RU2790941C1

RU2790941C1 - Method for determining the risk of developing inflammatory bowel disease by characterizing metabolites

Info

Publication number: RU2790941C1
Application number: RU2022105621A
Authority: RU
Inventors: Игорь Вениаминович Маев; Вадим Маркович Говорун; Светлана Владимировна Лямина; Наталья Борисовна Захаржевская; Дмитрий Александрович Кардонский; Дмитрий Николаевич Конанов; Артемий Сергеевич Силантьев; Дмитрий Николаевич Андреев
Filing date: 2022-03-02
Publication date: 2023-02-28

Abstract

FIELD: gastroenterology.

SUBSTANCE: invention can be used to determine the risk of developing inflammatory bowel disease (IBD) based on the quantitative ratio of metabolite intensities normalized to the total ion current in a stool sample. The following metabolites are searched for and identified: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole stool by GC-MS with headspace extraction method and their relative intensities are calculated, normalized to the total ion current. Calculate the risk factor for the development of IBD according to the formula Kr=(n-Hexadecanoic acid[I])/(Hexanoic acid[I]*Indole[I]), where [I] is the intensity of the ion current of the analysed metabolite, normalized to the total ion current. If Kr is less than 50, the absence of the risk of developing IBD is determined. Kr from 50 to 100 is a "grey zone", a borderline result. If Kr is equal to or greater than 100, a high risk of developing IBD is determined.

EFFECT: reduction of the number of sample preparation steps due to the use of the latest method for the study of metabolites through headspace extraction followed by GC-MS analysis with a minimum number.

1 cl, 1 dwg, 2 ex

Description

Настоящая заявка относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и медицины. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу определения воспалительного заболевания кишечника у индивида, а именно выявлению маркеров воспалительных заболеваний кишечника по соотношению метаболитов в образцах стула.This application relates to the field of biotechnology, molecular biology and medicine. More specifically, the present invention relates to a method for determining inflammatory bowel disease in an individual, namely the detection of markers of inflammatory bowel disease by the ratio of metabolites in stool samples.

Воспалительные заболевания кишечника - гетерогенная группа заболеваний желудочно-кишечного тракта, в структуре которой различают болезнь Крона и язвенный колит. На сегодняшний день указанные патологии занимают одно из ведущих мест среди заболеваний органов пищеварения и остаются актуальной проблемой в области гастроэнтерологии, что обусловлено не только тяжестью течения заболеваний, но также частотой осложнений и летальностью (Burisch, J.; Munkholm, P. Inflammatory bowel disease epidemiology. Curr. Opin. Gastroenterol. 2013, 29, 357-362.). Высокий уровень вариабельности симптомов, скрытое течение и толерантность к терапии формируют сразу несколько задач: поиск новых ранних маркеров заболеваний и разработка новых вариантов терапии заболеваний, основанных на вновь открываемых механизмах патогенеза (Cosnes, J.; Gower-Rousseau, С; Seksik, P.; Cortot, A. Epidemiology and natural history of inflammatory bowel diseases. Gastroenterology 2011, 140, 1785-1794.). Два основных вида ВЗК - болезнь Крона и язвенный колит имеют различные варианты патогенеза и особенности течения заболеваний, однако на ранних стадиях трудно диагностируются, что зачастую способствует несвоевременному лечению (Baumgart, D.C.; Sandborn, W.J. Crohn's disease. Lancet 2012, 380, 1590-1605). В случае болезни Крона ошибочная диагностика провоцирует переход заболевания в тяжелую или хроническую форму (Ordas, I.; Eckmann, L.; Talamini, M.; Baumgart, D.C.; Sandborn, W.J. Ulcerative colitis. Lancet 2012, 380, 1606-1619.).Inflammatory bowel disease is a heterogeneous group of diseases of the gastrointestinal tract, in the structure of which Crohn's disease and ulcerative colitis are distinguished. To date, these pathologies occupy one of the leading places among diseases of the digestive system and remain an urgent problem in the field of gastroenterology, which is due not only to the severity of the disease, but also to the frequency of complications and mortality (Burisch, J.; Munkholm, P. Inflammatory bowel disease epidemiology Curr Opin Gastroenterol 2013, 29, 357-362). The high level of symptom variability, latent course and tolerance to therapy form several tasks at once: the search for new early markers of diseases and the development of new options for the treatment of diseases based on newly discovered mechanisms of pathogenesis (Cosnes, J.; Gower-Rousseau, C; Seksik, P. Cortot, A. Epidemiology and natural history of inflammatory bowel diseases Gastroenterology 2011, 140, 1785-1794.). The two main types of IBD - Crohn's disease and ulcerative colitis have different pathogenesis and course of the disease, but are difficult to diagnose in the early stages, which often contributes to delayed treatment (Baumgart, D.C.; Sandborn, W.J. Crohn's disease. Lancet 2012, 380, 1590-1605 ). In the case of Crohn's disease, misdiagnosis provokes the transition of the disease into a severe or chronic form. .

В этой связи основной проблемой, которую необходимо решать, является поиск новых вариантов ранней диагностики заболеваний. На сегодняшний день к вопросу изучения основ патогенеза ВЗК, а, соответственно, и новых принципов диагностики и терапии необходимо подходить комплексно. Значительный арсенал омиксных технологий является важнейшим этапом на пути поиска и последующей верификации наиболее информативных маркеров заболеваний (Yunki Yau, Rupert W Leong, Ming Zeng, Valerie С Wasinger Proteomics and metabolomics in inflammatory bowel disease J Gastroenterol Hepatol. 2013 Jul;28(7):1076-86.). Кроме того, необходимо разрабатывать дополнительные молекулярно-биологические тесты как на основе уже имеющихся омиксных данных, так и с применением новейших технологий. Ранняя диагностика должна при этом быть малоинвазивной или в идеале неинвазивной, для повышения охвата тестируемого населения. Известно, что инструментальные методы исследования, такие как колоноскопия, являясь "золотым стандартом" диагностики патологий ЖКТ, имеют соответствующие риски и вызывают чувство опасения у пациентов перед предстоящей процедурой. В свою очередь, данная настороженность может усугубить течение заболевания при несвоевременном обращении, что сводит к минимуму попытки выявить указанные патологии на ранней стадии.In this regard, the main problem that needs to be addressed is the search for new options for early diagnosis of diseases. To date, the issue of studying the basics of the pathogenesis of IBD, and, accordingly, the new principles of diagnosis and therapy, must be approached comprehensively. A significant arsenal of omics technologies is the most important step towards the search and subsequent verification of the most informative disease markers (Yunki Yau, Rupert W Leong, Ming Zeng, Valerie C Wasinger Proteomics and metabolomics in inflammatory bowel disease J Gastroenterol Hepatol. 2013 Jul;28(7): 1076-86.). In addition, it is necessary to develop additional molecular biological tests both on the basis of existing omics data and using the latest technologies. Early diagnosis should also be minimally invasive, or ideally non-invasive, to increase coverage of the testing population. It is known that instrumental methods of research, such as colonoscopy, being the "gold standard" for diagnosing gastrointestinal pathologies, have corresponding risks and cause fear in patients before the upcoming procedure. In turn, this alertness can aggravate the course of the disease in case of untimely treatment, which minimizes attempts to identify these pathologies at an early stage.

