RU2790288C2 - Antibodies binding cd3 - Google Patents
Antibodies binding cd3 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2790288C2 RU2790288C2 RU2019111037A RU2019111037A RU2790288C2 RU 2790288 C2 RU2790288 C2 RU 2790288C2 RU 2019111037 A RU2019111037 A RU 2019111037A RU 2019111037 A RU2019111037 A RU 2019111037A RU 2790288 C2 RU2790288 C2 RU 2790288C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gly
- heavy chain
- disease
- ser
- domain
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Перекрестная ссылкаcross reference
Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 62/394360, поданной 14 сентября 2016 года и предварительной заявки на патент США № 62/491908, поданной 28 апреля 2017 года, которые включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. This application claims priority of U.S. Provisional Application No. 62/394,360, filed September 14, 2016, and U.S. Provisional Application No. 62/491,908, filed April 28, 2017, which are incorporated herein by reference in their entirety.
Уровень техникиState of the art
Иммунная система организма служит защитой от инфекции, травм и рака. Две отдельные, но взаимосвязанные системы, гуморальная и клеточная иммунные системы, работают вместе, чтобы защитить организм. Гуморальная система опосредуется растворимыми факторами, называемыми антителами, которые нейтрализуют продукты, признанные организмом чужеродными. Тогда как, клеточная система включает клетки, такие как Т-клетки и макрофаги, которые удаляют и нейтрализуют чужеродные вторжения. The body's immune system serves as a defense against infection, injury, and cancer. Two separate but interconnected systems, the humoral and cellular immune systems, work together to protect the body. The humoral system is mediated by soluble factors called antibodies that neutralize products recognized as foreign by the body. Whereas, the cellular system includes cells such as T cells and macrophages that remove and neutralize foreign intruders.
Активация Т-клеток имеет решающее значение для стимуляции иммунных реакций. Т-клетки проявляют иммунологическую специфичность и направляют большинство клеточных иммунных ответов. Хотя Т-клетки не секретируют антитела, они необходимы для секреции антител В-лимфоцитами. Активация Т-клеток требует участия ряда молекул клеточной поверхности, таких как рецепторный комплекс Т-клеток, и молекулы CD4 или CD8. Антиген-специфический Т-клеточный рецептор (ТКР) состоит из дисульфид-связанного гетеродимера, мембранного гликопротеина с цепями, альфа и бета (α и β) или гамма и дельта (γ и δ). ТКР нековалентно связан с комплексом инвариантных белков, обозначенных CD3. T cell activation is critical to stimulate immune responses. T cells exhibit immunological specificity and direct most cellular immune responses. Although T cells do not secrete antibodies, they are required for B lymphocytes to secrete antibodies. T cell activation requires the participation of a number of cell surface molecules, such as the T cell receptor complex, and CD4 or CD8 molecules. The antigen-specific T-cell receptor (TCR) consists of a disulfide-linked heterodimer, a membrane glycoprotein with alpha and beta (α and β) or gamma and delta (γ and δ) chains. TCR is non-covalently bound to a complex of invariant proteins, designated CD3.
Известно, что Т-клетки оказывают сильное противоопухолевое действие в многочисленных экспериментальных условиях. Антитела, способные эффективно вовлекать Т-клетки против опухолевых клеток, были доступны в виде биспецифических антител, например, направленных на антигены, ассоциированные с опухолью (ТАА - tumor-associated antigen) и агонистические мембранные белки Т-клеток, такие как комплекс ТКР/CD3 и CD28. Эти биспецифические антитела способны активировать Т-клетки независимо от специфичности их ТКР, что приводит к специфическому лизису клеток, несущих соответствующие TAA. T cells are known to exert strong antitumor effects under numerous experimental conditions. Antibodies capable of effectively recruiting T cells against tumor cells have been available as bispecific antibodies, such as those directed against tumor-associated antigens (TAA) and agonistic T cell membrane proteins such as the TCR/CD3 complex. and CD28. These bispecific antibodies are capable of activating T cells regardless of their TCR specificity, resulting in specific lysis of cells bearing the respective TAAs.
Однако, хотя биспецифические антитела к CD3 могут перенаправлять лизис, опосредованный Т-клетками, на злокачественные клетки, клинические испытания с применением бсАт на основе CD3 показали высокую токсичность у пациентов. Неспецифическая активация Т-клеток от бсАт может происходить антиген-независимым образом из-за взаимодействия Fc/Fc-рецептора (FcR) или антиген-зависимым образом, в случае если антиген экспрессируется как на нормальных, так и на опухолевых клетках. Оба механизма могут быть ответственны за токсичность, наблюдаемую в предыдущих клинических исследованиях. (См., например, Link и соавт. (1998 год) Int. J. Cancer 77(2):251-6; Durben и соавт. Molecular Therapy (2015 г.); 23 4, 648–655). Из-за возникающего в результате синдрома высвобождения цитокинов имели место значительные ограничения в разработке этих антител для терапевтических целей. However, although anti-CD3 bispecific antibodies can redirect T cell-mediated lysis to malignant cells, clinical trials with CD3-based bsAbs have shown high toxicity in patients. Non-specific activation of T cells by bsAbs can occur in an antigen-independent manner due to Fc/Fc receptor (FcR) interaction or in an antigen-dependent manner when the antigen is expressed on both normal and tumor cells. Both mechanisms may be responsible for the toxicity observed in previous clinical studies. (See, for example, Link et al. (1998) Int. J. Cancer 77(2):251-6; Durben et al. Molecular Therapy (2015); 23 4, 648–655). Due to the resulting cytokine release syndrome, there have been significant limitations in the development of these antibodies for therapeutic purposes.
Взаимодействие Т-клеточного рецептора (TCR) с его пептид-МНС-лигандом определяет активность Т-клетки. Характеристики связывания этого взаимодействия были детально изучены и было показано, что оно контролирует функцию Т-клеток. Сила и природа взаимодействия TCR-пептид/MHC определяет, выполняют ли T-клетки эффекторные функции или инактивируются и удаляются. Антитела против CD3 активируют Т-клетки путем изменения конформации CD3ε-цепи и в зависимости от эпитопа могут оказывать агонистическое или антагонистическое действие на Т-клетки (Yoon et al., 1994 Immunity 1: 563-569). В свете значительных побочных эффектов многих агонистов Т-клеток может оказаться предпочтительным поддерживать сильные противоопухолевые эффекты с одновременным уменьшении высвобождения провоспалительных цитокинов. Однако частично агонистические анти-CD3-антитела могут субоптимально изменять цепь CD3ε, приводя к неэффективной передаче сигнала, и большинство анти-CD3-антител являются полными агонистами для обоих путей. Неясно, могут ли эти эффекторные функции быть разделены. Многие существующие анти-CD3-антитела (например, SP-34, UCHT1, OKT3) имеют сродство в диапазоне 1-50 нМ KD, однако это может быть не оптимальным для терапевтического применения.The interaction of the T cell receptor (TCR) with its peptide-MHC ligand determines the activity of the T cell. The binding characteristics of this interaction have been studied in detail and have been shown to control T cell function. The strength and nature of the TCR-peptide/MHC interaction determines whether T cells perform effector functions or are inactivated and removed. Anti-CD3 antibodies activate T cells by changing the conformation of the CD3ε chain and, depending on the epitope, may have an agonistic or antagonistic effect on T cells (Yoon et al., 1994 Immunity 1: 563-569). In light of the significant side effects of many T cell agonists, it may be preferable to maintain strong antitumor effects while reducing the release of pro-inflammatory cytokines. However, partially agonistic anti-CD3 antibodies can alter the CD3ε chain suboptimally, resulting in inefficient signal transduction, and most anti-CD3 antibodies are full agonists for both pathways. It is unclear whether these effector functions can be separated. Many existing anti-CD3 antibodies (eg, SP-34, UCHT1, OKT3) have an affinity in the range of 1-50 nM KD, however this may not be optimal for therapeutic use.
CD3-специфические антитела и биспецифические антитела, полученные из них, обеспечиваются данным изобретением. CD3-specific antibodies and bispecific antibodies derived therefrom are provided by this invention.
ПубликацииPublications
Антитела к CD3 описаны, например, в патентах США № 5585097; 5929212; 5968509; 6706,265; 6750325; 7381803; 7728114. Биспецифические антитела со специфичностью связывания CD3 описаны, например, в патентах США № 7262276; 7635472; 7862813; и 8236308, каждый из которых специально включен в данный документ посредством ссылки. Antibodies to CD3 are described, for example, in US patent No. 5585097; 5929212; 5968509; 6706.265; 6750325; 7381803; 7,728,114. Bispecific antibodies with CD3 binding specificity are described, for example, in US Pat. Nos. 7,262,276; 7635472; 7862813; and 8236308, each of which is specifically incorporated herein by reference.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Композиции и способы их применения предоставлены для семейства родственных антител, которые связываются и активируют передачу сигналов посредством CD3, например, активацией CD3+ T-клеток. Семейство антител содержит набор последовательностей CDR, как определено в данном документе. Семейство антител обеспечивает ряд преимуществ, которые способствуют полезности в качестве клинического лекарственного средства(в). Антитела в семействе включают членов с рядом аффинностей связывания, позволяющих выбирать конкретную последовательность с желаемой аффинностью. Способность точно настраивать аффинность имеет особое значение для управления уровнем активации CD3 у индивида, которого лечат, и, таким образом, для снижения токсичности. Compositions and methods for their use are provided for a family of related antibodies that bind to and activate signaling through CD3, for example, activation of CD3 + T cells. An antibody family contains a set of CDR sequences as defined herein. The antibody family provides a number of advantages that contribute to utility as a clinical drug(s). The antibodies in the family include members with a range of binding affinities allowing the selection of a particular sequence with the desired affinity. The ability to fine-tune affinity is of particular importance in order to control the level of CD3 activation in the individual being treated and thus to reduce toxicity.
В некоторых вариантах осуществления анти-CD3 антитела обладают аффинностью (KD) к CD3 в диапазоне от около 10-6 до около 10-11. Антитела к CD3, которые имеют аффинность (KD) 50 нМ или более, 100 нМ или более, 500 нМ или более или 1 мкМ, или более, могут быть желательными для более точной имитации взаимодействия ТКР/ГКГС (главный комплекс гистосовместимости) и минимизации высвобождения токсических цитокинов при поддержании эффективного лизиса опухолевых клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела к CD3 характеризуются или отбираются для снижения склонности индуцировать высвобождение цитокинов при связывании с компетентной Т-клеткой, например, для высвобождения ИЛ-2 и ИФНγ. Антитела могут быть отобраны для терапевтического применения, которое оптимизирует уничтожение опухолевых клеток и сниженное высвобождение цитокинов, например антитело, в семействе последовательностей антител, описанных в данном документе, индуцирует высвобождение цитокинов, которое составляет менее чем около половины от максимума, наблюдаемого для члена семьи в сравнительном анализе, и может быть меньше, например, меньше и около 25% от максимума, наблюдаемого для члена семьи в сравнительном анализе. В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются биспецифические или мультиспецифические антитела, которые содержат по меньшей мере вариабельную область тяжелой цепи из семейства антител и могут содержать вариабельную область тяжелой и легкой цепи, представленную в данном документе. Биспецифические антитела содержат по меньшей мере вариабельную область тяжелой цепи антитела, специфичного к белку, отличному от CD3, и могут содержать вариабельную область тяжелой и легкой цепи. В некоторых таких вариантах реализации изобретения второе антитело специфично связывается с антигеном, ассоциированным с опухолью, нацеливающим антигеном, например, интегринами и тому подобным, патогенным антигеном, белком контрольной точки и тому подобным. Различные форматы биспецифических антител находятся в пределах объема изобретения, включая без ограничения одноцепочечные полипептиды, двухцепочечные полипептиды, трехцепочечные полипептиды, четырехцепочечные полипептиды и кратные им. In some embodiments, anti-CD3 antibodies have an affinity (KD) for CD3 in the range of about 10 -6 to about 10 -11 . Anti-CD3 antibodies that have an affinity (KD) of 50 nM or more, 100 nM or more, 500 nM or more, or 1 μM or more may be desirable to more closely mimic the TKR/MHC (major histocompatibility complex) interaction and minimize release toxic cytokines while maintaining effective lysis of tumor cells. In some embodiments, anti-CD3 antibodies are characterized or selected to reduce the propensity to induce cytokine release when bound to a competent T cell, for example, to release IL-2 and IFNγ. Antibodies can be selected for therapeutic applications that optimize tumor cell killing and reduced cytokine release, e.g., an antibody in the family of antibody sequences described herein induces cytokine release that is less than about half the maximum observed for a family member in a comparative analysis, and may be less, for example, less than and about 25% of the maximum observed for a family member in a comparative analysis. In some embodiments, bispecific or multispecific antibodies are provided that comprise at least a heavy chain variable region from an antibody family, and may comprise the heavy and light chain variable regions provided herein. Bispecific antibodies comprise at least the heavy chain variable region of an antibody specific for a protein other than CD3, and may comprise a heavy and light chain variable region. In some such embodiments, the second antibody specifically binds to a tumor-associated antigen, a targeting antigen, such as integrins and the like, a pathogenic antigen, a checkpoint protein, and the like. Various formats of bispecific antibodies are within the scope of the invention, including, without limitation, single chain polypeptides, double chain polypeptides, three chain polypeptides, four chain polypeptides and multiples thereof.
Каждое из CD3-специфических антител содержит домен VH, содержащий последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 в каркасе VH человека. Последовательности CDR семейства 2 могут быть расположены, например, в области около аминокислотных остатков 26-33; 51-58; и 97-112 для CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, предоставленных типовых последовательностей вариабельной области, изложенных в SEQ ID NO: 1-18. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что последовательности CDR могут находиться в другом положении, в случае если выбрана другая каркасная последовательность, хотя обычно порядок последовательностей будет оставаться тем же. Each of the CD3-specific antibodies contains a VH domain containing the sequences CDR1, CDR2, and CDR3 in a human VH framework.
Последовательности CDR для антитела семейства 2 по данному изобретению могут иметь следующие формулы последовательности. Х обозначает вариабельную аминокислоту, которая может представлять собой специфические аминокислоты, как указано ниже. The CDR sequences for a
CDR1CDR1
при этом:wherein:
X5 может быть любой аминокислотой; в некоторых вариантах реализации изобретения X5 представляет собой D, A или H, в некоторых вариантах реализации изобретения X5 представляет собой D.X 5 can be any amino acid; in some embodiments X 5 is D, A or H, in some embodiments X 5 is D.
X6 может быть любой аминокислотой; в некоторых вариантах реализации изобретения X6 представляет собой D или N; в некоторых вариантах реализации D6 представляет собой D.X 6 can be any amino acid; in some embodiments of the invention, X 6 is D or N; in some embodiments, D 6 is D.
В некоторых вариантах реализации последовательность CDR1 анти-CD3 антитела семейства 2 содержит последовательность, приведенную в любой SEQ ID NO: 1-18, остатки 26-33.In some embodiments, the CDR1 sequence of an
CDR2CDR2
В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность CDR2 антитела к CD3 семейства 2 содержит последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO: 1-18, остатки 51-58. In some embodiments, the CDR2 sequence of an
CDR3CDR3
A1” K2” D3” S4” R5” G6” Y7” G8” X9” Y10” X11” X12” G13” G12” A15” Y16” A 1” K 2” D 3” S 4” R 5” G 6” Y 7” G 8” X 9” Y 10” X 11” X 12” G 13” G 12” A 15” Y 16”
при этом:wherein:
X9” может быть любой аминокислотой, в некоторых вариантах реализации изобретения X9” представляет собой D или S; в некоторых вариантах реализации изобретения X9” представляет собой D;X 9” can be any amino acid, in some embodiments of the invention X 9” is D or S; in some embodiments, X 9” is D;
X11” может быть любой аминокислотой; в некоторых вариантах реализации изобретения X11” представляет собой R или S;X 11" can be any amino acid; in some embodiments of the invention, X 11” is R or S;
X12” может быть любой аминокислотой; в некоторых вариантах реализации изобретения X12” представляет собой L или R;X 12" can be any amino acid; in some embodiments, X 12” is L or R;
В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность CD3 анти- CD3 антитела семейства 2 имеет формулу A K D S R G Y G D Y X11” X12” G G A Y, где X11” и X12” являются тем, как определено выше. В некоторых вариантах реализации изобретения CD3-связывающий домен VH антитела семейства 2 связан с доменом вариабельной области легкой цепи. В некоторых таких вариантах реализации изобретения легкая цепь представляет собой фиксированную легкую цепь.In some embodiments, the CD3 sequence of a
В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь содержит домен VL с последовательностями CDR1, CDR2 и CDR3 в каркасе VL человека. Последовательности CDR могут быть теми, которые приведены в SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность CDR1 содержит аминокислотные остатки 27-32; 50-52; 89-97 для CDR1, CDR2, CDR3 соответственно.In some embodiments, the light chain comprises a VL domain with sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 in a human VL framework. CDR sequences may be those shown in SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the CDR1 sequence contains amino acid residues 27-32; 50-52; 89-97 for CDR1, CDR2, CDR3 respectively.
В некоторых вариантах реализации изобретения последовательности CDR антитела по данному изобретению представляют собой последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью, по меньшей мере 90% идентичностью, по меньшей мере 95% идентичностью, по меньшей мере 99% идентичностью относительно последовательности CDR или набора последовательностей CDR в SEQ ID NO: 1-18. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность CDR по данному изобретению содержит одну, две, три или более аминокислотных замен по отношению к последовательности CDR или набора последовательностей CDR в любой из SEQ ID NO:1-18. В некоторых вариантах реализации изобретения указанная аминокислотная замена(ы) представляет собой одну или более в положении 5 или 10 из CDR1, положении 2, 6 или 7 из CDR2, положении 1, 8, 9 или 10 из CDR3 относительно формул семейства 2, представленных выше. In some embodiments, the CDR sequences of an antibody of the invention are at least 85% identical, at least 90% identical, at least 95% identical, at least 99% identical to a CDR sequence or set of CDR sequences in SEQ ID NO: 1-18. In some embodiments, the CDR sequence of this invention contains one, two, three or more amino acid substitutions with respect to the CDR sequence or set of CDR sequences in any of SEQ ID NOs: 1-18. In some embodiments, said amino acid substitution(s) is one or more at
В некоторых вариантах реализации изобретения биспецифическое антитело по данному изобретению содержит CD3-связывающую вариабельную область, описанную в данном документе, спаренную с легкой цепью. В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь содержит последовательность вариабельной области, изложенную в SEQ ID NO: 19, или вариабельную область, содержащую набор последовательностей CDR в SEQ ID NO: 19, и каркасные последовательности. Различные последовательности Fc находят применение, включая, без ограничения, человеческие IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4 и тому подобные. В некоторых вариантах реализации изобретения второе плечо биспецифического антитела содержит вариабельную область, которая специфически связывается с антигеном, ассоциированным с опухолью. В некоторых вариантах реализации изобретения второе плечо биспецифического антитела содержит вариабельную область, которая специфически связывается с ВСМА. В некоторых вариантах реализации изобретения плечо к BCMA представляет собой одноцепочечную вариабельную область, например, как изображено на фиг 2В. В некоторых вариантах реализации изобретения плечо к BCMA содержит последовательность вариабельной области, изложенную в SEQ ID NO: 20; или тандемную последовательность вариабельной области, изложенную в SEQ ID NO: 21. Последовательность Fc плеча к BCMA может представлять собой, без ограничения, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4 человека и тому подобное. Последовательности CDR могут быть теми, которые содержатся в SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность CDR содержит аминокислотные остатки 26-33; 51-58; 97-108 для CDR1, CDR2, CDR3 соответственно. In some embodiments, the bispecific antibody of the invention comprises the CD3 binding variable region described herein coupled to a light chain. In some embodiments, the light chain comprises the variable region sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or a variable region containing the set of CDR sequences in SEQ ID NO: 19 and framework sequences. Various Fc sequences find use, including, without limitation, human IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, and the like. In some embodiments, the second arm of the bispecific antibody contains a variable region that specifically binds to a tumor-associated antigen. In some embodiments, the second arm of the bispecific antibody contains a variable region that specifically binds to BCMA. In some embodiments, the arm to BCMA is a single chain variable region, such as shown in FIG. 2B. In some embodiments, the BCMA arm comprises the variable region sequence set forth in SEQ ID NO: 20; or a tandem variable region sequence set forth in SEQ ID NO: 21. The anti-BCMA arm Fc sequence can be, without limitation, human IgG1, IgG2a, IgG2b, human IgG3, IgG4, and the like. CDR sequences may be those contained in SEQ ID NO: 20. In some embodiments, the CDR sequence contains amino acid residues 26-33; 51-58; 97-108 for CDR1, CDR2, CDR3 respectively.
В других вариантах реализации изобретения предлагаются фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере CD3-связывающий домен VH по данному изобретению, например, моноспецифическое, биспецифическое и тому подобное антитело или антителоподобный белок, содержащий по меньшей мере CD3-связывающий домен VH по данному изобретению; и фармацевтически приемлемый наполнитель. Композиция может быть лиофилизирована, суспендирована в растворе и тому подобное. И может быть представлена в виде стандартной дозы. In other embodiments, pharmaceutical compositions are provided comprising at least a VH CD3 binding domain of the invention, for example, a monospecific, bispecific, and the like antibody or antibody-like protein comprising at least a VH CD3 binding domain of the invention; and a pharmaceutically acceptable excipient. The composition may be lyophilized, suspended in solution, and the like. And it can be presented in the form of a standard dose.
В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения рака, включающий введение индивиду, имеющему для этого показания, эффективной дозы моноспецифического, биспецифического и тому подобного антитела по данному изобретению. Когда антитело является биспецифическим, второй антигенсвязывающий участок может специфически связывать опухолевый антиген, белок контрольной точки и тому подобное. В различных вариантах реализации изобретения рак выбран из группы, состоящей из рака яичников, рака молочной железы, желудочно-кишечного тракта, рака головного мозга, рака головы и шеи, рака предстательной железы, рака толстой кишки, рака легких, лейкемии, лимфомы, саркомы, карциномы, опухолей нервных клеток, плоскоклеточного рака, эмбрионально-клеточных опухолей, метастазов, недифференцированных опухолей, семином, меланом, миелом, нейробластом, опухолей смешанных клеток и неоплазий, вызванных инфекционными агентами. In some embodiments, the invention provides a method of treating cancer, comprising administering to an individual having an indication for this, an effective dose of a monospecific, bispecific, or the like of an antibody of this invention. When the antibody is bispecific, the second antigen-binding site can specifically bind the tumor antigen, checkpoint protein, and the like. In various embodiments, the cancer is selected from the group consisting of ovarian cancer, breast cancer, gastrointestinal cancer, brain cancer, head and neck cancer, prostate cancer, colon cancer, lung cancer, leukemia, lymphoma, sarcoma, carcinomas, nerve cell tumors, squamous cell carcinomas, embryonic cell tumors, metastases, undifferentiated tumors, seminomas, melanomas, myelomas, neuroblastomas, mixed cell tumors, and neoplasias caused by infectious agents.
В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения инфекционного заболевания, включающий введение индивидууму, имеющему для этого показания, эффективной дозы моноспецифического, биспецифического и тому подобного антитела по данному изобретению. Когда антитело является биспецифическим, второй антигенсвязывающий участок может специфически связывать патогенный антиген, например, бактерии, вирусы или паразиты. In some embodiments, the invention provides a method of treating an infectious disease, comprising administering to an individual having an indication for this, an effective dose of a monospecific, bispecific, and the like of an antibody of this invention. When the antibody is bispecific, the second antigen-binding site can specifically bind a pathogenic antigen, such as bacteria, viruses, or parasites.
