RU2792236C9 - Polypeptide derivative and method for its production - Google Patents
Polypeptide derivative and method for its production Download PDFInfo
- Publication number
- RU2792236C9 RU2792236C9 RU2021136068A RU2021136068A RU2792236C9 RU 2792236 C9 RU2792236 C9 RU 2792236C9 RU 2021136068 A RU2021136068 A RU 2021136068A RU 2021136068 A RU2021136068 A RU 2021136068A RU 2792236 C9 RU2792236 C9 RU 2792236C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polypeptide
- insulin
- lysine
- derivative
- group
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к области биомедицины и, в частности, к производному полипептида и к способу его получения.The present invention relates to the field of biomedicine and, in particular, to a polypeptide derivative and a method for its production.
Уровень техникиState of the art
По результатам фармакокинетических исследований было установлено, что выведение in vivo лекарственных препаратов на основе полипептидов/белков осуществляется, в основном, через механизмы распада, экскреции, опосредуемого рецепторами эндоцитоза и т.д. Полипептидные факторы с молекулярной массой менее 20 кДа без труда отфильтровываются гломерулами в процессе метаболизма; во время прохождения через почечные канальцы они частично распадаются под воздействием протеаз и выводятся с мочой, что обусловливает их короткий период полувыведения. Возьмем, к примеру, ГПП-1; в общем случае, продолжительность его биологического периода полувыведения in vivo составляет 20 минут. Часто для получения терапевтического эффекта требуется применение лекарственных средств в высоких дозах. Длительные и частые инъекции не только увеличивают страдания пациентов и стоимость лечения, но также часто являются причиной возникновения ряда серьезных побочных эффектов. Важной тенденцией в процессе вспомогательной разработки первого поколения генно-инженерных лекарственных препаратов на основе полипептидов/белков стало стремление к созданию полипептидных/белковых препаратов пролонгированного действия. В настоящее время пролонгирование периода полувыведения белковых препаратов, в основном, достигается двумя способами. С одной стороны, это - увеличение молекулярной массы белкового препарата для снижения скорости клубочковой фильтрации и иммуногенности гетерологичных белков, что позволяет снизить их почечный клиренс in vivo. С другой стороны, используется способ непрерывного и медленного высвобождения действующего вещества для поддержания его концентрации на постоянном уровне и, следовательно, пролонгирования его времени действия. В состав обычно используемых методов входят следующие операции: приготовление веществ замедленного высвобождения, конструирование мутантов, химическое модифицирование и слияние генов и т.д.Based on the results of pharmacokinetic studies, it was found that in vivo elimination of drugs based on polypeptides/proteins is carried out mainly through the mechanisms of degradation, excretion, receptor-mediated endocytosis, etc. Polypeptide factors with a molecular weight of less than 20 kDa are easily filtered out by glomeruli during metabolism; during passage through the renal tubules, they are partially degraded by proteases and excreted in the urine, which leads to their short half-life. Take, for example, GLP-1; in General, the duration of its biological half-life in vivo is 20 minutes. Often, to obtain a therapeutic effect, the use of drugs in high doses is required. Long and frequent injections not only increase patient suffering and cost of treatment, but also often cause a number of serious side effects. An important trend in the process of auxiliary development of the first generation of genetically engineered drugs based on polypeptides/proteins has been the desire to create long-acting polypeptide/protein drugs. Currently, the prolongation of the half-life of protein drugs is mainly achieved in two ways. On the one hand, this is an increase in the molecular weight of the protein preparation to reduce the glomerular filtration rate and the immunogenicity of heterologous proteins, which makes it possible to reduce their renal clearance in vivo. On the other hand, a method of continuous and slow release of the active substance is used to maintain its concentration at a constant level and, therefore, to prolong its action time. Commonly used methods include the following operations: preparation of sustained release substances, construction of mutants, chemical modification and gene fusion, etc.
Таким образом, в настоящем изобретении период полувыведения белков или полипептидов, находящихся в крови, может быть пролонгирован за счет модификации жирных кислот крови и обеспечения наличия нековалентной связи между жирной кислотой и альбумином.Thus, in the present invention, the half-life of proteins or polypeptides found in the blood can be prolonged by modifying blood fatty acids and providing a non-covalent bond between the fatty acid and albumin.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Цель настоящего изобретения - создать новое производное полипептида, которое характеризовалось бы более длительным действием.The purpose of the present invention is to create a new derivative of the polypeptide, which would be characterized by a longer action.
Первый объект настоящего изобретения касается получения производного полипептида, содержащего следующее:The first object of the present invention relates to the production of a polypeptide derivative containing the following:
(a) полипептид; и(a) a polypeptide; And
(b) модифицированную группу L, связанную с сайтом лизина полипептида, как показано в Формуле I,(b) a modified L group linked to the lysine site of the polypeptide as shown in Formula I,
где волнистая линия обозначает связь с сайтом лизина, am целое число из диапазона 0-8; а, b, с, d, е и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n - целое число из диапазона от 14 до 16.where the wavy line denotes the connection with the lysine site, am is an integer from the range 0-8; a, b, c, d, e and f are independent integers selected from the range 0 to 10; n is an integer from 14 to 16.
В другом предпочтительном варианте осуществления группа L выбирается из группы, состоящей из следующих элементов:In another preferred embodiment, the group L is selected from the group consisting of the following elements:
В еще одном предпочтительном варианте осуществления полипептид выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: один из инсулинов, ГПП-1, ПТГ, а также комбинации указанных элементов.In another preferred embodiment, the polypeptide is selected from the group consisting of the following elements: one of insulins, GLP-1, PTH, and combinations of these elements.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: одно из производных инсулина, одно из производных ГПП-1, одно из производных ПТГ, а также комбинации указанных элементов.In another preferred embodiment, the polypeptide derivative is selected from the group consisting of the following elements: one of the insulin derivatives, one of the GLP-1 derivatives, one of the PTH derivatives, and combinations of these elements.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь А инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или 2.In yet another preferred embodiment, insulin chain A has the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь В инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 4, 5 или 6.In yet another preferred embodiment, the insulin chain B has the sequence shown in SEQ ID NO: 3, 4, 5 or 6.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления ГПП-1 имеет последовательность, показанную в любом из SEQ ID NO: 7-9.In yet another preferred embodiment, GLP-1 has the sequence shown in any of SEQ ID NOs: 7-9.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления ПТГ имеетIn yet another preferred embodiment, the PTH has
последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10.the sequence shown in SEQ ID NO: 10.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида имеет структуру, показанную ниже, где 
где m целое число из диапазона 0-8; а, b, с, d, е и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n целое число из диапазона от 14 до 16.where m is an integer from the range 0-8; a, b, c, d, e and f are independent integers selected from the range 0 to 10; n is an integer from 14 to 16.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида выбирается из группы, состоящей из следующих элементов:In another preferred embodiment, the polypeptide derivative is selected from the group consisting of the following elements:
где
В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: L0-CFA16-полипептид, L2-CFA16-полипептид, L3-CFA16-полипептид, L4-GFA16-полипептид, L5-CFA16-полипептид или L6-GFA16-полипептид.In yet another preferred embodiment, the polypeptide derivative is selected from the group consisting of the following elements: L0-CFA16 polypeptide, L2-CFA16 polypeptide, L3-CFA16 polypeptide, L4-GFA16 polypeptide, L5-CFA16 polypeptide, or L6-GFA16 -polypeptide.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления L0-GFA16-полипептид имеет структуру, показанную ниже, где
В еще одном предпочтительном варианте осуществления L2-GFA16-полипептид имеет структуру, показанную ниже, где
В еще одном предпочтительном варианте осуществления L3-GFA16-полипептид имеет структуру, показанную ниже, где
В еще одном предпочтительном варианте осуществления L4-GFA16-полипептид имеет структуру, показанную ниже, где
В еще одном предпочтительном варианте осуществления L5-GFA16-полипептид имеет структуру, показанную ниже, где
В еще одном предпочтительном варианте осуществления L6-GFA16-полипептид имеет структуру, показанную ниже, где
В еще одном предпочтительном варианте осуществления инсулин содержит цепь А и цепь В.In yet another preferred embodiment, the insulin comprises an A chain and a B chain.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления инсулин содержит человеческий инсулин или животный инсулин; и, предпочтительно, человеческий инсулин.In yet another preferred embodiment, the insulin comprises human insulin or animal insulin; and preferably human insulin.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления животный инсулин содержит свиной инсулин и бычий инсулин.In yet another preferred embodiment, the animal insulin comprises porcine insulin and bovine insulin.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь А и цепь В инсулина, кроме того, содержат одну или более одной дисульфидных связей.In yet another preferred embodiment, chain A and chain B of insulin further contain one or more than one disulfide bond.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления инсулин содержит естественный инсулин, предшественник инсулина или один из вариантов инсулина.In yet another preferred embodiment, the insulin comprises natural insulin, an insulin precursor, or one of the insulin variants.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное инсулина содержит предшественник инсулина и модифицированную группу L.In another preferred embodiment, the insulin derivative contains an insulin precursor and a modified L group.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь А инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или 2.In yet another preferred embodiment, insulin chain A has the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь В инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 4, 5 или 6.In yet another preferred embodiment, the insulin chain B has the sequence shown in SEQ ID NO: 3, 4, 5 or 6.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь А инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, и цепь В инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 5 или 6.In yet another preferred embodiment, the insulin chain A has the sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the insulin chain B has the sequence shown in SEQ ID NO: 3, 5 or 6.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь А инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, и цепь В инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4 или 6.In yet another preferred embodiment, insulin chain A has the sequence shown in SEQ ID NO: 2 and insulin chain B has the sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 6.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L ковалентно связана с сайтом лизина (K).In yet another preferred embodiment, the modified L group is covalently linked to the lysine (K) site.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L ковалентно связана с ε-амино группой лизина (K).In yet another preferred embodiment, the modified L group is covalently linked to the ε-amino group of lysine (K).
В еще одном предпочтительном варианте осуществления инсулин содержит мотив РК, DKT, РКТ или КРТ, а модифицированная группа L связана с сайтом лизина (K) мотива.In yet another preferred embodiment, the insulin contains a PK, DKT, PKT, or KPT motif and the modified L group is linked to the lysine (K) site of the motif.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления инсулин содержит мотив ТРК, ТКР или TDK, а модифицированная группа L связана с сайтом лизина (K) мотива.In yet another preferred embodiment, the insulin contains a TRK, TCR, or TDK motif and the modified L group is linked to the lysine (K) site of the motif.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления инсулин содержит мотив YTPK, YTDKT, YTPKT или YTKPT, а модифицированная группа L связана с сайтом лизина (K) мотива.In yet another preferred embodiment, the insulin contains a YTPK, YTDKT, YTPKT or YTKPT motif and the modified L group is linked to the lysine (K) site of the motif.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L связана с 28-м или 29-м лизином (K) цепи В.In yet another preferred embodiment, the modified L group is linked to the 28th or 29th lysine (K) of chain B.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L ковалентно связана с 29-м лизином (K) последовательности, как показано в SEQ ID NO: 3, 4 или 6.In yet another preferred embodiment, the modified L group is covalently linked to the 29th lysine (K) of the sequence as shown in SEQ ID NO: 3, 4 or 6.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь В инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 4 или 6, и модифицированная группа L связана с 29-м лизином (K) последовательности, как показано в SEQ ID NO: 3, 4 или 6.In yet another preferred embodiment, the insulin chain B has the sequence shown in SEQ ID NO: 3, 4 or 6 and the modified L group is linked to the 29th lysine (K) of the sequence as shown in SEQ ID NO: 3, 4 or 6.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь В инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 5, и модифицированная группа L связана с 28-м лизином (K) последовательности, как показано в SEQ ID NO: 5.In another preferred embodiment, the insulin chain B has the sequence shown in SEQ ID NO: 5 and the modified L group is linked to the 28th lysine (K) of the sequence as shown in SEQ ID NO: 5.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное инсулина выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: L0-GFA16-инсулин, L2-GFA16-инсулин, L3-GFA16-инсулин, L4-GFA16-инсулин, L5-GFA16-инсулин или Ь6-GFA16-инсулин.In another preferred embodiment, the insulin derivative is selected from the group consisting of the following elements: L0-GFA16-insulin, L2-GFA16-insulin, L3-GFA16-insulin, L4-GFA16-insulin, L5-GFA16-insulin, or L6-GFA16 -insulin.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное ГПП-1 содержит аналог ГПП-1 и модифицированную группу L.In yet another preferred embodiment, the GLP-1 derivative contains a GLP-1 analogue and a modified L group.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления ГПП-1 имеет последовательность, показанную в любом из SEQ ID NO: 7-9.In yet another preferred embodiment, GLP-1 has the sequence shown in any of SEQ ID NOs: 7-9.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L ковалентно связана с сайтом лизина (K).In yet another preferred embodiment, the modified L group is covalently linked to the lysine (K) site.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L ковалентно связана с ε-амино группой лизина (K).In yet another preferred embodiment, the modified L group is covalently linked to the ε-amino group of lysine (K).
