RU2791531C2 - 1-(4-amino-5-bromo-6-(1h-pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1h-pyrazol-4-ol and its applications for cancer treatment - Google Patents
1-(4-amino-5-bromo-6-(1h-pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1h-pyrazol-4-ol and its applications for cancer treatment Download PDFInfo
- Publication number
- RU2791531C2 RU2791531C2 RU2019128199A RU2019128199A RU2791531C2 RU 2791531 C2 RU2791531 C2 RU 2791531C2 RU 2019128199 A RU2019128199 A RU 2019128199A RU 2019128199 A RU2019128199 A RU 2019128199A RU 2791531 C2 RU2791531 C2 RU 2791531C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ser
- thr
- val
- leu
- gly
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe field of technology to which the invention belongs
Настоящее изобретение относится к активному метаболиту 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина, а именно 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-олу, который модулирует аденозиновый рецептор A2a. В частности, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ол, а также способам их получения и их применения в лечении рака. The present invention relates to the active metabolite of 5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine, namely 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H - pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol, which modulates the A2a adenosine receptor. In particular, the present invention relates to pharmaceutical compositions containing 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol, as well as methods for their preparation and their use in the treatment of cancer.
Предпосылки изобретенияBackground of the invention
Рак является существенной проблемой в сфере общественного здравоохранения во всем мире. В настоящее время он является второй ведущей причиной смертности в Соединенных Штатах и ряде развитых стран, и ожидается, что он превзойдет заболевания сердца в качестве ведущей причины смертности в следующие несколько лет. (Siegel R L, et al, Cancer Statistics, 2015, CA Cancer J Clin 2015; 65:5-29. VC 2015 American Cancer Society и ссылки, приведенные в нем).Cancer is a significant public health problem worldwide. It is currently the second leading cause of death in the United States and several developed countries and is expected to surpass heart disease as the leading cause of death in the next few years. (Siegel R L, et al, Cancer Statistics, 2015, CA Cancer J Clin 2015; 65:5-29. VC 2015 American Cancer Society and references cited therein).
Рак считается сложным заболеванием, которое обусловлено как внутренними, так и внешними клеточными процессами, связанными с развитием рака. В ходе ряда исследований, проведенных на различных in vitro и животных моделях, включая, например, легочные метастазы, клетки аденокарциномы легких человека, мышиные клетки меланомы, мышиные клетки рака яичников, мышиные клетки рака молочной железы, было подтверждено, что целенаправленное воздействие на аденозинэргическую систему обладает огромным потенциалом для разработки различных средств для лечения. Целый ряд данных подчеркивает значение аденозина в качестве критически важного регуляторного аутокринного и паракринного фактора, который накапливается в неопластическом микроокружении. Внеклеточный аденозин, который обычно присутствует в высоких концентрациях в раковых тканях, является крайне важным медиатором изменения функций иммунных клеток при раке. Возможно, это объясняется тем, что жестко регулируемые сигнальные пути аденозиновых рецепторов иммунных клеток подвергаются значительным изменениям в опухолях, тем самым изменяя функции этих клеток с иммунного надзора и защиты организма хозяина на способствование перерождению клеток в раковые и их росту. (Antonioli L et al., Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine, Nature, 842, December 2013, Volume 13 и ссылки, приведенные в нем).Cancer is considered a complex disease that is driven by both intrinsic and extrinsic cellular processes associated with cancer development. In a number of studies conducted in various in vitro and animal models, including, for example, lung metastases, human lung adenocarcinoma cells, mouse melanoma cells, mouse ovarian cancer cells, mouse breast cancer cells, it was confirmed that a targeted effect on the adenosinergic system has great potential for the development of various treatments. A number of data highlight the importance of adenosine as a critical regulatory autocrine and paracrine factor that accumulates in the neoplastic microenvironment. Extracellular adenosine, which is normally present in high concentrations in cancerous tissues, is a critical mediator of changes in immune cell function in cancer. This may be due to the fact that tightly regulated immune cell adenosine receptor signaling pathways undergo significant changes in tumors, thereby changing the function of these cells from immune surveillance and host defense to promoting cell transformation into cancer cells and their growth. (Antonioli L et al., Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine , Nature, 842, December 2013, Volume 13 and references cited therein).
Как известно, опухоли используют многочисленные механизмы иммуносупрессии для способствования опухолевому росту (Koebel CM. et al, Adaptive immunity maintains occult cancer in an equilibrium state, Nature. 2007, 450, 7171:903-907 и Schreiber RD. et al., Cancer immunoediting: Integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion, Science. 2011, 331, 6024:1565-1570). Существуют исследования, свидетельствующие о том, что один такой механизм опосредован катаболизмом внеклеточного AMP в иммуносупрессивный аденозин (Ohta A. et al, A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103: 13132-13137 и Ohta A. et al., A2A adenosine receptor may allow expansion of T cells lacking effector functions in extracellular adenosine-rich microenvironments. J Immunol. 2009, 183, 9:5487-5493). Сначала внеклеточный ATP подвергается превращению в AMP посредством экзофермента CD39. Дополнительное дефосфорилирование AMP посредством экзофермента CD73 приводит к продуцированию внеклеточного аденозина.Tumors are known to use multiple immunosuppressive mechanisms to promote tumor growth (Koebel CM. et al., Adaptive immunity maintains occult cancer in an equilibrium state , Nature. 2007, 450, 7171:903-907 and Schreiber RD. et al., Cancer immunoediting : Integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion , Science 2011, 331, 6024:1565-1570). There are studies suggesting that one such mechanism is mediated by the catabolism of extracellular AMP to immunosuppressive adenosine (Ohta A. et al, A2A adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells . Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103: 13132-13137 and Ohta A. et al., A2A adenosine receptor may allow expansion of T cells lacking effector functions in extracellular adenosine-rich microenvironments (J Immunol. 2009, 183, 9:5487-5493). First, extracellular ATP is converted to AMP by the CD39 exoenzyme. Additional dephosphorylation of AMP by the CD73 exoenzyme leads to the production of extracellular adenosine.
Во время данного процесса активность аденозинкиназы также подавляется, обуславливая подавление реутилизационной активности данного фермента и повышение уровней аденозина. Например, в условиях гипоксии при воспалении или в пределах микроокружения опухоли ингибирование аденозинкиназы вызывает повышение в 15-20 раз как внеклеточного, так и внутриклеточного уровней аденозина (Decking UK. Et al, Hypoxia-induced inhibition of adenosine kinase potentiates cardiac adenosine release. Circ. Res. 1997; 81(2):154-164. doi: 10.1161/01.RES.81.2.154). Образованный внеклеточный аденозин связывается с четырьмя известными рецепторами клеточной поверхности (A1, A2A, A2B и A3), которые экспрессируются на множестве субпопуляций иммунных клеток, включая T-клетки, естественные клетки-киллеры (NK), T-клеточные естественные киллеры, макрофаги, дендритные клетки и супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC). Подтипы рецепторов A2A и A2B главным образом ответственны за иммуносупрессивные эффекты аденозина. Они участвуют в общем сигнальном пути, причем оба из них вызывают активацию аденилатциклазы и накопление внутриклеточного cAMP. Был дополнительно предоставлен ряд свидетельств, демонстрирующих, что внутриклеточный cAMP является сигнальной молекулой, которая ингибирует сигнальный путь T-клеточного рецептора на ранней и поздней стадиях инициируемого T-клеточным рецептором сигнального пути активации T-клетки. (Ohta A, Sitkovsky M, Role of G-protein-coupled adenosine receptors in downregulation of inflammation and protection from tissue damage, Nature, 2001, 414: 916-920).During this process, adenosine kinase activity is also suppressed, causing suppression of the recycling activity of this enzyme and an increase in adenosine levels. For example, under conditions of hypoxia during inflammation or within the tumor microenvironment, inhibition of adenosine kinase causes a 15-20-fold increase in both extracellular and intracellular levels of adenosine (Decking UK. Et al, Hypoxia-induced inhibition of adenosine kinase potentiates cardiac adenosine release . Circ. Res. 1997;81(2):154-164 doi: 10.1161/01.RES.81.2.154). Formed extracellular adenosine binds to four known cell surface receptors (A1, A2A, A2B, and A3) that are expressed on a variety of immune cell subpopulations, including T cells, natural killer (NK) cells, T-cell natural killers, macrophages, dendritic cells and suppressor cells of myeloid origin (MDSC). The A2A and A2B receptor subtypes are primarily responsible for the immunosuppressive effects of adenosine. They are involved in a common signaling pathway, both of which cause adenylate cyclase activation and accumulation of intracellular cAMP. Additional evidence has been provided demonstrating that intracellular cAMP is a signaling molecule that inhibits T-cell receptor signaling in the early and late stages of T-cell receptor-initiated T-cell activation signaling. (Ohta A, Sitkovsky M, Role of G-protein-coupled adenosine receptors in downregulation of inflammation and protection from tissue damage , Nature, 2001, 414: 916-920).
Было высказано предположение, что элиминация рецептора A2a способами генетической инженерии или ингибирование сигнального пути рецептора A2a с применением антагонистов рецептора A2a обеспечит предупреждение ингибирования противоопухолевых T-клеток и улучшит отторжение опухоли (Ohta A. et al., A 2 a adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103: 13132-13137).It has been suggested that elimination of the A 2 a receptor by genetic engineering or inhibition of the A 2 a receptor signaling pathway using A 2 a receptor antagonists would prevent inhibition of antitumor T cells and improve tumor rejection (Ohta A. et al., A 2 a adenosine receptor protects tumors from antitumor T cells Proc Natl Acad Sci US A. 2006;103:13132-13137).
Рецептор A2a функционирует в качестве неизбыточного отрицательного регулятора активированных T-клеток для защиты нормальных тканей от чрезмерного коллатерального повреждения при воспалении. Было высказано предположение, что рецептор A2a может также 'ошибочно' защищать раковые ткани. Был сделан вывод, что если это действительно так, то генетическая инактивация или фармакологический антагонизм рецептора A2a будет обеспечивать предупреждение ингибирования противоопухолевых T-клеток и тем самым улучшать отторжение опухоли посредством таких деингибированных T-клеток (Sitkovsky M. et al, Adenosine A 2 a receptor antagonists: blockade of adenosinergic effects and T regulatory cells, British Journal of Pharmacology, 2008, 153, S457-S464).The A 2 a receptor functions as a non-redundant negative regulator of activated T cells to protect normal tissues from excessive collateral damage in inflammation. It has been suggested that the A 2 a receptor may also 'erroneously' protect cancerous tissues. It was concluded that if this is indeed the case, then genetic inactivation or pharmacological antagonism of the A 2 a receptor would prevent inhibition of antitumor T cells and thereby improve tumor rejection by such deinhibited T cells (Sitkovsky M. et al, Adenosine A 2 a receptor antagonists: blockade of adenosinergic effects and T regulatory cells , British Journal of Pharmacology, 2008, 153, S457-S464).
Рак легкого является ведущей причиной смертности от рака по всему миру, и с 1985 г. он является наиболее распространенной формой рака в мире как с точки зрения частоты возникновения, так и смертности. В глобальном масштабе рак легкого вносит наибольший вклад в новые случаи диагностирования рака (12,4% от общего количества новых случаев рака) и случаи смертей от рака (17,6% от общего количества смертей от рака).Lung cancer is the leading cause of cancer death worldwide, and since 1985 it has been the most common form of cancer in the world in terms of both incidence and mortality. Globally, lung cancer is the largest contributor to new cancer diagnoses (12.4% of total new cancer cases) and cancer deaths (17.6% of total cancer deaths).
Рак легкого развивается из клеток респираторного эпителия, и его можно подразделить на две широкие категории. Мелкоклеточный рак легкого (SCLC) является опухолью с высокой степенью злокачественности, происходящей из клеток, демонстрирующих нейроэндокринные характеристики, и на его долю приходится 15% случаев рака легкого. Немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), на долю которого приходятся оставшиеся 85% случаев, дополнительно подразделяют на 3 главных патологических подтипа: аденокарциному, плоскоклеточную карциному и крупноклеточную карциному. На долю только аденокарциномы приходится 38,5% всех случаев рака легкого, при этом на долю плоскоклеточной карциномы приходится 20%, а на долю крупноклеточной карциномы приходится 2,9%. За последние несколько десятилетий частота возникновения аденокарциномы сильно увеличилась, и аденокарцинома заняла позицию плоскоклеточной карциномы в качестве наиболее распространенного типа NSCLC. (De la Cruz, C et al., Lung Cancer: Epidemiology, Etiology, and Prevention, Clin Chest Med. 2011 December; 32(4)).Lung cancer develops from cells in the respiratory epithelium and can be divided into two broad categories. Small cell lung cancer (SCLC) is a highly malignant tumor derived from cells showing neuroendocrine characteristics and accounts for 15% of lung cancer cases. Non-small cell lung cancer (NSCLC), which accounts for the remaining 85% of cases, is further subdivided into 3 major pathological subtypes: adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, and large cell carcinoma. Adenocarcinoma alone accounts for 38.5% of all lung cancer cases, with squamous cell carcinoma accounting for 20% and large cell carcinoma accounting for 2.9%. Over the past few decades, the incidence of adenocarcinoma has greatly increased, and adenocarcinoma has taken the position of squamous cell carcinoma as the most common type of NSCLC. (De la Cruz, C et al., Lung Cancer: Epidemiology, Etiology, and Prevention , Clin Chest Med. 2011 December; 32(4)).
В частности, в случае NSCLC стадия заболевания определяет способ лечения, который включает хирургическое вмешательство, лучевую терапию, двухкомпонентную химиотерапию на основе препаратов платины и с недавних пор целевые виды терапии, предусматривающие прерывание сигнальных путей, ответственных за пролиферацию и выживание клеток. На ранних стадиях заболевания эффективной является системная химиотерапия (двухкомпонентная на основе препаратов платины, таксановая, гемцитабиновая, пеметрекседовая) (Azzoli CG. et al., 2011 Focused Update of 2009 American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update on Chemotherapy for Stage IV Non-Small-Cell Lung Cancer, J Oncol Pract. 2012; 8:63-6 doi:10.1200/JOP.2011.000374), которая в результате обеспечивает невысокую эффективность, поэтому мультимодальная терапевтическая стратегия стала важным вариантом лечения пациентов с NSCLC. В нескольких исследованиях было доказано, что комбинации двух или более лекарственных средств обладают более высокой эффективностью, но за счет дополнительной токсичности (Yoshida T. et al., Comparison of adverse events and efficacy between gefitinib and erlotinib in patients with non-small-cell lung cancer: a retrospective analysis, Med Oncol. 2013; 30:349).In particular, in the case of NSCLC, the stage of the disease determines the mode of treatment, which includes surgery, radiation therapy, dual platinum-based chemotherapy, and more recently, targeted therapies that interrupt signaling pathways responsible for cell proliferation and survival. In the early stages of the disease, systemic chemotherapy (two-component based on platinum drugs, taxane, gemcitabine, pemetrexed) is effective (Azzoli CG. et al., 2011 Focused Update of 2009 American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update on Chemotherapy for Stage IV Non- Small-Cell Lung Cancer , J Oncol Pract. 2012; 8:63-6 doi:10.1200/JOP.2011.000374), which results in poor efficacy, making a multimodal therapeutic strategy an important treatment option for patients with NSCLC. Several studies have shown that combinations of two or more drugs are more effective, but at the expense of additional toxicity (Yoshida T. et al., Comparison of adverse events and efficacy between gefitinib and erlotinib in patients with non-small-cell lung cancer: a retrospective analysis , Med Oncol 2013; 30:349).
В последнее время осуществляется разработка нескольких подходов для усиления противораковых ответов Т-клеток и восстановления их способности выявлять и атаковать раковые клетки, среди которых были разработаны mAb, блокирующие ассоциированный с цитотоксическими лимфоцитами антиген 4 (CTLA4) и опосредованные белком 1 программируемой смерти клеток (PD-1) T-клеточные события.Recently, several approaches have been developed to enhance anti-cancer responses of T cells and restore their ability to detect and attack cancer cells, among which mAbs have been developed that block cytotoxic lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA4) and are mediated by programmed cell death protein 1 (PD- 1) T-cell events.
Ипилимумаб, представляющий собой полностью человеческое mAb к CTLA4, показал тенденцию к обеспечению более высокой клинической пользы среди пациентов с SQCLC (Lynch TJ. et al., Ipilimumab in combination with paclitaxel and carboplatin as first-line treatment in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer: Results from a randomized, double-blind, multicenter phase II study, J Clin Oncol.2012; 30: 2046-54). mAb к PD-1 (MEDI4735, BMS-936558, BMS-936559) продемонстрировали способность обеспечивать существенную длительную регрессию опухолей у проходивших интенсивное предварительное лечение пациентов с NSCLC на поздней стадии (Brahmer JR. et al., Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer, N Engl J Med. 2012; 366: 2455-65).Ipilimumab, a fully human anti-CTLA4 mAb, has shown a trend towards higher clinical benefit among patients with SQCLC . -cell lung cancer: Results from a randomized, double-blind, multicenter phase II study , J Clin Oncol.2012;30:2046-54). anti-PD-1 mAbs (MEDI4735, BMS-936558, BMS-936559) have demonstrated the ability to provide significant long-term tumor regression in intensively pretreated patients with advanced NSCLC (Brahmer JR. et al., Safety and activity of anti-PD- L1 antibody in patients with advanced cancer , N Engl J Med. 2012; 366: 2455-65).
Существуют исследования, показывающие наличие изменений, вызывающих изменения во внеклеточном микроокружении опухоли. Одним из таких внеклеточных изменений является повышение концентраций аденозина, что нарушает опосредованное T-клетками отторжение и способствует ангиогенезу. Исследование показало, что значительное количество аденокарцином легкого экспрессируют аденозиновый рецептор A2a, поддерживая проведение тестирования антагонистов аденозинового рецептора A2a в качестве противораковых терапевтических средств. (Mediavilla-Varela, M et al., Antagonism of adenosine A 2 a receptor expressed by lung adenocarcinoma tumor cells and cancer associated fibroblasts inhibits their growth, Cancer Biology & Therapy, September 2013, 14:9, 860-868). There are studies showing the presence of changes that cause changes in the extracellular microenvironment of the tumor. One such extracellular change is an increase in adenosine concentrations, which impairs T-cell mediated rejection and promotes angiogenesis. The study showed that a significant number of lung adenocarcinomas express the adenosine A 2 a receptor, supporting the testing of adenosine A 2 a receptor antagonists as anti-cancer therapeutic agents. (Mediavilla-Varela, M et al., Antagonism of adenosine A 2 a receptor expressed by lung adenocarcinoma tumor cells and cancer associated fibroblasts inhibits their growth , Cancer Biology & Therapy, September 2013, 14:9, 860-868).
Несмотря на разработку новых терапевтических средств NSCLC все еще характеризуется 5-летней выживаемостью у только 14%, что предполагает необходимость продолжения исследований, направленных на новые средства для лечения (Spira A. et al., Multidisciplinary management of lung cancer, N Engl J Med. 2004; 350:379-92 doi: 10.1056/NEJMra035536).Despite the development of new therapeutics, NSCLC still has a 5-year survival rate of only 14%, suggesting the need for continued research into new treatments (Spira A. et al., Multidisciplinary management of lung cancer , N Engl J Med. 2004; 350:379-92 doi: 10.1056/NEJMra035536).
В WO 2011/121418, соответствующее раскрытие которого включено в данный документ посредством ссылки, раскрыт ряд аминопиримидиновых производных в качестве антагонистов аденозинового рецептора A2a для применения в лечении нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона. Кроме того, эффективность соединений, описанных в WO 2011/121418, в лечении рака была исследована впоследствии. Конкретное соединение в данном классе представляет собой 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амин, которое, как было установлено, является эффективным в лечении рака. Структура 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина показана ниже.WO 2011/121418, the corresponding disclosure of which is incorporated herein by reference, discloses a series of aminopyrimidine derivatives as adenosine A2a receptor antagonists for use in the treatment of neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease. In addition, the efficacy of the compounds described in WO 2011/121418 in the treatment of cancer was subsequently investigated. A specific compound in this class is 5-bromo-2,6-di(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine, which has been found to be effective in the treatment of cancer. The structure of 5-bromo-2,6-di(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine is shown below.
В PCT/IB2016/054834 раскрывается применение такого соединения отдельно или в комбинации с одним или несколькими иммунотерапевтическими средствами в лечении рака.PCT/IB2016/054834 discloses the use of such a compound alone or in combination with one or more immunotherapeutic agents in the treatment of cancer.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к активному метаболиту 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина, а именно 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-олу или его фармацевтически приемлемой соли. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает вышеуказанное соединение, находящееся в по сути выделенном виде. Настоящее изобретение дополнительно предусматривает композиции, содержащие 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ол или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.The present invention relates to the active metabolite of 5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine, namely 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H - pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The present invention further provides the above compound in a substantially isolated form. The present invention further provides compositions containing 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol or a pharmaceutically acceptable salt thereof and at least one pharmaceutically acceptable carrier.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ ингибирования аденозинового рецептора A2a, включающий введение 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола или его фармацевтически приемлемой соли.The present invention further provides a method for inhibiting the A2a adenosine receptor, comprising administering 1-(4-amino-5-bromo-6-( 1H- pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl) -1H- pyrazol-4-ol or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в таком лечении, включающий введение 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола или его фармацевтически приемлемой соли отдельно или в комбинации с одним или несколькими иммунотерапевтическими средствами.The present invention further provides a method of treating cancer in a subject in need of such treatment, comprising administering 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H - pyrazol-4-ol or a pharmaceutically acceptable salt thereof, alone or in combination with one or more immunotherapeutic agents.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
Фиг. 1. Иллюстрирует XIC-хроматограмму, спектры Q1 и MS/MS 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина в водном стандарте (MH+: 308).Fig. 1. Illustrates the XIC chromatogram, Q1 and MS/MS spectra of 5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine in aqueous standard (MH+: 308).
Фиг. 2. Иллюстрирует XIC-хроматограмму, спектры Q1 и MS/MS 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина в микросомах печени человека через 120 минут (MH+: 308).Fig. 2. Illustrates the XIC chromatogram, Q1 and MS/MS spectra of 5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine in human liver microsomes after 120 minutes (MH+: 308).
Фиг. 3. Иллюстрирует XIC-хроматограмму, спектры Q1 и MS/MS продукта монооксигенации 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина в микросомах печени человека через 120 минут (MH+: 324).Fig. 3. Illustrates the XIC chromatogram, Q1 and MS/MS spectra of the monooxygenation product of 5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine in human liver microsomes after 120 minutes (MH+: 324 ).
Фиг. 4. Иллюстрирует Q1-спектр водных стандартов 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина (1 мкМ; MH+: 308) и его продуктов монооксигенации: 1-(6-амино-5-бром-2-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-ил)-1H-пиразол-4-ола (1 мкМ; MH+: 324) и 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола (1 мкМ; MH+: 324) и идентификацию 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола в микросомах печени человека через 120 минут (MH+: 324).Fig. 4. Illustrates the Q1 spectrum of aqueous standards of 5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine (1 μM; MH+: 308) and its monooxygenation products: 1-(6- amino-5-bromo-2-( 1H- pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-yl)-1H - pyrazol-4-ol (1 μM; MH+: 324) and 1-(4-amino-5 -bromo-6-( 1H- pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl) -1H -pyrazol-4-ol (1 μM; MH+: 324) and identification of 1-(4-amino-5-bromo -6-( 1H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl) -1H -pyrazol-4-ol in human liver microsomes after 120 minutes (MH+: 324).
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDISCLOSURE OF THE INVENTION
Таким образом, в варианте осуществления 1 настоящее изобретение относится к следующему соединению, представляющему собой 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ол:Thus, in Embodiment 1, the present invention relates to the following compound, which is 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazole -4-ol:
которое образуется посредством метаболизма 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина у животных, человека и/или в клеточных анализах in-vitro.which is formed through the metabolism of 5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine in animals, humans and/or in in-vitro cellular assays.
В варианте осуществления 2 настоящее изобретение относится к находящемуся в выделенном виде 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-олу или его фармацевтически приемлемой соли.In
В варианте осуществления 3 настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ол или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.In Embodiment 3, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising 1-(4-amino-5-bromo-6-( 1H- pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl) -1H- pyrazol-4-ol or a pharmaceutically acceptable salt thereof; and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
В варианте осуществления 4 настоящее изобретение предусматривает комбинацию, в частности фармацевтическую комбинацию, содержащую терапевтически эффективное количество 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола или его фармацевтически приемлемой соли и одно или несколько иммунотерапевтических средств.In
В варианте осуществления 5 настоящее изобретение предусматривает способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в таком лечении, при этом способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола или его фармацевтически приемлемой соли отдельно или в комбинации с одним или несколькими иммунотерапевтическими средствами.In Embodiment 5, the present invention provides a method of treating cancer in a subject in need of such treatment, the method comprising administering to the subject in need thereof a therapeutically effective amount of 1-(4-amino-5-bromo-6-( 1H -pyrazole -1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol or a pharmaceutically acceptable salt thereof, alone or in combination with one or more immunotherapeutic agents.
В варианте осуществления 6 настоящее изобретение относится к применению 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола или его фармацевтически приемлемой соли отдельно или в комбинации с одним или несколькими иммунотерапевтическими средствами для лечения рака.In
В варианте осуществления 7 настоящее изобретение относится к соединению 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ол в соответствии с вариантом осуществления 2 или фармацевтической композиции в соответствии с вариантом осуществления 3 для применения в лечении рака.In Embodiment 7, the present invention relates to the compound 1-(4-amino-5-bromo-6-(1H - pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl) -1H- pyrazol-4-ol according to
В варианте осуществления 8 настоящее изобретение относится к комбинации 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола и одного или нескольких иммунотерапевтических средств для применения в лечении рака.In
В варианте осуществления 9 настоящее изобретение предусматривает способ ингибирования аденозинового рецептора A2a у субъекта, где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола в соответствии с вариантом осуществления 2 или введение фармацевтической композиции в соответствии с вариантом осуществления 3 субъекту.In Embodiment 9, the present invention provides a method for inhibiting an adenosine A2a receptor in a subject, wherein the method comprises administering to the subject a therapeutically effective amount of 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2- yl)-1 H -pyrazol-4-ol according to
В варианте осуществления 10 настоящее изобретение относится к способу согласно варианту осуществления 5, применению в соответствии с вариантом осуществления 6, или соединению для применения в соответствии с вариантом осуществления 7, или комбинации для применения в соответствии с вариантом осуществления 8, где рак выбран из рака легкого, меланомы, рака почки, рака печени, миеломы, рака предстательной железы, рака молочной железы, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака анального канала, рака желудка и пищевода, рака щитовидной железы, рака шейки матки, лимфопролиферативного заболевания или гемобластоза, T-клеточной лимфомы, B-клеточной лимфомы, неходжкинской лимфомы или лейкоза.In
В варианте осуществления 11 настоящее изобретение относится к способу согласно варианту осуществления 5, применению в соответствии с вариантом осуществления 6, или соединению для применения в соответствии с вариантом осуществления 7, или комбинации для применения в соответствии с вариантом осуществления 8, где рак представляет собой виды карциномы, конкретно рак легкого и более конкретно немелкоклеточный рак легкого.In Embodiment 11, the present invention relates to a method according to Embodiment 5, a use according to
В варианте осуществления 12 настоящее изобретение относится к способу согласно варианту осуществления 5, 10 или 11, применению в соответствии с вариантом осуществления 6, 10 или 11 или комбинации для применения в соответствии с вариантами осуществления 9, 10 или 11, где одно или несколько иммунотерапевтических средств выбраны из группы, состоящей из антител к CTLA4, антител к PD-1 и антител к PD-L1.In
В варианте осуществления 13 настоящее изобретение относится к способу согласно варианту осуществления 5, 10 или 11, применению в соответствии с вариантом осуществления 6, 10 или 11 или комбинации для применения в соответствии с вариантами осуществления 9, 10 или 11, где иммунотерапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из ипилимумаба, тремелимумаба, ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба (CT-011), AMP-224, AMP-514 (MEDI0680-Medimmune), MPDL3280A (Genentech Roche), MEDI4736, MSB0010718C (Merck Serono), YW243.55.S70 и MDX-1105.In Embodiment 13, the present invention relates to a method according to
В варианте осуществления 14 настоящее изобретение относится к способу согласно варианту осуществления 5, 10 или 11, применению в соответствии с вариантом осуществления 6, 10 или 11 или комбинации для применения в соответствии с вариантами осуществления 9, 10 или 11, где иммунотерапевтические средства представляют собой антитело к PD-1.In
В варианте осуществления 14A настоящее изобретение относится к способу согласно варианту осуществления 5, 10 или 11, применению в соответствии с вариантом осуществления 6, 10 или 11 или комбинации для применения в соответствии с вариантами осуществления 9, 10 или 11, где иммунотерапевтические средства представляют собой антитело к PD-1, выбранное из ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, MEDI0680 (AMP514 Medimmune), AMP224 (Medimmune) и антител, описанных в US 2015/0210769).In Embodiment 14A, the present invention relates to a method according to
В варианте осуществления 15 настоящее изобретение относится к способу, применению или комбинации для применения в соответствии с вариантом осуществления 14, где антитело к PD-1 содержитIn Embodiment 15, the present invention relates to a method, use, or combination for use according to
(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 4, аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 5 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 3; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 13, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 14 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 15;(a) a heavy chain variable region (VH) comprising the VHCDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the VHCDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and the VHCDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and a light chain variable region (VL) comprising the VLCDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, the VLCDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, and the VLCDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
(b) VH, содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 1; аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 2 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 3; и VL, содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 12;(b) VH containing the amino acid sequence of VHCDR1 under SEQ ID NO: 1; the amino acid sequence of VHCDR2 under SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence of VHCDR3 under SEQ ID NO: 3; and VL containing the amino acid sequence of VLCDR1 under SEQ ID NO: 10, the amino acid sequence of VLCDR2 under SEQ ID NO: 11 and the amino acid sequence of VLCDR3 under SEQ ID NO: 12;
(c) VH, содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 41, аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 5 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 3; и VL, содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 13, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 14 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 15; или(c) VH containing the VHCDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 41, the VHCDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and the VHCDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and VL containing the amino acid sequence of VLCDR1 under SEQ ID NO: 13, the amino acid sequence of VLCDR2 under SEQ ID NO: 14 and the amino acid sequence of VLCDR3 under SEQ ID NO: 15; or
(d) VH, содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 41; аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 2 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 3; и VL, содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 12.(d) VH containing the amino acid sequence of VHCDR1 under SEQ ID NO: 41; the amino acid sequence of VHCDR2 under SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence of VHCDR3 under SEQ ID NO: 3; and VL containing the VLCDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, the VLCDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and the VLCDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
В варианте осуществления 16 настоящее изобретение относится к способу, применению или комбинации для применения в соответствии с вариантом осуществления 14, где антитело к PD-1 содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6, и VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.In
В варианте осуществления 17 настоящее изобретение относится к способу, применению или комбинации для применения в соответствии с вариантом осуществления 14, где антитело к PD-1 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22.In Embodiment 17, the present invention relates to the method, use, or combination for use according to
В варианте осуществления 18 настоящее изобретение относится к способу, применению или комбинации для применения в соответствии с вариантом осуществления 14, где антитело к PD-1 содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6, и VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.In
В варианте осуществления 19 настоящее изобретение относится к способу, применению или комбинации для применения в соответствии с вариантом осуществления 14, где антитело к PD-1 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18.In Embodiment 19, the present invention relates to the method, use, or combination for use according to
В варианте осуществления 20 настоящее изобретение относится к способу, применению или комбинации для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 14-19, где молекула антитела к PD-1 вводится в дозе, составляющей приблизительно 300 мг, один раз каждые три недели.In
В варианте осуществления 21 настоящее изобретение относится к способу, применению или комбинации для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 14-19, где молекула антитела к PD-1 вводится в дозе, составляющей приблизительно 400 мг, один раз каждые четыре недели.In Embodiment 21, the present invention provides a method, use, or combination for use according to any of Embodiments 14-19, wherein the anti-PD-1 antibody molecule is administered at a dose of approximately 400 mg once every four weeks.