В других вариантах реализации изобретения предложен способ получения биспецифического антитела по данному изобретению, включающий экспрессию последовательностей антитела, например, одной или более кодирующих последовательностей легкой цепи, одной или более кодирующих последовательностей тяжелой цепи в одной клетке-хозяине. В различных вариантах реализации изобретения клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую или эукариотическую клетку, такую как клетка млекопитающего. In other embodiments, a method for producing a bispecific antibody of the invention is provided, comprising expressing antibody sequences, for example, one or more light chain coding sequences, one or more heavy chain coding sequences, in a single host cell. In various embodiments, the host cell may be a prokaryotic or eukaryotic cell, such as a mammalian cell.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
Изобретение лучше всего будет понятно из последующего подробного описания при чтении вместе с прилагаемыми графическими материалами. Файл патента или заявки содержит по меньшей мере одно графическое изображение, выполненное в цвете. Копии этого патента или патентной заявки с цветным графическим материалом(и) будут предоставлены патентным ведомством по запросу и после уплаты необходимого взноса. Следует подчеркнуть, что в соответствии с установившейся практикой согласно общепринятой практике, различные объекты графических материалов проиллюстрированы без соблюдения масштаба. Напротив, размеры различных объектов произвольно увеличены или уменьшены для ясности. В графические материалы включены следующие фигуры. The invention will be best understood from the following detailed description when read in conjunction with the accompanying drawings. The patent or application file contains at least one color graphic. Copies of this patent or patent application with color graphic material(s) will be made available by the Patent Office upon request and upon payment of the required fee. It should be emphasized that in accordance with established practice according to common practice, the various objects of the graphic materials are illustrated not to scale. On the contrary, the sizes of various objects are arbitrarily enlarged or reduced for clarity. The following figures are included in the graphics.
Фиг. 1A-1C. На фиг. 1A проиллюстрировано выравнивание областей CDR1, 2 и 3 членов семейства 2 антител из SEQ ID NO: 1-18, которые специфически связываются с CD3 человека и соответствуют остаткам 26-33; 51-58; и 97-112. На фиг. 1B проиллюстрированы области CDR1, 2 и 3 фиксированной легкой цепи (SEQ ID NO: 19); и типовая последовательность к ВСМА (SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21). Фиг. 1C демонстрирует последовательности CDR эталонного анти-CD3 антитела (SEQ ID NO: 20), ID 304704.Fig. 1A-1C. In FIG. 1A illustrates an alignment of the CDR1, 2 and 3 regions of
На фиг. 2A-2E проиллюстрированы схематические модели биспецифических антител человека. На фиг. 2A проиллюстрировано биспецифическое антитело к CD3:опухолевому антигену с общей легкой цепью (всего 3 уникальные цепи). На фиг. 2B проиллюстрировано биспецифическое антитело к CD3:опухолевому антигену с 2 уникальными легкими цепями (всего 4 уникальные цепи). На фиг. 2C проиллюстрировано биспецифическое антитело к CD3:опухолевому антигену с тяжелой цепью только опухолевого антигенсвязывающего домена (3 уникальные цепи). На фиг. 2D проиллюстрировано биспецифическое антитело к CD3:опухолевому антигену с опухолевым антигенсвязывающим доменом scFv (всего 3 уникальные цепи). На фиг. 2E проиллюстрировано биспецифическое антитело к CD3:опухолевому антигену с связывающим доменом scFv к CD3 (всего 3 уникальные цепи). In FIG. 2A-2E illustrate schematic models of human bispecific antibodies. In FIG. 2A illustrates an anti-CD3:tumor antigen bispecific antibody with a common light chain (total 3 unique chains). In FIG. 2B illustrates an anti-CD3:tumor antigen bispecific antibody with 2 unique light chains (4 unique chains in total). In FIG. 2C illustrates a CD3:tumor antigen bispecific antibody with a heavy chain of the tumor antigen-binding domain only (3 unique chains). In FIG. 2D illustrates an anti-CD3:tumor antigen bispecific antibody with an scFv tumor antigen-binding domain (3 unique chains in total). In FIG. 2E illustrates an anti-CD3:tumor antigen bispecific antibody with an scFv anti-CD3 binding domain (total 3 unique chains).
Фиг. 3. Таблица данных по анти-CD3 семейства 2, обобщает поведение антител к CD3 в моноспецифическом и биспецифическом формате. В столбце 1 показан идентификатор последовательности для последовательности VH к CD3. В столбце 2 показано значение СИФ для связывания клетками Jurkat исходного моноспецифического (антитела) к CD3. В столбце 3 показано значение СИФ для связывания T-клетками яванского макака исходного моноспецифического (антитела) к CD3. В столбце 4 показано название биспецифического антитела aCD3:aBCMA. В столбце 5 показаны пикограммы ИЛ-2, высвобождаемого пан-Т-клетками, стимулированными биспецифическим антителом, связывающим белок ВСМА, помещенным на пластике, в указанной дозе. В столбце 6 показаны пикограммы ИЛ-6, высвобождаемого пан-Т-клетками, стимулированными биспецифическим антителом, связывающим белок ВСМА, помещенным на пластике, в указанной дозе. В столбце 7 показаны пикограммы ИЛ-10, высвобождаемого пан-Т-клетками, стимулированными биспецифическим антителом, связывающим белок ВСМА, помещенным на пластике, в указанной дозе. В столбце 8 показаны пикограммы ИФН-γ, высвобождаемого пан-Т-клетками, стимулированными биспецифическим антителом, связывающим белок ВСМА, помещенным на пластике, в указанной дозе. В столбце 9 показаны пикограммы ФНОα, высвобождаемого пан-Т-клетками, стимулированными биспецифическим антителом, связывающим белок ВСМА, помещенным на пластике, в указанной дозе. В столбце 10 показана ЭК50 лизиса опухолевых клеток U266, опосредованного биспецифическими антителами, в присутствии пан-Т-клеток человека. В столбце 11 показан процент лизиса опухолевых клеток U266, в присутствии биспецифического антитела и пан-Т-клеток человека при дозе 333 нг/мл биспецифического антитела. В столбце 12 показана аффинность белкового связывания плеча к CD3 биспецифического антитела, измеренная с помощью Octet. В столбце 13 показано значение СИФ для связывания клетками Jurkat биспецифического антитела. Fig. 3.
На фиг. 4 проиллюстрирован опосредованный биспецифическими антителами лизис опухолевых клеток. Семь биспецифических антител αCD3_fam2:aBCMA, каждое с уникальным плечом к CD3 и общим плечом к BCMA, были протестированы на способность убивать опухолевые клетки U266 BCMA+ посредством перенаправления активированных первичных Т-клеток. В этом эксперименте клетки U266, которые экспрессируют BCMA, смешивали с активированными пан-Т-клетками в соотношении E:T 10:1 наряду с добавлением биспецифического антитела. Ось x демонстрирует концентрацию применяемого антитела, а ось y демонстрирует % лизиса опухолевых клеток через 6 часов после добавления антитела. In FIG. 4 illustrates bispecific antibody-mediated lysis of tumor cells. Seven αCD3_fam2:aBCMA bispecific antibodies, each with a unique anti-CD3 arm and a common anti-BCMA arm, were tested for their ability to kill U266 BCMA+ tumor cells by redirecting activated primary T cells. In this experiment, U266 cells that express BCMA were mixed with activated pan T cells in an E:T ratio of 10:1 along with the addition of a bispecific antibody. The x-axis shows the concentration of the applied antibody, and the y-axis shows the %
На фиг. 5 проиллюстрирована биспецифическая активность уничтожения U266, коррелирующая с высвобождением ИЛ-2. Сравнение активности лизиса опухолевых клеток, опосредованной биспецифическими антителами, с высвобождением цитокина ИЛ-2 изображено на диаграмме рассеяния. Корреляция между производством ИЛ-2 и лизисом опухолевых клеток U266 составляет R2= 0,37. In FIG. 5 illustrates the bispecific killing activity of U266 correlated with IL-2 release. Comparison of the activity of tumor cell lysis mediated by bispecific antibodies with the release of the cytokine IL-2 is shown in the scatterplot. The correlation between IL-2 production and U266 tumor cell lysis is R 2 = 0.37.
На фиг. 6 проиллюстрирована биспецифическая активность уничтожения U266, коррелирующая с высвобождением ИФН-γ. Сравнение активности лизиса опухолевых клеток, опосредованной биспецифическими антителами, с высвобождением цитокина ИФН- γ изображено на диаграмме рассеяния. Корреляция между производством ИФН- g и лизисом опухолевых клеток U266 составляет R2= 0,53. In FIG. 6 illustrates bispecific U266 killing activity correlated with IFN-γ release. Comparison of the activity of tumor cell lysis mediated by bispecific antibodies with the release of the cytokine IFN-γ is shown in the scatterplot. The correlation between the production of IFN-g and the lysis of tumor cells U266 is R 2 = 0.53.
На фиг. 7 проиллюстрирована биспецифическая активность уничтожения U266, коррелирующая с аффинностью связывания с CD3. Сравнение активности лизиса опухолевых клеток U266, опосредованной биспецифическими антителами, с аффинностью связывания с CD3 изображено на диаграмме рассеяния. Корреляция между ЭК50 уничтожения U266 и аффинностью связывания белка составляет R2= 0,93. In FIG. 7 illustrates the bispecific killing activity of U266 correlated with binding affinity for CD3. Comparison of bispecific antibody-mediated U266 tumor cell lysis activity with CD3 binding affinity is depicted in a scatterplot. The correlation between U266 killing EC50 and protein binding affinity is R 2 = 0.93.
На фиг. 8A-8D проиллюстрирован опосредованный биспецифическими антителами лизис опухолевых клеток. Биспецифические антитела αCD3_F1F: aBCMA анализировали на способность уничтожать три различных линии опухолевых клеток ВСМА+ и одну линию ВСМА-негативных клеток путем перенаправления активированных исходных Т-клеток. В этом эксперименте опухолевые клетки смешивали с активированными пан-Т-клетками в соотношении E:T 10:1 наряду с добавлением биспецифического антитела. На фиг. 8A проиллюстрировано уничтожение клеток RPMI-8226. На фиг. 8B проиллюстрировано уничтожение клеток NCI-H929, на фиг. 8C проиллюстрировано уничтожение клеток U-266 и на фиг. 8D проиллюстрировано уничтожение клеток K562, отрицательный контроль. Ось x демонстрирует концентрацию применяемого антитела, а ось y демонстрирует % лизиса опухолевых клеток через 6 часов после добавления антитела. In FIG. 8A-8D illustrate bispecific antibody-mediated tumor cell lysis. The αCD3_F1F:aBCMA bispecific antibodies were analyzed for their ability to kill three different BCMA+ tumor cell lines and one BCMA-negative cell line by redirecting activated parental T cells. In this experiment, tumor cells were mixed with activated pan-T cells in an E:T ratio of 10:1 along with the addition of a bispecific antibody. In FIG. 8A illustrates the killing of RPMI-8226 cells. In FIG. 8B illustrates the killing of NCI-H929 cells, FIG. 8C illustrates the killing of U-266 cells and FIG. 8D shows killing of K562 cells, negative control. The x-axis shows the concentration of the applied antibody, and the y-axis shows the %
На фиг. 9A-9D проиллюстрировано опосредованное биспецифическими антителами высвобождение ИЛ-2. Уровень высвобождения цитокинов ИЛ-2 измеряли после культивирования Т-клеток человека в покое с различными линиями опухолевых клеток и увеличивающимися дозами биспецифического антитела αCD3_F1F:aBCMA. На фиг. 9A проиллюстрировано высвобождение ИЛ-2, стимулированное клетками RPMI-8226, на фиг. 9B проиллюстрировано высвобождение ИЛ-2, стимулированное клетками NCI-H929, на фиг. 9C проиллюстрировано высвобождение ИЛ-2, стимулированное клетками U-266 и на фиг. 9D проиллюстрировано высвобождение ИЛ-2, стимулированное клетками K562, отрицательный контроль. In FIG. 9A-9D illustrate bispecific antibody mediated release of IL-2. The release of IL-2 cytokines was measured after culturing human T cells at rest with various tumor cell lines and increasing doses of the αCD3_F1F:aBCMA bispecific antibody. In FIG. 9A illustrates IL-2 release stimulated by RPMI-8226 cells, FIG. 9B illustrates IL-2 release stimulated by NCI-H929 cells, FIG. 9C illustrates IL-2 release stimulated by U-266 cells and FIG. 9D illustrates IL-2 release stimulated by K562 cells, negative control.
На фиг. 10A-10D проиллюстрировано опосредованное биспецифическими антителами высвобождение ИФН-γ. Уровень высвобождения цитокина ИФН-γ измеряли после культивирования Т-клеток человека в покое с различными линиями опухолевых клеток и увеличивающимися дозами биспецифического антитела αCD3_F1F:aBCMA (как проиллюстрировано на фиг. 10). На фиг. 10A проиллюстрировано высвобождение ИФН-γ, стимулированное клетками RPMI-8226, на фиг. 10B проиллюстрировано высвобождение ИФН-γ, стимулированное клетками NCI-H929, на фиг. 10C проиллюстрировано высвобождение ИФН-γ, стимулированное клетками U-266 и на фиг. 10D проиллюстрировано высвобождение ИФН-γ, стимулированное клетками K562, отрицательный контроль. In FIG. 10A-10D illustrate bispecific antibody mediated release of IFN-γ. The level of release of the cytokine IFN-γ was measured after culturing human T cells at rest with various tumor cell lines and increasing doses of the αCD3_F1F:aBCMA bispecific antibody (as illustrated in Fig. 10). In FIG. 10A illustrates IFN-γ release stimulated by RPMI-8226 cells, FIG. 10B illustrates IFN-γ release stimulated by NCI-H929 cells, FIG. 10C illustrates IFN-γ release stimulated by U-266 cells and FIG. 10D illustrates IFN-γ release stimulated by K562 cells, negative control.
Подробное описаниеDetailed description
Чтобы облегчить понимание этого изобретения, ряд терминов определен ниже. To facilitate understanding of this invention, a number of terms are defined below.
Перед описанием данных активных агентов и способов, следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретной описанной методологией, продуктами, устройствами и факторами, поскольку такие способы, устройства и составы, конечно, могут видоизменяться. Следует также понимать, что применяемая в данном документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов реализации изобретения и не предназначена для ограничения объема данного изобретения, которое будет ограничено только прилагаемой формулой изобретения. Before describing these active agents and methods, it should be understood that this invention is not limited to the particular methodology, products, devices, and factors described, as such methods, devices, and formulations may, of course, be modified. It should also be understood that the terminology used herein is only intended to describe particular embodiments of the invention and is not intended to limit the scope of the invention, which will be limited only by the appended claims.
Необходимо отметить, что в данном документе и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают обозначаемые объекты во множественном числе, если иное непосредственно не следует из контекста. Таким образом, например, ссылка на "потенциальный лекарственный препарат" относится к одному или более таким потенциальным кандидатам, а ссылка на "способ" включает ссылки на эквивалентные этапы и способы, известные специалистам в данной области техники, и так далее. It should be noted that in this document and in the appended claims, the singular forms include the designated objects in the plural, unless otherwise directly follows from the context. Thus, for example, reference to "drug potential" refers to one or more such potential candidates, and reference to "method" includes references to equivalent steps and methods known to those skilled in the art, and so on.
Если не указано иное, все употребляемые в данном документе технические и научные термины имеют значения, обычно подразумеваемые специалистом в данной области техники, к которой принадлежит изобретение. Все публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки с целью описания и раскрытия устройств, составов и методов, которые описаны в публикации и которые могут применяться в связи с описанным выше изобретением. Unless otherwise indicated, all technical and scientific terms used in this document have the meanings usually implied by a person skilled in the art to which the invention belongs. All publications mentioned in this document are incorporated herein by reference for the purpose of describing and disclosing the devices, compositions and methods that are described in the publication and which can be used in connection with the invention described above.
В случае, когда предусмотрен диапазон значений, следует понимать, что каждое промежуточное значение, до десятой единицы нижнего предела, если из контекста явно не следует иное, между верхним и нижним пределом этого диапазона и любое другое указанное или промежуточное значение в этом указанном диапазоне охватываются в пределах изобретения. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны, а также включены в данное изобретение, с учетом любого конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. В тех случаях, когда указанный диапазон включает одно или оба из этих пределов, в изобретение также включены диапазоны, исключающие любой или оба из этих включенных пределов. Where a range of values is provided, it is to be understood that each intermediate value, up to the tenth unit of the lower limit, unless the context clearly dictates otherwise, between the upper and lower limits of that range and any other specified or intermediate value within that specified range is covered by within the scope of the invention. The upper and lower limits of these smaller ranges may be independently included in the smaller ranges and are also included in this invention, subject to any specifically excluded limit in the specified range. In cases where the specified range includes one or both of these limits, the invention also includes ranges that exclude any or both of these included limits.
В последующем описании изложены многочисленные конкретные подробности с целью обеспечения более полного понимания данного изобретения. Однако для специалиста в данной области техники будет очевидно, что данное изобретение может применяться на практике и без одной или более указанных конкретных подробностей. В других случаях общеизвестные особенности и процедуры, хорошо известные специалистам в данной области техники, не описываются с целью избегания затруднения понимания изобретения. In the following description, numerous specific details are set forth in order to provide a more complete understanding of the present invention. However, for a person skilled in the art it will be obvious that this invention can be practiced without one or more of these specific details. In other cases, well-known features and procedures well known to those skilled in the art are not described in order to avoid obscuring the invention.
Обычно в данном изобретении применяются общепринятые способы синтеза белка, культуры рекомбинантных клеток и выделения белка и методы рекомбинантной ДНК, известные специалистам в данной области техники. Такие методы подробно описаны в литературе, см., например, Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual (1982 год); Sambrook, Russell and Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2001 год); Harlow, Lane and Harlow, Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol No. I, Cold Spring Harbor Laboratory (1998 год); и Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (1988 год). Generally, conventional methods of protein synthesis, recombinant cell culture and protein isolation, and recombinant DNA methods known to those skilled in the art are employed in the present invention. Such methods are described in detail in the literature, see, for example, Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Sambrook, Russell and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2001); Harlow, Lane and Harlow, Using Antibodies:A Laboratory Manual:Portable Protocol No. I, Cold Spring Harbor Laboratory (1998); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (1988).
Определения терминовDefinitions of terms
Под термином "содержащий" подразумевается, что перечисленные элементы требуются для композиции/способа/набора, однако для формирования композиции/способа/набора и тому подобного в рамках формулы изобретения могут быть включены и другие элементы. The term "comprising" means that the listed elements are required for the composition/method/kit, however, other elements may be included within the scope of the claims to form the composition/method/kit and the like.
Под термином "состоящий по существу из" подразумевается ограничение рамок описанной композиции или способа указанными материалами или поэтапными действиями, не оказывающими существенного влияния на основную и новую характеристику (характеристики) объекта изобретения. The term "consisting essentially of" means limiting the scope of the described composition or method to the specified materials or step-by-step actions that do not significantly affect the main and new characteristic (characteristics) of the subject matter of the invention.
Под термином “состоящий из” подразумевается исключение любого элемента, поэтапного действия или ингредиента, не указанного в формуле изобретения, из композиции, способа или набора. By "consisting of" is meant the exclusion of any element, step, or ingredient not listed in a claim from a composition, method, or kit.
Термины “лекарственное средство”, “лечение” и тому подобное используются в данном документе для общего обозначения желательного фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим в смысле полного или частичного предотвращения заболевания или его симптома, и/или терапевтическим в смысле частичного или полного излечения заболевания и/или нежелательного эффекта, относящегося к указанному заболеванию. Термин “лечение” в данном документе охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего, и включает:(a) профилактику возникновения заболевания у субъекта, который, возможно, предрасположен к данному заболеванию, однако которому не поставлен диагноз данного заболевания; (b) ингибирование заболевания, то есть, остановку его развития; или (c) облегчение заболевания, то есть, регрессию заболевания. Терапевтический агент можно вводить до, во время или после начала заболевания или травмы. Лечение текущего заболевания, при котором лечение стабилизирует или ослабляет нежелательные клинические симптомы у пациента, представляет особый интерес. Такое лечение желательно выполнять до полной потери функции пораженных тканей. Рассматриваемое лекарственное средство можно вводить во время симптоматической стадии заболевания, и, в некоторых случаях, после симптоматической стадии заболевания. The terms "drug", "treatment", and the like are used herein to generically refer to a desired pharmacological and/or physiological effect. The effect may be prophylactic in the sense of completely or partially preventing a disease or symptom thereof, and/or therapeutic in the sense of partially or completely curing a disease and/or an undesirable effect related to said disease. The term "treatment" as used herein encompasses any treatment of a disease in a mammal, and includes: (a) preventing the onset of the disease in a subject who may be predisposed to the disease but who has not been diagnosed with the disease; (b) inhibiting the disease, that is, stopping its development; or (c) alleviating the disease, ie regression of the disease. The therapeutic agent may be administered before, during, or after the onset of a disease or injury. The treatment of the current disease, in which the treatment stabilizes or alleviates the patient's undesirable clinical symptoms, is of particular interest. Such treatment is desirable to perform until the complete loss of function of the affected tissues. The drug in question can be administered during the symptomatic stage of the disease, and, in some cases, after the symptomatic stage of the disease.
"Терапевтически эффективное количество" означает количество активного агента, необходимое для получения терапевтического благоприятного эффекта у субъекта. Например, “терапевтически эффективное количество” представляет собой количество, индуцирующее, облегчающее или иным образом вызывающее улучшение патологических симптомов, прогрессирования заболевания или физиологических состояний, ассоциированных с заболеванием или, или улучшающее устойчивость к расстройству. "Therapeutically effective amount" means the amount of an active agent required to produce a therapeutically beneficial effect in a subject. For example, a "therapeutically effective amount" is an amount that induces, alleviates, or otherwise causes improvement in pathological symptoms, disease progression, or physiological conditions associated with the disease, or, or improves resistance to a disorder.
Термины “субъект”, “индивид” и “пациент” в данном документе используются на равных основаниях и относятся к млекопитающему, подвергаемому оценке на предмет лечения и/или лечению. В одном варианте реализации млекопитающее является человеком. Термины “субъект”, “индивид” и “пациент” без ограничений охватывают индивидов с раком, аутоиммунными заболеваниями, патогенными инфекциями и тому подобным. Субъекты могут являться людьми, но включают и других млекопитающих, особенно пригодных для применения в качестве лабораторных моделей заболеваний человека, например, мышь, крысу и тому подобное. The terms “subject”, “individual” and “patient” are used interchangeably herein and refer to a mammal being evaluated for treatment and/or treatment. In one embodiment, the mammal is a human. The terms "subject", "individual" and "patient" include without limitation individuals with cancer, autoimmune diseases, pathogenic infections, and the like. Subjects may be humans, but include other mammals particularly useful as laboratory models of human diseases, such as mice, rats, and the like.
Термины "рак", "новообразование" и "опухоль" применяются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения клеток, которые демонстрируют автономный нерегулируемый рост таким образом, что они демонстрируют аберрантный фенотип роста, характеризующийся значительной потерей контроля над пролиферацией клеток. Клетки, представляющие интерес для обнаружения, анализа или лечения в данной заявке, включают предраковые (например, доброкачественные), злокачественные, предметастатические, метастатические и неметастатические клетки. Рак практически каждой ткани является известным. Фраза "раковая нагрузка" относится к количеству раковых клеток или объему рака у субъекта. Соответственно, снижение раковой нагрузки означает уменьшение количества раковых клеток или объема рака у субъекта. В данном контексте термин "раковая клетка" относится к любой клетке, которая представляет собой раковую клетку или получена из раковой клетки, например, клона раковой клетки. Специалистам в данной области техники известны многие типы раковых заболеваний, включая солидные опухоли, такие как карциномы, саркомы, глиобластомы, меланомы, лимфомы, миеломы и тому подобное, и циркулирующие злокачественные новообразования, такие как лейкемии, включая, в частности, В-клеточные лейкемии, Т-клеточные лейкемии и тому подобное. Примеры рака включают, но без ограничений, рак яичников, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак легких, рак простаты, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, рак мочевыводящих путей, рак щитовидной железы, рак почки, карциному, меланому, рак головы и шеи и рак головного мозга. The terms "cancer", "neoplasm" and "tumor" are used interchangeably herein to refer to cells that exhibit autonomous unregulated growth such that they exhibit an aberrant growth phenotype characterized by a significant loss of control over cell proliferation. Cells of interest for detection, analysis, or treatment in this application include precancerous (eg, benign), malignant, pre-metastatic, metastatic, and non-metastatic cells. Cancer of almost every tissue is known. The phrase "cancer burden" refers to the number of cancer cells or the volume of cancer in a subject. Accordingly, a reduction in cancer burden means a reduction in the number of cancer cells or the volume of cancer in a subject. In this context, the term "cancer cell" refers to any cell that is a cancer cell or derived from a cancer cell, such as a clone of a cancer cell. Many types of cancers are known to those skilled in the art, including solid tumors such as carcinomas, sarcomas, glioblastomas, melanomas, lymphomas, myelomas, and the like, and circulating malignancies such as leukemias, including but not limited to B-cell leukemias. , T-cell leukemias and the like. Examples of cancer include, but are not limited to, ovarian cancer, breast cancer, colon cancer, lung cancer, prostate cancer, hepatocellular cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, cancer urinary tract, thyroid cancer, kidney cancer, carcinoma, melanoma, head and neck cancer, and brain cancer.
