RU2793240C2

RU2793240C2 - Bio-ink composition for sheet for derma regeneration, method for manufacture of individualized sheet for derma regeneration, using bio-ink composition

Info

Publication number: RU2793240C2
Application number: RU2020124018A
Authority: RU
Inventors: Сок Хван ЁУ
Original assignee: Рокит Хелскеа Инк.
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2023-03-30

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: group of inventions relates to a bio-ink composition for a sheet for derma regeneration, a method for the manufacture of an individualized sheet for derma regeneration, using it. The bio-ink composition for the sheet for derma regeneration includes the first liquid containing a stromal-vascular fraction obtained from adipose tissue, an intracellular matrix, and fibrinogen; and the second liquid containing thrombin, in which a content of the intracellular matrix in the first liquid is 20-60 wt.%, and in which a concentration of thrombin in the second liquid is 40-250 IU/ml. A method for the manufacture of an individualized sheet for derma regeneration is also disclosed.

EFFECT: group of inventions provides a bio-ink composition for a sheet for derma regeneration, capable of minimizing an implant rejection reaction, and manufacture of a sheet for derma regeneration, individualized for a patient, a method for the manufacture of an individualized sheet for derma regeneration, using it.

10 cl, 7 dwg

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY

Настоящая заявка испрашивает приоритет и преимущество на основании патентной заявки Кореи №10-2018-0012220, поданной в ведомство по интеллектуальной собственности Кореи 31 января 2018 г., все содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.This application claims priority and benefit from Korean Patent Application No. 10-2018-0012220 filed with the Korean Intellectual Property Office on January 31, 2018, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

Настоящее изобретение относится к композиции биочернил для листа для регенерации дермы, способу изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы с ее использованием и индивидуализированному листу для регенерации дермы, изготовленному с использованием указанного способа производства.The present invention relates to a bio-ink composition for a dermis regeneration sheet, a method for manufacturing a customized dermis regeneration sheet using the same, and a customized derma regeneration sheet made using said manufacturing method.

Уровень техникиState of the art

Кожа - самый большой орган, который покрывает всю поверхность человеческого тела, и функционирует, чтобы предотвратить потерю жидкостей организма, предотвратить приток вредных материалов и микроорганизмов извне и защитить наш организм от физического раздражения, радиации, ультрафиолетовых лучей, и тому подобное. Кожа имеет различные вспомогательные органы, такие как волосяные фолликулы, волосы, потовые и сальные железы, и, таким образом, является важным сложным органом, выполняющим различные функции в дополнение к функции защитной пленки. Кожа примерно делится на эпидермис, дерму и подкожную ткань (гиподерму).The skin is the largest organ that covers the entire surface of the human body, and functions to prevent the loss of body fluids, prevent the influx of harmful materials and microorganisms from outside, and protect our body from physical irritation, radiation, ultraviolet rays, and the like. The skin has various subsidiary organs such as hair follicles, hair, sweat and sebaceous glands and thus is an important complex organ with various functions in addition to being a protective film. The skin is roughly divided into epidermis, dermis, and subcutaneous tissue (hypoderm).

Дерма - это слой под эпидермисом, который обеспечивает субстрат, поддерживающий различные структуры, такие как кровеносные сосуды и нервы, и состоит из коллагена, эластичных волокон и внеклеточного матрикса. Дерма в основном состоит из сосочкового слоя, в верхней части которого много фибробластов и распределены микрососуды, а также из ретикулярной соединительной ткани, в которой много коллагеновых волокон.The dermis is the layer below the epidermis that provides the substrate that supports various structures such as blood vessels and nerves and is made up of collagen, elastic fibers, and extracellular matrix. The dermis mainly consists of the papillary layer, in the upper part of which there are many fibroblasts and microvessels are distributed, as well as of the reticular connective tissue, in which there are many collagen fibers.

Часть ткани кожи может быть повреждена в результате ожогов, травмы, кожных заболеваний, и в этом случае используют метод аутотрансплантации для имплантации ткани кожи человека с целью заживления поврежденной ткани или для реконструктивной хирургии, метод гомотрансплантации или аллотрансплантации для имплантации кожи другого человека, а также метод гетеротрансплантации или ксенотрансплантации для имплантации кожи животного. Среди этих методов метод аутотрансплантации является наиболее идеальным, но имеет недостатки, заключающиеся в том, что, когда участок лечения широкий, участок, на котором можно закрепить ткань, ограничен, а участок сбора остается новым участком раны. Гомотрансплантат или аллотрансплантат служит для содействия миграции и заживлению клеток вокруг раны.Part of the skin tissue can be damaged as a result of burns, trauma, skin diseases, and in this case, the autotransplantation method is used to implant human skin tissue in order to heal the damaged tissue or for reconstructive surgery, the homotransplantation or allotransplantation method is used to implant the skin of another person, as well as the method heterotransplantation or xenotransplantation for animal skin implantation. Among these methods, the autograft method is the most ideal, but has the disadvantage that when the treatment site is wide, the area where tissue can be fixed is limited, and the collection site remains a new wound site. The homograft or allograft serves to promote cell migration and healing around the wound.

Искусственная кожа - это трехмерно реконструированная кожа с использованием клеток кожи и компонентов кожи, таких как коллаген и эластин, и называется кожным эквивалентом или реконструированной кожей, поскольку искусственная кожа состоит из живых фибробластов и кератиноцитов, которые имеют морфологические и физиологические характеристики, аналогичные характеристикам реальной кожи. Искусственная кожа была разработана в 1980-х годах для лечения пациентов, которым требуется имплантация кожи из-за сильных ожогов, но их собственная кожа не может быть имплантирована из-за слишком большой тяжести ожога или слишком широкой пораженной области, и в ходе постоянного улучшения и исследования, искусственная кожа в настоящее время используется в различных областях, таких как исследования физиологии кожи, оценка раздражения кожи и оценка эффективности кожи. Однако существующая искусственная кожа имеет проблему, заключающуюся в том, что происходит явление, при котором дерма постепенно сокращается во время культивирования ткани в способе изготовления, и когда дерма резко сокращается, искусственная кожа полностью деформируется.Artificial skin is three-dimensionally reconstructed skin using skin cells and skin components such as collagen and elastin and is called skin equivalent or reconstructed skin because artificial skin is composed of living fibroblasts and keratinocytes that have morphological and physiological characteristics similar to those of real skin . Artificial skin was developed in the 1980s to treat patients who require skin implantation due to severe burns, but their own skin cannot be implanted because the burn is too severe or the affected area is too wide, and in the course of continuous improvement and research, artificial skin is currently used in various fields such as skin physiology research, skin irritation evaluation, and skin efficacy evaluation. However, the existing artificial skin has a problem in that a phenomenon occurs in which the dermis gradually shrinks during tissue culture in the manufacturing method, and when the dermis abruptly shrinks, the artificial skin is completely deformed.