Молекулярные методы диагностики призваны не заменить, но дополнить инструментальные способы исследования. Такие биологические образцы, как сыворотка крови, кал, моча - являются кладезем полезной прогностической информации, а все более развивающиеся методы исследования молекулярных маркеров способствуют более глубокому пониманию механизмов патогенеза заболеваний.Molecular diagnostic methods are designed not to replace, but to supplement the instrumental methods of research. Biological samples such as blood serum, feces, urine are a storehouse of useful prognostic information, and more and more developing methods for studying molecular markers contribute to a deeper understanding of the mechanisms of disease pathogenesis.

Однако обилие молекулярных методов исследования приводит к формированию значительного объема неинтерпретируемых результатов. Особенно при анализе таких сложных структур, как геном, протеом или метаболом биологического образца. В этой связи необходимо найти удачное вычислительное решение, которое позволит перевести найденные маркеры из терминов молекулярной биологии в термины практической медицины, а именно, сформировать удобные для итогового прочтения результаты молекулярной диагностики.However, the abundance of molecular research methods leads to the formation of a significant amount of uninterpretable results. Especially when analyzing such complex structures as the genome, proteome or metabolome of a biological sample. In this regard, it is necessary to find a successful computational solution that will allow us to translate the found markers from the terms of molecular biology into the terms of practical medicine, namely, to form the results of molecular diagnostics that are convenient for final reading.

Известно, что воспалительные заболевания имеют в своей основе генетическую предрасположенность (Barrett, J.C.; Hansoul, S.; Nicolae, D.L.; Cho, J.H.; Duerr, R.H.; Rioux, J.D.; Brant, S.R.; Silverberg, M.S.; Taylor, K.D.; Barmada, M.M.; et al. Genome-wide association defines more than 30 distinct susceptibility loci for Crohn's disease. Nat. Genet. 2008, 40, 955-962.).It is known that inflammatory diseases are based on genetic predisposition (Barrett, J.C.; Hansoul, S.; Nicolae, D.L.; Cho, J.H.; Duerr, R.H.; Rioux, J.D.; Brant, S.R.; Silverberg, M.S.; Taylor, K.D.; Barmada , M.M.; et al. Genome-wide association defines more than 30 distinct susceptibility loci for Crohn's disease. Nat. Genet. 2008, 40, 955-962.).

Описаны и достоверно подтверждены ассоциации целого ряда полиморфизмов генов и продуктов генной активности - белков-маркеров в патогенезе язвенного колита и болезни Крона (Franke, A.; McGovern, D.P.; Barrett, J.C.; Wang, K.; Radford-Smith, G.L.; Ahmad, Т.; Lees, C.W.; Balschun, Т.; Lee, J.; Roberts, R.; et al. Genome-wide meta-analysis increases to 71 the number of confirmed Crohn's disease susceptibility loci. Nat. Genet. 2010, 42, 1118-1125). Однако процессы, способствующие накоплению продуктов биохимических реакций, также связаны с патогенезом заболеваний, а некоторые типы метаболитов могут уже на ранних стадиях сигнализировать о наличии воспалительной реакции в пределах ЖКТ. Важно отметить, что развитию практически любого заболевания ЖКТ предшествует воспалительная реакция, глубина и особенности течения которой при прочей совокупности факторов могут определить тип развивающейся патологии. Но выявить именно воспалительную реакцию на уровне имеющихся биохимических, генетических или иных существующих тестов невозможно, поскольку даже сам пациент не связывает транзиторные нарушения пищеварения с развитием патологии. Поэтому тестирование должно быть в первую очередь направлено на выявление воспаления в пределах ЖКТ, тогда как последующие диагностические процедуры уже будут способствовать уточнению диагноза.Associations of a number of polymorphisms of genes and products of gene activity - marker proteins in the pathogenesis of ulcerative colitis and Crohn's disease have been described and reliably confirmed (Franke, A.; McGovern, D.P.; Barrett, J.C.; Wang, K.; Radford-Smith, G.L.; Ahmad , T.; Lees, C.W.; Balschun, T.; Lee, J.; Roberts, R.; et al. Genome-wide meta-analysis increases to 71 the number of confirmed Crohn's disease susceptibility loci. Nat. Genet. 2010, 42, 1118-1125). However, the processes that contribute to the accumulation of products of biochemical reactions are also associated with the pathogenesis of diseases, and some types of metabolites can signal the presence of an inflammatory reaction within the gastrointestinal tract already at an early stage. It is important to note that the development of almost any disease of the gastrointestinal tract is preceded by an inflammatory reaction, the depth and course of which, with other factors, can determine the type of developing pathology. But it is impossible to identify an inflammatory reaction at the level of available biochemical, genetic or other existing tests, since even the patient himself does not associate transient digestive disorders with the development of pathology. Therefore, testing should be primarily aimed at identifying inflammation within the gastrointestinal tract, while subsequent diagnostic procedures will already help clarify the diagnosis.

