RU2789083C2 - Method for obtaining a dextranase preparation and its use - Google Patents

Method for obtaining a dextranase preparation and its use Download PDF

Info

Publication number
RU2789083C2
RU2789083C2 RU2020122332A RU2020122332A RU2789083C2 RU 2789083 C2 RU2789083 C2 RU 2789083C2 RU 2020122332 A RU2020122332 A RU 2020122332A RU 2020122332 A RU2020122332 A RU 2020122332A RU 2789083 C2 RU2789083 C2 RU 2789083C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
dextranase
preparation
drug
dextran
sugar
Prior art date
Application number
RU2020122332A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2020122332A3 (en
RU2020122332A (en
Inventor
Георгий Владимирович Данилов
Игорь Владимирович Загорский
Евгений Григорьевич Кахоян
Original Assignee
Георгий Владимирович Данилов
Игорь Владимирович Загорский
Евгений Григорьевич Кахоян
Filing date
Publication date
Application filed by Георгий Владимирович Данилов, Игорь Владимирович Загорский, Евгений Григорьевич Кахоян filed Critical Георгий Владимирович Данилов
Priority to RU2020122332A priority Critical patent/RU2789083C2/en
Publication of RU2020122332A3 publication Critical patent/RU2020122332A3/ru
Publication of RU2020122332A publication Critical patent/RU2020122332A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2789083C2 publication Critical patent/RU2789083C2/en

Links

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, in particular to a method for obtaining a dextranase preparation Aspergillus insuetus VKMP F - 342. The method includes: obtaining a working culture on a slant agar; preparation of deep sowing culture in flasks; preparation of a deep seed culture in a fermenter; carrying out the process of biosynthesis in fermenters; separation on the flow separator; concentration of the native solution in an ultrafiltration unit; mixing with mannitol, sterilizing filtration, freezing; freeze drying, while mannitol is added at the rate of 1 g per 8000-12000 units activity. The invention also relates to a dextranase preparation Aspergillus insuetus VKMP F - 342, which has an increased activity and applications of this drug for the treatment and prevention of dental caries and gingivitis. In addition, the invention is directed to oral care products using the preparation.
EFFECT: invention makes it possible to obtain a dextranase preparation with increased activity. 7 cl, 8 tbl

Description

Область изобретенияField of invention

Изобретение относится к способу получения препарата на основе декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342, непосредственно препарату, обладающему определенными характеристиками активности и стабильности, к применениям указанного препарата декстраназы (или декстраназы, восстановленной из препарата) для профилактики и лечения заболеваний пародонта, в том числе кариеса зубов, гингивитов и пародонтитов; для разрушения декстрана диффузионного сока в производстве сахара из сахарной свеклы, а также композициям и средствам определенного назначения использующим данный препарат.The invention relates to a method for producing a drug based on Aspergillus insuetus VKMP F-342 dextranase, directly to a drug with certain activity and stability characteristics, to the use of said dextranase drug (or dextranase recovered from the drug) for the prevention and treatment of periodontal diseases, including caries teeth, gingivitis and periodontitis; for the destruction of dextran diffusion juice in the production of sugar from sugar beets, as well as compositions and products for certain purposes using this drug.

Уровень техникиState of the art

Первоначальный интерес к декстраназам был проявлен в отношении их возможного применения при коммерческом производстве клинического декстрана, то есть стерильного раствора декстрана с определенной молекулярной массой, который будет использоваться для восстановления объема крови у пациентов, страдающих от шока в результате кровопотери (Kim, D., and D. F. Day. 1994. A new process for the production of clinical dextran by mixed-culture fermentation of Lipomyces starkeyi and Leuconostoc mesenteroides. Enzyme Microb. Technol. 16:844-848; Lee, J.M., and P.F. Fox. 1985. Purification and characterization of Paecilomyces lilacinus dextranase. Enzyme Microb. Technol. 7:573-577). Относительно низкомолекулярные клинические декстраны ранее были получены из декстрана путем контролируемого кислотного гидролиза с последующим фракционированием органического растворителя. Однако выход низкий (10-12%) из-за потерь при гидролизе и фракционировании. Ферментативный метод, по-видимому, имел потенциал для замены кислотного гидролиза для клинического производства декстрана, и такие процессы были запатентованы в 1950-х годах. Ферментативный метод требует меньше энергии и более простого оборудования и приводит к более однородному продукту с выходом от 25% до 52%.Initial interest in dextranases was expressed with regard to their possible use in the commercial production of clinical dextran, i.e. a sterile solution of dextran with a specific molecular weight, which would be used to restore blood volume in patients suffering from shock due to blood loss (Kim, D., and D. F. Day 1994 A new process for the production of clinical dextran by mixed-culture fermentation of Lipomyces starkeyi and Leuconostoc mesenteroides Enzyme Microb Technol 16:844-848 Lee, J. M. and P. F. Fox 1985 Purification and characterization of Paecilomyces lilacinus dextranase Enzyme Microb Technol 7:573-577). Relatively low molecular weight clinical dextrans have previously been prepared from dextran by controlled acid hydrolysis followed by organic solvent fractionation. However, the yield is low (10-12%) due to losses during hydrolysis and fractionation. The enzymatic method appears to have had the potential to replace acid hydrolysis for the clinical production of dextran, and such processes were patented in the 1950s. The enzymatic method requires less energy and simpler equipment and results in a more homogeneous product with a yield of 25% to 52%.

Наибольший выход клинического декстрана, 94% общего производства декстрана, был получен при смешанной культуральной ферментации Lipomyces mesenteroides и конститутивного декстраназного мутанта Lipomyces starkeyi в присутствии сахарозы. Простая промышленная ферментация была разработана для производства декстранов регулируемого размера с небольшим индексом полидисперсности (Kim, D., and D.F. Day. 1994. A new process for the production of clinical dextran by mixed-culture fermentation of Lipomyces starkeyi and Leuconostoc mesenteroides. Enzyme Microb. Technol. 16:844-848; Lee, J.M., and P.F. Fox. 1985. Purification and characterization of Paecilomyces lilacinus dextranase. Enzyme Microb. Technol. 7:573-577; US 5,229,277).The highest yield of clinical dextran, 94% of total dextran production, was obtained from the mixed culture fermentation of Lipomyces mesenteroides and the constitutive dextranase mutant Lipomyces starkeyi in the presence of sucrose. A simple industrial fermentation has been developed to produce controlled size dextrans with a low polydispersity index (Kim, D., and D.F. Day. 1994. A new process for the production of clinical dextran by mixed-culture fermentation of Lipomyces starkeyi and Leuconostoc mesenteroides. Enzyme Microb. Technol 16:844-848; Lee, J.M., and P.F. Fox 1985. Purification and characterization of Paecilomyces lilacinus dextranase Enzyme Microb Technol 7:573-577; US 5,229,277).

Зубная пластинка (бляшка), бактериальная пленка, прилипающая к поверхностям зубов, состоит из плотно упакованных бактерий и неклеточного материала. Примерно 20% сухой массы зубного налета - нерастворимые в воде глюканы. Было высказано предположение о деградации и удалении этих глюканов для профилактики заболеваний полости рта, таких как кариес. Декстраназа может ингибировать синтез нерастворимых глюканов (Marotta, М., A. Martino, A. Rosa, Е. Farina, М. Carteni, and М. Rosa. 2002. Degradation of dental plaque glucans and prevention of glucan formation using commercial enzymes. Process Biochem. 38:101-108), а также прилипание стрептококков (Schilling, К. M., and W. H. Bowen. 1992. Glucans synthesized in situ in experimental salivary pellicle function as specific binding sites for Streptococcus mutans. Infect. Immun. 60:284-295).Dental lamina (plaque), a bacterial film that adheres to tooth surfaces, is composed of densely packed bacteria and non-cellular material. Approximately 20% of the dry weight of plaque is water-insoluble glucans. Degradation and removal of these glucans has been suggested to prevent oral diseases such as caries. Dextranase can inhibit the synthesis of insoluble glucans (Marotta, M., A. Martino, A. Rosa, E. Farina, M. Carteni, and M. Rosa. 2002. Degradation of dental plaque glucans and prevention of glucan formation using commercial enzymes. Process Biochem. 38:101-108), as well as streptococcal adherence (Schilling, K. M., and W. H. Bowen. 1992. Glucans synthesized in situ in experimental salivary pellicle function as specific binding sites for Streptococcus mutans. Infect. Immun. 60: 284-295).

Фармакологические свойства декстраназы базируются на ее способности катализировать расщепления связей декстрана, входящего в состав зубного налета. Декстраназа интенсивно (до 94%) расщепляет декстран зубного налета, имеет ярко выраженную антибактериальное действие в отношении кариесогенной микрофлоры (US 6,254,856, US 4,438,093). Известно, что чем выше гигиена полости рта, тем лучше состояние пародонта. Но даже регулярная чистка зубов не избавляет полностью и надолго от зубного налета, тем более что сахар может оставаться в микротрещинах десен. Декстраназа является единственным средством, предупреждающим образование зубного налета и в этом смысле действие препарата можно считать прорывом в области лечения, профилактики кариеса и заболеваний пародонта, и именно это выгодно отличает декстраназу от других предлагаемых на рынке препаратов.The pharmacological properties of dextranase are based on its ability to catalyze the cleavage of dextran bonds, which is part of dental plaque. Dextranase intensively (up to 94%) breaks down plaque dextran, has a pronounced antibacterial effect against cariogenic microflora (US 6,254,856, US 4,438,093). It is known that the higher the oral hygiene, the better the condition of the periodontium. But even regular brushing of teeth does not completely and permanently eliminate plaque, especially since sugar can remain in the microcracks of the gums. Dextranase is the only agent that prevents the formation of plaque and in this sense, the action of the drug can be considered a breakthrough in the field of treatment, prevention of caries and periodontal disease, and this is what distinguishes dextranase from other drugs on the market.

Применение препарата с профилактической целью обеспечивает полное снятие зубного налета. Предотвращает образование камней и кариеса, укрепляет десны, отбеливает зубы, обеспечивает 100% профилактику кариеса у детей (US 4,438,093).The use of the drug for prophylactic purposes ensures the complete removal of plaque. Prevents the formation of stones and caries, strengthens the gums, whitens teeth, provides 100% prevention of caries in children (US 4,438,093).

Для лечения и профилактики образования зубного налета были предложены различные композиции, которые содержат ферменты, гидролизующие или ингибирующие глюканы (WO 01/66570; Schilling, К.М., and W.Н. Bowen. 1992. Glucans synthesized in situ in experimental salivary pellicle function as specific binding sites for Streptococcus mutans. Infect. Immun. 60:284-295; US 6,254,856; US 4,438,093).For the treatment and prevention of plaque formation, various compositions have been proposed that contain enzymes that hydrolyze or inhibit glucans (WO 01/66570; Schilling, K. M., and W. H. Bowen. 1992. Glucans synthesized in situ in experimental salivary pellicle function as specific binding sites for Streptococcus mutans Infect Immun 60:284-295; US 6,254,856; US 4,438,093).

Распространенной причиной порчи сахарной свеклы и сахарного тростника являются инфекции Leuconostoc mesenteroides, особенно во влажных и теплых условиях. L. mesenteroides образуют декстраны (α-(1→6)-α-d-глюканы) и другие продукты распада, включая маннит и D-молочную кислоту, что в случаях средней и тяжелой степени может нарушить нормальный производственный процесс. Заморозки и последующее оттаивание повреждают сахарную свеклу и делают ее уязвимой для заражения микробами, особенно L. mesenteroides, если затем следует теплая погода. Образование высокомолекулярного декстрана оказывает пагубное влияние на кристаллизацию (образование) карбоната кальция в процессе осветления. В результате формируются более мелкие частицы карбоната кальция, которые, увеличивая фильтрационное давление, отрицательно влияют на фильтрование сока 2-й сатурации. Это, в свою очередь, ведет к сокращению объема переработки свеклы. Повышенная вязкость, наблюдаемая при высоких концентрациях декстрана, также может привести к проблемам с кристаллизацией сахара, однако чаще это происходит на производстве с сахарным тростником.Leuconostoc mesenteroides infections are a common cause of spoilage in sugar beet and sugar cane, especially in humid and warm conditions. L. mesenteroides form dextrans (α-(1→6)-α-d-glucans) and other degradation products, including mannitol and D-lactic acid, which in moderate to severe cases can interfere with the normal manufacturing process. Freezing and subsequent thawing damage the sugar beet and leave it vulnerable to microbial infestation, especially L. mesenteroides, if warm weather follows. The formation of high molecular weight dextran has a detrimental effect on the crystallization (formation) of calcium carbonate during the clarification process. As a result, finer particles of calcium carbonate are formed, which, by increasing the filtration pressure, adversely affect the filtration of the juice of the 2nd carbonation. This, in turn, leads to a reduction in beet processing. The increased viscosity seen at high concentrations of dextran can also lead to sugar crystallization problems, but this is more common in sugar cane production.

Декстраны, выделенные из различных продуктов сахарного тростника, имеют очень похожую структуру, 95% α-1,6 связей и 5% разветвления, вероятно, через α-1,3-связи (Khalikova Е. Microbial dextran-hidrolyzing enzymes: fundamentals and application / E. Khalikova, P. Susi, T. Korpela // Microbiology and molecular biology reviews. Jue, 2005, p. 306-325).Dextrans isolated from various sugarcane products have a very similar structure, 95% α-1,6 bonds and 5% branching, probably through α-1,3 bonds (Khalikova E. Microbial dextran-hydrolyzing enzymes: fundamentals and application / E. Khalikova, P. Susi, T. Korpela // Microbiology and molecular biology reviews, Jue, 2005, pp. 306-325).

Коммерческие декстраназы (1→6)-α-глюканогидролазы, EC 3.2.1.11) использовались на свекловичных и тростниковых заводах для расщепления декстрана при помощи гидролиза α-(1→6) связей в случайных эндогенных участках. Декстраназа Р. Lilacinum фирмы Novo (Дания) и декстраназа Hutten DL-2 Chaetomium gracile (Япония), были успешно использованы для гидролиза декстрана загрязненного сахара (Rogalski, J., J. Szczodrak, G. Gl'owiak, M. Pleszczynska, Z. Szczodrak, and A. Wiater. 1998. Purification and immobilization of dextranase. Acta Biotechnol. 18:63-75; Zinchenko, O.N., V.I. Shishlo, О.V. Krivosheeva, and A.G. Lobanok. 1993. Fungal and yeast dextranases: properties and prospects for application in sugar industry. Prikl. Biokh. Mikrobiol. 29:851-855). Декстраназа Hutten DL-2 Chaetomium gracile в жидком виде (56%-ный раствор в глицерине) испытана на Яготинском опытном производстве НПО «Сахар» (Очистка диффузионного сока в сахарном производстве / под ред. Ловкиса З.В. 2013. 232 с.). Декстраназа Chaetomium gracile фирмы Sugazym DX L (Германия) успешно использует в производстве сахара (Абрахам К., Хаген С., Шлюмбах К., Роде А., Флютер Е. Некоторые аспекты применения декстраназы в сахарных растворах. Сахар. - №5. - С. 34-42.). Концентрация фермента 1-5 г/т, время реакции 10-20 минут, оптимум действия - рН 4-8, t - 55-75°С. Эти условия в основном совпадают со свойствам декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342.Commercial dextranases (1→6)-α-glucanohydrolases, EC 3.2.1.11) have been used in beet and cane plants to cleave dextran by hydrolysis of α-(1→6) bonds at random endogenous sites. P. Lilacinum dextranase from Novo (Denmark) and Hutten DL-2 dextranase Chaetomium gracile (Japan) were successfully used for dextran hydrolysis of contaminated sugar (Rogalski, J., J. Szczodrak, G. Gl'owiak, M. Pleszczynska, Z Zinchenko, O. N., V. I. Shishlo, O. V. Krivosheeva, and A. G. Lobanok 1993. Fungal and yeast dextranases: properties and prospects for application in sugar industry Prikl Biokh Mikrobiol 29:851-855). Hutten DL-2 dextranase Chaetomium gracile in liquid form (56% solution in glycerol) was tested at the Yagotinsky pilot plant of NPO Sakhar (Purification of diffusion juice in sugar production / edited by Lovkis Z.V. 2013. 232 p.) . Chaetomium gracile dextranase from Sugazym DX L (Germany) is successfully used in the production of sugar (Abraham K., Hagen S., Schlumbach K., Rode A., Fluther E. Some aspects of the use of dextranase in sugar solutions. Sugar. - No. 5. - pp. 34-42.). The enzyme concentration is 1-5 g/t, the reaction time is 10-20 minutes, the optimum action is pH 4-8, t is 55-75°C. These conditions basically coincide with the properties of Aspergillus insuetus VKMP F-342 dextranase.

Большинство коммерческих декстраназ в США производятся из грибов Chaetomium gracile и Chaetomium erraticum, выпускаемых в жидком виде и признанных безопасными - статус GRAS (Эгглстон Д., Дилкз Э., Блоуэрс М., Уинтерс К. 2017. Успешное применение декстраназы на свеклоперерабатывающих заводах. Сахар. - №3. - С. 30-40).Most commercial dextranases in the US are made from Chaetomium gracile and Chaetomium erraticum, which are available in liquid form and are recognized as safe - GRAS status (Eggleston D., Dilks E., Blowers M., Winters K. 2017. Successful use of dextranase in beet processing plants. Sugar - No. 3. - S. 30-40).

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Предложенное изобретение решает задачу предоставления способа получения препарата декстраназы штамма Aspergillus insuetus ВКМП F - 342, обладающего повышенной активностью, а также применения препарата, полученного указанным способом для профилактики и лечения заболеваний пародонта, в том числе кариеса зубов, гингивитов и пародонтитов; а также для разрушения декстрана диффузионного сока в производстве сахара из сахарной свеклы. Кроме того, изобретение направлено на средства для ухода за полостью рта, использующие препарат.The proposed invention solves the problem of providing a method for obtaining a dextranase preparation of the strain Aspergillus insuetus VKMP F - 342, which has increased activity, as well as the use of a drug obtained by this method for the prevention and treatment of periodontal diseases, including dental caries, gingivitis and periodontitis; as well as for the destruction of dextran diffusion juice in the production of sugar from sugar beets. In addition, the invention is directed to oral care products using the preparation.