В варианте осуществления 22 настоящее изобретение относится к способу согласно варианту осуществления 5, 10 или 11, применению в соответствии с вариантом осуществления 6, 10 или 11 или комбинации для применения в соответствии с вариантами осуществления 9, 10 или 11, где иммунотерапевтические средства представляют собой антитело к PD-L1.In
В варианте осуществления 22A настоящее изобретение относится к способу, применению или комбинации для применения в соответствии с вариантом осуществления 22, где молекула антитела к PD-L1 выбрана из YW243.55.S70, MPDL3280A, MEDI-4736, MSB-0010718C, MDX-1105 и антитела к PD-L1, описанного в US 2016/0108123.In Embodiment 22A, the present invention relates to the method, use, or combination for use according to
В варианте осуществления 23 настоящее изобретение относится к способу, применению или комбинации для применения в соответствии с вариантом осуществления 22, где молекула антитела к PD-L1 содержитIn Embodiment 23, the present invention relates to the method, use, or combination for use according to
(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 47, аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 48 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 46; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 52, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 53 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 54;(a) a heavy chain variable region (VH) comprising the VHCDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, the VHCDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, and the VHCDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 46; and a light chain variable region (VL) comprising the VLCDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 52, the VLCDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, and the VLCDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 54;
(b) VH, содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 44; аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 45 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 46; и VL, содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 49, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 50 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 51;(b) VH containing the amino acid sequence of VHCDR1 under SEQ ID NO: 44; the amino acid sequence of VHCDR2 under SEQ ID NO: 45 and the amino acid sequence of VHCDR3 under SEQ ID NO: 46; and VL containing the amino acid sequence of VLCDR1 under SEQ ID NO: 49, the amino acid sequence of VLCDR2 under SEQ ID NO: 50 and the amino acid sequence of VLCDR3 under SEQ ID NO: 51;
(c) VH, содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 63, аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 48 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 46; и VL, содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 52, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 53 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 54; или(c) VH containing the VHCDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 63, the VHCDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, and the VHCDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 46; and VL containing the amino acid sequence of VLCDR1 under SEQ ID NO: 52, the amino acid sequence of VLCDR2 under SEQ ID NO: 53 and the amino acid sequence of VLCDR3 under SEQ ID NO: 54; or
(d) VH, содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 63; аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 45 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 46; и VL, содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 49, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 50 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 51.(d) VH containing the amino acid sequence of VHCDR1 under SEQ ID NO: 63; the amino acid sequence of VHCDR2 under SEQ ID NO: 45 and the amino acid sequence of VHCDR3 under SEQ ID NO: 46; and VL containing the VLCDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, the VLCDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, and the VLCDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 51.
В варианте осуществления 24 настоящее изобретение относится к способу, применению или комбинации для применения в соответствии с вариантом осуществления 22, где молекула антитела к PD-L1 содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 55, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 58.In
В варианте осуществления 25 настоящее изобретение относится к способу, применению или комбинации для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 12-24, где иммунотерапевтическое средство вводится совместно в одной композиции или вводится раздельно в двух или более различных формах композиций.In Embodiment 25, the present invention relates to a method, use, or combination for use according to any of Embodiments 12-24, wherein the immunotherapeutic agent is co-administered in one composition or administered separately in two or more different composition forms.
В варианте осуществления 26 настоящее изобретение относится к способу, применению или комбинации для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 12-24, где иммунотерапевтическое средство вводится одновременно с соединением -(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ол, до или после него.In
В варианте осуществления 27 настоящее изобретение предусматривает способ получения 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола в соответствии с примером 1.In Embodiment 27, the present invention provides a process for the preparation of 1-(4-amino-5-bromo-6-(1H - pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl) -1H- pyrazol-4-ol according to example 1.
ОпределениеDefinition
Применяемый в данном документе термин рак используют для обозначения группы заболеваний, характеризующихся аномальным ростом клеток со способностью проникать или распространяться в другие части организма. Виды рака классифицируют на основе типа клеток, с которым опухолевые клетки имеют сходство, и который, таким образом, считается источником происхождения опухоли. Такие типы включают карциному, саркому, лимфому и лейкоз, герминогенную опухоль и бластому.As used herein, the term cancer is used to refer to a group of diseases characterized by abnormal growth of cells with the ability to invade or spread to other parts of the body. Cancers are classified on the basis of the cell type with which the tumor cells resemble, and which is thus considered to be the origin of the tumor. Such types include carcinoma, sarcoma, lymphoma and leukemia, germ cell tumor and blastoma.
Применяемый в данном документе термин карцинома используют для обозначения видов рака, происходящих из эпителиальных клеток. Данная группа включает множество наиболее распространенных видов рака, в частности у людей старшего возраста, и включает практически все виды, развивающиеся в молочной железе, предстательной железе, легком, поджелудочной железе и толстой кишке.As used herein, the term carcinoma is used to refer to cancers derived from epithelial cells. This group includes many of the most common types of cancer, particularly in older people, and includes virtually all types that develop in the breast, prostate, lung, pancreas, and colon.
Например, термин "рак" включает без ограничения солидную опухоль, гемобластоз (например, лейкоз, лимфому, миелому, например множественную миелому) и метастатическое поражение. В одном варианте осуществления рак представляет собой солидную опухоль. Примеры солидных опухолей включают злокачественные новообразования, например виды саркомы и карциномы, например виды аденокарциномы различных систем органов, такие как поражающие легкое, молочную железу, яичник, лимфоидную ткань, желудочно-кишечный тракт (например, толстую кишку), анальный канал, половые органы и мочеполовой тракт (например, клетки почки, уротелия, мочевого пузыря, предстательную железу), глотку, ЦНС (например, головной мозг, нервные или глиальные клетки), голову и шею, кожу (например, меланома) и поджелудочную железу, а также виды аденокарциномы, которые включают злокачественные новообразования, такие как виды рака толстой кишки, рак прямой кишки, почечно-клеточная карцинома, рак печени, немелкоклеточный рак легкого, рак тонкой кишки и рак пищевода. Рак может быть на ранней, промежуточной, поздней стадии или представлять собой метастатический рак.For example, the term "cancer" includes, without limitation, a solid tumor, hemoblastosis (e.g., leukemia, lymphoma, myeloma, e.g. multiple myeloma) and metastatic disease. In one embodiment, the cancer is a solid tumor. Examples of solid tumors include malignancies such as types of sarcoma and carcinoma, for example types of adenocarcinoma of various organ systems, such as those affecting the lung, breast, ovary, lymphoid tissue, gastrointestinal tract (for example, colon), anal canal, genitals, and genitourinary tract (eg. cells of the kidney, urothelium, bladder, prostate), pharynx, CNS (for example, brain, nerve or glial cells), head and neck, skin (for example, melanoma) and pancreas, as well as types of adenocarcinoma, which include malignant neoplasms such as colon cancer, rectal cancer, renal cell carcinoma, liver cancer, non-small cell lung cancer, small intestine cancer, and cancer of the esophagus. The cancer may be early, intermediate, advanced, or metastatic.
В одном варианте осуществления рак выбран из рака легкого (например, немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) (например, NSCLC с плоскоклеточной и/или неплоскоклеточной гистологией или аденокарциномы NSCLC)), меланомы (например, меланомы на поздней стадии), рака почки (например, почечно-клеточной карциномы), рака печени, миеломы (например, множественной миеломы), рака предстательной железы, рака молочной железы (например, рака молочной железы, при котором не экспрессируются один, два или все из рецептора эстрогена, рецептора прогестерона или Her2/neu, например трижды негативного рака молочной железы), колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи (например, плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC), рака анального канала, рака желудка и пищевода, рака щитовидной железы, рака шейки матки, лимфопролиферативного заболевания (например, посттрансплантационного лимфопролиферативного заболевания) или гемобластоза, T-клеточной лимфомы, B-клеточной лимфомы, неходжкинской лимфомы или лейкоза (например, миелоидного лейкоза или лимфоидного лейкоза).In one embodiment, the cancer is selected from lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer (NSCLC) (for example, NSCLC with squamous and/or non-squamous histology or NSCLC adenocarcinomas)), melanomas (eg, melanoma at an advanced stage), kidney cancer (for example, renal cell carcinoma), liver cancer, myeloma (for example, multiple myeloma), prostate cancer, breast cancer (eg. breast cancer in which one, two, or all of the estrogen receptor, progesterone receptor, or Her2/neu are not expressed, e.g. triple-negative breast cancer), colorectal cancer, pancreatic cancer, head and neck cancer (eg, head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), anal cancer, gastric and esophageal cancer, thyroid cancer, cervical cancer, lymphoproliferative disease (eg, post-transplant lymphoproliferative disease) or hemoblastosis, T-cell lymphoma, B-cell lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, or leukemia (eg, myeloid leukemia or lymphoid leukemia).
В другом варианте осуществления рак может представлять собой, например, рак, описанный в данном документе, такой как рак легкого (плоскоклеточный), рак легкого (аденокарцинома), рак головы и шеи, рак шейки матки (плоскоклеточный), рак желудка, рак щитовидной железы, меланому, рак носоглотки (например, дифференцированная или недифференцированная метастатическая или местно-рецидивирующая носоглоточная карцинома) или рак молочной железы.In another embodiment, the cancer may be, for example, cancer described herein such as lung cancer (squamous cell), lung cancer (adenocarcinoma), head and neck cancer, cervical cancer (squamous cell), gastric cancer, thyroid cancer, melanoma, nasopharyngeal cancer (e.g., differentiated or undifferentiated metastatic or locally recurrent nasopharyngeal carcinoma) or breast cancer.
В другом варианте осуществления рак выбран из карциномы (например, карциномы на поздней стадии или метастатической карциномы), меланомы или карциномы легкого, например немелкоклеточной карциномы легкого.In another embodiment, the cancer is selected from a carcinoma (e.g., advanced-stage carcinomas or metastatic carcinomas), melanomas, or carcinomas of the lung, such as non-small cell lung carcinoma.
В одном варианте осуществления рак представляет собой рак легкого, например немелкоклеточный рак легкого или мелкоклеточный рак легкого.In one embodiment, the cancer is lung cancer, e.g. non-small cell lung cancer or small cell lung cancer.
Применяемый в данном документе термин рак легкого (также известный как карцинома легкого или легочная карцинома) используют для обозначения злокачественных опухолей легкого, характеризующихся неконтролируемым ростом клеток в тканях легкого.As used herein, the term lung cancer (also known as lung carcinoma or pulmonary carcinoma) is used to refer to malignant tumors of the lung characterized by uncontrolled growth of cells in lung tissue.
Применяемый в данном документе термин немелкоклеточная карцинома легкого (NSCLC) используют для обозначения любого типа рака легкого, отличного от мелкоклеточной карциномы легкого (SCLC).As used herein, the term non-small cell lung carcinoma (NSCLC) is used to refer to any type of lung cancer other than small cell lung carcinoma (SCLC).
Применяемый в данном документе термин иммунотерапевтическое лечение относится к широкому классу видов терапии, предназначенных для стимулирования иммуно-опосредованного уничтожения опухолевых клеток. В указанных видах терапии применяют иммунотерапевтические средства.As used herein, the term immunotherapeutic treatment refers to a broad class of therapies designed to promote immune-mediated killing of tumor cells. In these types of therapy, immunotherapeutic agents are used.
Применяемый в данном документе термин иммунотерапевтические средства относится к соединениям, пригодным для осуществления иммунотерапевтического лечения рака, как например средство, выбранное из группы, состоящей из антител к CTLA4, таких как ипилимумаб и тремелимумаб, антител к PD-1, таких как MDX-1106, MK3475, CT-011, AMP-224 или молекула антитела к PD-1, описанная в WO 2015/112900; и антител к PD-L1, таких как MEDI4736, MDX-1105 или антитело к PD-L1, описанное в US 2016/0108123.As used herein, the term immunotherapeutic agents refers to compounds useful in the immunotherapeutic treatment of cancer, such as an agent selected from the group consisting of anti-CTLA4 antibodies such as ipilimumab and tremelimumab, anti-PD-1 antibodies such as MDX-1106, MK3475, CT-011, AMP-224, or an anti-PD-1 antibody molecule as described in WO 2015/112900; and anti-PD-L1 antibodies such as MEDI4736, MDX-1105 or the anti-PD-L1 antibody described in US 2016/0108123.
Используемый в данном документе термин "белок 1 программируемой смерти клеток" или "PD-1" охватывает изоформы PD-1 млекопитающих, например PD-1 человека, видовые гомологи PD-1 человека и аналоги, содержащие по меньшей мере один общий с PD-1 эпитоп. Аминокислотная последовательность PD-1, например PD-1 человека, известна из уровня техники, например Shinohara T et al., (1994) Genomics 23(3):704-6; Finger LR, et al., Gene (1997) 197(1-2):177-87.As used herein, the term "programmed cell death protein 1" or "PD-1" encompasses mammalian isoforms of PD-1, e.g., human PD-1, species homologues of human PD-1, and analogs containing at least one common with PD-1 epitope. The amino acid sequence of PD-1, eg human PD-1, is known in the art, eg Shinohara T et al ., (1994) Genomics 23(3):704-6; Finger LR, et al., Gene (1997) 197(1-2):177-87.
Применяемый в данном документе термин "лиганд 1 программируемой смерти клеток" или "PD-L1" охватывает изоформы PD-L1 млекопитающих, например PD-1 человека, видовые гомологи PD-L1 человека и аналоги, содержащие по меньшей мере один общий с PD-1 эпитоп. Аминокислотная последовательность PD-L1, например PD-1 человека, известна из уровня техники, например Dong et al., (1999) Nat Med. 5(12):1365-9; Freeman et al., (2000) J Exp Med. 192(7):1027-34).As used herein, the term "programmed cell death ligand 1" or "PD-L1" encompasses mammalian isoforms of PD-L1, e.g. Human PD-1, human PD-L1 species homologues, and analogs containing at least one epitope in common with PD-1. Amino acid sequence of PD-L1, for example Human PD-1, known in the art, for example Donget al., (1999)Nat Med. 5(12):1365-9; Freemanet al., (2000)J Exp Med.192(7):1027-34).
Под "находящийся в выделенном виде" авторы настоящего изобретения подразумевают, что соединение не содержит каких-либо компонентов, которые бы, как правило, сопутствовали ему при его образовании в процессе метаболизма in vivo. Например, оно не содержит какого-либо биологического материала, такого как компоненты сыворотки крови, а также других метаболитов 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина, образующихся in vivo. Соответствующим образом, соединение находится в очищенном и выделенном виде. Под "очищенный" авторы настоящего изобретения подразумевают, что соединение является в подходящем случае более чем на 75% чистым, в более подходящем случае более чем на 90% чистым, и предпочтительно более чем на 95% чистым, и наиболее предпочтительно более чем на 98% чистым.By "isolated" is meant by the present inventors that the compound does not contain any of the components that would normally accompany it when it is formed during in vivo metabolism. For example, it does not contain any biological material, such as blood serum components, as well as other metabolites of 5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine formed in vivo . Suitably, the compound is in a purified and isolated form. By "purified" we mean that the compound is suitably greater than 75% pure, more suitably greater than 90% pure, and preferably greater than 95% pure, and most preferably greater than 98% pure. clean.
Применяемый в данном документе термин "комбинация" относится либо к фиксированной комбинации в одной единичной дозированной форме, либо к комбинированному применению, где соединение формулы I и партнер по комбинации (т.е. иммунотерапевтическое средство) могут быть введены независимо в одно и то же время или по отдельности через промежутки времени, в частности когда данные промежутки времени дают возможность партнерам по комбинации демонстрировать кооперативный, например синергетический, эффект. Отдельные компоненты могут быть упакованы в набор или находиться по отдельности. Один или оба компонента (например, порошки или жидкости) могут быть восстановлены или разбавлены до требуемой дозы перед введением.As used herein, the term "combination" refers to either a fixed combination in a single unit dosage form, or combination use, where the compound of formula I and the combination partner (i.e., the immunotherapeutic agent) can be administered independently at the same time. or separately at intervals, in particular when these intervals allow the combination partners to demonstrate a cooperative, eg synergistic, effect. The individual components may be packaged in a kit or placed separately. One or both components (eg, powders or liquids) may be reconstituted or diluted to the desired dose prior to administration.
Термины "совместное введение" или "комбинированное введение" или им подобные, используемые в данном документе, понимаются как охватывающие введение выбранного партнера по комбинации одному субъекту, нуждающемуся в этом (например, пациенту), и предполагают включение схем лечения, в которых средства необязательно вводят тем же путем введения или в то же время.The terms "co-administration" or "combination administration" or the like, as used herein, are understood to encompass the administration of a selected combination partner to a single subject in need (e.g., a patient) and is intended to include treatment regimens in which the agents are optionally administered by the same route of administration or at the same time.
Используемые в данном документе термины "фармацевтическая комбинация" и "комбинированный продукт" используются взаимозаменяемо и относятся либо к фиксированной комбинации в одной единичной дозированной форме, либо к нефиксированной комбинации или набору из частей для комбинированного введения, где два или более терапевтических средств могут вводиться независимо в одно и то же время или по отдельности в пределах временных интервалов, в частности, когда такие временные интервалы обеспечивают возможность демонстрации кооперативного, например синергетического, эффекта партнеров по комбинации. Термин "фиксированная комбинация" означает, что как соединение формулы I, так и партнер по комбинации (т.е. иммунотерапевтическое средство) вводятся пациенту одновременно в форме единого объекта или дозы. Термин "нефиксированная комбинация" означает, что как соединение формулы I, так и партнер по комбинации (т.е. иммунотерапевтическое средство) вводятся пациенту в виде отдельных объектов либо одновременно, параллельно, либо последовательно без конкретных ограничений по времени, при этом такое введение обеспечивает эффективные терапевтические уровни двух соединений в организме пациента. Последнее также применяется в отношении "коктейльной терапии", например введение трех или более терапевтических средств. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая комбинация представляет собой нефиксированную комбинацию.As used herein, the terms "pharmaceutical combination" and "combination product" are used interchangeably and refer to either a fixed combination in a single unit dosage form, or a non-fixed combination or set of parts for combined administration, where two or more therapeutic agents can be administered independently in at the same time or separately within time intervals, in particular when such time intervals allow the cooperative, eg synergistic, effect of the combination partners to be demonstrated. The term "fixed combination" means that both the compound of formula I and the combination partner (ie, the immunotherapeutic agent) are administered to the patient simultaneously in the form of a single entity or dose. The term "non-fixed combination" means that both the compound of formula I and the combination partner (i.e., the immunotherapeutic agent) are administered to the patient as separate entities, either simultaneously, in parallel, or sequentially without specific time limits, such administration providing effective therapeutic levels of the two compounds in the patient. The latter also applies to "cocktail therapy", for example the administration of three or more therapeutic agents. In a preferred embodiment, the pharmaceutical combination is a non-fixed combination.
Термин "комбинированная терапия" относится к введению двух или более терапевтических средств для лечения рака, описанных в настоящем изобретении. Такое введение охватывает совместное введение этих терапевтических средств по сути одновременно, например, в одной капсуле, имеющей фиксированное соотношение активных ингредиентов. В качестве альтернативы, такое введение охватывает совместное введение в нескольких или в отдельных контейнерах (например, в таблетках, капсулах, порошках и жидкостях) для каждого активного ингредиента. Порошки и/или жидкости могут быть восстановлены или разбавлены до требуемой дозы перед введением. Кроме того, такое введение также охватывает применение каждого типа терапевтического средства последовательным образом, либо приблизительно в одно и то же время, либо в различное время. В любом случае схема лечения будет обеспечивать полезные эффекты комбинации лекарственных средств при лечении состояний или нарушений, описанных в данном документе.The term "combination therapy" refers to the administration of two or more therapeutic agents for the treatment of cancer described in the present invention. Such administration encompasses the co-administration of these therapeutic agents substantially simultaneously, for example in a single capsule having a fixed ratio of active ingredients. Alternatively, such administration encompasses co-administration in multiple or separate containers (eg tablets, capsules, powders and liquids) for each active ingredient. Powders and/or liquids may be reconstituted or diluted to the desired dose prior to administration. In addition, such administration also encompasses the use of each type of therapeutic agent in a sequential manner, either at approximately the same time or at different times. In any event, the treatment regimen will provide the beneficial effects of the combination of drugs in the treatment of the conditions or disorders described herein.
Применяемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к солям, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства соединений по настоящему изобретению и которые не являются нежелательными с биологической или иной точки зрения. Во многих случаях соединения по настоящему изобретению способны к образованию кислотных и/или основных солей вследствие присутствия амино- и/или карбоксильных групп или подобных им групп. Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты могут быть образованы с использованием неорганических кислот и органических кислот, например ацетатные, аспартатные, бензоатные, безилатные, бикарбонатные/карбонатные, бисульфатные/сульфатные, боратные, камфорсульфонатные, цитратные, эдисилатные, эсилатные, формиатные, фумаратные, глюцептатные, глюконатные, глюкуронатные, гексафторфосфатные, гибензатные, гидрохлоридные/хлоридные, гидробромидные/бромидные, гидройодидные/йодидные, изетионатные, лактатные, малатные, малеатные, малонатные, мезилатные, метилсульфатные, нафтилатные, 2-напсилатные, никотинатные, нитратные, оротатные, оксалатные, пальмитатные, памоатные, фосфатные/гидрофосфатные/дигидрофосфатные, сахаратные, стеаратные, сукцинатные, тартратные, тозилатные и трифторацетатные соли. Неорганические кислоты, из которых могут быть получены соли, включают, например, хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту и фосфорную кислоту. Органические кислоты, из которых могут быть получены соли, включают, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, пировиноградную кислоту, щавелевую кислоту, малеиновую кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, п-толуолсульфоновую кислоту и салициловую кислоту. Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания могут быть образованы с помощью неорганических и органических оснований. Неорганические основания, из которых могут быть получены соли, включают, например, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция, магния, железа, цинка, меди, марганца и алюминия; в частности, предпочтительными являются соли аммония, калия, натрия, кальция и магния. Органические основания, из которых могут быть получены соли, включают, например, первичные, вторичные и третичные амины, замещенные амины, в том числе встречающиеся в природе замещенные амины, циклические амины и основные ионообменные смолы, в частности, такие как изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипропиламин и этаноламин. Фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению можно синтезировать из исходного соединения, основного или кислотного фрагмента, с помощью традиционных химических способов. Как правило, такие соли можно получать путем проведения реакции форм свободной кислоты таких соединений со стехиометрическим количеством подходящего основания (такого как гидроксид, карбонат, бикарбонат Na, Ca, Mg или K или подобных), или путем проведения реакции форм свободного основания таких соединений со стехиометрическим количеством подходящей кислоты. Такие реакции, как правило, проводят в воде, или в органическом растворителе, или в их смеси. Как правило, желательным является применение неводных сред, таких как эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил, где это применимо. Перечни дополнительных подходящих солей можно найти, например, в "Remington's Pharmaceutical Sciences", 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985); и в "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, Вайнхайм, Германия, 2002).Used in this document, the term "pharmaceutically acceptable salts" refers to salts that retain the biological effectiveness and properties of the compounds of the present invention and which are not undesirable from a biological or other point of view. In many cases, the compounds of the present invention are capable of forming acidic and/or basic salts due to the presence of amino and/or carboxyl groups or the like. Pharmaceutically acceptable acid addition salts can be formed using inorganic acids and organic acids, e.g. , glucuronate, hexafluorophosphate, hibenzate, hydrochloride/chloride, hydrobromide/bromide, hydroiodide/iodide, isethionate, lactate, malate, maleate, malonate, mesylate, methyl sulfate, naphthylate, 2-napsilate, nicotinate, nitrate, orotate, oxalate, pamoate , phosphate/hydrophosphate/dihydrophosphate, sugar, stearate, succinate, tartrate, tosylate and trifluoroacetate salts. Inorganic acids from which salts can be derived include, for example, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid. Organic acids from which salts can be derived include, for example, acetic acid, propionic acid, glycolic acid, pyruvic acid, oxalic acid, maleic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p -toluenesulfonic acid and salicylic acid. Pharmaceutically acceptable base addition salts can be formed with inorganic and organic bases. Inorganic bases from which salts can be derived include, for example, sodium, potassium, lithium, ammonium, calcium, magnesium, iron, zinc, copper, manganese and aluminum salts; in particular, the ammonium, potassium, sodium, calcium and magnesium salts are preferred. Organic bases from which salts may be derived include, for example, primary, secondary, and tertiary amines, substituted amines, including naturally occurring substituted amines, cyclic amines, and basic ion exchange resins such as, for example, isopropylamine, trimethylamine, diethylamine. , triethylamine, tripropylamine and ethanolamine. The pharmaceutically acceptable salts of the present invention can be synthesized from the parent compound, basic or acid moiety, using conventional chemical methods. Generally, such salts can be prepared by reacting the free acid forms of such compounds with a stoichiometric amount of a suitable base (such as Na, Ca, Mg or K hydroxide, carbonate, bicarbonate or the like), or by reacting the free base forms of such compounds with a stoichiometric appropriate acid. Such reactions are generally carried out in water, or in an organic solvent, or in a mixture thereof. Generally, it is desirable to use non-aqueous media such as ether, ethyl acetate, ethanol, isopropanol, or acetonitrile, where applicable. Lists of additional suitable salts can be found, for example, in "Remington's Pharmaceutical Sciences" , 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985); and in "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002).
Настоящее изобретение включает все фармацевтически приемлемые изотопно-меченые соединения по настоящему изобретению, т.е. соединения согласно вариантам осуществления с первого по семидесятый, где (1) один или несколько атомов заменены на атомы, характеризующиеся одинаковым атомным числом, но отличающимися атомной массой или массовым числом от атомной массы или массового числа, которые обычно встречаются в природе, и/или (2) изотопное соотношение одного или нескольких атомов отличается от встречающегося в природе соотношения.The present invention includes all pharmaceutically acceptable isotopically labeled compounds of the present invention, i. compounds according to the first through seventieth embodiments, wherein (1) one or more atoms are replaced by atoms having the same atomic number but different atomic mass or mass number from the atomic mass or mass number normally found in nature, and/or ( 2) the isotope ratio of one or more atoms differs from the naturally occurring ratio.
Примеры изотопов, подходящих для включения в соединения по настоящему изобретению, включают изотопы водорода, такие как 2H и 3H, углерода, такие как 11C, 13C и 14C, хлора, такой как 36Cl, фтора, такой как 18F, йода, такие как 123I и 125I, азота, такие как 13N и 15N, кислорода, такие как 15O, 17O и 18O, фосфора, такой как 32P, и серы, такой как 35S.Examples of isotopes suitable for inclusion in the compounds of the present invention include isotopes of hydrogen such as 2 H and 3 H, carbon such as 11 C, 13 C and 14 C, chlorine such as 36 Cl, fluorine such as 18 F , iodine such as 123 I and 125 I, nitrogen such as 13 N and 15 N, oxygen such as 15 O, 17 O and 18 O, phosphorus such as 32 P, and sulfur such as 35 S.
Некоторый изотопно-меченые соединения согласно вариантам осуществления с первого по семидесятый, например соединения, содержащие радиоактивный изотоп, пригодны в исследованиях распределения лекарственного средства и/или субстрата в тканях. Радиоактивные изотопы тритий, т.е. 3H, и углерод-14, т.е. 14C, являются особенно пригодными для данной цели ввиду простоты их включения и доступности средств обнаружения.Certain isotopically labeled compounds of embodiments one through seventy, such as those containing a radioactive isotope, are useful in drug and/or substrate tissue distribution studies. Radioactive isotopes of tritium, i.e. 3H, and carbon-14, i.e. 14C are particularly suitable for this purpose due to their ease of incorporation and the availability of detection tools.