В случае существующих клеточных терапевтических агентов используют способ имплантации аллогенных клеток с использованием аллогенных клеток или способ трансплантации аутологичных клеток. Имплантация аллогенных клеток обладает паракринным эффектом, но имеет проблему, заключающуюся в том, что организм рассматривает аллогенные клетки как инородное тело, и аллогенные клетки в конечном итоге исчезают. Кроме того, когда аутологичные клетки имплантируются методом инъекции, весьма вероятно, что клетки исчезнут, когда нет среды (например, каркаса) для роста клеток, и в конечном итоге трудно увидеть вызванный эффект введенными клетками.In the case of existing cellular therapeutic agents, an allogeneic cell implantation method using allogeneic cells or an autologous cell transplantation method is used. Allogeneic cell implantation has a paracrine effect, but has the problem that the body treats the allogeneic cells as a foreign body, and the allogeneic cells eventually disappear. In addition, when autologous cells are implanted by injection, it is highly likely that the cells will disappear when there is no medium (eg, scaffold) for cell growth, and it is ultimately difficult to see the induced effect of the injected cells.

Кроме того, аутологичная имплантация, при которой часть аутологической ткани изолируется, культивируется и размножается, имеет такие проблемы, как возможность рубцевания донорского участка и отсутствие донорского участка, когда участок для имплантации широк, и аллотрансплантат и ксенотрансплантат имеют такие проблемы, как иммунные реакции отторжения или индукция воспаления. Следовательно, существует потребность в разработке способа, способного заменить или регенерировать поврежденную кожу и минимизировать побочные эффекты, как описано выше.In addition, autologous implantation, in which a part of autologous tissue is isolated, cultured, and propagated, has problems such as scarring of the donor site and lack of a donor site when the implantation site is wide, and the allograft and xenograft have problems such as immune rejection reactions or inflammation induction. Therefore, there is a need to develop a method capable of replacing or regenerating damaged skin and minimizing the side effects as described above.

Документы предшествующего уровня техники Патентный документ Кореи №10-1710615.Prior Art Documents Korean Patent Document No. 10-1710615.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Техническая проблемаTechnical problem

Настоящее изобретение было создано при решении задачи предоставления композиции биочернил для листа для регенерации дермы, способного минимизировать реакцию отторжения имплантата и изготовления индивидуализированного для пациента листа для регенерации дермы, способа изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы с его использованием и листа регенерации дермы.The present invention has been made in response to the problem of providing a bioink composition for a dermal regeneration sheet capable of minimizing implant rejection and making a patient-specific dermis regeneration sheet, a method for manufacturing a customized dermis regeneration sheet using the same, and a dermis regeneration sheet.

Техническое решениеTechnical solution

Один из примеров осуществления настоящего изобретения обеспечивает композицию биочернил для листа для регенерации дермы, при этом композиция биочернил включает первую жидкость, содержащую стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани, внеклеточный матрикс и фибриноген; и вторую жидкость, содержащую тромбин.One embodiment of the present invention provides a bioink composition for a dermal regeneration sheet, wherein the bioink composition comprises a first fluid containing an adipose tissue-derived stromal-vascular fraction, extracellular matrix, and fibrinogen; and a second fluid containing thrombin.

Другой пример осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы, включающий: а) получение трехмерных данных участка дефекта дермы с использованием 3D-сканера; b) формирование первого слоя, соответствующего форме полученных трехмерных данных, с использованием первой жидкости, содержащей стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани, внеклеточный матрикс и фибриноген; с) формирование второго слоя путем нанесения второй жидкости, содержащей тромбин, на первый слой; и d) формирование листа для регенерации дермы, позволяя первому слою и второму слою взаимодействовать друг с другом.Another embodiment of the present invention provides a method for manufacturing a customized dermal regeneration sheet, comprising: a) obtaining 3D data of a dermal defect site using a 3D scanner; b) forming a first layer corresponding to the shape of the obtained three-dimensional data, using the first fluid containing stromal-vascular fraction obtained from adipose tissue, extracellular matrix and fibrinogen; c) forming a second layer by applying a second liquid containing thrombin to the first layer; and d) forming a sheet for regenerating the dermis, allowing the first layer and the second layer to interact with each other.

Еще один пример осуществления настоящего изобретения обеспечивает индивидуализированный лист для регенерации дермы, полученный с использованием указанного способа изготовления.Yet another embodiment of the present invention provides a customized dermal regeneration sheet obtained using said manufacturing method.

Преимущества изобретенияBenefits of the Invention

Композиция биочернил для листа для регенерации дермы согласно настоящему изобретению и способ изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы с его использованием имеют преимущество в том, что может быть изготовлен лист для регенерации дермы, подходящий для поврежденной ткани кожи пациента. В частности, способом изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы в соответствии с настоящим изобретением может изготавливать лист для регенерации дермы, имеющий форму, соответствующую пораженной области, с помощью трехмерного сканирования точной формы пораженной области.The bioink composition for a dermis regeneration sheet of the present invention and the method for manufacturing a customized dermis regeneration sheet using it are advantageous in that a dermis regeneration sheet suitable for a patient's damaged skin tissue can be produced. In particular, the method for manufacturing a customized dermis regeneration sheet according to the present invention can produce a dermis regeneration sheet having a shape corresponding to the affected area by scanning the exact shape of the affected area in 3D.

Лист для регенерации дермы согласно настоящему изобретению имеет преимущество в том, что имплантацию можно проводить без реакции иммунного отторжения, а также в том, что здоровые клетки могут быть имплантированы в пораженный участок, поскольку лист для регенерации дермы может быть изготовлен в пределах короткого промежутка времени.The dermal regeneration sheet of the present invention has the advantage that implantation can be carried out without immune rejection, and that healthy cells can be implanted in the affected area, since the dermal regeneration sheet can be produced within a short time.

Описание чертежейDescription of drawings

На фиг. 1 показан способ соответственно изготовления первой жидкости и второй жидкости для изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы в соответствии с настоящим изобретением.In FIG. 1 shows a method for making a first fluid and a second fluid, respectively, for making a customized dermis regeneration sheet in accordance with the present invention.

На фиг. 2 показаны фотографии, подтверждающие жизнеспособность клеток индивидуализированного листа для регенерации дермы в соответствии с экспериментальным примером 1.In FIG. 2 shows photographs confirming cell viability of the individualized dermal regeneration leaf according to Experimental Example 1.

На фиг. 3 показана фотография, на которой кожа удалена в эксперименте на животных для экспериментального примера 2.In FIG. 3 shows a photograph in which the skin is removed in the animal experiment for Experimental Example 2.

На фиг. 4 показан контроль, полученный в соответствии с экспериментальным примером 2, и индивидуализированный лист для регенерации дермы согласно этому примеру.In FIG. 4 shows the control obtained according to Experimental Example 2 and the individualized dermal regeneration sheet according to this example.

На фиг. 5 показан прогресс имплантированных индивидуализированных листов для регенерации дермы в соответствии с экспериментальным примером 2.In FIG. 5 shows the progress of implanted individualized dermal regeneration sheets according to Experimental Example 2.

