RU2792884C9

RU2792884C9 - Pharmacological composition for compensation of arterial hypertension and associated pathologies of the cardiovascular system

Info

Publication number: RU2792884C9
Application number: RU2021133499A
Authority: RU
Inventors: Юрий Моисеевич Кокоз; Александр Владимирович Мальцев; Иван Андреевич Митрошин
Filing date: 2021-11-18
Publication date: 2023-05-26

Abstract

FIELD: medicine; cardiology.

SUBSTANCE: invention is a drug composition intended for the treatment of cardiovascular diseases. This composition can be used for treatment in the complex therapy of coronary heart disease, chronic heart failure, arterial hypertension, myocardial hypertrophy, rhythm disturbances of various origins, cardioneurosis.

EFFECT: basis of the proposed composition is the sharingβ - adrenoblockers,α₂-adrenergic agonists, as well as a nitric oxide (NO) donor, which, when used together, will significantly reduce the effective therapeutic doses of each of the compounds due to a double synergistic effect (β- adrenoblocker +α_2-adrenergic agonist andα₂-blocker + NO donor), which, in turn, will lead to minimization of possible side effects associated with the intake of these compounds.

1 cl, 7 dwg

Description

Данное изобретение относится к медицине, а именно к медикаментозным препаратам, направленным на лечение кардиоваскулярных патологий. Настоящая композиция может использоваться для лечения в комплексной терапии артериальной гипертензии (АГ), ишемической болезни сердца, начальной стадии сердечной недостаточности, нефункциональной гипертрофии миокарда, нарушениях ритма и сердечной проводимости (аритмии различного генеза), кардионеврозе. Согласно статистике ВОЗ, сердечно-сосудистые заболевания бессменно лидируют в числе причин смертности населения Земли независимо от социоэкономических факторов, что указывает на принципиальную актуальность поисков новых стратегий для лечения/компенсации кардиоваскулярных патологий. Одной из наиболее распространенных (и прогрессирующих с возрастом) патологий является АГ. Ее принято считать скорее следствием (симптомом), нежели причиной патофизиологических реакций возникающих в организме. АГ является одним из ключевых факторов риска развития ишемической болезни сердца, нефункциональной гипертрофии миокарда, хронической сердечной недостаточности, инфаркта миокарда и инсультов. Среди внутренних факторов, провоцирующих возникновение АГ, наиболее существенны генетически детерминированные (предрасположенность) нарушения нормальной нейрогуморальной регуляции, заключающиеся в повышении активности прессорных механизмов и/или снижении функциональности депрессорных механизмов. Основными и наиболее часто применяемыми средствами являются ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, блокаторы потенциал-чувствительных Са²⁺-каналов, β-адреноблокаторы, антагонисты рецепторов ангиотензина-II, тиазидные диуретики, имидазолиновые агонисты. На практике, «одномерная» терапия препаратом из конкретной группы часто не приносит желаемых результатов, и тогда их назначают в составе комплексной терапии. Для ее показания обязано быть соблюденным условие усиления (потенцирования) тотального эффекта комбинации препаратов, наряду со снижением возможных побочных эффектов друг друга. Основой предлагаемой композиции является совместное использование β-адреноблокаторов, агонистов α₂-адренорецепторов и донора оксида азота (NO) для лечения АГ. This invention relates to medicine, namely to drugs aimed at the treatment of cardiovascular pathologies. The present composition can be used for treatment in the complex therapy of arterial hypertension (AH), coronary heart disease, the initial stage of heart failure, non-functional myocardial hypertrophy, rhythm and cardiac conduction disorders (arrhythmias of various origins), cardioneurosis. According to WHO statistics, cardiovascular diseases are consistently leading among the causes of death of the Earth's population, regardless of socioeconomic factors, which indicates the fundamental relevance of the search for new strategies for the treatment/compensation of cardiovascular pathologies. One of the most common (and progressive with age) pathologies is hypertension. It is considered to be rather a consequence (symptom) than the cause of pathophysiological reactions that occur in the body. AH is one of the key risk factors for coronary heart disease, nonfunctional myocardial hypertrophy, chronic heart failure, myocardial infarction and stroke. Among the internal factors provoking the onset of AH, the most significant are genetically determined (predisposition) disorders of normal neurohumoral regulation, which consist in an increase in the activity of pressor mechanisms and/or a decrease in the functionality of depressor mechanisms. The main and most commonly used drugs are angiotensin-converting enzyme inhibitors, blockers of voltage-sensitive Ca ²⁺ channels, β-blockers, angiotensin-II receptor antagonists, thiazide diuretics, imidazoline agonists. In practice, "one-dimensional" therapy with a drug from a particular group often does not bring the desired results, and then they are prescribed as part of complex therapy. For its indication, the condition of strengthening (potentiating) the total effect of a combination of drugs, along with a decrease in possible side effects of each other, must be met. The basis of the proposed composition is the joint use of β-blockers, α ₂ -adrenergic receptor agonists and a nitric oxide (NO) donor for the treatment of hypertension.

АГ - комплексная патология сердечно-сосудистой системы, при которой в течение длительного времени наблюдается увеличение артериального давления (АД) как во время систолы, так и в период диастолы в покое. Согласно статистическим данным, этому заболеванию подвержены 20-30% взрослого населения в мире, причем с возрастом распространенность заболевания значительно увеличивается [1]. В силу полиэтиологической природы возникновения АГ, в настоящий момент существует ряд стратегий компенсации увеличенного АД, которые, зачастую, для улучшения эффектов, комбинируют между собой в составе комплексной терапии. Из патента на изобретение RU 2073485 (СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ НИТРАТОВ И СИДНОНИМИНОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СТЕНОКАРДИИ) известно, что применение нитратов хорошо сказывается на качестве уровня жизни и частично компенсирует нарушения сердечной проводимости, возникающие у пациентов со стенокардией. Кроме того, известно применение нитратов в качестве лекарственных средств против сердечной недостаточности, отягощенных ишемической болезнью сердца (а.с. СССР №1503819, опубл. 30.08.89 г.; а.с. СССР №1685453, опубл. 23.10.91 г.).AH is a complex pathology of the cardiovascular system, in which for a long time there is an increase in blood pressure (BP) both during systole and during diastole at rest. According to statistics, 20-30% of the adult population in the world are affected by this disease, and the prevalence of the disease increases significantly with age [1]. Due to the polyetiological nature of the occurrence of hypertension, at the moment there are a number of strategies for compensating for increased blood pressure, which, often, to improve the effects, are combined with each other as part of complex therapy. From the patent for invention RU 2073485 (METHOD FOR PREDICTING THE EFFECTIVENESS OF NITRATES AND SYDNONIMINES FOR THE TREATMENT OF ANGINA), it is known that the use of nitrates has a good effect on the quality of life and partially compensates for cardiac conduction disorders that occur in patients with angina pectoris. In addition, the use of nitrates as drugs against heart failure aggravated by coronary heart disease is known (AS USSR No. 1503819, publ. 08/30/89; AS USSR No. 1685453, publ. 10/23/91 ).

Совместное использование одновременно β-адреноблокатора (метопролола) и антагониста мускариновых рецепторов - атропина предлагается для эффективной вегетативной блокады сердца в диагностических целях в патенте RU 2572339 (СПОСОБ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ ВЕГЕТАТИВНОЙ БЛОКАДЫ СЕРДЦА). Основное преимущество комбинирования заключалось в уменьшении количества ложноположительных результатов при проведении исследований, что приводило к исключению гипердиагностики состояний, связанных с заболеванием проводящей системы сердца. Исследований по терапии / коррекции патологических состояний (АГ, ишемическая болезнь сердца, миокардиальная гипертрофия и т.д.) комбинацией β-адреноблокатор + атропин в данном случае не проводилось.The combined use of a β-blocker (metoprolol) and a muscarinic receptor antagonist, atropine, is proposed for effective autonomic heart block for diagnostic purposes in patent RU 2572339 (METHOD FOR PHARMACOLOGICAL AUTONOMIC HEART BLOCK). The main advantage of the combination was to reduce the number of false positive results in studies, which led to the exclusion of overdiagnosis of conditions associated with a disease of the conduction system of the heart. Studies on the therapy / correction of pathological conditions (AH, coronary heart disease, myocardial hypertrophy, etc.) with a combination of β-blocker + atropine were not conducted in this case.

Наиболее используемым способом лечения ХСН является способ, рекомендованный в 2003 г. Российским Обществом Специалистов по Сердечной Недостаточности (Национальные рекомендации по диагностике и лечению ХСН, ж. "Сердечная недостаточность", 2003 г., т. 4, №6), в котором в качестве основных средств медикаментозной терапии ХСН рекомендованы следующие группы препаратов: ингибиторы АПФ, β-адреноблокаторы, диуретики, ингибиторы альдостерона.The most used method for the treatment of CHF is the method recommended in 2003 by the Russian Society of Specialists in Heart Failure (National recommendations for the diagnosis and treatment of CHF, g. "Heart failure", 2003, vol. 4, No. 6), in which The following groups of drugs are recommended as the main means of drug therapy for CHF: ACE inhibitors, β-blockers, diuretics, aldosterone inhibitors.