Замещение более тяжелыми изотопами, как например дейтерием, т.е. 2H, может обеспечивать определенные терапевтические преимущества, что обусловлено более высокой устойчивостью к инактивации в процессе метаболизма, например увеличение периода полувыведения in vivo или снижение требований в отношении дозировки, и, следовательно, может быть предпочтительным в некоторых случаях. В некоторых соединениях согласно вариантам осуществления с первого по семидесятый остатки R9 или кольцо, образованное комбинацией R8 и R9, могут содержать один или несколько атомов дейтерия для улучшения устойчивости к инактивации в процессе метаболизма соединения in vivo.Substitution by heavier isotopes, such as deuterium, i.e. 2H, may provide certain therapeutic benefits due to greater resistance to metabolic inactivation, such as increased half-lifein vivo or lower dosage requirements, and therefore may be preferred in some cases. In some compounds according to embodiments, the first to seventieth residues of R9 or a ring formed by the combination R8 and R9, may contain one or more deuterium atoms to improve resistance to inactivation during compound metabolismin vivo.
Замещение позитронно-активными изотопами, такими как 11C, 18F, 15O и 13N, может быть пригодно в исследованиях с использованием позитронно-эмиссионной томографии (PET) для оценки степени занятости рецепторов субстратом.Substitution with positron active isotopes such as 11 C, 18 F, 15 O and 13 N may be useful in studies using positron emission tomography (PET) to assess the degree of substrate receptor occupancy.
Изотопно-меченые соединения согласно вариантам осуществления с первого по семидесятый, как правило, можно получать с помощью традиционных методик, известных специалистам в данной области техники, или посредством способов, аналогичных описанным в сопутствующих примерах и способах получения, с использованием подходящего изотопно-меченого реагента вместо немеченого реагента, используемого ранее.The isotopically labeled compounds of embodiments one through seventy can generally be prepared using conventional techniques known to those skilled in the art, or by methods similar to those described in the accompanying examples and preparation methods, using an appropriate isotopically labeled reagent instead of unlabeled reagent used previously.
Фармацевтически приемлемые сольваты в соответствии с настоящим изобретением включают таковые, где растворитель для кристаллизации может быть замещен изотопом, например, D2O, d6-ацетон, d6-DMSO.Pharmaceutically acceptable solvates in accordance with the present invention include those wherein the crystallization solvent may be replaced by an isotope, for example, D2O, d6-acetone, d6-DMSO.
Применяемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные средства, противогрибковые средства), средства для обеспечения изотоничности, замедляющие абсорбцию средства, соли, консерванты, лекарственные средства, стабилизаторы лекарственных средств, связующие средства, вспомогательные вещества, разрыхляющие средства, смазывающие вещества, подслащивающие средства, ароматизирующие средства, красители и подобные материалы и их комбинации, которые будут известны специалисту обычной квалификации в данной области техники (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). За исключением случаев, когда любой традиционный носитель является несовместимым с активным ингредиентом, предполагается его применение в терапевтических или фармацевтических композициях.As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" includes any and all solvents, dispersion media, coatings, surfactants, antioxidants, preservatives (e.g., antibacterials, antifungals), isotonicity agents, absorption delaying agents, salts, preservatives, drugs, drug stabilizers, binders, excipients, disintegrants, lubricants, sweeteners, flavoring agents, coloring agents, and the like, and combinations thereof, as will be known to one of ordinary skill in the art (see, e.g., , Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329). Except where any conventional carrier is incompatible with the active ingredient, it is intended to be used in therapeutic or pharmaceutical compositions.
Термин "терапевтически эффективное количество" соединения по настоящему изобретению относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ у субъекта, например снижение или подавление активности фермента или белка, или уменьшать тяжесть симптомов, облегчать состояния, замедлять или сдерживать прогрессирование заболевания, или предупреждать развитие заболевания и т.д. В одном неограничивающем варианте осуществления термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству соединения по настоящему изобретению, которое при введении субъекту является эффективным в отношении (1) по меньшей мере частичного облегчения, подавления, предупреждения и/или снижения тяжести состояния, или нарушения, или заболевания, (i) опосредованного его аденозиновым рецептором A2a, или (ii) ассоциированного с аденозином или активностью аденозинового рецептора A2a, или (iii) характеризующегося аномальной активностью аденозинового рецептора A2a; или (2) снижения или подавления активности его аденозинового рецептора A2a. В другом неограничивающем варианте осуществления термин "терапевтически эффективное количество" означает количество соединения формулы I, которое при введении в клетку, или в ткань, или в неклеточный биологический материал, или в среду является эффективным в отношении по меньшей мере частичного снижения или подавления активности рецептора A2a; или по меньшей мере частичного снижения или подавления экспрессии рецептора A2a.The term "therapeutically effective amount" of a compound of the present invention refers to an amount of a compound of the present invention that will elicit a biological or medical response in a subject, such as reducing or inhibiting enzyme or protein activity, or lessening the severity of symptoms, alleviating conditions, slowing or controlling the progression of a disease. , or prevent the development of a disease, etc. In one non-limiting embodiment, the term "therapeutically effective amount" refers to an amount of a compound of the present invention that, when administered to a subject, is effective in (1) at least partially alleviating, suppressing, preventing and/or reducing the severity of a condition or disorder, or a disease (i) mediated by its adenosine A2a receptor, or (ii) associated with adenosine or adenosine A2a receptor activity, or (iii) characterized by abnormal adenosine A2a receptor activity; or (2) reducing or suppressing the activity of its A2a adenosine receptor. In another non-limiting embodiment, the term "therapeutically effective amount" means an amount of a compound of Formula I that, when administered to a cell, or tissue, or non-cellular biological material, or environment, is effective to at least partially reduce or suppress A receptor activity. 2a ; or at least partial reduction or suppression of A 2 a receptor expression.
Используемый в данном документе термин "субъект" относится к животному. Предпочтительно, животное является млекопитающим. Субъект также относится, например, к приматам (например, людям), коровам, овцам, козам, лошадям, собакам, кошкам, кроликам, крысам, мышам, рыбам, птицам и т.п. В предпочтительном варианте осуществления субъектом является человек.As used herein, the term "subject" refers to an animal. Preferably, the animal is a mammal. The subject also refers to, for example, primates (eg, humans), cows, sheep, goats, horses, dogs, cats, rabbits, rats, mice, fish, birds, and the like. In a preferred embodiment, the subject is a human.
Используемые в данном документе термины "ингибирование" или "ингибирующий" относятся к снижению или ослаблению данного состояния, симптома, или нарушения, или заболевания или значительному снижению исходной активности в отношении биологической активности или процесса.As used herein, the terms "inhibiting" or "inhibiting" refer to the reduction or amelioration of a given condition, symptom, or disorder, or disease, or a significant reduction in the underlying activity in relation to a biological activity or process.
Используемый в данном документе термин "осуществление лечение" или "лечение" любого заболевания или нарушения относится в одном варианте осуществления к снижению тяжести заболевания или нарушения (т.е. замедлению, или остановке, или снижению развития заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В другом варианте осуществления "осуществление лечения" или "лечение" относятся к облегчению или снижению тяжести по меньшей мере одного физического параметра, в том числе таких, которые могут быть неявными для пациента. В еще одном варианте осуществления "осуществление лечения" или "лечение" означают модулирование заболевания или нарушения либо физически (например, стабилизацию явного симптома), либо физиологически (например, стабилизацию физического параметра), либо включая и то, и другое. В еще одном варианте осуществления "осуществление лечения" или "лечение" относится к предупреждению или задержке возникновения, или развития, или прогрессирования заболевания или нарушения.As used herein, the term "treating" or "treating" any disease or disorder refers, in one embodiment, to reducing the severity of the disease or disorder (i.e., slowing or stopping or reducing the progress of the disease or at least one of its clinical symptoms). In another embodiment, "treatment" or "treatment" refers to alleviating or reducing the severity of at least one physical parameter, including those that may not be apparent to the patient. In yet another embodiment, "administering treatment" or "treatment" means modulating a disease or disorder, either physically (eg, stabilizing an overt symptom) or physiologically (eg, stabilizing a physical parameter) or both. In another embodiment, "treatment" or "treatment" refers to preventing or delaying the onset or development or progression of a disease or disorder.
Используемые в данном документе термины в форме единственного числа и подобные термины, применяемые в контексте настоящего изобретения (в частности, в контексте формулы изобретения), следует истолковывать как охватывающие как формы единственного числа, так и формы множественного числа, если в данном документе не указано иное или нет явного противоречия по контексту.As used herein, terms in the singular form and similar terms used in the context of the present invention (in particular, in the context of the claims) should be construed as covering both the singular and plural forms, unless otherwise indicated in this document. or there is no apparent contradiction in context.
Все способы, описанные в данном документе, можно осуществлять в любом подходящем порядке, если в данном документе не указано иное или нет иного явного противоречия по контексту. Использование всех возможных примеров или иллюстративного стиля изложения (например, "такой как"), предоставленных в данном документе, предназначено только для лучшего освещения настоящего изобретения и не предполагает ограничения объема настоящего изобретения, заявленного иным образом.All of the methods described herein may be performed in any suitable order unless otherwise indicated herein or otherwise expressly conflicted by context. Use of all possible examples or illustrative style of presentation (for example, "such as") provided herein is only intended to better illuminate the present invention and is not intended to limit the scope of the present invention as otherwise claimed.
Соединение по настоящему изобретению получают либо в свободной форме, в виде его соли, либо в виде его пролекарственных производных.The compound of the present invention is obtained either in free form, as its salt, or as its prodrug derivatives.
В настоящем изобретении также предусмотрены пролекарства на основе соединений по настоящему изобретению, которые превращаются in vivo в соединения по настоящему изобретению. Пролекарство представляет собой активное или неактивное соединение, которое химически модифицировано посредством физиологического действия in vivo, такого как гидролиз, метаболизм и т.п., в соединение по настоящему изобретению после введения пролекарства субъекту. Пригодность и методики, используемые для изготовления и применения пролекарств, хорошо известны специалистам в данной области техники. Пролекарства можно по существу разделить на две неисключительные категории: пролекарства-биопредшественники и пролекарства-носители. См. The Practice of Medicinal Chemistry, Ch. 31-32 (Ed. Wermuth, Academic Press, San Diego, Calif., 2001). Как правило, пролекарства-биопредшественники представляют собой соединения, которые являются неактивными или обладают низкой активностью по сравнению с соответствующим активным лекарственным соединением, которые содержат одну или несколько защитных групп и превращаются в активную форму посредством метаболизма или сольволиза. Как форма активного лекарственного средства, так и любые высвобожденные продукты метаболизма должны обладать приемлемо низкой токсичностью.The present invention also provides prodrugs based on the compounds of the present invention, which are converted in vivo to the compounds of the present invention. A prodrug is an active or inactive compound that is chemically modified by in vivo physiological action such as hydrolysis, metabolism, and the like, into a compound of the present invention after administration of the prodrug to a subject. The suitability and techniques used for the manufacture and use of prodrugs are well known to those skilled in the art. Prodrugs can be broadly divided into two non-exclusive categories: bioprecursor prodrugs and carrier prodrugs. See The Practice of Medicinal Chemistry , Ch. 31-32 (Ed. Wermuth, Academic Press, San Diego, Calif., 2001). Typically, bioprecursor prodrugs are compounds that are inactive or have low potency compared to the corresponding active drug compound, that contain one or more protecting groups and are converted to the active form by metabolism or solvolysis. Both the active drug form and any metabolites released should have acceptably low toxicity.
Пролекарства-носители представляют собой лекарственные соединения, которые содержат транспортный фрагмент, например, который улучшает поглощение и/или локализированную доставку к месту(местам) действия. Желательно, чтобы для такого пролекарства-носителя связь между фрагментом лекарственного средства и транспортным фрагментом представляла собой ковалентную связь, пролекарство являлось неактивным или менее активным, чем лекарственное соединение, и любой высвобожденный транспортный фрагмент являлся приемлемо нетоксичным. Для пролекарств, где транспортный фрагмент предназначен для увеличения поглощения, как правило, высвобождение транспортного фрагмента должно быть быстрым. В других случаях желательно использовать фрагмент, который обеспечивает медленное высвобождение, например определенные полимеры или другие фрагменты, такие как циклодекстрины. Пролекарства-носители, например, можно применять для улучшения одного или нескольких из следующих свойств: увеличенная липофильность, увеличенная продолжительность фармакологических эффектов, увеличенная сайт-специфичность, сниженные токсичность и нежелательные реакции и/или улучшение состава на основе лекарственного средства (например, устойчивость, растворимость в воде, подавление нежелательного органолептического или физико-химического свойства). Например, липофильность может быть увеличена путем эстерификации (a) гидроксильных групп липофильными карбоновыми кислотами (например, карбоновой кислотой, содержащей по меньшей мере один липофильный фрагмент).Carrier prodrugs are drug compounds that contain a transport moiety, for example, that enhances absorption and/or localized delivery to the site(s) of action. Desirably, for such a carrier prodrug, the bond between the drug moiety and the transport moiety is a covalent bond, the prodrug is inactive or less active than the drug, and any transport moiety released is acceptably non-toxic. For prodrugs where the transport moiety is designed to increase uptake, typically the release of the transport moiety should be rapid. In other cases, it is desirable to use a moiety that provides a slow release, such as certain polymers or other moieties such as cyclodextrins. Carrier prodrugs, for example, can be used to improve one or more of the following properties: increased lipophilicity, increased duration of pharmacological effects, increased site specificity, reduced toxicity and adverse reactions, and/or improved drug formulation (e.g., stability, solubility in water, suppression of an undesirable organoleptic or physico-chemical property). For example, lipophilicity can be increased by esterification of (a) hydroxyl groups with lipophilic carboxylic acids (eg, a carboxylic acid containing at least one lipophilic moiety).
Иллюстративные пролекарства представляют собой, например, O-ацилпроизводные спиртов или арилспиртов. Предпочтительными являются фармацевтически приемлемые сложноэфирные производные, подвергающиеся превращению путем сольволиза при физиологических условиях. Кроме того, было осуществлено маскирование аминов в виде арилкарбонилоксиметилзамещенных производных, которые расщепляются эстеразами in vivo с высвобождением свободного лекарственного средства и формальдегида (Bundgaard, J. Med. Chem. 2503 (1989)). Более того, было осуществлено маскирование лекарственных средств, содержащих кислотную NH-группу, как например имидазол, имид, индол и т.п., с помощью N-ацилоксиметильных групп (Bundgaard, Design of Prodrugs, Elsevier (1985)). Было осуществлено маскирование гидроксигрупп в виде сложных эфиров и эфиров. В EP 039051 (Sloan и Little) раскрыты пролекарства на основе основания Манниха гидроксамовой кислоты, их получение и применение.Illustrative prodrugs are, for example, O -acyl derivatives of alcohols or aryl alcohols. Preferred are pharmaceutically acceptable ester derivatives that are converted by solvolysis under physiological conditions. In addition, masking of amines as arylcarbonyloxymethyl-substituted derivatives has been carried out, which are cleaved by esterases in vivo to release the free drug and formaldehyde (Bundgaard, J. Med. Chem . 2503 (1989)). Furthermore, drugs containing an acidic NH group, such as imidazole, imide, indole, etc., have been masked with N-acyloxymethyl groups (Bundgaard, Design of Prodrugs , Elsevier (1985)). Masking of hydroxy groups was carried out in the form of esters and esters. EP 039051 (Sloan and Little) discloses Mannich base hydroxamic acid prodrugs, their preparation and use.
Кроме того, соединения по настоящему изобретению, в том числе их соли, также могут быть получены в форме их гидратов или включают другие растворители, применяемые для их кристаллизации.In addition, the compounds of the present invention, including their salts, can also be obtained in the form of their hydrates or include other solvents used for their crystallization.
Фармацевтическая композиция, комбинация, доза и введениеPharmaceutical composition, combination, dosage and administration
В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая соединение по настоящему изобретению и носитель, например фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может быть составлена для конкретных путей введения, таких как пероральное введение, офтальмическое введение (например, местное введение, интравитреальная инъекция, имплантат (в том числе интравитреальный, транссклеральный, субтеноновый и т.п., депо и т.д.) и парентеральное введение и т.д. Кроме того, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены в твердой форме, в том числе капсулах, таблетках, пилюлях, гранулах, порошках или суппозиториях, или в жидкой форме, в том числе растворах, суспензиях или эмульсиях. Фармацевтические композиции можно подвергать традиционным фармацевтическим технологическим операциям, таким как стерилизация, и/или они могут содержать традиционные инертные разбавители, смазывающие средства или буферные средства, а также вспомогательные средства, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие средства, эмульгаторы и буферы и т.д.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a compound of the present invention and a carrier, such as a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutical composition may be formulated for specific routes of administration such as oral administration, ophthalmic administration (eg, topical administration, intravitreal injection, implant (including intravitreal, transscleral, subtenon, etc., depot, etc.) and parenteral administration, etc. In addition, the pharmaceutical compositions of the present invention may be in solid form, including capsules, tablets, pills, granules, powders, or suppositories, or in liquid form, including solutions, suspensions, or emulsions. The pharmaceutical compositions may be subjected to conventional pharmaceutical processing steps such as sterilization and/or may contain conventional inert diluents, lubricants or buffers, as well as adjuvants such as preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers and buffers, etc. d.
Как правило, фармацевтические композиции представляют собой таблетки и желатиновые капсулы, содержащие активный ингредиент вместе сAs a rule, pharmaceutical compositions are tablets and gelatin capsules containing the active ingredient together with
a) разбавителями, например лактозой, декстрозой, сахарозой, маннитом, сорбитом, целлюлозой и/или глицином;a) diluents, for example lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and/or glycine;
b) смазывающими веществами, например диоксидом кремния, тальком, стеариновой кислотой, ее магниевой или кальциевой солью и/или полиэтиленгликолем; в случае таблеток также соb) lubricants, for example silicon dioxide, talc, stearic acid, its magnesium or calcium salt and/or polyethylene glycol; in the case of tablets also with
c) связующими средствами, например алюмосиликатом магния, крахмальной пастой, желатином, трагакантом, метилцеллюлозой, натрий-карбоксиметилцеллюлозой и/или поливинилпирролидоном; при необходимости,c) binders, for example magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and/or polyvinylpyrrolidone; if necessary,
d) разрыхлителями, например видами крахмала, агаром, альгиновой кислотой или ее натриевой солью или шипучими смесями; и/илиd) baking powder, for example starch species, agar, alginic acid or its sodium salt or effervescent mixtures; and/or
e) абсорбентами, красящими веществами, ароматизаторами и подсластителями.e) absorbents, colorants, flavors and sweeteners.
Таблетки могут быть либо покрыты оболочкой, либо покрыты энтеросолюбильным покрытием в соответствии со способами, известными из уровня техники.Tablets may be either coated or enteric coated according to methods known in the art.
Подходящие композиции для перорального введения включают эффективное количество соединения по настоящему изобретению в форме таблеток, пастилок для рассасывания, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсий, твердых или мягких капсул, или сиропов, или настоек. Композиции, предназначенные для перорального применения, получают в соответствии с любым способом, известным из уровня техники, для изготовления фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать одно или несколько средств, выбранных из группы, состоящей из подслащивающих веществ, ароматизирующих средств, красящих средств и консервирующих средств, с целью обеспечения препаратов, которые являются фармацевтически приемлемыми и имеют привлекательный вкус. Таблетки содержат активный ингредиент в смеси с нетоксичными, фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, которые являются подходящими для изготовления таблеток. Такие вспомогательные вещества представляют собой, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и разрыхляющие средства, например кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связующие средства, например крахмал, желатин или аравийская камедь; и смазывающие средства, например стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки являются непокрытыми или покрытыми посредством известных методик для замедления распада и абсорбции в желудочно-кишечном тракте и тем самым обеспечения устойчивого действия в течение более длительного периода. Например, можно применять материал для обеспечения замедленного действия, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат. Составы для перорального применения могут быть представлены в виде твердых желатиновых капсул, где активный ингредиент смешивают с инертным твердым разбавителем, например карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, где активный ингредиент смешивают с водой или масляной средой, например с арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.Suitable compositions for oral administration include an effective amount of a compound of the present invention in the form of tablets, lozenges, aqueous or oily suspensions, dispersible powders or granules, emulsions, hard or soft capsules or syrups or tinctures. Compositions intended for oral administration are prepared according to any method known in the art for the manufacture of pharmaceutical compositions, and such compositions may contain one or more agents selected from the group consisting of sweetening agents, flavoring agents, coloring agents and preservatives. means, with the aim of providing preparations that are pharmaceutically acceptable and have an attractive taste. The tablets contain the active ingredient in admixture with non-toxic, pharmaceutically acceptable excipients which are suitable for the manufacture of tablets. Such excipients are, for example, inert diluents such as calcium carbonate, sodium carbonate, lactose, calcium phosphate or sodium phosphate; granulating and disintegrating agents, for example corn starch or alginic acid; binders, for example starch, gelatin or gum arabic; and lubricants such as magnesium stearate, stearic acid or talc. The tablets are uncoated or coated by known techniques to slow down disintegration and absorption in the gastrointestinal tract and thereby provide sustained action over a longer period. For example, a delayed release material such as glyceryl monostearate or glyceryl distearate may be used. Formulations for oral administration may be presented as hard gelatin capsules wherein the active ingredient is mixed with an inert solid diluent such as calcium carbonate, calcium phosphate or kaolin, or as soft gelatin capsules wherein the active ingredient is mixed with water or an oily vehicle such as peanut oil, liquid paraffin or olive oil.
Некоторые композиции для инъекции представляют собой водные изотонические растворы или суспензии, и суппозитории преимущественно получают из жировых эмульсий или суспензий. Указанные композиции могут быть стерилизованы и/или могут содержать вспомогательные средства, такие как консерванты, стабилизирующие, смачивающие или эмульгирующие средства, ускорители растворения, соли для регуляции осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они также могут содержать другие терапевтически полезные вещества. Указанные композиции получают в соответствии с традиционными способами смешивания, гранулирования или нанесения покрытия соответственно, и они содержат приблизительно 0,1-75% или содержат приблизительно 1-50% активного ингредиента.Some injectable compositions are aqueous isotonic solutions or suspensions, and suppositories are advantageously prepared from fat emulsions or suspensions. Said compositions may be sterilized and/or may contain adjuvants such as preservatives, stabilizing, wetting or emulsifying agents, dissolution accelerators, salts for adjusting osmotic pressure and/or buffers. In addition, they may also contain other therapeutically useful substances. Said compositions are prepared according to conventional mixing, granulating or coating methods, respectively, and contain about 0.1-75% or about 1-50% active ingredient.
Некоторые композиции для инъекции включают составы в форме глазных имплантатов и глазного депо, которые являются подходящими для внутриглазного, окологлазного, субконъюнктивального и/или субтенонового введения. Как правило, композиции для инъекции содержат соединение согласно вариантам осуществления с первого по семидесятый в комбинации с биологически совместимым или биоразлагаемым полимерным материалом. Some injectable compositions include ocular implant and ocular depot formulations that are suitable for intraocular, periocular, subconjunctival, and/or subtenon administration. Typically, injectable compositions comprise a compound of embodiments one through seventy in combination with a biocompatible or biodegradable polymeric material.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы, содержащие соединения по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов, поскольку вода может содействовать разрушению некоторых соединений.The present invention further provides anhydrous pharmaceutical compositions and dosage forms containing the compounds of the present invention as active ingredients, since water may assist in the degradation of some compounds.
Безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы по настоящему изобретению можно получать с применением безводных ингредиентов или ингредиентов с низким содержанием влаги и условий с низким содержанием влаги или низкой влажностью. Безводную фармацевтическую композицию можно получать и хранить таким образом, чтобы сохранялась ее безводная природа. Соответственно, безводные композиции предпочтительно упаковывают с применением материалов, которые, как известно, предотвращают воздействие воды, так чтобы их можно было включать в подходящие рецептурные наборы. Примеры подходящей упаковки включают без ограничения герметично закрытые виды фольги, пластиковые материалы, контейнеры с однократной дозой (например флаконы), блистерные упаковки и контурные безъячейковые упаковки.Anhydrous pharmaceutical compositions and dosage forms of the present invention can be prepared using anhydrous or low moisture ingredients and low moisture or low humidity conditions. The anhydrous pharmaceutical composition may be prepared and stored in a manner that maintains its anhydrous nature. Accordingly, anhydrous compositions are preferably packaged using materials known to prevent exposure to water so that they can be included in suitable formulation kits. Examples of suitable packaging include, but are not limited to, sealed foils, plastic materials, single dose containers (eg, vials), blister packs, and blister packs.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены фармацевтические композиции и лекарственные формы, которые содержат одно или несколько средств, которые снижают скорость, с которой соединение по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента будет распадаться. Такие средства, которые упоминаются в данном документе как "стабилизаторы", включают без ограничения антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, буферы для регулирования pH или солевые буферы и т.д.The present invention further provides pharmaceutical compositions and dosage forms that contain one or more agents that reduce the rate at which the compound of the present invention as an active ingredient will degrade. Such agents, which are referred to herein as "stabilizers", include, without limitation, antioxidants such as ascorbic acid, pH buffers or saline buffers, and the like.
В предпочтительном варианте осуществления 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ол или фармацевтически приемлемая соль для применения в лечении рака предназначены для введения парентеральным или пероральным путем, предпочтительно пероральным путем.In a preferred embodiment, 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol or a pharmaceutically acceptable salt for use in the treatment cancers are intended for administration by the parenteral or oral route, preferably by the oral route.
Фармацевтическая композиция или комбинация по настоящему изобретению может быть представлена в однократной дозировке, составляющей приблизительно 1-1000 мг активного(активных) ингредиента(ингредиентов) для субъекта весом приблизительно 50-70 кг, или приблизительно 1-500 мг, или приблизительно 1-250 мг, или приблизительно 1-150 мг, или приблизительно 0,5-100 мг, или приблизительно 1-50 мг активных ингредиентов. Терапевтически эффективная доза соединения, фармацевтической композиции или их комбинаций зависит от вида субъекта, веса тела, возраста и индивидуального состояния, нарушения или заболевания, лечение которых осуществляют, или их тяжести. Лечащий врач, клиницист или ветеринар обычной квалификации может легко определить эффективное количество каждого из активных ингредиентов, необходимое для предупреждения, лечения или ингибирования прогрессирования нарушения или заболевания.The pharmaceutical composition or combination of the present invention may be presented in a single dosage of about 1-1000 mg of active ingredient(s) for a subject weighing about 50-70 kg, or about 1-500 mg, or about 1-250 mg , or about 1-150 mg, or about 0.5-100 mg, or about 1-50 mg of the active ingredients. A therapeutically effective dose of a compound, pharmaceutical composition, or combinations thereof will depend upon the type of subject, body weight, age, and individual condition, disorder, or disease being treated, or their severity. The attending physician, clinician or veterinarian of ordinary skill can easily determine the effective amount of each of the active ingredients necessary to prevent, treat or inhibit the progression of the disorder or disease.
Вышеупомянутые параметры дозировки являются очевидными в тестах in vitro и in vivo с применением преимущественно млекопитающих, например мышей, крыс, собак, нечеловекообразных обезьян или выделенных органов, тканей и их препаратов. Соединения по настоящему изобретению можно применять in vitro в виде растворов, например, предпочтительно водных растворов, и in vivo либо энтерально, либо парентерально, преимущественно внутривенно, например в виде суспензии или водного раствора. Доза in vitro может находиться в диапазоне молярной концентрации от приблизительно 10-3 моль/л до 10-9 моль/л. Терапевтически эффективное количество in vivo в зависимости от пути введения может находиться в диапазоне приблизительно 0,1-500 мг/кг или приблизительно 1-100 мг/кг.The above dosage parameters are evident in in vitro and in vivo tests using predominantly mammals, eg mice, rats, dogs, non-human apes or isolated organs, tissues and preparations thereof. The compounds of the present invention may be administered in vitro as solutions, eg preferably aqueous solutions, and in vivo either enterally or parenterally, preferably intravenously, eg as a suspension or aqueous solution. The in vitro dose may be in the molar concentration range from about 10 -3 mol/l to 10 -9 mol/l. A therapeutically effective amount in vivo, depending on the route of administration, may be in the range of about 0.1-500 mg/kg or about 1-100 mg/kg.
В других вариантах осуществления предусматривается фармацевтическая композиция, которая содержит по меньшей мере одно соединение в соответствии с вариантами осуществления от первого по семидесятый и по меньшей мере один носитель.In other embodiments, a pharmaceutical composition is provided that contains at least one compound according to embodiments one through seventy and at least one carrier.
Терапевтические наборыTherapy kits
В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусматривается набор, содержащий две или более отдельных фармацевтических композиций, по меньшей мере одна из которых содержит соединение формулы (I). В одном варианте осуществления набор содержит средства для раздельного содержания указанных композиций, такие как контейнер, разделенная бутылка или разделенный пакет из фольги. Примером такого набора является блистерная упаковка, как правило, применяемая для упаковки таблеток, капсул и т.п.In one embodiment, the present invention provides a kit containing two or more separate pharmaceutical compositions, at least one of which contains a compound of formula (I). In one embodiment, the kit contains means for keeping said compositions separate, such as a container, a split bottle, or a split foil pouch. An example of such a kit is a blister pack, typically used for packaging tablets, capsules, and the like.
Набор по настоящему изобретению можно применять для введения различных лекарственных форм, например для перорального и парентерального применения, для введения отдельных композиций с различными интервалами между введениями доз или для титрования отдельных композиций одна относительно другой. В целях содействия соблюдению режима лечения набор по настоящему изобретению, как правило, содержит инструкции по введению.The kit of the present invention can be used to administer different dosage forms, for example for oral and parenteral use, to administer separate compositions at different intervals between doses, or to titrate individual compositions against each other. In order to facilitate adherence to a treatment regimen, the kit of the present invention typically contains instructions for administration.
