RU2792447C1 - Method for the manufacture of biological microarrays for the detection of genetic and protein markers - Google Patents

Method for the manufacture of biological microarrays for the detection of genetic and protein markers Download PDF

Info

Publication number
RU2792447C1
RU2792447C1 RU2022117590A RU2022117590A RU2792447C1 RU 2792447 C1 RU2792447 C1 RU 2792447C1 RU 2022117590 A RU2022117590 A RU 2022117590A RU 2022117590 A RU2022117590 A RU 2022117590A RU 2792447 C1 RU2792447 C1 RU 2792447C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
chitosan
biological
microarrays
manufacture
genetic
Prior art date
Application number
RU2022117590A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Денис Валерьевич Уткин
Михаил Николаевич Киреев
Константин Алексеевич Никифоров
Оксана Александровна Волох
Original Assignee
Федеральное казенное учреждение науки "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУН "Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора")
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное казенное учреждение науки "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУН "Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора") filed Critical Федеральное казенное учреждение науки "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУН "Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора")
Application granted granted Critical
Publication of RU2792447C1 publication Critical patent/RU2792447C1/en

Links

Images

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology. A method for the manufacture of biological microarrays for the detection of genetic and protein markers on an inert substrate activated with a 1% solution of chitosan, m.m., is described. 38 kDa in 1.5% acetic acid, followed by washing in distilled water, drying and further application of biological molecules.
EFFECT: invention can be used for the manufacture of oligonucleotide, protein, carbohydrate biological microarrays (microarrays) intended for the detection of genetic and protein markers in multivariate analysis on a solid surface activated with a biopolymer - chitosan.
1 cl, 2 dwg, 2 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для изготовления олигонуклеотидных, белковых, углеводных биологических микрочипов (микроматриц), предназначенных для выявления генетических и белковых маркеров в многофакторном анализе на твердой поверхности, активированной биополимером - хитозаном.The invention relates to the field of biotechnology and can be used for the manufacture of oligonucleotide, protein, carbohydrate biological microarrays (microarrays) intended for the detection of genetic and protein markers in multivariate analysis on a solid surface activated with a biopolymer - chitosan.

Для изготовления ДНК-, белковых и углеводных микроматриц используются полимерные гидрогели [1, 2]. Существенным недостатком трехмерных гидрогелевых микрочипов является низкая скорость диффузии биологических молекул внутрь объема геля, требующая многочасовой экспозиции, что практически нивелирует преимущество, полученное в результате неспецифической иммобилизации молекул.Polymer hydrogels are used to fabricate DNA, protein, and carbohydrate micromatrices [1, 2]. A significant disadvantage of three-dimensional hydrogel microarrays is the low rate of diffusion of biological molecules into the gel volume, which requires many hours of exposure, which practically eliminates the advantage obtained as a result of nonspecific immobilization of molecules.

У двумерных микрочипов биологические молекулы адсорбированы на поверхности или ковалентно связаны с подложкой и непосредственно контактируют с исследуемым материалом, что существенно сокращает время анализа и упрощает технологию изготовления микрочипа.In two-dimensional microarrays, biological molecules are adsorbed on the surface or covalently bonded to the substrate and directly contact the material under study, which significantly reduces the analysis time and simplifies the microchip fabrication technology.

Неспецифическое связывание биологических молекул методом адсорбции (например, при использовании нитроцеллюлозных мембран) обеспечивает непрочное связывание молекул с поверхностью, что ведет к их вымыванию в процессе анализа и снижению чувствительности.Nonspecific binding of biological molecules by adsorption (for example, when using nitrocellulose membranes) provides unstable binding of molecules to the surface, which leads to their washing out during the analysis and a decrease in sensitivity.

Для ковалентного связывания биологических молекул поверхность подложки микрочипа подвергают химической модификации для введения функциональных групп, что обеспечивает прочное связывание биологических молекул с поверхностью носителя.For covalent binding of biological molecules, the microchip substrate surface is subjected to chemical modification to introduce functional groups, which ensures strong binding of biological molecules to the carrier surface.

