'-sialyllactose and 6.6% disialyl lactose (ratio 15:1) was subjected to cross-flow filtration using the described system, and the concentration of 6'-sialyllactose and disialyl lactose was determined within the permeate and retentate. The results show a significant reduction in the amount of disialyl lactose within the permeate from 6.6% to 0.2% (the ratio of 6'-sialyllactose to disialyl lactose was 55:1), while the ratio of 6'-sialyllactose to disialyl lactose within the retentate was 14:1. This result shows that 6'-sialyllactose could be separated from disialyl lactose by using an additional filtration step. This observation could also be demonstrated by using a second type of membrane with a similar cut-off from a different supplier. By using a S-CUT YSNF-YS600-2540-M46D-ATD membrane (CUT Membrane Technology GmbH) with a nominal cutoff of 600-800 Da, 6'-sialyllactose was also separated from disialyl lactose by cross-flow filtration.

Пример 6: Обработка на основе электродиализаExample 6 Treatment Based on Electrodialysis

Пермеат, полученный в примере 5, подвергали электродиализу до 2 мСм/см, используя электродиализатор PC-Cell 15 (PC-Cell, Heusweiler, Германия), оснащенный мембранным пакетом PC-Cell ED 1000Н. Данный мембранный пакет был оснащен следующими мембранами: катионообменная мембрана СЕМ: PK SK и анионообменная мембрана AEM:PcAcid60 с границей разделения по размеру 60 Да. 0,025 M раствор сульфаминовой кислоты (амидосульфоновая кислота) использовали в качестве электролита в процессе электродиализа. После электродиализа получали раствор, содержащий 6'-сиалиллактозу с чистотой 83% (по сухой массе). В качестве альтернативы обработке на основе электродиализа можно было использовать способ диафильтрации.The permeate obtained in Example 5 was subjected to electrodialysis to 2 mS/cm using a PC-Cell 15 electrodialyzer (PC-Cell, Heusweiler, Germany) equipped with a PC-Cell ED 1000H membrane bag. This membrane package was equipped with the following membranes: CEM: PK SK cation exchange membrane and AEM: PcAcid60 anion exchange membrane with a 60 Da sizing cutoff. A 0.025 M solution of sulfamic acid (amidosulfonic acid) was used as the electrolyte in the electrodialysis process. After electrodialysis, a solution was obtained containing 6'-sialyllactose with a purity of 83% (by dry weight). As an alternative to electrodialysis-based treatment, a diafiltration method could be used.

Пример 7: Концентрирование и обработка активированным углемExample 7: Concentration and treatment with activated carbon

Некоторое количество воды удаляли из водного раствора, используя фильтр с обратным осмосом и ротационное выпаривание при 45°С с получением 25%-ного (масс./об.) раствора 6'-сиалиллактозы. Затем полученный водный раствор обрабатывали активированным углем (Norit SA2). 125 г активированного угля использовали на 1 л 25%-ного (масс./об.) раствора 6'-сиалиллактозы.Some water was removed from the aqueous solution using a reverse osmosis filter and rotary evaporation at 45° C. to give a 25% (w/v) solution of 6'-sialyllactose. The resulting aqueous solution was then treated with activated carbon (Norit SA2). 125 g of activated charcoal was used per liter of 25% (w/v) 6'-sialyllactose solution.

Пример 8: Стерильная фильтрация и удаление эндотоксинаExample 8 Sterile Filtration and Endotoxin Removal

Далее, раствор, полученный в примере 7, подвергали стерильной фильтрации посредством пропускания раствора через фильтр 6 кДа (половолоконный модуль ультрафильтрации Pall Microza SEP-2013, Pall Corporation, Dreieich, Германия). Стерильный раствор затем хранили при KТ до распылительной сушки.Next, the solution obtained in Example 7 was subjected to sterile filtration by passing the solution through a 6 kDa filter (Pall Microza SEP-2013 Hollow Fiber Ultrafiltration Module, Pall Corporation, Dreieich, Germany). The sterile solution was then stored at RT until spray dried.

Пример 9: Распылительная сушка 6'-сиалиллактозыExample 9: Spray Drying of 6'-sialyllactose

Полученную таким образом (пример 8) стерильную 6'-сиалиллактозу затем подвергали распылительной сушке, используя распылительную сушилку NUBILOSA LTC-GMP (NUBILOSA, Konstanz, Германия). Для распылительной сушки 6'-сиалиллактозы раствор пропускали под давлением 3,5 бар (350 кПа) через сопла распылительной сушилки, установленные при 130°С, и поток регулировали для поддержания температуры нагнетания от 67°С до 69°С.Используя данные установки, мог быть получен порошок, высушенный посредством распылительной сушки, с влажностью меньше чем 9%. Содержание влаги определяли посредством титрования по Карлу Фишеру.The sterile 6'-sialyllactose thus obtained (Example 8) was then spray dried using a NUBILOSA LTC-GMP spray dryer (NUBILOSA, Konstanz, Germany). For spray drying of 6'-sialyllactose, the solution was passed at a pressure of 3.5 bar (350 kPa) through spray dryer nozzles set at 130°C and the flow was adjusted to maintain the discharge temperature from 67°C to 69°C. Using these setups, a spray-dried powder with a moisture content of less than 9% could be obtained. The moisture content was determined by Karl Fischer titration.