Эффективность приема β-адреноблокаторов показана широким спектром когортных исследований, а механизм действия сводится к блокаде β-адренергических рецепторов (β-АР) в гладкомышечной ткани сосудов и рабочих клетках миокарда [2]. β-адреноблокаторы вызывают опосредованное гипотензивное действие посредством снижения частоты сердечных сокращений и сердечного выброса. Установлено, что некоторые из них эффективны в задачах по предупреждению и улучшению прогноза при ишемической болезни сердца [3]. Прием β-адреноблокаторов повышает среднюю продолжительность жизни при ХСН, асимптоматической дисфункции левого желудочка и у больных, перенесших инфаркт миокарда [4]. Из-за широкого распространения β-АР в периферических тканях, где они участвуют в регуляции ряда физиологических функций, «одномерная» терапия β-адреноблокаторами может вызывать нежелательные побочные эффекты. Например, наиболее известным из них является бронхоспазм, в связи с чем, большинство врачей не рекомендуют назначение β-адреноблокаторов для снижения АД при хронической обструктивной болезни легких и/или бронхиальной астме [5]. Основное показание к их назначению - комплексная терапия при сердечной недостаточности или асимптоматической дисфункции левого желудочка и различные формы тахиаритмий, связанных с гиперактивацией синтеза катехоламинов при развитии и течении АГ. В клинической практике β-адреноблокаторы часто используют совместно с тиазидными диуретиками, что дает обнадеживающие результаты в поддерживающей терапии при АГ [6]. Однако тиазидные диуретики негативно влияют на ряд метаболических показателей углеводного и жирового обменов, из-за чего комбинация β-адреноблокаторов и тиазидных диуретиков нежелательна для лиц с метаболическим синдромом и/или нарушениями энергетического метаболизма [7, 8]. В большом рандомизированном исследовании ASCOT BPLA, было обнаружено повышение уровня триглицеридов и снижение липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови при совместном применении β-адреноблокаторов и тиазидных диуретиков. Помимо этого, почти на треть чаще возникал сахарный диабет II типа [9]. Тем не менее, комбинация β-адреноблокатора бисопролола и гидрохлоротиазида для лечения АГ зарегистрирована под коммерческим названием "Лодоз".The effectiveness of taking β-blockers has been shown by a wide range of cohort studies, and the mechanism of action is reduced to the blockade of β-adrenergic receptors (β-AR) in vascular smooth muscle tissue and myocardial working cells [2]. β-blockers cause an indirect hypotensive effect by reducing heart rate and cardiac output. It has been established that some of them are effective in preventing and improving the prognosis in coronary heart disease [3]. Taking β-blockers increases the average life expectancy in CHF, asymptomatic left ventricular dysfunction, and in patients with myocardial infarction [4]. Due to the wide distribution of β-AR in peripheral tissues, where they are involved in the regulation of a number of physiological functions, "one-dimensional" therapy with β-blockers can cause undesirable side effects. For example, the most well-known of these is bronchospasm, and therefore, most doctors do not recommend the appointment of β-blockers to reduce blood pressure in chronic obstructive pulmonary disease and/or bronchial asthma [5]. The main indication for their appointment is complex therapy for heart failure or asymptomatic left ventricular dysfunction and various forms of tachyarrhythmias associated with hyperactivation of catecholamine synthesis during the development and course of hypertension. In clinical practice, β-blockers are often used in conjunction with thiazide diuretics, which gives encouraging results in maintenance therapy for hypertension [6]. However, thiazide diuretics negatively affect a number of metabolic indicators of carbohydrate and fat metabolism, which is why the combination of β-blockers and thiazide diuretics is undesirable for people with metabolic syndrome and/or energy metabolism disorders [7, 8]. In a large randomized study, ASCOT BPLA, an increase in triglycerides and a decrease in serum high-density lipoprotein were found with the combined use of β-blockers and thiazide diuretics. In addition, type II diabetes mellitus occurred almost a third more often [9]. However, the combination of the β-blocker bisoprolol and hydrochlorothiazide for the treatment of hypertension is registered under the commercial name Lodoz.

Еще одним часто применяемым в клинической практике является комбинирование β-адреноблокаторов с блокаторами потенциал-зависимых Са²⁺-каналов (группа "медленных" Са²⁺-антагонистов или блокаторов) [10]. Са²⁺-блокаторы метаболически нейтральны [7, 8], и способны в некоторых случаях уменьшать степень поражения органов-мишеней при АГ [11]. На данный момент, коммерчески реализуемый препарат Са²⁺-блокатора (амлодипина) и β-адреноблокатора бисопролола является зарегистрированным под названием "Конкор AM" и используется в клинической практике.Another frequently used in clinical practice is the combination of β-blockers with blockers of voltage-dependent Ca ²⁺ channels (a group of "slow" Ca ²⁺ antagonists or blockers) [10]. Ca ²⁺ -blockers are metabolically neutral [7, 8], and in some cases can reduce the degree of target organ damage in AH [11]. At the moment, the commercially sold preparation of Ca ²⁺ -blocker (amlodipine) and β-blocker bisoprolol is registered under the name "Concor AM" and is used in clinical practice.

Из патента RU 2304964 (СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ) известно, что дополнение к рекомендуемой, исходя из класса/степени тяжести ХСН, терапии, осуществляемой β-адреноблокаторами / ингибиторами ангиотензин-превращающего фермента / диуретиками / ингибиторами альдостерона, цитопротектора «Мексикора» (действующее вещество - этилметилгидроксипиридина сукцинат) приводит к улучшение прогноза и качества жизни пациентов с ХСН. Действие «Мексикора» в дозировке 0.1 мг/сутки связано с его неспецифической антиоксидантной и антигипоксической активностью, приводящей к снижению повреждений миокардиальных и гладкомышечных тканей свободными радикалами.From patent RU 2304964 (METHOD OF TREATMENT OF CHRONIC HEART FAILURE) it is known that in addition to the therapy recommended, based on the class/severity of CHF, by β-blockers / angiotensin-converting enzyme inhibitors / diuretics / aldosterone inhibitors, the cytoprotector "Mexicor" (active substance - ethylmethylhydroxypyridine succinate) leads to an improvement in the prognosis and quality of life of patients with CHF. The action of Mexicor at a dosage of 0.1 mg / day is associated with its non-specific antioxidant and antihypoxic activity, leading to a decrease in damage to myocardial and smooth muscle tissues by free radicals.

В настоящем патенте переход к «многомерной» терапии ХСН, АГ и связанных с их течением кардиоваскулярных патологий включает одновременное применение β-адреноблокаторов, α₂-адренергических агонистов и донора NO. α₂-адренорецепторы первоначально были обнаружены в центре контроля кровяного давления в продолговатом мозге, чья активация клонидином вызывала устойчивый гипотензивный и умеренный брадикардический эффект [12]. Наряду с этим, центральная активация α₂-адренорецепторов обладала некоторыми нежелательными побочными эффектами, в частности, сонливость, сухость во рту, одышка, седативный эффект [13]. На данный момент, агонисты α₂-адренорецепторов ограниченно применяются в клинической практике для лечения некоторых невропатических болей и состояний, премедикативных средств для ряда наркозов в анестезиологии, реже - как гипотензивные препараты первого поколения. Ограничения использования α₂-адреноагонистов для терапии АГ связаны, как упоминалось выше, с их выраженными побочными эффектами.In the present patent, the transition to "multidimensional" therapy of CHF, hypertension and related cardiovascular pathologies includes the simultaneous use of β-blockers, α ₂ -adrenergic agonists and an NO donor. α ₂ -adrenergic receptors were originally found in the center of blood pressure control in the medulla oblongata, whose activation by clonidine caused a sustained hypotensive and moderate bradycardia effect [12]. Along with this, the central activation of α ₂ -adrenergic receptors had some undesirable side effects, in particular, drowsiness, dry mouth, shortness of breath, and sedation [13]. At the moment, α ₂ -adrenergic agonists are limitedly used in clinical practice for the treatment of certain neuropathic pains and conditions, premedication for a number of anesthesia in anesthesiology, less often as first-generation antihypertensive drugs. The limitations of the use of α ₂ -adrenergic agonists for the treatment of hypertension are associated, as mentioned above, with their pronounced side effects.

Недавно, на сарколемме одиночных кардиомиоцитов нами были обнаружены белки всех трех известных на данный момент подтипов α₂-адренорецепторов (α_2A, α_2B, α_2C) [14]. Обнаруженные α₂-адренорецепторы являются функционально активными по отношению к регуляции потенциал-зависимых Са²⁺-каналов и внутриклеточной концентрации ионов кальция, как основного посредника, определяющего порог и силу сокращения клеток миокарда. Так, активация α₂-адренорецепторов гуанабенцем снижает как плотность потенциал-зависимых Са²⁺-токов, так и уровень внутриклеточного Са²⁺ в одиночных кардиомиоцитах [14]. В данной заявке предлагается одновременное использование комбинации β-адреноблокаторов, α₂-адреноагонистов и донора NO для более эффективного контроля сердечной сократимости в основе комплексного лечения ХСН, АГ, а также связанных с ними патологических состояний (желудочковая гипертрофия, ишемическая болезнь сердца, аритмии различного генеза, стенокардия).Recently, on the sarcolemma of single cardiomyocytes, we have found proteins of all three currently known subtypes of α ₂ -adrenergic receptors (α _2A , α _2B , α _2C ) [14]. The discovered α ₂ -adrenergic receptors are functionally active in relation to the regulation of voltage-dependent Ca ²⁺ -channels and intracellular concentration of calcium ions, as the main mediator that determines the threshold and force of contraction of myocardial cells. Thus, activation of α ₂ -adrenergic receptors by guanabenz reduces both the density of voltage-dependent Ca ²⁺ currents and the level of intracellular Ca ²⁺ in single cardiomyocytes [14]. This application proposes the simultaneous use of a combination of β-adrenergic blockers, α ₂ -adrenoagonists and an NO donor for more effective control of cardiac contractility in the basis of complex treatment of CHF, hypertension, as well as associated pathological conditions (ventricular hypertrophy, coronary heart disease, arrhythmias of various origins). , angina).