Для изготовления ДНК-, белковых и углеводных микроматриц путем ковалентного связывания функциональных групп биологических молекул используются модифицированные поверхности активированные кремнийорганическими соединениями - силанами с эпокси-, амино- и альдегидными группами [3, 4]. Кремнийорганические соединения и способ их изготовления характеризуются высокой себестоимостью. При этом ковалентное связывание происходит, в ряде случаев, за счет присутствия в биологических молекулах аминогрупп. Белковые молекулы в своей структуре имеют экспонированные амино- и карбоксильные группы, поэтому они не требуют дополнительной модификации. Для ковалентного связывания олигонуклеотидов и углеводных (липополисахаридных (ЛПС)) молекул требуется их модификация с ведением функциональной аминогруппы [5].Modified surfaces activated by organosilicon compounds - silanes with epoxy, amino, and aldehyde groups are used to fabricate DNA, protein, and carbohydrate micromatrices by covalent binding of functional groups of biological molecules [3, 4]. Silicone compounds and the method of their manufacture are characterized by high cost. In this case, covalent bonding occurs, in some cases, due to the presence of amino groups in biological molecules. Protein molecules have exposed amino and carboxyl groups in their structure, so they do not require additional modification. Covalent binding of oligonucleotides and carbohydrate (lipopolysaccharide (LPS)) molecules requires their modification with the addition of a functional amino group [5].

В то же время, известно, что биополимер хитозан обладает высокой липополисахаридсвязывающей активностью и высокой сорбционной емкостью [6-8]. Хитозан представляет собой N-деацетилированное производное природного полисахарида хитина, получаемое в результате отщепления ацетильной группы. Хитозан является линейным сополимером N-ацетил-D-глюкозамина и D-глюкозамина, имеющим дополнительную реакционноспособную функциональную аминогруппу. Хитозан образует с молекулами ЛПС стабильный комплекс. Взаимодействие между ЛПС и хитозаном происходит при участии положительно заряженных аминогрупп хитозана и отрицательно заряженных фосфатных и карбоксильных групп липида А и олигосахарида кора ЛПС [7, 8]. Кроме того, хитозан обладает низкой себестоимостью, является биоразлагаемым и экологически чистым биополимером.At the same time, it is known that the chitosan biopolymer has a high lipopolysaccharide-binding activity and a high sorption capacity [6–8]. Chitosan is an N-deacetylated derivative of the natural polysaccharide chitin obtained by cleavage of the acetyl group. Chitosan is a linear copolymer of N-acetyl-D-glucosamine and D-glucosamine with an additional reactive amino functional group. Chitosan forms a stable complex with LPS molecules. The interaction between LPS and chitosan occurs with the participation of positively charged amino groups of chitosan and negatively charged phosphate and carboxyl groups of lipid A and oligosaccharide of the LPS core [7, 8]. In addition, chitosan has a low cost, is a biodegradable and environmentally friendly biopolymer.

Описан способ изготовления гидрофобного стекла, покрытого хитозаном, не предназначенного для иммобилизации биологических молекул [Патент РФ №2494984]. Известен способ изготовления подложек, покрытых хитозаном, где в качестве подложки выступают целлюлозосодержащие материалы - бумага, картон и др., также не предназначенные для иммобилизации биологических молекул [Заявка на изобретение №2013158317]. Описан способ изготовления стекла, покрытого хитозаном, для изготовления, так называемых, «клеточных» биочипов для анализа единичных соматических клеток [9]. При этом хитозан иммобилизуется на поверхности стекла с использованием гидроксилов, а сам хитозан активируется поли(этиленгликоль) диглицидиловым эфиром. Известен способ изготовления планарного оптического сенсора на основе инертного носителя (стекла), покрытого наночастицами металлов и микропористым хитозаном, модифицированного л-акцепторным соединением, способным распознавать полиароматические гетероциклические серосодержащие соединения в нефтепродуктах [Патент РФ №2572801].A method for manufacturing hydrophobic glass coated with chitosan, not intended for the immobilization of biological molecules, is described [RF Patent No. 2494984]. A known method of manufacturing substrates coated with chitosan, where the substrate is cellulose-containing materials - paper, cardboard, etc., also not intended for immobilization of biological molecules [Application for invention No. 2013158317]. A method for manufacturing glass coated with chitosan is described for the manufacture of so-called “cellular” biochips for the analysis of single somatic cells [9]. In this case, chitosan is immobilized on the glass surface using hydroxyls, and chitosan itself is activated by poly(ethylene glycol) diglycidyl ether. A known method of manufacturing a planar optical sensor based on an inert carrier (glass) coated with metal nanoparticles and microporous chitosan, modified with a p-acceptor compound capable of recognizing polyaromatic heterocyclic sulfur-containing compounds in petroleum products [RF Patent No. 2572801].