Способ получения микробной декстраназыMethod for obtaining microbial dextranase

Известно, что микромицеты являются наиболее распространенным источником внеклеточных эндодекстраназ (ЕС3.2.1.11) и проявляют более высокую активность фермента, чем декстраназы из бактерий и дрожжей.Micromycetes are known to be the most common source of extracellular endodextranases (EC3.2.1.11) and exhibit higher enzyme activity than dextranases from bacteria and yeasts.

Для производства декстраназы использовали штамм - продуцент Aspergillus insuetus ВКМП F - 342, полученный из штамма Aspergillus insuetus Г-116 без применения мутагенов. Штамм Aspergillus insuetus ВКМП F - 342 проверяли на патогенность на двух видах лабораторных животных: крысах и мышах. Вводимые дозы составляли 107 и 108 клеток на одно животное. В результате испытаний гибель и диссеминация паренхиматозных органов у животных отсутствовали.For the production of dextranase, a strain producing Aspergillus insuetus VKMP F - 342, obtained from a strain of Aspergillus insuetus G-116 without the use of mutagens, was used. Aspergillus insuetus strain VKMP F - 342 was tested for pathogenicity in two types of laboratory animals: rats and mice. The doses administered were 10 7 and 10 8 cells per animal. As a result of the tests, the death and dissemination of parenchymal organs in animals were absent.

Схема получения декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342Scheme for obtaining dextranase Aspergillus insuetus VKMP F - 342

Получение ферментного препарата декстраназы вели по следующим этапам:Obtaining the enzyme preparation of dextranase was carried out according to the following steps:

- получение рабочей культуры на скошенном агаре (сусло-агар, среда Чапека);- obtaining a working culture on slant agar (wort agar, Czapek's medium);

- приготовление глубинной посевной культуры в колбах;- preparation of deep sowing culture in flasks;

- приготовление глубинной посевной культуры в ферментере V=10 л;- preparation of deep seed culture in the fermenter V=10 l;

- проведение процесса биосинтеза в ферментерах вместимостью 250 л;- carrying out the process of biosynthesis in fermenters with a capacity of 250 l;

- сепарирование на проточном сепараторе - Сера Z-61;- separation on the flow separator - Sulfur Z-61;

- концентрирование нативного раствора на ультрафильтрационной установке;- concentration of the native solution in the ultrafiltration unit;

- смешивание с маннитом, стерилизующая фильтрация, замораживание;- mixing with mannitol, sterilizing filtration, freezing;

- сублимационное высушивание.- sublimation drying.

Состав питательной среды для культивирования продуцента (г/л):The composition of the nutrient medium for the cultivation of the producer (g/l):

Полиглюкин 5,0Polyglukin 5.0

Дрожжевой автолизат (экстракт) 3,0Yeast autolysate (extract) 3.0

NaNO3 3,0NaNO 3 3.0

КН2РО4 1,0KN 2 RO 4 1.0

KCl 0,5KCl 0.5

MgSO4⋅7H2O 0,5MgSO 4 ⋅ 7H 2 O 0.5

Софэксил-1520 0,1 млSofaxil-1520 0.1 ml

рН=5,0-5,2.pH=5.0-5.2.

Колбы помещают на качалку (190-220 об./мин), выращивание проводят при температуре 29±10 С в течение 48 часов. Объем среды в колбах - 200 мл.The flasks are placed on a shaker (190-220 rpm), the cultivation is carried out at a temperature of 29±10 C for 48 hours. The volume of the medium in flasks is 200 ml.

Двумя колбами засевают посевной ферментер объемом 10 л, рабочий объем 6-7 л.Two flasks are seeded with a seed fermenter with a volume of 10 liters, a working volume of 6-7 liters.

Процесс культивирования ведут при следующем режиме:The cultivation process is carried out in the following mode:

- температура 30±10°С- temperature 30±10°С

- аэрация сжатым воздухом 6 л/мин,- aeration with compressed air 6 l/min,

- перемешивание среды мешалкой 400 об./мин.- mixing of the medium with a stirrer 400 rpm.

Затем 6-7 л посевного материала перемешали в ферментер типа БИОР-025 с рабочим объемом 160 л с вышеуказанном составом питательной среды.Then 6-7 liters of seed material was mixed into a BIOR-025 type fermenter with a working volume of 160 liters with the above nutrient medium composition.

Значения технологических параметров процесса культивирования микромицета: температура, °С 30+10°СValues of technological parameters of the micromycete cultivation process: temperature, °С 30+10°С

рН перемешивание, об/мин 350pH mixing, rpm 350

аэрация, об/об/мин 0,5 первые 10 часов, далееaeration, rpm 0.5 for the first 10 hours, then

1,01.0

продолжительность выращивания продуцента 50-70 часов по значению активности фермента (50-80 ед/мл) при рН выше 8,0.the duration of the cultivation of the producer is 50-70 hours according to the value of the enzyme activity (50-80 units/ml) at a pH above 8.0.

Сепарирование биомассыBiomass separation

Сепарирование биомассы осуществляли на проточном сепараторе Сера Z-61 при скорости вращения ротора 16000 об/мин. Скорость сепарирования подбирали такой, чтобы проба фильтрата на выходе из сепаратора была визуально прозрачной. Скорость подачи культуральной жидкости на сепаратор поддерживали в интервале 30-40 л/час.Separation of biomass was carried out on a flow separator Sera Z-61 at a rotor speed of 16000 rpm. The separation rate was chosen such that the filtrate sample at the outlet of the separator was visually transparent. The rate of supply of the culture fluid to the separator was maintained in the range of 30-40 l/h.

Получают 150-155 л фильтрата культуральной жидкости с активностью 50-80 ед/мл.Receive 150-155 l of the filtrate of the culture fluid with an activity of 50-80 units/ml.

Эти этапы получения декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342 проводились в соответствии с авторскими свидетельствами SU 1756355 и SU 1808873. Схема выделения и очистки декстраназы из культуральной жидкости в свидетельствах не описывается. Указано только, что препарат фермента получают известным способом путем осаждения этиловым спиртом.These stages of obtaining dextranase Aspergillus insuetus VKMP F - 342 were carried out in accordance with the author's certificates SU 1756355 and SU 1808873. The scheme for the isolation and purification of dextranase from the culture fluid is not described in the certificates. It is only indicated that the enzyme preparation is obtained in a known manner by precipitation with ethyl alcohol.

Стадии получения очищенного препарата декстраназыSteps for obtaining a purified dextranase preparation

Ультрафильтрация фильтратаfiltrate ultrafiltration

Концентрирование нативного раствора вели на раствора на ультрафильтрационной установке с модулем АР-3-15 (НПК «Биотест», г. Кириши) с диаметром пор 15 кДа. Перепад давления - 0,18-0,20 мПа.The concentration of the native solution was carried out on the solution using an ultrafiltration unit with an AR-3-15 module (NPK Biotest, Kirishi) with a pore diameter of 15 kDa. Pressure drop - 0.18-0.20 MPa.

Скорость фильтрации - около 10-12 л/час. Конечный объем 7-8 л.The filtration rate is about 10-12 l/hour. The final volume is 7-8 liters.

Выпаривание ведут до активности концентрата 600-800 ед/мл.Evaporation is carried out until the activity of the concentrate is 600-800 units/ml.

Известно, что глубокая очистка ферментов приводит к существенной потере активности препаратов, а также очень дорогостояща. Более того, высокоочищенные белки менее стабильны по сравнению с неочищенными. Поэтому при использовании растворимых ферментов редко пользуются полной очисткой. Тем более что в зависимости от сферы применения требования к чистоте ферментных препаратов различны [Биотехнология / Т.Г. Волова. - Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения Российской Академии наук, 1999. - 252 с.].It is known that deep purification of enzymes leads to a significant loss of drug activity, and is also very expensive. Moreover, highly purified proteins are less stable than unpurified ones. Therefore, when using soluble enzymes, complete purification is rarely used. Moreover, depending on the scope of application, the requirements for the purity of enzyme preparations are different [Biotechnology / T.G. Volova. - Novosibirsk: Publishing House of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, 1999. - 252 p.].

Но, для сохранения стабильности фермента на стадии лиофилизации, как правило, необходимо вводить в нативные растворы вспомогательные ингредиенты, оптимизирующие технические характеристики лекарственных препаратов. Основным условием получения качественного препарата является подбор оптимального соотношения между вспомогательным и основным веществами.But, in order to maintain the stability of the enzyme at the stage of lyophilization, as a rule, it is necessary to introduce auxiliary ingredients into native solutions that optimize the technical characteristics of drugs. The main condition for obtaining a high-quality drug is the selection of the optimal ratio between the auxiliary and the main substances.

Для ферментных и других белковых препаратов в качестве наполнителей используются компоненты, стабилизирующие белковые молекулы по отношению к внешним воздействиям.For enzyme and other protein preparations, components are used as fillers that stabilize protein molecules with respect to external influences.

Изучение гомогенной эндодекстраназы Penicillium fimiculosum 15 показало, что декстраназа является гликопротеином. Фермент содержит остатки маннозы, галактозы и фруктозы в соотношении 6:2:1. Углеводы ковалентно связаны с белковой частью декстраназы и играют важную роль в стабильности фермента.The study of homogeneous endodextranase Penicillium fimiculosum 15 showed that dextranase is a glycoprotein. The enzyme contains residues of mannose, galactose and fructose in a ratio of 6:2:1. Carbohydrates are covalently linked to the protein portion of dextranase and play an important role in the stability of the enzyme.

Получены образцы гомогенной декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342.Samples of homogeneous dextranase Aspergillus insuetus VKMP F - 342 were obtained.

Препараты гомогенной декстраназы характеризуются следующими показателями:Homogeneous dextranase preparations are characterized by the following indicators:

- молекулярная масса 71000±2000;- molecular weight 71000±2000;

- изоэлектрическая точка 4,5±0,05;- isoelectric point 4.5±0.05;

- активность гомогенной декстраназы составляет 1700-2000 ед/мг, содержание белка - 48-50% белка;- the activity of homogeneous dextranase is 1700-2000 units/mg, the protein content is 48-50% protein;

- удельная активность - 900±100 ед/мг белка;- specific activity - 900±100 units/mg protein;

- фермент содержит 6,0±0,5% углеводов, ковалентно связанных через глюкозамин с белком, которые играют важную роль в стабильности фермента. Углеводный компонент содержит остатки маннозы, галактозы и фруктозы в соотношении 6:2:1. Очевидно, что большинство эндодекстраназ являются гликопротеинами. Данные исследования показывают, что наиболее перспективными наполнителями-стабилизаторами являются низкомолекулярные сахара или близкие к ним вспомогательные вещества. Среди известных наполнителей, разрешенных при получении лекарственных средств, используют маннит (маннитол) (Хабриев Р.У., Камаев Н О., Данилова Т.И., Кахоян Е.Г. Разработка технологии получения микробной гиалуронидазы и лекарственного средства на ее основе. - Вопросы биол. медиц. и фарм. Химии. - №1. - 2016. - С. 4-11). Этот сахароспирт очень близок по своей структуре к основному компоненту углеводной части молекулы декстраназы - маннозе. Экспериментально доказано, что стабилизатором эндодекстраназы Penicillium fimiculosum 15 являются продукты глубокого гидролиза декстрана, содержащие в основном моносахарид и дисахарид - глюкозу и изомальтозу соответственно. Маннит является стабилизатором декстраназы, сохраняя нативную структуру молекулы фермента при высушивании и дальнейшем использовании.- the enzyme contains 6.0 ± 0.5% carbohydrates covalently linked through glucosamine to the protein, which play an important role in the stability of the enzyme. The carbohydrate component contains residues of mannose, galactose and fructose in a ratio of 6:2:1. Obviously, most endodextranases are glycoproteins. These studies show that the most promising stabilizing fillers are low molecular weight sugars or auxiliary substances close to them. Among the known excipients allowed in the preparation of medicines, mannitol (mannitol) is used (Khabriev R.U., Kamaev N.O., Danilova T.I., Kakhoyan E.G. Development of a technology for obtaining microbial hyaluronidase and a drug based on it. - Issues of Biomedical and Pharmaceutical Chemistry - No. 1. - 2016. - P. 4-11). This sugar alcohol is very close in its structure to the main component of the carbohydrate part of the dextranase molecule - mannose. It has been experimentally proven that the stabilizer of Penicillium fimiculosum 15 endodextranase is the products of deep hydrolysis of dextran, containing mainly monosaccharide and disaccharide - glucose and isomaltose, respectively. Mannitol is a dextranase stabilizer, preserving the native structure of the enzyme molecule during drying and further use.

Стерилизующая фильтрация концентратаSterilizing filtration of concentrate

В концентрат добавляют маннит из расчета 1 г на 8000-12000 ед активности. Стерилизующую фильтрацию концентрата проводят на микрофильтрационной установке с микрофильтрационным модулем Microza серии Р (фирма Pall) Площадь фильтрации 0,2 м2, диаметр пор - 0,1 мкм. В установке используют центробежный насос при давлении 2,8 бар.Mannitol is added to the concentrate at the rate of 1 g per 8000-12000 units of activity. Sterilizing filtration of the concentrate is carried out on a microfiltration unit with a microfiltration module Microza of the P series (Pall). The filtration area is 0.2 m2, the pore diameter is 0.1 μm. The plant uses a centrifugal pump at a pressure of 2.8 bar.

Фильтрат с модуля принимают в стерильную емкость и передают в бокс для розлива в кюветы. Полупродукт разливают в поддоны (по 400-500 см3) и замораживают при температуре минус 40°С в течение суток. Остатки концентрата из модуля передают на утилизацию.The filtrate from the module is taken into a sterile container and transferred to a box for filling into cuvettes. The intermediate product is poured into pallets (400-500 cm 3 ) and frozen at a temperature of minus 40°C during the day. The rest of the concentrate from the module is transferred for disposal.

Сушка ферментного препарата.Drying of the enzyme preparation.

Сублимационную сушку ферментного препарата производят в вакуум-сушильных аппаратах марки КС-30. Кюветы с вмороженными в контрольные образцы датчиками устанавливают в середине полок. Все датчики подключают к регистрирующему устройству с самописцами, установленными на пульте управления.Sublimation drying of the enzyme preparation is carried out in vacuum dryers of the KS-30 brand. Cuvettes with sensors frozen into the control samples are installed in the middle of the shelves. All sensors are connected to a recording device with recorders installed on the control panel.

После загрузки закрывают дверь камеры, открывают вентиль на вакуумной линии. По достижении рабочего вакуума, не превышающего 100 микрон, препарат должен быть охлажден до минус (30-35)°С и выдержан при указанной температуре в течение 45-60 минут.After loading, close the chamber door, open the valve on the vacuum line. Upon reaching a working vacuum not exceeding 100 microns, the preparation must be cooled to minus (30-35)°C and maintained at the specified temperature for 45-60 minutes.

При высушивании препарата регулируют температуру на полках таким образом, чтобы достигнуть 0°С в препарате к 16-18 часу сушки, затем, повышая постепенно температуру, достигнуть (27-30)°С в материале, при которой выдерживают препарат в течение 8-10 часов.When drying the drug, regulate the temperature on the shelves in such a way as to reach 0°C in the drug by 16-18 hours of drying, then, gradually increasing the temperature, reach (27-30)°C in the material, at which the drug is kept for 8-10 hours.

Длительность процесса высушивания составляет 24-28 часов. Стандартный препарат декстраназы имеет активность 50,0±5,0 ед/мг.The duration of the drying process is 24-28 hours. The standard dextranase preparation has an activity of 50.0±5.0 units/mg.

За единицу декстраназной активности принято такое количество декстраназы. которое, действуя в течение 1 мин на 0,15% раствор полиглюкина при температуре 37°С и рН 4,9-5,1, образует олигосахариды в количестве, эквивалентном 1 мкмолю глюкозы.This amount of dextranase is taken as a unit of dextranase activity. which, acting for 1 min on a 0.15% solution of polyglucin at a temperature of 37°C and pH 4.9-5.1, forms oligosaccharides in an amount equivalent to 1 μmol of glucose.

В 3 пробирки (2 опытные и 1 контрольную) вносят по 0.75 мл 0.15% раствора полиглюкина и термостатируют при 37°С в течение 1-2 мин. В контрольную пробирку вносят 0,25 мл воды, а в 2 опытные - по 0.25 мл 0,0004% раствора препарата с концентрацией 0,004 мг/мл. Смеси инкубируют 10 мин (по секундомеру) в термостате при 37°С, после чего в каждую пробирку прибавляют по 3 мл 0,06% раствора калия феррицианида. Пробирки помещают в кипящую водяную баню (по секундомеру) на 10 мин, затем охлаждают в бане с холодной водой. Оптическую плотность испытуемых и контрольного растворов измеряют на фотоэлектрическом колориметре при длине волны 400 нм в кювете с толщиной сдоя 5 мм. В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду.0.75 ml of a 0.15% solution of polyglucin is added to 3 test tubes (2 experimental and 1 control) and thermostated at 37°C for 1-2 minutes. 0.25 ml of water is added to the control tube, and 0.25 ml of a 0.0004% solution of the drug with a concentration of 0.004 mg / ml is added to 2 experimental tubes. The mixtures are incubated for 10 minutes (with a stopwatch) in a thermostat at 37°C, after which 3 ml of a 0.06% solution of potassium ferricyanide are added to each test tube. The test tubes are placed in a boiling water bath (according to the stopwatch) for 10 min, then cooled in a bath of cold water. The optical density of the test and control solutions is measured on a photoelectric colorimeter at a wavelength of 400 nm in a cuvette with a thickness of 5 mm. Distilled water is used as a reference solution.