Термины "антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность" и "АЗКЦ" относятся к реакции, опосредованной клетками, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют рецепторы Fc, такие как естественные клетки-киллеры, нейтрофилы и макрофаги, распознают связанное антитело на целевой клетке и вызывают лизис целевой клетки. Активность АЗКЦ может быть оценена с применением способов, таких как описанные в патенте США № 5,821,337. АЗКЦ относится к антителозависимому клеточноопосредованному фагоцитозу. The terms "antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity" and "ADCC" refer to a cell-mediated response in which non-specific cytotoxic cells that express Fc receptors, such as natural killer cells, neutrophils, and macrophages, recognize the bound antibody on the target cell and cause lysis of the target cell. . ADCC activity can be assessed using methods such as those described in US Pat. No. 5,821,337. ADCC refers to antibody-dependent cell-mediated phagocytosis.
"Эффекторные клетки" представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или более рецепторов константной области и выполняют эффекторные функции. "Effector cells" are leukocytes that express one or more constant region receptors and perform effector functions.
"Цитокин" представляет собой белок, высвобождаемый одной клеткой для воздействия на другую клетку в качестве межклеточного медиатора. Цитокины, представляющие интерес, включают, без ограничения, цитокины высвобождаемые из активированных Т клеток, например ИЛ-2, ИФН-γ и др.A "cytokine" is a protein released by one cell to act on another cell as an intercellular mediator. Cytokines of interest include, without limitation, those released from activated T cells, such as IL-2, IFN-γ, and others.
Термин "неиммуногенный" относится к материалу, который не инициирует, не провоцирует и не усиливает иммунный ответ, при этом иммунный ответ включает в себя адаптивный и/или врожденный иммунный ответ. The term "non-immunogenic" refers to a material that does not initiate, provoke, or enhance an immune response, which immune response includes an adaptive and/or innate immune response.
Термин "выделенный" означает, что материал извлечен из своего исходного окружения (например, природной среды, если он встречается в естественных условиях). Например, природный полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом животном, не является выделенным, но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от материалов, совместно с ним присутствующих в естественной системе, является выделенным. Такие нуклеотиды могут входить в состав вектора, и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могут входить в состав композиции, и по-прежнему являться выделенными в том смысле, что такой вектор или композиция не являются частью их природного окружения. The term "isolated" means that the material is removed from its original environment (eg, the natural environment, if it occurs naturally). For example, a natural polynucleotide or polypeptide present in a living animal is not isolated, but the same polynucleotide or polypeptide separated from materials co-existing with it in the natural system is isolated. Such nucleotides may be included in a vector, and/or such polynucleotides or polypeptides may be included in a composition and still be isolated in the sense that such vector or composition is not part of its natural environment.
Под термином "фармацевтически приемлемое вещество" подразумевают вспомогательное вещество, которое можно применять при получении фармацевтической композиции, и которое является в целом безопасным, нетоксичным и желательным; этот термин включает вспомогательные вещества, приемлемые как для ветеринарного использования, так и для фармацевтического использования для лечения людей. Такие вспомогательные вещества могут быть твердыми, жидкими, полужидкими или, в случае аэрозольной композиции, газообразными. By "pharmaceutically acceptable substance" is meant an excipient which can be used in the preparation of a pharmaceutical composition and which is generally safe, non-toxic and desirable; this term includes excipients acceptable for both veterinary use and pharmaceutical use in the treatment of humans. Such excipients may be solid, liquid, semi-liquid or, in the case of an aerosol composition, gaseous.
Под термином “фармацевтически приемлемые соли и сложные эфиры” подразумевают соли и сложные эфиры, являющиеся фармацевтически приемлемыми и обладающие желательными фармакологическими свойствами. Такие соли включают соли, которые могут образовываться при реакции кислых протонов, присутствующих в соединениях, с неорганическими или органическими основаниями. Подходящие неорганические соли включают соли, образованные щелочными металлами, например, натрием и калием, магнием, кальцием и алюминием. Подходящие органические соли включают соли, образованные органическими основаниями, например, аминными основаниями, например, этаноламином, диэтаноламином, триэтаноламином, трометамином, N-метилглюкамином и тому подобным. Такие соли также включают кислотно-аддитивные соли, образованные неорганическими кислотами (например, соляной и бромистоводородной кислотой) и органическими кислотами (например, уксусной кислотой, лимонной кислотой, малеиновой кислотой и алкан- и аренсульфоновыми кислотами, например, метансульфоновой кислотой и бензолсульфоновой кислотой). Фармацевтически приемлемые сложные эфиры включают эфиры, образованные из карбокси-, сульфонилокси- и фосфоноксигрупп, присутствующих в соединениях, например, C1-6 алкиловые эфиры. При наличии двух кислотных групп фармацевтически приемлемая соль или сложный эфир может представлять собой монокислоту-моносоль или сложный эфир или двойную соль, или сложный эфир, и, аналогичным образом, при наличии более чем двух кислотных групп, некоторые или все из таких групп могут находиться в виде соли или этерифицированном виде. Соединения, названия которых указаны в данном изобретении, могут присутствовать вне в форме соли или сложного эфира, или в форме соли и/или сложного эфира, и подразумевается, что наименование таких соединений включают как исходное соединение (не соль и не сложный эфир), так и его фармацевтически приемлемые соли и сложные эфиры. Кроме того, некоторые соединения, названия которых указаны в данном изобретении, могут присутствовать в более чем одной стереоизомерной форме, и подразумевается, что наименование таких соединений включают все одиночные стереоизомеры и все смеси (рацемические или другие) таких стереоизомеров. By "pharmaceutically acceptable salts and esters" is meant salts and esters that are pharmaceutically acceptable and have the desired pharmacological properties. Such salts include salts which may be formed by the reaction of acidic protons present in the compounds with inorganic or organic bases. Suitable inorganic salts include alkali metal salts such as sodium and potassium, magnesium, calcium and aluminum. Suitable organic salts include those derived from organic bases, eg amine bases, eg ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, tromethamine, N-methylglucamine and the like. Such salts also include acid addition salts formed with inorganic acids (eg, hydrochloric and hydrobromic acid) and organic acids (eg, acetic acid, citric acid, maleic acid, and alkane and arenesulfonic acids, such as methanesulfonic acid and benzenesulfonic acid). Pharmaceutically acceptable esters include esters derived from carboxy, sulfonyloxy and phosphonoxy groups present in the compounds, eg C 1-6 alkyl esters. When two acidic groups are present, the pharmaceutically acceptable salt or ester may be a monoacid-monosalt or ester, or a double salt or ester, and similarly, when more than two acidic groups are present, some or all of such groups may be in salt form or esterified form. The compounds whose names are mentioned in this invention may be present externally in the form of a salt or ester, or in the form of a salt and/or ester, and the name of such compounds is intended to include both the parent compound (not a salt and not an ester) and and its pharmaceutically acceptable salts and esters. In addition, some compounds named in this invention may be present in more than one stereoisomeric form, and the names of such compounds are intended to include all single stereoisomers and all mixtures (racemic or otherwise) of such stereoisomers.
Термины "фармацевтически приемлемый", "физиологически переносимый" и их грамматические формы по отношению к композициям, носителям, разбавителям и реагентам применяются на равных основаниях и означают, что указанные материалы можно вводить или наносить на организм человека без нежелательных физиологических эффектов, которые могли бы препятствовать введению композиции. The terms "pharmaceutically acceptable", "physiologically tolerable" and their grammatical forms in relation to compositions, carriers, diluents and reagents are used on an equal footing and mean that these materials can be administered or applied to the human body without undesirable physiological effects that could prevent composition introduction.
"Гомологию" между двумя последовательностями определяют по идентичности последовательностей. Если две последовательности, которые должны сравниваться друг с другом, отличаются по длине, идентичность последовательности предпочтительно относится к проценту нуклеотидных остатков более короткой последовательности, которые идентичны нуклеотидным остаткам более длинной последовательности. Обычно идентичность последовательностей можно определять с помощью компьютерных программ, таких как программа Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, Wis. 53711). Программа Bestfit применяет локальный алгоритм гомологии Смита-Уотермана (Smith и Waterman), Advances in Applied Mathematics 2 (1981 год), 482-489, для поиска сегмента с самой высокой идентичностью последовательности между двумя последовательностями. В случае применения Bestfit или другой программы выравнивания последовательностей с целью определения того, идентична ли конкретная последовательность, например, на 95% эталонной последовательности, предлагаемой в данном изобретении, параметры предпочтительно регулируют таким образом, чтобы процент идентичности рассчитывался для всей длины эталонной последовательности, и при этом, чтобы допускались гэпы в гомологии вплоть до 5% от общего количества нуклеотидов в эталонной последовательности. В случае применения Bestfit так называемые необязательные параметры предпочтительно оставляют в своих предустановленных ("по умолчанию") значениях. Отклонения, появляющиеся при сравнении данной последовательности и описанных выше последовательностей, предлагаемых в данном изобретении, могут быть вызваны, например, добавлением, делецией, заменой, вставкой или рекомбинацией. Такое сравнение последовательностей можно предпочтительно выполнять с помощью программы "fasta20u66" (версия 2. 0u66, сентябрь 1998 года, разработана William R. Pearson и University of Virginia; смотри также публикацию W. R. Pearson (1990 год), Methods in Enzymology 183, 63-98, прилагаемые примеры и http://workbench.sdsc.edu/). Для этой цели могут применять настройки параметров "по умолчанию". "Homology" between two sequences is defined by sequence identity. If the two sequences to be compared to each other differ in length, sequence identity preferably refers to the percentage of nucleotide residues of the shorter sequence that are identical to the nucleotide residues of the longer sequence. Typically, sequence identity can be determined using computer programs such as Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package,
Термин "вариант" относится к полипептидам, имеющим аминокислотные последовательности, которые в некоторой степени отличаются от полипептида с нативной последовательностью. Обычно варианты аминокислотных последовательностей будут обладать, по меньшей мере, около 80% идентичностью последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере, на около 90% гомологичны по последовательности. Варианты аминокислотной последовательности могут иметь замены, делеции и/или вставки в определенных положениях в эталонной аминокислотной последовательности. The term "variant" refers to polypeptides having amino acid sequences that differ to some extent from the native sequence polypeptide. Typically, amino acid sequence variants will have at least about 80% sequence identity, more preferably at least about 90% sequence homology. Amino acid sequence variants may have substitutions, deletions and/or insertions at certain positions in the reference amino acid sequence.
Термин "вектор" в контексте данного документа обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, с ней соединенную. Один тип вектора представляет собой "плазмиду", которая относится к циклической двухцепочечной петле ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, не-эпиcомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку хозяина и, таким образом, реплицироваться вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы упоминаются в данном документе как "рекомбинантные экспрессионные векторы" (или просто, "рекомбинантные векторы"). В общем, векторы экспрессии, используемые в технологиях рекомбинантной ДНК, часто имеют форму плазмид. В данном описании изобретения "плазмида" и "вектор" могут быть взаимозаменяемы, поскольку плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. The term "vector" in the context of this document means a nucleic acid molecule capable of carrying another nucleic acid connected to it. One type of vector is a "plasmid", which refers to a cyclic double-stranded loop of DNA into which additional DNA segments can be ligated. Another type of vector is a viral vector in which additional DNA segments can be ligated into the viral genome. Certain vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors having a bacterial origin of replication and mammalian episomal vectors). Other vectors (eg, non-episomal mammalian vectors) can be integrated into the genome of a host cell when introduced into the host cell and thus replicate along with the host genome. Moreover, some vectors are capable of directing the expression of genes to which they are operatively linked. Such vectors are referred to herein as "recombinant expression vectors" (or simply, "recombinant vectors"). In general, expression vectors used in recombinant DNA technologies are often in the form of plasmids. In this specification, "plasmid" and "vector" may be used interchangeably, as the plasmid is the most commonly used form of the vector.
Применяемый в данном документе термин "клетка-хозяин" (или "рекомбинантная клетка-хозяин") предназначен для обозначения клетки, которая была генетически изменена или способна генетически изменяться путем введения экзогенного полинуклеотида, такого как рекомбинантная плазмида или вектор. Следует понимать, что такие термины предназначены для обозначения не только конкретной исследуемой клетки, но и клеток, происходящих из нее. Поскольку некоторые модификации могут произойти в последующих поколениях из-за мутаций или воздействия окружающей среды, такое потомство не может, по сути, быть идентичным родительской клетке, но все еще включено в термин "клетка-хозяин", как применяется в данном документе. As used herein, the term "host cell" (or "recombinant host cell") is intended to refer to a cell that has been genetically altered or is capable of being genetically altered by the introduction of an exogenous polynucleotide, such as a recombinant plasmid or vector. It should be understood that such terms are intended to refer not only to the specific cell under study, but also to cells derived from it. Since some modifications may occur in subsequent generations due to mutations or environmental influences, such progeny may not be essentially identical to the parent cell, but are still included in the term "host cell" as used herein.
"Аффинность связывания" обычно относится к силе суммарного количества нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антителом или другой связывающей молекулой) и ее партнером по связыванию (например, антигеном или рецептором). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y, как правило, можно представить в виде константы диссоциации (Kd). Аффинность можно измерить с помощью общепринятых способов, известных в данной области техники, в том числе тех, которые описаны в данном документе. Низкоаффинные антитела слабо связывают антиген (или рецептор) и склонны легко диссоциировать, тогда как высокоаффинные антитела связывают антиген (или рецептор) более плотно и имеют тенденцию оставаться связанными дольше. "Binding affinity" generally refers to the strength of the total number of non-covalent interactions between one binding site of a molecule (eg, an antibody or other binding molecule) and its binding partner (eg, an antigen or receptor). The affinity of a molecule X for its partner Y can generally be represented as a dissociation constant (Kd). Affinity can be measured using conventional methods known in the art, including those described herein. Low affinity antibodies bind the antigen (or receptor) weakly and tend to dissociate easily, while high affinity antibodies bind the antigen (or receptor) more tightly and tend to stay bound longer.
Если специально не указано иное, термин "конъюгат", как описано и заявлено в данном документе, определяется как гетерогенная молекула, образованная ковалентным присоединением одного или более фрагментов антитела к одной или более молекуле(ам) полимера, при этом гетерогенная молекула растворима в воде, то есть растворима в физиологических жидкостях, таких как кровь, и при этом гетерогенная молекула свободна от любого структурированного агрегата. Представляющий интерес конъюгат представляет собой ПЭГ. В контексте вышеприведенного определения термин "структурированный агрегат" относится к (1) любому агрегату молекул в водном растворе, имеющему структуру сфероида или сфероидной оболочки, так что гетерогенная молекула не находится в мицелле или другой эмульсионной структуре, и не фиксирована в липидном бислое, везикуле или липосоме; и (2) любому агрегату молекул в твердой или нерастворимой форме, такой как матрица хроматографических шариков, который не высвобождает гетерогенную молекулу в раствор при контакте с водной фазой. Соответственно, термин "конъюгат", как он определено в данном документе, охватывает вышеупомянутую гетерогенную молекулу как преципитат, осадок, биоразрушаемая матрица или другое твердое вещество, способное высвобождать гетерогенную молекулу в водный раствор при гидратации твердого вещества. Unless specifically stated otherwise, the term "conjugate", as described and stated herein, is defined as a heterogeneous molecule formed by the covalent attachment of one or more antibody fragments to one or more polymer molecule(s), wherein the heterogeneous molecule is soluble in water, that is, soluble in bodily fluids such as blood, yet the heterogeneous molecule is free of any structured aggregate. The conjugate of interest is PEG. In the context of the above definition, the term "structured aggregate" refers to (1) any aggregate of molecules in aqueous solution having a spheroid or spheroid shell structure such that the heterogeneous molecule is not in a micelle or other emulsion structure, and is not fixed in a lipid bilayer, vesicle or liposome; and (2) any aggregate of molecules in solid or insoluble form, such as an array of chromatographic beads, that does not release the heterogeneous molecule into solution upon contact with the aqueous phase. Accordingly, the term "conjugate" as defined herein encompasses the aforementioned heterogeneous molecule as a precipitate, precipitate, biodegradable matrix, or other solid capable of releasing the heterogeneous molecule into aqueous solution upon hydration of the solid.
Слово "метка" при использовании в данном документе относится к детектируемому соединению или композиции, которое прямо или косвенно конъюгировано с антителом. Сама метка может быть выявляемой сама по себе (например, метки-радиоизотопы или флуоресцентные метки) или, в случае ферментной метки, может катализировать такие химические изменения субстратного соединения или композиции, которые можно выявить. The word "label" as used herein refers to a detectable compound or composition that is directly or indirectly conjugated to an antibody. The label itself may be detectable per se (eg, radioisotope or fluorescent labels) or, in the case of an enzymatic label, may catalyze such chemical changes in the substrate compound or composition as are detectable.
Под "твердой фазой" подразумевается безводная матрица, к которой может приставать антитело по данному изобретению. Примеры твердых фаз, охватываемых данным документом, включают те, которые сформированы частично или полностью из стекла (например, стекла с контролируемым размером пор), полисахаридов (например, агарозы), полиакриламидов, полистирола, поливинилового спирта и силиконов. В определенных вариантах реализации изобретения, в зависимости от контекста, твердая фаза может содержать лунку аналитического планшета; в других это колонка очистки (например, колонка аффинной хроматографии). Этот термин также включает в себя прерывистую твердую фазу из дискретных частиц, такую как описанная в патенте США № 4,275,149. By "solid phase" is meant an anhydrous matrix to which an antibody of the invention can adhere. Examples of solid phases covered by this document include those formed partially or wholly from glass (eg, controlled pore glass), polysaccharides (eg, agarose), polyacrylamides, polystyrene, polyvinyl alcohol, and silicones. In certain embodiments of the invention, depending on the context, the solid phase may contain the well of the analytical tablet; in others it is a purification column (for example, an affinity chromatography column). The term also includes a discontinuous solid phase of discrete particles, such as described in US patent No. 4,275,149.
Антитела, также называемые иммуноглобулинами, обычно содержат по меньшей мере одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, причем аминоконцевой домен тяжелой и легкой цепей является вариабельным по последовательности, и поэтому обычно называется доменом вариабельной области, или вариабельным доменом тяжелой цепи (VH) и вариабельным доменом легкой цепи (VH). Эти два домена обычно связываются друг с другом, образуя специфическую область связывания, хотя здесь также обсуждается, что специфическое связывание также можно получить с применением только вариабельных последовательностей тяжелой цепи, и в данной области техники известно и применяется большое количество неприродных конфигураций антител. Antibodies, also called immunoglobulins, usually contain at least one heavy chain and one light chain, wherein the amino-terminal domain of the heavy and light chains is variable in sequence and is therefore commonly referred to as a variable region domain, or a heavy chain variable domain (VH) and a variable domain light chain (VH). These two domains usually bind to each other to form a specific binding region, although it is also discussed here that specific binding can also be obtained using only heavy chain variable sequences, and a large number of non-natural antibody configurations are known and used in the art.
"Функциональное" или "биологически активное" антитело или антигенсвязывающая молекула (включая антитела, содержащие только тяжелые цепи, и биспецифичные трехцепочечные антителоподобные молекулы (ТСА - three-chain antibody-like molecules) в данном документе) представляет собой антитело или молекулу, способную проявлять одну или более из своих естественных активностей при структурных, регуляторных, биохимических или биофизических явлениях. Например, функциональное антитело или другая связывающая молекула, например, TCA, может обладать способностью специфически связывать антиген, и это связывание, в свою очередь, может вызывать или изменять клеточные, или молекулярные явления, например, передачу сигнала или ферментативную активность. Функциональное антитело или другая связывающая молекула, например, TCA, также может блокировать активацию лиганда или рецептора или действовать как агонист или антагонист. Способность антитела или другой связывающей молекулы, например, TCA, проявить одну или более своих природных активностей, зависит от нескольких факторов, включая правильный фолдинг и сборку полипептидных цепей. A "functional" or "biologically active" antibody or antigen-binding molecule (including heavy chain-only antibodies and bispecific three-chain antibody-like molecules (TCAs) herein) is an antibody or molecule capable of exhibiting one or more of their natural activities in structural, regulatory, biochemical or biophysical phenomena. For example, a functional antibody or other binding molecule, such as TCA, may have the ability to specifically bind an antigen, and this binding, in turn, may cause or alter cellular or molecular events, such as signal transduction or enzymatic activity. A functional antibody or other binding molecule, such as TCA, can also block ligand or receptor activation or act as an agonist or antagonist. The ability of an antibody or other binding molecule, such as TCA, to exhibit one or more of its natural activities depends on several factors, including the correct folding and assembly of polypeptide chains.
Термин "антитело" в данном документе применяют в его наиболее широком смысле; он специфически охватывает моноклональные антитела, поликлональные антитела, мономеры, димеры, мультимеры, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), антитела, содержащие только тяжелую цепь, трехцепочечные антитела, одноцепочечные Fv-фрагменты, нанотела и тому подобное, а также включает фрагменты антител, при условии, что они обладают желательной биологической активностью (Miller и соавт. (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). Антитела могут являться антителами мыши, человека, гуманизированными, химерными антителами или могут быть происходить от других видов животных. The term "antibody" in this document is used in its broadest sense; it specifically encompasses monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, monomers, dimers, multimers, polyspecific antibodies (e.g., bispecific antibodies), heavy chain-only antibodies, three-chain antibodies, single-chain Fv fragments, nanobodies, and the like, and also includes antibody fragments, provided they have the desired biological activity (Miller et al. (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). The antibodies may be murine, human, humanized, chimeric, or may be derived from other animal species.
Термин антитело может относиться к полноразмерной тяжелой цепи, полноразмерной легкой цепи, интактной молекуле иммуноглобулина; или иммунологически активному фрагменту любого из этих полипептидов, то есть, полипептиду, содержащему антигенсвязывающий сайт, иммуноспецифически связывающий антиген или мишень, представляющую интерес, или их фрагмент, причем такие мишени включают раковую клетку или клетки, продуцирующие аутоиммунные антитела, ассоциированные с аутоиммунным заболеванием, но не ограничиваются ими. Описанный в данном документе иммуноглобулин может быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекул иммуноглобулинов, включая сконструированные подклассы с измененными Fc-фрагментами, обеспечивающими ослабление или усиление активности эффекторных клеток. Иммуноглобулины могут происходить от любого вида животных. В одном аспекте иммуноглобулин имеет в основном человеческое происхождение. The term antibody can refer to a full length heavy chain, a full length light chain, an intact immunoglobulin molecule; or an immunologically active fragment of any of these polypeptides, that is, a polypeptide containing an antigen-binding site that immunospecifically binds an antigen or target of interest, or a fragment thereof, and such targets include a cancer cell or cells producing autoimmune antibodies associated with an autoimmune disease, but are not limited to them. The immunoglobulin described herein can be of any type (eg, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA), class (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2) or subclass of immunoglobulin molecules, including engineered subclasses with altered Fc -fragments that provide a weakening or enhancement of the activity of effector cells. Immunoglobulins can be derived from any animal species. In one aspect, the immunoglobulin is primarily of human origin.
Термин “вариабельный” относится к тому факту, что последовательности некоторых частей вариабельных доменов сильно различаются у разных антител и вносят вклад в связывание и специфичность каждого конкретного антитела по отношению к его конкретному антигену. В то же время изменчивость не является равномерно распределенной по вариабельным доменам антител. Она сосредоточена в трех сегментах вариабельных доменов как легкой, так и тяжелой цепи, называемых гипервариабельными областями. Более консервативные фрагменты вариабельных доменов называются каркасными областями (FR). Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, преимущественно принимающих конфигурацию бета-листа, соединенных тремя гипервариабельными участками, которые образуют петли, соединяющие структуру бета-листа, а в некоторых случаях – образующие часть структуры бета-листа. Гипервариабельные области каждой цепи объединены друг с другом в непосредственной близости от FR и, вместе с гипервариабельными областями другой цепи, участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat и соавт. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд. Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, штат Мэриленд). Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, однако проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности (АЗКЦ). The term “variable” refers to the fact that the sequences of certain portions of the variable domains vary greatly between antibodies and contribute to the binding and specificity of each particular antibody for its particular antigen. At the same time, variability is not evenly distributed across the variable domains of antibodies. It is concentrated in three segments of both the light and heavy chain variable domains called hypervariable regions. More conserved fragments of variable domains are called framework regions (FRs). Each of the native heavy and light chain variable domains contains four FRs, predominantly taking on the beta-sheet configuration, connected by three hypervariable regions that form loops connecting the beta-sheet structure, and in some cases forming part of the beta-sheet structure. The hypervariable regions of each chain are associated with each other in close proximity to the FR and, together with the hypervariable regions of the other chain, are involved in the formation of the antigen-binding site of antibodies (see Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. . Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD). The constant domains are not directly involved in the binding of the antibody to the antigen, but exhibit various effector functions, such as participation of the antibody in antibody-dependent cellular toxicity (ADCC).