Среди прочих молекулярно-биологических направлений метаболомика является наиболее динамичной областью исследований для поиска маркеров воспаления (McIntosh, K.; Reed, D.E.; Schneider, Т.; Dang, F.; Keshteli, A.H.; de Palma, G.; Madsen, K.; Bercik, P.; Vanner, S. Fodmaps alter symptoms and the metabolome of patients with IBS: A randomised controlled trial. Gut 2016). Происходящие в ЖКТ процессы пищеварения и естественный результат функциональной активности микрофлоры в полной мере могут быть оценены путем метаболомного анализа стула пациента. При данном исследовании большое внимание уделяется оценке комплекса короткоцепочечных жирных кислот (КЖК), активно продуцируемых как микрофлорой ЖКТ, так и формирующихся в процессе пищеварения (De Preter, V.; Machiels, K.; Joossens, М.; Arijs, I.; Matthys, С.; Vermeire, S.; Rutgeerts, P.; Verbeke, K. Faecal metabolite profiling identifies medium-chain fatty acids as discriminating compounds in IBD. Gut2015, 64, 447-458). Известно, что количественное изменение некоторых КЖК связано с популяционными изменениями в составе микрофлоры вследствие развития патологии ЖКТ (Rehman, A.; Lepage, P.; Nolte, A.; Hellmig, S.; Schreiber, S.; Ott, S.J. Transcriptional activity of the dominant gut mucosal microbiota in chronic inflammatory bowel disease patients. J. Med. Microbiol. 2010, 59, 1114-1122). Однако данная оценка проводится таргетно, т.е. внимание уделяется в большей степени относительному количественному содержанию ацетата, пропионата и бутирата, тогда как спектр легколетучих соединений (ЛС) значительно более разнообразен и должен быть исследован совокупно. Новейшие инструменты для оценки летучего состава образцов стула уже активно эксплуатируются в формате научных исследований и работ. Такие методы как газожидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией (ГХ-МС), позволяют получить исчерпывающую информацию о метаболитах в анализируемых образцах (Ahmed, R Greenwood, В Costello, N Ratcliffe, С S Probert. Investigation of faecal volatile organic metabolites as novel diagnostic biomarkers in inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther. 2016 Mar;43(5):596-611). Однако именно для образцов стула важно избрать такой способ пробоподготовки, который не затрагивал бы существенно количественно анализируемый спектр летучих соединений. Для этих целей ГХ-МС дополняется методом парофазной экстракции, что позволяет минимизировать этапы пробоподготовки и получить более полную информацию о содержании в образце короткоцепочечных, среднецепочных и длинноцепочечных жирных кислот, кислот с фенильным радикалом, альдегидов, гетероциклов и других (Sofia El Manouni El Hassani, Ruud J Soers, Daniel J С Berkhout, Hendrik J Niemarkt, Hans Weda, Tamara Nijsen, Marc A Benninga, Nanne K H de Boer, Tim G J de Meij, Hugo H Knobel. Optimized sample preparation for fecal volatile organic compound analysis by gas chromatography-mass spectrometry. Metabolomics. 2020 Oct 10;16(10):112).Among other molecular biology areas, metabolomics is the most dynamic area of research for the search for markers of inflammation (McIntosh, K.; Reed, D.E.; Schneider, T.; Dang, F.; Keshteli, A.H.; de Palma, G.; Madsen, K. ; Bercik, P.; Vanner, S. Fodmaps alter symptoms and the metabolome of patients with IBS: A randomized controlled trial. Gut 2016). The processes of digestion occurring in the gastrointestinal tract and the natural result of the functional activity of the microflora can be fully assessed by metabolomic analysis of the patient's stool. In this study, much attention is paid to the assessment of the complex of short-chain fatty acids (SCFA), actively produced both by the microflora of the gastrointestinal tract, and formed during digestion (De Preter, V.; Machiels, K.; Joossens, M.; Arijs, I.; Matthys , C.; Vermeire, S.; Rutgeerts, P.; Verbeke, K. Faecal metabolite profiling identifies medium-chain fatty acids as discriminating compounds in IBD. Gut2015, 64, 447-458. It is known that the quantitative change of some SCFAs is associated with population changes in the composition of the microflora due to the development of gastrointestinal pathology (Rehman, A.; Lepage, P.; Nolte, A.; Hellmig, S.; Schreiber, S.; Ott, S.J. Transcriptional activity of the dominant gut mucosal microbiota in chronic inflammatory bowel disease patients J. Med. Microbiol. 2010, 59, 1114-1122). However, this assessment is carried out on a targeted basis, i.e. attention is paid more to the relative quantitative content of acetate, propionate and butyrate, while the spectrum of volatile compounds (VOCs) is much more diverse and should be studied collectively. The latest tools for assessing the volatile composition of stool samples are already being actively used in the format of scientific research and work. Methods such as gas-liquid chromatography combined with mass spectrometry (GC-MS) provide comprehensive information on metabolites in the analyzed samples (Ahmed, R Greenwood, B Costello, N Ratcliffe, C S Probert. Investigation of faecal volatile organic metabolites as a novel diagnostic biomarkers in inflammatory bowel disease Aliment Pharmacol Ther 2016 Mar;43(5):596-611). However, it is important for stool samples to choose a sample preparation method that would not significantly affect the quantitatively analyzed spectrum of volatile compounds. For these purposes, GC-MS is supplemented by the headspace extraction method, which allows minimizing the stages of sample preparation and obtaining more complete information about the content of short-chain, medium-chain and long-chain fatty acids, acids with a phenyl radical, aldehydes, heterocycles and others in the sample (Sofia El Manouni El Hassani, Ruud J Soers, Daniel J C Berkhout, Hendrik J Niemarkt, Hans Weda, Tamara Nijsen, Marc A Benninga, Nanne K H de Boer, Tim G J de Meij, Hugo H Knobel Optimized sample preparation for fecal volatile organic compound analysis by gas chromatography- mass spectrometry Metabolomics 2020 Oct 10;16(10):112).

Метод парофазной экстракции с последующим анализом ЛС позволяет получить информацию о более чем 200 соединениях и произвести количественное профилирование в рамках сравнительного анализа проб стула от пациентов с ВЗК и обследуемых лиц без патологии, т.е. нормы (Zakharzhevskaya D. Kardonsky, D. Konanov, A. Silantyev, A. Troshenkova, S. Lyamina, I. Kolesnikova, E. Zhgun, E. Ilina, I. Maev, V. Govorun. HS-GC/MS-based metabolomics approach for volatile compounds analysis in IBD. N. UEG Journal Vol 9 Issue 8, Oct 2021, p.471).The method of headspace extraction with subsequent analysis of drugs allows you to obtain information on more than 200 compounds and perform quantitative profiling in the framework of a comparative analysis of stool samples from patients with IBD and examined individuals without pathology, i.e. norms (Zakharzhevskaya D. Kardonsky, D. Konanov, A. Silantyev, A. Troshenkova, S. Lyamina, I. Kolesnikova, E. Zhgun, E. Ilina, I. Maev, V. Govorun. HS-GC/MS-based metabolomics approach for volatile compounds analysis in IBD, N. UEG Journal Vol 9 Issue 8, Oct 2021, p.471).

Но решение задачи ранней диагностики лежит не только в области применения новейших методов исследования, но и надлежащей интерпретации получаемых данных и трансляции результатов в область практической медицины. Для этих целей необходимым является подбор адекватного математического решения, основанного на данных статистической обработки. Применение логистической регрессии или классификаторов по типу Байесовского классификатора позволяет с высокой степенью достоверности сформировать математическое правило, позволяющее оценивать конкретные параметры метаболомного анализа и переводить их в формат числового значения риска развития патологии в пределах ЖКТ. Сформированные значения рисков позволят выявить группы лиц, для которых необходимо проведение подтверждающих диагностических процедур.But the solution to the problem of early diagnosis lies not only in the application of the latest research methods, but also in the proper interpretation of the data obtained and the translation of the results into the field of practical medicine. For these purposes, it is necessary to select an adequate mathematical solution based on statistical processing data. The use of logistic regression or classifiers like the Bayesian classifier allows, with a high degree of certainty, to form a mathematical rule that allows evaluating specific parameters of metabolomic analysis and converting them into the format of a numerical value of the risk of developing pathology within the gastrointestinal tract. The formed risk values will make it possible to identify groups of persons for whom it is necessary to carry out confirmatory diagnostic procedures.