В видах комбинированной терапии по настоящему изобретению соединение формулы I и другое иммунотерапевтическое средство могут быть изготовлены и/или составлены одними и теми же или различными производителями. Более того, соединение по настоящему изобретению и другое терапевтическое средство можно объединять в комбинированной терапии (i) до того, как комбинированный продукт попадает к лечащим врачам (например, в случае набора, содержащего соединение по настоящему изобретению и другое терапевтическое средство); (ii) самими лечащими врачами (или под наблюдением лечащего врача) незадолго до введения; (iii) в самих пациентах, например, в ходе последовательного введения соединения по настоящему изобретению и другого терапевтического средства.In the combination therapies of the present invention, the compound of formula I and the other immunotherapeutic agent may be manufactured and/or formulated by the same or different manufacturers. Moreover, the compound of the present invention and another therapeutic agent can be combined in combination therapy (i) before the combined product reaches the attending physicians (for example, in the case of a kit containing a compound of the present invention and another therapeutic agent); (ii) by the attending physicians themselves (or under the supervision of the attending physician) shortly before administration; (iii) in the patients themselves, for example, during the sequential administration of a compound of the present invention and another therapeutic agent.
Соответственно, в настоящем изобретении предусматривается применение 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака, где лекарственный препарат получают для осуществления введения с другим иммунотерапевтическим средством. В настоящем изобретении также предусматривается применение иммунотерапевтического средства для лечения рака, где лекарственный препарат вводят с 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-олом или его фармацевтически приемлемой солью.Accordingly, the present invention contemplates the use of 1-(4-amino-5-bromo-6-( 1H- pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl) -1H- pyrazol-4-ol or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the treatment of cancer, wherein the drug is prepared to be administered with another immunotherapeutic agent. The present invention also contemplates the use of an immunotherapeutic agent for the treatment of cancer, wherein the drug is administered with 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H - pyrazol-4-ol or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
В настоящем изобретении также предусматривается 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ол или его фармацевтически приемлемая соль для применения в способе лечения рака, где 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ол получают для осуществления введения с другим иммунотерапевтическим средством. В настоящем изобретении также предусматривается другое иммунотерапевтическое средство для применения в способе лечения рака, где другое иммунотерапевтическое средство получают для осуществления введения с 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-олом. В настоящем изобретении также предусматривается 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ол для применения в способе лечения рака, где 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ол вводится с другим иммунотерапевтическим средством. В настоящем изобретении также предусматривается другое иммунотерапевтическое средство для применения в способе лечения рака, где другое терапевтическое средство вводится с 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-олом.The present invention also provides 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in a cancer treatment method wherein 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol is prepared to be administered with another immunotherapeutic agent. The present invention also provides another immunotherapeutic agent for use in a method of treating cancer, wherein the other immunotherapeutic agent is prepared to be administered with 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2 -yl)-1 H -pyrazol-4-ol. The present invention also provides 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol for use in a method of treating cancer, where 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol is administered with another immunotherapeutic agent. The present invention also provides another immunotherapeutic agent for use in a method of treating cancer, wherein the other therapeutic agent is administered with 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl) -1 H -pyrazole-4-ol.
В настоящем изобретении также предусматривается применение 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола для лечения рака, где пациент ранее (например в течение 24 часов) получал лечение с помощью другого иммунотерапевтического средства. В настоящем изобретении также предусматривается применение другого иммунотерапевтического средства для лечения рака, где пациент ранее (например в течение 24 часов) получал лечение с помощью 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола или его фармацевтически приемлемой соли.The present invention also contemplates the use of 1-(4-amino-5-bromo-6-(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1H-pyrazol-4-ol for the treatment of cancer where the patient has previously (eg within 24 hours) was treated with another immunotherapeutic agent. The present invention also contemplates the use of another immunotherapeutic agent for the treatment of cancer where the patient has previously (e.g. within 24 hours) was treated with 1-(4-amino-5-bromo-6-(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1H-pyrazol-4-ol or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
Комбинированная терапияCombination Therapy
В одном варианте осуществления фармацевтическая комбинация (или комбинированный продукт) содержит соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль или сокристалл и одно или несколько иммунотерапевтических средств, выбранных из группы, состоящей из антител к CTLA4, таких как ипилимумаб и тремелимумаб, антител к PD-1, таких как MDX-1106 (ниволумаб), MK3475 (пембролизумаб), CT-011 (пидилизумаб), AMP-224, AMP-514 (MEDI0680 Medimmune) или молекула антитела к PD-1, описанная в WO 2015/112900 (US 2015/0210769); и антител к PD-L1, таких как MPDL3280A, MEDI4736, MSB0010718C (Merch Sorono), YW243.55.S70, MDX-1105 или молекулы антитела к PD-L1, раскрытого в US 2016/0108123, поданной 13 октября 2015 г. под названием "Молекулы антител к PD-L1 и варианты их применения".In one embodiment, the pharmaceutical combination (or combined product) comprises a compound of formula (I), or a pharmaceutically acceptable salt or co-crystal thereof, and one or more immunotherapeutic agents selected from the group consisting of anti-CTLA4 antibodies such as ipilimumab and tremelimumab, anti-PD antibodies -1 such as MDX-1106 (nivolumab), MK3475 (pembrolizumab), CT-011 (pidilizumab), AMP-224, AMP-514 (MEDI0680 Medimmune) or the anti-PD-1 antibody molecule described in WO 2015/112900 ( US 2015/0210769); and anti-PD-L1 antibodies such as MPDL3280A, MEDI4736, MSB0010718C (Merch Sorono), YW243.55.S70, MDX-1105 or anti-PD-L1 antibody molecules disclosed in US 2016/0108123, filed October 13, 2015 under entitled "Anti-PD-L1 Antibody Molecules and Their Uses".
Компоненты комбинированного продукта находятся в одном и том же составе или в отдельных составах.The components of the combined product are in the same formulation or in separate formulations.
В предпочтительном варианте осуществления комбинированный продукт содержит соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль или сокристалл и одно или несколько иммунотерапевтических средств, пригодных в лечении рака, конкретно в иммунотерапевтическом лечении рака, при этом такое средство выбрано из группы, состоящей из антител к PD-1, таких как MDX-1106, MK3475, CT-011, AMP-224 или молекула антитела к PD-1, описанная в WO 2015/112900 (US 2015/0210769); и антител к PD-L1, таких как MPDL3280A, MEDI4736, MDX-1105 или молекулы антитела к PD-L1, раскрытого в US 2016/0108123.In a preferred embodiment, the combination product comprises a compound of formula (I), or a pharmaceutically acceptable salt or co-crystal thereof, and one or more immunotherapeutic agents useful in the treatment of cancer, specifically in the immunotherapeutic treatment of cancer, which agent is selected from the group consisting of antibodies to PD -1 such as MDX-1106, MK3475, CT-011, AMP-224 or the anti-PD-1 antibody molecule described in WO 2015/112900 (US 2015/0210769); and anti-PD-L1 antibodies such as MPDL3280A, MEDI4736, MDX-1105 or anti-PD-L1 antibody molecules disclosed in US 2016/0108123.
Примеры молекулы антитела к PD-1Examples of an Anti-PD-1 Antibody Molecule
В предпочтительном варианте осуществления комбинированный продукт содержит соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль или сокристалл и молекулу антитела к PD-1, как например антител, описанных в данном документе.In a preferred embodiment, the combination product comprises a compound of formula (I), or a pharmaceutically acceptable salt or co-crystal thereof, and an anti-PD-1 antibody molecule, such as the antibodies described herein.
PD-1 является представителем семейства CD28/CTLA-4, который экспрессируется, например, на активированных Т-клетках CD4+ и CD8+, Treg и В-клетках. Он осуществляет отрицательную регуляцию передачи сигнала в эффекторных Т-клетках и их функционирования. PD-1 индуцируется на Т-клетках, инфильтрирующих опухоль, и может приводить к их функциональному истощению или дисфункции (Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704; Pardoll et al., (2012) Nat Rev Cancer 12(4):252-64). PD-1 подает коингибирующий сигнал при связывании с любым из двух своих лигандов, представляющих собой лиганд 1 программируемой смерти клеток (PD-L1) или лиганд 2 программируемой смерти клеток (PD-L2). PD-L1 экспрессируется на клетках ряда типов, в том числе на Т-клетках, естественных клетках-киллерах (NK), макрофагах, дендритных клетках (DC), В-клетках, эпителиальных клетках, клетках эндотелия сосудов, а также во многих типах опухолей. Высокий уровень экспрессии PD-L1 в опухолях мыши и человека был связан с неблагоприятными клиническими исходами при различных видах рака (Keir et al., (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704; Pardoll et al., (2012) Nat Rev Cancer 12(4):252-64). PD-L2 экспрессируется на дендритных клетках, макрофагах и в некоторых опухолях. Блокировка сигнального пути PD-1 была утверждена в доклинических и клинических исследованиях в качестве иммунотерапии рака. Как доклинические, так и клинические исследования продемонстрировали, что блокировка PD-1 может обеспечивать восстановление активности эффекторных Т-клеток и приводит к устойчивому противоопухолевому ответу. Например, блокировка сигнального пути PD-1 может обеспечивать восстановление функции истощенных/дисфункциональных эффекторных Т-клеток (например, пролиферации, секреции IFN-γ или цитолитической функции) и/или ингибирование функции Treg-клеток (Keir et al., (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704; Pardoll et al., (2012) Nat Rev Cancer 12(4):252-64). Блокада сигнального пути PD-1 может быть осуществлена с помощью антитела, его антигенсвязывающего фрагмента, иммуноадгезина, слитого белка или олигопептида PD-1, PD-L1 и/или PD-L2.PD-1 is a member of the CD28/CTLA-4 family, which is expressed, for example, on activated CD4 + and CD8 + T cells, T reg and B cells. It down-regulates signal transduction in effector T cells and their function. PD-1 is induced on tumor infiltrating T cells and can lead to their functional depletion or dysfunction (Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704; Pardoll et al., (2012) Nat Rev Cancer 12(4):252-64). PD-1 produces a co-inhibitory signal when bound to either of its two ligands, programmed cell death ligand 1 (PD-L1) or programmed cell death ligand 2 (PD-L2). PD-L1 is expressed on a number of cell types, including T cells, natural killer (NK) cells, macrophages, dendritic cells (DC), B cells, epithelial cells, vascular endothelial cells, and many tumor types. . High levels of PD-L1 expression in mouse and human tumors have been associated with poor clinical outcomes in various cancers (Keir et al., (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704; Pardoll et al., (2012) Nat Rev Cancer 12(4):252-64). PD-L2 is expressed on dendritic cells, macrophages, and in some tumors. Blocking the PD-1 signaling pathway has been validated in preclinical and clinical studies as an immunotherapy for cancer. Both preclinical and clinical studies have demonstrated that blocking PD-1 can restore the activity of effector T cells and lead to a sustained antitumor response. For example, blocking the PD-1 signaling pathway may provide restoration of depleted/dysfunctional effector T cell function (e.g., proliferation, IFN-γ secretion, or cytolytic function) and/or inhibition of T reg cell function (Keir et al., (2008) Annu Rev Immunol 26:677-704; Pardoll et al., (2012) Nat Rev Cancer 12(4):252-64). Blockade of the PD-1 signaling pathway can be accomplished with an antibody, an antigen-binding fragment thereof, an immunoadhesin, a fusion protein, or a PD-1, PD-L1 and/or PD-L2 oligopeptide.
В одном варианте осуществления ингибитор PD-1 представляет собой молекулу антитела к PD-1. В одном варианте осуществления ингибитор PD-1 представляет собой молекулу антитела к PD-1, как описано в US 2015/0210769, опубликованном 30 июля 2015 г. под названием "Молекулы антител к PD-1 и варианты их применения", включенном посредством ссылки во всей своей полноте.In one embodiment, the PD-1 inhibitor is an anti-PD-1 antibody molecule. In one embodiment, the PD-1 inhibitor is an anti-PD-1 antibody molecule as described in US 2015/0210769, published July 30, 2015, titled "Anti-PD-1 Antibody Molecules and Uses Therefor", incorporated by reference in in all its fullness.
В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть определяющих комплементарность областей (CDR) (или в совокупности все CDR) из вариабельной области тяжелой и легкой цепи, содержащих аминокислотную последовательность, показанную в таблице A (например, из последовательностей вариабельной области тяжелой и легкой цепи BAP049-Клон-E или BAP049-Клон-B, раскрытых в таблице A), или кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице A. В некоторых вариантах осуществления CDR находятся в соответствии с определением по Kabat (например, как указано в таблице A). В некоторых вариантах осуществления CDR находятся в соответствии с определением по Chothia (например, как указано в таблице A). В некоторых вариантах осуществления CDR находятся в соответствии с комбинированными определениями CDR как по Kabat, так и по Chothia (например, как указано в таблице A). В одном варианте осуществления CDR1 VH согласно комбинации определений CDR по Kabat и Chothia содержит аминокислотную последовательность GYTFTTYWMH (SEQ ID NO: 41). В одном варианте осуществления одна или несколько CDR (или в совокупности все CDR) имеют одно, два, три, четыре, пять, шесть или больше изменений, например, аминокислотных замен (например, консервативных аминокислотных замен) или делеций, по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в таблице A, или кодируемой нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице A.In one embodiment, an anti-PD-1 antibody molecule comprises at least one, two, three, four, five, or six complementarity determining regions (CDRs) (or collectively all CDRs) from the heavy and light chain variable regions containing the amino acid sequence, shown in Table A (e.g., from the BAP049-Clone-E or BAP049-Clone-B heavy and light chain variable region sequences disclosed in Table A), or encoded by the nucleotide sequence shown in Table A. In some embodiments, the CDRs are in according to the definition according to Kabat (for example, as indicated in table A). In some embodiments, the CDRs are as defined by Chothia (eg, as indicated in Table A). In some embodiments, the CDRs are in accordance with the combined definitions of both Kabat and Chothia CDRs (eg, as indicated in Table A). In one embodiment, the VH CDR1 according to the combination of the Kabat and Chothia CDR definitions contains the amino acid sequence GYTFTTYWMH (SEQ ID NO: 41). In one embodiment, one or more CDRs (or collectively all CDRs) have one, two, three, four, five, six, or more changes, such as amino acid substitutions (e.g., conservative amino acid substitutions) or deletions, compared to the amino acid sequence shown in Table A, or encoded by the nucleotide sequence shown in Table A.
В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 1, аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 2 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 3; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 12, каждая из которых раскрыта в таблице A.In one embodiment, an anti-PD-1 antibody molecule comprises a heavy chain variable region (VH) comprising the VHCDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the VHCDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the VHCDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; and a light chain variable region (VL) comprising the VLCDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, the VLCDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and the VLCDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, each of which is disclosed in Table A.
В одном варианте осуществления молекула антитела содержит VH, содержащую VHCDR1, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 24, VHCDR2, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 25, и VHCDR3, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 26; и VL, содержащую VLCDR1, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 29, VLCDR2, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 30, и VLCDR3, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 31, каждая из которых раскрыта в таблице A.In one embodiment, the antibody molecule comprises a VH containing VHCDR1 encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24, VHCDR2 encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25, and VHCDR3 encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26; and VL containing VLCDR1 encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29, VLCDR2 encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30, and VLCDR3 encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31, each of which is disclosed in Table A.
В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, идентичную на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 99% или больше SEQ ID NO: 6. В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20 или аминокислотную последовательность, идентичную на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 99% или больше SEQ ID NO: 20. В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, идентичную на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 99% или больше SEQ ID NO: 16. В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6, и VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20. В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6, и VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.In one embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule comprises a VH containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence at least 85%, 90%, 95%, or 99% or greater identical to SEQ ID NO: 6. In one embodiment, an anti-PD-1 antibody molecule comprises a VL comprising an amino acid sequence under SEQ ID NO: 20 or an amino acid sequence at least 85%, 90%, 95%, or 99% or greater identical to SEQ ID NO: 20. In one embodiment, an anti-PD-1 antibody molecule comprises a VL comprising an amino acid sequence under SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence at least 85%, 90%, 95%, or 99% or greater identical to SEQ ID NO: 16. In one embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In one embodiment, the anti-PD antibody molecule -1 contains a VH containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a VL containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
В одном варианте осуществления молекула антитела содержит VH, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 7 или нуклеотидной последовательностью, идентичной на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 99% или больше SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления молекула антитела содержит VL, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 21 или 17 или нуклеотидной последовательностью, идентичной на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 99% или больше SEQ ID NO: 21 или 17. В одном варианте осуществления молекула антитела содержит VH, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 7, и VL, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 21 или 17.In one embodiment, the antibody molecule contains a VH encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 or by a nucleotide sequence at least 85%, 90%, 95%, or 99% or greater identical to SEQ ID NO: 7. In one embodiment, the antibody molecule contains a VL encoded by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 or 17 or a nucleotide sequence that is at least 85%, 90%, 95%, or 99% or greater identical to SEQ ID NO: 21 or 17. In one embodiment, the antibody molecule contains a VH encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 and a VL encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 or 17.
В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8 или аминокислотную последовательность, идентичную на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 99% или больше SEQ ID NO: 8. В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22 или аминокислотную последовательность, идентичную на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 99% или больше SEQ ID NO: 22. В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или аминокислотную последовательность, идентичную на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 99% или больше SEQ ID NO: 18. В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22. В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18.In one embodiment, an anti-PD-1 antibody molecule comprises a heavy chain comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence at least 85%, 90%, 95% or 99% or greater identical to SEQ ID NO: 8 In one embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule comprises a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or an amino acid sequence at least 85%, 90%, 95%, or 99% or greater identical to SEQ ID NO: 22. In one embodiment, an anti-PD-1 antibody molecule comprises a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or an amino acid sequence at least 85%, 90%, 95%, or 99% or more identical to SEQ ID NO. : 18. In one embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule contains a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. In one In an embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule comprises a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
В одном варианте осуществления молекула антитела содержит тяжелую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 9 или нуклеотидной последовательностью, идентичной на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 99% или больше SEQ ID NO: 9. В одном варианте осуществления молекула антитела содержит легкую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 23 или 19 или нуклеотидной последовательностью, идентичной на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или 99% или больше SEQ ID NO: 23 или 19. В одном варианте осуществления молекула антитела содержит тяжелую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 9, и легкую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 23 или 19.In one embodiment, the antibody molecule comprises a heavy chain encoded by a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 or a nucleotide sequence at least 85%, 90%, 95%, or 99% or greater identical to SEQ ID NO: 9. In one embodiment, implementation, the antibody molecule contains a light chain encoded by a nucleotide sequence under SEQ ID NO: 23 or 19 or a nucleotide sequence identical to at least 85%, 90%, 95% or 99% or more of SEQ ID NO: 23 or 19. In one in an embodiment, the antibody molecule comprises a heavy chain encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 or 19.
Молекулы антител, описанные в данном документе, можно получать с использованием векторов, клеток-хозяев и способов, описанных в US 2015/0210769, включенном посредством ссылки во всей своей полноте.The antibody molecules described herein can be generated using the vectors, host cells, and methods described in US 2015/0210769, incorporated by reference in its entirety.
ОпределенияDefinitions
Области VH и VL можно подразделить на области гипервариабельности, называемые "определяющими комплементарность областями" (CDR), которые чередуются с областями, являющимися более консервативными, называемыми "каркасными областями" (FR или FW).The VH and VL regions can be subdivided into regions of hypervariability called "complementarity determining regions" (CDRs) that alternate with more conserved regions called "framework regions" (FRs or FWs).
Размеры каркасной области и CDR были точно определены с помощью ряда способов (см. Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chothia, C. et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; и определения AbM, используемого в программном обеспечении Oxford Molecular's AbM для моделирования антител. См. в целом, например, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. В Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg).Framework sizes and CDRs have been accurately determined using a number of methods (see Kabat, EA, et al ., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91- 3242; Chothia, C. et al ., (1987) J. Mol. Biol . 196:901-917; and definition of AbM used in Oxford Molecular's AbM antibody modeling software. See in general, for example, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains In Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg).
Термины "определяющая комплементарность область" и "CDR", используемые в данном документе, относятся к последовательностям аминокислот в вариабельных областях антитела, которые придают антигенную специфичность и аффинность связывания. Как правило, в каждой вариабельной области тяжелой цепи присутствуют три CDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3), и в каждой вариабельной области легкой цепи присутствуют три CDR (LCDR1, LCDR2, LCDR3).The terms "complementarity determining region" and "CDR" as used herein refer to amino acid sequences in the variable regions of an antibody that confer antigen specificity and binding affinity. Typically, three CDRs are present in each heavy chain variable region (HCDR1, HCDR2, HCDR3), and three CDRs are present in each light chain variable region (LCDR1, LCDR2, LCDR3).
Точные границы аминокислотной последовательности данной CDR могут быть определены с использованием любой из ряда хорошо известных схем, в том числе описанных в Kabat et al., (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (схема нумерации в соответствии с "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (схема нумерации в соответствии с "Chothia"). Как используется в данном документе, CDR, определенные согласно схеме нумерации "Chothia", также иногда называют "гипервариабельными петлями".The exact boundaries of the amino acid sequence of a given CDR can be determined using any of a number of well known schemes, including those described in Kabat et al., (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5 th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (numbering scheme according to "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (numbering scheme according to "Chothia"). As used herein, CDRs defined according to the "Chothia" numbering scheme are also sometimes referred to as "hypervariable loops".
Например, согласно Kabat аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене тяжелой цепи (VH) нумеруются 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); а аминокислотные остатки CDR в вариабельном домене легкой цепи (VL) нумеруются 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3). Согласно Chothia аминокислоты CDR в VH нумеруются 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3); а аминокислотные остатки в VL нумеруются 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) и 91-96 (LCDR3). Объединяя определения CDR по Kabat и по Chothia, CDR состоят из аминокислотных остатков 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) и 95-102 (HCDR3) в VH человека и аминокислотных остатков 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) и 89-97 (LCDR3) в VL человека.For example, according to Kabat, the CDR amino acid residues in the heavy chain variable domain (VH) are numbered 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), and 95-102 (HCDR3); and the CDR amino acid residues in the light chain variable domain (VL) are numbered 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) and 89-97 (LCDR3). According to Chothia, the CDR amino acids in VH are numbered 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2), and 95-102 (HCDR3); and amino acid residues in VL are numbered 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) and 91-96 (LCDR3). Combining the Kabat and Chothia definitions of CDRs, CDRs consist of amino acid residues 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) and 95-102 (HCDR3) in the human VH and amino acid residues 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) and 89-97 (LCDR3) in human VL.
Как правило, если конкретно не указано иное, молекулы антитела к PD-1 могут содержать любую комбинацию одной или нескольких CDR по Kabat и/или CDR по Chothia, например, описанных в таблице A. В одном варианте осуществления для молекул антитела к PD-1, описанных в таблице A, используются следующие определения: HCDR1 в соответствии с комбинированными определениями CDR как по Kabat, так и по Chothia, и HCCDR 2-3 и LCCDR 1-3 в соответствии с определением CDR по Kabat. Согласно всем определениям, каждая из VH и VL, как правило, содержит три CDR и четыре FR, расположенные от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.In general, unless specifically stated otherwise, anti-PD-1 antibody molecules may contain any combination of one or more Kabat CDRs and/or Chothia CDRs, for example, described in Table A. In one embodiment, for the anti-PD-1 antibody molecules described in Table A, the following definitions are used: HCDR1 according to the combined definitions of both Kabat and Chothia CDRs and HCCDR 2-3 and LCCDR 1 -3 according to the definition of CDR by Kabat. By all definitions, each of VH and VL typically contains three CDRs and four FRs, arranged from amino to carboxy in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Расчеты гомологии или идентичности последовательностей между последовательностями (термины используются в данном документе взаимозаменяемо) выполняют следующим образом.Calculations of homology or sequence identity between sequences (terms used interchangeably herein) are performed as follows.
Чтобы определить процентную идентичность двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, для оптимального выравнивания можно вводить гэпы в одну или обе из первой и второй аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновых кислот, и негомологичные последовательности могут не учитываться в целях сравнения). В предпочтительном варианте осуществления длина эталонной последовательности, выровненной в целях сравнения, составляет по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, 60% и еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 100% длины эталонной последовательности. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Когда положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, тогда молекулы являются идентичными в данном положении (как используется в данном документе, "идентичность" аминокислоты или нуклеиновой кислоты эквивалентна "гомологии" аминокислоты или нуклеиновой кислоты).To determine the percent identity of two amino acid sequences or two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison (e.g., one or both of the first and second amino acid or nucleic acid sequences may be gapped for optimal alignment, and non-homologous sequences may be ignored for comparison purposes). In a preferred embodiment, the length of the reference sequence aligned for comparison purposes is at least 30%, preferably at least 40%, more preferably at least 50%, 60% and even more preferably at least 70%, 80%, 90%, 100% of the length of the reference sequence. The amino acid residues or nucleotides at the corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position (as used herein, "identity" of an amino acid or nucleic acid is equivalent to "homology" of an amino acid or nucleic acid ).
Процентная идентичность двух последовательностей зависит от числа идентичных положений, общих для последовательностей, при этом учитывается число гэпов и длина каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей.The percentage identity of two sequences depends on the number of identical positions that the sequences share, taking into account the number of gaps and the length of each gap that must be entered for optimal alignment of the two sequences.
Сравнение последовательностей и определение процентной идентичности двух последовательностей можно осуществлять с применением математического алгоритма. В предпочтительном варианте осуществления процентную идентичность двух аминокислотных последовательностей определяют с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453), который был включен в программу GAP в составе пакета программного обеспечения GCG (доступного на www.gcg.com), с применением либо матрицы Blossom 62, либо матрицы PAM250, а также штрафа за открытие гэпа, составляющего 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и штрафа за продление гэпа, составляющего 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В еще одном предпочтительном варианте осуществления процентную идентичность между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с применением программы GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступного на www.gcg.com) с применением матрицы NWSgapdna.CMP и штрафа за открытие гэпа, составляющего 40, 50, 60, 70 или 80, и штрафа за продление гэпа, составляющего 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Особенно предпочтительным набором параметров (и тем, который следует применять, если не указано иное) является матрица весов Blossum 62 со штрафом за открытие гэпа 12, штрафом за продление гэпа 4 и штрафом за сдвиг рамки гэпа 5.Comparing sequences and determining the percent identity of two sequences can be done using a mathematical algorithm. In a preferred embodiment, the percent identity of two amino acid sequences is determined using the Needleman-Wunsch algorithm ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453), which has been included in the GAP program as part of the GCG software package (available at www. gcg.com), using either the Blossom 62 matrix or the PAM250 matrix, and a gap opening penalty of 16, 14, 12, 10, 8, 6, or 4, and a gap extension penalty of 1, 2, 3 , 4, 5, or 6. In yet another preferred embodiment, percent identity between two nucleotide sequences is determined using the GAP program in the GCG software package (available at www.gcg.com) using the NWSgapdna.CMP matrix and gap opening penalty, of 40, 50, 60, 70, or 80, and a gap extension penalty of 1, 2, 3, 4, 5, or 6. An especially preferred set of parameters (and one that should be used unless otherwise noted) is ma A triage of Blossum weights of 62 with a gap opening penalty of 12, a gap extension penalty of 4, and a gap framing penalty of 5.
Процентную идентичность двух аминокислотных или нуклеотидных последовательностей можно определить с помощью алгоритма E. Meyers и W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17), который был включен в программу ALIGN (версия 2.0), с применением таблицы весов замен остатков PAM120, штрафа за продление гэпа 12 и штрафа за открытие гэпа 4.Percent identity of two amino acid or nucleotide sequences can be determined using the algorithm of E. Meyers and W. Miller ((1989) CABIOS , 4:11-17), which was included in the ALIGN program (version 2.0), using the PAM120 residue substitution weight table , a gap extension penalty of 12, and a gap opening penalty of 4.
Последовательности нуклеиновой кислоты и белка, описанные в данном документе, можно применять в качестве "запрашиваемой последовательности" для проведения поиска в общедоступных базах данных, например, для идентификации других представителей семейства или родственных последовательностей. Такие поиски можно выполнять с применением программ NBLAST и XBLAST (версия 2.0) Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Поиски нуклеотидов посредством BLAST можно выполнять с помощью программы NBLAST, оценка=100, длина слова=12, чтобы получить нуклеотидные последовательности, гомологичные молекулам нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Поиски белка посредством BLAST можно выполнять с помощью программы XBLAST, оценка=50, длина слова=3, чтобы получить аминокислотные последовательности, гомологичные молекулам белка по настоящему изобретению. Для получения выравниваний с гэпами в целях сравнения можно использовать Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST можно применять параметры по умолчанию из соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См. www.ncbi.nlm.nih.gov.The nucleic acid and protein sequences described herein can be used as a "query sequence" for searching public databases, for example, to identify other members of the family or related sequences. Such searches can be performed using the programs NBLAST and XBLAST (version 2.0) Altschul,et al., (1990)J. Mol. Biol. 215:403-10. BLAST nucleotide searches can be performed using the NBLAST program, score=100, wordlength=12, to obtain nucleotide sequences homologous to the nucleic acid molecules of the present invention. BLAST protein searches can be performed using the XBLAST program, score=50, wordlength=3, to obtain amino acid sequences homologous to the protein molecules of the present invention. Gapped BLAST can be used to obtain alignments with gaps for comparison purposes, as described in Altschulet al., (1997)Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. When using the BLAST and Gapped BLAST programs, you can use the default settings from the respective programs (for example, XBLAST and NBLAST). Cm. www.ncbi.nlm.nih.gov.
"Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток замещается аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в уровне техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).A "conservative amino acid substitution" is one in which an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (for example, lysine, arginine, histidine), acidic side chains (for example, aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (for example, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (eg, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (eg, threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (for example, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
Таблица A. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности иллюстративных молекул антител к PD-1 Table A. Amino acid and nucleotide sequences of exemplary anti-PD-1 antibody molecules
Другие иллюстративные ингибиторы PD-1Other exemplary PD-1 inhibitors
В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 представляет собой ниволумаб (Bristol-Myers Squibb), также известный как MDX-1106, MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558 или OPDIVO®. Ниволумаб (клон 5C4) и другие антитела к PD-1 раскрыты в US 8008449 и WO 2006/121168, включенных посредством ссылки во всей своей полноте. В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит одну или несколько из последовательностей CDR (или в совокупности все из последовательностей CDR), последовательность вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи или последовательность тяжелой цепи или легкой цепи ниволумаба, например, как раскрыто в таблице B.In one embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule is nivolumab (Bristol-Myers Squibb), also known as MDX-1106, MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558, or OPDIVO®. Nivolumab (clone 5C4) and other anti-PD-1 antibodies are disclosed in US 8008449 and WO 2006/121168, incorporated by reference in their entirety. In one embodiment, an anti-PD-1 antibody molecule contains one or more of the CDR sequences (or all of the CDR sequences in combination), a heavy chain or light chain variable region sequence, or a nivolumab heavy chain or light chain sequence, for example, as disclosed in Table b.