Термин "гипервариабельная область", в случае если применяется в данном документе, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывания антигена. Гипервариабельная область может содержать аминокислотные остатки из "определяющей комплементарность области" или "CDR" и/или эти остатки из "гипервариабельной петли". Остатки "каркасной области" или "FR" представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области, как определено в данном документе. The term "hypervariable region", as used herein, refers to the amino acid residues of an antibody that are responsible for antigen binding. A hypervariable region may contain amino acid residues from a "complementarity determining region" or "CDR" and/or those residues from a "hypervariable loop". "Framework region" or "FR" residues are variable domain residues other than hypervariable region residues as defined herein.
Вариабельные области, представляющие интерес, включают, по меньшей мере, одну последовательность CDR из вариабельных областей семейства 2, представленных в данном документе, обычно, по меньшей мере, 2 последовательности CDR и, более обычно, 3 последовательности CDR. Типовые обозначения CDR показаны в данном документе, однако специалист в данной области техники поймет, что обычно применяется ряд определений CDR, включая определение по Кабату (см. "Zhao и соавт., A germline knowledge based computational approach for determining antibody complementarity determining regions". Mol Immunol. 2010 год; 47:694–700), которое основано на изменчивости последовательности и является наиболее часто применяемым. Определение по Чотиа основано на расположении областей структурной петли (Chothia и соавт. "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions." Nature. 1989 год; 342:877–883). Предоставляющие интерес альтернативные определения CDR включают, без ограничения, те, которые раскрыты в работах Honegger, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool. " J Mol Biol. 2001 год; 309:657–670; Ofran и соавт. "Automated identification of complementarity determining regions (CDRs) reveals peculiar characteristics of CDRs and B cell epitopes". J Immunol. 2008 год; 181:6230–6235; Almagro "Identification of differences in the specificity-determining residues of antibodies that recognize antigens of different size: implications for the rational design of antibody repertoires". J Mol Recognit. 2004 год; 17:132–143; и Padlanet и соавт. "Identification of specificity-determining residues in antibodies." Faseb J. 1995 год; 9:133–139., каждая из которых специально включена в данном документе посредством ссылки. Variable regions of interest include at least one CDR sequence from the
Термин "моноклональное антитело" в данном документе относится к антителу, полученному из популяции в значительной степени однородных антител, то есть, отдельные антитела в составе популяции являются идентичными, за исключением мутаций, происходящих по естественным причинам, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, поскольку они направлены против одиночного антигенного сайта. Кроме того, по сравнению с препаратами поликлональных антител, которые содержат различные антитела против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одиночной детерминанты антигена. Кроме специфичности, моноклональные антитела обладают преимуществом, заключающимся в том, что их можно синтезировать в виде, не загрязненном другими антителами. Модификатор “моноклональное” указывает на то, что антитело получено из практически однородной популяции антител; его не следует интерпретировать как требование о продукции антитела посредством какого-либо конкретного способа. The term "monoclonal antibody" as used herein refers to an antibody derived from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e., individual antibodies within the population are identical except for naturally occurring mutations that may be present in small amounts. Monoclonal antibodies are highly specific because they are directed against a single antigenic site. In addition, compared to polyclonal antibody preparations that contain different antibodies against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single antigen determinant. In addition to specificity, monoclonal antibodies have the advantage that they can be synthesized in a form that is not contaminated with other antibodies. The modifier "monoclonal" indicates that the antibody is derived from a substantially homogeneous population of antibodies; it should not be interpreted as requiring the production of an antibody by any particular method.
Антитела в данном документе включают "химерные" антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител конкретного вида животных или антител, принадлежащих к конкретному классу или подклассу, в то время как остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител другого вида животных или антител, принадлежащих к другому классу или подклассу, а также фрагментам таких антител, при условии, что они демонстрируют желательную биологическую активность (патент США № 4,816,567; и Morrison и соавт. (1984 год) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855). Представляющие интерес химерные антитела включают "приматизированные" антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, полученные от примата отличного от человека (например, мартышки Старого Света, обезьяны и тому подобное), и человеческие последовательности константной области. Antibodies herein include "chimeric" antibodies in which a portion of the heavy and/or light chain is identical or homologous to the corresponding sequences of antibodies of a particular animal species or antibodies belonging to a particular class or subclass, while the remainder of the chain(s) is identical or homologous to the corresponding sequences of antibodies from another animal species or antibodies belonging to another class or subclass, as well as fragments of such antibodies, provided that they demonstrate the desired biological activity (US patent No. 4,816,567; and Morrison et al. (1984) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851-6855). Chimeric antibodies of interest include "primatized" antibodies containing variable domain antigen-binding sequences derived from a non-human primate (eg, Old World marmosets, monkeys, and the like) and human constant region sequences.
"Интактная цепь антитела" в данном документе представляет собой цепь, содержащую полноразмерную вариабельную область и полноразмерную константную область (Fc). Интактное “стандартное” антитело содержит интактную легкую цепь и интактную тяжелую цепь, а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи - CH1, шарнир, CH2 и CH3 (для секретируемого IgG). Другие изотипы, например, IgM или IgA, могут содержать другие CH-домены. Константные домены могут представлять собой константные домены с нативной последовательностью (например, константные домены человека с нативной последовательностью) или варианты их аминокислотных последовательностей. Интактное антитело может обладать одной или более “эффекторными функциями”, которые относятся к его биологической активности, относимой на счет Fc-константной области (нативной последовательности Fc-области или аминокислотной последовательности вариантной Fc-области) антитела. Примеры эффекторных функций антител включают связывание C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание с рецептором Fc; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ); фагоцитоз; и подавление рецепторов поверхности клетки. Варианты константной области включают варианты, изменяющие эффекторный профиль, связывание с рецепторами Fc и тому подобным. An "intact antibody chain" as used herein is a chain containing a full length variable region and a full length constant region (Fc). An intact "standard" antibody contains an intact light chain and an intact heavy chain, as well as a light chain constant domain (CL) and heavy chain constant domains - CH1, hinge, CH2 and CH3 (for secreted IgG). Other isotypes, such as IgM or IgA, may contain other CH domains. The constant domains can be native sequence constant domains (eg, human native sequence constant domains) or amino acid sequence variants thereof. An intact antibody may have one or more "effector functions" that refer to its biological activity attributable to the Fc constant region (native sequence Fc region or amino acid sequence of a variant Fc region) of the antibody. Examples of antibody effector functions include C1q binding; complement-dependent cytotoxicity; binding to the Fc receptor; antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC); phagocytosis; and downregulation of cell surface receptors. Variants of the constant region include options that change the effector profile, binding to Fc receptors, and the like.
В зависимости от аминокислотных последовательностей Fc (константных доменов) тяжелых цепей антитела и разнообразные антиген-связывающие белки могут быть предоставлены как различные "классы". Существует пять основных классов Fc областей тяжелой цепи: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно подразделены на "подклассы" (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, и IgA2. Fc константные домены, соответствующие различным классам антител, могут упоминатся как α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Хорошо известны субъединичная структура и трехмерная конфигурация различных классов иммуноглобулинов. Формы Ig включают модификации шарнирной области или бесшарнирные формы (Roux и соавт. (1998 год) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund и соавт. (2000 год) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256; США 2005/0048572; США 2004/0229310). Легкие цепи антител любого вида позвоночных можно отнести к одному из двух типов, называемых κ- и λ-цепями, на основе аминокислотной последовательности их константных доменов. Depending on the Fc amino acid sequences (constant domains) of the heavy chains, antibodies and various antigen-binding proteins can be provided as different "classes". There are five major classes of heavy chain Fc regions: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and some of these can be further subdivided into "subclasses" (isotypes), such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, and IgA2. Fc constant domains corresponding to different classes of antibodies may be referred to as α, δ, ε, γ and μ, respectively. The subunit structure and three-dimensional configuration of various classes of immunoglobulins are well known. Ig forms include hinge modifications or hingeless forms (Roux et al. (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256; USA 2005 /0048572; USA 2004/0229310). The light chains of antibodies from any vertebrate species can be assigned to one of two types, called κ- and λ-chains, based on the amino acid sequence of their constant domains.
"Функциональная область Fc" обладает "эффекторной функцией" нативной последовательности области Fc. Типовые эффекторные функции включают связывание C1q; КЗЦ (комплементзависимую цитотоксичность); Связывание с рецептором Fc; АЗКЦ; АЗКФ (антителозависимый клеточный фагоцитоз); подавление рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточного рецептора) и тому подобное. Такие эффекторные функции обычно требуют взаимодействия области Fc с рецептором, например, рецепторами FcγRI; FcγRIIA; FcγRIIB1; FcγRIIB2; FcγRIIIA; FcγRIIIB, и рецептором FcRn, обладающим низкой аффинностью; их оценку можно выполнить с помощью различных анализов, описанных, например, в определениях в данном документе. "Мертвая" область Fc представляет собой область Fc, мутированную с целью сохранения активности по отношению к, например, увеличению продолжительности периода полужизни сыворотки, однако не активирующую рецептор Fc, обладающий высокой аффинностью. A "functional Fc region" has an "effector function" of a native sequence Fc region. Exemplary effector functions include C1q binding; CPC (complement dependent cytotoxicity); Fc receptor binding; ADCC; ADCP (antibody-dependent cellular phagocytosis); downregulation of cell surface receptors (eg B-cell receptor) and the like. Such effector functions typically require interaction of the Fc region with a receptor, such as FcγRI receptors; FcγRIIA; FcγRIIB1; FcγRIIB2; FcγRIIIA; FcγRIIIB, and a low affinity FcRn receptor; their evaluation can be performed using various analyzes described, for example, in the definitions in this document. A "dead" Fc region is an Fc region mutated to remain active in relation to, for example, increased serum half-life, but does not activate a high affinity Fc receptor.
“Нативная последовательность Fc-области” содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, встречающейся в природе. Нативные последовательности Fc-областей человека включают, например, нативную последовательность Fc-области IgG1 человека (отличных от А и А аллотипов); нативную последовательность Fc-области IgG2 человека; нативную последовательность Fc-области IgG3 человека; и нативную последовательность Fc-области IgG4 человека, а также их варианты, встречающиеся в природе. A "native sequence Fc region" contains an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of a naturally occurring Fc region. Native sequences of human Fc regions include, for example, native sequence of human IgG1 Fc regions (other than the A and A allotypes); native sequence of the human IgG2 Fc region; native sequence of the human IgG3 Fc region; and the native sequence of the human IgG4 Fc region, as well as naturally occurring variants thereof.
“Вариантная Fc-область” содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от нативной последовательности Fc-области за счет модификации по меньшей мере одной аминокислоты, предпочтительно замены одной или более аминокислот. Предпочтительно, вариантная Fc-область содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с нативной последовательностью Fc-области или Fc-области исходного полипептида, например, от приблизительно одной до приблизительно десяти аминокислотных замен, и предпочтительно от приблизительно одной до приблизительно пяти аминокислотных замен в нативной последовательности Fc-области или Fc-области исходного полипептида. Вариантная область Fc согласно данному изобретению предпочтительно обладает по меньшей мере около 80% гомологией по отношению к нативной последовательности области Fc и/или с области Fc исходного полипептида, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере около 90% гомологией по отношению к ним, более предпочтительно, по меньшей мере около 95% гомологией по отношению к ним. A "variant Fc region" contains an amino acid sequence that differs from the native sequence of the Fc region by modifying at least one amino acid, preferably by substituting one or more amino acids. Preferably, the variant Fc region contains at least one amino acid substitution compared to the native sequence Fc region or Fc region of the parent polypeptide, for example, from about one to about ten amino acid substitutions, and preferably from about one to about five amino acid substitutions in native sequence Fc-region or Fc-region of the original polypeptide. The variant Fc region of the present invention preferably shares at least about 80% homology with the native sequence of the Fc region and/or with the Fc region of the parent polypeptide, and most preferably at least about 90% homology with them, more preferably at least about 95% homology to them.
Вариантные последовательности Fc могут содержать три аминокислотных замены в области СН2 с целью ослабления связывания FcγRI в положениях 234, 235 и 237 согласно индексу ЕС (см., Duncan и соавт., (1988 год) Nature 332:563). Две аминокислотные замены в сайте связывания комплемента C1q в положениях 330 и 331 согласно индексу ЕС, ослабляют фиксацию комплемента (см., Tao и соавт., J. Exp. Med. 178:661 (1993 год) и Canfield and Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991 год)). Замена остатков в положениях 233-236 IgG1 или IgG2 человека и в положениях 327, 330 и 331 IgG4 значительно ослабляет АЗКЦ и КЗЦ (см., например, Armour KL. и соавт., 1999 год Eur J Immunol. 29(8):2613-24; и Shields RL. и соавт., 2001 год. J Biol Chem. 276(9):6591-604). Возможны другие варианты Fc-области, в том числе, без ограничений, вариант, в котором область, способная образовывать дисульфидную связь, удалена, или вариант, в котором удалены некоторые аминокислотные остатки на N-конце нативной Fc-формы или к ним добавлен остаток метионина. Таким образом, в одном варианте реализации данного изобретения один или более из Fc-фрагментов молекулы scFc может содержать одну или более мутацию в шарнирной области с целью устранения возможности образования дисульфидных связей. В еще одном варианте реализации шарнирная область Fc может быть полностью удалена. В еще одном варианте реализации молекула может содержать вариант Fc-области. Variant Fc sequences may contain three amino acid substitutions in the CH2 region to reduce FcγRI binding at positions 234, 235 and 237 according to the EC index (see Duncan et al. (1988) Nature 332:563). Two amino acid substitutions at complement binding site C1q at positions 330 and 331, according to the EC index, impair complement fixation (see, Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993) and Canfield and Morrison, J. Exp Med. 173:1483 (1991)). Replacing residues at positions 233-236 of human IgG1 or IgG2 and at positions 327, 330 and 331 of IgG4 significantly attenuates ADCC and CDC (see, for example, Armor KL. et al., 1999 Eur J Immunol. 29(8):2613 -24 and Shields RL et al 2001 J Biol Chem 276(9):6591-604). Other variants of the Fc region are possible, including, without limitation, a variant in which the region capable of forming a disulfide bond is removed, or a variant in which some amino acid residues at the N-terminus of the native Fc form are removed or a methionine residue is added to them . Thus, in one embodiment of the present invention, one or more of the Fc fragments of the scFc molecule may contain one or more mutations in the hinge region to eliminate the possibility of formation of disulfide bonds. In yet another embodiment, the Fc hinge region may be completely removed. In yet another embodiment, the molecule may contain a variant Fc region.
Кроме того, можно сконструировать вариант Fc-области, удалив или значительно ослабив эффекторные функции посредством замены, делеции или добавления аминокислотных остатков для влияния на связывание комплемента или рецептора Fc. В качестве неограничивающего примера, возможна делеция в сайте связывания комплемента, например, C1q-связывающем сайте. Методы получения таких производных последовательностей фрагмента Fc иммуноглобулинов описаны в международных патентных публикациях № WO 97/34631 и WO 96/32478. Кроме того, можно модифицировать домен Fc путем фосфорилирования, сульфатирования, ацилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования, амидирования и тому подобного. In addition, a variant Fc region can be engineered to remove or greatly attenuate effector functions through substitution, deletion, or addition of amino acid residues to affect complement or Fc receptor binding. As a non-limiting example, a deletion at a complement binding site, such as the C1q binding site, is possible. Methods for obtaining such derived immunoglobulin Fc fragment sequences are described in International Patent Publication Nos. WO 97/34631 and WO 96/32478. In addition, the Fc domain can be modified by phosphorylation, sulfation, acylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation, amidation, and the like.
Fc-область может находиться в форме, содержащей нативные углеводные цепи, увеличенное количество углеводных цепей по сравнению с нативной формой или уменьшенное количество углеводных цепей по сравнению с нативной формой, или может находиться в агликозилированной или дегликозилированной форме. Увеличение, уменьшение, удаление или другие модификации углеводных цепей можно осуществить с помощью способов, часто применяемых в данной области техники, например, химического способа, ферментативного способа или посредством экспрессии в генетически сконструированной линии клеток-продуцентов. Такие линии клеток могут включать микроорганизмы, например, Pichia Pastoris и клеточную линию млекопитающих, например, клетки СНО, которые естественным образом экспрессируют гликозилирующие ферменты. Кроме того, можно сконструировать микроорганизмы или клетки для экспрессии гликозилирующих ферментов или сделать их неспособными к экспрессии ферментов гликозилирования (см., например, Hamilton и соавт., Science, 313:1441 (2006 год); Kanda, и соавт, J. Biotechnology, 130:300 (2007 год); Kitagawa и соавт., J. Biol. Chem., 269 (27):17872 (1994 год); Ujita-Lee и соавт., J. Biol. Chem., 264 (23):13848 (1989 год); Imai-Nishiya и соавт., BMC Biotechnology 7:84 (2007 год); и WO 07/055916). В качестве примера сконструированных клеток с модифицированной активностью сиалирования, в клетки яичника китайского хомячка и в клетки sf9 рекомбинантно внедрили ген альфа-2,6-сиалилтрансферазы 1. Антитела, экспрессируемые этими рекомбинантными клетками, подвергаются сиалированию продуктом экзогенного гена. Дополнительный способ получения молекул Fc с модифицированным количеством углеводных остатков по сравнению с множеством нативных молекул включает разделение указанного множества молекул на гликозилированную и негликозилированную фракции, например, с помощью аффинной хроматографии с лектином (см., например, WO 07/117505). Показано, что наличие конкретных гликозилирующих функциональных групп приводит к изменению функции иммуноглобулинов. Например, удаление углеводных цепей с молекулы Fc приводит к резкому снижению аффинности связывания с фрагментом C1q первого компонента комплемента C1 и ослаблению или потере антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) или комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ) и, следовательно, отсутствию индукции ненужных иммунных реакций in vivo. Дополнительные важные модификации включают сиалирование и фукозилирование: присутствие сиаловой кислоты в IgG коррелировало с противовоспалительной активностью (см., например, Kaneko, и соавт., Science 313:760 (2006 год)), в то время как удаление фукозы из IgG приводит к усилению активности АЗКЦ (см., например, Shoj-Hosaka, и соавт., J. Biochem., 140:777 (2006 год)). The Fc region may be in a form containing native carbohydrate chains, an increased number of carbohydrate chains compared to the native form, or a reduced number of carbohydrate chains compared to the native form, or may be in an aglycosylated or deglycosylated form. The increase, decrease, removal or other modifications of carbohydrate chains can be carried out using methods often used in the art, for example, a chemical method, an enzymatic method, or through expression in a genetically engineered producer cell line. Such cell lines may include microorganisms, eg Pichia pastoris and a mammalian cell line, eg CHO cells, which naturally express glycosylation enzymes. In addition, microorganisms or cells can be engineered to express glycosylation enzymes or rendered incapable of expressing glycosylation enzymes (see, for example, Hamilton et al., Science, 313:1441 (2006); Kanda, et al., J. Biotechnology, 130:300 (2007) Kitagawa et al J Biol Chem 269(27):17872 (1994) Ujita-Lee et al J Biol Chem 264(23): 13848 (1989); Imai-Nishiya et al., BMC Biotechnology 7:84 (2007); and WO 07/055916). As an example of engineered cells with modified sialylation activity, the alpha-2,6-
В альтернативных вариантах реализации антитела по данному изобретению могут содержать последовательность Fc с усиленными эффекторными функциями, например, повышенной способностью к связыванию с FcγRIIIA и повышенной активностью АЗКЦ. Например, присоединение фукозы к N-связанному гликану при Asn-297 области Fc стерически затрудняет взаимодействие Fc с FcγRIIIA, а удаление фукозы посредством гликоинженерии может усилить связывание с FcγRIIIA, что приводит к >50-кратному увеличению активности АЗКЦ по сравнению с контрольными IgG1 дикого типа. Белковая инженерия позволяет получить различные варианты с повышенной аффинностью связывания Fc с FcγRIIIA за счет мутаций аминокислот в области Fc IgG1. Примечательно, что тройной мутант с заменой на аланин S298A/E333A/K334A демонстрирует 2-кратное усиление связывания с FcγRIIIA и функцию АЗКЦ. Варианты S239D/I332E (2X) и S239D/I332E/A330L (3X) характеризуются значительным увеличением сродства связывания с FcγRIIIA и усилением АЗКЦ in vitro и in vivo. Другие варианты области Fc, выявленные посредством фагового дисплея, также демонстрировали улучшенное связывание с FcγRIIIA и усиленное уничтожение опухолевых клеток в моделях ксенотрансплантатов у мышей. См., например, Liu и соавт. (2014 год) JBC 289(6):3571-90, специально включенный в данный документ посредством ссылки. In alternative embodiments, the antibodies of this invention may contain an Fc sequence with enhanced effector functions, such as increased FcγRIIIA binding and increased ADCC activity. For example, attachment of fucose to an N-linked glycan at the Asn-297 region of Fc sterically hinders Fc interaction with FcγRIIIA, and removal of fucose by glycoengineering can enhance binding to FcγRIIIA, resulting in a >50-fold increase in ADCC activity compared to control wild-type IgG1. . Protein engineering makes it possible to obtain various variants with increased Fc binding affinity for FcγRIIIA due to amino acid mutations in the IgG1 Fc region. Notably, the alanine triple mutant S298A/E333A/K334A shows a 2-fold increase in FcγRIIIA binding and ADCC function. Variants S239D/I332E (2X) and S239D/I332E/A330L (3X) are characterized by a significant increase in binding affinity for FcγRIIIA and increased ADCC in vitro and in vivo. Other Fc region variants detected by phage display also showed improved FcγRIIIA binding and increased tumor cell killing in mouse xenograft models. See, for example, Liu et al. (2014) JBC 289(6):3571-90, specifically incorporated herein by reference.
Термин "антитело, содержащее область Fc" относится к антителу, содержащему область Fc. С-концевой остаток лизина (остаток 447 в соответствии с ЕС-системой нумерации) в Fc-области можно удалить, например, при очистке антитела или с помощью рекомбинантной инженерии нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело. Соответственно, антитело, содержащее область Fc согласно данному изобретению, может включать антитело с K447 или без него. The term "antibody containing an Fc region" refers to an antibody containing an Fc region. The C-terminal lysine residue (residue 447 according to the EC numbering system) in the Fc region can be removed, for example, by purification of the antibody or by recombinant engineering of the nucleic acid encoding the antibody. Accordingly, an antibody containing an Fc region of the invention may include an antibody with or without K447.
"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий участок. Связывающие CD3 антитела по данному изобретению содержат димер одного домена вариабельной области тяжелой цепи и одного домена вариабельной области легкой цепи, соединенных жесткой нековалентной связью; однако дополнительные антитела, например, для применения в мультиспецифической конфигурации может содержать VH в отсутствие последовательности VL. Даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащего только три гипервариабельные области, специфичные для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя аффинность может быть ниже, чем аффинность сайта связывания двух доменов. "Fv" is the minimum antibody fragment containing a complete antigen recognition and antigen binding site. The CD3 binding antibodies of the invention comprise a dimer of one heavy chain variable region domain and one light chain variable region domain joined by a rigid non-covalent bond; however, additional antibodies, for example, for use in a multispecific configuration, may contain a VH in the absence of a VL sequence. Even a single variable domain (or half of an Fv containing only three antigen-specific hypervariable regions) has the ability to recognize and bind an antigen, although the affinity may be lower than that of the binding site of the two domains.