Таким образом, в целях повышения эффективности выявления воспалительных заболеваний на ранней стадии необходимо выявить наборы метаболитов, комбинации которых достоверно характеризуют указанную патологию. Для оценки потенциала данного способа необходимо рассмотреть имеющиеся в данной области заявки по выявлению маркеров воспаления в образцах стула и предлагаемые схемы интерпретации получаемых данных.Thus, in order to increase the efficiency of detecting inflammatory diseases at an early stage, it is necessary to identify sets of metabolites, combinations of which reliably characterize this pathology. To assess the potential of this method, it is necessary to consider the applications available in the field for the detection of inflammatory markers in stool samples and the proposed schemes for interpreting the data obtained.

Международная заявка WO/2021/113989 описывает способ диагностики болезни Крона и язвенного колита на основании определения метаболитов в образцах мочи, таких как серии, гипоксантин, кинуренин, треонин, диметилглицин, триптофан, индоксилсульфат, фенилацетилглутамин, сиаловая кислота, 5-гидрокси-6-индолил -о-сульфат, 5-(Δ-карбоксибутил)гомоцистеин и/или анион, имеющий m/z:RMT:полярность 345,1553:0,770:n, также предлагается определение таких метаболитов в образцах стула, как кетодезоксихолевая кислота, холевая кислота, холин, триптофан, триметиллизин, серин, масляная кислота, молочная кислота, гипоксантин и/или гуанин.International application WO/2021/113989 describes a method for diagnosing Crohn's disease and ulcerative colitis based on the determination of metabolites in urine samples, such as serine, hypoxanthine, kynurenine, threonine, dimethylglycine, tryptophan, indoxyl sulfate, phenylacetylglutamine, sialic acid, 5-hydroxy-6- indolyl-o-sulfate, 5-(Δ-carboxybutyl)homocysteine and/or an anion having an m/z:RMT:polarity of 345.1553:0.770:n, detection of metabolites in stool samples such as ketodeoxycholic acid, cholic acid is also suggested , choline, tryptophan, trimethyllysine, serine, butyric acid, lactic acid, hypoxanthine and/or guanine.

Международная заявка US 2018/0203018 описывает способ идентификации фенотипа болезни Крона у обследуемых, в основе которого лежит определение методом масс-спектрометрии трех и более идентифицированных метаболитов в разбавленном образце фекалий. Идентифицированные метаболиты выбирают из общего пула 21 метаболитов, сопоставляя полученные данные со средними уровнями метаболитов у здоровых субъектов. В качестве метаболитов интереса заявлены гликохолат, таурохолат и хенодезоксигликохолат. Гликохолат в указанном контексте используется в качестве маркера, определяющего БК, а повышенные уровни таурохолата или хенодезоксигликохолата позволяют предположить поражение подвздошной кишки. Также для дифференцировки фенотипа болезни Крона предложено использование (Z)/4/гидроксифенил-ацетальдоксима - для поражения толстой кишки, а арахидоновая кислота или октадекатриеновая кислота - для идентификации поражения подвздошной кишки.International application US 2018/0203018 describes a method for identifying the phenotype of Crohn's disease in subjects, which is based on the determination by mass spectrometry of three or more identified metabolites in a diluted fecal sample. Identified metabolites are selected from a total pool of 21 metabolites, comparing the obtained data with the average levels of metabolites in healthy subjects. As metabolites of interest, glycocholate, taurocholate and chenodeoxy glycocholate are claimed. Glycocholate in this context is used as a marker for CD, and elevated levels of taurocholate or chenodeoxyglycocolate suggest ileal involvement. Also, to differentiate the phenotype of Crohn's disease, the use of (Z) / 4 / hydroxyphenyl-acetaldoxime - for lesions of the colon, and arachidonic acid or octadecatrienic acid - for the identification of lesions of the ileum has been proposed.

Международная заявка US 8679457 описывает способ диагностики ВЗК, в том числе болезни Крона и язвенного колита, на основании применения различных биомаркеров воспалительных заболеваний кишечника. Предлагается способ дифференциальной диагностики болезни Крона и язвенного колита по анализу биологического образца обследуемого для определения уровня (уровней) одного или нескольких биомаркеров воспалительного заболевания кишечника, включающих 6-бета-ОН-литохолат, 7-альфа-гидрокси-3-оксо-4-холестеноат (7-НОСА), дезоксихолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту и гиодезоксихолевую кислоту; а также сравнение уровня (уровней) одного или нескольких биомаркеров в образце с референсными уровнями, установленными для болезни Крона, язвенного колита.International application US 8679457 describes a method for the diagnosis of IBD, including Crohn's disease and ulcerative colitis, based on the use of various biomarkers of inflammatory bowel diseases. Proposed is a method for differential diagnosis of Crohn's disease and ulcerative colitis by analyzing a biological sample of the subject to determine the level (s) of one or more biomarkers of inflammatory bowel disease, including 6-beta-OH-lithocholate, 7-alpha-hydroxy-3-oxo-4-cholesthenoate (7-NOCA), deoxycholic acid, glycodeoxycholic acid and giodeoxycholic acid; and comparing the level(s) of one or more biomarkers in the sample with reference levels established for Crohn's disease, ulcerative colitis.

Международная заявка WO 2012/127213 описывает способ выявления или мониторинга синдрома раздраженного кишечника (СРК) или воспалительного заболевания кишечника на основании обнаружения одного или нескольких летучих органических соединений (ЛОС) в образце, взятом у субъекта. В качестве биологического материала заявлены фекалии или моча. Согласно представленным данным, ЛОС могут представлять собой один или несколько этиловых эфиров пропановой или бутановой кислот, пропановой кислоты, бутановой кислоты, метилового эфира бутановой кислоты, метилового эфира пропановой кислоты, 3-метилбутановой кислоты, 1-бутанола, 1-пропанола, индола, 2-метилпропановая кислота, 1-пентанол, гидроксимочевина, метилциклобутан, (R)-(-)-2-амино-1-пропанол, 2-гидроксипропанамид, гидразид уксусной кислоты, 2-пентанон, пиррол, 1-бутокси-2-пропанол, 2-бутанон, диметилдисульфид, 2-метил-1,3-диоксолан и диоксид серы.International application WO 2012/127213 describes a method for detecting or monitoring irritable bowel syndrome (IBS) or inflammatory bowel disease based on the detection of one or more volatile organic compounds (VOCs) in a sample taken from a subject. Feces or urine are declared as biological material. According to the data presented, VOCs can be one or more propanoic or butanoic acid ethyl esters, propanoic acid, butanoic acid, butanoic acid methyl ester, propanoic acid methyl ester, 3-methylbutanoic acid, 1-butanol, 1-propanol, indole, 2 -methylpropanoic acid, 1-pentanol, hydroxyurea, methylcyclobutane, (R)-(-)-2-amino-1-propanol, 2-hydroxypropanamide, acetic acid hydrazide, 2-pentanone, pyrrole, 1-butoxy-2-propanol, 2-butanone, dimethyl disulfide, 2-methyl-1,3-dioxolane and sulfur dioxide.