В еще одном предпочтительном варианте осуществления ГПП-1 содержит мотив АКБ, а модифицированная группа L связана с сайтом лизина (K) мотива.In yet another preferred embodiment, GLP-1 contains the AKB motif and the modified L group is linked to the lysine (K) site of the motif.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления ГПП-1 содержит мотив AAKEF, а модифицированная группа L связана с сайтом лизина (K) мотива.In another preferred embodiment, GLP-1 contains the AAKEF motif and the modified L group is linked to the lysine (K) site of the motif.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L связана с 20-м или 26-м лизином (K) цепи.In yet another preferred embodiment, the modified L group is linked to the 20th or 26th lysine (K) of the chain.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное ГПП-1 выбирается из группы, состоящей из следующих компонентов: L0-GFA16-GLP-1, L2-GFA16-GLP-1, L3-GFA16-GLP-1, L4-GFA16-GLP-1, L5-GFA16-GLP-1 или L6-GFA16-GLP-1.In another preferred embodiment, the GLP-1 derivative is selected from the group consisting of the following components: L0-GFA16-GLP-1, L2-GFA16-GLP-1, L3-GFA16-GLP-1, L4-GFA16-GLP-1 , L5-GFA16-GLP-1 or L6-GFA16-GLP-1.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное ПТГ содержит аналог ПТГ и модифицированную группу L.In yet another preferred embodiment, the PTH derivative contains a PTH analogue and a modified L group.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления ПТГ имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10.In yet another preferred embodiment, PTH has the sequence shown in SEQ ID NO: 10.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L ковалентно связана с сайтом лизина (K).In yet another preferred embodiment, the modified L group is covalently linked to the lysine (K) site.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L ковалентно связана с ε-амино группой лизина (K).In yet another preferred embodiment, the modified L group is covalently linked to the ε-amino group of lysine (K).
В еще одном предпочтительном варианте осуществления ПТГ содержит мотив RKR, а модифицированная группа L связана с сайтом лизина (K) мотива.In yet another preferred embodiment, the PTH contains the RKR motif and the modified L group is linked to the lysine (K) site of the motif.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления ПТГ содержит мотив LRKRL, а модифицированная группа L связана с сайтом лизина (K) мотива.In yet another preferred embodiment, the PTH contains the LRKRL motif and the modified L group is linked to the lysine (K) site of the motif.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления модифицированная группа L связана с 26-м лизином (K) ПТГ.In yet another preferred embodiment, the modified L group is linked to the 26th lysine (K) of PTH.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное ПТГ выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: L0-GFA16-ПТГ, L2-GFA16-ПТГ, L3-GFA16-ПТГ, L4-GFA16-ПТГ, L5-GFA16-ПТГ или L6-GFA16-ПТГ.In another preferred embodiment, the PTH derivative is selected from the group consisting of the following elements: L0-GFA16-PTH, L2-GFA16-PTH, L3-GFA16-PTH, L4-GFA16-PTH, L5-GFA16-PTH, or L6-GFA16 -PTG.
Второй объект настоящего изобретения касается фармацевтической композиции, содержащей производное полипептида согласно первому объекту настоящего изобретения, а также фармацевтически приемлемый носитель.The second object of the present invention relates to a pharmaceutical composition containing a derivative of the polypeptide according to the first object of the present invention, as well as a pharmaceutically acceptable carrier.
Третий объект настоящего изобретения касается использования производного полипептида согласно первому объекту настоящего изобретения, для получения лекарств или препаратов для профилактики и/или лечения остеопороза, диабета, гипергликемии и других заболеваний, при которых снижение уровня глюкозы в крови дает положительный эффект.The third object of the present invention relates to the use of a derivative of the polypeptide according to the first object of the present invention, for the production of drugs or preparations for the prevention and/or treatment of osteoporosis, diabetes, hyperglycemia and other diseases in which lowering blood glucose levels has a positive effect.
Четвертый объект настоящего изобретения касается способа получения производного полипептида; указанный способ содержит следующие этапы:The fourth object of the present invention relates to a method for obtaining a derivative of the polypeptide; this method contains the following steps:
(1) в присутствии лизина группы X, пирролизил-тРНК-синтетазы и связанной с ней гомологичной тРНК культивируют штамм, содержащий кодирующую последовательность инсулина, где кодирующая последовательность полипептида в составе указанной кодирующей последовательности заменена TAG (осуществляющим кодирование производного лизина) и, следовательно, продуцирует производное полипептида, содержащее следующие компоненты:(1) in the presence of group X lysine, pyrrolysyl-tRNA synthetase and its associated homologous tRNA, a strain containing an insulin coding sequence is cultivated, where the polypeptide coding sequence in the specified coding sequence is replaced by TAG (encoding a lysine derivative) and, therefore, produces a polypeptide derivative containing the following components:
(a) полипептидную цепь; и(a) a polypeptide chain; And
(b) модифицированную группу L, связанную с сайтом лизина полипептида, причем модифицированная группа L представляет собой группу X, как определено в первом объекте настоящего изобретения; и, необязательно,(b) a modified L group linked to a lysine site of a polypeptide, wherein the modified L group is an X group as defined in the first aspect of the present invention; and optionally
(2) отделяют производное полипептида от продуктов ферментации.(2) separating the polypeptide derivative from the fermentation products.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления полипептид выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: один из инсулинов, ГПП-1, ПТГ, а также комбинации указанных элементов.In another preferred embodiment, the polypeptide is selected from the group consisting of the following elements: one of insulins, GLP-1, PTH, and combinations of these elements.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: одно из производных инсулина, одно из производных ГПП-1, одно из производных ПТГ, а также комбинации указанных элементов.In another preferred embodiment, the polypeptide derivative is selected from the group consisting of the following elements: one of the insulin derivatives, one of the GLP-1 derivatives, one of the PTH derivatives, and combinations of these elements.
Пятый объект настоящего изобретения касается способа получения производного полипептида; указанный способ содержит следующие этапы:The fifth object of the present invention relates to a method for obtaining a polypeptide derivative; this method contains the following steps:
(1) в присутствии соединения согласно Формуле III, пирролизил-тРНК-синтетазы и связанной с ней гомологичной тРНК культивируют штамм, содержащий кодирующую последовательность полипептида, где кодирующая лизин последовательность полипептида в составе указанной кодирующей последовательности заменена TAG (осуществляющим кодирование производного лизина) и, следовательно, продуцирует соединение согласно Формуле IV; и(1) in the presence of a compound according to Formula III, pyrrolysyl-tRNA synthetase and its associated homologous tRNA, a strain containing a polypeptide coding sequence is cultivated, where the lysine-coding sequence of the polypeptide in the specified coding sequence is replaced by TAG (encoding a lysine derivative) and, therefore , produces a compound according to Formula IV; And
(2) проводят реакцию между соединением согласно Формуле IV и соединением согласно Формуле V в инертном растворителе, обеспечивая, таким образом, получение производного полипептида,(2) carrying out a reaction between the compound according to Formula IV and the compound according to Formula V in an inert solvent, thus providing a derivative of the polypeptide,
где а, b, с, d, е и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n целое число из диапазона от 14 до 16 в Формуле V.where a, b, c, d, e and f are independent integers selected from the range from 0 to 10; n is an integer from 14 to 16 in Formula V.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления полипептид выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: один из инсулинов, ГПП-1, ПТГ или комбинации указанных элементов.In another preferred embodiment, the polypeptide is selected from the group consisting of the following elements: one of insulins, GLP-1, PTH, or combinations of these elements.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: одно из производных инсулина, одно из производных ГПП-1, одно из производных ПТГ или комбинации указанных элементов.In another preferred embodiment, the polypeptide derivative is selected from the group consisting of the following elements: one of the insulin derivatives, one of the GLP-1 derivatives, one of the PTH derivatives, or a combination of these elements.
Шестой объект настоящего изобретения касается способа получения производного полипептида, где указанный способ содержит следующие этапы:The sixth object of the present invention relates to a method for obtaining a derivative of a polypeptide, where this method contains the following steps:
(1) в присутствии соединения согласно Формуле VI, пирролизил-тРНК-синтетазы и связанной с ней гомологичной тРНК культивируют штамм, содержащий кодирующую последовательность полипептида, где кодирующая лизин последовательность полипептида в составе указанной кодирующей последовательности заменена TAG (осуществляющим кодирование производного лизина) и, следовательно, продуцирует соединение согласно Формуле VII; и(1) in the presence of a compound according to Formula VI, pyrrolysyl-tRNA synthetase and its associated homologous tRNA, a strain containing a polypeptide coding sequence is cultivated, where the lysine-coding sequence of the polypeptide in the specified coding sequence is replaced by TAG (encoding a lysine derivative) and, therefore , produces a compound according to Formula VII; And
(2) проводят реакцию между соединением согласно Формуле VII и соединением согласно Формуле VIII в инертном растворителе, обеспечивая, таким образом, получение производного полипептида,(2) carrying out a reaction between the compound according to Formula VII and the compound according to Formula VIII in an inert solvent, thus providing a derivative of the polypeptide,
где а, b, с, d, е и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n целое число из диапазона от 14 до 16 в Формуле VIII.where a, b, c, d, e and f are independent integers selected from the range from 0 to 10; n is an integer from the range of 14 to 16 in Formula VIII.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления полипептид выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: один из инсулинов, ГПП-1, ПТГ или комбинации указанных элементов.In another preferred embodiment, the polypeptide is selected from the group consisting of the following elements: one of insulins, GLP-1, PTH, or combinations of these elements.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: одно из производных инсулина, одно из производных ГПП-1, одно из производных ПТГ или комбинации указанных элементов.In another preferred embodiment, the polypeptide derivative is selected from the group consisting of the following elements: one of the insulin derivatives, one of the GLP-1 derivatives, one of the PTH derivatives, or a combination of these elements.
Седьмой объект настоящего изобретения касается промежуточного соединения, в состав которого входят следующие компоненты:The seventh object of the present invention relates to an intermediate compound, which includes the following components:
(a) полипептид, представляющий собой инсулин, ГПП-1 или ПТГ; и(a) a polypeptide that is insulin, GLP-1 or PTH; And
(b) модифицированная группа L, связанная с сайтом лизина полипептида, где модифицированная группа L представляет собой группу, соответствующую показанной в Формуле А,(b) a modified L group linked to a lysine site of a polypeptide, wherein the modified L group is the group shown in Formula A,
где волнистая линия обозначает связь с сайтом лизина, a m - целое число из диапазона 0-8.where the wavy line represents the bond to the lysine site and m is an integer in the range 0-8.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления промежуточное соединение имеет структуру, показанную в Формуле IV, где
В еще одном предпочтительном варианте осуществления промежуточное соединение используется для получения производного полипептида согласно первому объекту настоящего изобретения.In another preferred embodiment, the intermediate is used to obtain a polypeptide derivative according to the first aspect of the present invention.
Настоящее изобретение, кроме того, предусматривает использование промежуточного соединения согласно седьмому аспекту настоящего изобретения, где промежуточное соединение используется для получения производного полипептида согласно первому объекту настоящего изобретения.The present invention further provides for the use of an intermediate according to the seventh aspect of the present invention, wherein the intermediate is used to obtain a polypeptide derivative according to the first aspect of the present invention.
Следует понимать, что в пределах объема настоящего изобретения вышеупомянутые технические признаки настоящего изобретения и технические признаки, конкретно описанные ниже (например, варианты осуществления), могут быть объединены друг с другом для образования нового или предпочтительного технического решения; описание указанных признаков не будет при этом далее повторяться снова и снова вследствие ограниченного объема данного документа.It should be understood that, within the scope of the present invention, the aforementioned technical features of the present invention and the technical features specifically described below (eg, embodiments) may be combined with each other to form a new or preferred technical solution; the description of these features will not be repeated again and again due to the limited scope of this document.
Подробное описаниеDetailed description
После проведения обширных и интенсивных исследований изобретатели неожиданно получили производное полипептида. Экспериментальные результаты показывают, что указанное производное полипептида характеризуется существенно увеличенным периодом полувыведения, сохраняя при этом свою биологическую активность. Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает фармацевтическое использование указанного производного полипептида и его функциональность в лечении и профилактике диабета, способствовании остеогенезу костных клеток и т.д. Руководствуясь вышеизложенным, изобретатели представили настоящее изобретение.After conducting extensive and intensive studies, the inventors unexpectedly obtained a derivative of the polypeptide. Experimental results show that said polypeptide derivative has a significantly increased half-life while retaining its biological activity. The present invention further provides pharmaceutical use of said polypeptide derivative and its functionality in treating and preventing diabetes, promoting bone cell osteogenesis, and so on. Based on the foregoing, the inventors have presented the present invention.
Идеальный эффект от применения инсулина медленного действия достигается при перестройке базового уровня секреции инсулина у пациентов с диабетом с использованием как можно меньшего количества инъекций инсулина. Одним из путем получения инсулина медленного действия является химическая модификация. Химические модификаторы должны характеризоваться устойчивой структурой, нетоксичностью, неантигенностью и приемлемой молекулярной массой. Специфическая химическая модификация согласно настоящему изобретению может обеспечить продление периода полувыведения инсулинов и снизить степень их антигенности при одновременном сохранении их биологической активности. Модифицированное производное инсулина согласно данному изобретению представляет собой полимерное соединение, характеризующееся хорошей биосовместимостью и нетоксичностью по отношению к организму человека; при этом лекарственные препараты характеризуются увеличенной растворимостью в воде. Применение указанного производного может также обеспечить пониженные почечный клиренс / скорость клубочковой фильтрации и увеличение периода полувыведения лекарственных препаратов при их циркуляции in vivo, что в конечном итоге обеспечивает их пролонгированное действие. Инсулины, ГПП-1 и ПТГ белки, содержащие бутинилоксикарбонил-лизин согласно настоящему изобретению, связываются с ацильными соединениями жирных кислот путем проведения клик-реакции для получения серий производных ГПП-1 и производных ПТГ со значительно пролонгированными периодами полувыведения.The ideal effect of the use of slow-acting insulin is achieved by rearranging the baseline insulin secretion in diabetic patients using as few insulin injections as possible. One of the ways to obtain slow-acting insulin is chemical modification. Chemical modifiers should be structurally stable, non-toxic, non-antigenic, and of acceptable molecular weight. The specific chemical modification according to the present invention can extend the half-life of insulins and reduce their antigenicity while maintaining their biological activity. The modified insulin derivative of the present invention is a polymeric compound with good biocompatibility and non-toxicity to the human body; while drugs are characterized by increased solubility in water. The use of said derivative may also provide a reduced renal clearance/glomerular filtration rate and an increase in the half-life of drugs in their circulation in vivo, which ultimately provides their prolonged action. The insulin, GLP-1 and PTH proteins containing butynyloxycarbonyl-lysine of the present invention bind to fatty acid acyl compounds by performing a click reaction to produce a series of GLP-1 derivatives and PTH derivatives with significantly prolonged half-lives.
