RU2791227C1

RU2791227C1 - Defrosting liquid, its preparation method and its use

Info

Publication number: RU2791227C1
Application number: RU2021123868A
Authority: RU
Inventors: Цзе Цяо; Цзе ЯНЬ; Лиин ЯНЬ; Жун ЛИ; Цзяньцзюнь ВАН; Шэнлинь ЦЗИНЬ; Цзяньюн ЛВ
Original assignee: Пекинг Юниверсити Сёрд Хоспитал; Инститьют Оф Кемистри, Чайниз Академи Оф Сайенсиз
Priority date: 2019-04-09
Filing date: 2020-03-02
Publication date: 2023-03-06

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to the field of preservation of biological material, in particular, to defrosting of cryopreserved cells or tissues. A defrosting solution contains, per 100 ml: 0.1-50 g of biomimetic material for suppression of ice growing, water-soluble saccharide at a concentration of 0-1.0 mol/l, and the rest is a buffer. Biomimetic material for suppression of ice growing is atactic polyvinyl alcohol (PVA) having syndiotacticity of 15-65%, molecular weight of 10-500 kDa, or a combination of the specified atactic polyvinyl alcohol (PVA), amino acid, polypeptide, and/or polyamino acid. Amino acid is selected from one of or a combination of two or more of arginine, threonine, proline, lysine, histidine, glutamine, aspartic acid, glycine. Polypeptide is one or more of L-Thr-L-Arg (TR), L-Thr-L-Pro (TP), L-Arg-L-Thr (RT), L-Pro-L-Thr (PT), L-Thr-L-Arg-L-Thr (TRT), L-Thr-L-Pro-L-Thr (TPT), or L-Thr-L-Cys-L-Thr (TCT). The defrosting solution is used in a defrosting reagent, which contains defrosting solutions I-IV, wherein defrosting solutions I-IV have different compositions by quantitative content of initial components.

EFFECT: proposed defrosting solution provides effective control of ice crystal growth, as well as significant reduction in cell or tissue damage caused by uncontrolled ice crystal growth during reduction, reduction in risks of a short service life and inclusion of parasitic biological contaminants to bonds with the absence in a composition of animal serum, contributes to preservation of stability, when passaging cells or tissues, has low toxicity.

10 cl, 4 dwg, 2 tbl, 3 ex

Description

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент №2019102824210 под названием «РАЗМОРАЖИВАЮЩАЯ ЖИДКОСТЬ ДЛЯ КРИОКОНСЕРВАЦИИ И СПОСОБ РАЗМОРАЖИВАНИЯ» и заявки на патент №2019102824155 под названием «ПРИМЕНЕНИЕ РАЗМОРАЖИВАЮЩЕЙ ЖИДКОСТИ ДЛЯ РАЗМОРАЖИВАНИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ООЦИТОВ ИЛИ ЭМБРИОНОВ», поданной в Национальное ведомство по интеллектуальной собственности Китая 9 апреля 2019 года. Эти две предыдущие заявки включены в настоящую заявку в полном объеме посредством ссылки.This application trits the priority on the basis of the application for patent No.2019102824210 called “defrosting fluid for cryoconsection and a method of defrosting” and applications for patent No. 2019102824155 called “The use of defrosting fluids for defrosting cryoconced oocytes or embryos” fed to the National Department of Chinese. April 9, 2019. These two previous applications are incorporated into the present application in their entirety by reference.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY

Настоящее изобретение относится к технической области биомедицинских материалов и, в частности, к размораживающему раствору для криоконсервации и способу размораживания.The present invention relates to the technical field of biomedical materials and, in particular, to a thawing solution for cryopreservation and a thawing method.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

Криоконсервация представляет собой сохранение биологического материала при сверхнизких температурах, замедляющих или приостанавливающих метаболизм и деление клеток, с возможностью продолжения их развития после восстановления нормальных физиологических температур. С момента ее создания данная технология стала одной из самых незаменимых исследовательских методик в области естественных наук и широко применяется. В последнее время, ввиду нарастающего напряжения в современной жизни, год от года наблюдается тенденция к снижению репродуктивной способности у людей, и, соответственно, сохранение репродуктивной способности становится все более и более насущным. Важным средством сохранения репродуктивной способности становится криоконсервация половых клеток человека (сперматозоидов и ооцитов), гонадных тканей и т.п. Кроме того, по мере старения мировой популяции, быстро растет потребность в криоконсервации донорских клеток, тканей или органов человека, которые могут быть использованы для регенеративной медицины и трансплантации органов. Следовательно, вопрос эффективной криоконсервации ресурсов на основе ценных клеток, тканей и органов на будущие потребности становится научно-технической проблемой, требующей неотложного решения.Cryopreservation is the preservation of biological material at ultra-low temperatures, slowing down or stopping metabolism and cell division, with the possibility of continuing their development after the restoration of normal physiological temperatures. Since its inception, this technology has become one of the most indispensable research methods in the life sciences and is widely used. Recently, due to the increasing tension in modern life, year by year there is a tendency to reduce the reproductive capacity of people, and, accordingly, the preservation of reproductive capacity is becoming more and more urgent. Cryopreservation of human germ cells (spermatozoa and oocytes), gonadal tissues, etc. becomes an important means of preserving reproductive ability. In addition, as the world population ages, the need for cryopreservation of human donor cells, tissues or organs, which can be used for regenerative medicine and organ transplantation, is rapidly growing. Consequently, the issue of effective cryopreservation of resources based on valuable cells, tissues and organs for future needs is becoming a scientific and technical problem requiring an urgent solution.

В настоящее время наиболее часто используемым способом криоконсервации является витрификация. Во время процесса размораживания необходимо обратить внимание на предотвращение повреждения в результате цикла замораживания-размораживания, такого как кристаллы льда, холодовый шок, влияние растворенного вещества, разрушающее повреждение, перекристаллизация и осмотический шок. Исходя из соображений улучшения показателя выживаемости восстановленных эмбрионов и ооцитов, схема замораживания и размораживания в целом выглядит следующим образом: за счет быстрого процесса размораживания бластулы или ооциты при высоком осмотическим давлении размораживают в культуральных средах с определенным градиентом концентрации криопротектора, тем самым постепенно уменьшая разницу значений осмотического давления внутри и снаружи клеток, снижая скорость изменения объема клеток и предотвращая повреждение клеток или эмбрионов во время процесса размораживания. Большинство размораживающих реагентов, широко используемых в настоящее время в клинической практике, содержат сахарозу, сыворотку и буфер в качестве основных ингредиентов. Однако такие размораживающие растворы не могут обеспечить эффективный контроль роста и перекристаллизации кристаллов льда в процессе размораживания, что приводит к повреждениям клеток. Кроме того, существующие размораживающие растворы характеризуются рядом проблем, такими как короткий срок годности и риски в отношении паразитарных биологических загрязнений, обусловленных точно не установленным составом и легкостью ухудшения качества сыворотки.Currently, the most commonly used method of cryopreservation is vitrification. During the thawing process, attention must be paid to preventing damage from the freeze-thaw cycle, such as ice crystals, cold shock, solute influence, destructive damage, recrystallization, and osmotic shock. Based on the considerations of improving the survival rate of recovered embryos and oocytes, the scheme of freezing and thawing as a whole is as follows: due to the rapid process of thawing, blastula or oocytes are thawed at high osmotic pressure in culture media with a certain concentration gradient of the cryoprotectant, thereby gradually reducing the difference in osmotic values. pressure inside and outside the cells, reducing the rate of change in cell volume and preventing damage to cells or embryos during the thawing process. Most of the thawing reagents currently widely used in clinical practice contain sucrose, serum and buffer as the main ingredients. However, such thawing solutions cannot effectively control the growth and recrystallization of ice crystals during thawing, resulting in cell damage. In addition, existing defrosting solutions suffer from a number of problems such as short shelf life and risks of parasitic biological contaminants due to the unclear composition and ease of degradation of whey.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯDISCLOSURE OF THE INVENTION

Для преодоления вышеуказанных недостатков предшествующего уровня техники согласно настоящему изобретению предложен размораживающий раствор для криоконсервации и способ размораживания.To overcome the above disadvantages of the prior art, the present invention provides a cryopreservation thawing solution and a thawing method.