Так же, как и «одномерная» терапия β-адреноблокаторами, применение α₂-адреноагонистов или донора NO не всегда эффективно решает задачи компенсации означенных сердечно-сосудистых патологий. Применение α₂-адреноагонистов в настоящий момент сильно ограничено из-за достаточно высоких доз, применение которых необходимо для пересечения гематоэнцефалического барьера и достижения эффективной концентрации действующих соединений в центре кровяного давления в мозге [15]. Предлагаемый здесь впервые подход к использованию α₂-адреноагонистов отличается тем, что основывается на полученных нами данных, что мишени их действия локализованы непосредственно в миокардиальных клетках. Соответственно, для локально-миокардиального действия требуются меньшие дозы α₂-адреноагонистов, что, в свою очередь, будет минимизировать их побочные эффекты.Just like "one-dimensional" therapy with β-blockers, the use of α ₂ -adrenoagonists or an NO donor does not always effectively solve the problem of compensating for the indicated cardiovascular pathologies. The use of α ₂ -adrenergic agonists is currently severely limited due to the rather high doses required to cross the blood-brain barrier and achieve an effective concentration of active compounds in the center of blood pressure in the brain [15]. The approach proposed here for the first time to the use of α ₂ -adrenergic agonists is different in that it is based on the data we have obtained that the targets of their action are localized directly in myocardial cells. Accordingly, lower doses of α ₂ -adrenergic agonists are required for local myocardial action, which, in turn, will minimize their side effects.

В работах [16, 17] нами было обнаружено усиление совместного действия β-адреноблокады и аппликации α₂-адреноагониста гуанабенца в отношении уменьшения плотности потенциал-зависимых Са²⁺-токов в кардиомиоцитах. Данный факт позволит существенно снизить эффективные дозы α₂-адреноагонистов и β-адреноблокаторов, ослабляя их возможные нежелательные эффекты. Кроме того, эксперименты на миокардиальных тканях показывают, что совместная аппликация α₂-адреноагониста и донора NO потенцируют активность серин/треониновых фосфатаз, что также способствует дополнительному снижению Са²⁺-токов и уменьшении нагрузки на сердце.In [16, 17], we found an increase in the combined action of β-blockade and the application of α ₂ -adrenoagonist guanabenz in relation to a decrease in the density of voltage-dependent Ca ²⁺ currents in cardiomyocytes. This fact will significantly reduce the effective doses of α ₂ -adrenergic agonists and β-blockers, weakening their possible undesirable effects. In addition, experiments on myocardial tissues show that the joint application of an α ₂ -adrenoagonist and an NO donor potentiates the activity of serine/threonine phosphatases, which also contributes to an additional decrease in Ca ²⁺ currents and a decrease in the load on the heart.

Хорошо известно, что поток ионов кальция через потенциал-управляемые Са²⁺-каналы определяет высвобождение Са²⁺, запасенного во внутриклеточных депо (так называемое Са²⁺-индуцируемый Са²⁺-выброс). Скачкообразное и кратковременное повышение Са²⁺ в цитоплазме запускает акт механохимического сопряжения в сердечной мышце, приводящий к ее сокращению при действии физиологических стимулов [18]. Периодически возникающие и/или длительные сбои в регулировке работы миокардиальных потенциал-управляемых Са²⁺-каналов, в конечном счете, приводят к инициации патофизиологических состояний (нефункциональная гипертрофия миокарда, аритмии разного генеза, нарушения проводимости отделов сердца, ХСН) [19]. Важнейшим нейрогуморальным регулятором Са²⁺-токов в сердечных клетках являются вырабатываемые надпочечниками катехоламины (норадреналин и адреналин), чья продукция резко увеличивается в момент стресс-реакции "сражайся или спасайся бегством" ("fight-or-flight"). Пролонгированное повышение концентраций катехоламинов, в плазме крови, возникающее при психоэмоциональных перегрузках, может модифицировать кинетические свойства Са²⁺-токов, приводя к изменениям чувствительности Са²⁺-каналов в отношении физиологических стимулов. В конечном счете, нарушения нормально-физиологической Са²⁺-сигнализации в сердечных клетках ведет к возникновению кардиоваскулярных патологий. Например, установлено, что вольт-амперные характеристики потенциал-управляемых Са²⁺-каналов L-типа в кардиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс (линия SHR) почти на 10 мВ сдвинуты в сторону гиперполяризованных потенциалов в сравнении с нормотензивным контролем [19]. Смещение вольт-амперных кривых влево означает тот факт, что реальный порог физиологического стимула для удаления канального воротного блока (а соответственно -и открытия Са²⁺-канала) снижен, и старт потенциала действия наблюдается при меньшей амплитуде стимула. Измененная активность потенциал-управляемых Са²⁺-каналов также характерна для атриальных кардиомиоцитов и гладких мышц сосудов у SHR крыс, что сопряжено с увеличенным Са²⁺-входом, который может приводить к кальциевой перегрузке и усилению тяжести течения сердечно-сосудистых патологий [20, 21]. Помимо этого, в сердцах спонтанно-гипертензивных крыс повышена экспрессия функционального белка Са²⁺-каналов L-типа [19], а текущие исследования обнаружили изменения в регуляции статуса фосфорилирования потенциал-управляемых Са²⁺-каналов [22]. В частности, блокада РКА-зависимого фосфорилирования или аппликация β-адреноблокаторов улучшали некоторые показатели в ряде моделей АГ, например, уровень систолического и диастолического АД, отношение массы левого желудочка к общей массе сердца, общее и периферическое сопротивление сосудов [23].It is well known that the flow of calcium ions through voltage-gated Ca ²⁺ channels determines the release of Ca ²⁺ stored in intracellular depots (the so-called Ca ²⁺ -induced Ca ²⁺ release). An abrupt and short-term increase in Ca2 ⁺ in the cytoplasm triggers an act of mechanochemical conjugation in the heart muscle, leading to its contraction under the action of physiological stimuli [18]. Periodically arising and/or long-term failures in the regulation of the work of myocardial voltage-gated Ca2 ⁺ channels ultimately lead to the initiation of pathophysiological conditions (nonfunctional myocardial hypertrophy, arrhythmias of various origins, conduction disturbances in the heart, CHF) [19]. The most important neurohumoral regulator of Ca ²⁺ currents in cardiac cells are catecholamines produced by the adrenal glands (norepinephrine and adrenaline), whose production increases sharply at the time of the "fight-or-flight" stress reaction. A prolonged increase in the concentration of catecholamines in the blood plasma, which occurs during psychoemotional overload, can modify the kinetic properties of Ca ²⁺ currents, leading to changes in the sensitivity of Ca ²⁺ channels in relation to physiological stimuli. Ultimately, disturbances in the normal physiological Ca ²⁺ signaling in the heart cells lead to the occurrence of cardiovascular pathologies. For example, it has been found that the current-voltage characteristics of voltage-gated L-type Ca2 ⁺ channels in cardiocytes of spontaneously hypertensive rats (SHR line) are shifted by almost 10 mV towards hyperpolarized potentials in comparison with normotensive control [19]. The shift of the current-voltage curves to the left means that the actual threshold of the physiological stimulus for the removal of the channel gate block (and, accordingly, the opening of the Ca ²⁺ channel) is reduced, and the start of the action potential is observed at a lower stimulus amplitude. Altered activity of voltage-gated Ca ²⁺ channels is also characteristic of atrial cardiomyocytes and vascular smooth muscles in SHR rats, which is associated with increased Ca ²⁺ input, which can lead to calcium overload and increase the severity of cardiovascular pathologies [20, 21]. In addition, in the hearts of spontaneously hypertensive rats, the expression of the functional protein of L-type Ca ²⁺ channels is increased [19], and current studies have found changes in the regulation of the phosphorylation status of voltage-gated Ca ²⁺ channels [22]. In particular, the blockade of PKA-dependent phosphorylation or the application of β-blockers improved some parameters in a number of AH models, for example, the level of systolic and diastolic blood pressure, the ratio of the mass of the left ventricle to the total mass of the heart, and total and peripheral vascular resistance [23].