ТерминыTerms
Перед представлением описания настоящего изобретения необходимо указать, что настоящее изобретение не ограничивается описанными конкретными способами и экспериментальными условиями вследствие высокой степени вариабельности указанных способов и условий. Необходимо также понимать, что термины, использованные в данном документе, предназначены лишь для описания конкретных вариантов осуществления, а не ограничения объема настоящего изобретения, который ограничивается лишь прилагаемой формулой изобретения.Before presenting the description of the present invention, it must be pointed out that the present invention is not limited to the specific methods and experimental conditions described due to the high degree of variability of these methods and conditions. It is also to be understood that the terms used herein are only intended to describe specific embodiments and are not intended to limit the scope of the present invention, which is only limited by the appended claims.
При использовании в данном документе термин «около» может относиться к варьированию значения не более чем на 1% по отношению к конкретно приведенному значению. Например, в контексте данного документа, выражение «около 100» включает в себя все значения от 99 до 101 (например, 99,1; 99,2; 99,3; 99,4 и т.д.).As used herein, the term "about" may refer to a value varying by no more than 1% with respect to a specifically given value. For example, in the context of this document, the expression "about 100" includes all values from 99 to 101 (eg, 99.1; 99.2; 99.3; 99.4, etc.).
В контексте данного документа термин «содержать» или «включать в себя» может быть неограничивающим, частично ограничивающим и ограничивающим. Другими словами, такой термин также включает в себя значения «в значительной степени состоящий из» или «состоящий из».As used herein, the term "comprise" or "include" may be non-limiting, partially limiting, and limiting. In other words, such a term also includes the meanings "substantially consisting of" or "consisting of".
ГПП-1GPP-1
ГПП-1 представляет собой глюкозозависимый полипептидный гормон инкретин, стимулирующий секрецию инсулина для предотвращения гипогликемии. Глюкозозависимый характер стимулирования секреции инсулина позволяет избежать риска развития гипогликемии, часто присутствующего при лечении диабета. Благодаря указанным физиологическим функциям ГПП-1 имеет широкие перспективы стать одним из терапевтических лекарственных средств при лечении диабета 2-го типа. Как правило, ГПП-1 функционирует в качестве рецептора ГПП-1 (т.е., ГПП-1 Р) на мембранах островных (3-клеток поджелудочной железы для стимулирования секреции инсулина. Тем не менее, хотя естественный ГПП-1 и характеризуется многочисленными преимуществами при лечении диабета, он быстро расщепляется in vivo дипептидилпептидазой-IV (т.е. DPP-IV) и быстро отфильтровывается и метаболизируется почками. Таким образом, нам необходимо модифицировать естественный ГПП-1 для «отсеивания» аналогов ГПП-1, которые могут сопротивляться процессу расщепления под воздействием DPP-IV и могут избегать быстрой фильтрации и метаболизирования почками.GLP-1 is a glucose-dependent polypeptide hormone incretin that stimulates insulin secretion to prevent hypoglycemia. The glucose-dependent nature of stimulating insulin secretion avoids the risk of hypoglycemia often present in the treatment of diabetes. Due to these physiological functions, GLP-1 has great prospects to become one of the therapeutic drugs in the treatment of type 2 diabetes. Generally, GLP-1 functions as a receptor for GLP-1 (i.e., GLP-1 R) on the membranes of insular (pancreatic 3-cells) to stimulate insulin secretion. However, although natural GLP-1 is characterized by numerous benefits in the treatment of diabetes, it is rapidly cleaved in vivo by dipeptidyl peptidase-IV (i.e. DPP-IV) and is rapidly filtered and metabolized by the kidneys.Thus, we need to modify natural GLP-1 to screen out GLP-1 analogs that can resist degradation by DPP-IV and may avoid rapid filtration and metabolization by the kidneys.
ГПП-1 характеризуется функцией секреции глюкозависимого инкретина, предотвращает дегенерацию островных β-клеток поджелудочной железы, стимулирует пролиферацию и дифференциацию β-клеток, индуцирует транскрипцию генов, стимулирует биосинтез предшественников инсулина, повышает чувствительность к инсулину; повышает секрецию соматостатина и подавляет процессы продуцирования инсулина и глюкагона (которые также являются глюкозозависимыми).GLP-1 is characterized by the function of secretion of glucose-dependent incretin, prevents the degeneration of insular β-cells of the pancreas, stimulates the proliferation and differentiation of β-cells, induces gene transcription, stimulates the biosynthesis of insulin precursors, increases insulin sensitivity; increases the secretion of somatostatin and inhibits the production of insulin and glucagon (which are also glucose-dependent).
Паратиреоидный гормон (ПТГ)Parathyroid hormone (PTH)
Паратиреоидный гормон (ПТГ) представляет собой одноцепной полипептидный белок, содержащий 84 аминокислоты и выделяемый паращитовидной железой. Он является одним из наиболее важных пептидных гормонов, регулирующих метаболизм кальция и фосфора, а также ремоделирование костной ткани. Основными физиологическими функциями чПТГ (т.е. человеческого ПТГ) являются стимулирование остеогенеза костных клеток, стимулирование реабсорбции кальция, секреция фосфора в почках и реконструкция костной ткани. Главным недостатком ПТГ является то, что молекула чПТГ не содержит цистеина и является очень нестабильной in vivo. Интактный ПТГ имеет малую молекулярную массу и без труда отфильтровывается гломерулами, в связи с чем длительность его периода полувыведения является малой. Период полувыведения при подкожной или внутримышечной инъекции составляет, в общем случае, около 12 часов. Для достижения терапевтического эффекта в общем случае необходим частый прием лекарственных препаратов в высоких дозах (т.е., выполнение подкожной инъекции один раз в день в течение нескольких месяцев). Тем не менее, частое введение лекарственных препаратов и длительный период терапии трудно переносятся пациентами и могут приводить к возникновению головной боли, рвоты, лихорадки и к другим неблагоприятным реакциям в клинических условиях, что приводит к частым нарушениям режима лечения пациентами. Следовательно, существует насущная необходимость в создании препаратов ПТГ (или подобных им) с пролонгированным действием, которые могли бы быть модифицированы с использованием паратиреоидных гормонов для продления их периода полувыведения.Parathyroid hormone (PTH) is a single-chain polypeptide protein containing 84 amino acids and secreted by the parathyroid gland. It is one of the most important peptide hormones regulating calcium and phosphorus metabolism and bone tissue remodeling. The main physiological functions of hPTH (i.e. human PTH) are to stimulate bone cell osteogenesis, stimulate calcium reabsorption, kidney phosphorus secretion, and bone remodeling. The main disadvantage of PTH is that the hPTH molecule does not contain cysteine and is very unstable in vivo. Intact PTH has a low molecular weight and is easily filtered out by the glomeruli, and therefore its half-life is short. The half-life for subcutaneous or intramuscular injection is generally about 12 hours. In order to achieve a therapeutic effect, in general, frequent administration of drugs in high doses (ie, subcutaneous injection once a day for several months) is necessary. However, the frequent administration of drugs and the long duration of therapy are difficult to tolerate by patients and can lead to headache, vomiting, fever, and other adverse reactions in the clinical setting, resulting in frequent patient off-treatment. Therefore, there is an urgent need to develop long-acting PTH (or similar) preparations that can be modified using parathyroid hormones to prolong their half-life.
Ацильные соединения жирных кислотAcyl compounds of fatty acids
Полипептиды (например, инсулины, ГПП-1 и ПТГ), содержащие бутинилоксикарбонил-лизин согласно настоящему изобретению, связываются с ацильными соединениями жирных кислот путем проведения клик-реакции для получения серий производных полипептида со значительно пролонгированными периодами полувыведения.Polypeptides (eg, insulins, GLP-1, and PTH) containing butynyloxycarbonyl-lysine of the present invention are linked to fatty acid acyl compounds by a click reaction to produce a series of polypeptide derivatives with significantly prolonged half-lives.
Ацильное соединение жирных кислот в настоящем изобретении содержит 14-18 атомов углерода; его структура показана в следующих Формуле V или Формуле VIII:The fatty acid acyl compound of the present invention contains 14-18 carbon atoms; its structure is shown in the following Formula V or Formula VIII:
где a, b, с, d, е и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n - целое число из диапазона от 14 до 16.where a, b, c, d, e and f are independent integers selected from the range from 0 to 10; n is an integer from 14 to 16.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления ацильное соединение жирных кислот выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: LO-GFA, L2-GFA, L3-GFA, L4-GFA, L5-GFA или L6-GFA.In another preferred embodiment, the fatty acid acyl compound is selected from the group consisting of the following elements: LO-GFA, L2-GFA, L3-GFA, L4-GFA, L5-GFA or L6-GFA.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления ацильное соединение жирных кислот выбирается из группы, состоящей из следующих элементов: L0-GFA16, L2-GFA16, L3-GFA16, L4-GFA16, L5-GFA16 или L6-GFA16.In another preferred embodiment, the fatty acid acyl compound is selected from the group consisting of the following elements: L0-GFA16, L2-GFA16, L3-GFA16, L4-GFA16, L5-GFA16 or L6-GFA16.
Производные полипептидовPolypeptide derivatives
При использовании в данном документе термины «аналог полипептида», «производное полипептида» и «производное согласно настоящему изобретению» используются взаимозаменяемо и все относятся к производному полипептида согласно первому объекту настоящего изобретения.As used herein, the terms "polypeptide analog", "polypeptide derivative" and "derivative of the present invention" are used interchangeably and all refer to a polypeptide derivative according to the first aspect of the present invention.
В настоящем изобретении, кроме того, представлено производное полипептида согласно первому объекту настоящего изобретения.The present invention further provides a polypeptide derivative according to the first aspect of the present invention.
Более конкретно, указанное производное полипептида содержит следующие элементы:More specifically, said polypeptide derivative contains the following elements:
(a) полипептидную цепь; и(a) a polypeptide chain; And
(b) модифицированную группу L, связанную с сайтом лизина полипептида, где модифицированная группа L представляет собой группу X, соответствующую показанной в Формуле I,(b) a modified L group linked to a lysine site of a polypeptide, wherein the modified L group is an X group corresponding to that shown in Formula I,
где волнистая линия обозначает связь с сайтом лизина, a m целое число из диапазона 0-8; а, b, с, d, е и f представляют собой независимые целые числа, выбираемые из диапазона от 0 до 10; n - целое число из диапазона от 14 до 16.where the wavy line denotes the connection with the lysine site, and m is an integer from the range 0-8; a, b, c, d, e and f are independent integers selected from the range 0 to 10; n is an integer from 14 to 16.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления производное полипептида содержит производное инсулина, производное ГПП-1, производное ПТГ, а также комбинации указанных элементов.In yet another preferred embodiment, the polypeptide derivative comprises an insulin derivative, a GLP-1 derivative, a PTH derivative, and combinations of these elements.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь А инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или 2.In yet another preferred embodiment, insulin chain A has the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления цепь В инсулина имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 4, 5 или 6.In yet another preferred embodiment, the insulin chain B has the sequence shown in SEQ ID NO: 3, 4, 5 or 6.
GIVEQCСТSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG (SEQ ID NO: 2)GIVEQCCTSICSLYQLENYCG (SEQ ID NO: 2)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 3)FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 3)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK (SEQ ID NO: 4)FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK (SEQ ID NO: 4)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO: 5)FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (SEQ ID NO: 5)
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO: 6)FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT (SEQ ID NO: 6)
В еще одном предпочтительном варианте осуществления ГПП-1 имеет последовательность, показанную в любом из SEQ ID NO: 7-9.In yet another preferred embodiment, GLP-1 has the sequence shown in any of SEQ ID NOs: 7-9.
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID NO: 7)HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID NO: 7)
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 8)HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 8)
HXEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 9) (где X представляет собой 2-аминоизомасляную кислоту (Aib))HXEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 9) (where X is 2-aminoisobutyric acid (Aib))
В еще одном предпочтительном варианте осуществления ПТГ имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10.In yet another preferred embodiment, PTH has the sequence shown in SEQ ID NO: 10.