Декстраназную активность (А) выражают числом единиц на I мг препарата (ед/мг) и вычисляют по формуле:Dextranase activity (A) is expressed as the number of units per I mg of the drug (u/mg) and is calculated by the formula:

Figure 00000001
Figure 00000001

где Ух - содержание глюкозы в опытной пробе, определяемое по калибровочному графику, построенному но D-глюкозе, в микрограммах:where Yx is the glucose content in the test sample, determined from the calibration graph built for D-glucose, in micrograms:

Гк - содержание глюкозы в контрольной пробе, определяемое по калибровочному графику, построенному по D-глюкозе, в микрограммах;Gk - glucose content in the control sample, determined by the calibration graph, built on D-glucose, in micrograms;

- коэффициент разбавления реакционной смеси,- dilution factor of the reaction mixture,

ISO - молекулярная масса глюкозы,ISO - molecular weight of glucose,

10 - время гидролиза, в минутах;10 - hydrolysis time, in minutes;

m - концентрация раствора препарата декстраназы, мг/мл.m is the concentration of the solution of the dextranase preparation, mg/ml.

Декстраназная активность 1 мг препарата должна быть 50 ед ± 5 ед.Dextranase activity of 1 mg of the drug should be 50 units ± 5 units.

Построение калибровочного графика. Стандартные растворы Д-глюкозы готовят разбавлением исходного раствора водой согласно таблице 1. Для приготовления исходного раствора точно 0,075 г Д-глюкозы безводной (ГОСТ 6038-79) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 500 мл и доводят объем раствора до метки.Construction of a calibration graph. Standard solutions of D-glucose are prepared by diluting the stock solution with water according to Table 1. To prepare the stock solution, exactly 0.075 g of anhydrous D-glucose (GOST 6038-79) is dissolved in water in a 500 ml volumetric flask and the volume of the solution is adjusted to the mark.

Приготовление стандартных растворов глюкозыPreparation of standard glucose solutions

Figure 00000002
Figure 00000002

В пробирки со стандартными растворами прибавляют по 3 мл 0,06% раствора калия феррицианида, помешают на 10 мин (по секундомеру) в кипящую водяную баню, затем охлаждают в бане с холодной водой. Измеряют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре при длине волны 400 нм ± 2 нм в кювете с толщиной слоя 5 мм.Add 3 ml of a 0.06% solution of potassium ferricyanide to test tubes with standard solutions, place in a boiling water bath for 10 minutes (according to a stopwatch), then cool in a bath of cold water. Measure the optical density of solutions on a photoelectric colorimeter at a wavelength of 400 nm ± 2 nm in a cuvette with a layer thickness of 5 mm.

В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду.Distilled water is used as a reference solution.

Калибровочный график строят, откладывая по оси абсцисс - содержание Д-глюкозы в микрограммах в 1 мл стандартных растворов, а но оси ординат-соответствуюшие им оптические плотности.A calibration graph is built by plotting along the abscissa axis - the content of D-glucose in micrograms in 1 ml of standard solutions, and along the ordinate axis - the optical densities corresponding to them.

Полученная зависимость оптической плотности от концентрации является линейной (коэффициент корреляции /у/=0,998). По калибровочному графику находят значения Ух и Ук, соответствующие оптическим плотностям опытного и контрольного раствора, измерянным при длине волны 400 нм ± 2 нм. и подставляют эти значения в формулу расчета декстраназной активности.The obtained dependence of optical density on concentration is linear (correlation coefficient /y/=0.998). According to the calibration graph, the values of Vx and Vk are found, corresponding to the optical densities of the experimental and control solution, measured at a wavelength of 400 nm ± 2 nm. and substitute these values into the formula for calculating dextranase activity.

В таблице 1 приведена характеристика предлагаемого способа получения очищенной декстраназы.Table 1 shows the characteristics of the proposed method for obtaining purified dextranase.

Figure 00000003
Figure 00000003

В таблице 2 представлена схема производства очищенной декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342 по стадиямTable 2 shows the scheme for the production of purified dextranase Aspergillus insuetus VKMP F - 342 by stages

Figure 00000004
Figure 00000004

Figure 00000005
Figure 00000005

Также препарат исследовался в стоматологической практике и при переработке сахарной свеклы, о чем подробнее ниже.Also, the drug was studied in dental practice and in the processing of sugar beet, which is discussed in more detail below.

Декстраназа может применяться при переработке сахарной свеклы, пораженной слизистым бактериозом, а также для переработки сахара-сырца с целью повышения выработки и качества белого сахара, экономии затрат на сырье (сахарная свекла); увеличения срока службы оборудования и снижения износа фильтров.Dextranase can be used in the processing of sugar beets affected by mucous bacteriosis, as well as for the processing of raw sugar in order to increase the production and quality of white sugar, save raw material costs (sugar beet); increase equipment life and reduce filter wear.

Важной проблемой для свеклосахарного производства является большой объем сырья (корнеплодов), пораженного слизистым бактериозом.An important problem for sugar beet production is the large volume of raw materials (root crops) affected by mucous bacteriosis.

В результате жизнедеятельности микроорганизмов (бактерий) образуются высокомолекулярные полисахариды - декстраны, которые повышают вязкость сахарных растворов, значительно снижая их технологические качества. Удалить декстран из растворов сахара-песка фильтрованием или химическими добавками практически невозможно. Являясь мощным биокатализатором декстраназа разрывает молекулы декстрана на более короткие цепочки, затем появляются олигосахариды и конечный продукт - глюкоза. При этом вязкость сиропа снижается до значения соответствующего вязкости чистого сахарного раствора, исчезает слизь и муть, восстанавливается фильтрация.As a result of the vital activity of microorganisms (bacteria), high-molecular polysaccharides - dextrans are formed, which increase the viscosity of sugar solutions, significantly reducing their technological qualities. It is almost impossible to remove dextran from granulated sugar solutions by filtration or chemical additives. Being a powerful biocatalyst, dextranase breaks dextran molecules into shorter chains, then oligosaccharides appear and the end product is glucose. At the same time, the viscosity of the syrup is reduced to a value corresponding to the viscosity of a pure sugar solution, mucus and turbidity disappear, and filtration is restored.

Декстраназу используют на первых стадиях технологического процесса, после получения сока из диффузионной установки.Dextranase is used in the first stages of the technological process, after obtaining juice from a diffusion plant.

Расход препарата составляет 2,5-5,0 г на 1 кубический метр сока при температуре 45-50°С, продолжительность действия 5-10 минут. Использование декстраназы при переработке сырца осуществляется во время первой фазы растворения при температуре 45-50°С. Продолжительность действия 10-15 минут.The drug consumption is 2.5-5.0 g per 1 cubic meter of juice at a temperature of 45-50°C, the duration of action is 5-10 minutes. The use of dextranase in the processing of raw material is carried out during the first phase of dissolution at a temperature of 45-50°C. The duration of action is 10-15 minutes.

В результате использования препарата скорость фильтрации соков увеличивается в 2,5-3 раза. Ускорение кристаллизации сахарозы повышается в 1,5-3 раза. Экономия сырья до 20% от общего объема за счет возможности переработки ослизненной свеклы. Дополнительная выработка сахара из свеклы увеличивается на 9-11% от общего объема выхода. Сложение активной прибыли от продажи дополнительного объема сахара и экономии затрат на сырье и замене фильтров увеличивает рентабельность.As a result of using the drug, the juice filtration rate increases by 2.5-3 times. The acceleration of crystallization of sucrose increases by 1.5-3 times. Saving raw materials up to 20% of the total volume due to the possibility of processing mucilaginous beets. Additional production of sugar from beets increases by 9-11% of the total output. Adding the active profit from the sale of additional volume of sugar and the cost savings on raw materials and filter replacement increases profitability.

Присутствие в сахарной свекле даже небольших количеств декстрана осложняет технологический процесс сахарного, а затем и рафинадного производства. Среди технологических процессов сахарного производства значительное место занимает процесс фильтрования. При большом содержании полисахаридов в сахарной свекле и диффузионном соке наблюдаются затруднения при фильтровании соков I и II сатурации. Затруднения при фильтровании увеличиваются, когда на переработку поступает подмороженная и оттаявшая свекла длительного срока хранения. Из свеклы такого качества в диффузионный сок переходит высокомолекулярный декстран, который препятствует образованию крупных агрегатов СаСО3, а на фильтровальной поверхности оставляет слизистый осадок. Разрушить декстран в соках можно с помощью энзима декстраназы.The presence of even small amounts of dextran in sugar beet complicates the technological process of sugar and then refinery production. Among the technological processes of sugar production, a significant place is occupied by the filtration process. With a high content of polysaccharides in sugar beet and diffusion juice, difficulties are observed in filtering juices of I and II saturation. Difficulties in filtering increase when frozen and thawed beets with a long shelf life are sent for processing. High molecular weight dextran passes from beets of this quality into diffusion juice, which prevents the formation of large CaCO 3 aggregates, and leaves a slimy residue on the filter surface. Destruction of dextran in juices can be done with the enzyme dextranase.

При известково-углекислотной очистке диффузионного сока удаляется 20-25% декстрана, остальное количество переходит в очищенный сок. Декстран, обладая положительным зарядом, не сорбируется на карбонате кальция, лишь незначительная его часть образует с частицами последнего желатинозный, плохо фильтруемый осадок. При этом в присутствии декстрана скорость образования зародышей карбоната кальция значительно превышает скорость их роста, в результате последний выпадает в виде мелкозернистого, слабоагломерированного осадка, затрудняющего фильтрование. Так, при переработке замороженной и оттаявшей сахарной свеклы, хранившейся в течение 7 сут., полученный из нее сок II сатурации содержал кристаллы осадка СаСО3 размером 1-3 мкм, в то время как из свеклы, не содержащей декстран - 5.7 мкм. Замедлению процесса фильтрования способствует адсорбция декстрана поверхностью фильтровальной ткани. В основном фильтрование замедляют высокомолекулярные фракции декстрана с молекулярной массой 105-107, а фракции с массой 104 и ниже практически не влияют на ее скорость.With lime-carbon dioxide purification of diffusion juice, 20-25% of dextran is removed, the rest goes into purified juice. Dextran, having a positive charge, is not sorbed on calcium carbonate, only a small part of it forms a gelatinous, poorly filtered precipitate with particles of the latter. Moreover, in the presence of dextran, the rate of formation of calcium carbonate nuclei significantly exceeds the rate of their growth; as a result, the latter precipitates in the form of a fine-grained, slightly agglomerated precipitate, which makes filtering difficult. Thus, during the processing of frozen and thawed sugar beets stored for 7 days, the second saturation juice obtained from it contained CaCO 3 precipitate crystals 1–3 µm in size, while from beets that did not contain dextran - 5.7 µm. The adsorption of dextran on the surface of the filter cloth contributes to the slowing down of the filtration process. Basically, filtration is slowed down by high-molecular fractions of dextran with a molecular weight of 10 5 -10 7 , and fractions with a mass of 10 4 and below practically do not affect its speed.

Далее по технологическому потоку декстран приводит к замедленной кристаллизации сахарозы и центрифугированию утфелей, не способствует истощению мелассы, ухудшает качество белого сахара. При кристаллизации сахарозы из сахарных растворов, содержащих декстран, происходит деформация кристаллов сахара, образуются кристаллы удлиненной, иглообразной формы. При кристаллизации сахарозы выпариванием кристаллами утфеля I ступени кристаллизации удерживается от 18 до 25% декстрана к исходному содержанию его в растворе. Такой утфель плохо центрифугируется, ухудшаются условия отделения оттеков, возрастают потери сахара в мелассе.Further downstream, dextran leads to delayed crystallization of sucrose and centrifugation of massecuites, does not contribute to the depletion of molasses, and degrades the quality of white sugar. During the crystallization of sucrose from sugar solutions containing dextran, the sugar crystals are deformed, elongated, needle-shaped crystals are formed. During the crystallization of sucrose by evaporation, the massecuite crystals of the first stage of crystallization retain from 18 to 25% of dextran to its initial content in solution. Such a massecuite is poorly centrifuged, the conditions for separating edema worsen, and the loss of sugar in molasses increases.

Перекристаллизацией сахара удаляется примерно 80% декстрана. Кристаллический сахар может содержать декстрана до 100 мг/кг, а в мелассе иногда содержится несколько тысяч мг/кг.Recrystallization of the sugar removes approximately 80% of the dextran. Crystalline sugar can contain up to 100 mg/kg of dextran, and molasses sometimes contains several thousand mg/kg.

Наличие декстрана в белом сахаре, используемом для производства безалкогольных и ликероводочных напитков, кондитерских изделий, отрицательно влияет как на качество продукта, так и на процессы его производства. Так, наличие декстрана в сахаре вызывает ослизнение напитков, кваса, квасного сусла; затрудняется или полностью останавливается процесс фильтрования сахарного сиропа, забиваются трубопроводы. Иногда в трубопроводе может образовываться слизистая пробка, которая полностью перекрывает поток. Из-за разложения сахарозы снижается количество сахара, необходимого по рецептуре, уменьшается выход продукта. Декстран устойчив к воздействию щелочей, трудно гидролизуется. Фермент декстраназа расщепляет декстран до изомальтозы и высших изомальтосахаридов. При получении декстраназы используются различные штаммы плесневых грибов Penicillium и Chaetomium, которые выращивают на питательной среде, содержащей декстран, азотное, фосфорное и минеральное питание. Присутствие в питательной среде декстрана индуцирует образование в плесенях фермента декстраназы. Полный гидролиз декстрана обеспечивается при следующих условиях: введение декстраназы в количестве 0,04%, обеспечение pH20 5,5 и температуры 50°С в течение 35 мин.The presence of dextran in white sugar used for the production of non-alcoholic and alcoholic beverages, confectionery adversely affects both the quality of the product and the processes of its production. So, the presence of dextran in sugar causes mucilage of drinks, kvass, kvass wort; the process of filtering sugar syrup is difficult or completely stops, pipelines are clogged. Sometimes a mucous plug can form in the pipeline, which completely blocks the flow. Due to the decomposition of sucrose, the amount of sugar required by the recipe decreases, and the yield of the product decreases. Dextran is resistant to alkalis, it is difficult to hydrolyze. The enzyme dextranase breaks down dextran to isomaltose and higher isomaltosaccharides. When obtaining dextranase, various strains of mold fungi Penicillium and Chaetomium are used, which are grown on a nutrient medium containing dextran, nitrogen, phosphorus and mineral nutrition. The presence of dextran in the nutrient medium induces the formation of the enzyme dextranase in molds. Complete hydrolysis of dextran is ensured under the following conditions: introduction of dextranase in an amount of 0.04%, ensuring pH 20 5.5 and temperature 50°C for 35 minutes.

Влияние температуры и рН сахарных растворов на ферментативное разрушение декстранаEffect of temperature and pH of sugar solutions on the enzymatic degradation of dextran

Влияние температуры на эффективность действия ферментного препарата декстраназы изучали путем определения скорости уменьшения вязкости диффузионного сока, содержащего декстран и имеющего СВ=10%; рН=5,5 при изотермических условиях в диапазоне температур 30-70°С. В диффузионный сок добавляли 0,5% декстрана с молекулярной массой 5×105 Да, нагревали до требуемой температуры, вводили декстраназу в количестве 1 мг/дм3, термостатировали в течение 5-40 мин при заданной температуре непосредственно в трубке вискозиметра и определяли вязкость. Результаты определения представлены в таблице.The influence of temperature on the effectiveness of the action of the dextranase enzyme preparation was studied by determining the rate of decrease in the viscosity of a diffusion juice containing dextran and having a CB=10%; pH=5.5 under isothermal conditions in the temperature range of 30-70°C. 0.5% dextran with a molecular weight of 5×10 5 Da was added to the diffusion juice, heated to the required temperature, dextranase was introduced in an amount of 1 mg/dm 3 , thermostated for 5-40 min at a given temperature directly in the viscometer tube and the viscosity was determined . The results of the determination are presented in the table.

Figure 00000006
Figure 00000006

Результаты исследований свидетельствуют, что исследуемый препарат декстраназы является относительно нетермоустойчивым ферментным препаратом, активность которого проявляется в диапазоне температур 30-50°С, и полностью инактивируется при температуре выше 60°С.The research results indicate that the studied dextranase preparation is a relatively heat-resistant enzyme preparation, the activity of which is manifested in the temperature range of 30-50°C, and is completely inactivated at temperatures above 60°C.

Влияние рН на активность декстраназы также изучали по темпу падения динамической вязкости при термостатировании непосредственно в трубке вискозиметра в течение 30 мин при температуре 40°С в диффузионном соке (СВ=12%) и в растворе сахара (СВ=10%). Диапазон значений рН был предварительно установлен в пределах 4,3-7,0 для диффузионного сока и 3,0-8,0 - для растворов сахара с помощью цитратного буфера. Концентрация добавленного декстрана составляла 0,4%, а доза декстраназы - 0,4 мг/дм3. Результаты определения представлены в таблицахThe effect of pH on dextranase activity was also studied by the rate of decrease in dynamic viscosity during thermostating directly in the viscometer tube for 30 min at a temperature of 40°C in diffusion juice (CB=12%) and in a sugar solution (CB=10%). The pH range was pre-set within 4.3-7.0 for diffusion juice and 3.0-8.0 for sugar solutions using citrate buffer. The concentration of added dextran was 0.4% and the dose of dextranase was 0.4 mg/dm 3 . The results of the determination are presented in tables

Figure 00000007
Figure 00000007

Figure 00000008
Figure 00000008

Судя по темпу падения вязкости, как в диффузионном соке, так и в растворах сахара, наибольшая активность декстраназы проявляется в районе рН=4. При рН более и менее 4 темп снижения вязкости замедлялся и был наименьшим при 3 < рН < 7, что следует учитывать при определении дозы препарата, необходимой для разрушения декстрана.Judging by the rate of decrease in viscosity, both in diffusion juice and in sugar solutions, the highest activity of dextranase is manifested in the region of pH=4. At pH more and less than 4, the rate of viscosity decrease slowed down and was the smallest at 3 < pH < 7, which should be taken into account when determining the dose of the drug required to destroy dextran.