Согласно настоящему изобретению реализованы следующие технические решения:According to the present invention, the following technical solutions are implemented:

Размораживающий раствор, содержащий на 100 мл: 0,1-50 г биомиметического материала для подавления нарастания льда, 0-1,0 моль/л водорастворимого сахарида, и остальное составляет буфер, при этом биомиметический материал для подавления нарастания льда представляет собой материал для подавления нарастания льда, содержащий группу, характеризующейся сродством со льдом, и гидрофильную группу.A defrosting solution containing per 100 ml: 0.1-50 g of biomimetic material to suppress the build-up of ice, 0-1.0 mol/l of water-soluble saccharide, and the rest is a buffer, while the biomimetic material to suppress the build-up of ice is a material to suppress an ice buildup containing a group having an affinity for ice and a hydrophilic group.

Согласно настоящему изобретению указанная гидрофильная группа представляет собой функциональную группу, способную к образованию нековалентного взаимодействия с молекулой воды, например, путем образования водородной связи, ван-дер-ваальсового взаимодействия, электростатического взаимодействия, гидрофобного взаимодействия или π-π-взаимодействия с водой; в качестве иллюстрации гидрофильная группа может быть выбрана из по меньшей мере одного из гидроксила (-ОН), амино (-NH₂), карбоксила (-СООН) и ациламино (-CONH₂) или из молекулы соединения, такого как пролин (L-Pro), аргинин (L-Arg), лизин (L-Lys), гистидин (L-His) и глицин (L-Gly), глюконо-дельта-лактон (GDL) и сахарид, и его молекулярного фрагмента.According to the present invention, said hydrophilic group is a functional group capable of forming a non-covalent interaction with a water molecule, for example, by hydrogen bonding, van der Waals interaction, electrostatic interaction, hydrophobic interaction, or π-π interaction with water; by way of illustration, the hydrophilic group may be selected from at least one of hydroxyl (-OH), amino (-NH ₂ ), carboxyl (-COOH) and acylamino (-CONH ₂ ) or from a compound molecule such as proline (L- Pro), arginine (L-Arg), lysine (L-Lys), histidine (L-His) and glycine (L-Gly), glucono-delta-lactone (GDL) and saccharide, and its molecular fragment.

Согласно настоящему изобретению указанная группа, характеризующаяся сродством со льдом, представляет собой функциональную группу, способную к образованию нековалентного взаимодействия со льдом, например, путем образования водородной связи, ван-дер-ваальсового взаимодействия, электростатического взаимодействия, гидрофобного взаимодействия или π-π-взаимодействия со льдом; в качестве иллюстрации группа, характеризующаяся сродством со льдом, может быть выбрана из гидроксила (-ОН), амино (-NH₂), фенила (-C₆H₅) и пирролидинила (-C₄H₈N) или молекулы соединения, такого как глутамин (L-Gln), треонин (L-Thr), аспарагиновая кислота (L-Asn), бензол (C₆H₆) и пирролидин (C₄H₉N), и его молекулярного фрагмента.According to the present invention, said ice affinity group is a functional group capable of forming a non-covalent interaction with ice, for example, by hydrogen bonding, van der Waals interaction, electrostatic interaction, hydrophobic interaction, or π-π interaction with ice; by way of illustration, a group having an affinity for ice may be selected from hydroxyl (-OH), amino (-NH ₂ ), phenyl (-C ₆ H ₅ ), and pyrrolidinyl (-C ₄ H ₈ N) or a molecule of a compound such as glutamine (L-Gln), threonine (L-Thr), aspartic acid (L-Asn), benzene (C ₆ H ₆ ) and pyrrolidine (C ₄ H ₉ N), and its molecular fragment.

Согласно настоящему изобретению биомиметический материал для подавления нарастания льда выбран из по меньшей мере одного из или комбинации двух или более из поливинилового спирта (ПВС), аминокислоты, полипептида и полиаминокислоты.According to the present invention, the biomimetic material for suppressing ice buildup is selected from at least one of, or a combination of two or more of, polyvinyl alcohol (PVA), an amino acid, a polypeptide, and a polyamino acid.

Согласно настоящему изобретению аминокислота может быть выбрана из одного из или комбинации двух или более из аргинина, треонина, пролина, лизина, гистидина, глутамина, аспарагиновой кислоты, глицина и т.п.; полиаминокислота может представлять собой гомополимер (со степенью полимеризации ≥ 2, предпочтительно 2-40, например, 6, 8, 15 и 20) по меньшей мере одного, выбранного из лизина, аргинина, пролина, треонина, гистидина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, глицина и т.п.According to the present invention, the amino acid may be selected from one or a combination of two or more of arginine, threonine, proline, lysine, histidine, glutamine, aspartic acid, glycine, and the like; the polyamino acid may be a homopolymer (degree of polymerization ≥ 2, preferably 2-40, e.g. 6, 8, 15 and 20) of at least one selected from lysine, arginine, proline, threonine, histidine, glutamic acid, aspartic acid, glycine, etc.

В качестве иллюстрации полипептид представляет собой полипептид, состоящий из двух или более из вышеуказанных аминокислот или гликопептидного производного, образованного в результате реакции аминокислоты с сахаридом (например, глюконолактоном). Например, полипептид представляет собой полипептид, состоящий из 2-8 разных аминокислот, и, например, дипептид, трипептид или тетрапептид. Согласно вариантам реализации настоящего изобретения полипептид представляет собой одно или более из L-Thr-L-Arg (TR), L-Thr-L-Pro (TP), L-Arg-L-Thr (RT), L-Pro-L-Thr (PT), L-Thr-L-Arg-L-Thr (TRT), L-Thr-L-Pro-L-Thr (TPT), L-Ala-L-Ala-L-Thr (AAT) или L-Thr-L-Cys-L-Thr (TCT).By way of illustration, a polypeptide is a polypeptide consisting of two or more of the above amino acids, or a glycopeptide derivative formed by the reaction of an amino acid with a saccharide (eg, gluconolactone). For example, a polypeptide is a polypeptide consisting of 2-8 different amino acids, and, for example, a dipeptide, tripeptide, or tetrapeptide. According to embodiments of the present invention, the polypeptide is one or more of L-Thr-L-Arg (TR), L-Thr-L-Pro (TP), L-Arg-L-Thr (RT), L-Pro-L -Thr (PT), L-Thr-L-Arg-L-Thr (TRT), L-Thr-L-Pro-L-Thr (TPT), L-Ala-L-Ala-L-Thr (AAT) or L-Thr-L-Cys-L-Thr (TCT).