Фрагмент Fab также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab по дополнительным нескольким остаткам на карбоксильном конце домена CH1 тяжелой цепи, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. В данном описании Fab'-SH представляет собой обозначение Fab', в котором цистеиновый(е) остаток(и) константных доменов несет по меньшей мере одну свободную тиольную группу. Фрагменты F(ab')2 антитела первоначально получали в виде пар фрагментов Fab’, между которыми находятся шарнирные остатки цистеина. Известны также другие варианты химического связывания фрагментов антител. The Fab fragment also contains a light chain constant domain and a heavy chain first constant domain (CH1). Fab' fragments differ from Fab fragments in an additional few residues at the carboxyl terminus of the heavy chain CH1 domain, including one or more cysteines from the antibody hinge region. In this description, Fab'-SH is the designation Fab', in which the cysteine(s) residue(s) of the constant domains bear at least one free thiol group. F(ab') 2 fragments of the antibody were originally generated as pairs of Fab' fragments with hinged cysteine residues between them. Other variants of chemical binding of antibody fragments are also known.
"Гуманизированные" формы антител нечеловеческого происхождения (например, грызунов), включая одноцепочечные антитела, представляют собой химерные антитела (включая одноцепочечные антитела), содержащие минимальные последовательности, происходящие от иммуноглобулина нечеловеческого происхождения. См., например, Jones и соавт., (1986 год) Nature 321:522-525; Chothia и соавт., (1989 год) Nature 342:877; Riechmann и соавт., (1992 год) J. Mol. Biol. 224, 487-499; Foote and Winter, (1992 год) J. Mol. Biol. 224:487-499; Presta и соавт., (1993 год) J. Immunol. 151, 2623-2632; Werther и соавт., (1996 год) J. Immunol. Methods 157:4986-4995; и Presta и соавт., (2001 год) Thromb. Haemost. 85:379-389. Дополнительную информацию см. в патентах США № 5,225,539; 6,548,640; 6,982,321; 5,585,089; 5,693,761; 6,407,213; Jones и соавт., (1986 год) Nature, 321:522-525; и Riechmann и соавт., (1988 год) Nature 332:323-329. "Humanized" forms of non-human (eg, rodent) antibodies, including single chain antibodies, are chimeric antibodies (including single chain antibodies) containing minimal sequences derived from a non-human immunoglobulin. See, for example, Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Chothia et al. (1989) Nature 342:877; Riechmann et al., (1992) J. Mol. Biol. 224, 487-499; Foote and Winter, (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; Presta et al., (1993) J. Immunol. 151, 2623-2632; Werther et al., (1996) J. Immunol. Methods 157:4986-4995; and Presta et al., (2001) Thromb. haemost. 85:379-389. See US Pat. Nos. 5,225,539 for additional information; 6,548,640; 6,982,321; 5,585,089; 5,693,761; 6,407,213; Jones et al. (1986) Nature, 321:522-525; and Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-329.
В данном контексте термин "одноцепочечное антитело" означает одну полипептидную цепь, содержащую один или более антигенсвязывающих доменов, которые связывают эпитоп антигена, при этом такие домены получены из или имеют идентичность последовательности с вариабельной областью тяжелой или легкой цепи антитела. Части такой вариабельной области могут кодироваться генными сегментами VH или VL, генными сегментами D и JH или генными сегментами JL. Вариабельная область может кодироваться перестроенными генными сегментами VHDJH, VLDJH, VHJL или VLJL. Генные сегменты V-, D- и J- могут быть получены от людей и различных животных, включая птиц, рыб, акул, млекопитающих, грызунов, приматов, отличных от человека, верблюдов, лам, кроликов и тому подобных. As used herein, the term "single chain antibody" means a single polypeptide chain containing one or more antigen-binding domains that bind an antigen epitope, such domains being derived from or having sequence identity with an antibody heavy or light chain variable region. Portions of such a variable region may be encoded by V H or V L gene segments, D and J H gene segments, or J L gene segments. The variable region may be encoded by rearranged V H DJ H , V L DJ H , V H J L or V L J L gene segments. The V-, D-, and J- gene segments can be derived from humans and various animals, including birds, fish, sharks, mammals, rodents, non-human primates, camels, llamas, rabbits, and the like.
CD3-связывающие антитела по данному изобретению находят конкретное применение в мультиспецифических конфигурациях, которые включают, без ограничения, биспецифические антитела, трифункциональные антитела и тому подобное. Большое разнообразие способов и конфигураций белков известно и применяется в биспецифических моноклональных антителах (БсмАт), триспецифических антителах и тому подобных. The CD3 binding antibodies of this invention find particular use in multispecific configurations, which include, without limitation, bispecific antibodies, trifunctional antibodies, and the like. A wide variety of methods and configurations of proteins are known and used in bispecific monoclonal antibodies (BSmAbs), trispecific antibodies, and the like.
БсмАт первого поколения состояли из двух тяжелых и двух легких цепей, по одной от двух разных антител. Две области Fab направлены против двух антигенов. Область Fc состоит из двух тяжелых цепей и образует третий сайт связывания с рецептором Fc на иммунных клетках (см., например, Lindhofer и соавт., The Journal of Immunology, Том 155, стр. 219-225, 1995 г.). Антитела могут быть из одного или разных видов. Например, клеточные линии, экспрессирующие антитела крысы и мыши, секретируют функциональное биспецифическое Ат из-за преимущественного, ограниченного видом, спаривания тяжелых и легких цепей. В других вариантах реализации изобретения области Fc сконструированы так, что они подходят друг другу только определенным образом. The first generation BsAbs consisted of two heavy and two light chains, one each from two different antibodies. Two Fab regions are directed against two antigens. The Fc region consists of two heavy chains and forms a third binding site for the Fc receptor on immune cells (see, for example, Lindhofer et al., The Journal of Immunology, Vol. 155, pp. 219-225, 1995). Antibodies can be from the same or different species. For example, cell lines expressing rat and mouse antibodies secrete a functional bispecific Ab due to a preferential species-limited pairing of heavy and light chains. In other embodiments of the invention, the Fc regions are designed such that they only fit together in certain ways.
Другие типы биспецифических антител включают химически связанные Fab, состоящие только из областей Fab. Два химически связанных фрагмента Fab или Fab2 образуют искусственное антитело, которое связывается с двумя различными антигенами, что делает его типом биспецифического антитела. Получаются антигенсвязывающие фрагменты (Fab или Fab2) двух разных моноклональных антител связанные химическими средствами, такими как тиоэфир (см. Glennie, M J и соавт., Journal of immunology 139, стр. 2367-75, 1987 г.; Peter Borchmann и соавт., Blood, т. 100, № 9, стр. 3101-3107, 2002 г.). Other types of bispecific antibodies include chemically linked Fabs consisting of only Fab regions. Two chemically linked Fab or Fab2 fragments form an artificial antibody that binds to two different antigens, making it a type of bispecific antibody. Antigen-binding fragments (Fab or Fab2) of two different monoclonal antibodies linked by chemical means such as a thioether are obtained (see Glennie, M J et al., Journal of immunology 139, pp. 2367-75, 1987; Peter Borchmann et al., Blood, vol. 100, no. 9, pp. 3101-3107, 2002).
Различные другие способы получения поливалентных искусственных антител были разработаны путем рекомбинантного слияния вариабельных доменов двух антител. Одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) представляет собой слитый белок вариабельных областей тяжелых (VH) и легких цепей (VL) иммуноглобулинов, связанных с коротким линкерным пептидом из 10-25 аминокислот. Обычно линкер насыщен глицином для гибкости, а также серином или треонином для растворимости и может соединять N-конец VH с C-концом VL, или наоборот. Биспецифические одноцепочечные вариабельные фрагменты (ди-scFvs, би-scFvs) могут быть сконструированы путем связывания двух scFv с различной специфичностью. Производится одна пептидная цепь с двумя областями VH и двумя областями VL, что приводит к получению двухвалентных scFv. Various other methods for producing polyvalent artificial antibodies have been developed by recombinant fusion of the variable domains of two antibodies. A single chain variable fragment (scFv) is a fusion protein of immunoglobulin heavy (VH) and light chain (VL) variable regions linked to a short linker peptide of 10-25 amino acids. Typically, the linker is saturated with glycine for flexibility and serine or threonine for solubility, and may connect the N-terminus of the VH to the C-terminus of the VL, or vice versa. Bispecific single chain variable fragments (di-scFvs, bi-scFvs) can be constructed by linking two scFvs with different specificities. One peptide chain with two VH and two VL regions is produced, resulting in divalent scFvs.
Биспецифические тандемные scFv также известны как привлекающие T-клетки биспецифические активаторы (BiTE). Биспецифические scFv могут быть созданы с помощью линкерных пептидов, которые являются слишком короткими для того, чтобы две вариабельные области складывались вместе (длиной около пяти аминокислот), заставляя scFvs димеризоваться. Этот тип известен как диатела (Adams и соавт., British journal of cancer 77, стр. 1405-12, 1998 год). Технология платформы двуафинного перенацеливания (DART - Dual-Affinity Re-Targeting) (Macrogenics, Роквилл, штат Мэриленд). Эта технология слияния белков применяет два одноцепочечных вариабельных фрагмента (scFv) различных антител на одной пептидной цепи длиной около 55 килодальтон. SCORPION Therapeutics (Emergent Biosolutions, Inc., Сиэтл, штат Вашингтон) объединяет два антигенсвязывающих домена в одноцепочечный белок. Один связывающий домен находится на С-конце, а второй связывающий домен находится на N-конце эффекторного домена на основе областей Fc иммуноглобулина. Bispecific tandem scFvs are also known as T-cell-attracting bispecific activators (BiTEs). Bispecific scFvs can be created with linker peptides that are too short for two variable regions to be folded together (about five amino acids long), causing the scFvs to dimerize. This type is known as a diabody (Adams et al., British journal of cancer 77, pp. 1405-12, 1998). Dual-Affinity Re-Targeting (DART) Platform Technology (Macrogenics, Rockville, MD). This protein fusion technology uses two single chain variable fragments (scFv) of different antibodies on a single peptide chain of about 55 kilodaltons. SCORPION Therapeutics (Emergent Biosolutions, Inc., Seattle, WA) combines two antigen-binding domains into a single-stranded protein. One binding domain is at the C-terminus and the second binding domain is at the N-terminus of an effector domain based on immunoglobulin Fc regions.
Тетравалентные и биспецифические подобные антителам белки также включают DVD-Ig, которые сконструированы из двух моноклональных антител (Wu, C. и соавт., Nature Biotechnology, 25, стр. 1290-1297, 2007 год). Для конструирования молекулы DVD-Ig домены V двух мАт сливаются в тандеме с помощью короткого линкера (TVAAP) с вариабельным доменом легкой цепи (VL) первого антитела на N-конце, за которым следуют VL и Ck других антител для образования легкой цепи белка DVD-Ig. Аналогичным образом, вариабельные области тяжелой (VH) цепи двух мАт сливаются в тандеме с помощью короткого линкера (ASTKGP) с первым антителом на N-конце, за которым следует другое антитело и константные домены тяжелой цепи с образованием тяжелой цепи (VH1/VL1) белка DVD-Ig. Все константные домены легкой цепи и тяжелой цепи сохраняются в конструкции DVD-Ig, поскольку они являются критическими для образования дисульфид-связанной полной IgG-подобной молекулы. Котрансфекция клеток млекопитающих экспрессионными векторами, кодирующими легкую цепь и тяжелую цепь DVD-Ig, приводит к секреции IgG-подобной молекулы одного вида с молекулярной массой приблизительно 200 кДа. Эта молекула теперь имеет четыре сайта связывания, по 2 от каждого мАт. Tetravalent and bispecific antibody-like proteins also include DVD-Ig, which are constructed from two monoclonal antibodies (Wu, C. et al., Nature Biotechnology, 25, pp. 1290-1297, 2007). To construct the DVD-Ig molecule, the V domains of the two mAbs are fused in tandem using a short linker (TVAAP) with the light chain variable domain (VL) of the first antibody at the N-terminus followed by the VL and Ck of the other antibodies to form the light chain of the DVD- Ig. Similarly, the heavy chain variable regions (VH) of two mAbs are fused in tandem using a short linker (ASTKGP) with the first antibody at the N-terminus followed by the other antibody and the heavy chain constant domains to form the heavy chain (VH1/VL1) of the protein. DVD-Ig. All light chain and heavy chain constant domains are retained in the DVD-Ig construct as they are critical for the formation of a disulfide-linked complete IgG-like molecule. Co-transfection of mammalian cells with expression vectors encoding the DVD-Ig light chain and heavy chain results in the secretion of a single species IgG-like molecule with a molecular weight of approximately 200 kDa. This molecule now has four binding sites, 2 from each mAb.
Термин "биспецифическая трехцепочечная антитело-подобная молекула" или "ТСА" применяется в данном документе для обозначения антитело-подобных молекул, включающих, состоящих по существу или состоящих из трех полипептидных субъединиц, две из которых включают в себя, состоят по существу из или состоят из одной тяжелой и одной легкой цепи моноклонального антитела или функциональных антигенсвязывающих фрагментов таких цепей антитела, содержащих антигенсвязывающую область и по меньшей мере один домен СН. Эта пара тяжелая цепь/легкая цепь обладает специфичностью связывания для первого антигена. Третья полипептидная субъединица содержит, состоит по существу или состоит из антитела с только тяжелой цепью, содержащего участок Fc, содержащий домены СН2 и/или СН3, и/или СН4, в отсутствие домена СН1, и антигенсвязывающий домен, который связывает эпитоп второго антигена или другой эпитоп первого антигена, при этом такой связывающий домен происходит из или имеет идентичность последовательности с вариабельной областью тяжелой или легкой цепи антитела. Части такой вариабельной области могут кодироваться генными сегментами VH или VL, генными сегментами D и JH или генными сегментами JL. Вариабельная область может кодироваться перестроенными генными сегментами VHDJH, VLDJH, VHJL или VLJL. The term "bispecific three-chain antibody-like molecule" or "TCA" is used herein to refer to antibody-like molecules comprising, consisting essentially of, or consisting of three polypeptide subunits, two of which include, consist essentially of, or consist of one heavy and one light chain of a monoclonal antibody, or functional antigen-binding fragments of such antibody chains, comprising an antigen-binding region and at least one CH domain. This heavy chain/light chain pair has binding specificity for the first antigen. The third polypeptide subunit contains, consists essentially of, or consists of a heavy chain-only antibody comprising an Fc region containing CH2 and/or CH3 and/or CH4 domains, in the absence of a CH1 domain, and an antigen-binding domain that binds an epitope of a second antigen or other an epitope of the first antigen, wherein such binding domain is derived from or has sequence identity with the heavy or light chain variable region of the antibody. Portions of such a variable region may be encoded by V H or V L gene segments, D and J H gene segments, or J L gene segments. The variable region may be encoded by rearranged V H DJ H , V L DJ H , V H J L or V L J L gene segments.
Белок TCA использующий "антитело только с тяжелой цепью" или "антитело с тяжелой цепью" или "полипептид тяжелой цепи", в данном контексте означает одноцепочечное антитело, содержащее константные области тяжелой цепи СН2 и/или СН3, и/или СН4, но не имеющее домена СН1. В одном варианте реализации изобретения антитело с тяжелой цепью состоит из антигенсвязывающего домена, по меньшей мере, части шарнирной области и доменов CH2 и CH3. В другом варианте реализации изобретения антитело с тяжелой цепью состоит из антигенсвязывающего домена, по меньшей мере, части шарнирной области и домена CH2. В дополнительном варианте реализации изобретения антитело с тяжелой цепью состоит из антигенсвязывающего домена, по меньшей мере, части шарнирной области и домена CH3. Антитела с тяжелой цепью, в которых домен СН2 и/или СН3 укорочен, также включены в данный документ. В дополнительном варианте реализации изобретения тяжелая цепь состоит из антигенсвязывающего домена и, по меньшей мере, одного домена СН (СН1, СН2, СН3 или СН4), но без шарнирной области. Антитело только с тяжелой цепью может быть в форме димера, в котором две тяжелые цепи дисульфидно связаны друг с другом или ковалентно или нековалентно связаны друг с другом. Антитело с тяжелой цепью может принадлежать к подклассу IgG, но антитела, принадлежащие к другим подклассам, таким как подкласс IgM, IgA, IgD и IgE, также включены в данный документ. В конкретном варианте реализации изобретения антитело с тяжелой цепью относится к подтипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, в частности подтипу IgG1. A TCA protein using a "heavy chain-only antibody" or "heavy chain antibody" or "heavy chain polypeptide", as used herein, means a single chain antibody containing CH2 and/or CH3 and/or CH4 heavy chain constant regions, but no the CH1 domain. In one embodiment, the heavy chain antibody consists of an antigen-binding domain, at least a portion of the hinge region, and CH2 and CH3 domains. In another embodiment, the heavy chain antibody consists of an antigen-binding domain, at least a portion of the hinge region, and a CH2 domain. In a further embodiment, the heavy chain antibody consists of an antigen-binding domain, at least a portion of the hinge region, and a CH3 domain. Heavy chain antibodies in which the CH2 and/or CH3 domain is truncated are also included in this document. In a further embodiment, the heavy chain consists of an antigen-binding domain and at least one CH domain (CH1, CH2, CH3, or CH4), but without the hinge region. The heavy chain-only antibody may be in the form of a dimer in which two heavy chains are disulfide-linked to each other or covalently or non-covalently linked to each other. The heavy chain antibody may belong to the IgG subclass, but antibodies belonging to other subclasses such as the IgM, IgA, IgD and IgE subclass are also included in this document. In a particular embodiment, the heavy chain antibody is of the IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 subtype, in particular the IgG1 subtype.
Антитела с тяжелой цепью составляют около одной четвертой части антител IgG, продуцируемых верблюдовыми, например, верблюдами и ламами (Hamers-Casterman C., и соавт. Nature. 363, 446-448 (1993 год)). Эти антитела образованы двумя тяжелыми цепями, но лишены легких цепей. Как следствие, вариабельная антигенсвязывающая часть называется доменом VHH и представляет собой наименьший встречающийся в природе интактный антигенсвязывающий сайт длиной всего около 120 аминокислот (Desmyter A., и соавт. J. Biol. Chem. 276, 26285-26290 (2001 год)). Антитела с тяжелой цепью с высокой специфичностью и аффинностью могут производиться против различных антигенов посредством иммунизации (van der Linden, R. H., и соавт. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999 год)), а часть VHH может быть легко клонирована и экспрессирована в дрожжах (Frenken, L. G. J., и соавт. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000 год)). Их уровни экспрессии, растворимости и стабильности значительно выше, чем у классических фрагментов F(ab) или Fv (Ghahroudi, M. A. и соавт. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997 год)). Также было показано, что акулы имеют один VH-подобный домен в своих антителах, называемый VNAR. (Nuttall и соавт. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003 год); Nuttall и соавт., Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004 год); Dooley и соавт., Molecular Immunology 40, 25-33 (2003 год)). Heavy chain antibodies make up about one-fourth of the IgG antibodies produced by camelids, such as camelids and llamas (Hamers-Casterman C., et al. Nature. 363, 446-448 (1993)). These antibodies are formed by two heavy chains but lack light chains. As a consequence, the variable antigen-binding portion is referred to as the VHH domain and is the smallest naturally occurring intact antigen-binding site only about 120 amino acids long (Desmyter A., et al. J. Biol. Chem. 276, 26285-26290 (2001)). Heavy chain antibodies with high specificity and affinity can be produced against various antigens by immunization (van der Linden, R. H., et al. Biochim. Biophys. Acta. 1431, 37-46 (1999)), and the VHH part can be easily cloned and expressed in yeast (Frenken, L. G. J., et al. J. Biotechnol. 78, 11-21 (2000)). Their levels of expression, solubility and stability are significantly higher than those of classical F(ab) or Fv fragments (Ghahroudi, M. A. et al. FEBS Lett. 414, 521-526 (1997)). Sharks have also been shown to have a single VH-like domain in their antibodies, called VNAR. (Nuttall et al. Eur. J. Biochem. 270, 3543-3554 (2003); Nuttall et al., Function and Bioinformatics 55, 187-197 (2004); Dooley et al.,
Антитело или антигенсвязывающая молекула, включая антитела, содержащие только тяжелую цепь, и биспецифические трехцепочечные антителоподобные молекулы (ТСА) в данном документе, "которые связывают" представляющий интерес антиген, представляют собой молекулу, которая связывает антиген с достаточной аффинностью, так что антитело или связывающая молекула полезна в качестве диагностического и/или терапевтического агента при нацеливании на антиген и не имеет значительного перекрестного взаимодействия с другими белками. В таких вариантах реализации изобретения степень связывания антитела или другой связывающей молекулы с нецелевым антигеном будет составлять не более 10%, как определено анализом сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS - fluorescence activated cell sorting) или радиоиммунопреципитацией (РИА).An antibody or antigen-binding molecule, including heavy chain-only antibodies and bispecific three-chain antibody-like molecules (TCAs) herein, "which binds" an antigen of interest, is a molecule that binds the antigen with sufficient affinity such that the antibody or binding molecule useful as a diagnostic and/or therapeutic agent when targeting an antigen, and has no significant cross interaction with other proteins. In such embodiments, the degree of binding of the antibody or other binding molecule to the non-target antigen will be no more than 10%, as determined by a fluorescence activated cell sorting (FACS) or radioimmunoprecipitation (RIA) assay.
БелкиSquirrels
Данное изобретение обеспечивает семейство родственных антител, которые связываются и активируют передачу сигналов посредством CD3, например, активацией CD3+ T-клеток. Антитела в семействе содержат набор последовательностей CDR, как определено в данном документе, и примерами которых являются предоставленные последовательности VH из SEQ ID NO: 1-18. Семейство антител обеспечивает ряд преимуществ, которые способствуют полезности в качестве клинического лекарственного средства(в). Антитела в семействе включают членов с рядом аффинностей связывания, позволяющих выбирать конкретную последовательность с желаемой аффинностью. Способность точно настраивать аффинность имеет особое значение для управления уровнем активации CD3 у индивида, которого лечат, и, таким образом, для снижения токсичности. Например, если целью являются опухолевые антигены, присутствующие в небольшом количестве (менее 10000 молекул на клетку), ожидается, что предпочтительными являются высокоаффинные связыватели CD3 (<30 нМ). Если целью являются опухолевые антигены, присутствующие в большом количестве (более 50000 молекул на клетку), предпочтительными являются низкоаффинные связыватели CD3 (> 50 нМ). Отдельно от афинности может определяться способность антитела индуцировать высвобождение цитокинов при связывании Т клеток, например, высвобождение ИЛ-2, ИФН-γ и др., в условиях, в которых высвобождение цитокинов может быть желательным.The present invention provides a family of related antibodies that bind to and activate signaling through CD3, for example by activating CD3 + T cells. The antibodies in the family comprise a set of CDR sequences as defined herein, and examples of which are the provided VH sequences of SEQ ID NOs: 1-18. The antibody family provides a number of advantages that contribute to utility as a clinical drug(s). The antibodies in the family include members with a range of binding affinities allowing the selection of a particular sequence with the desired affinity. The ability to fine-tune affinity is of particular importance in order to control the level of CD3 activation in the individual being treated and thus to reduce toxicity. For example, if low levels of tumor antigens (less than 10,000 molecules per cell) are targeted, high affinity CD3 binders (<30 nM) are expected to be preferred. If high levels of tumor antigens (greater than 50,000 molecules per cell) are the target, low affinity CD3 binders (>50 nM) are preferred. Separately from affinity, the ability of an antibody to induce cytokine release upon T cell binding, eg, release of IL-2, IFN-γ, etc., under conditions where cytokine release may be desirable, can be determined.