Известно, что чем выше содержание декстрана в сахарном растворе, тем больше доза, необходимая для его разрушения до заданной концентрации. Изучалось влияние содержания декстрана в диффузионном соке в диапазоне (500-5000 мг/дм3), продолжительности ферментной обработки (5 и 15 мин) и рН (5,1-6,6) на остаточные концентрации декстрана при дозе декстраназы, вводимой в диффузионный сок, в пределах 0,1-8,0 мг/дм3. В опытах добавляли декстран в диффузионный сок; затем после термостатирования при 45°С проводили определение остаточного содержания декстрана с помощью турбидиметрического метода. Результаты в Таблице ниже.It is known that the higher the content of dextran in a sugar solution, the greater the dose required for its destruction to a given concentration. The influence of dextran content in diffusion juice in the range (500-5000 mg/dm 3 ), the duration of enzyme treatment (5 and 15 min) and pH (5.1-6.6) on the residual concentrations of dextran at a dose of dextranase introduced into the diffusion juice was studied. juice, in the range of 0.1-8.0 mg / dm 3 . In the experiments, dextran was added to the diffusion juice; then, after thermostating at 45°C, the residual content of dextran was determined using the turbidimetric method. The results are in the table below.

Figure 00000009
Figure 00000009

Как видно из полученных данных; расход ферментного препарата значительно возрастает при увеличении исходного содержания декстрана в диффузионном соке; уменьшении длительности термостатирования и повышении рН.As can be seen from the data obtained; the consumption of the enzyme preparation increases significantly with an increase in the initial content of dextran in the diffusion juice; reducing the duration of thermostating and increasing pH.

На основании полученных данных; исходя из того; что остаточное количество декстрана в диффузионном соке не должно превышать 100 мг/дм3; нами были рассчитаны ориентировочные дозы изучаемого препарата, которые необходимо ввести в диффузионный сок содержащий декстран (таблица 6).Based on the received data; assuming; that the residual amount of dextran in the diffusion juice should not exceed 100 mg/dm 3 ; we calculated the approximate doses of the studied drug, which must be introduced into the diffusion juice containing dextran (table 6).

Figure 00000010
Figure 00000010

При содержании декстрана в диффузионном соке 500 мг/дм3 и длительности обработки 15 минут расход ферментного препарата составил 0,2-0,6 мг/дм3; при возрастании содержания декстрана до 2000-5000 мг/дм3 доза декстраназы увеличивается до 2,0-4,0 мг/дм3. Таким образом, расход исследуемого препарата оказался в 5-15 раз меньше, чем известных препаратов декстраназы других фирм, что свидетельствует о его высокой активности.When the content of dextran in the diffusion juice is 500 mg/DM 3 and the duration of treatment is 15 minutes, the consumption of the enzyme preparation was 0.2-0.6 mg/DM 3 ; with an increase in the content of dextran to 2000-5000 mg/DM 3 the dose of dextranase increases to 2.0-4.0 mg/DM 3 . Thus, the consumption of the studied drug turned out to be 5-15 times less than the known dextranase preparations from other companies, which indicates its high activity.

Указанные дозы являются ориентировочными, поскольку зависят от многих факторов, в том числе от длительности ферментативной обработки, температуры, рН, химического состава диффузионного сока и других факторов, влияющих на ход ферментного разложения декстрана.The indicated doses are indicative, since they depend on many factors, including the duration of the enzymatic treatment, temperature, pH, the chemical composition of the diffusion juice and other factors that affect the course of the enzymatic decomposition of dextran.

Для того, чтобы проверить эффективность действия декстраназы в диффузионном соке, максимально приближенному к производственному, в лаборатории получали диффузионный сок из здоровой сахарной свеклы и из свеклы, инфицированной бактериями Leuconostoc - продуцентами декстрана. Содержание декстрана в диффузионном соке из пораженной бактериями свеклы составило 6000 мг/дм3. Далее готовили пробы диффузионного сока с содержанием декстрана от 600 до 6000 мг/дм3 и рН 4,5-5,0 путем смешивания в различных пропорциях сока здоровой свеклы и сока пораженной свеклы. Пробы подвергли ферментной обработке при дозе декстраназы 0,2-8,0 мг/дм3 в течение 15 мин при температуре 45°С, после чего в них определили остаточное количество декстрана. Результаты исследований представлены в таблице 7.In order to test the effectiveness of dextranase in diffusion juice, as close as possible to production, diffusion juice was obtained in the laboratory from healthy sugar beets and beets infected with Leuconostoc bacteria - dextran producers. The content of dextran in the diffusion juice from beetroot affected by bacteria was 6000 mg/dm 3 . Next, samples of diffusion juice were prepared with a dextran content of 600 to 6000 mg/dm 3 and a pH of 4.5-5.0 by mixing healthy beet juice and diseased beet juice in various proportions. The samples were subjected to enzymatic treatment at a dose of dextranase 0.2-8.0 mg/DM 3 for 15 min at a temperature of 45°C, after which they determined the residual amount of dextran. The research results are presented in table 7.

Figure 00000011
Figure 00000011

Из данных, представленных в таблице, видно, что наблюдаемые закономерности аналогичны закономерностям, полученным при разрушении декстрана с молекулярной массой 5×105 Да при его добавке в диффузионный сок (таблица 5).From the data presented in the table, it can be seen that the observed patterns are similar to those obtained during the destruction of dextran with a molecular weight of 5×10 5 Da when it is added to the diffusion juice (table 5).

Такие же закономерности наблюдаются и при определении ориентировочных доз расхода ферментного препарата, рассчитанного на основании данных, полученных для инфицированного диффузионного сока (таблица 8).The same patterns are observed when determining the approximate doses of the consumption of the enzyme preparation, calculated on the basis of the data obtained for the infected diffusion juice (table 8).

Figure 00000012
Figure 00000012

При содержании декстрана в диффузионном соке 500-1000 мг/дм3 расход ферментного препарата декстраназы был в тех же пределах 0,2-0,6 мг/дм3, что в опытах с диффузионным соком, в который добавляли декстран с молекулярной массой 5×105 Да (таблица 6). При более высоком содержании декстрана в диффузионном соке (более 2000 мг/дм3) расход ферментного препарата для инфицированного диффузионного сока был выше, что, по- видимому, объясняется изменением химического состава инфицированного сока и ухудшением условий для ферментного разрушения декстрана.When the content of dextran in the diffusion juice was 500-1000 mg/ dm 10 5 Yes (Table 6). With a higher content of dextran in the diffusion juice (more than 2000 mg/dm 3 ), the consumption of the enzyme preparation for the infected diffusion juice was higher, which, apparently, is due to a change in the chemical composition of the infected juice and worsening conditions for the enzymatic destruction of dextran.

Также было исследовано влияние препарата на заболевания полости ртаThe effect of the drug on diseases of the oral cavity was also investigated.

Фармакологические свойства декстраназы основаны на ее способности катализировать расщепление связей декстрана, входящего в состав зубного налета. Декстраназа интенсивно (до 94%) расщепляет декстран зубного налета, обладает ярко выраженным антибактериальным действием в отношении кариесогенной микрофлоры, а также высоким антикариесным эффектом. Известно, что чем выше гигиена ротовой полости, тем лучше состояние парадонта. Но даже регулярная чистка зубов не избавляет полностью и надолго от зубного налета, тем более что сахара остаются и в микротрещинах десен. Именно отсутствие зубного налета просто не дает образовываться кариесу. Декстраназа является единственным средством, подавляющим образование зубного налета Применение препарата в профилактических целях обеспечивает полное снятие зубного налета. Предотвращает образование камней и кариеса, укрепляет десны, отбеливает зубы, дает 100% профилактику кариеса у детей.The pharmacological properties of dextranase are based on its ability to catalyze the cleavage of dextran bonds, which is part of dental plaque. Dextranase intensively (up to 94%) breaks down plaque dextran, has a pronounced antibacterial effect against cariogenic microflora, as well as a high anti-caries effect. It is known that the higher the oral hygiene, the better the periodontal condition. But even regular brushing of teeth does not completely and permanently eliminate plaque, especially since sugars remain in the microcracks of the gums. It is the absence of plaque that simply prevents caries from forming. Dextranase is the only agent that suppresses the formation of plaque. The use of the drug for prophylactic purposes ensures the complete removal of plaque. Prevents the formation of stones and caries, strengthens the gums, whitens teeth, provides 100% prevention of caries in children.

При заболеваниях парадонта позволяет в кратчайшие сроки прекратить кровоточивость десен, остановить воспалительный процесс, закрыть «карманы», восстановить парадонт вокруг шейки зубов и прекратить шатание и выпадение зубов, отбелить зубы и избавить от неприятного запаха изо ртаWith periodontal diseases, it allows you to quickly stop bleeding gums, stop the inflammatory process, close "pockets", restore periodontium around the neck of the teeth and stop loosening and falling out of teeth, whiten teeth and get rid of bad breath

Как известно, ведущим этиологическим и патогенетическим фактором развития кариеса зубов и гингивита является образование зубного налета, состоящего главным образом из микроорганизмов, белков и полисахаридов, в частности декстранов, обеспечивающих адгезию зубного налета к поверхности зуба с последующим разрушением эмали.As you know, the leading etiological and pathogenetic factor in the development of dental caries and gingivitis is the formation of plaque, which consists mainly of microorganisms, proteins and polysaccharides, in particular dextrans, which ensure adhesion of plaque to the tooth surface with subsequent destruction of enamel.

При экспериментальном изучении субстанции и лекарственной формы декстраназы (таблетки, содержащие 0,006 г - 30 ед.) в опытах in vitro in vivo на экспериментальных моделях установлено, что препарат интенсивно гидролизует декстран зубного налета (до 94%), обладает выраженным антибактериальным действием в отношении кариесов генной микрофлоры. На основании выявленного в эксперименте воздействия препарата на зубной налет, он был рекомендован разработчиками к его клиническому изучению в стоматологической практике.In an experimental study of the substance and dosage form of dextranase (tablets containing 0.006 g - 30 units) in experiments in vitro in vivo on experimental models, it was found that the drug intensively hydrolyzes plaque dextran (up to 94%), has a pronounced antibacterial effect against caries genetic microflora. Based on the effect of the drug on plaque revealed in the experiment, it was recommended by the developers for its clinical study in dental practice.

Клиническое изучение препарат «Декстраназа» проходил в ЦНИИ стоматологии в отделении терапевтической стоматологии (действующим началом препарата «Декстраназа» является декстраназа).A clinical study of the drug "Dextranase" was held at the Central Research Institute of Dentistry in the Department of Therapeutic Dentistry (the active principle of the drug "Dextranase" is dextranase).

Материал и методика исследованияMaterial and research methodology

Изучение действия декстраназы в клинике было проведено у 53 пациентов в возрасте от 25 до 55 лет с заболеваниями пародонта, из них с гингивитом - 38, с пародонтитами - 20, у 38 пациентов был диагностирован катаральный генерализованный гингивит легкой формы, у 20 пациентов - хронический генерализованный пародонтит средней тяжести.The study of the action of dextranase in the clinic was carried out in 53 patients aged 25 to 55 years with periodontal diseases, of which 38 patients had gingivitis, 20 patients had periodontitis, 38 patients were diagnosed with mild generalized catarrhal gingivitis, 20 patients had chronic generalized moderate periodontitis.

Все больные перед получением препарата были обучены гигиене полости рта (чистка зубов 2 раза в день после еды).All patients before receiving the drug were trained in oral hygiene (brushing teeth 2 times a day after meals).

Предварительно у всех групп пациентов был снят зубной налет и зубной камень механическим путем.Previously, all groups of patients had dental plaque and tartar removed mechanically.

Схема назначения препарата «Декстраназа» была следующей: пациентам рекомендовалось сосание таблеток препарата в течение 18-20 минут после чистки зубов зубной пастой два раза в сутки - утром и вечером по 1 таблетке; курс - 1 месяц.The scheme for prescribing the drug "Dextranase" was as follows: patients were recommended to suck the tablets of the drug for 18-20 minutes after brushing their teeth with toothpaste twice a day - in the morning and in the evening, 1 tablet; course - 1 month.

Контрольные осмотры проводили сразу после проведения курса профилактики декстраназой (через один месяц после начала применения препарата), через 1, 3 и 6 месяцев после окончания курса профилактики декстраназой. Другого лечения пациенты не получали.Control examinations were performed immediately after the dextranase prophylaxis course (one month after the start of the drug), 1, 3 and 6 months after the end of the dextranase prophylaxis course. The patients received no other treatment.

Критерии оценки действия декстраназы: 1. состояние клинических признаков; 2. количество зубного налета определялось гигиеническими индексами Грина-Вермиллиона; 3. состояние пародонта определялось по показателям индекса ПМА м ПИ.Criteria for evaluating the action of dextranase: 1. the state of clinical signs; 2. the amount of plaque was determined by the hygienic Green-Vermillion indices; 3. The state of the periodontium was determined by the index PMA and PI.

Контрольную группу (20 человек) составили пациенты с аналогичными заболеваниями (10 человек с гингивитом и 10 человек с пародонтитом), которые после снятия зубных отложений не получали декстраназу, а проводили регулярную гигиеническую чистку зубов пастой 2 раза в день по общепринятой методике. Контрольные осмотры проводили сразу после снятия зубных отложений, через 1, 3 и 6 месяцев после этой процедуры.The control group (20 people) consisted of patients with similar diseases (10 people with gingivitis and 10 people with periodontitis), who, after removing dental deposits, did not receive dextranase, but carried out regular hygienic toothbrushing with paste 2 times a day according to the generally accepted method. Control examinations were carried out immediately after the removal of dental deposits, 1, 3 and 6 months after this procedure.

Изучалась также биодоступность декстраназы - выход в слюну.The bioavailability of dextranase was also studied - exit into saliva.

РЕЗУЛЬТАТЫRESULTS

Результаты проведенного лечения представлены в таблицах 1 и 2. У больных гингивитом при первичном обследовании гигиенический индекс Грина-Вермиллиона составил от 2,5 до 3,0 баллов, у больных с пародонтитом соответственно от 2,8 до 3,0 баллов.The results of the treatment are presented in tables 1 and 2. In patients with gingivitis during the initial examination, the Green-Vermillion hygienic index ranged from 2.5 to 3.0 points, in patients with periodontitis, respectively, from 2.8 to 3.0 points.

Состояние пародонта при первичном осмотре у больных опытной и контрольной групп по данным пародонтальных индексов характеризовалось следующими показателями:The condition of the periodontium during the initial examination in patients of the experimental and control groups, according to periodontal indices, was characterized by the following indicators:

у больных с гингивитом - ПМА 100%, ПИ 2,0in patients with gingivitis - PMA 100%, PI 2.0

у больных с пародонтитом - ПМА 100%, ПИ 2,5.in patients with periodontitis - PMA 100%, PI 2.5.

Проба Шиллера-Писарева у пациентов с этими заболеваниями была положительной.The Schiller-Pisarev test in patients with these diseases was positive.

Все больные с заболеваниями пародонта отмечали кровоточивость десны после чистки зубов, запах изо рта, неприятный привкус во рту, зуд в деснах. Клинически отмечались отек, гиперемия десневого края.All patients with periodontal disease noted bleeding gums after brushing their teeth, bad breath, bad taste in the mouth, itching in the gums. Edema, hyperemia of the gingival margin were clinically noted.

Сразу же после снятия зубных отложений гигиенический индекс у пациентов обеих групп выражался в следующих данных:Immediately after the removal of dental deposits, the hygienic index in patients of both groups was expressed in the following data:

у больных с гингивитом - Грина-Вермиллиона 0,5-0,6,in patients with gingivitis - Green-Vermillion 0.5-0.6,

у больных с пародонтитом - соответственно 0,5 и 0,6 балла. Пародонтальные индексы оставались в первоначальных цифровых показателях. Результаты действия препарата «Декстраназа» в опытной группе пациентов с заболеваниями пародонта в динамике на зубной налет и ткани пародонтаin patients with periodontitis - 0.5 and 0.6 points, respectively. Periodontal indices remained at their original numerical values. The results of the action of the drug "Dextranase" in the experimental group of patients with periodontal diseases in dynamics on plaque and periodontal tissues

Figure 00000013
Figure 00000013

Состояние гигиены полости рта и состояние тканей пародонта у пациентов контрольной группыThe state of oral hygiene and the state of periodontal tissues in patients of the control group

Figure 00000014
Figure 00000014

Figure 00000015
Figure 00000015

Как видно из таблиц 1 и 2 состояние тканей пародонта находится в прямой зависимости от гигиенического состояния полости рта - чем выше гигиена, тем менее выражены признаки воспаления в пародонте.As can be seen from tables 1 and 2, the state of periodontal tissues is directly dependent on the hygienic state of the oral cavity - the higher the hygiene, the less pronounced are the signs of inflammation in the periodontium.

Профилактический прием препарата «Декстраназа» удерживает хорошее состояние полости рта до 3-х месяцев после снятия зубных отложений. После аналогичного лечебного вмешательства в контрольной группе пациентов хорошее гигиеническое состояние полости рта сохранялось только в течение 1 месяца.Prophylactic administration of the drug "Dextranase" keeps a good condition of the oral cavity up to 3 months after the removal of dental deposits. After a similar therapeutic intervention in the control group of patients, a good hygienic condition of the oral cavity was maintained only for 1 month.

Отсутствие зубного налета в этот период благоприятно действует на ткани пародонта. Что выявлено и клинически - десна становится бледнорозового цвета, отсутствует кровоточивость.The absence of plaque during this period has a beneficial effect on periodontal tissues. What is revealed and clinically - the gum becomes pale pink, there is no bleeding.