SVSEIQLMHNLGRHLNSMERVEWLRKRLQDVHNF (SEQ ID NO.: 10)SVSEIQLMHNLGRHLNSMERVEWLRKRLQDVHNF (SEQ ID NO.: 10)
В настоящем изобретении производное инсулина содержит инсулин, предшественник инсулина и один из вариантов инсулина. Указанный вариант инсулина отличается от любой формы инсулина естественного происхождения, но по-прежнему может выполнять функцию, подобную функции человеческого инсулина, а именно, контролировать уровень глюкозы в крови организма человека. Путем генетического изменения основообразующей ДНК удается изменить последовательность аминокислот инсулина и, таким образом, свойства, определяющие характер его абсорбции, распределения, метаболизма и секреции. Улучшения касаются создания аналогов инсулина, которые более легко абсорбируются участком инъекции и, таким образом, действуют быстрее в сравнении с вводимыми подкожно естественными инсулинами. Они предназначены для создания терапевтического уровня инсулинов (т.е., обеспечения присутствия прандиального инсулина), необходимого при приеме пищи, в то время как указанные аналоги инсулина, высвобождаемые медленно в течение периода времени длительностью от 8 часов до 24 часов, предназначены для создания базального уровня инсулинов (т.е., обеспечения присутствия базального инсулина) в течение суток, особенно ночью. В состав быстродействующих аналогов инсулина входят инсулин лизпро (Eli Lilly and Company) и инсулин аспарт (Novo Nordisk Company), в то время как в состав аналогов инсулина медленного действия входят инсулин НПХ, инсулин глулизин (Sanofi Aventis Company), инсулин детемир (Novo Nordisk Company) и инсулин гларгин (Sanofi Aventis Company).In the present invention, the insulin derivative comprises insulin, an insulin precursor, and an insulin variant. This variant of insulin is different from any form of naturally occurring insulin, but can still perform a function similar to that of human insulin, namely, to control the level of glucose in the blood of the human body. By genetically altering the underlying DNA, it is possible to change the amino acid sequence of insulin and thus the properties that determine its absorption, distribution, metabolism, and secretion. The improvements relate to the creation of insulin analogs that are more easily absorbed by the injection site and thus act faster than subcutaneously administered natural insulins. They are designed to create the therapeutic level of insulins (i.e., ensure the presence of prandial insulin) required during meals, while these insulin analogs, released slowly over a period of time lasting from 8 hours to 24 hours, are designed to create a basal insulin levels (i.e. ensuring the presence of basal insulin) during the day, especially at night. Fast-acting insulin analogs include insulin lispro (Eli Lilly and Company) and insulin aspart (Novo Nordisk Company), while slow-acting insulin analogs include insulin NPH, insulin glulisine (Sanofi Aventis Company), insulin detemir (Novo Nordisk Company). Company) and insulin glargine (Sanofi Aventis Company).
В контексте данного документа термин «вариант» включает в себя любой вариант, в котором (а) один или несколько аминокислотных остатков заменены естественным или неестественным аминокислотным остатком; (b) порядок следования двух или более аминокислотных остатков изменен на противоположный; (с), (а) и (b) верны одновременно; (d) между любыми двумя аминокислотными остатками присутствует спейсерная группа; (е) один или несколько аминокислотных остатков присутствуют в пептоидной форме; (f) главная цепь (NCC) в одном или нескольких аминокислотных остатках пептида модифицирована, или же присутствует любая комбинация признаков от (а) до (f). Предпочтительно, вариант должен соответствовать признаку (а), (b) или (с).In the context of this document, the term "variant" includes any variant in which (a) one or more amino acid residues are replaced by a natural or unnatural amino acid residue; (b) the order of two or more amino acid residues is reversed; (c), (a) and (b) are true at the same time; (d) a spacer group is present between any two amino acid residues; (e) one or more amino acid residues are present in peptoid form; (f) the main chain (NCC) at one or more amino acid residues of the peptide is modified, or any combination of features (a) to (f) is present. Preferably, the variant should correspond to feature (a), (b) or (c).
Более предпочтительно, один или несколько аминокислотных остатков заменяются одним или несколькими аминокислотными остатками. И еще более предпочтительно, один аминокислотный остаток заменятся другим аминокислотным остатком. Предпочтительно, замена должна быть гомологичной.More preferably, one or more amino acid residues are replaced with one or more amino acid residues. And even more preferably, one amino acid residue will be replaced by another amino acid residue. Preferably, the substitution should be homologous.
Могут происходить гомологичные замены (термины «замена» и «замещение», используемые в данном документе, относятся к замене существующих аминокислотных остатков возможными остатками), т.е., однотипные замены, например, замена одного основного остатка другим основным, замена одного кислотного остатка другим кислотным, замена одного ионизированного остатка другим ионизированным и т.д. Могут происходить также и негомологичные замены, т.е., замены, при которых один вид остатка заменяется другим видом остатка, или же при которых в состав заменяемых элементов в качестве альтернативы входят неестественные аминокислоты, такие как орнитин, 2-аминоизомасляная кислота-орнитин, норлейцин-орнитин, пиридилаланин, тиенилаланин, нафтилаланин и фенилглицин. Более подробную информацию можно найти в следующей таблице. Одновременно может модифицироваться более одного аминокислотного остатка. В контексте данного документа аминокислоты классифицируются с разбиением на следующие категории: основные: Н, K, R; кислотные: D, Е; неполярные: A, F, G, I, L, М, Р, V, W; полярные: С, N, Q, S, Т, Y.Homologous substitutions may occur (the terms "substitution" and "substitution" as used herein refer to the replacement of existing amino acid residues by possible residues), i.e., the same type of substitutions, for example, the replacement of one basic residue with another basic, the replacement of one acidic residue another acid, replacement of one ionized residue with another ionized one, etc. Non-homologous substitutions can also occur, i.e. substitutions in which one type of residue is replaced by another type of residue, or in which unnatural amino acids such as ornithine, 2-aminoisobutyric acid-ornithine, norleucine-ornithine, pyridylalanine, thienylalanine, naphthylalanine and phenylglycine. More details can be found in the following table. More than one amino acid residue can be modified at the same time. In the context of this document, amino acids are classified into the following categories: basic: H, K, R; acidic: D, E; non-polar: A, F, G, I, L, M, P, V, W; polar: C, N, Q, S, T, Y.
В добавление к спейсерным группам аминокислот (таким как глицин или остатки β-аланина), в состав подходящих спейсерных групп, которые могут вставляться между любыми двумя аминокислотными остатками в носителе, входят следующие: алкильные группы, такие как метил, этил или пропил. Специалистам в данной области техники понятно, что может существовать и другой вариант указанной формы, а именно, тип (е), содержащий один или несколько аминокислотных остатков в пептоидной форме. Для исключения любых недоразумений необходимо указать, что термин «пептоидная форма», используемый в данном документе, указывает на то, что заместитель α-С располагается на атоме N остатка, а не на вариантных аминокислотных остатках α-С. Процедура приготовления пептидов в пептоидной форме известна в данной области техники, например, из документа Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 and Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134. Модификация по типу (f) может быть выполнена способом, описанным в Международном издании PCT/GB 99/01855. Наблюдаемые в любом из положений аминокислотные варианты (предпочтительно, типов (а) или (b)), предпочтительно, должны быть независимыми. Как было указано выше, одновременно может встречаться более одной гомологичной или негомологичной замены. Другие варианты могут быть получены путем изменения направления последовательности некоторых аминокислотных остатков внутри общей последовательности на противоположное. В одном из вариантов осуществления замещающий аминокислотный остаток выбирается среди следующих элементов: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамат, глутамин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин и валин.In addition to amino acid spacer groups (such as glycine or β-alanine residues), suitable spacer groups that can be inserted between any two amino acid residues in the carrier include the following: alkyl groups such as methyl, ethyl or propyl. Specialists in the art it is clear that there may be another variant of this form, namely, type (e), containing one or more amino acid residues in peptoid form. To avoid any confusion, it should be noted that the term "peptoid form" as used herein indicates that the α-C substituent is located on the N atom of the residue, and not on the variant α-C amino acid residues. The procedure for preparing peptides in peptoid form is known in the art, for example, from Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 and Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134. Type (f) modification can be made in the manner described in International Publication PCT/GB 99/01855. Amino acid variants (preferably of types (a) or (b)) observed at any one of the positions should preferably be independent. As mentioned above, more than one homologous or non-homologous substitution can occur at the same time. Other variants can be generated by reversing the sequence direction of certain amino acid residues within the overall sequence. In one embodiment, the substitution amino acid residue is selected from the following: alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamate, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine.
Производные полипептидов согласно настоящему изобретению могут существовать в форме их солей или эфиров, особенно фармацевтически приемлемых солей или эфиров.The polypeptide derivatives of the present invention may exist in the form of their salts or esters, especially pharmaceutically acceptable salts or esters.
В состав фармацевтически приемлемых солей соединений согласно настоящему изобретению входят пригодные кислые добавочные соли или соответствующие основные соли. Информацию о пригодных фармацевтически приемлемых солях можно найти в обзорной статье Berge et al. J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977). Они могут использоваться в комбинации с сильными неорганическими кислотами, например, минеральными кислотами (такими как серные кислоты, фосфорные кислоты или галогеноводородные кислоты), с сильными органическими карбоновыми кислотами, такими как незамещенные или замещенные (например, замещенные галогеном) алкилкарбоновые кислоты (например, уксусные кислоты) с количеством атомов углерода от 1 до 4; с насыщенными или ненасыщенными дикарбоновыми кислотами, такими как щавелевые кислоты, малоновые кислоты, янтарные кислоты, малеиновые кислоты, фумаровые кислоты, фталевые кислоты или терефталевые кислоты; с оксикарбоновыми кислотами, такими как аскорбиновые кислоты, гликолевые кислоты, молочные кислоты, яблочные кислоты, виннокаменные кислоты или лимонные кислоты; с аминокислотами, такими как аспарагиновые кислоты или глутаматы; с бензойными кислотами; или же с органическими сульфоновыми кислотами, такими как незамещенные или замещенные (например, замещенные галогеном) (С1-С4)-алкил- или арил-сульфоновые кислоты (например, метансульфоновая кислота или п-толуолсульфоновая кислота) для образования солей.The pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the present invention include suitable acid addition salts or the corresponding base salts. Information on suitable pharmaceutically acceptable salts can be found in the review article by Berge et al. J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977). They can be used in combination with strong inorganic acids, e.g. mineral acids (such as sulfuric acids, phosphoric acids or hydrohalic acids), with strong organic carboxylic acids, such as unsubstituted or substituted (e.g. halogen-substituted) alkyl carboxylic acids (e.g. acetic acids) with the number of carbon atoms from 1 to 4; with saturated or unsaturated dicarboxylic acids such as oxalic acids, malonic acids, succinic acids, maleic acids, fumaric acids, phthalic acids or terephthalic acids; with hydroxycarboxylic acids such as ascorbic acids, glycolic acids, lactic acids, malic acids, tartaric acids or citric acids; with amino acids such as aspartic acids or glutamates; with benzoic acids; or with organic sulfonic acids such as unsubstituted or substituted (eg halogen-substituted) (C1-C4)-alkyl or aryl-sulfonic acids (eg methanesulfonic acid or p-toluenesulfonic acid) to form salts.
Настоящее изобретение, кроме того, включает в себя сольватные формы производных настоящего изобретения. Указанные формы включены в термины, используемые в формуле изобретения. Настоящее изобретение, кроме того, относится к различным кристаллическим формам, полиморфам и (безводным) гидратным формам аналогов настоящего изобретения. В фармацевтической промышленности был разработан метод разделения химических соединений, находящихся в любой из указанных форм, путем внесения небольших изменений в способ очистки и/или способ отделения растворителя, используемого при синтетическом приготовлении соединения.The present invention further includes solvate forms of the derivatives of the present invention. These forms are included in the terms used in the claims. The present invention also relates to various crystalline forms, polymorphs and (anhydrous) hydrate forms of analogues of the present invention. The pharmaceutical industry has developed a method for separating chemical compounds in any of these forms by making small changes to the purification method and/or the method of separating the solvent used in the synthetic preparation of the compound.
Настоящее изобретение, кроме того, включает в себя пролекарственные формы производных настоящего изобретения. Такие пролекарства в общем случае представляют собой производные данного изобретения, в которых одна или несколько приемлемых групп модифицируются таким образом, что модификация может быть обращена при приеме пролекарства человеком или млекопитающим. Хотя для завершения процесса обращения in vivo вместе с указанными пролекарствами может приниматься и второй препарат, указанное обращение, как правило, осуществляется с использованием ферментов, которые в естественном виде присутствуют в организме человека или млекопитающего. Примеры указанных модификаций включают в себя эфиры (включая любые из описанных выше), где процесс обращения может быть осуществлен с использованием эстеразы. Специалистам в этой области техники известны и другие системы.The present invention further includes prodrugs of the derivatives of the present invention. Such prodrugs are generally derivatives of the present invention in which one or more of the acceptable groups are modified such that the modification can be reversed when the prodrug is administered to a human or mammal. Although a second drug may be administered along with said prodrugs to complete the in vivo circulation process, said circulation is typically accomplished using enzymes that are naturally present in the human or mammalian body. Examples of these modifications include esters (including any of those described above), where the conversion process can be carried out using an esterase. Other systems are known to those skilled in the art.
По сравнению с предшествующим уровнем техники основными преимуществами настоящего изобретения являются следующие:Compared with the prior art, the main advantages of the present invention are as follows:
(1) По сравнению с предшествующим уровнем техники производные инсулина и производные ГПП-1 согласно настоящему изобретению характеризуются более длительным, устойчивым и долгосрочным эффектом снижения уровня глюкозы в крови, а также существенно пролонгированными периодами полувыведения.(1) Compared with the prior art, the insulin derivatives and GLP-1 derivatives of the present invention are characterized by a longer, stable and long-term blood glucose lowering effect, as well as significantly prolonged half-lives.
(2) Применение производных инсулина и производных ГПП-1 согласно настоящему изобретению не вызывает гипогликемию и позволяет снизить количество выполняемых инъекций, сопряженных с возникновением небольших побочных эффектов.(2) The use of insulin derivatives and GLP-1 derivatives according to the present invention does not cause hypoglycemia and can reduce the number of injections performed with minor side effects.
(3) По сравнению с предшествующим уровнем техники производные ПТГ согласно настоящему изобретению характеризуются более длительным и устойчивым действием препарата и существенно пролонгированным периодом полувыведения.(3) Compared with the prior art, the PTH derivatives of the present invention are characterized by a longer and more stable drug action and a significantly prolonged half-life.