Также известен способ изготовления планарного оптического сенсора на основе инертного носителя (стекла), покрытого наночастицами металлов и мелкопористым полиэлектролитом, в частности, хитозаном [Заявка на изобретение №2016148003]. Сенсор предназначен для анализа белковых молекул, находящихся в жидкой пробе, методом спектроскопии комбинационного рассеяния.Also known is a method for manufacturing a planar optical sensor based on an inert carrier (glass) coated with metal nanoparticles and a finely porous polyelectrolyte, in particular, chitosan [Application for invention No. 2016148003]. The sensor is intended for the analysis of protein molecules in a liquid sample using Raman spectroscopy.

Задачей изобретения является разработка более простого и экономичного способа изготовления биологических (ДНК-, белковых и углеводных) микроматриц.The objective of the invention is to develop a simpler and more economical method for the manufacture of biological (DNA, protein and carbohydrate) microarrays.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в упрощении технологии изготовления биологических (ДНК-, белковых и углеводных) микроматриц, снижении себестоимости, увеличении экспрессности, селективности и чувствительности выявления генетических и белковых маркеров в многофакторном анализе.The technical result of the claimed invention is to simplify the manufacturing technology of biological (DNA-, protein and carbohydrate) micromatrices, reduce costs, increase expressivity, selectivity and sensitivity of detection of genetic and protein markers in multivariate analysis.

Технический результат достигается способом изготовления биологических микроматриц, который предусматривает: изготовление двумерных микрочипов на основе инертной подложки (стекла), которую активируют в растворе 1% хитозана с молекулярной массой 38 кДа в 1,5% уксусной кислоте; инкубацию в течение 5-10 мин при комнатной температуре; последующую отмывку дистиллированной водой в течение 5 мин при комнатной температуре, высушивание на воздухе и дальнейшее нанесение биологических молекул на активированную хитозаном подложку методом контактной печати с использованием миниплоттера, причем каждый образец биологических молекул, разведенных в соотношении 1:1 в соответствующем буфере для печати, наносят на поверхность в трех повторах в виде 12-16 идентичных зон на одном слайде.The technical result is achieved by a method for manufacturing biological microarrays, which involves: manufacturing two-dimensional microchips based on an inert substrate (glass), which is activated in a solution of 1% chitosan with a molecular weight of 38 kDa in 1.5% acetic acid; incubation for 5-10 min at room temperature; subsequent washing with distilled water for 5 min at room temperature, drying in air and further application of biological molecules on a chitosan-activated substrate by contact printing using a miniplotter, with each sample of biological molecules diluted 1:1 in the appropriate printing buffer being applied on the surface in three repetitions in the form of 12-16 identical zones on one slide.

Активация инертной подложки хитозаном обеспечивает одновременно ковалентное связывание и адсорбцию биологических молекул различной природы (нуклеиновых кислот, белков, углеводов, липидов) без дополнительных этапов их модификации аминогруппами и активации хитозана. Повышение экспрессности анализа достигается за счет использования двумерной конструкции микроматриц. Количественно повышение чувствительности анализа связано с увеличением значений «сигнал/фон». Повышение значения «сигнал» достигается за счет прочного ковалентного связывания биологических молекул с хитозаном. Снижение значения «фон» достигается за счет прозрачности хитозана в области длин волн 300-800 нм детекции биологических молекул меченых флуоресцирующими красителями. Повышение селективности связано за счет использования специфических биологических молекул.Activation of an inert substrate with chitosan provides simultaneous covalent binding and adsorption of biological molecules of various nature (nucleic acids, proteins, carbohydrates, lipids) without additional stages of their modification with amino groups and chitosan activation. An increase in the rapidity of analysis is achieved through the use of a two-dimensional microarray design. Quantitatively, the increase in the sensitivity of the analysis is associated with an increase in the “signal/background” values. An increase in the "signal" value is achieved due to the strong covalent binding of biological molecules to chitosan. The decrease in the "background" value is achieved due to the transparency of chitosan in the wavelength range of 300-800 nm for the detection of biological molecules labeled with fluorescent dyes. The increase in selectivity is due to the use of specific biological molecules.