Кроме того, известны кардиопротекторные свойства оксида азота. Посредством активации цитозольной гуанилатциклазы и далее циклогуанозинмонофосфат (цГМФ) - протеинкиназа G-сигнального пути и/или прямого нитрозилирования белков-мишеней, NO способствует релаксации мышечной ткани, расслаблению стенок кровеносных сосудов, снижению сосудистого сопротивления, что вызывает стойкий гипотензивный эффект. Кроме того, некоторые доноры NO (нитроглицерин, нитраты) давно применяют для снятия острых приступов стенокардии, а из клинических исследований известно его торможение миокардиальной гипертрофии за счет воздействия на кальцинейрин/NFAT сигнальный путь [24]. Ранее нами было установлено, что NO кроме всего прочего, способствует усилению закачивания кальция в ретикулум посредством Са²⁺-АТФазы саркоплазматического ретикулума (SERCA). Активация SERCA способствует эффективной утилизации кальция из цитозоля, что обеспечивает более полное расслабление миокардиальных клеток и предотвращает их от возникновения Са²⁺-перегрузок.In addition, the cardioprotective properties of nitric oxide are known. By activating cytosolic guanylate cyclase and further cycloguanosine monophosphate (cGMP) - a protein kinase of the G-signaling pathway and / or direct nitrosylation of target proteins, NO promotes muscle tissue relaxation, relaxation of blood vessel walls, and a decrease in vascular resistance, which causes a persistent hypotensive effect. In addition, some NO donors (nitroglycerin, nitrates) have long been used to relieve acute angina attacks, and its inhibition of myocardial hypertrophy due to the effect on the calcineurin/NFAT signaling pathway is known from clinical studies [24]. Previously, we found that NO, among other things, promotes increased pumping of calcium into the reticulum through Ca ²⁺ -ATPase of the sarcoplasmic reticulum (SERCA). Activation of SERCA contributes to the efficient utilization of calcium from the cytosol, which provides a more complete relaxation of myocardial cells and prevents them from the occurrence of Ca ²⁺ -overloads.

Результаты собственных исследованийResults of own research

Действие агадреноагонистов на фоне стимуляции β-адренергической сигнализацииThe action of agdrenoagonists against the background of stimulation of β-adrenergic signaling

Гуанабенц (10 мкМ) сам по себе вызывает снижение потенциал-зависимых Са²⁺-токов на 31.3±4.2% относительно контрольного уровня (n=8, рис. 1а, б). Анализ стационарной (steady-state) кинетики активации/инактивации Са²⁺-токов при аппликации гуанабенца показывает, что он значительно смещает активационную кривую вправо, более чем на 2 мВ (с -18.9±0.3 мВ в контроле до -16.2±0.3 мВ в присутствии гуанабенца, р≤0.05, n=8, рис. 1в, штриховые линии), практически не влияя на кинетические параметры инактивации (-20.6±0.5 мВ vs. 21.2±0.4 мВ, р≥0.05, рис. 1в, сплошные линии). Значения slope-коэффициентов для кривой активации также достоверно отличаются (6.07±0.06 vs. 4.77±0.07, р≤0.05). Полученные данные свидетельствуют о том, что механизм ингибирования Са²⁺-каналов при активации α₂-адренорецепторов гуанабенцом, вероятно, связан с его действием на открытое состояние канала и почти не затрагивает кинетику канальной инактивации и/или закрытое состояние Са²⁺-канального комплекса. Гуанабенц также был эффективен в экспериментах по моделированию адренергического стресса с использование синтетического β-агониста. Агонист β-АР - изопротеренол (1 мкМ) стимулировал амплитуду входящих потенциал-зависимых Са²⁺-токов на 186.0±15.0% относительно контрольного уровня, n=12, рис 1г, д).Guanabenz (10 μM) by itself causes a decrease in voltage-dependent Ca ²⁺ currents by 31.3±4.2% relative to the control level (n=8, Fig. 1a, b). An analysis of the stationary (steady-state) kinetics of activation/inactivation of Ca ²⁺ currents upon application of guanabenz shows that it significantly shifts the activation curve to the right by more than 2 mV (from -18.9±0.3 mV in control to -16.2±0.3 mV in in the presence of guanabenz, р≤0.05, n=8, Fig. 1c, dashed lines), having practically no effect on the kinetic parameters of inactivation (-20.6±0.5 mV vs. 21.2±0.4 mV, р≥0.05, Fig. 1c, solid lines) . The values of the slope coefficients for the activation curve also differ significantly (6.07±0.06 vs. 4.77±0.07, р≤0.05). The data obtained indicate that the mechanism of inhibition of Ca ²⁺ channels upon activation of α ₂ -adrenergic receptors by guanabenz is probably associated with its effect on the open state of the channel and almost does not affect the kinetics of channel inactivation and/or the closed state of the Ca ²⁺ channel complex. . Guanabenz was also effective in adrenergic stress simulation experiments using a synthetic β-agonist. The β-AR agonist, isoproterenol (1 μM), stimulated the amplitude of incoming voltage-dependent Ca ²⁺ currents by 186.0±15.0% relative to the control level, n=12, Fig. 1d, e).

Резкое увеличение амплитуды и плотности входящего в клетку Са²⁺-тока сопровождалось также достоверным снижением времени полуинактивации канальных комплексов с 14.5±1.9 мс в контроле до 8.7±1.6 мс в присутствии изопротеренола (р≤0.05, рис. 1е). Очевидно, что такой механизм позволяет несколько снизить входящий поток ионов кальция, хоть и недостаточен для того, чтобы справиться с состоянием кальциевой перегрузки, возникающей в цитозоле кардиомиоцитов из-за аппликации β-агониста. Активация α₂-адренорецепторов гуанабенцем частично обращает действие изопротеренола, амплитуда Са²⁺-токов снижается почти вдвое против изопротеренол-индуцируемого уровня (повышение на 75.3±6.9%), хоть и не возвращается к базальным значениям (n=5, р≤0.05, рис. 16, в). Гуанабенц достоверно не влиял на величину полуинактивации Са²⁺-канальных комплексов (12.9±1.9 мс, р≥0.05, рис. 1е), однако был способен увеличивать время достижения половины пиковой амплитуды при действии изопротеренола до значений, достоверно не отличимых от контроля (12.3±1.8 vs. 14.2±2.1 в контроле, р≥0.05, рис. 1е). Таким образом, активация α₂-адренорецепторов оказывается полезной при пролонгированной чрезмерной стимуляции β-адренергической системы. Несмотря на то, что при действии исследуемых агонистов, индуцированные изопротеренолом Са²⁺-токи сохранялись на большем уровне, чем базальные, их частичная компенсация в сторону снижения амплитуды за счет влияния на проводимость Са²⁺-каналов представляется важной, как с функциональной, так и фармакологической точек зрения.A sharp increase in the amplitude and density of the Ca2 ⁺ current entering the cell was also accompanied by a significant decrease in the half-inactivation time of the channel complexes from 14.5±1.9 ms in the control to 8.7±1.6 ms in the presence of isoproterenol (р≤0.05, Fig. 1f). It is obvious that this mechanism makes it possible to somewhat reduce the incoming flow of calcium ions, although it is not sufficient to cope with the state of calcium overload that occurs in the cytosol of cardiomyocytes due to the application of a β-agonist. Activation of α ₂ -adrenergic receptors by guanabenz partially reverses the action of isoproterenol, the amplitude of Ca ²⁺ currents decreases almost twice against the isoproterenol-induced level (increase by 75.3±6.9%), although it does not return to basal values (n=5, p≤0.05, Fig. 16, c). Guanabenz did not significantly affect the value of semi-inactivation of Ca ²⁺ -channel complexes (12.9±1.9 ms, p≥0.05, Fig. 1f), however, it was able to increase the time to reach half the peak amplitude under the action of isoproterenol to values that were not significantly different from the control (12.3 ±1.8 vs. 14.2±2.1 in control, p≥0.05, Fig. 1f). Thus, activation of α ₂ -adrenergic receptors is useful in prolonged overstimulation of the β-adrenergic system. Despite the fact that under the action of the studied agonists, the Ca ²⁺ currents induced by isoproterenol remained at a higher level than the basal currents, their partial compensation towards a decrease in amplitude due to the effect on the conductivity of the Ca ²⁺ channels seems to be important, both from a functional and and pharmacological points of view.

Участие протеинкиназы A (РКА) в реализации эффектов α₂-адреноагонистовInvolvement of protein kinase A (PKA) in the implementation of the effects of α ₂ -adrenergic agonists

Далее был исследован возможный механизм ингибирования β-АР-сигнализации в отношении потенциал-чувствительных Са²⁺-токов через α₂-адренорецепторы. Установлено, что принципиальные эффекты β-агонистов в значительной степени опосредуются РКА [2, 3]. Если сигнальные пути от α₂-адренорецепторов, в конечном счете, приводят к подавлению РКА-опосредованного увеличения Са²⁺-токов, логично предположить, что действие их агонистов на фоне блокирования данной протеинкиназы будет отсутствовать или выражаться существенно меньше. Для проверки этой гипотезы, нами был использован специфический РКА-блокатор - соединение Н 89. Добавление Н 89 (5 мкМ) в камеру само по себе приводило к некоторому ингибированию потенциал-управляемых Са²⁺-токов на 37.4±5.2% от контроля, показывая, таким образом, что базальный уровень активности РКА в цитозоле кардиомиоцитов весьма важен для их нормальной функциональности (рис. 2а, б).Further, a possible mechanism of inhibition of β-AR signaling in relation to voltage-sensitive Ca ²⁺ currents through α ₂ -adrenergic receptors was investigated. It has been established that the principal effects of β-agonists are largely mediated by PKA [2, 3]. If the signaling pathways from α ₂ -adrenergic receptors eventually lead to the suppression of the PKA-mediated increase in Ca ²⁺ currents, it is logical to assume that the effect of their agonists against the background of blocking this protein kinase will be absent or expressed significantly less. To test this hypothesis, we used a specific PKA blocker, compound H 89. The addition of H 89 (5 μM) to the chamber itself led to some inhibition of voltage-controlled Ca ²⁺ currents by 37.4±5.2% of the control, showing , so that the basal level of PKA activity in the cytosol of cardiomyocytes is very important for their normal functionality (Fig. 2a, b).