Согласно настоящему изобретению содержание биомиметического материала для подавления нарастания льда составляет 1,0-50 г, 2,0-20 г или 5,0-10 г. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения содержание биомиметического материала для подавления нарастания льда составляет 3,0 г, 4,0 г, 5,0 г, 10 г, 25 г или 30 г. According to the present invention, the content of biomimetic material for suppressing ice buildup is 1.0-50 g, 2.0-20 g, or 5.0-10 g. According to one embodiment of the present invention, the content of biomimetic material for suppressing ice build-up is 3.0 g , 4.0 g, 5.0 g, 10 g, 25 g or 30 g.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения биомиметический материал для подавления нарастания льда содержит 1,0-6,0 г ПВС.According to one embodiment of the present invention, the biomimetic material for suppressing ice buildup contains 1.0-6.0 g of PVA.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения биомиметический материал для подавления нарастания льда содержит 1,0-30 г аминокислоты. В качестве иллюстрации аминокислота представлена комбинацией аргинина и треонина, например, содержащей 1,0-20 г, 1,0-10 г или 1,0-5 г аргинина и 1,0-10 г, 1,0-5,0 г или 1,0-2,5 г треонина.According to one embodiment of the present invention, the biomimetic material for suppressing ice buildup contains 1.0-30 g of an amino acid. By way of illustration, an amino acid is represented by a combination of arginine and threonine, for example, containing 1.0-20 g, 1.0-10 g or 1.0-5 g arginine and 1.0-10 g, 1.0-5.0 g or 1.0-2.5 g of threonine.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения биомиметический материал для подавления нарастания льда содержит 0,1-9,0 г полиаминокислоты, например, 1-5,0 г. В качестве иллюстрации поли амино кислота представляет собой поли-L-пролин и/или поли-L-аргинин.According to one embodiment of the present invention, the biomimetic material for inhibiting ice buildup comprises 0.1-9.0 g of a polyamino acid, such as 1-5.0 g. L-arginine.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения биомиметический материал для подавления нарастания льда содержит 1,0-50 г полипептида; например, 1,0-25 г, 1,0-13 г, 1,0-10 г или 1,0-5,0 г. According to one embodiment of the present invention, the biomimetic material for inhibiting ice buildup comprises 1.0-50 g of a polypeptide; e.g. 1.0-25g, 1.0-13g, 1.0-10g or 1.0-5.0g.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения биомиметический материал для подавления нарастания льда представляет собой комбинацию ПВС и аминокислоты, полипептида и/или полиаминокислоты.According to one embodiment of the present invention, the biomimetic material for inhibiting ice buildup is a combination of PVA and an amino acid, polypeptide and/or polyamino acid.

Согласно настоящему изобретению содержание водорастворимого сахарида на 100 мл размораживающего раствора составляет 0,1-1,0 моль/л, например, 0,1-0,8 моль/л, 0,2-0,6 моль/л, например, 0,25 моль/л, 0,5 моль/л, 1,0 моль/л.According to the present invention, the content of water-soluble saccharide per 100 ml of defrosting solution is 0.1-1.0 mol/l, for example 0.1-0.8 mol/l, 0.2-0.6 mol/l, for example 0 .25 mol/l, 0.5 mol/l, 1.0 mol/l.

Размораживающий реагент, содержащий размораживающий раствор I, размораживающий раствор II, размораживающий раствор III и размораживающий раствор IV, причем размораживающие растворы I-IV имеют составы для размораживающего раствора, описанные выше.A thawing agent comprising a thawing solution I, a thawing solution II, a thawing solution III, and a thawing solution IV, wherein the thawing solutions I-IV have the thawing solution formulations described above.

В соответствии с размораживающим реагентом согласно настоящему изобретению градиенты концентрации биомиметического материала для подавления нарастания льда в размораживающих растворах I IV конкретно не ограничены. Концентрации биомиметического материала для подавления нарастания льда в размораживающих растворах могут быть одинаковыми или разными. В качестве иллюстративного варианта реализации концентрации биомиметического материала для подавления нарастания льда в размораживающих растворах I-IV являются разными. Например, содержание биомиметического материала для подавления нарастания льда в размораживающем растворе II составляет 50-100% от содержания в размораживающем растворе I, а содержание биомиметического материала для подавления нарастания льда в размораживающем растворе III составляет 50-100% от содержания в размораживающем растворе II.According to the defrosting agent of the present invention, the concentration gradients of the biomimetic material for suppressing ice buildup in the defrosting solutions I IV are not specifically limited. The concentrations of biomimetic material to suppress the buildup of ice in the defrosting solutions may be the same or different. As an exemplary implementation, the concentrations of the biomimetic material to suppress the buildup of ice in the defrosting solutions I-IV are different. For example, the content of the biomimetic material for suppressing ice build-up in the defrosting solution II is 50-100% of the content in the defrosting solution I, and the content of the biomimetic material for suppressing the build-up of ice in the defrosting solution III is 50-100% of the content in the defrosting solution II.

В размораживающем реагенте согласно настоящему изобретению размораживающие растворы I IV содержат 1,0-6,0 г ПВС; и предпочтительно концентрации ПВС в размораживающих растворах I-IV являются одинаковыми.In the defrosting agent according to the present invention, the defrosting solutions I IV contain 1.0-6.0 g of PVA; and preferably the PVA concentrations in the defrosting solutions I-IV are the same.

В размораживающем реагенте согласно настоящему изобретению концентрация водорастворимого сахарида в размораживающем растворе II составляет 50-100% от концентрации в размораживающем растворе I, концентрация водорастворимого сахарида в размораживающем растворе III составляет 50-100% от концентрации в размораживающем растворе II, а концентрация сахарида в размораживающем растворе IV составляет 0.In the defrosting agent of the present invention, the concentration of water-soluble saccharide in the defrosting solution II is 50-100% of the concentration in the defrosting solution I, the concentration of the water-soluble saccharide in the defrosting solution III is 50-100% of the concentration in the defrosting solution II, and the concentration of the saccharide in the defrosting solution IV is 0.

Согласно одному варианту реализации размораживающего реагента согласно настоящему изобретению размораживающий раствор I содержит на 100 мл: 1,0-50 г аминокислоты, 1,0-5,0 г ПВС, водорастворимый сахарид в концентрации 1,0 моль/л, и остальное составляет буфер;According to one embodiment of the thawing reagent according to the present invention, the thawing solution I contains per 100 ml: 1.0-50 g of amino acid, 1.0-5.0 g of PVA, water-soluble saccharide at a concentration of 1.0 mol/l, and the rest is buffer ;

размораживающий раствор II содержит на 100 мл: 1,0-25 г аминокислоты, 1,0-5,0 г ПВС, водорастворимый сахарид в концентрации 0,5 моль/л, и остальное составляет буфер;defrosting solution II contains per 100 ml: 1.0-25 g of amino acid, 1.0-5.0 g of PVA, water-soluble saccharide at a concentration of 0.5 mol/l, and the rest is a buffer;

размораживающий раствор III содержит на 100 мл: 1,0-12,5 г аминокислоты, 1,0-5,0 г ПВС, водорастворимый сахарид в концентрации 0,25 моль/л, и остальное составляет буфер;defrosting solution III contains per 100 ml: 1.0-12.5 g of amino acid, 1.0-5.0 g of PVA, water-soluble saccharide at a concentration of 0.25 mol/l, and the rest is a buffer;

размораживающий раствор IV содержит на 100 мл: 0-6,25 г аминокислоты, 1,0-5,0 г ПВС, и остальное составляет буфер.defrosting solution IV contains per 100 ml: 0-6.25 g of amino acid, 1.0-5.0 g of PVA, and the rest is buffer.