Новизна заявляемого изобретения заключается в том, что для изготовления ДНК-, белковых и углеводных микроматриц используется инертная подложка, покрытая хитозаном.The novelty of the claimed invention lies in the fact that an inert substrate coated with chitosan is used for the manufacture of DNA, protein and carbohydrate micromatrices.

Осуществление изобретения:Implementation of the invention:

Пример 1. Изготовление ДНК-микроматрицExample 1. Preparation of DNA microarrays

Препараты олигонуклеотидных зондов к специфическим генам Yersinia pestis

Figure 00000001
Figure 00000002
в концентрации 100 пмоль/мкл суспендируют в буфере (3М бетаин, 4х SSPE-буфер, 0,05% твин-20) в соотношении 1:1, наносят на поверхность микрочипа, активированного хитозаном, в объеме 2-3 нл. Иммобилизацию биологических молекул осуществляют при температуре 80°С в течение 20 мин.Preparations of oligonucleotide probes for specific genes of Yersinia pestis
Figure 00000001
Figure 00000002
at a concentration of 100 pmol/µl is suspended in a buffer (3M betaine, 4 x SSPE buffer, 0.05% tween-20) in a ratio of 1:1, applied to the surface of a microchip activated with chitosan, in a volume of 2-3 nl. Immobilization of biological molecules is carried out at a temperature of 80°C for 20 minutes.

Перед этапом ДНК-ДНК-гибридизации осуществляют предварительную блокировку поверхности ДНК-чипов. Для этого в лунки инкубационной камеры вносят по 100 мкл блокирующего раствора. Блокировку проводят на термошейкере при температуре 42°С в течение 30 мин при скорости вращения платформы 200 об/мин. Затем, содержимое из лунок аккуратно, не касаясь зоны эррея, отбирают с помощью вакуумного отсасывателя. Для промывки в лунки добавляют по 100 мкл отмывочного раствора 1, инкубируют при температуре 42°С в течение 5 мин при скорости вращения платформы 250 об/мин. Затем, содержимое из лунок аккуратно, не касаясь зоны эррея, отбирают с помощью вакуумного отсасывателя.Before the stage of DNA-DNA hybridization, preliminary blocking of the surface of DNA chips is carried out. To do this, 100 µl of blocking solution is added to the wells of the incubation chamber. Blocking is carried out on a thermoshaker at a temperature of 42°C for 30 min at a platform rotation speed of 200 rpm. Then, the contents from the wells are carefully, without touching the area of the array, taken using a vacuum aspirator. For washing, 100 μl of washing solution 1 is added to the wells, incubated at a temperature of 42°C for 5 min at a platform rotation speed of 250 rpm. Then, the contents from the wells are carefully, without touching the area of the array, taken using a vacuum aspirator.