Стоит также отметить, что Н 89 достоверно увеличивал время полуинактивации Са²⁺-каналов с 14.5±1.9 мс в контроле до 22.5±2.2 мс (n=10, р≤0.05, рис. 2в). Вероятно, замедление кинетики инактивации Са²⁺-каналов было связано со снижением их уровня фосфорилирования и явилось компенсаторным эффектом в ответ на сниженное поступление Са²⁺ из экстраклеточного раствора. Замедленная кинетика инактивации, индуцируемая соединением Н 89, сохранялась и при последующей аппликации α₂-адреноагониста гуанабенца: (20.8±2.1 мс, n=5, р≥0.05 vs. Н 89).It should also be noted that H 89 significantly increased the half-inactivation time of Ca ²⁺ channels from 14.5±1.9 ms in the control to 22.5±2.2 ms (n=10, р≤0.05, Fig. 2c). It is likely that the slowing down of Ca ²⁺ channel inactivation kinetics was associated with a decrease in their level of phosphorylation and was a compensatory effect in response to a reduced Ca ²⁺ supply from the extracellular solution. The slow kinetics of inactivation induced by the compound H 89 persisted with subsequent application of the α ₂ -adrenergic agonist guanabenz: (20.8±2.1 ms, n=5, p≥0.05 vs. H 89).

На фоне Н 89 гуанабенц оказался способен эффективно подавлять амплитуду и плотность входящих Са²⁺-токов в размере, сопоставимом с его действием в одиночку, значения амплитуды Са²⁺-токов снижались до 37.8±5.2% (n=5, р≤0.05, рис. 2б). Полученные результаты свидетельствуют о том, что активация α₂-адренорецепторов снижает входящие через потенциал-управляемые Са²⁺-каналы токи, вероятно, не через блокаду активности РКА, а посредством иного, альтернативного механизма. Этот механизм аддитивен действию блокады РКА-зависимого фосфорилирования, и, по-видимому, не связан с G-белок-опосредуемой регуляцией активности аденилатциклазы. Установлено, что изменения внутриклеточной концентрации Са²⁺ тесным образом коррелируют с флуктуациями синтеза сигнальной молекулы оксида азота (NO) [14]. NO может стимулировать активность цитоплазматической гуанилатциклазы, продуцирующей циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ), а также, может прямо нитрозилировать таргетные белки (включая ионные каналы) и модулировать, таким образом, их функциональный статус [24]. Нитрозилирование потенциал-управляемых Са²⁺-каналов по-разному влияет на их общеканальную проницаемость для Са²⁺. Это зависит от положения аминокислотного остатка цистеина, по которому происходит нитрозилирование, в структуре белка (в порообразующей или регуляторных субъединицах), конкретного подтипа каналов, клеточной специфичности и ее физиологического состояния, концентрации свободного Са²⁺ в цитозоле и т.д. [24].Against the background of H 89, guanabenz was able to effectively suppress the amplitude and density of incoming Ca ²⁺ currents in an amount comparable to its action alone, the amplitude values of Ca ²⁺ currents decreased to 37.8±5.2% (n=5, p≤0.05, Fig. 2b). The results obtained indicate that the activation of α ₂ -adrenergic receptors reduces the currents entering through the voltage-gated Ca ²⁺ channels, probably not through the blockade of PKA activity, but through a different, alternative mechanism. This mechanism is additive to the action of the blockade of PKA-dependent phosphorylation, and, apparently, is not associated with the G-protein-mediated regulation of adenylate cyclase activity. It has been established that changes in the intracellular Ca2 ⁺ concentration closely correlate with fluctuations in the synthesis of the nitric oxide (NO) signaling molecule [14]. NO can stimulate the activity of cytoplasmic guanylate cyclase, which produces cyclic guanosine monophosphate (cGMP), and can also directly nitrosylate target proteins (including ion channels) and thus modulate their functional status [24]. Nitrosylation of voltage-gated Ca ²⁺ channels differently affects their total channel permeability for Ca ²⁺ . It depends on the position of the cysteine amino acid residue at which nitrosylation occurs in the protein structure (in the pore-forming or regulatory subunits), the specific channel subtype, cell specificity and its physiological state, the concentration of free Ca2 ⁺ in the cytosol, etc. [24].

Действие α₂-адреноагонистов на Са²⁺-токи является NO-зависимымThe action of α ₂ -adrenergic agonists on Ca ²⁺ currents is NO-dependent

На рис. 3 представлены результаты по действию гуанабенца на фоне блокатора изоформ NO-синтаз - 7NI (2 мкМ). В используемой концентрации, 7NI практически не влиял ни на базальный уровень Са²⁺-токов (95.6±3.7%, р≥0.05, рис. 3а), ни на величину канальной полуинактивации (15.3±2.4 мс vs. 14.5±1.9 мс в контроле, р≥0.05). Подача в экспериментальную камеру 10 мкМ гуанабенца на фоне 7NI приводила к существенно менее выраженному снижению амплитуды Са²⁺-токов (13.1±3.1% vs. 31.3±4.2%, р≤0.05, n=5, рис. 3а). Эти результаты подтвердились и при прямом измерении продукции NO с использованием высокоспецифичного NO-чувствительного зонда - 4'5'-диаминофлуоресцеин диацетата (DAF-FM). Аппликация 10 мкМ гуанабенца увеличивала уровень NO на 54.5±9.0% (рис. 3б, в).On fig. Figure 3 shows the results of the action of guanabenz against the background of the blocker of NO-synthase isoforms - 7NI (2 μM). At the concentration used, 7NI had virtually no effect on either the basal level of Ca ²⁺ currents (95.6±3.7%, p≥0.05, Fig. 3a) or the magnitude of the channel semi-inactivation (15.3±2.4 ms vs. 14.5±1.9 ms in control). , p≥0.05). The introduction of 10 μM guanabenz into the experimental chamber against the background of 7NI led to a significantly less pronounced decrease in the amplitude of Ca2 ⁺ currents (13.1±3.1% vs. 31.3±4.2%, p≤0.05, n=5, Fig. 3a). These results were also confirmed by direct measurement of NO production using a highly specific NO-sensitive probe - 4'5'-diaminofluorescein diacetate (DAF-FM). Application of 10 µM guanabenz increased the NO level by 54.5±9.0% (Fig. 3b, c).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в механизмы снижения индуцированных изопротеренолом потенциал-зависимых Са²⁺-токов α₂-адреноагонистами вовлекается NO-опосредуемая сигнальная система.Thus, the obtained results indicate that the NO-mediated signaling system is involved in the mechanisms of reduction of voltage-dependent Ca ²⁺ currents induced by isoproterenol by α ₂ -adrenergic agonists.

Роль серин/треониновых протеинфосфатаз в реализации эффектов α₂-адреноагон истовThe role of serine/threonine protein phosphatases in the implementation of the effects of α ₂ -adrenoagonists

При активации α₂-адренорецепторов происходит стимуляция гуанилатциклазы и синтез цГМФ [24]. цГМФ является еще одним внутриклеточным мессенджером, который может активировать некоторые изоформы серин/треониновых протеинфосфатаз [25]. Дефосфорилирование потенциал-управляемых Са²⁺-каналов фосфатазами (преимущественно изоформами 1 и 2А, РР1 и РР2А) по остаткам серина и/или треонина - не менее важный фактор регулировки Са²⁺-токов в сердечных клетках, чем протеинкиназные влияния [26]. Поэтому, мы предположили, что в действие α₂-адреноагонистов могут вовлекаться фосфатазы, меняя, таким образом, киназно-фосфатазный баланс. Для проверки вовлеченности РР1 и/или РР2А в сигнализации, запускаемой от α₂-адренорецепторов, был использован общий ингибитор указанных протеинфосфатаз - каликулин А (0.5 мкМ). Его подача в экспериментальную камеру приводила к двукратному увеличению амплитуды (плотности) потенциал-управляемых Са²⁺-токов (на 95.6±7.8%, n=10), что, вероятно, было связано со сдвигом киназно-фосфатазного равновесия в сторону фосфорилирования (рис. 4а, б).Upon activation of _α2 -adrenergic receptors, guanylate cyclase is stimulated and cGMP is synthesized [24]. cGMP is another intracellular messenger that can activate some isoforms of serine/threonine protein phosphatases [25]. Dephosphorylation of voltage-gated ^Ca2+ channels by phosphatases (mainly isoforms 1 and 2A, PP1 and PP2A) at serine and/or threonine residues is no less important factor in the regulation of ^Ca2+ currents in cardiac cells than protein kinase effects [26]. Therefore, we assumed that phosphatases may be involved in the action of α ₂ -adrenoagonists, thus changing the kinase-phosphatase balance. To test the involvement of PP1 and/or PP2A in signaling triggered by α ₂ -adrenergic receptors, a common inhibitor of these protein phosphatases, caliculin A (0.5 μM), was used. Its supply to the experimental chamber led to a twofold increase in the amplitude (density) of voltage-controlled Ca ²⁺ currents (by 95.6±7.8%, n=10), which was probably associated with a shift in the kinase-phosphatase balance towards phosphorylation (Fig. 4a, b).