Результаты изучения у пациентов биодоступности препарата подтвердили данные, полученные в эксперименте - наибольшую концентрацию декстраназы в слюне мы наблюдали через 18-20 минут сосания таблетки.The results of studying the bioavailability of the drug in patients confirmed the data obtained in the experiment - we observed the highest concentration of dextranase in saliva after 18-20 minutes of sucking the tablet.

Клинические испытания препарата «Декстраназы» в таблетированной форме проведены в отделении профилактики поликлиники детского и подросткового возраста ЦНИИС на 113 подростках 12-15 лет.Clinical trials of the drug "Dextranase" in tablet form were carried out in the prevention department of the polyclinic for children and adolescents of the Central Research Institute of Medical Sciences on 113 adolescents aged 12-15 years.

Методика применения. Все испытуемые были распределены на 3 группы в зависимости от гигиены полости рта и вида применяемого препарата: 1 группу составили 42 подростка с высоким уровнем гигиены полости рта, которые получали плацебо-таблетки; 2 группу составили 43 подростка с высоким уровнем гигиены полости рта, которые получали таблетки декстраназы; 3 группу составили 28 подростков с низким уровнем гигиены (с резистентным к обычной чистке зубов зубным налетом), которые получали таблетки декстраназы.Method of application. All subjects were divided into 3 groups depending on oral hygiene and the type of drug used: group 1 consisted of 42 adolescents with a high level of oral hygiene who received placebo tablets; group 2 consisted of 43 adolescents with a high level of oral hygiene who received dextranase tablets; Group 3 consisted of 28 adolescents with a low level of hygiene (with dental plaque resistant to conventional brushing), who received dextranase tablets.

Предварительно все испытуемые прошли специальный курс обучения правилам гигиены полости рта, в результате которого выявлены лица с повышенным налетообразованием, которые и были включены в группу 3.Previously, all subjects underwent a special training course on the rules of oral hygiene, as a result of which individuals with increased plaque formation were identified, which were included in group 3.

Всем обследованным согласно программе назначалось по 1 таблетке декстраназы или плацебо для сосания в течение 10 минут после чистки зубов 2 раза в сутки - утром и вечером. Стоматологические осмотры проводились перед началом применения препарата (исходные данные), через одну неделю и месяц применения препарата, а также через одну неделю и один месяц и три месяца после окончания курса.According to the program, all examined were prescribed 1 tablet of dextranase or placebo for sucking within 10 minutes after brushing their teeth 2 times a day - in the morning and in the evening. Dental examinations were performed before the start of the drug (baseline), after one week and one month of the drug, as well as one week and one month and three months after the end of the course.

Оценку эффективности действия таблеток декстраназы проводили по индексам OHI-S (по его компоненту DI-S) и РМА. Особое внимание уделялось выявлению аллергических реакций и неприятных ощущений в полости рта.Evaluation of the effectiveness of dextranase tablets was carried out according to the OHI-S indices (according to its DI-S component) and PMA. Particular attention was paid to the identification of allergic reactions and discomfort in the oral cavity.

После завершения исследований, полученный цифровые данные подвергались статистической обработке по методу Стьюдента.After the completion of the research, the obtained digital data were subjected to statistical processing according to the Student's method.

Результаты. Анализ результатов динамического наблюдения свидетельствует о том, что состояние пародонта и гигиены полости рта у подростков первой и второй групп существенно не отличалось друг от друга и практически не изменялось на протяжении всего периода наблюдения (см. табл. 1). Что касается пациентов третьей группы, то у них через одну неделю и один месяц применения декстраназы отмечено улучшение гигиенического состояния полости рта и уменьшение воспалительных явлений в области десневого края. Установлено достоверное снижение индексов DI-S и РМА уже после недельного применения препарата, а после завершения курса (1 месяц) эти показатели снизились почти в 2 раза, что свидетельствует о высокой эффективности декстраназы в снижении налетообразования у подростков с резистентным к обычной чистке зубов зубным налетом.Results. An analysis of the results of dynamic observation indicates that the state of the periodontium and oral hygiene in adolescents of the first and second groups did not differ significantly from each other and practically did not change throughout the entire observation period (see Table 1). As for the patients of the third group, after one week and one month of using dextranase, they noted an improvement in the hygienic state of the oral cavity and a decrease in inflammation in the gingival margin. A significant decrease in the DI-S and PMA indices was established already after a week of using the drug, and after the completion of the course (1 month), these indicators decreased by almost 2 times, which indicates the high efficiency of dextranase in reducing plaque formation in adolescents with dental plaque resistant to conventional brushing. .

Однако через месяц после окончания применения препарата было отмечено ухудшение гигиенического состояния полости рта и нарастание воспалительных явлений в области альвеолярного края, а через три месяца состояние подростков этой группы практически не отличалось от исходного уровня. Это указывает на необходимость повторения курса применения таблеток декстраназы с интервалом не более 3 месяцев.However, a month after the end of the use of the drug, a deterioration in the hygienic state of the oral cavity and an increase in inflammation in the area of the alveolar margin were noted, and after three months the condition of adolescents in this group practically did not differ from the initial level. This indicates the need to repeat the course of dextranase tablets with an interval of no more than 3 months.

Figure 00000016
Figure 00000016

Figure 00000017
Figure 00000017

В результате клинической апробации таблеток декстраназы установлено значительное ингибирующее действие этого препарата на образование зубного налета, особенно у лиц с плохой гигиеной полости рта. В связи с этим этот препарат может рассматриваться как средство для профилактики кариеса и гингивитов, а также как вспомогательное средство при лечении воспалительных заболеваний пародонта, способствующее поддержанию стойкого эффекта благодаря снижению налетообразования у больных с гингивитами и пародонтитами. Интервалы между курсами приема таблеток декстраназы не должны превышать 3 месяцев.As a result of clinical testing of dextranase tablets, a significant inhibitory effect of this drug on the formation of plaque has been established, especially in individuals with poor oral hygiene. In this regard, this drug can be considered as a tool for the prevention of caries and gingivitis, as well as an adjunct in the treatment of inflammatory periodontal diseases, helping to maintain a stable effect due to the reduction of plaque in patients with gingivitis and periodontitis. The intervals between courses of taking dextranase tablets should not exceed 3 months.

Клиническая апробация препарата декстраназа проводилась в поликлинике и стационаре кафедры госпитальной терапевтической стоматологии ММСИ им. Н.А. Семашко.Clinical testing of the drug dextranase was carried out in the clinic and hospital of the Department of Hospital Therapeutic Dentistry, MMOSI named after A.I. ON THE. Semashko.

Обследовано 112 больных в возрасте от 22 лет и старше (50 мужчин и 62 женщины). Из них изучение действия декстраназы проведено у 61 больного с кариесом и заболеваниями пародонта (хронический катаральный гингивит - 36, хронический генерализованный пародонтит легкой степени - 25, в том числе у 18 больных препарат применяли для гидролиза налета в послеоперационном периоде). Кроме того, декстраназа была использована у 4 больных с красным плоским лишаем. Контрольная группа составляла 51 человек.112 patients aged 22 years and older (50 men and 62 women) were examined. Of these, the study of the action of dextranase was carried out in 61 patients with caries and periodontal diseases (chronic catarrhal gingivitis - 36, chronic generalized mild periodontitis - 25, including 18 patients, the drug was used for plaque hydrolysis in the postoperative period). In addition, dextranase was used in 4 patients with lichen planus. The control group consisted of 51 people.

Применению препарата предшествовало обучение больным методам рациональной гигиены полости рта. Назначение декстраназы проводилось согласно инструкции по клиническому изучению препарата. Больные контрольной группы получали плацебо.The use of the drug was preceded by teaching patients methods of rational oral hygiene. The administration of dextranase was carried out according to the instructions for the clinical study of the drug. Patients in the control group received a placebo.

Ранние признаки воспаления в пародонте выявляли по данным анализа и клиническим методам обследования, определялись индексы гигиены по Федорову-Володкиной и Г рин-Вермиллиону, а также ПМА и ИК.Early signs of inflammation in the periodontium were identified according to the analysis and clinical methods of examination, hygiene indices were determined according to Fedorov-Volodkina and Green-Vermillion, as well as PMA and IC.

Анализ результатов клинического испытания декстраназы, основанных на данных клинического обследования и субъективных ощущениях больных, показал следующее:An analysis of the results of a clinical trial of dextranase, based on clinical examination data and subjective feelings of patients, showed the following:

после применения создается впечатление чистоты рта,after application, the impression of cleanliness of the mouth is created,

поверхность зубов становится гладкой, больные отмечают побеление зубов,the surface of the teeth becomes smooth, patients notice whitening of the teeth,

переносимость препарата удовлетворительная, таблетки приятны на вкус,the tolerance of the drug is satisfactory, the tablets are pleasant to the taste,

таблетированная форма лекарства устойчива к свету и влажности, не меняет окраски, запаха, вкуса, консистенции.the tablet form of the drug is resistant to light and humidity, does not change color, smell, taste, consistency.

Под влиянием препарата (таблица) наблюдалось достоверное снижение индексов гигиены полости рта и состояния тканей пародонта в конце лечения.Under the influence of the drug (table), there was a significant decrease in the indices of oral hygiene and the state of periodontal tissues at the end of treatment.

ИГ1 по Федорову-Володкиной - 36,5%IG 1 according to Fedorov-Volodkina - 36.5%

ИГ2 по Грин-Вермиллиону - 47,96%IG 2 by Green-Vermillion - 47.96%

ПМА - 35,2%PMA - 35.2%

ИК - 64,7%.IR - 64.7%.

Следует отметить, что у нескольких больных наблюдалось появление тошноты в процессе лечения, которое не требовало отмены препарата. Иногда больные отмечали неудобства от необходимости достаточно долго (18-20 мин) держать таблетку в полости рта, не сглатывая слюны.It should be noted that several patients experienced nausea during treatment, which did not require discontinuation of the drug. Sometimes patients noted inconvenience from the need to keep the tablet in the oral cavity for a long time (18-20 minutes) without swallowing saliva.

При заболеваниях пародонта, осложненных красным плоским лишаем (4 больных), сопровождающимся нарушением целостности слизистой, после однократного применения декстраназы наблюдалось появление кровоточивости и чувство жжения, что требовало отмены препарата. Данных больных исключили из общей оценки эффективности действия декстраназы.In periodontal diseases complicated by lichen planus (4 patients), accompanied by a violation of the integrity of the mucosa, after a single application of dextranase, bleeding and a burning sensation were observed, which required discontinuation of the drug. These patients were excluded from the overall evaluation of the effectiveness of dextranase.

ВЫВОДЫCONCLUSIONS

Учитывая все вышеизложенное, препарат декстраназа может быть рекомендован для широкого медицинского применения в профилактике и лечения кариеса и заболеваний пародонта.Given all of the above, the drug dextranase can be recommended for widespread medical use in the prevention and treatment of caries and periodontal disease.

При красном лишае, сопровождающимся нарушение целостности слизистой оболочки, препарат следует использовать с осторожностью.With red lichen, accompanied by a violation of the integrity of the mucous membrane, the drug should be used with caution.

Целесообразно создание новых лекарственных форм препарата (зубной пасты, жевательной резинки и т.п.).It is advisable to create new dosage forms of the drug (toothpaste, chewing gum, etc.).

Сотрудники кафедры терапевтической стоматологии ОГМИ провели первый этап испытаний декстраназы.Employees of the Department of Therapeutic Dentistry of OSMI conducted the first stage of testing dextranase.

Задача испытания:Test task:

Выявить влияние декстраназы на зубной налет.To reveal the effect of dextranase on dental plaque.

Материал и методика:Material and method:

Общее число больных в опытной группе составило 34 человека. В контрольной группе 7 человек.The total number of patients in the experimental group was 34 people. There are 7 people in the control group.

Длительность одного курса лечения - 30 дней. В течение года предполагается повторить курс через 6 месяцев.The duration of one course of treatment is 30 days. Within a year it is supposed to repeat a course in 6 months.

Отбор больныхPatient selection

Препарат применяли у студентов ОГМИ в возрасте от 18 до 27 лет с целью профилактики кариеса зубов и гингивита, а также в составе комплексной терапии при лечении заболеваний пародонта.The drug was used in OSMI students aged 18 to 27 years to prevent dental caries and gingivitis, as well as as part of complex therapy in the treatment of periodontal diseases.

Критерии включения больных в испытанияCriteria for inclusion of patients in trials

Наличие у пациентов зубного налета на гладких поверхностях коронок зубов в пришеечной области, что определяется гигиеническими индексами Г рина-Вермиллиона и Федорова-Володкиной.The presence of plaque in patients on the smooth surfaces of the crowns of the teeth in the cervical region, which is determined by the hygienic indices of Green-Vermillion and Fedorov-Volodkina.

Предрасположенность к кариесу зубов (индекс КПУ - не менее 3).Predisposition to dental caries (KPU index - at least 3).

Наличие ранних признаков воспаления в пародонте (жалобы на зуд в деснах, кровоточивость при чистке зубов и пр.).The presence of early signs of inflammation in the periodontium (complaints of itching in the gums, bleeding when brushing teeth, etc.).

Критерии для исключения больных из испытанийCriteria for exclusion of patients from trials

В испытания не включали больных с развившейся стадией пародонтита - с глубоким зубо-десневым карманом (более 3 мм) и явлениями гноетечения.The tests did not include patients with advanced stage of periodontitis - with a deep dentogingival pocket (more than 3 mm) and symptoms of suppuration.

Схема назначения препаратаPrescribing scheme

Применению препарата предшествует обучение больных методам рациональной гигиены полости рта.The use of the drug is preceded by training patients in methods of rational oral hygiene.

Препарат назначали по 1 таблетке 2 раза в день (утром и вечером) после чистки зубов в течение 30 дней.The drug was prescribed 1 tablet 2 times a day (morning and evening) after brushing your teeth for 30 days.

Контрольные осмотры проводили сразу после окончания курса лечения.Control examinations were performed immediately after the end of the course of treatment.

Пациенты были санированы.The patients were sanitized.

Проведены общепринятые способы лечения гингивита.Conventional methods for the treatment of gingivitis have been carried out.

Схема обследования больногоScheme of examination of the patient

Заполнение медицинской карты стоматологического больного (форма №043/у).Filling out a medical card of a dental patient (form No. 043 / y).

Количество зубного налета определялось гигиеническими индексами Грина-Вермиллиона (ОН 1-5 с учетом его составляющей DI-S, характеризующей количество мягких зубных отложений) и индекса Федорову-Володкиной.The amount of plaque was determined by the Green-Vermillion hygienic indices (OH 1-5, taking into account its DI-S component, which characterizes the amount of soft dental deposits) and the Fedorov-Volodkina index.

Состояние твердых тканей зубов определялось индексом КПХ.The condition of the hard tissues of the teeth was determined by the CPH index.

Состояние пародонта определяли по показаниям индекса ПМА.The condition of the periodontium was determined by the indications of the PMA index.

Полученные данные позволяют заключить:The data obtained allow us to conclude:

Пациенты, принимавшие декстраназу отмечают снижение кровоточивости или полное ее исчезновение, уменьшение количества зубного налета.Patients taking dextranase note a decrease in bleeding or its complete disappearance, a decrease in the amount of plaque.

Четыре человека предъявили жалобы на появление гиперостезии твердых тканей зубов после приема препарата.Four people complained about the appearance of hyperesthesia of the hard tissues of the teeth after taking the drug.

Статистическая обработка предварительных результатов клинических испытаний позволила установить следующее:Statistical processing of the preliminary results of clinical trials made it possible to establish the following:

Индекс ПМА в контрольной (плацебо) и опытной (декстраназа) группах не различался.The PMA index in the control (placebo) and experimental (dextranase) groups did not differ.

M1±ш=13,007±2,026 (контроль)M 1 ±w=13.007±2.026 (control)

М2±ш=13,918±1,480 (опыт) р>0,05M 2 ±w=13.918±1.480 (experiment) p>0.05

В ходе испытаний препарата (через 30 дней) установлено незначительное (статистически недостоверное) снижение значений индекса ПМА в контрольной до 10,932±2,026 (р>0,05) в опытной индекс ПМА достоверно снизился до 7,906±0,987 (исходные значения его 13,918±1,480) р<0,001.In the course of testing the drug (after 30 days), a slight (statistically unreliable) decrease in the values of the PMA index in the control group to 10.932±2.026 (p>0.05) was established; p<0.001.

Сравнивая значения индекса ПМА в контрольной и опытной группах через определенный срок от начала испытаний препарата (30 дней), следует отметить, что хотя и произошло уменьшение значений ПМА в обеих группах, однако статистически достоверных различий при повторном осмотре групп не отмечено.Comparing the values of the PMA index in the control and experimental groups after a certain period of time from the start of the drug trials (30 days), it should be noted that although there was a decrease in the PMA values in both groups, however, there were no statistically significant differences during the second examination of the groups.

M1±ш=10,392±2,026 (контроль)M 1 ±w=10.392±2.026 (control)

М2±ь=7,906±1,480 (опыт) р>0,05M 2 ±b=7.906±1.480 (experiment) p>0.05

При сравнении индекса гигиены полости рта (индекс Федорова-Володкиной) в контрольной и опытной (декстраназа) группах отмечено следующее:When comparing the oral hygiene index (Fedorov-Volodkina index) in the control and experimental (dextranase) groups, the following was noted:

Исходные показатели индекса гигиены полости рта в контрольной и опытной группах статистически достоверно не различались.The initial indicators of the oral hygiene index in the control and experimental groups did not differ statistically significantly.

В ходе испытаний препарата (через 30 дней) установлено статистически достоверное (р<0,001) снижение показателей индекса гигиены в опытной группе (декстраназа), тогда как в контрольной (плацебо) значения его достоверно не изменились.During the trials of the drug (after 30 days), a statistically significant (p<0.001) decrease in the hygiene index in the experimental group (dextranase) was established, while in the control group (placebo) its values did not change significantly.