Флуоресцентно меченые ПЦР-продукты, полученные на этапе амплификации, в объеме 10 мкл смешивают с гибридизационным буфером в объеме 70 мкл, прогревают в твердотельном термостате при температуре 95°С в течение 5 мин. В лунки инкубационной камеры вносят по 80 мкл прогретой гибридизационной смеси и инкубируют на термошейкере при температуре 42°С в течение 1,5-2 ч при скорости вращения платформы 200 об/мин. Затем, содержимое из лунок аккуратно, не касаясь зоны эррея, отбирают с помощью вакуумного отсасывателя. Стекла отмывают отмывочным раствором 1 при температуре 42°С в течение 3 мин при скорости вращения платформы 250 об/мин, путем добавления в каждую лунку по 100 мкл отмывочного раствора. Содержимое лунок аккуратно отбирают с помощью вакуумного отсасывателя. Затем, стекла отмывают отмывочным раствором при температуре 42°С в течение 2 мин при скорости вращения платформы 250 об/мин, путем добавления в каждую лунку по 100 мкл отмывочного раствора. Содержимое лунок аккуратно отбирают с помощью вакуумного отсасывателя. Далее стекла вынимают из рамок, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 1 мин. Регистрацию и учет результатов осуществляют с помощью флуоресцентного сканера. По результатам анализа уровень значений «сигнал/фон» с использованием подложки активированной хитозаном в 1,5 раза выше, чем при использовании аминомодифицированной подложки и в 20 раз, чем при использовании эпоксимодифицированной подложки.Fluorescently labeled PCR products obtained at the stage of amplification, in a volume of 10 μl, are mixed with a hybridization buffer in a volume of 70 μl, heated in a solid-state thermostat at a temperature of 95°C for 5 minutes. In the wells of the incubation chamber, 80 μl of the heated hybridization mixture is added and incubated on a thermoshaker at a temperature of 42°C for 1.5-2 hours at a platform rotation speed of 200 rpm. Then, the contents from the wells are carefully, without touching the area of the array, taken using a vacuum aspirator. The slides are washed with washing solution 1 at a temperature of 42°C for 3 min at a platform rotation speed of 250 rpm by adding 100 μl of washing solution to each well. The contents of the wells are carefully removed using a vacuum aspirator. Then, the slides are washed with a wash solution at 42°C for 2 min at a platform rotation speed of 250 rpm by adding 100 µl of wash solution to each well. The contents of the wells are carefully removed using a vacuum aspirator. Next, the glasses are taken out of the frames, rinsed with distilled water, dried by centrifugation at 1000 rpm for 1 min. Registration and accounting of results is carried out using a fluorescent scanner. According to the results of the analysis, the level of “signal/background” values using a chitosan-activated substrate is 1.5 times higher than when using an amino-modified substrate and 20 times higher than when using an epoxy-modified substrate.

На фиг.1 флуоресцентные профили результатов анализа выявления генетических маркеров Yersinia pestis. 1 - буфер для печати (отрицательный контроль), 2 - олигонуклеотидный зонд 3а, 3 - олигонуклеотидный зонд 45, 4 - олигонуклеотидный зонд irp2, 5 - олигонуклеотидный зонд pla, 6 - олигонуклеотидный зонд cafl, 7 - олигонуклеотидный зонд lcrV. А - аминомодифицированное стекло, Б - эпоксимодифицированное стекло, В - хитозанмодифицированное стекло.Figure 1 fluorescent profiles of the results of the analysis of the detection of genetic markers of Yersinia pestis. 1 - printing buffer (negative control), 2 - oligonucleotide probe 3a, 3 - oligonucleotide probe 45, 4 - oligonucleotide probe irp2, 5 - oligonucleotide probe pla, 6 - oligonucleotide probe cafl, 7 - oligonucleotide probe lcrV. A - amino-modified glass, B - epoxy-modified glass, C - chitosan-modified glass.

Пример 2. Изготовление белковых и углеводных (липополисахаридных) микроматриц и их использованиеExample 2. Production of protein and carbohydrate (lipopolysaccharide) microarrays and their use

Препараты биологических молекул белковой (холероген-анатоксин) и углеводной природы (O139, O1 Огава, O1 Инаба) Vibrio cholerae в концентрации 1 мг/мл суспендируют в буфере (1х фосфатно-солевой буфер (ФСБ), 5% глицерин, 0,01% твин-20) в соотношении 1:1, наносят на поверхность микрочипа, активированного хитозаном, в объеме 2-3 нл. Иммобилизацию биологических молекул осуществляют при температуре 60°С в течение 20 мин.Preparations of biological molecules of protein (cholerogen-anatoxin) and carbohydrate nature (O139, O1 Ogava, O1 Inaba) Vibrio cholerae at a concentration of 1 mg/ml are suspended in buffer (1x phosphate-buffered saline (PBS), 5% glycerol, 0.01% tween-20) in a ratio of 1:1 is applied to the surface of a microchip activated with chitosan in a volume of 2-3 nl. Immobilization of biological molecules is carried out at a temperature of 60°C for 20 minutes.