Несмотря на повышенные значения амплитуды токов, входящих в клетку при действии каликулина А через потенциал-зависимые Са²⁺-каналы, константа канальной полуинактивации достоверно увеличивалась до 20.8±2.6 мс (vs. 14.5±1.9 мс в контроле, n=5, р≤0.05, рис. 4в), что говорит о замедлении перехода каналов в инактивированное состояние, индуцируемое блокадой статуса дефосфорилирования. Действие гуанабенца (10 мкМ) на фоне каликулина А существенно ослабляется (снижение Са²⁺-токов на 12.6±4.1%, n=5, рис. 4б), что достоверно не отличается от действия ингибитора протеинфосфатаз в одиночку, и свидетельствует о вовлечении активности фосфатаз в α₂-адренорецептор-опосредуемую сигнализацию. Гуанабенц предотвращал вызванное каликулином А замедление перехода Са²⁺-каналов в инактивированное состояние, возвращая его к значениям не отличающимся от контроля (17.6±2.5 мс, р≥0.05, n=5, рис. 4в).Despite the increased amplitude of the currents entering the cell under the action of caliculin A through voltage-dependent Ca ²⁺ channels, the channel semi-inactivation constant significantly increased to 20.8±2.6 ms (vs. 14.5±1.9 ms in control, n=5, р≤ 0.05, Fig. 4c), which indicates a slowdown in the transition of channels to an inactivated state induced by blockade of the dephosphorylation status. The effect of guanabenz (10 μM) against the background of caliculin A is significantly weakened (decrease in Ca ²⁺ currents by 12.6±4.1%, n=5, Fig. 4b), which does not significantly differ from the effect of the protein phosphatase inhibitor alone, and indicates the involvement of the activity phosphatases in α ₂ -adrenergic receptor-mediated signaling. Guanabenz prevented caliculin A-induced slowing down of Ca ²⁺ channel transition to an inactivated state, returning it to values not different from control (17.6±2.5 ms, p≥0.05, n=5, Fig. 4c).

Для подтверждения участия фосфатаз в действии α₂-адреноагонистов были проведены прямые измерения активности серин/треониновых фосфатаз в миокардиальной ткани. Гуанабенц дозозависимым образом увеличивает в миокарде величину фосфатазной реакции (рис. 5).To confirm the involvement of phosphatases in the action of α ₂ -adrenergic agonists, direct measurements of the activity of serine/threonine phosphatases in myocardial tissue were carried out. Guanabenz dose-dependently increases the magnitude of the phosphatase reaction in the myocardium (Fig. 5).

В концентрациях 10 и 20 мкМ он повышает общую активность серин/треониновых фосфатаз на 21.0±3.6% (n=4, р≤0.05) и 33.0±5.0% (n=5, р≤0.05), соответственно. Для дополнительного валидирования протокола определения фосфатазной активности, был использован прямой донор NO - SNAP (S-нитрозо-N-ацетил-пеницилламин), который, как известно, увеличивает активность РР2А, РР2В и некоторых других фосфатаз. SNAP (100 мкМ) повышал величину фосфатазной реакции на 15.5±7.8% (n=5, р≤0.05, рис. 5), и его совместная аппликация с 20 мкМ гуанабенца проявляла синергизм их действия: активность серин/треониновых фосфатаз увеличивалась на 66.0±23.0%. Таким образом, активация α₂-адренорецепторной системы в условиях гиперактивации β-адренорецепторов в кардиомиоцитах, РКА-независимо снижает потенциал-управляемые Са²⁺-токи, и ключевыми механизмами наблюдаемого подавления проницаемости Са²⁺-каналов является синтез NO и стимуляция серин/треониновых фосфатаз.At concentrations of 10 and 20 µM, it increases the total activity of serine/threonine phosphatases by 21.0±3.6% (n=4, p≤0.05) and 33.0±5.0% (n=5, p≤0.05), respectively. For additional validation of the protocol for determining phosphatase activity, a direct NO donor - SNAP (S-nitroso-N-acetyl-penicillamine) was used, which is known to increase the activity of PP2A, PP2B and some other phosphatases. SNAP (100 µM) increased the phosphatase reaction by 15.5±7.8% (n=5, p≤0.05, Fig. 5), and its joint application with 20 µM guanabenz showed synergism of their action: the activity of serine/threonine phosphatases increased by 66.0± 23.0%. Thus, activation of the α ₂ -adrenergic system under conditions of hyperactivation of β-adrenergic receptors in cardiomyocytes, PKA-independently reduces voltage-controlled Ca ²⁺ currents, and the key mechanisms of the observed suppression of the permeability of Ca ²⁺ channels are NO synthesis and stimulation of serine/threonine phosphatase.

Внутриклеточный уровень Са²⁺ и α₂-адреноагонистыIntracellular level of Ca ²⁺ and α ₂ -adrenergic agonists

α₂-Адреноагонисты сами по себе снижают внутриклеточный уровень свободного кальция в кардиомиоцитах. Гуанабенц дозо-зависимым образом снижал [Ca²⁺]_jn на 3.1±2.2% (n=6), 28.0±6.3% (n=8), 48.9±7.3% (n=6), 64.9±11.2% (n=8) в концентрациях 1, 10, 20 и 50 мкМ, соответственно (рис. 6а). Кривая дозо-зависимости действия гуанабенца хорошо аппроксимировалась стандартным уравнением Хилла с константой полуингибирования IC₅₀=13.2±1.3 мкМ, максимальным уровнем ингибирования 27.0±4.7% относительно контроля, и коэффициентом Хилла, равным 1.6±0.2.α ₂ -Adrenoagonists themselves reduce the intracellular level of free calcium in cardiomyocytes. Guanabenz dose-dependently reduced [Ca ²⁺ ] _jn by 3.1±2.2% (n=6), 28.0±6.3% (n=8), 48.9±7.3% (n=6), 64.9±11.2% (n= 8) at concentrations of 1, 10, 20, and 50 µM, respectively (Fig. 6a). The dose-response curve for guanabenz was well approximated by the standard Hill equation with a half-inhibition constant IC ₅₀ =13.2±1.3 µM, a maximum inhibition level of 27.0±4.7% relative to control, and a Hill coefficient of 1.6±0.2.

Эффект гуанабенц ацетата предотвращался на фоне блокатора α₂-адренорецепторов - раувольсцина (с 64.9±11.2% - для концентрации 50 мкМ до 11.6±8.3%, n=7, р≤0.05, рис. 6б, г), и ингибиторов сопряженного с этими рецепторами сигнального пути, вортманнина для фосфатидилинозитол-3-киназы (до 13.6±7.8%, n=9, р≤0.05, рис. 6в, г) и Akt1/2 киназы ингибитора (до 5.4±6.6%, n=7, р≤0.05, рис. 6в, г). Полученные данные указывают на важность α₂-адренорецепторов для регуляции внутриклеточного уровня кальция в кардиомиоцитах, и, судя по отсутствию в кардиологической литературе статей, посвященных этому вопросу, являются первой прямой демонстрацией влияния агонистов α₂-адренорецепторов на [Са²⁺]_in в клетках сердечной мышцы.The effect of guanabenz acetate was prevented against the background of the α ₂ -adrenergic receptor blocker - rauwolscine (from 64.9±11.2% - for a concentration of 50 μM to 11.6±8.3%, n=7, p≤0.05, Fig. 6b, d), and inhibitors associated with these signaling pathway receptors, wortmannin for phosphatidylinositol-3-kinase (up to 13.6±7.8%, n=9, р≤0.05, Fig. 6c, d) and Akt1/2 kinase inhibitor (up to 5.4±6.6%, n=7, р ≤0.05, Fig. 6c, d). The data obtained indicate the importance of α ₂ -adrenergic receptors for the regulation of intracellular calcium levels in cardiomyocytes, and, judging by the absence of articles on this issue in the cardiology literature, they are the first direct demonstration of the effect of α ₂ -adrenergic receptor agonists on [Ca ²⁺ ] _in in cells. heart muscle.

Установлено, что NO, изначально открытый как эндотелий-релаксирующий фактор, расслабляет гладкомышечные клетки сосудов и мышечную ткань миокарда. Ряд NO-высвобождающих доноров хорошо известны в клинической практике для купирования острых приступов стенокардии, аритмиях разного генеза и повышению расслабляемости миокарда. Кроме того, нами обнаружено, что NO приводит к повышению активности Са²⁺-АТФазы саркоплазматического ретикулума (SERCA), что в конечном счете, снижает уровень свободного кальция и препятствует Са²⁺-перегрузке сердечных клеток (рис. 7). В модельных животных спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) способность NO стимулировать SERCA существенно снижена (рис. 7), что могло бы быть решено за счет экзогенного введения доноров NO. Особенно актуально рассматривать эту возможность исходя из установленного антигипертрофического действия NO, когда регулярное введение приводит к регрессии увеличенной мышечной ткани миокарда, а соотношение массы левого желудочка к массе сердца ревертируется к контрольным значениям. Кроме того, в работе [27] было показано, что α₂-адреноагонист гуанабенц предотвращал возникновение аритмии, вызванное высокими доза изопротеренола или индукторами массового Са²⁺-выброса из депо - тапсигаргина и туникамицина.It has been established that NO, originally discovered as an endothelial-relaxing factor, relaxes vascular smooth muscle cells and myocardial muscle tissue. A number of NO-releasing donors are well known in clinical practice for the relief of acute attacks of angina pectoris, arrhythmias of various origins and increasing myocardial relaxation. In addition, we found that NO leads to an increase in the activity of Ca ²⁺ -ATPase of the sarcoplasmic reticulum (SERCA), which ultimately reduces the level of free calcium and prevents Ca ²⁺ overload of cardiac cells (Fig. 7). In model animals of spontaneously hypertensive rats (SHR), the ability of NO to stimulate SERCA is significantly reduced (Fig. 7), which could be resolved by exogenous administration of NO donors. It is especially relevant to consider this possibility based on the established antihypertrophic effect of NO, when regular administration leads to regression of increased myocardial muscle tissue, and the ratio of the mass of the left ventricle to the mass of the heart is reverted to control values. In addition, it was shown in [27] that the α ₂ -adrenergic agonist guanabenz prevented the occurrence of arrhythmias caused by high doses of isoproterenol or inducers of massive Ca ²⁺ release from the depot - thapsigargin and tunikamycin.