(4) Применение производных ПТГ согласно настоящему изобретению позволяет снизить количество выполняемых инъекций, сопряженных с возникновением небольших побочных эффектов.(4) The use of the PTH derivatives of the present invention can reduce the number of injections performed with little side effects.
(5) Способ получения лекарственных средств согласно настоящему изобретению, характеризующийся малым количеством побочных продуктов, высоким выходом полезного продукта, низкой стоимостью и значительной простотой процесса, пригоден для крупномасштабного производства. Отсутствует необходимость в проведении бромцианового расщепления, окислительного гидролиза сульфитов и связанных с ними этапов очистки, а также отсутствует необходимость использования меркаптанов или гидрофобных адсорбирующих смол в высоких концентрациях. Данный способ характеризуется малым количеством этапов очистки и низкой стоимостью производства.(5) The method for producing drugs according to the present invention, which is characterized by a small amount of by-products, a high yield of a useful product, a low cost, and a great simplicity of the process, is suitable for large-scale production. There is no need for cyanogen bromide digestion, oxidative hydrolysis of sulfites and associated purification steps, and there is no need to use high concentrations of mercaptans or hydrophobic adsorbent resins. This method is characterized by a small number of purification steps and a low production cost.
Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется ниже на конкретных примерах. Следует понимать, что эти примеры предназначены только для иллюстрирования изобретения, а не для ограничения объема настоящего изобретения. Методики проведения экспериментов без каких-либо особых условий, описанных в следующих примерах, реализовывались, как правило, в обычных условиях (например, в условиях, описанных в публикации Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Guide (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), или же в соответствии с инструкциями производителя. Если не указано иное, все процентные доли и части рассчитываются по массе. Если не указано иное, все использованные в следующих примерах экспериментальные материалы и реагенты являются серийно выпускаемыми.The present invention is further illustrated below with specific examples. It should be understood that these examples are only intended to illustrate the invention and not to limit the scope of the present invention. The experimental procedures without any special conditions described in the following examples were generally carried out under normal conditions (e.g., under the conditions described in Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Guide (New York: Cold Spring Harbor Laboratory). Press, 1989), or according to the manufacturer's instructions. Unless otherwise indicated, all percentages and parts are by weight. Unless otherwise indicated, all experimental materials and reagents used in the following examples are commercially available.
Пример 1. Синтез белков рекомбинантных инсулинов, содержащих бутинилоксикарбонил-лизинExample 1 Synthesis of Recombinant Insulin Proteins Containing Butynyloxycarbonyl-Lysine
Фрагмент ДНК, кодирующий белок рекомбинантного инсулина, содержащего бутинилоксикарбонил-лизин, который, в свою очередь, содержит аминокислотную последовательность согласно показанному в SEQ ID NO: 11, был получен в результате химического синтеза, в процессе которого кодирующая последовательность 80-го лизина (K) была заменена TAG (осуществляющим кодирование производного лизина). Затем фрагмент ДНК, использованный для кодирования всей аминокислотной последовательности согласно показанному в SEQ ID NO: 11, клонировался в модифицированный вектор pBAD-HisA. Полученная плазмида использовалась для обеспечения экспрессии белка рекомбинантного инсулина, содержащего в себе структуру бутинилоксикарбонил-лизина. Плазмида и ферментная плазмида pEvol-pylRs-pylT совместно трансформировались в штамм Е. coli Тор 10. Трансформационный раствор культивировался в течение ночи при температуре 37°С на агаровой среде Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл. Отбиралась одна колония, которая затем культивировалась на шейкере постоянной температуры (при 220 об/мин) в течение ночи при температуре 37°С на агаровой среде Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл. Затем ночная культура вносилась в 100 мл жидкой среды Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл, и культивировалась при температуре 37°С до достижения уровня значений 2-4 оптической плотности ODeoo. Затем к среде добавлялся 25% раствор арабинозы до достижения окончательной концентрации 0,25% и добавлялось 0,1 М трет-бутинилоксикарбонил-лизинового раствора до достижения окончательной концентрации 5 мМ для индуцирования экспрессии гибридного белка. Раствор культуры культурировался в течение 16-20 часов, а затем осуществлялась процедура сбора центрифугированием (10000 об/мин, 5 мин, 4°С).A DNA fragment encoding a protein of recombinant insulin containing butynyloxycarbonyl lysine, which in turn contains the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 11, was obtained by chemical synthesis, during which the coding sequence of the 80th lysine (K) has been replaced by TAG (encoding a lysine derivative). Then, the DNA fragment used to encode the entire amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 11 was cloned into the modified pBAD-HisA vector. The resulting plasmid was used to ensure the expression of a recombinant insulin protein containing the butynyloxycarbonyl-lysine structure. The plasmid and the enzyme plasmid pEvol-pylRs-pylT were co-transformed into the E. coli strain Top 10. The transformation solution was cultivated overnight at 37°C on a Luria-Bertani agar medium containing kanamycin at a concentration of 25 μg/ml and chloramphenicol at a concentration of 17 mcg/ml. A single colony was selected and then cultured on a constant temperature shaker (at 220 rpm) overnight at 37°C on Luria-Bertani agar medium containing kanamycin at a concentration of 25 μg/ml and chloramphenicol at a concentration of 17 μg/ml. Then, the overnight culture was added to 100 ml of liquid Luria-Bertani medium containing kanamycin at a concentration of 25 μg/ml and chloramphenicol at a concentration of 17 μg/ml, and cultivated at a temperature of 37°C until the optical density level of 2-4 ODeoo was reached. Then, a 25% arabinose solution was added to the medium until a final concentration of 0.25% was reached, and 0.1 M tert-butynyloxycarbonyl lysine solution was added until a final concentration of 5 mM was reached to induce expression of the fusion protein. The culture solution was cultured for 16-20 hours, and then the collection procedure by centrifugation (10,000 rpm, 5 min, 4°C) was carried out.
Аминокислотная последовательность согласно SEQ ID NO: 11:Amino acid sequence according to SEQ ID NO: 11:
MVSKGEELFTGVTYKTRAEVKFEGDDDDDKTLVNRIELKGIDFENLYFQGMVSKGEELFTGVTYKTRAEVKFEGDDDDDDKTLVNRIELKGIDFENLYFQG
RFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN,RFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN,
где 80-й K является лизином, к которому ковалентно присоединялась бутинилоксикарбониловая группа.where the 80th K is a lysine to which a butynyloxycarbonyl group has been covalently attached.
Экспрессия гибридных белков осуществлялась в форме нерастворимых «внутриклеточных включений». Для высвобождения внутриклеточных включений клетки Е. coli разрушались с использованием гомогенизатора высокого давления. Клеточный детрит и растворимые белки хоста, Е. coli, удалялись посредством центрифугирования при 5000g. Внутриклеточные включения вымывались с использованием раствора, содержащего Tween 80, ЭДТА и NaCl, а затем 1-2 раза вымывались чистой водой. Смытые внутриклеточные включения растворялись в 7,5 М раствора мочевины, содержащего 2-10 мМ (3-меркаптоэтанола (рН 10,5-11,5), так что концентрация общего белка после растворения достигала 10-25 мг/мл. Образец разбавлялся 5-10 раз, выдерживался при температуре 4-8°С; затем производилось его складывание обычным способом в течение 14-30 часов при рН 10,5-11,7. Процедура ферментативного переваривания с использованием трипсина и карбоксипептидазы В выполнялась в течение 10-20 часов при температуре 18-25°С; значение рН поддерживалось в диапазоне 8,0-9,5. Затем для прекращения процесса ферментативного переваривания добавлялся 0,45 М раствор сульфата аммония. Результаты ВЭЖХ анализа в режиме обращения фазы показывают, что выход продукта на указанном этапе ферментативного переваривания составлял более 90%. Аналог инсулина, получаемый после ферментативного переваривания с участием трипсина и карбоксипептидазы В, был назван «бутинилоксикарбонил-лизин-человеческий инсулин». Образец осветлялся в процессе мембранной фильтрации. После первоначальной очистки в процессе гидрофобной хроматографии с использованием 0,45 М раствора сульфата аммония в качестве буфера А и чистой воды в качестве буфера В получался неочищенный экстракт бутинилоксикарбонил-лизин-человеческого инсулина со степенью чистоты 90%, подтвержденной электрофорезом. После выполнения очистки с использованием полимерного заполнителя с обращенной фазой и заполнителя С8 с обращенной фазой в конце концов получался бутинилоксикарбонил-лизин-человеческий инсулин со степенью чистоты выше 99%.The expression of hybrid proteins was carried out in the form of insoluble "intracellular inclusions". To release intracellular inclusions, E. coli cells were destroyed using a high pressure homogenizer. Cellular debris and soluble host proteins, E. coli, were removed by centrifugation at 5000g. Intracellular inclusions were washed out using a solution containing Tween 80, EDTA and NaCl, and then washed out 1-2 times with pure water. The washed-out intracellular inclusions were dissolved in a 7.5 M urea solution containing 2-10 mM (3-mercaptoethanol (pH 10.5-11.5), so that the concentration of total protein after dissolution reached 10-25 mg/ml. The sample was diluted 5 -10 times, kept at a temperature of 4-8°C, then it was folded in the usual way for 14-30 hours at pH 10.5-11.7 Enzymatic digestion procedure using trypsin and carboxypeptidase B was performed for 10-20 hours at a temperature of 18-25°C, the pH value was maintained in the range of 8.0-9.5.Then 0.45 M solution of ammonium sulfate was added to stop the process of enzymatic digestion.The results of HPLC analysis in reverse phase mode show that the yield of the product on Insulin analogue obtained after enzymatic digestion with trypsin and carboxypeptidase B was named “butynyloxycarbonyl-lysine-human insulin.” The sample was clarified by membrane filtration. After initial purification by hydrophobic chromatography using 0.45 M ammonium sulfate as buffer A and pure water as buffer B, a crude extract of butynyloxycarbonyl-lysine-human insulin was obtained with a purity of 90%, confirmed by electrophoresis. After purification was performed using reversed phase polymer filler and reversed phase C8 filler, butynyloxycarbonyl-lysine-human insulin was eventually obtained with a purity greater than 99%.
Пример 2. Синтез L0-GFA16-инсулинов (n равно 14)Example 2 Synthesis of L0-GFA16 insulins (n is 14)
Так как ацильное соединение жирной кислоты имело азидную группу, введение белка инсулина с терминальным алкином осуществлялось с использованием принципа «клик-химии»; алкин при этом реагировал с азидом для образования 1,2,3-триазольного кольца, с формированием поперечной межмолекулярной связи. В чистую центрифужную трубку объемом 1,5 мл помещалось 4 мкл сернокислой меди (50 мкМ), затем по порядку добавлялось 3 мкл ВТТАА (300 мкМ) и 10 мкл соединения IV (белка]/[-(бутинилоксикарбонил)-лизин-человеческого инсулина) (приблизительно 5 мкМ), приготовление которого было описано в Примере 1. В это время раствор мог быть разбавлен до достижения надлежащего значения объема или концентрации белка. Для инициирования реакции к этому раствору добавлялись 1 мкл L0-GFA16 (1 мкМ) и 2 мкл аскорбата натрия (2,5 мМ). После выдерживания в течение приблизительно 1 часа при комнатной температуре добавлялось 5 мкл буфера для образца SDS-PAGE и осуществлялся нагрев до температуры 100°С в течение 10 минут. Анализ раствора завершался с использованием 12% SDS-PAGE. Было осуществлено извлечение геля с последующим его анализом с использованием процедуры гелевой визуализации и флуоресцентного анализа; затем было произведено его окрашивание кумасси бриллиантовым синим.Since the fatty acid acyl compound had an azide group, administration of the alkyne-terminated insulin protein was carried out using the "click chemistry" principle; alkyne reacted with azide to form a 1,2,3-triazole ring, with the formation of a transverse intermolecular bond. 4 µl of copper sulphate (50 µM) was placed in a clean 1.5 ml centrifuge tube, then 3 µl of BTTAA (300 µM) and 10 µl of compound IV (protein]/[-(butynyloxycarbonyl)-lysine-human insulin) were added in order (approximately 5 μm), the preparation of which was described in Example 1. At this time, the solution could be diluted to achieve the proper volume or protein concentration. To initiate the reaction, 1 μl of L0-GFA16 (1 μM) and 2 μl of sodium ascorbate (2.5 mM) were added to this solution. After approximately 1 hour at room temperature, 5 μl of SDS-PAGE sample buffer was added and heated to 100° C. for 10 minutes. Solution analysis was completed using 12% SDS-PAGE. The gel was extracted and then analyzed using a gel imaging procedure and fluorescent analysis; it was then stained with Coomassie Brilliant Blue.