При сравнении значений индекса гигиены полости рта (индекс гигиены по Грину-Вермиллиону).When comparing the values of the oral hygiene index (Green-Vermillion Hygiene Index).

Исходные значения индекса гигиены по Грину-Вермиллиону в контрольной и опытной группах не различались.The initial values of the Green-Vermillion hygiene index in the control and experimental groups did not differ.

В ходе испытаний препарата (через 30 дней) установлено статистически достоверное уменьшение значений изучаемого показателя как в контрольной (р<0,01), так и в опытной группах (р<0,001).In the course of testing the drug (after 30 days), a statistically significant decrease in the values of the studied indicator was established both in the control (p<0.01) and experimental groups (p<0.001).

Не отмечено статистически достоверных различий в уровне гигиенического состояния полости рта (индекс Грина-Вермиллиона) между опытной и контрольной группой после 30 дней клинических испытаний препарата (р>0,05).There were no statistically significant differences in the level of oral hygiene (Green-Vermillion index) between the experimental and control groups after 30 days of clinical trials of the drug (p>0.05).

ЗаключениеConclusion

Клинические испытания позволили выявить влияние декстраназы на зубной налет. Это подтверждается уменьшением накопления налета на зубах (снижение значений индексов гигиены Федорова-Володкиной, Грина-Вермиллиона) и уменьшением воспаления пародонта (отмечено снижение или полное исчезновение кровоточивости десен).Clinical trials have revealed the effect of dextranase on plaque. This is confirmed by a decrease in the accumulation of plaque on the teeth (a decrease in the values of the Fedorov-Volodkina, Green-Vermillion hygiene indices) and a decrease in periodontal inflammation (a decrease or complete disappearance of gum bleeding was noted).

Также настоящее изобретение направлено на средство для ухода за полостью рта.The present invention is also directed to an oral care agent.

Средство для ухода за полостью рта может представлять собой зубную пасту, эликсир или жевательную резинку, содержащие предлагаемый препарат.The oral care agent may be a toothpaste, elixir or chewing gum containing the proposed preparation.

Основные компоненты зубных паст.The main components of toothpastes.

Многоатомные углеводородные спирты.Polyhydric hydrocarbon alcohols.

Маннитол или маннит (лат. mannitum, англ. mannitol) - шестиатомный углеводородный спирт из группы Сахаров. Маннитол - стереоизомер сорбитола. Эмпирическая формула маннитола - С6Н8(ОН)6. Молярная масса 182,172 моль-1.Mannitol or mannitol (Latin mannitum, English mannitol) is a six-atomic hydrocarbon alcohol from the group of sugars. Mannitol is a stereoisomer of sorbitol. The empirical formula of mannitol is C 6 H 8 (OH) 6 . Molar mass 182.172 mol-1.

Маннитол широко применяется в фармацевтической и пищевой промышленности. В современной медицине маннитол рассматривается, в основном, как вводимый внутривенно осмотический диуретик, средство, способствующее выведению из организма жидкости. В фармацевтике маннитол часто используется как вспомогательное, неактивное вещество (Маалокс, Панум, Тальцид, Гастрозол, Омепразол-акри, Гастал, Гастрацид, Гевискон, Мотилиум, Париет, Омез, Имодиум, Рабелок, Зульбекс и других).Mannitol is widely used in the pharmaceutical and food industries. In modern medicine, mannitol is considered mainly as an intravenously administered osmotic diuretic, a means that promotes the excretion of fluid from the body. In pharmaceuticals, mannitol is often used as an auxiliary, inactive substance (Maalox, Panum, Talcid, Gastrozole, Omeprazole-acry, Gastal, Gastracid, Gaviscon, Motilium, Pariet, Omez, Imodium, Rabelok, Zulbeks and others).

Маннитол (маннит) - пищевая добавка Е421, разрешенная к применению в России, Украине и других странах. В пищевой промышленности маннитол используется в качестве подсластителя и вещества, препятствующие комкованию. Применяется при изготовлении зубных паст и жевательной резинки и других средств по уходу за полостью рта.Mannitol (mannitol) is a food additive E421 approved for use in Russia, Ukraine and other countries. In the food industry, mannitol is used as a sweetener and anti-caking agent. It is used in the manufacture of toothpastes and chewing gum and other oral care products.

Маннитол и сорбитол используются в качестве стабилизаторов-наполнителей ферментных препаратов на стадии лиофилизации [патент №2111426 (РФ), 1998 «Способ лиофильной сушки биопрепаратов / Е.Ю. Шалаев, Франке Феликс, Н.А. Вараксин, М.Ю. Руковишников]. В наших исследованиях в качестве наполнителя-стабилизатора лекарственной формы на основе микробной гиалуронидазы был в выбран маннитол. Препараты с маннитолом позволяют получить препараты гиалуронидазы с достаточно высоким выходом по активности на стадии лиофилизации [Хабриев Р.У., Камаев Н.О., Данилова Т.И., Кахоян Е.Г. Разработка технологии получения микробной гиалуронидазы и лекарственного средства на ее основе. - Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - №1. - 2016. - С. 4-11].Mannitol and sorbitol are used as stabilizers-fillers of enzyme preparations at the stage of lyophilization [patent No. 2111426 (RF), 1998 "Method of freeze drying of biological products / E.Yu. Shalaev, Franke Felix, N.A. Varaksin, M.Yu. Rukovishnikov]. In our studies, mannitol was chosen as a filler-stabilizer of the dosage form based on microbial hyaluronidase. Preparations with mannitol make it possible to obtain hyaluronidase preparations with a sufficiently high yield of activity at the lyophilization stage [Khabriev R.U., Kamaev N.O., Danilova T.I., Kakhoyan E.G. Development of a technology for obtaining microbial hyaluronidase and a drug based on it. - Issues of biological, medical and pharmaceutical chemistry. - No. 1. - 2016. - S. 4-11].

Маннитол является основным компонентом разработанной нами рецептуры лекарственного препарата для профилактики и лечения кариеса зубов на основе декстраназы. Препарат применяется в таблетированной форме. Каждая таблетка содержи 0.006 г (30 ед.) декстраназы.Mannitol is the main component of the dextranase-based drug formulation developed by us for the prevention and treatment of dental caries. The drug is used in tablet form. Each tablet contains 0.006 g (30 units) of dextranase.

Сорбитол - пищевая добавка Е421. В основном применяется как подсластитель и комплексообразователь, текстуратор (назначение - улучшение структуры продукта), а также как влагоудерживающий агент (предохраняет продукты от высыхания и появления грубой сухой корочки на поверхности изделий). В зубных пастах сорбитол используется в качестве вкусовой добавки. Это синтетический заменитель сахара, который придают зубной пасте приятный вкус, не создавая при этом угрозы кариеса. Кроме того, сорбитол добавляют с целью предупреждения высыхания пасты. Обычно и зубных пастах используют сорбитол 70% в концентрации 20-40 мас. %.Sorbitol - food additive E421. It is mainly used as a sweetener and complexing agent, texturizer (appointment - improving the structure of the product), as well as a moisture-retaining agent (prevents products from drying out and the appearance of a rough dry crust on the surface of products). In toothpastes, sorbitol is used as a flavoring agent. It is a synthetic sugar substitute that gives toothpaste a pleasant taste without causing cavities. In addition, sorbitol is added to prevent the paste from drying out. Usually toothpastes use sorbitol 70% at a concentration of 20-40 wt. %.

Глицерол (глицерин) - пищевая добавка Е422 используется в кондитерской промышленности. Широко применяется в составе средств по уходу за полостью рта. Медицинский препарат на основе глицерина используется в качестве слабительного средства. Глицерин не рекомендуется употреблять людям, имеющим заболевания почек и сердечно сосудистой системы. В зубных пастах глицерин используется в качестве загустителя. Концентрация - 10-50 мас. %Glycerol (glycerol) - food additive E422 is used in the confectionery industry. Widely used in oral care products. A glycerin-based medication is used as a laxative. Glycerin is not recommended for people with kidney and cardiovascular diseases. In toothpastes, glycerin is used as a thickener. Concentration - 10-50 wt. %

Ксилитол (ксилит) пищевая добавка Е967 используется в пищевой промышленности как подсластитель. Эмпирическая формула ксилитол а - C5H7(OH)5. Применяется в качестве заменителя сахара при диабете. Ксилит сдерживает рост бактерий в ротовой полости, обладает реминерализующим действием (важно для создания рецептур по уходу за полостью рта). Такое действие на зубной налет обусловлено наличием ОН-групп, ксилит предотвращает разрушение зубов, увеличивает слюноотделение, что помогает восстановить кислотно-щелочной баланс, препятствует развитию микроорганизмов, и не приносит вреда при взаимодействии с эмалью. При этом для достижения ощутимого результата от использования противокариозной зубной пасты содержание ксилита в ней должно составлять 5-20, например, около 10 мас. %.Xylitol (xylitol) food additive E967 is used in the food industry as a sweetener. The empirical formula of xylitol is a - C 5 H 7 (OH) 5 . It is used as a sugar substitute for diabetes. Xylitol inhibits the growth of bacteria in the oral cavity, has a remineralizing effect (important for formulating oral care). This effect on plaque is due to the presence of OH groups, xylitol prevents tooth decay, increases salivation, which helps restore acid-base balance, prevents the development of microorganisms, and does not harm when interacting with enamel. At the same time, to achieve a tangible result from the use of anticaries toothpaste, the content of xylitol in it should be 5-20, for example, about 10 wt. %.

Исследования показывают, что все выше перечисленные многоатомные спирты обеспечивают высокую стабильность декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342.Studies show that all of the above polyhydric alcohols provide high stability of Aspergillus insuetus VKMP F-342 dextranase.

Низкомолекулярные вещества, такие как сорбитол, маннитол, ксилитол, проникают в зубной налет, но вследствие малой активности фермента, превращающего их во фруктозу, молочная кислота образуется в незначительных количествах и не снижает рН.Low molecular weight substances, such as sorbitol, mannitol, xylitol, penetrate into plaque, but due to the low activity of the enzyme that converts them into fructose, lactic acid is formed in small quantities and does not lower the pH.

Абразивные вещества (чистящий компонент) - мел, фосфаты Са, например, дикальций фосфатдигидрат, диоксид кремния, гидроксид алюминия, оксид алюминия, метил метакрилат натрия.Abrasives (cleaning component) - chalk, Ca phosphates, for example, dicalcium phosphate dihydrate, silicon dioxide, aluminum hydroxide, aluminum oxide, sodium methyl methacrylate.

Индекс абразивности зубной пасты (или RDA) должен быть в пределах 60-80. В последнее время наблюдается тенденция к снижению допустимой абразивности зубных паст, поэтому ниже 60 это тоже хорошо.The toothpaste abrasiveness index (or RDA) should be in the range of 60-80. Recently, there has been a tendency to reduce the allowable abrasiveness of toothpastes, so below 60 is also good.

Пасты на меловой основе имеют щелочное значение рН (до 11,0), что не подходит для дексраназы и гиалуронидазы.Chalk-based pastes have an alkaline pH value (up to 11.0), which is not suitable for dexranase and hyaluronidase.

Известно, что избыток алюминия снижает задержку кальция в организме, уменьшает адсорбцию фосфора и приводит к нарушениям нервной и регуляторной систем. И поэтому главная опасность алюминия в составе зубной пасты заключается в том, что возможно его скапливание в организме, которое отслеживается довольно трудно, не приводит к «быстрым» последствиям, но наносит ощутимый вред здоровью.It is known that an excess of aluminum reduces the retention of calcium in the body, reduces the adsorption of phosphorus and leads to disorders of the nervous and regulatory systems. And therefore, the main danger of aluminum in the composition of toothpaste is that it can accumulate in the body, which is monitored quite difficultly, does not lead to “quick” consequences, but causes significant harm to health.

Диоксид кремния (гидратированный кремнезем) хорошо совместим с соединениями фтора и другими активными компонентами, обладает контролируемой абразивностью, позволяющей создавать пасты с широким диапазоном заданных свойств. Он также обеспечивает оптимальный рН - 6,8 7,0 (оптимальный для декстраназы), за счет которого пасты на основе диоксида кремния нормализуют кислотно-щелочной баланс. Чаще применяется гидратированний диоксид кремния (SiO2 × Н2О) в количестве 15-25% по весу.Silicon dioxide (hydrated silica) is highly compatible with fluorine compounds and other active ingredients, has controlled abrasiveness, which allows creating pastes with a wide range of desired properties. It also provides an optimal pH - 6.8 7.0 (optimal for dextranase), due to which silica-based pastes normalize the acid-base balance. More commonly used hydrated silicon dioxide (SiO 2 × H 2 O) in the amount of 15-25% by weight.

Использование диоксида кремния имеет ряд преимуществ:The use of silicon dioxide has several advantages:

- эти абразивы практически индифферентны к большому количеству активных компонентов. Современные технологии позволяют производить достаточно качественную очистку от следов ионов Са, Mg, Al, Fe и других, в связи, с чем при необходимости совместимость с фторосодержащими веществами достигается максимума;- these abrasives are practically indifferent to a large number of active components. Modern technologies allow for sufficiently high-quality cleaning from traces of Ca, Mg, Al, Fe and others ions, and therefore, if necessary, compatibility with fluorine-containing substances is achieved to a maximum;

- возможность регулирования абразивности и очищающей способности в широком диапазоне;- possibility of regulation of abrasiveness and clearing ability in a wide range;

- разрушение зубного камня, регулирование кислотно-щелочного баланса;- destruction of tartar, regulation of acid-base balance;

- возможность разработки прозрачных зубных паст, т.е. таких паст, в которых коэффициент рефракции абразива равен коэффициенту рефракции жидкой фазы, в которой он суспензирован. Гелеобразные пасты обладают высокой пенообразующей способностью, имеют приятный вкус и привлекательный внешний вид. Кроме того, благодаря образованию водных внутренних структур, гель позволяет включить в его состав химически несовместимые вещества, так как водная оболочка препятствует химической реакции между ними. Однако очищающая способность таких паст ниже, чем паст на основе абразивных систем. При незрелости или повышенной стираемости твердых тканей зубов низкая абразивность гелеобразных паст делает их более предпочтительными.- the possibility of developing transparent toothpastes, i.e. such pastes in which the refractive index of the abrasive is equal to the refractive index of the liquid phase in which it is suspended. Gel-like pastes have a high foaming ability, have a pleasant taste and attractive appearance. In addition, due to the formation of aqueous internal structures, the gel allows you to include chemically incompatible substances in its composition, since the aqueous shell prevents the chemical reaction between them. However, the cleaning power of such pastes is lower than those based on abrasive systems. With immaturity or increased abrasion of hard tissues of the teeth, the low abrasiveness of gel-like pastes makes them more preferable.

Дикальций фосфат дигидрат (ДКФДГ) является единственным из широко применяемых абразивов, который по своему составу близок к составу зубной эмали. Способствует поддержанию постоянства состава тканей зубов за счет предотвращения растворения ионов кальция и фосфора зубной эмали и регуляции рН. Использование дикальция фосфатдигидрата является наиболее привлекательным с точки зрения высокой полирующей способности и хорошей совместимости с отдушками. К тому же в пастах на основе ДКФДГ улучшается стабильность запаха. Величина водородного показателя зубной пасты с ДКФДГ находится в интервале 6,0-8,0. Правда, в присутствии ионов фтора велика вероятность изменения рН в сторону повышения кислотности, вплоть до 5,0. В связи с этим это абразивное вещество следует использовать в составе зубной пасты без фтора. Концентрация этого компонента в пасте колеблется от 30 до 40 мас. %.Dicalcium phosphate dihydrate (DCPDG) is the only widely used abrasive that is close in composition to that of tooth enamel. It helps to maintain the constancy of the composition of dental tissues by preventing the dissolution of calcium and phosphorus ions of tooth enamel and by regulating pH. The use of dicalcium phosphate dihydrate is the most attractive in terms of high polishing power and good perfume compatibility. In addition, DCPDG-based pastes improve odor stability. The value of the pH value of toothpaste with DCFDG is in the range of 6.0-8.0. True, in the presence of fluorine ions, there is a high probability of a change in pH in the direction of increasing acidity, up to 5.0. Therefore, this abrasive should be used in a fluoride-free toothpaste. The concentration of this component in the paste ranges from 30 to 40 wt. %.

Дикальций фосфат дигидрат и диоксид кремния относятся к полимерным носителям, которые благодаря своим свойствам обеспечивают обратимую связь (иммобилизацию) с белками, в частности ферментами, содержащимися в композиции по изобретению.Dicalcium phosphate dihydrate and silica are polymeric carriers which, due to their properties, provide a reversible bond (immobilization) with proteins, in particular enzymes, contained in the composition according to the invention.

Таким образом, наиболее подходящими для декстраназы являются и диоксид кремния и дикальций фосфат дигидрат.Thus, both silica and dicalcium phosphate dihydrate are most suitable for dextranase.

Детергенты (ПАВ) или тензиды в концентрации 0,5-2,0% используются для стимуляции процессов образования пены. Для этих целей чаще всего используют лаурилсульфат натрия, лаурилсаркозинат натрия.Detergents (surfactants) or tensides at a concentration of 0.5-2.0% are used to stimulate the processes of foam formation. For these purposes, sodium lauryl sulfate, sodium lauryl sarcosinate are most often used.

Лаурилсульфат натрия обеспечивает пенообразование и уничтожает бактерии в полости рта, препятствует последующее размножение бактерий. Высокие концентрации этого вещества опасны для организма человека: могут вызвать катаракту, способствуют выпадению волос, способны накапливаться в организме человека. Кроме того, это сильнейший абразив, применение которого приводит к истончению эмали.Sodium lauryl sulfate provides foaming and destroys bacteria in the oral cavity, prevents the subsequent reproduction of bacteria. High concentrations of this substance are dangerous for the human body: they can cause cataracts, contribute to hair loss, and can accumulate in the human body. In addition, it is the strongest abrasive, the use of which leads to a thinning of the enamel.