Таким образом, доноры NO потенцируют эффекты α₂-адреноагонистов, повышая эффективность функционирования сердечных клеток. Синергизм их действия позволяет снизить эффективные дозы для приема, что минимизирует риски и/или возможные побочные действия.Thus, NO donors potentiate the effects of α ₂ -adrenergic agonists, increasing the efficiency of the functioning of cardiac cells. The synergy of their action allows you to reduce the effective dose for admission, which minimizes the risks and / or possible side effects.

Технический результат настоящего изобретения заключается в том, что использование композиции обеспечивает синергизм совместного действия β-адреноблокаторов и α2-адренергических агонистов, который позволит снизить эффективные терапевтические дозы каждого из соединений, что неизбежно приведет к минимизации возможных побочных эффектов, связанных с приемом данных соединений, а третий компонент в виде донора NO потенцирует действие α2-адренергических агонистов в отношении активации серин/треониновых фосфатаз, что приводит к более эффективному контролю над сократимостью миокарда и снижает риски возникновения кальциевой перегрузки рабочих кардиомиоцитов, предотвращая развитие патологических событий в сердце.The technical result of the present invention lies in the fact that the use of the composition provides a synergy of the combined action of β-blockers and α2-adrenergic agonists, which will reduce the effective therapeutic doses of each of the compounds, which will inevitably lead to minimization of possible side effects associated with the intake of these compounds, and the third component in the form of an NO donor potentiates the action of α2-adrenergic agonists in relation to the activation of serine / threonine phosphatases, which leads to more effective control of myocardial contractility and reduces the risk of calcium overload of working cardiomyocytes, preventing the development of pathological events in the heart.

Преимущества по сравнению с имеющимися аналогами:Advantages compared to existing analogues:

1) Синергизм (усиление) совместного действия α2-адреноагонистов и β-адреноблокаторов позволит снизить эффективные терапевтические дозы каждого из соединений, что неизбежно приведет к минимизации возможных побочных эффектов, связанных с приемом данных соединений.1) Synergism (enhancement) of the joint action of α2-adrenoagonists and β-blockers will reduce the effective therapeutic doses of each of the compounds, which will inevitably lead to minimization of possible side effects associated with the intake of these compounds.

2) Синергизм (усиление) совместного действия α2-адреноагонистов и донора NO позволит дополнительно снизить эффективные дозы α2-адреноагонистов, что в еще большей степени уменьшит нежелательные побочные реакции.2) Synergism (enhancement) of the joint action of α2-adrenoagonists and NO donor will further reduce the effective doses of α2-adrenoagonists, which will further reduce unwanted side reactions.

Преимущества фиксированных комбинаций препаратов в одной таблетке ранее были исследованы и показана их эффективность. Так, Egan и соавт. обнаружили, что использование фиксированной комбинации, в отличие от свободной комбинации тех же препаратов, приводит к значительному улучшению контроля уровня артериального давления [10], а по данным метаанализа Gupta и соавт. к повышению приверженности больных терапии [28].The advantages of fixed combinations of drugs in one tablet have previously been investigated and shown to be effective. For example, Egan et al. found that the use of a fixed combination, in contrast to the free combination of the same drugs, leads to a significant improvement in blood pressure control [10], and according to a meta-analysis by Gupta et al. to increase adherence of patients to therapy [28].

Литература.Literature.

[1] World Health Statistics 2016: Monitoring health for the SDGs. Geneva: World Health Organization; 2016. http://www.who.int/gho/publications/world_health_statistics/2016/en/[1] World Health Statistics 2016: Monitoring health for the SDGs. Geneva: World Health Organization; 2016. http://www.who.int/gho/publications/world_health_statistics/2016/en/

[2] O.E. Brodde, Beta-adrenoceptor blocker treatment and the cardiac beta-adrenoceptor-G-protein(s)-adenylyl cyclase system in chronic heart failure, Naunyn Schmiederbergs Arch. Pharmacol. 374 (2016) 361-372.[2] O.E. Brodde, Beta-adrenoceptor blocker treatment and the cardiac beta-adrenoceptor-G-protein(s)-adenylyl cyclase system in chronic heart failure, Naunyn Schmiederbergs Arch. Pharmacol. 374 (2016) 361-372.

[3] A. Cannavo, G. Rengo, D. Liccardo, A. Pun, E. Gao, A.J. George, G. Gambino, A. Rapacciuolo, D. Leosco, B. Ibanez, N. Ferrara, N. Paolocci, W.J. Koch, Pi-Blockade Prevents Post-Ischemic Myocardial Decompensation Via PsAR-Dependent Protective Sphingosine-1 Phosphate Signaling, J. Am. Coll. Cardiol. 70 (2017) 182-192.[3] A. Cannavo, G. Rengo, D. Liccardo, A. Pun, E. Gao, A.J. George, G. Gambino, A. Rapacciuolo, D. Leosco, B. Ibanez, N. Ferrara, N. Paolocci, W.J. Koch, Pi-Blockade Prevents Post-Ischemic Myocardial Decompensation Via PsAR-Dependent Protective Sphingosine-1 Phosphate Signaling, J. Am. Coll. cardiol. 70 (2017) 182-192.

[4] J. Hong, A.R. Barry, Long-term beta-blocker therapy after myocardial infarction in the reperfusion era: a systematic review, Pharmacotherapy 38 (2018) 546-554.[4] J. Hong, A.R. Barry, Long-term beta-blocker therapy after myocardial infarction in the reperfusion era: a systematic review, Pharmacotherapy 38 (2018) 546-554.

[5] J.G. Baker, R.G. Wilcox, β-blockers, heart disease and COPD: current controversies and uncertainties, Thorax 72 (2017) 271-276.[5] J.G. Baker, R.G. Wilcox, β-blockers, heart disease and COPD: current controversies and uncertainties, Thorax 72 (2017) 271-276.

[6] L. Hansson, L.H. Lindholm, T. Ekbom, B. Dahlof, J. Lanke, B. Schersten, P.O. Wester, T. Hedner, U. de Faire, Randomised trial of old and new antihypertensive drugs in elderly patients: cardiovascular mortality and morbidity the Swedish Trial in Old Patients with Hypertension-2 study, Lancet 354 (1999) 1751-1756.[6] L. Hansson, L.H. Lindholm, T. Ekbom, B. Dahlof, J. Lanke, B. Schersten, P.O. Wester, T. Hedner, U. de Faire, Randomised trial of old and new antihypertensive drugs in elderly patients: cardiovascular mortality and morbidity the Swedish Trial in Old Patients with Hypertension-2 study, Lancet 354 (1999) 1751-1756.

[7] Brook R.D., Mechanism of Differential Effects of Antihypertensive Agents on Serum Lipids, Curr Hypertens Rep. 2 (2000) 370-377.[7] Brook R.D., Mechanism of Differential Effects of Antihypertensive Agents on Serum Lipids, Curr Hypertens Rep. 2 (2000) 370-377.

[8] J.H. Karnes, R.M. Cooper-DeHoff, Antihypertensive medications: benefits of blood pressure lowering and hazards of metabolic effects, Expert Rev Cardiovasc Ther. 7 (2009) 689-702.[8] J.H. Karnes, R.M. Cooper-DeHoff, Antihypertensive medications: benefits of blood pressure lowering and hazards of metabolic effects, Expert Rev Cardiovasc Ther. 7 (2009) 689-702.

[9] B. Dahlof, P.S. Sever, N.R. Poulter et al., Prevention of cardiovascular events with an antihypertensive regimen of amlodipine adding perindopril as required versus atenolol adding bendroflumethiazide as required, in the Anglo-Scandinavian Cardiac Outcomes Trial-Blood Pressure Lowering Arm (ASCOT-BPLA): a multicentre randomised controlled trial, Lancet. 366 (2005) 895-906.[9] B. Dahlof, P.S. North, N.R. Poulter et al., Prevention of cardiovascular events with an antihypertensive regimen of amlodipine adding perindopril as required versus atenolol adding bendroflumethiazide as required, in the Anglo-Scandinavian Cardiac Outcomes Trial-Blood Pressure Lowering Arm (ASCOT-BPLA): a multicentre randomized controlled trial , Lancet. 366 (2005) 895-906.