Подходящее антитело может быть выбрано из тех, которые предоставлены в данном документе для разработки и применения, включая без ограничения применение в качестве биспецифического антитела. Определение аффинности к белку-кандидату может быть выполнено с применением способов, известных в данной области техники, например, измерения Biacore и тому подобного. Члены семейства антител могут иметь аффинность к CD3 с Kd от около 10-6 до около 10-11, включая без ограничений: от около 10-6 до около 10-10; от около 10-6 до около 10-9; от около 10-6 до около 10-8; от около 10-8 до около 10-11; от около 10-8 до около 10-10; от около 10-8 до около 10-9; от около 10-9 до около 10-11; от около 10-9 до около 10-10; или любое значение в этих диапазонах. Выбор аффинности может быть подтвержден биологической оценкой активации Т-клеток, например, in vitro или в доклинической модели, и оценкой потенциальной токсичности. Измерение высвобождения цитокинов может осуществляться с помощью любого удобного анализа, включая, но не ограничиваясь ими, анализы, описанные в примерах.A suitable antibody may be selected from those provided herein for development and use, including, without limitation, use as a bispecific antibody. Determination of affinity for a candidate protein can be performed using methods known in the art, for example, Biacore measurements and the like. Members of the antibody family may have an affinity for CD3 with Kd from about 10 -6 to about 10 -11 , including without limitation: from about 10 -6 to about 10 -10 ; from about 10 -6 to about 10 -9 ; from about 10 -6 to about 10 -8 ; from about 10 -8 to about 10 -11 ; about 10 -8 to about 10 -10 ; from about 10 -8 to about 10 -9 ; from about 10 -9 to about 10 -11 ; from about 10 -9 to about 10 -10 ; or any value in those ranges. The choice of affinity can be confirmed by biological assessment of T cell activation, for example, in vitro or in a preclinical model, and an assessment of potential toxicity. The measurement of cytokine release can be carried out using any convenient assay, including, but not limited to, the assays described in the examples.
Стимуляция рецептора T-клетки (ТКР) путем связывания комплексов MH-пептид или антител к ТКР/CD3 инициирует активацию T-клеток. Примерами антител к ТКР/CD3, которые активируют Т-клетки, являются OKT3 и UCHT1. Эти антитела к CD3 перекрестно конкурируют за связывание с CD3 на Т-клетках и обычно применяются в анализах активации Т-клеток. Антитела к CD3 по данному изобретению перекрестно конкурируют с OKT3 за связывание с CD3 человека. В зависимости от аффинности связывания CD3 и эпитопа на CD3 антитела к CD3 активировали Т-клетки с различными функциональными результатами. Инкубация in vitro Т-клеток человека с низкоаффинными антителами к CD3 приводила к неполной активации Т-клеток, низкой продукции ИЛ-2 и ИЛ-10. Напротив, высокоаффинные связыватели CD3 активировали Т-клетки, чтобы продуцировать значительно больше ИЛ-2 и других цитокинов. Низкоаффинные антитела к CD3 считаются частичными агонистами, которые избирательно индуцируют некоторые эффекторные функции, сильное уничтожение опухоли и активацию CD69, но не вызывают других, таких как продукция ИЛ-2 и ИЛ-10. Высокоаффинные связыватели по данному изобретению являются полными агонистами, активирующими многие иммунные эффекторные функции Т-клеток. Сила взаимодействия с CD3 и узнаваемым эпитопом привела к качественно различной активации Т-клеток. Максимальная продукция цитокинов Т-клетками, активированными низкоаффинными антителами к CD3, была ниже, чем максимальная активация высокоаффинными антителами к CD3. В некоторых вариантах реализации антитело по данному изобретению приводит к более низкому высвобождению одного или обоих ИЛ-2 и ИЛ-10 при объединении с Т-клетками в анализе активации по сравнению с эталонным антителом к CD3 в том же анализе, при этом эталонное антитело может представлять собой ID 304703 (SEQ ID NO: 22) или антитело с эквивалентной аффинностью. Максимальное высвобождение ИЛ-2 и/или ИЛ-10 может составлять менее чем около 75% высвобождения с помощью эталонного антитела, менее чем около 50% высвобождения с помощью эталонного антитела, менее чем около 25% высвобождения с помощью эталонного антитела, и может составлять менее чем около 10% высвобождения с помощью эталонного антитела. Stimulation of the T cell receptor (TCR) by binding of MH-peptide complexes or anti-TCR/CD3 antibodies initiates T cell activation. Examples of anti-TCR/CD3 antibodies that activate T cells are OKT3 and UCHT1. These anti-CD3 antibodies cross-compete for binding to CD3 on T cells and are commonly used in T cell activation assays. The anti-CD3 antibodies of this invention cross-compete with OKT3 for binding to human CD3. Depending on the binding affinity of CD3 and the epitope on CD3, anti-CD3 antibodies activated T cells with different functional outcomes. In vitro incubation of human T cells with low affinity anti-CD3 antibodies resulted in incomplete T cell activation, low production of IL-2 and IL-10. In contrast, high affinity CD3 binders activated T cells to produce significantly more IL-2 and other cytokines. Low affinity anti-CD3 antibodies are considered partial agonists that selectively induce some effector functions, strong tumor killing, and CD69 activation, but do not induce others, such as IL-2 and IL-10 production. The high affinity binders of this invention are full agonists that activate many of the immune effector functions of T cells. The strength of the interaction with CD3 and the recognizable epitope resulted in qualitatively different T cell activation. The maximum production of cytokines by T cells activated with low-affinity anti-CD3 antibodies was lower than the maximum activation by high-affinity anti-CD3 antibodies. In some embodiments, an antibody of the invention results in lower release of one or both of IL-2 and IL-10 when combined with T cells in an activation assay compared to an anti-CD3 reference antibody in the same assay, wherein the reference antibody may represent is ID 304703 (SEQ ID NO: 22) or an antibody of equivalent affinity. The maximum release of IL-2 and/or IL-10 may be less than about 75% release with the reference antibody, less than about 50% release with the reference antibody, less than about 25% release with the reference antibody, and may be less than than about 10% release with a reference antibody.
В некоторых вариантах реализации изобретения предлагаются биспецифические или мультиспецифические антитела, которые могут иметь любую из обсуждаемых в данном документе конфигураций, включая, без ограничения, биспецифическую трехцепочечную конфигурацию. Биспецифические антитела содержат по меньшей мере вариабельную область тяжелой цепи антитела, специфичного к белку, отличному от CD3, и могут содержать вариабельную область тяжелой и легкой цепи. В некоторых таких вариантах реализации изобретения вторая специфичность антитела связывается с антигеном, ассоциированным с опухолью, нацеливающим антигеном, например, интегринами и тому подобное, патогенным антигеном, белком контрольной точки и тому подобным. Различные форматы биспецифических антител находятся в пределах объема изобретения, включая без ограничения одноцепочечные полипептиды, двухцепочечные полипептиды, трехцепочечные полипептиды, четырехцепочечные полипептиды и кратные им. In some embodiments, the invention provides bispecific or multispecific antibodies that may have any of the configurations discussed herein, including, without limitation, the bispecific three-chain configuration. Bispecific antibodies comprise at least the heavy chain variable region of an antibody specific for a protein other than CD3, and may comprise a heavy and light chain variable region. In some such embodiments, the second specificity of the antibody is associated with a tumor associated antigen, a targeting antigen, eg, integrins and the like, a pathogenic antigen, a checkpoint protein, and the like. Various formats of bispecific antibodies are within the scope of the invention, including, without limitation, single chain polypeptides, double chain polypeptides, three chain polypeptides, four chain polypeptides and multiples thereof.
Семейство CD3-специфических антител содержит домен VH, содержащий последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 в каркасе VH человека. Последовательности CDR могут быть расположены, например, в области аминокислотных остатков 26-33; 51-58; и 97-112 для CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, предоставленных типовых последовательностей вариабельной области, изложенных в SEQ ID NO: 1-18. Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что последовательности CDR могут находиться в другом положении, в случае если выбрана другая каркасная последовательность, хотя обычно порядок последовательностей будет оставаться тем же. The CD3-specific antibody family contains a VH domain containing the sequences CDR1, CDR2, and CDR3 in a human VH framework. CDR sequences can be located, for example, in the region of amino acid residues 26-33; 51-58; and 97-112 for CDR1, CDR2 and CDR3, respectively, provided exemplary variable region sequences set forth in SEQ ID NOs: 1-18. One skilled in the art will appreciate that the CDR sequences may be in a different position if a different framework sequence is selected, although the order of the sequences will generally remain the same.
Последовательности CDR для антитела семейства 2 могут иметь следующие формулы последовательности. Х обозначает вариабельную аминокислоту, которая может представлять собой специфические аминокислоты, как указано ниже. CDR sequences for a
CDR1CDR1
при этом:wherein:
X5 может быть любой аминокислотой; в некоторых вариантах реализации изобретения X5 представляет собой D, A или H; в некоторых вариантах реализации изобретения X5 представляет собой D.X 5 can be any amino acid; in some embodiments, X 5 is D, A, or H; in some embodiments, X 5 is D.
X6 может быть любой аминокислотой; в некоторых вариантах реализации изобретения X6 представляет собой D или N; в некоторых вариантах реализации изобретения D6 представляет собой D.X 6 can be any amino acid; in some embodiments of the invention, X 6 is D or N; in some embodiments, D 6 is D.
В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность CDR1 анти-CD3 антитела семейства 2 содержит последовательность определенную в любой из SEQ ID NO: 1-18, остатках 26-33.In some embodiments, the CDR1 sequence of an
CDR2CDR2
I1’ S2’ W3’ N4’ S5’ G6’ S7’ I8’ I 1' S 2' W 3' N 4' S 5' G 6' S 7' I 8'
В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность CDR2 антитела к CD3 семейства 2 содержит последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO: 1-18, остатки 51-58. In some embodiments, the CDR2 sequence of an
CDR3CDR3
A1” K2” D3” S4” R5” G6” Y7” G8” X9” Y10” X11” X12” G13” G12” A15” Y16” A 1” K 2” D 3” S 4” R 5” G 6” Y 7” G 8” X 9” Y 10” X 11” X 12” G 13” G 12” A 15” Y 16”
при этом:wherein:
X9” может быть любой аминокислотой; в некоторых вариантах реализации изобретения X9” представляет собой D или S; в некоторых вариантах реализации изобретения X9” представляет собой D;X 9" can be any amino acid; in some embodiments, X 9” is D or S; in some embodiments, X 9” is D;
X11” может быть любой аминокислотой; в некоторых вариантах реализации изобретения X11” представляет собой R или S.X 11" can be any amino acid; in some embodiments, X 11” is R or S.
X12” может быть любой аминокислотой; в некоторых вариантах реализации изобретения X12” представляет собой L или R.X 12" can be any amino acid; in some embodiments, X 12” is L or R.
В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность CD3 анти-CD3 антитела семейства 2 имеет формулу A K D S R G Y G D Y X11” X12” G G A Y, в которой X11” и X12” представляют собой определенное выше. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность CDR3 антитела к CD3 семейства 2 содержит последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO: 1-18, остатки 97-112. In some embodiments, the CD3 sequence of an
В некоторых вариантах реализации изобретения CD3-связывающий домен VH связан с доменом вариабельной области легкой цепи. В некоторых таких вариантах реализации изобретения легкая цепь представляет собой фиксированную легкую цепь. В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь содержит домен VL с последовательностями CDR1, CDR2 и CDR3 в каркасе VL человека. Последовательности CDR могут быть последовательностями из SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность CDR1 содержит аминокислотные остатки 27-32; 50-52; 89-97 для CDR1, CDR2, CDR3 соответственно. In some embodiments, a VH CD3 binding domain is linked to a light chain variable region domain. In some such embodiments, the light chain is a fixed light chain. In some embodiments, the light chain comprises a VL domain with sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 in a human VL framework. CDR sequences may be sequences from SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the CDR1 sequence contains amino acid residues 27-32; 50-52; 89-97 for CDR1, CDR2, CDR3 respectively.
В некоторых вариантах реализации изобретения последовательности CDR антитела семейства 2 имеют последовательность с по меньшей мере 85% идентичностью, по меньшей мере 90% идентичностью, по меньшей мере 95% идентичностью, по меньшей мере 99% идентичностью относительно последовательности CDR или набора последовательностей CDR в любой из SEQ ID NO: 1-18. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность CDR по данному изобретению содержит одну, две, три или более аминокислотных замен по отношению к последовательности CDR или набора последовательностей CDR в любой из SEQ ID NO: 1-18. В некоторых вариантах реализации изобретения указанная аминокислотная замена(ы) представляет собой одну или более в положении 5 или 10 из CDR1, положении 2, 6 или 7 из CDR2, положении 1, 8, 9 или 10 из CDR3 относительно формул, представленных выше. In some embodiments, the CDR sequences of a
Когда белок по данному изобретению представляет собой биспецифическое антитело, один связывающий фрагмент, то есть комбинация VH/VL или только VH, является специфичным для CD3 человека, тогда как другое плече может быть специфичным для клеток-мишеней, включая раковые клетки, такие как клетки яичника, молочной железы, желудочно-кишечного тракта, головного мозга, головы и шеи, предстательной железы, толстой кишки и рак легкого и тому подобное, а также гематологические опухоли, такие как В-клеточные опухоли, включая лейкемии, лимфомы, саркомы, карциномы, опухоли нервных клеток, плоскоклеточные карциномы, эмбрионально-клеточные опухоли, метастазы, недифференцированные опухоли, семиномы, меланомы, миеломы, нейробластомы, опухоли смешанных клеток, новообразования, вызванные инфекционными агентами, и другие злокачественные новообразования, клетки, инфицированные патогеном, аутореактивные клетки, вызывающие воспаление и/или аутоиммунную реакцию. Часть, не содержащая CD3, также может быть специфичной для иммунорегуляторного белка, как будет описано в данном документе. When the protein of the invention is a bispecific antibody, one binding fragment, i.e. a combination of VH/VL or VH alone, is specific for human CD3 while the other arm can be specific for target cells, including cancer cells such as ovarian cells. , breast, gastrointestinal tract, brain, head and neck, prostate, colon and lung cancer and the like, as well as hematological tumors such as B-cell tumors, including leukemias, lymphomas, sarcomas, carcinomas, tumors cell tumors, squamous cell carcinomas, embryonic cell tumors, metastases, undifferentiated tumors, seminomas, melanomas, myelomas, neuroblastomas, mixed cell tumors, neoplasms caused by infectious agents and other malignancies, pathogen-infected cells, autoreactive cells that cause inflammation and /or an autoimmune reaction. The non-CD3 portion may also be specific for an immunoregulatory protein, as will be described herein.
Опухолеассоциированные антигены (TAA) относительно ограничены опухолевыми клетками, тогда как опухолеспецифические антигены (TSA) являются уникальными для опухолевых клеток. TSA и TAA обычно представляют собой части внутриклеточных молекул, экспрессируемых на поверхности клетки как часть основного комплекса гистосовместимости. Tumor-associated antigens (TAA) are relatively limited to tumor cells, while tumor-specific antigens (TSA) are unique to tumor cells. TSA and TAA are usually parts of intracellular molecules expressed on the cell surface as part of the major histocompatibility complex.
Тканеспецифические дифференцировочные антигены представляют собой молекулы, присутствующие на опухолевых клетках и их нормальных клеточных аналогах. Опухолеассоциированные антигены, о которых известно, что они распознаются терапевтическими мАт, подразделяются на несколько различных категорий. Гематопоэтические дифференцировочные антигены представляют собой гликопротеины, которые обычно связаны с группами кластера дифференцировки (CD) и включают в себя CD20, CD30, CD33 и CD52. Дифференцировочные антигены клеточной поверхности представляют собой разнообразную группу гликопротеинов и углеводов, которые находятся на поверхности как нормальных, так и опухолевых клеток. Антигены, которые участвуют в передаче сигналов роста и дифференцировки, часто являются факторами роста и рецепторами факторов роста. Факторы роста, которые являются целями для антител у онкопациентов, включают CEA, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR (epidermal growth factor receptor); также известный как ERBB1), ERBB2 (также известный как HER2), ERBB3, MET (также известный как HGFR), рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R - insulin-like growth factor 1 receptor), рецептор эфрина A3 (EPHA3), рецептор ФНО-зависимого апоптоз-индуцирующего лиганда 1 (TRAILR1 (tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand receptor 1); также известный как TNFRSF10A), TRAILR2 (также известный как TNFRSF10B) и лиганд рецептора-активатора ядерного фактора κВ (RANKL; также известный как TNFSF11). Антигенами, участвующими в ангиогенезе, обычно являются белки или факторы роста, которые поддерживают образование нового микроциркуляторного русла, включая фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF - vascular endothelial growth factor), рецептор VEGF (VEGFR), интегрин αVβ3 и интегрин α5β1. Строма опухоли и внеклеточный матрикс являются необходимыми опорными структурами для опухоли. Антигены стромального и внеклеточного матрикса, которые являются терапевтическими мишенями, включают белок активации фибробластов (FAP - fibroblast activation protein) и тенасцин. Tissue-specific differentiation antigens are molecules present on tumor cells and their normal cellular counterparts. Tumor-associated antigens known to be recognized by therapeutic mAbs fall into several different categories. Hematopoietic differentiation antigens are glycoproteins that are commonly associated with cluster of differentiation (CD) groups and include CD20, CD30, CD33 and CD52. Cell surface differentiation antigens are a diverse group of glycoproteins and carbohydrates that are found on the surface of both normal and tumor cells. Antigens that are involved in growth and differentiation signaling are often growth factors and growth factor receptors. Growth factors that are targets for antibodies in cancer patients include CEA, epidermal growth factor receptor (EGFR; also known as ERBB1), ERBB2 (also known as HER2), ERBB3, MET (also known as HGFR) , insulin-
Примеры лекарственных средств на основе моноклональных антител, полезных в биспецифических конфигурациях, включают, без ограничения, ритуксимаб; Ибритумомаб; Тиуксетан; Тозитумомаб; Брентуксимаб; ведотин; Гемтузумаб; озогамицин; Алемтузумаб; IGN101; адекатумумаб; Лабетузумаб; huA33; Пемтумомаб; ореговомаб; CC49 (минретумомаб); cG250; J591; MOv18; MORAb-003 (фарлетузумаб); 3F8, ch14. 18; KW-2871; hu3S193; IgN311; Бевацизумаб; IM-2C6; CDP791; Етарацизумаб; Волоциксимаб; Цетуксимаб, панитумумаб, нимотузумаб; 806; Трастузумаб; пертузумаб; MM-121; AMG 102, METMAB; SCH 900105; AVE1642, IMC-A12, MK-0646, R1507; CP 751871; KB004; IIIA4; Мапатумумаб (HGS-ETR1); HGS-ETR2; CS-1008; Деносумаб; Сибротузумаб; F19; и 81C6. Examples of monoclonal antibody drugs useful in bispecific configurations include, without limitation, rituximab; Ibritumomab; Tiuxetan; Tositumomab; brentuximab; vedotin; Gemtuzumab; ozogamicin; Alemtuzumab; IGN101; adecatumumab; Labetuzumab; huA33; Pemtumomab; oregovomab; CC49 (minretumomab); cG250; J591; MOv18; MORAb-003 (farletuzumab); 3F8, ch14. 18; KW-2871; hu3S193; IgN311; Bevacizumab; IM-2C6; CDP791; Etaracizumab; Volociximab; cetuximab, panitumumab, nimotuzumab; 806; Trastuzumab; pertuzumab; MM-121;
Рецепторы иммунной контрольной точки, которые наиболее активно изучались в контексте клинической иммунотерапии рака, антиген 4 ассоцииированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA4 - cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4; также известный как CD152) и белок 1 запрограммированной смерти клетки (PD1 - programmed cell death protein 1; также известный как CD279) - оба представляют собой ингибирующие рецепторы. Клиническая активность антител, которые блокируют любой из этих рецепторов, подразумевает, что противоопухолевый иммунитет может быть усилен на нескольких уровнях и что комбинаторные стратегии могут быть разумно разработаны, руководствуясь механистическими соображениями и доклиническими моделями. The immune checkpoint receptors that have been most extensively studied in the context of clinical cancer immunotherapy are cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA4; also known as CD152) and programmed cell death protein 1 (PD1).
Двумя лигандами для PD1 являются лиганд 1 PD1 (PDL1; также известный как B7-H1 и CD274) и PDL2 (также известный как B7-DC и CD273). PDL1 экспрессируется на раковых клетках и посредством связывания с его рецептором PD1 на Т-клетках ингибирует активацию/функцию Т-клеток. The two ligands for PD1 are PD1 ligand 1 (PDL1; also known as B7-H1 and CD274) and PDL2 (also known as B7-DC and CD273). PDL1 is expressed on cancer cells and, by binding to its PD1 receptor on T cells, inhibits T cell activation/function.
Ген 3 активации лимфоцитов (LAG3; также известный как CD223), 2B4 (также известный как CD244), аттенюатор (attenuator) В и Т-лимфоцитов (BTLA; также известный как CD272), белок 3 мембраны Т-клеток (TIM3; также известный как HAVcr2), рецептор аденозина A2a (A2aR) и семейство рецепторов подавления цитотоксичности, были связаны с ингибированием активности лимфоцитов и в некоторых случаях с индукцией анергии лимфоцитов. Нацеливание антител этих рецепторов можно применять в способах по данному изобретению. Lymphocyte activation gene 3 (LAG3; also known as CD223), 2B4 (also known as CD244), B and T lymphocyte attenuator (BTLA; also known as CD272), T cell membrane protein 3 (TIM3; also known as like HAVcr2), the adenosine A2a receptor (A2aR) and the cytotoxicity suppression receptor family have been associated with inhibition of lymphocyte activity and in some cases with induction of lymphocyte anergy. Targeting antibodies to these receptors can be used in the methods of this invention.
Агенты, которые агонизируют иммунную костимулирующую молекулу, также полезны в способах по данному изобретению. Такие агенты включают агонисты или CD40 и OX40. CD40 представляет собой костимулирующий белок, обнаруженный в антигенпрезентирующих клетках (АПК) и необходимый для их активации. Эти АПК включают фагоциты (макрофаги и дендритные клетки) и B-клетки. CD40 является частью семейства рецепторов ФНО. Первичными активирующими сигнальными молекулами для CD40 являются ИФНγ и лиганд CD40 (CD40L). Стимуляция через CD40 активирует макрофаги. Agents that agonize the immune costimulatory molecule are also useful in the methods of this invention. Such agents include either CD40 and OX40 agonists. CD40 is a co-stimulatory protein found in antigen presenting cells (APCs) and required for their activation. These APCs include phagocytes (macrophages and dendritic cells) and B cells. CD40 is part of the TNF receptor family. The primary activating signaling molecules for CD40 are IFNγ and the CD40 ligand (CD40L). Stimulation via CD40 activates macrophages.
Представляющие интерес антитела к CCR4 (CD194) включают в себя гуманизированные моноклональные антитела, направленные против C-C-хемокинового рецептора 4 (CCR4) с потенциальной противовоспалительной и противоопухолевой активностями. CCR2 экспрессируется на свободных макрофагах, которые могут быть обнаружены при различных воспалительных состояниях, например, ревматоидном артрите; и также были идентифицированы как экспрессирующиеся на макрофагах, стимулирующих опухоль. CCR2 также экспрессируется на регуляторных Т-клетках, а лиганд CCR2, CCL2, опосредует рекрутирование регуляторных Т-клеток в опухоли. Регуляторные Т-клетки подавляют ответ на противоопухолевые Т-клетки, и поэтому желательно их ингибирование или истощение их популяции. Anti-CCR4 (CD194) antibodies of interest include humanized monoclonal antibodies directed against the C-C chemokine receptor 4 (CCR4) with potential anti-inflammatory and anti-tumor activities. CCR2 is expressed on free macrophages, which can be found in various inflammatory conditions such as rheumatoid arthritis; and have also been identified as being expressed on tumor-stimulating macrophages. CCR2 is also expressed on regulatory T cells, and the CCR2 ligand, CCL2, mediates the recruitment of regulatory T cells in tumors. Regulatory T cells suppress the response to antitumor T cells, and therefore their inhibition or depletion of their population is desirable.
Получение белков по данному изобретениюObtaining proteins according to this invention
Хотя антитела могут быть получены с помощью химического синтеза, их обычно получают методами рекомбинантной ДНК, такими как коэкспрессия всех цепей, составляющих белок в одной рекомбинантной клетке-хозяине, или коэкспрессия полипептида тяжелой цепи и антитела, например, человеческого антитела. Кроме того, тяжелая и легкая цепи антитела также могут быть экспрессированы с применением одного полицистронного экспрессионного вектора. Очистка отдельных полипептидов достигается с применением стандартных методов очистки белков, таких как аффинная (белок А) хроматография, эксклюзионная хроматография и/или хроматография гидрофобного взаимодействия. Биспецифические достаточно различаются по размеру и гидрофобности, поэтому очистку можно проводить с применением стандартных процедур. Although antibodies can be made by chemical synthesis, they are usually made by recombinant DNA techniques, such as co-expression of all the chains that make up a protein in a single recombinant host cell, or co-expression of a heavy chain polypeptide and an antibody, such as a human antibody. In addition, the heavy and light chains of an antibody can also be expressed using a single polycistronic expression vector. Purification of individual polypeptides is achieved using standard protein purification methods such as affinity (protein A) chromatography, size exclusion chromatography and/or hydrophobic interaction chromatography. The bispecifics differ sufficiently in size and hydrophobicity that purification can be carried out using standard procedures.