Лаурилсульфат натрия практически не используется в составе детских зубных паст, поскольку происходит раздражение слизистых оболочек.Sodium lauryl sulfate is practically not used in the composition of children's toothpastes, since irritation of the mucous membranes occurs.

Лаурилсульфат натрия с успехом можно заменить сапонином, ксилитолом. Хорошим пенообразующим эффектом обладает касторовое масло.Sodium lauryl sulfate can be successfully replaced with saponin, xylitol. Castor oil has a good foaming effect.

Сапонин - экстракт коры квилайи - вечнозеленого дерева родом из Латинской Америки. Средняя молекулярная масса 1800-2000 дальтон. Экстракт квилайи считается более мягкой заменой поверхностно-активным веществам, которые используются в производстве продуктов для гигиены рта. Экстракт квилайи приемлем по многим характеристикам: он отличается приятным вкусом во рту, а сапонины из квилайи, как правило, хорошо совместимы с другими ингредиентами, используемыми в зубных пастах, например, ксилитолом, глицерином и сорбитолом. При этом остается оптимальным качество пены: экстракт коры этого дерева образует маленькие аккуратные однородные пузырьки и сохраняет отличные реологические свойства продукта. Экстракт квилайи применяется и в качестве вспомогательного ингредиента - как загуститель, стабилизатор, а также агент обеспечивающий адгезию косметики с кожей и слизистой оболочкой рта. При этом наибольший потенциал экстракт коры квилайи проявляет в сложных смесях.Saponin is an extract from the bark of a quilaia, an evergreen tree native to Latin America. The average molecular weight is 1800-2000 daltons. Quilaya extract is considered a gentler substitute for surfactants used in oral hygiene products. The quilaia extract is acceptable for many characteristics: it has a pleasant taste in the mouth, and quilaia saponins are generally well compatible with other ingredients used in toothpastes, such as xylitol, glycerin and sorbitol. At the same time, the quality of the foam remains optimal: the bark extract of this tree forms small, neat, uniform bubbles and maintains excellent rheological properties of the product. Quilaia extract is also used as an auxiliary ingredient - as a thickener, stabilizer, as well as an agent that ensures the adhesion of cosmetics to the skin and oral mucosa. At the same time, quilaia bark extract shows the greatest potential in complex mixtures.

Разбавители (глицерин, полиэтиленгликоль) - обеспечивают эластичность, вязкость пасты. В нашем случае наиболее целесообразно использовать глицерин в концентрации 10-50 мас. %.Thinners (glycerin, polyethylene glycol) - provide elasticity, viscosity of the paste. In our case, it is most advisable to use glycerin at a concentration of 10-50 wt. %.

Загустители (лактат алюминия, сорбитол, этиленгликоль).Thickeners (aluminum lactate, sorbitol, ethylene glycol).

Лактат алюминия - соль алюминия и молочной кислоты. Это вещество уменьшает чувствительность, уплотняет десны и останавливает кровоточивость.Aluminum lactate is a salt of aluminum and lactic acid. This substance reduces sensitivity, seals the gums and stops bleeding.

По вышеуказанным причинам соединения алюминия не желательно использовать в составе зубных паст.For the above reasons, aluminum compounds are not desirable for use in toothpastes.

В нашем случае наиболее целесообразно для стабилизации декстраназы использовать сорбитол в концентрации 20-40 мас. %.In our case, it is most expedient to use sorbitol at a concentration of 20–40 wt. %.

Гелеобразующие агенты. Наиболее известным гелеобразующим веществом является NaKMЦ - натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы. Это продукт взаимодействия целлюлозы с монохлоруксусной кислотой. Белое порошкообразное вещество без запаха и вкуса. Получают как побочный продукт переработки хлопка. Обладает эмульгирующими, загущающими, пенообразующими, стабилизирующими, смягчающими, гелеобразующими, пленкообразующими свойствами. ЫаКМЦ широко используется в зубных пастах, кремах и косметических масках, шампунях, кремах для бритья. Нетоксична, хорошо растворима в воде. Вязкость ее растворов практически не зависит от рН. Хорошо связывает воду, растворы устойчивы к одновалентным солям.gelling agents. The best known gelling agent is NaKMC, the sodium salt of carboxymethyl cellulose. It is a product of the interaction of cellulose with monochloroacetic acid. White powdery substance, odorless and tasteless. Obtained as a by-product of cotton processing. It has emulsifying, thickening, foaming, stabilizing, softening, gelling, film-forming properties. NaCMC is widely used in toothpastes, creams and cosmetic masks, shampoos, and shaving creams. Non-toxic, highly soluble in water. The viscosity of its solutions is practically independent of pH. It binds water well, solutions are resistant to monovalent salts.

NaKMЦ и каррагинан относятся к полимерным носителям, которые благодаря своим свойствам обеспечивают обратимую связь (иммобилизацию) с белками, в частности ферментами, содержащимися в композиции по изобретению.NaKMC and carrageenan are polymeric carriers that, due to their properties, provide a reversible bond (immobilization) with proteins, in particular enzymes, contained in the composition according to the invention.

Концентрация NaKMЦ в нашем изобретении 0,5-2,0 например, 1,1 мас. %.The concentration of NaKMC in our invention is 0.5-2.0, for example, 1.1 wt. %.

Соединения фтора. Противокариозные зубные средства делятся на две группы: содержащие фториды и не содержащие фториды. Из соединений фтора в зубных пастах используют монофторфосфат натрия, фторид натрия, фторид олова, органические фторсодержащие соединения. В зубной пасте соединения фтора используются потому, что ионы фтора останавливают гликолиз (брожение) и укрепляют зубную эмаль. Однако при взаимодействии с водой фториды, входящие в состав зубных паст, диссоциируют, а фторид-ионы относятся по параметрам острой токсичности к веществам первого класса опасности, их попадание в дыхательные пути или пищеварительный тракт может привести к смертельному исходу [Матело С.К. Клинико-экспериментальное изучение новых лечебно-профилактических зубных паст и гелей, не содержащих фтора и обладающих реминерализующим действием: автореферат диссертации кандидата медицинских наук: - Санкт-Петербург, 2009. - 23 с.]. Заметим, что смертельная доза фторида натрия для человека при весе 70 кг составляет 5-10 г, а допустимое законом содержание этого соединения в зубной пасте - 150 мг/100 г для взрослых и 50 мг/100 г для детей. Следовательно, смертельная доза (при приеме внутрь человеком, вес которого 70 кг) взрослой зубной пасты - около 3 кг, а детской - 10 кг. Но, тем не менее, рекомендуется выбирать детскую зубную пасту без фтора, так как у детей сильно развит глотательный рефлекс, и во время чистки зубов ребенок непременно проглатывает часть пены.Fluorine compounds. Anti-caries dentifrices are divided into two groups: containing fluoride and not containing fluoride. Of the fluorine compounds in toothpastes, sodium monofluorophosphate, sodium fluoride, tin fluoride, and organic fluorine-containing compounds are used. Fluorine compounds are used in toothpaste because fluoride ions stop glycolysis (fermentation) and strengthen tooth enamel. However, when interacting with water, fluorides, which are part of toothpastes, dissociate, and fluoride ions are related to substances of the first hazard class in terms of acute toxicity, their entry into the respiratory tract or digestive tract can lead to death [Matelo S.K. Clinical and experimental study of new therapeutic and prophylactic toothpastes and gels that do not contain fluorine and have a remineralizing effect: abstract of the thesis of a candidate of medical sciences: - St. Petersburg, 2009. - 23 p.]. Note that the lethal dose of sodium fluoride for a person weighing 70 kg is 5-10 g, and the legal content of this compound in toothpaste is 150 mg/100 g for adults and 50 mg/100 g for children. Consequently, the lethal dose (when ingested by a person weighing 70 kg) of adult toothpaste is about 3 kg, and for children - 10 kg. But, nevertheless, it is recommended to choose a children's toothpaste without fluorine, since children have a strongly developed swallowing reflex, and while brushing their teeth, the child will certainly swallow some of the foam.

В некоторых регионах России отмечается высокое содержание фтора в воде (Башкортостан, Краснодарский край, Москва, Московская и Рязанская области). Концентрация фтора в питьевой воде на уровне 1 мг/дм3 является оптимальной. Пасты с содержанием фтора 1000 ч/млн (ppm) т.е. 0,1% приемлемы для ежедневной чистки зубов. Данная концентрация относится к содержанию ионов фтора, следовательно, концентрация вещества, в составе которого этот ион вводится в пасту, должна быть выше. Так, концентрация натрия монофторфосфата (Na2PO3F) может достигать 0,80%In some regions of Russia, there is a high content of fluorine in water (Bashkortostan, Krasnodar Territory, Moscow, Moscow and Ryazan Regions). The concentration of fluorine in drinking water at the level of 1 mg/dm3 is optimal. Pastes with a fluorine content of 1000 ppm i.e. 0.1% is acceptable for daily brushing. This concentration refers to the content of fluorine ions, therefore, the concentration of the substance in which this ion is introduced into the paste should be higher. So, the concentration of sodium monofluorophosphate (Na 2 PO 3 F) can reach 0.80%

В отсутствие фтора за укрепление эмали в зубной пасте отвечают соединения кальция: кальция глицерофосфат, лактат и цитрат кальция, синтетический гидроксиапатит и многие другие. Пасты, содержащие кальций отлично подходят для постоянного применения.In the absence of fluorine, calcium compounds are responsible for strengthening enamel in toothpaste: calcium glycerophosphate, calcium lactate and calcium citrate, synthetic hydroxyapatite, and many others. Calcium-containing pastes are excellent for permanent use.

Глицерофосфат кальция - кальциевая соль 1,2,3-пропантриол моногидрогенфосфата обеспечивает процесс реминерализации. Это вещество выпускается в форме таблеток для применения внутрь, восполняет дефицит кальция и стимулирует анаболические процессы. Противопоказание - гиперкальцемия, и все, что с этим связано. В отличие от фтора, глицерофосфат кальция является природным полуфабрикатом фосфорно-кальциевого обмена, соответственно в составе зубной пасты противопоказаний нет, его концентрация колеблется от 0,1 до 0,15 в среднем около 0,13 мас. %.Calcium glycerophosphate - calcium salt of 1,2,3-propanetriol monohydrogen phosphate provides the remineralization process. This substance is available in the form of tablets for oral administration, replenishes calcium deficiency and stimulates anabolic processes. Contraindication - hypercalcemia, and everything connected with it. Unlike fluorine, calcium glycerophosphate is a natural semi-finished product of phosphorus-calcium metabolism, therefore, there are no contraindications in the composition of toothpaste, its concentration ranges from 0.1 to 0.15, on average, about 0.13 wt. %.

Отбеливающие вещества бывают высокоабразивными и содержащими пероксиды [[Матело С.К. Клинико-экспериментальное изучение новых лечебно-профилактических зубных паст и гелей, не содержащих фтора и обладающих реминерализующим действием: автореферат диссертации кандидата медицинских наук: - Санкт-Петербург, 2009. - 23 с.]Bleaching agents are highly abrasive and contain peroxides [[Matelo S.K. Clinical and experimental study of new therapeutic and prophylactic toothpastes and gels that do not contain fluorine and have a remineralizing effect: abstract of the thesis of a candidate of medical sciences: - St. Petersburg, 2009. - 23 p.]

Высокоабразивные компоненты содержат бикарбонат натрия, т.е. пищевую соду, карбонат кальция, лактат кальция, тексапон, диоксид титана, их использование приводит к тому, что стирается эмаль, и зубы становятся более светлыми. Во втором случае используется пероксид водорода, который при взаимодействии с эмалью выступает в роли окислителя. Долговременный контакт с полостью рта способен вызывать раздражение, и даже ожоги. То есть, достигнув желаемого результата, вы сталкиваетесь с такими последствиями, как повышенная чувствительность эмали, раздражение или даже потеря вкусовых ощущений. Не рекомендуется длительное время использовать отбеливающие зубные пасты, т.к. они нарушают структуру эмали. Кроме того, первоначальный оттенок эмали редко бывает идеально белым.Highly abrasive components contain sodium bicarbonate, i.e. baking soda, calcium carbonate, calcium lactate, texapone, titanium dioxide, their use leads to the fact that the enamel is erased and the teeth become lighter. In the second case, hydrogen peroxide is used, which, when interacting with enamel, acts as an oxidizing agent. Long-term contact with the oral cavity can cause irritation, and even burns. That is, having achieved the desired result, you are faced with such consequences as increased sensitivity of the enamel, irritation or even loss of taste sensations. It is not recommended to use whitening toothpastes for a long time, because. they break the structure of the enamel. In addition, the original shade of enamel is rarely perfectly white.

Консерванты (антимикробные компоненты). Существует общепринятая практика добавлять консерванты в состав зубных паст для защиты от микроорганизмов. Обычно для этих целей применяют метиловый, пропиловый эфиры параоксибензойной кислоты, или бензонат натрия.Preservatives (antimicrobial components). It is common practice to add preservatives to toothpastes to protect against microorganisms. Usually, methyl, propyl esters of paraoxybenzoic acid, or sodium benzoate are used for these purposes.

В качестве консерванта применяемого при изготовлении композиции в соответствии с настоящим изобретением, используют бензоат натрия, который может быть включен в количестве от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% по весу.Sodium benzoate is used as a preservative used in the preparation of the composition of the present invention, which may be included in an amount of from about 0.1% to about 2% by weight.

Отдушки сами по себе обладают некоторыми антибактериальными действием, также как и некоторые используемые в настоящее время активные компоненты (например, триклозан).Perfumes themselves have some antibacterial activity, as do some currently used active ingredients (for example, triclosan).

Хлоргексидин - 1,6-ди-(пара-хлорфенилгуанидо)-гексан. Препятствует образованию налета на зубах, активен в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий (кроме микобактерий туберкулеза), простейших и вируса герпеса, также применяется для промывки операционных ран. Но он не предназначен для приема внутрь! И, кроме того, естественная микрофлора также подвергается антисептическому действию хлоргексидина, что отрицательно сказывается на здоровье полости рта.Chlorhexidine - 1,6-di-(para-chlorophenylguanido)-hexane. It prevents the formation of plaque on the teeth, is active against gram-positive and gram-negative bacteria (except mycobacterium tuberculosis), protozoa and the herpes virus, and is also used for washing surgical wounds. But it is not meant to be taken orally! And, in addition, the natural microflora is also exposed to the antiseptic action of chlorhexidine, which negatively affects oral health.

Что касается триклозана, он обладает схожими свойствами в составе зубной пасты, но более активен химически, чем хлоргексидин. Представляет собой эфир, углеводородные радикалы в котором - дихлорбензил и хлорфенил. Исследования показали опасность этого соединения заключается в том, что оно может вызывать мутации микроорганизмов, поэтому не рекомендуется использовать триклозан содержащие для гигиены полости рта.As for triclosan, it has similar properties in the composition of toothpaste, but is more chemically active than chlorhexidine. It is an ether, the hydrocarbon radicals in which are dichlorobenzyl and chlorophenyl. Studies have shown the danger of this compound is that it can cause mutations in microorganisms, so it is not recommended to use triclosan containing for oral hygiene.

Хлорофилл принимает непосредственное участие в процессе фотосинтеза в зеленой части растений, успешно заменяет триклозан. Преимущество перед триклозаном заключается в том, что хлорофилл - природное вещество, а не синтетическое, и поэтому его действие направлено не на уничтожение бактерий, а на взращивание естественной микрофлоры. Препараты хлорофилла способствуют прекращению кровоточивости и активируют процессы регенерации тканей. То же касается экстрактов трав: органические несинтетические вещества ближе нам, и наиболее безопасны, но они менее активны, а их содержание в зубной пасте крайне мало. Хлорофилл используют в концентрации 4,2-5,0 мас. %.Chlorophyll is directly involved in the process of photosynthesis in the green part of plants, successfully replacing triclosan. The advantage over triclosan is that chlorophyll is a natural substance, not synthetic, and therefore its action is not aimed at killing bacteria, but at growing natural microflora. Chlorophyll preparations help stop bleeding and activate tissue regeneration processes. The same applies to herbal extracts: organic non-synthetic substances are closer to us, and the safest, but they are less active, and their content in toothpaste is extremely small. Chlorophyll is used at a concentration of 4.2-5.0 wt. %.

Примеры подсластителей, применимых при изготовлении средства по уходу за зубами в соответствии с настоящим изобретением, могут включать аспартам, сахарин, сукралозу или их смесь в количестве от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% по весу.Examples of sweeteners useful in making the dentifrice of the present invention may include aspartame, saccharin, sucralose, or a mixture thereof in an amount of from about 0.1% to about 2% by weight.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является зубные пасты (прототипы) по патенту RU № RU 2407512 и патенту №2535045The closest in technical essence to the proposed one is toothpastes (prototypes) according to the patent RU No. RU 2407512 and patent No. 2535045

Изобретение охватывает композиции для ухода за полостью рта и способы их применения, которые эффективны для ингибирования или снижения накопления налета на зубах, снижения содержания кислоты, продуцируемой (кариогенными) бактериями, реминерализации зубов и ингибирования или ослабления гингивита. Изобретение также охватывает композиции и способы для очистки полости рта и относится к улучшенным способам укрепления здоровья полости рта и/или общего состояния здоровья (включая состояние сердечнососудистой системы) путем уменьшения возможности получения системной инфекции через ткани полости рта, снизить воспалительные явления в полости рта на 80-85%.The invention encompasses oral care compositions and methods of using the same that are effective for inhibiting or reducing the accumulation of plaque on teeth, reducing acid produced by (cariogenic) bacteria, remineralizing teeth, and inhibiting or attenuating gingivitis. The invention also encompasses compositions and methods for cleaning the oral cavity and relates to improved methods for promoting oral health and/or general health (including cardiovascular health) by reducing the possibility of receiving systemic infection through the tissues of the oral cavity, reduce inflammation in the oral cavity by 80 -85%.