Рассмотренные международные заявки предлагают способы анализа метаболитов для верификации и дифференциальной диагностики таких заболеваний, как болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК). Предлагаемые технические решения позволяют выявить широкий спектр отличий анализируемых маркеров при сравнении патологии и нормы. При всем разнообразии выявляемых достоверно маркеров у предложенных способов есть недостатки, которые могут преодолены в описываемом в данной заявке способе.Reviewed international applications offer methods for the analysis of metabolites for verification and differential diagnosis of diseases such as Crohn's disease (CD) and ulcerative colitis (UC). The proposed technical solutions make it possible to identify a wide range of differences between the analyzed markers when comparing the pathology and the norm. With all the variety of reliably detected markers, the proposed methods have disadvantages that can be overcome in the method described in this application.

Во-первых, работа с образцом стула сопряжена с необходимостью использования различных способов пробоподготовки, а также анализа с применением твердофазной экстракции. Большинство описанных способов исследования метаболома стула содержат многоступенчатые протоколы пробоподготовки. Высушивание и расчет итоговых концентраций на количество исходного материала также не является универсальным методическим решением, а результат в свою очередь полностью зависит от выбранного метода анализа и технических параметров используемого оборудования. Парофазный способ экстракции полностью решает вопрос о методике пробоподготовки, сводя к минимуму число необходимых подготовительных этапов, кроме того, позволяет в полной мере проанализировать весь спектр летучих компонентов, без существенного влияния на исходные концентрационные соотношения компонентов метаболома в образце стула.First, working with a stool sample involves the need to use various methods of sample preparation, as well as analysis using solid phase extraction. Most of the described methods for studying the stool metabolome contain multi-stage sample preparation protocols. Drying and calculation of the final concentrations for the amount of starting material is also not a universal methodological solution, and the result, in turn, depends entirely on the chosen method of analysis and the technical parameters of the equipment used. The headspace extraction method completely solves the issue of the sample preparation technique, minimizing the number of necessary preparatory steps, in addition, it allows you to fully analyze the entire spectrum of volatile components, without a significant impact on the initial concentration ratios of the metabolome components in the stool sample.

Во-вторых, получая полный спектр летучих соединений, важнейшим этапом становится интерпретация полученных данных. В описанных способах анализа метаболома стула для диагностики ВЗК в качестве оценочной метрики приводят значения относительных концентраций компонентов метаболома, что в значительной степени является вариативным параметром и во многом определяется методическим подходом, используемым для анализа и идентификации метаболитов. Трансляция результатов описанных способов в область их практического применения, а именно, использования данных клиническими специалистами для диагностики ВЗК, является полностью невозможным. Получаемые данные хорошо интерпретируются профильными специалистами в области масс-спектрометрии и биоинформатики, тогда как должны легко быть интерпретируемы в первую очередь практикующими врачами. Описываемый в предлагаемой заявке способ решает проблему интерпретации, позволяя обработать в минимальном формате получаемые данные и благодаря представленному расчетному решению перевести значения относительных концентрации или интенсивностей анализируемых метаболитов в количественную метрику риска развития патологии.Second, when obtaining the full spectrum of volatile compounds, the most important step is the interpretation of the obtained data. In the described methods for analyzing the stool metabolome for the diagnosis of IBD, the values of the relative concentrations of the metabolome components are used as an evaluation metric, which is largely a variable parameter and is largely determined by the methodological approach used for the analysis and identification of metabolites. Translation of the results of the described methods in the field of their practical application, namely, the use of data by clinical specialists for the diagnosis of IBD, is completely impossible. The data obtained are well interpreted by specialists in the field of mass spectrometry and bioinformatics, while they should be easily interpreted primarily by practitioners. The method described in the proposed application solves the problem of interpretation, allowing processing the received data in a minimal format and, thanks to the presented calculation solution, converting the values of the relative concentrations or intensities of the analyzed metabolites into a quantitative metric of the risk of developing pathology.

Описание изобретенияDescription of the invention

Авторами изобретения был разработан способ выявления воспалительных заболеваний кишечника на основании данных количественного соотношения интенсивностей следующих метаболитов: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole. Измерение метаболитов необходимо проводить в образце стула методом ГХ-МС с парофазным способом экстракции. Полученные значения интенсивностей, нормированные на суммарный ионный ток, должны быть соотнесены в формулу, подготовленную для определения коэффициента риска развития воспалительного заболевания кишечника. Рассчитанные коэффициенты сравнивают с пограничными значениями, полученными из соотношения коэффициентов логистической регрессии, обученной разделять группы по значению предиктора для группы с воспалительными заболеваниями кишечника и группы контроля. Вывод о степени риска развития ВЗК делается исходя из значения рассчитанного коэффициента.The inventors have developed a method for detecting inflammatory bowel diseases based on the quantitative ratio of the intensities of the following metabolites: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole. The measurement of metabolites must be carried out in a stool sample by GC-MS with headspace extraction. The obtained values of intensities, normalized to the total ion current, should be correlated into a formula prepared to determine the risk factor for the development of inflammatory bowel disease. The calculated coefficients are compared with breakpoints obtained from the ratio of logistic regression coefficients trained to separate groups according to the predictor value for the inflammatory bowel disease group and the control group. The conclusion about the degree of risk of developing IBD is made based on the value of the calculated coefficient.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу выявления воспалительных заболеваний кишечника на основании данных количественного соотношения интенсивностей метаболитов, нормированных на суммарный ионный ток в образце стула, который включает:In one aspect, the present invention relates to a method for detecting inflammatory bowel disease based on data on the quantitative ratio of metabolite intensities normalized to the total ion current in a stool sample, which includes:

а) выделение метаболитов из образца стула,a) isolation of metabolites from a stool sample,

б) поиск и идентификацию следующих метаболитов: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole стула методом ГХ-МС с парофазным способом экстракции,b) search and identification of the following metabolites: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole stool by GC-MS with headspace extraction,

в) расчет относительных интенсивностей следующих метаболитов: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole, нормированных на общий ионный ток,c) calculation of the relative intensities of the following metabolites: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole, normalized to the total ion current,

г) расчет коэффициента риска развития ВЗК согласно формуле:d) calculation of the risk factor for the development of IBD according to the formula:

[I] - интенсивность ионного тока анализируемого метаболита, нормированная на общий ионный ток;[I] - the intensity of the ion current of the analyzed metabolite, normalized to the total ion current;

Kr - коэффициент риска развития ВЗК (безразмерная величина), иKr is the risk factor for the development of IBD (dimensionless value), and

если значение Kr менее 50, определяют отсутствие риска развития воспалительного заболе вания кишечника,if the Kr value is less than 50, it is determined that there is no risk of developing inflammatory bowel disease,

значение Kr от 50 до 100 является «серой зоной», пограничным результатом, если значение Kr равно или более 100, определяют высокий риск развития воспалительного заболевания кишечника.a Kr value of 50 to 100 is a "grey area", a borderline result, if the Kr value is equal to or greater than 100, defines a high risk of developing inflammatory bowel disease.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

Фигура 1 показывает распределение коэффициента риска развития воспаления ЖКТ в группах с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) и в группе контроля (Норма).Figure 1 shows the distribution of the risk factor for the development of inflammation of the gastrointestinal tract in groups with inflammatory bowel diseases (IBD) and in the control group (Norm).