Согласно одному варианту реализации размораживающего реагента согласно настоящему изобретению размораживающий раствор I содержит на 100 мл: 1,0-5,0 г ПВС, водорастворимый сахарид в концентрации 1,0 моль/л, и остальное составляет буфер;According to one embodiment of the thawing agent according to the present invention, the thawing solution I contains per 100 ml: 1.0-5.0 g PVA, a water-soluble saccharide at a concentration of 1.0 mol/l, and the rest is buffer;

размораживающий раствор II содержит на 100 мл: 1,0-5,0 г ПВС, водорастворимый сахарид в концентрации 0,5 моль/л, и остальное составляет буфер;defrosting solution II contains per 100 ml: 1.0-5.0 g of PVA, a water-soluble saccharide at a concentration of 0.5 mol/l, and the rest is buffer;

размораживающий раствор III содержит на 100 мл: 1,0-5,0 г ПВС, водорастворимый сахарид в концентрации 0,25 моль/л, и остальное составляет буфер;defrosting solution III contains per 100 ml: 1.0-5.0 g of PVA, a water-soluble saccharide at a concentration of 0.25 mol/l, and the rest is buffer;

размораживающий раствор IV содержит на 100 мл: 1,0-5,0 г ПВС, и остальное составляет буфер.defrosting solution IV contains per 100 ml: 1.0-5.0 g of PVA and the rest is buffer.

Согласно одному варианту реализации размораживающего реагента согласно настоящему изобретению размораживающий раствор I содержит на 100 мл: 1,0-9,0 г полиаминокислоты, 0,1-5,0 г ПВС, водорастворимый сахарид в концентрации 1,0 моль/л, и остальное составляет буфер;According to one embodiment of the thawing agent according to the present invention, thawing solution I contains per 100 ml: 1.0-9.0 g of polyamino acid, 0.1-5.0 g of PVA, water-soluble saccharide at a concentration of 1.0 mol/l, and the rest makes a buffer;

размораживающий раствор II содержит на 100 мл: 0,1-4,5 г полиаминокислоты, 1,0-5,0 г ПВС, водорастворимый сахарид в концентрации 0,5 моль/л, и остальное составляет буфер;defrosting solution II contains per 100 ml: 0.1-4.5 g of polyamino acid, 1.0-5.0 g of PVA, water-soluble saccharide at a concentration of 0.5 mol/l, and the rest is buffer;

размораживающий раствор III содержит на 100 мл: 0,1-2,3 г полиаминокислоты, 1,0-5,0 г ПВС, водорастворимый сахарид в концентрации 0,25 моль/л, и остальное составляет буфер;defrosting solution III contains per 100 ml: 0.1-2.3 g of polyamino acid, 1.0-5.0 g of PVA, water-soluble saccharide at a concentration of 0.25 mol/l, and the rest is buffer;

размораживающий раствор IV содержит на 100 мл: 0-1,2 г полиаминокислоты, 1,0-5,0 г ПВС, и остальное составляет буфер.defrosting solution IV contains per 100 ml: 0-1.2 g of polyamino acid, 1.0-5.0 g of PVA, and the rest is buffer.

Согласно одному варианту реализации размораживающего реагента согласно настоящему изобретению размораживающий раствор I содержит на 100 мл: 1,0-50 г полипептида, 1,0-5,0 г ПВС, водорастворимый сахарид в концентрации 1,0 моль/л, и остальное составляет буфер;According to one embodiment of the thawing reagent according to the present invention, the thawing solution I contains per 100 ml: 1.0-50 g of polypeptide, 1.0-5.0 g of PVA, a water-soluble saccharide at a concentration of 1.0 mol/l, and the rest is buffer ;

размораживающий раствор II содержит на 100 мл: 1,0-25 г полипептида, 1,0-5,0 г ПВС, водорастворимый сахарид в концентрации 0,5 моль/л, и остальное составляет буфер;defrosting solution II contains per 100 ml: 1.0-25 g of polypeptide, 1.0-5.0 g of PVA, water-soluble saccharide at a concentration of 0.5 mol/l, and the rest is buffer;

размораживающий раствор III содержит на 100 мл: 1,0-12,5 г полипептида, 1,0-5,0 г ПВС, водорастворимый сахарид в концентрации 0,25 моль/л, и остальное составляет буфер;defrosting solution III contains per 100 ml: 1.0-12.5 g of polypeptide, 1.0-5.0 g of PVA, water-soluble saccharide at a concentration of 0.25 mol/l, and the rest is buffer;

размораживающий раствор IV содержит на 100 мл: 0-6,25 г полипептида, 1,0-5,0 г ПВС, и остальное составляет буфер.defrosting solution IV contains per 100 ml: 0-6.25 g of polypeptide, 1.0-5.0 g of PVA, and the rest is buffer.

Согласно настоящему изобретению водорастворимый сахарид может представлять собой по меньшей мере одно из невосстанавливающего дисахарида, водорастворимого полисахарида и гликозида, например, выбран из сахарозы и трегалозы, предпочтительно, сахарозы. Водорастворимый сахарид может защищать клеточные мембраны и препятствовать седиментации клеток.According to the present invention, the water-soluble saccharide may be at least one of a non-reducing disaccharide, a water-soluble polysaccharide and a glycoside, for example selected from sucrose and trehalose, preferably sucrose. The water-soluble saccharide can protect cell membranes and prevent cell sedimentation.

Согласно настоящему изобретению буфер может быть выбран из по меньшей мере одного из DPBS, HEPES-забуференного HTF-буфера и других буферов для культур клеток.According to the present invention, the buffer may be selected from at least one of DPBS, HEPES buffered HTF buffer, and other cell culture buffers.

Согласно настоящему изобретению ПВС выбран из одного из или комбинации двух или более ПВС, таких как изотактический ПВС, синдиотактический ПВС и атактический ПВС. Например, ПВС характеризуется синдиотактичностью 15-65%, в частности, например, 40-60% или 53-55%. Предпочтительным является атактический ПВС, например, ПВС с синдиотактичностью 45-65%.According to the present invention, the PVA is selected from one or a combination of two or more PVA, such as isotactic PVA, syndiotactic PVA, and atactic PVA. For example, PVA is characterized by a syndiotacticity of 15-65%, in particular, for example, 40-60% or 53-55%. Atactic PVA is preferred, eg PVA with a syndiotacticity of 45-65%.

Согласно настоящему изобретению ПВС может быть выбран из ПВС с молекулярной массой 10-500 кДа или более, например, 10-30 кДа, 30-50 кДа, 80-90 кДа или 200-500 кДа.According to the present invention, PVA can be selected from PVA with a molecular weight of 10-500 kDa or more, such as 10-30 kDa, 30-50 kDa, 80-90 kDa or 200-500 kDa.

Согласно настоящему изобретению ПВС может быть выбран из ПВС со степенью гидролиза более 80%, например, 80-99%, 82-87%, 87-89%, 89-99% или 98-99%.According to the present invention, PVA can be selected from PVA with a degree of hydrolysis of more than 80%, for example, 80-99%, 82-87%, 87-89%, 89-99% or 98-99%.

Размораживающий раствор согласно настоящему изобретению может быть получен способами, известными в данной области техники, такими как:The defrosting solution according to the present invention can be obtained by methods known in the art, such as:

растворение биомиметического материала для подавления нарастания льда в одной части буфера и регулирование рН; растворение водорастворимого сахарида в другой части буфера; и охлаждение двух растворов до комнатной температуры, и смешивание двух растворов.dissolving the biomimetic material to suppress the buildup of ice in one part of the buffer and adjusting the pH; dissolving the water-soluble saccharide in another part of the buffer; and cooling the two solutions to room temperature, and mixing the two solutions.

Способ размораживания криоконсервированных клетки, ткани или органа, включающий:A method for defrosting a cryopreserved cell, tissue or organ, including:

размораживание криоконсервированных клетки, ткани или органа в размораживающем растворе I при 37°С в течение 3-5 минут, и затем последовательно размораживание криоконсервированной клетки или ткани в размораживающем растворе II, размораживающем растворе III и размораживающем растворе IV в течение 3 5 минут при комнатной температуре.thawing a cryopreserved cell, tissue or organ in defrosting solution I at 37°C for 3-5 minutes, and then sequentially thawing the cryopreserved cell or tissue in thawing solution II, thawing solution III and thawing solution IV for 3-5 minutes at room temperature .