Поэтому изобретение включает в себя композицию для ухода за полостью рта (композицию по изобретению), например, средство для чистки зубов, содержащее фермент декстраназу микробного происхождения.Therefore, the invention includes an oral care composition (composition according to the invention), for example, a dentifrice, containing the enzyme dextranase of microbial origin.

Эффективное количество фермента, например, декстраназы например, присутствующей в количестве, по меньшей мере, примерно 0,03%, например, от примерно 0,03 (около 1500 ед.) до примерно 0,1% (около 5000 ед.).An effective amount of an enzyme, eg, dextranase, eg, present in an amount of at least about 0.03%, eg, from about 0.03 (about 1500 units) to about 0.1% (about 5000 units).

Вещество в виде частиц, например, диоксид кремния или дикальция фосфат, которое имеет рН в незабуференном растворе меньше примерно 7,5, например, от примерно 6,5 до примерно 7,4, например, от примерно 6,8 до примерно 7,4, например, приблизительно нейтральный рН. Это важно для сохранения активности и стабильности фермента в составе композиции.A particulate material, such as silica or dicalcium phosphate, that has a pH in unbuffered solution of less than about 7.5, such as from about 6.5 to about 7.4, such as from about 6.8 to about 7.4 eg approximately neutral pH. This is important for maintaining the activity and stability of the enzyme in the composition.

Многоатомные спирты, например, глицерин, сорбитол, ксилитол, или их смесь, используются в настоящем изобретении в качестве увлажняющих средств, обеспечивающих сохранение активности и стабильности фермента декстраназы в концентрации по меньшей мере, приблизительно 10 мас. %, например приблизительно от 10 до 50 мас. %.Polyhydric alcohols, for example, glycerol, sorbitol, xylitol, or a mixture thereof, are used in the present invention as moisturizing agents that maintain the activity and stability of the dextranase enzyme at a concentration of at least about 10 wt. %, for example from about 10 to 50 wt. %.

Детергенты (поверхностно активные вещества), например, лаурилсульфат натрия или сапонин в концентрации по меньшей мере, приблизительно 0,5 мас. %, например приблизительно от 0,5 до 2,0 мас. %Detergents (surfactants), for example, sodium lauryl sulfate or saponin at a concentration of at least about 0.5 wt. %, for example from about 0.5 to 2.0 wt. %

Figure 00000018
Figure 00000018

Figure 00000019
Figure 00000019

Композиция по изобретению содержит гелеобразующие соединения, например, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы.The composition according to the invention contains gelling compounds, for example sodium carboxymethyl cellulose.

Натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы обеспечивает иммобилизацию декстраназы и соответственно стабильность фермента.The sodium salt of carboxymethyl cellulose ensures the immobilization of dextranase and, accordingly, the stability of the enzyme.

Композиция по изобретению содержит натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы или каррагинан в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,5 мас. % например, приблизительно от 0,5 до 2,0 мас. %The composition of the invention contains sodium carboxymethyl cellulose or carrageenan at a concentration of at least about 0.5 wt. % for example, from about 0.5 to 2.0 wt. %

Композиция по изобретению не обязательно содержит соединение фтора, например, монофторфосфат натрия меньше примерно 0,80, например, от примерно 0,40 до примерно 0,75 мас. %.The composition according to the invention does not necessarily contain a fluorine compound, for example, sodium monofluorophosphate is less than about 0.80, for example, from about 0.40 to about 0.75 wt. %.

Композиция по изобретению не обязательно содержит, например, глицерофосфат кальция, в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 мас. % например, приблизительно от 0,1 до 0,15 мас. %The composition according to the invention does not necessarily contain, for example, calcium glycerophosphate, at a concentration of at least about 0.1 wt. % for example, from about 0.1 to 0.15 wt. %

Указанную зубную пасту по примерам 1,2 готовят следующим образом: деминерализованной воде последовательно растворяют все компоненты, кроме натрий КМЦ, дикальций фосфат дигидрата и диоксида кремния затем добавляют натрий КМЦ и дикальций фосфат дигидрат или диоксид кремния перемешивают до образования геля. Полученную зубную пасту перемешивают, вакуумируют и гомогенизируют.The specified toothpaste according to examples 1,2 is prepared as follows: all components are successively dissolved in demineralized water, except for sodium CMC, dicalcium phosphate dihydrate and silicon dioxide, then sodium CMC and dicalcium phosphate dihydrate or silicon dioxide are added until a gel is formed. The resulting toothpaste is mixed, evacuated and homogenized.

Тщательный подбор ингредиентов композиции по изобретению и способа приготовления зубной пасты обеспечивают высокую остаточную активность и стабильность декстраназы в течение 2 лет.Careful selection of the ingredients of the composition according to the invention and the method of preparation of toothpaste provide high residual activity and stability of dextranase for 2 years.

Именно зубные пасты, содержащие декстраназу, рекомендуется применять для гигиены полости рта при лечении заболеваний пародонта и слизистой оболочки полости рта. Пасты содержащие декстраназу - обеспечивают снижение воспалительных явлений в полости рта на 85,8%.It is toothpastes containing dextranase that are recommended for oral hygiene in the treatment of periodontal and oral mucosa diseases. Pastes containing dextranase - provide a reduction in inflammation in the oral cavity by 85.8%.

После 5-минутной чистки зубов зубные пасты состава 1-2 с положительным эффектом приводили к снижению микроорганизмов по сравнению с исходным значением на 45-97% для десневой борозды, на 78-96% для вестибулярной и язычной поверхностей зубов и на 94-98% для вестибулярной и язычной поверхностей десен. На слизистой оболочке щеки наблюдали снижение микроорганизмов на 60-95%.After a 5-minute brushing session, Formula 1-2 toothpastes with positive effects resulted in a reduction in microorganisms from baseline of 45-97% for the gingival sulcus, 78-96% for the vestibular and lingual surfaces of the teeth, and 94-98% for the vestibular and lingual surfaces of the gums. On the buccal mucosa, a decrease in microorganisms by 60-95% was observed.

Положительный эффект после чистки зубов сохранялся в течение 2 часов.The positive effect after brushing the teeth lasted for 2 hours.

Изменение рН ротовой жидкости в область нейтральных и слабо щелочных значений также можно рассматривать в качестве положительного эффекта пасты, так как это действие способствует процессам реминерализации зубной эмали. Изменение времени чистки зубов с 5-ти до 3-х минут снижало эффективность используемых паст.A change in the pH of the oral fluid to the range of neutral and slightly alkaline values can also be considered as a positive effect of the paste, since this action contributes to the remineralization of tooth enamel. Changing the brushing time from 5 to 3 minutes reduced the effectiveness of the pastes used.

Зубные пасты состава 1-2 уменьшать образование налета как минимум на 70%, а также безвредны и безопасны при длительном применении.Formula 1-2 toothpastes reduce plaque formation by at least 70%, and are harmless and safe for long-term use.

Клинические испытания специфического действия таблеток декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342 в качестве средства профилактики кариеса зубов. Обследовано 114 человек. Из этих людей были сформированы три группы. В первую вошли люди, которым была проведена только санация полости рта. Второй группе в течение десяти дней на зубные ряды наносили фторсодсржаший гель. Профилактика в третьей группе осуществлялась с помощью препарата "Декстраль". Каждая таблетка содержала 0.006 г (30 ед.) декстраназы. Препарат "Декстраназа" применялся 1 раз в день утром после чистки зубов в течении 30 дней. Таблетка держалась пациентом в полости рта до 20 минут, перемещалась языком и после полного рассасывания таблетки исследуемому не рекомендовали полоскать рот до 1 часа.Clinical trials of the specific action of Aspergillus insuetus VKMP F - 342 dextranase tablets as a means of preventing dental caries. 114 people were examined. Three groups were formed from these people. The first included people who underwent only sanitation of the oral cavity. The second group received fluoride gel on the dentition for ten days. Prevention in the third group was carried out with the help of the drug "Dekstral". Each tablet contained 0.006 g (30 units) of dextranase. The drug "Dextranase" was used once a day in the morning after brushing your teeth for 30 days. The tablet was kept by the patient in the oral cavity for up to 20 minutes, moved with the tongue, and after complete resorption of the tablet, the patient was not recommended to rinse his mouth for up to 1 hour.

Проведенное исследование позволило установить следующее. В первом группе, то есть у лиц, которым была проведена только санация полости рта, прирост кариеса за год по индексу КПУ составил 1,556+0,239, по индексу КПУП - 2,204+0,301.The conducted research allowed to establish the following. In the first group, that is, in persons who underwent only oral cavity sanitation, the increase in caries per year according to the KPU index was 1.556 + 0.239, according to the KPU index - 2.204 + 0.301.

У лиц третьей группы, где в качестве кариеспрофилактичсского использован препарат "Декстраназа" темп прироста кариеса за год был самым невысоким. Прирост кариеса по индексу КПУ (ДКПУ) составил 0,588+0,125, а по индексу КПУП (ДКПУП) -1,353+0,166.In persons of the third group, where the drug "Dextranase" was used as a caries prophylactic, the growth rate of caries for the year was the lowest. The increase in caries according to the KPU index (DKPU) was 0.588+0.125, and according to the KPUP index (DKPUP) -1.353+0.166.

Таким образом, сравнение эффективности изучаемых кариеспрофилактических средств позволило установить следующее. Наибольший кариеспрофнлактнческий эффект получен при санации полости рта и назначении препарата "Декстраль", наименьший - у лиц, которым проводилась только санация полости рта. Применение в качестве кариеспрофилактического препарата фторсодержащего геля оказало незначительный эффект.Thus, a comparison of the effectiveness of the studied caries prophylactic agents made it possible to establish the following. The greatest caries prophylactic effect was obtained during the sanitation of the oral cavity and the appointment of the drug "Dekstral", the smallest - in persons who underwent only sanitation of the oral cavity. The use of a fluorine-containing gel as a caries preventive drug had little effect.

В результате рекомендует использовать таблетки «Декстраль», содержащие декстраназу в терапевтической дозе 30 ед как кариеспрофилактическое средство для лиц со средним, низким и очень низким уровнями резистентности зубов.As a result, it recommends the use of Dextral tablets containing dextranase at a therapeutic dose of 30 units as a caries prophylactic agent for individuals with medium, low and very low levels of tooth resistance.

Claims (7)

1. Способ получения препарата декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342, включающий: получение рабочей культуры Aspergillus insuetus ВКМП F - 342 на скошенном агаре; приготовление глубинной посевной культуры в колбах; приготовление глубинной посевной культуры в ферментере; проведение процесса биосинтеза в ферментерах; сепарирование на проточном сепараторе; концентрирование нативного раствора на ультрафильтрационной установке; смешивание с маннитом, стерилизующую фильтрацию, замораживание; сублимационное высушивание, при этом маннит добавляют из расчета 1 г на 8000-12000 ед. активности.1. The method of obtaining the drug dextranase Aspergillus insuetus VKMP F - 342, including: obtaining a working culture of Aspergillus insuetus VKMP F - 342 on slant agar; preparation of deep sowing culture in flasks; preparation of a deep seed culture in a fermenter; carrying out the process of biosynthesis in fermenters; separation on the flow separator; concentration of the native solution in an ultrafiltration unit; mixing with mannitol, sterilizing filtration, freezing; freeze drying, while mannitol is added at the rate of 1 g per 8000-12000 units. activity. 2. Препарат декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342, полученный способом по п. 1, содержащий маннит, который добавлен после стадии концентрирования нативного раствора на ультрафильтрационной установке из расчета 1 г на 8000-12000 ед. активности, для лечения и профилактики кариеса зубов и гингивитов, а также для лечения заболеваний пародонта в составе комплексной терапии.2. The preparation of dextranase Aspergillus insuetus VKMP F - 342, obtained by the method according to p. activity, for the treatment and prevention of dental caries and gingivitis, as well as for the treatment of periodontal diseases as part of complex therapy. 3. Применение препарата декстраназы по п. 2 для лечения и профилактики кариеса зубов и гингивитов, а также для лечения заболеваний пародонта в составе комплексной терапии.3. The use of the dextranase preparation according to claim 2 for the treatment and prevention of dental caries and gingivitis, as well as for the treatment of periodontal diseases as part of complex therapy. 4. Средство для ухода за полостью рта, содержащее препарат по п. 2.4. An oral care product containing the preparation according to claim 2. 5. Средство для ухода за полостью рта по п. 4, представляющее собой зубную пасту.5. An oral care product according to claim 4, which is a toothpaste. 6. Средство для ухода за полостью рта по п. 4, представляющее собой эликсир.6. Oral care agent according to claim 4, which is an elixir. 7. Средство для ухода за полостью рта по п. 4, представляющее собой жевательную резинку.7. Oral care agent according to claim 4, which is chewing gum.
RU2020122332A 2020-07-06 Method for obtaining a dextranase preparation and its use RU2789083C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020122332A RU2789083C2 (en) 2020-07-06 Method for obtaining a dextranase preparation and its use

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020122332A RU2789083C2 (en) 2020-07-06 Method for obtaining a dextranase preparation and its use

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2022108745A Division RU2022108745A (en) 2022-04-01 Method for obtaining dextranase drug and its use

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2020122332A3 RU2020122332A3 (en) 2022-01-11
RU2020122332A RU2020122332A (en) 2022-01-11
RU2789083C2 true RU2789083C2 (en) 2023-01-30

Family

ID=

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2651433A1 (en) * 1989-09-07 1991-03-08 Dana Dominique Enzyme complex having activity with respect to tartar and dental caries
SU1756355A1 (en) * 1986-11-19 1992-08-23 Институт Микробиологии Ан Бсср Method of dextranase preparation
RU2377864C2 (en) * 2003-07-11 2010-01-10 Колгейт-Палмолив Компани Chewing confectionary composition for teeth preventing dental deposit
RU2407512C1 (en) * 2009-06-24 2010-12-27 Сергей Борисович Улитовский Nonabrasive tooth paste containing papain, dextranase, alpha-amilase, potassium or ammonium thiocyanate, invertase or glucoamylase, glucose oxidase, lactoperoxidase, lysozyme or lactoferrin and lactulose enzymes
RU2535051C1 (en) * 2013-04-09 2014-12-10 Владимир Николаевич Иванов Tooth paste
RU2535045C1 (en) * 2013-07-02 2014-12-10 Владимир Николаевич Иванов Tooth paste containing regeneration stimulators

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1756355A1 (en) * 1986-11-19 1992-08-23 Институт Микробиологии Ан Бсср Method of dextranase preparation
FR2651433A1 (en) * 1989-09-07 1991-03-08 Dana Dominique Enzyme complex having activity with respect to tartar and dental caries
RU2377864C2 (en) * 2003-07-11 2010-01-10 Колгейт-Палмолив Компани Chewing confectionary composition for teeth preventing dental deposit
RU2407512C1 (en) * 2009-06-24 2010-12-27 Сергей Борисович Улитовский Nonabrasive tooth paste containing papain, dextranase, alpha-amilase, potassium or ammonium thiocyanate, invertase or glucoamylase, glucose oxidase, lactoperoxidase, lysozyme or lactoferrin and lactulose enzymes
RU2535051C1 (en) * 2013-04-09 2014-12-10 Владимир Николаевич Иванов Tooth paste
RU2535045C1 (en) * 2013-07-02 2014-12-10 Владимир Николаевич Иванов Tooth paste containing regeneration stimulators

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ПАНИН А.М. и др. Современные методы диагностики, устранения и профилактики галитоза. Учебное пособие, М., 2016, с. 62-67. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6136298A (en) Process for inhibiting S. mutans and caries
KR20080034890A (en) Agent for enhancing collagen production and utilization of the same
KR101065085B1 (en) Oral Cavity Cleaning Composition
JPH05503280A (en) Topical preparations for the treatment of conditions of teeth and their supporting tissues
RU2381021C2 (en) Liposome containing tooth paste
JPH08502970A (en) Antibacterial mouthwash
EP1895996B1 (en) Formulation for prophylaxis of oral cavity diseases
EA024261B1 (en) Mineral-enzyme complex for fortifying and whitening tooth enamel, oral hygiene composition and toothpaste
CN112426376A (en) Mouthwash and preparation method thereof
CN117100676A (en) Toothpaste containing centella asiatica extract and probiotics and preparation method thereof
RU2789083C2 (en) Method for obtaining a dextranase preparation and its use
KR101660467B1 (en) Oral composition containing fermentative extract of lycii fructus as active ingredient
US10813878B2 (en) Oral health composition
US20200155438A1 (en) Pharmaceutical composition and method for the prevention and treatment of pathologies of the oral cavity
KR20200041659A (en) Composition for prevention or treatment of oral disease
KR100519477B1 (en) Periodontal disease prevention and treatment composition containing trichromic acid, urodessoxycholine acid derivative and milky skin extract
RU2312657C2 (en) Mouth cavity rinsing agent
KR20130060084A (en) Composition for preventing or treating peridontal disease
RU2527343C1 (en) Toothpaste containing papain, lactoperoxidase and lactulose enzymes
KR100330924B1 (en) Oral composition containing extract of ulmi cortex for treatment of periodontal diseases
WO2020141201A1 (en) Antibacterial oral compositions
KR101295242B1 (en) Antibacterial Composition for Inhibiting Oral Bacteria comprising extract of Dianthus superbus
JP3140412B2 (en) Oral composition containing beef knee or yu white skin extract
FR3010634A1 (en) PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS BASED ON VEGETABLE SURFACTANTS FOR THE TREATMENT OF HYPOSIALIE
Ravichandran et al. Comparative evaluation of the efficacy of xylitol toothpaste and xylitol chewing gum on salivary parameters: An in-vivo study.