Определения и общие методыDefinitions and Common Methods

Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.Unless otherwise defined herein, scientific and technical terms used in connection with the present invention will have meanings that are commonly understood by those skilled in the art.

Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемые названия метаболитов, описанный метод газожидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией, методы парофазной экстракции метаболитов, расчет коэффициентов риска развития воспалительного заболевания ЖКТ хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Описанные методы экстракции метаболитов проводятся согласно стандартному протоколу выделения метаболитов.In addition, unless the context requires otherwise, terms in the singular include terms in the plural, and terms in the plural include terms in the singular. As a rule, the names of metabolites used, the described method of gas-liquid chromatography combined with mass spectrometry, the methods of headspace extraction of metabolites, the calculation of risk factors for the development of inflammatory gastrointestinal disease are well known to specialists and are widely used in this field. The described methods of extraction of metabolites are carried out according to the standard protocol for the isolation of metabolites.

Техническим результатом данного способа неинвазивной диагностики воспалительных заболеваний кишечника по характеристике метаболитов является снижение числа этапов пробоподготовки благодаря применению новейшего метода исследования метаболитов посредством парофазной экстракции с последующим ГХ-МС анализом с минимальным числом. Снижение числа возможных техническим проблем на указанных этапах пробоподготовки минимизирует риск получения неинтерпретабельного результата. Уровень предлагаемого методического решения позволяет допустить до используемого оборудования в том числе клинических специалистов при минимальной технической подготовке кадров.The technical result of this method for non-invasive diagnosis of inflammatory bowel diseases by characterization of metabolites is to reduce the number of sample preparation steps due to the use of the latest method for studying metabolites by means of headspace extraction followed by GC-MS analysis with a minimum number. Reducing the number of possible technical problems at these stages of sample preparation minimizes the risk of obtaining an uninterpretable result. The level of the proposed methodological solution allows access to the equipment used, including clinical specialists with minimal technical training.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

Выделение метаболитов проводят методом парофазной экстракции. Под ГХ-МС анализом мы понимаем прицельное исследование группы отобранных метаболитов методом газожидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией с последующим анализом относительного количественного содержания следующих метаболитов: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole. Под относительным количественным содержанием мы понимаем сравнение интенсивностей исследуемых метаболитов, нормированных на общий ионный ток.Isolation of metabolites is carried out by the method of headspace extraction. By GC-MS analysis, we mean a targeted study of a group of selected metabolites by gas-liquid chromatography combined with mass spectrometry, followed by analysis of the relative quantitative content of the following metabolites: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole. By relative quantitative content, we mean a comparison of the intensities of the studied metabolites normalized to the total ion current.

В исследование, которое легло в основу данного патента, были включены 100 индивидов. Анализируемая выборка включала группу индивидов с установленным диагнозом болезнь Крона (n=15), группу индивидов с установленным диагнозом язвенный колит (n=35), а также здоровый контроль (n=50).The study that formed the basis of this patent included 100 individuals. The analyzed sample included a group of individuals diagnosed with Crohn's disease (n=15), a group of individuals diagnosed with ulcerative colitis (n=35), and healthy controls (n=50).

У всех испытуемых были собраны образцы стула для последующего исследования ЛС методом газожидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией.Stool samples were collected from all subjects for subsequent drug testing by gas-liquid chromatography combined with mass spectrometry.

200 мкг образца стула помещали во флаконы с завинчивающейся крышкой в парофазный экстрактор Shimadzu HS-20. Для увеличения ионной силы раствора добавляли 2 г смеси солей (сульфат аммония и дигидрофосфат калия в соотношении 4:1). Применяли следующие настройки: температура печи 80°С, температура линии пробы 220°С, температура линии передачи 220°С, время уравновешивания 15 мин, время повышения давления 2 мин, время загрузки 0,5 мин, время впрыска 1 мин, время промывки иглы 7 мин.A 200 µg stool sample was placed in screw cap vials in a Shimadzu HS-20 headspace extractor. To increase the ionic strength of the solution, 2 g of a mixture of salts (ammonium sulfate and potassium dihydrogen phosphate in a ratio of 4:1) were added. The following settings were used: oven temperature 80°C, sample line temperature 220°C, transfer line temperature 220°C, equilibrate time 15 min, pressurization time 2 min, loading time 0.5 min, injection time 1 min, needle wash time 7 min.

Флаконы запечатывали и анализировали на ГХ/МС Shimadzu QP2010 Ultra с парофазным экстрактором Shimadzu HS-20, колонкой VF-WAXMS длиной 30 м, диаметром 0,25 мм и толщиной фазы 0,25 мкм. Начальная температура колонки 80°С, скорость нагрева 20°С/мин до 240°С, экспозиция 20 мин. Газ-носитель - гелий 99,9999, режим ввода - без деления потока - безраздельный, расход 1 мл/мин. Температура источника ионов - 230С.Использовался режим мониторинга общего ионного тока. Для анализа полученных масс-спектров использовалась библиотека масс-спектров NIST 2014.Vials were sealed and analyzed on a Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS with a Shimadzu HS-20 headspace extractor, a 30 m VF-WAXMS column, 0.25 mm diameter, and 0.25 µm phase thickness. Initial column temperature 80°С, heating rate 20°С/min to 240°С, exposure 20 min. Carrier gas - helium 99.9999, injection mode - without flow division - undivided, flow rate 1 ml / min. The temperature of the ion source was 230C. The total ion current monitoring mode was used. To analyze the obtained mass spectra, the NIST 2014 mass spectra library was used.

В результате анализа в исследуемых группах были получены значения интенсивностей пиков следующих метаболитов: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole. В дальнейшем полученные значения интенсивностей были нормированы на общий ионный ток. Для выделения наиболее значимых метаболитов использовался тест Манна-Уитни. Дополнительно, для определения размера эффекта и направления изменения использовался размер эффекта по Коэну. Соединения с абсолютным размером эффекта более 0.8 были приняты в формулу с положительным значением как числители, а с отрицательным значением, как знаменатели. Для групп (Болезнь Крона+ЯК) методами статистики были выявлена формулы для расчета коэффициента риска развития воспалительного заболевания кишечника. На основании данных была произведена оценки принадлежности анализируемых пациентов к группам контроля и ВЗК:As a result of the analysis in the studied groups, the peak intensities of the following metabolites were obtained: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole. Subsequently, the intensity values obtained were normalized to the total ion current. The Mann-Whitney test was used to isolate the most significant metabolites. Additionally, the Cohen effect size was used to determine the effect size and direction of change. Compounds with an absolute effect size greater than 0.8 were taken into the formula with positive values as numerators and negative values as denominators. For groups (Crohn's disease + UC), statistical methods revealed formulas for calculating the risk factor for the development of inflammatory bowel disease. Based on the data, an assessment was made of the belonging of the analyzed patients to the control groups and IBD:

[I] - интенсивность ионного тока, нормированная на общий ионный ток[I] - intensity of the ion current, normalized to the total ion current

Kr - коэффициент риска развития ВЗК (безразмерная величина).Kr - risk factor for the development of IBD (dimensionless value).