Пример 10: ЖХ-МС/МС анализ 6'-сиалиллактозыExample 10: LC-MS/MS analysis of 6'-sialyllactose

Для количественной оценки проводили масс-спектрометрический анализ посредством MRM (от англ. multiple reaction monitoring - мониторинг множественных реакций) с использованием хромато-масс-спектрометра LC Triple-Quadrupole MS detection system. Ионы-предшественники отбирают и анализируют в квадруполе 1, фрагментация проходит в столкновительной ячейке с использованием аргона в качестве газа CID, отбор фрагментных ионов проводят в квадруполе 3. Хроматографическое разделение сахаридов проводили на колонке для ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) XBridge Amide (3,5 мкм, 2,1 × 50 мм (Waters, США) с защитным картриджем XBridge Amide (3,5 мкм, 2,1 × 10 мм) (Waters, США). Температура термостата колонки системы ВЭЖХ составляла 50°С. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила/H₂O с 10 мМ ацетатом аммония. Образец 1 мкл инъецировали в прибор; прогон проводили в течение 3,60 мин со скоростью потока 400 мкл/мин. 6'-Сиалиллактозу анализировали посредством MRM в режиме положительной ионизации ИЭР (ионизация электрораспылением). Масс-спектрометр работал при единичном разрешении. Сиалиллактоза образует ион m/z 656,2 [М+Na]. Ион-предшественник сиалиллактозы был дополнительно фрагментирован в столкновительной ячейке на фрагментные ионы m/z 612,15, m/z 365,15 и m/z 314,15. Энергию столкновения, Q1 и Q3 Pre Bias оптимизировали для каждого аналита отдельно. Способы количественной оценки устанавливали с использованием имеющихся в продаже стандартов (Carbosynth, Compton, UK).For quantification, mass spectrometric analysis was performed by MRM (from the English. multiple reaction monitoring - monitoring of multiple reactions) using a gas chromatography-mass spectrometer LC Triple-Quadrupole MS detection system. Precursor ions are sampled and analyzed in quadrupole 1, fragmentation is performed in a collision cell using argon as CID gas, fragment ion sampling is performed in quadrupole 3. Chromatographic separation of saccharides was performed on an XBridge Amide HPLC column (3.5 µm, 2.1 × 50 mm (Waters, USA) with XBridge Amide protective cartridge (3.5 µm, 2.1 × 10 mm) (Waters, USA) The HPLC column oven temperature was 50°C. from acetonitrile/H ₂ O with 10 mM ammonium acetate 1 µl sample was injected into the instrument run for 3.60 min at a flow rate of 400 µl/min 6'-Sialyl lactose was analyzed by MRM in positive ionization mode ESI (electrospray ionization The mass spectrometer operated at unit resolution Sialyl lactose forms the ion m/z 656.2 [M+Na] The sialyl lactose precursor ion was additionally fragmented in a collision cell into 15 and m/z 314.15. Collision energy, Q1 and Q3 Pre Bias were optimized for each analyte separately. Quantification methods were set using commercially available standards (Carbosynth, Compton, UK).

Claims

1. A method for purifying sialyllactose from other carbohydrates, characterized in that said method includes the steps of subjecting an aqueous solution containing sialyllactose and other carbohydrates to two stages of membrane filtration using different membranes, where

one membrane has a molecular weight cut-off from about 300 to about 500 Da, and

the other membrane has a molecular weight cutoff of about 600 to about 800 Da.

2. The method of claim. 1, in which the aqueous solution is obtained by fermentation or enzymatic process for obtaining sialyllactose.

3. The method according to claim 1 or 2, wherein the aqueous solution is fermented by separating the biomass from the fermentation broth.

4. The method of claim 3, wherein separating the biomass from the fermentation broth comprises at least one ultrafiltration step, preferably two ultrafiltration steps, more preferably a first ultrafiltration using a membrane having a molecular weight cutoff of about 500 kDa, and a second ultrafiltration with using a membrane having a molecular weight cutoff of about 150 kDa.

5. The method according to any one of paragraphs. 1-4, in which the aqueous solution containing sialyllactose is treated with a cation exchange resin, preferably in the form of H ⁺ , and an anion exchange resin, preferably in the form of Cl ^- , more preferably before subjecting the aqueous solution to the steps of membrane filtration.

6. The method according to any one of paragraphs. 1-5, wherein said method further comprises the step of dialysis, preferably electrodialysis.

7. The method according to any one of paragraphs. 1-6, wherein the purity of sialyllactose in aqueous solution is 70% or less, 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less; 10% or less or 5% or less before purification and/or the aqueous solution contains sialyllactose with a purity of 80% or more, preferably 85% or more or more preferably 90% or more after purification.

8. The method according to any one of paragraphs. 1-7, wherein the sialyllactose is 3'-sialyllactose or 6'-sialyllactose.