Исследуемые сыворотки вносят в лунки реакционных ячеек микроматриц, инкубируют на термошейкере при температуре 37°С в течение 1 ч со скоростью вращения платформы 300 об/мин. После инкубации стекла отмывают троекратно ФСБ и вносят конъюгаты антивидовых флуоресцирующих антител против IgG, IgM. Стекла инкубируют при температуре 37°С в течение 1 ч, отмывают троекратно ФСБ и высушивают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 1 мин. Регистрацию и учет результатов осуществляют с помощью флуоресцентного сканера. По результатам анализа уровень значений «сигнал/фон» с использованием подложки активированной хитозаном в 2 раза выше, чем при использовании аминомодифицированной подложки и в 10 раз, чем при использовании альдегидмодифицированной подложки.The test sera are added to the wells of the reaction cells of microarrays, incubated on a thermoshaker at a temperature of 37°C for 1 hour with a platform rotation speed of 300 rpm. After incubation, the glass is washed three times with PBS and conjugates of anti-species fluorescent antibodies against IgG, IgM are added. The slides are incubated at 37°C for 1 h, washed three times with PBS, and dried by centrifugation at 1000 rpm for 1 min. Registration and accounting of results is carried out using a fluorescent scanner. According to the results of the analysis, the level of “signal/background” values using a chitosan-activated substrate is 2 times higher than when using an amino-modified substrate and 10 times higher than when using an aldehyde-modified substrate.

На фиг.2 Флуоресцентные профили результатов анализа выявления специфических антител в сыворотке диагностической холерной 01. 8- буфер для печати (отрицательный контроль), 9 - O139-антиген, 10 - O1-антиген Огава, 11 - O1-антиген Инаба, 12 - холероген-анатоксин. А - аминомодифицированное стекло, Б -альдегидмодифицированное стекло, В - хитозанмодифицированное стекло.In Fig.2, Fluorescent profiles of the results of the analysis of the detection of specific antibodies in the serum of diagnostic cholera 01. 8 - print buffer (negative control), 9 - O139 antigen, 10 - Ogawa O1 antigen, 11 - Inaba O1 antigen, 12 - cholerogen -anatoxin. A - amino-modified glass, B - aldehyde-modified glass, C - chitosan-modified glass.

Таким образом, применение для изготовления биологических микроматриц хитозанмодифицированных стекол в качестве подложки обеспечивает повышение уровня значений «сигнал/фон» в 1,5-2 раза по сравнению с коммерческой амминомодифицированной подложкой, в 10 раз - по сравнению с альдегидмодифицированной подложкой, в 20 раз - по сравнению с эпиксимодифицированной подложкой.Thus, the use of chitosan-modified glasses as a substrate for the manufacture of biological micromatrices provides an increase in the level of “signal/background” values by 1.5-2 times compared to a commercial ammine-modified substrate, 10 times - compared to an aldehyde-modified substrate, 20 times - compared to the epixi-modified substrate.

Источники информацииInformation sources

1. Грядунов Д.А. Гидрогелевые биочипы - инструменты многопараметрического анализа маркеров бактериальных, вирусных и растительных геномов: автореф. дис. … д-ра биол. наук: 03.01.03 / Грядунов Дмитрий Михайлович. - Москва, 2017. 315 с. 1. Gryadunov D.A. Hydrogel biochips - tools for multiparametric analysis of markers of bacterial, viral and plant genomes: Abstract of the thesis. dis. … Dr. Biol. Sciences: 03.01.03 / Gryadunov Dmitry Mikhailovich. - Moscow, 2017. 315 p.

2. Михайлович В.М. Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенное™ и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах: автореф. дис.... д-ра биол. наук: 03.00.03, 03.00.07 / Михайлович Владимир Михайлович. - Москва, 2009. 53 с. 2. Mikhailovich V.M. Identification of infectious agents, genetic determinants of pathogenicity and drug resistance of microorganisms and viruses on biological microchips: Ph.D. thesis .... Dr. Biol. Sciences: 03.00.03, 03.00.07 / Mikhailovich Vladimir Mikhailovich. - Moscow, 2009. 53 p.