Границы значений коэффициента риска развития ВЗК формируются из соотношения коэффициентов логистической регрессии, обученной разделять группы по значению предиктора. Значение коэффициента риска развития ВЗК I менее 50 свидетельствует об отсутствии риска развития воспалительного заболевания кишечника, Значение коэффициента риска развития ВЗК I от 50 до 100 является «серой зоной», пограничным результатом. Значение коэффициента риска развития ВЗК I, равное или более 100, свидетельствует о риске развития воспалительного заболевания кишечника.The boundaries of the values of the risk coefficient for the development of IBD are formed from the ratio of the logistic regression coefficients trained to separate groups by the value of the predictor. The value of the risk ratio for the development of IBD I less than 50 indicates no risk of developing inflammatory bowel disease. The value of the risk ratio for the development of IBD I from 50 to 100 is a "gray zone", a borderline result. An IBD I risk ratio of 100 or greater indicates a risk of developing inflammatory bowel disease.

Таким образом, согласно полученным результатам возможно оценить принадлежность тестируемого пациента к группе контроля или к группе пациентов с высоким риском развития ВЗК. Получение значения индекса риска развития ВЗК в "серой зоне" будет свидетельствовать в пользу необходимости проведения дополнительного тестирования.Thus, according to the results obtained, it is possible to assess whether the tested patient belongs to the control group or to the group of patients with a high risk of developing IBD. Obtaining the value of the IBD risk index in the "gray zone" will testify in favor of the need for additional testing.

ПримерыExamples

Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.For a better understanding of the invention, the following examples are given. These examples are provided for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the invention in any form.

Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема предлагаемых вариантов осуществления изобретения.All publications, patents, and patent applications referenced in this specification are incorporated herein by reference. Although the above invention has been described in some detail by way of illustration and example in order to avoid ambiguous interpretation, it will be quite clear to those skilled in the art based on the ideas disclosed in this invention that certain changes and modifications can be made without deviating from the essence and scope of the proposed options. implementation of the invention.

Пример 1Example 1

Испытуемый, имеющий в анамнезе воспалительное заболевание кишечника у родственника, а также симптомы, характерные для данной группы заболеваний, обращается в медицинский центр для неинвазивной диагностики и расчета риска развития ВЗК. Производится забор образца стула. Полученный образец замораживается при -20°С и доставляется в лабораторию для исследования.A subject with a history of inflammatory bowel disease in a relative, as well as symptoms characteristic of this group of diseases, applies to a medical center for non-invasive diagnostics and calculation of the risk of developing IBD. A stool sample is taken. The resulting sample is frozen at -20°C and delivered to the laboratory for analysis.

200 мкг образца стула помещают во флаконы с завинчивающейся крышкой в парофазный экстрактор Shimadzu HS-20. Для увеличения ионной силы раствора добавляют 2 г смеси солей (сульфат аммония и дигидрофосфат калия в соотношении 4:1). Применяют следующие настройки: температура печи 80°С, температура линии пробы 220°С, температура линии передачи 220°С, время уравновешивания 15 мин, время повышения давления 2 мин, время загрузки 0,5 мин, время впрыска 1 мин, время промывки иглы 7 мин.A 200 μg stool sample is placed in screw cap vials in a Shimadzu HS-20 headspace extractor. To increase the ionic strength of the solution, add 2 g of a mixture of salts (ammonium sulfate and potassium dihydrogen phosphate in a ratio of 4:1). The following settings apply: oven temperature 80°C, sample line temperature 220°C, transfer line temperature 220°C, equilibrate time 15 min, pressurization time 2 min, loading time 0.5 min, injection time 1 min, needle flush time 7 min.

Флаконы запечатывают и анализируют на ГХ/МС Shimadzu QP2010 Ultra с парофазным экстрактором Shimadzu HS-20, колонкой VF-WAXMS длиной 30 м, диаметром 0,25 мм и толщиной фазы 0,25 мкм. Начальная температура колонки 80°С, скорость нагрева 20°С/мин до 240°С, экспозиция 20 мин. Газ-носитель - гелий 99,9999, режим ввода - без деления потока, - безраздельный, расход 1 мл/мин. Температура источника ионов - 230С. В ходе анализа используется режим мониторинга общего ионного тока. Для анализа полученных масс-спектров используют библиотеку масс-спектров NIST 2014.The vials were sealed and analyzed on a Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS with a Shimadzu HS-20 headspace extractor, a 30 m VF-WAXMS column, 0.25 mm diameter, and 0.25 µm phase thickness. Initial column temperature 80°С, heating rate 20°С/min to 240°С, exposure 20 min. Carrier gas - helium 99.9999, injection mode - without flow division, - undivided, flow rate 1 ml / min. The temperature of the ion source is 230C. During the analysis, the total ion current monitoring mode is used. To analyze the obtained mass spectra, the NIST 2014 mass spectrum library is used.

В результате анализа в исследуемом образце получены следующие значения интенсивностей пиков следующих метаболитов: n-Hexadecanoic acid (I=11235059), Hexanoic acid (I=1038047), Indole (I=2342458). В дальнейшем полученные значения интенсивностей были нормированы на общий ионный ток, в результате чего были получены следующие значения относительных интенсивностей анализируемых метаболитов: n-Hexadecanoic acid (I=0,87), Hexanoic acid (I=0,038), Indole (I=0,17). Ha основании полученных данных была произведена оценки риска развития ВЗК у данного пациента:As a result of the analysis in the test sample, the following peak intensities of the following metabolites were obtained: n-Hexadecanoic acid (I=11235059), Hexanoic acid (I=1038047), Indole (I=2342458). Subsequently, the obtained intensity values were normalized to the total ion current, as a result of which the following values of the relative intensities of the analyzed metabolites were obtained: n-Hexadecanoic acid (I=0.87), Hexanoic acid (I=0.038), Indole (I=0, 17). Based on the data obtained, the risk of developing IBD in this patient was assessed:

[I] - относительная интенсивность ионного тока[I] - relative intensity of the ion current

Kr - коэффициент риска развития ВЗК (безразмерная величина),Kr - IBD risk factor (dimensionless value),

Для пациента значение Кг оказалось равным 145, что, согласно правилам интерпретации получаемых результатов, свидетельствует о высоком риске развития ВЗК у обследуемого пациента. После получения данного результата для пациента рекомендованы дополнительные инструментальные обследования для уточнения диагноза.For the patient, the Kg value turned out to be 145, which, according to the rules for interpreting the results obtained, indicates a high risk of developing IBD in the examined patient. After receiving this result, additional instrumental examinations are recommended for the patient to clarify the diagnosis.