Количество антитела и полипептида тяжелой цепи, продуцируемых в одной клетке-хозяине, можно минимизировать путем конструирования константных областей антитела и тяжелой цепи, так что гомодимеризация является предпочтительнее гетеродимеризации, например, путем введения самокомплементарных взаимодействий (см., например, WO 98/50431 о возможностях, таких как стратегии "выпуклости-в-полость" (см., WO 96/27011)). Поэтому еще одним аспектом данного изобретения является предоставление способа получения биспецифического в рекомбинантном хозяине, способа, включающего этап: экспрессии в рекомбинантной клетке-хозяине последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере два полипептида тяжелой цепи, при этом указанные полипептиды тяжелой цепи отличаются своими константным областям в достаточной степени, чтобы уменьшить или предотвратить образование гомодимера, но увеличить образование биспецифического. The amount of antibody and heavy chain polypeptide produced in a single host cell can be minimized by designing antibody and heavy chain constant regions such that homodimerization is favored over heterodimerization, e.g. , such as "bulge-to-cavity" strategies (see WO 96/27011)). Therefore, another aspect of the present invention is to provide a method for producing a bispecific in a recombinant host, a method comprising the step of: expressing in a recombinant host cell a nucleic acid sequence encoding at least two heavy chain polypeptides, wherein said heavy chain polypeptides differ in their constant regions in sufficient to reduce or prevent homodimer formation but increase bispecific formation.
Когда белок содержит три цепи, например, FlicAb, они могут быть получены путем коэкспрессии трех цепей (2 тяжелых цепи и одна легкая цепь), составляющих молекулу в одной рекомбинантной клетке-хозяине. When a protein contains three chains, such as FlicAb, they can be produced by co-expression of three chains (2 heavy chains and one light chain) constituting a molecule in a single recombinant host cell.
Для рекомбинантной продукции белков в данном документе применяют одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих все цепи, например, 2, 3, 4 и тому подобное, выделяют и встраивают в реплицируемый вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии. Многие векторы являются доступными. Компоненты вектора, как правило, включают в себя, но не ограничиваются ими, один или более из следующих элементов: сигнальную последовательность, точку начала репликации, один или более маркерных генов и энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции. For recombinant production of proteins herein, one or more nucleic acids encoding all strands, eg 2, 3, 4 and the like, are isolated and inserted into a replicable vector for further cloning (DNA amplification) or for expression. Many vectors are available. Vector components typically include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes and an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence.
В предпочтительном варианте реализации изобретения клетка-хозяин в соответствии со способом по данному изобретению способна к экспрессии человеческого иммуноглобулина на высоком уровне, то есть, по меньшей мере, 1 пг/клетка/день, предпочтительно, по меньшей мере, 10 пг/клетка/день и даже более предпочтительно по меньшей мере 20 пг/клетка/день или более без необходимости амплификации молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих отдельные цепи в указанной клетке-хозяине. In a preferred embodiment, the host cell according to the method of the invention is capable of expressing human immunoglobulin at a high level, i.e. at least 1 pg/cell/day, preferably at least 10 pg/cell/day and even more preferably at least 20 pg/cell/day or more without the need for amplification of nucleic acid molecules encoding single strands in said host cell.
Фармацевтическая композицияpharmaceutical composition
Другим аспектом данного изобретения является предоставление фармацевтических композиций, содержащих один или более белков по данному изобретению в смеси с подходящим фармацевтически приемлемым носителем. Примеры фармацевтически приемлемых носителей, применяемых в данном документе, представляют собой, но без ограничений, адъюванты, твердые носители, воду, буферы или другие носители, применяемые в данной области техники для хранения терапевтических компонентов или их комбинаций. Another aspect of this invention is the provision of pharmaceutical compositions containing one or more proteins according to this invention in admixture with a suitable pharmaceutically acceptable carrier. Examples of pharmaceutically acceptable carriers used herein are, but are not limited to, adjuvants, solid carriers, water, buffers or other carriers used in the art for storage of therapeutic components or combinations thereof.
Терапевтические составы белков, применяемые в соответствии с данным изобретением, готовят для хранения путем смешивания белков, имеющих желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences 16-е издание, Osol, A. Ред. (1980 год)), например, в виде лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях, и включают буферные вещества, например, фосфат, цитрат и другие органические соли; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (например, хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензэтония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, например, метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и m-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее 10 остатков) полипептиды; белки, например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, например, поливинилпирролидон; аминокислоты, например, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, например, ЭДТК; сахара, например, сахарозу, маннит, трегалозу или сорбит; солеобразующие противоионы, например, натрия; металлсодержащие комплексы (например, комплексы Zn-белок) и/или неионогенные ПАВ, например, TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Therapeutic protein formulations used in accordance with this invention are prepared for storage by mixing proteins having the desired purity with optional pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or stabilizers (see, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), for example, in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions. Acceptable carriers, excipients or stabilizers are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations employed and include buffering agents such as phosphate, citrate and other organic salts; antioxidants including ascorbic acid and methionine; preservatives (eg octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol; butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens, eg methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol); low molecular weight (containing less than 10 residues) polypeptides; proteins, eg serum albumin, gelatin or immunoglobulins; hydrophilic polymers, for example polyvinylpyrrolidone; amino acids, for example glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates, including glucose, mannose or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars, for example sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; metal complexes (eg Zn-protein complexes) and/or non-ionic surfactants such as TWEEN™, PLURONICS™ or polyethylene glycol (PEG).
Составы антител к CD3 описаны, например, в патентной публикации США № 20070065437, полное описание которой включено в данный документ посредством ссылки. Подобные составы могут быть применены для белков по данному изобретению. Основными компонентами таких составов являются рН-буферное средство, эффективное в диапазоне от 3,0 до 6,2, соль, поверхностно-активное вещество и эффективное количество биспецифического со специфичностью к CD3. Anti-CD3 antibody formulations are described, for example, in US Patent Publication No. 20070065437, the full disclosure of which is incorporated herein by reference. Similar formulations can be used for the proteins of this invention. The main components of such formulations are a pH buffering agent effective in the range of 3.0 to 6.2, a salt, a surfactant, and an effective amount of a CD3 specific bispecific.
Способы примененияApplication methods
Предлагаются способы лечения или снижения заболеваемости, включая, без ограничения, инфекцию, аутоиммунное заболевание, первичный или метастатический рак и тому подобное, в схеме приема лекарств, включающей контакт клеток-мишеней с антигенсвязывающей композицией по данному изобретению, особенно когда антигенсвязывающая композиция представляет собой мультиспецифическое антитело, подходящее для состояния, подвергаемого лечению, например, где один связывающий фрагмент специфически связывается с антигеном, ассоциированным с опухолью, для лечения соответствующих раковых клеток; связывающий фрагмент, специфичный для патогена, представляющего интерес, для лечения соответствующей инфекции, и тому подобное. Такие способы включают в себя введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества или эффективной дозы агентов по данному изобретению, включая без ограничения комбинации реагента с химиотерапевтическим лекарственным средством, лучевую терапию или хирургическое вмешательство. Methods are provided for treating or reducing morbidity, including, without limitation, infection, autoimmune disease, primary or metastatic cancer, and the like, in a drug regimen comprising contacting target cells with an antigen binding composition of the present invention, especially when the antigen binding composition is a multispecific antibody. suitable for the condition being treated, for example, where one binding fragment specifically binds to a tumor associated antigen to treat the respective cancer cells; a binding fragment specific for the pathogen of interest to treat the corresponding infection, and the like. Such methods include administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount or effective dose of the agents of this invention, including, without limitation, combinations of a reagent with a chemotherapeutic drug, radiation therapy, or surgery.
Эффективные дозы композиций по данному изобретению для лечения заболевания варьируют в зависимости от многих разных факторов, в том числе способа введения, целевого сайта, физиологического состояния пациента, от того, представляет ли собой пациент человека или животное, других вводимых медикаментов, и того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно пациентом является человек, но млекопитающие, отличные от человека, также могут подвергаться лечению, например, домашние животные, такие как собаки, кошки, лошади и тому подобное, лабораторные млекопитающие, такие как кролики, мыши, крысы и тому подобное, и тому подобное. Дозировки для лечения можно подбирать для оптимизации безопасности и эффективности. Effective dosages of the compositions of this invention for treating a disease will vary depending on many different factors, including the route of administration, the target site, the physiological state of the patient, whether the patient is a human or an animal, other medications administered, and whether preventive or therapeutic treatment. Usually, the patient is a human, but non-human mammals can also be treated, for example, domestic animals such as dogs, cats, horses and the like, laboratory mammals such as rabbits, mice, rats and the like, and the like. . Dosages for treatment can be adjusted to optimize safety and efficacy.
Уровни дозировки могут быть легко определены квалифицированным лечащим врачом и могут быть изменены при необходимости, например, при необходимости изменения реакции субъекта на терапию. Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с веществами-носителями для получения разовой лекарственной формы, изменяется в зависимости от получающего лечение индивида и конкретного способа введения. Единичные лекарственные формы обычно содержат от около 1 мг до около 500 мг активного ингредиента. Dosage levels can be easily determined by the skilled physician and can be changed as needed, for example, if the subject's response to therapy needs to be changed. The amount of active ingredient that can be combined with carrier materials to form a single dosage form will vary depending on the individual being treated and the particular route of administration. Unit dosage forms typically contain from about 1 mg to about 500 mg of the active ingredient.
В некоторых вариантах реализации изобретения терапевтическая дозировка агента может составлять от около 0,0001 до 100 мг/кг и более, обычно от 0,01 до 5 мг/кг от массы тела хозяина. Например, дозировки могут составлять 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или в пределах 1-10 мг/кг. Типовая схема лечения включает в себя введение один раз каждые две недели или один раз в месяц или один раз каждые 3-6 месяцев. Терапевтические препараты по данному изобретению обычно вводят несколько раз. Интервалы между введением каждой дозы могут быть еженедельными, ежемесячными или ежегодными. Интервалы также могут быть неравномерными, на что указывает измерение уровня терапевтического препарат в крови пациента. В альтернативном варианте, терапевтические препараты по данному изобретению могут быть введены в виде состава для продолжительного высвобождения, в этом случае необходимо менее частое введение. Дозировка и частота варьируют в зависимости от времени полужизни полипептида у пациента. In some embodiments of the invention, the therapeutic dosage of the agent may be from about 0.0001 to 100 mg/kg or more, usually from 0.01 to 5 mg/kg, based on the body weight of the host. For example, dosages may be 1 mg/kg body weight or 10 mg/kg body weight, or in the range of 1-10 mg/kg. A typical treatment regimen includes administration once every two weeks or once a month or once every 3-6 months. Therapeutic formulations of this invention are typically administered multiple times. The intervals between administration of each dose may be weekly, monthly or yearly. The intervals can also be uneven, as indicated by measuring the level of the therapeutic drug in the patient's blood. Alternatively, the therapeutics of this invention may be administered as a sustained release formulation, in which case less frequent administration is necessary. The dosage and frequency will vary depending on the half-life of the polypeptide in the patient.
В профилактических целях относительно небольшая доза может вводиться через относительно длительные интервалы на протяжении продолжительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение на протяжении всей жизни. В других терапевтических применениях иногда требуется относительно высокая дозировка с относительно короткими интервалами, до тех пор, пока прогрессирование заболевания не уменьшится или не прекратится, и предпочтительно, до тех пор, пока пациент не покажет частичное или полное улучшение симптомов заболевания. После этого пациенту может быть назначен профилактический режим. For prophylactic purposes, a relatively small dose may be administered at relatively long intervals over an extended period of time. Some patients continue to receive treatment throughout their lives. In other therapeutic applications, a relatively high dosage is sometimes required at relatively short intervals until the progression of the disease is reduced or stopped, and preferably until the patient shows a partial or complete improvement in the symptoms of the disease. After that, the patient can be assigned a prophylactic regimen.
В еще других вариантах реализации способы по данному изобретению включают в себя лечение, уменьшение или предотвращение роста опухоли, метастазирования опухоли или инвазии опухоли раков, включая карциномы, гематологические злокачественные опухоли, такие как лейкемии и лимфомы, меланомы, саркомы, глиомы, и тому подобное. Для профилактического применения фармацевтические композиции или лекарственные препараты вводят пациенту, подверженному риску заболевания или иным образом восприимчивому к заболеванию, в количестве, достаточном для устранения или уменьшения риска, уменьшения степени тяжести или задержки начала заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, присутствующие в ходе развития заболевания. In yet other embodiments, the methods of this invention include treating, reducing, or preventing tumor growth, tumor metastasis, or tumor invasion of cancers, including carcinomas, hematologic malignancies such as leukemias and lymphomas, melanomas, sarcomas, gliomas, and the like. For prophylactic use, pharmaceutical compositions or medicaments are administered to a patient at risk for, or otherwise susceptible to, a disease in an amount sufficient to eliminate or reduce the risk, reduce the severity, or delay the onset of a disease, including the biochemical, histological and/or behavioral symptoms of the disease, its complications and intermediate pathological phenotypes present during the development of the disease.
Композиции для лечения заболевания могут вводиться парентеральным, местным, внутривенным, внутриопухолевым, пероральным, подкожным, внутриартериальным, внутричерепным, внутрибрюшинным, интраназальным или внутримышечным способом. Типичным путем введения является внутривенный или внутриопухолевый, хотя другие пути могут быть одинаково эффективными. Compositions for treating a disease may be administered by parenteral, topical, intravenous, intratumoral, oral, subcutaneous, intra-arterial, intracranial, intraperitoneal, intranasal, or intramuscular routes. A typical route of administration is intravenous or intratumoral, although other routes may be equally effective.
Обычно композиции готовят в виде инъекционных растворов, либо в виде жидких растворов, либо суспензий; также могут быть приготовлены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препарат также может быть эмульгирован или инкапсулирован в липосомы или микрочастицы, такие как полилактид, полигликолид или сополимер, для усиления адъювантного эффекта, как обсуждалось выше. Langer, Science 249:1527, 1990 год и Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119, 1997 год. Агенты по данному изобретению можно вводить в форме инъекции веществ замедленного всасывания или имплантата препарата, который может быть составлен таким образом, чтобы обеспечить длительное или пульсирующее высвобождение активного ингредиента. Фармацевтические композиции, как правило, составлены как стерильные, по существу изотонические и полностью соответствующие всем нормам Надлежащей Производственной Практики (GMP - Good Manufacturing Practice) США. Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США. Typically, the compositions are prepared as injectable solutions, either as liquid solutions or suspensions; solid forms suitable for dissolution or suspension in liquid vehicles prior to injection may also be prepared. The drug may also be emulsified or encapsulated in liposomes or microparticles such as polylactide, polyglycolide or copolymer to enhance the adjuvant effect as discussed above. Langer, Science 249:1527, 1990 and Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97-119, 1997. The agents of this invention may be administered in the form of an injection of depot agents or an implant formulation, which may be formulated to provide sustained or pulsatile release of the active ingredient. Pharmaceutical compositions are typically formulated to be sterile, substantially isotonic, and fully compliant with all US Good Manufacturing Practice (GMP) regulations. US Food and Drug Administration.
Токсичность белков, описанных в данном документе, может быть определена стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, путем определения ЛД50 (доза, летальная для 50% популяции) или ЛД100 (доза, летальная для 100% популяции). Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектом, представляет собой терапевтический индекс. Данные, полученные из этих анализов клеточных культур и исследований на животных, могут быть применены при определении диапазона доз, который не токсичен для применения у человека. Дозировка белков, описанных в данном документе, предпочтительно находится в диапазоне значений концентраций в кровообращении, которые включают эффективную дозу с небольшой токсичностью или без нее. Дозировка может меняться в этом диапазоне в зависимости от применяемой формы дозировки и используемого пути введения. Точный состав, способ введения и дозировка могут быть выбраны отдельным врачом с учетом состояния пациента. The toxicity of the proteins described herein can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals, for example, by determining LD 50 (dose lethal to 50% of the population) or LD 100 (dose lethal to 100% of the population). The dose ratio between toxic and therapeutic effect is the therapeutic index. The data obtained from these cell culture assays and animal studies can be used in determining a dosage range that is not toxic for human use. The dosage of the proteins described herein is preferably in the range of circulating concentrations that include an effective dose with little or no toxicity. The dosage may vary within this range depending on the dosage form used and the route of administration used. The precise composition, route of administration, and dosage may be selected by the individual physician based on the condition of the patient.
Фармацевтические композиции можно вводить в различных стандартных лекарственных формах в зависимости от способа введения. Например, стандартные лекарственные формы, подходящие для перорального введения, включают, но без ограничения, порошок, таблетки, пилюли, капсулы и пастилки для рассасывания. Общепризнано, что композиции по данному изобретению при пероральном введении должны быть защищены от воздействия пищеварения. Это обычно достигается либо путем образования комплексов молекул с композицией для придания им устойчивости к кислотному и ферментативному гидролизу, либо путем упаковки молекул в подходяще устойчивый носитель, такой как липосома или защитный барьер. Средства защиты агентов от системы пищеварения хорошо известны в данной области техники. Pharmaceutical compositions can be administered in various unit dosage forms depending on the route of administration. For example, unit dosage forms suitable for oral administration include, but are not limited to, powder, tablets, pills, capsules, and lozenges. It is recognized that the compositions of this invention when administered orally must be protected from the effects of digestion. This is usually achieved either by complexing the molecules with the composition to render them resistant to acid and enzymatic hydrolysis, or by packaging the molecules in a suitably stable carrier such as a liposome or protective barrier. Means of protecting agents from the digestive system are well known in the art.
Композиции для введения обычно содержат антитело или другой абляционный агент, растворенный в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно в водном носителе. Могут применяться различные водные носители, например, забуференный физиологический раствор и тому подобное. Эти растворы являются стерильными и, как правило, не содержат нежелательных веществ. Эти композиции могут быть стерилизованы обычными, хорошо известными методами стерилизации. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которые необходимы для соответствия физиологическим условиям, такие как средства регулирующие рН и буферные средства, средства, регулирующие токсичность и тому подобное, например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия и тому подобное. Концентрация активного агента в этих составах может варьироваться в широких пределах и будет выбираться в первую очередь на основе объемов жидкости, вязкости, массы тела и тому подобного в соответствии с конкретным выбранным путем введения и потребностями пациента (например, Remington's Pharmaceutical Science (15-е. изд., 1980 год) и Goodman & Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (Hardman и соавт., ред., 1996 год)). Compositions for administration typically contain an antibody or other ablative agent dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier, preferably an aqueous carrier. Various aqueous vehicles may be used, for example buffered saline and the like. These solutions are sterile and generally free of unwanted substances. These compositions can be sterilized by conventional, well known sterilization techniques. The compositions may contain pharmaceutically acceptable excipients which are necessary to suit physiological conditions, such as pH adjusting and buffering agents, toxicity adjusting agents and the like, for example sodium acetate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium lactate and the like. similar. The concentration of the active agent in these formulations can vary widely and will be selected primarily based on fluid volumes, viscosity, body weight, and the like, according to the particular route of administration chosen and the needs of the patient (e.g., Remington's Pharmaceutical Science (15th. ed., 1980) and Goodman & Gillman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (Hardman et al., ed., 1996)).
Также в объем данного изобретения входят наборы, содержащие активные агенты и их составы, по данному изобретению и инструкции по применению. Набор может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный реагент, например, химиотерапевтическое лекарственное средство и тому подобное. Наборы обычно включают в себя этикетку, указывающую на предполагаемое применение содержимого набора. Термин "этикетка" включает в себя любые письменные или записанные материалы, поставляемые в комплекте или вместе с ним, или иным образом сопровождающие набор. Also included within the scope of this invention are kits containing the active agents and their formulations of the invention and instructions for use. The kit may further contain at least one additional reagent, for example, a chemotherapeutic drug and the like. Kits usually include a label indicating the intended use of the contents of the kit. The term "label" includes any written or recorded materials supplied with or with the kit, or otherwise accompanying the kit.
Композиции можно вводить для терапевтического лечения. Композиции вводят пациенту в количестве, достаточном для существенного удаления клеток-мишеней, как описано выше. Количество, достаточное для достижения этого, определяется как "терапевтически эффективная доза", которая может обеспечить улучшение общей выживаемости. Композиции можно вводить однократно или многократно в зависимости от требуемой и переносимой пациентом дозировки и частоты. Конкретная доза, необходимая для лечения, будет зависеть от медицинского диагноза и истории заболевания млекопитающего, а также от других факторов, таких как возраст, вес, пол, путь введения, эффективность и тому подобного. The compositions may be administered for therapeutic treatment. The compositions are administered to the patient in an amount sufficient to substantially remove target cells as described above. An amount sufficient to achieve this is defined as the "therapeutically effective dose" which may provide an improvement in overall survival. The compositions can be administered once or multiple times, depending on the dosage and frequency desired and tolerated by the patient. The specific dose required for treatment will depend on the medical diagnosis and medical history of the mammal, as well as other factors such as age, weight, sex, route of administration, efficacy, and the like.
Теперь, когда изобретение полностью описано, для специалиста в данной области техники будет очевидно, что различные изменения и модификации могут быть сделаны без отклонения от сущности или объема изобретения. Now that the invention has been fully described, it will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made without departing from the spirit or scope of the invention.
ПримерыExamples
Пример 1. Генетически сконструированные крысы, экспрессирующие антитела, содержащие только тяжелые цепиExample 1 Genetically Engineered Rats Expressing Heavy Chain Only Antibodies
Человеческий локус IgH был сконструирован и собран из нескольких частей, которые включали модификацию и объединение генов С-области крысы, которые затем соединялись по ходу транскрипции области VH6-D-JH человека. Два BAC с отдельными кластерами человеческих генов VH были затем совместно введены с BAC, кодирующим собранный (человеческий VH6-D-JH-крысиный C) фрагмент. The human IgH locus was constructed and assembled from several parts that included modification and fusion of the rat C-region genes, which were then fused downstream of the human V H 6-DJ H region. The two BACs with separate clusters of human V H genes were then co-introduced with the BAC encoding the assembled (human V H 6-DJ H -rat C) fragment.
Были получены трансгенные крысы, несущие искусственные локусы иммуноглобулинов тяжелой цепи в неупорядоченной конфигурации. Включенные гены константной области кодируют IgM, IgD, IgG2b, IgE, IgA и 3'-энхансер. ОТ-ПЦР и анализ сыворотки (ИФА) трансгенных крыс выявили продуктивную перестройку локусов трансгенных иммуноглобулинов и экспрессию в сыворотке различных изотипов антител только с тяжелой цепью. Трансгенные крысы перекрестно скрещивались с крысами с мутированными эндогенными локусами тяжелой цепи и легкой цепи, ранее описанными в публикации патента США 2009/0098134 А1. Анализ таких животных продемонстрировал инактивацию экспрессии тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина крысы и высокий уровень экспрессии антител тяжелой цепи с вариабельными областями, кодируемыми генами V, D и J человека. Иммунизация трансгенных крыс приводила к получению сывороточных ответов с высоким титром антигенспецифических антител с тяжелой цепью. Эти трансгенные крысы, экспрессирующие антитела с тяжелой цепью с областью VDJ человека, были названы UniRats. Were obtained transgenic rats carrying artificial heavy chain immunoglobulin loci in a disordered configuration. The included constant region genes encode IgM, IgD, IgG2b, IgE, IgA and a 3' enhancer. RT-PCR and serum analysis (ELISA) of transgenic rats revealed productive rearrangement of transgenic immunoglobulin loci and serum expression of various isotypes of heavy chain-only antibodies. Transgenic rats were cross-bred with mutated endogenous heavy chain and light chain loci previously described in US Patent Publication 2009/0098134 A1. Analysis of these animals demonstrated inactivation of rat immunoglobulin heavy and light chain expression and high expression of heavy chain antibodies with variable regions encoded by the human V, D and J genes. Immunization of transgenic rats resulted in serum responses with high titers of antigen-specific heavy chain antibodies. These transgenic rats expressing heavy chain antibodies with the human VDJ region were named UniRats.