В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 представляет собой пембролизумаб (Merck & Co), также известный как ламбролизумаб, MK-3475, MK03475, SCH-900475 или KEYTRUDA®. Пембролизумаб и другие антитела к PD-1 раскрыты в Hamid, O. et al., (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44, US 8354509 и WO 2009/114335, включенных посредством ссылки во всей своей полноте. В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит одну или несколько из последовательностей CDR (или в совокупности все из последовательностей CDR), последовательность вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи или последовательность тяжелой цепи или легкой цепи пембролизумаба, например, как раскрыто в таблице B.In one embodiment, the PD-1 antibody molecule is pembrolizumab (Merck & Co), also known as lambrolizumab, MK-3475, MK03475, SCH-900475, or KEYTRUDA®. Pembrolizumab and other anti-PD-1 antibodies are disclosed in Hamid, O. et al ., (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44, US 8354509 and WO 2009/114335, incorporated by reference in their entirety . In one embodiment, an anti-PD-1 antibody molecule comprises one or more of the CDR sequences (or collectively all of the CDR sequences), a pembrolizumab heavy chain or light chain variable region sequence, or a pembrolizumab heavy chain or light chain sequence, e.g., as disclosed in Table b.
В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 представляет собой пидилизумаб (CureTech), также известный как CT-011. Пидилизумаб и другие антитела к PD-1 раскрыты в Rosenblatt, J. et al., (2011) J Immunotherapy 34(5): 409-18, US 7695715, US 7332582 и US 8686119, включенных посредством ссылки во всей своей полноте. В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит одну или несколько из последовательностей CDR (или в совокупности все из последовательностей CDR), последовательность вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи или последовательность тяжелой цепи или легкой цепи пидилизумаба, например, как раскрыто в таблице B.In one embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule is pidilizumab (CureTech), also known as CT-011. Pidilizumab and other anti-PD-1 antibodies are disclosed in Rosenblatt, J. et al., (2011) J Immunotherapy 34(5): 409-18, US 7695715, US 7332582 and US 8686119, incorporated by reference in their entirety. In one embodiment, an anti-PD-1 antibody molecule comprises one or more of the CDR sequences (or collectively all of the CDR sequences), a heavy chain or light chain variable region sequence, or a pidilizumab heavy chain or light chain sequence, e.g., as disclosed in Table b.
В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 представляет собой MEDI0680 (Medimmune), также известное как AMP-514. MEDI0680 и другие антитела к PD-1 раскрыты в US 9205148 и WO 2012/145493, включенных посредством ссылки во всей своей полноте. В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-1 содержит одну или несколько из последовательностей CDR (или в совокупности все из последовательностей CDR), последовательность вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи или последовательность тяжелой цепи или легкой цепи MEDI0680.In one embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule is MEDI0680 (Medimmune), also known as AMP-514. MEDI0680 and other anti-PD-1 antibodies are disclosed in US 9205148 and WO 2012/145493, incorporated by reference in their entirety. In one embodiment, an anti-PD-1 antibody molecule comprises one or more of the CDR sequences (or all of the CDR sequences in combination), a heavy chain or light chain variable region sequence, or a MEDI0680 heavy chain or light chain sequence.
Дополнительные известные антитела к PD-1 включают таковые, описанные, например, в WO 2015/112800, WO 2016/092419, WO 2015/085847, WO 2014/179664, WO 2014/194302, WO 2014/209804, WO 2015/200119, US 8735553, US 7488802, US 8927697, US 8993731 и US 9102727, включенных посредством ссылки во всей своей полноте.Additional known anti-PD-1 antibodies include those described, for example, in WO 2015/112800, WO 2016/092419, WO 2015/085847, WO 2014/179664, WO 2014/194302, WO 2014/209804, WO 2015/200119, US 8735553, US 7488802, US 8927697, US 8993731 and US 9102727, incorporated by reference in their entirety.
В одном варианте осуществления антитело к PD-1 представляет собой антитело, которое конкурирует за связывание и/или связывает тот же эпитоп на PD-1, как и одно из антител к PD-1, описанных в данном документе.In one embodiment, an anti-PD-1 antibody is an antibody that competes for binding and/or binds the same epitope on PD-1 as one of the anti-PD-1 antibodies described herein.
В одном варианте осуществления ингибитор PD-1 представляет собой пептид, который ингибирует сигнальный путь с участием PD-1, например, как описано в US 8907053, включенном посредством ссылки во всей своей полноте. В одном варианте осуществления ингибитор PD-1 представляет собой иммуноадгезин (например, иммуноадгезин, который содержит внеклеточную или PD-1-связывающую часть PD-L1 или PD-L2, слитую с константной областью (например, Fc-область последовательности иммуноглобулина)). В одном варианте осуществления ингибитор PD-1 представляет собой AMP-224 (B7-DCIg (Amplimmune), например, раскрытый в WO 2010/027827 и WO 2011/066342, включенных посредством ссылки во всей своей полноте).In one embodiment, a PD-1 inhibitor is a peptide that inhibits a signaling pathway involving PD-1, e.g., as described in US 8907053, incorporated by reference in its entirety. In one embodiment, the PD-1 inhibitor is an immunoadhesin (e.g., an immunoadhesin that contains an extracellular or PD-1 binding portion of PD-L1 or PD-L2 fused to a constant region (e.g., Fc region of the immunoglobulin sequence)). In one embodiment, the PD-1 inhibitor is AMP-224 (B7-DCIg (Amplimmune), e.g., disclosed in WO 2010/027827 and WO 2011/066342, incorporated by reference in its entirety).
Таблица B. Аминокислотные последовательности других иллюстративных молекул антител к PD-1 Table B. Amino acid sequences of other exemplary anti-PD-1 antibody molecules
Пример молекулы антитела к PD-L1An example of an anti-PD-L1 antibody molecule
В одном варианте осуществления комбинированный продукт содержит соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль или сокристалл и молекулу антитела к PD-L1, как например антител, описанных в данном документе.In one embodiment, the combination product contains a compound of formula (I), or a pharmaceutically acceptable salt or co-crystal thereof, and an anti-PD-L1 antibody molecule, such as the antibodies described herein.
Лиганд 1 программируемой смерти клеток (PD-L1) был описан как лиганд иммуноингибирующего рецептора 1 программируемой смерти клеток (PD-1). Связывание PD-L1 с PD-1 приводит к подавлению опосредованной T-клеточным рецептором пролиферации лимфоцитов и секреции цитокинов (Freeman et al., (2000) J Exp Med 192:1027-34). Таким образом, блокирование PD-L1 может привести к усилению противоопухолевого иммунитета.Programmed cell death ligand 1 (PD-L1) has been described as a ligand for the immunoinhibitory programmed cell death receptor 1 (PD-1). Binding of PD-L1 to PD-1 leads to suppression of T-cell receptor-mediated lymphocyte proliferation and cytokine secretion (Freeman et al., (2000) J Exp Med 192:1027-34). Thus, blocking PD-L1 can lead to increased antitumor immunity.
Несколько типов клеток экспрессируют PD-L1. Например, PD-L1 экспрессируется на активированных T-клетках, дендритных клетках (DC), естественных клетках-киллерах (NK), макрофагах, B-клетках, моноцитах и клетках эндотелия сосудов. PD-L1 экспрессируется при множестве видов рака, включая карциному легкого, яичника и толстой кишки человека и различные виды миеломы (Iwai et al., (2002) PNAS 99:12293-7; Ohigashi et al., (2005) Clin Cancer Res 11:2947-53; Okazaki et al. (2007) Intern. Immun. 19:813-24; Thompson et al., (2006) Cancer Res. 66:3381-5). Экспрессия PD-L1 сильно коррелирует с неблагоприятным прогнозом для различных типов рака, в том числе рака почки, яичника, мочевого пузыря, молочной железы, желудка и поджелудочной железы.Several cell types express PD-L1. For example, PD-L1 is expressed on activated T cells, dendritic cells (DC), natural killer (NK) cells, macrophages, B cells, monocytes, and vascular endothelial cells. PD-L1 is expressed in a variety of cancers, including human lung, ovarian, and colon carcinomas and various types of myeloma (Iwai et al., (2002) PNAS 99:12293-7; Ohigashi et al., (2005) Clin Cancer Res 11 :2947-53 Okazaki et al (2007) Intern Immun 19:813-24 Thompson et al (2006) Cancer Res 66:3381-5). PD-L1 expression is highly correlated with poor prognosis for various types of cancer, including kidney, ovarian, bladder, breast, stomach, and pancreatic cancers.
Множество инфильтрирующих опухоль T-лимфоцитов преимущественно экспрессируют PD-1 по сравнению с T-лимфоцитами в нормальных тканях и T-лимфоцитами периферической крови. Это указывает на то, что активация PD-1 на опухолереактивных T-клетках может содействовать нарушению противоопухолевых иммунных ответов (Ahmadzadeh et al., (2009) Blood 114:1537-44). Таким образом, передача сигнала с участием PD-L1, опосредуемая экспрессирующими PD-L1 опухолевыми клетками, взаимодействующими с экспрессирующими PD-1 T-клетками, может приводить к аттенуации активации T-клеток и ускользанию от иммунного надзора (Sharpe et al., (2002) Nat Rev Immunol. 2:116-26; Keir et al., (2008) Annu Rev Immunol. 26:677-704). Блокирование PD-1 может подавлять распространение в крови недостаточно иммуногенных опухолевых клеток путем усиления рекрутирования эффекторных Т-клеток (Iwai et al., (2005) Int. Immunol. 17:133-144).Many tumor-infiltrating T-lymphocytes preferentially express PD-1 compared to T-lymphocytes in normal tissues and T-lymphocytes in peripheral blood. This indicates that PD-1 activation on tumor-reactive T cells may contribute to disruption of antitumor immune responses (Ahmadzadeh et al., (2009) Blood 114:1537-44). Thus, PD-L1 signaling mediated by PD-L1-expressing tumor cells interacting with PD-1-expressing T cells may lead to attenuation of T cell activation and escape from immune surveillance (Sharpe et al., (2002 ) Nat Rev Immunol 2:116-26; Keir et al., (2008) Annu Rev Immunol 26:677-704). Blocking PD-1 can suppress the spread of insufficiently immunogenic tumor cells in the blood by enhancing the recruitment of effector T cells (Iwai et al., (2005) Int. Immunol. 17:133-144).
Антитело к PD-L1 может усиливать T-клеточный иммунитет, например, посредством блокирования его ингибирующих взаимодействий как с PD-1, так и B7-1. Антитело к PD-1 также может обеспечивать осуществление иммунной регуляции посредством PD-L2/PD-1. Как PD-1, так и B7-1 экспрессируются на T-клетках, B-клетках, DC и макрофагах, что обеспечивает возможность двусторонних взаимодействий между B7-1 и PD-L1 на таких типах клеток. PD-L1 на клетках, не являющихся гемопоэтическими, может взаимодействовать с B7-1, а также PD-1 на T-клетках.An anti-PD-L1 antibody can enhance T-cell immunity, for example, by blocking its inhibitory interactions with both PD-1 and B7-1. An anti-PD-1 antibody can also mediate immune regulation through PD-L2/PD-1. Both PD-1 and B7-1 are expressed on T cells, B cells, DCs, and macrophages, allowing for bilateral interactions between B7-1 and PD-L1 on these cell types. PD-L1 on non-hematopoietic cells can interact with B7-1 as well as PD-1 on T cells.
В некоторых вариантах осуществления молекула антитела к PD-L1 выбрана из YW243.55.S70, MPDL3280A, MEDI-4736, MSB-0010718C или MDX-1105.In some embodiments, the anti-PD-L1 antibody molecule is selected from YW243.55.S70, MPDL3280A, MEDI-4736, MSB-0010718C, or MDX-1105.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-L1 представляет собой MSB0010718C. MSB0010718C (также обозначаемое как A09-246-2; Merck Serono) представляет собой моноклональное антитело, которое связывается с PD-L1. MSB0010718C и другие гуманизированные антитела к PD-L1 раскрыты в WO 2013/079174 и характеризуются последовательностью, раскрытой в данном документе (или последовательностью, по сути идентичной или подобной ей, например, последовательностью, на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или больше идентичной указанной последовательности). Аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей MSB0010718C включают по меньшей мере следующие:In some embodiments, the anti-PD-L1 antibody is MSB0010718C. MSB0010718C (also referred to as A09-246-2; Merck Serono) is a monoclonal antibody that binds to PD-L1. MSB0010718C and other humanized anti-PD-L1 antibodies are disclosed in WO 2013/079174 and are characterized by the sequence disclosed herein (or a sequence substantially identical or similar to it, for example, sequence at least 85%, 90%, 95% or more identical to the specified sequence). The amino acid sequences of the heavy and light chains of MSB0010718C include at least the following:
тяжелая цепь (SEQ ID NO: 24, раскрытая в WO 2013/079174)heavy chain (SEQ ID NO: 24 disclosed in WO 2013/079174)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 42)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 42)
легкая цепь (SEQ ID NO: 25, раскрытая в WO 2013/079174) light chain (SEQ ID NO: 25 disclosed in WO 2013/079174)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSN RPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL (SEQ ID NO: 43)QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSN RPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL (SEQ ID NO: 43)
В одном варианте осуществления ингибитор PD-L1 представляет собой YW243.55.S70. Антитело YW243.55.S70 представляет собой антитело к PD-L1, описанное в WO 2010/077634 (последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей показаны под SEQ ID NO: 20 и 21 соответственно), и характеризуется последовательностью, раскрытой в нем (или последовательностью, по сути идентичной или подобной ей, например, последовательностью, на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или больше идентичной указанной последовательности).In one embodiment, the PD-L1 inhibitor is YW243.55.S70. The YW243.55.S70 antibody is an anti-PD-L1 antibody described in WO 2010/077634 (the heavy and light chain variable region sequences are shown under SEQ ID NOs: 20 and 21, respectively) and is characterized by the sequence disclosed therein (or the sequence , essentially identical or similar to it, for example, sequence at least 85%, 90%, 95% or more identical to the specified sequence).
В одном варианте осуществления ингибитор PD-L1 представляет собой MDX-1105. MDX-1105, также известное как BMS-936559, представляет собой антитело к PD-L1, описанное в WO 2007/005874, и характеризуется последовательностью, раскрытой в нем (или последовательностью, по сути идентичной или подобной ей, например, последовательностью, на по меньшей мере 85%, 90%, 95% или больше идентичной указанной последовательности).In one embodiment, the PD-L1 inhibitor is MDX-1105. MDX-1105, also known as BMS-936559, is an anti-PD-L1 antibody described in WO 2007/005874 and is characterized by the sequence disclosed therein (or a sequence substantially identical or similar to it, e.g., sequence at least 85%, 90%, 95% or more identical to the specified sequence).
В одном варианте осуществления ингибитор PD-L1 представляет собой MDPL3280A (Genentech/Roche). MDPL3280A представляет собой моноклональное антитело IgG1 человека с оптимизированной Fc, которое связывается с PD-L1. MDPL3280A и другие моноклональные антитела к PD-L1 человека раскрыты в патенте США № 7943743 и публикации заявки на патент США № 20120039906.In one embodiment, the PD-L1 inhibitor is MDPL3280A (Genentech/Roche). MDPL3280A is an Fc-optimized human IgG1 monoclonal antibody that binds to PD-L1. MDPL3280A and other anti-human PD-L1 monoclonal antibodies are disclosed in U.S. Patent No. 7,943,743 and U.S. Patent Application Publication No. 20120039906.
В другом варианте осуществления ингибитор PD-L1 представляет собой молекулу антитела к PD-L1, раскрытую в US 2016/0108123, поданном 13 октября 2015 г. под названием "Молекулы антител к PD-1 и варианты их применения", включенном посредством ссылки во всей своей полноте.In another embodiment, the PD-L1 inhibitor is an anti-PD-L1 antibody molecule disclosed in US 2016/0108123, filed Oct. 13, 2015, titled "Anti-PD-1 Antibody Molecules and Uses Therefor", incorporated by reference throughout its fullness.
В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-L1 содержит по меньшей мере один или два вариабельных домена тяжелой цепи (необязательно включающих константную область), по меньшей мере один или два вариабельных домена легкой цепи (необязательно включающих константную область) или оба из них, содержащих аминокислотную последовательность любого из BAP058-hum01, BAP058-hum02, BAP058-hum03, BAP058-hum04, BAP058-hum05, BAP058-hum06, BAP058-hum07, BAP058-hum08, BAP058-hum09, BAP058-hum10, BAP058-hum11, BAP058-hum12, BAP058-hum13, BAP058-hum14, BAP058-hum15, BAP058-hum16, BAP058-hum17, BAP058-Клон-K, BAP058-Клон-L, BAP058-Клон-M, BAP058-Клон-N или BAP058-Клон-O; или приведенную в таблице 1 US 2016/0108123, или кодируемую нуклеотидной последовательностью из таблицы 1; или последовательность, по сути идентичную (например, идентичную на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или больше) любой из вышеуказанных последовательностей.In one embodiment, an anti-PD-L1 antibody molecule contains at least one or two heavy chain variable domains (optionally including a constant region), at least one or two light chain variable domains (optionally including a constant region), or both of them, containing the amino acid sequence of any of BAP058-hum01, BAP058-hum02, BAP058-hum03, BAP058-hum04, BAP058-hum05, BAP058-hum06, BAP058-hum07, BAP058-hum08, BAP058-hum09, BAP058-hum10, BAP058-hum11, BAP058- hum12, BAP058-hum13, BAP058-hum14, BAP058-hum15, BAP058-hum16, BAP058-hum17, BAP058-Clone-K, BAP058-Clone-L, BAP058-Clone-M, BAP058-Clone-N or BAP058-Clone- O; or shown in table 1 US 2016/0108123, or encoded by the nucleotide sequence from table 1; or a sequence that is essentially identical (for example, at least 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% or more identical) to any of the above sequences.
В еще одном варианте осуществления молекула антитела к PD-L1 содержит по меньшей мере одну, две или три определяющих комплементарность области (CDR) из вариабельной области тяжелой цепи и/или вариабельной области легкой цепи антитела, описанного в данном документе, например, любого антитела, выбранного из BAP058-hum01, BAP058-hum02, BAP058-hum03, BAP058-hum04, BAP058-hum05, BAP058-hum06, BAP058-hum07, BAP058-hum08, BAP058-hum09, BAP058-hum10, BAP058-hum11, BAP058-hum12, BAP058-hum13, BAP058-hum14, BAP058-hum15, BAP058-hum16, BAP058-hum17, BAP058-Клон-K, BAP058-Клон-L, BAP058-Клон-M, BAP058-Клон-N или BAP058-Клон-O; или описанного в таблице 1 US 2016/0108123, или кодируемого нуклеотидной последовательностью из таблицы 1 US 2016/0108123; или с последовательностью, по сути идентичной (например, на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или больше идентичной) любой из вышеуказанных последовательностей.In yet another embodiment, an anti-PD-L1 antibody molecule comprises at least one, two, or three complementarity determining regions (CDRs) from a heavy chain variable region and/or a light chain variable region of an antibody described herein, e.g., any antibody selected from BAP058-hum01, BAP058-hum02, BAP058-hum03, BAP058-hum04, BAP058-hum05, BAP058-hum06, BAP058-hum07, BAP058-hum08, BAP058-hum09, BAP058-hum10, BAP058-hum11, BAP058 -hum12, BAP058-hum13, BAP058-hum14, BAP058-hum15, BAP058-hum16, BAP058-hum17, BAP058-Clone-K, BAP058-Clone-L, BAP058-Clone-M, BAP058-Clone-N, or BAP058-Clone -O; or described in Table 1 US 2016/0108123, or encoded by a nucleotide sequence from Table 1 US 2016/0108123; or with a sequence that is essentially identical (for example, at least 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% or more identical) to any of the above sequences.
В еще одном варианте осуществления молекула антитела к PD-L1 содержит по меньшей мере одну, две или три CDR (или в совокупности все CDR) из вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в таблице 1 US 2016/0108123, или кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице 1 US 2016/0108123. В одном варианте осуществления одна или несколько CDR (или в совокупности все CDR) имеют одно, два, три, четыре, пять, шесть или больше изменений, например, аминокислотных замен или делеций, по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в таблице 1 US 2016/0108123, или кодируемой нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице 1 US 2016/0108123.In yet another embodiment, an anti-PD-L1 antibody molecule comprises at least one, two, or three CDRs (or all CDRs in total) from the heavy chain variable region, comprising the amino acid sequence shown in Table 1 of US 2016/0108123, or encoded by a nucleotide the sequence shown in Table 1 US 2016/0108123. In one embodiment, one or more CDRs (or collectively all CDRs) have one, two, three, four, five, six or more changes, for example, amino acid substitutions or deletions compared to the amino acid sequence shown in US 2016/0108123 Table 1 or the encoded nucleotide sequence shown in US 2016/0108123 Table 1.
В еще одном варианте осуществления молекула антитела к PD-L1 содержит по меньшей мере одну, две или три CDR (или в совокупности все CDR) из вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в таблице 1 US 2016/0108123, или кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице 1. В одном варианте осуществления одна или несколько CDR (или в совокупности все CDR) имеют одно, два, три, четыре, пять, шесть или больше изменений, например, аминокислотных замен или делеций, по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в таблице 1 US 2016/0108123, или кодируемой нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице 1 US 2016/0108123. В некоторых вариантах осуществления молекула антитела к PD-L1 содержит замену в CDR легкой цепи, например одну или несколько замен в CDR1, CDR2 и/или CDR3 легкой цепи.In yet another embodiment, an anti-PD-L1 antibody molecule contains at least one, two, or three CDRs (or all CDRs in total) from a light chain variable region comprising the amino acid sequence shown in Table 1 of US 2016/0108123 or encoded by a nucleotide the sequence shown in Table 1. In one embodiment, one or more CDRs (or collectively all CDRs) have one, two, three, four, five, six or more changes, for example, amino acid substitutions or deletions compared to the amino acid sequence shown in US 2016/0108123 Table 1 or the encoded nucleotide sequence shown in US 2016/0108123 Table 1. In some embodiments, the anti-PD-L1 antibody molecule contains a substitution in the light chain CDR, e.g. one or more substitutions in CDR1, CDR2 and/or CDR3 of the light chain.
В другом варианте осуществления молекула антитела к PD-L1 содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть CDR (или в совокупности все CDR) из вариабельной области тяжелой и легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в таблице 1, или кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице 1 US 2016/0108123. В одном варианте осуществления одна или несколько CDR (или в совокупности все CDR) имеют одно, два, три, четыре, пять, шесть или больше изменений, например, аминокислотных замен или делеций, по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в таблице 1 US 2016/0108123, или кодируемой нуклеотидной последовательностью, показанной в таблице 1 US 2016/0108123.In another embodiment, an anti-PD-L1 antibody molecule contains at least one, two, three, four, five, or six CDRs (or all CDRs in total) from the heavy and light chain variable region, comprising the amino acid sequence shown in Table 1, or encoded by the nucleotide sequence shown in Table 1 US 2016/0108123. In one embodiment, one or more CDRs (or collectively all CDRs) have one, two, three, four, five, six or more changes, for example, amino acid substitutions or deletions compared to the amino acid sequence shown in US 2016/0108123 Table 1 or the encoded nucleotide sequence shown in US 2016/0108123 Table 1.
В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-L1 содержит по меньшей мере одну, две или три CDR или гипервариабельные петли из вариабельной области тяжелой цепи антитела, описанного в данном документе, например любого антитела, выбранного из BAP058-hum01, BAP058-hum02, BAP058-hum03, BAP058-hum04, BAP058-hum05, BAP058-hum06, BAP058-hum07, BAP058-hum08, BAP058-hum09, BAP058-hum10, BAP058-hum11, BAP058-hum12, BAP058-hum13, BAP058-hum14, BAP058-hum15, BAP058-hum16, BAP058-hum17, BAP058-Клон-K, BAP058-Клон-L, BAP058-Клон-M, BAP058-Клон-N или BAP058-Клон-O, в соответствии с определениями по Kabat и Chothia (например, по меньшей мере одну, две или три CDR или гипервариабельные петли в соответствии с определениями по Kabat и Chothia, как указано в таблице 1 US 2016/0108123); или кодируемых нуклеотидной последовательностью из таблицы 1 US 2016/0108123; или с последовательностью, по сути идентичной (например, идентичной на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% или больше) любой из вышеуказанных последовательностей; или которые имеют по меньшей мере одно изменение аминокислоты, но не более двух, трех или четырех измерений (например, замен, делеций или вставок, например, консервативных замен), по сравнению с одной, двумя или тремя CDR или гипервариабельными петлями в соответствии с Kabat и/или Chothia, показанными в таблице 1 US 2016/0108123.In one embodiment, an anti-PD-L1 antibody molecule contains at least one, two, or three CDRs or hypervariable loops from the heavy chain variable region of an antibody described herein, e.g. any antibody selected from BAP058-hum01, BAP058-hum02, BAP058-hum03, BAP058-hum04, BAP058-hum05, BAP058-hum06, BAP058-hum07, BAP058-hum08, BAP058-hum09, BAP058-hum10, BAP058-hum11, BAP058 -hum12, BAP058-hum13, BAP058-hum14, BAP058-hum15, BAP058-hum16, BAP058-hum17, BAP058-Clone-K, BAP058-Clone-L, BAP058-Clone-M, BAP058-Clone-N, or BAP058-Clone -O, as defined by Kabat and Chothia (e.g., at least one, two or three CDRs or hypervariable loops as defined by Kabat and Chothia as set out in Table 1 US 2016/0108123); or encoded by a nucleotide sequence from Table 1 US 2016/0108123; or with a sequence that is essentially identical (for example, at least 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% or more identical) to any of the above sequences; or which have at least one amino acid change but no more than two, three, or four dimensions (e.g., substitutions, deletions or insertions, for example, conservative substitutions), compared to one, two or three CDR or hypervariable loops according to Kabat and/or Chothia shown in Table 1 US 2016/0108123.
В одном варианте осуществления молекула антитела к PD-L1 может содержать CDR1 VH в соответствии с Kabat et al., ((1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD), или гипервариабельную петлю 1 VH в соответствии с Chothia et al., (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817, или их комбинацию, например, как показано в таблице 1 US 2016/0108123. В одном варианте осуществления CDR1 VH согласно комбинации определений CDR по Kabat и Chothia содержит аминокислотную последовательность GYTFTSYWMY (SEQ ID NO: 63) или аминокислотную последовательность, по сути идентичную ей (например, имеющую по меньшей мере одно аминокислотное изменение, но не более двух, трех или четырех изменений (например, замен, делеций или вставок, например, консервативных замен)). Молекула антитела к PD-L1 может дополнительно содержать, например, CDR 2-3 VH в соответствии с Kabat et al., и CDR 1-3 VL в соответствии с Kabat et al., например, показанные в таблице 1 US 2016/0108123.In one embodiment, an anti-PD-L1 antibody molecule may comprise a VH CDR1 according to Kabatet al., ((1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD), or VH hypervariable loop 1 according to Chothiaet al., (1992)J. Mol. biol. 227:799-817, or a combination of both, for example, as shown in Table 1 US 2016/0108123. In one embodiment, the VH CDR1 according to the combination of the Kabat and Chothia CDR definitions contains the amino acid sequence GYTFTSYWMY (SEQ ID NO: 63) or an amino acid sequence substantially identical to it (e.g., having at least one amino acid change, but no more than two, three or four changes (for example, substitutions, deletions or insertions, for example, conservative substitutions. An anti-PD-L1 antibody molecule may further comprise, for example, CDR 2-3 VH according to Kabatet al., and CDR 1-3 VL according to Kabatet al., such as those shown in Table 1 US 2016/0108123.
В предпочтительном варианте осуществления молекула антитела к PD-L1 для применения в настоящем изобретении содержитIn a preferred embodiment, an anti-PD-L1 antibody molecule for use in the present invention comprises
(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 47, аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 48 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 46; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 52, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 53 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 54;(a) a heavy chain variable region (VH) comprising the VHCDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, the VHCDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, and the VHCDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 46; and a light chain variable region (VL) comprising the VLCDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 52, the VLCDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, and the VLCDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 54;
(b) VH, содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 44; аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 45 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 46; и VL, содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 49, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 50 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 51;(b) VH containing the amino acid sequence of VHCDR1 under SEQ ID NO: 44; the amino acid sequence of VHCDR2 under SEQ ID NO: 45 and the amino acid sequence of VHCDR3 under SEQ ID NO: 46; and VL containing the amino acid sequence of VLCDR1 under SEQ ID NO: 49, the amino acid sequence of VLCDR2 under SEQ ID NO: 50 and the amino acid sequence of VLCDR3 under SEQ ID NO: 51;
(c) VH, содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 63, аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 48 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 46; и VL, содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 52, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 53 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 54; или(c) VH containing the VHCDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 63, the VHCDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, and the VHCDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 46; and VL containing the amino acid sequence of VLCDR1 under SEQ ID NO: 52, the amino acid sequence of VLCDR2 under SEQ ID NO: 53 and the amino acid sequence of VLCDR3 under SEQ ID NO: 54; or
(d) VH, содержащую аминокислотную последовательность VHCDR1 под SEQ ID NO: 63; аминокислотную последовательность VHCDR2 под SEQ ID NO: 45 и аминокислотную последовательность VHCDR3 под SEQ ID NO: 46; и VL, содержащую аминокислотную последовательность VLCDR1 под SEQ ID NO: 52, аминокислотную последовательность VLCDR2 под SEQ ID NO: 53 и аминокислотную последовательность VLCDR3 под SEQ ID NO: 54.(d) VH containing the amino acid sequence of VHCDR1 under SEQ ID NO: 63; the amino acid sequence of VHCDR2 under SEQ ID NO: 45 and the amino acid sequence of VHCDR3 under SEQ ID NO: 46; and VL containing the VLCDR1 amino acid sequence of SEQ ID NO: 52, the VLCDR2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, and the VLCDR3 amino acid sequence of SEQ ID NO: 54.