Пример 3. Синтез L2-GFA16-инсулинов, L3-GFA16-инсулинов, L4-СРА16-инсулинов, L5-СРА16-инсулинов и L6-СРА16-инсулинов (n равно 14)Example 3 Synthesis of L2-GFA16 Insulins, L3-GFA16 Insulins, L4-CPA16 Insulins, L5-CPA16 Insulins and L6-CPA16 Insulins (n=14)
В чистую центрифужную трубку объемом 1,5 мл помещалось 4 мкл сернокислой меди (50 мкМ), затем по порядку добавлялось 3 мкл ВТТАА (300 мкМ) и 10 мкл соединения IV (белка K-(бутинилоксикарбонил)-лизин-человеческого инсулина) (приблизительно 5 мкМ), приготовление которого было описано в Примере 1. В это время, возможно, необходимо добавить воду для разбавления раствора до достижения надлежащего значения объема или концентрации белка. Для инициирования реакции к этому раствору добавлялись 1 мкл L2-GFA16 (1 мкМ) и 2 мкл аскорбата натрия (2,5 мМ). После выдерживания в течение приблизительно 1 часа при комнатной температуре добавлялось 5 мкл буфера для образца SDS-PAGE и осуществлялся нагрев до температуры 100°С в течение 10 минут. Анализ раствора завершался с использованием 12% SDS-PAGE. Было осуществлено извлечение геля с последующим его анализом с использованием процедуры гелевой визуализации и флуоресцентного анализа; затем было произведено его окрашивание кумасси бриллиантовым синим.4 µl of copper sulphate (50 µM) was placed in a clean 1.5 ml centrifuge tube followed by 3 µl of BTTAA (300 µM) and 10 µl of Compound IV (protein K-(butynyloxycarbonyl)-lysine-human insulin) in order (approx. 5 μM), the preparation of which was described in Example 1. At this time, it may be necessary to add water to dilute the solution to achieve the proper volume or protein concentration. To initiate the reaction, 1 μl of L2-GFA16 (1 μM) and 2 μl of sodium ascorbate (2.5 mM) were added to this solution. After approximately 1 hour at room temperature, 5 μl of SDS-PAGE sample buffer was added and heated to 100° C. for 10 minutes. Solution analysis was completed using 12% SDS-PAGE. The gel was extracted and then analyzed using a gel imaging procedure and fluorescent analysis; it was then stained with Coomassie Brilliant Blue.
Аналогично, для завершения клик-реакции с целью получения указанных ниже продуктов использовались, соответственно, соединение IV, приготовление которого было описано в Примере 1, и L3-GFA16, L4-GFA16, L5-GFA16, L6-GFA16; структура указанных компонентов показана ниже.Similarly, compound IV, the preparation of which was described in Example 1, and L3-GFA16, L4-GFA16, L5-GFA16, L6-GFA16 were used to complete the click reaction to obtain the following products; the structure of these components is shown below.
Пример 4. Фармакокинетические исследования действия производных инсулина согласно настоящему изобретению у крысExample 4 Pharmacokinetic studies of the action of insulin derivatives according to the present invention in rats
В эксперименте принимали участие группа вещества сравнения и группа исследуемого вещества. Осуществлялась подкожная однократная инъекция человеческих инсулинов и L6-GFA16-инсулинов по 0,45 мг/кг соответственно. Кровь для анализа отбиралась у животных из каждой группы через 15 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 3 ч, 5 ч, 7 ч, 12 ч и 24 ч после выполнения инъекции. Для обнаружения присутствия различных аналогов инсулина использовался метод LC-MS/MS. Для подготовки статистических данных, касающихся концентрации веществ в плазме крови, использовалось программное обеспечение для метаболического кинетического анализа данных WinNonlin 7.0, а для расчета фармакокинетических параметров (Таблица 1) использовался метод некомпартментального моделирования (NCA). Результаты, приведенные в Таблице 1, указывают на получение сходных значений времени обнаружения пиковой концентрации лекарственных веществ для каждой из групп животных, а именно, 0,5-1 часов. Длительность периодов полувыведения Ь6-GFA16-инсулинов превышала соответствующий параметр для рекомбинантных человеческих инсулинов в 3-4 раза. Время воздействия лекарственных веществ in vivo оказалось пролонгированным, а экспозиционные дозы увеличенными.The group of the reference substance and the group of the test substance took part in the experiment. A single subcutaneous injection of human insulins and L6-GFA16-insulins at 0.45 mg/kg, respectively, was performed. Blood for analysis was taken from animals from each group 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 5 h, 7 h, 12 h and 24 h after the injection. LC-MS/MS was used to detect the presence of various insulin analogs. WinNonlin 7.0 Metabolic Kinetic Data Analysis software was used to prepare plasma concentration statistics, and non-compartmental modeling (NCA) was used to calculate pharmacokinetic parameters (Table 1). The results shown in Table 1 show similar peak drug detection times for each group of animals, namely 0.5-1 hour. The duration of the half-life of L6-GFA16-insulins exceeded the corresponding parameter for recombinant human insulins by 3-4 times. The exposure time of medicinal substances in vivo turned out to be prolonged, and exposure doses increased.
Эксперименты, описанные выше, повторялись аналогичным образом, за исключением факта использования L0-GFA16-инсулинов, L2-GFA16-инсулинов, L3-GFA16-инсулинов, L4-GFA16-инсулинов и L5-GFA16-инсулинов согласно настоящему изобретению. Результаты показали, что длительность периодов полувыведения производных инсулина согласно настоящему изобретению оказалась существенно пролонгированной, а показатели биологической активности - сохранены.The experiments described above were repeated in a similar manner except for the fact that L0-GFA16 insulins, L2-GFA16 insulins, L3-GFA16 insulins, L4-GFA16 insulins and L5-GFA16 insulins were used according to the present invention. The results showed that the duration of the half-life of the insulin derivatives according to the present invention was significantly prolonged, and the indicators of biological activity were preserved.
Пример 5. Синтез белков ГПП-1, содержащих бутинилоксикарбонил-лизинExample 5 Synthesis of GLP-1 Proteins Containing Butynyloxycarbonyl-Lysine
Фрагмент ДНК, кодирующий белок ГПП-1, содержащего бутинилоксикарбонил-лизин, который, в свою очередь, содержит аминокислотную последовательность согласно показанному в SEQ ID NO: 12, был получен в результате химического синтеза, в процессе которого кодирующая последовательность 70-го лизина (K) была заменена TAG (осуществляющим кодирование производного лизина). Затем фрагмент ДНК, использованный для кодирования всей аминокислотной последовательности согласно показанному в SEQ ID NO: 12, клонировался в модифицированный вектор pBAD-HisA. Полученная плазмида использовалась для обеспечения экспрессии белка GLP-1, содержащего в себе структуру бутинилоксикарбонил-лизина. Плазмида и ферментная плазмида pEvol-pylRs-pylT совместно трансформировались в штамм Е. coli Тор 10. Трансформационный раствор культивировался в течение ночи при температуре 37°С на агаровой среде Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл. Отбиралась одна колония, которая затем культивировалась на шейкере постоянной температуры (при 220 об/мин) в течение ночи при температуре 37°С на агаровой среде Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл. Затем ночная культура вносилась в 100 мл жидкой среды Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл, и культивировалась при температуре 37°С до достижения уровня значений 2-4 оптической плотности OD600. Затем к среде добавлялся 25% раствор арабинозы до достижения окончательной концентрации 0,25% и добавлялось 0,1 М трет-бутинилоксикарбонил-лизинового раствора до достижения окончательной концентрации 5 мМ для индуцирования экспрессии гибридного белка. Раствор культуры культурировался в течение 16-20 часов, а затем осуществлялась процедура сбора центрифугированием (10000 об/мин, 5 мин, 4°С).The DNA fragment encoding the GLP-1 protein containing butynyloxycarbonyl-lysine, which in turn contains the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 12, was obtained as a result of chemical synthesis, during which the coding sequence of the 70th lysine (K ) has been replaced by TAG (encoding a lysine derivative). Then, the DNA fragment used to encode the entire amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 12 was cloned into the modified pBAD-HisA vector. The resulting plasmid was used to ensure the expression of the GLP-1 protein containing the butynyloxycarbonyl-lysine structure. The plasmid and the enzyme plasmid pEvol-pylRs-pylT were co-transformed into the E. coli strain Top 10. The transformation solution was cultivated overnight at 37°C on a Luria-Bertani agar medium containing kanamycin at a concentration of 25 μg/ml and chloramphenicol at a concentration of 17 mcg/ml. A single colony was selected and then cultured on a constant temperature shaker (at 220 rpm) overnight at 37°C on Luria-Bertani agar medium containing kanamycin at a concentration of 25 μg/ml and chloramphenicol at a concentration of 17 μg/ml. Then, the overnight culture was added to 100 ml of liquid Luria-Bertani medium containing kanamycin at a concentration of 25 μg/ml and chloramphenicol at a concentration of 17 μg/ml, and cultivated at a temperature of 37°C until reaching the level of OD600 values of 2-4. Then, a 25% arabinose solution was added to the medium until a final concentration of 0.25% was reached, and 0.1 M tert-butynyloxycarbonyl lysine solution was added until a final concentration of 5 mM was reached to induce expression of the fusion protein. The culture solution was cultured for 16-20 hours, and then the collection procedure by centrifugation (10,000 rpm, 5 min, 4°C) was carried out.
Аминокислотная последовательность согласно SEQ ID NO: 12:Amino acid sequence according to SEQ ID NO: 12:
MVSKGEELFTGVTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFENLYFQGDDDDKMVSKGEELFTGVTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFENLYFQGDDDDK
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG, где 70-й K является лизином, к которому ковалентно присоединялась бутинилоксикарбониловая группа.HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG, where the 70th K is a lysine to which a butynyloxycarbonyl group has been covalently attached.
Экспрессия гибридных белков осуществлялась в форме нерастворимых «внутриклеточных включений». Для высвобождения внутриклеточных включений клетки Е. coli разрушались с использованием гомогенизатора высокого давления. Клеточный детрит и растворимые белки хоста, Е. coli, удалялись посредством центрифугирования при 5000g. Внутриклеточные включения вымывались с использованием раствора, содержащего Tween 80, ЭДТА и NaCl, а затем 1-2 раза вымывались чистой водой. Смытые внутриклеточные включения растворялись в 7,5 М раствора мочевины, содержащего 2-10 мМ (3-меркаптоэтанола (рН 10,5-11,5), так что концентрация общего белка после растворения достигала 10-25 мг/мл. Образец разбавлялся 5-10 раз, выдерживался при температуре 4-8°С; затем производилось его складывание обычным способом в течение 14-30 часов при рН 10,5-11,7. После осветления раствора для рефолдинга производились отделение и очистка гибридного белка с использованием слабоанионного заполнителя при рН 9,0, и степень чистоты целевого белка достигала 80%, что подтверждалось электрофорезом. Образец подвергался элюированию с использованием высокосолевой среды. После обессоливания проводилась процедура ферментативного переваривания с использованием энтерокиназы в течение 10-20 часов при температуре 25°С; значение рН поддерживалось в диапазоне 8,0-9,0. Результаты ВЭЖХ анализа в режиме обращения фазы показывают, что выход продукта на указанном этапе ферментативного переваривания составлял более 90%о. Аналог ГПП-1, получаемый после ферментативного переваривания с использованием энтерокиназы, был назван бутинилоксикарбонил-лизин-ГПП-1. После проведения ферментативного переваривания он очищался с использованием гидрофобного заполнителя для экстракции бутинилоксикарбонил-лизин-ГПП-1; степень чистоты последнего, подтвержденная электрофорезом, достигала 90%.The expression of hybrid proteins was carried out in the form of insoluble "intracellular inclusions". To release intracellular inclusions, E. coli cells were destroyed using a high pressure homogenizer. Cellular debris and soluble host proteins, E. coli, were removed by centrifugation at 5000g. Intracellular inclusions were washed out using a solution containing Tween 80, EDTA and NaCl, and then washed out 1-2 times with pure water. The washed-out intracellular inclusions were dissolved in a 7.5 M urea solution containing 2-10 mM (3-mercaptoethanol (pH 10.5-11.5), so that the concentration of total protein after dissolution reached 10-25 mg/ml. The sample was diluted 5 -10 times, kept at a temperature of 4-8 ° C, then it was folded in the usual way for 14-30 hours at pH 10.5-11.7 After clarification of the refolding solution, the fusion protein was separated and purified using a weakly anionic filler at pH 9.0, and the purity of the target protein reached 80%, which was confirmed by electrophoresis.The sample was eluted using a high-salt medium.After desalting, an enzymatic digestion procedure was carried out using enterokinase for 10-20 hours at a temperature of 25°C; was maintained in the range of 8.0-9.0 The results of HPLC analysis in reverse phase mode show that the yield of the product at this stage of enzymatic digestion was more than 90%. The GLP-1 analogue obtained after enzymatic digestion using enterokinase was named butynyloxycarbonyl-lysine-GLP-1. After enzymatic digestion, it was purified using a hydrophobic aggregate to extract butynyloxycarbonyl-lysine-GLP-1; the degree of purity of the latter, confirmed by electrophoresis, reached 90%.
Пример 6. Синтез L0-GFA16-ГПП-1 (n равно 14)Example 6 Synthesis of L0-GFA16-GLP-1 (n is 14)
Так как ацильное соединение жирной кислоты имело азидную группу, введение белка ГПП-1 с терминальным алкином осуществлялось с использованием принципа «клик-химии»; алкин при этом реагировал с азидом для образования 1,2,3-триазольного кольца, с формированием поперечной межмолекулярной связи. В чистую центрифужную трубку объемом 1,5 мл помещалось 4 мкл сернокислой меди (50 мкМ), затем по порядку добавлялось 3 мкл ВТТАА (300 мкМ) и 10 мкл соединения IV (белка N-(бутинилоксикарбонил)-лизин-ГПП-1) (приблизительно 5 мкМ), приготовление которого было описано в Примере 5. В это время раствор мог быть разбавлен до достижения надлежащего значения объема или концентрации белка. Для инициирования реакции к этому раствору добавлялись 1 мкл L0-GFA16 (1 мкМ) и 2 мкл аскорбата натрия (2,5 мМ). После выдерживания в течение приблизительно 1 часа при комнатной температуре добавлялось 5 мкл буфера для образца SDS-PAGE и осуществлялся нагрев до температуры 100°С в течение 10 минут. Анализ раствора завершался с использованием 12% SDS-PAGE. Было осуществлено извлечение геля с последующим его анализом с использованием процедуры гелевой визуализации и флуоресцентного анализа; затем было произведено его окрашивание кумасси бриллиантовым синим.Since the fatty acid acyl compound had an azide group, the introduction of the GLP-1 protein with a terminal alkyne was carried out using the principle of "click chemistry"; alkyne reacted with azide to form a 1,2,3-triazole ring, with the formation of a transverse intermolecular bond. 4 µl of copper sulphate (50 µM) was placed in a clean centrifuge tube with a volume of 1.5 ml, then 3 µl of BTTAA (300 µM) and 10 µl of compound IV (N-(butynyloxycarbonyl)-lysine-GLP-1 protein) were added in order ( approximately 5 μm), the preparation of which was described in Example 5. At this time, the solution could be diluted to achieve the proper volume or protein concentration. To initiate the reaction, 1 μl of L0-GFA16 (1 μM) and 2 μl of sodium ascorbate (2.5 mM) were added to this solution. After approximately 1 hour at room temperature, 5 μl of SDS-PAGE sample buffer was added and heated to 100° C. for 10 minutes. Solution analysis was completed using 12% SDS-PAGE. The gel was extracted and then analyzed using a gel imaging procedure and fluorescent analysis; it was then stained with Coomassie Brilliant Blue.