Пример 2Example 2

Испытуемый без симптомов желает пройти неинвазивное тестирование с целью выявления риска скрытого течения ВЗК. У испытуемого производится забор образца стула. Полученный образец замораживается при -20°С и доставляется в лабораторию для исследования.An asymptomatic subject wishes to undergo non-invasive testing to determine the risk of latent IBD. A stool sample is taken from the subject. The resulting sample is frozen at -20°C and delivered to the laboratory for analysis.

Флаконы запечатывают и анализируют на ГХ/МС Shimadzu QP2010 Ultra с парофазным экстрактором Shimadzu HS-20, колонкой VF-WAXMS длиной 30 м, диаметром 0,25 мм и толщиной фазы 0,25 мкм. Начальная температура колонки 80°С, скорость нагрева 20°С/мин до 240°С, экспозиция 20 мин. Газ-носитель - гелий 99,9999, режим ввода - без деления потока, - безраздельный, расход 1 мл/мин. Температура источника ионов - 230°С. В ходе анализа используется режим мониторинга общего ионного тока. Для анализа полученных масс-спектров используют библиотеку масс-спектров NIST 2014.The vials were sealed and analyzed on a Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS with a Shimadzu HS-20 headspace extractor, a 30 m VF-WAXMS column, 0.25 mm diameter, and 0.25 µm phase thickness. Initial column temperature 80°С, heating rate 20°С/min to 240°С, exposure 20 min. Carrier gas - helium 99.9999, injection mode - without flow division, - undivided, flow rate 1 ml / min. The temperature of the ion source is 230°C. During the analysis, the total ion current monitoring mode is used. To analyze the obtained mass spectra, the NIST 2014 mass spectrum library is used.

В результате анализа в исследуемом образце получены следующие значения интенсивностей пиков следующих метаболитов: n-Hexadecanoic acid (I=12235059), Hexanoic acid (I=1057032), Indole (I=5786324). В дальнейшем полученные значения интенсивностей были нормированы на общий ионный ток, в результате чего были получены следующие значения относительных интенсивностей анализируемых метаболитов: n-Hexadecanoic acid (I=0,54), Hexanoic acid (I=0,057), Indole (I=0,14). Ha основании полученных данных была произведена оценки риска развития ВЗК у данного пациента:As a result of the analysis in the test sample, the following peak intensities of the following metabolites were obtained: n-Hexadecanoic acid (I=12235059), Hexanoic acid (I=1057032), Indole (I=5786324). Subsequently, the obtained intensity values were normalized to the total ion current, as a result of which the following values of the relative intensities of the analyzed metabolites were obtained: n-Hexadecanoic acid (I=0.54), Hexanoic acid (I=0.057), Indole (I=0, 14). Based on the data obtained, the risk of developing IBD in this patient was assessed:

Для пациента значение Kr оказалось равным 67,5, что, согласно правилам интерпретации получаемых результатов, свидетельствует о пограничном значении риска развития ВЗК у обследуемого пациента. После получения данного результата для пациента могут быть рекомендованы дополнительные обследования для уточнения диагноза при наличии соответствующих симптомов или наблюдение пациента в случае отсутствия таковых.For the patient, the Kr value turned out to be 67.5, which, according to the rules for interpreting the results obtained, indicates the borderline value of the risk of developing IBD in the examined patient. After receiving this result, additional examinations may be recommended for the patient to clarify the diagnosis in the presence of relevant symptoms or observation of the patient in the absence of any.

Таким образом, полученное вычислительное решение позволяет сформировать конечный результат метаболомного анализа образца стула и является уникальным способом трансляции специальных научно-исследовательских данных в область практической медицины. Рассчитанные коэффициенты риска развития ВЗК позволяют мгновенно принимать решения о тактике дальнейшего ведения пациента. Так, в частности, при значении коэффициента риска развития ВЗК I менее 50 и при отсутствии специфических жалоб, совокупно врач может принять решение о прекращении наблюдения за данным пациентом, сводя риск развития ВЗК в конкретном случае к минимуму. При значении коэффициента риска развития ВЗК I от 50 до 100, при отсутствии симптомов ВЗК, врач может как назначить дополнительную диагностику для уточнения возможных причин повышения активности воспалительных маркеров (изменения относительного содержания метаболитов, ассоциированных с риском развития ВЗК), так и наблюдать пациента до появления ассоциированных симптомов без проведения инструментальной диагностики. Рекомендация по дополнительной диагностики при значении коэффициента риска развития ВЗК I от 50 до 100 "серой зоны" приводится для возможности выявления скрытых, бессимптомных патологий ЖКТ. При значении коэффициента риска развития ВЗК I более 100, врач в обязательном порядке назначает дополнительное исследование.Thus, the resulting computational solution makes it possible to form the final result of the metabolomic analysis of a stool sample and is a unique way to translate special research data into the field of practical medicine. The calculated risk factors for the development of IBD allow you to instantly make decisions about the tactics of further management of the patient. So, in particular, if the IBD risk factor I is less than 50 and in the absence of specific complaints, the doctor can collectively decide to stop monitoring this patient, minimizing the risk of developing IBD in a particular case. If the IBD risk ratio I is from 50 to 100, in the absence of IBD symptoms, the doctor can prescribe additional diagnostics to clarify the possible reasons for the increase in the activity of inflammatory markers (changes in the relative content of metabolites associated with the risk of developing IBD), and observe the patient until associated symptoms without instrumental diagnosis. The recommendation for additional diagnostics with the value of the risk factor for the development of IBD I from 50 to 100 "gray zone" is given to be able to identify hidden, asymptomatic pathologies of the gastrointestinal tract. If the value of the risk factor for the development of IBD I is more than 100, the doctor must prescribe an additional study.

Claims

A method for determining the risk of developing inflammatory bowel disease (IBD) based on the quantitative ratio of metabolite intensities normalized to the total ion current in a stool sample, which includes:

a) isolation of metabolites from a stool sample,

b) search and identification of the following metabolites: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole stool by GC-MS with headspace extraction,

c) calculation of the relative intensities of the following metabolites: n-Hexadecanoic acid, Hexanoic acid, Indole, normalized to the total ion current,

d) calculation of the risk factor for the development of IBD according to the formula

Kr=(n-Hexadecanoic acid[I])/(Hexanoic acid[I]*Indole[I]), where

[I] - the intensity of the ion current of the analyzed metabolite, normalized to the total ion current;

Kr - IBD risk ratio - dimensionless value, and

if the Kr value is less than 50, the absence of the risk of developing inflammatory bowel disease is determined,

a Kr value of 50 to 100 is a "grey area", a borderline result, if the Kr value is equal to or greater than 100, defines a high risk of developing inflammatory bowel disease.