3. Wingren С, Borrebaeck С.А.К. Antibody-based microarrays // Methods Mol Biol. 2009; 509: 57-84. doi: 10.1007/978-1 -59745-372-1_5.3. Wingren C, Borrebaeck C.A.K. Antibody-based microarrays // Methods Mol Biol. 2009; 509:57-84. doi: 10.1007/978-1-59745-372-1_5.

4. Schena, M. Microarray Biochip Technology // Eaton Publishing Company/Biotechniques Books. - 2000. - ISBN: 1881299376. - 298 p.4. Schena, M. Microarray Biochip Technology // Eaton Publishing Company/Biotechniques Books. - 2000. - ISBN: 1881299376. - 298 p.

5. Parthasarathy N., Saksena R., Kovac P. [et al.] Application of carbohydrate microarray technology for the detection of Burkholderia pseudomallei, Bacillus anthracis and Francisella tularensis antibodies // Carbohydr Res. - 2008. - V. 343, N 16. - P. 2783-2788.5. Parthasarathy N., Saksena R., Kovac P. [et al.] Application of carbohydrate microarray technology for the detection of Burkholderia pseudomallei, Bacillus anthracis and Francisella tularensis antibodies // Carbohydr Res. - 2008. - V. 343, N 16. - P. 2783-2788.

6. Горбач В.И., Давыдова В.Н., Володько А.В. [и др.] Сорбция липополисахаридов цеолитами модифицированными хитозаном // Актуальные вопросы биологической физики и химии. - 2016. - N 1-2. - С. 60-64.6. Gorbach V.I., Davydova V.N., Volodko A.V. [et al.] Sorption of lipopolysaccharides by zeolites modified with chitosan // Actual problems of biological physics and chemistry. - 2016. - N 1-2. - S. 60-64.

7. Давыдова В.Н., Набережных Г.А., Ермак И.М. [и др.] Определение констант связывания липополисахаридов различной структуры с хитозаном // Биохимия. - 2006. - Т. 71, N 3. - С. 417-425.7. Davydova V.N., Naberezhnykh G.A., Ermak I.M. [et al.] Determination of binding constants of lipopolysaccharides of various structures with chitosan // Biochemistry. - 2006. - T. 71, N 3. - S. 417-425.

8. Набережных Г.А., Горбач В.И., Лихацкая Г.Н. [и др.] Взаимодействие хитозанов и N-ацилированных производных хитозанов с липополисахаридами грамотрицательных бактерий // Биохимия. - 2008. - Т. 73, N 4. - С. 530-541.8. Naberezhnykh G.A., Gorbach V.I., Likhatskaya G.N. [et al.] Interaction of chitosans and N-acylated chitosan derivatives with lipopolysaccharides of Gram-negative bacteria // Biochemistry. - 2008. - T. 73, N 4. - S. 530-541.

9. Ferrara V., Zito G., Arrabito G. [et al.] Aqueous Processed Biopolymer Interfaces for Single-Cell Microarrays // ACS Biomater Sci Eng. - 2020 May 11;6(5):3174-3186. doi: 10.1021/acsbiomaterials.9b01871. Epub 2020 Apr 17.9. Ferrara V., Zito G., Arrabito G. [et al.] Aqueous Processed Biopolymer Interfaces for Single-Cell Microarrays // ACS Biomater Sci Eng. - 2020 May 11;6(5):3174-3186. doi: 10.1021/acsbiomaterials.9b01871. Epub 2020 Apr 17.