Размораживающий раствор и размораживающий реагент могут быть применены для размораживания криоконсервированных ооцитов, эмбриона, ткани или органа. Например, ткань или орган представляют собой овариальную ткань или овариальный орган.The thawing solution and thawing reagent can be used to thaw cryopreserved oocytes, embryos, tissues or organs. For example, the tissue or organ is an ovarian tissue or an ovarian organ.

Кроме того, согласно настоящему изобретению предложено применение размораживающего раствора и размораживающего реагента, в частности, применение для размораживания криоконсервированных ооцитов, эмбриона, ткани или органа, например, ткань или орган представляет собой овариальную ткань или овариальный орган.In addition, according to the present invention, the use of a thawing solution and a thawing reagent is proposed, in particular, the use for thawing cryopreserved oocytes, an embryo, a tissue or an organ, for example, the tissue or organ is an ovarian tissue or an ovarian organ.

ПреимуществаAdvantages

Размораживающий раствор и размораживающий реагент согласно настоящему изобретению получают из биомиметического материала для подавления нарастания льда, характеризующегося сродством со льдом и гидрофильными свойствами, который может обеспечивать эффективный контроль роста кристаллов льда и значительное уменьшение повреждения клеток или тканей, обусловленного изменением температуры в процессе размораживания. Размораживающий раствор и размораживающий реагент характеризуются надлежащей биосовместимостью, не содержат сыворотки животных и характеризуются низкой токсичностью, и, таким образом, характеризуются более низкими рисками в отношении, например, короткого срока годности и включения паразитарных биологических загрязнителей, а также характеризуются наличием преимуществ, заключающихся в сохранении стабильности при пассировании клеток или тканей по сравнению с традиционными размораживающими растворами, содержащими сыворотку. Настоящее изобретение имеет простой состав, характеризуется экономической эффективностью и надлежащей перспективой применения.The thawing solution and thawing reagent of the present invention are made from a biomimetic ice buildup suppressing material with ice affinity and hydrophilic properties, which can effectively control the growth of ice crystals and greatly reduce cell or tissue damage caused by temperature change during thawing. The thawing solution and the thawing reagent have proper biocompatibility, do not contain animal serum and have low toxicity, and thus have lower risks regarding, for example, short shelf life and incorporation of parasitic biological contaminants, and also have the advantage of saving stability when passaged cells or tissues in comparison with traditional thawing solutions containing whey. The present invention has a simple composition, economic efficiency, and good application prospects.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

ФИГ. 1 представляет собой фотографию окрашенного среза свежего незамороженного овариального органа;FIG. 1 is a photograph of a stained section of a fresh unfrozen ovarian organ;

ФИГ. 2 представляет собой фотографию окрашенного среза овариального органа, размороженного с применением размораживающего раствора из Примера 1;FIG. 2 is a photograph of a stained section of an ovarian organ thawed using the thawing solution from Example 1;

ФИГ. 3 представляет собой фотографию окрашенного среза свежей незамороженной овариальной ткани; иFIG. 3 is a photograph of a stained section of fresh unfrozen ovarian tissue; And

ФИГ. 4 представляет собой фотографию окрашенного среза овариальной ткани, размороженной с применением размораживающего раствора из примера 1.FIG. 4 is a photograph of a stained section of ovarian tissue thawed using the thawing solution from Example 1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕDETAILED DESCRIPTION

Способ получения согласно настоящему изобретению будет более подробно проиллюстрирован со ссылкой на следующие конкретные примеры. Следует понимать, что следующие примеры представлены лишь с целью типичной иллюстрации и пояснения настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как ограничивающие объем правовой охраны настоящего изобретения. Все методики, разрабатываемые на основании вышеуказанного содержания настоящего изобретения, подпадают под объем правовой охраны настоящего изобретения.The production method according to the present invention will be illustrated in more detail with reference to the following specific examples. It should be understood that the following examples are provided only for the purpose of exemplifying and explaining the present invention and should not be construed as limiting the scope of the present invention. All methods developed on the basis of the above content of the present invention fall within the scope of the legal protection of the present invention.

Если не указано иное, экспериментальные методы, используемые в следующих примерах, представляют собой традиционные методы. Если не указано иное, реагенты, материалы и т.п., используемые в следующих примерах, являются коммерчески доступными.Unless otherwise indicated, the experimental methods used in the following examples are conventional methods. Unless otherwise noted, the reagents, materials, and the like used in the following examples are commercially available.

ПВС, используемый в примерах настоящего изобретения, характеризуется синдиотактичностью 50-55%, молекулярной массой 13-23 кДа и степенью гидролиза 98%.The PVA used in the examples of the present invention has a syndiotacticity of 50-55%, a molecular weight of 13-23 kDa, and a degree of hydrolysis of 98%.

В примерах настоящего изобретения поли-L-пролин, используемый в криоконсервирующем растворе, характеризуется степенью полимеризации 15 и молекулярной массой 1475. Поли-L-пролин в размораживающем растворе характеризуется степенью полимеризации 8 и молекулярной массой 795.In the examples of the present invention, the poly-L-proline used in the cryopreservation solution has a degree of polymerization of 15 and a molecular weight of 1475. The poly-L-proline in the defrosting solution has a degree of polymerization of 8 and a molecular weight of 795.

В примерах настоящего изобретения использовали следующие замораживающий уравновешивающий раствор и криоконсервирующий раствор:In the examples of the present invention, the following freezing equilibration solution and cryopreservation solution were used:

Криоконсервирующий раствор А (общий объем: 100 мл): 2,0 г ПВС растворяли в 30 мл DPBS на водяной бане при 80°С с использованием магнитной мешалки при нагревании и доводили рН до 7,0 с получением раствора 1; 17 г (0,05 моль) сахарозы (конечная концентрация сахарозы в криоконсервирующем растворе составляла 0,5 моль/л) растворяли под воздействием ультразвука в 25 мл DPBS и после полного растворения сахарозы добавляли 10 мл этиленгликоля с получением раствора 2; после повторного достижения комнатной температуры раствор 1 и раствор 2 хорошо смешивали, регулировали рН, и смесь разбавляли до 100 мл DPBS для последующего применения.Cryopreservation solution A (total volume: 100 ml): 2.0 g of PVA was dissolved in 30 ml of DPBS in a water bath at 80° C. using a magnetic stirrer while heating, and the pH was adjusted to 7.0 to obtain solution 1; 17 g (0.05 mol) of sucrose (the final concentration of sucrose in the cryopreservation solution was 0.5 mol/l) was dissolved under the influence of ultrasound in 25 ml of DPBS, and after complete dissolution of sucrose, 10 ml of ethylene glycol was added to obtain solution 2; after returning to room temperature, solution 1 and solution 2 were mixed well, the pH was adjusted, and the mixture was diluted to 100 ml DPBS for later use.

Замораживающий уравновешивающий раствор а (общий объем: 100 мл): 2,0 г ПВС растворяли в 50 мл DPBS на водяной бане при 80°С с использованием магнитной мешалки при нагревании и доводили рН до 7,0 после полного растворения ПВС; к раствору добавляли 7,5 мл этиленгликоля и тщательно перемешивали, регулировали рН и разбавляли смесь до 100 мл с помощью DPBS для последующего применения.Freezing equilibration solution a (total volume: 100 ml): 2.0 g of PVA was dissolved in 50 ml of DPBS in a water bath at 80° C. using a magnetic stirrer while heating, and the pH was adjusted to 7.0 after complete dissolution of PVA; 7.5 ml of ethylene glycol was added to the solution and mixed thoroughly, the pH was adjusted and the mixture was diluted to 100 ml with DPBS for later use.