Пример 7. Синтез L2-GFA16-ГПП-1, L3-GFA16-ГПП-1, L4-GFA16-ГПП-1, L5-GFA16-ГПП-1 и L6-GFA16-ГПП-1 (n равно 14)Example 7 Synthesis of L2-GFA16-GLP-1, L3-GFA16-GLP-1, L4-GFA16-GLP-1, L5-GFA16-GLP-1 and L6-GFA16-GLP-1 (n is 14)
В чистую центрифужную трубку объемом 1,5 мл помещалось 4 мкл сернокислой меди (50 мкМ), затем по порядку добавлялось 3 мкл ВТТАА (300 мкМ) и 10 мкл соединения IV (белка N-(бутинилоксикарбонил)-лизин-ГПП-1) (приблизительно 5 мкМ), приготовление которого было описано в Примере 5. В это время, возможно, необходимо добавить воду для разбавления раствора до достижения надлежащего значения объема или концентрации белка. Для инициирования реакции к этому раствору добавлялись 1 мкл L2-GFA16 (1 мкМ) и 2 мкл аскорбата натрия (2,5 мМ). После выдерживания в течение приблизительно 1 часа при комнатной температуре добавлялось 5 мкл буфера для образца SDS-PAGE и осуществлялся нагрев до температуры 100°С в течение 10 минут. Анализ раствора завершался с использованием 12% SDS-PAGE. Было осуществлено извлечение геля с последующим его анализом с использованием процедуры гелевой визуализации и флуоресцентного анализа; затем было произведено его окрашивание кумасси бриллиантовым синим.4 µl of copper sulphate (50 µM) was placed in a clean centrifuge tube with a volume of 1.5 ml, then 3 µl of BTTAA (300 µM) and 10 µl of compound IV (N-(butynyloxycarbonyl)-lysine-GLP-1 protein) were added in order ( approximately 5 μM), the preparation of which was described in Example 5. At this time, it may be necessary to add water to dilute the solution to achieve the proper volume or protein concentration. To initiate the reaction, 1 μl of L2-GFA16 (1 μM) and 2 μl of sodium ascorbate (2.5 mM) were added to this solution. After approximately 1 hour at room temperature, 5 μl of SDS-PAGE sample buffer was added and heated to 100° C. for 10 minutes. Solution analysis was completed using 12% SDS-PAGE. The gel was extracted and then analyzed using a gel imaging procedure and fluorescent analysis; it was then stained with Coomassie Brilliant Blue.
Аналогично, для завершения клик-реакции с целью получения указанных ниже продуктов использовались, соответственно, соединение IV, приготовление которого было описано в Примере 5, и L3-GFA16, L4-GFA16, L5-GFA16, L6-GFA16; структура указанных компонентов показана ниже.Similarly, compound IV, the preparation of which was described in Example 5, and L3-GFA16, L4-GFA16, L5-GFA16, L6-GFA16 were used to complete the click reaction to obtain the following products; the structure of these components is shown below.
Пример 8. Фармакокинетические исследования действия производных ГПП-1 согласно настоящему изобретению у крысExample 8 Pharmacokinetic studies of the effect of GLP-1 derivatives according to the present invention in rats
В эксперименте принимали участие группа вещества сравнения и группа исследуемого вещества. Осуществлялась подкожная однократная инъекция ГПП-1 и L6-CFA16-ГПП-1 по 0,5 мг/кг. Кровь для анализа отбиралась у животных из каждой группы через 15 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 3 ч, 5 ч, 7 ч, 12 ч и 24 ч после выполнения инъекции. Для обнаружения присутствия различных аналогов GLP-1 использовался метод LC-MS/MS. Для подготовки статистических данных, касающихся концентрации веществ в плазме крови, использовалось программное обеспечение для метаболического кинетического анализа данных WinNonlin 7.0, а для расчета фармакокинетических параметров (Таблица 2) использовался метод некомпартментального моделирования (NCA).The group of the reference substance and the group of the test substance took part in the experiment. A single subcutaneous injection of GLP-1 and L6-CFA16-GLP-1 at 0.5 mg/kg was performed. Blood for analysis was taken from animals from each group 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 5 h, 7 h, 12 h and 24 h after the injection. LC-MS/MS was used to detect the presence of various GLP-1 analogues. The WinNonlin 7.0 Metabolic Kinetic Data Analysis software was used to prepare plasma concentration statistics, and non-compartmental modeling (NCA) was used to calculate pharmacokinetic parameters (Table 2).
Результаты, приведенные в Таблице 2, указывают на получение сходных временных значений пиковой концентрации лекарственных веществ для каждой из групп животных, а именно, 4,8 мин. Время воздействия L6-GFA16-ГПП-1 in vivo оказалось пролонгированным, а экспозиционные дозы увеличенными.The results shown in Table 2 indicate that peak drug concentration times were similar for each of the groups of animals, namely 4.8 minutes. The time of exposure to L6-GFA16-GLP-1 in vivo was prolonged, and the exposure doses were increased.
Эксперименты, описанные выше, повторялись аналогичным образом, за исключением факта использования L0-GFA16-ГПП-1, L2-GFA16-ГПП-1, L3-GFA16-ГПП-1, L4-GFA16-ГПП-1 и L5-GFA16-ГПП-1 согласно настоящему изобретению. Результаты показали, что длительность периодов полувыведения производных ГПП-1 согласно настоящему изобретению оказалась существенно пролонгированной, а показатели биологической активности - сохранены.The experiments described above were repeated in a similar manner except for the fact that L0-GFA16-GLP-1, L2-GFA16-GLP-1, L3-GFA16-GLP-1, L4-GFA16-GLP-1 and L5-GFA16-GLP were used. -1 according to the present invention. The results showed that the duration of the half-life of the GLP-1 derivatives according to the present invention was significantly prolonged, and the indicators of biological activity were preserved.
Пример 9. Синтез белков ПТГ, содержащих бутинилоксикарбонил-лизинExample 9 Synthesis of PTH Proteins Containing Butynyloxycarbonyl-Lysine
Фрагмент ДНК, кодирующий белок ПТГ, содержащего бутинилоксикарбонил-лизин, который, в свою очередь, содержит аминокислотную последовательность согласно показанному в SEQ ID NO: 13, был получен в результате химического синтеза, при котором кодирующая последовательность 76-го лизина (K) была заменена TAG (осуществляющим кодирование производного лизина). Затем фрагмент ДНК, использованный для кодирования всей аминокислотной последовательности согласно показанному в SEQ ID NO: 13, клонировался в модифицированный вектор pBAD-HisA. Полученная плазмида использовалась для обеспечения экспрессии белка ПТГ, содержащего в себе структуру бутинилоксикарбонил-лизина. Плазмида и ферментная плазмида pEvol-pylRs-pylT совместно трансформировались в штамм Е. coli Тор 10. Трансформационный раствор культивировался в течение ночи при температуре 37°С на агаровой среде Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл. Отбиралась одна колония, которая затем культивировалась на шейкере постоянной температуры (при 220 об/мин) в течение ночи при температуре 37°С на агаровой среде Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл. Затем ночная культура вносилась в 100 мл жидкой среды Луриа-Бертани, содержащей канамицин в концентрации 25 мкг/мл и хлорамфеникол в концентрации 17 мкг/мл, и культивировалась при температуре 37°С до достижения уровня значений 2-4 оптической плотности OD600. Затем к среде добавлялся 25% раствор арабинозы до достижения окончательной концентрации 0,25% и добавлялось 0,1 М трет-бутинилоксикарбонил-лизинового раствора до достижения окончательной концентрации 5 мМ для индуцирования экспрессии гибридного белка. Раствор культуры культурировался в течение 16-20 часов, а затем осуществлялась процедура сбора центрифугированием (10000 об/мин, 5 мин, 4°С). Аминокислотная последовательность согласно SEQ ID NO: 13:A DNA fragment encoding a PTH protein containing butynyloxycarbonyl-lysine, which in turn contains the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 13, was obtained by chemical synthesis in which the coding sequence of the 76th lysine (K) was replaced TAG (encoding a lysine derivative). Then, the DNA fragment used to encode the entire amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 13 was cloned into the modified pBAD-HisA vector. The resulting plasmid was used to ensure the expression of the PTH protein containing the butynyloxycarbonyl-lysine structure. The plasmid and the enzyme plasmid pEvol-pylRs-pylT were co-transformed into the E. coli strain Top 10. The transformation solution was cultivated overnight at 37°C on a Luria-Bertani agar medium containing kanamycin at a concentration of 25 μg/ml and chloramphenicol at a concentration of 17 mcg/ml. A single colony was selected and then cultured on a constant temperature shaker (at 220 rpm) overnight at 37°C on Luria-Bertani agar medium containing kanamycin at a concentration of 25 μg/ml and chloramphenicol at a concentration of 17 μg/ml. Then, the overnight culture was added to 100 ml of liquid Luria-Bertani medium containing kanamycin at a concentration of 25 μg/ml and chloramphenicol at a concentration of 17 μg/ml, and cultivated at a temperature of 37°C until reaching the level of OD600 values of 2-4. Then, a 25% arabinose solution was added to the medium until a final concentration of 0.25% was reached, and 0.1 M tert-butynyloxycarbonyl lysine solution was added until a final concentration of 5 mM was reached to induce expression of the fusion protein. The culture solution was cultured for 16-20 hours, and then the collection procedure by centrifugation (10,000 rpm, 5 min, 4°C) was carried out. Amino acid sequence according to SEQ ID NO: 13:
MVSKGEELFTGVTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFENLYFQGDDDDKMVSKGEELFTGVTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFENLYFQGDDDDK
SVSEIQLMHNLGRHLNSMERVEWLRKRLQDVHNF, где 76-й K является лизином, к которому ковалентно присоединялась бутинилоксикарбониловая группа.SVSEIQLMHNLGRHLNSMERVEWLRKRLQDVHNF, where the 76th K is a lysine to which a butynyloxycarbonyl group has been covalently attached.
Экспрессия гибридных белков осуществлялась в форме нерастворимых «внутриклеточных включений». Для высвобождения внутриклеточных включений клетки Е. coli разрушались с использованием гомогенизатора высокого давления. Клеточный детрит и растворимые белки хоста, Е. coli, удалялись посредством центрифугирования при 5000g. Внутриклеточные включения вымывались с использованием раствора, содержащего Tween 80, ЭДТА и NaCl, а затем 1-2 раза вымывались чистой водой. Смытые внутриклеточные включения растворялись в 7,5 М раствора мочевины, содержащего 2-10 мМ β-меркаптоэтанола (рН 10,5-11,5), так что концентрация общего белка после растворения достигала 10-25 мг/мл. Образец разбавлялся 5-10 раз, выдерживался при температуре 4-8°С; затем производилось его складывание обычным способом в течение 14-30 часов при рН 10,5-11,7. После осветления раствора для рефолдинга производились отделение и очистка гибридного белка с использованием слабоанионного заполнителя при рН 9,0, и степень чистоты целевого белка достигала 80%, что подтверждалось электрофорезом. Образец подвергался элюированию с использованием высокосолевой среды. После обессоливания проводилась процедура ферментативного переваривания с использованием энтерокиназы в течение 10-20 часов при температуре 25°С; значение рН поддерживалось в диапазоне 8,0-9,0. Результаты ВЭЖХ анализа в режиме обращения фазы показывают, что выход продукта на указанном этапе ферментативного переваривания составлял более 90%. Аналог ПТГ, получаемый после ферментативного переваривания с использованием энтерокиназы, был назван бутинилоксикарбонил-лизин-ПТГ. После проведения ферментативного переваривания он очищался с использованием гидрофобного заполнителя для экстракции бутинилоксикарбонил-лизин-ПТГ; степень чистоты последнего, подтвержденная электрофорезом, достигала 90%.The expression of hybrid proteins was carried out in the form of insoluble "intracellular inclusions". To release intracellular inclusions, E. coli cells were destroyed using a high pressure homogenizer. Cellular debris and soluble host proteins, E. coli, were removed by centrifugation at 5000g. Intracellular inclusions were washed out using a solution containing Tween 80, EDTA and NaCl, and then washed out 1-2 times with pure water. The washed-out intracellular inclusions were dissolved in a 7.5 M urea solution containing 2-10 mM β-mercaptoethanol (pH 10.5-11.5), so that the concentration of total protein after dissolution reached 10-25 mg/ml. The sample was diluted 5-10 times, kept at a temperature of 4-8°C; then it was folded in the usual way for 14-30 hours at a pH of 10.5-11.7. After clarification of the refolding solution, separation and purification of the fusion protein was performed using a weakly anionic filler at pH 9.0, and the purity of the target protein reached 80%, which was confirmed by electrophoresis. The sample was eluted using a high salt medium. After desalting was carried out the procedure of enzymatic digestion using enterokinase for 10-20 hours at a temperature of 25°C; the pH value was maintained in the range of 8.0-9.0. The results of HPLC analysis in reverse phase show that the yield of the product at the specified stage of enzymatic digestion was more than 90%. The PTH analogue obtained after enzymatic digestion using enterokinase was named butynyloxycarbonyl-lysine-PTH. After carrying out the enzymatic digestion, it was purified using a hydrophobic filler for the extraction of butynyloxycarbonyl-lysine-PTH; the degree of purity of the latter, confirmed by electrophoresis, reached 90%.