Пример 2. Генетически сконструированные крысы, экспрессирующие антитела с фиксированной легкой цепьюExample 2 Genetically Engineered Rats Expressing Fixed Light Chain Antibodies
Наборы трансгенных человеческих антител были получены из Н-цепей с разнообразной (VH-D-JH)n перестройкой в сочетании с уникальной L-цепью. Для этого перестроенная L-цепь, человеческий Vk-Jk1-Ck, была интегрирована в зародышевую линию крысы посредством микроинъекции ДНК, и полученные трансгенные животные были скрещены с ранее описанной линией крысы, которая естественным образом экспрессирует набор человеческой H-цепи (Osborn и соавт., 2013 год). Эта новая линия крыс была названа OmniFlic. Sets of transgenic human antibodies were generated from H chains with a diverse (V H -DJ H ) n rearrangement in combination with a unique L chain. To do this, the rearranged L chain, human Vk-Jk1-Ck, was integrated into the rat germline via DNA microinjection, and the resulting transgenic animals were crossed with a previously described rat line that naturally expresses the human H chain set (Osborn et al. , year 2013). This new line of rats has been named OmniFlic.
Иммунизация крыс OmniFlic с применением множества различных антигенов продуцировала высокие уровни антигенспецифического IgG, сходного с другими трансгенными крысами, несущими тот же локус IgH. Анализ набора методом ОТ-ПЦР позволил выявить сильно вариабельные перестройки гена VH при высоких уровнях транскрипта и белка. Кроме того, был идентифицирован только один продукт L-цепи, также экспрессирующийся на высоком уровне. Immunization of OmniFlic rats with a variety of different antigens produced high levels of antigen-specific IgG, similar to other transgenic rats carrying the same IgH locus. Analysis of the set by RT-PCR revealed highly variable rearrangements of the V H gene at high transcript and protein levels. In addition, only one L chain product was identified, also highly expressed.
Антигенспецифические связыватели из OmniFlic были получены с помощью сиквенирования нового поколения (NGS) и отобраны из библиотек кДНК (дрожжей, E. coli, фагов), которые после сиквенирования идентифицировали разнообразные транскрипты H-цепи. Для экспрессии в клетках млекопитающих гипермутированные конструкции H-цепи трансфицировали в комбинации с исходной трансгенной последовательностью Igκ. В этом перестроенном Vk-Jk1-Ck не допускались мутационные изменения, и всегда одна и та же L-цепь экспрессировалась с различными продуктами H-цепи для генерации моноклонального человеческого IgG. Antigen-specific binders from OmniFlic were generated by next generation sequencing (NGS) and selected from cDNA libraries (yeast, E. coli, phage) that, after sequencing, identified a variety of H chain transcripts. For expression in mammalian cells, hypermutated H chain constructs were transfected in combination with the original Igκ transgenic sequence. Mutational changes were not allowed in this rearranged Vk-Jk1-Ck and always the same L chain was expressed with different H chain products to generate monoclonal human IgG.
Пример 3. Получение антигенспецифических антител у трансгенных крысExample 3. Obtaining antigen-specific antibodies in transgenic rats
Для получения антигенспецифических антител с тяжелой цепью у крыс, экспрессирующих генетически сконструированных крыс, иммунизировали двумя способами. To obtain antigen-specific heavy chain antibodies, rats expressing genetically engineered rats were immunized in two ways.
Иммунизация рекомбинантными внеклеточными доменами PD-L1 и BCMA. Рекомбинантные внеклеточные домены PD-L1 и BCMA были приобретены у R&D Systems, разбавлены стерильным физиологическим раствором и объединены с адъювантом. Иммуногены либо комбинировали с полным адъювантом Фрейнда (CFA) и неполным адъювантом Фрейнда (IFA), либо с адъювантами Titermax и Ribi. Первую иммунизацию (примирование) иммуногеном в CFA или Titermax вводили в левую и правую ноги. После первой иммунизации иммуногенами в CFA в каждую ногу вводили еще две иммунизации в IFA (бустер-инъекции) или еще 4 иммунизации в Ribi и еще одну в Titermax. Эта последовательность иммунизаций приводит к развитию В-клеток, продуцирующих высокоаффинные антитела. Концентрации иммуногена составляли 10 мкг на ногу. Сыворотку собирали у крыс при последнем кровопускании для определения титров сыворотки. Immunization with recombinant extracellular domains of PD-L1 and BCMA. Recombinant extracellular domains of PD-L1 and BCMA were purchased from R&D Systems, diluted with sterile saline and combined with adjuvant. The immunogens were either combined with complete Freund's adjuvant (CFA) and incomplete Freund's adjuvant (IFA), or with Titermax and Ribi adjuvants. The first immunization (priming) with the immunogen in CFA or Titermax was administered to the left and right legs. After the first immunization with immunogens in CFA, two more immunizations in IFA (booster injections) or 4 more immunizations in Ribi and another immunization in Titermax were administered to each leg. This sequence of immunizations results in the development of B cells producing high affinity antibodies. Immunogen concentrations were 10 μg per leg. Serum was collected from rats at the last bloodletting to determine serum titers.
Для получения антител к CD3δε человека генетически сконструированных крыс иммунизировали с применением протоколов иммунизации на основе ДНК. To obtain antibodies to human CD3δε, genetically engineered rats were immunized using DNA-based immunization protocols.
Крыс OmniFlic иммунизировали конструкциями CD3-эпсилон/дельта человека и яванской макаки в Aldevron, Inc. (Фарго, штат Северная Дакота) с применением технологии антител GENOVAC. Дренирующие лимфатические узлы собирали после окончательной иммунизации и выделяли РНК. После синтеза кДНК набор антител тяжелой цепи IgH был охарактеризован с помощью сиквенирования нового поколения и нашего собственного программного обеспечения для внутреннего использования. Были отобраны кандидатные антигенспецифические последовательности VH, демонстрирующие доказательства антигенспецифического положительного отбора. Несколько сотен последовательностей VH, кодирующих FlicAb, были отобраны для сборки генов и клонированы в экспрессионный вектор. Впоследствии полностью человеческие антитела FlicAb IgG1 экспрессировали в клетках HEK для анализа с помощью Flow и ИФА. Человеческие FlicAb тестировали на связывание с первичными человеческими Т-клетками и клетками Jurkat с помощью потока. Кроме того, человеческие FlicAb были протестированы с применением рекомбинантных белков CD3δε в ИФА. Все FlicAb с положительным связыванием с Т-клетками человека перечислены на фиг. 1 и 2. Выбранные последовательности были дополнительно охарактеризованы в анализах активации Т-клеток. OmniFlic rats were immunized with human and cynomolgus macaque CD3 epsilon/delta constructs at Aldevron, Inc. (Fargo, ND) using GENOVAC antibody technology. Draining lymph nodes were harvested after final immunization and RNA was isolated. After cDNA synthesis, the IgH heavy chain antibody set was characterized using next generation sequencing and our own in-house software. Candidate antigen-specific VH sequences were selected showing evidence of antigen-specific positive selection. Several hundred VH sequences encoding FlicAb were selected for gene assembly and cloned into an expression vector. Subsequently, fully human FlicAb IgG1 antibodies were expressed in HEK cells for analysis by Flow and ELISA. Human FlicAbs were tested for binding to primary human T cells and Jurkat cells using flow. In addition, human FlicAbs were tested using recombinant CD3δε proteins in ELISA. All FlicAbs with positive binding to human T cells are listed in FIG. 1 and 2. Selected sequences were further characterized in T cell activation assays.
Пример 4. Характеристизация антителExample 4 Characterization of Antibodies
Таблица данных на фиг. 3 обобщает поведение анти-CD3 антител семейства 2 в моноспецифическом и биспецифическом формате. В столбце 1 показан идентификатор последовательности для последовательности VH анти-CD3. В столбце 2 показано значение СИФ для связывания клетками Jurkat исходного моноспецифического (антитела) к CD3. В столбце 3 показано значение СИФ для связывания T-клетками яванского макака исходного моноспецифического (антитела) к CD3. Столбец 4 демонстрирует название aCD3:aBCMA биспецифического антитела. В столбце 5 показаны пикограммы ИЛ-2, высвобождаемого пан-Т-клетками, стимулированными биспецифическим антителом, связывающим белок ВСМА, помещенным на пластике, в указанной дозе. В столбце 6 показаны пикограммы ИЛ-6, высвобождаемого пан-Т-клетками, стимулированными биспецифическим антителом, связывающим белок ВСМА, помещенным на пластике, в указанной дозе. В столбце 7 показаны пикограммы ИЛ-10, высвобождаемого пан-Т-клетками, стимулированными биспецифическим антителом, связывающим белок ВСМА, помещенным на пластике, в указанной дозе. В столбце 8 показаны пикограммы ИФН-γ, высвобождаемого пан-Т-клетками, стимулированными биспецифическим антителом, связывающим белок ВСМА, помещенным на пластике, в указанной дозе. В столбце 9 показаны пикограммы ФНОα, высвобождаемого пан-Т-клетками, стимулированными биспецифическим антителом, связывающим белок ВСМА, помещенным на пластике, в указанной дозе. В столбце 10 показана ЭК50 лизиса опухолевых клеток U266, опосредованного биспецифическими антителами, в присутствии пан-Т-клеток человека. В столбце 11 показан процент лизиса опухолевых клеток U266, в присутствии биспецифического антитела и пан-Т-клеток человека при дозе 333 нг/мл биспецифического антитела. В столбце 12 показана аффинность белкового связывания плеча к CD3 биспецифического антитела, измеренная с помощью Octet. В столбце 13 показано значение СИФ для связывания клетками Jurkat биспецифического антитела. The data table in FIG. 3 summarizes the behavior of
Пример 5. Характеризация биспецифических антителExample 5 Characterization of Bispecific Antibodies
Семь биспецифических антител αCD3_fam2:aBCMA, каждое с уникальным плечом к CD3 и общим плечом к BCMA, были протестированы на способность убивать опухолевые клетки U266 BCMA+ посредством перенаправления активированных первичных Т-клеток. В этом эксперименте клетки U266, которые экспрессируют BCMA, смешивали с активированными пан-Т-клетками в соотношении E:T 10:1 наряду с добавлением биспецифического антитела. На фиг. 4 ось x демонстрирует концентрацию применяемого антитела, а ось y демонстрирует % лизиса опухолевых клеток через 6 часов после добавления антитела. Seven αCD3_fam2:aBCMA bispecific antibodies, each with a unique anti-CD3 arm and a common anti-BCMA arm, were tested for their ability to kill U266 BCMA+ tumor cells by redirecting activated primary T cells. In this experiment, U266 cells that express BCMA were mixed with activated pan T cells in an E:T ratio of 10:1 along with the addition of a bispecific antibody. In FIG. 4, the x-axis shows the concentration of the applied antibody, and the y-axis shows the % lysis of
Сравнение активности по лизису опухолевых клеток опосредованной биспецифическими антителами с высвобождением цитокина ИЛ-2 продемонстрировано на точечной диаграмме фиг. 5. Корреляция между производством ИЛ-2 и лизисом опухолевых клеток U266 составляет R2=0,37. Сравнение активности по лизису опухолевых клеток опосредованной биспецифическими антителами с высвобождением цитокина ИФН-γ продемонстрировано на точечной диаграмме фиг. 6. Корреляция между производством ИФН-γ и лизисом опухолевых клеток U266 составляет R2=0,53. Сравнение активности по лизису опухолевых клеток U266 опосредованной биспецифическими антителами с анти-CD3 связывающей афинностью продемонстрировано на точечной диаграмме фиг. 7. Корреляция между ЭК50 уничтожения U266 и аффинностью связывания белка составляет R2=0,93. A comparison of the activity of tumor cell lysis mediated by bispecific antibodies with the release of the cytokine IL-2 is shown in the scatter plot of FIG. 5. The correlation between IL-2 production and U266 tumor cell lysis is R 2 =0.37. Comparison of bispecific antibody-mediated tumor cell lysis activity with release of the cytokine IFN-γ is shown in the scatter plot of FIG. 6. The correlation between IFN-γ production and U266 tumor cell lysis is R 2 =0.53. Comparison of U266 tumor cell lysis activity mediated by bispecific antibodies with anti-CD3 binding affinity is shown in the dot plot of FIG. 7. The correlation between U266 killing EC50 and protein binding affinity is R 2 =0.93.
Пример 6. Лизис опухолевых клетокExample 6 Lysis of Tumor Cells
Биспецифические антитела αCD3_F1F:αBCMA анализировали на способность уничтожать три различных линии опухолевых клеток ВСМА+ и одну линию ВСМА-негативных клеток путем перенаправления активированных исходных Т-клеток. В этом эксперименте опухолевые клетки смешивали с активированными пан-Т-клетками в соотношении E:T 10:1 наряду с добавлением биспецифического антитела. Результаты продемонстрированы на фиг. 8А-6D. Панель А демонстрирует уничтожение клеток RPMI-8226, панель B демонстрирует уничтожение клеток NCI-H929, панель C демонстрирует уничтожение клеток U-266 и панель D демонстрирует уничтожение клеток K562, отрицательный контроль. Ось x демонстрирует концентрацию применяемого антитела, а ось y демонстрирует % лизиса опухолевых клеток через 6 часов после добавления антитела. The αCD3_F1F:αBCMA bispecific antibodies were analyzed for their ability to kill three different BCMA+ tumor cell lines and one BCMA-negative cell line by redirecting activated parental T cells. In this experiment, tumor cells were mixed with activated pan-T cells in an E:T ratio of 10:1 along with the addition of a bispecific antibody. The results are shown in FIG. 8A-6D. Panel A shows killing of RPMI-8226 cells, panel B shows killing of NCI-H929 cells, panel C shows killing of U-266 cells and panel D shows killing of K562 cells, negative control. The x-axis shows the concentration of the applied antibody, and the y-axis shows the %
Измеряли уровень высвобождения цитокинов ИЛ-2 измеренный после культивирования Т-клеток человека в покое с различными линиями опухолевых клеток и увеличивающимися дозами биспецифического антитела αCD3_F1F:αBCMA. На фиг. 9A проиллюстрировано высвобождение ИЛ-2, стимулированное клетками RPMI-8226, на фиг. 9B проиллюстрировано высвобождение ИЛ-2, стимулированное клетками NCI-H929, на фиг. 9C проиллюстрировано высвобождение ИЛ-2, стимулированное клетками U-266 и на фиг. 9D проиллюстрировано высвобождение ИЛ-2, стимулированное клетками K562, отрицательный контроль. The level of IL-2 cytokine release was measured after culturing human T cells at rest with various tumor cell lines and increasing doses of the αCD3_F1F:αBCMA bispecific antibody. In FIG. 9A illustrates IL-2 release stimulated by RPMI-8226 cells, FIG. 9B illustrates IL-2 release stimulated by NCI-H929 cells, FIG. 9C illustrates IL-2 release stimulated by U-266 cells and FIG. 9D illustrates IL-2 release stimulated by K562 cells, negative control.
Уровень высвобождения цитокина ИФН-γ измеряли после культивирования Т-клеток человека в покое с различными линиями опухолевых клеток и увеличивающимися дозами биспецифического антитела αCD3_F1F:aBCMA. Фиг. 10A демонстрирует высвобождение ИФН-γ, стимулированное клетками RPMI-8226, на фиг. 10B проиллюстрировано высвобождение ИФН-γ, стимулированное клетками NCI-H929, на фиг. 10C проиллюстрировано высвобождение ИФН-γ, стимулированное клетками U-266 и на фиг. 10D проиллюстрировано высвобождение ИФН-γ, стимулированное клетками K562, отрицательный контроль. The release of the cytokine IFN-γ was measured after culturing human T cells at rest with various tumor cell lines and increasing doses of the αCD3_F1F:aBCMA bispecific antibody. Fig. 10A shows IFN-γ release stimulated by RPMI-8226 cells, FIG. 10B illustrates IFN-γ release stimulated by NCI-H929 cells, FIG. 10C illustrates IFN-γ release stimulated by U-266 cells and FIG. 10D illustrates IFN-γ release stimulated by K562 cells, negative control.
Примеры указаны таким образом, чтобы обеспечить обычным специалистам в этой области техники полное раскрытие и описание того, как изготавливать и применять данное изобретение, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы изобретения считают своим изобретением, и они не предназначены для представления того, что эксперименты, приведенные ниже, это все эксперименты, которые проводились. Были предприняты меры для обеспечения точности в отношении применяемых чисел (например, количеств, температуры и тому подобного), но некоторые экспериментальные ошибки и отклонения должны учитываться. Если не указано иное, части представляют собой части по весу, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура представлена в градусах Цельсия, а давление равно или близко к атмосферному. The examples are provided in such a way as to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use this invention, and are not intended to limit the scope of what the inventors consider their invention, nor are they intended to represent what the experiments below are all the experiments that were performed. Care has been taken to ensure accuracy with respect to the numbers used (eg amounts, temperatures, and the like), but some experimental errors and deviations must be taken into account. Unless otherwise indicated, parts are parts by weight, molecular weight is average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is at or near atmospheric.
В то время как данное изобретение было описано со ссылками на конкретные варианты его реализации, специалистам в данной области техники следует понимать, что могут быть проведены различные изменения и эквиваленты могут быть заменены без отхода от истинной сути и объема данного изобретения. Кроме того, многие модификации могут быть произведены для того, чтобы адаптировать конкретную ситуацию, материал, состав вещества, процесс, технологические стадии или стадию к задаче, сути и объему данного изобретения. Предполагается, что все указанные модификации находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения. While the present invention has been described with reference to specific embodiments, it will be understood by those skilled in the art that various changes may be made and equivalents may be substituted without departing from the true spirit and scope of the present invention. In addition, many modifications can be made in order to adapt a particular situation, material, composition of matter, process, process steps or step to the object, spirit and scope of this invention. All such modifications are intended to be within the scope of the appended claims.
--->--->
Перечень последовательностей Sequence listing
SEQUENCE LISTING SEQUENCE LISTING
<110> Trinklein, Nathan<110> Trinklein, Nathan
vanSchooten, Wim vanSchooten, Wim
Aldred, Shelley Force Aldred, Shelley Force
Harris, Katherine Harris, Katherine
Pham, Duy Pham, Duy
<120> CD3 Binding Antibodies<120> CD3 Binding Antibodies
<130> TEBO-001WO2<130> TEBO-001WO2
<150> 62/394,360 <150> 62/394.360
<151> 2016-09-14 <151> 2016-09-14
<150> 62/491,908 <150> 62/491.908
<151> 2017-04-28 <151> 2017-04-28
<160> 22<160> 22
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1<210> 1
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 1<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArgGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 2<210> 2
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 2<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 3<210> 3
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 3<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArgGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 4<210> 4
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 4<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArgGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Leu Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Leu Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 5<210> 5
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 5<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArgGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Leu Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Leu Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 6<210> 6
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 6<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArgGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asn TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asn Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 7<210> 7
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 7<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArgGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 8<210> 8
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 8<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 9<210> 9
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 9<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArgGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 10<210> 10
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 10<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArgGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 11<210> 11
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 11<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArgGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 12<210> 12
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 12<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArgGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Ser Arg Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Ser Tyr Ser Arg Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 13<210> 13
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 13<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArgGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Asn TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Asn Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Leu Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Leu Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 14<210> 14
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 14<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Arg Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Cys Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerCys Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 15<210> 15
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 15<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArgGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Leu Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Leu Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 16<210> 16
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 16<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArgGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 17<210> 17
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 17<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArgGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 18<210> 18
<211> 123<211> 123
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 18<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly ArgGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Gly Gly Ala TyrAla Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Gly Gly Ala Tyr
100 105 110 100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 19<210> 19
<211> 107<211> 107
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 19<400> 19
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro GlyGlu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser AsnGlu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu IleLeu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser GlyTyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln SerSer Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro TrpGlu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Trp
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 20<210> 20
<211> 243<211> 243
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 20<400> 20
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp ValGly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Arg Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Arg Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Gln Gly Glu Asn Asp Gly Pro Phe Asp His Arg Gly Gln GlyAla Lys Gln Gly Glu Asn Asp Gly Pro Phe Asp His Arg Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln LeuThr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
115 120 125 115 120 125
Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg LeuLeu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
130 135 140 130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr Gly Met Ser TrpSer Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp
145 150 155 160 145 150 155 160
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Gly Ile ArgVal Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Gly Ile Arg
165 170 175 165 170 175
Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg PheGly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
180 185 190 180 185 190
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met AsnThr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
195 200 205 195 200 205
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gln GlySer Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gln Gly
210 215 220 210 215 220
Glu Asn Asp Gly Pro Phe Asp His Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val ThrGlu Asn Asp Gly Pro Phe Asp His Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240 225 230 235 240
Val Ser SerVal Ser Ser
<210> 21<210> 21
<211> 119<211> 119
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 21<400> 21
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp ValGly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Ile Arg Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser ValSer Gly Ile Arg Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Gln Gly Glu Asn Asp Gly Pro Phe Asp His Arg Gly Gln GlyAla Lys Gln Gly Glu Asn Asp Gly Pro Phe Asp His Arg Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 115
<210> 22<210> 22
<211> 128<211> 128
<212> PRT<212> PRT
<213> H. sapiens<213> H. sapiens
<400> 22<400> 22
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser GlnGln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser GlyThr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30 20 25 30
Gly His Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu GluGly His Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro SerTrp Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Ile Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln PheLeu Lys Ser Arg Val Ile Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80 65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr TyrSer Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95 85 90 95
Cys Ala Arg Trp Arg His Asp Ile Phe Ala Ala Tyr Pro Tyr Tyr TyrCys Ala Arg Trp Arg His Asp Ile Phe Ala Ala Tyr Pro Tyr Tyr Tyr
100 105 110 100 105 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerTyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125 115 120 125
<---<---
Claims (84)
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662394360P | 2016-09-14 | 2016-09-14 | |
US62/394,360 | 2016-09-14 | ||
US201762491908P | 2017-04-28 | 2017-04-28 | |
US62/491,908 | 2017-04-28 | ||
PCT/US2017/038377 WO2018052503A1 (en) | 2016-09-14 | 2017-06-20 | Cd3 binding antibodies |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2022103374A Division RU2807216C2 (en) | 2016-09-14 | 2017-06-20 | Cd3 binding antibodies |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2019111037A RU2019111037A (en) | 2020-10-15 |
RU2019111037A3 RU2019111037A3 (en) | 2020-11-26 |
RU2790288C2 true RU2790288C2 (en) | 2023-02-16 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014047231A1 (en) * | 2012-09-21 | 2014-03-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-cd3 antibodies, bispecific antigen-binding molecules that bind cd3 and cd20, and uses thereof |
WO2015121383A1 (en) * | 2014-02-12 | 2015-08-20 | Michael Uhlin | Bispecific antibodies for use in stem cell transplantation |
RU2561457C2 (en) * | 2007-04-03 | 2015-08-27 | Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх | Cd3-epsilon-binding domain having interspecies specificity |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2561457C2 (en) * | 2007-04-03 | 2015-08-27 | Эмджен Рисерч (Мьюник) Гмбх | Cd3-epsilon-binding domain having interspecies specificity |
WO2014047231A1 (en) * | 2012-09-21 | 2014-03-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-cd3 antibodies, bispecific antigen-binding molecules that bind cd3 and cd20, and uses thereof |
WO2015121383A1 (en) * | 2014-02-12 | 2015-08-20 | Michael Uhlin | Bispecific antibodies for use in stem cell transplantation |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
TRINKLEIN N. et al., Abstract LB-090: Sequence-based discovery of fully human anti-CD3 and anti-PDL1 single domain antibodies using novel transgenic rats, Cancer Research, Suppl, 2016, Vol.76, N.14, Найдено в Интернет, URL: https://aacrjournals.org/cancerres/article/76/14_Supplement/LB-090/613383/Abstract-LB-090-Sequence-based-discovery-of-fully [найдено 03.08.2022]. SPIESS C. et al., Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies, Mol Immunol, 2015, vol. 67, N. 2 Pt A, pp. 95-106. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11421027B2 (en) | CD3 binding antibodies | |
US20240018235A1 (en) | Cd3 binding antibodies | |
US20240117050A1 (en) | Cd3-delta/epsilon heterodimer specific antibodies | |
RU2790288C2 (en) | Antibodies binding cd3 | |
RU2779489C2 (en) | Antibodies binding cd3 | |
RU2807216C2 (en) | Cd3 binding antibodies | |
NZ785574A (en) | CD3 binding antibodies |