В одном аспекте предыдущего варианта осуществления молекула антитела к PD-L1 для применения в настоящем изобретении содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 55, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 58.In one aspect of the previous embodiment, an anti-PD-L1 antibody molecule for use in the present invention comprises a heavy chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55 and a light chain variable domain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58.
В одном аспекте предыдущего варианта осуществления молекула антитела к PD-L1 для применения в настоящем изобретении содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 62, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 60.In one aspect of the previous embodiment, an anti-PD-L1 antibody molecule for use in the present invention comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62 and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60.
Таблица C. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности гуманизированного mAb к PD-L1 BAP058-hum013. Показаны аминокислотные и нуклеотидные последовательности CDR тяжелых и легких цепей, вариабельных областей тяжелых и легких цепей, а также тяжелых и легких цепей. Table C. Amino acid and nucleotide sequences of the humanized anti-PD-L1 mAb BAP058-hum013. Shown are the amino acid and nucleotide sequences of the heavy and light chain CDRs, the heavy and light chain variable regions, and the heavy and light chains.
Доза и введение иммунотерапевтического средстваDose and Administration of the Immunotherapeutic Agent
Иммунотерапевтическое средство (такое как молекула антитела к PD-1 или молекула антитела к PD-L1) можно вводить субъекту системно (например, перорально, парентерально, подкожно, внутривенно, ректально, внутримышечно, внутрибрюшинно, интраназально, трансдермально или путем ингаляции или внутриполостной установки), местно или путем применения в отношении слизистых оболочек, как например носа, горла и бронхов.The immunotherapeutic agent (such as an anti-PD-1 antibody molecule or an anti-PD-L1 antibody molecule) can be administered to a subject systemically (e.g., orally, parenterally, subcutaneously, intravenously, rectally, intramuscularly, intraperitoneally, intranasally, transdermally, or by inhalation or intracavitary insertion) , topically or by application to mucous membranes such as the nose, throat and bronchi.
Дозы и терапевтические схемы приема иммунотерапевтического средства (например, молекулы антитела к PD-1 или молекулы антитела к PD-L1) могут быть определены специалистом в данной области техники. В определенных вариантах осуществления иммунотерапевтическое средство (например, молекулу антитела к PD-1) вводят путем инъекции (например, подкожно или внутривенно) в дозе от приблизительно 1 до 30 мг/кг, например от приблизительно 5 до 25 мг/кг, от приблизительно 10 до 20 мг/кг, от приблизительно 1 до 5 мг/кг или приблизительно 3 мг/кг. Схема введения доз может варьировать от, например, одного раза в неделю до одного раза в 2, 3 или 4 недели. В одном варианте осуществления молекулу антитела к PD-1 вводят в дозе от приблизительно 10 до 20 мг/кг раз в две недели. В другом варианте осуществления молекулу антитела к PD-1 вводят в дозе от приблизительно 1 до 10 мг/кг, или от приблизительно 1 до 5 мг/кг, или приблизительно 3 мг/кг каждые 4 недели.Doses and therapeutic regimens for an immunotherapeutic agent (eg, anti-PD-1 antibody molecule or anti-PD-L1 antibody molecule) can be determined by one of skill in the art. In certain embodiments, the immunotherapeutic agent (e.g., an anti-PD-1 antibody molecule) is administered by injection (e.g., subcutaneously or intravenously) at a dose of from about 1 to 30 mg/kg, for example, from about 5 to 25 mg/kg, from about 10 up to 20 mg/kg, from about 1 to 5 mg/kg, or about 3 mg/kg. Dosing schedule may vary from, for example, once a week to once every 2, 3 or 4 weeks. In one embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule is administered at a dose of about 10 to 20 mg/kg every other week. In another embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule is administered at a dose of about 1 to 10 mg/kg, or about 1 to 5 mg/kg, or about 3 mg/kg every 4 weeks.
Например, молекулу антитела к PD-1 вводят или применяют в постоянной или фиксированной дозе. В некоторых вариантах осуществления молекулу антитела к PD-1 вводят путем инъекции (например, подкожно или внутривенно) в дозе (например, в постоянной дозе) от приблизительно 200 мг до 500 мг, например от приблизительно 250 мг до 450 мг, от приблизительно 300 мг до 400 мг, от приблизительно 250 мг до 350 мг, от приблизительно 350 мг до 450 мг, или приблизительно 300 мг, или приблизительно 400 мг. Схема введения доз (например, схема введения постоянных доз) может варьировать, например, от одного раза в неделю до одного раза каждые 2, 3, 4, 5 или 6 недель. В одном варианте осуществления молекулу антитела к PD-1 вводят в дозе от приблизительно 300 мг до 400 мг один раз в три недели или один раз в четыре недели. В одном варианте осуществления молекулу антитела к PD-1 вводят в дозе от приблизительно 300 мг один раз в три недели. В одном варианте осуществления молекулу антитела к PD-1 вводят в дозе от приблизительно 400 мг один раз в четыре недели. В одном варианте осуществления молекулу антитела к PD-1 вводят в дозе от приблизительно 300 мг один раз в четыре недели. В одном варианте осуществления молекулу антитела к PD-1 вводят в дозе от приблизительно 400 мг один раз в три недели.For example, an anti-PD-1 antibody molecule is administered or administered at a constant or fixed dose. In some embodiments, the anti-PD-1 antibody molecule is administered by injection (e.g., subcutaneously or intravenously) at a dose (e.g., constant dose) of about 200 mg to 500 mg, such as about 250 mg to 450 mg, about 300 mg up to 400 mg, from about 250 mg to 350 mg, from about 350 mg to 450 mg, or about 300 mg, or about 400 mg. The dosing schedule (eg, fixed dose schedule) may vary, for example, from once a week to once every 2, 3, 4, 5 or 6 weeks. In one embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule is administered at a dose of about 300 mg to 400 mg once every three weeks or once every four weeks. In one embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule is administered at a dose of about 300 mg once every three weeks. In one embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule is administered at a dose of about 400 mg once every four weeks. In one embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule is administered at a dose of about 300 mg once every four weeks. In one embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule is administered at a dose of about 400 mg once every three weeks.
В другом варианте осуществления молекулу антитела к PD-1 вводят в постоянной дозе от приблизительно 300 мг до 400 мг один раз в три недели или один раз в четыре недели. В подварианте данного варианта осуществления молекулу антитела к PD-1 вводят в постоянной дозе, составляющей приблизительно 400 мг, каждые четыре недели. В еще одном подварианте данного варианта осуществления молекулу антитела к PD-1 вводят в постоянной дозе, составляющей приблизительно 300 мг, каждые три недели.In another embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule is administered at a constant dose of about 300 mg to 400 mg once every three weeks or once every four weeks. In a sub-variant of this embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule is administered at a constant dose of approximately 400 mg every four weeks. In yet another sub-variant of this embodiment, the anti-PD-1 antibody molecule is administered at a constant dose of approximately 300 mg every three weeks.
ПримерыExamples
Следующие примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения, и их не следует истолковывать как ограничивающие его. Значения температуры приведены в градусах Цельсия. Если не указано иное, то все операции выпаривания осуществляли при пониженном давлении предпочтительно от приблизительно 15 мм рт.ст. до 100 мм рт.ст. (= 20-133 мбар). Структура конечных продуктов, промежуточных соединений и исходных материалов подтверждена с помощью стандартных аналитических способов, например микроанализа и спектроскопических характеристик, например MS, IR, ЯМР. Используемые сокращения представляют собой стандартные сокращения в данной области техники.The following examples are intended to illustrate the present invention and should not be construed as limiting it. Temperature values are given in degrees Celsius. Unless otherwise indicated, all evaporation operations were carried out under reduced pressure, preferably from about 15 mmHg. up to 100 mm Hg (= 20-133 mbar). The structure of end products, intermediates and starting materials is confirmed using standard analytical methods, e.g. microanalysis and spectroscopic characteristics, e.g. MS, IR, NMR. The abbreviations used are standard abbreviations in the art.
Все исходные вещества, структурные элементы, реагенты, кислоты, основания, дегидрирующие средства, растворители и катализаторы, используемые для синтеза соединений по настоящему изобретению, являются либо коммерчески доступными, либо их можно получить посредством способов органического синтеза, известных специалисту обычной квалификации в данной области техники (Houben-Weyl 4th Ed. 1952, Methods of Organic Synthesis, Thieme, Volume 21). Также соединения по настоящему изобретению могут быть получены посредством способов органического синтеза, известных специалисту обычной квалификации в данной области техники, как показано в следующих примерах.All starting materials, building blocks, reagents, acids, bases, dehydrating agents, solvents and catalysts used in the synthesis of the compounds of the present invention are either commercially available or can be obtained by organic synthetic methods known to one of ordinary skill in the art. (Houben-Weyl 4th Ed. 1952, Methods of Organic Synthesis, Thieme, Volume 21). Also, the compounds of the present invention can be obtained by means of organic synthesis methods known to the person of ordinary skill in the art, as shown in the following examples.
Следующие примеры иллюстрируют, но никоим образом не ограничивают настоящее изобретение.The following examples illustrate, but in no way limit the present invention.
СокращенияAbbreviations
ACN ацетонитрилACN acetonitrile
водн. водныйaq. water
br широкийbr wide
BSA бычий сывороточный альбуминBSA bovine serum albumin
CPBA: 3-хлорпероксибензойная кислотаCPBA: 3-chloroperoxybenzoic acid
d дублетd doublet
dd дублет дублетовdd doublet of doublets
DCM дихлорметанDCM dichloromethane
DMF N,N-диметилформамидDMF N , N -dimethylformamide
DMSO диметилсульфоксидDMSO dimethyl sulfoxide
EtOAc этилацетатEtOAc ethyl acetate
г граммыg grams
ч час(-ы)h hour(s)
HPLC высокоэффективная жидкостная хроматографияHPLC high performance liquid chromatography
IS внутренний стандартIS internal standard
LCMS жидкостная хроматография и тандемная масс-спектрометрияLCMS liquid chromatography and tandem mass spectrometry
М моль/лM mol/l
m мультиплетm multiplet
MeOH метанолMeOH methanol
мин. минутыmin. minutes
мл миллилитр(-ы)ml milliliter(s)
ммоль миллимолиmmol millimoles
MS масс-спектрометрияMS mass spectrometry
масса/заряд соотношение массы и зарядаmass/charge ratio of mass and charge
NADPH бета-никотинамиддинуклеотидфосфат, восстановленная формаNADPH beta-nicotinamide dinucleotide phosphate, reduced form
ЯМР ядерный магнитный резонансNMR nuclear magnetic resonance
ppm частей на миллионppm parts per million
к.т. комнатная температураk.t. room temperature
Rt время удерживанияR t retention time
s синглетs singlet
насыщ. насыщенныйsat. saturated
t триплетt triplet
THF тетрагидрофуран.THF tetrahydrofuran.
Способы UPLCUPLC methods
2 мин. UPLC: Waters UPLC Acquity; колонка: Acquity HSS T3, 1,8 мм, 2,1*50 мм, при 60°C, элюент A: вода+0,05% HCOOH+3,75 мМ ацетат аммония, B: ACN+0,04% HCOOH, градиент: от 5 до 98% B за 1,4 мин, скорость потока: 1,0 мл/мин.2 minutes. UPLC: Waters UPLC Acquity; column: Acquity HSS T3, 1.8 mm, 2.1*50 mm, at 60°C, eluent A: water + 0.05% HCOOH + 3.75 mM ammonium acetate, B: ACN + 0.04% HCOOH , gradient: 5 to 98% B in 1.4 min, flow rate: 1.0 ml/min.
10 мин. UPLC: Waters UPLC Acquity; колонка: Acquity HSS T3, 1,8 мм, 2,1*50 мм, при 60°C, элюент A: вода+0,05% HCOOH+3,75 мМ ацетат аммония, B: ACN+0,04% HCOOH, градиент: от 5 до 98% B за 9,4 мин, время удержания 0,4 мин, скорость потока: 1 мл/мин.10 min. UPLC: Waters UPLC Acquity; column: Acquity HSS T3, 1.8 mm, 2.1*50 mm, at 60°C, eluent A: water + 0.05% HCOOH + 3.75 mM ammonium acetate, B: ACN + 0.04% HCOOH , gradient: 5 to 98% B in 9.4 min, retention time 0.4 min, flow rate: 1 ml/min.
Пример 1. Получение 1-(4-амино-5-бром-6-(1Example 1 Preparation of 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 HH -пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1-pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 HH -пиразол-4-ола-pyrazol-4-ol
5-Бром-6-хлор-2-(метилтио)пиримидин-4-амин5-Bromo-6-chloro-2-(methylthio)pyrimidine-4-amine
К охлажденному раствору 6-хлор-2-(метилтио)пиримидин-4-амина (15,0 г, 85 ммоль) в DMF (150 мл) порциями добавляли N-бромсукцинимид (16,7 г, 94 ммоль) при перемешивании при 0°C. Через 10 мин реакцию гасили путем добавления воды при 0°C. Реакционную смесь разбавляли солевым раствором и экстрагировали 3 раза с помощью EtOAc. Объединенные органические фазы промывали дважды с помощью насыщенного водного раствора NaHCO3, затем солевого раствора, разделяли и фильтровали через разделитель фаз с Na2SO4 для обеспечения высушивания. Фильтрат концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения (18,8 г, 74 ммоль, выход 80%, чистота 92%) в виде бесцветного твердого вещества, которое использовали на следующей стадии без дополнительный очистки. Масса/заряд=254/256/258 [M+H]+, Rt=0,95 мин. (UPLC 2 мин.), 1H ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ 8,03 (br s, 1H), 7,25 (br s, 1H), 2,42 (s, 3H).To a cooled solution of 6-chloro-2-(methylthio)pyrimidine-4-amine (15.0 g, 85 mmol) in DMF (150 ml) was added N-bromosuccinimide (16.7 g, 94 mmol) in portions with stirring at 0 °C. After 10 min the reaction was quenched by adding water at 0°C. The reaction mixture was diluted with brine and extracted 3 times with EtOAc. The combined organic phases were washed twice with saturated aqueous NaHCO 3 , then brine, separated and filtered through a phase separator with Na 2 SO 4 to ensure drying. The filtrate was concentrated in vacuo to give the title compound (18.8 g, 74 mmol, 80% yield, 92% purity) as a colorless solid, which was used in the next step without further purification. Mass/charge=254/256/258 [M+H]+, Rt=0.95 min. (
5-Бром-2-(метилтио)-6-(15-Bromo-2-(methylthio)-6-(1 HH -пиразол-1-ил)пиримидин-4-амин-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine
Смесь 5-бром-6-хлор-2-(метилтио)пиримидин-4-амина (17,8 г, 70 ммоль), 1H-пиразола (4,7 г, 69 ммоль) и KOtBu (7,9 г, 70 ммоль) в DMF (250 мл) перемешивали при 60°C в течение 16 часов. Растворитель устраняли in vacuo, и остаток разбавляли с помощью насыщенного водного раствора NaHCO3 и экстрагировали 3 раза с помощью EtOAc. Объединенные органические фазы промывали солевым раствором, разделяли и фильтровали через разделитель фаз с Na2SO4 для обеспечения высушивания. Фильтрат концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения (20 г, чистота 64%), которое использовали на следующей стадии без дополнительный очистки. Масса/заряд=286/288/290 [M+H]+, Rt=0,85 мин. (UPLC 2 мин), 1H ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ 8,35 (d, J=2,5 Гц, 1H), 8,03 (br s, 1H), 7,81 (br s, 1H), 7,26 (br s, 1H), 6,55 (s, 1H), 2,46 (s, 3H).Mixture of 5-bromo-6-chloro-2-(methylthio)pyrimidine-4-amine (17.8 g, 70 mmol), 1 H -pyrazole (4.7 g, 69 mmol) and KO t Bu (7.9 g, 70 mmol) in DMF (250 ml) was stirred at 60°C for 16 hours. The solvent was removed in vacuo and the residue was diluted with saturated aqueous NaHCO 3 and extracted 3 times with EtOAc. The combined organic phases were washed with brine, separated and filtered through a phase separator with Na 2 SO 4 to ensure drying. The filtrate was concentrated in vacuo to give the title compound (20 g, 64% purity), which was used in the next step without further purification. Mass/charge=286/288/290 [M+H]+, Rt=0.85 min. (
5-Бром-2-(метилсульфинил)-6-(15-Bromo-2-(methylsulfinyl)-6-(1 HH -пиразол-1-ил)пиримидин-4-амин-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine
К суспензии 5-бром-2-(метилтио)-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина (20 г, чистота 64%) в DCM (100 мл) по каплям добавляли раствор 3-хлорпероксибензойной кислоты (9,3 г, 53,7 ммоль) в DCM (100 мл) при перемешивании на протяжении 20 мин. при 0°C, и полученную смесь перемешивали при 23°C в течение 16 часов. Осадок собирали путем фильтрования реакционной смеси и промывали с помощью DCM. Твердое вещество высушивали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения (2,4 г, 7,6 ммоль, выход для двух стадий 11%) в виде бесцветного твердого вещества. Масса/заряд=302/304 [M+H]+, Rt=0,53 мин. (UPLC 2 мин.), 1H ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ 8,63 (br s, 1H), 8,38 (d, J=2,3 Гц, 1H), 7,87 (s, 1H), 7,72 (s, 1H), 6,60-6,61 (m, 1H), 2,86 (s, 3H).A solution of 3-chloroperoxybenzoic acid (9.3 g, 53.7 mmol) in DCM (100 mL) with stirring for 20 min. at 0°C, and the resulting mixture was stirred at 23°C for 16 hours. The precipitate was collected by filtering the reaction mixture and washed with DCM. The solid was dried in vacuo to give the title compound (2.4 g, 7.6 mmol, 11% yield over two steps) as a colorless solid. Mass/charge=302/304 [M+H]+, Rt=0.53 min. (
(1-(4-Амино-5-бром-6-(1(1-(4-Amino-5-bromo-6-(1 HH -пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1-pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 HH -пиразол-4-ил)бороновая кислота-pyrazol-4-yl)boronic acid
К смеси 5-бром-2-(метилсульфинил)-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина (50 мг, 0,17 ммоль) и (1H-пиразол-4-ил)бороновой кислоты (18 мг, 0,17 ммоль) в DMF (1 мл) добавляли Cs2CO3 (54 мг, 0,17 ммоль) при 0°C. Полученную смесь перемешивали в течение 1 часа при 23°C. Реакционную смесь разбавляли водой и экстрагировали 3 раза с помощью EtOAc. Объединенные органические фазы промывали водой, затем солевым раствором, разделяли и фильтровали через разделитель фаз с Na2SO4 для обеспечения высушивания. Фильтрат концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения (30 мг, 0,066 ммоль, выход 40%), которое использовали на следующей стадии без дополнительный очистки. Масса/заряд=350/352 [M+H]+, Rt=0,55 мин. (UPLC 2 мин).To a mixture of 5-bromo-2-(methylsulfinyl)-6-(1 H -pyrazol-1-yl) pyrimidin-4-amine (50 mg, 0.17 mmol) and (1 H -pyrazol-4-yl) boronic acid (18 mg, 0.17 mmol) in DMF (1 ml) was added Cs 2 CO 3 (54 mg, 0.17 mmol) at 0°C. The resulting mixture was stirred for 1 hour at 23°C. The reaction mixture was diluted with water and extracted 3 times with EtOAc. The combined organic phases were washed with water then brine, separated and filtered through a phase separator with Na 2 SO 4 to ensure drying. The filtrate was concentrated in vacuo to give the title compound (30 mg, 0.066 mmol, 40% yield) which was used in the next step without further purification. Mass/charge=350/352 [M+H]+, Rt=0.55 min. (
1-(4-Амино-5-бром-6-(11-(4-Amino-5-bromo-6-(1 HH -пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1-pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 HH -пиразол-4-ол-pyrazol-4-ol
К энергично перемешиваемому раствору (1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ил)бороновой кислоты (30 мг, 0,066 ммоль) в THF (1 мл) добавляли 25 вес. % водного раствора NaOH (0,021 мл, 0,13 ммоль) и 30% водный раствор H2O2 (0,020 мл, 0,20 ммоль) при 0°C. Через 30 минут добавляли другую порцию 30% водного раствора H2O2 (0,020 мл, 0,20 ммоль), и смесь перемешивали при той же температуре в течение в общей сложности 2,5 часов. Реакцию гасили с помощью насыщенного водного раствора NH4Cl, затем разбавляли водой и экстрагировали 4 раза с помощью DCM и 3 раза с помощью смеси 4/1 DCM/MeOH. Объединенные органические фазы фильтровали через разделитель фаз для обеспечения высушивания, и фильтрат концентрировали in vacuo. Неочищенный продукт абсорбировали на Isolute и очищали с помощью колоночной хроматографии (ISCO, 12 г колонка с диоксидом кремния RediSep, скорость потока: 30 мл/мин, растворитель: CH2Cl2:MeOH, начиная от 1:0, время удержания 3 мин, затем до 96:4 на протяжении 25 мин). Фракции продукта объединяли и концентрировали in vacuo с получением указанного в заголовке соединения (14 мг, 0,040 ммоль, выход 60%) в виде бесцветного твердого вещества. Масса/заряд=322/324 [M+H]+, Rt=0,58 мин. (UPLC 2 мин); Rt=2,27 мин; чистота при 254 нм: >95% (UPLC 10 мин), 1H ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ 9,23 (br s, 1H), 8,44 (d, J=2,5 Гц, 1H), 8,32 (br s, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,90-7,81 (m, 1H), 7,46 (br s, 2H), 6,63-6,50 (m, 1H).To a vigorously stirred solution of (1-(4-amino-5-bromo-6-( 1H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl) -1H- pyrazol-4-yl)boronic acid (30 mg, 0.066 mmol) in THF (1 ml) was added 25 wt. % NaOH aqueous solution (0.021 ml, 0.13 mmol) and 30% H 2 O 2 aqueous solution (0.020 ml, 0.20 mmol) at 0°C. After 30 minutes, another portion of 30% aqueous H 2 O 2 solution (0.020 ml, 0.20 mmol) was added and the mixture was stirred at the same temperature for a total of 2.5 hours. The reaction was quenched with saturated aqueous NH 4 Cl, then diluted with water and extracted 4 times with DCM and 3 times with 4/1 DCM/MeOH. The combined organic phases were filtered through a phase separator to ensure drying, and the filtrate was concentrated in vacuo . The crude product was absorbed onto Isolute and purified by column chromatography (ISCO, 12 g RediSep silica column, flow rate: 30 ml/min, eluent: CH 2 Cl 2 :MeOH, starting at 1:0, retention time 3 min, then to 96:4 for 25 minutes). Product fractions were combined and concentrated in vacuo to give the title compound (14 mg, 0.040 mmol, 60% yield) as a colorless solid. Mass/charge=322/324 [M+H]+, Rt=0.58 min. (
В качестве альтернативы 6-хлор-2-(метилтио)пиримидин-4-амин можно вводить в реакцию сначала с пиразолом в присутствии основания с получением 2-(метилтио)-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина с последующей обработкой с помощью NBS с получением 5-бром-2-(метилтио)-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина.Alternatively, 6-chloro-2-(methylthio)pyrimidin-4-amine can be reacted first with pyrazole in the presence of a base to give 2-(methylthio)-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4 -amine followed by treatment with NBS to give 5-bromo-2-(methylthio)-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine.
Пример 1A. Получение 1-(6-амино-5-бром-2-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-ил)-1H-пиразол-4-олаExample 1A. Preparation of 1-(6-amino-5-bromo-2-(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-yl)-1H-pyrazol-4-ol
5-Бром-6-хлор-2-(метилсульфинил)пиримидин-4-амин5-Bromo-6-chloro-2-(methylsulfinyl)pyrimidine-4-amine
К раствору 13 г 5-бром-6-хлор-2-(метилтио)пиримидин-4-амина (52 ммоль) в 450 мл DCM медленно по каплям добавляли 13 г (57 ммоль) м-хлорпербензойной кислоты (77%) (Sigma-Aldrich), растворенной в 100 мл DCM. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Образованный белый осадок фильтровали, промывали несколько раза с помощью DCM и высушивали. На данной стадии получали 14 г (99%) указанного в заголовке соединения. Масса/заряд=270/272 [M+H]+, Rt=0,56 мин. (UPLC 2 мин), 1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 8,17 (d, 2H), 2,78 (s, 3H).To a solution of 13 g of 5-bromo-6-chloro-2-(methylthio)pyrimidine-4-amine (52 mmol) in 450 ml of DCM was added slowly dropwise 13 g (57 mmol) of m-chloroperbenzoic acid (77%) (Sigma -Aldrich) dissolved in 100 ml DCM. The solution was stirred at room temperature for 1 hour. The white precipitate formed was filtered, washed several times with DCM and dried. At this stage, 14 g (99%) of the title compound was obtained. Mass/charge=270/272 [M+H]+, Rt=0.56 min. (
5-Бром-6-хлор-2-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амин5-Bromo-6-chloro-2-(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine
2 г (7,4 ммоль) 5-бром-6-хлор-2-(метилсульфинил)пиримидин-4-амина суспендировали в 30 мл DMF. К данной суспензии добавляли 0,5 г (7,4 ммоль) 1H-пиразола и 1,5 г (4,4 ммоль) карбоната цезия. Реакционную смесь энергично перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Раствор выливали на 200 мл холодной воды. Образованный осадок фильтровали, промывали с помощью холодной воды и высушивали. Требуемый продукт получали в виде белого твердого вещества (1,5 г, 72%). Масса/заряд=274/276 [M+H]+, Rt=0,80 мин. (UPLC 2 мин), 1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 8,44 (d, 1H), 8,15 (d, 2H), 7,81 (d, 1H), 6,56 (dd, 1H).2 g (7.4 mmol) of 5-bromo-6-chloro-2-(methylsulfinyl)pyrimidin-4-amine was suspended in 30 ml of DMF. To this suspension was added 0.5 g (7.4 mmol) of 1H-pyrazole and 1.5 g (4.4 mmol) of cesium carbonate. The reaction mixture was vigorously stirred at room temperature for 10 minutes. The solution was poured into 200 ml of cold water. The precipitate formed was filtered, washed with cold water and dried. The desired product was obtained as a white solid (1.5 g, 72%). Mass/charge=274/276 [M+H]+, Rt=0.80 min. (
(1-(6-Амино-5-бром-2-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-ил)-1H-пиразол-4-ил)бороновая кислота(1-(6-Amino-5-bromo-2-(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-yl)-1H-pyrazol-4-yl)boronic acid
Смесь 0,10 г (0,36 ммоль) 5-бром-6-хлор-2-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина, 0,14 г (0,73 ммоль) 4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1H-пиразола и 0,12 г (0,36 ммоль) карбоната цезия в 10 мл ацетонитрила перемешивали в течение 4 ч при 60°C в герметично закрытой стеклянной пробирке. Затем растворитель удаляли с использованием пониженного давления. Полученное твердое вещество промывали эфиром/пентаном и высушивали. Смесь бороновой кислоты и сложного эфира бороновой кислоты применяли на следующей стадии без дополнительной очистки.A mixture of 0.10 g (0.36 mmol) 5-bromo-6-chloro-2-(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine, 0.14 g (0.73 mmol) 4-(4 ,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-1H-pyrazole and 0.12 g (0.36 mmol) of cesium carbonate in 10 ml of acetonitrile were stirred for 4 h at 60° C in a hermetically sealed glass tube. The solvent was then removed using reduced pressure. The resulting solid was washed with ether/pentane and dried. A mixture of boronic acid and ester of boronic acid was used in the next step without further purification.
1-(6-Амино-5-бром-2-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-ил)-1H-пиразол-4-ол1-(6-Amino-5-bromo-2-(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-yl)-1H-pyrazol-4-ol
К раствору (1-(6-амино-5-бром-2-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-ил)-1H-пиразол-4-ил)бороновой кислоты или 5-бром-2-(1H-пиразол-1-ил)-6-(4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина в THF (2,5 мл), охлажденному до 0°C, добавляли 2 мл 1 н. NaOH и H2O2 (30%) (0,23 мл, 2,32 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакционную смесь подкисляли до pH 3-4 путем добавления 1 н. HCl, экстрагировали с помощью этилацетата, и высушивали над безводным Na2SO4, и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали посредством колоночной хроматографии на силикагеле с применением DCM-MeOH (2-5%). Масса/заряд=322/324 [M+H]+, Rt=0,58 мин. (UPLC 2 мин); 1H ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ 9,18 (br s, 1H), 8,57-8,78 (m, 1H), 8,29 (br s, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,40 (br s, 1H), 6,55 (s, 1H).To a solution of (1-(6-amino-5-bromo-2-(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-yl)-1H-pyrazol-4-yl)boronic acid or 5-bromo-2-( 1H-pyrazol-1-yl)-6-(4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4- amine in THF (2.5 ml), cooled to 0°C, was added 2 ml of 1N. NaOH and H 2 O 2 (30%) (0.23 ml, 2.32 mmol). The mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. The reaction mixture was acidified to pH 3-4 by adding 1 N. HCl, extracted with ethyl acetate, and dried over anhydrous Na 2 SO 4 and concentrated in vacuo. The crude product was purified by silica gel column chromatography using DCM-MeOH (2-5%). Mass/charge=322/324 [M+H]+, Rt=0.58 min. (
Пример 2. Выделение/характеристика метаболита 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина. Идентификация метаболитов в микросомах крысы, собаки и человека in vitro с применением жидкостной хроматографии и масс-спектрометрииExample 2 Isolation/Characterization of the Metabolite of 5-bromo-2,6-di(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine. Identification of metabolites in rat, dog and human microsomes in vitro using liquid chromatography and mass spectrometry
СокращенияAbbreviations
ACN: ацетонитрилACN: acetonitrile
CC: калибровочная криваяCC: calibration curve
IS: внутренний стандартIS: internal standard
DMSO: диметилсульфоксидDMSO: dimethyl sulfoxide
MRM: мониторинг множественных реакцийMRM: Multiple Reaction Monitoring
NADH: никотинамидадениндинуклеотидфосфат (восстановленный)NADH: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced)
об/мин: оборотов в минуту.rpm: revolutions per minute.