Использовались те же самые методы, что описаны и в Примерах 6 и 7. Для синтеза L0-GFA16-ПТГ, L2-GFA16-ПТГ, L3-GFA16-ПТГ, L4-GFA16-ПТГ, L5-GFA16-ПТГ и L6-GFA16-ПТГ белки ГПП-1, содержащие (бутинилоксикарбонил)-лизин, заменялись белками ПТГ, содержащими (бутинилоксикарбонил)-лизин.The same methods as described in Examples 6 and 7 were used. -PTH GLP-1 proteins containing (butynyloxycarbonyl)-lysine were replaced by PTH proteins containing (butynyloxycarbonyl)-lysine.
Пример 10. Фармакокинетические исследования действия производных ПТГ-1 согласно настоящему изобретению у крысExample 10. Pharmacokinetic studies of the action of PTH-1 derivatives according to the present invention in rats
В эксперименте принимали участие группа вещества сравнения и группа исследуемого вещества. Осуществлялась подкожная однократная инъекция ПТГ-1 и L6-GFA16-ПТГ-l по 8,6 мкг/кг соответственно. Кровь для анализа отбиралась у животных из каждой группы через 0 мин, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, и 4 ч после выполнения инъекции. Для обнаружения присутствия различных аналогов ПТГ-1 использовался метод LC-MS/MS. Для подготовки статистических данных, касающихся концентрации веществ в плазме крови, использовалось программное обеспечение для метаболического кинетического анализа данных WinNonlin 7.0, а для расчета фармакокинетических параметров (Таблица 3) использовался метод некомпартментального моделирования (NCA). Результаты, приведенные в Таблице 3, указывают на пролонгацию периода обнаружения пиковой концентрации L6-GFA16-ПТГ для каждой из групп животных приблизительно до 1,6 ч. Время воздействия лекарственных веществ in vivo оказалось пролонгированным, а экспозиционные дозы увеличенными.The group of the reference substance and the group of the test substance took part in the experiment. A single subcutaneous injection of PTH-1 and L6-GFA16-PTH-l was carried out at 8.6 μg/kg, respectively. Blood for analysis was taken from animals from each group at 0 min, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, and 4 h after the injection. LC-MS/MS was used to detect the presence of various PTH-1 analogues. WinNonlin 7.0 metabolic kinetic data analysis software was used to prepare plasma concentration statistics, and non-compartmental modeling (NCA) was used to calculate pharmacokinetic parameters (Table 3). The results shown in Table 3 indicate a prolongation of the period of detection of the peak concentration of L6-GFA16-PTH for each of the groups of animals to approximately 1.6 hours. The time of exposure to drugs in vivo was prolonged, and exposure doses were increased.
Эксперименты, описанные выше, повторялись аналогичным образом, за исключением факта использования L0-GFA16-ПТГ, L2-GFA16-ПТГ, L3-GFA16-ПТГ, L4-GFA16-ПТГ и L5-GFA16-ПТГсогласно настоящему изобретению. Результаты показали, что длительность периодов полувыведения производных ПТГ согласно настоящему изобретению оказалась существенно пролонгированной, а показатели биологической активности - сохранены.The experiments described above were repeated in a similar manner, except for the fact that L0-GFA16-PTH, L2-GFA16-PTH, L3-GFA16-PTH, L4-GFA16-PTH and L5-GFA16-PTH were used according to the present invention. The results showed that the duration of the half-life of the PTH derivatives according to the present invention was significantly prolonged, and the indicators of biological activity were preserved.
Все документы, упомянутые в настоящем изобретении, включены в настоящий документ в виде ссылок, как если бы они были включены при помощи ссылок по отдельности. Кроме того, необходимо понимать, что после ознакомления с вышеуказанными идеями настоящего изобретения специалисты в этой области техники могут вносить в изобретение различные изменения и модификации, а также что указанные эквиваленты также попадают под сферу действия формулы изобретения, прилагаемой к данной заявке.All documents referred to in the present invention are incorporated herein by reference as if they were incorporated by reference individually. In addition, it should be understood that after becoming familiar with the above ideas of the present invention, various changes and modifications can be made to the invention by specialists in this field of technology, and that these equivalents also fall within the scope of the claims appended to this application.
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ SEQUENCE LIST
<110> NНИНГБО КУНПЕНГ БИОТЕКХ КО., ЛТД.<110> NINGBO KUNPENG BIOTECH CO., LTD.
<120> ПРОИЗВОДНОЕ ПОЛИПЕПТИДА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ<120> POLYPEPTIDE DERIVATIVE AND METHOD FOR ITS PRODUCTION
<130> P2018-1748<130> P2018-1748
<150> CN201910390476.3<150> CN201910390476.3
<151> 2019-05-10<151> 2019-05-10
<160> 13<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1<210> 1
<211> 21<211> 21
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная Последовательность<213> Faux Sequence
<220><220>
<223> Аминокислотная Последовательность Цепи A Инсулина<223> Insulin A Chain Amino Acid Sequence
<400> 1<400> 1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn Glu Asn Tyr Cys Asn
20 20
<210> 2<210> 2
<211> 21<211> 21
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная Последовательность<213> Faux Sequence
<220><220>
<223> Аминокислотная Последовательность Цепи A Инсулина <223> Insulin A Chain Amino Acid Sequence
<400> 2<400> 2
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly Glu Asn Tyr Cys Gly
20 20
<210> 3<210> 3
<211> 30<211> 30
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная Последовательность<213> Faux Sequence
<220><220>
<223> Аминокислотная Последовательность Цепи B Инсулина <223> Insulin B Chain Amino Acid Sequence
<400> 3<400> 3
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30 20 25 30
<210> 4<210> 4
<211> 29<211> 29
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная Последовательность<213> Faux Sequence
<220><220>
<223> Аминокислотная Последовательность Цепи B Инсулина <223> Insulin B Chain Amino Acid Sequence
<400> 4<400> 4
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25 20 25
<210> 5<210> 5
<211> 30<211> 30
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная Последовательность<213> Faux Sequence
<220><220>
<223> Аминокислотная Последовательность Цепи B Инсулина <223> Insulin B Chain Amino Acid Sequence
<400> 5<400> 5
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr
20 25 30 20 25 30
<210> 6<210> 6
<211> 30<211> 30
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная Последовательность<213> Faux Sequence
<220><220>
<223> Аминокислотная Последовательность Цепи B Инсулина<223> Insulin B Chain Amino Acid Sequence
<400> 6<400> 6
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15 1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr
20 25 30 20 25 30
<210> 7<210> 7
<211> 31<211> 31
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная Последовательность<213> Faux Sequence
<220><220>
<223> Аминокислотная Последовательность GLP-1 <223> GLP-1 Amino Acid Sequence
<400> 7<400> 7
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30 20 25 30
<210> 8<210> 8
<211> 31<211> 31
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная Последовательность<213> Faux Sequence
<220><220>
<223> Аминокислотная Последовательность GLP-1 <223> GLP-1 Amino Acid Sequence
<400> 8<400> 8
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30 20 25 30
<210> 9<210> 9
<211> 31<211> 31
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная Последовательность<213> Faux Sequence
<220><220>
<223> Аминокислотная Последовательность GLP-1 <223> GLP-1 Amino Acid Sequence
<400> 9<400> 9
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30 20 25 30
<210> 10<210> 10
<211> 34<211> 34
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная Последовательность<213> Faux Sequence
<220><220>
<223> Аминокислотная Последовательность PTH<223> PTH Amino Acid Sequence
<400> 10<400> 10
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Asn Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Leu Asn
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Arg Leu Gln Asp Val His Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Arg Leu Gln Asp Val His
20 25 30 20 25 30
Asn Phe Asn Phe
<210> 11<210> 11
<211> 103<211> 103
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная Последовательность<213> Faux Sequence
<220><220>
<223> Аминокислотная Последовательность Бутинилоксикарбонил-лизина <223> Amino Acid Sequence of Butynyloxycarbonyl-lysine
<400> 11<400> 11
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Thr Tyr Lys Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Thr Tyr Lys Thr
1 5 10 15 1 5 10 15
Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Asp Asp Asp Asp Lys Thr Leu Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Asp Asp Asp Asp Lys Thr Leu
20 25 30 20 25 30
Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Glu Asn Leu Tyr Phe Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Glu Asn Leu Tyr Phe
35 40 45 35 40 45
Gln Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Gln Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu
50 55 60 50 55 60
Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
65 70 75 80 65 70 75 80
Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
85 90 95 85 90 95
Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
100 100
<210> 12<210> 12
<211> 81<211> 81
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная Последовательность<213> Faux Sequence
<220><220>
<223> Аминокислотная Последовательность Бутинилоксикарбонил-лизина<223> Amino Acid Sequence of Butynyloxycarbonyl-lysine
<400> 12<400> 12
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Thr Tyr Lys Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Thr Tyr Lys Thr
1 5 10 15 1 5 10 15
Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu
20 25 30 20 25 30
Leu Lys Gly Ile Asp Phe Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Asp Asp Asp Leu Lys Gly Ile Asp Phe Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Asp Asp Asp
35 40 45 35 40 45
Asp Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Asp Lys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Gly gly
<210> 13<210> 13
<211> 84<211> 84
<212> ПРТ<212> PRT
<213> Искусственная Последовательность<213> Faux Sequence
<220><220>
<223> Аминокислотная Последовательность Бутинилоксикарбонил-лизина<223> Amino Acid Sequence of Butynyloxycarbonyl-lysine
<400> 13<400> 13
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Thr Tyr Lys Thr Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Thr Tyr Lys Thr
1 5 10 15 1 5 10 15
Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu
20 25 30 20 25 30
Leu Lys Gly Ile Asp Phe Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Asp Asp Asp Leu Lys Gly Ile Asp Phe Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Asp Asp Asp
35 40 45 35 40 45
Asp Lys Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His Asp Lys Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Arg His
50 55 60 50 55 60
Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Arg Leu Gln Asp Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Arg Leu Gln Asp
65 70 75 80 65 70 75 80
Val His Asn PheVal His Asn Phe
<---<---
Claims (49)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910390476.3 | 2019-05-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2792236C1 RU2792236C1 (en) | 2023-03-21 |
| RU2792236C9 true RU2792236C9 (en) | 2023-05-26 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2007134156A (en) * | 2005-03-18 | 2009-04-27 | Ново Нордиск А/С (DK) | Acylated GLP-1 COMPOUNDS |
| WO2013018929A1 (en) * | 2011-08-04 | 2013-02-07 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Nitrogen-containing heterocyclic compound |
| CN104099360A (en) * | 2013-04-12 | 2014-10-15 | 北京大学 | Preparation for protein or peptide labeled by unnatural amino acid |
| WO2016065236A1 (en) * | 2014-10-24 | 2016-04-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Carbazole derivatives |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2007134156A (en) * | 2005-03-18 | 2009-04-27 | Ново Нордиск А/С (DK) | Acylated GLP-1 COMPOUNDS |
| WO2013018929A1 (en) * | 2011-08-04 | 2013-02-07 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Nitrogen-containing heterocyclic compound |
| CN104099360A (en) * | 2013-04-12 | 2014-10-15 | 北京大学 | Preparation for protein or peptide labeled by unnatural amino acid |
| WO2016065236A1 (en) * | 2014-10-24 | 2016-04-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Carbazole derivatives |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RESH M.D.: "Fatty Acylation of Proteins: The Long and the Short of it", Prog. Lipid Res., 2016, v. 63: 120-131, doi: 10.1016/j.plipres.2016.05.002. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6703068B2 (en) | Insulin receptor partial agonist | |
| JP5694779B2 (en) | Novel insulin derivatives with extremely delayed time action profiles | |
| JP5695909B2 (en) | Novel insulin derivatives with extremely delayed time action profiles | |
| KR102066987B1 (en) | Polypeptides | |
| CN106559984A (en) | For treating the compositionss comprising Recent Development of Long-acting Insulin Analogs conjugate and long lasting insulinotropic element peptide conjugate of diabetes | |
| JPH0469128B2 (en) | ||
| JP2011526886A (en) | Novel insulin analogues with sustained activity | |
| EP3448417A1 (en) | Insulin dimer-incretin conjugates | |
| JP2018510871A (en) | Amylin analog | |
| IE914347A1 (en) | Fusion polypeptides | |
| CN113105536A (en) | Novel proinsulin and method for preparing insulin glargine by using same | |
| JP2008546816A (en) | Exendin 4 polypeptide fragments and uses thereof | |
| CN113105561B (en) | Preparation method and application of double-target fusion protein | |
| JP6013330B2 (en) | Human insulin containing additional disulfide bonds | |
| RU2792236C9 (en) | Polypeptide derivative and method for its production | |
| RU2792236C1 (en) | Polypeptide derivative and method for its production | |
| EP3888667B1 (en) | Glucagon analog and methods of use thereof | |
| JP7453698B2 (en) | Polypeptide derivatives and methods for their preparation | |
| CN111909255A (en) | Insulin derivatives and process for preparing the same | |
| EP3904372A1 (en) | Insulin precursor purifying method using anion exchange chromatography | |
| EP3904373A1 (en) | Composition for converting insulin precursor into insulin enzyme and method for converting insulin precursor into insulin by using same |