На фиг. 6 показаны результаты окрашивания трихромом Массона в эксперименте на животных в соответствии с экспериментальным примером 2.In FIG. 6 shows the results of Masson's trichrome staining in an animal experiment according to Experimental Example 2.

На фиг. 7 показано наличие или отсутствие ангиогенеза в месте имплантации в результате эксперимента на животных в соответствии с экспериментальным примером 2 с использованием окрашивания CD31.In FIG. 7 shows the presence or absence of angiogenesis at the implantation site as a result of the animal experiment according to Experimental Example 2 using CD31 staining.

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

Когда в настоящем описании один элемент расположен «на» другом элементе, это включает не только случай, когда один элемент приводится в контакт с другим элементом, но также случай, когда еще один элемент присутствует между двумя элементами.When in the present description one element is located "on" another element, this includes not only the case when one element is brought into contact with another element, but also the case when another element is present between two elements.

Когда одна часть «включает» один составной элемент в настоящем описании, если иное специально не описано, это не означает, что другой составной элемент исключен, но означает, что еще один составной элемент может быть дополнительно включен.When one part "includes" one constituent element in the present description, unless otherwise specifically described, this does not mean that another constituent element is excluded, but means that one more constituent element may be additionally included.

Далее настоящее изобретение далее будет описано подробно.Hereinafter, the present invention will now be described in detail.

Композиция биочернил для листа для регенерации дермы в соответствии с настоящим изобретением является двухжидкостной, и первая жидкость и вторая жидкость могут наноситься последовательно, а затем вступать в реакцию с образованием листа для регенерации дермы. В частности, тромбин во второй жидкости может реагировать с фибриногеном в первой жидкости с образованием фибриновой сети, которая может служить для достаточной фиксации стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, и внеклеточного матрикса.The bioink composition for the dermis regeneration sheet according to the present invention is bi-liquid, and the first liquid and the second liquid can be applied sequentially and then react to form the dermis regeneration sheet. In particular, thrombin in the second fluid can react with fibrinogen in the first fluid to form a fibrin network that can serve to adequately anchor the adipose tissue-derived stromal-vascular fraction and the extracellular matrix.

Стромально-васкулярная фракция жировой ткани включает стволовые клетки, полученные из жировой ткани. Предпочтительно, стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может по существу не включать клетки (например, адипоциты, эритроциты, другие стромальные клетки и т.п.), кроме стволовых клеток, полученных из жировой ткани, и материалов внеклеточного матрикса, и, более предпочтительно, может полностью не включать другие клетки и материалы внеклеточного матрикса.The stromal vascular fraction of adipose tissue includes stem cells derived from adipose tissue. Preferably, the adipose tissue-derived stromal-vascular fraction may be substantially free of cells (e.g., adipocytes, erythrocytes, other stromal cells, etc.) other than adipose tissue-derived stem cells and extracellular matrix materials, and , more preferably, may be entirely devoid of other cells and extracellular matrix materials.

Стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может быть выделена из жировой ткани аллогенного животного или гетерологичного животного. Предпочтительно, стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может быть выделена из аутологичной жировой ткани. Более конкретно, стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может быть выделена с использованием жировой ткани пациента или животного, подлежащего лечению. Стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может быть получена путем выделения стромально-васкулярной фракции жировой ткани (SVF), внеклеточного матрикса (ЕСМ) и т.п. в форме микро- или нанокластера SVF/ECM из жировой ткани, а также чистые стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани (SVF), и внеклеточный матрикс (ЕСМ) также можно отделить друг от друга и использовать. Например, стромальная сосудистая фракция, полученная из жировой ткани, может быть выделена из жировой ткани с использованием набора Lipocell от Tiss'you. Однако настоящее изобретение не ограничивается этим, и стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может быть получена с использованием способа, набора для экстракции и тому подобного, известных в данной области.The adipose tissue-derived stromal vascular fraction may be isolated from the adipose tissue of an allogeneic animal or a heterologous animal. Preferably, the adipose-derived stromal vascular fraction may be isolated from autologous adipose tissue. More specifically, the adipose tissue-derived stromal vascular fraction can be isolated using the adipose tissue of the patient or animal to be treated. The adipose tissue-derived stromal vascular fraction can be obtained by isolating adipose tissue stromal vascular fraction (SVF), extracellular matrix (ECM), and the like. in the form of a micro- or nanocluster of SVF/ECM from adipose tissue, as well as pure adipose-derived stromal-vascular fraction (SVF) and extracellular matrix (ECM) can also be separated from each other and used. For example, adipose-derived stromal vascular fraction can be isolated from adipose tissue using Tiss'you's Lipocell Kit. However, the present invention is not limited to this, and a stromal vascular fraction obtained from adipose tissue can be obtained using a method, an extraction kit, and the like known in the art.

Согласно иллюстративному варианту осуществления настоящего изобретения концентрация стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, в первой жидкости может составлять от 10⁵ клеток/мл до 10⁷ клеток/мл. Когда концентрация стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, находится в пределах описанного выше диапазона, изготавливаемый индивидуализированный лист для регенерации дермы может эффективно дифференцировать стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани, в клетки дермы в месте имплантации.According to an exemplary embodiment of the present invention, the concentration of the adipose-derived stromal vascular fraction in the first fluid may be from 10 ⁵ cells/ml to 10 ⁷ cells/ml. When the concentration of the adipose tissue-derived stromal-vascular fraction is within the range described above, the individualized dermal regeneration sheet can be produced effectively to differentiate the adipose-derived stromal-vascular fraction into dermal cells at the implantation site.

Чем выше содержание стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, тем сильнее эффект, но когда ее содержание чрезвычайно велико, эффект может быть менее выражен из-за влияния внеклеточного матрикса, фибриногена и т.п. Следовательно, содержание стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, может уравновешивать содержание других компонентов в первой жидкости.The higher the content of stromal-vascular fraction derived from adipose tissue, the stronger the effect, but when its content is extremely high, the effect may be less pronounced due to the influence of extracellular matrix, fibrinogen, etc. Therefore, the content of the adipose-derived stromal-vascular fraction can balance the content of other components in the first fluid.

Стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может использоваться с внеклеточным матриксом, полученным из жировой ткани, для стимулирования дифференцировки в клетки дермы. В частности, внеклеточный матрикс, полученный из жировой ткани, имеет биохимические факторы, необходимые для роста и дифференцировки клеток, необходимых для заживления раны в пораженной области, и может обеспечивать физическую среду, в которой стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может дифференцироваться в клетки дермы и способствовать заживлению раны.The adipose-derived stromal-vascular fraction can be used with an adipose-derived extracellular matrix to stimulate differentiation into dermal cells. In particular, the adipose-derived extracellular matrix has the biochemical factors necessary for the growth and differentiation of cells necessary for wound healing in the affected area and can provide a physical environment in which the adipose-derived stromal-vascular fraction can differentiate. into the cells of the dermis and promote wound healing.

Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения внеклеточный матрикс может быть выделен из жировой ткани (или клеток) аллогенного или гетерологичного животного. Более того, внеклеточный матрикс может быть выделен из фиброзной ткани (или клеток) аллогенного или гетерологичного животного. В частности, внеклеточный матрикс может быть выделен из аутологичной жировой ткани (или клеток) или аутологичной фиброзной ткани (или клеток). Более конкретно, внеклеточный матрикс может быть выделен с использованием адипоцитов пациента или животного, подлежащего лечению.According to one embodiment of the present invention, the extracellular matrix can be isolated from adipose tissue (or cells) of an allogeneic or heterologous animal. Moreover, the extracellular matrix can be isolated from fibrous tissue (or cells) of an allogeneic or heterologous animal. In particular, the extracellular matrix can be isolated from autologous adipose tissue (or cells) or autologous fibrous tissue (or cells). More specifically, the extracellular matrix can be isolated using adipocytes from the patient or animal being treated.

Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения внеклеточный матрикс может быть очищен от клеток.According to one embodiment of the present invention, the extracellular matrix can be purified from cells.

Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения внеклеточный матрикс может представлять собой частицы, имеющие диаметр от 5 мкм до 100 мкм. В частности, внеклеточный матрикс можно очистить от клеток и измельчить физическим способом и приготовить в форме частиц. Кроме того, внеклеточный матрикс может быть получен с использованием способов, известных в данной области.According to one embodiment of the present invention, the extracellular matrix may be particles having a diameter of 5 µm to 100 µm. In particular, the extracellular matrix can be purified from cells and physically crushed and prepared in the form of particles. In addition, the extracellular matrix can be obtained using methods known in this field.

Фибриновый матрикс посредством реакции фибриногена первой жидкости и тромбина второй жидкости может служить для фиксации стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, и внеклеточного матрикса.The fibrin matrix, through the reaction of the fibrinogen of the first fluid and the thrombin of the second fluid, can serve to fix the adipose tissue-derived stromal-vascular fraction and the extracellular matrix.

Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения содержание внеклеточного матрикса в первой жидкости может составлять от 20 до 60 мас. %. В частности, содержание внеклеточного матрикса в первой жидкости может составлять от 20 до 50 мас. %. Когда содержание внеклеточного матрикса находится в пределах указанного выше диапазона, жизнеспособность клеток, дифференцирующихся в клетки дермы, может быть улучшена для эффективного достижения регенерации участка дефекта дермы. Когда содержание внеклеточного матрикса слишком велико, содержание фибриногена и тромбина для изготовления листа для регенерации дермы относительно снижено, так что может возникнуть проблема, состоящая в том, что трудно поддерживать форму полученного листа для регенерации дермы. Кроме того, когда содержание внеклеточного матрикса слишком низкое, содержание фибриногена и тромбина для изготовления листа для регенерации дермы сильно увеличивается, и в результате изготовленный лист для регенерации дермы становится слишком твердым, так что может возникнуть проблема, состоящая в том, что трудно ожидать эффекта, обусловленного внеклеточным матриксом. Следовательно, предпочтительно повышать жизнеспособность клеток, дифференцирующихся в клетки дермы, путем регулирования содержания внеклеточного матрикса до указанного выше диапазона и, кроме того, для облегчения сохранения формы листа для регенерации дермы.According to one of the embodiments of the present invention, the content of the extracellular matrix in the first liquid can be from 20 to 60 wt. %. In particular, the content of the extracellular matrix in the first liquid may be from 20 to 50 wt. %. When the content of the extracellular matrix is within the above range, the viability of cells differentiating into dermal cells can be improved to effectively achieve regeneration of the dermal defect site. When the content of the extracellular matrix is too high, the content of fibrinogen and thrombin for making the dermis regeneration sheet is relatively reduced, so that there may be a problem that it is difficult to maintain the shape of the resulting dermis regeneration sheet. In addition, when the content of the extracellular matrix is too low, the content of fibrinogen and thrombin for making the dermis regeneration sheet is greatly increased, and as a result, the manufactured derma regeneration sheet becomes too hard, so that there may be a problem that it is difficult to expect an effect, provided by the extracellular matrix. Therefore, it is preferable to improve the viability of cells differentiated into dermal cells by adjusting the content of the extracellular matrix to the above range, and furthermore, to facilitate maintaining the shape of the dermal regeneration sheet.

Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения концентрация фибриногена в первой жидкости может составлять 4-50 мг/мл. Кроме того, концентрация фибриногена в первой жидкости может составлять 5-40 мг/мл или 7-30 мг/мл.According to one embodiment of the present invention, the concentration of fibrinogen in the first fluid may be 4-50 mg/ml. In addition, the concentration of fibrinogen in the first fluid may be 5-40 mg/ml or 7-30 mg/ml.

Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения концентрация тромбина во второй жидкости может составлять 30-250 МЕ/мл. Кроме того, концентрация тромбина во второй жидкости может составлять 40-250 МЕ/мл, 40-100 МЕ/мл или 45-80 МЕ/мл.According to one embodiment of the present invention, the concentration of thrombin in the second fluid may be 30-250 IU/ml. In addition, the concentration of thrombin in the second fluid may be 40-250 IU/ml, 40-100 IU/ml or 45-80 IU/ml.

Когда концентрация фибриногена и тромбина находится в пределах вышеуказанных диапазонов, скорость отверждения может быть обеспечена надлежащим образом и может поддерживаться равномерное распределение стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани. Посредством этого может поддерживаться равномерное распределение клеток в индивидуализированном листе для регенерации дермы, который будет изготовлен, и может быть эффективно реализована способность клеток к дифференцировке после имплантации индивидуализированного листа для регенерации дермы. Более того, когда концентрации фибриногена и фибриногена ае находятся в пределах вышеуказанных диапазонов, это обеспечивает преимущества, заключающиеся в том, что форма изготовленного листа для регенерации дермы может сохраняться в хорошем состоянии, и лист может быть соответствующим образом имплантирован в пораженный участок, поддерживая соответствующую твердость.When the concentration of fibrinogen and thrombin is within the above ranges, the curing speed can be properly secured and uniform distribution of the adipose tissue-derived stromal-vascular fraction can be maintained. By this, a uniform distribution of cells in the individualized dermal regeneration sheet to be produced can be maintained, and the ability of cells to differentiate after the implantation of the individualized dermis regeneration sheet can be efficiently realized. Moreover, when the concentrations of fibrinogen and fibrinogen ae are within the above ranges, it provides the advantages that the shape of the manufactured dermis regeneration sheet can be maintained in good condition, and the sheet can be appropriately implanted in the lesion while maintaining appropriate hardness. .

Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения первая жидкость может дополнительно включать апротинин. Апротинин является ингибитором протеолитических ферментов, секретируемых поджелудочной железой, и представляет собой полипептид, состоящий в общей сложности из 58 аминокислот. Апротинин обычно получают из легких крупного рогатого скота и, как известно, обладает кровоостанавливающим действием, подавляя разложение фибрина в крови.According to one embodiment of the present invention, the first liquid may further include aprotinin. Aprotinin is an inhibitor of proteolytic enzymes secreted by the pancreas and is a polypeptide consisting of a total of 58 amino acids. Aprotinin is usually obtained from the lungs of cattle and is known to have a hemostatic effect by inhibiting the breakdown of fibrin in the blood.

Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения апротинин может быть включен в количестве от 900 кининоген инактивирующих единиц (KIU) до 1,1000 KIU, в частности 1,000 KIU, на мл первой жидкости.According to one embodiment of the present invention, aprotinin may be included in an amount of from 900 kininogen inactivating units (KIU) to 1,1000 KIU, in particular 1,000 KIU, per ml of the first liquid.

Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения вторая жидкость может представлять собой тромбин, растворенный в растворе хлорида кальция. В частности, вторая жидкость может включать от 40 до 250 ME тромбина и от 5 до 6,5 мг хлорида кальция на мл второй жидкости.According to one embodiment of the present invention, the second liquid may be thrombin dissolved in a calcium chloride solution. In particular, the second liquid may include from 40 to 250 IU of thrombin and from 5 to 6.5 mg of calcium chloride per ml of the second liquid.

Растворителем первой жидкости и второй жидкости может быть вода, в частности физиологический раствор. Кроме того, фибриноген в первой жидкости и тромбин во второй жидкости могут быть получены с помощью коммерчески доступного набора фибринового клея.The solvent of the first liquid and the second liquid may be water, in particular physiological saline. In addition, fibrinogen in the first fluid and thrombin in the second fluid can be obtained using a commercially available fibrin glue kit.

Поскольку реакция первой жидкости и второй жидкости завершается в течение 10 минут, предпочтительно в течение 5 минут, композиция биочернил для листа для регенерации дермы имеет преимущество в том, что лист для регенерации дермы может быть немедленно изготовлен с использованием 3D-принтера в месте лечения.Since the reaction of the first liquid and the second liquid is completed within 10 minutes, preferably within 5 minutes, the bioink composition for the dermis regeneration sheet has the advantage that the dermis regeneration sheet can be immediately produced using a 3D printer at the treatment site.

В настоящем изобретении в качестве адгезива используется фибриновый клей, включающий фибриноген и тромбин, который может обеспечить более высокую вязкость, чем вязкость адгезива на основе гиалуроновой кислоты или коллагенового адгезива, так что индивидуализированный лист для регенерации дермы имеет превосходную силу связывания с пораженной областью, и, кроме того, может сохранять высокую прочность.In the present invention, a fibrin adhesive including fibrinogen and thrombin is used as an adhesive, which can provide a higher viscosity than that of a hyaluronic acid adhesive or a collagen adhesive, so that the customized dermis regeneration sheet has excellent bonding strength to the affected area, and, in addition, it can maintain high strength.

Другой пример осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы, включающий: а) получение трехмерных данных участка дефекта дермы с использованием 3D-сканера; b) формирование первого слоя, соответствующего форме полученных трехмерных данных, с использованием первой жидкости, содержащей стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани, внеклеточный матрикс и фибриноген; с) формирование второго слоя путем нанесения второй жидкости, содержащей тромбин, на первый слой; и d) формирование листа для регенерации дермы путем обеспечения взаимодействия первого слоя со вторым слоем.Another embodiment of the present invention provides a method for manufacturing a customized dermal regeneration sheet, comprising: a) obtaining 3D data of a dermal defect site using a 3D scanner; b) forming a first layer corresponding to the shape of the obtained three-dimensional data, using the first fluid containing stromal-vascular fraction obtained from adipose tissue, extracellular matrix and fibrinogen; c) forming a second layer by applying a second liquid containing thrombin to the first layer; and d) forming a dermal regeneration sheet by allowing the first layer to interact with the second layer.

Кроме того, согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, способ дополнительно включает: этап a1) изготовление формы, соответствующей форме трехмерных данных, полученных с использованием 3D-принтера, где на этапе b) первая жидкость наносится в форму.In addition, according to one embodiment of the present invention, the method further includes: step a1) making a mold corresponding to the shape of the 3D data obtained using a 3D printer, where in step b) the first liquid is applied to the mold.

На этапе а) может быть использовано оборудование для 3D-сканирования или оборудование для 3D-печати, известное в данной области техники. Кроме того, на этапе a1) может быть использовано оборудование для 3D-печати, известное в данной области техники. Форма может служить для фиксации трехмерной формы при нанесении первой и второй жидкости. Форму можно удалить после формирования индивидуализированного листа для регенерации дермы. Форма может быть сформирована с использованием биосовместимого полимера, обычно используемого в данной области.In step a), 3D scanning equipment or 3D printing equipment known in the art may be used. In addition, in step a1), 3D printing equipment known in the art can be used. The shape may serve to fix the three-dimensional shape when the first and second liquids are applied. The mold can be removed after the individualized dermal regeneration sheet has been formed. The shape can be formed using a biocompatible polymer commonly used in the art.

Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения этапы b) и с) могут выполняться с использованием струйной печати или 3D-печати. В частности, на этапах b) и с) может использоваться печатающее устройство, имеющее два или более сопел, известное в данной области техники, и трехмерная форма может быть создана путем выпуска первой жидкости и второй жидкости из соответствующих сопел. Кроме того, когда формируется первый слой, равномерное распределение клеток может быть получено с использованием 3D-принтера или струйного принтера, тем самым предотвращая явление агрегации клеток и т.п. в индивидуализированном листе для регенерации дермы.According to one embodiment of the present invention, steps b) and c) can be performed using inkjet printing or 3D printing. In particular, in steps b) and c) a printer having two or more nozzles known in the art may be used, and a three-dimensional shape may be created by discharging the first liquid and the second liquid from the respective nozzles. In addition, when the first layer is formed, a uniform distribution of cells can be obtained using a 3D printer or an inkjet printer, thereby preventing cell aggregation phenomena and the like. in an individualized sheet for the regeneration of the dermis.

Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения этапы b) и с) могут повторяться поочередно. В частности, когда необходимо сформировать лист для регенерации дермы большого объема, этапы b) и с) поочередно выполняются для ламинирования слоев, а именно: "первый слой / второй слой / первый слой / второй слой", и затем слои могут быть коагулированы, чтобы сформировать каркас для регенерации хряща.According to one embodiment of the present invention, steps b) and c) may be repeated alternately. In particular, when it is necessary to form a large volume dermis regeneration sheet, steps b) and c) are alternately performed to laminate the layers, namely "first layer / second layer / first layer / second layer", and then the layers can be coagulated to form a scaffold for cartilage regeneration.

Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения этап d) может быть завершен в течение 10 минут, предпочтительно в течение 5 минут. В частности, на этапе d) реакция может проводиться в течение от 3 до 7 минут, и первый слой и второй слой могут вступать в реакцию с образованием индивидуализированного листа для регенерации дермы.According to one embodiment of the present invention, step d) can be completed within 10 minutes, preferably within 5 minutes. In particular, in step d), the reaction may be carried out for 3 to 7 minutes, and the first layer and the second layer may react to form an individualized dermal regeneration sheet.

В способе изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы согласно настоящему изобретению стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, и внеклеточный матрикс могут быть выделены из жировой ткани пациента или животного и получены без отдельной стадии культивирования. После того, как первая жидкость приготовлена с использованием того же самого, индивидуализированный лист для регенерации дермы может быть изготовлен в течение короткого периода времени и имплантирован в пораженный участок, так что активность клеток может быть максимальной.In the method for manufacturing an individualized dermal regeneration sheet according to the present invention, the adipose-derived stromal-vascular fraction and the extracellular matrix can be isolated from the adipose tissue of a patient or animal and obtained without a separate culture step. After the first fluid is prepared using the same, an individualized dermal regeneration sheet can be made within a short period of time and implanted in the affected area so that cell activity can be maximized.

Кроме того, поскольку лист для регенерации дермы может быть изготовлен такой же формы, как и форма пораженной области, с помощью способа изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы, естественное состояние после восстановления может быть реализовано путем минимизации зазора между местом имплантации и листом регенерации дермы.In addition, since the dermis regeneration sheet can be made in the same shape as the affected area by the method of manufacturing the customized dermis regeneration sheet, the natural state after restoration can be realized by minimizing the gap between the implantation site and the dermis regeneration sheet.

Еще один пример осуществления настоящего изобретения обеспечивает индивидуализированный лист для регенерации дермы, изготовленный с использованием указанного способа изготовления.Another embodiment of the present invention provides a customized dermal regeneration sheet manufactured using said manufacturing method.

Как описано выше, индивидуализированный лист для регенерации дермы может быть имплантирован после изготовления в форме, подходящей для пораженной области, в течение короткого периода времени с использованием жировой ткани пациента или животного. Может быть запланировано восстановление поврежденной кожи путем имплантации регенерирующего слоя дермы в пораженный участок и защиты пораженного участка повязкой. После имплантации индивидуализированного листа регенерации дермы, стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, дифференцируется в клетки дермы; дифференцированные клетки дермы могут быть зафиксированы во внеклеточном матриксе, полученном из жировой ткани, и фибриновом матриксе для восстановления поврежденной кожи.As described above, the individualized dermal regeneration sheet can be implanted after being manufactured in a shape suitable for the affected area within a short period of time using the patient's or animal's adipose tissue. Repair of damaged skin may be planned by implanting a regenerating dermis layer into the affected area and protecting the affected area with a dressing. After implantation of the individualized dermal regeneration sheet, the adipose-derived stromal-vascular fraction differentiates into dermal cells; differentiated dermal cells can be fixed in adipose-derived extracellular matrix and fibrin matrix to repair damaged skin.

Далее настоящее изобретение будет описано подробно со ссылкой на примеры для конкретного описания настоящего изобретения. Однако примеры согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы в различные формы, и не следует понимать, что объем настоящего изобретения ограничен примерами, которые будут описаны ниже. Примеры настоящего описания предоставлены для более полного объяснения настоящего изобретения специалистам в данной области техники.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples for a specific description of the present invention. However, the examples according to the present invention may be modified into various forms, and it should not be understood that the scope of the present invention is limited to the examples to be described below. The examples of the present description are provided to more fully explain the present invention to those skilled in the art.

Стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани (SVF) Клетки стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани (SVF), получали с помощью следующих этапов.Adipose Derived Stromal Vascular Fraction (SVF) Adipose derived stromal vascular fraction (SVF) cells were obtained by the following steps.

1. Приблизительно 60 см³ жировой ткани выделяли путем липосакции под руководством врача в стерильной операционной, добавляли в том же объеме 0,075% коллагеназы к ткани, и полученная смесь вступала в реакцию путем инкубации при встряхивании при 230 об/мин при температуре 37°С в течение 30 минут.1. Approximately 60 cm ³ of adipose tissue was isolated by liposuction under the guidance of a physician in a sterile operating room, 0.075% collagenase was added to the tissue in the same volume, and the resulting mixture was reacted by incubation with shaking at 230 rpm at a temperature of 37 ° C in within 30 minutes.

2. После описанной выше реакции продукт реакции центрифугировали со скоростью 420 g (относительная центробежная сила (RCF)) при 25°С в течение 10 минут, и в результате центрифугирования продукт реакции разделяли на три слоя гранул SVF, слой коллагеназы и масляный слой.2. After the above reaction, the reaction product was centrifuged at 420 g (relative centrifugal force (RCF)) at 25° C. for 10 minutes, and the reaction product was separated into three layers of SVF beads, a collagenase layer, and an oil layer by centrifugation.

3. После удаления верхнего раствора за исключением слоя гранул SVF и ресуспендирования слоя гранул SVF в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), волокнистые материалы и оставшиеся примеси ресуспендированного слоя SVF были удалены с использованием 100 мкм нейлонового фильтра (сетчатый фильтр).3. After removing the top solution except for the layer of SVF beads and resuspending the layer of SVF beads in phosphate buffered saline (PBS), fibrous materials and remaining impurities of the resuspended SVF layer were removed using a 100 µm nylon filter (mesh filter).

4. После ресуспендирования раствора, содержащего отфильтрованный SVF, и трехкратного центрифугирования все оставшиеся материалы были удалены за исключением осадка в нижнем слое, и затем в результате подсчета ядерных клеток с использованием счетчика клеток можно было подтвердить, что было получено от 0,26×10⁶ до 2,2×10⁶ клеток SVF.4. After resuspension of the solution containing the filtered SVF and centrifugation three times, all the remaining materials were removed except for the sediment in the lower layer, and then, as a result of counting nucleated cells using a cell counter, it could be confirmed that it was obtained from 0.26×10 ⁶ up to 2.2×10 ⁶ SVF cells.

Внеклеточный матрикс (ЕСМ)Extracellular matrix (ECM)

После того, как жировая ткань была выделена путем липосакции под руководством врача в стерильной операционной, жировая ткань была смешана с физиологическим раствором. Кроме того, после механического выделения ЕСМ из жировой ткани с использованием гомогенизатора в условиях 12000-20000 об/мин выделенный ЕСМ центрифугировали. После центрифугирования осадка процесс центрифугирования повторяли 3-5 раз, в конечном итоге получали ЕСМ.After the adipose tissue was isolated by physician-guided liposuction in a sterile operating room, the adipose tissue was mixed with saline. In addition, after mechanical isolation of ECM from adipose tissue using a homogenizer at 12,000-20,000 rpm, the isolated ECM was centrifuged. After centrifugation of the pellet, the centrifugation process was repeated 3-5 times, eventually obtaining ECM.