Криоконсервирующий раствор В (общий объем: 100 мл): 2,0 г ПВС растворяли в 25 мл DPBS на водяной бане при 80°С с использованием магнитной мешалки при нагревании и доводили рН до 7,0 с получением раствора 1; 1,5 г поли-L-пролина растворяли под воздействием ультразвука в дополнительных 20 мл DPBS и доводили рН до 7,0 с получением раствора 2; 17 г (0,05 моль) сахарозы (конечная концентрация сахарозы в криоконсервирующем растворе составляла 0,5 моль/л) растворяли под воздействием ультразвука в 25 мл DPBS и после полного растворения сахарозы добавляли 10 мл этиленгликоля с получением раствора 3; после повторного достижения комнатной температуры раствор 1, раствор 2 и раствор 3 хорошо смешивали, регулировали рН и смесь разбавляли до 100 мл DPBS для последующего применения.Cryopreservation solution B (total volume: 100 ml): 2.0 g of PVA was dissolved in 25 ml of DPBS in a water bath at 80° C. using a magnetic stirrer while heating, and the pH was adjusted to 7.0 to obtain solution 1; 1.5 g of poly-L-proline was sonicated into an additional 20 ml of DPBS and the pH was adjusted to 7.0 to give solution 2; 17 g (0.05 mol) of sucrose (the final concentration of sucrose in the cryopreservation solution was 0.5 mol/l) was dissolved under the influence of ultrasound in 25 ml of DPBS, and after complete dissolution of sucrose, 10 ml of ethylene glycol was added to obtain solution 3; after returning to room temperature, solution 1, solution 2 and solution 3 were mixed well, the pH was adjusted and the mixture was diluted to 100 ml DPBS for later use.

Замораживающий уравновешивающий раствор b (аналогичный замораживающему уравновешивающему раствору а; общий объем: 100 мл): 2,0 г ПВС растворяли в 40 мл DPBS на водяной бане при 80°С с использованием магнитной мешалки при нагревании и доводили рН до 7,0 после полного растворения ПВС; к раствору добавляли 7,5 мл этиленгликоля и тщательно перемешивали, регулировали рН и разбавляли смесь до 100 мл с помощью DPBS для последующего применения.Freeze equilibration solution b (similar to freeze equilibration solution a; total volume: 100 ml): 2.0 g of PVA was dissolved in 40 ml of DPBS in a water bath at 80° C. using a magnetic stirrer while heating and the pH was adjusted to 7.0 after complete dissolution of PVA; 7.5 ml of ethylene glycol was added to the solution and mixed thoroughly, the pH was adjusted and the mixture was diluted to 100 ml with DPBS for later use.

Криоконсервирующий раствор С, содержащий на 1 мл: 10% (об/об) этиленгликоля, 20% (об/об) фетальной бычьей сыворотки, сахарозу в концентрации 0,5 М, и остальное составляет DPBS.Cryopreservation solution C containing per ml: 10% (v/v) ethylene glycol, 20% (v/v) fetal bovine serum, sucrose at a concentration of 0.5 M, and the rest is DPBS.

Замораживающий уравновешивающий раствор с, содержащий на 1 мл: 7,5% (об/об) этиленгликоля, 20% (об/об) фетальной бычьей сыворотки, и остальное составляет DPBS.Freezing equilibration solution c containing per ml: 7.5% (v/v) ethylene glycol, 20% (v/v) fetal bovine serum, and the balance is DPBS.

Пример 1Example 1

Размораживающий раствор I содержит на 100 мл:Defrosting solution I contains per 100 ml:

Размораживающий раствор II содержит на 100 мл:Thawing solution II contains per 100 ml:

Размораживающий раствор III содержит на 100 мл:Thawing solution III contains per 100 ml:

Размораживающий раствор IV содержит на 100 мл:Thawing solution IV contains per 100 ml:

Пример 2Example 2

Сравнительный пример 1:Comparative example 1:

Размораживающий раствор I содержит: сахарозу в концентрации 1,0 моль/л, 20% сыворотки, и остальное составляет DPBS;Thawing solution I contains: sucrose at a concentration of 1.0 mol/l, 20% serum, and the rest is DPBS;

Размораживающий раствор II содержит: сахарозу в концентрации 0,5 моль/л, 20% сыворотки, и остальное составляет DPBS;Thawing solution II contains: sucrose at a concentration of 0.5 mol/l, 20% serum, and the rest is DPBS;

Размораживающий раствор III содержит: сахарозу в концентрации 0,25 моль/л, 20% сыворотки, и остальное составляет DPBS;Thawing solution III contains: sucrose at a concentration of 0.25 mol/l, 20% whey, and the rest is DPBS;

Размораживающий раствор IV содержит: сахарозу в концентрации 0 моль/л, 20% сыворотки, и остальное составляет DPBS.Thawing solution IV contains: sucrose at 0 mol/l, 20% serum, and the rest is DPBS.

Вариант применения 1. Размораживание криоконсервированных ооцитовApplication 1. Thawing of cryopreserved oocytes

Способ криоконсервирования ооцитов согласно настоящему изобретению, в частности, включает следующие стадии: сначала ооциты уравновешивали в замораживающем уравновешивающем растворе в течение 5 минут; затем ооциты уравновешивали в криоконсервирующем растворе в течение 45 секунд; ооциты, уравновешенные в криоконсервирующем растворе, загружали на соломинки; затем соломинки быстро помещали в жидкий азот (-196°С) и закрывали соломинки для криоконсервации.The method for cryopreserving oocytes according to the present invention specifically includes the following steps: first, the oocytes were equilibrated in a freezing equilibration solution for 5 minutes; then the oocytes were equilibrated in a cryopreservative solution for 45 seconds; oocytes equilibrated in a cryopreservative solution were loaded onto straws; then the straws were quickly placed in liquid nitrogen (-196°C) and the straws were closed for cryopreservation.

Ооциты мыши размораживали с помощью размораживающих реагентов, полученных из составов из Примера 1 и Примера 2, и размораживающих реагентов, полученных в Сравнительном примере 1. Способ размораживания ооцитов, в частности, включает следующие стадии: ооциты быстро переносили из жидкого азота в размораживающий раствор I при 37°С и инкубировали в течение 3-5 минут; затем ооциты последовательно инкубировали в размораживающем растворе II, размораживающем растворе III и размораживающем растворе IV в течение 3 минут в каждом при комнатной температуре; затем ооциты переносили в культуральную среду, и инкубировали в инкубаторе с содержанием диоксида углерода 5% при 37°С в течение 2 часов, и рассчитывали показатель выживаемости ооцитов (Таблица 1).Mouse oocytes were thawed using the thawing reagents prepared from the formulations of Example 1 and Example 2 and the thawing reagents prepared in Comparative Example 1. The method for thawing oocytes specifically includes the following steps: 37°C and incubated for 3-5 minutes; then the oocytes were successively incubated in thawing solution II, thawing solution III and thawing solution IV for 3 minutes each at room temperature; then, the oocytes were transferred to the culture medium, and incubated in a 5% carbon dioxide incubator at 37° C. for 2 hours, and the oocyte survival rate was calculated (Table 1).