Claims (1)

Способ изготовления биологических микроматриц для выявления генетических и белковых маркеров, предусматривающий изготовление двумерных микрочипов на основе инертной подложки (стекла), которую активируют в растворе 1% хитозана с молекулярной массой 38 кДа в 1,5% уксусной кислоте, инкубацию в течение 5-10 мин при комнатной температуре, последующую отмывку дистиллированной водой в течение 5 мин при комнатной температуре и высушивание на воздухе с последующим нанесением биологических молекул на активированную хитозаном подложку методом контактной печати с использованием миниплоттера, причем каждый образец биологических молекул, разведенных в соотношении 1:1 в соответствующем буфере для печати, наносят на поверхность в трех повторах в виде 12-16 идентичных зон на одном слайде.A method for manufacturing biological microarrays for the detection of genetic and protein markers, involving the manufacture of two-dimensional microchips based on an inert substrate (glass), which is activated in a solution of 1% chitosan with a molecular weight of 38 kDa in 1.5% acetic acid, incubation for 5-10 minutes at room temperature, subsequent washing with distilled water for 5 min at room temperature and drying in air, followed by application of biological molecules on a chitosan-activated substrate by contact printing using a miniplotter, with each sample of biological molecules diluted 1:1 in the appropriate buffer for printing, applied to the surface in three repetitions in the form of 12-16 identical zones on one slide.
RU2022117590A 2022-06-28 Method for the manufacture of biological microarrays for the detection of genetic and protein markers RU2792447C1 (en)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2792447C1 true RU2792447C1 (en) 2023-03-22

Family

ID=

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2319482C2 (en) * 2001-11-23 2008-03-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Method for identification of anti-tumor target enzymes
US20100332430A1 (en) * 2009-06-30 2010-12-30 Dow Agrosciences Llc Application of machine learning methods for mining association rules in plant and animal data sets containing molecular genetic markers, followed by classification or prediction utilizing features created from these association rules

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2319482C2 (en) * 2001-11-23 2008-03-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Method for identification of anti-tumor target enzymes
US20100332430A1 (en) * 2009-06-30 2010-12-30 Dow Agrosciences Llc Application of machine learning methods for mining association rules in plant and animal data sets containing molecular genetic markers, followed by classification or prediction utilizing features created from these association rules

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Молекулярные маркеры - инструмент исследования генетического разнообразия, найдено в интернет 08.12.2022, размещено https://www.fao.org/3/a1250r/a1250r17.pdf 21.01.2019. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Werz et al. Carbohydrates as the next frontier in pharmaceutical research
US8658093B2 (en) Devices and methods for the detection of analytes
Shakeri et al. Biofunctionalization of glass‐and paper‐based microfluidic devices: a review
JP5026070B2 (en) Polymer particles
KR20070099597A (en) Three-dimensional nanostructured and microstructured supports
JP4630817B2 (en) Substance immobilizing agent, substance immobilizing method using the same, and substance immobilizing substrate using the same
Bora et al. Photoreactive cellulose membrane—A novel matrix for covalent immobilization of biomolecules
Soga et al. Monodisperse liposomes with femtoliter volume enable quantitative digital bioassays of membrane transporters and cell-free gene expression
US10336881B2 (en) Monoliths
RU2792447C1 (en) Method for the manufacture of biological microarrays for the detection of genetic and protein markers
CN105295447A (en) Method for biological functionalization of silicon-based material surface
JP4207528B2 (en) Method for binding selective binding substances
CN109001453B (en) A kind of kit based on lysozyme content in latex immunoturbidimetry detection human body fluid sample
JP5252036B2 (en) Substrate having a hydrophilic layer
Tsouka et al. VaporSPOT: Parallel synthesis of oligosaccharides on membranes
JP2020132803A (en) Material immobilizing agent, and material immobilizing method using material immobilizing agent
CN104950106B (en) A kind of universal method of Sensitive Detection is built using amplification system is circulated
Dendane et al. Surface patterning of (bio) molecules onto the inner wall of fused-silica capillary tubes
JP5034302B2 (en) Fluorescent label
US7629016B2 (en) Process for photochemical activation of polymer surface and immobilization of biomolecules onto the activated surface
JP4553568B2 (en) Immobilization element coated with functional substance-containing thin film and method for producing the same
Fang et al. Polymer membrane with glycosylated surface by a chemo-enzymatic strategy for protein affinity adsorption
EP3221371B1 (en) Monoliths
JP2010032508A (en) Chip manufacturing method, chip, detection method and device using chip
Puchberger et al. Hydrogels for Imaging, Sensing and Diagnostics