[10] B.M. Egan, D. Bandyopadhyay, S.R. Shaftman et al., Initial monotherapy and combination therapy and hypertension control the first year, Hypertension. 59 (2012) 1124-1131.[10] B.M. Egan, D. Bandyopadhyay, S.R. Shaftman et al., Initial monotherapy and combination therapy and hypertension control the first year, Hypertension. 59 (2012) 1124-1131.

[11] A.U. Klingbeil, M. Schneider, P. Martus et al., A meta-analysis of the effects of treatment on left ventricular mass in essential hypertension, Am J Med. 115 (2003) 41-46.[11] A.U. Klingbeil, M. Schneider, P. Martus et al., A meta-analysis of the effects of treatment on left ventricular mass in essential hypertension, Am J Med. 115 (2003) 41-46.

[12] A. Ally, Cardiovascular effects of intravenous administration of clonidine in conscious cats, Brain Res. 810 (1998) 153-160.[12] A. Ally, Cardiovascular effects of intravenous administration of clonidine in conscious cats, Brain Res. 810 (1998) 153-160.

[13] C.C. Lang, C.M. Stein, H.B. He, et al., Blunted blood pressure response to central sympathoinhibition in normotensive blacks: increased importance of nonsympathetic factors in blood pressure maintenance in blacks, Hypertension. 30 (1997) 157-162.[13] C.C. Lang, C.M. Stein, H.B. He, et al., Blunted blood pressure response to central sympathoinhibition in normotensive blacks: increased importance of nonsympathetic factors in blood pressure maintenance in blacks, Hypertension. 30 (1997) 157-162.

[14] A.V. Maltsev, Y.M. Kokoz, E.V. Evdokimovskii, et al., Alpha-2 adrenoceptors and imidazoline receptors in cardiomyocytes mediate counterbalancing effect of agmatine on NO synthesis and intracellular calcium handling, J. Mol. Cell. Cardiol. 68 (2014) 66-74.[14] A.V. Maltsev, Y.M. Kokoz, E.V. Evdokimovskii, et al., Alpha-2 adrenoceptors and imidazoline receptors in cardiomyocytes mediate counterbalancing effect of agmatine on NO synthesis and intracellular calcium handling, J. Mol. cell. cardiol. 68 (2014) 66-74.

[15] P.A. van Zwieten, Centrally acting antihypertensives: a renaissance of interest. Mechanisms and haemodynamics, J. Hypertens. Suppl. 15 (1997) S3-8.[15] P.A. van Zwieten, Centrally acting antihypertensives: a renaissance of interest. Mechanisms and haemodynamics, J. Hypertens. Suppl. 15 (1997) S3-8.

[16] Y.M. Kokoz, E.V. Evdokimovskii, A.V. Maltsev, et al., Sarcolemmal α₂-adrenoceptors control protective cardiomyocyte-delimited sympathoadrenal response, J. Mol. Cell. Cardiol. 100 (2016) 9-20.[16] YM Kokoz, EV Evdokimovskii, AV Maltsev, et al., Sarcolemmal α ₂ -adrenoceptors control protective cardiomyocyte-delimited sympathoadrenal response, J. Mol. cell. cardiol. 100 (2016) 9-20.

[17] A.B. Мальцев, Ю.М. Кокоз, Периферические эффекты взаимодействия α2-адренергических и имидазолиновых агонистов в изолированных кардиомиоцитах, Кардиология. 59 (2019) 52-63.[17] A.B. Maltsev, Yu.M. Kokoz, Peripheral effects of the interaction of α2-adrenergic and imidazoline agonists in isolated cardiomyocytes, Cardiology. 59 (2019) 52-63.

[18] D.M. Bers, Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes, Annu. Rev. Physiol. 70 (2008) 23-49.[18] D.M. Bers, Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes, Annu. Rev. physiol. 70 (2008) 23-49.

[19] Z.Z. Tang, P. Liao, G. Li, et al., Differential splicing patterns of L-type calcium channel Ca_V 1.2. subunit in hearts of Spontaneously Hypertensive Rats and Wistar Kyoto Rats, Biochim. Biophys. Acta 1783 (2008) 118-130.[19] ZZ Tang, P. Liao, G. Li, et al., Differential splicing patterns of L-type calcium channel Ca _V 1.2. subunit in hearts of Spontaneously Hypertensive Rats and Wistar Kyoto Rats, Biochim. Biophys. Acta 1783 (2008) 118-130.

[20] L. Shi, H. Zhang, Y. Chen, et al., Chronic exercise normalizes changes in Ca_V 1.2 and K_Ca 1.1 channels in mesenteric arteries from spontaneously hypertensive rats, Br. J. Pharmacol. 172 (2015) 1846-1858.[20] L. Shi, H. Zhang, Y. Chen, et al., Chronic exercise normalizes changes in Ca _V 1.2 and K _Ca 1.1 channels in mesenteric arteries from spontaneously hypertensive rats, Br. J Pharmacol. 172 (2015) 1846-1858.

[21] F. Pluteanu, J. Heβ, J. Plackic, et al., Early subcellular Ca²⁺ remodelling and increased propensity for Ca²⁺ alternans in left atrial myocytes from hypertensive rats, Cardiovasc. Res. 106 (2015) 87-97.[21] F. Pluteanu, J. Heβ, J. Plackic, et al., Early subcellular Ca ²⁺ remodeling and increased propensity for Ca ²⁺ alternans in left atrial myocytes from hypertensive rats, Cardiovasc. Res. 106 (2015) 87-97.

[22] M. Poomvanicha, J. Matthes, K. Domes, et al., Beta-adrenergic regulation of the heart expressing the Ser1700A/Thr1704A mutated Ca_V 1.2 channel, J. Mol. Cell. Cardiol. 111 (2017)10-16.[22] M. Poomvanicha, J. Matthes, K. Domes, et al., Beta-adrenergic regulation of the heart expressing the Ser1700A/Thr1704A mutated Ca _V 1.2 channel, J. Mol. cell. cardiol. 111(2017)10-16.

[23] S.M. MacDonnell, H. Kubo, D.L. Crabbe, et al., Improved myocardial beta-adrenergic responsiveness and signaling with exercise training in hypertension, Circulation 111 (2005)3420-3428.[23] S.M. MacDonnell, H. Kubo, D.L. Crabbe, et al., Improved myocardial beta-adrenergic responsiveness and signaling with exercise training in hypertension, Circulation 111 (2005) 3420-3428.

[24] R. Fischmeister, L. Castro, A. Abi-Gerges, et al., Species- and tissue-dependent effects of NO and cyclic GMP on cardiac ion channels, Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 142 (2005) 136-143.[24] R. Fischmeister, L. Castro, A. Abi-Gerges, et al., Species- and tissue-dependent effects of NO and cyclic GMP on cardiac ion channels, Comp. Biochem. physiol. A Mol. integration physiol. 142 (2005) 136-143.

[25] D. Zhuang, A.C. Ceacareanu, B. Ceacareanu, et al., Essential role of protein kinase G and decreased cytoplasmic Ca²⁺ levels in NO-induced inhibition of rat aortic smooth muscle cell motility, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288 (2005) 1859-1866.[25] D. Zhuang, AC Ceacareanu, B. Ceacareanu, et al., Essential role of protein kinase G and decreased cytoplasmic Ca ²⁺ levels in NO-induced inhibition of rat aortic smooth muscle cell motility, Am. J Physiol. Heart Circ. physiol. 288 (2005) 1859-1866.

[26] W.H. duBell, T.B. Rogers, Protein phosphatase 1 and an opposing protein kinase regulate steady-state L-type Ca²⁺ current in mouse cardiac myocytes, J. Physiol. 556 (2004) 79-93.[26] WH duBell, TB Rogers, Protein phosphatase 1 and an opposing protein kinase regulate steady-state L-type Ca ²⁺ current in mouse cardiac myocytes, J. Physiol. 556 (2004) 79-93.

[27] C. Neuber, J. Uebeler, T. Schulze, et al., Guanabenz interferes with ER stress and exerts protective effects in cardiac myocytes, PLoS One. 9 (2014) e98893. doi: 10.1371/journal.pone.0098893.[27] C. Neuber, J. Uebeler, T. Schulze, et al., Guanabenz interferes with ER stress and exerts protective effects in cardiac myocytes, PLoS One. 9 (2014) e98893. doi: 10.1371/journal.pone.0098893.

[28] A.K. Gupta, S. Arshad, N.R. Poulter, Compliance, safety, and effectiveness of fixed-dose combinations of antihypertensive agents: a meta-analysis, Hypertension. 55 (2010) 399-407.[28] A.K. Gupta, S. Arshad, N.R. Poulter, Compliance, safety, and effectiveness of fixed-dose combinations of antihypertensive agents: a meta-analysis, Hypertension. 55 (2010) 399-407.

Claims

Composition for the treatment of arterial hypertension and associated pathologies of the cardiovascular system, consisting of a β-blocker, an _α2- adrenergic receptor agonist, a nitric oxide donor taken in therapeutically effective amounts, where the β-blocker is selected from bisoprolol, carvedilol, pindolol, atenolol , labetalol, where the α ₂ -adrenergic receptor agonist is selected from guanabenz, guanfacine, dexmedetomidine, tizanidine, clonidine, where the NO donor is selected from 3-nitroso-N-acetylpenicillamine, sodium nitroprusside, nitroglycerin, molsidomine.