Вариант применения 2. Размораживание криоконсервированных эмбрионовApplication 2: Thawing cryopreserved embryos

Способ криоконсервирования эмбрионов согласно настоящему изобретению, в частности, включает следующие стадии: сначала эмбрионы уравновешивали в замораживающем уравновешивающем растворе в течение 8 минут; затем эмбрионы уравновешивали в криоконсервирующем растворе, полученном в соответствии с составом, указанным выше, в течение 50 секунд; эмбрионы, уравновешенные в криоконсервирующем растворе, загружали на соломинки; затем соломинки быстро помещали в жидкий азот (-196°С) и закрывали соломинки для криоконсервации.The method for cryopreserving embryos according to the present invention specifically includes the following steps: first, the embryos were equilibrated in a freezing equilibration solution for 8 minutes; then the embryos were equilibrated in a cryopreservative solution prepared in accordance with the composition indicated above for 50 seconds; embryos equilibrated in cryopreservation solution were loaded onto straws; then the straws were quickly placed in liquid nitrogen (-196°C) and the straws were closed for cryopreservation.

Эмбрионы мыши размораживали с помощью размораживающих реагентов, полученных из составов из Примера 1 и Примера 2, и размораживающих реагентов, полученных в Сравнительном примере 1. Способ размораживания эмбрионов, в частности, включает следующие стадии: эмбрионы быстро переносили из жидкого азота в размораживающий раствор I при 37°С и инкубировали в течение 3 5 минут; затем эмбрионы последовательно инкубировали в размораживающем растворе II, размораживающем растворе III и размораживающем растворе IV в течение 3 минут в каждом при комнатной температуре; затем эмбрионы переносили в культуральную среду, и инкубировали в инкубаторе с содержанием диоксида углерода 5% при 37°С в течение 2 часов, и рассчитывали показатель выживаемости эмбрионов (Таблица 2).Mouse embryos were thawed using the thawing reagents prepared from the formulations of Example 1 and Example 2 and the thawing reagents prepared in Comparative Example 1. The method for thawing embryos specifically comprises the steps of rapidly transferring embryos from liquid nitrogen to thawing solution I at 37°C and incubated for 35 minutes; then the embryos were successively incubated in thawing solution II, thawing solution III and thawing solution IV for 3 minutes each at room temperature; then, the embryos were transferred to a culture medium, and incubated in a 5% carbon dioxide incubator at 37° C. for 2 hours, and the embryo survival rate was calculated (Table 2).

Показатель выживаемости в примерах настоящего изобретения представляет собой среднее для показателя выживаемости в 3-12 экспериментах, выполненных в двух повторностях.The survival rate in the examples of the present invention is the average of the survival rate in 3-12 experiments performed in duplicate.

Из данных, приведенных в Таблицах 1 и 2, видно, что показатель выживаемости ооцитов, размороженных с использованием размораживающего реагента согласно настоящему изобретению, составлял более 94%, даже вплоть до 98,6%, и что показатель выживаемости размороженных эмбрионов составлял более 97%, что значительно выше, чем в Сравнительном примере 1 (коммерчески доступные размораживающие растворы), что указывает на то, что эффективность размораживающего реагента превосходила эффективность традиционных размораживающих растворов для витрификации при размораживании ооцитов и эмбрионов. Кроме того, размораживающий реагент согласно настоящему изобретению не содержит сыворотки, характеризуется низким риском в отношении паразитарных биологических загрязнений и т.п. и является более подходящим для сохранения стабильности при пассировании клеток или тканей.From the data shown in Tables 1 and 2, it can be seen that the survival rate of oocytes thawed using the thawing reagent of the present invention was over 94%, even up to 98.6%, and that the survival rate of thawed embryos was over 97%, which is significantly higher than in Comparative Example 1 (commercially available thawing solutions), indicating that the effectiveness of the thawing reagent was superior to that of conventional vitrification thawing solutions in thawing oocytes and embryos. In addition, the thawing reagent of the present invention is serum-free, has a low risk of parasitic biological contaminants, and the like. and is more suitable for maintaining stability when passaged cells or tissues.

Вариант применения 3. Размораживание криоконсервированных интактных овариальных органов или срезов овариальных тканейApplication Option 3: Thawing cryopreserved intact ovarian organs or ovarian tissue sections

Комбинацию вышеуказанного замораживающего уравновешивающего раствора а и криоконсервирующего раствора А использовали для криоконсервирования среза овариального органа 3-дневных новорожденных мышей и среза овариальной ткани половозрелых мышей, а затем для размораживания использовали вышеуказанный размораживающий раствор из Примера 1. Способ замораживания и размораживания включает следующие стадии: интактные овариальные органы или срезы овариальных тканей уравновешивали в уравновешивающем растворе при комнатной температуре в течение 25 минут, уравновешивали в полученном криоконсервирующем растворе в течение 15 минут и затем загружали на соломинки. Соломинки помещали в жидкий азот для консервации. После размораживания интактные овариальные органы или срезы овариальных тканей инкубировали в культуральных средах (10% FBS+а-МЕМ) в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°С для размораживания в течение 2 часов, а затем фиксировали 4% параформальдегидом, заливали в парафин и окрашивали НЕ для морфологического исследования.The combination of the above freezing equilibration solution a and cryopreservation solution A was used to cryopreserve a section of the ovarian organ of 3-day-old neonatal mice and a section of the ovarian tissue of adult mice, and then the above thawing solution from Example 1 was used for thawing. The freezing and thawing method includes the following steps: intact ovarian organs or sections of ovarian tissues were equilibrated in an equilibrating solution at room temperature for 25 minutes, equilibrated in the resulting cryopreservation solution for 15 minutes, and then loaded onto straws. The straws were placed in liquid nitrogen for preservation. After thawing, intact ovarian organs or sections of ovarian tissues were incubated in culture media (10% FBS+a-MEM) in an incubator with 5% CO ₂ at 37°C to thaw for 2 hours, and then fixed with 4% paraformaldehyde, embedded in paraffin and stained with HE for morphological examination.

Результаты представлены на ФИГ. 14, при этом ФИГ. 1 представляет собой фотографию окрашенного среза свежего незамороженного овариального органа; ФИГ. 2 представляет собой фотографию окрашенного среза овариального органа, размороженного с использованием размораживающего раствора из Примера 1; ФИГ. 3 представляет собой фотографию окрашенного среза свежей незамороженной овариальной ткани; и ФИГ. 4 представляет собой фотографию окрашенного среза овариальной ткани, размороженной с использованием размораживающего раствора из Примера 1. Видно, что после размораживания с использованием размораживающего раствора из Примера 1 фолликулярная структура и интерстициальная структура овариальных органов или овариальных тканей оставались относительно интактными, цитоплазма клеток была относительно однородной и слегка окрашенной в относительно большом количестве, а сокращения ядер и глубокое окрашивание были относительно умеренными; структура сосудистой стенки оставалась интактной, разрушение просвета было умеренным, цитоплазма клеток эндотелия была однородной и слегка окрашенной в относительно большом количестве, сокращения ядер и глубокое окрашивание были относительно умеренными, что свидетельствовало о надлежащем размораживающем эффекте.The results are shown in FIG. 14, while FIG. 1 is a photograph of a stained section of a fresh unfrozen ovarian organ; FIG. 2 is a photograph of a stained section of an ovarian organ thawed using the thawing solution from Example 1; FIG. 3 is a photograph of a stained section of fresh unfrozen ovarian tissue; and FIG. 4 is a photograph of a stained section of ovarian tissue thawed using the thawing solution of Example 1. It can be seen that after thawing using the thawing solution of Example 1, the follicular structure and interstitial structure of the ovarian organs or ovarian tissues remained relatively intact, the cytoplasm of the cells was relatively homogeneous and lightly stained in a relatively large amount, and nuclear contractions and deep staining were relatively moderate; the structure of the vascular wall remained intact, the destruction of the lumen was moderate, the cytoplasm of endothelial cells was homogeneous and slightly stained in a relatively large amount, nuclear contractions and deep staining were relatively moderate, indicating a proper thawing effect.