Микросомы печениliver microsomes
Микросомы печени крысы (самец, объединенные, Sprague Dawley)Rat liver microsomes (male, pooled, Sprague Dawley)
Источник: XenoTech, LLC (Канзас, США)Source: XenoTech, LLC (Kansas, USA)
Содержание белка: 20 мг/млProtein content: 20mg/ml
Номер по каталогу: R I 000, номер партии: 0710623Part number: R I 000, lot number: 0710623
Микросомы печени собаки (самец, объединенные, бигль)Canine liver microsomes (male, pooled, beagle)
Источник: XenoTech, LLC (Канзас, США)Source: XenoTech, LLC (Kansas, USA)
Содержание белка: 20 мг/млProtein content: 20mg/ml
Номер по каталогу: D I 000, номер партии: 0810143Catalog number: D I 000, batch number: 0810143
Микросомы печени человека (смесь полов, объединенные)Human liver microsomes (mix of sexes, pooled)
Источник: XenoTech, LLC (Канзас, США)Source: XenoTech, LLC (Kansas, USA)
Содержание белка: 20 мг/млProtein content: 20mg/ml
Номер по каталогу: H061 0, номер партии: 101042Part number: H061 0, lot number: 101042
Исходные растворы и реагентыStock solutions and reagents
Тестируемое соединениеConnection under test
Получали 2 мМ и 0,2 мМ исходные растворы 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина в DMSO для инкубаций in vitro. Конечное содержание органического вещества при инкубациях микросом печени составляло 0,5%.Received 2 mm and 0.2 mm stock solutions of 5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine in DMSO for in vitro incubations. The final content of organic matter during incubation of liver microsomes was 0.5%.
Раздельно получали 2,5 мМ исходный раствор 1-(6-амино-5-бром-2-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-ил)-1H-пиразол-4-ола и 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-ил)-1H-пиразол-6-ола в DMSO. Исходные растворы дополнительно разбавляли в ацетонитриле с получением концентрации 1 мкМ 1-(6-амино-2-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-ил)-1H-пиразол-4-ола и 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-ил)-1H-пиразол-6-ола для проведения хроматографических анализов.A 2.5 mM stock solution of 1-(6-amino-5-bromo-2-( 1H- pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-yl)-1H - pyrazol-4-ol and 1-( 4-amino-5-bromo-6-(1H - pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-yl) -1H- pyrazol-6-ol in DMSO. The stock solutions were further diluted in acetonitrile to obtain a concentration of 1 μM 1-(6-amino-2-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-yl)-1 H -pyrazol-4-ol and 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-yl)-1 H -pyrazol-6-ol for chromatographic analyses.
Получали 0,1 мМ исходный раствор диклофенака и верапамила в DMSO для инкубаций in vitro. Конечное содержание органического вещества при инкубациях микросом печени составляло 0,5%.A 0.1 mM stock solution of diclofenac and verapamil in DMSO was prepared for in vitro incubations. The final content of organic matter during incubation of liver microsomes was 0.5%.
Инкубации микросом Microsome incubation in vitroin vitro
Микросомальный белок печени (25 мкл для 0,5 мг/мл; 15 мкл для 0,3 мг/мл), NADPH (100 мкл, в конечной концентрации 2 мМ) и фосфатный буфер (870 мкл для 0,5 мг/мл; 880 мкл для 0,3 мг/мл) инкубировали в микроцентрифужной пробирке в орбитальном шейкере-инкубаторе в течение 10 мин, поддерживая температуру на уровне 37°C. Реакции инициировали путем добавления 5 мкл 2 мМ и 0,2 мМ 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина (в конечной концентрации 10 мкМ для 0,5 мг/мл белка; в конечной концентрации 1 мкМ для 0,3 мг/мл белка; с конечной концентрацией DMSO 0,5%) и образцы инкубировали при 37°C. Аликвоты (200 мкл) отбирали из реакционной пробирки через 0, 60 и 120 минут, и реакцию гасили путем добавления 100 мкл ацетонитрила. Реакции проводили в двух повторностях. Подвергнутые гашению образцы центрифугировали при 14000 об/мин (примерно 21000g) в течение 10 минут (Eppendorf Centrifuge 5810 R), и супернатант анализировали с помощью LCMS/MS.Liver microsomal protein (25 µl for 0.5 mg/ml; 15 µl for 0.3 mg/ml), NADPH (100 µl, at a final concentration of 2 mM) and phosphate buffer (870 µl for 0.5 mg/ml; 880 μl for 0.3 mg/ml) were incubated in a microcentrifuge tube in an orbital shaker-incubator for 10 min, maintaining the temperature at 37°C. Reactions were initiated by adding 5 µl of 2 mM and 0.2 mM 5-bromo-2,6-di(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine (at a final concentration of 10 µM for 0.5 mg/ml protein ; at a final concentration of 1 μM for 0.3 mg/ml of protein; with a final concentration of DMSO 0.5%) and the samples were incubated at 37°C. Aliquots (200 µl) were taken from the reaction tube at 0, 60 and 120 minutes and the reaction was quenched by adding 100 µl of acetonitrile. Reactions were carried out in duplicate. The quenched samples were centrifuged at 14,000 rpm (approximately 21,000 g) for 10 minutes (Eppendorf Centrifuge 5810 R) and the supernatant analyzed by LCMS/MS.
Контрольные инкубации (без добавления NADPH) и холостые инкубации (без добавления тестируемого соединения) проводили в одной повторности для каждого вида. Данные образцы отбирали через 0 и 120 мин и гасили с применением ацетонитрила. Супернатант анализировали на предмет наличия какой-либо не связанной с микросомами деградации и матричного влияния. В качестве положительного контроля применяли диклофенак в микросомах печени крысы и человека и верапамил в микросомах печени собаки. Эксперименты в отношении реакции и контроля проводили в одной повторности. Данные в отношении метаболического обмена диклофенака и верапамила совпадали с полученными в лаборатории ретроспективными данными.Control incubations (no NADPH added) and blank incubations (no test compound added) were performed in single replication for each species. These samples were taken at 0 and 120 min and quenched using acetonitrile. The supernatant was analyzed for any non-microsomal degradation and matrix influence. Diclofenac in rat and human liver microsomes and verapamil in dog liver microsomes were used as positive controls. Reaction and control experiments were performed in one replicate. Data on the metabolic metabolism of diclofenac and verapamil were consistent with retrospective data obtained in the laboratory.
Аналитические способы и параметры оборудованияAnalytical methods and equipment parameters
Образцы обрабатывали с применением способа осаждения белков и затем анализировали с использованием линейного градиента с временем анализа 28 мин. посредством HPLC с тандемной масс-спектрометрией (масс-спектрометр API 4000). Каждый образец вводили и сканировали по отдельности в отношении спектров Q1 (MH+/MH-) и MS/MS.Samples were processed using a protein precipitation method and then analyzed using a linear gradient with an analysis time of 28 minutes. by HPLC with tandem mass spectrometry (API 4000 mass spectrometer). Each sample was injected and scanned individually for Q1 spectra(MH+/MH-) and MS/MS.
Пики различных возможных метаболитов идентифицировали по сканограмме Q1 после оценивания матричного влияния с применением холостых образцов без тестируемого соединения, и подтверждение осуществляли исходя из спектра фрагментации (по сканограмме MSIMS). Краткое описание аналитического способа представлено в таблице 9.Peaks of various possible metabolites were identified from the Q1 scan after matrix influence was evaluated using blanks without test compound, and confirmation was made from the fragmentation spectrum (MSIMS scan). A brief description of the analytical method is presented in table 9.
Таблица 9. Условия проведения хроматографии и масс-спектрометрииTable 9. Chromatography and Mass Spectrometry Conditions
Время анализаFlow rate
Analysis time
(мин)
0,01
5
23
24
28Time
(min)
0.01
5
23
24
28
95
95
5
95
9580% 5 mM ammonium formate (0.05% formic acid)+20% ACN
95
95
5
95
95
5
5
95
5
520% 5 mM ammonium formate (0.05% formic acid)+80% ACN
5
5
95
5
5
Модифицированный аналитический способModified analytical method
Также разрабатывали альтернативный вариант аналитического способа для увеличения времени удержания и проведения оценки других метаболитов, наряду с идентифицированным метаболитом M-1. Проводили совместную хроматографию водных растворов 1-(6-амино-5-бром-2-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-ил)-1H-пиразол-4-ола и 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола (1 мкМ) с инкубированными in vitro образцами, применяя модифицированный аналитический способ для подтверждения идентичности. Краткое описание модифицированного способа представлено в таблице 10.Also developed an alternative analytical method to increase the retention time and evaluate other metabolites, along with the identified metabolite M-1. Joint chromatography of aqueous solutions of 1-(6-amino-5-bromo-2-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-yl)-1 H -pyrazol-4-ol and 1-(4-amino -5-bromo-6-( 1H- pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl) -1H -pyrazol-4-ol (1 μM) with in vitro incubated samples using a modified analytical method to confirm identity. A brief description of the modified method is presented in Table 10.
Таблица 10. Модифицированные условия проведения хроматографии и масс-спектрометрииTable 10. Modified conditions for chromatography and mass spectrometry
Время анализаFlow rate
Analysis time
(мин.)
0,01
5
23
24
28Time
(min.)
0.01
5
23
24
28
95
95
5
95
950.1% formic acid in water.
95
95
5
95
95
5
5
95
5
50.1% formic acid in ACN
5
5
95
5
5
Определение массового баланса в микросомах печени человекаMass balance determination in human liver microsomes
Исходный раствор 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина и 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола подвергали серийному разбавлению в DMSO с получением растворов добавок в концентрациях 1, 0,5 и 0,25 мМ и 0,5, 0,25 и 0,125 мМ соответственно.Stock solution of 5-bromo-2,6-di( 1H- pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine and 1-(4-amino-5-bromo-6-(1H - pyrazol-1-yl) pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol was subjected to serial dilution in DMSO to obtain additive solutions at concentrations of 1, 0.5 and 0.25 mm and 0.5, 0.25 and 0.125 mm, respectively.
Калибровочные стандарты 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина и 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола получали путем добавления 5 мкл соответствующих растворов добавок в 995 мкл инкубационного буфера с получением 10, 5, 2,5 и 1,25 мкМ образцов для 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина и 5, 2,5, 1,25 и 0,625 мкМ образцов для 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола.Calibration standards 5-bromo-2,6-di( 1H- pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine and 1-(4-amino-5-bromo-6-(1H - pyrazol-1-yl) pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol was prepared by adding 5 µl of the appropriate additive solutions to 995 µl of incubation buffer to give 10, 5, 2.5 and 1.25 µM samples for 5-bromo-2, 6-di( 1H- pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine and 5, 2.5, 1.25, and 0.625 µM samples for 1-(4-amino-5-bromo-6-( 1H - pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol.
200 мкл аликвоту таких образцов с добавкой 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина и 1-(6-амино-5-бром-2-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-ил)-1H-пиразол-4-ола разбавляли с помощью 100 мкл ацетонитрила. Аликвоту (25 мкл) данных образцов дополнительно разбавляли с помощью 100 мкл внутреннего стандарта (галоперидол, 1 мкг/мл в ацетонитриле).200 µl aliquot of these samples supplemented with 5-bromo-2,6-di( 1H- pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine and 1-(6-amino-5-bromo-2-( 1H- pyrazole -1-yl)pyrimidin-4-yl)-1 H -pyrazol-4-ol was diluted with 100 μl of acetonitrile. An aliquot (25 μl) of these samples was further diluted with 100 μl internal standard (haloperidol, 1 μg/ml in acetonitrile).
Инкубационные образцы также получали аналогично получению калибровочных стандартов путем добавления 25 мкл подвергнутого гашению образца с 100 мкл внутреннего стандарта.Incubation samples were also prepared similarly to the preparation of calibration standards by adding 25 µl of quenched sample with 100 µl of internal standard.
Затем проводили количественное определение инкубационных образцов отдельно для 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина иThe incubation samples were then quantified separately for 5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine and
1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола в MRM-режиме, а подробное описание способа представлено в таблице 11.1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol in MRM mode, and a detailed description of the method is presented in the table eleven.
Таблица 11. Условия проведения хроматографии и масс-спектрометрии при MRM-анализеTable 11. Chromatography and Mass Spectrometry Conditions for MRM Analysis
Время анализаFlow rate
Analysis time
Результатыresults
Образцы in vitro оценивали в отношении наличия метаболитов. Показатели в отношении MH+ (Q I) и дочерних ионов (MS/MS) при различном времени удерживания для возможных метаболитов 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина со спектром фрагментации представлены в таблице 1 и ниже. In vitro samples were evaluated for the presence of metabolites. The values for MH+ (QI) and daughter ions (MS/MS) at various retention times for possible metabolites of 5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine with a fragmentation spectrum are presented in table 1 and below.
Таблица 1. Спектр фрагментации для исходного соединения (5-бром-2,6-ди(1Table 1. Fragmentation spectrum for the starting compound (5-bromo-2,6-di(1 HH -пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина)-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine) и его метаболитовand its metabolites
Обобщенные данные в отношении предполагаемых метаболитов 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина, обнаруженных у различных видов, представлены в таблице 2.A summary of the putative 5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine metabolites found in various species is summarized in Table 2.
Таблица 2. Обобщенные данные в отношении обнаруженных метаболитов 5-бром-2,6-ди(1Table 2. Summarized data on the detected metabolites of 5-bromo-2,6-di(1 HH -пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine
(M)5-Bromo-2,6-di(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine
(M)
Микросомы печени собаки
Микросомы печени человекаRat liver microsomes
Canine liver microsomes
Human liver microsomes
X
XX
X
X
X
XX
X
X
X обозначает наличие.X stands for presence.
Относительное содержание исходного соединения и его метаболита в образцах микросом представлено в таблице 3.The relative content of the parent compound and its metabolite in microsome samples is presented in Table 3.
Таблица 3. Относительное содержание 5-бром-2,6-ди(1Table 3. Relative content of 5-bromo-2,6-di(1 HH -пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина (10 мкМ) и его метаболитов, обнаруженных в микросомах печени с применением MRM-анализа-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine (10 μM) and its metabolites detected in liver microsomes using MRM analysis
M-ISource connection
Н. о.100
But.
Н. о.100
But.
0,0g100*
0.0g
0,0674
0.06
0,13100*
0.13
0,1452
0.14
M-ISource connection
0,01100
0.01
0,01100
0.01
0,5684
0.56
0,6794
0.67
0,9588
0.95
1,52100*
1.52
M-ISource connection
0,01100
0.01
0,02100
0.02
0,9794
0.97
0,9385
0.93
1,8484
1.84
1,7874
1.78
Исходное соединение представляет собой 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-аминThe starting compound is 5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine
Н.о.: не обнаружено; относительное содержание исходного соединения и его метаболитов являются количественными показателями; расчеты производились с учетом того, что эффективность ионизации для исходного соединения и его метаболитов является сходной; * значения % оставшегося количества, составляющие более 100%, принимались за 100 в расчетах.N.d.: not found; the relative content of the parent compound and its metabolites are quantitative indicators; calculations were made taking into account that the ionization efficiency for the parent compound and its metabolites is similar; * values of % of the remaining amount, which are more than 100%, were taken as 100 in the calculations.
Экстракционные ионные хроматограммы (XIC), Q1- и MS/MS-спектры водного стандарта и отдельных образцов микросом представлены на фигурах 1-3.Extraction ion chromatograms (XIC), Q1 and MS/MS spectra of the water standard and individual microsome samples are shown in Figures 1-3.
Метаболит монооксигенации (M-I, 6,22 мин) образовывался в микросомах печени крысы, собаки и человека. Процентная доля метаболита по отношению к исходному соединению (5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амину) являлась равномерно низкой. Однако данный анализ предполагает одинаковую эффективность ионизации как для метаболита, так и для исходного соединения (таблица 3).The monooxygenation metabolite (MI, 6.22 min) was generated in rat, dog, and human liver microsomes. The percentage of the metabolite relative to the parent compound (5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine) was uniformly low. However, this analysis assumes the same ionization efficiency for both the metabolite and the parent compound (Table 3).
Независимо исследовали зависимую от времени убыль 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина (1 мкМ), диклофенака (положительный контроль для человека и крысы, 0,5 мкМ), верапамила (положительный контроль для собаки, 0,5 мкМ) в микросомах печени (концентрация белка 0,3 мг/мл). Результаты представлены в таблице 4 и таблице 5.The time-dependent loss of 5-bromo-2,6-di(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine (1 µM), diclofenac (positive control for human and rat, 0.5 µM), verapamil (positive control for dog, 0.5 µM) in liver microsomes (protein concentration 0.3 mg/ml). The results are presented in table 4 and table 5.
Таблица 4. Зависимая от времени убыль 5-бром-2,6-ди(1Table 4. Time-dependent loss of 5-bromo-2,6-di(1 HH -пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина (1 мкМ) при инкубации в микросомах печени человека, собаки и крысы (0,3 мг/мл)-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine (1 μM) when incubated in human, dog and rat liver microsomes (0.3 mg/ml)
условияexperimental
conditions
(минуты)Time
(minutes)
печени человека
% оставшегося количестваMicrosomes
human liver
% remaining
% оставшегося количестваCanine liver microsomes
% remaining
% оставшегося количестваRat liver microsomes
% remaining
60
1200
60
120
40
24100
40
24
48
22100
48
22
50
17100
50
17
52
17100
52
17
78
65100
78
65
76
52100
76
52
1200
120
97100
97
100100
100
100100
100
(холостой)Control without parent compound
(idle)
1200
120
Исходное соединение представляет собой 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амин.The starting compound is 5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine.
Значения % оставшегося количества, составляющие более 100%, принимались за 100 в расчетах.% Remaining values greater than 100% were taken as 100 in the calculations.
Таблица 5. Зависимая от времени убыль положительных контролей (0,5 мкМ) при инкубации в микросомах печени (0,3 мг/мл)Table 5 Time-dependent loss of positive controls (0.5 μM) upon incubation in liver microsomes (0.3 mg/mL)
Положительный контроль ->Kinds
Positive control ->
(диклофенак)Human
(diclofenac)
(диклофенак)Rat
(diclofenac)
(верапамил)Dog
(verapamil)
60
1200
60
120
100
6100
100
6
12
1100
12
1
9
1100
9
1
1200
120
98100
98
100100
100
94100
94
Было обнаружено, что при инкубации контрольные образцы 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина (без добавления NADPH) сохраняли стабильность вплоть до 120 мин., указывая на отсутствие метаболизма, не опосредованного CYP. Холостые образцы при инкубации (без добавления тестируемого соединения) не продемонстрировали какого-либо матричного влияния (таблица 4).Upon incubation, 5-bromo-2,6-di( 1H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine controls (without NADPH addition) were found to be stable for up to 120 minutes, indicating no metabolism, not mediated by CYP. Blank samples upon incubation (without test compound addition) did not show any matrix effect (Table 4).
Относительный уровень метаболизма 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина при концентрациях 1 мкМ и концентрациях микросомального белка 0,3 мг/мл у тестированных видов составлял DLM>HLM>RLM. Результаты представлены в таблице 6.Relative metabolic rate of 5-bromo-2,6-di(1H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine at concentrations of 1 μM and microsomal protein concentrations of 0.3 mg/ml in the tested species was DLM>HLM>RLM. The results are presented in table 6.
Таблица 6. Относительный уровень метаболизма 5-бром-2,6-ди(1Table 6. Relative metabolic rate of 5-bromo-2,6-di(1 HH -пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина у различных видов-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine in various species
(мг/мл)Final protein concentration
(mg/ml)
Собака
ЧеловекRat
Dog
12 6
16 260 N.A.
12 6
16 26
1,2 0,6
1,6 2,60 N.A.
1.2 0.6
1.6 2.6
Собака
ЧеловекRat
Dog
Human
83 83
76 7835 48
83 83
76 78
0,83 0,83
0,76 0,780.35 0.48
0.83 0.83
0.76 0.78
* Концентрацию метаболизированного анализируемого соединения (мкМ) рассчитывали с применением следующей формулы:* The concentration of metabolized analyte (µM) was calculated using the following formula:
концентрация метаболизированного анализируемого соединения=(% метаболизированного количества через 120 мин X конечная концентрация исходного соединения)/100.concentration of metabolized analyte=(% metabolized at 120 minutes X final concentration of parent compound)/100.
Исходное соединения представляет собой 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-аминThe starting compound is 5-bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine
Синтезировали 1-(6-амино-5-бром-2-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-ил)-1H-пиразол-4-ол и 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ол. Структуры данных соединений представлены ниже.Synthesized 1-(6-amino-5-bromo-2-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-yl)-1 H -pyrazol-4-ol and 1-(4-amino-5-bromo -6-(1H - pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1H - pyrazol-4-ol. The structures of these compounds are shown below.
Затем проводили идентификацию метаболита, обнаруженного в инкубированных образцах микросом человека, посредством совместной хроматографии с соединениями, представляющими собой 1-(6-амино-5-бром-2-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-ил)-1H-пиразол-4-ол и 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ол, при мониторинге в Q1-режиме. Результаты совместной хроматографии подтвердили, что идентифицированный метаболит (M-I), обнаруженный в образцах микросом, представляет собой 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ол. Хроматограмма представлена на фигуре 4.The metabolite found in the incubated human microsome samples was then identified by co-chromatography with compounds representing 1-(6-amino-5-bromo-2-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-yl)- 1 H -pyrazol-4-ol and 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol, while monitoring in Q1 mode. The results of co-chromatography confirmed that the identified metabolite (MI) found in the microsome samples is 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol. The chromatogram is shown in figure 4.
5-Бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амин и его метаболит (M-I, 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ол) количественно определяли в инкубированных образцах микросом печени человека в MRM-режиме с применением стандарта в виде 4-точечной калибровочной кривой. Процентная доля метаболита M-I в микросомах печени человека составила приблизительно 15-20% после 60 минут инкубации с исходным соединением. Массовый баланс, составляющий приблизительно 95-107%, был достигнут для уровня метаболизма в микросомах печени человека. Результаты представлены в таблице 7. Обобщенные данные в отношении калибровочной кривой для 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина и 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-ола представлены в таблице 8.5-Bromo-2,6-di(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine and its metabolite (MI, 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1 -yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol) was quantified in incubated human liver microsome samples in MRM mode using a 4-point standard curve standard. The percentage of the MI metabolite in human liver microsomes was approximately 15-20% after 60 minutes of incubation with the parent compound. A mass balance of approximately 95-107% has been achieved for the metabolic rate in human liver microsomes. The results are shown in Table 7. Summarized calibration curve data for 5-bromo-2,6-di( 1H- pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine and 1-(4-amino-5-bromo-6 -(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol are shown in Table 8.
Таблица 7. Массовый баланс для метаболизма 5-бром-2,6-ди(1Table 7. Mass balance for the metabolism of 5-bromo-2,6-di(1 HH -пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine в микросомах печени человека с применением MRM-анализаin human liver microsomes using MRM analysis
(мин.)Time
(min.)
Концентрация
(мкМ)Source connection
Concentration
(µM)
Концентрация (мкМ)MI
Concentration (µM)
соединения% remaining original
connections
M-I% detected
MI
30
600
thirty
60
11,34a
10,47a 11.78a
11.34a
10.47a
1,29
2,230
1.29
2.23
96,26
88100
96.26
88
10,95
18,930
10.95
18.93
107,22
107,81N. d.
107.22
107.81
30
600
thirty
60
10,09a
9,18 11.54a
10.09a
9.18
0,92
1,740
0.92
1.74
87,44
79,55100
87.44
79.55
7,97
15,080
7.97
15.08
95,41
94,63N. d.
95.41
94.63
Значения находятся в пределах +/- 20% от ULOQ (верхнего предела количественного определения).Values are within +/- 20% of ULOQ (upper limit of quantitation).
Таблица 8. Обобщенные данные в отношении калибровочной кривой для 5-бром-2,6-ди(1Table 8. Summary data for the calibration curve for 5-bromo-2,6-di(1 HH -пиразол-1-ил)пиримидин-4-амина и 1-(4-амино-5-бром-6-(1-pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine and 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 HH -пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1-pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 HH -пиразол-4-ола в микросомах печени человека-pyrazol-4-ol in human liver microsomes
ASTD
A
BSTD
B
CSTD
C
DSTD
D
(мкМ)Calc. conc.
(µM)
конц. (мкМ)Rated
conc. (µM)
(мкМ)Calc. conc.
(µM)
На долю метаболита M-I, образованного в микросомах печени человека, приходится 15-20% количества исходного соединения. Метаболит M-I, образованный у крысы и собаки, количественно не определяли, и, таким образом, уровень образования данного метаболита может быть выше или ниже, чем в микросомах печени человека.The metabolite M-I, formed in human liver microsomes, accounts for 15-20% of the amount of the original compound. The rat and dog metabolite M-I was not quantified, and thus the level of formation of this metabolite may be higher or lower than in human liver microsomes.
В заключение, 5-бром-2,6-ди(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-4-амин подвергается метаболизму по окислительному пути в микросомах протестированных доклинических видов и человека in vitro, и обнаруженный метаболит являлся идентичным 1-(4-амино-5-бром-6-(1H-пиразол-1-ил)пиримидин-2-ил)-1H-пиразол-4-олу, что было подтверждено посредством хроматографии.In conclusion, 5-bromo-2,6-di( 1H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-4-amine is metabolized by the oxidative pathway in microsomes of tested preclinical and human species in vitro , and the metabolite found was identical to 1-( 4-amino-5-bromo-6-(1 H -pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H -pyrazol-4-ol, which was confirmed by chromatography.
Пример 3. Анализ связывания радиолиганда с hA2A in vitroExample 3 In Vitro Radioligand Binding Assay to hA2A
Аффинность связывания соединения определяли путем радиолигандного анализа конкурентного связывания (RLB) с использованием [3H]-ZM241385 (ARC, кат. № ART0884) в качестве радиолиганда и мембран, полученных из клеток HEK-293, стабильно экспрессирующих аденозиновый рецептор A2a человека (Perkin Elmer RBHA2AM400UA), применяя 50 мМ Tris с pH 7,5, 1 мМ MgCl2, 0,1 мг/мл BSA, 0,2 Ед./мл аденозиндеаминазы в качестве буфера для анализа. Мембраны предварительно связывали с покрытыми агглютинином из проростков пшеницы (WGA) SPA-гранулами на основе силиката иттрия (YSI) (Perkin Elmer RPNQ0023) перед уравновешением с радиолигандом (2 нМ 3H-ZM241385, 0,5 мкг/лунка мембран с hA2A, 50 мкг/лунка YSI WGA, конечная концентрация) и диапазоном концентраций тестируемого соединения (конечная концентрация DMSO 0,3%) в конечном объеме 100 мкл. Неспецифическое связывание (NSB) определяли посредством 10 мкМ XAC. Применяли белые 384-луночные аналитические планшеты (Greiner № 781207). Аналитические планшеты инкубировали при комнатной температуре до установления равновесия (1,5 часа) перед осуществлением центрифугирования и подсчета в бета-сцинтилляционном счетчике (TopCount NXT) с регистрацией измерений в виде числа импульсов в минуту (имп./мин). Имп./мин преобразовывали в процент ингибирования с применением уравнения:The binding affinity of the compound was determined by a competition binding radioligand (RLB) assay using [3H]-ZM241385 (ARC, cat. no. ART0884) as the radioligand and membranes derived from HEK-293 cells stably expressing the human A2a adenosine receptor (Perkin Elmer RBHA2AM400UA ) using 50 mM Tris pH 7.5, 1 mM MgCl 2 , 0.1 mg/ml BSA, 0.2 U/ml adenosine deaminase as assay buffer. The membranes were pre-coupled with wheatgerm agglutinin (WGA) coated yttrium silicate (YSI) SPA beads (Perkin Elmer RPNQ0023) prior to equilibration with radioligand (2 nM 3H-ZM241385, 0.5 µg/well membranes with hA2A, 50 µg /well YSI WGA, final concentration) and the concentration range of the test compound (final concentration DMSO 0.3%) in a final volume of 100 μl. Non-specific binding (NSB) was determined by 10 μm XAC. White 384-well assay plates (Greiner no. 781207) were used. The assay plates were incubated at room temperature until equilibrated (1.5 hours) before being centrifuged and counted in a beta scintillation counter (TopCount NXT) and recorded as counts per minute (ppm). PPM was converted to percent inhibition using the equation:
где общее связывание (TB) представляет собой связывание в отсутствие конкурирующего соединения.where total binding (TB) is binding in the absence of a competing compound.
Значение IC50, полученное исходя из кривой концентрация-эффект, преобразовывали в константу ингибирования (Ki) с применением уравнения Ченга-Прусова.The IC 50 value obtained from the concentration-effect curve was converted to an inhibition constant (Ki) using the Cheng-Prusov equation.
Таблица 11. Значения Ki A2A человека для примера 1 Table 11 Human Ki A 2A Values for Example 1
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
<110> NOVARTIS AG<110> NOVARTIS AG
PALOBIOFARMA S.L. PALOBIOFARMA S.L.