Экспериментальный пример 1 эксперимент in vitro для подтверждения жизнеспособности клеток в индивидуализированном листе для регенерации дермыExperimental Example 1 in vitro experiment to confirm cell viability in an individualized sheet for dermis regeneration

На фиг. 1 показан способ соответственно получения первой жидкости и второй жидкости для изготовления индивидуализированного листа для регенерации дермы в соответствии с настоящим изобретением. В частности, после того как полученные SVF и ЕСМ были смешаны с использованием шприца для смешивания, первая жидкость была приготовлена путем смешивания 1 мл жидкости апротинина, в которой 4,5 мг/мл фибриногена были смешаны со смесью SVF/ECM с использованием шприца для смешивания. В этом случае содержание ЕСМ в первой жидкости было доведено до 10-20 мас.%, как показано на фиг. 2.In FIG. 1 shows a method for preparing a first liquid and a second liquid, respectively, for making a customized dermis regeneration sheet in accordance with the present invention. Specifically, after the resulting SVF and ECM were mixed using a mixing syringe, the first liquid was prepared by mixing 1 ml of Aprotinin liquid in which 4.5 mg/ml of fibrinogen was mixed with the SVF/ECM mixture using a mixing syringe. . In this case, the content of ECM in the first liquid was adjusted to 10-20% by weight, as shown in FIG. 2.

Далее был приготовлен раствор хлорида кальция, в котором был растворен тромбин, имеющий тот же объем, что и приготовленная первая жидкость. В этом случае концентрация тромбина во второй жидкости была доведена до 7,8-250 МЕ/мл как показано на фиг. 2.Next, a solution of calcium chloride was prepared, in which thrombin was dissolved, having the same volume as the prepared first liquid. In this case, the thrombin concentration in the second fluid was adjusted to 7.8-250 IU/ml as shown in FIG. 2.

После того, как первый слой был сформирован путем нанесения полученной первой жидкости, был изготовлен индивидуализированный лист для регенерации дермы путем нанесения полученной второй жидкости на первый слой.After the first layer was formed by applying the obtained first liquid, a customized dermal regeneration sheet was made by applying the obtained second liquid to the first layer.

На фиг. 2 показаны фотографии, подтверждающие жизнеспособность клеток индивидуализированного листа для регенерации дермы в соответствии с экспериментальным примером 1. В частности, на фиг. 2 подтверждена жизнеспособность клеток индивидуализированного листа для регенерации дермы с использованием конфокального микроскопа (Leica, TCS SP5) после окрашивания зеленым флуоресцентным кальцеином-АМ для подтверждения наличия живых клеток и окрашивания красным флуоресцентным гомодимером-1 этидия для подтверждения того, что плазматическая мембрана была потеряна. Согласно фиг. 2, когда содержание ЕСМ составляло 20 мас. %, взаимодействие между SVF и ЕСМ было улучшенным, так что была активирована пролиферация клеток, и также, когда концентрация тромбина составляла 50 МЕ/мл или более, это могло подтверждать, что пролиферация клеток дополнительно активируется.In FIG. 2 shows photographs confirming cell viability of the individualized dermal regeneration sheet according to Experimental Example 1. In particular, FIG. 2, cell viability of an individualized dermal regeneration sheet using a confocal microscope (Leica, TCS SP5) is confirmed after staining with green fluorescent calcein-AM to confirm the presence of live cells and staining with red fluorescent ethidium homodimer-1 to confirm that the plasma membrane has been lost. According to FIG. 2 when the ECM content was 20 wt. %, the interaction between SVF and ECM was improved so that cell proliferation was activated, and also when the thrombin concentration was 50 IU/ml or more, it could confirm that cell proliferation was further activated.

Экспериментальный пример 2 эксперимент на животных (эксперимент in vivo) для подтверждения эффективности индивидуализированного листа для регенерации дермыExperimental Example 2 Animal experiment (in vivo experiment) to confirm the effectiveness of the individualized sheet for regenerating the dermis

Чтобы проверить эффективность листа для регенерации дермы в соответствии с настоящим изобретением, был удален кусок кожи четырехмесячной свиньи размером 2,5×2,5 см, а затем были получены SVF и ЕСМ из жировой ткани свиньи таким же образом, как описано выше. На фиг. 3 показана фотография, на которой кожа удалена в эксперименте на животных для экспериментального примера 2.To test the efficacy of the dermal regeneration sheet according to the present invention, a 2.5×2.5 cm piece of 4-month-old pig skin was removed, and then SVF and ECM were obtained from porcine adipose tissue in the same manner as described above. In FIG. 3 shows a photograph in which the skin is removed in the animal experiment for Experimental Example 2.

Далее, после того как полученные SVF и ЕСМ были смешаны с использованием шприца для смешивания, первая жидкость была приготовлена путем смешивания 1 мл жидкости апротинина, в которой 9 мг/мл фибриногена были смешаны со смесью SVF/ECM с использованием шприца для смешивания. В этом случае содержание ЕСМ в первой жидкости составляло 20 мас.%, а концентрация SVF составляла 6,25×10⁶ клеток/мл. Далее была приготовлена вторая жидкость, содержащая тромбин в концентрации 50 МЕ/мл.Further, after the resulting SVF and ECM were mixed using a mixing syringe, the first liquid was prepared by mixing 1 ml of Aprotinin liquid in which 9 mg/ml of fibrinogen was mixed with the SVF/ECM mixture using a mixing syringe. In this case, the ECM content of the first liquid was 20% by weight and the SVF concentration was 6.25×10 ⁶ cells/ml. Next, a second liquid was prepared containing thrombin at a concentration of 50 IU/ml.

Более того, после сканирования удаленной области кожи с помощью 3D-сканера подготовленная первая жидкость и вторая жидкость были последовательно нанесены с использованием 3D-принтера 3D Bio (INVIVO, ROKIT), а затем изготовлен индивидуализированный лист для регенерации дермы путем отверждения первой жидкости и второй жидкости в течение 5 минут. После того как лист для регенерации дермы, изготовленный, как описано выше, был имплантирован в область удаленной кожи и подвергнут обработке повязкой, степень восстановления кожи наблюдалась в течение 14 дней.Moreover, after scanning the removed skin area with a 3D scanner, the prepared first fluid and second fluid were successively applied using a 3D Bio 3D printer (INVIVO, ROKIT), and then a customized dermis regeneration sheet was made by curing the first fluid and the second fluid. within 5 minutes. After the dermal regeneration sheet prepared as described above was implanted in the area of the removed skin and subjected to dressing treatment, the degree of skin regeneration was observed for 14 days.

В качестве контроля индивидуализированный лист для регенерации дермы был изготовлен таким же образом, как описано выше, но без включения ЕСМ в первую жидкость, и имплантирован в удаленный участок кожи и подвергнут обработке повязкой, а затем наблюдали степень восстановления кожи в течение 14 дней.As a control, an individualized dermal regeneration sheet was made in the same manner as described above but without ECM in the first liquid, and implanted in the removed skin area and treated with a dressing, and then the degree of skin regeneration was observed for 14 days.