Выше были описаны конкретные примеры согласно настоящему изобретению. Однако настоящее изобретение не ограничено вышеприведенными примерами. Какие-либо модификации, эквиваленты, улучшения и т.п., выполненные без отступления от сущности и принципа настоящего изобретения, безусловно подпадают под действие правовой охраны настоящего изобретения.The specific examples according to the present invention have been described above. However, the present invention is not limited to the above examples. Any modifications, equivalents, improvements, etc., made without departing from the essence and principle of the present invention, will certainly fall under the legal protection of the present invention.

Claims

1. Thawing solution containing per 100 ml:

- 0.1-50 g of biomimetic material to suppress the growth of ice,

- a water-soluble saccharide at a concentration of 0-1.0 mol/l, and

- the rest is a buffer,

wherein the biomimetic material for suppressing ice buildup is atactic polyvinyl alcohol (PVA) having a syndiotacticity of 15-65%, a molecular weight of 10-500 kDa, or a combination of said atactic polyvinyl alcohol (PVA), an amino acid, a polypeptide and/or a polyamino acid ,

wherein the amino acid is selected from one or a combination of two or more of arginine, threonine, proline, lysine, histidine, glutamine, aspartic acid, glycine; And

wherein the polypeptide is one or more of L-Thr-L-Arg (TR), L-Thr-L-Pro (TP), L-Arg-L-Thr (RT), L-Pro-L-Thr ( PT), L-Thr-L-Arg-L-Thr (TRT), L-Thr-L-Pro-L-Thr (TPT), or L-Thr-L-Cys-L-Thr (TCT).

2. Defrost solution according to claim 1, characterized in that the polyamino acid is a homopolymer (with a degree of polymerization ≥2, preferably 2-40, for example, 6, 8, 15 and 20) of at least one selected from lysine, arginine, proline, threonine, histidine, glutamic acid, aspartic acid, glycine;

PVA is characterized by syndiotacticity of 45-65%; And

PVA is characterized by a degree of hydrolysis of 80-99%, 82-87%, 87-89%, 89-99% or 98-99%.

3. Defrost solution according to claim 1 or 2, characterized in that the content of biomimetic material to suppress the growth of ice is 1.0-30 g;

while preferably biomimetic material to suppress the growth of ice contains 1.0-6.0 g of PVA;

preferably, the biomimetic material for suppressing ice buildup contains 1.0-30 g of an amino acid, and more preferably, the amino acid is a combination of arginine and threonine;

preferably, the biomimetic material for suppressing ice buildup contains 0.1-9.0 g of a polyamino acid;

preferably, the biomimetic material for suppressing ice buildup contains 1.0-50 g of the polypeptide;

preferably, the biomimetic material for inhibiting ice buildup is a combination of atactic PVA and an amino acid, polypeptide and/or polyamino acid.

4. Defrost solution according to any one of paragraphs. 1-3, characterized in that the water-soluble saccharide may be at least one of a non-reducing disaccharide, a water-soluble polysaccharide, and a glycoside, for example, selected from sucrose, trehalose, water-soluble cellulose (for example, hydroxypropyl methylcellulose), and polysucrose;

preferably, the buffer may be selected from at least one of DPBS, HEPES buffered HTF buffer, and other cell buffers.

5. Defrost reagent containing defrost solution I, defrost solution II, defrost solution III and defrost solution IV, and defrost solutions I-IV have different compositions according to any one of paragraphs. 1-4.

6. The thawing agent according to claim 5, characterized in that the concentration of the water-soluble saccharide in the defrosting solution II is preferably 50-100% of the concentration in the defrosting solution I, the concentration of the water-soluble saccharide in the defrosting solution III is 50-100% of the concentration in the defrosting solution II, and the concentration of water-soluble saccharide in the defrosting solution IV is 0; preferably in defrosting solutions I-IV, for example, the concentrations of the biomimetic material to suppress the build-up of ice are the same or different, for example, the concentration of the biomimetic material to suppress the build-up of ice in the defrosting solution II is 50-100% of the concentration in the defrosting solution I, the concentration of the biomimetic material to suppress the build-up of ice in the defrosting solution III is 50-100% of the concentration in the defrosting solution II, and the concentration of the biomimetic material for suppressing the build-up of ice in the defrosting solution IV is 0;

defrosting solutions I-IV preferably contain 1.0-6.0 g of atactic PVA; and preferably the concentrations of atactic PVA in the defrosting solutions I-IV are the same.

7. Defrost reagent according to claim 5 or 6, characterized in that in the defrost reagent, the defrost solution I contains per 100 ml: 1.0-50 g of at least one of the amino acid and polypeptide, 1.0-5.0 g of atactic PVA, a water-soluble saccharide at a concentration of 1.0 mol/l, and the rest is buffer;

defrosting solution II contains per 100 ml: 1.0-25 g of at least one of an amino acid and a polypeptide, 1.0-5.0 g of atactic PVA, a water-soluble saccharide at a concentration of 0.5 mol/l, and the rest is a buffer;

defrosting solution III contains per 100 ml: 1.0-12.5 g of at least one of an amino acid and a polypeptide, 1.0-5.0 g of atactic PVA, a water-soluble saccharide at a concentration of 0.25 mol/l, and the rest is buffer;

thawing solution IV contains per 100 ml: 0-6.25 g of at least one of the amino acid and polypeptide, 1.0-5.0 g of atactic PVA, and the balance is buffer.

8. Defrost reagent according to claim 5 or 6, characterized in that the defrost solution I contains per 100 ml: 1.0-5.0 g of atactic PVA, a water-soluble saccharide at a concentration of 1.0 mol/l, and the rest is a buffer;

defrosting solution II contains per 100 ml: 1.0-5.0 g of atactic PVA, a water-soluble saccharide at a concentration of 0.5 mol/l, and the rest is a buffer;

defrosting solution III contains per 100 ml: 1.0-5.0 g of atactic PVA, a water-soluble saccharide at a concentration of 0.25 mol/l, and the rest is buffer;

thawing solution IV contains per 100 ml: 1.0-5.0 g of atactic PVA, and the rest is buffer;

preferably defrosting solution I contains per 100 ml: 0.1-9.0 g of polyamino acid, 1.0-5.0 g of atactic PVA, water-soluble saccharide at a concentration of 1.0 mol/l, and the rest is a buffer;

defrosting solution II contains per 100 ml: 0.1-4.5 g of polyamino acid, 1.0-5.0 g of atactic PVA, water-soluble saccharide at a concentration of 0.5 mol/l, and the rest is a buffer;

defrosting solution III contains per 100 ml: 0.1-2.3 g of polyamino acid, 1.0-5.0 g of atactic PVA, water-soluble saccharide at a concentration of 0.25 mol/l, and the rest is a buffer;

thawing solution IV contains per 100 ml: 0-1.2 g of polyamino acid, 1.0-5.0 g of atactic PVA, and the rest is buffer.

9. A method of thawing a cryopreserved cell or tissue using a thawing reagent according to any one of paragraphs. 5-8, including:

thawing the cryopreserved cell or tissue in thawing solution I at 37°C for 3-5 minutes, and then sequentially thawing the cryopreserved cell or tissue in thawing solution II, thawing solution III and thawing solution IV for 3-5 minutes at room temperature.

10. The use of a defrosting solution according to any one of paragraphs. 1-4 or defrosting reagent according to any one of paragraphs. 5-8 for thawing a cryopreserved oocyte, embryo, tissue, or organ, wherein, for example, the tissue or organ is an ovarian tissue or ovarian organ.