<120> 1-(4-АМИНО-5-БРОМ-6-(1H-ПИРАЗОЛ-1-ИЛ)ПИРИМИДИН-2-ИЛ)-1H-ПИРАЗОЛ-4-ОЛ<120> 1-(4-AMINO-5-BROMO-6-(1H-PYRAZOL-1-YL)PYRIMIDIN-2-YL)-1H-PYRAZOL-4-OL
И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В ЛЕЧЕНИИ РАКА AND ITS USE IN CANCER TREATMENT
<130> PAT057566-WO-PCT<130> PAT057566-WO-PCT
<140> PCT/IB2018/050783<140> PCT/IB2018/050783
<141> 2018-02-08<141> 2018-02-08
<150> 62/457,219<150> 62/457.219
<151> 2017-02-10<151> 2017-02-10
<160> 63 <160> 63
<170> PatentIn версия 3.5<170> PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 5<211> 5
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 1<400> 1
Thr Tyr Trp Met His Thr Tyr Trp Met His
1 5 15
<210> 2<210> 2
<211> 17<211> 17
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 2<400> 2
Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe Lys Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Asn Asn
<210> 3<210> 3
<211> 8<211> 8
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 3<400> 3
Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr
1 5 15
<210> 4<210> 4
<211> 7<211> 7
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 4<400> 4
Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
1 5 15
<210> 5<210> 5
<211> 6<211> 6
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 5<400> 5
Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Tyr Pro Gly Thr Gly Gly
1 5 15
<210> 6<210> 6
<211> 117<211> 117
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 6<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30 20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45 35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Thr Arg Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Thr Arg Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 7<210> 7
<211> 351<211> 351
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полинуклеотид" polynucleotide"
<400> 7<400> 7
gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaagc ccggcgagtc actgagaatt 60gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaagc ccggcgagtc actgagaatt 60
agctgtaaag gttcaggcta caccttcact acctactgga tgcactgggt ccgccaggct 120agctgtaaag gttcaggcta caccttcact acctactgga tgcactgggt ccgccaggct 120
accggtcaag gcctcgagtg gatgggtaat atctaccccg gcaccggcgg ctctaacttc 180accggtcaag gcctcgagtg gatgggtaat atctaccccg gcaccggcgg ctctaacttc 180
gacgagaagt ttaagaatag agtgactatc accgccgata agtctactag caccgcctat 240240 gacgagaagt ttaagaatag agtgactatc accgccgata
atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtct actactgcac taggtggact 300atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtct actactgcac taggtggact 300
accggcacag gcgcctactg gggtcaaggc actaccgtga ccgtgtctag c 351accggcacag gcgcctactg gggtcaaggc actaccgtga ccgtgtctag c 351
<210> 8<210> 8
<211> 443<211> 443
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 8<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30 20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45 35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Thr Arg Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Thr Arg Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125 115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140 130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175 165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190 180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205 195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220 210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240 225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255 245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270 260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285 275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300 290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320 305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335 325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350 340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365 355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380 370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400 385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415 405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430 420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 435 440
<210> 9<210> 9
<211> 1329<211> 1329
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полинуклеотид" polynucleotide"
<400> 9<400> 9
gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaagc ccggcgagtc actgagaatt 60gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaagc ccggcgagtc actgagaatt 60
agctgtaaag gttcaggcta caccttcact acctactgga tgcactgggt ccgccaggct 120agctgtaaag gttcaggcta caccttcact acctactgga tgcactgggt ccgccaggct 120
accggtcaag gcctcgagtg gatgggtaat atctaccccg gcaccggcgg ctctaacttc 180accggtcaag gcctcgagtg gatgggtaat atctaccccg gcaccggcgg ctctaacttc 180
gacgagaagt ttaagaatag agtgactatc accgccgata agtctactag caccgcctat 240240 gacgagaagt ttaagaatag agtgactatc accgccgata
atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtct actactgcac taggtggact 300atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtct actactgcac taggtggact 300
accggcacag gcgcctactg gggtcaaggc actaccgtga ccgtgtctag cgctagcact 360accggcacag gcgcctactg gggtcaaggc actaccgtga ccgtgtctag cgctagcact 360
aagggcccgt ccgtgttccc cctggcacct tgtagccgga gcactagcga atccaccgct 420aagggcccgt ccgtgttccc cctggcacct tgtagccgga gcactagcga atccaccgct 420
gccctcggct gcctggtcaa ggattacttc ccggagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480gccctcggct gcctggtcaa ggattacttc ccggagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga cctccggagt gcacaccttc cccgctgtgc tgcagagctc cgggctgtac 540ggagccctga cctccggagt gcacaccttc cccgctgtgc tgcagagctc cgggctgtac 540
tcgctgtcgt cggtggtcac ggtgccttca tctagcctgg gtaccaagac ctacacttgc 600tcgctgtcgt cggtggtcac ggtgccttca tctagcctgg gtaccaagac ctacacttgc 600
aacgtggacc acaagccttc caacactaag gtggacaagc gcgtcgaatc gaagtacggc 660aacgtggacc acaagccttc caacactaag gtggacaagc gcgtcgaatc gaagtacggc 660
ccaccgtgcc cgccttgtcc cgcgccggag ttcctcggcg gtccctcggt ctttctgttc 720ccaccgtgcc cgccttgtcc cgcgccggag ttcctcggcg gtccctcggt ctttctgttc 720
ccaccgaagc ccaaggacac tttgatgatt tcccgcaccc ctgaagtgac atgcgtggtc 780ccaccgaagc ccaaggacac tttgatgatt tcccgcaccc ctgaagtgac atgcgtggtc 780
gtggacgtgt cacaggaaga tccggaggtg cagttcaatt ggtacgtgga tggcgtcgag 840840
gtgcacaacg ccaaaaccaa gccgagggag gagcagttca actccactta ccgcgtcgtg 900gtgcacaacg ccaaaaccaa gccgagggag gagcagttca actccactta ccgcgtcgtg 900
tccgtgctga cggtgctgca tcaggactgg ctgaacggga aggagtacaa gtgcaaagtg 960tccgtgctga cggtgctgca tcaggactgg ctgaacggga aggagtacaa gtgcaaagtg 960
tccaacaagg gacttcctag ctcaatcgaa aagaccatct cgaaagccaa gggacagccc 1020tccaacaagg gacttcctag ctcaatcgaa aagaccatct cgaaagccaa gggacagccc 1020
cgggaacccc aagtgtatac cctgccaccg agccaggaag aaatgactaa gaaccaagtc 1080cgggaacccc aagtgtatac cctgccaccg agcggaag aaatgactaa gaaccaagtc 1080
tcattgactt gccttgtgaa gggcttctac ccatcggata tcgccgtgga atgggagtcc 1140tcattgactt gccttgtgaa gggcttctac ccatcggata tcgccgtgga atgggagtcc 1140
aacggccagc cggaaaacaa ctacaagacc acccctccgg tgctggactc agacggatcc 1200aacggccagc cggaaaacaa ctacaagacc acccctccgg tgctggactc agacggatcc 1200
ttcttcctct actcgcggct gaccgtggat aagagcagat ggcaggaggg aaatgtgttc 1260ttcttcctct actcgcggct gaccgtggat aagagcagat ggcaggaggg aaatgtgttc 1260
agctgttctg tgatgcatga agccctgcac aaccactaca ctcagaagtc cctgtccctc 1320agctgttctg tgatgcatga agccctgcac aaccactaca ctcagaagtc cctgtccctc 1320
tccctggga 1329tccctggga 1329
<210> 10<210> 10
<211> 17<211> 17
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 10<400> 10
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Thr
<210> 11<210> 11
<211> 7<211> 7
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 11<400> 11
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5 15
<210> 12<210> 12
<211> 9<211> 9
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 12<400> 12
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5 15
<210> 13<210> 13
<211> 13<211> 13
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 13<400> 13
Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe
1 5 10 1 5 10
<210> 14<210> 14
<211> 3<211> 3
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 14<400> 14
Trp Ala Ser Trp Ala Ser
1 1
<210> 15<210> 15
<211> 6<211> 6
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 15<400> 15
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr
1 5 15
<210> 16<210> 16
<211> 113<211> 113
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 16<400> 16
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30 20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45 35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60 50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95 85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110 100 105 110
Lys Lys
<210> 17<210> 17
<211> 339<211> 339
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полинуклеотид" polynucleotide"
<400> 17<400> 17
gagatcgtcc tgactcagtc acccgctacc ctgagcctga gccctggcga gcgggctaca 60gagatcgtcc tgactcagtc acccgctacc ctgagcctga gccctggcga gcgggctaca 60
ctgagctgta aatctagtca gtcactgctg gatagcggta atcagaagaa cttcctgacc 120ctgagctgta aatctagtca gtcactgctg gatagcggta atcagaagaa cttcctgacc 120
tggtatcagc agaagcccgg taaagcccct aagctgctga tctactgggc ctctactaga 180tggtatcagc agaagcccgg taaagcccct aagctgctga tctactgggc ctctactaga 180
gaatcaggcg tgccctctag gtttagcggt agcggtagtg gcaccgactt caccttcact 240gaatcaggcg tgccctctag gtttagcggt agcggtagtg gcaccgactt caccttcact 240
atctctagcc tgcagcccga ggatatcgct acctactact gtcagaacga ctatagctac 300atctctagcc tgcagcccga ggatatcgct acctactact gtcagaacga ctatagctac 300
ccctacacct tcggtcaagg cactaaggtc gagattaag 339ccctacacct tcggtcaagg cactaaggtc gagattaag 339
<210> 18<210> 18
<211> 220<211> 220
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 18<400> 18
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30 20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45 35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60 50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95 85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110 100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125 115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140 130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175 165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190 180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205 195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220 210 215 220
<210> 19<210> 19
<211> 660<211> 660
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полинуклеотид" polynucleotide"
<400> 19<400> 19
gagatcgtcc tgactcagtc acccgctacc ctgagcctga gccctggcga gcgggctaca 60gagatcgtcc tgactcagtc acccgctacc ctgagcctga gccctggcga gcgggctaca 60
ctgagctgta aatctagtca gtcactgctg gatagcggta atcagaagaa cttcctgacc 120ctgagctgta aatctagtca gtcactgctg gatagcggta atcagaagaa cttcctgacc 120
tggtatcagc agaagcccgg taaagcccct aagctgctga tctactgggc ctctactaga 180tggtatcagc agaagcccgg taaagcccct aagctgctga tctactgggc ctctactaga 180
gaatcaggcg tgccctctag gtttagcggt agcggtagtg gcaccgactt caccttcact 240gaatcaggcg tgccctctag gtttagcggt agcggtagtg gcaccgactt caccttcact 240
atctctagcc tgcagcccga ggatatcgct acctactact gtcagaacga ctatagctac 300atctctagcc tgcagcccga ggatatcgct acctactact gtcagaacga ctatagctac 300
ccctacacct tcggtcaagg cactaaggtc gagattaagc gtacggtggc cgctcccagc 360ccctacacct tcggtcaagg cactaaggtc gagattaagc gtacggtggc cgctcccagc 360
gtgttcatct tcccccccag cgacgagcag ctgaagagcg gcaccgccag cgtggtgtgc 420gtgttcatct tcccccccag cgacgagcag ctgaagagcg gcaccgccag cgtggtgtgc 420
ctgctgaaca acttctaccc ccgggaggcc aaggtgcagt ggaaggtgga caacgccctg 480ctgctgaaca acttctaccc ccgggaggcc aaggtgcagt ggaaggtgga caacgccctg 480
cagagcggca acagccagga gagcgtcacc gagcaggaca gcaaggactc cacctacagc 540cagagcggca acagccagga gagcgtcacc gagcaggaca gcaaggactc cacctacagc 540
ctgagcagca ccctgaccct gagcaaggcc gactacgaga agcataaggt gtacgcctgc 600ctgagcagca ccctgaccct gagcaaggcc gactacgaga agcataaggt gtacgcctgc 600
gaggtgaccc accagggcct gtccagcccc gtgaccaaga gcttcaacag gggcgagtgc 660gaggtgaccc accagggcct gtccagcccc gtgaccaaga gcttcaacag gggcgagtgc 660
<210> 20<210> 20
<211> 113<211> 113
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 20<400> 20
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30 20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45 35 40 45
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60 50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95 85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110 100 105 110
Lys Lys
<210> 21<210> 21
<211> 339<211> 339
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полинуклеотид" polynucleotide"
<400> 21<400> 21
gagatcgtcc tgactcagtc acccgctacc ctgagcctga gccctggcga gcgggctaca 60gagatcgtcc tgactcagtc acccgctacc ctgagcctga gccctggcga gcgggctaca 60
ctgagctgta aatctagtca gtcactgctg gatagcggta atcagaagaa cttcctgacc 120ctgagctgta aatctagtca gtcactgctg gatagcggta atcagaagaa cttcctgacc 120
tggtatcagc agaagcccgg tcaagcccct agactgctga tctactgggc ctctactaga 180tggtatcagc agaagcccgg tcaagcccct agactgctga tctactgggc ctctactaga 180
gaatcaggcg tgccctctag gtttagcggt agcggtagtg gcaccgactt caccttcact 240gaatcaggcg tgccctctag gtttagcggt agcggtagtg gcaccgactt caccttcact 240
atctctagcc tggaagccga ggacgccgct acctactact gtcagaacga ctatagctac 300atctctagcc tggaagccga ggacgccgct acctactact gtcagaacga ctatagctac 300
ccctacacct tcggtcaagg cactaaggtc gagattaag 339ccctacacct tcggtcaagg cactaaggtc gagattaag 339
<210> 22<210> 22
<211> 220<211> 220
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 22<400> 22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30 20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45 35 40 45
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60 50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr
65 70 75 80 65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95 85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110 100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125 115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140 130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175 165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190 180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205 195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220 210 215 220
<210> 23<210> 23
<211> 660<211> 660
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полинуклеотид" polynucleotide"
<400> 23<400> 23
gagatcgtcc tgactcagtc acccgctacc ctgagcctga gccctggcga gcgggctaca 60gagatcgtcc tgactcagtc acccgctacc ctgagcctga gccctggcga gcgggctaca 60
ctgagctgta aatctagtca gtcactgctg gatagcggta atcagaagaa cttcctgacc 120ctgagctgta aatctagtca gtcactgctg gatagcggta atcagaagaa cttcctgacc 120
tggtatcagc agaagcccgg tcaagcccct agactgctga tctactgggc ctctactaga 180tggtatcagc agaagcccgg tcaagcccct agactgctga tctactgggc ctctactaga 180
gaatcaggcg tgccctctag gtttagcggt agcggtagtg gcaccgactt caccttcact 240gaatcaggcg tgccctctag gtttagcggt agcggtagtg gcaccgactt caccttcact 240
atctctagcc tggaagccga ggacgccgct acctactact gtcagaacga ctatagctac 300atctctagcc tggaagccga ggacgccgct acctactact gtcagaacga ctatagctac 300
ccctacacct tcggtcaagg cactaaggtc gagattaagc gtacggtggc cgctcccagc 360ccctacacct tcggtcaagg cactaaggtc gagattaagc gtacggtggc cgctcccagc 360
gtgttcatct tcccccccag cgacgagcag ctgaagagcg gcaccgccag cgtggtgtgc 420gtgttcatct tcccccccag cgacgagcag ctgaagagcg gcaccgccag cgtggtgtgc 420
ctgctgaaca acttctaccc ccgggaggcc aaggtgcagt ggaaggtgga caacgccctg 480ctgctgaaca acttctaccc ccgggaggcc aaggtgcagt ggaaggtgga caacgccctg 480
cagagcggca acagccagga gagcgtcacc gagcaggaca gcaaggactc cacctacagc 540cagagcggca acagccagga gagcgtcacc gagcaggaca gcaaggactc cacctacagc 540
ctgagcagca ccctgaccct gagcaaggcc gactacgaga agcataaggt gtacgcctgc 600ctgagcagca ccctgaccct gagcaaggcc gactacgaga agcataaggt gtacgcctgc 600
gaggtgaccc accagggcct gtccagcccc gtgaccaaga gcttcaacag gggcgagtgc 660gaggtgaccc accagggcct gtccagcccc gtgaccaaga gcttcaacag gggcgagtgc 660
<210> 24<210> 24
<211> 15<211> 15
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Artificial Sequence Description: Synthetic
олигонуклеотид" oligonucleotide"
<400> 24<400> 24
acctactgga tgcac 15acctactgga tgcac 15
<210> 25<210> 25
<211> 51<211> 51
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Artificial Sequence Description: Synthetic
олигонуклеотид" oligonucleotide"
<400> 25<400> 25
aatatctacc ccggcaccgg cggctctaac ttcgacgaga agtttaagaa t 51aatatctacc ccggcaccgg cggctctaac ttcgacgaga agtttaagaa t 51
<210> 26<210> 26
<211> 24<211> 24
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Artificial Sequence Description: Synthetic
олигонуклеотид" oligonucleotide"
<400> 26<400> 26
tggactaccg gcacaggcgc ctac 24tggactaccg gcacaggcgc ctac 24
<210> 27<210> 27
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Artificial Sequence Description: Synthetic
олигонуклеотид" oligonucleotide"
<400> 27<400> 27
ggctacacct tcactaccta c 21ggctacacct tcactaccta c 21
<210> 28<210> 28
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Artificial Sequence Description: Synthetic
олигонуклеотид" oligonucleotide"
<400> 28<400> 28
taccccggca ccggcggc 18
<210> 29<210> 29
<211> 51<211> 51
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Artificial Sequence Description: Synthetic
олигонуклеотид" oligonucleotide"
<400> 29<400> 29
aaatctagtc agtcactgct ggatagcggt aatcagaaga acttcctgac c 51aaatctagtc agtcactgct ggatagcggt aatcagaaga acttcctgac c 51
<210> 30<210> 30
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Artificial Sequence Description: Synthetic
олигонуклеотид" oligonucleotide"
<400> 30<400> 30
tgggcctcta ctagagaatc a 21tgggcctcta ctagagaatc a 21
<210> 31<210> 31
<211> 27<211> 27
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Artificial Sequence Description: Synthetic
олигонуклеотид" oligonucleotide"
<400> 31<400> 31
cagaacgact atagctaccc ctacacc 27cagaacgact atagctaccc ctacacc 27
<210> 32<210> 32
<211> 39<211> 39
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Artificial Sequence Description: Synthetic
олигонуклеотид" oligonucleotide"
<400> 32<400> 32
agtcagtcac tgctggatag cggtaatcag aagaacttc 39agtcagtcac tgctggatag cggtaatcag aagaacttc 39
<210> 33<210> 33
<211> 9<211> 9
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Artificial Sequence Description: Synthetic
олигонуклеотид" oligonucleotide"
<400> 33<400> 33
tgggcctct 9tgggcctct 9
<210> 34<210> 34
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Artificial Sequence Description: Synthetic
олигонуклеотид" oligonucleotide"
<400> 34<400> 34
gactatagct acccctac 18
<210> 35<210> 35
<211> 440<211> 440
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 35<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110 100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125 115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140 130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160 145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175 165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190 180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205 195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220 210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240 225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255 245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270 260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285 275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300 290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320 305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335 325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350 340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365 355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380 370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415 405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430 420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 435 440
<210> 36<210> 36
<211> 214<211> 214
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 36<400> 36
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140 130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 210
<210> 37<210> 37
<211> 447<211> 447
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 37<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30 20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45 35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140 130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160 145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175 165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190 180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205 195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220 210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255 245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270 260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285 275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300 290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320 305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335 325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350 340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365 355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380 370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400 385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415 405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430 420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445 435 440 445
<210> 38<210> 38
<211> 218<211> 218
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 38<400> 38
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30 20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45 35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95 85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110 100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125 115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140 130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175 165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190 180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205 195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 210 215
<210> 39<210> 39
<211> 447<211> 447
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 39<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30 20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Met Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Met
35 40 45 35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asp Ser Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Trp Ile Asn Thr Asp Ser Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala Tyr Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Gly Met Tyr Phe Cys Leu Gln Ile Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Gly Met Tyr Phe Cys
85 90 95 85 90 95
Val Arg Val Gly Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Arg Val Gly Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125 115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140 130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175 165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190 180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205 195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220 210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255 245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270 260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285 275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300 290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320 305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335 325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350 340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365 355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380 370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400 385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415 405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430 420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445 435 440 445
<210> 40<210> 40
<211> 213<211> 213
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 40<400> 40
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30 20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45 35 40 45
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60 50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Cys Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Cys Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80 65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Phe Pro Leu Thr Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Phe Pro Leu Thr
85 90 95 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110 100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125 115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140 130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160 145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175 165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190 180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205 195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys Asn Arg Gly Glu Cys
210 210
<210> 41<210> 41
<211> 10<211> 10
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 41<400> 41
Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met His
1 5 10 1 5 10
<210> 42<210> 42
<211> 118<211> 118
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 42<400> 42
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Lys Gly Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Lys Gly
50 55 60 50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80 65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95 85 90 95
Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 43<210> 43
<211> 110<211> 110
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 43<400> 43
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30 20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45 35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95 85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110 100 105 110
<210> 44<210> 44
<211> 5<211> 5
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 44<400> 44
Ser Tyr Trp Met Tyr Ser Tyr Trp Met Tyr
1 5 15
<210> 45<210> 45
<211> 17<211> 17
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 45<400> 45
Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Asn Asn
<210> 46<210> 46
<211> 11<211> 11
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 46<400> 46
Asp Tyr Arg Lys Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Asp Tyr Arg Lys Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10 1 5 10
<210> 47<210> 47
<211> 7<211> 7
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 47<400> 47
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5 15
<210> 48<210> 48
<211> 6<211> 6
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 48<400> 48
Asp Pro Asn Ser Gly Ser Asp Pro Asn Ser Gly Ser
1 5 15
<210> 49<210> 49
<211> 11<211> 11
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 49<400> 49
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10 1 5 10
<210> 50<210> 50
<211> 7<211> 7
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 50<400> 50
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5 15
<210> 51<210> 51
<211> 9<211> 9
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 51<400> 51
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5 15
<210> 52<210> 52
<211> 7<211> 7
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 52<400> 52
Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
1 5 15
<210> 53<210> 53
<211> 3<211> 3
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 53<400> 53
Trp Ala Ser Trp Ala Ser
1 1
<210> 54<210> 54
<211> 6<211> 6
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 54<400> 54
Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
1 5 15
<210> 55<210> 55
<211> 120<211> 120
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 55<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Arg Lys Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Ala Arg Asp Tyr Arg Lys Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 56<210> 56
<211> 360<211> 360
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полинуклеотид" polynucleotide"
<400> 56<400> 56
gaggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggctac agtgaaaatc 60gaggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggctac agtgaaaatc 60
tcctgcaagg tttctggcta caccttcacc agttactgga tgtactgggt gcgacaggct 120tcctgcaagg tttctggcta caccttcacc agttactgga tgtactggggt gcgacaggct 120
cgtggacaac gccttgagtg gataggtagg attgatccta atagtgggag tactaagtac 180cgtggacaac gccttgagtg gataggtagg attgatccta atagtgggag tactaagtac 180
aatgagaagt tcaagaacag attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240aatgagaagt tcaagaacag attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
cttcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagggactat 300cttcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagggactat 300
agaaaggggc tctatgctat ggactactgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcctcc 360agaaaggggc tctatgctat ggactactgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcctcc 360
<210> 57<210> 57
<211> 1341<211> 1341
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полинуклеотид" polynucleotide"
<400> 57<400> 57
gaggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggctac agtgaaaatc 60gaggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggctac agtgaaaatc 60
tcctgcaagg tttctggcta caccttcacc agttactgga tgtactgggt gcgacaggct 120tcctgcaagg tttctggcta caccttcacc agttactgga tgtactggggt gcgacaggct 120
cgtggacaac gccttgagtg gataggtagg attgatccta atagtgggag tactaagtac 180cgtggacaac gccttgagtg gataggtagg attgatccta atagtgggag tactaagtac 180
aatgagaagt tcaagaacag attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240aatgagaagt tcaagaacag attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
cttcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagggactat 300cttcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagggactat 300
agaaaggggc tctatgctat ggactactgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcctcc 360agaaaggggc tctatgctat ggactactgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcctcc 360
gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 420gcttccacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 420
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 600ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 600
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 660tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 660
aaatatggtc ccccatgccc accgtgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 720aaatatggtc cccatgccc accgtgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 720
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840tgcgtggtgg tggacgtgag cggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtgt ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020tgcaaggtgt ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 1080
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 1260
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1320aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 1320
ctctccctgt ctctgggtaa a 1341ctctccctgt ctctgggtaa a 1341
<210> 58<210> 58
<211> 107<211> 107
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 58<400> 58
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Val Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 59<210> 59
<211> 321<211> 321
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полинуклеотид" polynucleotide"
<400> 59<400> 59
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtacct gcagaagcca 120atcacttgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtacct gcagaagcca 120
gggcagtctc cacagctcct gatctattgg gcatccaccc ggcacactgg ggtcccctcg 180gggcagtctc cacagctcct gatctattgg gcatccaccc ggcacactgg ggtcccctcg 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccttta ccatcagtag cctggaagct 240aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccttta ccatcagtag cctggaagct 240
gaagatgctg caacatatta ctgtcagcag tataacagct atcctctcac gttcggccaa 300gaagatgctg caacatatta ctgtcagcag tataacagct atcctctcac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 60<210> 60
<211> 214<211> 214
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 60<400> 60
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Val Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140 130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 210
<210> 61<210> 61
<211> 642<211> 642
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полинуклеотид" polynucleotide"
<400> 61<400> 61
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtacct gcagaagcca 120atcacttgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtacct gcagaagcca 120
gggcagtctc cacagctcct gatctattgg gcatccaccc ggcacactgg ggtcccctcg 180gggcagtctc cacagctcct gatctattgg gcatccaccc ggcacactgg ggtcccctcg 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccttta ccatcagtag cctggaagct 240aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccttta ccatcagtag cctggaagct 240
gaagatgctg caacatatta ctgtcagcag tataacagct atcctctcac gttcggccaa 300gaagatgctg caacatatta ctgtcagcag tataacagct atcctctcac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360gggaccaagg tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 62<210> 62
<211> 447<211> 447
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
полипептид" polypeptide"
<400> 62<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Gly Arg Ile Asp Pro Asn Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60 50 55 60
Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Arg Lys Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Ala Arg Asp Tyr Arg Lys Gly Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140 130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160 145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175 165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190 180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205 195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220 210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240 225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255 245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270 260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285 275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300 290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320 305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335 325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350 340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365 355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380 370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400 385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415 405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430 420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445 435 440 445
<210> 63<210> 63
<211> 10<211> 10
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический<223> /note="Artificial sequence description: synthetic
пептид" peptide"
<400> 63<400> 63
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Tyr Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Tyr
1 5 10 1 5 10
<---<---
Claims (6)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762457219P | 2017-02-10 | 2017-02-10 | |
| US62/457,219 | 2017-02-10 | ||
| PCT/IB2018/050783 WO2018146612A1 (en) | 2017-02-10 | 2018-02-08 | 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 h-pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 h-pyrazol-4-ol and use thereof in the treatment of cancer |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019128199A RU2019128199A (en) | 2021-03-10 |
| RU2019128199A3 RU2019128199A3 (en) | 2021-05-14 |
| RU2791531C2 true RU2791531C2 (en) | 2023-03-09 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA200800229A1 (en) * | 2005-07-01 | 2008-06-30 | Медарекс, Инк. | HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST LIGAND-1 PROGRAMMED CELL DECLINATION (PD-L1) |
| WO2009114335A2 (en) * | 2008-03-12 | 2009-09-17 | Merck & Co., Inc. | Pd-1 binding proteins |
| WO2011121418A1 (en) * | 2010-03-31 | 2011-10-06 | Palobiofarma, S.L. | 4 - aminopyrimidine derivatives and their as as adenosine a2a receptor antagonists |
| WO2014209804A1 (en) * | 2013-06-24 | 2014-12-31 | Biomed Valley Discoveries, Inc. | Bispecific antibodies |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA200800229A1 (en) * | 2005-07-01 | 2008-06-30 | Медарекс, Инк. | HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST LIGAND-1 PROGRAMMED CELL DECLINATION (PD-L1) |
| WO2009114335A2 (en) * | 2008-03-12 | 2009-09-17 | Merck & Co., Inc. | Pd-1 binding proteins |
| WO2011121418A1 (en) * | 2010-03-31 | 2011-10-06 | Palobiofarma, S.L. | 4 - aminopyrimidine derivatives and their as as adenosine a2a receptor antagonists |
| WO2014209804A1 (en) * | 2013-06-24 | 2014-12-31 | Biomed Valley Discoveries, Inc. | Bispecific antibodies |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109475603B (en) | anti-PD-L1 antibodies | |
| KR102114562B1 (en) | 5-bromo-2,6-di- (1H-pyrazol-1-yl) pyrimidin-4-amine for use in the treatment of cancer | |
| AU2021286320B2 (en) | Anti-her3 antibody-drug conjugate | |
| US11498972B2 (en) | Anti-OX40 antibody and use thereof | |
| US11008398B2 (en) | Anti-TROP2 antibody-drug conjugate | |
| KR102422411B1 (en) | PD-L1-Specific Antibodies and methods of using the same | |
| JP2018523652A (en) | Combination of PD-1 antagonist and EGFR inhibitor | |
| KR20170069257A (en) | Antibody molecules to pd-l1 and uses thereof | |
| KR20150094617A (en) | Anti-folr1 antibody | |
| KR20190068521A (en) | A combination of an anti-CD20 antibody, a PI3 kinase-delta inhibitor, and an anti-PD-1 or anti-PD-L1 antibody for treating blood cancer | |
| JP2023536631A (en) | Multispecific binding agents and uses thereof | |
| KR20190115053A (en) | 1- (4-amino-5-bromo-6- (1H-pyrazol-1-yl) pyrimidin-2-yl) -1H-pyrazol-4-ol and its use in the treatment of cancer | |
| KR20200018503A (en) | Crystalline Forms of 5-bromo-2,6-di (1H-pyrazol-1-yl) pyrimidin-4-amine and New Salts | |
| RU2791531C2 (en) | 1-(4-amino-5-bromo-6-(1h-pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1h-pyrazol-4-ol and its applications for cancer treatment | |
| KR102226100B1 (en) | 5-bromo-2,6-di-(lh-pyrazol-l-yl)pyrimidin-4-amine for use in the treatment of cancer | |
| RU2802211C2 (en) | Anti-her3 conjugate antibody-drug | |
| JP2023536630A (en) | PD-L1 binding agents and uses thereof | |
| CN117580861A (en) | Treatment of PD-L1 negative or low expression cancers with anti-ICOS antibodies |