На фиг. 5 показан прогресс имплантированных индивидуализированных листов для регенерации дермы в соответствии с экспериментальным примером 2. В частности, фиг. 5 показаны фотографии, на которых имплантированы индивидуализированные листы регенерации дермы в соответствии с контролем (только SVF) и примером (SVF+ЕСМ), и показан прогресс от даты имплантации (0 дней) до 14 дня после имплантации.In FIG. 5 shows the progress of implanted individualized dermal regeneration sheets according to Experimental Example 2. In particular, FIG. 5 shows photographs implanting individualized dermal regeneration sheets according to control (SVF only) and example (SVF+ECM) and shows the progress from the date of implantation (day 0) to day 14 post-implantation.

На фиг. 6 показаны результаты окрашивания трихромом Массона в эксперименте на животных в соответствии с экспериментальным примером 2. В частности, на фиг. 6 показана область неповрежденной кожи (нормальной), область удаленной кожи (только дефект) и область (SVF+ЕСМ), в которой индивидуализированный лист для регенерации дермы в соответствии с примером имплантирован в область удаленного кожного покрова, которая была окрашена трихромом Массона и наблюдалась через 14 дней после удаления кожи. Согласно фиг. 6, можно подтвердить, что, когда кожу удаляют, а затем оставляют на 14 дней (только дефект), в дерме образуется коллагеновый комплекс с очень низкой концентрацией. Напротив, можно подтвердить, что при имплантации индивидуализированного листа для регенерации дермы согласно примеру (SVF+ЕСМ) дерма четко окрашивается в синий цвет, что говорит о том, что в дерме образуется комплекс коллагена с высокой плотностью, и также подтверждает, что дерма четко окрашена в красный цвет, что говорит об образовании кератина, который является составным компонентом эпидермиса, цитоплазмы и т.п.In FIG. 6 shows the results of Masson's trichrome staining in an animal experiment according to Experimental Example 2. In particular, FIG. 6 shows the area of intact skin (normal), the area of skin ablation (defect only) and the area (SVF+ECM) in which the individualized dermal regeneration sheet according to the example is implanted in the area of dermal removal that was stained with Masson's trichrome and observed through 14 days after skin removal. According to FIG. 6, it can be confirmed that when the skin is removed and then left for 14 days (defect only), a very low concentration collagen complex is formed in the dermis. On the contrary, it can be confirmed that when the individualized dermis regeneration sheet according to Example (SVF+ECM) is implanted, the dermis is clearly stained blue, indicating that a high-density collagen complex is formed in the dermis, and also confirms that the dermis is clearly stained. in red color, which indicates the formation of keratin, which is an integral component of the epidermis, cytoplasm, etc.

На фиг. 7 показано наличие или отсутствие ангиогенеза в месте имплантации в результате эксперимента на животных в соответствии с экспериментальным примером 2 с использованием окрашивания CD31. В частности, на фиг. 7 наблюдают, регенерируются ли кровеносные сосуды путем окрашивания CD31 на каждой из областей неповрежденной кожи (нормальной), удаленной кожи (только дефект) и области (SVF+ЕСМ), в которой индивидуализированный лист для регенерации дермы согласно примеру имплантируют в удаленную область через 14 дней после удаления кожи. Согласно фиг. 7, можно подтвердить, что, когда кожу удаляют, а затем оставляют на 14 дней (только дефект), ангиогенные области, окрашенные в коричневый цвет, появляются очень спорадически и узко. Напротив, можно подтвердить, что при имплантации индивидуализированного листа для регенерации дермы согласно примеру (SVF+ЕСМ) имеется большое количество ангиогенных областей, окрашенных в коричневый цвет.In FIG. 7 shows the presence or absence of angiogenesis at the implantation site as a result of the animal experiment according to Experimental Example 2 using CD31 staining. In particular, in FIG. 7 observe whether blood vessels are regenerated by CD31 staining on each of the areas of intact skin (normal), ablated skin (defect only) and area (SVF+ECM) in which the individualized dermal regeneration sheet according to the example is implanted in the ablated area after 14 days after skin removal. According to FIG. 7, it can be confirmed that when the skin is removed and then left for 14 days (defect only), the angiogenic brown colored areas appear very sporadically and narrowly. On the contrary, it can be confirmed that when the individualized dermal regeneration sheet according to Example (SVF+ECM) is implanted, there are a large number of angiogenic brown colored areas.

Основываясь на различных экспериментальных результатах в экспериментальном примере 2, можно увидеть, что когда индивидуализированный лист для регенерации дермы в соответствии с настоящим изобретением имплантируется в кожу, регенерация кожи ускоряется, и более того, также стимулируется ангиогенез в коже, так что область, в которой кожа удалена, может быть восстановлена аналогично исходной коже.Based on various experimental results in Experimental Example 2, it can be seen that when the individualized dermal regeneration sheet according to the present invention is implanted in the skin, skin regeneration is accelerated, and moreover, angiogenesis in the skin is also stimulated, so that the area in which the skin removed, can be restored in the same way as the original skin.

Claims

1. A bioink composition for a dermal regeneration sheet, which includes a first fluid containing a adipose-derived stromal-vascular fraction, an extracellular matrix, and fibrinogen; and a second fluid containing thrombin,

in which the content of the extracellular matrix in the first liquid is 20-60 wt.% and

in which the concentration of thrombin in the second liquid is 40-250 IU/ml.

2. The bioink composition according to claim 1, in which the concentration of the stromal-vascular fraction obtained from adipose tissue in the first liquid is from 10 ⁵ to 10 ⁷ cells/ml.

3. The bioink composition according to claim 1, in which the concentration of fibrinogen in the first liquid is 4-50 mg/ml.

4. The bioink composition according to claim 1, wherein both the adipose tissue-derived stromal-vascular fraction and the extracellular matrix are isolated from autologous adipose tissue.

5. The bioink composition according to claim 1, wherein the first liquid further comprises aprotinin.

6. A method of manufacturing an individualized sheet for regeneration of the dermis, including: a) obtaining three-dimensional data of the area of the defect in the dermis using a 3D scanner; b) forming a first layer corresponding to the shape of the obtained three-dimensional data, using the first fluid containing stromal-vascular fraction obtained from adipose tissue, extracellular matrix and fibrinogen; c) forming a second layer by applying a second liquid containing thrombin to the first layer; and d) forming a sheet for regenerating the dermis by allowing the first layer to interact with the second layer,

where the content of the extracellular matrix in the first liquid is 20-60 wt.% and

where the concentration of thrombin in the second fluid is 40-250 IU/ml.

7. The method of claim 6, further comprising step a1) of making a mold corresponding to the shape of the 3D data obtained using the 3D printer, wherein in step b) a first liquid is applied to the mold.

8. The method of claim 6 wherein steps b) and c) are repeated alternately.

9. The method according to claim 6, wherein step d) is performed within 10 minutes.

10. The method of claim 6, wherein steps b) and c) are performed using inkjet printing or 3D printing.